JP2001508282A

JP2001508282A - 接合において有用な細菌ドナー細胞

Info

Publication number: JP2001508282A
Application number: JP52627097A
Authority: JP
Inventors: ピー．スロマ，アラン; アール．ウィドナー，ウィリアム
Original assignee: ノボノルディスクバイオテック，インコーポレイティド
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2001-06-26
Also published as: WO1997026361A2; WO1997026361A3; EP0900271A2; DE69714038D1; EP0900271B1; ATE220716T1; CN1211281A; AU1705097A

Abstract

(57)【要約】本発明は、接合において有用な修飾された細菌ドナー細胞に関し、ここで前記細胞は、ｉ）興味あるポリペプチドをコードするDNA構造体を含んで成るプラスミド、及びトランス作用性移動要素の存在下での接合による前記プラスミドのトランスファーのために必要とされる少なくとも１つのシス作用性DNA配列、及びii）前記トランス作用性移動要素をコードする少なくとも１つのDNA配列を含み、そして受容体細胞集団を殺害し、又はその集団の増殖を妨げる殺細菌剤の生成の、親細胞に対して減じられた能力を有することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】接合において有用な細菌ドナー細胞発明の分野本発明は、バシラスspp.（Bacillus spp．）の細胞中へのDNAの導入、及びそのような細胞の培養によるポリペプチドの製造の分野に関する。特に、本発明は、バシラスの接合(conjugution)においてドナー細胞としての使用のために修飾された細胞に向けられる。発明の背景伝統的に、３種の異なる方法が、バシラスsp.の株中にDNAを導入するために使用されて来た。一般的にＢ．ズブチリス(B．subtilis)の細胞のためにのみ有用である第１の方法は、コンピテント(compitent)細胞の形質転換（transformatio n）であり、第２の方法はエレクトロポレーション(electroporation)の原理に基き、そして第３の方法はプロトプラストの形質転換に基く。特に、プロトプラスト形質転換及びコンピテント細胞の形質転換が広く使用される。しかしながら、プロトプラストは多くの異なるバシラスsp.のために機能するが、一般的に、数日以下ではなし遂げられ得ないので、この方法を使用は厄介である。さらに、上記のように、コンピテント細胞の形質転換は、一般的に、Ｂ．スブチリス168の細胞のために満足して機能することが単に示されて来た。バシラスのいくつかの株が、接合により、すなわちある種の“トランスファープラスミド”により介在される遺伝子材料の交換により、DNAを取り込むことができる。より具体的には、Koehler and Thorne（Journal of Bacteriology，Nov．1987 ，pp.5771-5278）は、バシラスsp.間のプラスミドのトランスファーを介在することができる55kbのプラスミド、すなわちpLS20を記載する。それぞれ、テトラサイクリン耐性プラスミドpBC16及びスタフィロコーカス・アウレウス(Staphylo coccus aureus)カナマイシン耐性プラスミドpUB110のトランスファーが、Ｂ．スブチリス(natto)の株からバシラスspp．、B.アントラシス（B．anthracis）、Ｂ．セルス（B．cerus）、Ｂ．リケニホルミス（B．licheniformis）、Ｂ．メガテリウム(B．megaterium)、Ｂ．プミラス（B．pumilus）、Ｂ．スブチリス(B．sub tilis)及びＢ．スリンギエンシス（B．thuringiensis）の株に、プラスミドpLS2 0により介在されることが示された。他のプラスミドは、pLS20の使用によりトランスファーできないことが見出された。pLS20により介在されるプラスミドのトランスファーは、誘導（conduction）よりもむしろ供与（donation）により、すなわち２つのプラスミドの物理的な会合を伴わないで起こることが結論づけられた。 Journal of Bacteriology，June 1990，pp.3290-3297において、Selingerなどは、非接合性プラスミドpUB110及びpBC16におけるオープンリーディングフレームβ（ORF-β）領域を同定し、そしてこの領域が接合プラスミドpLS20又はその誘導体によるプラスミドの移動化のために必須であることを結論づける。また、 ORF-βの５’側に位置するpUB110及びpBC16のもう１つの領域（及びたぶん、ori Tを含む）は、移動化のために必要であることが示される。ORF-βはトランスで作用し、そして他の領域はシス−作用する。バシラスsp.の株中にDNAを導入するための改良された系を供給し、そして注目のポリペプチドの生成のためにそれらの系を使用することが、本発明の目的である。発明の簡単な開示接合は、トランスロケートされるポリペプチドをコードするDNAを、多くの異なったバシラスsp.，特に産業的に興味ある細胞中に導入するために使用され得、そしてさらに、この目的のためへの接合の使用は上記の従来使用されて来た方法よりもより一層、単純で且つ早いことが驚くべきことには見出された。さらに、トランスファー頻度は、従来使用されて来た方法のために観察される頻度よりもかなり高い。さらに、接合は、従来の方法が不満足であり又は単純には擁護できないことがわかっている細胞中にDNAを導入するために使用され得る。接合の方法は、ｉ）注目のポリペプチドをコードするDNA構造体を含んで成るプラスミド、及びトランス作用性（trans-acting）移動要素（mobilizing element）の存在下での接合による前記プラスミドのトランスファーのために必要とされる少なくとも１つのシス作用性（cis-acting）DNA、並びにii）前記トランス作用性移動要素をコードする少なくとも１のDNA配列を含む細菌細胞、好ましくはバシラスを、ドナー細胞として利用することを包含する。好ましい態様においては、タンパク質は、トランスロケートされるタンパク質である。しかしながら、接合へのそのようなドナー細胞の使用における驚くべき成功にもかかわらず、多くの場合、生存するトランス接合体の数は、所望され、そして／又は予測されるよりもかなり低い。受容体細胞間の低い残存率は、ドナー細胞による殺細菌化合物の生成によるものであることが現在、意外には見出された。これに関して、本発明は現在、上記に開示されるように、バシラスspp.間での好結果をもたらす接合のために適合される他に、接合の後、受容体細胞の生存率を改良するような態様で修飾された新規のドナー細胞を提供する。従って、第１の観点においては、本発明、上記で定義されたような好結果をもたらす接合のために必要とされる要素を含む他に、受容体細胞の集団を殺害し、又はその増殖を妨げる殺細菌剤を生成するために、それが由来する親細胞株に対して減じられた能力を示す変性されたバシラスドナー細胞に関する。本発明における“減じられた能力”とは、接合条件下で修飾されたドナー細胞とのインキュベーションの後、受容体細胞が、それが由来する親細胞が同じ接合方法に使用される場合に観察される生存率に対して、生存率の測定できる上昇を示すことができることを意味する。好ましい態様においては、修飾されたドナー細胞の使用は、それが由来する親細胞が同じ接合方法に使用される場合、生存率に対して受容体細胞の生存性において少なくとも10％の改良性をもたらす。本発明はまた、新規ドナー細胞の集団及びバシラスsp.受容体細胞の集団が、ドナー細胞の集団から受容体細胞の集団への接合によるプラスミドのトランスファーを可能にする条件下で混合される方法にも関する。受容体細胞は、たとえばそのための知られているDNA導入方法が存在しないか、又は非常に困難である産業用又は好アルカリ性バシラスsp.の細胞であり得る。定義用語“トランスロケートされるポリペプチド”とは、発現されるべきポリペプチドが、細胞膜を通してそのトランスロケーションを可能にするシグナル配列を担持することを示すことを意図する。特に、トランスロケートされるポリペプチドは、分泌されるポリペプチド、又は問題のバシラス細胞の分泌機構に関与するポリペプチドであり得る。本明細書において、用語“トランス作用性移動要素の存在下で接合による前記プラスミドのトランスファーのために必要とされるシス作用性DNA配列”とは、受容体細胞中に導入される予定であるプラスミド上に位置されるべきである。起こる移動化のために必要なDNA配列又はDNA部位を示すことが意図される。シス作用性DNA配列は、oriT、又はその機能的類似体又は一部であり得る。用語“トランス作用性移動要素”とは、上記で定義されたシス作用性DNA配列を含むDNA配列の接合トランスファーを介在するタンパク質を示すことが意図される。そのトランス作用性移動要素は、接合プラスミド、たとえばpLS20、又はその一部又は誘導体によりコードされるタンパク質であることができ、又はDNA 配列、たとえばorf-β、又はその機能的類似体又は一部によりコードされるタンパク質であり得る。前記移動要素はトランス形で作用するので、それはドナー細胞のゲノムに存在するか、又は前記ドナー細胞に存在する第２プラスミド、たとえば接合プラスミド上に存在するDNAによりコードされ得る。それぞれ、oriT及びorf-βを含んで成るDNA配列は、Sellingerなど.，前記により記載される。用語“機能的類似体”又は“機能的部分”とは、それぞれoriT及びorf-βについて使用される場合、修飾された遺伝子配列が、その修飾された遺伝子配列により付与されるプラスミド移動機能が実質的にそこなわれない限り、使用され得ることを示すつもりである。たとえば、それぞれoriT及びorf-β(Sellingerなど．により記載されるような)の一部は、所望の機能を発揮することができると思われる。それぞれoriT及びorf-βの機能的部分又は類似体は、生来のoriT又はorf- βの修飾、たとえば従来のDNA修飾による１又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換、及びその得られる部分又は類似体のプラスミド移動能力についての続く試験により同定され得る。用語“接合プラスミド”とは、接合によりDNAのトランスファーを介在できるいづれかのプラスミドを包含することが意図される。１つの非常に適切な例は、プラスミドpLS20（Sellingerなど.，前記により記載される）又はそれに対して実質的に同一のプラスミド、又はpLS20のプラスミド移動能力を保持しているpLS 20の誘導体である。用語“誘導体”とは、プラスミドpLS20に関して使用される場合、前記プラスミドの接合介在能力を保持している、遺伝的に修飾された、典型的にはサイズが減じられたプラスミドを示すことが意図される。用語“治すことができる(curable)プラスミド”とは、プラスミドを有する細胞が、外部的に適用された要因により、前記プラスミドから治され得ることを示す。たとえば、プラスミドは、一定の（許容できる）条件下でプラスミドの複製を可能にするが、しかし他の（非許容性）条件下で複製できない条件付き複製起点を担持することができる。たとえば、プラスミドは、複製のために感温性であるプラスミドであり得る。本発明においては、用語“プラスミド”とは、染色体外要素を自律的に複製する場合、機能することができるバクテリオファージ又は他のDNA分子をまた示すことが意図され、そして明細書及び請求の範囲を通して移動性プラスミドとは、いづれかの移動性遺伝子要素、たとえば染色体DNA配列又は非自律的に複製する要素、等をも包含することが意図されることに注目すべきである。発明の詳細な開示特定タイプのドナー細胞の使用による接合上記のように、接合は従来の技法よりも受容体細菌細胞中へのDNAの導入のためのより効果的且つ一般的に適用できる方法であるが、その接合頻度は、一定タイプのドナー及び受容体細胞間での接合に関しては比較的低いことが見出されている。本発明者は現在、低い接合頻度問題の一部が、ドナー細胞が受容体細胞を殺すか又はその増殖速度を低めるかいづれかである少量の殺細菌物質を生産する事実に基づかれていることを驚くべきことに見出している。従って、前記殺細菌物質の生産が減じられ、又は排除される場合、その接合頻度は有意に高められ得る。結局は、新規ドナー細胞は、親細胞により生成される殺細菌物質の効果を減じるその親細胞の修飾により創造される。従って、さらに重要な観点においては、本発明は、注目のポリペプチドをコードするDNA構造体を有するバシラスsp.の細胞を構成する方法に関し、ここで細菌ドナー細胞集団が、ｉ）前記DNA構造体を含んで成るプラスミド、及びトランス作用性移動要素の存在下での接合により前記プラスミドのトランスファーのために必要とされる少なくとも１つのシス作用性DNA配列、並びにii）前記トランス作用性移動要素をコードする少なくとも１つのDNA配列を有し、そしてバシラスs p.受容体細胞集団が、接合によるドナー細胞集団から受容体細胞集団への前記プラスミドのトランスファーを可能にする条件下で混合され、前記ドナー細胞集団が受容体細胞を殺し、又はその増殖を妨げる殺細菌物質を生産する能力が低下するように修飾された細胞から調製される。本明細書において、そのいづれかの子孫をも包含する用語、修飾されたドナー細胞とは、接合条件下でその修飾されたドナー細胞と共にインキュベートした後、受容体細胞が、ドナー細胞が由来する親細胞が同じ接合方法に使用される場合に観察される生存率に対して、測定できる生存率の上昇を示す場合、殺細菌物質の生産の“減じられた能力”を有すると思われる。１つの態様においては、修飾されたドナー細胞は、両ドナー細胞が同じ条件下での接合のために、及び同じ接合要素と共に使用される場合、それが究極的に由来する親ドナー細胞系よりも少なくとも約１％高い受容体細胞の生存率を可能にする。好ましくは、修飾されたドナー細胞は、親細胞系よりも少なくとも約10％高い、より好ましくは20％高い、及び最とも好ましくは少なくとも約30 ％高い受容体細胞の生存率を可能にする。用語“殺細菌物質”とは、受容体細胞集団の増殖阻害を発揮するか、又はその集団に対する効果又は殺害を発揮する細菌細胞集団により生成されるいづれかの成分を包含することが意図され、その存在は、それらの接合介在活性を発揮するドナー細胞集団のために必須ではない。生来のドナー細胞は１種以上の殺細菌物質を生産することができ、そして本発明のこの観点によれば、用語“殺細菌物質の減じられた生成”とは、ドナー細胞集団により生成される異なった活性な殺細菌物質の合計量又は合計数が減じられることを意味することが理解されるであろう。言い換えれば、この用語は、ドナー細胞集団が１，２又はそれ以上の殺細菌物質を欠失しているか又はその減じられた量を生成することを意味する。本発明のこの観点の方法は、いづれかの殺細菌物質、すなわち受容体細胞集団に対する増殖阻害又は殺害効果を示すドナー細胞集団により生成されるいづれかの成分に関して有用であると思われる。減じられるか、又は排除されるべきその対応する殺細菌物質は、受容体細胞の選択に依存するであろうことが理解されるであろう。この後、例においては、異なったバシラスsp.は異なった殺細菌物質に対して敏感であり、そしてその接合頻度は１つ以上のタイプの殺細菌物質（選択の受容体細胞に対するその増殖阻害又は殺害効果以外にはいづれか他に詳細に特徴づけられる必要はない）の生成を減じ、又は排除することによって有意に高められ得る。用語“修飾されたドナー細胞”とは、ドナー細胞からの特定の殺細菌物質（たとえば、Ｂ．アミロリクエファシエンス（B．amyloliquefaciens）及びＢ．レンタス受容体細胞の場合、バシリシン）の生成に関与する選択された遺伝子の欠失又は不活性化により生成される細胞、及び本明細書における開示に従って接合のために必要とされる要素を組込むようさらに修飾される、殺細菌物質を減じ、又は排除するために修飾されていることが知られている細胞を包含する。一般的により適用できる方法は、親ドナー細胞を突然変異にゆだね、そして親細胞よりも細菌受容体細胞の低い程度の殺害又は増殖阻害を示すか、又は殺害を示さない突然変異細胞について選択することである。通常、選択は、“感受性”受容体細胞の新しく広げられた培養物上での突然変異誘発された細胞のコロニーを複製し、減じられた又は好ましくはそれらを取り囲む殺害の領域を含まないコロニーを同定することによって実施されるであろう。類似する態様において、突然変異誘発物質に対して故意に暴露されていない親ドナー細胞集団は、受容体細胞の殺害のための減じられた能力を示す天然に存在する変異体について単純にスクリーンされ得；本明細書及び請求の範囲においては、用語“突然変異誘発”とは、“修飾された”細胞を同様に単離する方法もまた包含することが理解されるであろう。突然変異誘発は、たとえば適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はDNA配列をPCR生成された突然変異誘発にゆだねることにより実施され得、後者の可能性は、問題の又は前記剤における生成に関与する殺細菌剤をコードするDNA配列が知られている場合、特に適切なものである。さらに、突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいづれかの組合せの使用により実施され得る。本発明の目的のために適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線（UV）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（MNNG）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート(EMS)、亜硝酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体を包含する。そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、突然変異が起こる適切な条件下で選択の突然変異誘発剤の存在下で突然変異誘発されるべき細胞をインキュベートし、そして殺細菌剤の減じられた生成を有する突然変異誘発された細胞について選択することによって実施される。実際、選択は、“感受性” 受容体細胞の新しく広げられた培養物上での突然変異誘発された細胞のコロニーを複製し、それらを取り囲む殺害の減じられた領域を有するか又は好ましくはその領域を有さないコロニーを同定することによって実施されるであろう。殺細菌剤をコードするか又は前記剤の生成に関与するDNA配列が知られている場合、修飾又は不活性化は、殺細菌剤又はその合成に関与する酵素をコードする DNA配列における１又は複数のヌクレオチドの導入、置換又は除去によりなし遂げられ、又は調節要素の転写又は翻訳のために必要とされる調節要素においては、ヌクレオチドは、停止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームの変更をもたらすために挿入又は除去され得る。DNA配列又は調節要素の修飾又は不活性化は、当業界において知られている方法に従って、特定部位の突然変異誘発又はPCR生成された突然変異誘発によりなし遂げられ得る。便利な技法は、遺伝子破壊又は遺伝子置換、もしくはアンチセンスを包含する。殺細菌物質は、たとえばＢ．スブチリスの一定の株、たとえばＢ．サブチリス 168により生成されることが知られている抗生物質、たとえばバシリシンであり得る。バシリシン欠失Ｂ．スブチリス細胞は存在し、そしてそれは、本発明に従って、接合によるDNAの導入のためのドナー細胞として選択され得る。もう１つの殺細菌物質は、Ｂ．スブチリス168によりまた生成されるスブチリシンである。殺細菌物質の減じられた生成を有する他に、ドナー細胞は、接合が起こるために好都合である他の特性のいづれかを担持することができる。たとえば、ドナー細胞は、さらに上記で詳細に記載されるように、栄養要求性であり得る。有用な受容体細胞の生成接合の成功の頻度を改良するためのもう１つの方法は、ドナー細胞による殺害に対して抵抗力がある受容体細胞集団を使用することである。しかしながら、多くの場合、注目の受容体細胞はこの特性を有さないであろう。注目の受容体細胞を使用できるためには、ドナー細胞への暴露に対して生存することができる細胞を、敏感な集団からの単離するためのスクリーニングが可能である。これを達成するためには、ドナー細胞が、突然変異誘発された受容体細胞と共に、殺害又は増殖阻害の発生を通常可能にする時間及び条件下で混合される。次に、受容体細胞集団からの生存細胞が単離され、そして修飾されていないドナー細胞と共に、培養され、接合工程において都合良く使用され得る受容体細胞集団が供給される。用語“突然変異誘発された”が受容体細胞に関して使用される場合、それは、ドナー細胞について上記に開示される態様で活性的に突然変異誘発されている細胞、及び受容体細胞集団間に存在することができる天然に存在する突然変異体の両者を意味する。トランスロケートされるポリペプチドの生成ドナー細胞は、問題のトランスロケートされるポリペプチドをコードするDNA 構造体を接合により獲得する受容体バシラス細胞の培養により、ポリペプチド、好ましくはトランスロケートされるポリペプチドを生成するために使用される受容体細胞との接合に有用である。接合は好ましくは、DNA構造体を担持するプラスミド、及びトランス形で供給される少なくとも１つの移動要素の存在下での接合により前記プラスミドのトランスファーのために必要とされる少なくとも１つのシス作用性配列の使用により、すなわち次の開示にさらにより詳細に記載される接合の方法のいづれかにより達成される。本発明に関して特に興味あるバシラス株の１つのタイプは、好アルカリ性バシラスである。好アルカリ性バシラスsp.の例は、アメリカ特許第5,217,878号に記載されるもの、たとえばアメリカ特許第3,723,250号及び第3,840,433号に記載されるバシラスsp．BP92を包含する。本発明の方法のための興味あるもう１つのタイプのバシラス株は、産業用バシラスの細胞である。用語“産業用バシラスsp.”とは、１ｌ当たり５ｇよりも多くの分泌されるポリペプチドを生成することができる、バシラス・スブチリス16 8とは異なるバシラスsp.の非組換え株を示すつもりである。産業用バシラスsp.の例は、ヨーロッパ特許第134048号に特定され、そしてＢ．リケニホルミス、Ｂ．アミロリクエファシエンス及びＢ．レンタスの株を包含する。バシラス（産業用及び／又は好アルカリ性であっても又はそうでなくても良い）の適切な細胞のさらなる例は、バシラス・スブチリス、バシラス・リケニホルミス、バシラス・レンタス、バシラス・ブレビス(Bacillus brevis )、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミロリクエファシエンス、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バシラス・サーキュランス（Bacillus circalans）、バシラス・ラウタス(Bacillus lautus) 、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)及びバシラス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）から成る群から選択され得る。本発明のこの観点の方法に使用されるバシラス細胞の安定性を改良するためには、トランスロケートされるポリペプチドをコードするDNA構造体がバシラス細胞のゲノム中に組込まれることが所望される。これはプラスミドが、受容体細胞のゲノムの一部に対して相同組換えを可能にするために十分に相同である。１又は複数のDNA配列を担持する場合に達成され得る。受容体細胞のゲノムへのDNA構造体の安定した組込みを得るための適切な方法は、下記にさらに詳細に論ぜられる。本発明の第１の観点の方法に従って生成されるトランスロケート可能なポリペプチドは好ましくは、分泌されるポリペプチド、又は分泌細胞の分泌路のポリペプチドである。分泌されるポリペプチドは、たとえばデンプン分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ酵素又は植物細胞壁分解酵素から選択された酵素であり得る。そのような酵素の例は、AMG、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、ガラクトシダーゼ、及びキチナーゼを包含する。他方では、分泌されるポリペプチドは、ホルモン、成長因子、受容体又は同様のものであり得る。分泌路のポリペプチドの好ましい例は、PrsA(WO 94／19471、この内容は引用により本明細書に組込まれる)である。トランスロケートされるポリペプチドが分泌されるタンパク質である場合、本発明のこの第１の観点の方法は好ましくは、さらにポリペプチド回収段階を含んで成る。ポリペプチドは、遠心分離又は濾過により媒体から細胞を分離し、必要なら、細胞の破壊の後、上清液又は濾液中のタンパク質成分を、塩、たとえば硫酸アンモニウムにより沈殿せしめ、続いて、種々のクロマトグラフィー法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー又は同様のものにより精製する従来の方法により回収され得る。接合によるDNA導入のための本発明の方法産業用バシラス又は好アルカリ性バシラス受容体細胞の使用：本発明の好ましい態様においては、ドナー細胞が、注目のポリペプチドをコードするDNA構造体をバシラスsp.の細胞中に導入する方法に使用され、この方法においては、ｉ)DNA構造体を含んで成るプラスミド、及びトランス作用性移動要素の存在下での接合による前記プラスミドのトランスファーのために必要とされる少なくとも１つのシス作用性DNA配列、及びii）前記トランス作用性移動要素をコードする少なくとも１つのDNA配列を有する細菌ドナー細胞集団、及びバシラスsp.受容体細胞集団が、前記ドナー細胞集団から接合により受容体細胞集団へのプラスミドのトランスファーを可能にする条件下で混合され、ここで前記バシラスsp.は、好アルカリ性バシラスsp.及び／又は産業用バシラスsp.である。この発明の観点は、好アルカリ性及び／又は産業用バシラスsp.の株が一般的にコンピデンスによっては非形質転換性であり、そして従って、上記のように、 DNAの導入のために非常に厄介であるプロトプラスト形質転換にのみ依存することが見出されているので、特に好都合である。好アルカリ性及び／又は産業用バシラスsp.の例は上記に与えられる。栄養要求性ドナー細胞の使用：もう１つの態様においては、本発明は、注目のポリペプチドをコードするDNA 構造体を有するバシラスsp.の細胞を構成するための方法に関し、この方法においては、ｉ)DNA構造体を含んで成るプラスミド、及びトランス作用性移動要素の存在下での接合による前記プラスミドのトランスファーのために必要とされる少なくとも１つのシス作用性DNA配列、並びにii）前記トランス作用性移動要素をコードする少なくとも１つのDNA配列を有する栄養要求性の修飾された細菌ドナー細胞、及び標識されていないバシラスsp.受容体細胞集団が、前記栄養要求性ドナー細胞集団から接合により標識されていない受容体細胞集団へのプラスミドのトランスファーを可能にする条件下で混合され、そして前記ドナー細胞の栄養要求性質が受容体細胞について選択するために利用される。本発明のこの観点は、選択が受容体細胞のために行なわれる必要がなく、すなわちそれらは、ドナー細胞の栄養要求性質を利用する場合に残存する唯一のものであることにおいて明確に好都合である。ドナー細胞は、たとえば特定のアミノ酸に対して栄養要求性であり得る。本発明の方法に使用される特に好ましいドナーは、Ｄ−アラニンに対して栄養要求性であるドナー、すなわちdal^-であるドナーである。接合処理が行なわれた後、da l^-ドナー細胞及び受容体細胞の混合物が、Ｄ−アラニンを欠いている培地、すなわちdal^-ドナー細胞が増殖できない培地上で又は培地において培養される。それにより、受容体細胞のみが残存する。栄養要求性マーカーを用いる原理は、たとえばアメリカ特許第4,920,048号に記載されている。続いて、注目のDNA構造体を獲得した受容体細胞についての唯一の選択が、選択マーカー、たとえばプラスミドによりコードされる耐抗生物質性マーカーの使用により便利に行なわれるべきである。治すことができる(curable)プラスミドの使用：もう１つの観点においては、本発明は、注目のポリペプチドをコードするDNA 構造体をバシラスsp.の細胞中に導入するための方法に関し、この方法においては、ｉ)DNA構造体を含んで成る治すことができる(curable)プラスミド、及びトランス作用性移動要素の存在下での接合による前記プラスミドのトランスファーのために必要とされる少なくとも１つのシス作用性DNA配列、並びにii）前記トランス作用性移動要素をコードする少なくとも１つのDNA配列を有する、本発明に開示される修飾された細菌ドナー細胞集団、及びバシラスsp.受容体細胞集団が、前記ドナー細胞集団から接合により受容体細胞集団へのプラスミドのトランスファーを可能にする条件下で混合される。治すことができるプラスミドの使用は、接合を通して細胞中にトランスファーされているが、しかし他の要素、たとえば接合によるプラスミドのトランスファーのために必要とされるシス作用性DNA 配列、を有さないプラスミドのいくつかの要素を受けている受容体の構成のために特に適切である。そのような場合、注目のポリペプチドをコードするDNA構造体を、受容体細胞のゲノム中に、任意には細胞に保持されるべき他の要素と一緒に組込むことが好都合であり、この場合、細胞に所望されない要素（たとえばシス作用性DNA配列）はプラスミド上に保持される。ゲノム組込みが生じた後、細胞は、所望しない要素を担持する治すことができるプラスミドから治される。ゲノム組込みを達成するための方法は、さらに下記に記載される。本発明のこの観点の方法に使用される治すことができる(curable)プラスミドは、当業界において知られている方法に従って、典型的には、治すことができるプラスミド、又はシス作用性DNA配列を担持するプラスミドのいづれかの修飾により、それぞれの要素（たとえば感温性複製起点、シス作用性DNA配列、注目のD NA構造体、等）を組合すことによって構成され得る。本発明の方法の好ましい態様次に、本発明の上記方法の好ましい態様が記載される。本発明のそれらの態様の主題は、特にことわらない限り、上記の主要観点の個々及びいづれかの方法のために一般的に適用できる。受容体細胞：本発明の接合方法のいづれかに使用される受容体細胞は、好アルカリ性バシラスsp.の細胞又は産業用バシラスsp.の細胞であることが好ましい。受容体細胞はさらに、バシラスsp.，たとえばバシラス・スブチリス、バシラス・リケニホルミス、バシラス・レンタス、バシラス・ブレビス、バシラス・ステアロサーモフィラス、バシラス・アルカロフィラス、バシラス・アミロリクエファシエンス、バシラス・コーギュランス、バシラス・サーキュランス、バシラス・ラウタス、バシラス・メガテリウム及びバシラス・スリンギエンシスの細胞であり得る。後者の種は、産業用又は好アルカリ性バシラスsp.のグループに属することができる。修飾されたドナー細胞：本発明の方法のいづれかに使用される修飾された細菌ドナー細胞は、エスシェリシアsp．(Eschericia，sp.)、たとえばＥ．コリの細胞であり得るが、しかし好ましくは、バシラスsp.たとえばバシラス・スブチリス、バシラス・リケニホルミス、バシラス・レンタス、バシラス・ブレビス、バシラス・ステアロサーモフィラス、バシラス・アルカロフィラス、バシラス・アミロリクエファシエンス、バシラス・コーギュランス、バシラス・サーキュランス、バシラス・ラウタス、バシラス・メガテリウム又はバシラス・スリンギエンシスの細胞であり、この細胞は、又は親細胞により通常生成される殺細菌物質を生産できず、又は親細胞に比較して減じられた生産能力を有し、その修飾された細胞は、ｉ）注目のポリペプチドをコードするDNA構造体を含んでなるプラスミド、及びトランス作用性移動要素の存在下で接合による前記プラスミドのトランスファーのために必要とされる少なくとも１つのシス作用性DNA配列、並びにii）前記トランス作用性移動要素をコードする少なくとも１つのDNA配列を有する。前記細胞は、好都合には、Ｂ．スブチリス、たとえば問題の殺細菌物質の低い生産性を有するか又はまったく有さないＢ．スブチリス168の細胞である。好ましい態様において、細胞は、殺細菌物質バシリシンもしくはスブチリシン、又はそれらの両物質の減じられた生産性を有するか又はまったく有さない。そのような細胞は、上記“特定タイプのドナー細胞による接合” に詳細に記載される。さらに、ドナー細胞は、上記にさらに詳細に記載されるように、栄養要求性であり得る。治すことができる(curable)プラスミド：より好ましい態様において、受容体細胞中に導入されるDNA構造体は、シス作用性配列をまた含んで成る治すことができる(curable)プラスミド上に存在する。治すことができる(curable)プラスミド及びその使用は、標題“治すことができる(curable)プラスミドを用いての、接合によるDNA導入のための本発明の方法 ”にさらに詳しく記載される。注目のDNA構造体のゲノム組込み：本発明の上記一般的な観点のいづれかに従って受容体細胞に導入される予定である、注目のポリペプチドをコードするDNA構造体は、受容体細胞において染色体外要素（たとえば、細胞中にDNAを導入するために使用されるプラスミド上に担持される）として存在することができるが、ゲノム的に組込まれるDNAが一般的により安定していると思われるので、DNA構造体は受容体細胞のゲノムに組込まれることが一般的に好ましい。ゲノム組込みは、便利には、それぞれ、プラスミド及びゲノム上の相同配列間での組換えに基づいて良く知られた方法により達成され得る。１つの態様においては、ゲノム組込みは、トランスファーされるべきプラスミドが次の構造体を含んで成るプラスミドである場合に達成され得る：シス−Ｒ（１）−DNA−Ｒ（２）、ここでシスは接合トランスファーのために必要とされるシス作用性DNA配列を示し、DNAは受容体細胞中に導入されるべきDNA構造体を示し、そしてＲ（１）及びＲ（２）はそれぞれ、Ｒ（１）とＲ（２）との間に位置するDNA構造体の二重クロスオーバーによる受容体細胞のゲノム中への組込みを可能にするために受容体細胞ゲノムの一部に対して十分な相同なDNA配列を示す。プラスミドは便利には、治すことができる(curable)プラスミド、たとえばＲ（１）−DNA−Ｒ（２）を含んで成るフラグメントのいづれかの側上に位置する感温性複製起点を含んで成るプラスミドであり得る。治すことができる(curable )プラスミドの使用は、接合がいったん起った後、起こる接合のために必要とされるシス作用性DNA配列の細胞からの除去を可能にする追加の利点を有する。治すことができる(curable)プラスミドが使用される場合、好ましくは、その方法は、注目のポリペプチドをコードするDNA構造体をそのゲノム中に組込んでおり、そしてそれから、シス作用性要素を担持するプラスミドが失なわれている受容体細胞について選択する追加の段階を含んで成る。相同領域の使用によるゲノム組込みに関する本発明の態様に関して、用語、ゲノムの“相同”領域は好ましくは、受容体細胞の生存及び適切な機能のためには重要ではない領域である。さらに、上記で示されたように、上記方法のいづれかに従って組込みの効率を改良するためには、治すことができるプラスミドを利用することができる。たとえば、そのプラスミドは、複製のために感温性であるプラスミドであり得る。組込み、及び細胞からの第１子孫ベクターの続く損失の効率を高めるもう１つの手段は、プラスミドにより形質転換された細胞を、上記のように、選択条件下で宿主細胞を培養した後、プラスミド−治療剤、たとえばノボビオシン(Gado，I.など.，1987，ZbI，Bakt，Hyg.A．265，136-145)により処理することであり得る。注目のポリペプチドをコードするDNA配列の増幅：本発明の接合方法は好都合には、受容体細胞のゲノムに存在するゲノムDNA配列の増幅を達成するために使用され得る。ゲノムDNA 配列の増幅を達成するための非常に便利な方法は、WO 94／14968(この内容は引用により本明細書に組込まれる)に記載される。増幅されるべきゲノムDNA配列は、本発明の接合方法により受容体細胞中に導入されている、注目のポリペプチドをコードする配列であり得る。本発明の受容体細胞さらにもう１つの観点においては、本発明は、注目のDNA構造体、及び生じる接合のために必要とされるシス作用性DNA配列を有する、本発明の接合方法により生成されるバシラスsp.の細胞に関する。この細胞は好ましくは、“受容体細胞”のセクションに特定されるバシラスsp.のいづれかの細胞である。ポリペプチドを生成するための方法さらにもう１つの観点においては、本発明は、注目のポリペプチドの生成のための助けとなる条件下で上記で定義されたような本発明の方法により生成される細胞の培養、及び興味あるポリペプチドの任意の回収を包含する、興味あるポリペプチドを生成するための方法に関する。前記ポリペプチドは、従来の回収又は精製技法（この例は、上記でさらに言及されている）により回収され得る。本発明のこの観点の方法は、トランスロケートされたポリペプチド、たとえば分泌されたポリペプチド、又は受容体細胞の分泌路において機能するポリペプチドの生成のために特に好ましい。分泌されたポリペプチド、たとえば酵素の好ましい例は、上記に言及される。プラスミド及びDNA構造体の構成最終観点においては、本発明は、oriT又はその機能的部分もしくは類似体を含んで成る天然に存在しないプラスミドに関する。プラスミドはさらに、プラスミドに感温性を付与するDNA配列、及び注目のポリペプチド、特に、上記で定義されるようなトランスロケートされるポリペプチドをコードするDNA配列を含んで成る。本発明の方法において正しく機能するよう、トランス作用性要素、たとえばor f-βが、調節DNA配列（たとえばプロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位、等）に作用可能に連結され、遺伝子の転写及び翻訳を確保すべきであることが理解されるであろう。たとえば、前記遺伝子の後に、適切なプロモーター、たとえば自然において、前記遺伝子に関連していることが見出されているプロモーター、より好ましくは、前記遺伝子からの強い転写を確保するプロモーターが存在すべきである。さらに、orf-β配列の前に特別なプロモーターを挿入することが好都合である。たとえば、orf-βの前へのＢ．アミロリクエファシエンス α−アミラーゼプロモーター及びその天然のプロモーターの挿入は、有意に改良されたトランスファー頻度をもたらすことが見出された。特別な又は他のプロモーターとして挿入され得る他の強いプロモーターの例は、バシラスリケニホルミス α−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バシラスステアロサーモフィラスマルトゲニックアミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、等を包含する。本発明の方法に使用されるDNA構造体及びプラスミドは、一連の遺伝子操作を使用する方法、及び当業界において知られている酵素により合成され得る。材料及び方法細菌株及びプラスミド：ドナー株：Ｂ．スブチリス培地及び増殖条件：接合方法は、Koehler and Thorne（文献１）により記載される方法の変法である。すべての細菌株は、適切な場合、Ｄ−アラニン（50μｇ／ｌ）及び抗生物質により補充されたLB寒天プレート（Maniatis，T.など.，198 2、文献５）上で通常、増殖された。（好アルカリ性株の良好な増殖のためには、LB培地は50mMのNaHCO₃により緩衝され得た）。新しく製造された一晩の培養物が、接合のために使用された。接合：ドナー及び受容体株の一晩の培養物（14〜24時間）を、LB＋Ｄ−アラニンプレートに移し、そして個々の株の５〜10のコロニーを含む接種物を混合した。株の混合の後、細胞をプレート上に広げた。その接合体を30〜37℃で少なくとも４時間インキュベートした。その接合体プレートを選択プレート（適切な抗生物質を有するが、しかしＤ−アラニンを有さないLB寒天）に複製し、又は細胞を LB培地に再懸濁し、そして選択培地上に10⁵までの希釈度で広げた。それらのプレートから、接合体を30〜37℃での１〜２日後に評点を付け、そしてさらに、選択プレート上で精製した。残るプレートは、選択プレート（適切な抗生物質を有するが、しかしＤ−アラニンを有さないLB寒天）に複製され、又は細胞はLB培地に再懸濁され、そして選択プレート上に10⁵までの希釈度で広げられた。それらのプレートから、接合体を、30〜37℃での１〜２日後に評点をつけ、そして選択培地上でさらに精製した。例１構成によるこの遺伝子の供給のために有用なベクターは、pMOL553である。このプラスミドを、２種の段階で構成した。段階１ BamHＩ部位を、cat遺伝子のすぐ上流のpHV1248のトランスポゾン（Petit，M.- A.，Bruand，C.，Janniere，L.Ehrlich，S.D.（1990）Tn10-drived transposons active in Bacillus subtilis，J.Bacteriol.，172:6736-6740）中に導入した。そのBamHＩ部位を、前に記載されたPCRに基づくSUE技法(Horton，R.M.など．（1989）Gene，pp.61-68)の使用により挿入した。２種の別々のPCR反応を、鋳型とてpHV1248プラスミドを用いて実施した。第１のPCR反応のためのオリゴは、プライマー１：CCCACTGGATCCAATTTTCGTTTGTTG(配列番号１)、及びプライマー２：G CAAATTGATCCAAGAGAACCAAC（配列番号２）であった。フライマー１における下線の塩基は、BamHＩ部位の位置を示す。第２のPCR反応は、プライマー３：CAACAAACGAAAATTGGATCCAGTGGG(配列番号３)及びプライマー４：GCACATCATCATCATAAGC(配列番号４)に基づかれた。両PCR 反応を、変性段階で96℃、アニーリング段階で55℃及び延長段階で72℃の温度を用いて標準の方法により実施した。両フラグメントをアガロースゲルから精製し、そしてそれぞれ500ngを次の第２の５サイクルPCR反応のために使用した：96℃ で２分間、50℃で５分間、及び72℃で１分間、プライマー２及びプライマー４(1 00ｐモル)を96℃で添加し、そして次の第３の25サイクルPCR反応を開始した：95 ℃で30秒、55℃で30秒及び72℃で90秒。1330bpの最終PCRフラグメントを、HindI IIにより消化し、そしてHindIII消化されたpHV1248中にクローン化し、プラスミドpMOL610を得た。連結混合物を用いて、Ｅ．コリSJ2(Diderichsenなど.，1990 ，J.Bacteriol．172，4315-4321)を形質転換した。pMOL610におけるBamHＩ部位の位置を、制限消化により確かめた。段階２ー領域を、BamHＩ制限部位（下線）を有するプライマー５：CCGGCGGATCCAAGGGGT GA TCG（配列番号５）及びプライマー６：GGGGTACTAGTAACCCGGGCCCGGCGTAGAGGA TCC ATACACAAA(配列番号６)を用いて、PCRによりpSX222(WO 92／11357)プライマーから増幅した。PCR反応を次のようにして実施した：96℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で120秒。20サイクルの後、PCRフラグメントをBamHＩにより消化し、精製し、そしてpMOL610のBamHＩ部位中にクローン化した。クローニングを、制限消化物、及びＢ．スブチリス（たとえばDN1885 株(Diderichsenなど.，1990，J.Bacteriol．172，4315-4321)又はこの株のプロテアーゼ欠失誘導体）における明確なプロテアーゼ表るベクターは、pMOL553である。の構成 pLS20又はその誘導体によるプラスミドpUB110の移動化は、記載されており、そしていくらか詳細に分析されている（Koehler，T.M．and Thorne，C.B．(1987 )．Bacillus subtilis（natto）plasmid pLS20 mediates interspecies plasmid transfer．J.Bacteriol.，169，5271-5278;Selinger，L.B.，McGregor，N.F.， Khachatourians，G.G．and Hynes，M.F．(1990)．Mobilization of closely rel ated plasmids pUB110 and pBC16 by Bacillus plasmid pXO503 requires trans -acring open reading frame β．J.Bacteriol.，172，3290-3297）。動するためにそれらのプラスミドからの要素を使用した。 pUB110の移動化は、5’側のorfβに位置するシス作用性領域（oriT）に依存する(Selingerなど.，1990)。pUB110配列の位置1020から位置1575まで延長する、p UB110からの555bpのセグメントを、次のプライマーLWN5232及びLWN5233を用いて PCR増幅した： LWN5232: 5’-GTCGGAGCTCATTATTAATCTGTTCAGCAATCGGGC-3’（配列番号７） LWN5233: 5’-GTCGGAGCTCTGCCTTTTAGTCCAGCTGATTTCAC-3’（配列番号８）。増幅されたフラグメントをSacＩにより消化し、そして初めに、Ｅ．コリプラスミド(pUC19誘導体)のSacＩ部位中にクローン化した。続いて、そのフラグメントを、SacＩを用いて再び切除し、そして前に記載されたプラスミドpMOL553におけるユニークSacＩ部位中にクローン化した。その連結混合物を用いて、Amp耐性Ｅ．コリSJ2を形質転換した。得られるプラスミドは、pMOL553-oriTである。を含む接合体ドナー株の構成プラスミドpLS20及びpBC16を、Ｂ．スブチリス株PSL1 UM13からの接合により、種々のバシラス受容体株中にトランスファーした（Koehler and Thorne，1987 ）。 DN1280は、dal遺伝子に欠失を含む、Ｂ．スブチリス168の誘導体である(Dider ichsen，B．(1986)．A genetic system for stabilization of clonced genes i n Bacillus subtilis，p.35-46．In A.T.Ganesan and J.A.Hoch(eds.)，Bacillu s molecular genetics and biotechnology applications．Academic Press，Inc .，New York)。DN1280をコンピテントにし、そして30℃でエリトロマイシン耐性（５μｇ／ml）を有するプラスミドpHV1248により形質転換した。その得られる株を、PSL1 UM13との接合において受容体として使用した。両株を、リン酸塩(0. 01ＭのK₃PO₄)、グルコース(0.4％)、スターチ(0.5％)及びＤ−アラニン(100μｇ／ml)により補充されたLBプレート上で混合し、そして30℃で５時間インキュベートした。次に、プレートを上記のようにしてLBプレート（さらに、エリトロマイシン（５μｇ／ml）及びテトラサイクリン（５μｇ／ml）を含む）上にレプリカプレートした。レプリカプレート上に出現する単一のコロニーを、Ｂ．スブチリスDN1885中に pBC16をトランスファーするそれらの能力についてアッセイした。接合を、上記のようにして、LBプレート上での前記株の混合及び30℃での５時間のインキュベーションにより実施した。レプリカプレートを、テトラサイクリン（５μｇ／ml）を含むが、しかしＤ−アラニンを含まないLBに対して行なった。Ｄ−アラニンの欠失は、dal^-ドナー株を効果的に、逆選択する。アッセイされた少数のコロニーは、DN1885中にTet^Rマーカーをトランスファーすることができた。これは、それらのコロニーが、pBC16の他にpLS20を有することを示す。１つのそのようなコロニーを、テトラサイクリン（５μｇ／ml）及びＤ−アラニン（ 100μｇ／ml）を含む液体TY培地において50℃で増殖し、次いで、テトラサイクリン（５μｇ／ml）及びＤ−アラニン(100μｇ／ml)を含むLB上にプレートし、そしてそれぞれ、Ｄ−アラニン(100μｇ／ml)及びエリトロマイシン（５μｇ／m l）又はクロラムフェニコール（６μｇ／ml）を含むLB上にレプリカプレートした。テトラサイクリン耐性で、エリトロマイシン及びクロラムフェニコール感受性の単離物を、PP289-5として維持した。dal^-であり、そしてpLS20及びpBC16を含むこの株を、pUB110 oriTを含むプラスミドの種々の受容体株中へのトランスファーを可能にする接合ドナー株として使用することができる。従って、PP289-5をコンピテントにし、そしてpMOL553，pMOL553-oriTのoriT含有誘導体により形質転換した。プラスミドを、Ｅ．コリSJ2のプールされた形質転換体から調製し、そしてそのプラスミド混合物によりPP289-5を形質転換し、Ｄ−アラニン(100μｇ／ml)を含むLBプレート上でテトラサイクリン（５μｇ／m l）、クロラムフェニコール（６μｇ／ml）及びエリトロマイシン（５μｇ／ml ）に対する耐性を選択した。形質転換体を再びプールし、そしてそのプールを、上記方法を用いて、結合によりpMOL553-oriTをDN1885中にトランスファーするために使用した。最終的に、トランス接合体におけるプラスミドの本体を、制限マッピングにより確かめ、そして正しいプラスミドを保持した（pMOL553-oriT）。 pMOL553-oriTを用いて、PP289-5を再び使用するために再形質転換した。Ｄ）好アルカリ性バシラス株中へのアルカリプロテアーゼ遺伝子の接合トランスファー PP289-5含有pMOL553-oriTを、バシラスレンタスから単離されラスレンタス株C360（Annstrup，K.，Outtrup，H.，Andresen，O.，Dampmann ，C．（1972）Proteases from alkalophilic Bacillus species，P.299-305．In Proceeding og the fourth international symposium on fermentation techno logy．Society of fermentation technology，Osaka，Japan）中にトランスファーするための接合ドナー株として使用した。ドナー株PP289-5／pMOL553-oriTの１日目の細胞を、50μｇ／mlのＤ−アラニン、５μｇ／mlのエリトロマイシン及び５μｇ／mlのテトラサイクリンにより補充されたLBプレートから収穫した。受容体株（C360）を、LB9プレート（LB9＝0. 05ＭのHNa₂CO₃／H₂NaCO₃によりpH9に緩衝されたLBプレート）から収穫した（１日目の細胞）。受容体及びドナー株を、50μｇ／mlのＤ−アラニンにより補充されたLBプレート上で混合し、そして30℃で５時間インキュベートした。次に、プレートを、５ μｇ／mlのエリトロマイシンにより補充されたLB9上にレプリカプレートした。レプリカプレート上に出現する単一のコロニー（30℃で２日後）を、５μｇ／ml のエリトロマイシンにより補充されたLB9プレート上で再単離した。（選択プレートにおけるＤ−アラニンを削除することによって、dal⁺ドナー株を殺害し、そして移動性pMOL553-oriTプラスミドを含むＢ．レンタス受容体のみが生存するであろう）。Ｂ．レンタスのいくつかのトランス接合体におけるプラスミドを単離し、そして制限マッピングが、pMOL553-oriTプラスミドのＢ．レンタス中へのトランスファーを確かめた。例２新規bac-1ドナー株の構成 dal遺伝子を、バシラス・スブチリス株1A758（Bacillus Stock Center，Colum bus，Ohio）から欠失せしめ、接合に続く株に対する逆選択を可能にした。バシラススブチリス株1A758は、ジペプチド抗生物質バシリシンを合成するその細菌の能力を排除する、“bac-1”遺伝子座における突然変異を有する。細菌染色体上で野生型dal遺伝子と交換され得る、dal遺伝子の欠失された部分を、インビトロで構成した。dal遺伝子の５’及び３’側部分を、前記遺伝子の５’部分（ヌクレオチド19−419、ATGコドンのＡは＋１である）をPCR増幅するために使用されるオリゴ１及び２を用いてのPCRによりクローン化し、そしてオリゴ３及び４を、前記遺伝子の３’部分（ヌクレオチド618−1037）をPCR増幅するために使用した。オリゴ１：5’-GAGCTCACAGAGATACGTGGGC-3’ （配列番号９）オリゴ２：5’-GGATCCACACCAAGTCTGTTCAT-3’ （配列番号10）オリゴ３：5’-GGATCCGCTGGACTCCGGCTG-3’ （配列番号11）オリゴ４：5’-AAGCTTATCTCATCCATGGAAA-3’ （配列番号12）。両PCR生成物を、TA Cloningキット（Invitrogen，Corp.，San Diego，CA）を用いてpCRIIベクター中にクローン化した。クローン化した後すぐに、２つの半部分を、両フラグメントに共通するBamHＩ部位を用いることによってインビトロで組合し、NotＩ−HindIIIフラグメント(NotＩ部分はベクターリンカーの一部である)として pCRIIベクターから便利に除去され得る、中間部に約200bpの欠失を有する部分da l遺伝子(Δdal)を生成した。２種の異なった方法を用いて、dal-bac-Ｉドナー株を生成した。最初の方法は、dal遺伝子コード配列中にcat遺伝子を挿入することによる遺伝子破壊の創造を包含した。cat発現カセットを、pCRII−ΔdalプラスミドのBamHＩ部位中にクローン化した。この構成は、次の態様での二重交差を通して細菌染色体中に導入された：プラスミドをScaＩにより線状化し、そしてそれを用いて、接合プラスミドpXO503を含むbac-Ｉ株を形質転換し、それをＤ−アラニン(0.1mg／ml)及びクロラムフェニコール（５μｇ／ml）を含むTBAB（トリプトン血液寒天基材）上でのクロラムフェニコール耐性に対して選択した。クロラムフェニコーム耐性を獲得する細菌細胞のための唯一の手段は、線状プラスミドDNA及び染色体のcat遺伝子を両端に有するdal配列間に生じる二重交差であり、これにより、cat発現カセットを含む破壊されたdal遺伝子を導入する。この方法は、株バシラススブチリスBW97，bac-Ｉ，Δdal::cat接合熟成ドナー株を生成した。第２の方法は、“標識されていない”ドナー株（耐杭生物質マーカーがdal遺伝子中に挿入されていない）を構成するために使用された。この場合、二重交差現象を直接的に選択する代わりに、２種の別々の単一の交差が、欠失された“標識されていない”dal遺伝子を細菌染色体中に導入するために実施された。これは次の通りにして達成された：欠失されたdal遺伝子（上記で説明された）を、感温性プラスミドpE194^TSのNotＩ−HindIII部位中にクローン化し、それを用いて、bac-Ｉ株を形質転換し、そして34℃の許容温度で増殖せしめた。第１の交差（染色体上のdal遺伝子中へのdal欠失プラスミドの組込み）を得るために、前記性質転換された株を、Ｄ −アラニン(0.1mg／ml)（dal遺伝子を染色体破壊物中に組込む場合、細胞増殖のために必要とされる）及びエリトロマイシン（５μｇ／ml）を含むTBABプレート上に画線培養し、そして45℃の非許容温度で一晩増殖せしめた。大きなコロニーを、同じ条件下で再画線培養し、染色体上のdal遺伝子中に組込まれた感温性プラスミドを含む細胞の均質集団を生成した。非許容温度で、染色体に前記プラスミドを含む細胞のみが、前記プラスミドは複製できなかったので、エリトロマイシン上で増殖することができた。第２の交差現象(dal遺伝子の欠失された部分の後に残る、染色体からのプラスミドの切除をもたらす)を得るために、ループいっぱいの細胞を、Ｄ−アラニン(0.1mg／ml)により補充されたLuriaブイヨン20ml に移し、そして第２交差現象の複製及び発生の起点の機能を可能にするために34 ℃の許容温度で、選択を伴わないで後期対数相まで増殖した。細胞を４回以上、移し（個々の移行当たり１／100の希釈度）、染色体からのプラスミドの切除及び前記集団からのプラスミドの分離を可能にした。最終的に、細胞を、Ｄ−アラニン(0.1mg／ml)により補充されたTBABプレート上に、34℃で単一コロニーのためにプレートし、そしてＤ−アラニン(0.1mg／ml)を有さないTBABプレート上にレプリカプレートし、そしてＤ−アラニン(0.1mg／ml)及びエリトロマイシン（５μｇ／ml）を有するTBABプレート上にレプリカプレートし、dal^-及びerm⁵であるコロニーを評価した。50のコロニーのうち２つのコロニーがこの表現型を生成した。得られる株を、バシラススブチリスBW96と命名した。次に、プラスミド pSJ2662（非必須領域中に挿入されるポリリンカーを有するpUB110）を導入し、d alΔ bac-1，Kan^r株BW104を生成した。接合プラスミドpXO503を、ドナー株としてBW100を用いての接合によりこの株中に導入し；トランス接合体を、Ｄ−アラニン＋エリトロマイシン（５ μｇ／ml）＋カナマイシン（10μｇ／ml）を有するTBAB上での増殖についての選択により評価した。これは、pXO503及びpSJ2662を含む“標識されていない”ドナー株BW105:bac-1，dalΔを生成した。ドナー株BW101(pXO503のみを有するdal欠失株)を、まず、BW96中にtsレプリコンpPL254-tetを導入し、dal欠失されたbac-1，tet^r株BW99を生成することによって構成した。接合プラスミドpXO503を、ドナー株としてBW97を用いての接合によりこの株中に導入し；接合体を、TBAB＋Ｄ−アラニン＋エリトロマイシン（５μ ｇ／ml）＋テトラサイクリン（10μｇ／ml）上での増殖について選択することによって評点を付けた。これは、pXO503及びpPL2541-tetを含むドナー株BW100:bac -1，dalΔを生成した。最終的に、この株を45℃の非許容温度で一晩増殖し、そして34℃の許容温度で、TBAB＋Ｄ−アラニン上で、単一のコロニーのためにプレートした。次に、コロニーを、TBAB＋Ｄ−アラニン＋テトラサイクリン（10μｇ／ml）プレート及びTBAB＋Ｄ−アラニン＋エリトロマイシン（５μｇ／ml）上にプレートし、erm^r及びtet⁵であるコロニーを固定し；この表現型を示すいくつかのコロニーを同定し、その１つを貯蔵し、そしてBW101を命名した。Ａ）Ｂ．アミロリクエファシエンス株中への接合株BW105を、Ｂ．アミロリクエファシエンス（及び陽性対照としてのＢ．スブチリス168）中へのpSJ2662の移動能力について試験し；このドナーを同等の野生型ドナー株MT105に比較した。ドナー及び受容体の両者を、２mlのＬブイヨン＋Ｄ−アラニン＋グルコース(0.2％)において、中間の対数相まで増殖した。１ml のドナー及び受容体を混合し、そして遠心分離、ペレットを残留ブイヨン100μ ｌに再懸濁し；次に、その50μｌを、TBAB＋Ｄ−アラニン＋グルコースのプレート上にスポットした。それらを37℃で５時間インキュベートし；細胞をプレートから剥ぎ取り、そして１mlのＬブイヨンに移し、そしてTBAB＋ネオマイシン（10μｇ／ml）プレート上でトランス接合体を及びプレーンのTBABプレート上で生存細胞について力価した。両ドナーは、pUB110レプリコンをＢ．スブチリス（10^-3〜10^-4）中に比較的高い効率で移動せしめた。しかしながら、ba c-1ドナー株は、MT105ドナー（＜10^-7）に比較して、pUB110のＢ．アミロリクファシエンス株（〜10^-5）中への移動で、より良好であった(100倍以上)。Ｂ）Ｂ．レンタス株165-2中への接合 dal遺伝子にcat挿入を有するbac-1ドナー株BW97（bac-1，dalΔ::cam^r）を、プラスミドpCm::Nmにより形質転換した。Bacillus Genetic Stock Centerから得られたこのプラスミドは、cat遺伝子5’及び3’側部分を両端に有するneo耐性遺伝子を含む。このプラスミドによる形質転換は、neo遺伝子によりdal遺伝子におけるcat遺伝子を置換することができる。このプラスミドによる形質転換は、数百のneo耐性コロニーをもたらした。このプラスミドはpE194レプリコン上に存在するので、その形質転換体の１つを非許容温度（45℃）で増殖せしめ、相同組換えを通して染色体におけるプラスミドを組込んだ。この株を、約20の世代の間、許容温度（34℃）で増殖し、次に、TBAB＋neo上にプレートした。30のneo耐性コロニーのうち、２つのコロニーがクロラムフェニコール感受性であり、これはne o遺伝子によるcat遺伝子の置換を示す。次に、この株BW98（bac-1，dalΔ::neo^r ）を、neoの代わりにcat遺伝子を有するpUB110であるプラスミドpMOL913により形質転換した。クロラムフェニコール耐性コロニーを、ドナー株(BW106)として選択し、そしてbac＋同当物(MT101／pMOL913)と比較した。接合を上記のようにして行なった。すべての接合はpH7で行なわれた。古いドナーにより得られたトランス接合体の数は実験当たり約10〜100であり、そして新規のドナーを用いれば、約10³〜10⁴個のトランス接合体が得られた。選択をpH7で行ない、そしてすべてのトランス接合体を、pH9での増殖する能力について試験し、すべては増殖し、これは、それらがＢ．ランタスであることを示す。 pUB110(MT105)を含む古いドナー株を、Ｂ．レンタスとの接合において用いる場合、pH7でのネオマイシン耐性について選択するトランス接合体は得られなかった。同等の新規ドナー株を用いる場合、pH7でのネオマイシン耐性について選択する合計約10³個のトランス接合体が得られたが、ドナーのみ又は受容体のみをプレートする場合、コロニーは得られなかった。すべてのそれらのコロニーは pH9で増殖し、これは、それらが正しいことを確証した。Ｃ）減じられた殺害能力を有するＢ．スブチリス変異体の単離Ｂ．スブチリスのbac-1変異体株がＢ．アミロリクエファシエンス受容体細胞の殺害をほとんど排除したとしても、いくつかの他のバシラス種、たとえばＢ．メガテリウムの検出できる殺害がまだ存在し、これは他の抗微生物剤が生成されることを包含する。次に、従来の突然変異誘発スケムによりそれらの他の要因を “ノックアウトする”ことが可能であることが示されており；それによれば、１又は複数の突然変異とbac-1変異体とをたぶん組合し、そしてより良好なドナー株を生成することである。突然変異誘発プログラムを、追加の変異体を得るために取り；野生型ドナー株MT101の細胞を、化学的突然変異誘発剤EMSにより突然変異誘発した（突然変異誘発の他の形、たとえばNTG，UV及びトランスポゾン標識がまた使用され得た）。Spizizen'sI培地＋Ｄ−アラニンにおいて増殖されたMT1 01の一晩の培養物0.5mlを用いて、側部装備されたKlettフラスコにおける同じ培地20mlを接種した。細胞を、37℃で振盪しながら、70Klett 単位まで増殖し、そして室温で遠心分離した。細胞ペレットを、12mlのSpizizen 塩＋2.5mlの１Ｍのトリス（pH7.4）に再懸濁した。ｔ₀サンプルのために、２ml のアリコートを、18mlのVY培地＋Ｄ−アラニンに移し、そして37℃で一晩、振盪した。残りに、30μｌのEMSを添加し、そして細胞を37℃で振盪し；２mlのアリコートをｔ₁(１時間)，ｔ₂(２時間)及びｔ₃(３時間)で取り、前記ｔ₀サンプルについての上記のようにして新鮮な培地に移した。一晩のインキュベーションの後、グリセロールを細胞に添加し、15％の最終濃度にし、滴定し、そして−70℃で、Revcoフリーザーに貯蔵し；その％生存率は、それぞれサンプルｔ₁，ｔ₂及びｔ₃に関して38，19及び0.1であった。ｔ₂サンプルを、変異体スクリーニングのために選択した。細胞を、TBAB＋Ｄ −アラニン上に、単一のコロニーのためにプレートし；次に、それらを、Ｂ．アミロリクエファシエンス受容体株（いづれかの“敏感な”株がインジケータとして使用され得る）の新しく広げられた培地上にレプリカプレートした。それらのプレートを34℃で一晩インキュベートし、そしてMT101ドナーコロニーのまわりの透明な領域について評点をつけ；可能性ある変異体は実質的に減じられたか、又は透明な領域は存在しなかった。６個の変異体を、試験された約1500個のコロニーから得；それらの１つである“mut1”をさらなる分析のために選択した。Ｂ．アミロリクエファシエンス及びmut1株の両者を、中間の対数相まで増殖し、それぞれ１mlを組合し、そして遠心分離によりペレット化し、細胞をブイヨン100 μｌに再懸濁し、そして50μｌをTBAB＋Ｄ−アラニンプレート上にスポットした。37℃で５時間のインキュベーションの後、細胞をプレート表面から剥ぎ取り、そして新鮮なＬブイヨン１mlに再懸濁し；生存体を、Ｄ−アラニンを欠くTBABプレート上にその希釈溶液をプレートすることによって滴定した。Killingは、野生型ドナーに比較して、実質的に減じられた（10,000倍）ことを見出した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．接合への使用のための修飾された細菌ドナー細胞であって、ｉ）注目のポリペプチドをコードするDNA構造体を含んで成るプラスミド、及びトランス作用性移動要素の存在下での接合による前記プラスミドのトランスファーのために必要とされる少なくとも１つのシス作用性DNA配列、並びにii）前記トランス作用性移動要素をコードする少なくとも１つのDNA配列を含み、ここで前記ドナー細胞が、受容体細胞集団を殺し、又はその集団の増殖を妨げる殺細菌物質の生成の、親細胞に対して減じられた能力を有することを特徴とするドナー細胞。２．前記ドナー細胞がバシラス細胞である請求の範囲第１項記載のドナー細胞。３．前記ドナー細胞が複数の異なった殺細菌物質の減じられた生産性を有する請求の範囲第１項記載のドナー細胞。４．前記ドナー細胞集団が殺細菌物質を実質的に生産することができない請求の範囲第１項記載のドナー細胞。５．前記殺細菌物質がバシリシン又はスブチロシンである請求の範囲第１項記載のドナー細胞。６．前記バシラス細胞が好アルカリ性バシラスから成る群から選択される請求の範囲第２項記載のドナー細胞。７．前記バシラス細胞が産業用バシラスの細胞である請求の範囲第２項記載のドナー細胞。８．前記ポリペプチドが、トランスロケートされるポリペプチドである請求の範囲第１項記載のドナー細胞。９．前記トランスロケートされるポリペプチドが、分泌されるポリペプチド又は分泌細胞の分泌路のポリペプチドである請求の範囲第８項記載のドナー細胞。 10．前記分泌されるポリペプチドが、酵素であり、そして前記分泌ポリペプチドがPrsAである請求の範囲第９項記載のドナー細胞。 11．さらに栄養要求性である請求の範囲第１項記載のドナー細胞。 12．アミノ酸に対する栄養要求性である請求の範囲第11項記載のドナー細胞。 13．前記トランス作用性移動要素をコードするDNA配列が、第２プラスミド上に、又はドナー細胞のゲノムに存在する請求の範囲第１項記載のドナー細胞。 14．前記シス作用性要素が、oriT又はその機能的類似体である請求の範囲第１項記載の方法。 15．前記トランス作用性要素が、orf-β又はその機能的類似体である請求の範囲第１項記載の方法。 16．前記接合性プラスミドがpLS20、又はpLS20の接合性能力を保持しているその誘導体である請求の範囲第１項記載の方法。 17．前記シス作用性配列を有するプラスミドが、治すことができる(curable) プラスミドである請求の範囲第１項記載の方法。 18．注目のポリペプチドをコードするDNA構造体を、バシラスsp.の細胞中に導入するための方法であって、ｉ）前記DNA構造体を含んで成るプラスミド、及びトランス作用性移動要素の存在下での接合による前記プラスミドのトランスファーのために必要とされる少なくとも１つのシス作用性DNA配列、並びii）前記トランス作用性移動要素をコードする少なくとも１つのDNA配列を有する細菌ドナー細胞集団、及びバシラスsp.受容体細胞集団が、前記ドナー細胞集団から接合により受容体細胞集団への前記プラスミドのトランスファーを可能にする条件下で混合され、ここで前記ドナー細胞が、受容体細胞集団を殺し、又はその集団の増殖を妨げる殺細菌物質の生成の、親細胞に対して減じられた能力を有することを特徴とする方法。 19．前記ドナー細胞が、バシラス細胞である請求の範囲第18項記載の方法。 20．前記ドナー細胞が、好アルカリ性バシラスsp.及び／又は産業用バシラスs p.である請求の範囲第19項記載の方法。 21．興味あるポリペプチドをコードするDNA構造体を有するバシラスsp.の細胞を構成するための方法であって、ｉ）前記DNA構造体を含んで成るプラスミド、及びトランス作用性移動要素の存在下での接合による前記プラスミドのトランスファーのために必要とされる少なくとも１つのシス作用性DNA配列、並びにii）前記トランス作用性移動要素をコードする少なくとも１つのDNA配列を有する栄養要求性細菌ドナー細胞集団、及び標識されていないバシラスsp.受容体細胞集団が、前記栄養要求ドナー細胞集団から接合により標識されていない受容体細胞集団への前記プラスミドのトランスファーを可能にする条件下で混合され、そして前記ドナー細胞の栄養要求性質が受容体細胞について選択するために利用され、ここで前記ドナー細胞が、受容体細胞集団を殺し、又はその集団の増殖を妨げる殺細菌物質の生成の、親細胞に対して減じられた能力を有することを特徴とする方法。 22．前記栄養要求性ドナー細胞がdal^-である請求の範囲第21項記載の方法。 23．注目のポリペプチドをコードするDNA構造体をバシラスsp.の細胞中に導入するための方法であって、ｉ）前記DNA構造体を含んで成る治すことができる(curable)プラスミド、及びトランス作用性移動要素の存在下での接合による前記プラスミドのトランスファーのために必要とされる少なくとも１つのシス作用性DNA配列、並びにii）前記トランス作用性移動要素をコードする少なくとも１つのDNA配列を有する細菌ドナー細胞集団、及びバシラスsp.受容体細胞集団が、前記ドナー細胞集団から接合により受容体細胞集団への前記プラスミドのトランスファーを可能にする条件下で混合され、ここで前記ドナー細胞が、受容体細胞集団を殺害し、又はその集団の増殖を妨げる殺細菌物質の生成の、親細胞に対して減じられた能力を有することを特徴とする方法。 24．請求の範囲第１項記載のドナー細胞を製造するための方法であって、親のバシラス細胞を突然変異誘発にゆだね、そして親細胞よりも、受容体細胞の低い程度の殺害を示すか、又は受容体細胞の殺害を示さない突然変異細胞についてスクリーニングすることを含んで成る方法。