LT4000B - Expression module, transformed host cell, process for preparing serine protease, method of transformation, dna sequence, plasmid, oligonucleotide - Google Patents

Expression module, transformed host cell, process for preparing serine protease, method of transformation, dna sequence, plasmid, oligonucleotide Download PDF

Info

Publication number
LT4000B
LT4000B LTIP1820A LTIP1820A LT4000B LT 4000 B LT4000 B LT 4000B LT IP1820 A LTIP1820 A LT IP1820A LT IP1820 A LTIP1820 A LT IP1820A LT 4000 B LT4000 B LT 4000B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
bacillus
host cell
dna
serine protease
host
Prior art date
Application number
LTIP1820A
Other languages
English (en)
Inventor
Johannes Cornelis Vanderlaan
Leonardus Johannes S Mulleners
Christiaan Albertus Vaneekelen
Original Assignee
Gist Brocades Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gist Brocades Nv filed Critical Gist Brocades Nv
Publication of LTIP1820A publication Critical patent/LTIP1820A/xx
Publication of LT4000B publication Critical patent/LT4000B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Šio išradimo objektas yra transformuotas Bacillus ląstelės gavimas, panaudojant rekombinantines technologijas.
Bacilos plačiai naudojamos, gaminant svarbius pramonėje fermentus, tokius kaip alfa-amilazė, neutrali proteazė ir šarminės arba serino proteazės. Bendrai, bakterinės serino proteazės gali būti gaunamos iš daugelio prokariotinių organizmų, įskaitant gramneigiamus organizmus, tokius kaip Serratia arba Pseudomonas rūšys ir gram-teigiamas bakterijas, tokias kaip Micrococcus ir Baccillus rūšys. Į svarbių pramonėje serino proteazių grupę, kuria ypač domimasi, įeina tos proteazės, kurios pasižymi dideliu aktyvumu šarminėje terpėje. Pramoninės serino proteazės gaminamos įvairių mikroorganizmų rūšių, tarp jų ir B.subtilis, B.licheniformis, B.amyloliąuefaciens, B.alcalophilus ir kitų Bacillus rūšių, o stipriai šarminės proteazės pagrindinai gaminamos Bacillus kamienų, kurie sugeba augti esant šarminiam pH. Tokios bakterijos pavyzdžiu gali būti Bacillus novo species PB 92. Domimasi sukūrimu bakterijų kamienų, sugebančių gaminti proteolitinius fermentus su didele išeiga, tarp jų ir stipriai šarmines proteazes.
Buvo sėkmingai klonuoti keletas bacilų genų, koduojančių neląstelinius fermentus. Tai alfa-amilazės genai B.amyloliąue-faciens (Palva et ak, Gene 15 (1981) 43-51), B.licheniformis (Ortlepp, Gene 23 (1983) 267, B.stearothermophilus (Mielenz et ak Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 5975-5979; EPĄ - 0057976) ir B.subtilis (Yang et ak, Nucleic Acids Res.ll (1983) 237); levansukrazės genai B.subtilis (Gay et ak, J.Bacterio 153, /1983/ 1424), genai koduojantys neutralią proteazę B.stearothermophilus (Fuji et ak, J.Bacteriol 156, /1983/ 831), B.amiloliąuefaciens (Honjo et ak, J.Biotech. 1 /1984/ 165; B.subtilis (Yang et ak, J.Bacteriol 160/1984/115), genai, koduojantys serino ar šarminę proteazę B.subtilis (Wong et ak, Proc.Natl Acad. Sci. USA 81/1984/1184), B.lichenifomis (Jacobs et ak, Nucleic Acids Res. 13/1985/8913) ir B.amyloliquefaciens (Wells et ak, Nucleic. Acids Res. 13/1985/8913 ir B.amyloliąuefaciens (Wells et ak, Nucleic Acids Res., 11/1983/7911).
Pramoninių serino proteazių gamyba įvairiose Bacillus rūšyse aprašyta, pvz., JAV patentuose Nr. 3 674 643, 3 723 250 ir 4 480 043. Didelio šarmingumo proteolitinio fermento gamyba Bacillus kamienuose, galinčiuose augti esant šarminiam pH, aprašyta, pvz., JAV patentuose Nr. 3 723 250, 30 602 ir 4 480 037. Apžvalginis straipsnis apie bakterijų panaudojimą pramonei svarbių fermentų gamybai, pvz., Debabovo str. “The industrial Ūse of Bacill’s”, in The Molecular Biology of Bacili, (Acad. Press. New York, 1982. B.subtilis protoplasto transformacijos protokolas buvo aprašytas Chang ir Goken str. (Mol.Gen.Genet. 168/1979/111-115). Panašūs sėkmingos B.megaterium protoplastų transformacijos protokolai buvo aprašyti (Vorobjeva et ai., FEMS Microbiol. Letters 7/1980/261-263, taip pat B.amyloliąuefaciens protoplastų (Smith et ai., Appl. and Env. Microbiol. 51/1966/643), B.thuringiensis protoplastų (Fisher et ai., Arch. Microbiol 139/1981/213-217), B.sphaerieus protoplastų (McDonal d, J.Gen.Microbiol. 130/1984/203 ir B.larvae protoplastų (Bakhiet et ak, Appl. and Env. Microbiol. 49/1985/377). Tačiau Bakhiet su bendr. (aukščiau) praneša apie nesėkmingus rezultatus su B.popillae. Mann et ai., Current Microbiol. 13/1986/181-185 pranešė apie sėkmingą B.Polymyxa, B.licheniforrnis, B.Macerans ir B.laterosporus transformaciją. Tačiau tie būdai nebuvo sėkmingi B.coagulans, B.cereus ir B.pumilus, nors ir galima buvo stebėti gerą protoplastų susidarymą. Kiti DNR įvedimo į protoplastus būdai panaudoja susiliejimą su liposomomis, turinčiomis DNR (Holubeva, Folia Microbiol. 30/1985/97).
Siūlomi nauji alkalofiliniai Bacillus kamienai, būdai ir sąstatai tokių kamienų transformacijai. Siūloma nauja DNR seka, beje, į minėtą seką įeina genas, koduojantis stipriai šarminį proteolitinį fermentą, gautas iš alkalofilinio Bacillus kamieno. Ląstelėšeimininkė, pageidautina, turinti teigiamą foną, transformuojama, panaudojant plazmidę konstrukciją, turinčią geną, koduojantį minėtą stipriai šarminį proteolitinį fermentą. Gali būti panaudota protoplasto transformacija plazmidine konstrukcija, esant polietilenglikoliui šarminėje terpėje. DNR seka gali būti palaikoma nechromosomoje arba įjungta į ląstelės-šeiminkės genomą.
Fig. 1 rodo histidin/MORS gel-elektroforezės rezultatus, kurie gauti su kultūrų B.subtilis DB104, turinčių atitinkamai pUBUO ir pM58 lyginant su kai kuriais subtilizinais.
takelis: subtilizinas Carlsberg;
takelis: proteazė Bacillus PB92;
takelis: subtilizinas Bacillus subtilis;
takelis: Bacillus subtilis DB104 (pM58);
takelis: Bacillus subtilis DB104 (pUBllO).
Fig. 2 rodo plazmidės pM58 restriktogramą. Dar daugiau, viršutinėje piešinio dalyje parodyta sekų nustatymo strategija. Ištisinės linijos su rodyklėmis vaizduoja fragmentus, klonuotus fago M13 vektoriuose mplO, mpll ir mpl3 fago M13. Apatinė piešinio dalis rodo sekų nustatymo stategiją, naudojant 10 oligonukleotidų, esančių lygiais tarpais proteazės gene.
Fig. 3 rodo koduojančios grandinės nukleotidų seką, nustatytą pagal serino proteazės Bacillus PB92 aminorūgščių seką. Taip pat parodyti promotoriai (P1,P2), ribosomų prisirišimo vietos (rbs) ir DNR sekos terminacijos rajonai (term). Sunumeruotos ištisinės linijos rodo dešimties oligonukleotidų, panaudotų sekų nustatymui, išsidėstymo vietą.
Fig. 4a rodo plazmidės pE194-neo konstravimo schemą.
Fig. 4b rodo plazmidės pMAX-4 konstravimo schemą.
Atitinkamai su išradimo objektu, siūlomos kaip naujos DNR konstrukcijos ir Bacillus kamienai, skirti proteolitinių fermentų gavimui su aukšta išeiga, taip ir jų paruošimo būdai. Ląstelės-šeimininkės transformuojamos, sujungiant protoplastus, paruoštus iš Bacillus kamieno-šeimininko, susiliejant su plazmidės konstrukcija, turinčią DNR seką, koduojančią proteolitinį fermentą.
Stipriai šarminės proteazės - tai serino proteazės arba subtilizinai, pasižymintys dideliu aktyvumu šarminėje terpėje. Konkrečiau, stipriai šarminės proteazės turi optimalų aktyvumą, kai pH maždaug 9 ir išlaiko bent jau 80% to aktyvumo, kai pH maždaug 11 ar net daugiau. Stipriai šarmines proteazes daugiausiai pagamina Bacillus kamienai, kurie sugeba augti šarminiame pH.
Šioje mokslo srityje žinomi būdai, naudojami išskiriant proteazės geną, apimantys sintezę, išskyrimą geno iš genominės DNR, paruošimą iš kDNR arba jų derinius. Stipriai šarminės proteazės geno išskyrimas ir ekspresija atskleisti prioritetiniame dokumente paraiškoje Europos patentui Nr.EP-A-87200358.7, kuriuo remiasi ir ši paraiška, kurios turinys įjungtas čia nuorodų pagalba. Įvairūs darbo su genais būdai gerai žinomi ir apima restrikciją, skaidymą, iškirpimą, sujungimą, mutagenezę in vitro, pirminę reparaciją, linkerių ir adapterių panaudojimą ir pan. (žiūr. Maniatis et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982).
Kaip taisyklė, būdas apima genominės bibliotekos paruošimą iš organizmo, ekspresuojančio stipriai šarminę proteazę. Donorinio mikroorganizmo genomas išskiriamas ir sukarpomas tinkamu restrikciniu fermentu. Gauti donorinio kamieno DNR fragmentai po to sujungiami su klonavimo vektoriumi, kuris sukarpomas ta pačia restrikcijos endonukleaze.
Klonai, turintys įstatytą DNR fragmentą, gali būti aptikti stabilaus markerio pagalba arba panaudojant tiesioginės ar teigiamos selekcijos būdą, kaip tai yra parengta B.subtilis (Gryczan and Dubnow, Gene 20/1982/459-469). Be to, klonai, ekspresuojantys stipriai šarminę proteazę, gali būti identifikuoti antikūnų prieš ekspresijos produktą pagalba arba aptinkant substrato sunaudojimą, arba susidarant proteolitinio fermento veikimo produktui. Pavyzdžiui, kolonijos, ekspresuojančios markerinį geną, kokiu yra stabilumo antibiotikui genas, gali būti išanalizuotos proteazės gamybai, nustatomi pagal kazeino precipitacijos aureolės padidėjimą aplink kolonijas lėkštelėse su agaru, turinčiu kazeino.
Kada pilnas genas identifikuotas arba kaip kDNR, arba kaip chromosominė DNR, po to ekspresijos užtikrinimui juo galima manipuliuoti įvairiais keliais. Gali būti panaudoti įvairūs Bacillus šeimininkai, pvz., šarminės bakterijos, tame tarpe tokios alkalofilinės bakterijas, kurios jau yra stipriai šarminių proteazių producentais. Pageidautinu šeimininko organizmu yra Bacillus novo sp. pB 92, todėl patogu palaikyti laukinio tipo seką su reguliatoriniais signalais ir sektorinėmis pradžios sekomis ir taip toliau, nors gali būti panaudotos kontroliuojančios atkarpos, gautos iš kitų bacilų, kurios funkcionuoja Bacillus kamiene-šeimininke. Patogus Bacillus ląstelės transformacijai vektorius tuo būdu turi savyje struktūrinį geną, koduojantį stipriai šarminę proteazę, gautą iš alkalofilinės Bacillus ir turinčios kontroliuojančias atkarpas, tokias kaip promotoriaus seka, seka, sudaranti ribosomų surišimo atkarpą ir sekas, kontroliuojančias transkripcijos terminaciją ir šarminės proteazės geno transliaciją, beje, išvardintos kontoliuojančios atkarpos yra funkcionalios alkalofilinės Bacillus ląstelėje-šeimininke.
Be to, vektorius gali turėti markerinį geną, pvz., suteikiantį atsparumą antibiotikui, kuriam kamienas-šeimininkas jautrus, ir replikacijos pradmuo, kuris sugeba autonomiškai replikuotis ląstelėje-šeimininke. Replikacijos pradmuo gali būti toks, kuris turi mutaciją, darančią jo funkcionavimą ląstelėje-šeimininke jautriu temperatūrai, tuo būdu užtikrinant chromosomalinio įsistatymo selekciją, kaip aprašyta Erlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978) 1433.
Aminorūgšeių seka gali būti panaudota tam, kad būtų sukurtas kDNR bibliotekos arba genominės bibliotekos, paruoštų iš mPNR ar DNR ląstelių, skriningo zondas; pastarosiomis ląstelėmis domimasi, kaip stipriai šarminės proteazės geno donorinėmis ląstelėmis. Panaudojant stipriai Šarminės proteazės kDNR arba jos fragmentą, kaip hibridizuojantį zondą, gali būti lengvai klonuojami struktūriškai giminingi genai, rasti kituose organizmuose. Ypatingas dėmesys skiriamas genų išskyrimui iš organizmų, kurie ekspresuoja stipriai šarmines serino proteazes, panaudojant oligonukleotidinius zondus, kurie pagaminti pagal stipriai šarminių serino proteazių genų nukleotidines sekas, kurias galima gauti iš alkalofilinių Bacillus kamienų, tame tarpe ir Bacillus novo species pB 92. Tokie zondai gali būti žymiai trumpesni, negu visa seka, bet jų ilgis turi būti bent jau 10, geriau 15, o dar geriau 20 nukleotidų. Tinkami ir ilgesni oligonukleotidai, iki pat pilno geno ilgio, bet ne ilgesni, negu 1200 nukleotidų. Galima naudoti kaip RNR, taip ir DNR zondus.
Naudojami zondai paprastai žymėti detektuojamu būdu (pvz., 32 3, biotinu arba avidinu) ir inkubuojami su vienos grandinės DNR ar RNR suspensija iš organizmo, kuriame ieškomas genas. Hibridizacija aptinkama pagal žymę, atskyrus vienos grandinės ir dviejų grandinių (hibridizuotą) DNR (arba DNR/RNR), paprastai panaudojant nitroceliuliozinį popierių. Hibridizacijos būdai, tinkami naudojimui su oligonukleotidais, gerai žinomi šios srities specialistams.
Nors dažniausiai naudojami zondai su detektuojama žyme, kuri garantuoja lengvą identifikaciją, nežymėti oligonukleotidai taip pat naudingi kaip žymėtų zondų pirmtakai, bei naudojant juos tiesioginiam dviejų grandžių DNR (arba DNR/RNR) nustatymui. Todėl terminas oligonukleotidinis zondas tinka kaip žymėtoms, taip ir nežymėtoms formoms. Ligavimo mišinys po to naudojamas B.subtilis kompetentinių ląstelių transformacijai. Naudojant markerinį geną kaip selekcijos priemonę, rekombinantines plazmidės po to galima išskirti ir charakterizuoti, pasitelkiant į pagalbą restrikcinę analizę ir sekos nustatymą.
Gaminant stipriai šarminę proteazę, geriausia DNR seka yra seka, gauta iš Bacillus novo species PB 92, naudojant transformacijai Bacillus kamienus, kurie jau produkuoja serino proteazę. Serino proteazės aminorūgščių seka, koduojama DNR seka, yra tokia:
H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-AV-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-NTR-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-O-D-G-NG-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-VK-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-LS-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-NS-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-SQ-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-SM-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-NT-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
Nors tinkamiausiu kamienu proteazės geno aprūpinimui yra rūšis Bacillus PB 92, iš esmės tokia pati serino proteazė gali būti gauta ir iš kitų šarminę terpę mėgstančių bakterijų. Proteazių genai, turintys giminingumą su aminorūgščių seka Bacillus PB 92 bent jau 70%, o geriau virš 80%, turi būti laikomi patekę į šio išradimo objekto sritį.
Pageidautina, kad išraiškos produktas būtų išskiriamas į terpę. Kadangi šarminė proteazė yra sekretuojama, gali būti panaudoti sekreciniai pradžios signalai ir laukinio tipo procesingo signalai. Be to, sujungtas genas gali būti gautas, suteikus 5’ seką struktūriniam genui, koduojančiam sekrecijos pradžios signalą ir processingo signalą. Charakteringos skirtingos sekretorinės pradžios sekos apima Bacillus amilazės ir proteazės genų sekretorines pradžios sekas. Teisingai sujungus pagal atskaitos rėmelį sekretorinę pradžios seką su norimu struktūriniu genu, į augimo terpę gali būti sekretuojama alkalofilinė proteazė.
Ekspresijos blokas gali būti pilnai ar dalinai gautas iš gamtinių šaltinių arba iš šaltinių, giminingų ląstelei-šeimininkei. Įvairios DNR konstrukcijos, DNR sekos, vektoriai, plazmidės, ekspresijos blokai pagal šį išradimą išskiriami ir/arba valomi ir sintetinami, ir tuo būdu nėra “gamtiniai”. Priklausomi nuo to, ar norima įstatyti struktūrinį geną į kamieno-šeimininko chromosomą ar palaikyti j j nechromosominiame elemente, replikacinė Bacillus sistema gali būti, o gali ir nebūti įjungta.
Ί
Norint įstatyti giminingos su Bacillus genomu, plazmidės konstrukcijos atkarpos gali būti panaudotos rekombinacijų tikimybės padidinimui, Dar daugiau, tai kad į plazmidinę konstrukciją įjungiamas temperatūrai jautrus replikacijos pradmuo, leidžia vykdyti atranką pagal įterpimą į chromosomą. Žiūrėk, pavyzdžiui, Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sc. USA (1978) 1433.
Struktūrinio geno ekspresijos padidinimui į ląstelę-šeimininką gali būti įstatyta daugiau, nei viena struktūrinio geno kopija. Stabili struktūrinio geno amplifikacija gali būti gauta, įstatant bent vieną papildomą struktūrinio geno kopiją į ląstelės-šeimininko genomą ir atrenkant transformantus, kuriuose struktūrinio geno kopijos atskirtos endogeninėmis chromosominėmis sekomis. DNR konstrukcijos ir panaudojimo būdai prokariotinėse sistemose aprašyti paraiškoje Europos patentui Nr.EP-A-87200356 išradimui, kuris čia minimas kaip literatūros šaltinis.
Papildant replikacijos sistemą, paprastai būna bent vienas markerinis genas, įjungtas į plazmidinę konstrukciją. Markerinis genas - tai struktūrinis genas, sugebantis reikštis šeimininke, suteikiantis atsparumą biocidams ar virusams arba atsparumą sunkiesiems metalams, imunintetą ir pan. Kalbant apie atsparumą biocidams, galima sakyti, kad tai apima ir atsparumą antibiotikams, pvz., neomicinui, kanamicinui, tetraciklinui ir t.t. Markerinis genas bus parinktas taip, kad užtikrintų atranką esant mažam kopijų skaičiui ir antibiotiko koncentracijai, kuri nestipriai sulėtina rekombinacinių ląstelių augimą. Ypatingai įdomus yra atsparumas neomicinui.
Įvairios DNR sekos gali būti gaunamos iš skirtingų šaltinių ir sujungtos kartu, kad būtų gautas vektorius, kuris turi vieną ar daugiau patogių, pageidautina - unikalių restrikcijos saitų, kurie leistų įstatyti arba pakeisti struktūrinius genus pagal tuos saitus ir gauti plazmidinę konstrukciją.
Po to, kai plazmidinę konstrukcija paruošta, ji gali būti panaudota tinkamos ląstelės-šeimininko transformacijai. Bacillus šeimininku gali būti bet koks Bacillus kamienas, tačiau parenkant tinkamą kamieną, įvertinami faktoriai, kurie gali pagerinti šarminių proteazių produkciją. Produkcija gali būti pagerinta įvairiais keliais, įskaitant šeimininką, kuriame sumažinta norimo produkto degradacija, reguliatorinių signalų pažinimas, sekrecijos palengvinimas ir t.t. Tuo būdu, nors tinkamas Bacillus šeimininkas yra stipriai šarminės proteazės producentas, arba Bacillus laukinio tipo arba Bacillus mutantas, Bacillus šeimininkas gali būti mutantinių producentu alkalofilinės proteazės, kuris negamino alkalofilinės proteazės.
Bacilos, produkuojančios stipriai šarminę proteazę, taksonomiškai nėra pakankamai klasifikuotos, ir paprastai jas priskiria prie alkalofilinių Bacillus kamienų. Pavyzdžiai Bacillus kamienų, galinčių augti esant šarminiam pH, aprašyti, pavyzdžiui, JAV patentuose Nr.Nr.3 723 250, Re.30 602 ir 4 480 037. Labiau tinkamo ūkinio alkalofilinio Bacillus kamieno-šeimininko pavyzdžiu yra Bacillus novo species PB92, atskleistas kartu su kitais JAV patente Nr.Re.30602.
Pramoniniai alkalofiliniai Bacillus kamienai taip pat gali būti naudojami kaip ląstelės-šeimininkai. Pramoniniai Bacillus kamienai yra išvedami iš organizmų, kurie gali būti išskirti iš dirvos arba gali būti paimti iš bankų ar kitų šaltinių ir gaunami genetiškai modifikuojant tokius Bacillus kamienus. Pramoniniams Bacillus kamienams charakteringas atsparumas genetiniams mainams, tokiems kaip fagų infekcija arba transformacija. Tie kamienai stabilūs, ir transformacijos gali arba negali sudaryti sporas. Kamienai dažniausiai yra fototrofai ir modifikuoti taip, kad būtų gaunamos didelės endogeninių baltyminių produktų, tokių kaip alfa-amilazės fermentai ir įvairios proteazės, išeigos. Endogeninių baltyminių produktų išeiga, gauta pramoninės gamybos procese, gali siekti bent jau 5 g/1 0,5% (svoris/tūris). Pramoniniai kamienai taip pat išskiria DNRzes, kurios degraduoja DNR terpėje, tuo apsaugodamos nuo genetinių mainų.
Alkalofilinių Bacillus kamienų transformacija pirmoje eilėje įjungs minėtų kamienų protoplastų panaudojimą. Tačiau, kaip aprašyta Cohen et ai. (aukščiau), paprastas protoplastų transformacijos būdas netinka alkalofiliniams Bacillus kamienams. Taigi, turi būti sukurti papildomi būdai.
Alkalofilinėms bakterijoms protoplastų susidarymas ir regeneracija gali vykti aukštame pH, geriausia apie pH 8. Protoplastai gali būti paruošti, resuspenduojant ląsteles šarminėje buferinėje terpėje (AHM - alkaline holding medium) pH 7,8-8,5 su po to sekančia ląstelių inkubacija 37°C temperatūroje 30-80 minučių. Tai matome 5 pavyzdyje. Gauti protoplastai po to plaunami, siekiant pašalinti lizocimą, o po to resuspenduojami šarminėje buferinėje terpėje (AHM). Dalyvaujant tinkamam sukirpimo reagentui, plazmidinė konstrukcija ir šarminę terpę mėgstančio Bac/Z/ns-šeimininko protoplastas susijungia. Nors gali būti naudojamas bet koks sujungimo reagentas, uštikrinantis norimą efektyvumą, tačiau buvo rasta, kad tam geriausiai tinka polietilenglikolis, kurio molekul. svoris 1000-8000. Protoplastai, paruošti iš akceptorinio Bacillus kamieno ir laikomi ne ilgiau kaip 5 min., geriau ne ilgiau kaip 2 min., sumaišomi su plazmidine konstrukcija, dalyvaujant polietilenglikoliui. Sujungimo reagentų mišinys po to pakeičiamas paprasta maitinimo terpe, kurioje ląstelės inkubuojamos iki 5 h, geriau 2-3 h, po to pernešamos ant regeneracijos terpės lėkštelių. Regeneracijos lėkštelėse yra antibiotikas, toks, kaip neomicinas - transformantų atrankai.
Klonai su episomaliniu DNR konstrukcijos palaikymu gali būti identifikuoti, aptinkant stipriai šarminės serino proteazes ekspresiją. Klonai, kurių ekspresinė konstrukcija yra atkarpa, įsistačiusi į jų chromosomas, yra atrenkami ir identifikuojami, išskiriant sumarinę ląstelinę DNR ir atrenkant tuos klonus, kuriuose gali būti aptikta laisva plazmidine DNR, su ekspresuojamu markeriniu piazmidės genu. Tie klonai gali būti atrenkami stipriai šarminės serino proteazes aptikimui tinkamais būdais.
Įvairūs aptikimo būdai, įskaitant ir specifinių antikūnų panaudojimą, DNR ir RNR hibridizaciją, fermentinio produkto susidarymą arba fermentinio substrato išnykimą, gali būti panaudojami tam, kad atrinkus klonus, norint aptikti ekspresinės konstrukcijos buvimą ir dominančio struktūrinio geno ekspresiją, būtent, proteazes gamybą. Gaminama proteazė gali būti charakterizuojama biochemiškai, pavyzdžiui, nustatant proteazes molekulinę masę elektroforezės SDS-poliakrilamidiniame gelyje, elektroforezės Histidin-MOPS gelyje pagalba, nustatant kinetinius K ir V parametrus sintetiniam substratui sukcinil - L - alanil - L - alanil - L - propil - L - fenilalanil - p - nitro - anilidui.
Bacillus šeimininkas, turintis ekspresuojančią konstrukciją, įjungtą episomaliai ar chromosomaliai, auginamas maitinančioje terpėje tokiose sąlygose, kurios palankios fermento sintezei. Maitinanti terpė būtinai turi piazmidės palaikymui skirtų medžiagų, kaip antibiotiko, kuriam jautrus netransformuotas šeimininkas. Fermentacija gali tęstis tol, kol nebus išnaudotos maisto medžiagos. Tuo atveju, kai produktas sekretuojamas, jis gali būti išskirtas iš buljono patogiu būdu, pvz., ekstrakcijos, chromatografijos, elektroforezės ar pan. Ten, kur produktas lieka citoplazmoje, ląstelės gali būti surinktos centrifugavimu, filtravimu ir t.t., suardomos mechaniškai pertrinant, detergentu, lizocimu ar kitais metodais, ir produktas gali būti išskirtas, kaip aprašyta aukščiau. Kai netransformuota ląstelė-šeimininkė yra stipriai šarminės proteazes producentė, tai pateikto metodo pagalba gali būti pasiektas smarkiai stipriai šarminės serino proteazės išeigos padidėjimas, bent jau 120%, lyginant su išeiga netransformuotos ląstelėsšeimininkės su vienintele nechromosomine geno kopija.
Pavyzdžiai siūlomi kaip iliustracija, bet ne kaip išradimo apribojimas.
I pavyzdys
Genominės DNR banko paruošimas iš alkalofilinės naujos rūšies Bacillus PB 92 banko ir serino proteazės geno išskyrimas
Chromosominė DNR, išskirta iš Bacillus novo sp. PB 92 (saugoma Delfto Techninio universiteto mikrobiologijos laboratorijoje NR.OR-60; Niderlandai, žiūr. JAV patentą Nr.30 602) būdu, aprašytu Saito-Miuva, Biochim.Biophys. Actą 72 (1963) 619623, dalinai buvo sukarpyta restrikcinių fermentu Sau 3A ir liguota Bam HI kirpimo vietoje plazmidėje pUBUO (Gryczan et ai., J.Bacteriol. 134 (1978) 313-329). Plazmidinė DNR pUBllO buvo paruošta, kaip aprašyta Birnboim and Doly (Nucl.Acids Res. 7 (1979) 1513-1523).
Ligavimo mišiniu transformavo B.subtilis IA40 (Genetinis bacilų saugojimo centras) pagal būdą, aprašytą Spizizen et ai., J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746, naudojant 0,6-1 ųg DNR/ml komponentinių ląstelių. Ląsteles iš transformacijos mišinio išsėjo ant minimalių lėkštelių, turinčių: 2,8% K2HPO4; 1,2% KH2PO4; 0,4% (NH4)2SO4; 0,2% triNa-citrato 2H2O; 0,04% MgSO4-7H2O; 0,00005% MnSO4-4H2O; 0,4% L-gliutamininės rūgšties; 0,5% gliukozės; 0,02% kazamino rūgšties, 50 ųg/ml triptofano; 20 ųg/ml metionino; 20 ųg/ml lizino; 20 ųg/ml neomicino; 0,4% kazeino ir 1,5% agaro. Po to, kai lėkštelės buvo išlaikytos per naktį 37°C temperatūroje, viena iš 50000 kolonijų, atsparių neomicinui, parodė išaugusią proteazės produkciją; tai nustatė pagal padidintą kazeino skilimo produktų precipitacijos žiedo padidėjimą aplink koloniją ant agaro plokštelės. Plazmidinė DNR buvo išskirta iš tos kolonijos būdu, aprašytu Birnboim and Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523 ir pažymėta pM 58.
pavyzdys
PB serino proteazės geno ekspresija
Bacillus subtilis IA 40, turinti pM 58, buvo išauginta minimalioje terpėje (Spizizen et ai., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 44 (1958) 1072-1078), į kurią buvo pridėta 0,02% kazamino rūgščių; 50 ųg/ml triptofano; 20 ųg/ml metionino; 20 ųg/ml lizino ir 20 ųg/ml neomicino. Po 24 valandų kultūrą centrifugavo ir tikrino nuopilo proteazinį aktyvumą, substratu naudodami dimetilkazeiną. (Lin et ai., J Biol. Chem. 244 (1969) 739-793). Kultūra B.subtilis IA 40, turinti plazmidę pUBllO, panaudota kaip kontrolinė, parodė mažiau nei 1/60 proteazės aktyvumo, lyginant su kultūra, transformuota pM58. Proteazės aktyvumas pilnai nuslopinamas, apdorojant 1 mM fenilsulfanilfluoridu (FSF), bet ne 20 mM EDTA.
Aukščiau aprašytų nuopilų tokie bandiniai buvo analizuojami, panaudojant baltyminį gelį aprašytu Leamly, Nature, 227 (1970) 680 būdu. Analizių ant šių gelių bandiniai buvo paruošti, apdorojant nuopilus 5% trichloracto rūgštimi (TCA). Pavyzdį nucentrifugavus, išsodinto baltymo nuosėdos du kartus buvo praplautos acetonu, po to ištirpintos 40 μΐ buferio pavyzdžiams (0,5 M TrisHCl pH 7,5; 10% (tūrio) 2merkaptoetanolio; 50% tūrio glicerino ir 0,05 % bromfenolio mėlio), virinant 10 min. Po elektroforezės geliai dažomi, panaudojant Kumassi Briliantinį Mėlį. Po to kultūrų nuopilų bandiniai buvo analizuojami elektroforeze. Buvo naudojami trys skirtingi B.subtilis IA40 kamienai: kamienas, turintis pUBllO; arba pM58; arba be plazmidės ir Bacillus pB92 proteazė kaip kontrolinė. Po elektroforezės gelius dažė, panaudodami Kumassi Briliantinį Mėlį ir atplovė. Pavyzdys iš B.subtilis kamieno IA40, turinčio pM58, turėjo 31 kDa svorio baltymą, kuris migruoja kartu su Bacillus PB92 proteaze. Tas baltymas nebuvo aptinkamas kontroliniame kamieno B.subtilis IA40, turinčio pUBllO, takelyje.
Visos serino proteazės turi vienodą molekulinį svorį. Dėl to klonuota Bacillus PB92 serino proteazė buvo atskiriama nuo žinomų serino proteazių subtilizino B.subtilis, subtilizino Calsberg, panaudojant pM58 ir pUBllO transformaciją į beproteazinį kamieną B.subtilis DB104 (R.Doi, J.Bacteriol. 160(1984)442-444) ir produkuojamos neląstelinės proteazės analizę. Gauti transformantai buvo auginami minimalioje trerpėje (‘Spizizen et ai., aukščiau), turinčioje 0,02% kazamino rūgščių, 50 ųg/ml histidino ir 20 ųg/ml neomicino. Po 24 h buvo paimti pavyzdžiai, centrifuguoti ir be papildomo apdorojimo analizuoti, panaudojant histidin/MORS gelį, turintį 75 mM KOH; 40 mM histidino; 100 mM MORS (3-(N-morfolino)-propansulforūgštis), pH 7,5 ir 5% poliakrilamido. Elektroforezės buferis turėjo 40 mM histidino, 100 mM MORS, pH 6,6. Pavyzdžiai judėjo katodo link. Proteazės juostos buvo aptinkamos specialių plėvelių Agfa Pan 100 pagalba (Zuidweg et ai., Biotechnol. and Bioengin 14 (1972) 685-714). Šie rezultatai parodyti Fig. 1. Kaip matome, pM58 turi geną, koduojantį Bacillus PB92 proteazę.
pavyzdys
Serino proteazės Bacillus PB92 geno nukleotidų sekų nustatymas
Pilna seka Ball-HpaI fragmento pM58 buvo nustatyta būdu, aprašytu Sanger, Proc Natl. Acad. Sci USA 77 (1977) 6463. Restrikcijos fragmentai pM58 (žiūr. Fig. 2) buvo klonuoti fago M13 vektoriuose mplO, mpll ir mpl8 (Messing at ai., Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309-321). Apie pM58 fragmentų įsistatymą buvo sprendžiama fago kolonijų hibridizacijos pagalba. Po sekų nustatymo (sekvenavimo) buvo padaryta dešimt oligonukleotidų, lokalizuotų gene lygiais tarpais ir buvo pakartotas sekų nustatymas, kuris patvirtino seką, parodytą Fig. 3.
pavyzdys
Plazmidės pMAX-4, turinčios serino proteazės geną, konstravimas
Plazmidės pUCN710 (Fig. 4A) konstravimui pUBUO buvo sukarpyta endonukleazėmis Tayl ir Pvnll. Fragmentas, turintis atsparumo neomicinui geną, buvo išvalytas žemos lydymosi temperatūros agarozės pagalba ir užbukintas Klenovo polimeraze ir TNF (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor 1982). Plazmidė pUC7 (Vieira et ai., Gene 19 (1982) 259-268) buvo linearizuota Salį ir užbukinta, kaip aprašyta aukščiau. Abu fragmentai buvo sujungti T4 ligaze (Maniatis) ir transformuoti į E.Coli JM103. Atranką vykdė ant 2xTY lėkštelių (1,6% sv./tūr. Bakto-triptono; 1% sv./tūr. mielių ekstrakto; 0,5% NaCl), turinčiu 50 ųg/ml ampicilino ir 10 ųg/ml neomicino. Gauta plazmidė, pavadinta pUCN710, buvo sukarpyta BamHI. Plazmidė pE194 (Vardanescu, Plasmid 1 (1978) 468-479) buvo paveikta Bell. Fragmentai iš abiejų karpymų buvo sujungti T4 ligazė ir transformuoti į B.subtilis IA40. Atranką vykdė minimalios terpės lėkštelėse, turinčiose 20 ųg/ml neomicino.
Proteazės geno pakartotiną perklonavimą, panaudodami įstatymo vektorių, atliko tokiu būdu: pM58 (žiūr. 1 pavyzdys) sukarpė HpaI ir Bali ir BgelI. Plazmidę pE194-neo karpė HpaI. Tuos fragmentus sujungė T4 ligazė ir jais transformavo B.subtilis IA40. Transformantus atrinko pagal atsparumą neomicinui ir proteazės produkcijos padidėjimą, apie ką sprendė pagal kazeino skilimo produktų precipitaciją (žiedo susidarymą, žiūr. 1 pavyzdį). Buvo gauta plazmidė pMAX-4, kurios struktūra patvirtinta restrikcinių fragmentų analize (žiūr. Fig. 4B).
pavyzdys
Bacillus PB92 pMAX-4 kamieno protoplastų transformacija
Bacilus PB92 kamieną augino per naktį 100 ml terpės NBSG-X (Thorne et ai, J.Bacteriol. 91 (1966)1012-1020) Kultūrą 10 min. centrifugavo Sorvall tipo GSA modelio rotoriuje esant 4500 aps/min. Protoplastai buvo paruošti, inkubuojant bacilas 37°C temperatūroje laike 1 h 10 ml šarminės terpės, turinčios 0,5 M sacharozės; 0,02 M MgCl2 ir 0,02 M Tris/maleato, pH8,0; steriliame vandenyje, į kurį buvo pridėta 0,4 mg/ml lizocimo. Protoplastai buvo nusodinti centrifūguojant 10 min., esant 4500 aps/min resuspenduoti 5 ml buferinio mišinio AHM+pH 8,0 (AHM buferis, į kurį pridėta 3,5% sv./tūrio Bakto Panessay buljono ir 0,04% sv./tūr. Merieux albumino), sumaišyti, po to persodinti, kaip anksčiau. Po suspendavimo 5,0 ml AHM, 0,5 ml šios protoplastų suspensijos buvo sumaišyta su 5 ųg demineralizuoto vandens, su 1 ųg plazmidės DNR ir 2 min. inkubuoti, esant 30% sv./tūr. polietilenglikolio 8000, pH 8,0. Triskart praskiedus AHM+ terpe pH 8,0 ir centrifugavus, nuosėdas suspendavo mažame tūryje -1 ml AHM+ ir inkubavo 2-3 h. Tokie pat tūriai po 100 ųl buvo išsėti ant šviežiai paruoštų regeneracinės terpės lėkštelių, turinčių 0,5 M sukcinato Na/HCl pH 8,0; 1,5% sv./tūr. agaro; 0,5% sv./tūr. kazamino rūgščių, 0,5% sv./tūr. mielių ekstrakto; 0,031 M fosfatinio buferio pH 8,0; 0,5 sv./tūr. gliukozės; 0,02 M MgCL ir 0,02 % sv./tūr. Merieux albumino. Selekcijos tikslais lėkštelėse buvo 1000 pg/ml neomicino. Inkubavus 37°C temperatūroje bent jau 72h, kolonijos buvo perneštos ant lėkštelių su agaru, turinčiu širdies ekstrakto ir 20 pg/ml neomicino.
pavyzdys pMAX-4 įstatymas į Bacillus PB92 kamieno chromosomą
Bacillus PB92 kamieno, turinčio pMAX-4, kolonija, išauginta ant lėkštelės su agaru, turinčiu širdies ekstraktą ir 20 ųg/ml neomicino, buvo patalpinta į 100 ml triptoninio sojos buljono, turinčio 1 pg/ml neomicino ir inkubuota 24h 37°C temperatūroje. 2 ml kultūros (apie 109 ląstelių/ml) buvo praskiesti 100 ml tos pat terpės, turinčios 1 pg/ml neomicino ir inkubuota 24 h 50°C temperatūroje. Po 24 h 5 ml kultūros (apie 109 ląstelių/ml) buvo vėl praskiesti, kaip aprašyta aukščiau, ir inkubuoti 24 h 50°C, esant 1 ųg/ml neomicino. Pastaroji procedūra buvo pakartota dar kartą. Po to ląstelinė suspensija buvo praskiesta 100 kartų ir išsėta į lėkštelę su agaru, turinčiu širdies ekstrakto (HI-agaras Difco), turinčio 1 pg/ml neomicino. Lėkštelės inkubuotos 16 h 50°C. Kolonijos, atsparios neomicinui, buvo izoliuotos ir kultivuotos 16 h laikotarpyje 37°C 10-je ml terpės TSB, turinčios 1 ųg/ml neomicino. Iš tų kultūrų buvo išskirta bendra DNR (Holnus et ak, Anai. Biochem. 114(1981) 193-197) ir DNR elektroforezės agaro gelyje pagalba buvo patikrinta, ar nėra plazmidės. Pavyzdžiui, kuriuose nerasta plazmidinės DNR, buvo dar kartą patikrinti, sumarine DNR transformuojant į B.subtilis IA40. Pavyzdžiai, neturintys sugebėjimo transformuoti B.subtilis IA40, buvo laikomi neturintys plazmidės. Buvo rastas atsparus neomicinui ir neturintis plazmidės kamienas, gautas iš Bacillus PB92, ir pavadintas PBT109. Šis kamienas turėjo plazmidės pMAX-4 kopiją, įstatytą j jo chromosomą. Įstatymas į PBT109 kamieną vykdo pagal taip vadinamą Campbell tipo mechanizmą homologinės rekombinacijos keliu, duodančiu du paeiliui išsidėsčiusius proteazės genus ant chromosomos, atskirtus plazmidinėmis sekomis. Ši genetinė kamieno PBT109 organizacija buvo patvirtinta, kaip parodyta bendroje paraiškoje Europos patentui, užregistruotoje kartu su šia, kurios atradimas įjungtas čia kaip literatūros nuoroda.
pavyzdys
Transformuotų kamienų proteazės produkcija
Transformuotų kamienų proteazės produkcija buvo nustatyta, pridedant 0,2 ml TSB kultūros suspensijos, turinčios apie 109 ląstelių/ml, 500 ml supamoje kolboje, turinčioje 100 ml produkcinės terpės, aprašytos JAV patente Nr. Re.30 602. Tačiau, tiriant B.subtilis kamienus, pH buvo sureguliuota iki pH 7,0. DB104 (pUBllO), DB104 (ρΜΑΧ-4), PB92 pMAX-4 kamienams pridėdavo 20 ųg/ml neomicino, o kamienui PBT109 - 1 pg/ml neomicino. Santykinė proteazės produkcija šioms ląstelių linijoms pateikta 1 lentelėje.
lentelė
Transformuotų bacilų proteazės produkcija
Kamienas Santykinė proteazės produkcija ** neomicino priedas
Bacillus PB92 100.0%
Bacillus PB92 pMAX-4 120.0% +
Bacillus PBT109 120.0% +
B.subtilis B104 (pUBllO)* 1.5% +
B.subtilis B104 (pMAX-4) 10.0% +
* Tik proteazino pMAX-4 geno proteazės produkcijos matavimui plazmidė buvo taip pat transformuota (Spizizen et ai., (1961) aukščiau) į beproteazinį kamieną
B.subtilis DB104 (R.Doi, J.Bacteriol. 160 (1984) 442-444) kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
** Proteazinj aktyvumą matavo, panaudojant kaip substratą dimetilkazeiną, kaip aprašyta Lin et ai., J. Biol. Chem.
244 (1969) 789-793.
Fermentuojant didesniame kiekyje - 10-je litrų, Bacillus PB92 pMAX-4 pasirodė nestabilus ir duodantis mažesnę produkciją, negu PB109, jei į fermentacinę terpę nepridėdavo neomicino.
Iš aukščiau minėtų rezultatų seka, kad pasiūlytas paprastas ir efektyvus serino proteazės produkcijos būdas, stabiliai įvedant homologinj ir heterologinį geną, koduojantį serino proteazę, į pramoninių Bacillus kamienų chromosomą. Taip pat siūloma padidinta serino proteazės produkcija Bacillus-šeimininke, kuris jau gamina serino proteazę. Plazmidinių konstrukcijų įstatymas j ląstelės-šeimininko chromosomą lemia stabilumą gamybinėse fermentacijose ir žymiai padidina proteazės produkciją negu esant kamienams su nechromosominėmis plazmidėmis.
Visos publikacijos ir paraiškos patentams, minėtos šiame išradimo aprašyme, nurodo tos srities specialistų kvalifikacijos lygį. Visos publikacijos ir paraiškos patentams įrašyti į šį patentą kaip nuorodos taip, lyg kiekviena atskira publikacija ar paraiška patentui būtų specialiai ir individualiai nurodyta literatūros sąraše.
Kadangi išradimas dabar pilnai aprašytas, tai daugelio pakeitimų ir modifikacijų jame galimybė, neatitrūkstant nuo išradimo esmės ir apibrėžties apimties bus, matyti, įprastu technikos dalyku.

Claims (30)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Ekspresijos blokas, į kurį įeina transkripcijos kryptimi: transkripcijos reguliavimo seka ir transliacijos inicijavimo seka, funkcionuojantys Bacillus ląstelėje-šeimininke; DNR seka, koduojanti stipriai šarminį proteolitinį fermentą; transliacijos ir transkripcijos terminacijos sekos, funkcionuojančios minėtoje ląstelėje-šeimininke, kurioje minėtos DNR sekos ekspresija vyksta minėtų sekų iniciacijos ir terminacijos reguliacinėje kontrolėje; ir bent jau vienas markerinis genas ir temperatūrai jautrus bakterinės plazmidės replikacijos pradmuo.
  2. 2. Ekspresijos blokas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas proteolitinis fermentas gautas iš alkalofilinio Bacillus kamieno PB92 rūšies.
  3. 3. Ekspresijos blokas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR seka turi bent jau 70% nukleotidines sekos homologijos su proteolitinį fermentą koduojančiu Bacillus novo species PB92 genu.
  4. 4. Ekspresijos blokas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR seka koduoja polipeptidą, turintį tokią aminorūgšeių seką:
    H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-AV-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-NG-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-VK-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-LS-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-NS-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-SQ-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-SM-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-NT-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
  5. 5. Transformuota Bacillus ląstelė-šeimininkė, besiskirianti tuo, kad turi savyje ekspresijos bloką, kuriame yra transkripcijos kryptimi transkripcijos reguliavimo seka ir transliacijos inicijavimo seka, funkcionuojantys minėtoje ląstelėje-šeimininke, DNR seka, koduojanti stipriai šarminę serino proteazę ir transliacijos ir terminacijos transkripcijos sekos, funkcionuojančios minėtoje ląstelėje-šeimininke, kurioje minėtos DNR sekos ekspresija vyksta minėtų sekų iniciacijos ir terminacijos reguliacinėje kontrolėje; ir bent jau vienas markerinis genas ir temperatūrai jautrus bakterinės plazmidės replikacijos pradmuo.
  6. 6. Ląstelė pagal 5 punktą, besiskirianti tuo, kad turi bent jau dvi minėtos DNR sekos kopijas, įstatytas į minėtos ląstelės chromosomą.
  7. 7. Ląstelė pagal 5 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta ląstelė-šeimininkė yra laukinio tipo serino proteazės transformuotu producentu.
  8. 8. Ląstelė pagal 5 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta ląstelė-šeimininkė yra laukinio tipo serino proteazės transformuotu mutantiniu kamienu.
  9. 9. Ląstelė pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas mutantas nėra serino proteazės producentu.
  10. 10. Ląstelė pagal 5 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta stipriai šarminė serino proteazė gauta iš Bacillus novo species PB92.
  11. 11. Serino proteazės produkcijos būdas alkalofilinėje Bacillus ląstelėje-šeimininke, besi skiriantis tuo, kad į minėtą ląstelę-šeimininkę įveda ekspresijos bloką, turintį transkripcijos kryptimi transkripcijos kryptimi transkripcijos ir transliacijos reguliacinį iniciavimo seką; DNR seką, koduojančią serino proteazę; transkripcijos ir transliacijos terminacijos reguliavimo seką, kur minėti reguliavimo rajonai funkcionuoja minėtoje ląstelėje-šeimininke; ir selekcinį markerinį geną transformuotų ląstelių-šeimininkių atrankai;
    augina minėtas transformuotas ląsteles-šeimininkes, turinčias minėtą ekspresijos bloką, selektyvinėse sąlygose, kur gauta transformuota kultūra yra laisva nuo netransformuotų ląstelių-šeimininkių ir inkubuoja minėtą transformuotą kultūrą maitinimo terpėje, gaudami dėl to didesnę serino proteazės produkciją.
  12. 12. Būdas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta ląstelė-šeimininkė yra laukinio tipo serino proteazės producentė.
  13. 13. Būdas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta ląstelė-šeimininkė yra laukinio tipo serino proteazės producento mutantas.
  14. 14. Būdas pagal 13 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas mutantas nėra serino proteazės producentu.
  15. 15. Būdas pagal 12 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas alkalofilinis kamienas yra Bacillus novo species PB92.
  16. 16. Alkalofilinių ląstelių transformacijos būdas, besiskiriantis tuo, kad minėtų Bacillus ląstelių pradinį apdorojimą atlieka lizocimu šarminėje terpėje maždaug 20-37 C temperatūroje, kad susidarytų protoplastai;
    minėtus protoplastus atskiria nuo minėto lizino, apjungia minėtus protoplastus su DNR kostrukcija, dalyvaujant sujungimo reagentui maždaug 20-37 C temperatūroje, praskiedžia minėtą reagentą, kad minėtos Bacillus ląstelės susijungtų ir regeneruotųsi ir augina minėtas regeneruotas Bacillus ląsteles selektyvinėse sąlygose.
  17. 17. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta DNR konstrukcija transkripcijos kryptimi turi transkripcijos ir transliacijos reguliacinę seką; DNR seką, koduojančią dominantį polipeptidą; ir terminacijos transkripcijos ir transliacijos reguliacinę seką, kur minėtos reguliacinės sekos funkcionuoja minėtoje ląstelėješeimininke.
  18. 18. Dominančio polipeptido produkcijos alkalofilinio Bacillus kamieno ląstelėješeimininke sustiprinimo būdas, besiskiriantis tuo, kad dalyvaujant susijungimo šarminiame PH reagentui, sujungia minėtos ląstelės-šeimininkės protoplastą ir plazmidinę konstrukciją, į kurią įeina DNR seka, koduojanti minėtos ląstelėsšeimininkės endogeninį fermentą, replikacinė sistema, funkcionuojanti minėtoje ląstelėje-šeimininke ir selektyvus markerinis genas, dėka ko minėta DNR įjungiama į minėtą ląstelę-šeimininkę;
    minėtas ląsteles-šeimininkes, turinčias minėtą DNR, atrenka ir minėtas ląsteles-šeimininkes augina sąlygomis, turinčiomis gerą poveikį minėto dominančio polipeptido sintezei.
  19. 19. Būdas pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta ląstelė-šeimininkė yra Bacillus novo species PB92.
  20. 20. Būdas pagal 18 ar 19 punktus, besiskiriantis tuo, kad minėtas endogeninis fermentas yra serino proteazė, geriausiai, stipriai šarminė proteazė.
  21. 21. Būdas pagal bet kurį iš punktų nuo 18 iki 20, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad bent jau viena minėtos DNR kopija yra įstatyta į ląstelę-šeimininkę.
  22. 22. DNR seka, koduojanti tokios aminorūgščių sekos polipeptidą:
    h2n-a-q-s-v-p-w-g-i-s-r-v-q-a-p-a-a-h-n-r-g-l-t-g-s-g-v-k-v-aV-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-O-D-G-NG-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-ST-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-VK-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-LS-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-O-A-V-N-S-A-T-S-R-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-NS-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-O-N-N-N-R-A-S-F-SQ-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-SM-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-NT-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH
  23. 23. DNR seka pagal 22 punktą, besiskirianti tuo, kad koduoja serino proteazę, kilusią iš Bacillus novo species PB92.
  24. 24. Transformuotos Bacillus ląstelės-šeimininkės, besiskiriančios tuo, kad yra gautos pagal būdą, į kurį įeina:
    DNR fragmento, turinčio geną, koduojantį serino proteazę, sugebantį ekspresuotis minėtoje ląstelėje-šeimininke, atskyrimas:
    minėto DNR fragmento sujungimas su linijine vektorine DNR, norint gauti vektorių, turintį minėtą geną ir selekcijos markerį;
    protoplasto, paruošto iš ląstelės-šeimininkės, sujungimas su minėtu vektoriumi, esant sujungimo šarminiame pH reagentui, ir dėka to minėtas genas įvedamas į minėtą ląstelęšeimininkę ir įstato į minėtos ląstelės-šeimininkės chromosomą;
    ląstelių-šeimininkių, stabiliai turinčių minėtą geną, atrinkimas.
  25. 25. Transformuota Bacillus ląstelė-šeimininkė pagal 24 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta Bacillus yra Bacillus novo species PB92.
  26. 26. Transformuota Bacillus ląstelė-šeimininkė pagal 24 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtu vektoriumi yra pMAX-4.
  27. 27. Plazmidė pMAX-4.
  28. 28. Išskirtas DNR arba RNR oligonukleotidas, turintis seką bent jau iš 15 nukleotidų, atrinktų iš nukleotidų, galinčių hibridizuotis su seka, kuri koduoja stipriai šarminės serino proteazės, gaunamos iš Bacillus novo species PB92, aminorūgščių seką.
  29. 29. Oligonukleotidas pagal 28 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi radioaktyvią žymę.
  30. 30. Oligonukleotidas pagal 28 arba 29 punktus, besiskiriantis tuo, kad turi seką bent jau iš 20 nukleotidų.
LTIP1820A 1987-02-27 1994-01-28 Expression module, transformed host cell, process for preparing serine protease, method of transformation, dna sequence, plasmid, oligonucleotide LT4000B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP87200358 1987-02-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1820A LTIP1820A (en) 1995-08-25
LT4000B true LT4000B (en) 1996-06-25

Family

ID=8197584

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1820A LT4000B (en) 1987-02-27 1994-01-28 Expression module, transformed host cell, process for preparing serine protease, method of transformation, dna sequence, plasmid, oligonucleotide

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5217878A (lt)
JP (1) JP3026567B2 (lt)
KR (1) KR0127560B1 (lt)
CN (1) CN88101681A (lt)
AT (2) ATE181110T1 (lt)
AU (1) AU620026B2 (lt)
BG (1) BG49049A3 (lt)
BR (1) BR8805647A (lt)
CA (1) CA1339100C (lt)
DE (2) DE3856339T2 (lt)
DK (2) DK175738B1 (lt)
FI (3) FI105483B (lt)
HU (1) HU213220B (lt)
LT (1) LT4000B (lt)
LV (1) LV10307B (lt)
NO (1) NO884423L (lt)
PT (1) PT86864B (lt)
RU (1) RU2023723C1 (lt)
WO (1) WO1988006624A2 (lt)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT86864B (pt) * 1987-02-27 1992-05-29 Gist Brocades Nv Processo para clonagem molecular e expressao de genes que codificam para enzimas proteoliticas
DK6488D0 (da) * 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
GB2214508A (en) * 1988-01-27 1989-09-06 Bayer Ag Plasmid vector for the efficient expression of foreign genes fused with newly conceived transcriptional and translational signal sequences.
US6287841B1 (en) * 1988-02-11 2001-09-11 Genencor International, Inc. High alkaline serine protease
EP0370103A4 (en) * 1988-05-05 1991-11-27 Health Res Inst City New York Protease-deficient gram-positive bacteria and their use as host organisms for the production of recombinant products
US5665587A (en) * 1989-06-26 1997-09-09 Novo Nordisk A/S Modified subtilisins and detergent compositions containing same
JP3046344B2 (ja) * 1990-10-24 2000-05-29 塩野義製薬株式会社 新規プロテアーゼ
US5482849A (en) * 1990-12-21 1996-01-09 Novo Nordisk A/S Subtilisin mutants
DK58391D0 (da) * 1991-04-03 1991-04-03 Novo Nordisk As Hidtil ukendte proteaser
DE69333463D1 (de) * 1992-05-18 2004-05-06 Genencor Int Alkalische Proteasen produzierende Bakterien, und Verfahren zur Herstellung dieser alkalischen Proteasen
US6440717B1 (en) * 1993-09-15 2002-08-27 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6436690B1 (en) * 1993-09-15 2002-08-20 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted
US6599730B1 (en) * 1994-05-02 2003-07-29 Procter & Gamble Company Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US5831004A (en) * 1994-10-27 1998-11-03 Affymax Technologies N.V. Inhibitors of metalloproteases, pharmaceutical compositions comprising same and methods of their use
US5646044A (en) * 1995-03-02 1997-07-08 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Expression systems for the production of target proteins in bacillus
US6455295B1 (en) * 1995-03-08 2002-09-24 The Procter & Gamble Company Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6475765B1 (en) * 1995-03-09 2002-11-05 Procter & Gamble Company Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
IL117350A0 (en) * 1995-03-09 1996-07-23 Procter & Gamble Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
DE69739020D1 (de) 1996-11-04 2008-11-13 Novozymes As Subtilase varianten und verbindungen
US5766871A (en) * 1996-11-27 1998-06-16 Food Industry Research And Development Institute Screening and characterization of glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase
US6485957B1 (en) 1999-04-30 2002-11-26 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. DNA encoding the human serine protease EOS
US6420157B1 (en) 1999-04-30 2002-07-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Zymogen activation system
US6458564B1 (en) 1999-08-31 2002-10-01 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. DNA encoding the human serine protease T
US6426199B1 (en) 1999-08-31 2002-07-30 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Dna
CN1312370A (zh) * 2000-03-07 2001-09-12 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人atp依赖的丝氨酸蛋白水解酶11和编码这种多肽的多核苷酸
US6777218B1 (en) * 2000-03-14 2004-08-17 Novozymes A/S Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains
EP1287123B1 (en) * 2000-04-03 2011-03-02 Maxygen, Inc. Subtilisin variant
DK1495128T3 (da) 2002-03-29 2014-08-11 Genencor Int Forstærket proteinekspression i Bacillus
WO2004101759A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Genencor International, Inc. Novel lipolytic enzyme lip2
EP1625217B1 (en) * 2003-05-12 2014-12-17 Danisco US Inc. Novel lipolytic enzyme elip
EP1625202A4 (en) 2003-05-12 2010-10-20 Genencor Int NEW LIPOLYTIC ENZYME LIP1
US7575769B2 (en) 2003-09-19 2009-08-18 Innovative Cereal System Llc Preparation of an edible product from dough
US7985569B2 (en) 2003-11-19 2011-07-26 Danisco Us Inc. Cellulomonas 69B4 serine protease variants
WO2005052146A2 (en) * 2003-11-19 2005-06-09 Genencor International, Inc. Serine proteases, nucleic acids encoding serine enzymes and vectors and host cells incorporating same
CA2562208A1 (en) * 2004-04-09 2006-03-30 Genencor International, Inc. Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus
WO2005123915A1 (en) * 2004-06-21 2005-12-29 Novozymes A/S Stably maintained multiple copies of at least two orf in the same orientation
US7202074B2 (en) * 2004-07-22 2007-04-10 University Of Chile Protein and nucleic acid sequence encoding a KRILL-derived cold adapted trypsin-like activity enzyme
CA2680563A1 (en) 2007-03-12 2008-09-18 Danisco Us Inc. Modified proteases
CN101679489B (zh) 2007-05-10 2014-05-28 丹尼斯科美国公司 增加细菌内多肽表达的修饰的分泌***
ES2562919T3 (es) 2007-08-06 2016-03-09 University Of Chile Proteína y secuencia de ADN que codifica una actividad del tipo de la subtilisina adaptada al frío
CN101903519B (zh) 2007-12-21 2013-07-31 丹尼斯科美国公司 杆菌中增强的蛋白质生产
FI123122B (fi) 2009-02-16 2012-11-15 Optogear Oy Laitteisto lasimateriaalin valmistamiseksi
US8530218B2 (en) * 2009-04-24 2013-09-10 Danisco Us Inc. Proteases with modified pro regions
AR076941A1 (es) 2009-06-11 2011-07-20 Danisco Us Inc Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina
MX350391B (es) * 2011-09-22 2017-09-06 Novozymes As Polipeptidos que poseen actividad proteasa y polinucleotidos que los codifican.
CN103013960A (zh) * 2012-12-21 2013-04-03 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌
JP6585602B2 (ja) 2013-12-31 2019-10-02 ダニスコ・ユーエス・インク タンパク質発現の増大
KR102500121B1 (ko) 2014-12-16 2023-02-20 다니스코 유에스 인크. 향상된 단백질 발현
WO2016100128A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Danisco Us Inc Enhanced protein expression
EP3619309B1 (en) * 2017-05-05 2024-04-10 Bioecho Life Sciences GmbH Rapid purification of high quality nucleic acids from biological samples

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3674643A (en) 1967-11-10 1972-07-04 Novo Terapeutisk Labor As Preparation of proteolytic enzymes having maximum activity at high alkalinity
US3723250A (en) 1967-10-03 1973-03-27 Novo Terapeutisk Labor As Proteolytic enzymes, their production and use
US4480037A (en) 1982-02-08 1984-10-30 Showa Denko Kabushiki Kaisha Alkaline protease and preparation method thereof
US4480043A (en) 1980-05-20 1984-10-30 Biomerieux Process for the preparation of toxoplasmas for the diagnosis of toxoplasmosis, and preparations thus obtained

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1519148A (en) * 1974-11-19 1978-07-26 Gist Brocades Nv Compositions of matter
NO170594C (no) * 1982-11-01 1992-11-04 Solvay Enzymes Inc Fremgangsmaate for heterolog kloning av gen i bacillus mikroorganisme
IE81141B1 (en) * 1983-06-24 2000-04-05 Genencor Int Procaryotic carbonyl hydrolases
DE3480411D1 (en) * 1983-07-06 1989-12-14 Gist Brocades Nv Molecular cloning and expression in industrial microorganism species
EP0138075A1 (en) * 1983-09-16 1985-04-24 Synergen Associates, Inc. A method for the generation and detection of enzyme variants with enhanced themostability and activity
US4828994A (en) * 1984-09-21 1989-05-09 Genex Corporation Bacillus strains with reduced extracellular protease levels
FR2582316B1 (fr) * 1985-05-22 1988-12-02 Centre Nat Rech Scient Vecteurs d'expression de l'a-amylase dans bacillus subtilis, souches obtenues et procede de preparation d'a-amylase
DE3527913A1 (de) * 1985-08-03 1987-02-12 Henkel Kgaa Alkalische protease, verfahren zur herstellung von hybridvektoren und genetisch transformierte mikroorganismen
EP0254735B2 (en) * 1986-01-15 1998-06-17 Amgen Inc. METHOD FOR PRODUCTION OF THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS
SG30639G (en) * 1986-04-30 1995-09-01 Genencor Int Non-human carbonyl hydrolase mutants DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors
EP0896062A3 (en) * 1987-02-27 1999-04-07 Genencor International, Inc. Transformation of alkalophilic bacillus strains
PT86864B (pt) * 1987-02-27 1992-05-29 Gist Brocades Nv Processo para clonagem molecular e expressao de genes que codificam para enzimas proteoliticas

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3723250A (en) 1967-10-03 1973-03-27 Novo Terapeutisk Labor As Proteolytic enzymes, their production and use
US3674643A (en) 1967-11-10 1972-07-04 Novo Terapeutisk Labor As Preparation of proteolytic enzymes having maximum activity at high alkalinity
US4480043A (en) 1980-05-20 1984-10-30 Biomerieux Process for the preparation of toxoplasmas for the diagnosis of toxoplasmosis, and preparations thus obtained
US4480037A (en) 1982-02-08 1984-10-30 Showa Denko Kabushiki Kaisha Alkaline protease and preparation method thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHANG S, COHEN SN.: "High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA.", MOL GEN GENET., 1979, pages 111 - 115, XP002092527, DOI: doi:10.1007/BF00267940
MANIATIS T, ET AL.: "Molecular cloning"
P. VOROBJEVA ET AL.: "TRANSFORMATION OF BACILLUS MEGATERIUM PROTOPLASTS BY PLASMID DNA", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, 1980, pages 261 - 263, XP001313771
PALVA I. ET AL.: "Nucleotide sequence of the promoter and NH2-terminal signal peptide region of the alpha-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens", GENE, 1981, pages 43 - 51, XP023542084, DOI: doi:10.1016/0378-1119(81)90103-7

Also Published As

Publication number Publication date
BG49049A3 (en) 1991-07-15
NO884423D0 (no) 1988-10-05
FI884904A0 (fi) 1988-10-24
JP3026567B2 (ja) 2000-03-27
FI925413A0 (fi) 1992-11-27
LV10307A (lv) 1994-10-20
FI884904A (fi) 1988-10-24
BR8805647A (pt) 1989-10-31
DK200401262A (da) 2004-08-20
ATE181110T1 (de) 1999-06-15
DK175738B1 (da) 2005-02-07
PT86864A (pt) 1988-03-01
DE3856339D1 (de) 1999-07-15
AU1398088A (en) 1988-09-26
PT86864B (pt) 1992-05-29
HU213220B (en) 1997-03-28
CN88101681A (zh) 1988-11-09
AU620026B2 (en) 1992-02-13
ATE180016T1 (de) 1999-05-15
DK175852B1 (da) 2005-04-04
NO884423L (no) 1988-10-05
DK593988D0 (da) 1988-10-26
DK593988A (da) 1988-10-26
RU2023723C1 (ru) 1994-11-30
WO1988006624A2 (en) 1988-09-07
DE3856331D1 (de) 1999-06-17
KR890700665A (ko) 1989-04-26
LV10307B (en) 1995-08-20
FI106726B (fi) 2001-03-30
JPH01502876A (ja) 1989-10-05
KR0127560B1 (ko) 1997-12-29
FI925413A (fi) 1992-11-27
WO1988006624A3 (en) 1988-11-17
FI20001152A (fi) 2000-05-15
DE3856339T2 (de) 1999-11-04
FI105483B (fi) 2000-08-31
CA1339100C (en) 1997-07-29
FI119028B (fi) 2008-06-30
LTIP1820A (en) 1995-08-25
US5217878A (en) 1993-06-08
DE3856331T2 (de) 1999-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LT4000B (en) Expression module, transformed host cell, process for preparing serine protease, method of transformation, dna sequence, plasmid, oligonucleotide
EP0479396B1 (en) Transformation of alkalophilic bacillus strains
RU2091487C1 (ru) Способ получения штамма bacillus, содержащего две копии последовательности днк, кодирующей фермент с гидролазной активностью
KR100200166B1 (ko) 알칼리성 단백질 가수분해효소 및 그것의 제조방법
JP4571304B2 (ja) バチルス細胞内でのポリペプチドの製法
US5843720A (en) Introduction of DNA into bacillus strains by conjugation
EP0686195B1 (en) Method and system for enhanced production of commercially important exoproteins in gram-positive bacteria
US5945278A (en) Method and system for enhanced production of commercially important exoproteins in gram-positive bacteria
US5763187A (en) Bacterial donor cell useful in conjugation
JP2001508282A (ja) 接合において有用な細菌ドナー細胞
CA2156425C (en) Method and system for enhanced production of commercially important exoproteins in gram-positive bacteria
JPH0833484A (ja) アルカリプロテアーゼの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PC9A Transfer of patents

Free format text: GENENCOR INTERNATIONAL, INC.,4 CAMBRIDGE PLACE, 870 SOUTH WINTON ROAD, ROCHESTER NY 14618,US,970729

MM9A Lapsed patents

Effective date: 19980128