ES2639413T3 - Procedimiento y composiciones ecológicas para la producción de productos químicos de poli(5HV) y de 5 carbonos - Google Patents

Procedimiento y composiciones ecológicas para la producción de productos químicos de poli(5HV) y de 5 carbonos Download PDF

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Abstract

Un organismo no humano recombinante modificado por ingeniería genética para convertir 5-aminopentanoato en un polímero de polihidroxialcanoato (PHA) o en un copolímero del mismo que comprende 5-hidroxivalerato, en el que la ruta para convertir el 5-aminopentanoato en PHA que comprende 5-hidroxivalerato comprende 5- aminopentanoato transaminasa (δ-aminovalerato transaminasa), EC 2.6.1.48; succinato semialdehído reductasa (también conocida como glutarato semialdehído reductasa), EC 1.1.1.61; CoA-transferasa, EC 2.8.3.14 y EC 2.8.3.n o Acil-CoA sintetasa, EC 6.2.1.3; y PHA sintasa, EC 2.3.1.n; y en el que el organismo recombinante produce el PHA que comprende 5-hidroxivalerato a partir de lisina, en el que el organismo recombinante está modificado por ingeniería genética para expresar al menos uno o más genes que codifican una o más enzimas para la producción del PHA que comprende 5-hidroxivalerato a partir de lisina, en el que las enzimas se seleccionan del grupo que consiste en: lisina 2-monooxigenasa, EC 1.13.12.2; 5- aminopentanamidasa (δ-aminovaleramidasa), EC 3.5.1.30; 5-aminopentanoato transaminasa (δ-aminovalerato transaminasa), EC 2.6.1.48; succinato semialdehído reductasa (también conocida como glutarato semialdehído reductasa), EC 1.1.1.61; CoA-transferasa, EC 2.8.3.14 y EC 2.8.3.n; Acil-CoA sintetasa, EC 6.2.1.3; PHA sintasa, EC 2.3.1.n, en el que el 5-aminopentanoato se convierte en 5-hidroxivalerato, y en el que el 5-hidroxivalerato se convierte en un polímero de PHA o en un copolímero del mismo por medio del organismo recombinante.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento y composiciones ecologicas para la produccion de productos qmmicos de poli(5HV) y de 5 carbonos
Descripcion
Campo de la invencion
La invencion se refiere, en lmeas generales, a organismos transgenicos no humanos que producen polihidroxialcanoatos y copolfmeros de los mismos que contienen 5-hidroxivalerato.
Antecedentes de la invencion
Los polihidroxialcanoatos (PHA) son plasticos biodegradables que pueden utilizarse para fabricar, sin limitacion, peKculas (por ejemplo, pelfculas para envasado, pelfculas agncolas, pelfculas cobertoras), soportes (tees) de golf, tapas y cierres, soportes y estacas agncolas, recubrimientos de papel y carton (por ejemplo, para tazas, platos, cajas, etc.), productos termoformados (por ejemplo, bandejas, recipientes, tarros de yogur, macetas, cuencos, molduras, etc.), carcasas (por ejemplo, para artfculos electronicos), bolsas (por ejemplo, bolsas de basura, bolsas para la compra, bolsas para alimentos, bolsas para abono, etc.), artfculos de higiene (por ejemplo, panales, productos de higiene femenina, productos para la incontinencia, toallitas desechables, etc.) y recubrimientos para productos granulados (por ejemplo, fertilizantes, herbicidas, pesticidas, semillas, etc., granulados).
Los PHA tambien se han utilizado para desarrollar dispositivos biomedicos, tales como suturas, dispositivos reparadores, parches reparadores, eslingas, parches cardiovasculares, pernos ortopedicos, barreras de adhesion, estents, dispositivos guiados de reparacion/regeneracion de tejido, dispositivos de reparacion de cartflago articular, grnas nerviosas, dispositivos de reparacion de tendones, armazones de medula osea y apositos.
Los polihidroxialcanoatos pueden producirse mediante un proceso de fermentacion. Los procedimientos de fermentacion existentes para la produccion de polihidroxialcanoatos utilizan microrganismos de tipo silvestre o transgenicos cultivados en sustratos espedficos para la produccion de la composicion polimerica de PHA deseada. En muchos casos los polfmeros de interes son copolfmeros del (D)-isomero de 3-hidroxibutirato copolimerizado con uno de otros 3, 4 o 5-hidroxiacidos. Estos copolfmeros se producen como inclusiones granulares dentro de las celulas y son copolfmeros aleatorios.
El documento US 2004/033572 notifica que las composiciones polimericas de PHA producidas utilizando sistemas biologicos, incluyen monomeros tales como 3-hidroxibutirato, 3-hidroxipropionato, 2-hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxivalerato y 5-hidroxivalerato. Adicionalmente notifica que estas composiciones de PHA pueden extenderse para incorporar monomeros adicionales que incluyen, por ejemplo, 3-hidroxihexanoato, 4- hidroxihexanoato, 6-hidroxihexanoato u otros 3-hidroxiacidos de cadena mas larga que contiene siete o mas atomos de carbono. Esto puede realizarse tomando productores de PHA naturales y mutando a traves de mutagenesis qrnmica o basada en transposones, para eliminar o inactivar genes que codifican actividades no deseables. Como alternativa, las cepas pueden modificarse por ingeniena genetica para expresar solamente aquellas enzimas necesarias para la produccion de la composicion polimerica deseada.
Desde el punto de vista industrial, el copolfmero de poli(3-hidroxibutirato-co-5-hidroxivalerato) (PHB5HV) y el homopolfmero de poli(5-hidroxivalerato) (P5HV) son utiles como materiales y plasticos y tienen la ventaja de ser materiales biodegradables y bioabsorbibles. Hasta ahora, estos materiales se habfan producido suministrando sustratos de 5 atomos de carbono derivados de petroleo, tales como el acido 5-hidroxivalerico (5HV) o el 1,5- pentanodiol, a un microorganismo con capacidad de metabolizar estos sustratos para dar 5HV-coenzima A monomerica activada y polimerizarlos por la accion de una PHA polimerasa para formar los polfmeros PHB5HV o P5HV, los polfmeros PHB5HV y P5HV producidos por estos procedimientos se obtienen, solo parcialmente, de fuentes renovables y costosas debido al alto coste de los sustratos de 5 atomos de carbono derivados de petroleo. Es muy deseable utilizar, como materia prima para la produccion de polfmeros PHB5HV y P5HV, sustratos de carbono renovables no derivados de petroleo, tanto a un coste mas bajo como para proporcionar materiales que se obtengan completamente de fuentes renovables. Tambien sena deseable desarrollar procedimientos para la produccion de estos polfmeros que reduzcan la produccion de gases de invernadero. Las fuentes renovables adecuadas incluyen materias primas de hidratos de carbono disponibles de la agricultura, incluyendo una o mas materias primas seleccionadas de: almidon, sacarosa, glucosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa y materias primas de aminoacidos, entre los que se incluyen lisina y prolina.
Yamanishi y col, 2007, FEBS J., 274(9): 2262-73 describen la reconstruccion de la ruta de degradacion de lisina de Pseudomonas aeruginosa, e identificaron una supuesta 5-aminovalerato aminotransferasa (EC 2.6.1.48) y una supuesta glutarato semialdetndo deshidrogenasa (EC 1.2.1.20).
El documento US 2006/117401 describe un procedimiento para la produccion de aminoacidos en organismos transgenicos, en particular L-metionina, en organismos transgenicos, en el que el procedimiento comprende las etapas de: a) introducir una secuencia de acido nucleico que codifique una protema degradadora de treonina y/o una protema degradadora de lisina o b) introducir una secuencia de acido nucleico que aumente la degradacion de
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treonina y/o la degradacion de lisina en los organismos transgenicos y c) expresar una secuencia de acido nucleico mencionada en (a) o (b), en el organismo transgenico.
Es un objeto de la invencion proporcionar organismos no humanos recombinantes y procedimientos mediante los cuales puedan introducirse genes en productores de polihidroxialcanoato de tipo silvestre o modificados por ingeniena genetica, para crear nuevas cepas que sinteticen monomeros de 5-hidroxivalerato que se producen a partir de sustratos no derivados de petroleo.
Un objeto adicional de la invencion es proporcionar tecnicas y procedimientos para modificar de manera estable por ingeniena genetica, organismos no humanos recombinantes que sinteticen PHA que contengan 5-hidroxivalerato bien como unico constituyente o como un co-monomero.
Sumario de la invencion
BiopoKmeros de PHA que contienen 5HV
Se proporcionan hospedadores recombinantes para la produccion de polihidroxialcanoatos (PHA) que comprenden monomeros de 5-hidroxivalerato (5HV) y procedimientos de produccion de los PHA que comprenden monomeros de 5HV a partir de sustratos de carbono renovables. En el presente documento tambien se describen determinados hospedadores recombinantes que producen productos qmmicos de 5 atomos de carbono, tales como 5- aminopentanoato (5AP), 5HV, glutarato y 1,5-pentanodiol (PDO).
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invencion proporciona un organismo no humano recombinante modificado por ingeniena genetica, para convertir 5-aminopentanoato en un polfmero de polihidroxialcanoato (PHA) o en un copolfmero del mismo que comprende 5-hidroxivalerato, como se define adicionalmente en la reivindicacion 1. Mas preferentemente, el organismo no humano recombinante se define mediante cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
En un segundo aspecto, la presente invencion proporciona un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, para la produccion de polfmeros de polihidroxialcanoato (PHA) basados en 5 atomos de carbono o sus copolfmeros, comprendiendo el procedimiento proporcionar lisina, u otra materia prima de carbono renovable, para modificar por ingeniena genetica celulas de acuerdo con el primer aspecto de la presente invencion. Opcionalmente, la materia prima de carbono renovable se selecciona entre almidon, sacarosa, glucosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa y arabinosa, o combinaciones de las mismas; y/o el polihidroxialcanoato comprende 5-hidroxivalerato, por ejemplo, poli(5-hidroxivalerato), poli(3-hidroxipropionato-co-5Hv), poli(3-hidroxibutirato-co-5HV) o poli(4-hidroxibutirato-co- 5HV). Opcionalmente, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de recuperar el polihidroxialcanoato, el polfmero o copolfmero del mismo, por ejemplo, mediante tratamiento acuoso o extraccion con disolventes.
Una realizacion proporciona un hospedador no humano recombinante, modificado por ingeniena genetica, para convertir 5-aminopentanoato en un polfmero de polihidroxialcanoato (PHA) o su copolfmero que comprende 5- hidroxivalerato como se define en la reivindicacion 1, y la expresion de genes que codifican una polihidroxialcanoato (PHA) sintasa y una 5-hidroxivalerato-CoA (5HVCoA) transferasa o 5HV-CoA sintesasa y al menos un transgen que codifica una enzima heterologa que interviene en las rutas catabolicas de lisina en la que el hospedador produce un polfmero de PHA que contiene monomeros de 5HV cuando al organismo se le proporciona un sustrato de carbono renovable seleccionado de: lisina, almidon, sacarosa, glucosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa o combinaciones de los mismos y el nivel de monomero de 5HV producido es mayor que en ausencia de expresion de dicho transgen o transgenes. Un hospedador ejemplar expresa uno o mas genes que codifican lisina 2- monooxigenasa, 5-aminopentanamidasa, 5-aminopentanoato transaminasa, glutarato semialdetndo reductasa, 5- hidroxivalerato CoA-transferasa y polihidroxialcanoato sintasa, para la produccion de un polfmero de PHA que contiene 5 monomeros de 5HV. Preferentemente, el hospedador tiene eliminaciones o mutaciones en genes que codifican glutarato semialdetndo deshidrogenasa y/o genes que codifican exportador de lisina. Los hospedadores particularmente adecuados tambien tienen la capacidad de sobreproducir lisina y son resistentes a analogos toxicos de lisina, como S-(2-aminoetil) cistema.
En una realizacion adicional uno o mas de los genes que codifican PHA sintasa, 5HV-CoA transferasa o 5HV-CoA sintetasa tambien se expresan a partir de un transgen.
En otra realizacion al organismo no humano recombinante se le suministra lisina en combinacion con uno o mas sustratos de carbono renovables seleccionados de: almidon, sacarosa, glucosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa o combinaciones de los mismos, de tal manera que se produce el polfmero de PHA que contiene 5HV y las celulas recuperan el polfmero.
En otra realizacion al organismo no humano recombinante se le suministra uno o mas sustratos de carbono renovables seleccionados de: almidon, sacarosa, glucosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa o combinaciones de los mismos, de tal manera que se produce el polfmero de PHA que contiene 5HV y las celulas recuperan el polfmero.
Los polfmeros producidos por los hospedadores recombinantes pueden ser homopolfmeros o copolfmeros de
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monomeros de 5HV. Un copoUmero preferido es PHB5HV. Otros poUmeros utiles producidos por los hospedadores recombinantes en los copolfmeros poli(3-hidroxipropionato-co-5-hidroxivalerato) y poli(4-hidroxibutirato-co-5- hidroxivalerato) y el homopoKmero P5HV.
El organismo hospedador no humano puede ser procariota o eucariota. Los hospedadores procariotas preferidos con E. coli, Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus y C. glutamicum.
Tambien se proporcionan hospedadores no humanos recombinantes para la produccion de polfmeros de PHA a partir de lisina, o de uno o mas sustratos de carbono renovables, seleccionados de almidon, sacarosa, glucosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa, arabinosa o combinaciones de los mismos, de acuerdo con el primer aspecto de la presente invencion. Un hospedador ejemplar expresa lisina 2-monooxigenasa, 5-aminopentanamidasa, 5- aminopentanoato transaminasa, glutarato semialdehndo reductasa, 5-hidroxivalerato CoA-transferasa y polihidroxialcanoato sintasa para la produccion de un polfmero que incluye 5HV. El polfmero se produce utilizando, como materia prima, lisina y uno o mas sustratos de carbono renovables, seleccionados de almidon, sacarosa, glucosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa y arabinosa. Preferentemente el hospedador tiene eliminaciones en los genes que codifican glutarato semialdehndo deshidrogenasa y exportador de lisina.
Produccion de 1,5-pentanodiol
En el presente documento tambien se describe otro hospedador recombinante que puede modificarse por ingeniena genetica para sobreexpresar 5-hidroxivalerato CoA transferasa, propionaldehndo deshidrogenasa dependiente de CoA y 1,3-propanodiol deshidrogenasa, para la produccion de 1,5 pentanodiol. El 1,5 pentanodiol se produce utilizando como materia prima 5-hidroxivalerato, lisina, almidon, sacarosa, glucosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa y arabinosa en solitario o en combinaciones. Preferentemente el hospedador recombinante tiene eliminaciones en adhE, ldhA, y ackA-pta y expresa genes que codifican lisina 2-monooxigenasa, 5-aminopentanamidasa, 5- aminopentanoato transaminasa y una o mas de glutarato o succinato semialdehndo reductasa. Los hospedadores particularmente adecuados tienen la capacidad de sobreproducir lisina y de ser resistentes a analogos toxicos de lisina, como S-(2-aminoetil) cistema. Preferentemente, el organismo tiene una actividad glutarato semialdehndo deshidrogenasa reducida o no la tiene.
En el presente documento se describe un procedimiento para la produccion de 1,5-pentanodiol a partir de sustratos de carbono renovables, en el que a un organismo recombinante se le suministra un sustrato de carbono renovable y se produce 1,5-pentanodiol, que se secreta al medio y se recupera del mismo.
Por consiguiente, la presente solicitud tambien desvela 1,5-pentanodiol producido a partir de fuentes renovables. Produccion de acido glutarico
En el presente documento tambien se describen hospedadores recombinantes para la sobreproduccion de glutarato (acido glutarico) a partir de lisina, o de uno o mas sustratos de carbono renovables, seleccionados de almidon, sacarosa, glucosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa y arabinosa, o una combinacion de los mismos. Un hospedador ejemplar expresa genes que codifican lisina 2-monooxigenasa, 5-aminopentanamidasa, 5-aminopentanoato transaminasa y uno o mas de glutarato semialdehndo deshidrogenasa. Los hospedadores particularmente adecuados tienen la capacidad de sobreproducir lisina y ser resistentes a analogos toxicos de lisina, como S-(2- aminoetil) cistema.
En el presente documento tambien se describe un procedimiento para la sobreproduccion de glutarato a partir de sustratos de carbono renovables, en el que a un organismo recombinante se le suministra un sustrato de carbono renovable, seleccionado de lisina, almidon, sacarosa, glucosa, lactosa, fructosa, xilosa, maltosa y arabinosa o combinaciones de los mismos y el glutarato se sobreproduce, se secreta al medio y se recupera del mismo.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama esquematico que muestra las diversas moleculas de 5 atomos de carbono que pueden producirse biologicamente a partir de fuentes renovables, en algunos casos estas moleculas basadas en fuentes renovables pueden interconvertirse utilizando qrnmica convencional y utilizarse para fabricar polfmeros, etc. mediante procedimientos qrnmicos de polimerizacion.
La Figura 2A es un diagrama esquematico que muestra rutas bioqmmicas de polfmeros de polihidroxialcanoato que contienen 5-hidroxivalerato y productos qrnmicos de 5 atomos de carbono tales como 5-aminopentanoato (5- APO), glutarato, 5-valerolactona (DVL) y 1,5 pentanodiol. Tambien se muestran rutas metabolicas competidoras que han de eliminarse o las actividades reducidas (indicadas por con una cruz (X)) para obtener un flujo de carbono optimo en los productos deseados indicados anteriormente. La Figura 2B muestra enzimas que catalizan las reacciones biosinteticas: (1) lisina 2-monoxigenasa, EC 1.13.12.2; (2) 5-aminopentanamidasa (tambien conocida como 8-aminovaleramidasa), EC 3.5.1.30; (3) 5-aminopentanoato transaminasa (tambien conocido como 5-aminovalerato transaminasa), EC 2.6.1.48; (4) succinato semialdehndo reductasa (tambien conocido como 5-oxopentanoato reductasa), EC 1.1.1.61; (5) CoA-transferasa, EC 2.8.3.n; (6) Acil-CoA sintetasa, EC 6.2.1.3; (7) PHA sintasa, EC 2.3.1.n; (8) p-cetoacil-CoA tiolasa, EC 2.3.1.9; (9) acetoacetil-CoA reductasa, EC 1.1.1.36; (10) glutarato-semialdehndo deshidrogenasa, EC 1.2.1.20.
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La Figura 3 es un diagrama esquematico que muestra rutas bioqmmicas de una via alternativa desde L-lisina a 5-aminopentanoato mediante cadaverina y 5-aminopentanal.
La Figura 4 es un diagrama esquematico que muestra rutas bioqmmicas desde L-prolina a 5-aminopentanoato.
La Figura 5 es un diagrama esquematico que muestra rutas bioqmmicas desde alfa-cetoglutarato a glutarato semialdetndo, un producto intermedio metabolico para la produccion de 5-hidroxivalerato y sus derivados, y glutarato.
La Figura 6 es un diagrama esquematico que muestra rutas bioqmmicas a partir de oxaloacetato, un producto intermedio del ciclo del acido tricarboxflico, TCA, a L-lisina.
La Figura 7 es un diagrama esquematico que muestra rutas bioqmmicas a 1,5 pentanodiol.
La Figura 8A es un cromatograma que muestra el tiempo (minutos) frente a la abundancia de iones total de un cultivo celular procesado de la cepa 3291. La Figura 8B es un espectro de iones de un cultivo celular procesado de la cepa 3291 que muestra la relacion entre masa y carga “m/z” frente a su abundancia de iones (unidades relativas).
Descripcion detallada de la invencion
I. Definiciones
En la siguiente seccion se definen y se aclaran diversos terminos utilizados en el presente documento.
La expresion “copolfmero de PHA” se refiere a un polfmero compuesto por al menos dos monomeros de acido hidroxialcanoico diferentes.
La expresion “homopolfmero de PHA” se refiere a un polfmero que esta compuesto por un solo monomero de acido hidroxialcanoico.
Como se usa en el presente documento, un “vector” es un replicon, tal como un plasmido, un fago o un cosmido, en el cual puede insertarse otro segmento de ADN para llevar a cabo la replicacion del segmento insertado. Los vectores pueden ser vectores de expresion.
Como se usa en el presente documento, un “vector de expresion” es un vector que incluye una o mas secuencias de control de expresion.
Como se usa en el presente documento, una “secuencia de control de expresion” es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripcion y/o traduccion de otra secuencia de ADN.
Como se usa en el presente documento, “unido operativamente” significa incorporado en una construccion genetica de tal manera que las secuencias de control de expresion controlan de un modo eficaz la expresion de una secuencia codificante de interes.
Como se usa en el presente documento, “transformado” y “transfectado” incluye la introduccion de un acido nucleico en una celula mediante diversas tecnicas conocidas en la materia.
Como se usa en el presente documento, “sobreproducido” significa que el compuesto particular se produce a una cantidad mas alta en el organismo modificado por ingeniena genetica en comparacion con el organismo no modificado por ingeniena genetica.
Como se usa en el presente documento, todas las expresiones “materia prima renovable”, “sustrato de carbono renovable” y “sustrato renovable” se usan ellas indistintamente.
Los “plasmidos” se indican con una letra minuscula “p” precedida y/o seguida por otras mayusculas y/o numeros.
Como se usa en el presente documento, el termino “heterologo” significa de otro hospedador. El otro hospedador puede ser de la misma especie o de una especie diferente.
II. Rutas metabolicas para la produccion de polihidrixoalcanoatos y productos qmmicos de 5 atomos de carbono
Se proporcionan organismos no humanos recombinantes que tienen enzimas para las rutas bioqmmicas para la produccion de polfmeros de polihidroxialcanoato que contienen 5-hidroxivalerato de acuerdo con el primer y segundo aspectos de la presente invencion. En el presente documento tambien se describen organismos no humanos recombinantes que tienen enzimas para las rutas bioqmmicas para la produccion de productos qmmicos de 5 atomos de carbono, tales como 5-aminopentanoato (5AP), 5-hidroxivalerato (5HV), glutarato y 1,5 pentanodiol (PDO). Los hospedadores procariotas o eucariotas se modifican geneticamente para expresar las enzimas necesarias para la produccion de 5-hidroxivalerato, sus polfmeros o los productos qmmicos de 5 atomos de carbono desvelados procedentes de materias primas basadas en fuentes renovables. Mas adelante se proporcionan las rutas enzimaticas para la produccion de los productos deseados.
A. 5-aminopentanoato
El 5-aminopentanoato (5AP) puede producirse en dos etapas enzimaticas a partir de L-lisina, un a-aminoacido, siendo la 5-aminopentanoamida el producto intermedio (Figura 2). La primera de estas enzimas, la lisina 2- monooxigenasa es la primera etapa enzimatica en la ruta de degradacion de lisina de diversas cepas de Pseudomonas (Takeda y Hayaishi, J. Biol. Chem. 241: 2733-2736; (1966); Hayaishi, Bacteriol. Rev. 30: 720-731 5 (1966); Reitz y Rodwell, J. Biol. Chem. 245: 3091-3096 (1970); Flashner y Massey, J. Biol. Chem. 249: 2579-2586
(1974)). El gen que codifica la lisina 2-monooxigenasa se identifico en Pseudomonas putida y se denomino davB (Revelles y col., J. Bacteriol. 187:7500-7510 (2005)). La segunda etapa enzimatica convierte la 5- aminopentanoamida en 5AP y se cataliza mediante la 5-aminopentanoamidasa (Reitz y col., Anal. Biochem. 28: 269272 (1969); Reitz y Rodwell, J. Biol. Chem. 245: 3091-3096 (1970)), que esta codificada por davA en P. putida 10 (Revelles y col., J. Bacteriol. 187: 7500-7510 (2005)).
Como se muestra en la Figura 3, puede utilizarse una ruta alternativa para convertir L-lisina en 5AP en tres reacciones enzimaticas que incluyen una lisina descarboxilasa para la produccion de cadaverina, una putrescina transaminasa para formar 5-aminopentanal, y una Y-aminobutiraldehndo deshidrogenasa para biosintetizar 5AP.
Como se indica en el esquema de la Figura 4, el 5AP tambien puede producirse a partir de L-prolina, en lugar de L- 15 lisina, en dos reacciones enzimaticas que incluyen una prolina racemasa para biosintetizar D-prolina y una prolina reductasa para formar 5AP.
B. 5-hidroxivalerato
La biosmtesis de otro producto qmmico de 5 atomos de carbono, el 5HV, puede producirse a partir de 5AP con 2 etapas enzimaticas como se indica en el esquema de la Figura 2. El 5AP se convierte en glutarato semialdehndo 20 mediante la 5AP transaminasa (Reitz y Rodwell, J. Biol. Chem. 245: 3091-3096 (1970)) y se identifico un gen de P. putida que se denomino davT (Espinosa-Urgel y Ramos, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5219-5224 (2001)). Como se indica en el Ejemplo 7, diversos genes recombinantes de semialdehndo reductasa se clonaron y ensayaron para investigar que enzima codificada convertfa de un modo eficaz el glutarato semialdehndo en 5HV. Se descubrio que la protema hipotetica ATEG_00539 catalizaba de un modo eficaz esta reaccion y por tanto se renombro gsaR por 25 glutarato semialdehndo reductasa.
En algunas bacterias termofilas y hongos inferiores, incluyendo a las levaduras, la lisina se sintetiza mediante la ruta de a-aminocetoadipato (Xu, Cell Biochem. Biophys. 46: 43-64 (2006)) en la que el 2-cetoadipato es el cuarto producto intermedio y por lo tanto un posible precursor de productos qmmicos de C5 tales como glutarato y 5HV, asf como de polfmeros de PHA que contienen 5HV. Como se muestra en la Figura 5, esta ruta comienza desde a- 30 cetoglutarato y acetil-CoA para biosintetizar 2-cetoadipato. Se observo que cepas hospedadoras recombinantes de E. coli que expresaban estas cuatro enzimas, produdan 2-cetoadipato (Andi y col., Biochem. 43: 11790-11795 (2004); Jia y col., Biochem. J. 396: 479-485 (2006); Miyazaki y col., J. Biol. Chem. 278: 1864-1871 (2003)). El 2- cetoadipato puede convertirse mediante una a-cetoglutarato deshidrogenasa en glutaril-CoA debido a la similitud estructural del a-cetoglutarato y 2-cetoadipato. La glutaril-CoA puede convertirse mediante una semialdehndo 35 succmico (SSA) deshidrogenasa, tal como succinil-CoA sintetasa (SucD) (Sohling y Gottschalk J. Bacteriol. 178:
871-880 (1996)), de nuevo debido a la similitud estructural de la succinil-CoA y glutaril-CoA.
C. Glutarato
La biosmtesis del producto qmmico de 5 atomos de carbono, glutarato, procede de glutarato semialdehndo mediante una reaccion deshidrogenasa (Ischihara y col., J. Biochem. (Tokio) 49: 154-157 (1961); Reitz y Rodwell, J. Biol. 40 Chem. 245: 3091-3096 (1970)) como se indica en el esquema de la Figura 2. Se identifico el gen davD que codificaba dicha actividad glutarato semialdehndo deshidrogenasa en P. putida (Espinosa-Urgel y Ramos, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5219-5224 (2001); Revelles y col., J. Bacteriol. 186: 3439-3446 (2004)). El glutarato es util para la produccion de polfmeros tales como poliesteres, polioles de poliester y poliamidas. El numero impar de atomos de carbono (es decir 5) es util, por ejemplo, en la disminucion de la elasticidad del polfmero. Ademas, el 1,545 pentanodiol, es un plastificante comun y precursor de poliesteres que se fabrica por hidrogenacion de glutarato y sus derivados (Werle y Morawietz, “Alcohols, Polyhydric” en: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry: 2002, Wiley-VCH: Weinheim. DOI 10.1002/14356007.a01_305).
D. poli(5-hidroxivalerato)
La biosmtesis de un homopolfmero que consiste en poli(5-hidroxivalerato) (tambien conocido como P(5HV)) PHA 50 puede proceder de 5HV mediante 5-hidroxivalerato-CoA. Dos reacciones enzimaticas diferentes pueden catalizar la primera etapa, es decir, bien mediante una CoA-transferasa, como describen Huisman y col. (Patente de Estados Unidos N.° 7.229.804), Sohling y Gottschalk (J. Bacteriol. 178: 871-880 (1996)) y Eikmanns y Buckel (Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371: 1077-1082 (1990)), o mediante una CoA-sintetasa, como describen van Beilen y col. (Molec. Microbiol. 6: 3121-3136 (1992)). La polimerizacion de 5-hidroxivalerato-CoA puede catalizarse mediante la PHA 55 polimerasa, tal como codificarse por phaCI de Ralstonia eutropha (Peoples y Sinskey, J. Biol. Chem. 264: 1529815303 (1989)). Como alternativa, la protema de fusion PhaC3/C5 sintasa puede emplearse como describen Huisman y col. (Patente de Estados Unidos N.° 6.316.262).
E. poli(3-hidroxibutirato-co-5-hidroxivalerato)
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La biosmtesis de un copoMmero que incluye poli(3-hidroxibutirato-co-5-hidroxivalerato) (tambien conocido como P(3HB-co-5HV)) puede producirse proporcionando 3-hidroxibutiril-CoA (3HB-CoA) y moleculas precursoras monomericas de 5-HV-CoA. Como se indica en el esquema de la Figura 2, 3HB-CoA puede biosintetizarse a partir de acetil-CoA mediante 2 etapas enzimaticas: (i) una reaccion de p-cetoacil-CoA tiolasa que convierte acetil-CoA en acetoacetil-CoA (Nishimura y col., J. Biol. Chem, 116: 21-27 (1978)) utilizando genes adecuados tales como, pero sin limitacion, bktB de Ralstonia eutropha (Slater y col., J. Bacteriol. 180(8): 1979-1987 (1998)) y (ii.) una reaccion de acetoacetil-CoA reductasa que convierte acetoacetil-CoA en 3HB-CoA (Fukui y col., Biochim. Biophys. Acta 917: 365-371 (1987)) utilizando genes adecuados tales como, pero sin limitacion, phaB de Bacillus megaterium (McCool y Cannon, J. Bacteriol. 181(2): 585-592 (1999)). Como se indica anteriormente, el copolfmero PHA puede sintetizarse mediante diversas PHA sintasas.
F. Lisina
La Figura 6 indica la ruta biosintetica del metabolismo de lisina en E. coli. Las lmeas discontinuas y continuas en el centro del diagrama indican inhibicion por retroalimentacion alosterica y represion transcripcional por L-lisina, respectivamente, que proporcionan dianas para modificaciones geneticas necesarias para aumentar la produccion de L-lisina en celulas hospedadoras recombinantes tales como E. coli.
G. 1,5-pentanodiol
La Figura 7 proporciona una vision general de la produccion de 1,5-pentanodiol (PDO) a partir de 5HV. El 5HV puede convertirse en 5HV-CoA mediante una CoA-transferasa como describen Huisman y col. (Patente de Estados Unidos N.° 7.229.804), Sohling y Gottschalk (J. Bacteriol. 178: 871-880 (1996)), y Eikmanns y Buckel (Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371: 1077-1082 (1990)), o mediante una CoA-sintetasa como describen van Beilen y col. (Molec. Microbiol. 6:3121-3136 (1992)). El 5HV puede convertirse en 5-hidroxipentenal mediante una propionaldehndo deshidrogenasa o alcohol deshidrogenasa tal como pduP de Salmonella typhimurium (Leal, Arch. Microbiol. 180:353-361 (2003)) o eutE de E. coli (Skraly, Patente WO N.° 2004/024876). El 5-hidroxipentenal puede convertirse en PDO mediante 1,3-propanodiol deshidrogenasa o alcohol deshidrogenasa tal como dhaT de Klebsiella pneumoniae (Tong y col., Appl. Environ. Microbiol. 57(12): 3541-3546 (1991)).
H. 5-hidroxivalerato-co-3-hidroxipropionato
A partir de 5HV puede producirse un copolfmero que contenga 5-hidroxivalerato-co-hidroxipropionato. Cepas K12 de E. coli que eran /adR+ (degradacion de acidos grasos (FAD, acronimo ingles de fatty acid degradation) reprimida) o fadR- (FAD constitutiva) se transfectaron con acidos nucleicos que expresaban polihidroxialcanoato y 5- hidroxivalerato CoA transferasa. Las cepas de E. coli preferidas inclman MG1655 y LS5218 (Spratt y col., J. Bacteriol. 146(3): 1166-1169 (1981)). Como se muestra en la Tabla 6, un analisis por GC-FID (cromatograffa de gases con detector de ionizacion de llama), indico que la cepa LS5218 [pMS93] produjo un PHA con un dcw (dry cell weight, peso seco celular) de 6,4%, con una composicion polimerica de 5HV 52% y 3HP 48%. Por otro lado, la cepa MG1655 [pMS93], estaba constituida por PHA con un dcw de 63,1%, que consistfa solo en 5HV. Adicionalmente, un analisis por GC-MS de LS5218 [pMS93] confirmo la presencia de 3HP en la muestra polimerica. Por tanto, el sistema FAD activo en LS5218 podfa sintetizar 3HP a partir de Na5HV.
MI. Produccion de organismos transgenicos para la produccion de polihidroxialcanoatos y productos qmmicos de 5 atomos de carbono
Se produjeron organismos transgenicos para la produccion de polihidroxialcanoatos y productos qmmicos de 5 atomos de carbono usando tecnicas convencionales conocidas en la materia.
A. Genes para la produccion de productores transgenicos de P(5HV)
En la siguiente Tabla 1A, se presentan los genes clonados y/o evaluados para cepas hospedadoras que producen PHA que contiene 5HV y productos qmmicos de 5 atomos de carbono, junto con el numero de Comision de Enzimas (numero EC) apropiado y referencias. Como tambien se indican mas adelante, algunos genes que se sintetizaron por optimizacion de codones mientras que otros se clonaron por PCR a partir de ADN genomico del organismo nativo o de tipo silvestre.
Tabla 1A. Genes en cepas hospedadoras microbianas productoras de PHA que contiene 5HV y productos qmmicos de 5 atomos de carbono
Numero de reaccion (Fig. 1B)
Nombre del gen Nombre de la enzima Numero EC N.° de registro de protema
1
davB lisina 2-monooxigenasa 1.13.12.2 BAG54787
2
davA 5-aminopentanamidasa 3.5.1.30 BAG54788
3
davT 5-aminopentanoato transaminasa 2.6.1.48 AAK97868
3
gabT 4-aminobutirato transaminasa 2.6.1.19 NP_417148
4
gsaRAt2 glutarato semialdehudo reductasa 1.1.1.61 Gen/Protema ID 1; XP_001210625
4
gsaRAt glutarato semialdehudo reductasa 1.1.1.61 Gen/Protema ID 2; AAK94781
5
orfZ CoA-transferasa 2.8.3.n AAA92344
5
5-hidroxipentanoato CoA-transferasa 2.8.3.14
6
alkK acil-CoA sintetasa 6.2.1.3 Q00594
7
phaC polihidroxialcanoato sintasa 2.3.1.n YP_725940
7
phaC3/C5 protema de fusion de polihidroxialcanoato sintasa 2.3.1.n Gen/Protema ID 3
7
PhaEC polihidroxialcanoato sintasa 2.3.1.n Gen/Protema ID 4 y 5
8
bktB(phaA) P-cetoacil-CoA tiolasa 2.3.1.9 CAJ92573
9
phaB acetoacetil-CoA reductasa 1.1.1.36 AAD05259
10
davD glutarato-semialdehudo deshidrogenasa 1.2.1.20 NP_742381
10
gabD succinato-semialdelmdo deshidrogenasa, dependiente de NADP+ 1.2.1.20 NP_417147
10
ynel succinato-semialdelmdo deshidrogenasa, dependiente de NAD+- 1.2.1.20 NP_416042
pduP propionaldehudo deshidrogenasa dependiente de CoA 1.2.1.3 NP_460996
eutE aldehudo deshidrogenasa prevista en la utilizacion de etanolamina 1.2.1.3 NP_416950
dhaT 1,3-propanodiol deshidrogenasa 1.1.1.202 YP_002236499
eutG alcohol deshidrogenasa prevista, protema de utilizacion de etanolamina 1.1.1.202 AP_003038
argO (yggA) protema exportadora de arginina NP_417398
lysE permeasa de salida de lisina NP_600485
lysP transportador APC de lisina LysP NP_416661
cadA lisina descarboxilasa 1 4.1.1.18 AAC77092
IdcC lisina descarboxilasa 2 4.1.1.18 AAC73297
yjeK lisina 2,3-aminomutasa 5.4.3. AAC77106
Consultando bibliograffa cientffica, patentes o busquedas BLAST, por ejemplo, contra la base de datos de nucleotidos o protemas del NCBI (
www.nc-bi.nlm.nih.gov/), pueden descubrirse otras protemas capaces de catalizar las reacciones indicadas en la Tabla 1A. Despues, pueden crearse genes sinteticos para proporcionar una via sencilla desde las bases de datos de secuencias a ADN ffsico. Dichos genes sinteticos se disenan y fabrican desde 5 la base, usando codones para potenciar la expresion de protemas heterologas, optimizando las caractensticas necesarias para el sistema de expresion y el hospedador. Empresas tales como, por ejemplo, DNA 2.0 (Menlo Park, CA 94025, EEUU) proporcionaran dicho servicio habitual. En las Tablas 1B-1Aa se proporcionan protemas que pueden catalizar las reacciones bioqmmicas indicadas en la Tabla 1A.
Tabla 1B. Homologos adecuados para la protema DavB (lisina 2-monooxigenasa, de Pseudomonas putida cepa 10 KT2440, EC N.° 1.13.12.2, que actua sobre L-lisina para la produccion de 5-aminopentanamida; N.° de registro de
protema BAG54787 (Revelles y col., J Bacteriol. 187: 7500-10 (2005))).
15
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
amina oxidasa
YP_001265764
amina oxidasa
YP_001666658
amina oxidasa
YP_001751665
amina oxidasa
YP_606177
amino oxidasa que contiene flavina
YP_262728
triptofano 2-monooxigenasa
YP_350882
triptofano 2-monooxigenasa
ZP_04590895
triptofano 2-monooxigenasa
NP_ 7790366
triptofano 2-monooxigenasa
ZP_0218996
Tabla 1C. Homologos adecuados para la protema DavA (5-aminopentanamidasa, de Pseudomonas putida cepa KT2440, EC N.° 3.5.1.30, que actua sobre 5-aminopentanamida para la produccion de 5-aminopentanoato, N.° de registro de protema BAG54788 (Revelles y col., J Bacteriol. 187: 7500-10 (2005))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
Nitrilasa/cianida hidratasa y apolipoprotema N- aciltransferasa
YP_001265763
Nitrilasa/cianida hidratasa y apolipoprotema N- aciltransferasa
YP_001666657
Nitrilasa/cianida hidratasa y apolipoprotema N- aciltransferasa
YP_001751666
Amidohidrolasa
YP_606176
Familia de las hidrolasas que actuan sobre enlaces carbono nitrogeno
NP_790365
Familia de las hidrolasas que actuan sobre enlaces carbono nitrogeno
ZP_04590894
supuesta hidrolasa
YP_002875091
Nitrilasa/cianida hidratasa y apolipoprotema N- aciltransferasa
YP_350883
Nitrilasa
YP_703491
Tabla 1D. Homologos adecuados para la protema DavT (5-aminopentanoato transaminasa, de Pseudomonas putida cepa KT2440, EC N.° 2.6.1,48, que actua sobre 5-aminopentanoato para la produccion de glutarato semialdehudo; N.° de registro de protema AAK97868 (Espinosa-Urgel y Ramos, Appl. Environ. Microbiol. 67 (11), 5219-5224
(2001))),
Nombre de la protema
4-aminobutirato aminotransferasa
4-aminobutirato aminotransferasa
4-aminobutirato aminotransferasa
4-aminobutirato transaminasa
4-aminobutirato aminotransferasa
4-aminobutirato aminotransferasa
4-aminobutirato aminotransferasa, dependiente de PLP
4-aminobutirato aminotransferasa
4-aminobutirato aminotransferasa
N.° de registro de protema
YP_788435
YP_002294190
YP_345921
YP_002801747
YP_001333938
NP_790151
NP_417148
YP_311652
YP 257332
5
10
Tabla 1E. Homologos adecuados para la protema GabT (4-aminobutirato transaminasa, de Escherichia coli cepa K- 12 sustrato MG1655, EC N.° 2.6.1.48 (o EC N.° 2.6.1.19), que actua sobre 5-aminopentanoato (o 4 aminobutirato) para la produccion de glutarato semialdehudo (semialdehudo succmico); N.° de registro de protema NP_417148 (Riley y col., Nucleic Acids Res. 34 (1), 1-9 (2006))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
4-aminobutirato aminotransferasa
ZP_05433421
4-aminobutirato aminotransferasa
YP_002381614
protema hipotetica CIT292_04138
ZP_03838094
4-aminobutirato aminotransferasa
YP_001333938
4-aminobutirato aminotransferasa
NP_461718
4-aminobutirato aminotransferasa
NP_248957
4-aminobutirato aminotransferasa
YP_964435
4-aminobutirato aminotransferasa
YP_982853
4-aminobutirato aminotransferasa
YP_583770
Tabla 1F. Homologos adecuados para la protema GsaRAt2 (glutarato semialdehudo reductasa, de Aspergillus terreus NIH2624, EC N.° 1.1.1.61, que actua sobre glutarato semialdehudo (o succmico semialdehudo) para la produccion de 5-hidroxivalerato (o 4-hidroxibutirato); N.° de registro de protema XP_001210625 (Birren, The Broad Institute Genome Sequencing Platform, presentacion directa al NCBI))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
aflatoxina B1-aldehndo reductasa de tipo GliO,
supuesta CBF89011
aflatoxina B1-aldehndo reductasa de tipo GliO
XP_752707
aflatoxina B1-aldelmdo reductasa, supuesta
aflatoxina B1-aldehndo reductasa de tipo GliO, supuesta XP_001264422 aflatoxina B1 aldehudo reductasa XP 002375825
5
10
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
protema hipotetica An08g06440 aflatoxina B1 aldehndo reductasa miembro, supuesto
EEH21318
XP_001392759
EER27170
Cadena A, Succmico Semialdehndo Reductasa de Raton, Akr7a5
2C91_A
Cadena A, Estructura de la Aflatoxina Aldehfdo Reductasa
2BP1_A
En Complejo con NADPH
Tabla 1G. Homologos adecuados para la protema GsaRAt (glutarato semialdehndo) reductasa, thaliana, EC N.° 1.1.1.61, que actua sobre glutarato semialdehudo (o succmico semialdehudo) para 5-hidroxivalerato (o 4-hidroxibutirato); N.° de registro de protema AAK94781 (Breitkreuz y col., J. (42), 41552-41556 (2003))).
de Arabidopsis la produccion de Biol. Chem. 278
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
protema hipotetica isoforma 1
XP_002266252
protema prevista
XP_002320548
Os02g0562700
NP_001047154
semialdehudo succmico) isoforma 1 reductasa
BAG16485
desconocida
ACU22717
protema hipotetica SORBIDRAFT_04g02 3180
XP_002452295
4-hidroxibutirato deshidrogenasa dependiente de NAD
AAC41425
1, 3-propanodiol deshidrogenasa
ZP_00945634
4-hidroxibutirato deshidrogenasa dependiente de NAD
AAA92348
4-hidroxibutirato deshidrogenasa dependiente de NAD
NP_348201
Tabla 1H. Homologos adecuados para la protema OrfZ (CoA-transferasa, de Clostridium kluyveri DSM 555, EC N.° 2.8.3.n, que actua sobre 5-hidroxivalerato para la produccion de 5-hidroxivaleril-CoA; N.° de registro de protema AAA92344 (Huisman y col., Patente de Estados Unidos N.° 7.229.804; Sohling y Gottschalk, J. Bacteriol. 178: 871880 (1996))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
acetil-CoA hidrolasa/transferasa
ZP_05395303
acetil-CoA hidrolasa/transferasa
YP_001309226
4-hidroxibutirato coenzima A transferasa
ZP_05618453
4-hidroxibutirato CoA-transferasa
CAB60036
4-hidroxibutirato CoA-transferasa
NP_904965
Nombre de la protema 4-hidroxibutirato CoA-transferasa acetil-CoA hidrolasa/transferasa acetil-CoA hidrolasa/transferasa acetil-CoA hidrolasa/transferasa
N.° de registro de protema ZP_05427217 YP_002430388 YP_001433830 YP 002509648
Tabla 1I. Homologos adecuados para la protema AlkK (Acil-CoA sintetasa, de Pseudomonas oleovorans; EC N.° 6.2.1.3, que actua sobre 5-hidroxivalerato para la produccion de 5-hidroxivaleril-CoA; N.° de registro de protema 5 Q00594 (van Beilen y col., Mol. Microbiol. 6 (21), 3121-3136 (1992))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
sintetasa y ligasa dependiente de AMP
YP_001185941
acil-CoA sintetasa de cadena media
ABO21016
acil-CoA sintetasa
CAB69080
acil-CoA sintetasa de cadena media
ZP_06063626
acil-CoA sintetasa
YP_523641
sintetasa y ligasa dependiente de AMP
ZP_03542412
acil-CoA sintetasa
YP_726019
ligasa CoA de acidos grasos de cadena media
ZP_06016304
ligasa CoA de acidos grasos de cadena media
ZP_02145453
Tabla 1J. Homologos adecuados para la protema PhaC (polihidroxialcanoato sintasa, de Ralstonia eutropha, EC N.° 2.3.1.n, que actua sobre (R)-3-hidroxibutiril-CoA + [(R)-3-hidroxibutanoato]n para la produccion de [(R)-3- hidroxibutanoato](n+1) + CoA; N.° de registro de protema YP_725940 (Peoples y Sinskey, J. Biol. Chem. 264: 10 15298-15303 (1989))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
acido polihidroxialcanoico sintasa
YP_002005374
PHB sintasa
BAB96552
PhaC
AAF23364
protema PhaC polihidroxialcanoato sintasa
AAC83658
polihidroxibutirato sintasa
AAL17611
acido poli(R)-hidroxialcanoico sintasa, clase I
YP_002890098
poli-beta-hidroxibutirato polimerasa
YP_159697
PHB sintasa
CAC41638
PHB sintasa
YP_001100197
Tabla 1K. Homologos adecuados para la protema PhaE (subunidad PhaE de PhaEC PHA sintasa, de Thiocapsa pfenigii, que actua sobre (R)-3-hidroxibutiril-CoA + [(R)-3-hidroxibutanoato]n para la produccion de [(R)-3- hidroxibutanoato](n+1) + CoA).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
orf2 5' en phbC
AAC60429
protema de 40,5 kDa no caracterizada en la region intergenica phbC-phbA
P45372
protema hipotetica 2
S29275
protema de 41,3 kDa no caracterizada en la region intergenica phbC-phbA
P45367
acido poli(R)-hidroxialcanoico sintasa, clase III, subunidad PhaE
ZP_04775558
protema hipotetica Tgr7_1513
YP_002513584
PHA sintasa subunidad PhaE
AAG30260
acido poli(R)-hidroxialcanoico sintasa, clase III, subunidad PhaE
YP_865086
PHA sintasa
BAE20054
PHA sintasa subunidad E
ABK60192
Tabla 1L. Homologos adecuados para la protema PhaC (subunidad PhaC de PhaEC PHA sintasa, de Thiocapsa pfenigii, que actua sobre (R)-3-hidroxibutiril-CoA + [(R)-3-hidroxibutanoato]n para la produccion de [(R)-3- hidroxibutanoate](n+1) + CoA).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
acido poli(R)-hidroxilcanoico sintasa, clase III, subunidad PhaC
ZP_04774202
Poli-beta-hidroxibutirato polimerasa
P45366
PHA sintasa subunidad PhaC
AAG30259
acido poli(R)-hidroxilcanoico sintasa, clase III, subunidad PhaC
YP_865087
poli (acido 3-hidroxibutmco) sintasa
YP_200860
poli(3-hidroxialcanoato) sintasa
YP_001660017
PhaC
AAL76316
poli(3-hidroxialcanoato) sintasa
NP_440750
acido poli(R)-hidroxilcanoico sintasa, clase III, subunidad PhaC
YP_003151887
acido poli(R)-hidroxialcanoico sintasa, clase III, subunidad PhaC
YP_001374365
Tabla 1M. Homologos adecuados para la protema BktB (PhaA) (P-cetoacil-CoA tiolasa, de Ralstonia eutropha H16, EC N.° 2.3.1.9, que actua sobre acetil-CoA para la produccion de acetoacetil-CoA; N.° de registro de protema CAJ92573 (Peoples y Sinskey, J Biol Chem. 15 de septiembre de 1989; 264(26): 15293-7. Pohlmann y col., Nature Biotech 24 (10), 1257-1262 (2006))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
acetil-CoA acetiltransferasa
YP_002005375
acetil-CoA acetiltransferasa
YP_558680
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
acetil-CoA acetiltransferasa
BAB96553
acetil-CoA acetiltransferasa
YP_001021062
beta-cetotiolasa
BAA33156
acetil-CoA acetiltransferasa
YP_523809
acetil-CoA acetiltransferasa
NP_250691
beta-cetotiolasa
YP_002802211
acetil-CoA acetiltransferasa
YP_001919890
Tabla 1N. Homologos adecuados para la protema PhaB (acetoacetil-CoA reductasa, de Bacillus megaterium, EC. N.° 1.1.1.36, que actua sobre acetoacetil-CoA para la produccion de (R)-3-hidroxibutiril-CoA; N.° de registro de 5 protema AAD05259 (McCool y Cannon, J. Bacteriol. 183 (14), 4235-4243 (2001))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
acetoacetil-CoA reductasa
NP_831099
3-cetoacil-(acil-transportador-protema) reductasa
YP_645133
3-cetoacil-(acil-transportador-protema) reductasa
ZP_01126888
protema hipotetica DSI2660
YP_518893
3-cetoacil-(acil-transportador-protema) reductasa
YP_001865860
3-cetoacil-(acil-transportador-protema) reductasa
YP_001658404
3-oxoacil-(acil-transportador-protema) reductasa
YP_002949207
3-oxoacil-(acil- transportador-protema) reductasa
NP_371755
3-cetoacil-(acil- transportador-protema) reductasa
YP_001385912
Tabla 1O. Homologos adecuados para la protema DavD (glutarato-semialdehudo deshidrogenasa, de Pseudomonas putida KT2440, EC N.° 1.2.1.20, que actua sobre glutarato semialdehudo para la produccion de glutarato; N.° de registro de protema NP_742381 (Espinosa-Urgel y Ramos, Appl. Environ. Microbiol. 67 (11), 5219-5224 (2001))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
succinato-semialdel'Hdo deshidrogenasa I
YP_605978
succinato-semialdel'Hdo deshidrogenasa I
YP_345920
succinato-semialdel'ndo deshidrogenasa I, dependiente de NADP
NP_417147
aldehfdo deshidrogenasa prevista
NP_416042
succinato-semialdel'ndo deshidrogenasa I
NP_461717
aldehndo deshidrogenasa
YP_002801982
succmico semialdehndo deshidrogenasa
YP_002827846
succmico semialdehndo deshidrogenasa
YP_001228901
succinato-semialdel'ndo deshidrogenasa (NADP+)
YP_841054
Tabla 1P. Homologos adecuados para la protema GabD (succinato semialdehudo deshidrogenasa, dependiente de NADP+, de Escherichia coli cepa K-12 sustrato MG1655, EC N.° 1.2.1.20, que actua sobre glutarato semialdehudo (o succmico semialdehudo) para la produccion de glutarato (o succinato); N.° de registro de protema NP_417147 (Riley y col., Nucleic Acids Res. 34 (1), 1-9 (2006))),
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
succinato-semialdel'Hdo deshidrogenasa I ZP_05433422
succinato-semialdel'ndo deshidrogenasa (NAD(P)(+)) YP_001744810
protema hipotetica CIT292_04137 ZP_03838093
succinato-semialdel'ndo deshidrogenasa YP_002638371
succinato-semialdel'Hdo deshidrogenasa I YP_001333939
succinato-semialdel'Hdo deshidrogenasa I NP_742381
succinato-semialdel'ndo deshidrogenasa [NADP+] (ssdh) YP_002932123 succmico semialdehndo deshidrogenasa YP_001951927
succinato semialdehndo deshidrogenasa YP_298405
5
Tabla 1Q. Homologos adecuados para la protema Ynel (Sad) (succinato semialdehndo deshidrogenasa, dependiente de NAD+, de Escherichia coli cepa K-12 sustrato MG1655, EC N.° 1.2.1.24, que actua sobre glutarato semialdehndo (succmico semialdehndo) para la produccion de glutarato (succinato); N.° de registro de protema NP_416042 (Fuhrer y col., J Bacteriol. Nov2o07; 189(22): 8073-8. Dennis y Valentin, Patente de Estados Unidos N.° 6.117.658))).
Nombre de la protema N.° de registro de protema
succinato semialdehndo deshidrogenasa NP_805238
supuesta aldehfdo deshidrogenasa YP_002919404
aldehfdo deshidrogenasa NP_745295
aldehndo deshidrogenasa ZP_03269266
aldehndo deshidrogenasa ZP_05726943
aldehndo deshidrogenasa YP_001906721
protema hipotetica BAF01627
aldehfdo deshidrogenasa ZP_03739186
succinato-semialdel'ndo deshidrogenasa NP_637690
10
Tabla 1R. Homologos adecuados para la protema PduP (propionaldehndo deshidrogenasa dependiente de CoA, de Salmonella typhimurium LT2, EC N.° 1.2.1.3, que actua sobre 5-hidroxivaleril-CoA para la produccion de 5- hidroxipentanal; N.° de registro de protema nP_460996 (Leal y col., Arch. Microbiol. 180: 353-361 (2003), McClelland y col., Nature 413: 852-856 (2001))).
Nombre de la protema
protema de utilizacion de etanolamina EutE
PduP
protema de utilizacion de propanodiol protema de utilizacion de etanolamina EutE aldehndo deshidrogenasa
N.° de registro de protema
YP_002216136
ZP_04562531
YP_002236771
NP_756394
YP 961823
(continuacion)
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
posible aldehudo deshidrogenasa
ZP_04969437
protema de utilizacion de etanolamina eutE
ZP_04637794
Aldehudo Deshidrogenasa
ZP_05373182
protema de utilizacion de etanolamina EutE
YP_002350444
Tabla 1S. Homologos adecuados para la protema EutE (prevista aldehndo deshidrogenasa, protema de utilizacion de etanolamina de Escherichia coli cepa K-12 sustrato MG1655, EC N.° 1.2.1.3, que actua sobre 5-hidroxivaleril-CoAtp 5 para la produccion de 5-hidroxipentanal, N.° de registro de protema NP_416950 (Riley y col., Nucleic Acids Res. 34 (1), 1-9 (2006))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
protema hipotetica SPAB_00490
YP_001586756
protema de utilizacion de etanolamina
YP_001336429
probable etanolamina
ZP_01222600
protema de utilizacion (EutE)
supuesta aldehfdo deshidrogenasa
ZP_03337600
protema utilizacion de etanolamina eutE
ZP_04573939
propionaldehfdo deshidrogenasa dependiente de CoA
ZP_00232619
Aldehfdo Deshidrogenasa
YP_003261430
EutE
YP_311399
protema hipotetica CKO_00340
YP_001451939
protema de utilizacion de etanolamina (EutE)
YP_066775
Tabla 1T. Homologos adecuados para la protema DhaT (1,3-propanodiol deshidrogenasa, de Klebsiella pneumonia 342, EC N.° 1.1.1.202, que actua sobre 5-hidroxipentanal para la produccion de 1,5-pentanodiol; N.° de registro de 10 protema YP_002236499 (Fouts y col., PLoS Genet. 4 (7), E1000141 (2008))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
1, 3-propanodiol deshidrogenasa
ABD74004
1, 3-propanodiol deshidrogenasa
YP_698334
alcohol deshidrogenasa
YP_001211060
1, 3-propanodiol deshidrogenasa
YP_796272
alcohol deshidrogenasa que contiene hierro
YP_003192340
protema hipotetica conservada
ZP_06063679
protema hipotetica BB14905_12250
ZP_01723545
protema EutG
ZP_02497862
1, 3-propanodiol deshidrogenasa
AAX12915
1, 3-propanodiol deshidrogenasa
AAM54730
5
Tabla 1U. Homologos adecuados para la protema EutG (alcohol deshidrogenasa prevista en la utilizacion de etanolamina, de Escherichia coli cepa K-12 sustrato W3110, EC. N.° 1.1.1.202, que actua sobre 5-hidroxipentanal para la produccion de 1,5-pentanodiol; N.° de registro de protema AP 003038 (Riley y col., Nucleic Acids Res. 34 (1), 1-9 (2006))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
protema de utilizacion de etanolamina EutG
YP_001881244
protema hipotetica CKO_00342
YP_001451941
protema hipotetica SPAB_00492
YP_001586758
supuesta protema de transporte en la utilizacion etanolamina
de YP_002920649
supuesta alcohol deshidrogenasa
ZP_03365534
protema de utilizacion de etanolamina EutG
ZP_02156849
protema de utilizacion de etanolamina EutG
ZP_04637792
eutG
AAA80211
alcohol deshidrogenasa que contiene hierro
NP_634793
protema de utilizacion de etanolamina EutG
ZP_06015246
Tabla 1V. Homologos adecuados para la protema ArgO (YggA) (protema exportadora de arginina, de Escherichia coli cepa K-12 sustrato MG1655, que actua sobre L-lisina (citoplasma) y produce L-lisina (exterior); N.° de registro de protema NP_417398 (Nandineni y Gowrishankar, J. Bacteriol. 186: 3539-3546 (2004))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
protema exportadora de arginina
YP_409404
producto de protema sin nombre
CAA32607
protema exportadora de arginina
ZP_04560344
protema exportadora de arginina
NP_461982
protema exportadora de arginina
YP_001336979
protema exportadora de arginina argO
YP_003211829
protema exportadora de arginina
YP_002649944
protema exportadora de arginina argO
ZP_04613777
protema exportadora de arginina
NP_930824
protema exportadora de arginina ArgO
ZP_01988459
Tabla 1W. Homologos adecuados para la protema LysE (permeasa de salida de lisina de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, que actua sobre L-lisina (citoplasma) para la produccion de L-lisina (exterior); N.° de registro de protema NP 600485 (Tokio Research Laboratories, Kogyo Co. Ltd., Japon, presentacion directa al NCBI)).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
protema exportadora de lisina
Q8RQM4
protema exportadora de arginina ArgO
ZP_04835056
protema exportadora de lisina
ZP_0393395
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
protema exportadora de lisina
ZP_03931790
exportador de L-lisina
YP_002958101
protema exportadora de lisina
ZP_05123881
LysE transportador de aminoacidos
NP_794117
protema exportadora de arginina
ZP_03832031
protema ECs3794 hipotetica
ACI78466
transportador de la familia de LysE
NP_353947
Tabla 1X. Homologos adecuados para la protema LysP (transportador APC de lisina LysP, de Escherichia coli cepa K-12 sustrato MG1655, que actua sobre L-lisina (exterior) y que produce L-lisina (citoplasma); N.° de registro de 5 protema NP_416661 (Steffes y col., J Bacteriol 174(10): 3242-9 (1992))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
transportador de lisina
YP_002383360
protema CIT292_03450 hipotetica
ZP_03837490
transportador de lisina
YP_001336242
permeasa espedfica de lisina
YP_003211189
transportador de lisina
ZP_03383884
transportador de lisina
NP_930088
permeasa espedfica de lisina
ZP_04623004
region asociada a permeasa de aminoacidos
YP_001565334
permeasa espedfica de lisina, superfamilia (APC) organizacion poliamina-aminoacido;
YP_002008821
region asociada a permeasa de aminoacidos
YP_776515
Tabla 1Y. Homologos adecuados para la protema CadA (lisina descarboxilasa 1, de Escherichia coli cepa K-12 sustrato W3110, que actua sobre lisina para la produccion de Cadaverina; N.° de registro de protema AP_004633
(Riley y col., Nucleic Acids Res. 34 (1), 1-9 (2006))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
lisina descarboxilasa
ZP_06166000
protema SARI_00317 hipotetica
YP_001569398
familia Orn/Lys/Arg descarboxilasa, supuesta
YP_002932309
Arginina / lisina / ornitina descarboxilasa
ZP_06179259
lisina descarboxilasa 1
YP_205440
lisina descarboxilasa
ZP_04636370
lisina descarboxilasa 2
ZP_04559973
lisina descarboxilasa 2, constitutiva
YP_002396273
Nombre de la protema N.° de registro de protema
lisina descarboxilasa ZP_04617787
lisina descarboxilasa, constitutiva YP_855733
Tabla 1Z. Homologos adecuados para la protema LdcC (lisina descarboxilasa 2, de Escherichia coli cepa K-12 sustrato MG1655, que actua sobre lisina para la produccion de Cadaverina; N.° de registro de protema NP_414728 5 (Riley y col., Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9 (2006))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
lisina descarboxilasa 2
NP_706131
protema CKO_03180 hipotetica
YP_001454701
lisina descarboxilasa constitutiva
ZP_02686615
lisina descarboxilasa, constitutiva
YP_002240326
lisina descarboxilasa, constitutiva
YP_003209178
lisina descarboxilasa
YP_002647915
lisina descarboxilasa
ZP_04621086
lisina descarboxilasa 1
YP_003294813
lisina descarboxilasa 1
YP_859739
familia Orn/Lys/Arg descarboxilasa, supuesta
YP_002931768
Tabla 1AA. Homologos adecuados para la protema YjeK (lisina 2,3-aminomutasa, de Escherichia coli cepa K-12 sustrato MG1655, que actua sobre L-lisina para la produccion de (R)-b-lisina; N.° de registro de protema NP_418570
(Riley y col., Nucleic Acids Res. 34 (l), 1-9 (2006))).
Nombre de la protema
N.° de registro de protema
protema SFV_4304 hipotetica
YP_691589
supuesta lisina aminomutasa
YP_002385208
protema hipotetica conservada
ZP_04559561
protema de la familia KamA
YP_002240896
supuesta aminomutasa
NP_463197
protema ESA_00156 hipotetica
YP_001436296
lisina 2, 3-aminomutasa protema de la familia YodO
YP_003019317
protema ETAE_0333 hipotetica
YP_003294390
protema yjEK de la familia kamA no caracterizada
ZP_04617468
lisina 2, 3-aminomutasa
YP_002157135
Una realizacion proporciona un organismo transgenico o recombinante para la produccion de P(5HV) o de otros PHA que contienen monomeros de 5HV. El organismo puede ser procariota o eucariota. Los procariotas adecuados incluyen, pero sin limitacion, bacterias, por ejemplo E. coli.
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B. Procedimientos y materiales para la produccion de organismos o celulas recombinantes
1. Organismos o celulas a modificar
Los organismos o celulas que pueden modificarse para la produccion de biopoUmeros de PHA que contienen 5HV, 5-aminopentanoato (5AP), 5-hidroxivalerato (5HV), glutarato y 1,5-pentanodiol (PDO), incluyen eucariotas y procariotas. Los procariotas adecuados incluyen bacterias. Diversas bacterias pueden modificarse geneticamente para la produccion de polihidroxialcanoatos. Los ejemplos incluyen E. coli, Alcaligenes latus, Alcaligenese eutrophus, Azotobacter, Pseudomonas putida, Ralstonia eutropha, Salmonella, Klebsiella, Corynebacterium glutamicum, Rhodoccocus y Brevibacterium lactofermentum. Otros procariotas incluyen, pero sin limitacion, eubacterias, tales como organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como E. coli. Diversas cepas de E. coli se encuentran disponibles al publico, tales como la cepa K12 de E. coli MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); (ATCC 27.325) y K5772 (ATCC 53.635).
Estos organismos incluyen los que ya producen polihidroxialcanoatos, modificados para utilizar sustratos alternativos o para incorporar monomeros adicionales, o aumentar la produccion, y organismos que no producen polihidroxialcanoatos, pero que no expresan ninguna de algunas de las enzimas necesarias para la produccion de polihidroxialcanoatos. R. eutropha es un ejemplo de un organismo que produce PHA de manera natural. E. coli y C. glutamicum son ejemplos de organismos en los que sena necesario introducir transgenes que codifiquen las enzimas para la produccion de PHA.
Para la produccion de los productos qmmicos C5, 5-aminopentanoato (5AP), 5-hidroxivalerato (5HV), glutarato y 1,5- pentanodiol, donde no se polimerizan a 5-hidroxivalerato que contienen PHA, pero se secretan en el medio de cultivo es util entonces utilizar microorganismos industriales que se utilizan para la fabricacion de lisina. Corynebacterium glutamicum, incluyendo sus subespecies Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium lilium, Corynebacterium efficiens y Brevibacterium divaricatum, que se han utilizado para la produccion industrial de L-lisina (Microbiol. Monogr.5: 39-70 (2007)), es un ejemplo de microorganismos que pueden desarrollarse para la produccion de glutarato, 1,5-pentanodiol, 5-hidroxivalerato y otros productos que pueden producirse a partir de lisina mediante las rutas de degradacion de lisina descritas en la presente invencion. E. coli modificada por ingeniena genetica tambien se ha utilizado para la produccion de lisina. Los procedimientos para obtener cepas de C. glutamicum para la produccion de L-lisina, tales como mutagenesis al azar y seleccion posterior del mutante que es resistente a analogos toxicos de lisina, tal como S-(2-aminoetil) cistema, y la introduccion de alelos mutantes de genes diana, tales como lysC y hom que codifican aspartato quinasa y homoserina deshidrogenasa, respectivamente, estan muy establecidos y se han descrito (Curr. Opin. Microbiol. 9: 268-274 (2007)). La aspartato quinasa se somete a una inhibicion de retroalimentacion por treonina y lisina, y la liberacion de esta enzima de la inhibicion por retroalimentacion se considera como una de las caractensticas clave para desarrollar cepas productoras de lisina. Otra diana de modificacion genetica para el desarrollo de cepas capaces de producir productos qmmicos procedentes de rutas de degradacion de lisina es el exportador de lisina tal como LysE en C. glutamicum. La mutagenesis del gen lysE de cepas de C. glutamicum productoras de L-lisina, impedira la secrecion de lisina desde el citoplasma y por tanto aumentara la produccion de productos mediante la ruta disenada para convertir lisina en los productos. En la tecnica tambien se conocen procedimientos para construir cepas de C. glutamicum para la produccion de PHA tal como PHB (Jo, S-T y col., 2006. J. Bioscience and Bioengineering 102: 233-236).
Las celulas u organismos eucariotas adecuados incluyen hongos, tales como hongos filamentosos o levaduras. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo hospedador eucariota inferior habitualmente utilizado.
2. Procedimientos para generar organismos transgenicos
i. Transfeccion extracromosomica
A traves de tecnicas de transformacion o de transfeccion convencionales, puede introducirse ADN vector en celulas procariotas o eucariotas. Tal y como se utilizan en el presente documento, los terminos “transformacion” y “transfeccion”, pretenden referirse a una variedad de tecnicas reconocidas en la materia para la introduccion de acido nucleico exogeno (por ejemplo, ADN) en una celula hospedadora, entre las que se incluyen, transformacion qmmica, tal como transfeccion con fosfato de calcio o co-precipitacion con cloruro de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, lipofeccion o electroporacion. En Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, se describen tecnicas de transformacion convencionales. Normalmente, las transformaciones en levadura se realizan de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen y col. J. Bact., 130: 946 (1977) y de Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979).
ii. Integracion cromosomica
Los expertos en la tecnica conocen bien procedimientos para la incorporacion de construcciones de genes modificados por ingeniena genetica en el ADN cromosomico de celulas bacterianas gram negativas y gram positivas. Los mecanismos de integracion tfpicos incluyen recombinacion homologa utilizando ADN linealizado en cepas recBC o recD seguido de transduccion P1 (Miller 1992, A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory
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Manual & Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) plasmidos especiales (Hamilton y col., J. Bacteriol. 171: 4617 (1989); Metcalf y col., Plasmid 35: 1
(1996) ; Patente de Estados Unidos N.° 5.470.727 de Mascarenhas y col.), o por insercion al azar usando sistemas basados en transposones (Herrero y col. J. Bacteriol. 172: 6557 (1990); Peredelchuk y Bennett, Gene 187: 231
(1997) ; Patente de Estados Unidos N.° 5.595.889 de Richaud y col.; Patente de Estados Unidos N.° 5.102.797 de Tucker y col.). En general, las cepas microbianas que contienen una insercion se seleccionan en funcion de un gen de resistencia a antibioticos adquirido que se proporciona a traves de la construccion integrada. Sin embargo, tambien puede utilizarse complementacion de mutantes auxotroficos. Para introducir cualquiera de los transgenes que codifican las diversas rutas metabolicas descritas en el presente documento pueden utilizarse los mismos procedimientos. Algunos de estos procedimientos se describen mas adelante con mas detalle con respecto a los genes pha.
La expresion de los genes de interes para la integracion cromosomica puede realizarse incluyendo una secuencia activadora de la transcripcion (promotora) en la construccion de ADN a integrar. La recombinacion homologa, dirigida pueden combinarse con amplificacion de expresion de genes de interes, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 5.000.000 de Ingram y col.
La integracion cromosomica tambien puede realizarse mediante los procedimientos de Datsenko y Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645 (2000)), y como se utiliza en el Ejemplo 7, mas adelante.
Para la insercion de genes heterologos en cromosomas bacterianos se ha desarrollado una serie de casetes de expresion. Estos casetes se basan en los sistemas de suministro de transposones descritos por Herrero y col., J. Bacteriol. 172: 6557-67 (1990); de Lorenzo y col., J. Bacteriol. 172: 6568 (1990). Aunque estos sistemas especifican la transferencia conyugal mediada por RP4 y utilizan solo los transposones Tn10 y Tn5, cualquier combinacion de extremos de transposon y sistema de suministro podna adaptarse a la tecnologfa descrita, dando como resultado una produccion de PHA sostenida y homogenea.
Para la generacion de productores transgenicos de PHB de E. coli se utilizo la siguiente estrategia general: (1) un gen de resistencia a antibiotico (abr) sin promotor se clono en el polienlazador de un plasmido adecuado tal como pUC18NotI o pUC18SfiI de tal manera que la mayor parte del polienlazador estaba corriente arriba de abr; (2) genes pha, genes que codifican una GABA transaminasa, una succmico semialdetudo reductasa y una 4-hidroxibutirato- CoA transferasa se clonaron posteriormente corriente arriba del gen abr y en la misma orientacion que la del gen abr; (3) el casete pha-abr se escindio como un fragmento Notl o AvrII (AvrII reconoce el sitio Sfil en pUC18SfiI) y se clono en los sitios correspondientes de cualquier plasmido como los de las series pUT- o pLOF-; (4) los plasmidos resultantes se mantuvieron en cepas de E. coli A pir y se sometieron a electroporacion o se conjugaron en la cepa de E. coli de eleccion en la que estos plasmidos no se replican; y (5) nuevas cepas en las que el casete pha-abr se habfa integrado satisfactoriamente en el cromosoma, se seleccionan en medio selectivo para el hospedador (por ejemplo, acido naladfxico cuando el hospedador es resistente a acido naladfxico) y para el casete (por ejemplo, cloranfenicol, kanamicina, tetraciclina, cloruro de mercurio, bialafos). Los integrantes de pha resultantes se exploraron en medio mmimo en presencia de glucosa con respecto al crecimiento y formacion de PHB.
En este procedimiento pueden realizarse diversas modificaciones. Si no se utiliza el marcador de resistencia a antibiotico sin promotor, la insercion de los genes de PHA se selecciona basandose en un marcador presente en el vector y cepas integradas productoras del nivel deseado de PHA se detectan explorando la produccion de PHA. Los genes pha pueden tener, pero no necesariamente, secuencias de transcripcion endogenas, tales como secuencias activadoras corriente arriba, sitios de union a la ARN polimerasa y/o secuencias operadoras. Si los genes pha no tienen dichas secuencias, la estrategia descrita esta limitada al uso de vectores como los de la serie pUT en las que la transcripcion puede proseguir a traves de las secuencias de insercion. Esta limitacion se debe a la incapacidad de la ARN polimerasa de leer a traves de las regiones flanqueantes Tn10 de los plasmidos pLOF. El gen abr puede llevar sus propias secuencias de expresion si se desea. En lugar de un gen abr, la construccion puede disenarse de tal manera que un gen esencial actua como un marcador selectivo cuando la cepa hospedadora tiene una mutacion en el gen de tipo silvestre correspondiente. En la tecnica se conocen en general ejemplos de genes utiles para este fin. En un hospedador pueden integrarse diferentes construcciones, posterior o simultaneamente, siempre que ambas construcciones lleven diferentes marcadores. Utilizando eventos de integracion multiples, los genes pha pueden integrarse por separado, por ejemplo, el gen de PHB polimerasa se integra primero como un casete phaC- cat, seguido de la integracion de los genes de tiolasa y reductasa como un casete phaAB-kan. Como alternativa, un casete puede contener todos los genes pha mientras que otro casete solo contiene algunos genes pha requeridos para la produccion de un polfmero de PHA deseado.
En algunos casos, puede utilizarse un vector de integracion de transposones, tal comopJMS11 (Panke y col. Appl. Enviro. Microbiol. 64: 748-751) de tal manera que el marcador de seleccion puede escindirse del cromosoma de la cepa integrada. Esto es util por diversas razones, entre las que se incluye el proporcionar un mecanismo para insertar construcciones de transposones multiples utilizando el mismo gen marcador escindiendo el marcador despues de cada evento de insercion.
3. Fuentes de pha y otros genes implicados en la formacion de PHA
Una referencia general para genes implicados en la formacion de PHA es Madison y Huisman, 1999, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63: 21-53. Los genes pha pueden proceder de diferentes fuentes y combinarse en un solo organismo, o pueden proceder de la misma fuente.
5 i. Genes que codifican reductasa
Los genes que codifican reductasa se han aislado de A. latus, R. eutropha (Peoples y Sinskey, J. Biol. Chem. 264(26): 15298-303 (1989); Acinetobacter sp. (Schembri, y col., J. Bacteriol. 177(15): 4501-7 (1995)), C. vinosum (Liebergesell y Steinbuchel, Eur. J. Biochem. 209(1): 135-50 (1992)), P. acidophila, P. denitrificans (Yabutani, y col., FEMS Microbiol. Lett. 133 (1-2): 85-90 (1995)), R. meliloti (Tombolini, y col., Microbiology 141: 2553-59 (1995)), y Z. 10 ramigera (Peoples, y col., J. Biol. Chem. 262(1):97-102 (1987)). La Patente de Estados Unidos N.° 7.229.804 desvela organismos transgenicos que producen P4HB utilizando el gen 4hbD que codifica 4-hidroxibutirato deshidrogenasa de C. kluyveri (Sohling y Gottschalk, J. Bacteriol. 178,871 880 (1996)). El gen 4hbD requiere NADH. Las reductasas preferidas incluyen, pero sin limitacion, las que no requieren NADH. Como reductasas ejemplares se incluyen AKR7A5 de Mus musculus (GenInfo Identifier: 27659727) (Hinshelwood, A. y col. FEBS Letters 523: 21315 218 (2002), GHBDH de Arabidopsis thaliana (GI:145338934) (Breitkreuz, K. y col. J. Biol. Chem. 278: 41552-41556,
ATEG_00539 de Aspergillus terreus (GI:115491994).
ii. CoA transferasa y CoA sintetasa
Las CoA transferasas (EC 2.8.3.n) adecuadas incluyen, pero sin limitacion, orfZ de C. kluyveri. La secuencia de orfZ se proporciona en la Patente de Estados Unidos N.° 7.229.804 de Huisman y col. Otra CoA transferasa adecuada 20 incluye abfT de C. aminobutyricum (Gerhardt y col., Arch Microbiol 74: 189-199 (2000)). Otras enzimas que podnan producir acil-CoA incluyen CoA sintetasas (EC 6.2.1.3). Estas enzimas utilizan ATP y CoA libre para catalizar la adicion covalente de CoA para el acido carboxflico y se han descrito en van Beilen y col. (Molec Microbiol (1992) 6:3121-3136) y en Aquin y col. (documento WO 02/40690 A2).
iii. Genes que codifican PHA polimerasa
25 Se han aislado genes que codifican PHA polimerasa de Aeromonas caviae (Fukui y Doi, J. Bacteriol. 179(15): 482130 (1997)), A. latus, R. eutropha (Peoples y Sinskey, J. Biol. Chem. 264(26): 15298-303 (1989); Acinetobacter (Schembri, y col., J. Bacteriol. 177(15): 4501-7 (1995)), C. vinosum (Liebergesell y Steinbuchel, Eur. J. Biochem. 209(1): 135-50 (1992)), Methylobacterium extorquens (Valentin y Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol. 39(3): 309-17 (1993)), Nocardia corallina (N.° Reg. GenBank AF019964), Nocardia salmonicolor, P. acidophila, P. 30 denitrificans (Ueda, y col., J. Bacteriol. 178(3): 774-79 (1996)), Pseudomonas aeruginosa (Timm y Steinbuchel, Eur. J. Biochem. 209(1): 15-30 (1992)), Pseudomonas oleovorans (Huisman, y col., J. Biol. Chem. 266: 2191-98 (1991)), Rhizobium etli (Cevallos, y col., J. Bacteriol. 178(6): 1646-54 (1996)), R. meliloti (Tombolini, y col., Microbiology 141 (Pt 10): 2553-59 (1995)), Rhodococcus ruber (Pieper y Steinbuchel, FEMS Microbiol. Lett. 96(1): 73-80 (1992)), Rhodospirrilum rubrum (Hustede, y col., FEMS Microbiol. Lett, 93: 285-90 (1992)), Rhodobacter sphaeroides 35 (Steinbuchel, y col., FEMS Microbiol. Rev. 9(2-4): 217-30 (1992); Hustede, y col., Biotechnol. Lett. 15: 709-14 (1993)), Synechocystis sp. (Kaneko, DNA Res. 3(3): 109-36 (1996)), T. violaceae (Liebergesell & Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38(4: 493-501 (1993)) y Z. ramigera (N.° Reg. GenBank U66242).
Tambien pueden utilizarse otros genes que no se han implicado en la formacion de PHA pero que comparten homologfa significativa con los genes pha y/o con los productos genicos correspondientes. Se han aislado genes 40 con homologfa significativa a la del gen phaB que codifica la acetoacetil CoA reductasa de diversos organismos, entre los que se incluyen Azospirillum brasiliense (NCBI N.° de Registro X64772, X52913) Rhizobium sp. (N.° de registro NCBI U53327, Y00604), E. coli (N.° de registro NCBI D90745), Vibrio harveyi (N.° de registro NCBI U39441), H. influenzae (N.° de registro NCBI U32701), B. subtilis (N.° de registro NCBIU59433), P. aeruginosa (N.° de registro NCBIU91631), Synechocystis sp. (N.° de registro NCBI D90907), H. pylori (N.° de registro NCBI AE000570), 45 Arabidopsis thaliana (N.° de registro NCBI X64464), Cuphea lanceolata (N.° de registro NCBI X64566) y Mycobacterium smegmatis (N.° de registro NCBI U66800).
IN. Procedimientos de produccion de PHA que contienen 5HV y productos qmmicos C5
Se proporcionan procedimientos para la produccion de polihidroxialcanoatos utilizando fuentes de carbono renovables como materia prima. En una realizacion preferida, las bacterias se transforman o transfectan con una o 50 mas construcciones de acidos nucleicos que codifican los genes necesarios para la produccion de 5- aminopentanoato (5AP), 5-hidroxivalerato (5HV), glutarato y 1,5-pentanodiol (PDO) y polfmeros de los mismos a partir de fuentes renovables.
IV. Procedimientos de uso
Los organismos transgenicos desvelados pueden utilizarse para la produccion de productos qmmicos C5, tales 55 como 5-aminopentanoato (5AP), 5-hidroxivalerato (5HV), glutarato y 1,5-pentanodiol (PDO), asf como biopolfmeros de PHA que comprenden monomeros de 5HV. En el caso de la produccion de los productos qmmicos de 5 atomos
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de carbono, C5, el organismo recombinante que expresa el transgen, o los transgenes, apropiado(s), opcionalmente incluyendo los que tienen genes que codifican rutas competidoras inactivadas o eliminadas, se cultivan en un sustrato de fermentacion renovable. El sustrato se selecciona entre hidratos de carbono, lisina, prolina, aceites vegetales, acidos grasos o combinaciones de los mismos. Una combinacion util para algunas realizaciones sena una mezcla de glucosa y lisina. Otra combinacion adecuada sena sacarosa y lisina. Preferentemente la materia prima comprende predominantemente un sustrato, por ejemplo, glucosa o sacarosa. Los sustratos de hidratos de carbono adecuados comprenden uno o mas azucares seleccionados de glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, lactosa y maltosa. Para la produccion de productos qmmicos C5, el organismo recombinante se cultiva en el sustrato renovable hasta que el producto final deseado se acumula en el medio de cultivo, momento en el cual las celulas se retiran por floculacion, sedimentacion, centrifugacion o filtracion y el producto se recupera del medio acelular por procedimientos convencionales. Para la recuperacion de otros acidos producidos por fermentacion y dioles tales como acido lactico, acido succmico, acido 3-hidroxipropionico, 1,3-propanodiol y 1,4-butanodiol, dichos procedimientos son conocidos en la tecnica.
Los organismos recombinantes pueden utilizarse para la produccion por fermentacion de biopolfmeros de PHA que contienen 5HV incluyendo copolfmeros de PHA que contienen homopolfmero de P5HV y 5HV cultivando los organismos en presencia de fuentes de carbono renovables tales como glucosa, lisina, etc. y otros sustratos seleccionados para proporcionar un polfmero o un copolfmero deseado. Los organismos recombinantes se cultivan en los sustratos hasta que los polfmeros de PHA se han acumulado dentro de las celulas, momento en el cual los polfmeros de PHA se extraen de las celulas por procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Los polfmeros de PHA que contienen 5HV obtenidos de los organismos, pueden utilizarse en una gran variedad de aplicaciones plasticas industriales, tales como para pelfculas, fibras, espumas, artfculos moldeados por inyeccion, frascos moldeados por soplado, recubrimientos de papel y similares. Estos tambien pueden utilizarse para aplicaciones biomedicas incluyendo el aumento de tejido, para la produccion de valvulas cardiacas, como suturas, y para la produccion de injertos vasculares. Como ejemplos de copolfmeros se incluyen, pero sin limitacion, PHB5HV y p(3-hidroxipropianato-co-5-hidroxivalerato) p(4-hidroxibutirato-co-5-hidroxivalerato). Los organismos recombinantes pueden modificarse por ingeniena genetica para incluir genes adicionales tales como beta-cetotiolasa y acetoacetil- CoA reductasa segun sea necesario para la produccion de copolfmeros.
A menos que se defina de otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado al normalmente entendido por un experto en la tecnica a la cual pertenece la invencion desvelada.
Ejemplos
Ejemplo 1: Biosmtesis del homopolimero P(5HV) a partir de 5-hidroxivalerato de sodio
Como una primera demostracion de la capacidad de sintetizar PHA que contienen 5HV, se suministro 5- hidroxivalerato de sodio (Na5HV) a cepas de E. coli que expresaban tanto una CoA transferasa o CoA sintetasa como una PHA sintetasa, para determinar si el monomero 5HV suministrado podna aceptarse e incorporarse directamente en el homopolfmero P(5HV), el Na5HV se sintetizo mediante hidrolisis basica de 8-valerolactona (DVL). Este procedimiento implico la adicion de NaOH 0,1 mol a metanol 50 ml con agitacion hasta su disolucion. Para ello, se anadio DVL 0,1 mol con agitacion intensa. El precipitado resultante se seco, se disolvio en agua, se ajusto el pH a 8,5, y se esterilizo en filtro con un filtro de 0,2 |jM. Para confirmar que toda la DVL se habfa saponificado, se realizo analisis de la solucion salina en un HPLC Waters Alliance.
Se ensayaron diferentes combinaciones de genes de CoA transferasa/sintetasa y PHA sintasa para encontrar la mejor combinacion adecuada para la produccion de P(5HV). Las CoA transferasas/sintetasas ensayadas fueron orfZ de C. kluyveri y alkK de P. oleovorans, y las PHA sintasas fueron phaC de R. eutropha y phaEC de T. pfenigii (Tabla 1A). Todas las cepas utilizadas en este experimento procedfan de MG1655 (Jensen, J. Bacteriol, 175(11): 34013407 (1993)). Se construyeron cuatro plasmidos de expresion (pFS92, pMS96, pMS93 y pMS102), cada uno de ellos conteniendo diferentes combinaciones de CoA transferasa/sintetasa y PHA sintasa, como se describe en los siguientes parrafos.
Construccion de plasmidos
El plasmido pFS30 se construyo por digestion de pAET41 (Peoples y Sinskey, J. Biol. Chem. 264(26): 15298-15303 (1989)) con Xmal y StuI para eliminar un fragmento que contema phaC de R. eutropha y su promotor nativo (PRe). El plasmido pAET41 es un vector pUC18 (N.° de registro L08752) que contiene un fragmento de cromosoma de H16 de R. eutropha que incluye el gen phaC. El plasmido pFS16 (Skraly y Peoples, Patente de Estados Unidos N.° 6.323.010), que es un derivado de pTrc99a (Pharmacia, Uppsala, Suecia) que contiene el gen orfZ de C. kluyveri (Tabla 1A) bajo el promotor PRe, se digirio con BamHI, se enromo con T4 polimerasa, y se digirio una segunda vez con Xmnl antes del ligamiento con el fragmento PRe-phaC Xmal-Stul. El plasmido resultante se denomino pFS30 y contema la fusion de phaC- operon orfZ bajo el promotor PRe expresado de manera constitutiva.
El plasmido pFS92 se creo en un procedimiento multietapa. Primero, phaE de T. pfenigii se amplifico de pMON25893 (Reiser y col., Appl. Microbiol. Biotechnol. 53(2): 209-218 (2000)) con cebadores FS-E5' y FS-E3', que
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conteman sitios de restriccion EcoRI y Acc65I modificados geneticamente. El producto PCR phaE se digirio despues con enzimas de restriccion EcoRI y Acc65I y se ligaron con pTrcN digerido de manera similar (Gerngross y col., Biochemistry 33:9311-9320 (1994)) para formar pFS89. La secuencia del cebador para FS-E5' es (5')- GGAATTCAGGAGGTTTTTATGAACGATACGGCCAACAAGACCAGC (SEQ ID NO: 1) y la secuencia del cebador para FS-E3' es (5')-GGGGTACCTCACTGGCCGGTGGTGGGCTTGGTGGTCTTGCGGCG (SEQ ID NO: 2). A continuacion, phaC de T. pfenigii se amplifico de pMON25894 (Reiser y col., Appl. Microbiol. Biotechnol. 53(2): 209218 (2000)) con los cebadores FS-C5' y FS-C3', que conteman sitios de restriccion Acc65I y BamHI modificados geneticamente. Despues, el producto de PCR phaC se sometio a digestion con las enzimas de restriccion Acc65I y BamHI y se ligo con pTrcN digerido de manera similar para formar pFS90. La secuencia del cebador para FS-C5' es (5')-GGGGTACCAGGAGGTTTTTATGTCCCCATTCCCGATCGACATCCG (SEQ ID NO: 3) y secuencia del cebador para FS-C3' es (5')-CGGGATCCTCAGCCGCGTTCGTTCAGCCAGCGGCCGATCGCCG (SEQ ID NO: 4). Despues, phaE y phaC de T. pfenigii se clonaron individualmente en pTrcN para formar pFS89 y pFS90, respectivamente, phaE se clono corriente arriba de phaC por digestion de pFS89 con MluI y Acc65I, aislando el fragmento que contema phaE, y ligandolo con una preparacion de pFS90 digerida de manera similar. El plasmido resultante, pFS91, contema la fusion operon phaEC bajo el promotor Pjrc. Finalmente, se creo pFS92 ligando un fragmento MluI-BamHI de pFS91 que contema phaEC con pFS16 que se habfa digerido con MluI y BamHI. El plasmido pFS92 contiene la fusion de operon phaEC-orfZ bajo el promotor Ptc
El plasmido pMS96 se creo clonando alkK (vease la Tabla 1A) en pFS91 corriente abajo de phaEC. Primero, alkK se amplifico por PCR a partir de ADN genomico de P. oleovorans utilizando los cebadores K5-1 y K3-1, que se modificaron geneticamente para incorporar los sitios BamHI sobre los extremos del producto de la PCR. La secuencia para el cebador K5-1 es (5')-GCTGAGGATCCAGGAGGTTTTTATGTTAGGTCAGATGATGCGTAATC (SEQ ID NO: 5) y la secuencia para el cebador K3-1 es (5')-CTAGAGGATCCTTATTCACAGACAGAAGAACTACTG (SEQ ID NO: 6). Despues de la amplificacion, el fragmento PCR alkK y pFS91 (descritos en el parrafo anterior) se digirieron con BamHI y se ligaron para formar pMS96. Se verifico que la orientacion de alkK en pMS96 estaba en la misma direccion que phaEC por digestion con enzimas de restriccion, garantizando de este modo la construccion adecuada de una fusion de operon phaEC-alkK bajo el promotor Ptc
Los plasmidos pMS93 y pMS102 se construyeron dirigiendo primero pACYC177 (N.° de registro X06402) con BspHI para eliminar el marcador kan y ligarlo en el unico sitio BspHI de pFS30 para formar pFS73, que contema phaC-orfZ bajo el control de promotores en tandem Prrc y PRe. La region del promotor PRe se elimino reemplazando el fragmento EcoRI-BspEI de pFS73 que contema tanto PRe como 837 pb desde el extremo 5' de phaC CDS con un fragmento EcoRI-BspEI de pKAS4 (Peoples y col., Patente de Estados Unidos N.° 5.480.794) que solo contema los 837 pb desde el extremo 5' de phaC. Este plasmido resultante, que contema phaC-orfZ solo bajo el promotor Pirc, se denomino pMS93. Para crear pMS102, el gen orfZ se elimino de pFS73 por digestion con DraI y se autoligo con la estructura del plasmido para formar pMS74. El gen alkK se amplifico por PCR del plasmido pTrcN-A.eut-AlkK (descrito mas adelante) utilizando los cebadores K5-2 y K3-2. La secuencia para el cebador K5-2 es (5')- AATTCAGGAGGTTTTTATGTTAGGTCAGATGATGCGTAATC (SEQ ID NO: 7) y la secuencia para el cebador K3-2 es (5')-GATCCTTATTCACAGACAGAAGAACTACTG (SEQ ID No: 8). Despues, el plasmido pMS74 se digirio con SpeI y SbfI y los extremos se enromaron con relleno Klenow y el fragmento de pCr alkK se ligo a la estructura pMS74 enromada para formar pMS92. El plasmido pMS92 contema por tanto la fusion del operon phaC-alkK bajo el control de los promotores en tandem Pirc y PRe. Para expresar el operon exclusivamente a partir del promotor Pirc inducible por IPTG, la region del promotor PRe se elimino reemplazando el fragmento EcoRI-BspEI de pMS92 que contema tanto PRe como los 837 pb del extremo 5' de phaC CDS, con un fragmento EcoRI-BspEI de pMS93 que contema solo los 837 pb del extremo 5' de phaC. Este plasmido resultante, que contema phaC-alkK solo bajo el promotor Pjrc, de denomino pMS102.
El plasmido pTrcN-A.eut-AlkK se creo amplificando primero por PCR alkK a partir de ADN genomico de P. oleovorans utilizando los cebadores Posynrbs.c (5'-
GGAATTCAGGAGGTTTTTATGTTAGGTCAGATGATGCGTAATCAG) (SEQ ID NO: 9) y Posynrbs.r (5'- CGGGATCCTTATTCACAGACAGAAGAACTACTGCG) (SEQ ID NO: 10). El producto resultante de la PCR se digirio con EcoRI y BamHI y se ligo con pTrcN digerido de manera similar para crear pTrcN-AlkK. El promotor PRe se amplifico despues por PCR a partir de ADN genomico de Ralstonia eutropha utilizando los cebadores A.eut.PhaG.c (5'-GGAATTCGGATCCCAAGTACCTTGCCGACATCTATGCGCTGGC) (SEQ ID NO: 11) y A.eut.EcoRI.r (5'- GGAATTCCCGGCTCCGGGATTGCCCTGGCCGGACT) (SEQ ID NO: 12). El producto resultante de la PCR se digirio con EcoRI y se ligo con pTrcN-AlkK digerido de manera similar para crear pTrcN-A.eut-AlkK.
Los plasmidos pFS92, pMS96, pMS93 y pMS102 se transformaron individualmente en MG1655 (Jensen, J. Bacteriol. 175(11): 3401-3407 (1993)) para crear cuatro cepas portadoras de plasmido que conteman diferentes combinaciones de CoA transferasa/sintetasa (orfZ o alkK) y PHA sintasa (phaC o phaEC). Estas cepas se cultivaron en matraces agitadores de 250 ml para caracterizar la produccion del homopolfmero P(5HV), como se describe en la siguiente seccion.
Medios, condiciones de cultivo y ensayo para la produccion de homopolmero P(5HV) en cultivos con matraces agitadores
Cada cepa MG1655 portadora de plasmido se cultivo durante una noche en un tubo de ensayo que contema LB 3 ml
(Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (2001)) complementado con antibiotico apropiado a 37 °C con agitacion a 250 rpm. Los antibioticos apropiados para cada cepa eran los siguientes: a cultivos durante una noche de cepas de MG1655, portadoras de pFS92 y pMS96, se anadio ampicilina 100 pg/ml; y a cultivos durante una noche de cepas MG1655, portadoras de pMS93 y pMS102, se anadio Km 50 5 pg/ml. Al dfa siguiente, 0,5 ml de cada cultivo durante una noche se utilizaron para inocular un matraz agitador que contema 50 ml de LB reciente complementado con el antibiotico apropiado y se cultivo a 37 °C con agitacion a 250 rpm. Al cabo de 3,5 horas, se anadio IPTG 0,1 mM a los cultivos lfquidos, y a las 5 horas, el cultivo se centrifugo a 4150 rpm (centnfuga de sobremesa Sorvall Legend RT) y se resuspendio en 50 ml de medio de produccion que contema IPTG 0,1 mM y el mismo antibiotico. El medio de produccion consistfa en solucion de sales minima 1x E2 10 que contema glucosa 10 g/l, LB 2,5 g/l, Na5HV 10 g/l, MgSO4 2 mM y solucion de sales traza 1x. La solucion de reserva 50x E2 consistfa en NaNH4HPO4-4H2O 1,275 M, K2HPO4 1,643 M y KH2PO41,36 M. La solucion de reserva de sales traza 1000x se preparo anadiendo por 1 l de HCL 1,5 N: FeSO4-7H2O 50 g, ZnSO4-7H2O 11 g, MnSO4-4H2O 2,5 g, CuSO4'5H2O, 5 g (NH4)aMo7O24'4H2O 0,5 g, Na2B4Oy 0,1 g y CaCh-2H2O 10 g.
Los cultivos resuspendidos se transfirieron a matraces agitadores de 250 ml y se incubaron a 30 °C durante 24 a 72 15 horas con agitacion. Al final del experimento, los cultivos se centrifugaron a 4150 rpm, se lavaron una vez con agua destilada, se congelaron a -80 °C durante al menos 30 minutos y se liofilizaron durante una noche. Al dfa siguiente, una cantidad medida de sedimento celular liofilizado se anadio a un tubo de vidrio, seguido de 3 ml de reactivo de butanolisis que consistfa en una mezcla del mismo volumen de n-butanol al 99,9 % y HCl 4,0 N en dioxano con difenilmetano 2 mg/ml como patron interno. Despues de tapar los tubos, se sometieron a agitacion vorticial 20 brevemente y se colocaron en un bloque termico ajustado a 93 °C durante seis horas con agitacion vorticial periodica. Despues de esto, el tubo se enfrio a temperatura ambiente antes de anadir 3 ml de agua destilada. El tubo se sometio a agitacion vorticial durante aproximadamente 10 s antes de centrifugar a 620 rpm (centnfuga de sobremesa Sorvall Legend RT) durante 2 min. Despues, 1 ml de la fase organica se transfirio con pipeta a un vial de GC, que despues se analizo por cromatograffa de gases con detector de ionizacion de llama (GC-FID) (Hewlett 25 Packard 5890 Series II). La cantidad de homopolfmero P(5HV) en el sedimento celular se determino comparando frente a curvas patron que se crearon anadiendo cantidades definidas de DVL en reacciones de butanolisis distintas. Para crear las curvas patron, se utilizaron tres patrones de DVL de 2-6 mg.
Resultados experimentales
La Tabla 2 muestra que todas las construcciones podfan generar P(5HV). Sin embargo, MG1655 [pMS93] genero 30 significativamente mas P(5HV) que cualquiera de las otras cepas, lo que demostraba que la combinacion genica optima para polimerizar P(5HV) era phaC y orfZ.
Tabla 2. Produccion de homopolfmero P(5HV)
Cepa [Plasmido]
Genotipo relevante P(5HV) (% dcw)
MG1655 [pMS93]
Ptrc-phaC-orfZ 54,6
MG1655 [pFS92]
Ptrc-phaEC-orfZ 5,7 + 1,2
MG1655 [pMS96]
Ptrc-phaEC-alkK 3,82
MG1655 [pMS102]
Ptrc-phaC-alkK 35,2
Ejemplo 2: Biosmtesis de copolimero P(3HB-co-5HV) a partir de 5-hidroxivalerato de sodio
35 El siguiente experimento era demostrar la produccion de copolfmero P(3HB-co-5HV) en una cepa de E. coli capaz de sintetizar los monomeros 3HB-coA y 5HV-CoA y su incorporacion en PHA.
Construccion de la cepa
La cepa que se utilizo en este experimento fue MBX2641, que es un derivado de MG1655 que contiene un operon que consiste en phaB-kan de B. megaterium - bktB-B de R. eutropha H16 integrado al azar en el cromosoma. Para 40 realizar la integracion del operon, la cepa S17-1Xpir (Miller y Mekalanos, J. Bacteriol. 170(6): 2575-2583 (1988)) que contema pCJ022 (descrita mas adelante) se emparejo con MBX1987, que es un mutante de MG1655 resistente al acido nalidfxico, utilizando un protocolo extrafdo de la bibliograffa (De Lorenzo y Timmis, Methods Enzymol. 235: 386-405 (1994)). Derivados de MBX1987, que llevaban el casete bktB-phaB-kan en el cromosoma, se seleccionaron en placas con LB que conteman acido nalidfxico (NI) 30 pg/ml y kanamicina (Km) 50 pg/ml. Un integrante de este 45 tipo, que mostraba un fenotipo NIR KmR se guardo como MBX2079. Despues, phaEC-cat se integro al azar en el cromosoma de MBX2079 emparejando con una cepa S17-1Xpir que llevaba el vector de integracion pUT-C16-cat (descrito mas adelante). Integrantes de MBX2079, que llevaban el casete phaEC-cat en el cromosoma, se seleccionaron en placas con LB que contema cloranfenicol (Cm) 25 pg/ml. Diversos integrantes que posefan el fenotipo NIr KmR CmR se agruparon y sometieron a mutagenesis con nitrosoguanidina (Miller, Experiments in
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Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)) con seleccion en placas con LB que contema Cm 100 |jg/ml. Se aislo un mutante y se denomino MBX2114. Finalmente, se creo MBX2641 creando un lisado P1 en MBX2114 y transluciendolo en MG1655, como describe Miller (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)) utilizando KmR como seleccion. Un transductante de este tipo se guardo y se denomino MBX2751, que es MG1655 con el casete genico bktB-phaB-kan integrado al azar en el genoma.
Los plasmidos pFS92 (vease el Ejemplo 1) y pJB84 (construccion descrita mas adelante), se transformaron individualmente en MBX2741 que contema bktB-phaB-kan integrado al azar en el cromosoma.
Construccion del plasmido
El plasmido pCJ022 se genero creando un vector de integracion mini-Tn5 que contema bktB-phaB corriente arriba de un marcador kan. Para ello, el operon bktB-phaB se ensamblo en pSE380 lnvitrogen, Carlsbad, CA) amplificando primero por PCR bktB con los cebadores MS069 y MS070 a parir de pMON25765 (Slater y col., J. Bacteriol. 180(8): 1979-1987 (1998)). La secuencia para el cebador MS069 es (5')-
GGTGGATCCTTAAGAGGAGGTTTTTATGACGCGTGAAGTGGTAGT GG (SEQ ID NO: 13) y la secuencia para el cebador MS070 es (5')-GGTGCTAGCTCAGATACGCTCGAAGATGGCG (SEQ ID NO: 14). El fragmento resultante de la PCR se digirio con BamHI y Nhel y se ligo en pSE380 que se habfa cortado con las mismas enzimas. El plasmido resultante se denomino pSE380-bktB. A continuacion, phaB se amplifico por PCR a partir de pGM10 (McCool y Cannon, J. Bacteriol. 181(2): 585-592 (1999)) con los cebadores MS071 y MS072. La secuencia para el cebador MS071 es (5')-GGTCCTAGGTTAAGAGGAGGTTTTTATGACAACATTACAAGGTAA AG (SEQ ID NO: 15) y la secuencia para el cebador MS072 es (5')-GGTGCGGCCGCTTACATGTATAAGCCGCCGTTAAT (SEQ ID NO: 16). El fragmento resultante de la PCR se digirio con AvrII y Notl y se ligo con pSE380-bktB que se habfa tratado con las mismas enzimas. El plasmido resultante se denomino pSE380-bktBphaB19. Despues de haber ensamblado el operon, este se transfirio a pTrcN-kan (un derivado de pTrcN que tema reemplazado el gen bla con el gen kan) por digestion de pSE380-bktBphaB19 con EcoRi y Spel y ligando el fragmento que contema bktB-phaB con pTrcN-kan que se habfa cortado con EcoRI y Xbal. El plasmido resultante se denomino pMS115. Despues, el operon bktB-phaB se transfirio de pMS115 al vector de integracion pBSL118 (Alexeyev y col., Can. J Microbiol. 41: 1053-1055 (1995)) por digestion de pMS115 y pBSL118 con BamHI y ligandolos entre sf para la produccion del plasmido pCJ022, que se utilizo para integrar bktB-phaB en el cromosoma de MG1655.
El plasmido pUT-C16cat se genero eliminando phaEC de pFS91 con EcoRI y Xbal y enromando los extremos cohesivos usando Klenow. El vector de integracion pUT-cat (De Lorenzo y Timmis, Methods Enzymol. 235: 386-405 (1994)) se digirio con AvrII, se enromo usando relleno Klenow y despues se ligo con el fragmento phaEC. Despues de verificar que PhaEC tema la misma orientacion que el marcador cat corriente abajo, el plasmido se denomino pUT-C16cat.
El plasmido pJB84 se construyo amplificando por PCR el marcador aacC (GmR) a partir de pBSL202 (Alexeyev y col., Can. J. Microbiol. 41: 1053-1055 (1995)) utilizando los cebadores JB12b y JB124a, que se modificaron geneticamente para incluir los sitios BspHI, en los extremos flanqueantes 5'. La secuencia para el cebador JB123b es (5')-TTATTTCATGAACCCTCGAATTGACGCGCTC (SEQ ID NO: 17) y la secuencia para el cebador JB124a es (5')-TTATTTCATGAGCTTATCGATACCGTCGACC (SEQ ID NO: 18). El fragmento resultante de la PCR, que contema el gen aacC, se digirio con BspHI y se ligo con pMS93 que se habfa digerido con la misma enzima para formar pJB84. Observese que esta ultima etapa se realizo para reemplazar el marcador bla (ApR) original en pMS93 por aacC (GmR) en la misma orientacion.
Resultados experimentales
Las cepas MBX2641, que llevaban los plasmidos pFS92 (descrito en el Ejemplo 1) o pJB84, se cultivaron y prepararon para analisis con GC-FID, como se describe en el Ejemplo 1. Como se muestra en la Tabla 3, MBX2641 [pJB84] genero mas copolfmero (69,5 % dcw) e incorporo mas 5HV en el copolfmero (82,3 % de PHA).
Tabla 3. Produccion de P(3HB-co-5HV)
Cepa [Plasmido]
Genes relevantes expresados PHA Total Incorporacion de 3HB Incorporacion de 5HV
(% dcw) (% PHA) (% PHA)
MBX2641 [pFS92]
bktB-phaB; phaEC-orfZ 7,8 46 54
MBX2641 [pJB84]
bktB-phaB; phaC-orfZ 69,5 18 82
Ejemplo 3: Composicion de monomero 5HV ajustable en copoKmero P(3HB-co-5HV) y efectos sobre propiedades materiales
La composicion copolimerica se modulo alterando las cantidades de Na5HV y de glucosa anadidas al medio de produccion. Como medios alternativos para realizar esto se incluyen (1) el suministro de diferentes cantidades de L- 5 lisina al medio de cultivo para que una celula recombinante pueda producir 5HV a partir de L-lisina como se muestra en el Ejemplo 6, o (2) la desregularizacion de genes de la ruta de L-lisina en celulas recombinantes que pueden producir 5HV a partir de glucosa mediante L-lisina, como se muestra en los Ejemplos 9 y 10.
Para demostrar la composicion de monomero 5HV ajustable en el copolfmero P(3HB-co-5HV), se utilizo la cepa MBX2641 [pFS30] que expresaba las enzimas para la ruta de 3HB (bktB y phaB) ademas de la CoA-transferasa 10 (orfZ) y la PHA sintasa (phaC). Cultivos paralelos de MBX2641 [pFS30] se cultivaron en concentraciones
decrecientes de glucosa 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0 g/l) o bien de Na5HV (10, 5,1, 0,5, 0,1, 0 g/l) y se analizo el contenido de polfmero como se describe en el Ejemplo 1. La Tabla 4 muestra que en el copolfmero P(3HB-co-5HV) pueden incorporarse varias cantidades de 5HV.
Tabla 4. Efecto del suministro conjunto sobre la incorporacion de 5HV en P(3HB-co-5HV)
Suministro de glucosa (g/l)
Suministro de Na5HV (g/l) PHA Total (% dcw) Incorporacion de 5HV (% PHA)
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42,5 +4,6 50,0 +3,4
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5 29,1 42,3
10
1 19,1 22,9
10
0,5 27,2 16,3
10
0,1 22,3 5,0
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0 14,8 2,5
5
10 27,6 51,4
1
10 12,7 45,2
0,5
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0,1
10 6,5 35,1
0
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En otro experimento, se genero un total de 10 muestras de copolfmero P(3HB-co-5HV) con una gran variedad de composiciones de 5HV y despues se extrajeron para analisis por calorimetna diferencial de barrido (DSC, differential scanning calorimetry). La Tabla 5 muestra que, a medida que aumenta el porcentaje de la composicion de 5HV en el copolfmero P(3HB-co-5HV), la temperatura de transicion vftrea (Tg) disminuye. Esto demuestra que modulando la 20 composicion comonomerica de 5HV puede obtenerse una gran variedad de propiedades materiales.
Tabla 5. Propiedades materiales de polfmeros extrafdos
Cepa / Origen
Procedimiento % 5HV Tg (°C)
MBX648 [pMS93]
Matraz agitador 100 -58
MBX2641 [pJB84]
Matraz agitador 82 -49
MBX2641 [pFS30]
Matraz agitador 52 -34
MBX2641 [pFS30]
Matraz agitador 49 -29
MBX2641 [pFS30]
Matraz agitador 47 -27
MBX2114 [pFS30]
Matraz agitador 39 -30
(continuacion)
Cepa / Origen
Procedimiento % 5HV Tg (°C)
MBX2641 [pF830]
Matraz agitador 39 -24
MBX2641 [pFS30]
Matraz agitador 23 -16
MBX2641 [pFS30]
Matraz agitador 16 -9
MBX2641 [pFS30]
Matraz agitador 5 0
Ejemplo 4: Sintesis de 3-hidroxipropionato a partir de Na5HV mediante el sistema de degradacion de acidos grasos
5 Para determinar si el sistema de degradacion de acidos grasos (FAD, fatty acid degradation) de E. coli es capaz de descomponer 5HV en acetil-Coa y 3-hidroxipropionil-CoA (3HP-CoA), el plasmido pMS93 (que expresaba phaC-orfZ de un promotor Ptrci vease el Ejemplo 1) se transformo en cepas K12 de E. coli que eran fadR+, atoC+ (FAD reprimido) o fadR-, atoCconst(FAD desreprimido). Se utilizaron MG1655 y LS5218 (Spratt y col., J. Bacteriol. 146(3): 1166-1169 (1981)) como las cepas fadR+, atoC+ y fadR-, atoCconst, respectivamente. MGl655 [pMS93] y LS52l8 10 [pMS93] se ensayaron suministrando Na5HV en matraces agitadores, como se describe en el Ejemplo 1. Los
analisis con GC-FID y Espectroscopfa de Masas (EM) demostraron que LS5218 [pMS93] produda p(5HV-co-3HP), mientras que MG1655 [pMS93] no lo produda (Tabla 6). Esto demuestra que la degradacion de acidos grasos activa producina 3HP a partir de 5HV.
Tabla 6. Incorporacion de 3HP en P(5HV-co-3HP)
Cepa [Plasmido]
Genotipo relevante PHA Total Incorporacion de 5HV Incorporacion de 3HP
(% dcw) (% PHA) (% PHA)
MG1655 [pMS93]
fadR+, atoC+ 63,1 100 0
LS5218 [pMS93]
fadR-, atoCconst 6,4 52 48
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Ejemplo 5: Biosintesis de homopoKmero P(5HV) a partir de L-lisina
El diagrama esquematico de la ruta concebida para convertir L-lisina en P(5HV) se representa en la Figura 2B y requiere seis genes heterologos a clonar y expresar en E. coli: davB de P. putida, davA de P. putida, davT de P. putida, gsaRAt• de A. thaliana, orfZ de C. kluyveri y phaC de R. eutropha (vease la Tabla 1A). Se diseno una 20 estrategia de clonacion de tal manera que los genes davBAT pudiesen clonarse en pACYC184 (Chang y Cohen, J.
Bacteriol. 134: 1141-1156 (1978)) y gsaRAt’, orfZ y phaC pudiesen clonarse en pSE380. Estos plasmidos se
denominaron pJB91 y pMZ28, respectivamente, y se ensamblan como se describe en el siguiente apartado.
Construccion de plasmidos
El sitio de clonacion multiple del plasmido pSE380 se amplifico por PCR con los cebadores JB134 (5'25 TGAGCGGATAACAATTTCAC) (SEQ ID NO: 19) y JB135 (5'-AATAACACGTCAACGCAAAAAGGCCATCCGT)
(SEQ ID NO: 20). El producto resultante de la PCR se digirio con BmgBI y se clono en el plasmido pACYC184 que se digirio con EcoRV y Nrul para crear pJB78.
El plasmido pJB91 se construyo en un procedimiento de tres etapas. Primero, los genes davBA de P. putida se amplificaron por PCR a partir de una preparacion de ADN genomico utilizando los cebadores JB136 y JB137, que se 30 modificaron geneticamente para incorporar los sitios de restriccion Ndel y BsrGI, respectivamente, en los extremos 5'
y 3' del producto de PCR davBA. La secuencia para el cebador JB136 es (5')-
TTTTTCATATGAGGAGGTTTTTATGAACAAGAAGAACCGCCA (SEQ ID NO: 21) y la secuencia para el cebador JB137 es (5')-TTTTTTGTACATCAGCCTTTACGCAGGTGCA (SEQ ID NO: 22). El producto resultante de la PCR se digirio con Ndel y BsrGI y se ligo con pJB78 que se habfa tratado con las mismas enzimas, para dar el plasmido
35 pJB79. A continuacion, el gen davT de P. putida se amplifico por PCR a partir de ADN genomico utilizando los
cebadores JB138 y JB139, que se modificaron geneticamente para incorporar los sitios de restriccion Spel y ApaLI, respectivamente, en los extremos 5' y 3' del producto de PCR davT. La secuencia para el cebador JB138 es (5')- TATATACTAGTAGGAGGATAATATGAGCAAAACCAACGAATC (SEQ ID NO: 23) y la secuencia para el cebador JB139 es (5')-TTTTTGTGCACTCAGGCGATTTCAGCGAAGC (SEQ ID NO: 24). El producto resultante de la PCR se 40 digirio con Spel y ApaLI y se ligo con pJB79 que se habfa digerido con las mismas enzimas, creando de este modo el plasmido pJB80. Finalmente, el promotor ompA se amplifico por PCR a partir de ADN genomico de K12 de E. coli
utilizando los cebadores JB141 y JB142, que se modificaron geneticamente para incorporar los sitios de restriccion BmgBI y Asel, respectivamente, en los extremos 5' y 3'. El producto resultante de la PCR se digirio con BmgBi y Asel y se ligo con pJB80 que se habfa digerido con SnaBI y Ndel para formar el plasmido pJB82. El plasmido pJB91 se construyo a traves de digestion de un producto de PCR davBA creado con los cebadores JB136 y JB137 (como se 5 ha descrito anteriormente), con DraIII y ligando el fragmento de 507 pb con pJB82 que se habfa digerido con la misma enzima, creando de este modo el plasmido pJB91. Esta construccion se realizo para corregir una mutacion finalizadora (nonsense) que se habfa descubierto en davB CDS de pJB82. El plasmido pJB80 contiene el operon davBAT bajo el promotor constitutivo Ptet, mientras que el plasmido pJB91 contiene el mismo operon bajo el fuerte promotor PompA.
10 El plasmido pMZ28 se construyo por digestion del plasmido pJ31:7950, que es una construccion creada por DNA 2.0 (Menlo Park, CA) y que contema gsaRAt que esta optimizado con codones para la expresion en K12 de E. coli, con BsrGI. El fragmento resultante que contema gsaRAt se ligo con pFS30 que tambien se habfa cortado con BsrGI. Despues de verificar que la orientacion de gsaRAt estaba en la misma direccion que phaC-orfZ por digestion con enzimas de restriccion, el plasmido resultante se denomino pMZ28.
15 Resultados experimentales
MG1655 [pMZ28] que expresa una L-lisina incompleta en la ruta de P(5HV) y MG1655 [pMZ28, pJB91] que expresa la L-lisina completa en la ruta de P(5HV), se inocularon en un tubo de ensayo que contema LB 3 ml complementado con antibiotico apropiado (cloranfenicol 25 pg/ml para pJB91; ampicilina 100 pg/ml para pMZ28) y se cultivo durante una noche a 37 °C con agitacion a 250 rpm. Al dfa siguiente, se utilizaron 0,5 ml de cada cultivo durante una noche 20 para inocular un matraz agitador que contema 50 ml de LB reciente complementado con el antibiotico o antibioticos apropiados, y se cultivo a 37 °C con agitacion a 250 rpm. Al cabo de 3,5 horas, se anadio IPTG 0,1 mM a los cultivos lfquidos, y a las 5 horas, los cultivos se centrifugaron a 4150 rpm (centnfuga de sobremesa Sorvall Legend RT) y se resuspendieron en 50 ml de medio de produccion que consistfa en una solucion de sales minima 1x E2 que contema glucosa 10 g/l, LB 2,5 g/l, L-lisina 10 g/l, MgSO4 2 mM, Solucion de Sales Traza 1x e IPTG 0,1 mM. En el Ejemplo 1 25 se proporcionan las formulas de las sales E2 y de la Solucion de Sales Traza.
Las condiciones de cultivo en matraz agitador y el protocolo de analisis para el contenido de PHA son como se describen en el Ejemplo 1. La Tabla 7 muestra que, despues de la introduccion del operon davBAT, se produda ocho veces mas P(5HV).
Tabla 7. Produccion de P(5HV) a partir de L-lisina
Cepa [Plasmido]
Genotipo relevante PHA Total (% dcw)
MG1655 [pMZ28]
pMZ28: Pjrc-gsaRM-PRe-phaC-orfZ 0,01
MG1655 [pMZ28, pJB91]
pMZ28: Pjrc-gsaRM-PRe-phaC-orfZ pJB91: PompA-davBAT 0,08
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Ejemplo 6: Biosmtesis de copolimero P(3HB-co-5HV) a partir de L-lisina
La ruta concebida para convertir L-lisina en P(5HV) tambien se introdujo en la cepa MBX2641 que expresaba bktB y phaB para la produccion del copolfmero P(3HB-co-5HV) a partir de L-lisina y eventualmente glucosa.
Construccion del plasmido
35 En este ejemplo, los genes comprendidos en la ruta incluyen: davB de P. putida, davA de P. putida, davT de P. putida, orfz de C. kluyveri, phaC de R. eutropha y gsaRAt de A. thaliana o gsaRAt2 de A. terreus (vease la Tabla 1A).
El plasmido pJB90, que contiene una ruta alternativa que consiste en los genes gsaRAt2, phaC y orfZ, se creo de la siguiente manera. El gen gsaRAt2 de A. terreus, optimizado con codones para la expresion en K12 de E. coli, se amplifico por PCR a partir de pSG40 (una construccion creada por DNA 2.0 (Menlo Park, CA)) utilizando los 40 cebadores JB145 y JB146. Ambos cebadores conteman los sitios BgIII en los extremos 5'. La secuencia para el cebador JB145 es (5')-TTTTTAGATCTAGGAGGTTTTTATGCTGCGTGCTGCTTCTCG (SEQ ID NO: 25) y la secuencia del cebador JB146 es (5')-TTTTTAGATCTTTAGCGGAAATAGTTTGGAC (SEQ ID NO: 26). El fragmento resultante de la PCR se digirio con BgIII y se ligo en el sitio de pJB84 correspondiente para crear pJB90.
Resultados experimentales
45 Las cepas MBX2641 [pJB78, pJB84], MBX2641 [pJB91, pMZ28] y MBX2641 [pJB91, pJB90] se cultivaron en matraces agitadores y se analizaron con respecto al contenido y composicion de PHA como se describe en los Ejemplos 1 y 2 para caracterizar la produccion de P(3HB-co-5HV) a partir de L-lisina y glucosa. Las cepas MBX2641 [pJB78, pPB84], MBX2641 [pJB91, pMZ28] y MBX2641 [pJB91, pJB90] se inocularon en tubos de ensayo que
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conteman LB 3 ml complementado con cloranfenicol 25 |jg/ml y ampicilina 100 jg/ml y se cultivaron durante una noche a 37 °C con agitacion a 250 rpm. Al dfa siguiente, 0,5 ml de cada cultivo durante una noche se utilizaron para inocular un matraz agitador que contema 50 ml de LB reciente complementado con el mismo antibiotico y se cultivo a 37 °C con agitacion a 250 rpm. Al cabo de 3,5 horas, se anadio IPTg 0,1 mM a los cultivos lfquidos y a las 5 horas, los cultivos se centrifugaron a 4150 rpm (centnfuga de sobremesa Sorvall Legend RT) y se resuspendio en 50 ml de medio de produccion que consistfa en solucion de sales mmimas 1 x E2 que contema glucosa 10 g/l, LB 2,5 g/l, L- lisina 10 g/l, MgSO4 2 mM, Solucion de Sales Traza 1x e IPTG 0,1 mM. En el Ejemplo 1 se proporcionan las formulas de las sales E2 y de la Solucion de Sales Traza.
Como se muestra en la Tabla 8, la cepa MBX2641 [pJB78, pJB84], que no tiene los genes que convierten L-lisina en 5HV, no pudo producir 5HV a partir de L-lisina y produjo solo homopolfmero P(3HB). Las cepas MBX2641 [pJB91, pMZ28] y MBX2641 [pJB91, pJB90], ambas de las cuales conteman toda la ruta para dar 5HV-CoA a partir de L- lisina, incorporaron 5Hv a 2,5 % en peso y 5 % en peso, respectivamente, del copolfmero total. Esto demuestra que los genes davBATy gsaR necesitan expresarse para la produccion de copolfmeros que contienen 5HV a partir de L- lisina.
Tabla 8. Produccion de P(3HB-co-5HV) a partir de L-lisina
Cepa [Plasmido]
Genotipo de plasmido relevante PHA Total (% dcw) Incorporacion de 3HB (% PHA) Incorporacion de 5HV(% PHA)
P ompA- davBAT
Ptre-phaCgsaRx- orfZ
MBX2641 [pJB78, pJB84]
ninguno Pjrc-phaC-orfZ (sin gsaRx) 38 + 9 100 0
MBX2641 [pJB91, pMZ28]
Presente P Trc-phaCgsaRAt- orfZ 33 + 11 97,5 + 1,5 2,5 + 1,5
MBX2641 [pJB91, pJB90]
Presente P Trc-phaCgsaRAt2- orfZ 41 +11 95,0 + 2,3 5,0 + 2,3
Ejemplo 7: Biosintesis mejorada de polimeros de PHA que contienen 5HV a partir de L-lisina
Debido al hecho de que el 5HV se incorporo a un nivel inesperadamente bajo, se considero la existencia de una ruta competidora. Para ver si a partir de L-lisina podfa producirse glutarato, se cultivo MG1655 [pJB91], que expresaba los genes davBAT del plasmido, en medio lB que contema cloranfenicol 25 mg/l a 30 °C con agitacion durante 6 h. Se inocularon almuotas de 25 jl de cultivos en fase semilogantmica en medio mmimo E0 475 jl y se incubo a 30 °C con agitacion a 250 rpm durante 48 h. El medio mmimo E0 consistfa en glucosa 10 g/l, lisina 4 g/l, K2HPO4 58 mM, KH2PO4 27 mM, MgSO4 2 mM, cloranfenicol 25 jg/ml, IPTG 0,1 mM y elementos traza. El glutarato, presente en el sobrenadante, se midio por GC-MS como indica mas adelante: los sobrenadantes del caldo de fermentacion se obtuvieron por centrifugacion y 1 jl de la muestra se transfirio con pipeta a un tubo Eppendorf nuevo que contema 1 jl de 4-aminobutirato (GABA) 1 g/l como patron interno. Las muestras se secaron en un centrivap de Labconco y se resuspendieron en una solucion 1:1 de acetonitrilo (ACN) 100 jl:N-(t-butildimetilsilil)-N-metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA), por ultrasonido durante 3 h. Despues, las muestras se derivatizaron a 65 °C durante 30 min, se centrifugaron para eliminar el material insoluble y los sobrenadantes se inyectaron en un GC-MS Agilent 5975 equipado con una columna HP-5ms utilizando los siguientes parametros de adquisicion: caudal de gas helio transportador 2 ml/min, modo de barrido m/z 65-700, retardo de disolvente durante 3,5 min, programa del horno: 150 °C durante 2 min, aumentando despues a 280 °C a 3 °C/min, temperatura de la fuente de iones 230 °C y temperatura del filtro de masa de cuadrupolo a 150 °C.
Cabe destacar que, cuando el operon davBAT se sobreexpresa en MG1655, se produdan 0,6 g/l de glutarato a partir de L-lisina El operon davBAT expresa genes que codifican enzimas que convierten la L-lisina en GSA. El glutarato puede producirse mediante un gen de E. coli endogeno cuya enzima codificada puede oxidar GSA en glutarato.
La inspeccion de probables reacciones enzimaticas de GSA a glutarato, condujo a la identificacion de dos genes GSA deshidrogenasa de E. coli posiblemente endogenos, gabD y/o ynel (vease la Tabla 1A). Anteriormente, se habfa identificado que estos dos genes oxidaban succmico semialdehndo en acido succmico (Dennis y Valentm, Patente de Estados Unidos N.° 6.117.658) pero no se habfa observado que oxidaran GSA en glutarato. Para comprobar si una cepa negativa a ynel y gabD aun produda glutarato a partir de L-lisina, se construyeron las siguientes cepas.
Se construyeron mutantes gabD y ynel nulos individuales mediante el procedimiento de recombinacion genetica Red/ET descrito por Datsenko y Wanner (Proc, Natl. Acad. Sci, USA. 97: 6640-6645 (2000)). El procedimiento de
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eliminacion de gabD del cromosoma de MG 1655 implico el reemplazo de gabD con un marcador kan flanqueado por FRT mediante recombinacion homologa mediada por PCR. El marcador kan flanqueado por FRT se amplifico por PCR a partir del plasmido pKD4 (Datsenko y Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645 (2000)) utilizando los cebadores RF314 5'-
GCAAGCCAGAGTAACCCCGGACGCACGCTGCGAGCGGCACGTAGTGTGGATGCCTTACACGCCGCATTTAATC AATAACCTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO: 27) y RF315 5'-
GAATTTGCCCAACGCCACGGGGAATCGCCTGACTGCGGCGCTGCATTAACTCTTTATTGCTGTTCATTCGCATTC TCCAGATGGGAATTAGCCATGGTCCATATGAATAT (SEG ID NO: 28).
El gen ynel se elimino del cromosoma de MG1655 por reemplazo con un marcador kan flanqueado por FRT. Este marcador se amplifico por PCR del plasmido pKD4 utilizando los cebadores MS220 5'-
GCAAGAGTAAATCTGCGTATCTTCATACCATGACTCATAAAGGAGATACCCCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO: 29) y MS217 5'-ACCGCAGGTCTGAAAAGACCTGCGAGTATATCAGAGCTGAATATG TCGCGCATATGAATATCCTCCTTAGT (SEQ ID NO: 30) que introdujo regiones de homologfa flanqueantes de 50 pb en el gen a eliminar. El reemplazo de ynel con este fragmento de ADN no surtio efecto y, por tanto, se creo otro fragmento por PCR que tema regiones de homologfa aumentadas para el reemplazo genico. Para lograr esto, se realizo una ronda adicional de PCR utilizando, como molde, el fragmento generado anteriormente por PCR y los cebadores MS223 5'-TCGATTCGTGAATAAGTGGCTTAATATTATTCATTTTAAAGCAAG AGTAAATCTGCGTATC (SEQ ID NO: 31) y MS224 5'-
GCCACTTTCTACTCCTGGACCGCAGGTCTGAAAAGACCTGCGAGTATATCAGAGCTG (SEQ ID NO: 32). Se consiguio un reemplazo satisfactorio de ynel con FRT-kan-FRT. El marcador kan se elimino despues como se describen Datsenko y Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645 (2000)).
Por transduccion mediada por P1 a parir de MG1655AgabD::FRT-kan-FRT a MG1655Ayne/::FRT, se construyo MG1655 AgabD;;FRT-kan-FRT, Ayne/::FRT y el marcador kan restante se elimino adicionalmente utilizando el mismo procedimiento que el descrito anteriormente. La cepa resultante MG1655 AgabD;;FRT, Ayne/::FRT se transformo con pJB91 y se analizo con respecto a la produccion de glutarato a partir de L-lisina en un experimento analogo al descrito anteriormente con MG1655 [pJB91] que expresaba los genes davBAT a partir del plasmido.
A diferencia de MG1655 [pJB91] que produda 0,6 g/l de glutarato a partir de L-lisina, la cepa MG1655 AgabD::FRT, Ayne/::FRT [pJB91] no produda glutarato a partir de L-lisina, lo que demostraba que los genes gabd y/o ynel endogenos de E. coli eran responsables de la conversion de GSA en glutarato.
Produccion mejorada de copolmeros P(3HB-co-5HV) a partir de L-lisina
La mejora del flujo de L-lisina a 5HV se realizo eliminando la GSA deshidrogenasa endogena que codifica los genes gabD e ynel en una cepa que produce el copolfmero 3HB-co-5HV.
Se construyo MBX2855 transformando los plasmidos pJB91 y pJB90 en la cepa MBX2641. Esta cepa tiene todos los genes para la produccion de (3HB-co-5HV) a partir de glucosa y L-lisina.
MG1655 AgabD;;FRT, Ayne/::FRT se transdujo a P1 con la cepa donante MBX2114 que confena capacidades de produccion de PHB como se describe en el Ejemplo 2. Esta cepa se transformo adicionalmente con pJB90 y pJB91, que expresaban la L-lisina en los genes de la ruta P(5HV) como se describe en los Ejemplos 6 y 5, respectivamente. La cepa resultante se denomino MBX3378 y tema todos los genes para la produccion de P(3HB-co-5Hv) a partir de glucosa y L-lisina pero a diferencia de MBX2855 los dos genes, gabD e ynel, se habfa eliminado del genoma.
Utilizando la cepa MXB2855 y su homologo MBX3378 deficiente en GSA deshidrogenasa, se realizo una fermentacion en placa con agitacion. Las celulas se incubaron y analizaron en las mismas condiciones que las descritas anteriormente (agitacion a 300 rpm a 30 °C). El medio mmimo E0 consistfa en glucosa 10 g/l, L-lisina 2 g/l, K2HPO4 58 mM, KH2PO4 27 mM, MgSO4 2 mM, cloranfenicol 25 pg/ml, gentamicina 5 pg/ml, IPTG 0,1 mM, y elementos traza, como se describe en un ejemplo previo. El flujo de carbono de L-lisina a 5HV mejoro drasticamente en la cepa MBX3378 deficiente de GSA deshidrogenasa en comparacion con MBX2855 que contema actividad GSA deshidrogenasa de tipo silvestre como se muestra en la Tabla 9. Para mejorar significativamente la produccion de PHA que contiene 5HV, es preciso eliminar los genes de GSA deshidrogenasa, tales como gabD e ynel, del genoma de los hospedadores de produccion.
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Tabla 9. Produccion mejorada de P(3HB-co-5HV) a partir de L-lisina
Cepa [plasmido]
Genes relevantes expresados Genes relevantes desactivados PHA Total (% dcw) Incorporacion de 3HB (% PHA) Incorporacion de 5HV (% PHA)
MBX2855
PompA-davBAT, PTrc- phaCgsaRAt2-orfZ ninguno 17,3 98,6 1,4
MBX3378
PompA-davBAT, PTrc- phaCgsaRAt2-orfZ gabD-1”, yneI 24,7 64,9 35,1
Ejemplo 8: Biosintesis de L-lisina a partir de glucosa
La regulacion por retroalimentacion alosterica se produce en la ruta de L-lisina a traves de los genes lysC y dapA. Por lo tanto, es necesario eliminar este control para permitir aumentar la produccion de L-lisina a partir de glucosa. El procedimiento para esto esta bien establecido y se ha descrito para los dos genes (Kojima y col., Patente de Estados Unidos N.° 6.040.160). Los mutantes de E. coli que poseen lysC y dapA desregularizados pueden obtenerse primero eliminando metL y thrA de E. coli. Las isozimas LysC, MetL y Thra catalizan la misma reaccion aspartato quinasa, por tanto sera necesario eliminar antes las dos ultimas mutaciones en Lysc que pueden seleccionarse positivamente. Una vez creada la cepa AmetL AthrA, esta puede mutarse con N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina (NTG). El grupo mutante resultante podna despues cultivarse en un medio mmimo que contiene S- 2-aminoetilcistema (AEC), un analogo no metabolizable de L-lisina, para poner presion sobre lysC y dapA. Dado que metL y thrA faltan, las unicas mutaciones que desensibilizan a lysC y dapA a L-lisina (o su analogo aEc) permitiran que la celula sintetice L-lisina, treonina y metionina y por tanto sobrevivira. Pueden realizarse manipulaciones adicionales sobreexpresando lysC desregularizado, dapA desregularizado, y otros genes de la ruta a partir de un promotor recombinante para aumentar la capacidad de flujo y eliminar la regulacion transcripcional.
Ejemplo 9: Biosintesis de homopoKmero P(5HV) a partir de glucosa
A partir de glucosa como la unica fuente de carbono, se produjo P(5HV) en la cepa E. coli capaz de sintetizar los monomeros 5HV-CoA de glucosa e incorporarlos en PHA. Para ello, se construyo una cepa que no solo expresaba los genes necesarios para la produccion del homopolfmero P(5HV) a partir de L-lisina, sino que tambien expresaba un gen dapA mutado denominado dapAfbr que codifica una dihidrodipicolinato sintasa resistente a retroalimentacion por L-lisina. La primera parte de este ejemplo describira la construccion de los plasmidos necesarios para demostrar esta capacidad.
Construccion de los plasmidos
En E. coli, la regulacion alosterica se produce en la ruta de L-lisina a traves de la aspartato quinasa III y la dihidrodipicolinato sintasa codificadas por los genes lysC y dapA, respectivamente (Figura 6). Para aumentar la produccion de L-lisina y eventualmente del homopolfmero P(5HV) a partir de glucosa, la regulacion alosterica debe reducirse o eliminarse por completo. El procedimiento para hacer esto esta muy establecido y se ha descrito para ambos genes (Kojima y col., Patente de Estados Unidos N.° 6.040.160). Se construyo un gen dapAfbr resistente a retroalimentacion por L-lisina, que tema el resto de nucleotido 352 de citosina cambiado portimina (dapAC352T). Esto se obtuvo por amplificacion con PCR del gen dapA de E. coli cromosomico generando dos fragmentos de ADN, utilizando cebadores que introducen el cambio de bases deseado, seguido de corte y empalme mediante PCR con extension solapada (SOE-PCR, splicing by overlap extension PCR) para fusionar los dos fragmentos de ADN. El procedimiento SOE-PCR se ha descrito anteriormente (Ho y col., Gene 77(1): 51-9 (1989). Con detalle, un fragmento de ADN que contema los pares de nucleotidos 1 a 366 del gen dapA, se amplifico con los cebadores DE081 (5'-AAAAGAATTCTTAATTAATTCTAGAAGGAGGTTTCATATGTTCACGGGAAGTATT GTC) (SEQ ID NO: 33) y DE082 (5'-AGCGATGGCTTTGAAATACTGATACAAACCTTC) (SEQ ID NO: 34) y el otro fragmento de ADN que contema los pares de nucleotidos 337 a 879 de dapA se amplifico con los cebadores DE083 (5'- GAAGGTTTGTATCAGTATTTCAAAGCCATCGCT) (SEQ ID NO: 35) y DE084 (5'-
CCCGAGCTCGTTTAAACTTAATTAAGACTAGTTTTACAGCAAACCGGCATGCTT) (SEQ ID NO: 36). Los cebadores DE082 y DE083 son complementarios inversos y se disenaron para introducir el cambio de bases de citosina por timina en el resto de nucleotido 352. Los dos fragmentos de ADN de la primera ronda de PCR se fusionaron mediante SOE-PCR utilizando los cebadores DE081 y DE084. El producto resultante de la PCR se digirio con Xbal y Sacl y se ligo con pDE031 que se habfa dirigido con Spel y Sacl, creando de este modo el plasmido pDE035. El plasmido pDE031, que contema un promotor constitutivo sintetico (PSyn) se construyo digiriendo un fragmento de ADN bicatenario de 63 pb sintetizado (5'-
TTTTTCTAGATTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCA CTAGTGTTTAAACCCCC) (SEQ ID NO: 37) con Xbal y Pmel y se ligo en los mismos sitios de enzimas de restriccion de un plasmido pBluescript II SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA) que previamente se habfa modificado por ingeniena genetica para contener estos sitios. La construccion del gen Psyn1-dapAC352T en pDE035 se digirio con Xhol y Pmel, que fue seguido de ligamiento con el
plasmido pJB90 (descrito en el Ejemplo 6) que se habfa digerido con BsrGI, enromado con nucleasa de jud^a Mung y digerido una segunda vez con Xhol para generar el plasmido pJG22 que expresaba el operon phaC-gsaRAt-orfZ a partir del promotor Ptre y el gen dapAC352T a partir del promotor Psynl.
Resultados experimentales
5 El plasmido pJG22 se transformo junto con los plasmidos pJB91 (descrito en el Ejemplo 5) en la cepa MBX3342
(MGl655 AgabD::FRT AyneI::FRT) para formar la cepa MBX3342 [pJB91, pJG22]. Los plasmidos pSE380 y
pACYC184, los vectores vados utilizados para construir pJG22 y pJB91, respectivamente, tambien se transformaron en la cepa MBX3342 para crear la cepa de control negativo MBX3342 [pSE380, pACYC184]. Estas cepas se incubaron durante 48 h agitando a 300 rpm a 30 °C en medio E2 2x y se analizo como se describe en los ejemplos 10 anteriores. El medio consistfa en glucosa 15 g/l, NaNH4HPO4 52 mM, K2HPO4 66 mM, KH2PO4 54 mM, MgsO4 2
mM, IPTG 0,1 mM y elementos traza, como se describe anteriormente. Para los medios de cultivo de MBX3342
[pJB91, pJG22], se complemento cloranfenicol 25 pg/ml y gentamicina 5 pg/ml, mientras que se anadieron cloranfenicol 25 pg/ml y ampicilina 100 pg/ml para MBX3342 [pSE380, pACYC184]. Los datos de la Tabla 10 muestran que MBX3342 [pJB9, pJG22] produjo homopolfmero P(5HV) con un peso seco celular (DCW) de 2,60 %, 15 mientras que la cepa MBX3342 [pSE380, pACYC184] no produjo ningun PHA. Estos resultados demuestran que una cepa que expresa el gen dapA resistente a retroalimentacion ademas de los genes de la ruta de L-lisina a P(5HV), pueden producir P(5HV) a partir de glucosa como una unica fuente de carbono.
Tabla 10. Produccion de P(5HV) a partir de glucosa
Cepa [Plasmido]
Genotipo del plasmido relevante PHA Total (% dcw)
MBX3342 [pSE380, pACYC184]
pSE380: control de vector vado pACYC184: control de vector vado 0,0
pJG22: PTrc-phaC-gsaRAt-orfZ
MBX3342 [pJG22, pJB91]
Psyni-dapAC352T 2,60
pJB91: PompA-davBAT
20 Ejemplo 10: Biosmtesis del copolimero P(3HB-co-5HV) a partir de glucosa
El siguiente experimento era demostrar la produccion del copolfmero P(3HB-co-5HV) a partir de glucosa en una cepa de E. coli capaz de sintetizar los monomeros 3HB-CoA y 5HV-CoA e incorporarlos en PHA.
Resultados experimentales
Los genes btkB-phaB-kan de la cepa MBX2114 se transdujeron a P1 en MBX3342 generando la cepa MBX3344. 25 MBX3344 se transformo con los plasmidos pJB91 y pJG22 para crear la cepa MBX3344 [pJB91, pJG22]. Los
plasmidos pSE380 y pACYC184, los vectores vados utilizados para construir pJG22 y pJB91, respectivamente, tambien se transformaron en MBX3344 para crear una cepa de control negativo, MBX3344 [pSE380, pACYC184]. Estas cepas se incubaron durante 48 h agitando a 300 rpm a 30 °C en medio E2 2x y se analizaron como se describe en los ejemplos anteriores. El medio consistfa en glucosa 15 g/l, NaNH4HPO4 52 mM, K2HPO4 66 mM, 30 KH2PO4 54 mM, MgSO4 2 mM, IPTG 0,1 mM y elementos traza como se describe anteriormente. Para los medios de
cultivo de MBX3344 [pJB91, pJG22], se complemento cloranfenicol 25 pg/ml y gentamicina 5 pg/ml, mientras que a MBX3344 [pSE380, pACYC184] se anadieron cloranfenicol 25 pg/ml y ampicilina 100 pg/ml. El caldo de cultivo se complemento con glucosa 10 g/l despues de 24 horas de incubacion. La Tabla 11 muestra que el 5HV pudo incorporarse en la cepa que contema todos los genes de la ruta metabolica de P(3HB-co-5HV) a partir de glucosa 35 como la unica fuente de carbono.
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Tabla 11. Produccion de P(3HB-co-5HV) a partir de glucosa
Cepa [Plasmido]
Genotipo del plasmido relevante PHA Total (% dcw) Incorporacion de 3HB (% PHA) Incorporacion de 5HV (% PHA)
MBX3344 [pSE380, pACYC184]
pSE380: control de vector vado pACYC184: control de vector vado 0 100 0
MBX3344 [pJG22, pJB91]
pJG22: PTrc-phaC- gsaRAt-orfZ Psyni-dapAC352T pJB91: PompA-davBAT 42 92 8,0
A continuacion, la cepa MBX3824 (W3110 AgabD::FRT Aynei::FRT AcadA::FRT AldcC::FRT AargO::FRT bktB-phaB- kan) se ensayo como la cepa hospedadora para la produccion del copoKmero P(3HB-co-5HV) a partir de glucosa. En esta cepa, las rutas competidoras que podfan separar L-lisina del comonomero 5HV-Coa se eliminaron del genoma de E. coli.
La primera ruta competidora puede convertir L-lisina en cadaverina y consiste en dos enzimas de L-lisina descarboxilasa (numero EC 4.1.1.18) codificadas por cadA (Meng y Bennett, J. Bacteriol. 174(8): 2659-2669 (1992); EcoCyc numero de registro: EG10131) e IdcC (vease Tabla 1A; Yamamoto y col., Genes Genet. Syst. 72(3): 167-72 (1997); EcoCyc numero de registro: g6094).
Una segunda ruta competidora puede exportar L-lisina fuera de la celula microbiana. En Corynebacterium glutamicum, la protema exportadora de L-lisina se ha identificado como LysE (vease la Tabla 1A; Vrljic y col., Mol. Microbiol. 22 (5): 815-826 (1996)). Para identificar supuestos genes exportadores de L-lisina en E. coli, se realizaron diversas busquedas en bibliograffas y patentes, asf como busquedas BLAST y Psi-BLAST, utilizando LysE de C. glutamicum como consulta. Se descubrieron seis protemas que eran dianas para eliminar del genoma de E. coli para prevenir la exportacion de L-lisina fuera de la celula. Estas inclrnan: (1) ArgO (tambien conocida como YggA, Nandineni y Gowrishankar, J. Bacteriol. 186: 3539-3546 (2004)), (2) YfiK (tambien conocida como EamB; Franke y col., J. Bacteriol. 185: 1161-1166 (2003)), (3) RhtB (anteriormente denominada YigK; Zakataeva y col., FEBS Lett. 452(3): 228-32 (1999)), (4) YahN (Kutukova y col., Mol Biol. (Mosk.) 39(3); 374-378 (2005)), (5) RhtC (anteriormente denominada YigJ; Zakataeva y col., FEBS Lett. 452(3): 228-32 (1999)) y (6) YeaS (tambien conocida como LeuE; Kutukova y col., FEBS Lett. 579(21): 4629-34 (2005)). ArgO pareda ser el candidato mas probable para exportar L- lisina fuera de las celulas de E. coli basandose en su valor e mas bajo de 2e-22 en busquedas de tipo BLASTP utilizando LysE de C. glutamicum como consulta, en el grupo mas cercano a LysE en un arbol filogenetico despues de ClustalX (Thompson y col., Nucleic Acids Res. 25: 4876-4882 (1997)) con LysE de C. glutamicum y en los seis homologos de E. coli, y en la resistencia 3 veces aumentada comunicada para L-lisina asf como una mayor acumulacion de L-lisina del 38 % cuando argO se sobreexpresaba en comparacion con las cepas de control solo con el vector (Livshits y col., Patente de Estados Unidos N.° 6.979.560). Sin embargo, las otras protemas identificadas pueden exportar L-lisina tambien y por lo tanto tambien son dianas para la eliminacion genica.
Otra ruta competidora puede convertir L-lisina en (R)-p-lisina que esta catalizada por lisina 2,3-aminomutasa (numero EC 5.4.3.) codificada por yjeK de E. coli (numero de registro EcoCyc: G7836; Behshad y col., Biochemistry 45(42): 12639-46 (2006)).
Se construyeron mutantes nulos cadA e IdcC individuales mediante el procedimiento de Recombinacion genetica Red/ET de Gene Bridges como se ha descrito anteriormente, utilizando los siguientes cebadores: DE118 (5'- TGTCCCATGTGTTGGGAGGGGCCTTTTTTACCTGGAGATATGACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC) (SEQ ID NO:

38) y DE119 (5'-
GAGCAAAAAAGGGAAGTGGCAAGCCACTTCCCTTGTACGAGCTAAATGGGAATTAGCCATGGTCC) (SEQ ID NO:

39) para una mutacion AcadA::FRT-kan-FRT y DE122 (5'-
GTTTGAGCAGGCTATGATTAAGGAAGGATTTTCCAGGAGGAACACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC) (SEQ ID NO:

40) y DE123 (5'-
TATTTGTTAACAGCACGTTACTCGCCCGGAAGCCGCTCTGGCAAGATGGGAATTAGCCATGGTCC) (SEQ ID NO:
41) para la mutacion AldcC::FRT-cat-FRT. Se construyo una mutacion argO nula individual por el procedimiento de

Recombinacion genetica Red/ET utilizando los cebadores DE106 (5'-
GTGTTTTCTTATTACTTTCAAGGTCTTGCACTTGGGGCGGCTATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC) (SEQ ID NO:
42) y DE107 (5'-CTAACTGAACAAGGCTTGTGCATGAGCAATACCGTCTCTCGCCAG
ATGGGAATTAGCCATGGTCC) (SEQ ID NO: 43). La cepa W3110 AgabD::FRT AyneI::FRT AcadA::FRT AldcC::FRT AargO::FRT se construyo por transducciones repetitivas mediadas por P1 de los casetes AgabD::FRT-
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kan-FRT, AyneI::FRT-kan-FRT, AcadA::FRT-kan-FRT, A/dcC::FRT-cat-FRT, AcadA::FRT-kan-FRT en la cepa W3110 (Bachmann, Bacteriol, Rev., 36 (4): 525-557 (1972)), que fue seguido de la eliminacion de los marcadores kan o cat despues de cada transduccion mediada por P1 como se describe en los ejemplos anteriores. La cepa resultante MBX3818 se transdujo a P1 con la cepa donante MBX2114 para finalizar la construccion de MBX3824. Los plasmidos pJG22 y pJB91 se transformaron en MXB3824 y la cepa resultante MBX3824 [pJG22, pJB91] se ensayo con respecto a la produccion de copoKmero P(3HB-co-5HV) junto con MBX3344 [pJG22, pJB91]. Estas cepas se incubaron durante 48 h con agitacion a 300 rpm a 30 °C en medio E2 1,5x y se analizaron como se describe en los ejemplos anteriores. El medio consistfa en glucosa 15 g/l, NaNH4HPO4 39 mM, K2HPO4 49,5 mM, KH2PO4 40,5 mM, MgSO4 2 mM, IPTG 0,1 mM y elementos traza como se describe anteriormente. Los medios de cultivo se complementaron con cloranfenicol 25 pg/ml y gentamicina 5 pg/ml. La Tabla 12 muestra que diversas cepas con diferentes fondos geneticos tienen la capacidad de producir P(3HB-co-5HV) a partir de glucosa con diferentes composiciones de 5HV en el polfmero. En particular, la eliminacion de rutas competidoras que separan el carbono de 5HV-CoA, tal como eliminando la protema exportadora de L-lisina, argO, o los dos genes de lisina descarboxilasa, cadA e IdcC, aumenta la incorporacion de 5Hv en PHA.
Tabla 12. Produccion de P(3HB-co-5HV) a partir de glucosa
Cepa [Plasmido]
Genotipo relevante PHA Total (% dcw) Incorporacion de 3HB (% PHA) Incorporacion de 5HV(% PHA)
MBX3344 [pJG22, pJB91]
MBX3344: MG1655 AaabD::FRT AyneI::FRT bktB-phaB-kan pJG22: PTrc-DhaC-asaRAt-orfZ Psyni- dpAF352T pJB91: PomnA-davBAT 47 89 11
MBX3824 [pJG22, pJB91]
MBX3824: W3110 AaabD::FRT AyneI::FRT AcadA::FRT A/dcC::FRT AargO::FRT bktB-phaB-kan pJG22:PTrr-DhaC-asaRA-orfZ P.,uni- daA352T pJB91: PomnA-davBAT 33 81 19
Ejemplo 11: Biosintesis de copoKmero P(4HB-co-5HV) a partir de 4-hidroxibutirato de sodio y de 5- hidroxivalerato de sodio
El siguiente experimento consistfa en demostrar la produccion de copolfmero P(4HB-co-5HV) en una cepa de E. co/i capaz de sintetizar los monomeros 4HB-CoA y 5HV-CoA e incorporarlos en PHA. Los procedimientos para modificar por ingeniena genetica los comonomeros 4Hb en organismos recombinantes se han descrito con detalle en la Patente de Estados Unidos N.° 6,117,658, Patente de Estados Unidos N.° 6.316.262, Patente de Estados Unidos N.° 6.689.589, Patente de Estados Unidos N.° 7.081.357, Patente de Estados Unidos N.° 7.229.804, Patente de Estados Unidos N.° 6.759.219, y en la publicacion de solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2004/0253693. En un experimento similar al descrito en el Ejemplo 1, se suministro 5-hidroxivalerato de sodio (Na5HV) a la cepa MG1655 [pMs93] junto con 4-hidroxibutirato de sodio (Na4HB). La cepa MG1655 [pMS93] contiene los genes orfZ y phaC, ambos de los cuales se requieren para generar 4HB-CoA y 5HV-CoA a partir de Na4HB y Na5HV, respectivamente, asf como para polimerizar los precursores con el copolfmero P(4HB-co-5HV). Na4HB, para su uso como sustrato, se preparo de manera similar al procedimiento descrito para la preparacion de Na5HV en el Ejemplo 1 utilizando y- butirolactona (GBL) en lugar de DVL. Las condiciones de cultivo utilizadas para la produccion de copolfmero tambien eran las mismas que las descritas en el Ejemplo 1 con la diferencia de que se anadieron 4 g/l de Na4HB al medio de produccion. Despues del periodo de produccion de PHA, el analisis del contenido polimerico del cultivo de MG1655 [pMS93] prosiguio como se describe en el Ejemplo 1 excepto que se realizo una curva patron para determinar el contenido de 4HB utilizando patrones GBL ademas de la curva patron realizada para determinar el contenido de 5HV. Este analisis mostro que el cultivo de MG1655 [pMS93] al que se suministro conjuntamente Na4HB y Na5HV genero copolfmero P(4HB-co-5HV) que comprendfa un dcw de 67 % y tema una composicion que era 67 % de 4HB y 33 % de 5HV. Se analizo una muestra extrafda de este polfmero usando DSC y despues se determino que tema una Tg de -54,9 °C y una Tm no detectable.
Ejemplo 12: Biosintesis de glutarato a partir de glucosa
Para diferenciar cuales de los dos productos genicos eran la GSA deshidrogenasa primaria, identificada en el Ejemplo 7, se compararon las cepas MG1655 [pJB91] de tipo silvestre, MG1655AyneI::FRT [pJB91] y
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MG1655AgabD::FRT [pJB91] con respecto a su capacidad para la produccion de glutarato a partir de 5- aminopentanoato, un metabolito intermedio entre la L-lisina y GSA (vease la Figura 2). Estas tres cepas contienen el plasmido pJB91 que expresa davBAT a partir del promotor PompA como se describe en el Ejemplo 5. Las tres cepas se cultivaron en medio mmimo E0 que contema 5-aminopentanoato 2 g/l como se describe anteriormente y el glutarato se midio mediante un procedimiento de GC-MS a partir de los sobrenadantes del cultivo. El procedimiento y las condiciones de incubacion eran los mismos que los descritos en el Ejemplo 7.
A diferencia de las otras dos cepas, MG1655AgabD [pJB91] no acumulaba ningun glutarato detectable. Por tanto, la deshidrogenasa codificaba por gabD tema la mayor actividad hacia GSA. Por lo tanto, si se produdan altas cantidades de glutarato, los hospedadores de produccion necesitaban expresar gabD u sus homologos (vease la Tabla 1P). Sin embargo, dado que MG1655Ayne/ [pJB91] acumulaba cantidades ligeramente inferiores de glutarato a partir de 5-aminopentanoato en comparacion con MG1655 [pJB91], 0,75 g/l frente a 1,0 g/l de glutarato, respectivamente, la deshidrogenasa codificada por yne/ tambien tema actividad moderada hacia GSA. Por tanto, la sobreexpresion de yne/ o de sus homologos (vease la Tabla 1Q), tambien podfa producir altas cantidades de glutarato a partir de GSA, L-lisina o glucosa.
Los dos mejores homologos de GabD presentes en Corynebacterium g/utamicum, incluyen (1) la aldehudo deshidrogenasa dependiente de NAD (N.° de registro NP_599302) y (2) la protema hipotetica cgR_0068 (N.° de registro YP_001136931). Inesperadamente, estas dos protemas de C. g/utamicum tambien se identificaron como los dos homologos mas cercanos a Ynel de E. co/i.
A continuacion, se produjo glutarato a partir de glucosa. Para proporcionar una cepa sobreproductora de L-lisina, se construyo el plasmido pDE033 que contema el gen dapAC352T resistente a retroalimentacion por L-lisina de la siguiente manera: el producto de SOE-PCR para la fabricacion del gen dapAC352T, descrito en el Ejemplo 9, se digirio con EcoRI y Sacl, seguido de ligamiento con pSE380 que se habfa digerido con las mismas enzimas, creando de este modo el plasmido pDE033. El gen dapAC352T en pDE033 estaba bajo el promotor Ptrc inducible por IPTG. Los plasmidos pDE033 y pJB91 (descritos anteriormente) se transformaron en la cepa MG1655 para crear la cepa MG1655 [pDE033, pJB91]. Las cepas MG1655 y MGl655 [pDE033, pJB91] se incubaron durante 48 h con agitacion a 300 rpm a 30 °C en un medio que contema glucosa 25 g/l, (NH^SOa l6 g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO4 1 g/l, extracto de levadura 2 g/l, CaCO3 30 g/l, IPTG 0,1 mM y elementos traza como se describe anteriormente. El medio de cultivo para MG1655 [pDE033, pJB91] se complemento con ampicilina 100 pg/l y cloranfenicol 25 pg/ml. El glutarato se midio como se describe en el Ejemplo 7. Los datos mostrados en la Tabla 13 demuestran que MG1655 [pDE033, pJB91] secreto glutarato 0,7 g/l en el medio mientras que la cepa de control negativa MG1655 no produjo ningun glutarato. Este resultado demuestra claramente que la utilizacion de un gen dapA resistente a retroalimentacion para acumular L-lisina, junto con el operon davBAT para convertir la L-lisina en GSA en una celula hospedadora que codifica una GSA deshidrogenasa, es suficiente para la produccion de glutarato a partir de glucosa como la unica fuente de carbono.
Tabla 13. Produccion de glutarato a partir de glucosa
Cepa [Plasmido]
Genotipo del plasmido relevante Glutarato (g/l)
MG1655
0
MG1655 [pDE033, pJB91]
pDE33: PTrc-dapAC52' pJB91: PompA-davBAT 0,7
Ejemplo 13: Biosmtesis de 1,5-pentanodiol a partir 5-hidroxivalerato de sodio Construccion de cepas
La cepa MBX3017 (LS5218 AadhE::FRT, A/dhA::FRT, AackA-pta::FRT) y la cepa MG1655 de K-12 se utilizaron como una cepa hospedadora para evaluar si el 1,5-pentanodiol (PDO) podfa acumularse y secretarse en el medio. Cada cepa de eliminacion individual se construyo por el procedimiento Red/ET de Gene Bridges. En la Tabla 14 se enumeran cebadores para la construir casetes desactivados para las tres rutas. En resumen, para la construccion de las diversas eliminaciones cromosomicas se utilizaron los siguientes cebadores: MS286 y MS287 para el casete AadhE; MS289 y MS290 para el casete AackA-pta; y MS292 y MS293 para el casete A/dhA. La LS5218 AadhE::FRT, A/dhA::FRT, AackA-pta::FRT se obtuvo por transduccion a P1 repetitiva de cada mutacion nula individual en LS5218 y eliminando el marcador como se describe en el ejemplo anterior.
Tabla 14: Cebadores utilizados para estudios de PDO
Cebador
Secuencia (5' ^ 3') Comentario
MS286
CCGTTTATGTTGCCAGACAGCGCTACTGATTAAGCGGATTTT TTCGCTTT CAT ATG A AT ATCCTCCTT AGT (SEQ ID NO:44) casete AadhE
MS287
CGAGCAGATGATTTACTAAAAAAGTTTAACATTATCAGGAG AGCATTATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO:45) casete AadhE
MS289
TGGCTCCCTG ACGTTTTTTT AGCCACGT ATC A ATT ATAGGTA CTTCCATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO:46) casete AackA pta
MS290
GCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGATTACTGCTGCTG TGCAGACTGCATATGAATATCCTCCTTAGT (SEQ ID NO:47) casete AackA pta
MS292
CTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGATTAAACCAGTTC GTTCGGGCACATATGAATATCCTCCTTAGT (SEQ ID NO:48) casete AlphA
MS293
TATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAACATCACTGGAGAA AGTCTTATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC {SEq }D NO;49) casete AlphA
FS011
TCCCCTAGGATTCAGGAGGTTTTTATGGAGTGGGAAGAGAT ATATAAAG (SEQ ID NO:50) 5' de orfZ
FS008
CCTTAAGTCGACAAATTCTAAAATCTCTTTTTAAATTC (SEQ ID NO: 51) 3' de orfZ
JRG047
TTCAGGATCCTGCGCATGCTAGCTATAGTTCTAGAGGTA (SEQ ID NO: 52) 5' de pduP
JRG048
CAT ACGATAGCTCATA A AA ACCTCCTCGC AGTT AGCG A ATA GAAAAGCCGTTGG (SEQ ID NO:53) 3' de pduP
JRG049
G AGG AGGTTTTTAT G AGCT ATCGT ATG AGCT AT CGT ATGTTT GATTATCTGGTGC (SEQ ID NO:54) 5' de dhaT
JRG050
TCTTTCATGAACTCAGAATGCCTGGCGGAAAATCG (SEQ ID NO: 55) 3' de dhaT
El gen pduP que codifica la propionaldelTdo deshidrogenasa dependiente de CoA de S. typhimurium (vease la Tabla 1A; Leal, Arch. Microbiol. 180: 353-361 (2003)) se amplifico con los cebadores JRG47 y JRG48. El gen dhaT que 5 codifica la 1,3-propanodiol deshidrogenasa de Klebsiella pneumoniae (vease la Tabla 1A; Tong y col., Appl. Environ. Microbiol. 57(12): 3541-3546 (1991)) se amplifico con los cebadores JRG49 y JRG50. Los dos genes se fusionaron entre sf mediante SOE-PCR utilizando los cebadores JRG47 y JRG50. El fragmento de ADN resultante se clono en pJB87 mediante los sitios BamHI y BspHI y el plasmido resultante se denomino pJG10.
La cepa MBX3017 o MG1655 que llevaban pFS16 o pSE380 y pJG10 o pJB78 se fusionaron para estudios de PDO.
10 Las cepas se cultivaron durante 40 h en condiciones limitadas de oxfgeno en medio E2 que contenfa 5HV. El medio consistfa en: glucosa 10 g/l, 5HV 2 g/l, NaNH4HPO4 26 mM, K2HPO4 33 mM, KH2PO4 27 mM, MgSO4 2 mM, cloranfenicol 25 |jg/ml, ampicilina 100 jg/ml, IPTG 0,1 mM y elementos traza, como se describe anteriormente. Los cultivos de una noche se inocularon en un tubo de cultivo sellado que contema medio reciente a una DO600 final de aproximadamente 0,2, el espacio de cabeza del tubo de cultivo era pequeno para garantizar la limitacion de oxfgeno
15 del cultivo. Los cultivos se incubaron a 30 °C. Despues de 48 h de incubacion, se extrajeron 100 jl de muestra, se centrifugo y el sobrenadante resultante se anadio con 1,4-butanodiol (0,1 g/l) como patron interno, se seco en un centrivap de Labconco y se resuspendio en acetonitrilo (ACN) 100 jl por ultrasonido durante 3 h. La solucion de acetonitrilo se centrifugo para extraer el material insoluble y el sobrenadante se inyecto en un GC-MC Agilent 5875 equipado con una columna DB-225ms utilizando los siguientes parametros de adquisicion: caudal de gas helio
transportador 1 ml/min, modo barrido m/z 30-500, programa del horno: 40 °C durante 2 min, despues aumento a 220 °C a 10 °C/min, temperatura de la fuente de iones 230 °C y temperatura del filtro de masa de cuadrupolo a 150 °C.
En la Tabla 14 se muestran los resultados de la medicion de PDO (1,5-pentanodiol). La combinacion de la cepa hospedadora MBX3017 y la sobreexpresion de orf Z-dhaT-pduP, produjo un rendimiento de PDO mas alto de 0,32 5 g/l. La cepa MG1655, que llevaba estos tres genes, produjo un rendimiento mas bajo de 0,22 g/l, posiblemente debido a su ruta activa de etanol, acetato y lactato, que son aceptores de electrones conocidos (Clark, FEMS Microbiol. Rev. 5: 223-34 (1989)) y que pueden competir con la ruta 5HV para NAD(P)H. Cabe destacar que, MG1655 que tan solo lleva orfZ tambien produce pequenas cantidades de PDO, mientras que la cepa hospedadora MBX3017 no produce ningun PDO detectable (Tabla 15). Esto indica que una alcohol deshidrogenasa endogena, 10 por ejemplo adhE, tiene una debil actividad hacia 5HV-CoA. El PDO medido se confirmo por GC-MS frente al patron
de PDO y un espectro de referencia de PDO de la biblioteca del NIST, como se muestra en la Figura 8. Estos resultados demuestran que, a partir de Na5HV puede producirse PDO, cuando el gen orfZ se expresa para generar 5HV-CoA y QUE los genes pduP-dhaT se expresan convirtiendo 5HV-CoA en 5-hidroxipentenal y en PDO.
Tabla 15: Tftulo de PDO de cepas cultivadas en medio que contiene 5HVa
Plasmidos y genes expresados
PDO (g/l)
MG1655
MBX3017
pFS16: Ptrc-orfZ pJB78: vector vado
0,08 0
pJG10: Ptet-pduP-dhaT pSE380: vector vado
0 0
pFS16: Ptrc-orfZ pJG10: Ptet-pduP-dhaT
0,22 0,32
pJB78: vector vado pSE380: vector vado
0 0
a Los resultados son el promedio de tres experimentos repetidos independientes.
15
Secuencia de nucleotidos, Gene ID 001: Gen gsaRAt2 de glutarato semialdehndo reductasa de Aspergillus terreus NIH2624
ATGCCACTGGTTGCTCAAAATCCACTGCCACGTGCTATTCTGGGTCTGATG ACTTTCGGTCCGAGCGAAAGCAAAGGTGCGCGTATCACTTCCCTGGATGAG TTTAACAAGTGCCTGGATTACTTCCAGCAGCAGGGCTTCCAGGAAATCGAT ACCGCGCGCATCTACGTCGGCGGTGAACAGGAGGCATTCACGGCGCAGGCA AAGTGGAAAGAACGCGGCCTGACGCTGGCGACTAAGTGGTATCCGCAGTAC CCGGGTGCGCACAAACCGGATGTCCTGCGTCAGAACCTGGAGCTGTCCCTG AAAGAACTGGGCACGAACCAGGTCGATATCTTCTATCTGCACGCCGCGGAT CGTTCTGTGCCGTTCGCGGAAACTCTGGAAACTGTTAACGAACTGCACAAA GAAGGCAAATTTGTTCAGCTGGGTCTGTCTAACTACACCGCTTTCGAAGTA GCTGAAATCGTGACCCTGTGTAACGAGCGTGGTTGGGTTCGTCCGACTATC TACCAGGCGATGTATAACGCTATCACCCGTAACATCGAAACTGAACTGATC CCGGCGTGCAAGCGTTACGGTATTGACATTGTTATCTACAACCCACTGGCG GGTGGCCTGTTCAGCGGCAAATACAAAGCACAGGACATCCCGGCTGAAGGT CGTTACAGCGACCAATCTTCCATGGGCCAGATGTACCGCAACCGTTACTTT AAGGACGCAACCTTTGACGCTCTGCGCCTGATCGAACCGGTTGTTGCGAAG CACGGCCTGACGATGCCGGAAACCGCGTTCCGCTGGGTCCACCACCACTCC GCACTGAACATGGAAGATGGCGGCCGTGACGGCATCATTCTGGGTGTAAGC AGCCTGGCTCAGCTGGAAAACAACCTGAAAGACATTCAGAAAGGTCCGCTG CCGCAGGAGGTTGTAGACGTCCTGGATCAGGCTTGGCTGGTGGCTAAGCCG ACGGCTCCAAACTACTGGCATCTGGACCTGAAATACACGTACGACACCCAG GAAGCTCTGTTCAAACCGAAATCTAAGGCGTAA (SEQ ID NO:56)
Secuencia de aminoacidos, Gene ID 001: Gen gsaRAt2 de glutarato semialdehido reductasa de Aspergillus terreus
NIH2624
MPLVAQNPLPRAILGLMTFGPSESKGARITSLDEFNKCLDYFQQQGFQEID TARIYVGGEQEAFTAQAKWKERGLTLATKWYPQYPGAHKPDVLRQNLELSL KELGTNQVDIFYLHAADRSVPFAETLETVNELHKEGKFVQLGLSNYTAFEV AEIVTLCNERGWVRPTIYQAMYNAITRNIETELIPACKRYGIDIVIYNPLA GGLFSGKYKAQDIPAEGRYSDQSSMGQMYRNRYFKDATFDALRLIEPWAR HGLTMPETAFRWVHHHSALNMEDGGRDGIILGVSSLAQLENNLKDIQKGPL PQEWDVLDQAWLVAKPTAPNYWHLDLKYTYDTQEALFKPKSKA {SEQ ID NO:57)
5 Secuencia de nucleotidos, Gene ID 002: Gen gsaRAt de glutarato semialdehido reductasa de Arabidopsis thaliana
ATGGAAGTAGGTTTTCTGGGTCTGGGCATTATGGGTAAAGCTATGTCCATG
aacctgctgaaaaacggtttcaaagttaccgtgtggaaccgcactctgtct
AAATGTGATGAACTGGTTGAACACGGTGCAAGCGTGTGCGAGTCTCCGGCT
gaggtgatcaagaaatgcaaatacacgatcgcgatgctgagcgatccgtgt
gcagctctgtctgttgttttcgataaaggcggtgttctggaacagatctgc
gagggtaagggctacatcgacatgtctaccgtcgacgcggaaactagcctg
aaaattaacgaagcgatcacgggcaaaggtggccgttttgtagaaggtcct
gttagcggttccaaaaagccggcagaagacggccagctgatcatcctggca
gcaggcgacaaagcactgttcgaggaatccatcccggcctttgatgtactg
ggcaaacgttccttttatctgggtcaggtgggtaacggtgcgaaaatgaaa
ctgattgttaacatgatcatgggttctatgatgaacgcgtttagcgaaggt
CTGGTACTGGCAGATAAAAGCGGTCTGTCTAGCGACACGCTGCTGGATATT CTGGATCTGGGTGCTATGACGAATCCGATGTTCAAAGGCAAAGGTCCGTCC ATGACTAAATCCAGCTACCCACCGGCTTTCCCGCTGAAACACCAGCAGAAA GACATGCGTCTGGCTCTGGCTCTGGGCGACGAAAACGCTGTTAGCATGCCG GTCGCTGCGGCTGCGAACGAAGCCTTCAAGAAAGCCCGTAGCCTGGGCCTG GGCGATCTGGACTTTTCTGCTGTTATCGAAGCGGTAAAATTCTCTCGTGAA TAA (SEQ ID NO:58)
Secuencia de aminoacidos, Gene ID 002: Gen gsaRAt de glutarato semialdehndo reductasa de Arabidopsis thaliana
MEVGFLGLGIMGKAMSMNLLKNGFKVTVWNRTLSKCDELVEHGASVCESPA EVIKKCKYTIAMLSDPCAALSWFDKGGVLEQICEGKGYIDMSTVDAETSL KINEAITGKGGRFVEGPVSGSKKPAEDGQLIILAAGDKALFEESIPAFDVL GKRS FYLGQVGNGAKMKLIVNMIMGSMMNAFS EGLVLADKSGLS SDTLLDI LDLGAMTNPMFKGKGFSMTKSSYPPAFPLKHQQKDMRLALALGDENAVSMP VAAAANEAFKKARSLGLGDLDFSAVIEAVKFSRE (SEQ ID NO:59)
Secuencia de nucleotidos, Gene ID 003: Genes de fusion phaC3/C5 de polihidroxialcanoato sintasa de 5 Pseudomonas putida/Zoogloea ramigera
ATGAGTAACAAGAACAACGATGAGCTGCAGTGGCAATCCTGGTTCAGCAAG
GCGCCCACCACCGAGGCGAACCCGATGGCCACCATGTTGCAGGATATCGGC
GTTGCGCTCAAACCGGAAGCGATGGAGCAGCTGAAAAACGATTATCTGCGT
GACTTCACCGCGTTGTGGCAGGATTTTTTGGCTGGCAAGGCGCCAGCCGTC
AGCGACCGCCGCTTCAGCTCGGCAGCCTGGCAGGGCAATCCGATGTCGGCG
TTCAATGCCGCATCTTACCTGCTCAACGCCAAATTCCTCAGTGCCATGGTG
GAGGCGGTGGACACCGCACCCCAGCAAAAGCAGAAAATACGCTTTGCCGTG
CAGCAGGTGATTGATGCCATGTCGCCCGCGAACTTCCTCGCCACCAACCCG
GAAGCGCAGCAAAAACTGATTGAAACCAAGGGCGAGAGCCTGACGCGTGGC
CTGGTCAATATGCTGGGCGATATCAACAAGGGCCATATCTCGCTGTCGGAC
GAATCGGCCTTTGAAGTGGGCCGCAACCTGGCCATTACCCCGGGCACCGTG
ATTTACGAAAATCCGCTGTTCCAGCTGATCCAGTACACGCCGACCACGCCG
ACGGTCAGCCAGCGCCCGCTGTTGATGGTGCCGCCGTGCATCAACAAGTTC
TACATCCTCGACCTGCAACCGGAAAATTCGCTGGTGCGCTACGCGGTGGAG
CAGGGCAACACCGTGTTCCTGATCTCGTGGAGCAATCCGGACAAGTCGCTG
GCCGGCACCACCTGGGACGACTACGTGGAGCAGGGCGTGATCGAAGCGATC
CGCATCGTCCAGGACGTCAGCGGCCAGGACAAGCTGAACATGTTCGGCTTC
TGCGTGGGCGGCACCATCGTTGCCACCGCACTGGCGGTACTGGCGGCGCGT
GGCCAGCACCCGGCGGCCAGCCTGACCCTGCTGACCACCTTCCTCGACTTC
AGCGACACCGGCGTGCTCGACGTCTTCGTCGATGAAACCCAGGTCGCGCTG
CGTGAACAGCAATTGCGCGATGGCGGCCTGATGCCGGGCCGTGACCTGGCC
TCGACGTTCTCGAGCCTGCGTCCGAACGACCTGGTATGGAACTATGTGCAG
TCGAACTACCTCAAAGGCAATGAGCCGGCGGCGTTTGACCTGCTGTTCTGG
AATTCGGACAGCACCAATTTGCCGGGCCCGATGTTCTGCTGGTACCTGCGC
AACACCTACCTGGAAAACAGCCTGAAAGTGCCGGGCAAGCTGACGGTGGCC
GGCGAAAAGATCGACCTCGGCCTGATCGAGGCCCCGGCCTTCATCTACGGT
TCGCGCGAAGACCACATCGTGCCGTGGATGTCGGCGTACGGTTCGCTCGAC
ATCCTCAACCAGGGCAAGCCGGGCGCCAACCGCTTCGTGCTGGGCGCGTCC
GGCCATATCGCCGGCGTGATCAACTCGGTGGCCAAGAACAAGCGCAGCTAC
TGGATCAACGACGGTGGCGCCGCCGATGCCCAGGCCTGGTTCGATGGCGCG
CAGGAAGTGCCGGGCAGCTGGTGGCCGCAATGGGCCGGGTTCCTGACCCAG CATGGCGGCAAGAAGGTCAAGCCCAAGGCCAAGCCCGGCAACGCCCGCTAC ACCGCGATCGAGGCGGCGCCCGGCCGTTACGTCAAAGCCAAGGGCTGA (SEQ ID NO:60)
Secuencia de aminoacidos, Gene ID 003: Genes de fusion phaC3/C5 de polihidroxialcanoato sintasa de 5 Pseudomonas putida/Zoogloea ramigera
MSNKNNDELQWQSWFSKAPTTEANPIYATMLQDIGVALKPEAMEQLKNDYLR DFTALWQDFLAGKAPAVSDRRFSSAAWQGNPMSAFNAASYLLNAKFLSAMV EAVDTAPQQKQKIRFAVQQVIDAMSPANFLATNPEAQQKLIETKGESLTRG LVNMLGDINKGHISLSDESAFEVGRNLAITPGTVIYENPLFQLIQYTPTTP TVS QRPLLMVPP CINKFYILDLQPENSLVRYAVEQGNTVFLISWSNPDKSL AGTTWDDYVEQGVIEAIRIVQDVSGQDKLNMFGFCVGGTIVATALAVLAAR GQHPAAS LTLLTTFLDFS DTGVLDVFVDETQVALREQQ LRDGGLMPGRDLA S TFS S LRPNDLVWNYVQ SNYLKGNE PAAFDLL FWNS D S TNL P GPM FCWYLR NTYLENSLKVPGKLTVAGEKIDLGLIDAPAFIYGSREDHIVPWMSAYGSLD ILNQGKPGANRFVLGASGHIAGVINSVAKNKRSYWINDGGAADAQAWFDGA QEVPGSWWPQWAGFLTQHGGKKVKPKAKPGNARYTAIEAAPGRYVKAKG (SEQ ID HO:61}
Secuencia de nucleotidos, Gene ID 004: Subunidad phaE de polihidroxialcanoato sintasa de Thiocapsa phenigii
ATGGCTGGTGACCACGTCGTGGAATGCCTTCGAATTCAGGAGGTTTTTATG AACGATACGGCCAACAAGACCAGCGACTGGCTGGACATCCAACGCAAGTAC TGGGAGACCTGGTCGGAGCTCGGCCGCAAGACCTTGGGTCTGGAGAAGACC CCGGCCAATCCTTGGGC CGGCGC C CTCGAT CATTGGTGGCAGACGGT CT CG CCCGCCGCCCCCAACGACCTGGTTCGCGACTTCATGGAGAAGCTCGCCGAG CAGGGCAAGGCCTTCTTCGGCCTCACCGACTACTTCACGAAGGGCCTCGGC GGCAGTAGCGGTACGCAGGGCTGGGACACCCTCTCGAAGACCATCGACGAC ATGCAAAAGGCCTTCGCCAGCGGCCGGATCGAAGGCGACGAGACCTTCCGC CGCCTGATGGCCTTCTGGGAGATGCCGCTCGACAACTGGCAGCGCACCATG TCCTCGCTGTCCCCGGTGCCCGGCGACCTGCTGCGCAACATGCCGCACGAC CAAGTCAGGGACAGCGTCGACCGCATCCTCTCGGCACCCGGGCTCGGCTAC ACGCGCGAGGAGCAGGCCCGCTACCAGGATCTGATCCGCCGCTCGCTGGAG TACCAGTCGGCCCTGAACGAATACAACGGCTTCTTCGGCCAGCTCGGTGTC AAGTCCCTCGAGCGGATGCGCGCCTTCCTGCAGGGACAGGCCGAGAAGGGC GTCGCCATCGAGTCGGCGCGCACCCTCTACGACGCCTGGGTCGGCTGCTGC GAAGAGGTCTATGCCGAGGAGGTCAGCTCCGCCGACTACGCGCACATCCAC GGCCGCCTCGTCAACGCCCAGATGGCCCTCAAGCAGCGCATGTCGACCATG GTCGACGAGGTCCTCGGCGCGATGCCGCTGCCGACCCGCAGCGAGCTGCGC ACGCTCCAGGATCGGCTCCAGGAGTCGCGCGGCGAGGGCAAGCGCCAGCGC CAAGAGATCGAGACGCTGAAGCGGCAGGTCGCGGCCTTGGCCGGCGGCGCC CAGCCCGCGCCCCAGGCCTCCGCCCAGCCCAGCACCCGGCCCGCGCCGGCG ACGGCCCCGGCGGCGAGCGCGGCGCCCAAGCGCAGCACCACGACCCGCCGC AAGACCACCAAGCCCACCACCGGCCAGTGA (SEQ ID NO:62)
Secuencia de aminoacidos, Gene ID 004: Subunidad phaE de polihidroxialcanoato sintasa de Thiocapsa phenigii
MNDTANKT SDWLDIQRKYWETWSELGRKTLGLEKTP ANPWAGALDHWWQTV SPAAPNDLVRDFMEKLAEQGKAFFGLTDYFTKGLGGSSGTQGWDTLSKTID DMQKAFASGRIEGDETFRRLMAFWEMPLDNWQRTMSSLSPVPGDLLRNMPH DQVRD SVDRILSAPGLGYTREEQARYQDLIRRSLEYQSALNEYNG FFGQLG VKSLERMRAFLQGQAEKGVAIESARTLYDAWVGCCEEVYAEEVSSADYAHI HGRLVNAQMALKQRMSTMVDEVLGAMPLPTRSELRTLQDRLQESRGEGKRQ RQg x E TLkRQVAALAGGAQPAPQASAQ P STEPAPATAPAASAAP KRSTTTR RKTTKPTTGQ {SEQ ID NO:63)
Secuencia de nucleotidos, Gene ID 005: Subunidad phaC de polihidroxialcanoato sintasa de Thiocapsa phenigii
ATGTCCCCATTCCCGATCGACATCCGGCCCGACAAGCTGACCGAGGAGATG CTGGAGTAC AG C CGCAAGCT CGGCGAGGGTATGC AGAAC CTGCTCAAGGC C GACCAGATCGACACAGGCGTCACCCCCAAGGACGTCGTCCACCGCGAGGAC AAGCTGGTCCTCTACCGCTACCGGCGCCCGGCGCAGGTGGCGACCCAGACG ATCCCGCTGCTGATCGTCTACGCCCTCGTCAATCGGCCCTACATGACCGAC ATCCAGGAGGATCGCTCGACGATCAAGGGCCTGCTCGCCACCGGTCAGGAC GTCTATCTGATCGACTGGGGCTACCCGGATCAGGCCGACCGGGCGCTGACC CTCGATGACTACATCAACGGCTACATCGACCGCTGCGTCGACTACCTGCGC GAGACCCACGGCGTCGACCAGGTCAACCTGCTCGGGATCTGCCAGGGCGGG GCCTTCAGCCTCTGCTACACGGCCCTGCACTCCGAGAAGGTCAAAAACCTC GTCACCATGGTCACGCCGGTCGACTTCCAGACCCCGGGCAACCTGCTCTCG GCCTGGGTCCAGAACGTCGACGTCGACCTGGCCGTCGACACCATGGGCAAC ATCCCGGGCGAACTGCTCAACTGGACCTTCCTGTCGCTCAAGCCCTTCAGC CTGACCGGCCAGAAGTACGTCAACATGGTCGACCTGCTCGACGACGAGGAC AAGGTCAAGAACTTCCTGCGGATGGAGAAGTGGATCTTCGACAGCCCGGAC CAGGCCGGCGAGACCTTCCGCCAGTTCATCAAGGACTTCTACCAGCGCAAC GGCTTCATCAACGGCGGCGTCCTGATCGGCGATCAGGAGGTCGACCTGCGC AACATCCGCTGCCCGGTCCTGAACATCTACCCGATGCAGGACCACCTGGTG CCGCCGGATGCCTCCAAGGCCCTCGCGGGACTGACCTCCAGCGAGGACTAC ACGGAGCTCGCCTTCCCCGGCGGGCACATCGGCATCTACGTCAGCGGCAAG GCGCAGGAAGGAGTCACCCCGGCGATCGGCCGCTGGCTGAACGAACGCGGC TGA (SEQ ID NO:64)
Secuencia de aminoacidos, Gene ID 005: Subunidad phaC de polihidroxialcanoato sintasa de Thiocapsa phenigii
MSPFPIDIRPDKLTEEMLEYSRKLGEGMQNLLKADQIDTGVTPKDWHRED KLVLYRYRRPAQVATQTIPLLIVYALVNRPYMTDIQEDRSTIKGLLATGQD VYLIDWGYPDQADRALTLDDYINGYIDRCVDYLRETHGVDQVNLLGICQGG AFSLCYTALKSEKVKNLVTMVTPVDFQTPGNLLSAWVQNVDVDLAVDTNGN IPGELLNWTFLSLKPFSLTGQKYVNMVDLLDDEDKVKNFLRMEKWIFDSPD QAGETFRQFIKDFYQRNGFINGGVLIGDQEVDLRNIRCPVLNIYPMQDHLV PPDASKALAGLTSSEDYTELAFPGGHIGIYVSGKAQEGVTPAIGRWLNERG (SEQ ID NO:65)
LISTADO DE SECUENCIAS <110> FARMER, WILLIAM R
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
BICKMEIER, JEFF LU, CHENFENG CHANG, DONG-EUN SKRALY, FRANK RAMSEIER, TOM M
<120> PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA LA PRODUCCION DE PRODUCTOS QUIMICOS DE POLI(5HV) Y DE 5 ATOMOS DE CARBONO
<130> MBX 067
<150> US 61/122,250 <151>
<160> 65
<170> Patentin Version 3.3
<210> 1 <211> 45 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico FS-E5'
<400> 1
ggaattcagg aggtttttat gaacgatacg gccaacaaga ccagc 45
<210> 2 <211> 44 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico FS-E3'
<400> 2
ggggtacctc actggccggt ggtgggcttg gtggtcttgc ggcg44
<210> 3 <211> 45 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico FS-C5'
<400> 3
ggggtaccag gaggttttta tgtccccatt cccgatcgac atccg 45
<210> 4 <211> 43 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico FS-C3'
<400> 4
cgggatcctc agccgcgttc gttcagccag cggccgatcg ccg 43
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico K5-1 5'
<400> 5
gctgaggatc caggaggttt ttatgttagg tcagatgatg cgtaatc 47
<210>6 <211> 36 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico K3-1 <400> 6
ctagaggatc cttattcaca gacagaagaa ctactg 36
<210> 7 <211> 41 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico K5-2 <400> 7
aattcaggag gtttttatgt taggtcagat gatgcgtaat c 41
<210>8 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico K3-2 <400> 8
gatccttatt cacagacaga agaactactg 30
<210>9 <211> 45 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico Posynrbs.c <400> 9
ggaattcagg aggtttttat gttaggtcag atgatgcgta atcag 45
<210> 10 <211> 35 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico Posynrbs.r <400> 10
cgggatcctt attcacagac agaagaacta ctgcg 35
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico A.eut.PhaG.c <400> 11
ggaattcgga tcccaagtac cttgccgaca tctatgcgct ggc 43
<210> 12 <211> 35 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico A.eut.EcoRl.r <400> 12
ggaattcccg gctccgggat tgccctggcc ggact 35
<210> 13 <211> 47 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS069 <400> 13
ggtggatcct taagaggagg tttttatgac gcgtgaagtg gtagtgg 47
<210> 14 <211> 31 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS070 <400> 14
ggtgctagct cagatacgct cgaagatggc g 31
<210> 15 <211> 47 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS071 <400> 15
ggtcctaggt taagaggagg tttttatgac aacattacaa ggtaaag 47
<210> 16 <211> 35 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS072 <400> 16
ggtgcggccg cttacatgta taagccgccg ttaat 35
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JB123b <400> 17
ttatttcatg aaccctcgaa ttgacgcgct c 31
<210> 18 <211> 31 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JB124a <400> 18
ttatttcatg agcttatcga taccgtcgac c 31
<210> 19 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JB134 <400> 19
tgagcggata acaatttcac 20
<210> 20 <211> 31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JB135 <400> 20
aataacacgt caacgcaaaa aggccatccg t 31
<210> 21 <211> 42 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JB136 <400> 21
tttttcatat gaggaggttt ttatgaacaa gaagaaccgc ca 42
<210> 22 <211> 31 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JB137 <400> 22
ttttttgtac atcagccttt acgcaggtgc a 31
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JB138 <400> 23
tatatactag taggaggata atatgagcaa aaccaacgaa tc 42
<210> 24 <211> 31 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JB139 <400> 24
tttttgtgca ctcaggcgat ttcagcgaag c 31
<210> 25 <211> 42 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JB145 <400> 25
tttttagatc taggaggttt ttatgctgcg tgctgcttct cg 42
<210> 26 <211> 31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JB146 <400> 26
tttttagatc tttagcggaa atagtttgga c 31
<210> 27 <211> 109 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico RF314 <400> 27
gcaagccaga gtaaccccgg acgcacgctg cgagcggcac gtagtgtgga tgccttacac
60
gccgcattta atcaataacc ttgagcgatt gtgtaggctg gagctgctt
109
<210> 28 <211> 110 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico RF315 <400> 28
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
gaatttgccc aacgccacgg ggaatcgcct gactgcggcg ctgcattaac tctttattgc
60
tgttcattcg cattctccag atgggaatta gccatggtcc atatgaatat
110
<210> 29 <211> 73 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS220 <400> 29
gcaagagtaa atctgcgtat cttcatacca tgactcataa aggagatacc ccggtgtagg 60
ctggagctgc ttc 73
<210> 30 <211> 71 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS217 <400> 30
accgcaggtc tgaaaagacc tgcgagtata tcagagctga atatgtcgcg catatgaata 60
tcctccttag t 71
<210> 31 <211> 61 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS223 <400> 31
tcgattcgtg aataagtggc ttaatattat tcattttaaa gcaagagtaa atctgcgtat c
<210> 32 <211> 57 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS224 <400> 32
gccactttct actcctggac cgcaggtctg aaaagacctg cgagtatatc agagctg 57
<210> 33 <211> 58 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
60
61
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<220>
<223> Cebador sintetico DE081 <400> 33
aaaagaattc ttaattaatt ctagaaggag gtttcatatg ttcacgggaa gtattgtc 58
<210> 34 <211> 33 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico DE082 <400> 34
agcgatggct ttgaaatact gatacaaacc ttc 33
<210> 35 <211> 33 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico DE083 <400> 35
gaaggtttgt atcagtattt caaagccatc gct 33
<210> 36 <211> 54 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico DE084 <400> 36
cccgagctcg tttaaactta attaagacta gttttacagc aaaccggcat gctt 54
<210> 37 <211> 63 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Fragmento sintetico de ADN <400> 37
tttttctaga ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcactag tgtttaaacc 60
ccc 63
<210> 38 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico DE118 <400> 38
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
tgtcccatgt gttgggaggg gcctttttta cctggagata tgactgtgta ggctggagct 60
gcttc 65
<210> 39 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico DE119 <400> 39
tgtcccatgt gttgggaggg gcctttttta cctggagata tgactgtgta ggctggagct 60
gcttc 65
<210> 40 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico DE122 <400> 40
gtttgagcag gctatgatta aggaaggatt ttccaggagg aacacgtgta ggctggagct 60
gcttc 65
<210> 41 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico DE123 <400> 41
tatttgttaa cagcacgtta ctcgcccgga agccgctctg gcaagatggg aattagccat 60
ggtcc 65
<210> 42 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico DE106 <400> 42
gtgttttctt attactttca aggtcttgca cttggggcgg ctatggtgta ggctggagct 60
gcttc 65
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico DE107 <400> 43
ctaactgaac aaggcttgtg catgagcaat accgtctctc gccagatggg aattagccat 60
ggtcc 65
<210> 44 <211> 71 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS286
<400> 44
ccgtttatgt
tcctccttag
<210> 45 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador sintetico MS287 <400> 45
cgagcagatg atttactaaa aaagtttaac attatcagga gagcattatg gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 46 <211> 70 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS289 <400> 46
imagen1
imagen2
<210> 47 <211> 71 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS290
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 47
gcagcgcaaa gctgcggatg atgacgagat tactgctgct gtgcagactg catatgaata 60
tcctccttag t 71
<210> 48 <211> 71 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS292
<400> 48
ctcccctgga
tcctccttag
<210> 49 <211> 70 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico MS293 <400> 49
imagen3
tatttttagt agcttaaatg tgattcaaca tcactggaga aagtcttatg gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 50 <211> 48 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico FS011 <400> 50
tcccctagga ttcaggaggt ttttatggag tgggaagaga tatataaa 48
<210> 51 <211> 38 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico FS008 <400>51
ccttaagtcg acaaattcta aaatctcttt ttaaattc 38
<210> 52 <211> 39 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JRG047
5
10
15
20
25
30
35
40
<400> 52
ttcaggatcc tgcgcatgct agctatagtt ctagaggta 39
<210> 53 <211> 53 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JRG048 <400> 53
catacgatag ctcataaaaa cctcctcgca gttagcgaat agaaaagccg ttg 53
<210> 54 <211> 55 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JRG049 <400> 54
gaggaggttt ttatgagcta tcgtatgagc tatcgtatgt ttgattatct ggtgc 55
<210> 55 <211> 35 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico JRG050 <400> 55
tctttcatga actcagaatg cctggcggaa aatcg 35
<210> 56 <211>1053 <212> ADN
<213> Aspergillus terreus <400> 56
5
atgccactgg
ttgctcaaaa tccactgcca cgtgctattc tgggtctgat gactttcggt 60
ccgagcgaaa
gcaaaggtgc gcgtatcact tccctggatg agtttaacaa gtgcctggat 120
tacttccagc
agcagggctt ccaggaaatc gataccgcgc gcatctacgt cggcggtgaa 180
caggaggcat
tcacggcgca ggcaaagtgg aaagaacgcg gcctgacgct ggcgactaag 240
tggtatccgc
agtacccggg tgcgcacaaa ccggatgtcc tgcgtcagaa cctggagctg 300
tccctgaaag
aactgggcac gaaccaggtc gatatcttct atctgcacgc cgcggatcgt 360
tctgtgccgt
tcgcggaaac tctggaaact gttaacgaac tgcacaaaga aggcaaattt 420
gttcagctgg
gtctgtctaa ctacaccgct ttcgaagtag ctgaaatcgt gaccctgtgt 480
aacgagcgtg
gttgggttcg tccgactatc taccaggcga tgtataacgc tatcacccgt 540
aacatcgaaa
ctgaactgat cccggcgtgc aagcgttacg gtattgacat tgttatctac 600
aacccactgg
cgggtggcct gttcagcggc aaatacaaag cacaggacat cccggctgaa 660
ggtcgttaca
gcgaccaatc ttccatgggc cagatgtacc gcaaccgtta ctttaaggac 720
gcaacctttg
acgctctgcg cctgatcgaa ccggttgttg cgaagcacgg cctgacgatg 780
ccggaaaccg
cgttccgctg ggtccaccac cactccgcac tgaacatgga agatggcggc 840
cgtgacggca
tcattctggg tgtaagcagc ctggctcagc tggaaaacaa cctgaaagac 900
attcagaaag
gtccgctgcc gcaggaggtt gtagacgtcc tggatcaggc ttggctggtg 960
gctaagccga
cggctccaaa ctactggcat ctggacctga aatacacgta cgacacccag 1020
gaagctctgt
tcaaaccgaa atctaaggcg taa 1053
<210> 57 <211> 350 <212> PRT
<213> Aspergillus terreus <400> 57
imagen4

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    1. Un organismo no humano recombinante modificado por ingeniena genetica para convertir 5-aminopentanoato en un polfmero de polihidroxialcanoato (PHA) o en un copoUmero del mismo que comprende 5-hidroxivalerato,
    en el que la ruta para convertir el 5-aminopentanoato en PHA que comprende 5-hidroxivalerato comprende 5- aminopentanoato transaminasa (5-aminovalerato transaminasa), EC 2.6.1.48; succinato semialdehndo reductasa (tambien conocida como glutarato semialdetndo reductasa), EC 1.1.1.61; CoA-transferasa, EC 2.8.3.14 y EC 2.8.3.n o Acil-CoA sintetasa, EC 6.2.1.3; y PHA sintasa, EC 2.3.1.n; y
    en el que el organismo recombinante produce el PHA que comprende 5-hidroxivalerato a partir de lisina, en el que el organismo recombinante esta modificado por ingeniena genetica para expresar al menos uno o mas genes que codifican una o mas enzimas para la produccion del PHA que comprende 5-hidroxivalerato a partir de lisina, en el que las enzimas se seleccionan del grupo que consiste en: lisina 2-monooxigenasa, EC 1.13.12.2; 5- aminopentanamidasa (5-aminovaleramidasa), EC 3.5.1.30; 5-aminopentanoato transaminasa (5-aminovalerato transaminasa), EC 2.6.1.48; succinato semialdehndo reductasa (tambien conocida como glutarato semialdehndo reductasa), eC 1.1.1.61; CoA-transferasa, EC 2.8.3.14 y EC 2.8.3.n; Acil-CoA sintetasa, EC 6.2.1.3; PHA sintasa, EC 2.3.1.n,
    en el que el 5-aminopentanoato se convierte en 5-hidroxivalerato, y
    en el que el 5-hidroxivalerato se convierte en un polfmero de PHA o en un copolfmero del mismo por medio del organismo recombinante.
  2. 2. El organismo recombinante de cualquier reivindicacion anterior, en el que el organismo recombinante expresa al menos uno o mas genes que codifican una o mas enzimas seleccionadas de p-cetoacil-CoA tiolasa, EC 2.3.1.9 y acetoacetil-CoA reductasa, EC 1.1.1.36.
  3. 3. El organismo recombinante de cualquier reivindicacion anterior, en el que PHA es un polfmero de monomeros de 5-hidroxivalerato o un copolfmero de polfmero de 5-hidroxivalerato, tal como poli(3-hidroxibutirato-co-5- hidroxivalerato).
  4. 4. El organismo recombinante de cualquier reivindicacion anterior, en el que el organismo recombinante convierte lisina en 5-aminopentanoato.
  5. 5. El organismo recombinante de cualquier reivindicacion anterior, en el que el organismo que se utiliza para construir el organismo recombinante se ha modificado para sobreproducir lisina con respecto a un organismo no modificado.
  6. 6. El organismo recombinante de cualquier reivindicacion anterior, en el que el organismo recombinante es resistente al analogo toxico de lisina S-(2-aminoetil) cistema, en el que el organismo recombinante expresa una dihidrodipicolinato sintasa resistente a la retroalimentacion por lisina, en el que el organismo recombinante expresa una aspartato quinasa III resistente a la retroalimentacion por lisina, y/o en el que el organismo recombinante se modifica adicionalmente por ingeniena genetica para inhibir o bloquear la exportacion de lisina.
  7. 7. El organismo recombinante de cualquier reivindicacion anterior, en el que el organismo se ha modificado para reducir o eliminar la actividad de glutarato semialdehndo deshidrogenasa, preferentemente en el que la glutarato semialdehndo deshidrogenasa se reduce o elimina por eliminacion o alteracion de uno o mas genes seleccionados del grupo que consiste en davD, ynel y gabD o sus homologos.
  8. 8. El organismo recombinante de cualquier reivindicacion anterior, en el que el organismo recombinante convierte el 5-hidroxivalerato en 5-hidroxivalerato CoA y/o convierte el 5-hidroxivalerato-CoA en un polihidroxialcanoato, tal como poli(5-hidroxivalerato) o en un copolfmero del mismo, por ejemplo, un copolfmero seleccionado de poli(3- hidroxipropionato-co-5HV), poli(3-hidroxibutirato-co-5HV) y poli(4-hidroxibutirato-co-5HV).
  9. 9. El organismo recombinante de cualquier reivindicacion anterior, en el que el organismo recombinante es procariota, tal como E. coli, o es un microorganismo eucariota.
  10. 10. Un organismo no humano recombinante, de acuerdo con la reivindicacion 1, para la produccion de polfmeros de polihidroxialcanoato (PHA) que comprenden monomeros de 5-hidroxivalerato a partir de lisina, en el que el organismo recombinante se modifica por ingeniena genetica para expresar al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en lisina 2-monooxigenasa, EC 1.13.12.2; 5-aminopentanamidasa (5-aminovaleramidasa), EC 3.5.1.30; 5-aminopentanoato transaminasa (5-aminovalerato transaminasa), EC 2.6.1.48; succinato semialdehndo reductasa (tambien conocida como glutarato semialdehndo reductasa), EC 1.1.1.61; CoA-transferasa, EC 2.8.3.14 y EC 2.8.3.n; Acil-CoA sintetasa, EC 6.2.1.3; PHA sintasa, EC 2.3.1.n para la produccion de un polihidroxialcanoato que comprende monomeros de 5-hidroxivalerato, y en el que el organismo recombinante no produce lisina, y/o no expresa una actividad enzimatica funcional de glutarato semialdehndo deshidrogenasa.
  11. 11. Un procedimiento de produccion de polfmeros de polihidroxialcanoato (PHA) basado en 5 atomos de carbono, o de copolfmeros del mismo, comprendiendo el procedimiento
    proporcionar lisina u otra materia prima de carbono renovable a celulas modificadas por ingeniena genetica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; y opcionalmente, en el que:
    (i) la materia prima de carbono renovable se selecciona entre almidon, sacarosa, glucosa, lactosa, fructosa,
    5 xilosa, maltosa y arabinosa, o combinaciones de las mismas; y/o
    (ii) el polihidroxialcanoato comprende 5-hidroxivalerato, por ejemplo, poli(5-hidroxivalerato), poli(3- hidroxipropionato-co-5HV), poli(3-hidroxibutirato-co-5HV) o poli(4-hidroxibutirato-co-5HV),
    y opcionalmente, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de recuperar el polihidroxialcanoato, el polfmero o copolfmero de los mismos, por ejemplo, mediante extraccion con disolvente o procesamiento acuoso.
    10
    imagen1
    Eteres de poliester
    Polioles de poliester Tereftalato de poli(pentametileno)
    (de tipo cerenol) (de ^P0 Sorona)
    TPA
    1,5 Pentanodiamida
    Glutarato de polipentileno
    1,5 Pentanodiol
    Glutaronitrilo
    (PPG)
    ji___^
    Acido glutarico
    Diamida glutarica
    Biopolimeros de
    5-Hidroxivalerato
    polihidroxialcanoato
    (5HV)
    producidos
    biologicamente
    N-metil-2-pipendona
    Polimerizacion por ,
    S-Valerolactona
    2-Piperidona
    apertura de amllo
    (DVL)
    para producir
    Tetrahidropirano N-vinil-2-piperidona
    homo-y co-poliesteres
    Figura 1
    imagen2
    Glucosa
    Glutarato 5HV" DVL
    5-APO
    L-Lisina
    exterior
    interior
    Glutarato
    L-Lisina
    Cadaverina
    5HV-CoA
    (R)-fl-Lisina
    PHA
    • P(SHV)
    • P(3HB-co-5HV)
    • P(4HB-co~5HV)
    • P(5HV-co-3HP)
    Lisina
    Glutarato semiaklehido
    15-oxopentanoato)
    Glutarato
    Figura 2 A
    Aceti -CoA
    Ofi,
    '-C-CA
    rAO lAO'H,
    5-Ammopentanamida
    5-Ami nopentanoato
    ;; .j-\
    Acetoacetil-CoA
    lr»flLce-to^lutarato
    ^ 5jlj;u”iatd
    ’•-■HAUr'
    Acetato fcW
    NADIPC
    •J'J
    5-Hidroxivalerato
    5-Hidroxiva en-CoA
    3-Hidroxibutiri -CoA
    AOP ATP* CoA
    in rtw,pr
    4-
    JWL.
    P(3HS-w-5HV)
    Figura 2B
    imagen3
    imagen4
    imagen5
    imagen6
    Metabolismo
    Oxaloacetato
    Central
    L-giutamaro
    EC 2,6.11
    a-cetogutarato
    Vy
    B-Alanma
    L-Aspariaio
    L-Arginma
    ATP
    © a.
    EC 2.7.2,A r
    L-Asparagina
    L-Aspartil-tRNA
    L-Asparta-4-fosfala
    ! '-i;
    msop- gc 1,2,1.11 *
    Sintesis
    ae treonma
    L-Aspa-ato
    semtaldeh do
    y met/onina
    'V‘«{
    piruva:o
    dapA
    g *
    EC 4,2.1.52
    EC 4.1.1 20
    vCv^1
    m«o-Dia mi nopi meiato
    NHr *Hj OH
    L-2 3-D»iidrodipicoiinato
    hl«DPH,H-~J dspB Q
    tfopF
    EC 1.3.1.26
    EC 5,1,1.7
    L, L* Dia m noptmclato
    Tolrah dro
    dip«co«na(o
    Succiral CoA + H;0
    dapE
    i dapD q *1 EC 2.3.1.117
    C 3/'
    EC 3.5.1,18
    atijD
    fW-Succinil-L.L
    C. -Ih dH
    EC 2.6.1.17
    o ^Dh ch
    2,6-diaminopimeIato
    cetopimelato
    L-gLtbinatc - cc’.oc uUiutu
    Figura 6
    imagen7
    imagen8
    tOf|Tr
    5CDC000
    5COOOOO
    •iX'TT
    1,4-Butanodiol (pat. int)
    :JJ.'l .L
    iDQi I'
    n:i; .‘I...
    Sanrii'in WSo+it Ifllt-CNito'fcTO, 1«W M
    Espectro 1,5PD de muestra
    1
    ■V
    w
    .......«
    Referenda 1.5PD
    de la biblioteca del NIST
    ftw
    Figura
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