DE102007047206B4 - Biotechnologische Fixierung von Kohlenstoffdioxid - Google Patents

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Abstract

Transgene mikrobielle Zelle, enthaltend in exprimierbarer Form: (1) mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend für Hydrogenase-Aktivität; und (2) Nucleinsäuremolekül, codierend für Enzymaktivität eines Kohlenstoff fixierenden Stoffwechselwegs, und zwar Citrat-Lyase-Aktivität und Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität, wobei mindestens ein Enzym davon heterolog exprimiert wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft die biotechnologische Nutzung von anorganischen Elektronendonatoren, vor allem von gasförmigem Wasserstoff zur Fixierung von Kohlenstoffdioxid als Kohlenstoffquelle zur Synthese von organischen Verbindungen als Energieträger und Wertprodukte durch Fermentation in Mikroorganismen.
  • Die Umsetzung von Wasserstoff und Kohlenstoffdioxid in einem biologischen Organismus ist bekannt. Es wurden Wildtypen verschiedener Mikroorganismen entdeckt, die zu dieser Stoffwechselleistung fähig sind. Dazu zählen Ralstonia metallidurans, Ralstonia metallidurans (Ralstonia eutropha; Alcaligenes eutrophus), fakultativ autotrophe Pseudomonaden wie P. aeruginosa, P. saccharophila, P. facilis, P. hydrogenovora, P. hydrogenothermophila, P. carboxydohydrogena, P. compransoris, P. carboxydovarans, P. gasotropha und P. stanieri; Rhodopseudomonas palustris, R. capsulata; zur Wasserstoff-Aufnahme und Homoacetatgärung fähige Clostridien wie C. aceticum, C. magnum, C. thermoaceticum, C. scatologenes, C. formicoaceticum und C. thermoautotrophicum; Acetobacterium woodii; Acetogenium kivui; Arten der Rhodospirillales (C-Quelle Kohlenmonooxid) und Rhodocyclus gelatinosus.
  • Eine Vielzahl dieser Organismen eignen sich nicht oder nicht ohne weiteres zur Verwendung in der biotechnologischen Anwendung. Darüber hinaus sind vor allem geringe Umsatzraten realisiert.
  • Aufgabenstellung
  • Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von organischen Verbindungen, besonders in Form von C2 bis C6-Körpern vor allem aus Kohlenstoffdioxid als Kohlenstoffquelle unter Umsetzung mit Wasserstoff als „Energiequelle” sowie Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens bereitzustellen. Das technische Problem besteht auch darin, ein solches Verfahren besonders auch bei bekannten, in biotechnologischen/fermentativen Prozessen etablierten Mikroorganismen beziehungsweise Zelllinien, die mittels üblicher Rekombinationstechnologien unter geringem Aufwand transfiziert werden können, einsetzbar zu machen. Gleichzeitig soll das technische Problem gelöst werden, eine stabile Synthese von organischen Verbindungen wie Carbonsäuren, kurzkettige Fettsäuren und Alkohol vor allem aus CO2 als Kohlenstoffquelle und mit Wasserstoff als „Energiequelle” mit hoher Ausbeute zu ermöglichen, die sowohl in anaeroben als gegebenenfalls auch in aeroben Prozessen ablaufen kann.
  • Das technische Problem wird gelöst durch Bereitstellung einer transgenen biologischen Zelle gemäß Anspruch 1, besonders eines rekombinanten Mikroorganismus oder Teilen davon, welche eine Enzymausstattung enthält welche ausgewählt ist aus:
    • (1) Hydrogenase-Aktivität, bevorzugt
    • (a) cytoplasmatische, bevorzugt NAD-reduzierende Hydrogenase-Aktivität, und/oder
    • (b) membranständige Hydrogenase-Aktivität, bevorzugt zur Erzeugung eines Protonengradienten; und
    • (2) Enzymaktivität, geeignet zur Realisierung eines CO2-fixierenden Stoffwechselweges, und zwar: reduktiver Tricarbonsäurezyklus (RTCC) und zwar: Citrat-Lyase-Aktivität und Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität sowie optional zusätzlich Fumarat-Reduktase-Aktivität; sowie optional zusätzlich Serin-Zyklus (SC), und zwar: Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität
  • Zur Realisierung dieser Zelle sieht die Erfindung bevorzugt vor, dass eine transgene Zelle bereitgestellt wird, welche mindestens ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül enthält mit einer Nucleotidsequenz, welche für mindestens eine Enzymaktivität codiert, welche ausgewählt ist aus:
    • (1) Hydrogenase-Aktivität, bevorzugt cytoplasmatische und/oder membranständige Hydrogenase-Aktivität;
    • (2) Citrat-Lyase-Aktivität und Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität und optional zusätzlich Fumarat-Reduktase-Aktivität; sowie optional zusätzlich Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität;
  • Zur Herstellbarkeit des Endprodukts Lactat/Milchsäure sieht die Erfindung bevorzugt weiter vor, dass die Zelle, zusätzlich enthält:
    • (3) Enzymaktivität, ausgewählt aus:
    • (a) Lactat-Dehydrogenase,
    • (b) Lactat-Oxidoreduktase,
    • (c) mindestens einer Enzymaktivität des Methylglyoxalwegs, und
    • (d) Aldehyd-Dehydrogenase
  • Zur Realisierung der Enzymausstattung enthält die Zelle, besonders im Genom, besonders in einer Expressionskassette und operativ verknüpft mit einem Promotor, mindestens ein Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, welche für mindestens eine der vorgenannten Enzymaktivitäten codiert.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch eine Expressionskassette und ein diese Expressionskassette enthaltender Vektor, welche geeignet sind, die Expression der erfindungsgemäß vorgesehenen Enzymaktivitäten in der Wirtszelle zu vermitteln. Bevorzugt enthält die Expressionskassette zur Transformation einer Wirtszelle:
    • (1) mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend für Hydrogenase-Aktivität; und
    • (2) mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül, codierend für Enzymaktivität und zwar: Citrat-Lyase-Aktivität und Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von C2–C6-Körpern als Produkt aus Kohlenstoffdioxid als Substrat und unter Assimilierung von Wasserstoff, Verwendung transgenen biologischen Zelle zur biotechnologischen Herstellung von Lactat oder Milchsäure sowie Alkohol aus Kohlenstoffdioxid.
  • Die Erfindung macht sich die überraschende Erkenntnis zunutze, dass in einer geeigneten transgenen beziehungsweise rekombinanten biologischen Zelle, besonders durch rekombinante Expression der vorgenannten Enzyme beziehungsweise Enzymaktivitäten die Fixierung von Kohlenstoffdioxid zur Herstellung von organischen Kohlenstoffverbindungen unter Verwendung eines Elektronendonors, vor allem Wasserstoff, mit hoher Ausbeute ermöglicht wird. Die Erfindung stellt somit Mittel zur Durchführung biotechnologischer Verfahren zu einer neuartigen hocheffektiven Umwandlung von insbesondere Wasserstoff und CO2 in einfach zu transportierende und nutzbare Treibstoffe, beispielsweise Alkohole, sowie chemische Grund- und Wertstoffe, beispielsweise Carbonsäuren und kurzkettige Fettsäuren dar. Die effektive Nutzung von CO2 als Kohlenstoffquelle ermöglicht so nicht nur die Realisierung CO2-neutraler Prozesse, sondern erlaubt durch die ubiquitäre Verfügbarkeit von CO2 auch eine unabhängige Standortwahl. Die vorliegende Erfindung macht sich vor allem die Verwendung von Wasserstoff als Elektronendonor als Energiequelle mikrobieller Prozesse zunutze. Der Wasserstoff steht dazu üblicherweise aus elektrochemischen Verfahren aus Wasser oder aus der Fermentation organischer Abfälle bereit.
  • Es versteht sich, dass die Zelle mindestens eine der vorstehend definierten Enzymaktivitäten exprimiert. Bevorzugt exprimiert die Zelle zwei, mehrere und besonders bevorzugt alle der vorstehend definierten Enzymaktivitäten. Dazu ist das mindestens eine Nucleinsäuremolekül operativ verbunden mit einem Expressionssystem, das heißt mit einem Promotor oder Promotor-System. Es versteht sich, dass bevorzugt ein konstitutiver Promotor einsetzt wird. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle wird der Wildtyp bevorzugt mit einem geeigneten Expressionsvektor, der die Expressionskassette enthält, transformiert.
  • Die Transformation der erfindungsgemäßen Zellen und der Einbau der isolierten Nucleinsäuremoleküle erfolgt in an sich bekannter Weise, bevorzugt durch entsprechend geeignete Expressionsvektoren beziehungsweise in Verbindung mit entsprechenden Expressionskassetten, bevorzugt inklusive entsprechender Expressionsvektoren. Alternativ erfolgt die de novo-Synthese von Nucleinsäuremolekülen mit den gewünschten Nucleotidsequenzen, gegebenenfalls der kompletten Expressionskassette in einem geeigneten Synthesesystem.
  • Ausführungen der Erfindung sind:
    Transgene biologische Zelle, enthaltend, vorzugsweise im Genom und insbesondere funktionell verknüpft mit einem Promotor:
    • (1) mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend für Hydrogenase-Aktivität; und
    • (2) Nucleinsäuremolekül, codierend für Enzymaktivität und zwar: Citrat-Lyase-Aktivität und Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität wobei mindestens eines dieser Enzyme heterolog exprimiert wird.
  • In einer Variante ist auch der Calvin-Benson-Bassham-Zyklus (CBB) realisiert. Dazu enthält die Zelle zusätzlich:
    • (2)(a) mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül, codierend für Phosphoribulose-Kinase-Aktivität und Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität, wobei mindestens eine Enzymaktivität, ausgewählt aus: Fructose-Bisphosphatase-Aktivität und Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität nicht exprimiert oder gehemmt wird;
  • In einer bevorzugten Variante enthält diese Zelle, vor allem zur Steigerung des Synthesepotentials, zusätzlich mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül, codierend für Enzymaktivität, ausgewählt aus:
    Fructose-6-Phosphat-Aldolase-Aktivität,
    Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität,
    Glycerolkinase-Aktivität,
    Glycerol-Dehydrogenase-Aktivität und
    Transaldolase-Aktivität.
  • In einer Variante ist in der Zelle zusätzlich der Serin-Zyklus realisiert. Dazu enthält die Zelle zusätzlich:
    • (2)(b) mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül, codierend für Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität.
  • In einer bevorzugten Variante weist die Zelle weiter die Enzymaktivität eines Glycin-Cleavage-Systems auf. Dazu enthält diese Zelle zusätzlich bevorzugt mindestens ein heterologes oder homologes Nucleinsäuremolekül codierend für diese Enzymaktivität.
  • In einer bevorzugten Variante, weist die Zelle die Enzymaktivität ausgewählt aus:
    Serin-Glyoxylat-Aminotransferase-Aktivität,
    Hydroxypyruvat-Reduktase-Aktivität,
    Malat-Thiokinase-Aktivität,
    Maloyl-CoA-Lyase-Aktivität und
    Isocitrat-Lyase-Aktivität, und
    bevorzugt alle diese Aktivitäten auf.
  • In einer bevorzugten Variante enthält diese Zelle zusätzlich Formiat-Dehydrogenase-Aktivität zur Realisierung unter Verwendung des Serin-Zyklus. Dazu enthält diese Zelle zusätzlich bevorzugt mindestens ein heterologes oder homologes Nucleinsäuremolekül codierend für diese Enzymaktivität.
  • In einer bevorzugten Alternative ist der reduktive Tricarbonsäure-Zyklus vollständig realisiert. Dazu enthält die Zelle:
    • (1) mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend für Hydrogenase-Aktivität; und
    • (2)(c) Nucleinsäuremoleküle, codierend für Citrat-Lyase-Aktivität, für Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität und für Fumarat-Reduktase-Aktivität, wobei zumindest ein Nucleinsäuremolekül eine heterologe Enzymaktivität codiert.
  • In bevorzugten Varianten dieser Ausführungen enthält die Zelle: mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend für Hydrogenase-Aktivität, ausgewählt aus:
    • (1)(a) membranständiger Hydrogenase-Aktivität, bevorzugt aus dem Mikroorganismus E. coli, ausgewählt aus Hydrogenase hyaABC und Hydrogenase hybOCAB; und
    • (1)(b) cytoplasmatischer NAD-reduzierender Hydrogenase-Aktivität, bevorzugt aus dem Mikroorganismus Ralstonia eutropha mit zumindest den Strukturgenen hoxFUYH.
  • Die Erfindung sieht in allen Varianten grundsätzlich vor, dass nur diejenigen Gene heterolog rekombiniert sind, die solche Enzymaktivitäten eines erfindungsgemäß identifizierten Stoffwechselwegs codieren, die nicht zur Enzymausstattung des Wildtyps der rekombinierten Zelle gehören. Die homologe Expression ist bevorzugt zur homologen Überexpression modifiziert. Alternativ ist in einer erfindungsgemäßen Zelle mindestens eine der beteiligten Enzymaktivitäten sowohl homolog als auch heterolog exprimiert.
  • Bevorzugt ist eine Zelle, die eine Lactat-Dehydrogenase-Aktivität exprimiert beziehungsweise aufweist. Dazu enthält diese Zelle zusätzlich bevorzugt mindestens ein heterologes oder homologes Nucleinsäuremolekül codierend für diese Enzymaktivität.
  • Zur Herstellbarkeit des Endprodukts Lactat/Milchsäure sieht die Erfindung bevorzugt vor, dass in der erfindungsgemäßen Zelle die bei der CO2-Assimilation gebildeten Zwischenprodukte überwiegend oder ausschließlich über die Aktivität einer Lactat-Dehydrogenase zu Lactat umsetzbar sind. Vorzugsweise ist in der erfindungsgemäßen Zelle dazu zusätzlich die Expression mindestens eines Lactat-Transporters realisiert. Alternativ sieht die Erfindung vor, dass die bei der CO2-Assimilation gebildeten Zwischenprodukte in der erfindungsgemäßen Zelle überwiegend oder ausschließlich über die Aktivität einer Lactat-Oxidoreduktase zu Lactat umsetzbar sind. Alternativ sieht die Erfindung vor, dass die bei der CO2-Assimilation gebildeten Zwischenprodukte in der erfindungsgemäßen Zelle überwiegend oder ausschließlich über den Methylglyoxalweg zu Lactat umsetzbar sind. Alternativ sieht die Erfindung vor, dass die bei der CO2-Assimilation gebildeten Zwischenprodukte in der erfindungsgemäßen Zelle überwiegend oder ausschließlich über die Aktivität einer Aldehyd-Dehydrogenase zu Lactat umsetzbar sind.
  • Für enantiomerenreines Lactat ist in der erfindungsgemäßen Zelle die Expression von Aktivitäten eines enantiomerenselektiven Enzyms realisiert. Die Aktivität gegebenenfalls vorhandener homologer Enzyme mit mangelnder oder umgekehrter Stereospezifität und gegebenenfalls vorhandener Lactat-Racemase-Aktivität ist in der erfindungsgemäßen Zelle bevozugt gehemmt oder bevorzugt durch Deletion der beteiligten Gene ausgeschaltet.
  • Die Erfindung umfasst bevorzugt solche transgenen oder rekombinanten Zellen, die aus Bakterien, Cyanobakterien, Pilzen und Hefen ausgewählt oder abgeleitet sind. Bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus Bakterien der Gattungen Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus und Lactococcus. Besonders bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus Bakterien der Spezies Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Ralstonia eutropha, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum und Clostridium acetobutylicum.
  • Die Erfindung umfasst auch solche biologischen Zellen, die ein synthetischer Mikroorganismus sind oder davon abgeleitet sind. Unter einer Zelle werden vorliegend auch Membranvesikel, Membrankompartimente sowie Teile und Fragmente davon verstanden. Erfindungsgemäß bevorzugt befinden sich die Enzymaktivitäten im „Inneren” beziehungsweise Cytosol oder Cytoplasma der Zelle. Alternativ oder zusätzlich liegt mindestens eine der Enzymaktivitäten an einer Membran, besonders an einer Zellmembran assoziiert vor. Die Erfindung umfasst demgemäß auch oder Teile oder Fragmente eines erfindungsgemäßen transgenen Mikroorganismus, welche bevorzugt und in an sich bekannter Weise und unter Erhalt der Enzymaktivität an Trägerstrukturen assoziiert oder gebunden sind.
  • Die Erfindung umfasst als „Zelle” auch einen Biokatalysator, worin die Enzymaktivitäten durch isolierte oder synthetisierte Enzymproteine mit den vorliegend angegebenen Aminosäuresequenzen realisiert sind. Dies geschieht vorzugsweise unter Umgehung zellulärer Expressions- und Translationssysteme durch Inkorporation der Enzymproteine in die Zelle oder den Biokatalysator.
  • Rekombinante Zellen, besonders rekombinante Mikroorganismen, welche die erfindungsgemäßen Gene enthalten und exprimieren, werden in an sich bekannter Weise durch übliche Rekombinationstechnologien hergestellt. Es versteht sich, dass die für die Rekombination ausgewählten Zellen oder Mikroorganismen gegenüber den gewünschten Stoffwechselendprodukten ausreichende Resistenz aufweisen. Bevorzugt sind Mikroorganismen, für die in der biotechnologischen Produktion standardisierte Kultivierungsbedingungen etabliert sind, sodass sich eine aufwändige Anpassung der etablierten biotechnologischen Prozessführung minimieren oder weitgehend vermeiden lässt.
  • Vom Umfang der Erfindung sind auch solche Zellen beziehungsweise Mikroorganismen und Zelllinien erfasst, die bereits in der nicht rekombinierten/transgenen Form zumindest eines oder mehrere der Gene beinhalten und exprimieren, die für eine der erfindungsgemäß vorgesehenen Enzymaktivitäten codieren. Es versteht sich, dass je nach Aktivität des vorhanden homologen Gens gegebenenfalls keine entsprechende Rekombination mit den analogen heterologen Genen erfolgen braucht. Gegebenenfalls werden an sich bekannte Maßnahmen zur Sicherstellung der homologen Expression beziehungsweise Überexpression des homologen Gens getroffen, um den erfindungsgemäßen Stoffwechselweg vollständig zu realisieren.
  • Je nach Enzymausstattung des Ausgangsorganismus kann es zusätzlich erforderlich sein, eventuell vorhandene konkurrierende Stoffwechselwege auszuschalten beziehungsweise zu unterdrücken. Dies kann durch an sich bekannte Maßnahmen erfolgen. Bevorzugte Ausgestaltungen solcher „enzymhemmender” Maßnahmen sind nachstehend beispielhaft für Mikroorganismen der Gattungen Escherichia und Ralstonia dargestellt. Zellen beziehungsweise Mikroorganismen, die entsprechende Deletionen zur Unterdrückung von konkurrierenden Stoffwechselwegen aufweisen, sind ebenfalls von der Erfindung umfasst.
  • Eine bevorzugte Ausführung der Erfindung ist eine transgene beziehungsweise rekombinante E. coli Zelle, beispielsweise abgeleitet aus den Zelllinien K12. Eine alternative bevorzugte Ausführung der Erfindung ist eine transgene beziehungsweise rekombinante Ralstonia eutropha Zelle.
  • Neben den nachstehend bevorzugt genannten Nucleotidsequenzen und zugehörigen Aminosäuresequenzen können vergleichbare Gene aus dem Genom von weiteren Mikroorganismen in an sich bekannter Weise gefunden werden. Es wird auf die gängigen und an sich bekannten Tools und Datenbanken der Bioinformatik verwiesen. Ist ein entsprechender Mikroorganismus, welcher die gewünschte Nucleotidsequenz in seinem Genom trägt, identifiziert, so können die entsprechenden Nucleinsäuremoleküle (DNA) mit den üblichen Verfahren daraus isoliert und amplifiziert werden.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung wird durch die 1 bis 16 näher erläutert.
  • 1 zeigt die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um die Reaktionen des Calvin-Benson-Bassham-Zyklus, beteiligt sind.
  • 2 zeigt die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um Teile des Calvin-Benson-Bassham-Zyklus, beteiligt sind.
  • 3 und 4 zeigen die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um eine Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase, beteiligt sind.
  • 5 und 6 zeigen die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um eine Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase und die Schlüsselenzyme des Serin-Zyklus beteiligt sind.
  • 7 und 8 zeigen die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um die Schlüsselenzyme des reduktiven Tricarbonsäurezyklus (Citrat-Lyase, Oxoglutarat-Oxidoreduktase und Fumarat-Reduktase), beteiligt sind.
  • 9 zeigt eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat aus CO2 und Wasserstoff mit den in 1 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
  • 10 zeigt eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat aus CO2 und Wasserstoff mit den in 2 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
  • 11 zeigt eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat aus CO2 und Wasserstoff mit den in 3 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
  • 12 zeigt eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat aus CO2 und Wasserstoff mit den in 4 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
  • 13 zeigt eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat aus CO2 und Wasserstoff mit den in 5 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
  • 14 zeigt eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat aus CO2 und Wasserstoff mit den in 6 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
  • 15 zeigt eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat aus CO2 und Wasserstoff mit den in 7 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
  • 16 zeigt eine Flussverteilung, die das Synthesepotential für Lactat aus CO2 und Wasserstoff mit den in 8 dargestellten Reaktionsschritten optimal ausnutzt. Alle Flüsse sind bezogen auf den Aufnahmefluss an Wasserstoff (100%).
  • (1) Hydrogenase-Aktivität
  • Unter einer Hydrogenase-Aktivität, wird vorliegend die Fähigkeit zur Assimilation von elementarem Wasserstoff unter Bildung von Reduktionsäquivalenten verstanden.
  • Die Erfindung sieht also bevorzugt vor, dass die Wirtszelle mit mindestens einem heterologen Hydrogenase-Operon ausgestattet wird. In einer weiteren Variante wird zusätzlich mindestens eine im Wildtyp der Zelle vorhandene homologe Hydrogenase-Aktivität exprimiert.
  • Zur Realisierung der Hydrogenase-Aktivität ist bevorzugt die Einbringung des pHG1-Megaplasmids aus Ralstonia eutropha vorgesehen. Die Nucleotidsequenz des pHG1-Megaplasmids ist in Schwartz et al. 2003 (Schwartz E., Henne A., Cramm R, Eitinger T., Friedrich B., Gottschalk G. (2003). Complete Nucleotide Sequence of PHG1: A Ralstonia eutropha H16 Megaplasmid Encoding Key Enzymes of H2-based Lithoautotrophy and Anaerobiosis. J Mol Biol 332, 369–383.) und unter Genbank Accession No. AY305378 publiziert; der Inhalt dieser Publikationen wird vollständig in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Beschreibung einbezogen. Das Megaplasmid ist 452 kbp groß und trägt 429 potentielle Gene. Darunter auch mindestens 41 Gene für Hydrogenase-Aktivität. In einer bevorzugten Variante ist deshalb vorgesehen, dass in die erfindungsgemäße Zelle ein verkürztes beziehungsweise modifiziertes Megaplasmid in die Zelle eingebracht ist, welches zumindest ein Hydrogenase-Operon des Megaplasids enthält.
  • Die Erfindung sieht dazu bevorzugt die rekombinante Expression der cytoplasmatischen NAD-reduzierenden Hydrogenase-Aktivität aus Ralstonia eutropha vor. Dazu wird in der erfindungsgemäßen Zelle bevorzugt die Expression der Strukturgene hoxFUYH, vorzugsweise zusammen mit der an der Reifung des Enzyms beteiligten Gene, hypC1, hypD1, hypE1 und hypABF realisiert. Im Zusammenhang mit der Umsetzung mit dem Transkriptionssystem von Ralstonia ist bevorzugt die Expression des H2-Sensorsystems hoxA, hoxBC, hoxJ vorgesehen.
  • Bevorzugt stammt die heterologe Hydrogenase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Ralstonia eutropha, besonders das Enzym NAD-Hydrogenase (EC 1.12.7.2), oder ist daraus abgeleitet. Die Erfindung macht sich dabei die Erkenntnis zunutze, dass vor allem die rekombinante Hydrogenase aus Ralstonia eutropha, vorteilhafterweise vergleichsweise aerotolerant ist und bereits selbst den universell verwendbaren Elektronenakzeptor NAD nutzt.
  • Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist die NAD-Hydrogenase (EC 1.12.7.2) aus Ralstonia eutropha ein Heterotetramer aus 4 Untereinheiten. Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 1 für Untereinheit hoxF, SEQ ID NO: 3 für Untereinheit hoxU, SEQ ID NO: 5 für Untereinheit hoxY und SEQ ID NO: 7 für Untereinheit hoxH. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2, 4, 6, und 8 auf.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, mindestens drei oder bevorzugt alle heterologe Nucleinsäuremoleküle enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Hydrogenase-Aktivität codieren.
  • Die Erfindung sieht zur Expression der Hydrogenase-Aktivität bevorzugt weiter vor: die Expression mindestens eines an der Reifung der Hydrogenase-Aktivität beteiligten Proteins. Bevorzugt sind die Strukturgene ausgewählt aus: codierenden Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 9 für hypC1, SEQ ID NO: 11 für hypD1 und SEQ ID NO: 13 für hypE1. Für die Proteine hypA, hypB und hypF sind bevorzugt die codierenden Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 15 für hypA1, SEQ ID NO: 17 für hypB1 und SEQ ID NO: 19 für hypF1 vorgesehen. Alternativ sind SEQ ID NO: 21 für hypA2, SEQ ID NO: 23 für hypB2 und SEQ ID NO: 25 für hypF2. Die für die Reifung relevanten Proteine weisen also bevorzugt die entsprechenden Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 10, 12, 14, sowie 16, 18, 20 und/oder 22, 24, 26 auf.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche außerdem mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt ein Reifungsprotein für Hydrogenase-Aktivität codieren.
  • Die Erfindung sieht im Zusammenhang mit der Expression der Hydrogenase-Aktivität bevorzugt weiter vor: die Expression mindestens eines der am H2-Sensor-System beteiligten Proteine. Bevorzugt ist das H2-Sensor-Protein ausgewählt aus: codierenden Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 27 für hoxA, SEQ ID NO: 29 für Untereinheit hoxB und SEQ ID NO: 31 für Untereinheit hoxC von hoxBC sowie SEQ ID NO: 33 für hoxJ. Die H2-Sensor-Proteine weisen also bevorzugt die entsprechenden Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 28, 30, 32 und 34 auf. Das H2-Sensorsystem (hoxA, hoxBC, hoxJ) wird bevorzugt nur dann realisiert, wenn ein Ralstonia-eigenes Transkriptionssystem verwendet wird.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche außerdem mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, mindestens drei oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 28, 30, 32, 34 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt ein H2-Sensor-Protein codieren.
  • Zur Realisierung der Hydrogenase-Aktivität sieht die Erfindung alternativ oder bevorzugt zusätzlich die Expression der Aktivität einer membranständigen Hydrogenase aus E. coli vor. Dies ist besonders das Enzym Hydrogenase hyaABC und das Enzym Hydrogenase hybOCAB. In dieser Variante sieht die Erfindung vor, dass, alternativ oder bevorzugt zusätzlich, die Aktivität einer membranständigen Hydrogenase exprimiert wird. Bevorzugt stammt die Hydrogenase-Aktivität aus dem Mikroorganismus E. coli, besonders das Enzym Hydrogenase hyaABC oder Hydrogenase hybOCAB, oder es ist davon abgeleitet.
  • In einer ersten Alternative dieser Variante ist die Expression der membranständigen Hydrogenase hyaABC realisiert. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist die Hydrogenase hyaABC aus E. coli ein Heteromer aus 3 Untereinheiten. Diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 137 für Untereinheit hyaA, SEQ ID NO: 139 für Untereinheit hyaB und SEQ ID NO: 141 für Untereinheit hyaC. Das Enzymprotein Hydrogenase hyaABC weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 138, 140 und 142 auf.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche außerdem mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthältq, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 137, 139, 141 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 138, 140, 142 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Hydrogenase-Aktivität codieren.
  • Analog dazu in einer weiteren Alternative ist, bevorzugt zusätzlich, die Expression der membranständigen Hydrogenase hybOCAB realisiert. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist die Hydrogenase hybOCAB aus E. coli ein Heteromer aus 4 Untereinheiten. Diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 149 für Untereinheit hybO, SEQ ID NO: 155 für Untereinheit hybC, und SEQ ID NO: 151 für Untereinheit hybA und SEQ ID NO: 153 für Untereinheit hybB. Das Enzymprotein Hydrogenase hybOCAB weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 150, 156, 152 und 154 auf.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche außerdem mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, mindestens drei oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 149, 151, 153, 155 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 150, 152, 154, 156 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Hydrogenase-Aktivität codieren.
  • Im Zusammenhang mit der Verwendung der membranständigen Hydrogenasen aus E. coli ist auch die Expression der zugehörigen Chaperone hyaD, hyaE und hyaF beziehungsweise hybD, hybE, hybF und hybG zumindest teilweise realisiert. Die die Chaperone codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 143 für hyaD, SEQ ID NO: 145 für hyaE und SEQ ID NO: 147 für hyaF. Die Chaperone weisen also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 144, 146 und 148 auf. Die Chaperon-Gene hyaE und hyaF sind optional und brauchen nicht exprimiert zu werden.
  • Die die Chaperone hybD, hybE, hybF und hybG codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 157 für hybD, SEQ ID NO: 159 hybE, SEQ ID NO: 161 für hybF und SEQ ID NO: 163 für hybG. Die Chaperone weisen also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 158, 160, 162 und 164 auf.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche außerdem mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, mindestens drei oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 143, 145, 147, 157, 159, 161, 163 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 144, 146, 148, 158, 160, 162, 164 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt Hydrogenase-Chaperone codieren.
  • (2a) Calvin-Benson-Bassham-Zyklus (CBB)
  • Unter einer Enzymaktivität eines am CBB beteiligten Enzyms wird vorliegend die Fähigkeit zur Umsetzung eines Zwischenprodukts des CBB, Calvin-Zyklus oder reduktivem Pentosephosphatweg, als Substrat in ein anderes Zwischenprodukt des Zyklus als Produkt der Enzymreaktion verstanden. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis sind 11 Enzyme am CBB beteiligt. Allgemein ist der CBB in drei Abschnitte einteilbar: eigentliche Kohlenstoff-Fixierung (Carboxylierung), Reduktionsphase (pro drei Zyklen wird ein C3-Körper als Produkt abgegeben) und Regenerationsphase des Kohlenstoff-Akzeptors Ribulose-1,5-bisphosphat.
  • Erfindungsgemäß werden als Schlüsselenzymaktivitäten des CBB die Aktivitäten einer Phosphoribulose-Kinase (Phosphoribulokinase) und einer Ribulosebisphosphat-Carboxylase angesehen. Die Erfindung sieht zur Realisierung des CBB in der erfindungsgemäßen Zelle vor: die gegebenenfalls heterologe Expression von zumindest einer Phosphoribulose-Kinase-Aktivität und einer Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität.
  • 1 zeigt die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat in Escherichia coli, rekombinant erweitert um die Reaktionen des Calvin-Benson-Bassham-Zyklus, beteiligt sind.
  • Im Zusammenhang mit der Realisierung der Phosphoribulose-Kinase-Aktivität und Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität sieht die Erfindung vor allem vor, dass in der erfindungsgemäßen Zelle die Expression von Fructose-Bisphosphatase-Aktivität und/oder von Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität durch Deletion der diese Aktivität codierenden Nucleotidsequenzen ausgeschaltet ist.
  • Die Erfindung sieht dazu vor allem vor, dass zur CO2-Assimilation überwiegend oder ausschließlich der Calvin-Benson-Bassham-Zyklus (CBB) realisiert wird, wobei in der erfindungsgemäßen Zelle mindestens eine am CBB beteiligte Enzymaktivitäten in ausreichendem Umfang exprimiert werden. Es ist bevorzugt vorgesehen, dass die Expression von Aktivitäten von Enzymen, ausgewählt aus:
    Phosphoribulose-Kinase-Aktivität (Phosphoribulokinase) und Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität
    und/oder damit vergleichbare Aktivitäten realisiert ist.
  • Die Erfindung sieht dazu weiter vor, dass der Calvin-Benson-Bassham-Zyklus (CBB) unter Vermeidung, Hemmung beziehungsweise Deletion mindestens einer, bevorzugt beider, gegebenenfalls im Wildtyp der Zelle vorhandenen Enzymaktivität, ausgewählt aus:
    Fructose-Bisphosphatase-Aktivität und
    Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität
    realisiert wird, falls solche Enzymaktivitäten im Wildtyp homolog exprimiert werden. Dies ist vor allem im Zusammenhang mit der Verwendung einer Wirtszelle aus Ralstonia besonders von Ralstonia eutropha beziehungsweise des Megaplasmids pHG 1 aus Ralstonia eutropha zur Transformation von Wirtszellen relevant.
  • In einer Variante sieht die Erfindung vor, dass der CBB unter Hemmung beziehungsweise Deletion einer Fructose-Bisphosphatase-Aktivität realisiert ist. Dies geschieht erfindungsgemäß bevorzugt durch Hemmung der Expression und/oder Deletion mindestens einer diese Enzymaktivität codierenden Nucleotidsequenz beziehungsweise mindestens eines der Gene. In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli Zelle sieht die Erfindung dazu bevorzugt vor:
    die Hemmung der Aktivität der Fructose-Bisphosphatase I fbp bevorzugt durch Deletion mindestens des Gens für fbp, dargestellt durch die SEQ ID NO: 77 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 78, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
    die Hemmung der Aktivität der Fructose-Bisphosphatase II glpX bevorzugt durch Deletion mindestens des Gens für glpX, dargestellt durch die SEQ ID NO: 79 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 80
  • In einer, alternativen oder bevorzugt zusätzlichen, Variante sieht die Erfindung vor, dass der CBB unter Hemmung beziehungsweise Deletion einer Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität realisiert ist. Dies geschieht erfindungsgemäß bevorzugt durch Hemmung der Expression und/oder Deletion mindestens einer diese Enzymaktivität codierenden Nucleotidsequenz beziehungsweise mindestens eines der Gene. In Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli Zelle sieht die Erfindung dazu bevorzugt alternativ oder bevorzugt zusätzlich vor:
    die Hemmung der Fructosebisphosphat-Aldolase II-Aktivität fbaA durch Deletion mindestens des Gens für fbaA, dargestellt durch die SEQ ID NO: 81 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 82, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
    die Hemmung der Fructosebisphosphat-Aldolase I-Aktivität fbaB durch Deletion mindestens des Gens für fbaB, dargestellt durch die SEQ ID NO: 83 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 84.
  • Bevorzugt stammt die Phosphoribulose-Kinase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Ralstonia eutropha, besonders das Enzym Phosphoribulose-Kinase cbbPp, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 35. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 36 auf.
  • Bevorzugt stammt die Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Ralstonia eutropha, besonders das Enzym Ribulosebisphosphat-Carboxylase cbbSp/cbbLp, oder ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist die Ribulosebisphosphat-Carboxylase aus 2 Untereinheiten aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 37 für Untereinheit cbbLp und SEQ ID NO: 39 für Untereinheit cbbSp. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 40 und 42 auf.
  • In einer Variante sieht die Erfindung bevorzugt vor, dass zur Realisierung des CBB in der erfindungsgemäßen Zelle in der Zelle das pHG1-Megaplasmid aus Ralstonia eutropha vorliegt und dort, neben des Hydrogenase-Operons besonders die Phosphoribulose-Kinase-Operon und/oder die Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Operon exprimiert werden. Dabei ist gemäß der Erfindung vorgesehen, ein verkürztes oder modifiziertes pHG1-Megaplasmid einzusetzen, worin die Operons, codierend für Fructose-Bisphosphatase-Aktivität und Fructosebisphosphat-Aldolase-Aktivität, deletiert oder unterdrückt sind.
  • Die Erfindung betrifft bevorzugt eine Zelle, welche mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 35, 37, 39 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 36, 38, 40 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Phosphoribulose-Kinase-Aktivität und/oder eine Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität codieren.
  • In diesen Varianten ist bevorzugt vorgesehen, dass die Expression einer Fructose-6-Phosphat-Aldolase-Aktivität realisiert ist. Bevorzugt stammt die Fructose-6-Phosphat-Aldolase-Aktivität aus dem Mikroorganismus E. coli, besonders ist es das Enzym Fructose-6-Phosphat-Aldolase fsaA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 85. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 86 auf.
  • Alternativ bevorzugt ist das Enzym Fructose-6-Phosphat-Aldolase fsaB, oder es ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 87. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 88 auf.
  • In diesen Varianten ist bevorzugt weiter vorgesehen, dass die Expression einer Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität realisiert ist. Bevorzugt stammt die Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität aus dem Mikroorganismus E. coli, besonders ist das Enzym Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase gpsA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 89. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 90 auf.
  • Alternativ bevorzugt ist das Enzym Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase glpABC, oder es ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist diese Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase aus 3 Untereinheiten aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 91 für Untereinheit glpA, SEQ ID NO: 93 für Untereinheit glpB und SEQ ID NO: 95 für Untereinheit glpC. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 92, 94 und 96 auf.
  • Alternativ bevorzugt ist das Enzym Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase glpD, oder es ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 97. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 98 auf.
  • In diesen Varianten ist bevorzugt weiter vorgesehen, dass die Expression einer Glycerol-Kinase-Aktivität realisiert ist. Bevorzugt stammt die Glycerol-Kinase-Aktivität aus dem Mikroorganismus E. coli, besonders ist das Enzym Glycerol-Kinase glpK, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 99. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 100 auf.
  • In diesen Varianten ist bevorzugt weiter vorgesehen, dass die Expression einer Glycerol-Dehydrogenase-Aktivität realisiert ist. Bevorzugt stammt die Glycerol-Dehydrogenase-Aktivität aus dem Mikroorganismus E. coli, besonders ist das Enzym Glycerol-Dehydrogenase gldA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 101. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 102 auf.
  • In diesen Varianten ist schließlich bevorzugt weiter vorgesehen, dass die Expression einer Transaldolase-Aktivität realisiert ist. Bevorzugt stammt die Transaldolase-Aktivität aus dem Mikroorganismus E. coli, besonders ist das Enzym die Transaldolase talA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 103. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 104 auf.
  • Alternativ bevorzugt ist das Enzym die Transaldolase talB, oder es ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 105. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 106 auf.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Enzymaktivität, ausgewählt aus: Fructose-6-Phosphat-Aldolase-Aktivität, Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität, Glycerolkinase-Aktivität, Glycerol-Dehydrogenase-Aktivität und Transaldolase-Aktivität, codieren.
  • 2 zeigt die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um Teile des Calvin-Benson-Bassharn-Zyklus, beteiligt sind; Fructosebisphosphat-Aldolase und Fructose-Bisphosphatase wurden zur Steigerung des Synthesepotentials ersetzt durch Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase, Glycerol-Kinase, Glycerol-Dehydrogenase, Fructose-6-Phosphat-Aldolase und Transaldolase.
  • (2b) Serin-Zyklus (SC)
  • Als Alternative zur Realisierung des CBB steht erfindungsgemäß auch der Serin-Zyklus (SC) zur Verfügung. Aufgrund des hohen Energiebedarfs der Fixierung von CO2 im CBB ist mit diesem Weg der CO2-Fixierung eine Produktion von organischen Substanzen (z. B. Lactat) nur möglich, wenn zusätzlich zu CO2 ein weiterer Elektronenakzeptor, beispielsweise Sauerstoff, zur Verfügung steht. Darüber hinaus weist die im CBB bevorzugt eingesetzte Ribulosebisphosphat-Carboxylase eine vergleichsweise niedrige Aktivität auf. Im SC besteht hingegen vorteilhafterweise die prinzipielle Möglichkeit, auf einen zusätzlichen Elektronenakzeptor neben CO2 gänzlich zu verzichten. Der SC ist nicht angewiesen auf die Fixierung von CO2 in der Reaktion der Ribulosebisphosphat-Carboxylase. Dieses Enzym katalysiert über die CO2-Fixierung hinaus auch eine unerwünschte Nebenreaktion mit O2 als Substrat, wodurch die Effizienz des Stoffwechselwegs reduziert wird.
  • Die Erfindung sieht in dieser alternativen Variante bevorzugt vor, dass zur CO2-Assimilation überwiegend oder ausschließlich der Serin-Zyklus (SC) realisiert wird. Die erfindungsgemäße Realisierung dieses Stoffwechselwegs sieht primär die Expression einer Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität vor.
  • 3 zeigt die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um eine Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase, beteiligt sind; zur Assimilation des Wasserstoffs und zur Synthese von Glycin werden hier homologe Enzyme verwendet.
  • 4 zeigt die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um eine Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase, beteiligt sind; zur Synthese von Glycin werden hier homologe Enzyme verwendet; die Assimilation von Wasserstoff geschieht durch eine rekombinante Hydrogenase.
  • Die erfindungsgemäße Realisierung einer Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität stellt vor allem die Einschleusung von Formiat in die Übertragung von C1-Körpern sicher, besonders die Übertragung von C1-Körpern auf Glycin im Zusammenhang mit einer Serin-Hydroxymethyl-Transferase-Aktivität. Dieser Prozess ist vor allem in Verbindung mit der Verwendung von E. coli als Wirtszelle relevant.
  • Bevorzugt ist zusätzlich die homologe oder heterologe Expression einer, bevorzugt cytosolischen, Formiat-Dehydrogenase-Aktivität und/oder einer damit vergleichbaren Aktivität realisiert.
  • Vor allem im Zusammenhang mit der Verwendung von E. coli als Wirtszelle im anaeroben Prozess und unter Voraussetzung einer reversiblen Formiat-Hydrogen-Lyase und Energieerzeugung durch eine Protonengradient-erzeugende Formiat-Dehydrogenase-Aktivität reicht die Realisierung der erfindungsgemäßen heterologen Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität überraschenderweise aus, um die Einschleusung von Formiat in die Übertragung von C1-Körpern zu sichern. Diese überraschende Erkenntnis macht sich die Erfindung zu nutze, um eine mit geringerem Aufwand transformierte Zelle bereitzustellen. In diesem Zusammenhang werden Reduktionsäquivalente, die bei der homologen Formiat-Dehydrogenase-Aktivität anfallen, übertragen auf C1-Tetrahydrofolat, Pyruvat etc. Es wird auf die in 3 dargestellten erfindungsgemäßen Stoffwechselwege verwiesen.
  • Zur erfindungsgemäßen Realisierung dieses Stoffwechselwegs wird erfindungsgemäß mindestens eine Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität exprimiert. Bevorzugt stammt die Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Methylobacterium extorquens, besonders das Enzym Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase ftfL, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 107. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 108 auf.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens ein, Nucleinsäuremolekül enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenz SEQ ID NO: 107 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenz SEQ ID NO: 108 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Aktivität von Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase codieren.
  • In einer bevorzugten Variante dieser Ausführung ist der SC unter Einbeziehung einer in der Wirtszelle vorhandenen Glycin-Cleavage-System-Aktivität realisiert. Dies ist vor allem bei Verwendung der Wirtszellen E. coli oder Ralstonia relevant. Erfindungsgemäß bevorzugt wird eine, bevorzugt wirtseigene, Glycin-Cleavage-System-Aktivität exprimiert. Bevorzugt stammt die Glycin-Cleavage-System-Aktivität gcvPHT und lpd aus E. coli oder ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist das Glycin-Cleavage-System von E. coli aus 4 Untereinheiten aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 189 für Untereinheit gcvP, SEQ ID NO: 191 für Untereinheit gcvH und SEQ ID NO: 193 für Untereinheit gcvT sowie SEQ ID NO: 63 für Untereinheit lpd. Das Enzymsystem weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 190, 192, 194 und 64 auf.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens ein, Nucleinsäuremolekül enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 189, 191, 193, 63 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 190, 192, 194, 64 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Aktivität des Glycin-Cleavage-Systems codieren.
  • In einer bevorzugten alternativen Variante ist vorgesehen, dass, alternativ zum wirtseigenen Glycin-Cleavage-Systems oder gegebenenfalls zusätzlich, die rekombinante Expression von Aktivitäten von Schlüsselenzymen des SC, ausgewählt aus:
    Serin-Glyoxylat-Aminotransferase-Aktivität,
    Hydroxypyruvat-Reduktase-Aktivität,
    Malat-Thiokinase-Aktivität,
    Malyl-CoA-Lyase-Aktivität und
    Isocitrat-Lyase-Aktivität
    und/oder damit vergleichbare Aktivitäten realisiert ist. Unter einer Enzymaktivität eines am SC beteiligten Enzyms wird vorliegend die Fähigkeit zur Umsetzung eines Zwischenprodukts des SC als Substrat in ein anderes Zwischenprodukt des Zyklus als Produkt der Enzymreaktion verstanden. Unter Schlüsselenzymen des SC werden vorliegend Serin-Glyoxylat-Aminotransferase, Hydroxypyruvat-Reduktase, Malat-Thiokinase, Glycerol-Dehydrogenase Malyl-CoA-Lyase und Isocitrat-Lyase verstanden. Bevorzugt werden alle der vorgenannten Enzymaktivitäten exprimiert, bevorzugt werden alle am SC beteiligten Enzymaktivitäten in ausreichendem Umfang exprimiert. Bevorzugt wird mindestens eine, besonders bevorzugt mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten heterolog exprimiert.
  • In einer erfindungsgemäß bevorzugten Realisierung der Serin-Glyoxylat-Aminotransferase-Aktivität erlaubt dies die Umgehung der Glycin-Cleavage-System-Aktivität, welche im Zusammenhang mit der Verwendung von E. coli als Wirtszelle vorhanden ist. Sie nutzt gleichzeitig die Aminogruppe aus Serin zur Synthese von Glycin aus Glyoxylat. Die erfindungsgemäß bevorzugte Realisierung einer Hydroxypyruvat-Reduktase-Aktivität erlaubt die Umsetzung des Stoffwechselprodukts der Serin-Glyoxylat-Aminotransferase gemeinsam mit der Glycerat-Kinase im Embden-Meyerhof-Parnas-Weg, welcher in der erfindungsgemäßen Zelle bevorzugt realisiert ist. Die Regeneration von Glyoxylat erfolgt optional, alternativ oder bevorzugt zusätzlich, über eine homologe Phosphoenolpyrovat-Carboxylase-Aktivität, Tricarbonsäure- und Glyoxylat-Weg; dies ist vor allem im Zusammenhang mit der Verwendung von E. coli als Wirtszelle relevant. Die erfindungsgemäße bevorzugte Realisierung der Isocitrat-Lyase-Aktivität wird bevorzugt auch als Teil des Glyoxylat-Wegs auch an der Glyoxylat-Regenerierung im Serin-Weg wirken. Dies ist vor allem im Zusammenhang mit der Verwendung von E. coli als Wirtszelle relevant.
  • Bevorzugt stammt die Serin-Glyoxylat-Aminotransferase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Methylobacterium extorquens, besonders ist das Enzym Serin-Glyoxylat-Aminotransferase sgaA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 113. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 114 auf.
  • Bevorzugt stammt die Hydroxypyruvat-Reduktase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Methylobacterium extorquens, besonders ist das Enzym Hydroxypyruvat-Reduktase hprA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 115. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 116 auf.
  • Bevorzugt stammt die Serin-Malat-Thiokinase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Methylobacterium extorquens, besonders ist das Enzym Malat-Thiokinase mtkAB, oder ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist die Malat-Thiokinase aus 2 Untereinheiten aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 117 für Untereinheit mtkA und SEQ ID NO: 119 für Untereinheit mtkB. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 118 und 120 auf.
  • Bevorzugt stammt die Glycerol-Dehydrogenase Malyl-CoA-Lyase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Methylobacterium extorquens, besonders ist das Enzym Glycerol-Dehydrogenase Malyl-CoA-Lyase mclA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 121. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 122 auf.
  • Bevorzugt stammt die Isocitrat-Lyase-Aktivität aus E. coli, besonders ist das Enzym Isocitrat-Lyase aceA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 111. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 112 auf. Im Zusammenhang mit der Verwendung einer Wirtszelle vom Stamm E. coli, ist die Expression der Isocitrat-Lyase-Aktivität realisiert durch homologe Expression, bevorzugt durch homologe Überexpression.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, drei, vier, fünf oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 111, 113, 115, 117, 119 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 112, 114, 116, 118, 120 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt die Aktivität von Schlüsselenzymen des SC, ausgewählt aus: Serin-Glyoxylat-Aminotransferase-Aktivität, Hydroxypyruvat-Reduktase-Aktivität, Malat-Thiokinase-Aktivität, Glycerol-Dehydrogenase Malyl-CoA-Lyase-Aktivität und Isocitrat-Lyase-Aktivität, codieren.
  • 5 zeigt die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um eine Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase und die Schlüsselenzyme des Serin-Zyklus (Serin-Glyoxylat-Aminotransferase, Hydroxypyruvat-Reduktase, Malat-Thiokinase und Malyl-CoA-Lyase), beteiligt sind; zur Assimilation von Wasserstoff wird eine homologe Hydrogenase verwendet.
  • 6 zeigt die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um eine Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase und die Schlüsselenzyme des Serin-Zyklus (Serin-Glyoxylat-Aminotransferase, Hydroxypyruvat-Reduktase, Malat-Thiokinase und Malyl-CoA-Lyase), beteiligt sind; zur Assimilation von Wasserstoff wird eine rekombinante Hydrogenase verwendet.
  • Wird zur erfindungsgemäßen Realisierung einer rekombinanten Hydrogenase-Aktivität das pHG1-Megaplasmid aus Ralstonia eutropha in die erfindungsgemäße Zelle eingeführt, muss zur Unterdrückung des CBB dort zumindest eine Deletion von Genen für Schlüsselenzyme des CBB, welche auf dem kompletten pHG1-Megaplasmid vorhanden sind, erfolgt sein. Bevorzugt sind auf dem Megaplasmid die Gene für Phosphoribulose-Kinase cbbPp (SEQ ID NO: 35) und/oder Ribulosebisphoshat-Carboxylase cbbLp (SEQ ID NO: 37) und cbbSp (SEQ ID NO: 39) deletiert.
  • (2c) reduktiver Tricarbonsäurezyklus (RTCC)
  • Als weitere Alternative zum CBB steht der erfindungsgemäß auch der reduktive Tricarbonsäurezyklus (RTCC) zur Verfügung. Ebenso wie bei der erfindungsgemäßen Variante der Realisierung des SC kann vorteilhafterweise auf einen zusätzlichen Elektronenakzeptor neben CO2 gänzlich verzichtet werden; auf die gegebenenfalls nachteilige Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Aktivität des CBB wird in dieser alternativen Weiterbildung ebenfalls verzichtet.
  • Unter einer Enzymaktivität eines am RTCC beteiligten Enzyms wird vorliegend die Fähigkeit zur Umsetzung eines Zwischenprodukts des RTCC als Substrat in ein anderes Zwischenprodukt des Zyklus als Produkt der Enzymreaktion verstanden. Unter Schlüsselenzymen des RTCC werden vorliegend Citrat-Lyase, Oxoglutarat-Oxidoreduktase und Fumarat-Reduktase verstanden.
  • Die Erfindung sieht in einer alternativen Variante bevorzugt vor, dass zur CO2-Assimilation überwiegend oder ausschließlich der reduktive Tricarbonsäurezyklus (RTCC) realisiert wird, wobei in der erfindungsgemäßen Zelle alle am RTCC beteiligten Enzymaktivitäten in ausreichendem Umfang exprimiert werden. Dazu ist erfindungsgemäß primär vorgesehen, dass die Expression von Aktivitäten von Schlüsselenzymen des RTCC, ausgewählt aus:
    Citrat-Lyase-Aktivität,
    Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität und
    Fumarat-Reduktase-Aktivität
    und/oder damit vergleichbare Aktivitäten realisiert wird.
  • Bevorzugt werden alle der vorgenannten Enzymaktivitäten exprimiert, bevorzugt werden alle am RTCC beteiligten Enzymaktivitäten in ausreichendem Umfang exprimiert. Bevorzugt wird mindestens eine, besonders bevorzugt mindestens zwei dieser Enzymaktivitäten heterolog exprimiert.
  • Bevorzugt stammt die Citrat-Lyase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Chlorobium tepidum, besonders ist das Enzym Citrat-Lyase aclAB, oder ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist diese Citrat-Lyase aus 2 Untereinheiten aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 123 für Untereinheit aclA, und SEQ ID NO: 125 für Untereinheit acdB. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 124 und 126 auf.
  • Alternativ stammt die Citrat-Lyase-Aktivität aus E. coli, besonders das Enzym Citrat-Lyase citFED, oder ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist diese Citrat-Lyase aus 3 Untereinheiten aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 127 für Untereinheit citF, SEQ ID NO: 129 für Untereinheit citE und SEQ ID NO: 131 für Untereinheit citD. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 128, 130 und 132 auf. Im Zusammenhang mit der Verwendung einer Wirtszelle vom Stamm E. coli, ist die Expression einer aktiven Citrat-Lyase-Aktivität realisiert durch homologe Expression, bevorzugt durch homologe Überexpression eines, gegebenenfalls durch Spontanmutation, mutierten Allels der ursprünglich inaktiven Citrat-Lyase von E. coli.
  • Bevorzugt stammt die Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Hydrogenobacter thermophilus, besonders ist das Enzym Oxoglutarat-Oxidoreduktase korAB, oder ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist diese Oxoglutarat-Oxidoreduktase aus 2 Untereinheiten aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 133 für Untereinheit korA, und SEQ ID NO: 135 für Untereinheit korB. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 134 und 136 auf.
  • Bevorzugt stammt die Fumarat-Reduktase-Aktivität aus E. coli, besonders ist das Enzym Fumarat-Reduktase frdDCBA, oder ist daraus abgeleitet. Nach dem bisherigen Stand der Erkenntnis ist die Fumarat-Reduktase aus 4 Untereinheiten aufgebaut. Bevorzugte, diese Untereinheiten codierenden Nucleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 57 für Untereinheit frdD, SEQ ID NO: 55 für Untereinheit frdC, SEQ ID NO: 53 für Untereinheit frdB und SEQ ID NO: 51 für Untereinheit frdA. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 58, 56, 54 und 52 auf. Im Zusammenhang mit der Verwendung einer Wirtszelle vom Stamm E. coli, ist die Expression der Fumarat-Reduktase-Aktivität realisiert durch homologe Expression, bevorzugt durch homologe Überexpression.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 51, 53, 57, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 52, 54, 56, 58, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine Aktivitäten von Schlüsselenzymen des RTCC, ausgewählt aus: Citrat-Lyase-Aktivität, Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität und Fumarat-Reduktase-Aktivität, codieren.
  • In einer bevorzugten Variante ist zusätzlich die homologe und bevorzugt die heterologe Expression einer, bevorzugt reversiblen, Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase-Aktivität beziehungsweise Pyruvat-Synthase-Aktivität und/oder einer damit vergleichbaren Aktivität realisiert. Besonders im Zusammenhang mit der Verwendung von E. coli oder Pseudomonas putida als Wirtszelle ist in einer alternativen Variante vorgesehen, dass durch die homologe oder gegebenenfalls heterologe Expression von Enzymaktivität des Malat-Wegs, bevorzugt durch eine NAD-abhängige Malatenzym-Aktivität, vozugsweise das NAD-abhängige Malatenzym aus E. coli, das Zwischenprodukt Oxalacetat durch Decarboxylierung irreversibel in Pyruvat umgewandelt wird. Alternativ oder zusätzlich ist vorgesehen, das Zwischenprodukt Oxalacetat durch homologe oder gegebenenfalls heterologe Expression von Oxalacetat-Decarboxylase-Aktivität, vorzugsweise die Oxalacetat-Decarboxylase aus E. coli, umzuwandeln. Es ziegt sich, dass vorteilhafterweise sowohl Malatenzym als auch Oxalacetat-Decarboxylase jeweils allein die erforderliche Funktion der Bereitstellung von Pyruvat aus einem Metaboliten des RTCC (Malst oder Oxalacetat) leisten können.
  • Bevorzugt ist die homologe Überexpression mindestens einer der vorgenannten Enzym-Aktivitäten vorgesehen, um vorteilhafterweise zu verhindern, dass Nebenprodukte aus dem Tricarbonsäurezyklus anstelle von Lactat produziert werden. Im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Herstellung von Lactat/Milchsäure ist daher bevorzugt diese Maßnahme vorgesehen, um den irreversiblen Abfluss aus dem Tricarbonsäurezyklus zu realisieren. In Organismen, die natürlicherweise den RTCC als Fixierungsweg für CO2 einsetzen, ist dieser in der Regel verbunden mit einer Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase-Aktivität. Entgegen der Erwartung führt aber auch der mit Malatenzym-Aktivität oder Oxalacetat-Decarboxylase-Aktivität verbundene Decarboxylierungsschritt, der ebenfalls die Herstellung von Pyruvat aus einem Metaboliten des RTCC zur Folge hat, nicht zu einer Einschränkung der Einsetzbarkeit des RTCC als hocheffizienten Weg zur CO2-Fixierung.
  • 7 zeigt die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um die Schlüsselenzyme des reduktiven Tricarbonsäurezyklus (Citrat-Lyase, Oxoglutarat-Oxidoreduktase und Fumarat-Reduktase), beteiligt sind. Hierbei wird zur Assimilation von Wasserstoff eine homologe Hydrogenase verwendet.
  • 8 zeigt die Reaktionsschritte, die an der Umsetzung von CO2 und Wasserstoff in Lactat durch Escherichia coli, rekombinant erweitert um die Schlüsselenzyme des reduktiven Tricarbonsäurezyklus (Citrat-Lyase, Oxoglutarat-Oxidoreduktase und Fumarat-Reduktase), beteiligt sind. Hierbei wird Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor verwendet. Zur Assimilation von Wasserstoff wird eine rekombinante Hydrogenase verwendet.
  • Wird zur erfindungsgemäßen Realisierung einer rekombinanten Hydrogenase-Aktivität das pHG1-Megaplasmid aus Ralstonia eutropha in die erfindungsgemäße Zelle eingeführt, muss zur Unterdrückung des CBB dort zumindest eine Deletion von Genen für Schlüsselenzyme des CBB, welche auf dem kompletten pHG1-Megaplasmid vorhanden sind, erfolgt sein. Bevorzugt sind auf dem Megaplasmid die Gene für Phosphoribulose-Kinase cbbPp und/oder Ribulosebisphoshat-Carboxylase cbbLp und cbbSp deletiert.
  • (3) Lactat-Synthese
  • Zur Unterstützung des Lactat-Synthesestoffwechsels sieht die Erfindung bevorzugt weiter vor, den potentiellen Abbau von Lactat-Vorläufern zu unterdrücken und den Stofffluss in Richtung Lactat zu lenken. Dies wird bevorzugt realisiert durch Hemmung von gegebenenfalls in der erfindungsgemäßen Zelle vorhandenen Enzymaktivitäten konkurrierender Stoffwechselwege und/oder vergleichbarer Enzymaktivitäten, vorzugsweise durch Hemmung der Expression und/oder Deletion der diese Enzymaktivitäten codierenden Nucleotidsequenzen beziehungsweise Gene.
  • Besonders im Zusammenhang mit der Verwendung von E. coli oder Pseudomonas putida als Wirtszelle ist zur Herstellung von Lactat/Milchsäure weiter vorgesehen, Acetat-umsetzende Stoffwechselwege zu unterdrücken, um die Bildung von Acetat als unerwünschtem Nebenprodukt zu unterdrücken. Im Zusammenhang mit der Realisierung des CBB wird dazu bevorzugt mindestens ein Enzym, bevorzugt alle Enzyme, ausgewählt aus:
    Acetat-Kinase A-/Propionat-Kinase 2-Aktivität
    Phosphat-Acetyl-Transferase-Aktivität,
    Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität,
    Pyruvat-Formiat-Lyase I-Aktivität,
    Acetaldehyd-CoA-Dehydrogenase-Aktivität,
    Fumarat-Reduktase-Aktivität,
    Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität,
    Succinat-Dehydrogenase-Aktivität
    gehemmt beziehungsweise deletiert.
  • Im Zusammenhang mit der Realisierung des SC oder RTCC wird dazu mindestens ein Enzym, bevorzugt alle Enzyme, ausgewählt aus:
    Acetat-Kinase A-/Propionat-Kinase 2-Aktivität
    Phosphat-Acetyl-Transferase-Aktivität,
    Pyruvat-Formiat-Lyase I-Aktivität,
    Acetaldehyd-CoA-Dehydrogenase-Aktivität,
    Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität
    gehemmt beziehungsweise deletiert.
  • Besonders in Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli Zelle sieht die Erfindung dazu bevorzugt vor:
    die Hemmung der Phosphat-Acetyltransferase-Aktivität bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für pta, dargestellt durch die SEQ ID NO: 41 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 42, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
    gegebenenfalls (bei CBB) die Hemmung der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für ppc, dargestellt durch die SEQ ID NO: 43 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 44, wobei die Hemmung der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität ppc in diesem Zusammenhang weniger bevorzugt ist.
  • Besonders in Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli Zelle im anaeroben Prozess sieht die Erfindung dazu alternativ oder bevorzugt zusätzlich vor:
    die Hemmung der Pyruvat-Formiat-Lyase I-Aktivität bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für pflB, dargestellt durch die SEQ ID NO: 45 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 46, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
    die Hemmung der Acetat-Kinase A/Propionat-Kinase 2-Aktivität bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für ackA, dargestellt durch die SEQ ID NO: 47 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 48, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
    die Hemmung der Acetaldehyd-CoA-Dehydrogenase-Aktivität bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für adhE, dargestellt durch die SEQ ID NO: 49 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 50, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
    gegebenenfalls (bei CBB) die Hemmung der anaeroben Fumarat-Reduktase-Aktivität bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für frdABCD, dargestellt durch die SEQ ID NO: 51, 53, 55 und 57 oder codierend für die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 52, 54, 56 und 58, besonders bevorzugt von frdA und/oder frdB.
  • Besonders in Verbindung mit der Verwendung einer rekombinanten E. coli Zelle im aeroben Prozess sieht die Erfindung dazu alternativ bevorzugt vor:
    die Hemmung der Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für aceEF/lpdA, dargestellt durch die SEQ ID NO: 59 und 61, sowie 63 oder codierend für die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 60 und 62, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
    die Hemmung der Acetat-Kinase A/Propionat-Kinase 2-Aktivität bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für ackA und alternativ oder bevorzugt zusätzlich die Hemmung der Acetaldehyd-CoA-Dehydrogenase-Aktivität bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für adhE und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
    die Hemmung der Succinat-Dehydrogenase-Aktivität bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für sdhABCD, dargestellt durch die SEQ ID NO: 65, 67, 69 und 71 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 66, 68, 70 und 72, besonders bevorzugt von sdhA und/oder sdhB.
  • Zur Herstellung von enantiomerenreinem D-Lactat sieht die Erfindung bevorzugt vor, dass die Expression einer D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität und/oder einer damit vergleichbaren Aktivität realisiert ist. Bevorzugt stammt die D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität aus E. coli, besonders ist es das Enzym Lactat-Dehydrogenase ldhA, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 73. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 74 auf.
  • Alternativ oder bevorzugt zusätzlich stammt die D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität aus Lactobacillus plantarum, besonders ist es das Enzym Lactat-Dehydrogenase ldhD, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 185. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 186 auf.
  • Im Zusammenhang mit der Verwendung einer Wirtszelle vom Stamm E. coli, ist die Expression der D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität realisiert durch homologe Expression, bevorzugt durch homologe Überexpression. Im Zusammenhang mit einer aeroben Prozessführung ist die heterologe Expression oder homologe Überexpression einer Lactat-Dehydrogenase-Aktivität obligatorisch.
  • Weiter ist zur Herstellung von enantiomerenreinem D-Lactat bevorzugt vorgesehen, dass die Expression einer D-Lactat-Transporter-Aktivität und/oder einer damit vergleichbaren Aktivität realisiert ist. Bevorzugt stammt die D-Lactat-Transporter-Aktivität aus E. coli, besonders ist es der Transporter lldP beziehungsweise lctP, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 165. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 166 auf.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens ein, oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 73, 165, 185 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 74, 166, 186 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität und/oder D-Lactat-Transporter-Aktivität codieren.
  • Vor allem im Zusammenhang mit der Verwendung einer E. coli Zelle zur Herstellung von D-Lactat sieht die Erfindung dazu zusätzlich vor:
    die Hemmung der homologen L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität, bevorzugt durch Deletion der Gene für lldD, dargestellt durch die SEQ ID NO: 75 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 76.
  • Vor allem im Zusammenhang mit der Verwendung einer Lactobacillus Zelle zur Herstellung von D-Lactat im anaeroben Prozess sieht die Erfindung dazu zusätzlich vor:
    die Hemmung der homologen L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität, bevorzugt durch Deletion des Gens für ldhL1, dargestellt durch die SEQ ID NO: 167 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 168, und alternativ und bevorzugt zusätzlich durch Deletion des Gens für ldhL2, dargestellt durch die SEQ ID NO: 169 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 170, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
    die Hemmung der homologen Lactat-Racemase-Aktivität, bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für larABC1C2E glpF1, dargestellt durch die SEQ ID NO: 173, 175, 177, 179 und 181 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 174, 176, 178, 180 und 182.
  • Zur Herstellung von enantiomerenreinem L-Lactat sieht die Erfindung bevorzugt vor, dass die Expression einer L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität und/oder einer damit vergleichbaren Aktivität realisiert ist. Bevorzugt stammt die L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität aus E. coli, besonders ist es das Enzym L-Lactat:Chinon-Oxidoreduktase (L-Lactat-Dehydrogenase) lctD beziehungsweise lldD, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 75. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 76 auf. Im Zusammenhang mit der Verwendung einer Wirtszelle vom Stamm E. coli, ist die homologe Expression der L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität bevorzugt realisiert durch homologe Überexpression der L-Lactat: Chinon-Oxidoreduktase (L-Lactat-Dehydrogenase) lctD beziehungsweise lldD.
  • Alternativ oder bevorzugt zusätzlich stammt die L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Lactobacillus plantarum. Bevorzugt ist es das Enzym Lactat-Dehydrogenase ldhL1 oder es ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 167. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 168 auf. Alternativ oder zusätzlich ist es das Enzym Lactat-Dehydrogenase ldhL2 oder es ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 169. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 170 auf.
  • Weiter ist zur Herstellung von enantiomerenreinem L-Lactat bevorzugt vorgesehen, dass die Expression einer L-Lactat-Transporter-Aktivität und/oder einer damit vergleichbaren Aktivität realisiert ist. Bevorzugt stammt die L-Lactat-Transporter-Aktivität aus dem Mikroorganismus Lactobacillus plantarum, besonders ist es der Transporter lctP, oder ist daraus abgeleitet. Eine bevorzugte, diese Aktivität codierende Nucleotidsequenz ist SEQ ID NO: 171. Das Enzymprotein weist also bevorzugt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 172 auf.
  • Die Erfindung betrifft somit bevorzugt eine Zelle, welche mindestens ein, bevorzugt mindestens zwei, oder bevorzugt alle Nucleinsäuremoleküle enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Nucleinsäuremolekülen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 167, 171, 75 enthalten oder daraus bestehen;
    • b) Nucleinsäuremolekülen, die für Aminosäuremoleküle, die die Sequenzen SEQ ID NO: 168, 172, 76 enthalten oder daraus bestehen, codieren; und
    • c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter a) und b) beschriebenen Nucleinsäuremolekülen zumindest 50%, bevorzugt zumindest, 60%, 70%, 80%, besonders bevorzugt zumindest 90% oder mehr Homologie aufweisen und bevorzugt eine L-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität und/oder eine L-Lactat-Transporter-Aktivität codieren.
  • Vor allem im Zusammenhang mit der Verwendung einer E. coli Zelle zur Herstellung von L-Lactat im anaeroben Prozess sieht die Erfindung dazu zusätzlich vor:
    die Hemmung der homologen fermentativen D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität, bevorzugt durch Deletion der Gene für ldhA, dargestellt durch die SEQ ID NO: 73 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 74.
  • Vor allem im Zusammenhang mit der Verwendung einer E. coli Zelle zur Herstellung von L-Lactat im aeroben Prozess sieht die Erfindung dazu zusätzlich vor:
    die Hemmung der homologen D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität, bevorzugt durch Deletion der Gene für dld, dargestellt durch die SEQ ID NO: 187 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 188.
  • Vor allem im Zusammenhang mit der Verwendung einer Lactobacillus Zelle zur Herstellung von L-Lactat sieht die Erfindung dazu zusätzlich vor:
    die Hemmung der homologen D-Lactat-Dehydrogenase-Aktivität, bevorzugt durch Deletion des Gens für ldhD, dargestellt durch die SEQ ID NO: 185 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 186, und alternativ oder bevorzugt zusätzlich
    die Hemmung der homologen Lactat-Racemase-Aktivität, bevorzugt durch Deletion mindestens eines der Gene für larABC1C2E glpF1, dargestellt durch die SEQ ID NO: 173, 175, 177, 179 und 181 oder codierend für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 174, 176, 178, 180 und 182.
  • Die vorstehend charakterisierten erfindungsgemäßen rekombinanten Mikroorganismen beziehungsweise transgenen biologischen Zellen sind besonders geeignet für die biotechnologische Synthese von Lactat/Milchsäure und anderen Carbonsäuren oder kurzkettigen Fettsäuren. Das sind erfindungsgemäß C2- bis C6-Körper, bevorzugt C3 bis C6-Körper. Bevorzugte Stoffwechselendprodukte, die sich mittels der erfindungsgemäßen Zellen erzeugen lassen, sind kurzkettige Carbonsäuren, vor allem Mono- und Dicarbonsäuren, bevorzugt D-Lactat und L-Lactat, Acetat/Essigsäure, Formiat/Ameisensäure und Succinat/Bernsteinsäure, sowie ein- und mehrwertige Alkohole, bevorzugt Ethanol. Sie dienen als Ausgangssubstanzen für die weitere organische Synthese, zum Beispiel zur Herstellung von Kunststoffen (z. B. Polylactate). Die erfindungsgemäß herstellbaren Produkte können auch als Energieträger eingesetzt werden, vor allem als Treibstoffe/Kraftstoffe sowie zu deren Herstellung.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von organischen Kohlenstoffverbindungen, und zwar vor allem C2- bis C6-Körper, als Produkt aus CO2 als Substrat und einem anorganischen Elektronendonor wie Wasserstoff, wobei in Schritt (a) eine erfindungsgemäße Zelle bereitgestellt wird, in Schritt (b) die Zelle mit dem Substrat und dem Elektronendonor in Kontakt gebracht wird und in Schritt (c) die Zelle unter Bedingungen kultiviert wird, unter denen die Substrate umgesetzt und die Zelle die organischen Kohlenstoffverbindundungen bildet. In einem weiteren Schritt (d) wird das Produkt aus dem Kulturmedium und/oder der Zelle isoliert und gegebenenfalls aufgereinigt. Üblicherweise wird das intrazellulär gebildete Produkt aus der Zelle in das Extrazellulärmedium abgegeben.
  • Die Kultivierung findet bevorzugt in vorzugsweise flüssigem Kulturmedium statt. Es ist bevorzugt vorgesehen, die Zelle dabei unter anaeroben Bedingungen zu kultivieren. Je nach Wirtsorganismus ist es in einer alternativen Variante auch vorgesehen, die Zelle unter aeroben Bedingungen zu kultivieren. Anhand der vorstehenden Beschreibung der Erfindung kann der Fachmann die jeweils günstige Enzymausstattung wählen.
  • Bevorzugt ist der Elektronendonor elementarer Wasserstoff, bevorzugt gasförmiger Wasserstoff. Bevorzugte alternative Elektronendonoren sind ausgewählt aus Schwefelwasserstoff, elementarem Schwefel, Sulfit, Thiosulfat, Ammonium, Nitrit und Metallen in reduzierter Form.
  • Als Elektronenakzeptor wird neben CO2, alternativ oder bevorzugt zusätzlich, mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus O2, Nitrat, Nitrit, Sulfat, Sulfit, Thiosulfat und Fumarat, verwendet.
  • Zu dieser Beschreibung gehört ein Sequenzprotokoll; dieses enthält Angaben zu nachstehend aufgelisteten Genen und damit codierten Proteinen:
    Figure DE102007047206B4_0002
    Figure DE102007047206B4_0003
    Figure DE102007047206B4_0004
    Figure DE102007047206B4_0005
    Figure DE102007047206B4_0006
    Figure DE102007047206B4_0007
    Figure DE102007047206B4_0008
    Figure DE102007047206B4_0009
    Figure DE102007047206B4_0010
    Figure DE102007047206B4_0011
    Figure DE102007047206B4_0012
    Figure DE102007047206B4_0013
    Figure DE102007047206B4_0014
    Figure DE102007047206B4_0015
    Figure DE102007047206B4_0016
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  • Ausführungsbeispiel: Synthese von Milchsäure aus CO2 und H2 in einem rekombinanten E. coli-Stamm
  • Ausgangspunkt für die Transformation ist der E. coli-Stamm K12. Zur Realisierung der Hydrogenase-Aktivität, des Serin-Zyklus und der Lactat-Synthese wurden Expressionskassetten für: NAD-reduzierende cytosolische Hydrogenase-Aktivität aus Ralstonia, Strukturgene hoxFUYH und Reifungsgene hypC1, hypD1, hypE1 und hypABF, sowie Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität aus Methylobacterium, speziell enthaltend Nucleinsäuremoleküle mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 und 107, in Expressionsvektoren pUC oder pPCU18 oder ähnlichen cloniert/ligiert. Die Ligation der Plasmid-DNA erfolgt in an sich bekannter Weise. Beispielsweise wird der Vektor durch Hydrolyse mit Restriktionsendonuclease geöffnet und die entsprechenden DNA-Sequenzen inseriert. Die Ligation erfolgt beispielsweise durch Kassettenmutagenese.
  • Die Transformation transformationskompetenter E. coli-Zellen sowie die Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen erfolgt vorzugsweise nach dem Protokoll von Hanahan, 1985 (Hanahan, D. in Glover, D. M. (ed.) DNA Cloning: „A Practical Approach” IRL Press Oxford 109–135).
  • Zur Herstellung der transformationskompetenten E. coli-Zellen werden E. coli K12-Stämme, beispielsweise TH1, TH2, TH5, TH5α, C600, Top 10, XL1-Blue und deren Derivate eingesetzt. Aus einer Vorabkultur aus einer Dauerkultur wird eine frische Zellkolonie in 5 ml SOB-Medium suspendiert und unter Schütteln bei 37°C bis zu einer Zelldichte von 1 bis 2 × 108/ml kultiviert. Anschließend wird 1:1 mit 40% Glycerol/60% SOB-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Trypton-mmol/l NaCl, 2,5 mmol/l KCl, nach Autoklavieren auf 10 mmol/l MgCl2 und MgSO4 einstellen) verdünnt und auf Eis gekühlt. Aus der Vorabkultur wird ein Zellausstrich auf eine LM-Platte angelegt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Daraus werden jeweils 5 Kolonien mit einem Durchmesser von etwa 0,5 bis 1 mm abgeimpft und in 50 ml SOB-Medium angeimpft; die Zellen werden für etwa 3 Stunden bis zu einer Dichte von 4 bis 7 × 107/ml bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Die Zellen werden auf Eis gekühlt und in Zentrifugenröhrchen überführt und bei 2500 rpm bei 4°C für 5 Minuten sedimentiert. Das Sediment wird mit 17 ml LM-Agar-FSB-Puffer resuspendiert und in Eis inkubiert. Der Vorgang wird gegebenenfalls wiederholt. Schließlich wird das Sediment in 5 ml LM-Agar-FSB-Puffer resuspendiert und 5 Minuten in Eis inkubiert. Dann werden 140 μl DMSO zugegeben, 5 Minuten in Eis inkubiert, nochmals 140 μl DMSO zugegeben, und 5 Minuten in Eis inkubiert. Die Zellsuspension kann beispielsweise in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen nach langsamen Tieffrieren bei –70°C mehrere Monate aufbewahrt werden.
  • Die Ligation wird in einem molaren Verhältnis von DNA zu Vektor-DNA von 1:1 bis 1:3 durchgeführt. Der Ligationsansatz: 4 μl steriles Wasser, 2 μl 5 × Ligasepuffer (250 mmol/l Tris-HCl, pH 7,6, 50 mmol/l MgCl2, 5 mmol/l ATP, 5 mmol/l DTT, 25% PEE (w/v)), 1 ml amplifizierte DNA, 2 μl Vektor-DNA (mit 3'-T-Überhang in 1 μl T4-Ligase, wird in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß vorgelegt und nach Vermischen über Nacht bei 14°C inkubiert. Jeweils 1–5 μl des Ansatzes werden zur Transformation von transformationskompetenten E. coli-Zellen eingesetzt; gegebenenfalls kann der Ligationsansatz bei –20°C gelagert werden.
  • Zur Transformation der kompetenten E. coli-Zellen werden jeweils 30 μl der zu tranformierenden DNA vorgelegt und bei Kühlung in Eis je 200 μl der Zellsuspension zugegeben und etwa 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wird für 90 Minuten bei 42°C ohne Schütteln inkubiert und danach für 2 Minuten auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 800 μl SOC-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Trypton-mmol/l NaCl, 2,5 mmol/l KCl, nach Autoklavieren auf 10 mmol/l MgCl2 und MgSO4 einstellen und zusätzlich auf 20 mmol/l Glucolse einstellen) wird bei 37°C bei etwa 200 RPM für etwa 1 Stunde inkubiert. Je 200 μl einer geeigneten Verdünnung des Transformationsansatzes wird auf LB-AMP-Platten ausplattiert. Die Inkubation erfolgt bei 37°C über Nacht.
  • Zur Selektion der rekombinanten Zellen werden Selektionsplatten verwendet, wobei jeweils 100 μl einer Mischung aus 10 μl 100 mmol/l IPTG, 40 μl 3% X-Gal und 50 μl SOC-Medium auf einer LB-AMP-Agarplatte ausplattiert werden und diese für etwa 1 Stunde bei 37°C inkubiert werden. Nach Inkubation werden jeweils 200 μl der Zellsuspension auf der Selektionsplatte ausplattiert. Anhand des α-Komplementationstests lassen sich die Kolonien, die kein rekombinantes Plasmid enthalten, aufgrund der Blaufärbung von den rekombinanten Clonen, welche keine Färbung aufweisen, leicht unterscheiden. Die stabile heterlologe Expression in den so erhältlichen rekombinanten E. coli Zellen wird in an sich bekannter Weise verifiziert.
  • Die erhaltenen rekombinanten E. coli Zellen werden nach Inokulation in einem 50 L-Fermenter mit Kulturmedium angesetzt und bei 25 bis 40°C kultiviert. Die Zugabe des C3-C6-Substrates, hier Glucose oder alternative Glycerol, erfolgt in das Kulturmedium.
  • In verschiedenen Ansätzen wird die Kultur unter Einleitung von gasförmigem CO2 und H2 im Reaktor kultiviert.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (15)

  1. Transgene mikrobielle Zelle, enthaltend in exprimierbarer Form: (1) mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend für Hydrogenase-Aktivität; und (2) Nucleinsäuremolekül, codierend für Enzymaktivität eines Kohlenstoff fixierenden Stoffwechselwegs, und zwar Citrat-Lyase-Aktivität und Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität, wobei mindestens ein Enzym davon heterolog exprimiert wird.
  2. Zelle nach Anspruch 1, enthaltend: (3) mindestens ein heterologes Nucleinsäuremolekül mit einer Nucleotidsequenz, welche für mindestens eine Enzymaktivität, ausgewählt aus: (3)(a) Lactat-Dehydrogenase, (3)(b) Lactat-Oxidoreduktase, (3)(c) mindestens eine Enzymaktivität des Methylglyoxalwegs, und (3)(d) Aldehyd-Dehydrogenase
  3. Zelle nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend Nucleinsäuremolekül, codierend für Fumarat-Reduktase-Aktivität.
  4. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, enthaltend Nucleinsäuremolekül, codierend für Formyl-Tetrahydrofolat Ligase-Aktivität.
  5. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, enthaltend Nucleinsäuremolekül, codierend für Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität und zusätzlich mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend für Enzymaktivität des Glycin-Cleavage-Systems.
  6. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, enthaltend Nucleinsäuremolekül, codierend für Formyl-Tetrahydrofolat-Ligase-Aktivität und zusätzlich mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend für Enzymaktivität, ausgewählt aus: Serin-Glyoxylat-Aminotransferase-Aktivität, Hydroxypyruvat-Reduktase-Aktivität, Malat-Thiokinase-Aktivität, Malyl-CoA-Lyase-Aktivität und Isocitrat-Lyase-Aktivität.
  7. Zelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, enthaltend zusätzlich mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend für Formiat-Dehydrogenase-Aktivität.
  8. Zelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, enthaltend zusätzlich mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend für Lactat-Dehydrogenase-Aktivität.
  9. Zelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine Nucleinsäuremolekül, codierend für Hydrogenase-Aktivität, ausgewählt ist aus: (1)(a) membranständiger Hydrogenase-Aktivität aus dem Mikroorganismus E. coli, ausgewählt aus Hydrogenase hyaABC und Hydrogenase hybOCAB; und (1)(b) cytoplasmatischer NAD-reduzierender Hydrogenase-Aktivität aus dem Mikroorganismus Ralstonia eutropha mit den Strukturgenen hoxFUYH.
  10. Zelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, ausgewählt aus: Bakterien der Gattungen Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus und synthetischen Mikroorganismen, Membranvesikeln, Membrankompartimenten und Teilen oder Fragmenten davon.
  11. Expressionskassette zur Transformation einer Wirtszelle, enthaltend: (1) mindestens ein Nucleinsäuremolekül, codierend für Hydrogenase-Aktivität; und (2) Nucleinsäuremolekül, codierend für Citrat-Lyase-Aktivität und Oxoglutarat-Oxidoreduktase-Aktivität, wobei mindestens ein Enzym davon heterolog ist.
  12. Vektor, enthaltend die Expressionskassette nach Anspruch 11, der geeignet ist, die Expression der genannten Enzymaktivitäten in einer Wirtszelle zu vermitteln.
  13. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von C2-C6-Körpern als Produkt aus Kohlenstoffdioxid als Substrat und unter Assimilierung von Wasserstoff, enthaltend die Schritte: a) Bereitstellen einer in einem der Ansprüche 1 bis 10 definierten transgenen biologischen Zelle; b) Inkontaktbringen der Zelle mit dem Substrat; c) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, unter denen Substrat umgesetzt und das Produkt gebildet wird; d) Isolieren des Produkts.
  14. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 10 definierten transgenen biologischen Zelle zur biotechnologischen Herstellung von Lactat oder Milchsäure aus Kohlenstoffdioxid und Wasserstoff.
  15. Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 10 definierten transgenen biologischen Zelle zur biotechnologischen Herstellung von Alkohol aus Kohlenstoffdioxid und Wasserstoff.
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