KR101109402B1

KR101109402B1 - 보효소 재생에 의한 히드록시카르복실산류의 생산방법

Info

Publication number: KR101109402B1
Application number: KR1020087029542A
Authority: KR
Inventors: 타카시 모리시게; 미츠후미 와다; 히토시 타카하시; 다이스케 모치즈키; 준코 토쿠다
Original assignee: 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2006-05-09
Filing date: 2007-04-27
Publication date: 2012-01-30
Also published as: US8748157B2; CN101437949B; US20090305368A1; WO2007129466A1; JP4886775B2; JPWO2007129466A1; EP2025760A4; ES2424866T3; CN101437949A; EP2025760B1; EP2025760A1; KR20090008446A

Abstract

미생물 내에 NADH 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 도입하는 것에 의해 NADH 디히드로게나아제의 기능을 강화하여 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 재생능을 향상시킨 미생물을 이용하여 히드록시카르복실산을 생산한다.

Description

보효소 재생에 의한 히드록시카르복실산류의 생산방법{METHOD FOR PRODUCING HYDROXYCARBOXYLIC ACID BY REGENERATING COENZYME}

본 발명은, 글리콜산을 비롯한 히드록시카르복실산을 생산하는 미생물과, 미생물을 이용한 글리콜산을 비롯한 히드록시카르복실산 생산방법에 관한 것이다.

히드록시카르복실산류 중에는 폴리머 원료나 의약 중간체로서 유용하고, 그 효율적인 생산방법이 요구되고 있는 것이 있다. 그 일례로서 글리콜산(α-히드록시아세트산)을 들 수 있다. 글리콜산은, 세정제나 화장품 원료로서 이용되어 왔지만, 최근, 가스배리어성 폴리머나 의료용 폴리머로서 유용한 폴리글리콜산의 원료로서 주목받고 있다. 가스배리어성 재료로서 주목받고 있는 이유는 폴리글리콜산층이 높은 산소가스배리어성을 가지고 있고, 산소의 존재하에서 변질하기 쉬운 식품이나 탄산음료를 포장하기 위한 재료로서의 성능을 구비하고 있기 때문이다.

현행 시판되고 있는 화학합성품의 글리콜산은 적지 않은 협잡물을 포함하고 있어, 폴리머 원료로서는 순도적으로 문제가 있다. 왜냐하면 이들의 협잡물은 글리콜산의 탈수축합반응을 저해할 뿐만 아니라, 협잡물의 하나인 메톡시아세트산이 발암성의 혐의가 있는 화합물이고, 식품이나 음료의 포장재 중에 포함되는 것이 바람직하지 않기 때문이다. 정제에 의해서 협잡물을 제거하는 것은 기술적으로는 가능 하지만, 그와 같은 정제품은 가격이 높아지게 되어, 저렴한 포장재 원료로서는 현실적이지 않다.

화학합성품의 글리콜산에 보여지는 상기의 문제점을 회피하기 위해서, 에틸렌글리콜을 원료로 한 바이오법에 의한 글리콜산 제조의 시도가 행해지고 있다. 특허문헌 1 및 특허문헌 2에 있어서, 에틸렌글리콜 함유 배지상에서, 피키아(Pichia)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces)속, 크루이베로마이세스(Kluyveromyces)속, 토룰로프시스(Torulopsis)속에 속하는 효모, 노카르디아(Nocardia)속에 속하는 균주, 로도코쿠스(Rhodococcus)속에 속하는 균주, 또는 에스케리치아ㆍ콜라이 B(Escherichia coli B)주를 배양하고, 배양액 중에서 글리콜산을 분리ㆍ채취하는 것을 특징으로 하는 미생물에 의한 글리콜산의 생산방법이 개시되고 있다. 특허문헌 1 및 특허문헌 2의 실시예에 기재되어 있는 글리콜산 생산방법 중에서 글리콜산 축적 농도가 가장 높은 것은, 피키아ㆍ나가니시이(Pichia naganishii)를 이용한 방법이고, 30시간의 반응에서 35.3g/L의 글리콜산이 얻어지고 있다. 피키아ㆍ나가니시이를 이용한 글리콜산 생산에 관해서는 더욱이, 반응 조건의 개선이 이루어지고, 120시간의 반응에서 105g/L의 글리콜산이 얻어지는 것이 비특허문헌 1에서 보고되고 있다.

특허문헌 3에 있어서는 락토알데히드 리덕타아제를 코드하는 유전자와 락토알데히드 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 플라스미드의 형태로 도입함으로써 상기 효소활성이 부여 또는 강화된 미생물을 이용하는 것에 의해 에틸렌글리콜을 비롯한 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올을 원료로 하여, 글리콜산을 비롯한 히드록시카르복실산을 생산하는 것이 가능하다는 것, 또한 미생물이 가지고 있는 글리콜산옥시다아제를 코드하는 유전자를 파괴하고, 상기 효소활성을 불활성화하는 것에 의해 글리콜산의 생산성이 향상한다는 것이 개시되어 있다.

상기한 종래의 방법에 의한 글리콜산을 비롯한 히드록시카르복실산의 생산반응에 있어서는 반응에 제공하는 균체량이 많기 때문에, 그에 따른 제조비용의 상승이나 균체에 유래하는 불순물의 뒤섞임, 또한 히드록시카르복실산류의 제조 후에 균체를 폐기하는데 많은 노력과 비용이 든다는 문제점을 들 수 있다.

산화효소를 이용하여 알코올로부터 케톤을 제조하는 방법에 있어서는 반응에 필요한 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(이하 NAD라고 약칭하는 경우가 있다)를 반응에 수반하여 생성하는 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(이하 NADH라고 약칭하는 경우가 있다)로부터 재생시키는 이하와 같은 기술이 이용되고 있다. 요컨대 목적으로 하는 케톤을 생산하기 위한 산화반응과 NAD 재생을 위한 케톤의 환원반응의 2가지의 반응을 조합시키는 방법이나, 글루타민산디히드로게나아제에 의한 옥소글루타르산의 환원반응을 조합시키는 기술 등이다.

상기의 NAD를 재생하는 기술에 있어서는 NAD 재생을 위한 반응기질을 반응 계에 첨가할 필요가 있고, 또한 NAD 재생반응에 의해 부생물이 반응계 내에 축적한다는 결점을 들 수 있다.

알코올로부터의 케톤 제조에 있어서, 상기의 결점을 보충하는 NAD 재생방법으로서 미생물이 가지는 호흡쇄를 개재하여 분자상 산소를 환원하여 물을 생성함으로써 NAD를 재생하는 NADH 디히드로게나아제를 이용하는 방법이 예시되지만(특허문 헌 4), 이 효소활성을 강화한 미생물에 의한 실례는 보고되어 있지 않다.

특허문헌 1:일본 특허공개공보 평10-174593호

특허문헌 2:일본 특허공개공보 평10-174594호

특허문헌 3:국제공개 팜플렛 제2005/106005호

특허문헌 4:일본 특허공개공보 제2005-218349호

비특허문헌 1:Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol.65(10), pp.2265-2270, (2001)

발명의 개시

화학합성법에서는, 얻어지는 히드록시카르복실산의 순도의 점에서 충분하지 않고, 또한, 종래의 바이오법에서는, 생산반응에 제공하는 균체량이 많아 균체의 폐기 등의 문제가 있다. 본 발명이 해결하려고 하는 과제는, 적은 균체량으로 효율 좋게 생산할 수 있는, 공업적으로 유리한 히드록시카르복실산류의 생산방법, 및 상기 생산방법에 적절한 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, 미생물을 이용하여 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로부터 히드록시카르복실산을 생산하는 방법에 있어서, 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 재생능을 강화한 미생물을 이용하는 것에 의해, 히드록시카르복실산을 적은 균체량으로 효율 좋게 생산할 수 있는 것을 발견했다.

즉, 본 발명은 이하의 [1]로부터 [9]에 기재한 바와 같다.

[1] 미생물을 이용하여 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로부터 히드록시카르복실산을 생산하는 방법에 있어서, NADH 디히드로게나아제의 활성을 강화한 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 히드록시카르복실산의 생산방법.

[2] 미생물이, 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 적어도 1개의 효소활성을 강화한 미생물인 것을 특징으로 하는 [1] 기재의 생산방법.

[3] 미생물이, 글리콜산옥시다아제 활성을 불활성화 또는 미생물 본래의 활성보다도 저감한 미생물인 것을 특징으로 하는 [1] 기재의 생산방법.

[4] 미생물이, 글리콜산옥시다아제 활성을 불활성화 또는 미생물 본래의 활성보다도 저감한 미생물인 것을 특징으로 하는 [2] 기재의 생산방법.

[5] 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올이 에틸렌글리콜이고, 히드록시카르복실산이 글리콜산인 것을 특징으로 하는 [1]~[4]의 어느 하나에 기재된 생산방법.

[6] 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 적어도 1개의 효소활성을 강화하고, 또한, NADH 디히드로게나아제의 활성을 강화한 미생물.

[7] 글리콜산옥시다아제 활성을 불활성화 또는 미생물 본래의 활성보다도 저감한 것을 특징으로 하는 [6] 기재의 미생물.

[8] 미생물이 에스케리치아ㆍ콜라이인 [1]~[5]의 어느 하나에 기재된 생산방법.

[9] 미생물이 에스케리치아ㆍ콜라이인 [6] 또는 [7]에 기재된 미생물.

본 발명에 의해 글리콜산을 비롯한 히드록시카르복실산류를 적은 균체량으로 효율 좋게 생산하는 것이 가능하다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하에 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 실시형태는, 히드록시카르복실산의 생산방법이다. 이 방법은, 미생물을 이용하여 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로부터 히드록시카르복실산을 생산하는 방법에 있어서, NADH 디히드로게나아제의 활성을 강화한 미생물을 이용하는 것이다.

미생물이란, 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로부터 히드록시카르복실산을 생산하는 능력을 본래 가지는지 여부에 상관 없이, 어떠한 수단을 이용하는 것에 의해 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로부터 히드록시카르복실산을 생산하는 능력을 가질 수 있는 미생물이면 어느 미생물이어도 좋다. 바람직하게는 에스케리치아(Escherichia)속, 바실루스(Bacillus)속, 수도모나스(Pseudomonas)속, 세라티아(Serratia)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 로도코쿠스(Rhodococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)속, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)속, 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces)속, 야로위아(Yarrowia)속, 트리코스포론(Trichosporon)속, 로도스포리디움(Rhodosporidium)속, 피키아(Pichia)속, 칸디다(Candida)속, 뉴로스포라(Neurospora)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 세파로스포리움(Cephalosporium)속, 트리코데르마(Trichoderma)속 등의 숙주벡터계가 개발되고 있는 세균, 방선균, 효모, 곰팡이가 예시되고, 보다 바람직하게는 에스케리치아ㆍ콜라이(Escherichia coli)가 예시된다.

또한, 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올이란, 탄소쇄의 말단에 수산기를 가지고, 또한 분자 내에 2개 이상의 수산기를 가지는 지방족 화합물이면 그 구조에 특별히 제한은 없지만, 그와 같은 화합물로서 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 글리세롤, 1,3-프로판디올, 1,2-부탄디올, 1,3-부탄디올, 1,4-부탄디올, 1,2,4-부탄트리올 등을 예시할 수 있다.

또한, 히드록시카르복실산이란, 상기한 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올류에 관하여 수산기를 가지는 말단 탄소의 하나가 산화되어 카르복실산으로 되어 있는 것이다. 그와 같은 화합물로서 글리콜산, 히드록시에톡시아세트산, 글리세린산, 3-히드록시프로판산, 2-히드록시부탄산, 3-히드록시부탄산, 4-히드록시부탄산, 2,4-디히드록시부탄산 등을 예시할 수 있다.

본 실시형태에 있어서 니코틴아미드 아데닌디뉴클레오티드란, 산화형 및 환원형의 명기가 없는 한 그 어느 쪽도 지칭한다.

본 실시형태에서는, 말단에 수산기를 가지는 지방족 다가알코올로서, 에틸렌글리콜을 이용할 수 있다. 또한, 히드록시카르복실산으로서는, 글리콜산을 적절하게 이용할 수 있다.

또한, NADH 디히드로게나아제란, 국제생화학연합(I.U.B.) 효소위원회보고에 준거한 효소번호 1.6.5.3 또는 1.6.99.3 또는 1.6.99.5로 분류되고, 유비퀴논, 디메틸메나퀴논, 메나퀴논 등의 퀴논류를 전자수용체로서 NADH로부터 NAD를 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소의 총칭을 가리킨다. 바람직하게는 I.U.B. 효소 위원회 보고에 준거한 효소번호 1.6.99.3으로 분류되는 NADH 디히드로게나아제이다. 에스케리치아ㆍ콜라이를 예로 하면 GenBank accession number V00306에 의해서 보고 되어 있는 유전자 ndh로 코드되어 있는 NADH 디히드로게나아제가 예시된다.

NADH 디히드로게나아제의 활성을 강화한다는 것은, 그 활성이 강화 전에 비해 2배 이상 향상하고 있는 것이 바람직하다. 효소활성이 향상한 미생물은, 예를 들면 상기 효소를 코드하는 유전자를 유전자재조합기술을 이용하여 야생형의 미생물(또는 재조합 전의 미생물)에 도입하는 방법이나 게놈 내에 있어서 상기 효소를 코드하는 유전자의 프로모터에 변이를 도입하는 등의 방법을 이용하여 만들어낼 수가 있다. 야생형의 미생물(또는 재조합 전의 미생물)에 상기 유전자를 도입하는 방법으로서는, 상기 유전자를 플라스미드의 형태로 미생물에 도입하는 것을 예시할 수 있다. 미생물에의 유전자의 도입에 이용되는 게놈 DNA의 조제, 플라스미드의 조제, DNA의 절단 및 연결, 형질전환, PCR(Polymerase Chain Reaction), 프라이머로서 이용하는 올리고뉴클레오티드의 설계, 합성 등의 방법은, 당업자에 의해 잘 알려져 있는 통상의 방법으로 행할 수 있다. 이들의 방법은, Sambrook, J., et. al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) 등에 기재되어 있다.

본 실시형태에 관련되는 미생물은, 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 적어도 1개의 효소활성을 강화한다.

여기에서, 락토알데히드 리덕타아제란, I.U.B. 효소 위원회 보고에 준거한 효소번호 1.1.1.77로 분류되고, 1.2-프로판디올로부터, 보효소인 NAD의 존재하에서 락토알데히드를 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소의 총칭을 가리킨다.

또한, 락토알데히드 디히드로게나아제란, I.U.B. 효소 위원회 보고에 준거한 효소번호 1.2.1.22로 분류되고, 락토알데히드로부터, 보효소인 NAD의 존재하에서 젖산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 총칭을 가리키고, 또한 I.U.B. 효소 위원회 보고에 준거한 효소번호 1.2.1.21로 분류되고, 글리콜알데히드로부터, 보효소인 NAD의 존재하에서 글리콜산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소 글리콜알데히드 디히드로게나아제의 총칭도 아울러 가리키는 것이다. 왜냐하면 에스케리치아ㆍ콜라이를 이용한 선행문헌에서, 락토알데히드 디히드로게나아제와 글리콜알데히드 디히드로게나아제는 동일한 효소인 것이 보고되어 있기 때문이다(Caballero, E., et. al., J. Biol. Chem., Vol.258, pp.7788-7792, (1983)).

또한, 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 적어도 1개의 효소활성을 강화하였다는 것은, 에스케리치아ㆍ콜라이를 예로 하면, 이들의 효소의 적어도 1개의 효소활성이, 야생주(또는 재조합 전의 미생물)의 20배 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 100배 이상이다.

효소활성이 향상한 미생물은, 예를 들면 상기 효소를 코드하는 유전자를 유전자 재조합기술을 이용하여 야생형의 미생물(또는 재조합 전의 미생물)에 도입하는 방법이나 게놈 내에 있어서 상기 효소를 코드하는 유전자의 프로모터에 변이를 도입하는 등의 방법을 이용하여 만들어낼 수가 있다. 야생형의 미생물(또는 재조합 전의 미생물)에 상기 유전자를 도입하는 방법으로서는, 상기 유전자를 플라스미드의 형태로 미생물에 도입하는 것을 예시할 수 있다. 미생물에의 유전자의 도입에 이용되는 게놈 DNA의 조제, 플라스미드의 조제, DNA의 절단 및 연결, 형질전환, PCR, 프라이머로서 이용하는 올리고뉴클레오티드의 설계, 합성 등의 방법은, 당업자에게 잘 알려져 있는 통상의 방법으로 행할 수 있다. 이들의 방법은, 상기 Sambrook, J.들의 문헌 등에 기재되어 있다.

예를 들어, 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 효소활성이 향상한 에스케리치아ㆍ콜라이는, 이하와 같이 제작할 수 있다.

에스케리치아ㆍ콜라이의 락토알데히드 리덕타아제의 유전자(이하, fucO로 약칭하는 경우가 있다)의 염기 서열은 이미 보고되어 있다(GenBank accession number M31059). 또한 에스케리치아ㆍ콜라이의 락토알데히드 디히드로게나아제의 유전자(이하, aldA로 약칭하는 경우가 있다)의 염기 서열도 이미 보고되어 있다(GenBank accession number M64541).

fucO를 취득하기 위해서 에스케리치아ㆍ콜라이의 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, 프라이머로 되는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하여, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소로 소화함으로써 fucO 프래그먼트를 얻는다.

또한, aldA를 취득하기 위해서 에스케리치아ㆍ콜라이의 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, 프라이머로 되는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하여, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소로 소화함으로써 aldA 프래그먼트를 얻는다.

더욱이, 글리세르알데히드 3-인산탈수효소(GAPDH) 프로모터를 취득하기 위하여 에스케리치아ㆍ콜라이의 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, 프라이머로 되는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하여, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소로 소화함으로써 GAPDH 프로모터를 코드하는 DNA 프래그먼트를 얻는다.

상기의 3개의 DNA 프래그먼트과 플라스미드를 제한효소로 소화함으로써 얻어지는 프래그먼트를 결합한 후, 에스케리치아ㆍ콜라이로 형질전환하고, LB 한천 플레이트에 생육하는 형질전환체를 얻는다. 얻어진 콜로니를 LB 액체배지에서 배양하여, 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수한다. 본 플라스미드를 임의의 숙주 에스케리치아ㆍ콜라이에 도입함으로써 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 효소활성이 향상한 에스케리치아ㆍ콜라이를 제작할 수 있다.

본 실시형태와 관련되는 미생물은, 글리콜산옥시다아제 활성을 불활성화 또는 미생물 본래의 활성보다도 저감된다.

여기에서, 글리콜산옥시다아제란, I.U.B. 효소 위원회 보고에 준거한 효소번호 1.1.3.15로 분류되고, 글리콜산으로부터 글리옥실산을 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소의 총칭을 가리킨다.

또한, 글리콜산옥시다아제 활성의 불활성화란, 그 효소활성이 완전히 소실하는 것을 의미한다. 또한, 글리콜산옥시다아제 활성의 저감이란, 그 효소활성의 일부가 소실하는 것을 의미하고, 야생주(또는 재조합 전의 미생물)가 가지는 글리콜산옥시다아제 활성에 대해서, 2분의 1 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10분의 1 이하이다. 효소 기능을 불활성화, 혹은 저감하려면, 그 단백질을 코드하는 유전자에 변이를 도입하거나, 결실시키거나, 치환시키거나, 혹은 그 단백질을 특이적으로 불활성화하는 약제를 첨가하거나, 자외선을 조사하는, 등의 방법이 있다. 표적으로 하는 유전자에 관해서 그것을 결실시키는 방법이나, 변이시키는 방법, 및, 치환하는 방법에 관해서는, 당업자에게 잘 알려져 있는 통상의 방법으로 행할 수 있다. 구체적으로는 에스케리치아ㆍ콜라이 MT-11023주가, 글리콜산옥시다아제를 코드하는 유전자인 glcDEF의 파괴에 의해 글리콜산옥시다아제 활성이 불활성화 한 미생물로서 예시할 수 있다.

에스케리치아ㆍ콜라이 MT-11023주는 유전자 파괴에 의해 글리콜산옥시다아제가 불활성화하고 있기 때문에, 이것을 이용하여 본 발명을 실시하는 것이 가능하다. 본 균주는, FERM BP-10293의 기탁 번호로, 이바라키현 츠쿠바시동 1쵸메 1번 1호 중앙 제6의 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에, 특허수속상의 미생물의 기탁 등의 국제 승인에 관한 부다페스트 조약에 근거하여, 평성17년 3월 10일부터 기탁되어 있다.

어느 표적 효소를 코드하는 유전자를 미생물에 도입하는데 있어서의 「플라스미드의 형태로」란, 상기 유전자를 벡터에 연결하여 재조합 플라스미드를 작성하고, 이것을 형질전환 등의 방법으로 상기 미생물에 도입하는 것을 의미한다. 또한, 항상적으로 미생물 내에서 기능하는 강력한 프로모터와 목적 유전자를 기능적으로 연결했을 때에는, 플라스미드가 가지는 레플리콘의 성질에 의해, 미생물 세포당 카피 수가 일반적으로 적다고 하는 플라스미드를 이용하는 것도 본 발명의 목적을 달성할 수 있다. 그와 같은 레플리콘을 가지는 플라스미드로서 pACYC184(GenBank accession number X06403) 등을 예시할 수 있다.

본 실시형태의 생산방법을 실시할 때에는, 통상, 배지를 이용하여 미생물을 배양하여 증식시켜 필요량의 미생물 균체를 얻는다.

본 발명에 있어서, 배양에 사용되는 배지는, 탄소원, 질소원, 무기이온 및 필요에 따라서 그 외의 유기 미량 원소를 함유하는 배지이면 특별히 제한은 없다. 탄소원으로서는, 글루코오스, 프룩토오스, 당밀 등의 당류, 푸마르산, 시트르산, 숙신산 등의 유기산, 메탄올, 에탄올, 글리세롤 등의 알코올류, 그 외가 적절히 사용된다. 질소원으로서는, 유기암모늄염, 무기암모늄염, 암모니아 가스, 암모니아수, 단백질 가수분해물 등의 무기 및 유기의 질소원, 그 이외의 것이 적절히 사용된다. 무기이온으로서는, 마그네슘 이온, 인산 이온, 칼륨 이온, 철 이온, 망간 이온, 황산 이온, 그 외가 필요에 따라 적절히 사용된다. 유기 미량 성분으로서는, 비타민, 아미노산 등 및 이것들을 함유하는 효모 엑기스, 펩톤, 옥수수 침지수(corn steep liquor), 카제인 분해물, 그 외가 적절히 사용된다.

배양에 사용되는 배지로서는, 공업적 생산에 제공하는 점을 고려하면 액체배지가 바람직하다.

또한, 배지 조성은, 폴리펩톤 0.5g/L 이상 10g/L 이하, Fe₂SO₄ 0.02g/L 이상 0.3g/L 이하, K₂HPO₄ 0.5g/L 이상 5g/L 이하, KH₂PO₄ 0.5g/L 이상 5g/L 이하, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.5g/L 이상 5g/L 이하, (NH₄)₂SO₄ 0.3g/L 이상 15g/L 이하, 니코틴산 0.02g/L 이상 1g/L 이하(용매는 물)로 하면 바람직하다.

본 실시형태와 관련되는 미생물의 배양에 즈음하여, 배양 조건은 특별한 제한은 없지만, pH와 온도를 적절히 제어하면서 배양한다. 호기 조건이어도, 혐기 조건이어도 좋지만, 바람직하게는, 호기 조건으로 한다. 통기량은, 배지 1L당 0.2L/min 이상 3L/min 이하로 하면 바람직하고, 0.5L/min 이상 2L/min 이하로 하면보다 바람직하다. 또한, 교반 속도는, 200rpm 이상 1000rpm 이하로 하면 바람직하고, 500rpm 이상 800rpm 이하로 하면 보다 바람직하다. 이렇게 하는 것에 의해, 균체 중량당 히드록시카르복실산 생산량이 많은 균체를 얻을 수 있다. 또한, 상기의 통기, 교반 조건과 상당하는 용존산소 공급을 실현할 수 있는 기포탑 등을 이용하는 것도 배양이 가능하다.

pH는 5 이상 8 이하로 하는 것이 바람직하고, pH7.0 이상 7.4 이하로 하면 보다 바람직하고, pH7.2로 하면 가장 바람직하다. 이렇게 하는 것에 의해, 균체 중량당의 히드록시카르복실산 생산량이 많은 균체를 얻을 수 있다.

또한, 온도는, 25℃ 이상 40℃ 이하로 하는 것이 바람직하고, 33℃ 이상 37℃ 이하로 하면 보다 바람직하고, 35℃로 하면 가장 바람직하다. 이렇게 하는 것에 의해, 균체 중량당의 히드록시카르복실산 생산량이 많은 균체를 얻을 수 있다.

배양에 필요한 시간은 12시간 이상 50시간 이하로 한다. 이것에 의해, 균체 중량당의 히드록시카르복실산 생산량이 많은 균체를 얻을 수 있다.

히드록시카르복실산의 제조에 사용되는 용매로서는, 인산칼륨 완충액 등의 완충액이나, 전술의 미생물의 배양에 이용한 배지, 및 순수를 예시할 수 있다. 또한, 원료의 지방족 다가알코올과 용매와의 혼합액에, 먼저 배양에 의해 얻어진 미생물 균체를 접촉시켜 반응을 행할 수 있다. 미생물 균체는, 배양이 끝난 배양액 그 자체를 사용하는 방법이나, 배양액으로부터 균체만을 회수하여 사용하는 방법을 예시할 수 있다.

본 발명의 생산방법에 있어서의 반응에 즈음하여, 반응 조건은 특별한 제한은 없고, pH와 온도를 적절히 제어하면서 반응한다.

예를 들면, pH는 6 이상 9 이하로 하면 바람직하고, pH7.0 이상 8.0 이하로 하면 보다 바람직하고, pH7.2로 하면 가장 바람직하다. 이렇게 하는 것에 의해 반응액에 첨가한 균체량당의 히드록시카르복실산 생산량을 높일 수 있다는 효과가 얻어진다.

또한, 온도는, 20℃ 이상 45℃ 이하의 범위 내가 바람직하고, 30℃ 이상 40℃ 이하로 하면 특히 바람직하고, 35℃가 가장 바람직하다. 이렇게 하는 것에 의해, 반응액에 첨가한 균체량당 히드록시카르복실산 생산량을 높일 수 있다는 효과가 얻어진다.

또한, 반응은, 바람직하게는, 호기 조건으로 한다. 통기량은, 반응액 1L당 0.1L/min 이상 2.0L/min 이하로 하면 바람직하고, 0.2L/min 이상 1.0L/min 이하로 하면 보다 바람직하다. 또한, 교반 속도는, 200rpm 이상 1000rpm 이하로 하면 바람직하고, 400rpm 이상 800rpm 이하로 하면 보다 바람직하다. 이렇게 하는 것에 의해, 반응액에 첨가한 균체량당의 히드록시카르복실산의 생산량을 높일 수 있다는 효과가 얻어진다. 또한, 상기의 통기, 교반 조건과 상당하는 용존산소 공급을 실현할 수 있는 기포탑 등을 이용하는 것도 반응이 가능하다.

또한, 반응 시간은 12시간 이상 96시간 이하로 하는 것에 의해, 수율 80% 이상에서 히드록시카르복실산을 얻을 수 있다.

이상과 같이 하여 얻어진 반응액 중에 축적한 생산물인 히드록시카르복실산을 회수하는 방법으로서는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 반응액으로부터 균체를 원심분리 등으로 제거한 후, 합성 흡착 수지를 이용하는 방법이나 침전제를 이용하는 방법, 그 외 통상의 채취 분리 방법으로 분리하는 방법을 채용할 수 있다.

상술한 목적, 및 그 외의 목적, 특징 및 이점은, 이하에 서술하는 최적의 실시의 형태, 및 그에 부수하는 이하의 도면에 의해서 더욱 분명하게 된다.

도 1은 참고예 1에 있어서의 세포 내의 NADH/NAD비(NADH 함량/NAD 함량)의 경시변화를 나타낸 그래프이다. 도면 중의 □는, △glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주의 NADH/NAD비를 나타낸다. 도면 중의 ○는, △glcDEF/pGAPfucO-aldA주의 NADH/NAD비를 나타낸다.

(제조예 1) 에스케리치아ㆍ콜라이 MG1655glcDEF 결실주의 제작

에스케리치아ㆍ콜라이의 게놈 DNA의 전체 염기서열은 공지이고(GenBanak accession number U00096), 에스케리치아ㆍ콜라이의 글리콜산옥시다아제의 유전자(이하, glcDEF로 약칭하는 경우가 있다)의 염기 서열도 이미 보고되어 있다(GenBank accession number L43490).

에스케리치아ㆍ콜라이 MG1655주의 게놈 DNA의 glcDEF 근방 영역의 유전자 정 보에 근거하여 작성된, 서열 번호 1(TTGGTACCGTTCTGCCAGCAACTGACG) 및 서열 번호 2(TGTCTAGAGTACCTCTGTGCGTCACTGG) 및 서열 번호 3(GCTCTAGACGCTTTGTTGTGTTGTGTGG) 및 서열 번호 4(AACTGCAGGATCGGTCAATGATTGCAGC)의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR를 행했다. 얻어진 DNA 프래그먼트를 각각, 제한효소 KpnI과 XbaI, XbaI과 PstI로 소화하는 것에 의해, 각각 약 670bp, 790bp의 프래그먼트를 얻었다. 이 DNA 프래그먼트를, 온도 감수성 클로닝 벡터-pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)(Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191(2000))을 KpnI, PstI로 소화하여 얻어지는 프래그먼트과 혼합하여, 리가아제를 이용하여 결합한 후, DH5α주(토요방적사제)에 30℃에서 형질전환하고, 클로람페니콜 10㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 생육하는 형질전환체를 얻었다. 얻어진 콜로니를 클로람페니콜 10㎍/ml를 포함한 LB 액체배지에서, 30℃에서 하룻밤 배양하여, 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수했다.

이 플라스미드를 에스케리치아ㆍ콜라이 MG1655주에 30℃에서 형질전환하고, 클로람페니콜 10㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 30℃에서 하룻밤 배양하여, 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 클로람페니콜 10㎍/ml를 포함한 LB 액체배지에 접종하여, 30℃에서 하룻밤 배양했다. 다음에 이들의 배양균체가 얻어지도록 클로람페니콜 10㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 도포하고, 42℃에서 생육하는 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니를, 약제를 포함하지 않는 LB 액체배지에서, 30℃에서 하룻밤 배양하여, 또한 약제를 포함하지 않은 LB 한천 플레이트에 도포하여 42℃에서 생육하는 콜로니를 얻었다.

출현한 콜로니 중에서 무작위로 100콜로니를 픽업하여 각각을, 약제를 포함하지 않는 LB 한천 플레이트와 클로람페니콜 10㎍/ml를 포함하는 LB 한천 플레이트에 생육시켜, 약제를 포함하지 않는 LB 한천 플레이트에만 생육하는 클로람페니콜 감수성의 클론을 선택했다. 더욱이 이들의 목적 클론의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 glcDEF를 포함하는 약 3.8kbp 단편을 증폭시켜, glcDEF 영역이 결실하고 있는 주를 선발하고, 얻어진 주식을 MG1655glcDEF 결실주(이하 △glcDEF로 약칭하는 경우가 있다)라 명명했다. 또 에스케리치아ㆍ콜라이 MG1655주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 입수할 수 있다.

(제조예 2) 락토알데히드 리덕타아제, 락토알데히드 디히드로게나아제 동시 발현 벡터의 구축

fucO를 취득하기 위해서 에스케리치아ㆍ콜라이 MG1655주의 게놈 DNA를 템플릿으로 이용하여 서열 번호 5(GCTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGATGGCTAACAGAATGATTCTG) 및 서열 번호 6(GTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG)로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하고, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소 XbaI 및 HindIII로 소화함으로써 약 1.2kbp의 fucO 프래그먼트를 얻었다. 더욱이, aldA를 취득하기 위 해서 에스케리치아ㆍ콜라이 MG1655주의 게놈 DNA를 템플릿으로 이용하여 서열 번호 7(CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGTCAGTACCCGTTCAACATCC) 및 서열 번호 8(GCTCTAGACTCTTTCACTCATTAAGACTG)로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하여, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소 EcoRI 및 XbaI로 소화함으로써 약 1.5kbp의 aldA 프래그먼트를 얻었다.

더욱이, 글리세르알데히드 3-인산탈수효소(GAPDH) 프로모터를 취득하기 위하여 에스케리치아ㆍ콜라이 MG1655주의 게놈 DNA를 템플릿으로 이용하여 서열 번호 9(AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC) 및 서열 번호 10(ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG)로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭하여, 얻어진 DNA 프래그먼트를 제한효소 EcoRI로 소화함으로써 약 100bp의 GAPDH 프로모터를 코드하는 DNA 프래그먼트를 얻었다.

상기의 3개의 DNA 프래그먼트과, 플라스미드 pUC18(토요방적사제)를 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 소화함으로써 얻어지는 프래그먼트를, 리가아제를, 이용하여 결합한 후, 에스케리치아ㆍ콜라이 DH5α주(토요방적사제)로 형질전환하여, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에 생육하는 형질전환체를 얻었다. 얻어진 콜로니를 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 액체배지에서, 37℃에서 하룻밤 배양하고, 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수하여, 이 플라스미드를 pGAPfucO-aldA라 명명했다.

(제조예 3) 락토알데히드 리덕타아제, 락토알데히드 디히드로게나아제 동시 발현 벡터에 의한 △glcDEF주 형질전환체의 구축

제조예 2에서 얻어진 플라스미드 pGAPfucO-aldA를 제조예 1에서 얻어진 △glcDEF주로 형질전환하고, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에서, 37℃에서 하룻밤 배양하는 것에 의해 △glcDEF/pGAPfucO-aldA주를 얻었다.

(실시예 1) 락토알데히드 리덕타아제, 락토알데히드 디히드로게나아제, NADH 디히드로게나아제 동시 발현 벡터의 구축과 상기 벡터에 의한 △glcDEF주 형질전환체의 구축

에스케리치아ㆍ콜라이의 NADH 디히드로게나아제의 유전자(이하, ndh로 약칭하는 경우가 있다)의 염기 서열은 이미 보고되어 있다(GenBank accession number V00306). ndh를 취득하기 위해서 에스케리치아ㆍ콜라이 MG1655주의 게놈 DNA를 템플릿으로 이용하여 서열 번호 11(CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGACTACGGCATTGAAAAAGATTGTG) 및 서열 번호 12(GGTCTAGACGATTAATGCAACTTCAAACG)로 표시되는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR법으로 증폭함으로써 약 1.3kbp의 ndh 프래그먼트를 얻었다. 얻어진 ndh 프래그먼트를 T4DNA 폴리뉴클레오티드키나아제 처리했다.

이 DNA 프래그먼트과, 제조예 2에서 작성한 pGAPfucO-aldA 플라스미드를 HindIII로 소화하고, 평활 말단 처리, 탈인산화 처리를 행한 프래그먼트를 혼합하고, 리가아제를 이용하여 결합한 후, 에스케리치아ㆍ콜라이 DH5α(토요방적사제)로 형질전환하고, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에 생육하는 형질전환체를 얻었다. 얻어진 콜로니를 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 액체배지에서, 37℃에서 하룻밤 배양하고, 얻어진 균체로부터 플라스미드를 회수하여, 이 플라스 미드를 pGAPfucO-aldA-ndh라 명명했다. 얻어진 플라스미드 pGAPfucO-aldA-ndh를 제조예 1에서 얻어진 △glcDEF주로 형질전환하고, 암피실린 50㎍/mL를 포함하는 LB 한천 플레이트에서, 37℃에서 하룻밤 배양하는 것에 의해 △glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주를 얻었다.

(실시예 2) △glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주에 의한 글리콜산 생산

실시예 1에서 얻어진 △glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주를 전배양으로서 삼각 플라스크에 넣은 LB Broth, Miller 배양액(Difco244620) 25mL에 식균하고, 하룻밤, 배양 온도 35℃, 120rpm으로 교반 배양을 행했다. 전배양액 전량을, 이하에 나타내는 조성의 배지 475g가 들어 있는 1L용적의 배양조(ABLE사제 배양장치 BMJ-01)에 옮기고, 배양을 행했다. 배양은 대기압하, 통기량 0.5L/min, 교반속도 800rpm, 배양 온도 35℃, pH7.2(NH₃ 수용액으로 조정)에서 행했다. 상기의 조건에서 최초의 글루코오스가 완전히 고갈한 후, 나머지의 시간을 배지 중의 글루코오스 농도 0.1g/L 미만이 되도록 하는 가변속도로 글루코오스를 전량으로 40g 공급했다.

<배지 조성>

폴리펩톤:7g/L

글루코오스:30g/L

니코틴산:0.1g/L

Fe₂SO₄:0.09g/L

K₂HPO₄:2g/L

KH₂PO₄:2g/L

MgSO₄ㆍ7H₂O:2g/L

(NH₄)₂SO₄:5g/L

용매:물

배양 개시 후 24시간의 균체를 원심분리(8000rpm, 20분간)에 의해 집균 했다. 집균 후의 습균체를 4.5g 칭량하고, 에틸렌글리콜 65g과 함께 증류수에 현탁 하여 최종액량을 500ml로 했다. 현탁액을 ABLE사제 배양장치 BMJ-01의 배양조로 옮겨 70시간 반응을 행했다. 반응은 대기압하, 통기량 0.25L/min, 교반속도 550rpm, 반응 온도 35℃, pH7.2(NH₃ 수용액으로 조정)으로 행했다. 얻어진 반응액 중의 글리콜산 축적량을, 히타치제작소제 고속액체크로마토그래피를 이용하여, 이하의 설정으로 정량했다.

컬럼:ULTRON PS-80H(노부카즈화공사제)

용리액:과염소산 수용액(pH2.1)

유속:1.0mL/min

검출기:UV 검출기 측정 파장:280nm

또한, 습균체의 일부를 50℃에서 건조시킨 후의 건조 중량으로부터, 반응에 사용한 균체의 건조균체 중량을 구했다. △glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주에 있어서 건조균체 1g당 39.8g의 글리콜산을 생산하고 있었다.

또한, △glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주의 생육 속도는, 비교예 1에 있어서의 △glcDEF/pGAPfucO-aldA주와 동일한 것이며, ndh의 강화에 의한 생육의 지연이 일어나지 않은 것이 확인되었다.

(비교예 1) △glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 의한 글리콜산 생산

제조예 3에서 얻어진 △glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 관하여 실시예 2와 동일하게 배양 및 글리콜산 생산을 행했다. △glcDEF/pGAPfucO-aldA주의 건조균체 1g당의 글리콜산 생산량은 20.2 g이었다.

(참고예 1) △glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주, △glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 있어서의 세포내 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 함량의 측정

△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주, 및 △glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 관하여 실시예 2와 동일하게 배양 및 글리콜산 생산을 행했다.

글리콜산 생산시의 △glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주 및 △glcDEF/pGAPfucO-aldA주에 관해서, 일정 시간에 있어서 샘플링을 행하고, 각각의 균주에 관해서 2개의 미량 원심관에 1mL씩 샘플링하여, 4℃에서 원심, 집균했다. 2개의 원심관 중 1개를 NAD 측정, 1개를 NADH 측정에 사용하여, 각각 이하의 처리를 행했다.

NAD 측정용의 샘플에는, 집균한 습균체 1.5mg당 400μL의 0.04mol/L의 염산 수용액을 가하여 현탁했다. 현탁액을 90℃에서 3분 가열 후, 얼음 위에서 급냉했다. 이 처리액의 상청을 이용하여, 이하에 나타내는 조성의 반응액을 만들었다. 또, 1mol/L Tris-HCl로서 pH9.0의 것을 이용했다. 또한 알코올 디히드로게나아제로서 SIGMA사제 알코올 디히드로게나아제(A3263)를 10mmol/L의 Tris-HCl(pH8.8)로 용해 하여, 400유닛/mL(다만 1유닛은 pH8.8, 25℃의 조건하, 1분간에 1μmol의 에탄 올을 아세트알데히드로 변환하는데 필요한 효소량)로 한 것을 사용했다. 반응액의 450nm에 있어서의 흡광도를 테트라카라원(생화학공업사제)의 프로토콜에 따라서 측정 했다. 또 SIGMA사제 NAD의 용액에 관하여 동일한 처리를 실시한 것을 측정하는 것에 의해 검량선을 작성하고, 샘플의 NAD 농도를 구했다.

NADH 측정용의 샘플에는, 집균한 습균체 1.5mg당 400μL의 0.04mol/L의 수산화칼륨 수용액을 가하여 현탁했다. 현탁액을 90℃에서 3분 가열 후, 얼음 위에서 급냉했다. 이 처리액의 상청을 이용하여, 이하에 나타내는 조성의 반응액을 만들었다. 또 1mol/L Tris-HCl로서 pH8.8의 것을 이용했다. 또한 알코올 디히드로게나아제로서 SIGMA사제 알코올 디히드로게나아제(A3263)를 10mmol/L의 Tris-HCl(pH8.8)으로 용해하여, 400유닛/mL(다만 1유닛은 pH8.8, 25℃의 조건하, 1분간에 1μmol의 에탄올을 아세트알데히드로 변환하는데 필요한 효소량)으로 한 것을 사용했다.

반응액의 450nm에 있어서의 흡광도를 테트라카라원(생화학공업사제)의 프로토콜에 따라서 측정했다. 또, SIGMA사제 NADH의 용액에 관해서, 동일한 처리를 실시한 것을 측정하는 것에 의해 검량선을 작성하여, 샘플의 NADH 농도를 구했다. 도 1은, 이 때의 NADH/NAD비(NADH 함량/NAD 함량)를 나타낸다. 가로축은 반응시간(hr), 세로축은 NADH/NAD비(NADH 함량/NAD 함량)를 나타내고 있다.

△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh주에 있어서 항상 NADH/NAD비의 값이 작고, NADH로부터 NAD를 재생하고 있는 것이 나타났다.

<반응액 조성>

샘플 상청:25μL

1mol/L Tris-HCl:25μL

25% 에탄올:10μL

순수:20μL 테트라카라원(생화학공업사제):10μL

알코올 디히드로게나아제:10μL

본 발명의 히드록시카르복실산의 생산방법 및 미생물은, 폴리머 원료나 의약 중간체로서 유용한 글리콜산 등의 히드록시카르복실산류의 제조에 이용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Mitsui Chemicals,Inc. <120> A method for producing hydroxycarboxylic acids by regeneration of coenzyme <130> MC-90129WO <150> JP06-129986 <151> 2006-05-09 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 1 ttggtaccgt tctgccagca actgacg 27 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 2 tgtctagagt acctctgtgc gtcactgg 28 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 3 gctctagacg ctttgttgtg ttgtgtgg 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 4 aactgcagga tcggtcaatg attgcagc 28 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 5 gctctagacg gagaaagtct tatgatggct aacagaatga ttctg 45 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 6 gtgaagcttg catttaccag gcggtatgg 29 <210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 7 cgaattccgg agaaagtctt atgtcagtac ccgttcaaca tcc 43 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 8 gctctagact ctttcactca ttaagactg 29 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 9 aacgaattct cgcaatgatt gacacgattc 30 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 10 acagaattcg ctatttgtta gtgaataaaa gg 32 <210> 11 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 11 cgaattccgg agaaagtctt atgactacgg cattgaaaaa gattgtg 47 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 12 ggtctagacg attaatgcaa cttcaaacg 29

Claims

미생물을 이용하여 에틸렌글리콜로부터 글리콜산을 생산하는 방법에 있어서,

에스케리치아ㆍ콜라이 유래의 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 에스케리치아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 효소 활성을 강화하고, 또한, 상기 에스케리치아ㆍ콜라이의 글리콜산 옥시다아제 활성을 불활성화 또는 에스케리치아ㆍ콜라이 유래의 글리콜산 옥시다아제 활성보다도 저감하고,

더욱이, 에스케리치아ㆍ콜라이 유래의 NADH 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 에스케리치아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해 NADH 디히드로게나아제의 활성을 강화한 재조합 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 글리콜산의 생산방법.
에스케리치아ㆍ콜라이 유래의 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 에스케리치아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해 락토알데히드 리덕타아제 및 락토알데히드 디히드로게나아제의 효소 활성을 강화하고,

상기 에스케리치아ㆍ콜라이의 글리콜산 옥시다아제 활성을 불활성화 또는 상기 에스케리치아ㆍ콜라이 유래의 글리콜산 옥시다아제 활성보다도 저감하고, 또한,

에스케리치아ㆍ콜라이 유래의 NADH 디히드로게나아제를 코드하는 유전자를 상기 에스케리치아ㆍ콜라이에 도입하는 것에 의해 NADH 디히드로게나아제의 활성을 강화한 재조합 미생물.
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