RU2023723C1 - Способ получения сериновой протеазы, штамм щелочефильных bacillus-продуцент сериновой протеазы - Google Patents
Способ получения сериновой протеазы, штамм щелочефильных bacillus-продуцент сериновой протеазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2023723C1 RU2023723C1 SU884356848A SU4356848A RU2023723C1 RU 2023723 C1 RU2023723 C1 RU 2023723C1 SU 884356848 A SU884356848 A SU 884356848A SU 4356848 A SU4356848 A SU 4356848A RU 2023723 C1 RU2023723 C1 RU 2023723C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacillus
- serine protease
- alkaline
- strain
- protease
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Использование: микробиологический способ получения фермента, а именно получение сериновой протеазы рекомбинантной технологией. Сущность изобретения: способ получения сериновой протеазы предполагает культивирование штамма щелочефильных Bacillus РВ 92, трансформированных рекомбинантной плазмидой ДНК pMAX 4, выделение и очистку целевого продукта. Трансформацию штамма осуществляют путем обработки штамма лизоцимом в щелочной среде при 20 - 37°С, отделения образовавшихся протопластов от лизоцима, объединения протопластов с рекомбинантной плазмидной ДНК при той же температуре в присутствии реагента для смещения, регенерации клеток штаммов и выращивания регенерированных клеток в селективных условиях. 1 табл., 2 ил.
Description
Изобретение относится к получению сериновой протеазы Bacillus c применением технологии рекомбинантных ДНК.
Бактериальные сериновые протеазы могут быть получены из многих прокариотических организмов, включая грамотрицательные организмы, такие как виды Serratia или Pseudomonas, и грамположительные бактерии, такие как виды Micrococcus и Bacillus. В группу промышленно важных сериновых протеаз, представляющих исключительный интерес, входят те протеазы, которые имеют высокую активность в щелочных средах. В то время как промышленные сериновые протеазы вырабатываются различными видами, включая B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. alcalophilus и другие виды Bacillus, высокощелочные протеазы в основном вырабатываются штаммами Bacillus, которые способны к росту при щелочном рН. Примером такой бациллы служит Bacillus novo species PB 92.
Существует значительный интерес к разработке штаммов бацилл, способных вырабатывать протеолитические ферменты с большим выходом, в частности высокощелочные протеазы.
Были успешно клонированы гены, кодирующие сериновую или щелочную протеазу B. subtilis (Wong et. al., Proc. Natl Acad. Sci USA 81, 1984, 1184), B. licheniformis (Jacols et. al. Nucleic Acids Res. 13, 1985, 8913) и B. amyloliquefaciens (wells et. al. Nucleic Acids Res 13, 1985, 8913) и B. amyloliquefaciens (wells et. al. Nucleic Acids Res, 11, 1983, 7911).
Производство промышленных сериновых протеаз в различных видах Bacillus известно из патентов США NN 3674643; 3723250 и 4480043. Производство высокощелочного протеолитического фермента в штаммах Bacillus, способных к росту при щелочном рН, описано, например, в патентах США NN 3723250; Re 30602 и 4480037.
Удобный вектор для трансформации клетки Bacillus включает структурный ген, кодирующий высокощелочную протеазу, получаемый щелочефильной Bacillus, содержащей контролирующие районы, такие как последовательность промотора, последовательность, образующая участок связывания с рибосомами, и последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции гена щелочной протеазы, причем перечисленные контролирующие участки являются функциональными в хозяйской клетке щелочефильной Bacillus.
Кроме того, вектор может содержать маркерный ген, например, для придания устойчивости к антибиотику, к которому хозяйский штамм чувствителен (особый интерес представляет устойчивость к неомицину), и origin репликации, который способен автономно реплицироваться в хозяйской клетке. Origin репликации может быть таким, который имеет мутацию, делающую его функционирование в хозяйской клетке температурочувствительным, таким образом обеспечивая селекцию на хромосомальное встраивание.
Для производства высокощелочной протеазы предпочтительной последовательностью ДНК для использования в трансформации штаммов Bacillus, которые продуцируют сериновую протеазу, является последовательность, полученная из Bacillus novospecies PB 92. Аминокислотная последовательность сериновой протеазы, кодируемая указанной последовательностью ДНК, следующая:
15 H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A- V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V- K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L- S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- 20 S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S- Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S- M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N- T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
15 H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A- V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V- K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L- S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- 20 S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S- Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S- M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N- T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
Хотя предпочтительным штаммов для обеспечения гена протеазы является вид Bacillus PB 92, такая же сериновая протеаза может быть получена из других щелочефильных бацилл. Гены протеаз - гомологичные по крайней мере на 70% и предпочтительно свыше 80% к гену Bacillus PB 92.
Желательно, чтобы продукт эксперсии секретировался. Так как щелочная протеаза секретируется, могут быть использованы секреционные лидерные сигналы и сигналы процессинга дикого типа. Кроме того, может быть получен слитый ген путем придания 5' -последовательности структурному гену, кодирующему секреторный лидерный сигнал и сигнал процессинга. Характерные гетерологичные секреторные лидерные последовательности включают секреторные лидерные последовательности генов амилазы и протеазы Bacillus. В зависимости от того, желательно ли встраивание структурального гена в хромосому хозяйского штамма либо поддержание его во внехромосомальном элементе, репликационная система Bacillus может быть включена или нет. С целью встраивания участки гомологии плазмидной конструкции с геномом Bacillus могут быть использованы для увеличения вероятности рекомбинаций. Более того, включение в плазмидную конструкцию температурочувствительного origin репликации позволяет проводить селекцию по хромосомальному встраиванию. Для увеличения экспрессии структурного гена в хозяйскую клетку может быть вставлено более одной копии структурного гена. Стабильная амплификация структурного гена может быть получена встраиванием по крайней мере одной добавочной копии структурного гена с геном хозяйской клетки и отбором трансформантов, в которых копии структурного гена разделены эндогенными хромосомальными последовательностями. Конструкции ДНК и способы для прокариотических систем известны из заявки N ЕР-А-87200356.
В качестве хозяина для трансформации может быть использован любой штамм Bacillus, однако при выборе подходящего штамма учитываются факторы, которые могут улучшить продукцию высокощелочных протеаз. Продукция может быть улучшена различными путями, включая хозяина, в котором снижена деградация желаемого продукта, узнавание регуляторных сигналов, облегчение секреции и т. д. Таким образом, хотя предпочтительным хозяином Bacillus является продуцент высокощелочной протеазы, в качестве хозяина также может быть использован мутант, который сам по себе не вырабатывает высокощелочную протеазу.
Бациллы, продуцирующие высокощелочную протеазу, таксономически недостаточно классифицированы и их обычно относят к щелочефильным штаммам Bacillus. Примеры штаммов Bacillus, способных расти при щелочном рН, известны из патентов США NN 3723250, Re 30602 и 4480037. Примером предпочтительного хозяйского штамма щелочефильного Bacillus является штамм Bacillus novo species PB 92, раскрытый наряду с другими в патенте США N Re 30602.
Промышленные штаммы щелочефильных Bacillus могут также быть использованы в качестве хозяйских клеток. Для промышленных штаммов Bacillus характерна устойчивость к генетическому обмену, такому как фаговая инфекция или трансформация. Эти штаммы стабильны и трансформанты могут быть или не быть способными к образованию cпор. Они обычно фототрофы и модифицированы для обеспечения высоких выходов эндогенных белковых продуктов, таких как альфа-амилаза и различные протеазы. Выход эндогенного белкового продукта, полученный в процессе промышленного производства, может доходить по крайней мере до 5 г/л/0,5% ( объем/вес ). Промышленные штаммы также секретируют ДНК-азы, которые приводят к деградации ДНК в среде, обеспечивая защиту от генетического обмена.
Трансформация щелочефильных штаммов Bacillus преимущественно включает использование протопластов упомянутых штаммов. Однако обычный способ трансформации протопласта не работает для щелочефильных штаммов Bacillus. Следовательно, должны быть разработаны дополнительные способы.
Для щелочефильных бацилл образование и регенерация протопластов может происходить при высоком рН, предпочтительно около рН 8. Протопласты могут быть приготовлены ресуспендированием клеток в щелочной буферной среде (АНМ - alkaline holding medium) pH 7,8-8,5 c последующей инкубацией в течение 30-80 мин при 37оС. В качестве примера АНМ см. пример 5. Полученные протопласты затем промываются для удаления лизоцима, затем ресуспендируются в АНМ. Далее в присутствии подходящего реагента для слияния, плазмидная конструкция и протопласт щелочефильного хозяина Bacillus объединяются. Хотя может быть использован любой реагент для слипания, который обеспечивает желаемую эффективность, обнаружено, что полиэтиленгликоль молекул веса 1000-8000 в значительной мере обеспечивает высокую эффективность слияния. Протопласты, приготовленные из акцепторного штамма Bacillus, смешиваются с плазмидной конструкцией в течение не более 5 мин, желательно не дольше 2 мин в присутствии полиэтиленгликоля. Смесь реагентов для слияния затем меняется обычной питательной средой, в которой клетки инкубируются в течение до 5 ч, предпочтительно 2-3 ч, перед переносом на регенерирующие чашки. Регенерирующие чашки содержат антибиотик, такой как неомицин, для отбора трансформантов.
Клоны с эписомальным поддерживанием конструкции ДНК могут быть идентифицированы путем обнаружения эксперссии высокощелочной сериновой протеазы. Для идентификации тех клонов, которые содержат экспрессирующую конструкцию в виде участка, встроенного в их хромосомы, клоны, которые получаются, скринируются путем выделения суммарной клеточной ДНК и отбора клонов, в которых может быть обнаружена свободная плазмидная ДНК, но маркерный ген плазмиды экспрессируется. Эти клоны затем можно скринировать подходящими способами для обнаружения экспрессии высокощелочной сериновой протеазы.
Различные методы обнаружения, включая использования специфических антител, ДНК- или РНК-гибридизацию, образование ферментного продукта или использование ферментного субстрата могут быть использованы для скринирования клонов с целью обнаружения присутствия экспрессирующей конструкции и экспрессии интересующего структурного гена, а именно производства протеазы. Производимая протеаза может быть охарактеризована биохимически, например, определением молекулярного веса протеазы с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, электрофореза в гис-тидин-MOPS геле и определением кинетических параметров Km и Vmax, определяемых на синтетическом субстрате suecinyl-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-p-nitro-analide.
Хозяин Bacillus, содержащий экспрессирующую конструкцию, включенную эписомально или хромосомально, затем выращивается на питательной среде в условиях, благоприятствующих синтезу фермента. Питательная среда обычно включает средства для поддержания плазмиды, такие как присутствие антибиотика, к которому чувствителен нетрансформированный хозяин. Ферментация может продолжаться пока не истощится бульон. Там, где продукт секретируется, он может быть выделен из бульона удобным способом, например экстракцией, хроматографией, электрофорезом или т.п. Там, где продукт остается в цитоплазме, клетки могут быть собраны центрифугированием, фильтрацией и т.д., лизированы механическим перетированием, детергентом, лизоцимом или другими методами и продукт может быть выделен, как описано ранее.
Когда нетрансформированная хозяйская клетка является продуцентом высокощелочной протеазы, посредством представленного метода могут быть достигнуты сильно увеличенные выходы высокощелочной сериновой протеазы, обычно по крайней мере 120% по сравнению с выходом в нетрансформированной хозяйской клетке с единственной внехромосомной копией гена.
На фиг.1 показаны результаты гистидин/MOPS гельэлектрофореза, проведенного с суспернатантами культур B. subtilis DB104, содержащими соответственно pUB110 и рМ 58 в сравнении с некоторыми субтилизации:
1 дорожка: субтилизин Carlsberg;
2 дорожка: протеаза Bacillus PB 92;
3 дорожка: субтилизин Bacillus subtilis;
4 дорожка: Bacillus subtilis ДВ 104 (рМ 58);
5 дорожка: Bacillus subtilis ДВ 104 (рИВ 110);
на фиг. 2 - рестрикционная карта плазмиды рМ 58: в верхней части показана стратегия секвенирования. Сплошные линии со стрелками представляют фрагменты, клонированные в векторах mp 10, mp 11 и mp 13 фага М 13, в нижней части - стратегия сиквенирования с использованием 10 олигонуклеитидов, локализованных через равные промежутки на гене протеазы.
1 дорожка: субтилизин Carlsberg;
2 дорожка: протеаза Bacillus PB 92;
3 дорожка: субтилизин Bacillus subtilis;
4 дорожка: Bacillus subtilis ДВ 104 (рМ 58);
5 дорожка: Bacillus subtilis ДВ 104 (рИВ 110);
на фиг. 2 - рестрикционная карта плазмиды рМ 58: в верхней части показана стратегия секвенирования. Сплошные линии со стрелками представляют фрагменты, клонированные в векторах mp 10, mp 11 и mp 13 фага М 13, в нижней части - стратегия сиквенирования с использованием 10 олигонуклеитидов, локализованных через равные промежутки на гене протеазы.
Нуклеитидная последовательность кодирующей цепи, соотнесенная с аминокислотной последовательностью сериновой протеазы Bacillus PB 92, показана ниже. Также показаны промоторы (Р1Р2), сайт связывания рибосом (rbs) и районы терминации (term). последовательности ДНК. Пронумерованные сплошные линии представляют место размещения десяти олигонуклеитидов, использованных для секвенирования (см.табл.1).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
П р и м е р 1. Приготовление библиотеки геномной ДНК из щелочефильного нового вида Bacillus PB 92 и выделение гена сериновой протеазы.
Громосомальная ДНК, выделенная из Bacillus novo sp. РВ 92 (хранится под N OR-60 в лаборатории микробиологии, Технический университет Дельфта, Нидерланды; патент США N Re 30602), была частично переварена рестрикционным ферментом San 3A и лигирована в Bam HI сайт плазмиды рИВ 110 (Gryczan et al., Y. Bacteriol 134, 1978, 313-329). Плазмида ДНК рИВ 110 была приготовлена как описано Birnoboim и Doly (Nucl. Acids Res, 7, 1979, 1513-1523).
Лигирующую смесь трансформировали в B. subtilis IA40. Генетический центр хранения бацилл по способу Spizizen et. al., I. Bacteriol 81 (1961) 741-746, используя 0,6-1 мкг ДНК на мл компетентных клеток. Клетки из трансформационной смеси высеивали на минимальные чашки, содержащие 2,8% K2HPO4, 1,2% KH2PO4, 0,4% (NH4)2SO4, 0,2% три-Na-цитрат˙ 2Н2О; 0,04% MgSO4
˙ 7H2O; 0,00005% MnSO4 ˙ 4H2O, 0,4% L-глутаминовой кислоты, 0,5% глюкозы, 0,02% казаминовых кислот, 50 мкг/мл триптофана, 20 мкг/мл метионина, 20 мкг/мл лизина, 20 мгк/мл неомицина, 0,4% казеина и 1,5% агара. После инкубации чашек в течение ночи при 37оС одна из 50000 колоний, устойчивых к неомицину, показала возросшую продукцию протеазы, что определили по увеличению преципитации ореола продуктов расщепления казеина вокруг колоний на пластинке агара. Плазмидная ДНК была выделена из этой колонии по способу, описанному birnboim и Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523 и обозначена рМ 58.
˙ 7H2O; 0,00005% MnSO4 ˙ 4H2O, 0,4% L-глутаминовой кислоты, 0,5% глюкозы, 0,02% казаминовых кислот, 50 мкг/мл триптофана, 20 мкг/мл метионина, 20 мкг/мл лизина, 20 мгк/мл неомицина, 0,4% казеина и 1,5% агара. После инкубации чашек в течение ночи при 37оС одна из 50000 колоний, устойчивых к неомицину, показала возросшую продукцию протеазы, что определили по увеличению преципитации ореола продуктов расщепления казеина вокруг колоний на пластинке агара. Плазмидная ДНК была выделена из этой колонии по способу, описанному birnboim и Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523 и обозначена рМ 58.
П р и м е р 2. Экспрессия гена сериновой протеазы РВ 92. Bacillus subtilis IA40, содержащая рМ 58, была выращена на минимальной среде (Spizizen et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 44 (1958) 1072-1078), к которой было добавлено 0,02% казаминовых кислот, 50 мкг/мл триптофана, 20 мкг/мл метионина, 20 мкг/мл лизина и 20 мкг/мл неомицина. Через 24 ч культуру центрифугировали и суспернатант проверяли на протеазную активность, используя в качестве субстрата диметилказеин Line et al., I. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793. Культура B. subtilis IA40, содержащая плазмиду рИВ 110, использованная в качестве контроля, показала меньше 1/60 протеазной активности, показанной культурой, трансформированной рМ 58. Протеазная активность полностью ингибировалась обработкой 1 мМ фенилсульфанилфлуоридом (РМ SF), но не 20 мМ ЭДТА.
Аликвоты супернатантов анализировались с помощью белкового геля по способу Laemmli, Nature 227 (1970) 680. Пробы для анализа на этих гелях были приготовлены обработкой супернатантов 5% -й трихлоруксусной кислотой (ТХУ). После центрифугирования образца осадок препитированного белка промывался дважды ацетоном, затем растворялся в 40 мкл буфера для образцов (0,5 М трис/HC pH 7,5; 10 об.% 2-меркаптоэтанола; 50 об.% глицерина и 0,05% бромфенолового синего) при кипячении в течение 10 мин. После электрофореза гели окрашивали, используя Кумасси бриллиантовый синий. Затем пробы супернатанта культур анализировались электрофорезом. Использовались три разных штамма B. subtilis IA40: штамм, содержащий рИВ 110, или рМ 58, или без плазмиды и протеаза Bacillus РВ92 в качестве контроля. После электрофореза гели окрашивали, используя Кумасси бриллиантовый синий, и отмывали. Образец из B. subtilis штамма IA40, содержащего рМ 58, включал белок весом 31 кДа, который мигрирует совместно с протеазой Bacillus PB92. Этот белок не обнаруживался в контрольной дорожке штамма B. subtilis IA40, содержащего рИВ 110.
Все сериновые протеазы имеют одинаковый молекулярный вес. Поэтому клонированная сериновая протеаза Bacillus PB 92 дифференцировалась от известных сериновых протеаз субтилизина B. subtilis, cубтилизина Carlsberg c помощью трансформации РМ 58 и ИВ 110 в беспротеазный штамм B. subtilis ДВ 104 (R. Doi, I. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) и анализа продуцируемой внеклеточной протеазы. Полученные трансформанты выращивались на минимальной среде (Spizizen et. al.), содержащей 0,02% казаминовых кислот, 50 мкг/мл гистидина и 20 мкг/мл неомицина. Через 24 ч были взяты образцы, центрифугированы и без дополнительной обработки анализированы с помощью гистидин/MOPS гелей, содержащих 75 мМ КОН; 40 мМ гистидин; 100 мМ MOPS [3-(11-морфолино)-пропансульфоновая кислота] , pH 7,5 и 5% полиакриламид. Электрофоретический буфер содержал 40 мМ гистидина, 100 мМ MOPS, pH 6,6. Образцы двигались по направлению к катоду. Полосы протеазы обнаруживались с помощью профессиональных пленок Agfa Pan 100. (Zuidweg et al., Biotechnol и Bioengin 14, 1972, 685-714). Эти результаты показаны на фиг.1. Как показано, рМ 58 несет ген, кодирующий протеазу Bacillus PB 92.
П р и м е р 3. Секвенирование гена сериновой протеазы Bacillus PB 92.
Полная последовательность BalIHpa1 фрагмента рМ 58 определена способом Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1977, 6469. Рестрикционные фрагменты рМ 58 (фиг. 2) были клонированы в векторах mp10, mp11 и mp18 фага М13 (Messing et. al., Nucleiе Acids. Res. 9, 1981, 309-321). Встраивания фрагментов м58 скринивали с помощью гибридизации бляшек. После секвенирования были сделаны десять олинонуклеотидов, локализованных через равные промежутки на гене, и было повторено секвенирование, которое подтвердило нуклеитидную последовательность кодирующей цепи.
П р и м е р 4. Конструирование плазмиды рМАХ-4, содержащей сериновую протеазу.
Для конструирования плазмиды pUCN 710 рИВ 110 была переварена TaqI и PVU II. Фрагмент, содержащий ген, придающий устойчивость к неомицину, был очищен с помощью низкоплавкой агарозы и затуплен полимеразой Кленова и НТФ (Matiatis, Molecular Cloning: A. Laboratory Manual. Cold Spring Harbor 1982). Плазмида рИС7 (Vieira et. al. Gene 19, 1982, 259-268) была линеаризована Sal 1 и затуплена, как описано выше. Оба фрагмента были лигированы Т4 лизазой (Maniatis) и трансформированы в E. Coli YMl 03. Отбор вели на 2хТV чашках (1,6 мас.%) объем бактотриптона; 1 мас.% (объем дрожжевого экстракта; 0,5% NaCl), cодержащих 50 мкг/мл ампициллина и 10 мкг/мл неомицина. Полученная плазмида, названная pиСN 710, была переварена BamHT. Плазмида PEl 94 (Lordanescu, Plasmid1, 1978, 468-479) была переварена BCl 1. Фрагменты из обоих расщеплений были лигированы Т4 лигазой и трансформированы в Subtilis IA40. Отбор вели на минимальных чашках, содержащих 20 мкл/мл неомицина.
Субклонирование гена протеазы в вектор встраивания вели следующим образом: pM 58 (см. пример 1) переваривали Нра 1 и Bal 1 и Bgl 11. Плазмиду рЕ 194-neo переваривали Нра 1. Эти фрагменты лигировали Т4 лигазой и трансформировали в S. subtilis IA40. Трансформанты отбирали на основе устойчивости к неомицину и увеличения продукции протеазы, о чем судили по преципитации продуктов расщепления казеина (образование ореола, см. пример 1). Была получена плазмида рМАХ-4, структура которой подтверждена анализом рестрикционными фрагментами.
П р и м е р 5. Трансформация протопласта штамма Bacillus PB 92 pMAX-4.
Штамм Bacillus PB 92 растили в течение ночи в 100 мл NBS 6-X cреды (Thorne et. al., I. Bacteriol, 91, 1966, 1012-1020). Культуру центрифугировали в течение 10 мин при 4500 об./мин в роторе Sorvall модель GSA. Протопласты были приготовлены инкубированием бацилл в течение часа при 37оС в 10 мл щелочной среды (АНМ), содержащей 0,5 М сахарозы; 0,02 М Mg Cl2 и 0,02 М Трис/малеат, рН 8,0, в стерильной воде, к которой было добавлено 0,4 мг/мл лизоцима. Протопласты были осаждены 10 мин при 4500 об./мин, ресуспендированы в 5 мл буферной смеси АНМ рН 8,0 (АНМ-буфер, к которому добавлено 3,5 мас. % /объем Бакто Penassay бульона и 0,04 мас.%/объем Merieux альбумина), перемешаны, затем переосаждены. После ресуспендирования в 5,0 мл АНМ 0,5 мл этой суспензии протопластов было смешано с 5 мкг деминерализованной воды, содержащей 1 мкг плазмидной ДНК, и инкубированы в течение 2 мин в присутствии 30 мас.%/объем полиэтиленгликоля 8000, рН 8,0. После трехкратного разбавления средой АНМ+ рН 8,0 и центрифугирования осадок ресуспендировали в малом объеме 1 мл АНМ+ и инкулировали в течение 2-3 ч. Аликвоты по 100 мкл были высеяны на свежеприготовленные регенерационные чашки, содержащие 0,5 М сукцината Na/HCl, рН 8,0; 1,5 мас.%/объем агара; 0,5 мас.%/объем казаминовых кислот; 0,5 мас.%/объем дрожжевого экстракта; 0,031 м фосфатного буфера, рН 8,0; 0,5 мас.%/объем глюкозы; 0,02 Mg Cl2 и 0,02 мас.%/объем Merieux альбумина. Эти чашки также содержали 1000 мкг/мл неомицина для селекции. После инкубации при 37оС в течение по крайней мере 72 ч колонии были перенесены на чашки с агаром, содержащим сердечный экстракт и 20 мкг/мл неомицина.
П р и м е р 6. Встраивание рМАХ-4 в хромосому штамма Bacillus PB 92.
Колония штамма Bacillus PB 92, содержащего рМАХ-4, выращенные на чашке с агаром, содержащим сердечный экстракт и 20 мкг/мл неомицина, была внесена в 100 мл траптонного соевого бульона, содержащего 1 мкг/мл неомицина, и инкубирована в течение 24 ч при 37оС. 2 мл культуры (приблизительно 109 кл. /мл) разводили в 100 мл той же среды, содержащей 1 мкг/мл неомицина, и инкубировали в течение 24 ч при 50оС. Через 24 ч 5 мл культуры (приблизительно 109 кл./мл) развели снова и инкубировали в течение 24 ч при 50оС в присутствии 1 мкг/мл неомицина. Последняя процедура была повторена еще раз. Затем клеточная суспензия была разведена в 100 раз и высеяна на чашки с агаром, содержащим сердечный экстракт (И1-агар, Difco), 1 мкг/мл неомицина. Чашки инкубировали в течение 16 ч при 50оС. Колонии, устойчивые к неомицину, были изолированы и культивировались в 10 мл среды TSB, содержащей 1 мкг/мл неомицина, в течение 16 ч при 37оС. Из этих культур была выделена суммарная ДНК (Holmes et. al., Anal. Bichem. 114, 1981, 198-197), и с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле проверена на отсутствие плазмиды. Образцы, в которых не обнаруживалась плазмидная ДНК, были перепроверены с помощью трансформации суммарной ДНК в B. sublitis IA40. Образцы, лишенные способности трансформировать subtilis IA40, считались свободными от плазмиды.
Устойчивый к неомицину, свободный от плазмиды, полученный из Bacillus PB 92 штамм был найден и назван РВТ 109. Этот штамм содержал копию плазмиды РМАХ-4, встроенной в его хромосому. Встраивание в штамм РВТ 109 происходило по так называемому механизму Camplell путем гомологичной рекомбинации, приводящей к двум тендемно расположенным генам протеазы на хромосоме, разделенным плазмидными последовательностями. Эта генетическая организация штамма РВТ 109 была подтверждена, как показано в совместном ЕРА-0000000.
П р и м е р 7. Протеазная продукция трансформированных штаммов.
Протеазная продукция трансформированных штаммов была тестирована добавлением 0,2 мл культуры TSB, содержащей приблизительно 109 кл./мл, в 500 мл качалочные колбы, содержащие 100 мл продукционной среды, описанной в патенте США N Re 30602. Однако при тестировании штаммов B. subtilis pH был доведен до 7,0. Неомицин добавляли в концентрации 20 мкг/мл для штаммов DB 104 (p. ИВ 110), DB 104 (pMAX-4), PB 92 pMAX-4 в концентрации 1 мкг/мл для РВТ 109. Относительная продукция протеазы для этих клеточных линий показана в табл.2.
При ферментации в 10 л Bacillus PB 92 pMAX-4 обнаружили нестабильность и уменьшение продукции по сравнению с РВТ 109, если к ферментационной среде не добавляли неомицин.
Из упомянутых результатов следует, что предложен простой и эффективный способ продукции сериновой протеазы путем стабильного введения гомологичного или гетерологичного гена, кодирующего сериновую протеазу, в хромосому промышленных штаммов Bacillus. Кроме того, увеличенная продукция сериновой протеазы в хозяине Bacillus, который производит сериновую протеазу. Встраивание плазмидных конструкций в хромосому хозяйской клетки приводит к более стабильной ситуации в производственных ферментациях и значительно усиленной продукции протеазы, чем в присутствии конструкций с внехромосомальными плазмидами.
Различные методики работы с генами хорошо известны.
Клоны, содержащие встроенный фрагмент ДНК, кодирующий щелочную фосфатазу, могут быть обнаружены с помощью устойчивого маркера или путем использования способа прямой или положительной селекции, как разработанные для B. sublitis (Gryczan и Dubnow, Gene 20, 1982, 459-469). Кроме того, клоны, экспрессирующие высокощелочную протеазу, могут быть идентифицированы с помощью антител против продукта экспрессии, обнаружением потери субстрата или образования продукта протеолитического фермента. Например, колонии, экспрессирующие маркерный ген, такой как ген устойчивости к антибиотику, могут быть проанализированы на производство протеазы, определяемое по увеличенной преципитации ореола казеина вокруг колоний на чашках с агаром, содержащим казеин.
Claims (3)
1. Способ получения сериновой протеазы, предусматривающий трансформацию штамма бацилл рекомбинатной плазмидной ДНК, культивирование трансформантов, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что трансформируют штамм щелочефильных Bacillus, при этом в качестве плазмидной ДНК используют PMAX4.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что трансформацию штамма Bacillus осуществляют путем обработки штамма лизоцимом в щелочной среде при 20 - 37oС, отделения образовавшихся протопластов от лизоцима, объединения протопластов с рекомбинатной плазмидной ДНК при той же температуре в присутствии реагента для смешения, регенерации клеток штаммов и выращивания регенерированных клеток в селективных условиях.
3. Штамм щелочефильных Bacillus PB 92/ pMAX-4 - продуцент сериновой протеазы.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP87200358 | 1987-02-27 | ||
| NL87200358.7 | 1987-02-27 | ||
| PCT/NL1988/000007 WO1988006624A2 (en) | 1987-02-27 | 1988-02-26 | Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2023723C1 true RU2023723C1 (ru) | 1994-11-30 |
Family
ID=8197584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU884356848A RU2023723C1 (ru) | 1987-02-27 | 1988-10-26 | Способ получения сериновой протеазы, штамм щелочефильных bacillus-продуцент сериновой протеазы |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5217878A (ru) |
| JP (1) | JP3026567B2 (ru) |
| KR (1) | KR0127560B1 (ru) |
| CN (1) | CN88101681A (ru) |
| AT (2) | ATE180016T1 (ru) |
| AU (1) | AU620026B2 (ru) |
| BG (1) | BG49049A3 (ru) |
| BR (1) | BR8805647A (ru) |
| CA (1) | CA1339100C (ru) |
| DE (2) | DE3856331T2 (ru) |
| DK (2) | DK175738B1 (ru) |
| FI (3) | FI105483B (ru) |
| HU (1) | HU213220B (ru) |
| LT (1) | LT4000B (ru) |
| LV (1) | LV10307B (ru) |
| NO (1) | NO884423L (ru) |
| PT (1) | PT86864B (ru) |
| RU (1) | RU2023723C1 (ru) |
| WO (1) | WO1988006624A2 (ru) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR8805647A (pt) * | 1987-02-27 | 1989-10-31 | Gist Brocades Nv | Processo para clonagem molecular e expressao de genes que codificam para enzimas proteoliticas |
| DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| GB2214508A (en) * | 1988-01-27 | 1989-09-06 | Bayer Ag | Plasmid vector for the efficient expression of foreign genes fused with newly conceived transcriptional and translational signal sequences. |
| US6287841B1 (en) * | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
| WO1989010976A1 (en) * | 1988-05-05 | 1989-11-16 | The Public Health Research Institute Of The City O | Protease-deficient gram-positive bacteria and their use as host organisms for the production of recombinant products |
| US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
| JP3046344B2 (ja) * | 1990-10-24 | 2000-05-29 | 塩野義製薬株式会社 | 新規プロテアーゼ |
| US5482849A (en) * | 1990-12-21 | 1996-01-09 | Novo Nordisk A/S | Subtilisin mutants |
| DK58391D0 (da) * | 1991-04-03 | 1991-04-03 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte proteaser |
| DE69333463D1 (de) * | 1992-05-18 | 2004-05-06 | Genencor Int | Alkalische Proteasen produzierende Bakterien, und Verfahren zur Herstellung dieser alkalischen Proteasen |
| US6440717B1 (en) * | 1993-09-15 | 2002-08-27 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6436690B1 (en) * | 1993-09-15 | 2002-08-20 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted |
| US6599730B1 (en) * | 1994-05-02 | 2003-07-29 | Procter & Gamble Company | Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US5831004A (en) * | 1994-10-27 | 1998-11-03 | Affymax Technologies N.V. | Inhibitors of metalloproteases, pharmaceutical compositions comprising same and methods of their use |
| US5646044A (en) * | 1995-03-02 | 1997-07-08 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Expression systems for the production of target proteins in bacillus |
| US6455295B1 (en) * | 1995-03-08 | 2002-09-24 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| IL117350A0 (en) * | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6475765B1 (en) * | 1995-03-09 | 2002-11-05 | Procter & Gamble Company | Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| KR100591553B1 (ko) | 1996-11-04 | 2006-06-19 | 노보자임스 에이/에스 | 섭틸라제 변종과 조성물 |
| US5766871A (en) * | 1996-11-27 | 1998-06-16 | Food Industry Research And Development Institute | Screening and characterization of glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase |
| US6420157B1 (en) * | 1999-04-30 | 2002-07-16 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Zymogen activation system |
| US6485957B1 (en) | 1999-04-30 | 2002-11-26 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | DNA encoding the human serine protease EOS |
| US6458564B1 (en) | 1999-08-31 | 2002-10-01 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | DNA encoding the human serine protease T |
| US6426199B1 (en) | 1999-08-31 | 2002-07-30 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Dna |
| CN1312370A (zh) * | 2000-03-07 | 2001-09-12 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人atp依赖的丝氨酸蛋白水解酶11和编码这种多肽的多核苷酸 |
| US6777218B1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
| AU4981101A (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-15 | Maxygen Inc | Subtilisin variants |
| EP2339016B8 (en) | 2002-03-29 | 2016-01-27 | Danisco US Inc. | Enhanced production of subtilisins in Bacillus |
| WO2004101759A2 (en) * | 2003-05-12 | 2004-11-25 | Genencor International, Inc. | Novel lipolytic enzyme lip2 |
| EP1625202A4 (en) | 2003-05-12 | 2010-10-20 | Genencor Int | NEW LIPOLYTIC ENZYME LIP1 |
| WO2004101760A2 (en) * | 2003-05-12 | 2004-11-25 | Genencor International, Inc. | Novel lipolytic enzyme elip |
| US7575769B2 (en) | 2003-09-19 | 2009-08-18 | Innovative Cereal System Llc | Preparation of an edible product from dough |
| US7985569B2 (en) | 2003-11-19 | 2011-07-26 | Danisco Us Inc. | Cellulomonas 69B4 serine protease variants |
| US8535927B1 (en) * | 2003-11-19 | 2013-09-17 | Danisco Us Inc. | Micrococcineae serine protease polypeptides and compositions thereof |
| EP1735339A2 (en) * | 2004-04-09 | 2006-12-27 | Genencor International, Inc. | Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus |
| US20080044853A1 (en) * | 2004-06-21 | 2008-02-21 | Novozymes A/S | Stably Maintained Multiple Copies of at Least Two Orf in the Same Orientation |
| US7202074B2 (en) * | 2004-07-22 | 2007-04-10 | University Of Chile | Protein and nucleic acid sequence encoding a KRILL-derived cold adapted trypsin-like activity enzyme |
| AU2008226792B2 (en) | 2007-03-12 | 2013-06-06 | Danisco Us Inc. | Modified proteases |
| US8343735B2 (en) * | 2007-05-10 | 2013-01-01 | Danisco Us Inc. | Modified secretion system to increase expression of polypeptides in bacteria |
| EP2173873B1 (en) | 2007-08-06 | 2015-11-18 | University of Chile | Protein and dna sequence encoding a cold adapted subtilisin-like activity |
| JP5629584B2 (ja) | 2007-12-21 | 2014-11-19 | ダニスコ・ユーエス・インク | バチルス内での促進されたタンパク質生成 |
| FI123122B (fi) | 2009-02-16 | 2012-11-15 | Optogear Oy | Laitteisto lasimateriaalin valmistamiseksi |
| DK2421973T3 (en) | 2009-04-24 | 2018-07-30 | Danisco Us Inc | PROTEAS WITH MODIFIED PRO AREAS |
| AR076941A1 (es) | 2009-06-11 | 2011-07-20 | Danisco Us Inc | Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina |
| MX350391B (es) * | 2011-09-22 | 2017-09-06 | Novozymes As | Polipeptidos que poseen actividad proteasa y polinucleotidos que los codifican. |
| CN103013960A (zh) * | 2012-12-21 | 2013-04-03 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌 |
| CN106068273B (zh) | 2013-12-31 | 2021-01-08 | 丹尼斯科美国公司 | 增强的蛋白质表达 |
| KR102588719B1 (ko) | 2014-12-16 | 2023-10-12 | 다니스코 유에스 인크. | 향상된 단백질 발현 |
| WO2016100128A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Danisco Us Inc | Enhanced protein expression |
| WO2018202911A1 (en) * | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Bioecho Life Sciences Gmbh | Rapid purification of high quality nucleic acids from biological samples |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1234445A (ru) | 1967-10-03 | 1971-06-03 | ||
| GB1205403A (en) | 1967-11-10 | 1970-09-16 | Novo Terapeutisk Labor As | Preparation of proteolytic enzyme preparations |
| GB1519148A (en) * | 1974-11-19 | 1978-07-26 | Gist Brocades Nv | Compositions of matter |
| FR2482980A1 (fr) | 1980-05-20 | 1981-11-27 | Biomerieux Sa | Procede d'obtention de preparations de toxoplasmes pour le diagnostic de la toxoplasmose, et preparations ainsi obtenues |
| JPS6055118B2 (ja) | 1982-02-08 | 1985-12-03 | 昭和電工株式会社 | 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法 |
| EP0108301B2 (en) * | 1982-11-01 | 1993-09-01 | SOLVAY ENZYMES, INC. (a Delaware corporation) | Method of heterologous cloning of gene in bacillus microorganism |
| IE81141B1 (en) * | 1983-06-24 | 2000-04-05 | Genencor Int | Procaryotic carbonyl hydrolases |
| EP0134048B2 (en) * | 1983-07-06 | 1996-08-14 | Gist-Brocades N.V. | Molecular cloning and expression in industrial microorganism species |
| EP0138075A1 (en) * | 1983-09-16 | 1985-04-24 | Synergen Associates, Inc. | A method for the generation and detection of enzyme variants with enhanced themostability and activity |
| US4828994A (en) * | 1984-09-21 | 1989-05-09 | Genex Corporation | Bacillus strains with reduced extracellular protease levels |
| FR2582316B1 (fr) * | 1985-05-22 | 1988-12-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs d'expression de l'a-amylase dans bacillus subtilis, souches obtenues et procede de preparation d'a-amylase |
| DE3527913A1 (de) * | 1985-08-03 | 1987-02-12 | Henkel Kgaa | Alkalische protease, verfahren zur herstellung von hybridvektoren und genetisch transformierte mikroorganismen |
| EP0254735B2 (en) * | 1986-01-15 | 1998-06-17 | Amgen Inc. | METHOD FOR PRODUCTION OF THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS |
| SG30639G (en) * | 1986-04-30 | 1995-09-01 | Genencor Int | Non-human carbonyl hydrolase mutants DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors |
| EP0896062A3 (en) * | 1987-02-27 | 1999-04-07 | Genencor International, Inc. | Transformation of alkalophilic bacillus strains |
| BR8805647A (pt) * | 1987-02-27 | 1989-10-31 | Gist Brocades Nv | Processo para clonagem molecular e expressao de genes que codificam para enzimas proteoliticas |
-
1988
- 1988-02-26 BR BR888805647A patent/BR8805647A/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-02-26 PT PT86864A patent/PT86864B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-02-26 KR KR1019880701347A patent/KR0127560B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-02-26 JP JP63502472A patent/JP3026567B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-26 HU HU881832A patent/HU213220B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-02-26 AU AU13980/88A patent/AU620026B2/en not_active Expired
- 1988-02-26 WO PCT/NL1988/000007 patent/WO1988006624A2/en active IP Right Grant
- 1988-02-27 CN CN198888101681A patent/CN88101681A/zh active Pending
- 1988-02-29 DE DE3856331T patent/DE3856331T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-29 DE DE3856339T patent/DE3856339T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-29 US US07/162,184 patent/US5217878A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-29 AT AT88200377T patent/ATE180016T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-02-29 AT AT91203297T patent/ATE181110T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-02-29 CA CA000560126A patent/CA1339100C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-05 NO NO884423A patent/NO884423L/no unknown
- 1988-10-24 FI FI884904A patent/FI105483B/fi active IP Right Grant
- 1988-10-25 BG BG85831A patent/BG49049A3/xx unknown
- 1988-10-26 DK DK198805939A patent/DK175738B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-10-26 RU SU884356848A patent/RU2023723C1/ru active
-
1992
- 1992-11-27 FI FI925413A patent/FI106726B/fi active
-
1993
- 1993-12-29 LV LVP-93-1390A patent/LV10307B/en unknown
-
1994
- 1994-01-28 LT LTIP1820A patent/LT4000B/lt not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-05-15 FI FI20001152A patent/FI119028B/fi not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-08-20 DK DK200401262A patent/DK175852B1/da not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Debabov. The Industrial Use of Bacillus, in the Molecular Biology of Bacillus, Acad. Press., New York, 1982. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2023723C1 (ru) | Способ получения сериновой протеазы, штамм щелочефильных bacillus-продуцент сериновой протеазы | |
| EP0479396B1 (en) | Transformation of alkalophilic bacillus strains | |
| EP0284126B1 (en) | Stable gene amplification in prokaryotic chromosomal dna | |
| US6783970B2 (en) | System for expressing hyperthermostable protein | |
| FI85287B (fi) | Molekulaer kloning och expression i industriella mikro-organismarter. | |
| HU205386B (en) | Process for expressing cloned lysostaphin gene and for producing dna fragment containing the gene, expression vector and transformed host cell | |
| US5624829A (en) | Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them | |
| KR100786514B1 (ko) | 유산균 내에서 복제가 가능한 대장균-락토바실러스 셔틀벡터 및 그 응용 | |
| JP2501779B2 (ja) | アルカリプロテア―ゼの製造方法 | |
| EP0303668A1 (en) | Stable expression vectors | |
| JPH0783716B2 (ja) | アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子系 |