JPH01502876A

JPH01502876A - 分子のクローニング及びタンパク分解酵素をコードする遺伝子の発現

Info

Publication number: JPH01502876A
Application number: JP63502472A
Authority: JP
Inventors: ファン　エーケレン　クリスチャン　アルベルテュス　ヘラルデュス; ファン　デル　ラーン　ヨハネス　コルネリス; ミュレネルス　レオナルデュス　ヨハネス　ソフィー　マリー
Original assignee: ジェネンコー　インターナショナル　インコーポレイテッド
Priority date: 1987-02-27
Filing date: 1988-02-26
Publication date: 1989-10-05
Anticipated expiration: 2015-03-27
Also published as: BG49049A3; NO884423D0; FI884904A0; JP3026567B2; FI925413A0; LV10307A; FI884904A; BR8805647A; LT4000B; DK200401262A; ATE181110T1; DK175738B1; PT86864A; DE3856339D1; AU1398088A; PT86864B; HU213220B; CN88101681A; AU620026B2; ATE180016T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】分子のクローニング及びタンパク分解酵素をコードする遺伝子の発現背景技術本発明は組換え体技法を用いるバチルス属の菌株中でのセリンプロテアーゼの増大された量における製造に関する。

責員挟歪産業上重要な酵素類例えばα−アミラーゼ、中性用プロテアーゼ及びアルカリ性用プロテアーゼ又はセリン　プロテアーゼの製造のために細菌類は広汎に使用されている。一般に細菌源セリンプロテアーゼ類は多くの原核性微生物、例えばグラム陰性微生物、例えばセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）又はプソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ）の種及びグラム陽性細菌例えばミクロコツカス属（旧ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種から得られる。特に興味ある産業上重要なセリン　プロテアーゼはアルカリ性の培地（又は媒体）中で高活性を有するプロテアーゼである。工業的セリン　プロテアーゼは各種のバチルス種、例えばＢ、スプチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ、リヘニホルミス（Ｂ、　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ、アミロリクイファシェンス（Ｂ、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　）　、Ｂ、アルカロフィルス（Ｂ。

ａｌｃａｌｏｐｂｉｌｕｓ）及びその他のバチルス属の種によって産生されるけれども、高アルカリ活性プロテアーゼはアルカリ性ｐ）ｌの下で生育し得るバチルス属の種によって産生されることが一般である。

かようなバチルスの一例はバチルス属新種Ｐ　Ｂ　９２　（Ｂａｃｉｌｌｕｓｎｏｖｏ　５ｐｅｃｉｅｓ　ＰＨ１０）　（訳注：下文においてはバチルスｎｏｖｏ　ｓｐ。

ＰＨ１０又はバチルスＰＢ９２と略記される〕。

バチルス属の細胞外酵素類製造のための数種の遺伝子が成功裡にクローニングされており、その例はＢ、アミロリクイファシェンス（Ｐａｌｖａｅｔａｌ、、Ｇｅｎｅ　１５　（１９８１）　４３　５１）、Ｂ。

リヘニホルミス（Ｏｒｔｌｅｐｐ、　Ｇｅｎｅ　２３　（１９８３）　２６７）　、Ｂ。

ステアロテルモフィルス（Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　ＣＭｉｅｌｅｎｚ　ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０　（１９Ｂ　３　）　５９７５−５９７９　；ＥＰＡ−００５７９７６）及びＢ、スブチリス（Ｙａｎｇｅｔａｌ、、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、１１　（１９８３）　２３７）の夫々がらのα−アミラーゼ遺伝子；Ｂ、スブチリス（Ｇａｙ　ｅｔ　ａｌ−＋　、ｒ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　°１５３　（１９８３）　１４２４）から・のレバンシュクラーゼ遺伝子；Ｂ、ステアロテルモフィルス（Ｆｕｊｉ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．１５６　（１９８３）　８３１）　、Ｂ、アミロリクイファシェンス（）ｌｏｎｊｏｅｔａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈ　・１　（１９８４）　１６５）及びＢ、スブチリス（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　・１６０　（１９８４）１１５）からの中性用プロテアーゼをコードする遺伝子；Ｂ、スブチリス（Ｗｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８１（１９８４）１１８４）、Ｂ、　リヘニホルミス（Ｊａｃｏｂｓ　ｅｔ　ａｌ、。

ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、１３　（１９８５）　８９１３）及びＢ、アミロリクイファシェンス（Ｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ−＋　Ｎｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｌ　１（１９８３）７９］］）からのセリン　プロテアーゼ又はアルカリ性用プロテアーゼをコードする遺伝子である。

各種のバチルス属の種による工業的セリン　プロテアーゼの製造は例えば米国特許第３６７４６４３　；　３７２３２５０　ｉ及び４４８００４３号各明細書に記載がある。アルカリ性ｐＨＯ下で生育し得るバチルス属の種による高アルカリ活性タンパク分解酵素の製造は例えば米国特許第３７２３２５０　；　Ｒｅ、３０６０２及び４４８００３７号各明細書に記載がある。産業上重要な酵素類の製造用の細菌使用に関する総覧については例えばダバボフの著書（Ｄａｂａｂｏｖ、　”　Ｔｈｅ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｉ　、　ｉｎ　ｓ　ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｉ　（Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９８２））を参照されたい。

Ｂ、スブテリスのプロトプラスト（原形質体）の形質転換に関する実験はチャン等ｒ、Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ　（Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１６ｇ（１９７９）１１１−１１５）によって記載された。同様の実験はＢ、メガテリウム（Ｂｏｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のプロトプラスト［Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ　ｅｔ　ａｌ、、　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔｅｒｓ　７　（１９８０）２６１−２６３１、Ｂ、アミロリクイファシェンスのプロトプラス）　（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｐｐｌ、ａｎｄ　Ｅｎｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５　１　（１９８６）６３４Ｅ、Ｂ、スリンギエンシス（Ｂ、　ｔｂｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のプロトプラスト［Ｆｉｓｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３９　（１９８１）２１３−２１７３、Ｂ、スフェリクス（Ｂ、　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ）のプロトプラスト　（Ｍｃ　Ｄｏｎａｌｄ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３０　（１９８４）２０３〕及びＢ、ラルベ（Ｂ、　１ａｒｖａｅ）のプロトプラスト［Ｂａｋｈ　１ｅｔｅｔａｌ、、　Ａｐｐｌ、　ａｎｄＥｎｖ９Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４９　（１９８５）　５７７３の成功された形質転換について記載されている。また、バキエ等［Ｂａｋｈｉｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、上掲書〕はＢ、ポビレ（Ｂ、　ｐｏｐｉｌｌａｅ）を用いる成功的結果について報告した。マン等［Ｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＣｕｒｒｅｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３　（１９８６）　１３１−１３５３はＢ、ポリミキサ（Ｂ、　ｐｏｌｙｍｙｘａ）、Ｂ、リヘニホルミス、８．７セランス（Ｂ。

ｍａｃｅｒａｎｓ）及びＢ、ラテロスポルス（Ｂ、　１ａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）を用いる成功的形質転換について報告した。けれども良好なプロトプラスト形成が観察されたにもかかわらすＢ、コアギユランス＜Ｂ。

ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ、セレウス（Ｂ、　ｃｅｒｅｕｓ）及びＢ、プミルス（Ｂ。

ｐｕｍｉｌｕｓ）を用いた場合に実験は成功しなかった。プロトプラストへのＤＮＡ導入の他の方法としては例えばＤＮＡ含有リポソームとの融合０１ｏ１ｕｂｏｖａ、　Ｐｏ１ｉａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３０　（１９８５）　９７］がある。

発明の開示本発明によって新規のアルカリ親和性のバチルス属の菌株、該菌株の形質転換に関する方法及びコンポジション（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）が提供される。新規のＤＮＡ配列も又提供されるが該ＤＮＡ配列はアルカリ親和性バチルス属の菌株から誘導される高アルカリ活性タンパク分解酵素をコードする遺伝子を有する。宿主細胞は好ましくは陽性の背景（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を有し、咳高アルカリ活性タンパク分解酵素をコードする遺伝子を有するプラスミド構成体（ｐｌａｓｎ＋ｉｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を用いることによって形質転換される。アルカリ性ｐＨＯ下でポリエチレングリフールの存在でプラスミド構成体を用いる原形質体（プロトプラスト）の形質転換の技法を使用し得る。ＤＮＡ配列はこれを染色体外で保持させてよく、又は宿主細胞のゲノムの中に組込んでもよい。

Ｈを　するための最　の３冨本発明に従いタンパク分解酵素を高収量で製造するための新規のＤＮＡ構成体及び新規のバチルス属の菌株並びにそれらの製造方法が提供される。宿主細胞は“ タンパク分解酵素をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミド構成体と、該宿主バチルス属菌株から調製されたプロトプラスト（複数）とを融合条件下に結合させること゛によって形質転換される。

高アルカリ活性プロテアーゼはアルカリ性培地（又は媒体）中で高活性を有するセリン　プロテアーゼ又はスブチリシンである。

更に詳細には高アルカリ活性プロテアーゼは約９以上のｐＨ値において最適活性を有し、ｐＨ約１１において、又はそれ以上のｐＨ値においてさえも該最適活性の少なくとも８０％の活性を保持する。

高アルカリ活性プロテアーゼはアルカリ性ｐ）Ｉの下で生育し得るバチルス属の菌株によって製造されることが一般である。

プロテアーゼ遺伝子の単離に用いられる技法は当業技術分野で公知であって該技法は該遺伝子の合成、ゲノムのＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製又はそれらの組合せを含む、高アルカリ活性プロテアーゼ遺伝子の単離及び発現は本件優先権主張出願の根拠である欧州出願ＮＣＬＥＰ−Ａ−８７２００３５８・７明細書中に開示され、該開示事項は本明細書中に引用されている。遺伝子操作に関する諸技法は周知であって制限、切断、切除、連結、インビトロでの突然変異誘発、プライマー修復、リンカ−及びアダプターの使用及び類似技法を含む（参照文献：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ］ｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｆｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８２　］。

一般に該技法は高アルカリ活性プロテアーゼを発現する微生物からのゲノムライブラリ　（染色体保存庫）の準備を含む。供与体としての微生物のゲノムを単離して適宜の制限酵素によって開裂させる。得られた供与体菌株のＤＮＡ断片を次にクローン形成用ベクターの中へ連結させるが該ベクターは共存可能な制限用エンドヌクレアーゼを用いて予め開裂されたものである。

挿入されたＤＮＡ断片を有するクローンは耐性付与物の使用により、又はＢ、スブチリスについて開発されたような直接又は陽性選択操作法の使用によって同定され得る［Ｇｒｙｃｚａｎ　ａｎｄ　Ｄｕｂｎｏｗ。

Ｇｅｎｅ　２０　（１９ｇ２）４５９−４６９１゜更に、高アルカリ活性プロテアーゼを発現するクローンは、発現産生物に対向する抗体の使用により、又は基質の損失の検出により、或いはタンパク分解酵素の産生物の形成により同定され得る。例えば抗性物質耐性のようなマーカーとなる遺伝子を発現するコロニーをプロテアーゼ産生についてスクリーニングし得るが、この場合にカゼイン（ｃａｓｅｉｎｅ）含有寒天平板上のコロニーを取巻くカゼインの円輪（ｈａｌｏ）の沈積増加によって決定する。

完結遺伝子がｃＤＮＡとして又は染色体のＤＮＡとして同定されたならば各種の方法に従ってこれを発現のために操作し得る。

バチルス属の宿主を使用し得るが該宿主は例えばアルカリ親和性細菌であって高アルカリ活性プロテアーゼ産生菌として確認されたアルカリ親和性細菌を含む、好ましい宿主菌はバチルス　ｎｏｖａｓｐ、、ＰＨ１０である。従って調節用シグナルを有する野生型配列及び分泌先導配列、及びその他の配列を保持することが便利であるけれども他の細菌から誘導された制御域、即ち該バチルス宿主株の中で機能する制御域も又使用し得る。従ってバチルス属細胞を形質転換させるための適切なベクターは高アルカリ活性プロテアーゼをコードする構造遺伝子を有する。該構造遺伝子はアルカリ親和性バチルス属から得られ、制御域例えばプロモーター配列、リポソーム結合部形成配列及び該アルカリプロテアーゼ遺伝子の転写終了及び翻訳を制御する配列を存し、該制御域はアルカリ親和性バチルス宿主細胞の中で機能するのである。

更にベクターはマーカー遺伝子、例えば宿主株が感受性を示す抗性物質に耐性であるマーカー遺伝子を有し得るがこれは宿主細胞内で自律的複製を可能とする複製起点である。複製起点は突然変異されたものであってよく、宿主細胞内で温度 −感受性能を発揮してエルリヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７５（１９７８）１４３３）記載の染色体への組込みのための選択を可能とする。

アミノ酸配列は、“高アルカリ活性プロテアーゼ遺伝子を提供するための供与細胞として有用な細胞からのｍＲＮＡ又はＤＮＡから調製されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリ０をスクリーニングするための探索子（プローブ）を企画する際に使用され得る。

高アルカリ活性プロテアーゼのｃＤＮＡ又はその断片を交雑（ハイブリダイゼーション）用のプローブとして使用することにより、他の微生物に見出される構造的に関連する遺伝子を容易にクローニングし得る。なかんずく高アルカリ活性セリンプロテアーゼを発現する微生物からの遺伝子の単離は特に重要であってこの場合にはアルカリ親和性バチルス属菌株、例えばバチルスｎｏｖｏ　ｓｐ。

ＰＨ１０から得られる高アルカリ活性セリンプロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを用いる。

該プローブは完全な配列よりかなり短かくてよいがその長さは少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、更に好ましくは２０個のヌクレオチドから成る長さであるべきである。それより長いオリゴヌクレオチド群も又有用であるが遺伝子の全長以下、好ましくは１２００個以下のヌクレオチドから成る長さである。

ＲＮＡプローブ及びＤＮＡプローブの双方を共に使用し得る。

使用に当りプローブを検出可能に（例えば３２ＰＳ　３Ｈ１ビオチン又はアビジンを用いて）標識することが典型的な仕方であり、該プローブを請求める遺伝子をもつ微生物からの一本釦Ｄ　Ｎ　Ａ又はＲＮＡと共に、恒温下に保持する。ハイブリダイゼーション（交雑）は、一本領及び二本鎖（交雑されたもの）のＤＮＡ　（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）を（典型的にはニトロセルロース紙使用下で）分別した後に標識によって検出させ得る。オリゴヌクレオチド使用に適する交雑技法は当業技術者にとって周知である。

検定の容易化のための検出可能標識を有するプローブの使用が普通であるけれども無標識のヌクレオチドも又有用であって、両者は標識されたプロニブの前駆体として、二本鎖ＤＮＡ　（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）の直接的検出法に使用される。

従って本明細書中の用語“オリゴヌクレオチド　プローブは標識型及び無標識型の双方を意味する。次いで連結混合物はコムビテントな（被感染性の）Ｂ、スブチリス細胞群の形質転換のために使用される。

を単離し、制限分析及び配列形成によって特性化し得る。

高アルカリ活性プロテアーゼの製造のために、既にセリン　プロテアーゼを産生じているバチルス属菌株を形質転換させるために使用される好適なりＮＡ配列はバチルスｎｏｖａ　ｓｐ、　ＰＨ１０に由来する配列である。該ＤＮＡＥ列によってコードささるセリン　プロテアーゼのアミノ酸配列は下記の通りであるニブロチアーゼ遺伝子を提供するための好適菌株はバチルスｎｏｖｏ　ｓｐ、ＰＨ１０であるけれどれも他のアルカリ親和性細胞からも本質的に同一なセリン　プロテアーゼが得られる。かようなプロテアーゼ遺伝子はバチルス　ＰＨ１０のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、好ましくは約８０％又はそれ以上の相同性をもつアミノ酸配列を有する遺伝子であって本発明の範囲に属することが理解されるべきである。

発現産生物（製品）は分泌されることが望ましい。アルカリプロテアーゼは分泌されるので野生型分泌先導シグナル及びプロセ符表平１−５０２８７６　（５）ッシングシグナル（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌｓ）を使用する。更に、分泌先導シグナル及びプロセッシングシグナルをコードする構造遺伝子に対し５パ配列を提供することによって融合遺伝子を調製し得る。例えば異種起源の先導シグナルはバチルス属のアミラーゼ遺伝子及びプロテアーゼ遺伝子の分泌先導シグナルを有する。分泌先導シグナルの正常な読取枠の中へ前記の構造遺伝子を融合させることによって″成熟したアルカリ親和性プロテアーゼ”を培地中へ分泌させ得る。

発源カセットは、その全部又は一部分を天然源から誘導し得るし、宿主細胞とは同種起源の供給源から、又は宿主細胞とは異種起源の供給源から全部又は一部分を誘導し得る。本発明による各種のＤＮＡ構成体（即ちＤＮＡ配列、ベクター、プラスミド、発源カセット）は単離及び（又は）純化され、或いは合成されるので、“天然に存在する″ことはない。

宿主菌株の染色体中への構造遺伝子の組込みが所望されるか又は染色体外の要素上での保持が所望されるかによってバチルス属の系の複製が含まれ、又は含まれない。組込みの場合にはバチルス属のゲノムを有するプラスミド構成体の中で相同体を伸長させて組換えの可能性を増大させる。更に、プラスミド構成体の中へ温度感受性の複製起点を含有させることは染色体への組込みを選択させるものである〔例えばＥｈｒｌｉｃｈ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

１１ｓＡ　７５　（１９７８）１４３３参照〕。

−コピー以上の構造遺伝子を宿主細胞の中へ挿入して構造遺伝子の発現を拡大させ得る。構造遺伝子の安定な拡大は、少なくとも−コピーの追加の構造遺伝子を宿主細胞のゲノムの中へ組込むこと、及び形質転換体（この中で構造遺伝子のコピーが内因性の染色体配列によって分別される）を選択することによって達成され得る。ＤＮＡ構成体及び原核微生物に関する技法は欧州出願ＮαＥＰ−Ａ−８７２００３５６・１明細書中に記載され、該開示事項は本明細書中に引用されている。

複製系のほかに少なくとも１個のマーカー遺伝子がプラスミド構成体中に含まれる。マーカー遺伝子の使用により殺生剤耐性、ウィルス耐性又は重金属耐性、免疫性及びその他の類似の性能を提供し、発現する構造遺伝子を宿主内に達成し得るようにする。

殺生剤耐性には抗性物質例えばネオマイシン、カナマイシン、テトラサイクリンに対する耐性が含まれる。マーカー遺伝子は組換え体細胞群の生育を著しく妨げない抗性物質濃度での少ないコピー数を選択するように選択される。特に重要なのはネオマイシン耐性である。

各種のＤＮＡ配列が各種の供給源から誘導され、相互に結合されてベクター、即ち好ましくは独特の、単数又は複数の有用な制限部位を有し、該部位に構造遺伝子を挿入又はＭ換させてプラスミド構成体を有するベクター、を提供する。

プラスミド構成体が調製されるとこれは適宜の宿主細胞の形質転換のために使用可能である。宿主のバチルス属菌はいかなるバチルス属の菌株であってよいけれども高アルカリ活性プロテアーゼの製造法を改良し得る要因を考慮して適切な菌株を選択する。

各種の方式で、例えば所望製品の劣化を減する方式、調節シグナルを認識させる方式、分泌を容易ならしめる方式、及びその他の方式で宿主を使用することによる製法改良が可能である。従って宿主バチルス属菌は高アルカリ活性プロテアーゼ産生菌であることが好ましいが、野生型バチルス属菌であり得るし又は突然変異バチルス属菌であり得るし、更に宿主バチルス属菌はアルカリ活性プロテアーゼを高度に産生じなかった高アルカリ活性プロテアーゼ産生突然変異株であり得る。

れてはいないし、アルカリ親和性バチルス属菌株として引用されることが一般である。アルカリ性ｐＨの下で生育し得るバチルス属菌株の例は例えば米国特許第３７２３２５０　；　Ｒｅ、３０６０２及び４４８００３７号各明細書に記載されている。好ましいアルカリ親和性バチルス属宿主株はなかんずく米国特許ＮｎＲｅ、　３０６０２号開示のバチルスｎｏｖａ　５ｐｅｃｉｅｓ　ＰＢ９２株である。

工業的なアルカリ親和性バチルス属菌株も又宿主細胞として使用可能である。工業的バチルス属菌株は土壌から単離されたか又は寄託機関或はその他の供給先から入手された菌株から由来し、該バチルス属菌株の遺伝学的一時変異によって得られる。工業的バチルス属菌株は遺伝学的変換、例えばファージ感染又は形質転換に対して抵抗性であることで特性づけられる。該菌株は安定であって胞子を形成し、又は形成しない。該菌株は通常は原栄養性であり、変改されると内因性のタンパク質生成物例えばα−アミラーゼ酵素及び各種のプロテアーゼを高収量で産生ずる。工業的製法によって得られる内因性タンパク質生成物の収量は少なくとも５ｇ／ｊ２（０，５％ｗ／ｖ）に達し得る。工業的菌株はＤＮアーゼをも分泌し、その結果培地内でＤＮＡの劣化を起し、遺伝学的交換に対する防御を果す。

アルカリ親和性バチルス属菌株の形質転換は該菌株からの原形質体の使用を含むことが好ましい。けれども慣用の原形質体形質転換の実験方式はコーエン記載（Ｃｏｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、前掲文献）の通りアルカリ親和性バチルス属菌株に関して作動しない。従って他の追加的な実験方式を開発せねばならなかった。

のＰＨ１好ましくはｐＨ約８の下で起り得る。原形質体は細胞群をアルカリ保有培地（Ａ　ＨＭ）　（ｐＨ７，８〜８．５）中に再ＬｊｉＧ５させてから細胞群を３０〜８０分間３７℃の恒温に保持して調製される。

ＡＨＭの一例については後文中の例５を参照されたい。次いで得られた原形質体を洗ってリゾチームを除いてからＡＨＭ中に再懸濁させる。プラスミド構成体とアルカリ親和性バチルス属宿主株の原形質体とを適宜のフソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）の存在下に結合させる。

所望の効果を奏するいかなるフソゲンをも使用し得るが最も多くの場合にポリエチレングリコール（ＭＷ：１０００〜８０００）は高い融合効果を奏するので大いに便利である。バチルス属の受容体菌株から調製された原形質体とプラスミド構成体とをポリエチレングリコールの存在下で５分間以内、好ましくは２分間以内に混合する。次に該フソゲン混合物を慣用の普通培地で再び平板培養し、細胞群を５時間以内、好ましくは２〜３時間恒温保持し、その後に再生用平板培地へ移す。再生用平板培地は形質転換体の選択のための抗性物質例えばネオマイシンを含有する。

ＤＮＡ構成体をエピゾーム中に保持するクローンは高アルカリ活性セリンプロテアーゼの発現を検定することによって同定され得る。染色体への組込み部分としての発現構成体を有するクローンの同定のためには、発生したクローンの細胞の全部のＤＮＡを単離し、遊離のプラスミドＤＮＡの存在がその中に検出されないクローンであってプラスミドのマーカー遺伝子が発現している該クローンを選択することによって該“発生したクローン”をスクリーニングする。次に高アルカリ活性セリンプロテアーゼの発現を検定するための適宜の方式によって該クローンをスクリーニングする。

各種の検定技法は特異的抗体、ＤＮＡ交雑又はＲＮＡ交雑、酵素生成物の形成又は酵素基質の消失の使用を含み、これらはクローンのスクリーニングに使用されて発現構成体の存在及び本発明で重要な構造遺伝子の発現、即ちプロテアーゼ製造を決定する。

製造されたプロテアーゼは、例えば５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ヒスチジン−ＭＯＰＳゲル電気泳動によるプロテアーゼの分子量の測定、及び運動学的助変数Ｋｍ及びＶｓａχの測定、合成基質即ちサクシニル−し−アラニル −し−アラニル−し−プロピル−Ｌ−フェニルアラニル−ｐ−ニトロ−アナライト上での試験によって生化学的に特性化される。

次にエピゾーム又は染色体に組込まれた発現構成体を有するバチルス属宿主株を、酵素合成に適する諸条件の下で普通培地中で生育させる。普通培地は通常の場合にプラスミド保持手段、例えば“形質転換されない宿主が感受性を示す抗性物質”を存在させる手段を有する０発酵はブロスが消費され終るまで継続される。

生成物（製品）が分泌される場合にはこれを慣用技法例えば抽出、クロマトグラフィ、電気泳動又は類似技術によってブロスから単離する。生成物（製品）が細胞質内に保持されている場合には細胞群を遠心分離、濾過等によって収穫し、機械約せん断、洗剤、リゾチーム又はその他の技法によって溶菌化し、既述の通りにして製品を単離する。形質転換されない宿主細胞が高アルカリ活性プロテアーゼ産生菌である場合には本発明方法の適用により高アルカリ活性セリンプロテアーゼの著大に増加された収率が達成され、単一の染色体外遺伝子コピーを用いることにより、形質転換されない宿主細胞に比して通常は少なくとも約１２０％の収率を達成し得る。

発　を実施するための最良の形態下記の諸例は本発明の例示のためであって本発明を限定するためではない。

１−　アルカリ親和性バチルスｎｏｖｏ　ｓｐ、　ＰＨ１０からのゲノムＤＮＡライブラリの調製及びセリン　プロテアーゼ遺伝子の単離バチルスｎｏｖｏ　ｓｐ、　ＰＨ１０（寄託光：　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ　ｖｏｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ、　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｄｅｌｆｔ、　ｔｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ　；受託番号１ｈＯＲ−６０；米国特許Ｎｕ　Ｒｅ、３０６０２参照）から、サイトウ等（Ｓａｉｔｏ−Ｍｉｕｖａ＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ７２　（１９６３）６１９−６３２）の方法に従って単離された染色体のＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａを用いて部分的に切断し、プラスミドｐＵＢ１１０のＢａｍＨ１サイトの中へ連結させた（Ｇｒｙｃｚａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３４　（１９７８）　３１８−３２９）、ｐＵＢ１１０プラスミドＤＮＡは文献（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄＤｏｌｙ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、７　（１９７９）　１５１３　１５２３）記載のようにして調製された。

連結混合物を文献（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、８１（１９６１）７４１−７４６）記載の方法に従い、被惑染性の細胞群１−７！当り０．６〜１μｇＤＮＡを用いてＢ、スプチリスＩＡ４、０　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｒｅ　）の中へ導入してこれを形質転換させた。形質転換混合物からの細胞群を下記諸成分：即ち２．８％　Ｋ　ｚ　ＨＰ　Ｏ−、１，２％ＫｔＨＰＯ，，０，４％（Ｎ　Ｈ，）、Ｓ　Ｏ，。

０．２％トリーＮａ−サイトレート・２Ｈ，Ｏｌｏ、０４％Ｍｇ５Ｏａ　・７Ｈ，０，０，００００５％Ｍｎ５Ｏａ　・４ＨｔＯ−０，４％Ｌ−グルタミン酸、０．５％グルコース、０．０２％カザミノ酸、５０μｇｌ■ｌトリプトファン、２０μｇ　／　ｗｒ　１メチオニン、２０ｐｇ／麟Ｅリジン、２０μｇ／ｗｊネオマイシン、０．４％カゼイン及び１．５％寒恒温保持した後に、寒天平板上のコロニー周辺のカゼイン開裂生成物の円輪状沈積物の増加によって測定した時に、ｓｏ、ｏｏｏ個のネオマイシン耐性コロニーの中の１個が増加されたプロテアーゼ産生を示した０文献［Ｂｉｒｎｂｏｉ＋ｉ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

７　（１９７９）１５１３−１５２３）記載の方法に従って該コロニーからプラスミドＤＮＡを単離してこれをｐＭ５　Ｂと命名した。

１２　ＰＢ９２セリン　プロテアーゼ遺伝子の発現極小培地（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　４４（１９５８）１０７２−１０７８）　に０．０２％カザミノ酸、５０μｇ１０ｊ！）リブトファン、２０　／Ｊ　ｇ　／ｍｊ！メチオニン、２０，１７ｇ／１１１リジン及び２０μｇ　／　ｅａ　１２ネオマイシンを含有させ、この中でｐＭ５８を有するＢ、スブチリスｌＡ４０を生育させた。２４時間後に培養物を遠心分離してから上澄液について、基質としてジメチルカゼインを用いるプロテアーゼ活性試験（Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２４４　（１９６９）　７８９　７９３）を行なった。

プラスミドｐＵＢ１１０を有するＢ、スブチリスＩＡ４０の培養物を対照として使用したところこれは上記ｐＭ５８形質転換菌培養物が示すプロテアーゼ活性の１／６０以下の活性を示した。プロテアーゼ活性は１ｍＭフェニルスルホニルフルオライド（Ｐ？１ＳＦ）を用いる処理によって完全に阻害されたけれども２０ｍＭのＥＤＴＡを用いる処理による場合には阻害されなかった。

上記の上澄液の載量についてタンパク質ゲル上で文献記載（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７　（１９７０）　６８０）の方法に従って分析した。このゲル上での分析試料は該上澄液の５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）による処理で調製された。該試料を遠心分離してから沈積タンパク質のベレットをアセトンで２回洗浄した後に４゜／Ｊｊの試料用緩衝液（０，５ＭのＴｒｉｓ／ＨＣＪ　ｐＨ７，５，１ｏ％ｖ／ｖ２−メルカプトエタノール、５０％Ｖ／Ｖグリセロール及び０．０５％ブロモフェノール青含有液）の中で１０分間煮沸することによって溶解させた。電気泳動の後に呈色試薬（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ）の使用で呈色させた。次に培養物の上澄液試料を電気泳動゛によって分析した。３種の異なるＢ、スブテリスｌＡ４０株を用いた：即ちｐＵＢ１１０含有菌株；　ｐＭ５８含有菌株；及びプラスミド不含有菌株；並びに対照としてバチルス　ＰＨ１０プロテアーゼ゛。電気泳動の後に上記呈色試薬を用いてゲルを呈色させ、そして脱色した。９Ｍ５８を有するＢ、スブチリス　ｌＡ４０株は３１ＫＤのタンパク質を含有し、これはバチルス　ＰＢ９２プロテアーゼと共泳動した。該タンパク質は、ｐＵＢ１１０含有のＢ、スブチリス　ｌＡ４０株の対照法路上には検出されなかった。

すべてのセリン　プロテアーゼは類似の分子量を有する。けれどもバチルス　ＰＨ１０のクローニングされて得られたセリンプロテアーゼは、プロテアーゼ　ネガティブのＢ、ズブチリス株ＤＢ１０４に対する９Ｍ５８及びｐＵＢｌｌｏへの導入［Ｒ，Ｄｏｉ。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６０　（１９８４）　４４２−４４４）による形質転換及び細胞外産生プロテアーゼの分析によって、既知のセリンプロテアーゼ類（Ｂ、スブチリスのスブチリシン、カールスペルヒ　スブチリシン）から区別された。得られた形質転換体を極小培地（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、前掲文献）（０，０２％カザミノ酸、５０生育させた。２４時間後に試料を採り、遠心分離し、予備処理を施すことなくヒスチジン／ＭＯＰＳゲルＣＴ　５ｍＭ　ＫＯＨ，４０ＩＩＩＭヒスチジン、１００ｍＭ　ＭＯＰＳ　（３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸）％ｐＨ７，５及び５％ポリアクリルアミド含含有上上分析した。ｉｉｔ気泳動用緩衝液は４０１ヒスチジン、１００ｍＭＭ０ＰＳ、ｐＨ６，６を含有していた。試料を陰極方向で泳動させた。

プロテアーゼ　バンドをフィルム（Ａｇｆａ　Ｐａｎ　１００　Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｆｉｌｍ）の使用で検定した（Ｚｕｉｄｗｅｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎ、１４　（１９７２）　６８５ −７１４参照〕、結果を第１図に示す０図示の通り９Ｍ５８はバチルス　ＰＨ１０プロテアーゼをコードする遺伝子を有している。

■１　バチルス　ＰＨ１０セリン　プロテアーゼ遺伝子の配列サンガー法（Ｓａｎｇａｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４（１９７７）６４６３）によってｐＨ５ＢのＢａ１ｌ−Ｈｐａｌ断片の全配列を決定した。９Ｍ５８の制限断片（第２図参照）をファージＭ１３ベクター即ちｍｐｌ　Ｏ２ｍｐｌ　１及びｍｐｌ　８　（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、９　（１９８１）３０９−３２１）の中でクローニングした。ｐＭ５Ｂ断片の挿入物（複数）をプラーク夾雑法によってスクリーニングした。配列形成の後に遺伝子上で規則的間隔を保って位置する１０個のオリゴヌクレオチドが設けられ、配列形成が繰返され、第３図に示される通りに配列が確定された。

４Ｍ４　プラスミドｐＭＡＸ−４を有するセリン　プロテアーゼ遺伝子の構成構成体プラスミドｐＨＣＮ−７１０（第４Ａ図参照）は、ｐＵＢ　１１０のＴａｇＩ及びＰｖｕＩ［による切断の結果生成された。ネオマイシン耐性を与える遺伝子を有する断片を低融点性のアガロース上で純化してからフレナラ（Ｋｌｅｎｏｉｓ＞ポリメラーゼ及びＮＴＰ’ｓを用いて末端を平滑化した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　１９８２　）　ａプラスミドｐＵＣ？　（Ｖｉｅｉｒａｅｔａｌ、、　Ｇｅｎｅ　１９　（１９８２）　２５９−２６８〕を５ａＩｌｌの使用で直線状にしてから上記のように末端平滑化した。双方の断片をＴ４リガーゼの使用で連結（Ｍａｎ　ｉａｔ　ｉｓ）してから大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　１０３へ導入して形質転換させた。

２　ｘＴＹ平板培地（１，６％ｗ／ｖ　バクトートリプトン、１％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．５％ＮａＣ１２，５０μｇ／＋ｎｊ！アムピシリン及び１０μｇ／１ｎｌｌネオマイシン含有）上で選択を行なった。得られたプラスミドをｐＵＣＮ −７１０と命名し、これをＢａｍＨＩで切断した。プラスミドｐＥ１９４　［Ｊｏｒｄａｎｅｓｃｕ、　Ｐｌａｓｍｉｄ　１　（１９７８）４６８−４７９：ｌをＢＣＩＩで切断した。双方の消化処理から得られた断片（複数）をＴ４リガーゼによって連結してからＢ、スブチリスｌＡ４０へ導入して形質転換させた。極小平板培地〔２０μｇ／ｍＵのネオマイシン含有（例１参照）〕上で選択を行なった。得られたプラスミドｐＥ１９４−ｎｅｏ　（ｉ４Ａ図）はネオマイシン耐性遺伝子を有する。

組込みベクターｐＥ１９４−ｎｅｏの中のプロテアーゼ遺伝子のサブクローニングを下記のように遂行した：ｐＭ５８（例１参照）をＨｐａｌ及びＢＣＩＩ並びにＢｇｌｎを用いて切断した。プラスミドｐＥ１９４−１’ｌｅＯをＨｐａｌによって切断した。これらの断片をＴ４リガーゼの使用で連結してからＢ、ズブチリスｌＡ４０株へ導入して形質転換させた。この転換体を、ネオマイシン耐性及びプロテアーゼ増産性〔カゼイン開裂生成物沈積（円輪形成、例１参照）〕にもとづいて選択した。プラスミドｐＭＡＸ−４が得られ、その構造は制限酵素分析によって確認された（第４Ｂ図参照）。

例５　ｐＭＡＸ−４によるバチルス属菌株ＰＢ９２の原形質体の形質転換バチルス属菌株ＰＢ９２を１００ｍＡのＮＢＳＧ−Ｘ培地［Ｔｈｏｒｎｅｅｔ− ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、９１　（１９６６）　１０１２−１０２０］の中で終夜生育させた。この細菌培養物を回転機（Ｓｏｒｖａｌｌ　ｍｏｄｅｌ　ＧＳＡ　ｒｏｔｏｒ）中で４５００ｒｐ＋ｗの下に１０分間遠心処理した。０．５Ｍショ糖、０．０２Ｍ　ＭｇＣ７！　、及び０．０２１１　Ｔｒｉｓ／マレエート、ｐｏｓ、ｏを滅菌水中に含む１０ｍＪのアルカリ保持培地（ＡＨＭ）の中で１時間３０℃に恒温保持し、これに対し０．４■／ａＪのリゾチームを加えた。原形質体をペレント状にし緩衝液（３，５％１１／ｖ　Ｂａｃｔｏ　ＰｅｎａｓｓａｙブＶス及び０．０４％−／ＶアルブミンＭｅｒｉｅｕｘを添加されたＡＨＭｌｌｊ街液）に再懸濁させて混合してから前記のようにしてこれをベレット化した−５．０ｍ＃のアルカリ保持培地中に再懸濁させた後に０．５＋ｉｊ２のこの原形質体悲濁物と“１μｇのプラスミドＤＮＡを含む５μｇの無機質不含有水”とを混合し、３０％−／シポリエチレングリコール８０００、ｐＨ８，０の存在下で２分間恒温保持した。ＡＨＭ”　ｐｔ＋ｓ、ｏ緩衝液を用いて１：３に希釈した後に遠心処理し、得られたベレットを少量（１ｍ＃）のＡＨＭ” の中に再懸濁させて２〜３時間恒温保持した。この液の１００マイロリフドルを新規調製の平板培地（０，５Ｍ　：ｌ　ハク酸ナトリウム／ＨＣ＃　ｐＨ８，０，１，５％ｗ／ｖ寒天、０．５％−／Ｖカザミノ酸、０．５％−／ν酵母抽出物、０．０３１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ８，０，０，５％−／νグルコース、０．０２　Ｍ　ＭｇＣ１を及び０．０２％ｉ１／ｖアルブミンＭｅｒｉｅｕｘ含有培地〕上で培養した。

該平板培地は選択のための１０００μｇ／ｖａｎのネオマイシンをも含有していた。少なくとも７２時間３７℃に恒温保持した後に２０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含む心臓浸出物添加寒天平板培地上で該コロニーを複製−平板培養した。

肛　バチルス属菌株ＰＢ９２染色体へのｐＭＡＸ−４の組込み２０μｇ／鵬１のネオマイシンを含む心臓抽出物添加平板培地上で生育させた“ｐＭＡＸ−４を有するバチルス属菌株ＰＢ９２゜のコロニーを１μｇ／ｍｌのネオマイシンを含む１００ｍ＃のトリプトン　ソーヤブロス（ＴＳＢ）へ接種してから２４時間３７ ℃に恒温保持した。２ｓｌずつの２個の培養物（細胞数約１０９７ｍｆ）を、１ μｇ／ｒａｇのネオマイシンを含む同一培地の１００ｍ１で希釈し、２４時間５０℃に恒温保持した。２４時間後に５■ｌの該培養物（細胞数約１０”／ｍ１）を上記のように再希釈してから１μｇ／ｍｊ！のネオマイシンの存在下に２４時間５０℃に恒温保持した。該最後の操作をもう一度繰返した０次に細胞懸濁物を１００倍に希釈し、１μｇ／ｒａ１のネオマイシンを含む心臓抽出物（Ｈｌ）添加寒天（Ｄｉｆｃｏ）平板培地上で培養した。この培養物を１６時間５０℃に恒温保持した。ネオマイシン耐性コロニーを単離して１μｇ　／　ｒａ　ｆのネオマイシンを含む１０謬ＡのＴＳＢ培地中で該コロニーを１６時間３７℃に培養した。これらの培養物から全Ｄ’ＮＡを単離しくＨｏｌｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１４（１９８１）１９３−１９７）、アガロースゲル上でのＤＮＡの電気泳動によってプラスミドの不存在をチェックした。

プラスミドＤＮＡが検出されなかった試料について、全ＤＮＡのＢ、スブチリスｌＡ４０への導入による形質転換によって、再度のチェックを行なった。Ｂ、スプチリスｌＡ４０を形質転換させる能力のない試料はプラスミド不含有であると考えた。ネオマイシン耐性でプラスミド不含有のバチルス　ＰＢ９２由来菌株をＰＢＴ１０９と命名した。この菌株はその染色体中に組込まれたｐＭＡＸ−４プラスミドのひとつのコピーを有していた。

菌株ＰＢ７１０９への組込みは、プラスミド配列によって分別された染色体上の２個の縦に並んで位置するプロテアーゼ遺伝子について生じた相同的再結合にもとづくいわゆるキャムベル型（Ｃａｍｐｂｅｌ　１−　ｔｙｐｅ）機構によって行なわれたのである。菌株ＰＢ７１０９の該遺伝学的編成は本件と同時出願された係属中のＥＰＡ−号明細書中に示される通りに確認されており、本明細書中にも引用されている。

拠工　形質転換菌株によるプロテアーゼ製造形質転換菌株によるプロテアーゼ製造は米国特許Ｎｎ　Ｒｅ、３０６０２明細書記載の製造用培地の１００ｍｆを有する５００ｍｊ！容振盪フラスコに対する細胞数約１０’／ｍｆ含有のＴＳＢ培養物（０，２閣ｌ）の添加によって試験的に行なわれた。Ｂ、スブチリス菌株についてのテストの場合にはｐＨを７．０に調節した。菌株ＤＢ１０４（ｐＵＢｌ　１０）　、ＤＢＩ　０４　（ｐＭＡＸ−４）　、ＰＢ９２　（ｐＭＡＸ−１）については、濃度２０μｇ／　ｍ１１ＤＢＴ１０９については濃度１μｇ／ｖａ１においてネオマイシンを添加した。これらの細胞系統に関する相対的なプロテアーゼ産生率を第１表に示す。

呈上表ヅ　転換細菌によるプロテアーゼ産生率〔注）＊　ｐＭＡＸ　４のみによるプロテアーゼ遺伝子にもとづくプロテアーゼ産生率を測定するためにこのプラスミドを細胞外プロテアーゼ陰性Ｂ、スプチリスＤＢ１０４株（Ｒ，Ｄｏｉ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６０　（１９８４）　４４２−４４４〕へ導入して形質転換（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９６１）前掲文献〕させた。（例２参照）。

＊＊　基質としてジメチル　カゼインを用いてプロテアーゼ活性を試験した（Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２４４（１９６９）７８９−７９３参照）。

更にスケールを大きくして（１０１”）発酵させるとバチルスＰＢ９２　（ｐＭＡＸ−４）は、発酵培地にネオマイシンを加えなかった場合には不安定性を示してＰＢＴ１０９を使用した場合よりもプロテアーゼ産生率を減じた。

皮呈上■■尻旦閂性本発明による上記の成績から、工業的バチルス属菌株の染色体の中ヘセリンプロテアーゼをコードする同種起源又は異種起源の遺伝子を安定に導入することによってセリンプロテアーゼ製造のための藺草で効率的な操業方式が提供されることが明らかである。

既にセリンプロテアーゼを産生ずるバチルス属宿主菌株についてセリンプロテアーゼを増加産生させる方式も又提供される。宿主細胞染色体中へのプラスミド構成体の組込みは、染色体外プラスミド構成体の存在の場合よりも、製造的発酵に対してより安定した状況をもたらし、著しく増大したプロテアーゼ産生を達成させる。

本明細書中に引用された刊行物及び特許出願公報は本発明が属する分野の技術的レベルを示すものである。各刊行物及び特許出願公報は本明細書中に引用されるべきものと思われる限りすべて本明細書中に記載された。

本明細書の記載は充分であるし、本発明の範囲から逸脱しない限り多くの変改が可能であることは当業界の通常の知識をもつ技術者にとって明らかであろう。

１．２．３．４．５゜Ｆ工Ｇｔ、ｌＲＥ　ｌドーーーーーーー仝１０９８７６５４３２１　：　オリゴヌクレオチド１１ＪＯ１６０１８０ＡＡＡＣαπ−；α論ＡＭｒππＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＧＣＡＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴＣＴＣｉＴＴＧ；ニーＴＡＣｉＴＴＣＡＳａｒ工１ａＡｌａｓｓｒＡｌａＡｌａｃｌｕｃ１ｕＡｌａＬｙｓＣａ１ｕＬｙｓＴｙｒＬｅｕＩｌｅｃｌｙＰｈｔＡｓｎＣ１ｕＧｌｎ２６０　′２８０　３００ＣＡＡＣ０ｖｒｃＡ（ＴＣＡ（ＴＩＴ（πＡＣＡＡＣん％ＣｒＡＣＡＧＧＣＡＡＡＴＣＡＣＣＡαπαＫＣＡτＩ’Ｃ７σにＴＣ１ｕＡｌａＶａ１５ｅ＜ｌｕ、 ’ｈｅＶａｌＣ１ｕＣ１ｎＶａｌＣｉｌｕＡｌａＡｓｎＡｓｐｃｌｕＶａｌＡｌａＩＬｅＬｅ６ｅｒＱＡＧＱｋＡＧＡＧＣＡＡＱＴＣＣＡＡＡＴＴＧｋＡτｒＧｃＴｒｃＡＴＧＡＡＴ−ｎ〜すＣＧＡＴＩ℃；ａτｒＴＡπＣＧｌｕＧｌｕＧｌｕｃｌｕＶａｌＧ１ｕＩｌｅＣ１ｕＬｅｕＬａｕＰｉｓＣ１ｕＰｈｅＣ１ｕＴｈｒ工１ｅＰｒｏＶａｌＬｅ！５ｒ３８０　１ｉ００　４２０ＣτＴＣＡＣ：’ｎＡＡＱＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴｃ′ｒＣＡＡＣＧＣＱＣτＴＯＡＡＣＴＣＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴｒｒＣττＡ丁ＡＴＴｒ工Ｇυ罠Ｅ３５００　５２０　５ＩｉＯＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣｉＣＣＣＡＴＡＡＣＣロ１冨πシＣＡズ「πππにワ人鯖σテＧ＝ごｃｃｒｃＣＡＴＡＣＡｒＡＴＴｒＣＣＡＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＴＡＡＡＴＡＴ１℃ロワコー℃ＧＣＴＡα：ＴＴＴＧ’ｒＡＣＣＡＡｓｐＴｈｒｌ：ｉｌｙ工１ａｓｓｒＴｈｒＨ１ｓＰｒｏＡｓｐＬｅｕＡｓ＋ｄｌｅＡｒｇｃｌｙＧ　１ｙＡ１ａｓｓｒＰｈｅＶａｌＰｘＧＣｉＧＧＡＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＣＡπ℃■μＴαχ１ｃＡＩＴＧＧｃＡαχλτＧＴＧＧ、ｅｃＧＡＴｒＧｃＴ（ｉｌｙＧｌｕＰｒｏＳｅｒＴｈに−ｐ（ｉｌｙＡｓｎＧｌｙＫｉｓＧｌｙＴｈｒＨＬ、ＶａｌＡｌａＧ１ｙＴｈｒ工ｌａＡｌａｃｃｒｒｒＡＩＩＩＡｃＭｒｒｃｃＡｒｒｃｃｃｃ”ｘ↑＝７刀α７ＡＧＣＡＣＣＣｉＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＴＡＴＡＣαπロＴＡｌａＬｅｕＡｓｎＡｓｎｓｅｒ工１ｅＧｌｙＶａｌＬｅｕｃｉｌｙＶａｌＡｌａＰｒｏＡｓｎＡｌａｃｌｕＬｅｕＴｙｒＡｌａＶａ１７４ｏ　７６０　７８０ＡＡＡＣＡＴ　ＡＴＴＡＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＴＴＣＡαｒにＧＣＴＣＡαπ α詰ＴＩ’ＥＣＣＡＡＧ（、ＡＴｒＣＣＭπ℃ＬｙｓＶａｌＬｅｕＣ１ｙＡｌａｓｅｒＧ１ｙｓｅ＜１ｙｓｅｒＶ凶ｒｓｅｒ工１ａＡｌａ（ｎｎｃ１ｙＬｅｕＧｌｕＴｒｐα漬α−仏ＣＡＡ−χＺＡ７＝ＡＣごコ℃ＣＴＡＡＴＴＴりＣ：τＡＧＣＡＡＧＣＣＣ’ＴＴＣＣＣＣＡＡＧｒＧＣＣＡＸ　ａｃ１ｙＡｓｎＡｓｎＣ１％ｅｔ？、ＬＳＶａｌＡｌａＡｓｎＬａｕｓｅｒＬｅｕＧｌｙｓｅｅツｅｒＰ冗Ｓｓ！”Ａｌ！ＡＣＡＣＴＴＣＡαシ講απＧＴｒＡＡＴＡＧＣＧＣＣＡＣＴＴＩ：ゴＡＧＡＧＧＣ：匡フ：〒−７πＡＧＣ（４ＣＡππフ５ｒＬｅｕ（ｉｌｕＧｌｎＡｌ　ｍＶａｌＡｓｎｓｅ　ｒＡｌａＴｈｒｓａ　ｒＡｒｇｃｌｙＶａｌＬｅｕＶ＋ａｌＶａｌＡｌ　ａＡｌａ唐■■ α追品ＴにＡｃｃｒｃＣＡＬＡｃｒｃ、ｕｘＡｃｃｒＡπＣＧＧＣＣＣＧＴｒＡＴＧＣＣＡＡＣ（Ｘ：ＡＡπ力ＣＡＧＴＣＧｌｙＡｓｎＳｅｒＣ１ｙＡｌａＧ１ｙＳｅｒ工１ａＳｅｒＴｙｒＰｒｏＡｌａＡｒｇＴｙｒＡｌａＡｓｎＡｌａＭｅｔｊｕａＶａｌＧＣＡＧＣＴＡＣＴＣＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＴｒＴＴＣＡＣＡＣｉＴ、ＡＴ（ｉＣｉＣＣＣＡＧｏＳ−ｈＡＣＡb ＡＴＴＧＴＣＧＣＡＣＣＡＧσｒＧｒＡＡＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＣＡＧｃｒＴＣＡＡＣＧｒＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＡｌｏ。

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泳路１：カールスペルヒ　スブチリシン（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）旅路２：バチルス　ＰＨ１０プロテアーゼ旅路３：バチルス　スブチリス　スブテリシン旅路４：バチルス　スブチリス　ＤＢ１０４　（ｐＭ５８）旅路４：バチルス　スブチリス　ＤＢＩ　０４　（ｐＵＢｌ　１０）第２図はプラスミドｐＭ５８の制限酵素地図を示す。更にこの図の上方部に配列方策を示す。

実線矢印はファージＭ１３ベクター類即ちｍｐｌ　Ｏ，ｒａｐＨ及びｍｐｌ３の中へクローニングされた断片（フラグメント）を表す、この図の下方部はプロテアーゼ遺伝子上で規則的な間隔を保って位置する１０個のオリゴヌクレオチドを用いる配列方策を示す。

第３図はバチルス　ＰＢ９−２のセリン　プロテアーゼのアミノ酸配列に相関する暗号鎖のヌクレオチド配列を示す、ＤＮＡ配列のプロモーター（ＰＩ、Ｐ２）　、リポソーム結合部位（ｒｂｓ）及び終了域（ｔｅｒ＋ｓ）も又示されている６番号付きの実線は配列形成に用いられた１０個のオリゴヌクレオチドの位置を示す。

第４ａ図はプラスミドＩ）Ｅ１９４ｎｅｏの構成を示す。

第４ｂ図はプラスミドｐＭＡＸ−４の構成を示す・手続補正帯（方式）アルカリ性ｐＨにおいてフソゲン存在下に宿主細胞の原形質体と、宿主細胞に対して内因性酵素をコードするＤ　Ｎ　Ａ配列を有するプラスミド構成体と、宿主細胞内で機能する複製系と、及び選択用マーカー遺伝子とを結合させ、かようにして該ＤＮＡを宿主細胞内へ導入し；該ＤＮＡを有する宿主細胞を選択し；そして該有用なポリペプチドの合成に適する条件下で宿主細胞を生育させることを特徴とする方法。

１９、宿主細胞がバチルス属新種ＰＢ９２、特許請求の範囲第１８項記載の方法。

２０、内因性酵素がセリンプロテアーゼ、好ましくは高アルカリ活性プロテアーゼである請求の範囲第１８又は１９項記載の方法。

２１、少なくとも１コピーのＤＮＡが宿主細胞内へ導入される請求の範囲第１８〜２０項のいずれか１項記載の方法。

２２、冥賃上下記のアミノ酸配列：Ｈ２ｔＪ−Ａ−０−５−Ｖ−Ｐ−ＳＪ−Ｇ−Ｘ−５−Ｒ−Ｖ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ａ− Ａ州−Ｎ−Ｒ−Ｇ−Ｌ−Ｔ−Ｇ−５−Ｇ−Ｖ−に−Ｖ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｄ−Ｔ−Ｇ −Ｉ　−５−Ｔ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｌ−Ｌｌ　−Ｉ　−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ａ−５−Ｆ−Ｖ −Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｐ　−Ｓ−Ｔ−０−ｒ）|Ｇ−Ｍ　− Ｇ−１（−Ｇ−’Ｍ　−Ｖ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｉ　−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｎ−ｔＪ−５−Ｘ　−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｐ−（Ｊ−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｙ−`−Ｖ− に−Ｖ−Ｌ−Ｇ−Ａ−５−Ｇ−５−Ｇ−５−Ｖ−５−５−Ｉ−Ａ−０−Ｇ−Ｌ− Ｅ−′、７−Ａ−Ｇ−Ｎ−ＦＪ−Ｇ−ＭＪＩ−Ｖ−Ａ−Ｎ−k− ５−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｐ−５−Ｐ−５−Ａ−Ｔ−Ｌ−Ｅ−０−Ａ−Ｖ−ＦＴ−５−Ａ −Ｔ−５−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｖ−Ａ−Ａ−５−Ｇ−ＦＴ@− ５−Ｇ−Ａ−Ｇ−５−ニー５−Ｙ−Ｐ−Ａ−Ｒ−Ｙ−Ａ−：Ｊ−Ａ−門−Ａ−Ｖ −Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｄ−Ｑ−：（−ｔＪ−：Ｊ−Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｆ|５− Ｑ−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−ニーＶ−Ａ−？−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｖ−０−５−Ｔ− Ｙ−Ｐ−Ｇ−５−Ｔ−Ｙ−八−５−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−５−１４−Ａ−’ｒ−Ｐ− １−Ｖ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｖ−に−Ｑ−に−ＬＴ−Ｐ−５−１７−５− Ｎ−Ｖ−Ｑ−ニーＲ−ＦＪ−’、（−k−に−？Ｊ− Ｔ−八　Ｔ−５−Ｌ−Ｇ−５−Ｔ−Ｎ−！、−Ｙ−Ｇ−５−Ｇ−Ｌ−Ｖ−！Ｊ− ＡｍＥ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｒ−Ｃ）０１４　。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．転写を指令する場合において、バチルス属に属する宿主細胞の中で機能する転写調節域及び翻訳開始域、高アルカリ活性タンパク分解性酵素をコードするＤＮＡ配列、該宿主細胞内で機能する翻訳終了域及び転写終了域、但し該ＤＮＡ配列による発現は該開始域及び終了域の調節制御下にあるものであり；並びに少なくとも１個のマーカー遺伝子及び細菌由来プラスミドの温度感受性の複製起点を有することを特徴とする発現カセット。
２．タンパク分解性酵素がアルカリ親和性バチルス属ＰＢ９２種の菌株から得られる請求の範囲第１項記載の発現カセット。
３．ＤＮＡ配列がバチルス属新種ＰＢ９２のタンパク分解性酵素をコードする遺伝子の少なくとも７０％の相同性をそのヌクレオチド配列の中に有する請求の範囲第１項記載の発現カセット。
４．ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が実質上下記のアミノ酸配列：【配列があります】を有する請求の範囲第１項記載の発現カセット。
５．転写を指令する場合において、形質転換されたバチルス属に属する宿主細胞の中で機能する転写調節域及び翻訳開始域、高アルカリ活性セリンプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列及び該宿主細胞内で機能する翻訳及び転写終了調節域、但し該ＤＮＡ配列による発現は該転写及び翻訳域の調節制御下にあるものであり；並びに少なくとも１個のマーカー遺伝子及び細菌由来プラスミドの温度感受性の複製起点を持つ発現カセットを有することを特徴とする上記の形質転換されたバチルス属に属する宿主細胞。
６．少なくとも２コピーのＤＮＡ配列が細胞の染色体の中へ組込まれている請求の範囲第５項記載の細胞。
７．宿主細胞が形質転換された野生型のセリンプロテアーゼ産生細胞である請求の範囲第５項記載の細胞。
８．宿主細胞が野生型セリンプロテアーゼ産生細胞の形質転換された突然変異細胞である請求の範囲第５項記載の細胞。
９．突然変異細胞がセリンプロテアーゼ非産生細胞である請求の範囲第８項記載の細胞。
１０．高アルカリ活性セリンプロテアーゼがバチルス属新種ＰＢ９２から得られる請求の範囲第５項記載の細胞。
１１．アルカリ親和性のバチルス属に属する宿主細胞の中でセリンプロテアーゼを産生する方法において、転写を指令する場合に、転写及び翻訳開始調節域；セリンプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列；転写及び翻訳終了調節域、但し該調節域は宿主細胞内で機能するものであり；及び形質転換された宿主細胞の選択のための選択用マーカー遺伝子を有する発現カセットを宿主細胞の中へ導入し；該発現カセットを持つ形質転換宿主細胞を選択条件下に生育させ、それによって形質転換培養物が“形質転換され得なかった親細胞”を実質上含有しないようにし；そして該形質転換培養物を普通培地中で恒温保持し、かようにしてセリンプロテアーゼを増大された量において産生することを特徴とする方法。
１２．宿主細胞が野生型のセリンプロテアーゼ産生細胞である請求の範囲第１１項記載の方法。
１３．宿主細胞が野生型セリンプロテアーゼ産生細胞の突然変異型のものである請求の範囲第１１項記載の方法。
１４．突然変異型がセリンプロテアーゼ非産生細胞である請求の範囲第１３項記載の方法。
１５．アルカリ親和性菌株がバチルス属新種ＰＢ９２である請求の範囲第１２項記載の方法。
１６．アルカリ親和性バチルス属細胞を形質転換させる方法において、バチルス属細胞をアルカリ性培地中て約２０〜約３７℃においてリゾチームを用いる予備処理に付して原形質体を形成させ；原形質体をリゾチームから分別し；フソゲンの存在下に約２０〜３０℃において該原形質体とＤＮＡ構成体とを結合させ；フソゲンを希釈してバチルス属細胞を再生させ；そして該再生バチルス属細胞を選択条件下に生育させることを特徴とする方法。
１７．ＤＮＡ構成体が、転写を指令する場合に、転写及び翻訳開始調節域；有用なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；宿主細胞内で機能するものである転写及び翻訳終了調節域を有する請求の範囲第１６項記載の方法。
１８．アルカリ親和性バチルス属菌株宿主細胞の中で有用なポリペプチドを増大された量で産生する方法において、アルカリ性ｐＨにおいてフソゲン存在下に宿主細胞の原形質体と、宿主細胞に対して内因性酵素をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミド構成体と、宿主細胞内で機能する複製系と、及び選択用マーカー遺伝子とを結合させ、かようにして該ＤＮＡを宿主細胞内へ導入し；該ＤＮＡを有する宿主細胞を選択し；そして該有用なポリペプチドの合成に適する条件下で宿主細胞を生育させることを特徴とする方法。
１９．宿主細胞かバチルス属新種ＰＢ９２である請求の範囲第１８項記載の方法。
２０．内因性酵素がセリンプロテアーゼ、好ましくは高アルカリ活性プロテアーゼである請求の範囲第１８又は１９項記載の方法。
２１．少なくとも１コピーのＤＮＡか宿主細胞内へ導入される請求の範囲第１８〜２０項のいずれか１項記載の方法。
２２．実質上下記のアミノ酸配列：を有する“ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列”。
２３．バチルス属新種ＰＢ９２から由来するセリンプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列。
２４．形質転換バチルス属宿主細胞において、該細胞が下記方法即ちバチルス属宿主細胞内で発現され得るセリンプロテアーゼをコードする遺伝子を有するＤＮＡ断片を単離し；該ＤＮＡ断片と直線型ベクターのＤＮＡと結合させて該遺伝子と選択用マーカーとを有するベクターを生成させ；宿主細胞から調製された原形質体と該ベクターとをフソゲンの存在下にアルカリ性ｐＨにおいて結合させ、それによって該遺伝子を宿主細胞中へ導入して宿主細胞の染色体の中へ組込み；そして該遺伝子を安定して有する宿主細胞を選択する諸工程を包含する方法によって得られたことを特徴とする上記の細胞。
２５．バチルス属宿主細胞がバチルス属新種ＰＢ９２である請求の範囲第２４項記載の形質転換されたバチルス属宿主細胞。
２６．ベクターがｐＭＡＸ−４である請求の範囲第２４項記載の形質転換されたバチルス属宿主細胞。
２７．プラスミドｐＭＡＸ−４。
２８．バチルス属に属する菌株ＰＢＴ１０９。
２９．単離されたＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドにおいて、バチルス属新種ＰＢ９２から得られる高アルカリ活性セリンプロテアーゼのアミノ酸配列をコードする配列と交雑し得るヌクレオチドから選択れさた少なくとも１５個のヌクレオチド群を有することを特徴とする上記のオリゴヌクレオチド。
３０．放射性標識を有する請求の範囲第２９項記載のオリゴヌクレオチド。
３１．少なくとも２０個の配列のヌクレオチド群を有する請求の範囲第２９又は３０項記載のオリゴヌクレオチド。