KR20160142322A

KR20160142322A - 펩티드 이중 glp-1/글루카곤 수용체 효능제로서의 엑센딘-4 유도체

Info

Publication number: KR20160142322A
Application number: KR1020167029222A
Authority: KR
Inventors: 마르틴 보싸르트; 랄프 엘베르트; 안드레아스 에베르스; 토르스텐 하아크; 지그프리트 스텐겔린; 미하엘 바그너
Original assignee: 사노피
Priority date: 2014-04-07
Filing date: 2015-04-02
Publication date: 2016-12-12
Also published as: CN106414486A; SI3129395T1; MX2016013244A; IL247834A0; JP2017519718A; EP3129395B1; AU2015243610B2; US9775904B2; TW201625668A; RU2016142018A; US20150315260A1; AR099975A1; AU2015243610A1; BR112016022754A2; WO2015155139A1; RU2016142018A3; CA2944682A1; SG11201607646UA; HRP20190388T1; EP3129395A1

Abstract

본 발명은 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제 및 예를 들어 당뇨병 및 비만을 포함하는 대사 증후군 장애의 치료에서뿐만 아니라 과도한 음식 섭취의 감소를 위한 이의 의학적 용도에 관한 것이다.

Description

펩티드 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제로서의 엑센딘-4 유도체{EXENDIN-4 DERIVATIVES AS PEPTIDIC DUAL GLP-1/GLUCAGON RECEPTOR AGONISTS}

본 발명은 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제 및 예를 들어, 당뇨병 및 비만을 포함하는 대사 증후군 장애의 치료에서 뿐만 아니라 과도한 음식 섭취의 감소를 위한 이의 의학적 용도에 관한 것이다. 이들 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제는 GIP 수용체에서 감소된 활성을 나타내어 저혈당증의 위험을 감소시키며, 순수한 GLP-1 수용체 효능제인 엑센딘-4에서 구조적으로 유래된다.

Pocai 등(Obesity 2012;20:1566-1571; Diabetes 2009, 58, 2258) 및 Day 등(Nat Chem Biol 2009;5:749)은, 예를 들어 하나의 분자에 GLP-1 및 글루카곤의 작용을 조합하여 무엇보다도 글루카곤-수용체 매개된 식욕 증가 및 에너지 소비로 인해 순수한 GLP-1 효능제에 비해 더 우수한 현저한 체중 감량 효과 및 항-당뇨 작용을 갖는 치료 원리로 이어지는, 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1) 및 글루카곤 수용체의 이중 효능제를 기재한다.

Holst(Physiol. Rev. 2007, 87, 1409) 및 Meier(Nat. Rev. Endocrinol. 2012, 8, 728)는 GLP-1 수용체 효능제, 예컨대 GLP-1, 리라글루티드 및 엑센딘-4가 공복 및 식후 글루코스(FPG 및 PPG)를 감소시킴으로써 T2DM 환자에서 혈당 제어를 개선시키는 3 가지 주요 약리 활성을 갖는다고 기술한다: (i) 증가된 글루코스-의존성 인슐린 분비(개선된 1-상 및 2-상), (ii) 고혈당 질환 하의 글루카곤 억제 활성, (iii) 식사-유래 글루코스의 흡수 지체를 발생시키는 위 배출의 지연.

GLP-1(7-36)-아미드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2로 제시된다:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂

리라글루티드(Liraglutide)는 다른 변형 중에서 지방산이 위치 20의 리신에 연결되어 연장된 작용 기간을 발생시키는 시판되는 화학적으로 변형된 GLP-1 유사체이다(Drucker DJ et al, Nature Drug Disc. Rev. 9, 267-268, 2010; Buse, J.B. et al., Lancet, 374:39-47, 2009).

리라글루티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4로 제시된다:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-) EFIAWLVRGRG-OH

글루카곤은 혈당이 낮은 경우 혈류 내로 방출되는 29-아미노산 펩티드이다. 글루카곤의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3으로 제시된다:

HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH

저혈당 동안, 혈당 수준이 정상 아래로 떨어지는 경우, 글루카곤은 간에 신호를 보내 글리코겐을 분해시키고, 글루코스를 방출시켜, 혈당 수준을 증가시켜 정상 수준에 도달시킨다. 최근 문헌에서는 글루카곤이 체지방 질량의 감소, 음식 섭취 감소 및 에너지 소비의 증가에 추가적인 이로운 효과를 가짐을 제시한다(KM Heppner, Physiology & Behavior 2010, 100, 545-548).

GIP(글루코스-의존성 인슐린자극 폴리펩티드)는 음식 섭취 후 장 K-세포로부터 방출되는 42 개의 아미노산 펩티드이다. GIP 및 GLP-1은 인크레틴 효과를 담당하는 2 개의 장 내분비 세포-유래 호르몬이며, 이들은 경구 글루코스 유발접종에 대한 인슐린 반응의 70% 초과를 차지한다(Baggio LL, Drucker DJ. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology 2007; 132: 2131-2157).

GIP의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5로 제시된다:

YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ-OH

GLP-1 또는 글루카곤의 구조에 기반하며, 글루카곤 및 GLP-1 수용체에 모두 결합하고 이를 활성화하며(Hjort et al. Journal of Biological Chemistry, 269, 30121-30124, 1994; Day JW et al, Nature Chem Biol, 5: 749-757, 2009) 체중 증가를 억제하고 음식 섭취를 감소시키는 펩티드는 그 내용이 참조로서 본원에 포함되는 특허 출원 WO 2008/071972, WO 2008/101017, WO 2009/155258, WO 2010/096052, WO 2010/096142, WO 2011/075393, WO 2008/152403, WO 2010/070251, WO 2010/070252, WO 2010/070253, WO 2010/070255, WO 2011/160630, WO 2011/006497, WO 2011/087671, WO 2011/087672, WO 2011/117415, WO 2011/117416, WO 2012/177443 WO 2012/177444, WO 2012/150503, WO 2013/004983, WO 2013/092703, WO 2014/041195 및 WO 2014/041375에 기재된다. 체중 감소는 순수한 GLP-1 효능제에 비해 더 우수한 것으로 밝혀졌다.

또한, GLP-1 및 글루카곤 수용체뿐만 아니라 GIP 수용체를 활성화하는 삼중 공동-효능제 펩티드가 WO 2012/088116 및 VA Gault 등(Biochem Pharmacol, 85, 16655-16662, 2013; Diabetologia, 56, 1417-1424, 2013)에 기재된다.

엑센딘-4는 미국 독도마뱀(헬로더마 서스펙텀(Heloderma suspectum))의 침샘에서 생산되는 39개 아미노산 펩티드이다(Eng, J. et al., J. Biol. Chem., 267:7402-05, 1992). 엑센딘-4는 GLP-1 수용체의 활성제인 반면, 이는 GIP 수용체의 낮은 활성화를 나타내고, 글루카곤 수용체를 활성화하지 않는다(표 1 참조).

방법에 기재된 바와 같이 형성된 cAMP를 측정하는, 증가하는 농도에서 인간 GLP-1, GIP 및 글루카곤 수용체에서 엑센딘-4의 효능(pM로 표시됨).

SEQ ID NO:	펩티드	EC50 hGLP-1 R [pM]	EC50 hGIP R [pM]	EC50 h글루카곤 R [pM]
1	엑센딘-4	0.4	12500.0	10000000 초과

엑센딘-4의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 제시된다:

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2

엑센딘-4는 GLP-1을 이용하여 관찰된 많은 당조절 작용을 공유한다. 임상 및 비-임상 연구에서 엑센딘-4는 인슐린 합성 및 분비에서 글루코스 의존성 증강, 글루카곤 분비의 글루코스 의존성 억제, 위 배출 늦춤, 음식 섭취 및 체중의 감소 및 베타-세포 덩어리 및 베타 세포 기능의 마커의 증가를 포함하는 여러 이로운 항당뇨 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다(Gentilella R et al., Diabetes Obes Metab., 11:544-56, 2009; Norris SL et al., Diabet Med., 26:837-46, 2009; Bunck MC et al., Diabetes Care., 34:2041-7, 2011).

이들 효과는 당뇨뿐만 아니라 비만으로 고통받는 환자에게도 이롭다. 비만인 환자는 당뇨병, 고혈압, 고지질혈증, 심혈관 및 근골격 질병에 걸릴 위험이 더 높다.

GLP-1와 비교하여, 엑센딘-4는 디펩티딜 펩티다제-4(DPP4)에 의한 분해에 내성이어서 더 긴 반감기 및 생체내 작용 기간을 발생시킨다(Eng J., Diabetes, 45(Suppl 2):152A(abstract 554), 1996).

엑센딘-4는 또한 GLP-1, 글루카곤 또는 옥신토모듈린(oxyntomodulin)과 비교하는 경우 중성 엔도펩티다제(NEP)에 의한 분해에 훨씬 더 안정적인 것으로 밝혀졌다(Druce MR et al., Endocrinology, 150(4), 1712-1721, 2009). 그럼에도 불구하고, 엑센딘-4는 위치 14에서의 메티오닌 산화(Hargrove DM et al., Regul. Pept., 141: 113-9, 2007)뿐만 아니라 위치 28에서의 아스파라긴의 탈아미드화 및 이성화(WO 2004/035623)로 인해 화학적으로 불안정하다.

본 발명의 화합물은 엑센딘-4 유도체이며, 이는 천연 엑센딘-4의 GLP-1 수용체에서의 효능 활성에 부가하여 글루카곤 수용체에서 효능제 활성을 나타내며, 다른 것 중에서 하기 변형을 갖는다: 친지성 잔기로 추가 치환되는, 위치 14에서의 측쇄에 -NH₂ 기를 갖는 아미노산(예를 들어, 링커와 조합된 지방산) 및 위치 27에서의 Aib.

Bloom 등(WO 2006/134340)은 글루카곤 및 GLP-1 수용체 둘 다에 결합하고 이를 활성화하는 펩티드가 글루카곤 및 엑센딘-4로부터의 하이브리드 분자로서 구축될 수 있음을 개시하며, 상기 N-말단 부분(예를 들어, 잔기 1 내지 14 또는 1 내지 24)은 글루카곤에서 유래하며 C-말단 부분(예를 들어, 잔기 15 내지 39 또는 25 내지 39)은 엑센딘-4에서 유래한다. 이러한 펩티드는 위치 10 내지 13에 글루카곤의 아미노산 모티프 YSKY를 포함한다. Krstenansky 등(Biochemistry, 25, 3833-3839, 1986)은 그 수용체 상호작용 및 아데닐레이트 사이클라제의 활성화를 위해 글루카곤의 이들 잔기 10 내지 13의 중요성을 나타낸다.

본 발명에 기재된 엑센딘-4 유도체에서, 여러 기저 잔기는 WO 2006/134340에 기재된 펩티드 및 글루카곤과 상이하다. 특히 글루카곤의 피브릴화에 기여하는 것으로 알려진 잔기 Tyr10 및 Tyr13(DE Otzen, Biochemistry, 45, 14503-14512, 2006)은 위치 10에서 Leu으로 그리고 위치 13에서 비방향족 극성 아미노산, Gln으로 치환된다. 특히 위치 23의 이소류신 및 위치 24의 글루타메이트와 조합된 상기 치환은 용액 중에서의 용해도 또는 응집 거동과 같은 잠재적으로 개선된 생물리학적 특성을 갖는 엑센딘-4 유도체를 발생시킨다. 엑센딘-4 유사체의 위치 13에서의 방향족 아미노산의 극성 아미노산에 의한 비-보존성 치환은 놀랍게도 GLP-1 수용체에 대한 이의 활성을 유지하며 글루카곤 수용체에 대해 높은 활성을 갖는 펩티드를 발생시킨다(또한 WO2013/186240 참조).

추가로, 본 발명자들은 놀랍게도 위치 27에 Aib 아미노산을 갖는 화합물이 실시예 5, 표 8에 나타낸 바와 같이, 천연 엑센딘-4에서의 위치 27의 Lys을 갖는 상응하는 유도체에 비해 GIP 수용체에 대해 감소된 활성을 나타내는 것을 발견하였다. 당뇨에서 고수준의 GIP가 일부 경우 보다 빈번한 저혈당 에피소드를 발생시킬 수 있다는 문헌 내 보고가 존재하므로, GIP 수용체의 감소된 활성화는 잠재적으로 이롭다(T McLaughlin et al., J Clin Endocrinol Metab, 95, 1851-1855, 2010; A Hadji-Georgopoulos, J Clin Endocrinol Metab, 56, 648-652, 1983).

또한, 본 발명의 화합물은 위치 14에 지방산 아실화된 잔기를 갖는 엑센딘-4 유도체이다. 위치 14에서의 상기 지방산 관능화는 상응하는 비-아실화된 엑센딘-4 유도체, 예를 들어 실시예 5, 표 7에 나타낸 것들과 비교하는 경우, GLP-1 수용체에서 뿐만 아니라 글루카곤 수용체에서 높은 활성을 갖는 엑센딘-4 유도체를 발생시킨다. 또한, 상기 변형은 개선된 약동학 프로파일을 발생시킨다.

위치 14에 아세틸화된 리신을 갖는 GLP-1 유사체는 천연 GLP-1에 비해 GLP-1 수용체에 대해 유의미하게 감소된 효능을 나타내는 것이 문헌 [Murage EN et al., Bioorg. Med. Chem. 16(2008), 10106-10112]에 기재되어 있다.

본 발명의 화합물은 천연 GLP-1 및 글루카곤과 비교하는 경우, 중성 엔도펩티다제(NEP) 및 디펩티딜 펩티다제-4(DPP4)에 의한 분해에 더욱 내성이 있어서 생체내 더 긴 반감기와 작용 기간을 발생시킨다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 중성 pH뿐만 아니라 pH 4.5에서 가용성이다. 상기 특성은 잠재적으로 인슐린 또는 인슐린 유도체와의, 바람직하게는 기본 인슐린 유사 인슐린 글라진/Lantus?과의 조합 요법을 위한 공동-제형화를 허용한다.

발명의 간략한 요약

천연 엑센딘-4는 글루카곤 수용체에 대해 활성을 갖지 않고 GIP 수용체에 대해 낮은 활성을 갖는 순수한 GLP-1 수용체 효능제이다. 천연 엑센딘-4의 구조에 기반하지만 SEQ ID NO: 1에 비해 10개 이상의 위치에서 상이한 엑센딘-4 유도체가 본원에 제공되며, 여기서 차이는 글루카곤 수용체에서 효능 활성의 증강에 기여한다. 다른 치환 중에서 - 위치 14에서의 메티오닌은 측쇄에 -NH₂ 기를 갖는 아미노산으로 치환되며, 이는 친지성 잔기(예를 들어, 링커와 조합된 지방산)로 추가 치환된다. 또한, 본 발명자들은 놀랍게도 위치 27에서의 Aib에 의한 리신 치환이 GLP-1 수용체 활성에 비해 감소된 GIP 수용체 활성을 발생시키는 것을 발견하였다. 당뇨에서 고수준의 GIP가 일부 경우 보다 빈번한 저혈당 에피소드를 발생시킬 수 있다는 문헌 내 보고가 존재하므로, GIP 수용체의 감소된 활성화는 잠재적으로 이롭다(T McLaughlin et al., J Clin Endocrinol Metab, 95, 1851-1855, 2010; A Hadji-Georgopoulos, J Clin Endocrinol Metab, 56, 648-652, 1983).

본 발명은 화학식 (I)의 펩티드 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물을 제공한다:

H₂N-His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Asp-Glu-Gln-Arg-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Aib-X28-X29-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-R¹ (I)

X14는 Lys, Orn, Dab 또는 Dap으로 구성된 군으로부터 선택된 관능화된 -NH₂ 측쇄기를 갖는 아미노산 잔기를 나타내며, 상기 -NH₂ 측쇄기는 -Z-C(O)-R⁵에 의해 관능화되며, 여기서

Z는 모든 입체이성질체 형태의 링커를 나타내고,

R⁵는 최대 50 개 탄소 원자 그리고 N 및 O로부터 선택된 헤테로원자를 포함하는 모이어티이고,

X28은 Ala, Lys 및 Ser으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

X29는 D-Ala 및 Gly으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

R¹은 NH₂ 또는 OH이다.

본 발명의 화합물은 이들이 방법에 기재된 검정 시스템에서 세포내 cAMP 형성을 자극할 수 있다는 관찰에 의해 결정되는 GLP-1 및 글루카곤 수용체 효능제이다.

또 다른 구현예에 따르면, 특히 위치 14에 리신을 가지며, 친지성 잔기로 추가 치환되는 본 발명의 화합물은 GLP-1 수용체에서 GLP-1(7-36)아미드에서에 비해 적어도 0.1%(즉, EC₅₀ 700 pM 미만), 보다 바람직하게는 1%(즉, EC₅₀ 70 pM 미만), 더욱 바람직하게는 5%(즉, EC₅₀ 14 pM 미만), 더욱 더 바람직하게는 10%(즉, EC₅₀ 7 pM 미만)의 상대 활성을 나타낸다. 또한, 화합물은 글루카곤 수용체에서 천연 글루카곤에서에 비해 적어도 0.09%(즉, EC₅₀ 1111 pM 미만), 보다 바람직하게는 0.45%(즉, EC₅₀ 222 pM 미만), 더욱 더 바람직하게는 0.9%(즉, EC₅₀ 111 pM 미만)의 상대 활성을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "활성"은 바람직하게는 인간 GLP-1 수용체 및 인간 글루카곤 수용체를 활성화하는 화합물의 능력을 나타낸다. 보다 바람직하게는 본원에서 사용되는 용어 "활성"은 세포내 cAMP 형성을 자극하는 화합물의 능력을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "상대 활성"은 또 다른 수용체 효능제에 비해 또는 또 다른 수용체에 비해 일정 비로 수용체를 활성화하는 화합물의 능력을 나타내는 것으로 이해된다. 효능제에 의한 수용체의 활성화(예를 들어, cAMP 수준의 측정에 의해)는 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정된다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 450 pmol 이하, 바람직하게는 200 pmol 이하, 보다 바람직하게는 100 pmol 이하, 보다 바람직하게는 50 pmol 이하, 보다 바람직하게는 25 pmol 이하, 보다 바람직하게는 10 pmol 이하, 보다 바람직하게는 8 pmol 이하, 보다 바람직하게는 5 pmol 이하의 hGLP-1 수용체에 대한 EC₅₀ 및/또는 500 pmol 이하, 바람직하게는 300 pmol 이하, 보다 바람직하게는 200 pmol 이하, 보다 바람직하게는 150 pmol 이하의 h글루카곤 수용체에 대한 EC₅₀ 및/또는 750 pmol 이상, 바람직하게는 1500 pmol 이상; 보다 바람직하게는 2000 pmol 이상의 hGIP 수용체에 대한 EC₅₀을 갖는다. hGLP-1 및 h글루카곤 수용체 모두에 대한 EC₅₀이 250 pm 이하, 보다 바람직하게는 200 pmol 이하, 보다 바람직하게는 150 pmol 이하인 것이 특히 바람직하다. hGLP-1 수용체, h글루카곤 수용체 및 hGIP 수용체에 대한 EC₅₀은 본원의 방법에 기재되고 실시예 4, 표 6에 기재된 결과를 발생시키도록 이용된 바와 같이 결정될 수 있다.

본 발명의 화합물은 환자의 장 통과를 감소시키고/시키거나, 위 함량을 증가시키고/시키거나, 음식 섭취를 감소시키는 능력을 갖는다. 본 발명의 화합물의 이러한 활성은 당업자에게 공지되고 또한 방법에서 본원에 기재된 동물 모델에서 평가될 수 있다.

본 발명의 화합물은 환자의 혈당 수준을 감소시키고/시키거나 HbA1c 수준을 감소시키는 능력을 갖는다. 본 발명의 화합물의 이러한 활성은 당업자에게 공지되고 또한 방법에서 본원에 기재된 동물 모델에서 평가될 수 있다.

본 발명의 화합물은 환자의 체중을 감소시키는 능력을 갖는다. 본 발명의 화합물의 이러한 활성은 당업자에게 공지되고 또한 방법 및 실시예 7에서 본원에 기재된 동물 모델에서 평가될 수 있다.

특히 위치 14에 리신을 가지며, 친지성 잔기로 추가 치환되는 화학식 (I)의 펩티드 화합물이 위치 14에 원래 메티오닌(엑센딘-4 유래) 또는 류신을 갖는 유도체에 비해 증가된 글루카곤 수용체 활성화를 나타내는 것으로 확인되었다(표 7 참조). 또한, 메티오닌의 산화(시험관내 또는 생체내)는 더 이상 가능하지 않다.

또한 위치 27에 Aib 아미노산을 갖는 화합물은 실시예 5, 표 8에 나타낸 바와 같이, 천연 엑센딘-4에서와 같은 위치 27에서 Lys을 갖는 상응하는 유도체에 비해 GIP 수용체에 대해 감소된 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 당뇨에서 고수준의 GIP가 일부 경우 보다 빈번한 저혈당 에피소드를 발생시킬 수 있다는 문헌 내 보고가 존재하므로, GIP 수용체의 감소된 활성화는 잠재적으로 이롭다(T McLaughlin et al., J Clin Endocrinol Metab, 95, 1851-1855, 2010; A Hadji-Georgopoulos, J Clin Endocrinol Metab, 56, 648-652, 1983).

한 구현예에서, 본 발명의 화합물은 산성 및/또는 생리학적 pH 값에서, 예로 25℃에서 pH 4.5 및/또는 pH 7.4에서 높은 용해도를, 또 다른 구현예에서 적어도 1 mg/ml을, 특정한 구현예에서 적어도 5 mg/ml을 갖는다.

또한, 본 발명의 화합물은 바람직하게는 용액 중에 저장하는 경우 높은 안정성을 갖는다. 안정성을 결정하기 위한 바람직한 검정 조건은 pH 4.5 또는 pH 7.4의 용액 중 40℃에서 7일 동안의 저장이다. 펩티드의 잔여량은 실시예에 기재된 바와 같이 크로마토그래피 분석에 의해 결정된다. 바람직하게는, pH 4.5 또는 pH 7.4의 용액 중 40℃에서 7일 후, 잔여 펩티드는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%이다.

바람직하게는, 본 발명의 화합물은 39개의 아미노 카르복실산, 특히 펩티드, 즉, 카르복사미드 결합에 의해 연결된 α-아미노 카르복실산의 선형 서열인 펩티드 모이어티를 포함한다.

한 구현예에서 R¹은 NH₂이며,추가 구현예에서 R¹은 OH이다.

-Z-C(O)-R⁵기에 대한 구체적인 바람직한 예가 하기 표 2에 기재되며, 이는 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, [2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-옥타데카노일아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시-헵타데카노일)아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸로부터 선택된다.

추가로 바람직한 것은 상기 기의 입체이성질체, 특히 S-거울상 이성질체 또는 R-거울상 이성질체인 거울상 이성질체이다. 표 2의 용어 "R"은 펩티드 백본, 즉, 특히 Lys의 ε-아미노기에서 Z-C(O)-R⁵의 부착 부위를 의미하는 것으로 의도된다.

추가 구현예는

X14가 Lys을 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄기가 -Z-C(O)R⁵ 기로 관능화되며, 여기서

Z는 γE, γE-γE, AEEAc-AEEAc-γE 및 AEEAc-AEEAc-AEEAc로부터 선택된 기를 나타내며,

R⁵는 펜타데카닐, 헵타데카닐 또는 16-카복시-헥사데카닐로부터 선택된 기를 나타내는 화합물의 군에 관한 것이다.

추가 구현예는

R⁵는 펜타데카닐 또는 헵타데카닐로부터 선택된 기를 나타내는 화합물의 군에 관한 것이다.

추가 구현예는

X14가 Lys을 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-로 관능화되며,

X28이 Ala를 나타내고,

X29가 Gly 및 D-Ala로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

R¹이 NH₂를 나타내는, 화합물의 군 또는 이의 염 또는 용매화물에 관한 것이다.

추가 구현예는

X14가 Lys을 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-로 관능화되며,

X28이 Ala를 나타내고,

X29가 Gly 및 D-Ala로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

추가 구현예는

X14가 Lys을 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-로 관능화되며,

X28이 Ala, Ser 및 Lys으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

X29가 Gly 및 D-Ala로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

추가 구현예는

X14가 Lys을 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, [2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-옥타데카노일아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카복시-4-(17-카복시-헵타데카노일)아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸로 관능화되며,

X28이 Ala를 나타내고,

X29가 D-Ala 및 Gly으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

추가 구현예는

X14가 Lys을 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, [2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-옥타데카노일아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸-로 관능화되며,

X28이 Ala를 나타내고,

X29가 D-Ala 및 Gly으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

추가 구현예는

X28이 Ser을 나타내고,

X29가 D-Ala 및 Gly으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

추가 구현예는

X28이 Lys을 나타내고,

X29가 D-Ala 및 Gly으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

추가 구현예는

X14가 Lys을 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-로 관능화되며,

X28이 Ala, Lys 및 Ser으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

X29가 D-Ala를 나타내고,

추가 구현예는

X29가 Gly을 나타내고,

추가 구현예는

X29가 Gly을 나타내고,

추가 구현예는

X28이 Ala를 나타내고,

X29가 Gly 및 D-Ala로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,

추가 구현예는

X14가 Lys을 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-로 관능화되는 화합물의 군 또는 이의 염 또는 용매화물에 관한 것이다.

추가 구현예는

X14가 Lys을 나타내고, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-로 관능화되는 화합물의 군 또는 이의 염 또는 용매화물에 관한 것이다.

화학식 (I)의 펩티드 화합물의 구체예는 SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO: 19의 화합물뿐만 아니라 이의 염 또는 용매화물이다.

화학식 (I)의 펩티드 화합물의 구체예는 SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO: 18의 화합물뿐만 아니라 이의 염 또는 용매화물이다.

화학식 (I)의 펩티드 화합물의 구체예는 SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8의 화합물뿐만 아니라 이의 염 또는 용매화물이다.

특정 구현예에서, 즉, 화학식 (I)의 화합물이 유전학적으로 인코딩된 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 본 발명은 상기 화합물을 인코딩하는 핵산(DNA 또는 RNA일 수 있음), 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 상기 핵산 또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.

추가 양태에서, 본 발명은 담체와 혼합된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용되는 조성물이고, 담체는 약학적으로 허용되는 담체이다. 본 발명의 화합물은 염, 예를 들어, 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 예를 들어, 수화물의 형태로 존재할 수 있다. 또 다른 추가 양태에서, 본 발명은 의학적 치료 방법, 특히 인간 약물에서 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

특정 구현예에서, 핵산 또는 발현 벡터는, 예를 들어, 유전자 요법에서 치료제로서 사용될 수 있다.

화학식 (I)의 화합물은 추가의 치료적으로 효과적인 작용제 없이 치료적 적용에 적합하다. 그러나, 다른 구현예에서, 화합물은 "조합 요법"에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 추가의 치료적 활성제와 함께 사용된다.

화학식 (I)의 화합물은 탄수화물 및/또는 지질 대사의 장애에 의해 야기되고/되거나, 이와 관련되고/되거나, 이에 수반되는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방, 예를 들어, 고혈당증, 타입 2 당뇨병, 글루코스 내성 장애, 타입 1 당뇨병, 비만 및 대사 증후군의 치료 또는 예방에 특히 적합하다. 추가로, 본 발명의 화합물은 변성 질병, 특히 신경변성 질병의 치료 또는 예방에 특히 적합하다.

기재된 화합물은 특히 체중 증가를 예방하거나 체중 감소를 촉진하는데 사용된다. "예방하는"은 치료의 부재와 비교하는 경우 억제하거나 감소시키는 것을 의미하며, 반드시 장애의 완전한 정지를 의미하지는 않는다.

본 발명의 화합물은 음식 섭취의 감소를 야기시키고/시키거나 에너지 소비를 증가시켜, 체중에 대해 관찰되는 효과를 발생시킬 수 있다.

체중에 대한 효과와 독립적으로, 본 발명의 화합물은 혈중 콜레스테롤 수준에 대해 이로운 효과를 가질 수 있고, 지질 수준, 특히 LDL뿐만 아니라 HDL 수준을 개선(예를 들어, HDL/LDL 비 증가)시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 화합물은 과도한 체중에 의해 야기되거나 과도한 체중을 특징으로 하는 임의의 질환의 직접적 또는 간접적 요법, 예를 들어, 비만, 병적 비만, 비만 관련 염증, 비만 관련 담낭 질병, 비만 유도 수면무호흡의 치료 및/또는 예방에 이용될 수 있다. 이들은 또한 대사 증후군, 당뇨병, 고혈압, 죽종형성 이상지질혈증, 죽상경화증, 동맥경화증, 관상동맥 심질환 또는 뇌졸중의 치료 및 예방에서 사용될 수 있다. 이들 질환에서의 이의 효과는 체중에 대한 이의 효과의 결과이거나 이와 관련될 수 있거나, 이와 독립적일 수 있다.

바람직한 의학적 용도는 타입 2 당뇨병에서 질병 진행을 지연시키거나 예방하거나, 대사 증후군을 치료하거나, 비만을 치료하거나 과체중을 예방하거나, 음식 섭취를 감소시키거나, 에너지 소비를 증가시키거나, 체중을 감소시키거나, 글루코스 내성 장애(IGT)로부터 타입 2 당뇨병으로의 진행을 지연시키거나; 타입 2 당뇨병으로부터 인슐린-필요 당뇨병으로의 진행을 지연시키거나; 식욕을 조절하거나; 포만을 유도하거나; 성공적인 체중 감량 후의 체중 재증가를 예방하거나; 과체중 또는 비만과 관련된 질병 또는 상태를 치료하거나; 폭식증을 치료하거나; 폭식을 치료하거나; 죽상경화증, 고혈압, 타입 2 당뇨병, IGT, 이상지질혈증, 관상동맥 심질환, 간 지방증을 치료하거나, 베타-차단제 중독을 치료하거나, 위장관 운동의 억제에 사용하는 것을 포함하거나, X-선, CT-스캐닝 및 NMR-스캐닝과 같은 기술을 이용한 위장관의 연구와 관련하여 유용하다.

추가의 바람직한 의학적 용도는 변성 장애, 특히 신경변성 장애, 예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 실조, 예를 들어, 척수소뇌성 실조증, 케네디병, 근긴장성 이영양증, 레비소체 치매, 다계통위축, 근육위축가쪽경화증, 원발가쪽경화증, 척수근육위축증, 프리온-관련 질병, 예를 들어, 크로이츠펠트-야콥병, 다발경화증, 모세혈관확장증, 배튼병, 피질기저핵변성, 척수의 아급성연합변성, 척수매독, 테이-삭스병, 중독성 뇌병증, 영아 레프숨병, 레프숨병, 신경유극적혈구증가증, 니이만-픽병, 라임병, 마카도-조셉병, 잔트호프병, 샤이-드래거 증후군, 워블리 헷지혹 증후군(wobbly hedgehog syndrome), 단백질병(proteopathy), 대뇌 β-아밀로이드 혈관병증, 녹내장에서의 망막 신경절 세포 변성, 시누클레인병증, 타우병증, 전두측두엽 변성(FTLD), 치매, 카다실 증후군(cadasil syndrome), 아밀로이드성 유전성 뇌출혈, 알렉산더병, 세이피노병증(seipinopathies), 가족성 아밀로이드 신경병증, 노년 전신 아밀로이드증, 서피노병증(serpinopathies), AL(경쇄) 아밀로이드증(원발성 전신 아밀로이드증), AH(중쇄) 아밀로이드증, AA(속발성) 아밀로이드증, 대동맥 중막 아밀로이드증, ApoAI 아밀로이드증, ApoAII 아밀로이드증, ApoAIV 아밀로이드증, 핀란드형 가족성 아밀로이드증(familial amyloidosis of the Finnish type)(FAF), 리소자임 아밀로이드증, 섬유소원 아밀로이드증, 투석 아밀로이드증, 봉입체 근염/근육병증, 백내장, 로돕신 돌연변이를 갖는 망막색소변성, 수질성 갑상샘 암종, 심장 심방 아밀로이드증, 뇌하수체 프로락틴분비종양, 유전성 격자 각막이상증, 피부 태선 아밀로이드증, 맬로리소체, 각막 락토페린 아밀로이드증, 허파꽈리단백증, 치원성(핀드버그(Pindborg)) 종양 아밀로이드, 낭성섬유증, 낫적혈구병 또는 중증 질환 근육병증(CIM)의 치료 또는 예방을 포함한다.

정의

본 발명의 아미노산 서열은 천연 발생 아미노산에 대한 통상적인 1 문자 및 3 문자 코드뿐만 아니라 다른 아미노산에 대한 일반적으로 인정되는 3 문자 코드, 예를 들어, Aib(α-아미노이소부티르산)를 함유한다.

용어 "천연 엑센딘-4"는 서열 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH₂(SEQ ID NO:1)를 갖는 천연 엑센딘-4를 나타낸다.

본 발명은 상기 정의된 바와 같은 펩티드 화합물을 제공한다.

본 발명의 펩티드 화합물은 펩티드에 의해 연결된 아미노 카르복실산의 선형 백본, 즉, 카르복사미드 결합을 포함한다. 바람직하게는, 아미노 카르복실산은 달리 지정하지 않는 한 α-아미노 카르복실산, 더욱 바람직하게는 L-α-아미노 카르복실산이다. 펩티드 화합물은 바람직하게는 39개 아미노 카르복실산의 백본 서열을 포함한다.

본 발명의 펩티드 화합물은 변형되지 않은 측쇄를 가질 수 있으나, 측쇄 중 하나에서 적어도 하나의 변형을 갖는다.

의혹을 피하기 위해, 본원에 제공된 정의에서, 펩티드 모이어티 (II)의 서열은 변화가 가능한 것으로 언급되는 위치 중 적어도 하나에서 천연 엑센딘-4와 상이한 것이 일반적으로 의도된다. 펩티드 모이어티 (II) 내의 아미노산은 통상적인 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1에서 39까지 연속적으로 넘버링되는 것으로 간주될 수 있다. 펩티드 모이어티 (I) 내의 "위치"에 대한 언급은 따라서 천연 엑센딘-4 및 다른 분자 내의 위치에 대한 언급으로 구성되어야 하며, 예를 들어, 엑센딘-4에서, His이 위치 1에 존재하고, Gly이 위치 2에 존재하고,..., Met이 위치 14에 존재하고,... Ser이 위치 39에 존재한다.

-NH₂ 측쇄기를 갖는 아미노산 잔기, 예를 들어 Lys, Orn, Dab 또는 Dap는 -NH₂ 측쇄기의 적어도 하나의 H 원자가 -Z-C(O)-R⁵로 치환되어 관능화되며, 상기 R⁵는 친지성 모이어티, 예로 무고리 선형 또는 분지형 (C₈ 내지 C₃₀) 포화 또는 불포화 탄화수소기를 포함하며, 이는, 예를 들어 할로겐, -OH 및/또는 CO₂H로 치환되거나 치환되지 않으며, Z는 모든 입체이성질체 형태의 링커, 예로 γ-글루타메이트(γE) 및 AEEAc 기로부터 선택된 1 개 이상, 예를 들어 1 개 내지 5 개, 바람직하게는 1 개, 2 개 또는 3 개의 아미노산 링커기를 포함하는 링커를 포함한다. 바람직한 기 R⁵는 친지성 모이어티, 예로 무고리 선형 또는 분지형 (C₁₂ 내지 C₂₀) 포화 또는 불포화 탄화수소기, 예로 펜타데카닐, 헥사데카닐 또는 헵타데카닐을 포함하며, 이는 CO₂H, 보다 바람직하게는 펜타데카닐, 헵타데카닐 또는 16-카복시-헥사데카닐로 치환되거나 치환되지 않는다. 한 구현예에서 아미노산 링커기는 γE, γE-γE, AEEAc-AEEAc-γE 및 AEEAc-AEEAc-AEEAc로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 링커기는 γE이다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 링커기는 γE-γE이다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 링커기는 AEEAc-AEEAc-γE이다. 또 다른 구현예에서, 아미노산 링커기는 AEEAc-AEEAc-AEEAc이다.

추가 양태에서, 본 발명은 담체와 혼합된 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한, 특히 하기 기재되는 바와 같은 질환의 치료를 위한 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 조성물을 제공하며, 이러한 조성물은 약학적으로 허용되는 조성물이고, 담체는 약학적으로 허용되는 담체이다.

펩티드 합성

당업자는 본 발명에서 기재되는 펩티드를 제조하는 여러 상이한 방법을 인지한다. 이들 방법은 합성 접근법 및 재조합 유전자 발현을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 이들 펩티드를 제조하는 한 방식은 용액 중 또는 고체 지지체 상에서의 합성 및 이후의 분리 및 정제이다. 펩티드를 제조하는 상이한 방식은 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열이 도입된 숙주 세포에서의 유전자 발현이다. 대안적으로, 유전자 발현은 세포 시스템을 이용하지 않고 달성될 수 있다. 상기 기재된 방법은 또한 임의의 방식으로 조합될 수 있다.

본 발명의 펩티드를 제조하는 바람직한 방식은 적합한 수지 상에서의 고체 상 합성이다. 고체 상 펩티드 합성은 잘 확립된 방법이다(예를 들어, 문헌 [Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III., 1984; E. Atherton and R. C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach, Oxford-IRL Press, New York, 1989] 참조). 고체 상 합성은 카르복시 말단을 갖는 N-말단 보호된 아미노산을 분해가능한 링커를 갖는 비활성 고체 지지체에 부착시킴으로써 개시된다. 이러한 고체 지지체는 수지에 대한 카르복시기(또는 Rink 수지에 대해서는 카르복사미드)의 결합이 산에 민감(Fmoc 전략이 이용되는 경우)한, 최초 아미노산의 커플링을 가능케 하는 임의의 중합체, 예를 들어, 트리틸 수지, 클로로트리틸 수지, Wang 수지 또는 Rink 수지일 수 있다. 중합체 지지체는 펩티드 합성 동안 α-아미노기를 탈보호시키는데 이용되는 조건하에서 안정적이어야 한다.

첫번째 아미노산이 고체 지지체에 커플링된 후, 상기 아미노산의 α-아미노 보호기가 제거된다. 나머지 보호된 아미노산은 이후에 적절한 아미드 커플링 시약, 예를 들어, BOP, HBTU, HATU 또는 DIC(N,N'-디이소프로필카르보디이미드)/HOBt(1-하이드록시벤조트라이아졸)을 이용하여 펩티드 서열에 의해 표시된 순서로 번갈아 커플링되는 아미노산이며, 상기 BOP, HBTU 및 HATU는 3차 아민 염기와 함께 사용된다. 대안적으로, 해방된 N-말단은 아미노산이 아닌 기, 예를 들어, 카르복실산 등으로 관능화될 수 있다.

보통, 아미노산의 반응성 측쇄 기는 적합한 차단 기로 보호된다. 이들 보호기는 요망되는 펩티드가 어셈블리된 후에 제거된다. 이들은 동일 조건하에서 수지로부터의 요망되는 생성물의 분해와 동시에 제거된다. 보호기 및 보호기를 도입하기 위한 절차는 문헌 [Protective Groups in Organic Synthesis, 3d ed., Greene, T. W. and Wuts, P. G. M., Wiley & Sons(New York: 1999)]에서 발견될 수 있다.

일부 경우에서, 다른 측쇄 보호기가 온전하게 유지되면서 선택적으로 제거될 수 있는 측쇄 보호기를 갖는 것이 요망될 수 있다. 이러한 경우에서, 해방된 작용기는 선택적으로 관능화될 수 있다. 예를 들어, 리신은 매우 친핵성인 염기, 예를 들어, DMF(디메틸 포름아미드) 중 4% 하이드라진에 불안정한 ivDde([1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리덴)-3-메틸부틸) 보호기(S.R. Chhabra et al., Tetrahedron Lett. 39, (1998), 1603)로 보호될 수 있다. 따라서, N-말단 아미노기 및 모든 측쇄 작용기가 산 불안정 보호기로 보호되는 경우, ivDde 기는 DMF 중 4% 하이드라진을 이용하여 선택적으로 제거될 수 있고, 상응하는 자유 아미노기는 이후, 예를 들어, 아실화에 의해 추가로 변형될 수 있다. 리신은 대안적으로 보호된 아미노산에 커플링될 수 있고, 이러한 아미노산의 아미노기는 이후 탈보호되어 아실화되거나 추가 아미노산에 부착될 수 있는 또 다른 자유 아미노기를 발생시킬 수 있다.

최종적으로, 펩티드는 수지로부터 분해된다. 이는 King 칵테일(King's cocktail)을 이용하여 달성될 수 있다(D. S. King, C. G. Fields, G. B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 36, 1990, 255-266). 이후, 원료 물질은 필요시 크로마토그래피, 예를 들어, 분취용 RP-HPLC에 의해 정제될 수 있다.

효능

본원에서 사용되는 용어 "효능" 또는 "시험관내 효능"은 세포-기반 검정에서 GLP-1, 글루카곤 또는 GIP에 대한 수용체를 활성화시키는 화합물의 능력에 대한 척도이다. 숫자적으로, 이는 용량-반응 실험에서 반응(예를 들어, 세포내 cAMP의 형성)의 최대 절반 증가를 유도하는 화합물의 효과적인 농도인 "EC50 값"으로 표현된다.

치료 용도

대사 증후군은 함께 발생하는 경우 타입 2 당뇨병뿐만 아니라 죽상경화 혈관 질병, 예를 들어, 심장병 및 뇌졸중이 발생할 위험을 증가시키는 의학적 장애의 조합이다. 대사 증후군에 대해 의학적 파라미터를 규정하는 것은 당뇨병, 글루코스 내성 장애, 상승된 공복 혈당, 인슐린 내성, 소변 알부민 분비, 중심부비만, 고혈압, 상승된 트라이글리세라이드, 상승된 LDL 콜레스테롤 및 감소된 HDL 콜레스테롤을 포함한다.

비만은 과도한 체지방이 건강 및 기대 여명에 유해한 효과를 미칠 수 있을 정도로 축적되고, 증가된 유병률로 인해 성인 및 아동에서 현대 사회에서의 주요한 예방가능한 사망 원인 중 하나가 되는 임상적 질환이다. 이는 심장병, 타입 2 당뇨병, 폐쇄수면무호흡, 특정 유형의 암뿐만 아니라 골관절염을 포함하는 다양한 다른 질병의 가능성을 증가시키며, 이는 가장 흔히 과도한 음식 섭취, 감소된 에너지 소비뿐만 유전적 감수성의 조합에 의해 야기된다.

당뇨로 종종 간단히 언급되는 당뇨병은 신체가 충분한 인슐린을 생성하지 않거나, 세포가 생성되는 인슐린에 반응하지 않아서 사람이 높은 혈당 수준을 갖는 대사 질병의 그룹이다. 가장 흔한 유형의 당뇨병은(1) 신체가 인슐린을 생성하지 못하는 타입 1 당뇨병, (2) 시간 경과에 따른 인슐린 결핍의 증가와 조합되는, 신체가 인슐린을 적절하게 사용하지 못하는 타입 2 당뇨병(T2DM) 및(3) 여성이 임신으로 인해 당뇨가 발생하는 임신당뇨병이다. 당뇨병의 모든 형태는 통상적으로 많은 햇수 후에 발생하는 장기간 합병증의 위험을 증가시킨다. 대부분의 상기 장기간 합병증은 혈관에 대한 손상을 기초로 하며, 더 큰 혈관의 죽상경화증으로부터 발생하는 "대혈관" 질병 및 작은 혈관의 손상으로부터 발생하는 "미세혈관" 질병의 2 개의 부류로 나뉘어질 수 있다. 대혈관 질병 상태의 예는 허혈심장병, 심근경색증, 뇌졸중 및 말초혈관병이다. 미세혈관 질병의 예는 당뇨망막병증, 당뇨병신장병증뿐만 아니라 당뇨신경병증이다.

GLP-1 및 GIP뿐만 아니라 글루카곤에 대한 수용체는 7-막횡단-스패닝(spanning), 이종삼합체 G-단백질 결합된 수용체의 패밀리의 일원이다. 이들은 서로 구조적으로 관련되며, 유의한 수준의 서열 동일성을 공유할뿐만 아니라 리간드 인지 및 세포내 신호전달 경로의 유사한 메커니즘을 갖는다.

유사하게, 펩티드 GLP-1, GIP 및 글루카곤은 높은 서열 동일성/유사성의 영역을 공유한다. GLP-1 및 글루카곤은 일반적인 전구체인 프레프로글루카곤(prepro글루카곤)으로부터 생성되며, 이는 조직-특이적 방식으로 차별적으로 가공되어, 예를 들어, 장 내분비 세포에서 GLP-1 및 췌장 섬 알파 세포에서 글루카곤이 생성된다. GIP는 더 큰 프로GIP 프로호르몬 전구체로부터 유래되고, 소장에 위치된 K-세포로부터 합성되고 방출된다.

펩티드 인크레틴 호르몬 GLP-1 및 GIP는 음식에 반응하여 장 내분비 세포에 의해 분비되고, 식사-자극 인슐린 분비의 70%까지 차지한다. 증거는 GLP-1 분비가 글루코스 내성 장애 또는 타입 2 당뇨병을 갖는 대상체에서 감소되는 반면, GLP-1에 대한 반응성은 상기 환자에서 여전히 보존되는 것을 암시한다. 따라서, 적합한 효능제를 이용한 GLP-1 수용체의 표적화는 당뇨병을 포함하는 대사 장애의 치료를 위한 매력적인 접근법을 제공한다. GLP-1에 대한 수용체는 널리 분포되어 있고, 이자섬, 뇌, 심장, 신장 및 위장관에서 주로 발견된다. 췌장에서, GLP-1은 베타 세포로부터의 인슐린의 분비를 증가시킴으로써 엄격히 글루코스-의존성 방식으로 작용한다. 이러한 글루코스-의존성은 GLP-1 수용체의 활성화가 저혈당을 야기시킬 가능성이 없는 것을 나타낸다. 또한, GIP에 대한 수용체는 이자섬, 지방 조직, 위, 소장, 심장, 뼈, 폐, 신장, 고환, 부신피질, 뇌하수체, 내피세포, 기관, 비장, 가슴샘, 갑상샘 및 뇌를 포함하는 말초 조직에서 광범위하게 발현된다. 인크레틴 호르몬으로서의 생물학적 기능과 일치하게, 췌장 β-세포는 인간에서 GIP에 대한 가장 높은 수준의 수용체를 발현한다. GIP-수용체 매개 신호전달이 T2DM을 갖는 환자에서 손상될 수 있으나, GIP-작용이 가역적이고 당뇨병 상태의 개선과 함께 회복될 수 있는 것이 밝혀진 일부 임상적 증거가 존재한다. 인슐린 분비에 대한 GIP 작용도 글루코스-의존성이라는 여러 보고가 존재하지만, GIP의 높은 혈장 수준이 보다 빈번한 저혈당 에피소드를 발생시킬 수 있다는 문헌 내 보고도 존재한다(T McLaughlin et al., J Clin Endocrinol Metab, 95, 1851-1855, 2010; A Hadji-Georgopoulos, J Clin Endocrinol Metab, 56, 648-652, 1983). 또한, 비만 대상체에서의 혈장 GIP 수준은 정상보다 높은 것으로 보고되어, GIP가 비만 및 인슐린 내성을 유도할 수 있음을 제시하였다(W Creutzfeldt et al. Diabetologia. 1978, 14,15-24). 이는 GIP 수용체의 절제가 이들 질환을 예방할 수 있다는 보고에 의해 뒷받침된다: 고지방 식이를 섭취한 GIP 수용체 녹-아웃 마우스는 야생형 마우스에 비해 체중 억제를 나타내었고(K Miyawaki et al. Nat Med. 2002, 8, 738-42), GIP 수용체 길항제 (Pro3)GIP의 장기 투여는 마우스에서 비만 및 인슐린 내성을 또한 예방하였다(VA Gault et al. Diabetologia. 2007, 50,1752-62). 따라서, 본 발명의 목표는 GIP 수용체에 대해 감소된 활성을 갖는 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제를 제공하는 것이었다.

글루카곤은 췌장 알파 세포에 의해 생성되고, 순환 글루코스가 낮은 경우 혈류로 방출되는 29개의 아미노산 펩티드 호르몬이다. 글루카곤의 중요한 생리학적 역할은 생체내에서 글루코스 항상성을 유지시키는데 있어서 인슐린에 대한 주요 역조절 메커니즘을 제공하는 과정인 간에서의 글루코스 배출을 자극하는 것이다.

그러나, 글루카곤 수용체는 또한 간외 조직, 예를 들어, 신장, 심장, 지방세포, 림프모세포, 뇌, 망막, 부신 및 위장관에서 발현되고, 이는 글루코스 항상성을 넘어서는 더 광범위한 생리학적 역할을 암시한다. 따라서, 최근의 연구는 글루카곤이 음식 섭취의 감소 및 체중 감소를 수반하는 에너지 소비 및 열발생의 자극을 포함하는 에너지 관리에 대한 치료적으로 긍정적인 효과를 갖는 것을 보고하였다. 대체적으로, 글루카곤 수용체의 자극은 비만 및 대사 증후군의 치료에 유용할 수 있다.

옥신토모듈린(Oxyntomodulin)은 C-말단 신장을 둘러싸는 8개의 아미노산을 갖는 글루카곤으로 구성된 펩티드 호르몬이다. GLP-1 및 글루카곤과 마찬가지로, 이는 프레프로글루카곤으로 미리 형성되고, 소장의 내분비 세포에 의해 조직-특이적 방식으로 분해되고 분비된다. 옥신토모듈린은 GLP-1 및 글루카곤에 대한 수용체 둘 모두를 자극하는 것으로 공지되어 있고, 따라서 이중 효능제의 원형(prototype)이다.

GLP-1이 이의 항-당뇨병 효과에 대해 공지되어 있고, GLP-1 및 글루카곤 둘 모두가 이의 음식 섭취-억제 효과에 대해 공지되어 있으며, 글루카곤이 또한 추가 에너지 소비의 매개체이므로, 하나의 분자에서의 2 개의 호르몬의 활성의 조합이 대사 증후군 및 특히 이의 구성요소인 당뇨병 및 비만의 치료를 위한 강력한 약물을 발생시킬 수 있는 것을 생각할 수 있다.

따라서, 본 발명의 화합물은 글루코스 불내성, 인슐린 내성, 당뇨병전기, 증가된 공복 혈당(고혈당), 타입 2 당뇨병, 고혈압, 이상지질혈증, 동맥경화증, 관상동맥 심질환, 말초 혈관 질환, 뇌졸중 또는 이들 개별적 질병 구성요소의 임의의 조합의 치료에 사용될 수 있다.

또한, 이들은 식욕, 영양 및 칼로리 섭취의 조절, 에너지 소비의 증가, 체중 증가의 예방, 체중 감소의 촉진, 과도한 체중의 감소의 조절 및 병적 비만을 포함하는 비만의 전체적 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 GIP 수용체에 대해 감소된 활성을 가지며 GLP-1 및 글루카곤에 대한 수용체를 위한 효능제(예를 들어, "이중 효능제")이며, 당뇨병 및 비만의 동시 치료를 허용하여 대사 증후군을 표적화하는 임상적 필요성을 해결하는 치료적 이로움을 제공할 수 있다.

본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 추가 질병 상태 및 건강 질환은 비만-관련 염증, 비만-관련 담낭 질병 및 비만-유도 수면무호흡이다.

모든 상기 질환은 비만과 직접적 또는 간접적으로 관련될 수 있으나, 본 발명의 화합물의 효과는 체중에 대한 효과를 통해 전체적 또는 부분적으로 매개될 수 있거나, 이와 독립적일 수 있다.

추가로, 치료되는 질병은 신경변성 질병, 예를 들어, 알츠하이머병 또는 파킨슨병 또는 상기 기재된 바와 같은 다른 변성 질병이다.

한 구현예에서, 화합물은 고혈당증, 타입 2 당뇨병, 비만의 치료 또는 예방에 유용하다.

GLP-1, 글루카곤 및 옥신토모듈린에 비해, 엑센딘-4는 이로운 물리화학적 특성, 예컨대 용액 중 용해도 및 안정성을 가지며, 생리학적 조건(효소, 예컨대 DPP4 또는 NEP에 의한 분해에 대한 효소적 안정성 포함) 하에 생체내에서 더 긴 작용 기간을 일으킨다. 따라서, 순수한 GLP-1 수용체 효능제 엑센딘-4는 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능작용을 갖는 엑센딘-4 유사체를 수득하기 위한 우수한 시작 스캐폴드로 작용할 수 있다.

그럼에도 불구하고, 또한 엑센딘-4는 위치 14에서의 메티오닌 산화뿐만 아니라 위치 28에서의 아스파라긴의 탈아미드화 및 이성화로 인해 화학적으로 불안정한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 안정성은 위치 14에서의 메티오닌의 치환 및 아스파르트이미드 형성을 통한 분해의 경향이 있는 것으로 공지된 서열, 특히 위치 28 및 29에서의 Asp-Gly 또는 Asn-Gly의 회피에 의해 추가로 개선될 수 있다.

약학적 조성물

용어 "약학적 조성물"은 혼합되는 경우에 상용성이고 투여될 수 있는 성분을 함유하는 혼합물을 나타낸다. 약학적 조성물은 하나 이상의 의학적 약물을 포함할 수 있다. 추가로, 약학적 조성물은 고려되는 활성 성분이거나 비활성 성분이건 간에 담체, 완충제, 산화제, 알칼리화제, 용매, 애쥬번트, 긴장성 조절인자, 완화제, 증량제, 보존제, 물리적 및 화학적 안정화제, 예를 들어, 계면활성제, 항산화제 및 다른 성분을 포함할 수 있다. 약학적 조성물을 제조하는데 있어서 당업자에 대한 지침은, 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20th ed.) ed. A. R. Gennaro A. R., 2000, Lippencott Williams & Wilkins 및 in R.C.Rowe et al(Ed), Handbook of Pharmaceutical Excipients, PhP, May 2013 update]에서 발견될 수 있다.

본 발명의 엑센딘-4 펩티드 유도체 또는 이의 염은 약학적 조성물의 일부로서 허용되는 약학적 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 투여된다. "약학적으로 허용되는 담체"는 투여되는 물질의 치료적 특성을 유지하면서 생리학적으로 허용(예를 들어, 생리학적으로 허용되는 pH)되는 담체이다. 표준의 허용되는 약학적 담체 및 이의 제형은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20th ed.) ed. A. R. Gennaro A. R., 2000, Lippencott Williams & Wilkins 및 in R.C.Rowe et al(Ed), Handbook of Pharmaceutical excipients, PhP, May 2013 update]에 기재되어 있다. 한 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 생리학적 염수 용액이다.

한 구현예에서, 담체는 완충제(예를 들어, 시트레이트/시트르산), 산성화제(예를 들어, 염산), 알칼리화제(예를 들어, 소듐 하이드록시드), 보존제(예를 들어, 페놀), 공-용매(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 400), 긴장성 조절인자(예를 들어, 만니톨), 안정화제(예를 들어, 계면활성제, 항산화제, 아미노산)의 군으로부터 선택된다.

사용되는 농도는 생리학적으로 허용되는 범위 내이다.

허용되는 약학적 담체 또는 희석제는 구강, 직장, 비내 또는 비경구(피하, 근내, 정맥내, 피내 및 경피) 투여에 적합한 제형에서 사용되는 것을 포함한다. 본 발명의 화합물은 통상적으로 비경구 투여될 것이다.

용어 "약학적으로 허용되는 염"은 포유동물에서 사용하기에 안전하고 효과적인 본 발명의 화합물의 염을 의미한다. 약학적으로 허용되는 염은 산 부가염 및 염기성 염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 산 부가염의 예는 클로라이드, 설페이트, 수소 설페이트, (수소) 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 토실레이트 또는 메실레이트 염을 포함한다. 염기성 염의 예는 무기 양이온을 갖는 염, 예를 들어, 알칼리성 염 또는 알칼리토금속염, 예를 들어, 소듐, 포타슘, 마그네슘 또는 칼슘 염 및 유기 양이온을 갖는 염, 예를 들어, 아민 염을 포함한다. 약학적으로 허용되는 염의 추가 예는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20th ed.) ed. A. R. Gennaro A. R., 2000, Lippencott Williams & Wilkins 또는 in Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use, e.d. P. H. Stahl, C. G. Wermuth, 2002, jointly published by Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich, Switzerland and Wiley-VCH, Weinheim, Germany]에 기재되어 있다.

용어 "용매화물"은 본 발명의 화합물 또는 이의 염과 용매 분자, 예를 들어, 유기 용매 분자 및/또는 물의 복합체를 의미한다.

약학적 조성물에서, 엑센딘-4 유도체는 단량체 또는 올리고머 형태일 수 있다.

화합물의 용어 "치료적 유효량"은 비독성이나, 요망되는 효과를 제공하는 화합물의 충분한 양을 나타낸다. 요망되는 생물학적 효과를 달성하는데 필요한 화학식 (I)의 화합물의 양은 다수의 요인, 예를 들어, 선택된 특정 화합물, 의도된 용도, 투여 방식 및 환자의 임상적 상태에 좌우된다. 임의의 개별적 환자에서의 적절한 "효과적인" 양은 일상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물의 "치료적 유효량"은 약 0.01 ㎎/용량 내지 50 ㎎/용량, 바람직하게는 0.1 ㎎/용량 내지 10 ㎎/용량이다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구(예를 들어, 피하, 근내, 피내 또는 정맥내), 구강, 직장, 국소 및 경구(예를 들어, 설하) 투여에 적합한 것이나, 가장 적합한 투여 방식은 각각의 개별적 환자에서 치료되는 질환의 특성 및 중증도 및 각각의 환자에서 사용되는 화학식 (I)의 화합물의 특성에 좌우된다.

적합한 약학적 조성물은 각각이 규정된 양의 화합물을 함유하는 독립된 단위, 예를 들어, 캡슐, 정제 및 바이얼 또는 앰풀 내의 분말의 형태; 분말 또는 과립; 수성 또는 비수성 액체 중 용액 또는 현탁액; 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼으로 존재할 수 있다. 이는 단일 또는 다중 용량 주사 형태, 예를 들어, 펜의 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 이미 언급된 바와 같이 활성 성분 및 담체(하나 이상의 추가 성분으로 구성될 수 있음)를 접촉시키는 단계를 포함하는 임의의 적합한 약학적 방법에 의해 제조될 수 있다.

특정 구현예에서, 약학적 조성물은 적용을 위한 장치, 예를 들어, 주사기, 주사 펜 또는 자기주사기와 함께 제공될 수 있다. 상기 장치는 약학적 조성물과 독립적으로 제공될 수 있거나, 약학적 조성물로 미리 충전될 수 있다.

조합 요법

본 발명의 화합물인 GLP-1 및 글루카곤 수용체에 대한 이중 효능제는 다른 약리학적으로 활성인 화합물, 예를 들어, [Rote Liste 2014]에 언급된 모든 약물, 예를 들어, [Rote Liste 2014, 챕터 1]에 언급된 모든 체중 감소제 또는 식욕 억제제, [Rote Liste 2014, 챕터 58]에 언급된 모든 지질-강하제, [Rote Liste 2014]에 언급된 모든 항고혈압제 및 신장보호제 또는 [Rote Liste 2014, 챕터 36]에 언급된 모든 이뇨제와 널리 조합될 수 있다.

활성 성분 조합물은 작용에 있어서 상승작용적 개선에 특히 이용될 수 있다. 이들은 환자로의 활성 성분의 독립된 투여 또는 복수의 활성 성분이 한 약학적 조제물에 존재하는 조합 생성물의 형태의 투여에 의해 적용될 수 있다. 활성 성분이 활성 성분의 독립된 투여에 의해 투여되는 경우, 이는 동시에 또는 연속적으로 이루어질 수 있다.

하기에 언급되는 활성 성분의 대부분은 문헌 [USP Dictionary of USAN and International Drug Names, US Pharmacopeia, Rockville 2011]에 개시되어 있다.

상기 조합물에 적합한 다른 활성 물질은 특히, 예를 들어, 언급된 적응증 중 하나와 관련하여 하나 이상의 활성 물질의 치료 효과를 강화시키고/시키거나 하나 이상의 활성 물질의 투여량이 감소되는 것을 가능케 하는 것을 포함한다.

조합물에 적합한 치료제는, 예를 들어, 하기와 같은 당뇨병치료제를 포함한다:

인슐린 및 인슐린 유도체, 예를 들어, 글라진(Glargine)/Lantus?, 270 U/㎖ 내지 330 U/㎖의 인슐린 글라진(EP 2387989 A), 300 U/㎖의 인슐린 글라진(EP 2387989 A), 글루리신(Glulisin)/Apidra?, 데테미르(Detemir)/Levemir?, 리스프로(Lispro)/Humalog?/Liprolog?, 데글루덱(Degludec)/데글루덱플러스(DegludecPlus), 아스파르트, 기본 인슐린 및 유사체(예를 들어, LY-2605541, LY2963016, NN1436), 페길화된(PEGylated) 인슐린 리스프로, Humulin?, 린제타(Linjeta), SuliXen?, NN1045, 인슐린 플러스 심린(Symlin), PE0139, 속성-작용 및 단기-작용 인슐린(예를 들어, 린제타(Linjeta), PH20, NN1218, HinsBet), (APC-002)하이드로젤, 구강, 흡입용, 경피 및 설하 인슐린(예를 들어, Exubera?, Nasulin?, 아프레자(Afrezza), 트레고필(Tregopil), TPM 02, 캡슐린(Capsulin), Oral-lyn?, Cobalamin? 구강 인슐린, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, VIAtab, 오샤디(Oshadi) 구강 인슐린). 이기능성 링커에 의해 알부민 또는 또 다른 단백질에 결합되는 인슐린 유도체가 또한 추가로 포함된다.

GLP-1, GLP-1 유사체 및 GLP-1 수용체 효능제, 예를 들어, 릭시세나티드(Lixisenatide)/AVE0010/ZP10/릭수미아(Lyxumia), 엑세나티드(Exenatide)/엑센딘-4/비에타(Byetta)/비두레온(Bydureon)/ITCA 650/AC-2993, 리라글루티드(리라글루티드)/빅토자(Victoza), 세마글루티드(Semaglutide), 타스포글루티드(Taspoglutide), 신크리아(Syncria)/알비글루티드(Albiglutide), 둘라글루티드(Dulaglutide), r엑센딘-4, CJC-1134-PC, PB-1023, TTP-054, 란글레나티드(Langlenatide)/HM-11260C, CM-3, GLP-1 엘리젠(Eligen), ORMD-0901, NN-9924, NN-9926, NN-9927, 노덱센(Nodexen), 비아도르(Viador)-GLP-1, CVX-096, ZYOG-1, ZYD-1, GSK-2374697, DA-3091, MAR-701, MAR709, ZP-2929, ZP-3022, TT-401, BHM-034. MOD-6030, CAM-2036, DA-15864, ARI-2651, ARI-2255, 엑세나티드(Exenatide)-XTEN 및 글루카곤-Xten.

DPP-4 억제제, 예를 들어: 알로글립틴(Alogliptin)/네시나(Nesina), 트라젠타(Trajenta)/리나글립틴(Linagliptin)/BI-1356/온데로(Ondero)/트라젠타(Trajenta)/트라드젠타(Tradjenta)/트라옌타(Trayenta)/트라드젠타(Tradzenta), 삭사글립틴(Saxagliptin)/온글리자(Onglyza), 시타글립틴(Sitagliptin)/자누비아(Januvia)/젤레비아(Xelevia)/테사베(Tesave)/자누멧(Janumet)/벨메티아(Velmetia), 갈부스(Galvus)/빌다글립틴(Vildagliptin), 아나글립틴(Anagliptin), 제미글립틴(Gemigliptin), 테넬리글립틴(Teneligliptin), 멜로글립틴(Melogliptin), 트렐라글립틴(Trelagliptin), DA-1229, 오마리글립틴(Omarigliptin)/MK-3102, KM-223, 에보글립틴(Evogliptin), ARI-2243, PBL-1427, 피녹사신(Pinoxacin).

SGLT2 억제제, 예를 들어: 인보카나(Invokana)/카나글리포진(Canaglifozin), 포르지가(Forxiga)/다파글리플로진(Dapagliflozin), 레모글리포진(Remoglifozin), 세르글리플로진(Sergliflozin), 엠파글리플로진(Empagliflozin), 이프라글리플로진(Ipragliflozin), 토포글리플로진(Tofogliflozin), 루세오글리플로진(Luseogliflozin), LX-4211, 에르투글리포진(Ertuglifozin)/PF-04971729, RO-4998452, EGT-0001442, KGA-3235/DSP-3235, LIK066, SBM-TFC-039,

비구아니드(Biguanide)(예를 들어, 메트포르민(Metformin), 부포르민(Buformin), 펜포르민(Phenformin)), 티아졸리딘디온(예를 들어, 피오글리타존(Pioglitazone), 리보글리타존(Rivoglitazone), 로시글리타존(Rosiglitazone), 트로글리타존(Troglitazone)), 이중 PPAR 효능제(예를 들어, 알레글리타자르(Aleglitazar), 무라글리타자르(Muraglitazar), 테사글리타자르(Tesaglitazar)), 설포닐우레아(Sulfonylurea)(예를 들어, 톨부타미드(Tolbutamide), 글리벤클라미드(Glibenclamide), 글리메피리드(Glimepiride)/아마릴(Amaryl), 글리피지드(Glipizide)), 메글리티니드(Meglitinides)(예를 들어, 나테글리니드(Nateglinide), 레파글리니드(Repaglinide), 미티글리니드(Mitiglinide)), 알파-글루코시다제 억제제(예를 들어, 아카르보스(Acarbose), 미글리톨(Miglitol), 보글리보스(Voglibose)), 아밀린(Amylin) 및 아밀린 유사체(예를 들어, 프람린티드(Pramlintide), 심린(Symlin)).

GPR119 효능제(예를 들어, GSK-263A, PSN-821, MBX-2982, APD-597, ZYG-19, DS-8500), GPR40 효능제(예를 들어, 파시글리팜(Fasiglifam)/TAK-875, TUG-424, P-1736, JTT-851, GW9508).

다른 적합한 조합 파트너는 다음과 같다: 사이클로셋(Cycloset), 11-베타-HSD의 억제제(예를 들어, LY2523199, BMS770767, RG-4929, BMS816336, AZD-8329, HSD-016, BI-135585), 글루코키나제의 활성제(예를 들어, TTP-399, AMG-151, TAK-329, GKM-001), DGAT의 억제제(예를 들어, LCQ-908), 단백질 티로신포스파타제 1의 억제제(예를 들어, 트로두스퀘민(Trodusquemine)), 글루코스-6-포스파타제의 억제제, 프룩토스-1,6-비스포스파타제의 억제제, 글리코겐 포스포릴라제의 억제제, 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제의 억제제, 글리코겐 신타제(synthase) 키나제의 억제제, 피루베이트 데하이드로키나제의 억제제, 알파2-길항제, CCR-2 길항제, SGLT-1 억제제(예를 들어, LX-2761), 이중 SGLT2/SGLT1 억제제.

예를 들어, 다음과 같은 하나 이상의 지질강하제가 또한 조합 파트너로서 적합하다: HMG-CoA-환원효소 억제제(예를 들어, 심바스타틴(Simvastatin), 아토르바스타틴(Atorvastatin)), 피브레이트(fibrate)(예를 들어, 베자피브레이트(Bezafibrate), 페노피브레이트(Fenofibrate)), 니코틴산 및 이의 유도체(예를 들어, 니아신(Niacin)), PPAR-(알파, 감마 또는 알파/감마) 효능제 또는 조정자(예를 들어, 알레글리타자르(Aleglitazar)), PPAR-델타 효능제, ACAT 억제제(예를 들어, 아바시미브(Avasimibe)), 콜레스테롤 흡수 억제제(예를 들어, 에제티미브(Ezetimibe)), 담즙산-결합 물질(예를 들어, 콜레스티라민(Cholestyramine)), 회장 담즙산 운반 억제제, MTP 억제제 또는 PCSK9의 조정자.

HDL-상승 화합물, 예를 들어: CETP 억제제(예를 들어, 토르세트라피브(Torcetrapib), 아나세트라피드(Anacetrapid), 달세트라피드(Dalcetrapid), 에바세트라피드(Evacetrapid), JTT-302, DRL-17822, TA-8995) 또는 ABC1 조절인자.

다른 적합한 조합 파트너는, 예를 들어, 다음과 같은 비만의 치료를 위한 하나 이상의 활성 물질이다: 시부트라민(Sibutramine), 테소펜신(Tesofensine), 오를리스타트(Orlistat), 카나비노이드-1 수용체의 길항제, MCH-1 수용체 길항제, MC4 수용체 효능제, NPY5 또는 NPY2 길항제(예를 들어, 벨네페리트(Velneperit)), 베타-3-효능제, 렙틴(leptin) 또는 렙틴 모방체, 5HT2c 수용체의 효능제(예를 들어, 로르카세린(Lorcaserin)) 또는 부프로피온(bupropione)/날트렉손(naltrexone), 부프로피온(bupropione)/조니사미드(zonisamide), 부프로피온(bupropione)/펜터민(phentermine) 또는 프람린티드(pramlintide)/메트렐렙틴(metreleptin)의 조합물.

다른 적합한 조합 파트너는 다음과 같다:

추가 위장 펩티드, 예를 들어, 펩티드 YY 3-36(PYY3-36) 또는 이의 유사체, 췌장 폴리펩티드(PP) 또는 이의 유사체.

글루카곤 수용체 효능제 또는 길항제, GIP 수용체 효능제 또는 길항제, 그렐린(ghrelin) 길항제 또는 역 효능제, 제닌(Xenin) 및 이의 유사체.

또한, 고혈압, 만성 심장기능상실 또는 죽상경화증에 영향을 미치는 약물과의 조합물, 예를 들어, 안지오텐신 II 수용체 길항제(예를 들어, 텔미사르탄(telmisartan), 칸데사르탄(candesartan), 발사르탄(valsartan), 로사르탄(losartan), 에프로사르탄(eprosartan), 이르베사르탄(irbesartan), 올메사르탄(olmesartan), 타소사르탄(tasosartan), 아질사르탄(azilsartan)), ACE 억제제, ECE 억제제, 이뇨제, 베타-차단제, 칼슘 길항제, 중추 작용 고혈압제(centrally acting hypertensives), 알파-2-아드레날린 수용체의 길항제, 중성 엔도펩티다제의 억제제, 혈소판 응집 억제제 및 기타 약물 또는 이의 조합물이 적합하다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 GLP-1 및 글루카곤에 대한 수용체에 결합하고, 이의 활성을 조절함으로써 영향을 받을 수 있는 질병 또는 질환의 치료 또는 예방에 적합한 약제를 제조하기 위한, 조합 파트너로서 상기 기재된 활성 물질 중 적어도 하나와 조합된 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다. 이는 바람직하게는 대사 증후군, 특히 상기 나열된 질병 또는 질환 중 하나, 가장 특히 당뇨병 또는 비만 또는 이의 합병증의 상황의 질병이다.

하나 이상의 활성 물질과 조합된 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염의 사용은 동시에, 별개로 또는 순차적으로 발생할 수 있다.

또 다른 활성 물질과 조합된 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염의 사용은 동시에 또는 시차를 두지만, 특히 단기간 내에 발생할 수 있다. 이들이 동시에 투여되는 경우, 2 개의 활성 물질은 함께 환자에게 제공되고, 이들이 시차를 두고 사용되는 경우, 2 개의 활성 물질은 12 시간 또는 그 미만, 그러나 특히 6 시간 또는 그 미만의 기간 내에 환자에게 제공된다.

결과로서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 또는 이러한 화합물의 생리학적으로 허용되는 염 및 조합 파트너로서 상기 기재된 활성 물질 중 적어도 하나와 함께 임의로 하나 이상의 비활성 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 또는 용매화물 및 이와 조합되는 추가 활성 물질은 둘 모두가 하나의 제형, 예를 들어, 바이얼 또는 카트리지에 함께 제공될 수 있거나, 예를 들어, 소위 부품 키트(kit-of-part)로서 2 개의 동일하거나 상이한 제형에 독립적으로 제공될 수 있다.

도 1. 암컷 고지방 사육 C57BL/6 마우스에서 50 ㎍/kg bid로 SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8을 이용한 4 주 피하 치료 동안의 체중 발달. 데이터는 평균+SEM이다.
도 2. 암컷 고지방 사육 C57BL/6 마우스에서 50 ㎍/kg bid로 SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8을 이용한 4 주 피하 치료 동안의 상대 체중 변화%. 데이터는 평균+SEM이다.
도 3. 암컷 고지방 사육 C57BL/6 마우스에서 50 ㎍/kg bid로 SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8을 이용한 치료 2 일 전 및 4 주 후, 핵 자기 공명(NMR)에 의해 측정된 총 지방 질량의 결정. 데이터는 평균+SEM이다.
도 4. 암컷 고지방 사육 C57BL/6 마우스에서 혈당에 대한 50 ㎍/kg 화합물 SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8의 s.c. 투여의 급성 효과. 데이터는 평균+SEM이다.
도 5. 암컷 고지방 사육 C57BL/6 마우스에서 혈당에 대한 50 ㎍/kg qd, 화합물 SEQ ID NO: 15의 s.c. 투여의 급성 효과. 데이터는 평균+SEM이다.
도 6. 암컷 고지방 사육 C57BL/6 마우스에서 50 ㎍/kg qd, SEQ ID NO: 15의 4 주 피하 치료 동안 상대 체중 변화%. 데이터는 평균+SEM이다.
도 7. 암컷 고지방 사육 C57BL/6 마우스에서 50 ㎍/kg qd, SEQ ID NO: 15를 이용한 치료 2 일 전 및 4 주 후, 핵 자기 공명(NMR)에 의해 측정된 총 지방 질량의 결정. 데이터는 평균+SEM이다.

방법

사용되는 약어는 하기와 같다:

AA 아미노산

AEEAc (2-(2-아미노에톡시)에톡시)아세틸

cAMP 고리 아데노신 모노포스페이트

Boc 3차-부틸옥시카르보닐

BOP (벤조트라이아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트

BSA 소 혈청 알부민

tBu 3차 부틸

DCM 디클로로메탄

Dde 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥실리덴)-에틸

ivDde 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥실리덴)-3-메틸-부틸

DIC N,N'-디이소프로필카르보디이미드

DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민

DMEM 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)

DMF 디메틸 포름아미드

DMS 디메틸설피드

EDT 에탄디티올

FA 포름산

FBS 소 태아 혈청

Fmoc 플루오레닐메틸옥시카르보닐

HATU O-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트

HBSS 행크 평형 염 용액

HBTU 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄 헥사플루오로포스페이트

HEPES 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄설폰산

HOBt 1-하이드록시벤조트라이아졸

HOSu N-하이드록시숙신이미드

HPLC 고성능 액체 크로마토그래피

HTRF 균일 시간 분해 형광(Homogenous Time Resolved Fluorescence)

IBMX 3-이소부틸-1-메틸잔틴

LC/MS 액체 크로마토그래피/질량분광법

Mmt 모노메톡시-트리틸

Palm 팔미토일

PBS 인산염 완충 염수

PEG 폴리에틸렌 글리콜

PK 약동학

RP-HPLC 역상 고성능 액체 크로마토그래피

Stea 스테아릴

TFA 트라이플루오로아세트산

Trt 트라이틸

UV 자외선

γ-E γ-글루타메이트

펩티드 화합물의 일반 합성

재료:

다양한 Rink-아미드 수지(4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르류실아미노메틸 수지, Merck Biosciences; 4-[(2,4-디메톡시페닐)(Fmoc-아미노)메틸]페녹시 아세트아미도 메틸 수지, Agilent Technologies)가 0.2 mmol/g 내지 0.4 mmol/g 범위 내의 부하(loading)로 펩티드 아미드의 합성에 사용되었다.

Fmoc 보호된 천연 아미노산을 Protein Technologies Inc., Senn Chemicals, Merck Biosciences, Novabiochem, Iris Biotech, Bachem, Chem-Impex International 또는 MATRIX Innovation으로부터 구입하였다. 하기 표준 아미노산을 합성 전체에 걸쳐 사용하였다: Fmoc-L-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-L-Asn(Trt)-OH, Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Gln(Trt)-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Ile-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)-OH, Fmoc-L-Met-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Pro-OH, Fmoc-L-Ser(tBu)-OH, Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-L-Val-OH.

또한, 다음과 같은 특정 아미노산을 상기와 동일한 공급업체로부터 구입하였다: Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH, Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-D-Ser(tBu)-OH, Fmoc-D-Ala-OH, Boc-L-Tyr(tBu)-OH, Boc-L-His(Boc)-OH(톨루엔 용매화물로서 이용가능함) 및 Boc-L-His(Trt)-OH.

고체상 펩티드 합성을, 예를 들어, 표준 Fmoc 화학 및 HBTU/DIPEA 활성화를 이용하여 Prelude 펩티드 Synthesizer(Protein Technologies Inc) 또는 유사한 자동화 합성기에서 수행하였다. DMF를 용매로서 사용하였다. 탈보호: 2 x 2.5분 동안 20% 피페리딘/DMF. 세정: 7 x DMF. 커플링 2 x 20분 동안 DMF 중 2:5:10의 200 mM AA/500 mM HBTU/2M DIPEA. 세정: 5 x DMF.

Lys-측쇄가 변형된 경우, Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH 또는 Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH를 상응하는 위치에서 사용하였다. 합성의 완료 후, ivDde 기를 DMF 중 4% 하이드라진 하이드레이트를 이용한 변형된 문헌의 절차(S.R. Chhabra et al., Tetrahedron Lett. 39, (1998), 1603)에 따라 제거하였다. Mmt 기를 디클로로메탄 중 1% TFA를 이용한 반복 처리에 의해 제거하였다. 수지를 요망되는 산의 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르로 처리하거나, HBTU/DIPEA 또는 HOBt/DIC와 같은 커플링 시약을 이용함으로써 하기 아실화를 수행하였다.

합성된 모든 펩티드를 82.5% TFA, 5% 페놀, 5% 물, 5% 티오아니솔, 2.5% EDT로 구성된 King 분해 칵테일을 이용하여 수지로부터 분해시켰다. 이후, 미정제 펩티드를 디에틸 또는 디이소프로필 에테르 중에 침전시키고, 원심분리시키고, 동결건조시켰다. 펩티드를 분석 HPLC에 의해 분석하고, ESI 질량분광법에 의해 확인하였다. 미정제 펩티드를 통상적인 분취용 RP-HPLC 정제 절차에 의해 정제하였다.

대안적으로, 펩티드를 수동 합성 절차에 의해 합성하였다:

0.3 g 건조된 Rink 아미드 MBHA 수지(0.66 mmol/g)를 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣었다. 수지를 1 h 동안 DCM(15 ml) 중에 그리고 1 h 동안 DMF(15 ml) 중에 팽윤시켰다. 수지 상의 Fmoc 기를 5 분 및 15 분 동안 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액으로 2 회 처리하여 탈보호하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF(각각 6:6:6 회)로 세정하였다. 고체 지지체로부터 Fmoc의 제거 입체형태를 위해 Kaiser 시험(정량적 방법)을 이용하였다. 건조 DMF 중 C-말단 Fmoc-아미노산(수지 부하 대비 5 당량 과량)을 탈보호된 수지에 첨가하고, 5 당량 과량의 DMF 중 DIC 및 HOBT로 커플링을 개시하였다. 반응 혼합물 중 각각의 반응물의 농도는 대략 0.4 M이었다. 혼합물을 2 h 동안 실온에서 회전자 상에서 회전시켰다. 수지를 여과하고 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6 회). 커플링 종료 시 펩티드 수지 분취액에 대한 Kaiser 시험은 음성이었다(수지에 색상 없음). 첫번째 아미노산 부착 후, 존재하는 경우 수지 내의 미반응 아미노기를 20 분 동안 아세트산 무수물/피리딘/DCM(1:8:8)을 이용해서 캡핑하여 서열의 임의 결실을 배제하였다. 캡핑 후, 수지를 DCM/DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6/6/6/6 회). 펩티드 수지에 부착된 C-말단 아미노산 상의 Fmoc 기를 5 분 및 15 분 동안 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액으로 2 회 처리하여 탈보호하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6 회). Fmoc-탈보호 종료 시 펩티드 수지 분취액에 대한 Kaiser 시험은 양성이었다. Rink 아미드 MBHA 수지 상의 표적 서열에서 나머지 아미노산을 DMF 중 수지 부하 대비 5 당량 과량을 이용하여 Fmoc AA/DIC/HOBt 방법을 이용해서 순차적으로 커플링하였다. 반응 혼합물 중 각각의 반응물의 농도는 대략 0.4 M이었다. 혼합물을 2 h 동안 실온에서 회전자 상에서 회전시켰다. 수지를 여과하고 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6 회). 각각의 커플링 단계 및 Fmoc 탈보호 단계 후, Kaiser 시험을 수행하여 반응 종료를 확인하였다.

선형 서열의 종료 후, 분지점 또는 변형점으로 이용된 리신의 ε-아미노기를 15 분 동안 2 회 DMF 중 2.5% 하이드라진 수화물을 이용해서 탈보호하고 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6 회). DMF 중에서 DIC/HOBt 방법으로(수지 부하 대비 5 당량 과량) Fmoc-Glu(OH)-OtBu을 이용하여 글루탐산의 γ-카르복실 말단을 Lys의 ε-아미노기로 부착하였다. 혼합물을 2 h 동안 실온에서 회전자 상에서 회전시켰다. 수지를 여과하고 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6x30 ml). 글루탐산 상의 Fmoc기를 5 분 및 15 분 동안 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액으로 2 회 처리하여 탈보호하였다(각각 25 ml). 수지를 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6 회). Fmoc-탈보호 종료 시 펩티드 수지 분취액에 대한 Kaiser 시험은 양성이었다.

측쇄 분지가 또한 γ-글루탐산을 하나 더 함유하는 경우, DMF 중에서 DIC/HOBt 방법으로(수지 부하 대비 5 당량 과량) γ-글루탐산의 자유 아미노기에 부착하기 위해 두번째 Fmoc-Glu(OH)-OtBu을 이용하였다. 혼합물을 2 h 동안 실온에서 회전자 상에서 회전시켰다. 수지를 여과하고 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6x30 ml). γ-글루탐산 상의 Fmoc기를 5 분 및 15 분 동안 20%(v/v) 피페리딘/DMF 용액(25 mL)으로 2 회 처리하여 탈보호하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6 회). Fmoc-탈보호 종료 시 펩티드 수지 분취액에 대한 Kaiser 시험은 양성이었다.

글루탐산의 측쇄에 대한 팔미트산 & 스테아르산 부착:

γ-글루탐산의 자유 아미노기에 DMF에 용해된 팔미트산 또는 스테아르산(5 당량)을 첨가하고, DMF 중 DIC(5 당량) 및 HOBt(5 당량)의 첨가에 의해 커플링을 개시하였다. 수지를 DMF/DCM/DMF로 세정하였다(각각 6:6:6 회).

수지로부터 펩티드의 최종 분해:

수동 합성에 의해 합성된 펩티드 수지를 DCM(6x10 ml), MeOH(6x10 ml) 및 에테르(6x10 ml)로 세정하고, 밤새 진공 건조기에서 건조하였다. 펩티드-수지를 3 h 동안 실온에서 시약 칵테일(80.0% TFA/5% 티오아니솔/5% 페놀/2.5% EDT, 2.5% DMS 및 5% DCM)로 처리하여 고체 지지체로부터의 펩티드 분해를 달성하였다. 분해 혼합물을 여과로 수집하고, 수지를 TFA(2 ml) 및 DCM(2 x 5 ml)으로 세정하였다. 과량의 TFA 및 DCM을 질소 하에 작은 부피로 농축하고 소량의 DCM(5 ml 내지 10 ml)을 잔류물에 첨가하고 질소 하에 증발시켰다. 공정을 3 회 내지 4 회 반복하여 대부분의 휘발성 불순물을 제거하였다. 잔류물을 0℃까지 냉각하고, 무수 에테르를 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 원심분리하고 상층액 에테르를 제거하고, 신선 에테르를 펩티드에 첨가하여 재-원심분리하였다. 미정제 샘플을 분취용 HPLC로 정제하고 동결건조하였다. 펩티드의 정체를 LCMS로 확인하였다.

분석용 HPLC / UPLC

방법 A: 210 nm 내지 225 nm에서 검출

컬럼: 50℃에서 Waters ACQUITY UPLC? CSH™ C18 1.7 ㎛(150 x 2.1 mm)

용매: H₂O와 0.5% TFA : ACN과 0.35% TFA(유량 0.5 ml/분)

구배: 80:20(0 분) → 80:20(3 분) → 25:75(23 분) → 2:98(23.5 분) → 2:98(30.5 분) → 80:20(31 분) → 80:20(37 분)

선택적으로 질량 분석기: LCT Premier, 전기분무 양이온 모드

방법 B: 210 nm 내지 225 nm에서 검출

컬럼: Aries prep XBC 18(4.6x250 mm x 3.6 ㎛), 온도: 25℃

용매: H₂O와 0.1% TFA : ACN과 0.1% TFA(유량 1 ml/분)

구배: 2% 완충제 B로 컬럼 평형화 및 15 분 동안 2% 내지 70% 완충제 B의 구배에 의한 용리.

일반 분취용 HPLC 정제 절차

미정제 펩티드를 Akta Purifier System, Jasco semiprep HPLC System 또는 Agilent 1100 HPLC 시스템에서 정제하였다. 다양한 크기 및 다양한 유량의 분취용 RP-C18-HPLC 컬럼을 정제되는 미정제 펩티드의 양에 따라 사용하였다. 아세토니트릴과 0.1% TFA(B) 및 물과 0.1% TFA(A)를 용리액으로 사용하였다. 생성물-함유 분획을 수집하고, 동결건조시켜, 통상적으로 TFA 염으로서 정제된 생성물을 수득하였다.

엑센딘 -4 유도체의 용해도 및 안정성-시험

펩티드 뱃치(batch)의 용해도 및 안정성의 시험 전, 이의 순도(HPLC-UV)를 결정하였다.

용해도 시험을 위해, 표적 농도는 1.0 mg/ml의 순수한 화합물이었다. 따라서, 고체 샘플로부터의 용액을 이전에 결정된 순도%를 기초로 하여 10 mg/ml의 화합물의 농도로 다양한 완충제 시스템에서 제조하였다. HPLC-UV를 4500 rpm에서 20 분의 원심분리에 의해 수득된 상층액으로부터의 2 시간의 가벼운 진탕 후에 수행하였다.

이후, 0.2 ㎕ 주사와 0.2 ㎕ 내지 2 ㎕ 범위의 상이한 주사 부피의 DMSO 중 1.2 mg/mL(순도%에 기초) 농도의 펩티드 스톡 용액으로 수득된 UV 피크 면적의 비교에 의해 용해도를 결정하였다. 이러한 분석은 또한 안정성 시험에 대한 시작점(t0)으로 작용하였다.

안정성 시험을 위해, 용해도에 대해 수득된 상층액의 분취액을 40℃에서 7 일 동안 저장하였다. 상기 시간 경과 후에, 샘플을 4500 rpm에서 20 분 동안 원심분리시키고, 0.2 ㎕의 상층액을 HPLC-UV를 이용하여 분석하였다.

잔여 펩티드의 양의 결정을 위해, t0 및 t7에서의 표적 화합물의 피크 면적을 비교하여, 하기 식에 따라 "잔여 펩티드%"를 발생시켰다.

잔여 펩티드% = [(피크 면적 펩티드 t7) x 100]/피크 면적 펩티드 t0.

안정성은 "잔여 펩티드%"로 표시된다.

HPLC/UPLC 방법으로서 방법 B를 이용하여 214 nM에서 검출하였다.

GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체 유효성에 대한 시험관내 세포 검정

수용체에 대한 화합물의 효능작용을 인간 GLP-1, GIP 또는 글루카곤 수용체를 안정적으로 발현하는 HEK-293 세포주의 cAMP 반응을 측정하는 기능 검정에 의해 결정하였다.

세포의 cAMP 함량을 HTRF(균일 시간 분해 형광)을 기초로 한 Cisbio Corp.로부터의 키트(cat. no. 62AM4PEC)를 이용하여 결정하였다. 제조를 위해, 세포를 T175 배양 플라스크로 나누고, 배지(DMEM/10% FBS) 중에서 거의 컨플루언스(confluence)까지 밤새 성장시켰다. 이후, 배지를 제거하고, 세포를 칼슘 및 마그네슘이 결여된 PBS로 세정한 후, 아큐타제(accutase)(Sigma-Aldrich cat. no. A6964)로 단백분해효소 처리하였다. 분리된 세포를 세정하고, 검정 완충제(1 x HBSS; 20 mM HEPES, 0.1% BSA, 2 mM IBMX)에 재현탁시키고, 세포 밀도를 결정하였다. 이후, 이들을 400000 세포/㎖로 희석시키고, 25 ㎕-분취액을 96-웰 플레이트의 웰로 분배하였다. 측정을 위해, 25 ㎕의 검정 완충제 중 시험 화합물을 웰에 첨가한 후, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 용해 완충제(키트 성분)에 희석된 HTRF 시약의 첨가 후, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션한 후, 665/620 nm에서 형광비를 측정하였다. 효능제의 시험관내 효능을 최대 반응의 50% 활성화를 야기한 농도(EC50)를 결정함으로써 정량하였다.

마우스 및 돼지에서의 엑센딘 -4 유도체의 정량을 위한 생분석 스크리닝 방법

마우스에 1 ㎎/㎏을 피하(s.c.) 투여하였다. 마우스를 희생시키고, 혈액 샘플을 적용 0.25 시간, 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 16 시간 및 24 시간 후에 수거하였다. 혈장 샘플을 액체 크로마토그래피 질량분광법(LC/MS)을 통한 단백질 침전 후에 분석하였다. PK 파라미터 및 반감기를 WinonLin Version 5.2.1(비-구획 모델)을 이용하여 계산하였다.

암컷 Goettinger 미니돼지에 0.1 ㎎/㎏을 피하(s.c.) 투여하였다. 혈액 샘플을 적용 0.25 시간, 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간, 32 시간, 48 시간, 56 시간 및 72 시간 후에 수거하였다. 혈장 샘플을 액체 크로마토그래피 질량분광법(LC/MS)을 통한 단백질 침전 후에 분석하였다. PK 파라미터 및 반감기를 WinonLin Version 5.2.1(비-구획 모델)을 이용하여 계산하였다.

마우스에서의 위 배출 및 장 통과

20 g 내지 30 g의 체중의 암컷 NMRI-마우스를 이용한다. 마우스를 적어도 1 주 동안 수용소 조건에 적응시킨다.

마우스를 항상 물을 이용가능하게 두면서 밤새 금식시킨다. 연구일에, 마우스를 칭량하고, 한마리씩 우리에 두고, 물을 분리한 채로 30 분 동안 500　㎎의 사료에 접근하도록 두었다. 30 분의 급식 기간 종료 후, 잔여 사료를 분리하고, 칭량한다. 60 분 후, 착색된 비-칼로리 볼루스를 위관영양법(gavage)에 의해 위에 주입한다. 시험 화합물/참조 화합물 또는 대조군 그룹에 이의 비히클을 피하 투여하여 착색 볼루스가 투여되었을 때 Cmax에 도달시키도록 한다. 또 다른 30 분 후, 동물을 희생시키고, 위 및 소장을 준비한다. 채워진 위를 칭량하고, 비우고, 조심스럽게 세척하고, 건조시키고, 재칭량한다. 계산된 위 내용물이 위 배출의 정도를 나타낸다. 소장을 강제적이지 않게 펴고, 길이를 측정한다. 이후, 장의 위 시작으로부터 가장 멀리 이동된 장 내용물 볼루스까지의 거리를 측정한다. 장 통과를 상기 거리 및 소장의 전체 길이의 백분율의 비로 제공한다.

동등한 데이터가 암컷 및 수컷 마우스 둘 모두에 대해 수득될 수 있다.

통계 분석을 일원 분산분석(1-way-ANOVA) 및 이후 사후 검정(post-hoc test)으로서 각각 두네트(Dunnetts) 또는 뉴만-케울스(Newman-Keuls)에 의해 Everstat 6.0으로 수행한다. p<0.05 수준의 차이를 통계적으로 유의한 것으로 간주한다. 사후 검정으로서, 두네트 검정은 비히클 대조군과 비교하기 위해서만 적용한다. 뉴만-케울스 검정을 모든 쌍별 비교(즉, 비히클 및 참조군 대비)를 위해 적용한다.

마우스에서의 사료 섭취의 자동화 평가

20 g 내지 30 g의 체중의 암컷 NMRI-마우스를 이용한다. 마우스를 적어도 1 주 동안 수용소 조건에 적응시키고, 평가 장비에서 적어도 하루 동안 한마리씩 우리에 두었으며, 이때 기본 데이터를 동시에 기록한다. 연구일에, 시험 생성물을 빛이 없는 시간(12 시간의 빛이 없는 시간)에 가깝게 피하 투여하고, 사료 소비 평가를 이후에 직접 시작하였다. 평가에는 22 시간에 걸친 지속적 모니터링(30 분 마다)을 포함시켰다. 수일에 걸친 상기 절차의 반복이 가능하다. 22 시간까지의 평가의 제한은 동물의 재칭량, 사료 및 물의 재충전 및 절차 사이의 약물 투여를 가능케 하는 실제적 이유로 인한 것이다. 결과는 22 시간에 걸쳐 누적된 데이터로 평가될 수 있거나, 30 분 간격으로 구별될 수 있다. 동등한 데이터가 암컷 및 수컷 마우스 둘 모두에 대해 수득될 수 있다.

통계 분석을 반복된 측정의 이원 분산분석(2-way ANOVA) 및 두네트 사후 검정에 의해 Everstat 6.0으로 수행한다. p<0.05 수준의 차이를 통계적으로 유의한 것으로 간주한다.

암컷 식이-유도 비만( DIO ) C57BL /6 마우스에서의 혈당 및 체중에 대한 피하 치료 후의 급성 및 만성 효과

C57BL/6 Harlan 마우스를 물 및 표준 또는 고-지방 식이에 자유롭게 접근하도록 하면서 12 시간 명/암 주기로 특정 병원체-비함유 장벽 시설에서 그룹 단위로 사육한다. 고-지방 식이에서 사전 급식 후, 마우스를 치료 그룹(n = 8)에 대해 각각의 그룹이 유사한 평균 체중을 갖도록 분류한다. 표준 사료에 대해 무제한적으로 접근하도록 한 연령-매치된 그룹을 표준 대조군으로 포함시킨다. 실험 전에 마우스에 비히클 용액을 피하(s.c.) 주사하고 3 일 동안 칭량하여, 이들을 절차에 순응시킨다.

1) 사육된 암컷 DIO 마우스에서의 혈당에 대한 급성 효과: 각각 비히클(인산염 완충 용액) 또는 엑센딘-4 유도체(인산염 완충제에 용해됨)의 첫번째 투여(s.c.) 직전에 최초 혈액 샘플을 수집한다. 투여 부피는 5 mL/kg이다. 동물을 실험 동안 물 및 이의 상응하는 식이에 접근하도록 한다. 혈당 수준을 t = 0 h, t = 1 h, t = 2 h, t = 3 h, t = 4 h, t = 6 h 및 t = 24 h(방법: Accu-Check 혈당측정계)에 측정한다. 혈액 샘플링을 마취 없이 꼬리 절개에 의해 수행한다.

2) 암컷 DIO 마우스에서 체중에 대한 만성 효과: 마우스를 4 주 동안 비히클 또는 엑센딘-4 유도체로 빛이 있는 시간의 시작시 및 종료시에 각각 1 일 2 회(오전 및 저녁에 s.c.) 또는 1 회(저녁 시간에 s.c.) 치료한다. 체중을 매일 기록한다. 치료 시작 2 일 전 및 26 일째에, 총 지방 질량을 핵자기공명(NMR)에 의해 측정한다.

통계 분석을 반복된 측정의 이원 분산분석 및 두네트 사후 검정(글루코스 프로파일) 및 일원 분산분석 및 이후의 두네트 사후 검정(체중, 체지방)에 의해 Everstat 6.0으로 수행한다. p<0.05 수준의 비히클-처리된 DIO 대조군 마우스 대비 차이를 통계적으로 유의한 것으로 간주한다.

암컷 당뇨 dbdb -마우스에서의 글루코스 , HbA1c 및 경구 글루코스 내성에 대한 4 주 치료 후의 효과

14.5 mmol/l의 평균 비-공복 글루코스 값 및 37 g 내지 40 g 체중의 8 주령 암컷 당뇨 dbdb-마우스를 이용한다. 마우스를 개별적으로 표시하고, 적어도 1주 동안 수용소 조건에 적응시킨다.

연구 시작 7 일 전에, 비-공복 글루코스 및 HbA1c에 대한 기준선 값을 결정하고, 연구 시작 5 일 전에, 그룹 사이의 더 낮은 값 및 더 높은 값의 고른 분포(층화)를 보장하기 위해 이의 HbA1c 값에 따라 마우스를 그룹 및 우리(cage)에 할당지정한다(우리 당 5 마리의 마우스, 그룹 당 10 마리).

마우스를 오전 및 오후 1 일 2 회 피하 투여에 의해 4 주 동안 치료한다. 꼬리 첨단으로부터의 혈액 샘플을 연구일 21 일에 HbA1c에 대해 수득하고, 경구 글루코스 내성을 4 번째 주에 평가한다.

경구 글루코스 내성 시험을 만성 치료 및 보다 적은 급성 화합물 투여의 효과를 주로 평가하기 위한 여분의 사전 화합물 투여 없이 오전에 수행한다. 마우스를 경구 글루코스 투여(2 g/㎏, t = 0 분) 4 시간 전에 금식시킨다. 혈액 샘플을 글루코스 투여 전 및 투여 15 분, 30 분, 60 분, 90 분, 120 분 및 180 분 후에 수집한다. 마지막 혈액 샘플링 후 급식을 다시 시작한다. 결과는 기준선으로부터의 변화로 표시되며, 글루코스는 mmol/l로 표시되고, HbA1c는 %로 표시된다.

통계 분석을 일원 분산분석에 의한 SAS 및 이후 비히클-대조군에 대한 두네트 사후 검정을 기초로 하여 Everstat Version 6.0으로 수행한다. p<0.05 수준의 차이를 통계적으로 유의한 것으로 간주한다.

비-공복 암컷 당뇨 dbdb -마우스에서의 글루코스 강하

20 mmol/l 내지 22 mmol/l의 평균 비-공복 혈당 값 및 42 g +/- 0.6 g(SEM)의 체중의 암컷 당뇨 dbdb-마우스를 이용한다. 마우스를 개별적으로 표시하고, 적어도 1 주 동안 수용소 조건에 적응시킨다.

연구 시작 3 일 내지 5 일 전, 그룹 사이의 더 낮은 값 및 더 높은 값의 고른 분포(층화)를 보장하기 위해 비-공복 글루코스 값에 따라 마우스를 그룹 및 우리에 할당지정한다(우리 당 4 마리의 마우스, 그룹 당 8 마리). 연구일에, 마우스를 칭량하고 투여(t = 0)한다. 화합물 투여 직전, 물을 이용가능한 채로 두면서 사료를 분리시키고, 꼬리 절개로 첫번째 혈액 샘플을 수집한다(기준선). 추가 혈액 샘플을 30 분, 60 분, 90 분, 120 분, 240 분, 360 분 및 480 분에 꼬리 절개에서 수집한다.

통계 분석을 반복 측정의 이원 분산분석에 의한 SAS 및 이후 비히클-대조군에 대한 두네트 사후 검정을 기초로 하여 Everstat Version 6.0으로 수행한다. p<0.05 수준의 차이를 통계적으로 유의한 것으로 간주한다.

실시예

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.

실시예 1:

SEQ ID NO: 7의 합성

방법에 기재된 수동 합성 절차를 탈수 Rink 아미드 MBHA 수지(0.66 mmol/g) 상에서 수행하였다. Fmoc-합성 전략을 DIC/HOBt-활성화와 함께 적용하였다. 위치 14에서 Fmoc-Lys(ivDde)-OH 및 위치 1에서 Boc-His(Boc)-OH를 사용하였다. ivDde-기를 DMF 중 4% 하이드라진 하이드레이트를 이용하여 변형된 문헌 절차(S.R. Chhabra et al., Tetrahedron Lett. 39, (1998), 1603)에 따라 수지 상의 펩티드로부터 분해시켰다. 펩티드를 King 칵테일을 이용하여 수지로부터 분해시켰다(D. S. King, C. G. Fields, G. B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 36, 1990, 255-266). 미정제 생성물을 아세토니트릴/물 구배(둘 모두의 완충제는 0.1% TFA를 가짐)를 이용하여 분취용 HPLC를 통해 정제하였다. 정제된 펩티드를 LCMS에 의해 분석하였다(방법 B).

체류 시간 14.29 분을 갖는 피크 아래에서 발견된 질량 신호의 디콘볼루션(Deconvolution)은 4649.29의 예상값과 일치하는 펩티드 질량 4649.20을 나타내었다.

실시예 2:

SEQ ID NO: 8의 합성

체류 시간 14.05 분을 갖는 피크 아래에서 발견된 질량 신호의 디콘볼루션은 4635.27의 예상값과 일치하는 펩티드 질량 4634.80을 나타내었다.

유사한 방식으로, 표 3에 기재된 펩티드를 합성하고 특성규명하였다.

합성된 펩티드의 목록 및 계산된 분자량 대 측정된 분자량의 비교

SEQ ID NO	계산된 분자량	측정된 분자량	단일동위원소 또는 평균 분자량
6	4545.4	4546.0	단일동위원소
7	4649.3	4649.2	평균
8	4635.3	4634.8	평균
9	4534.2	4533.0	평균
10	4506.1	4504.8	평균
11	4520.2	4518.3	평균
12	4662.4	4662.2	단일동위원소
13	4648.4	4648.4	단일동위원소
14	4703.5	4703.6	단일동위원소
15	4689.5	4689.5	단일동위원소
16	4793.5	4793.6	단일동위원소
17	4821.6	4821.6	단일동위원소
18	4837.6	4837.6	단일동위원소
20	4150.1	4150.2	단일동위원소
21	4675.5	4675.4	단일동위원소
22	4689.5	4689.5	단일동위원소
23	4138.6	4139.4	평균
24	4123.6	4122.6	평균
25	4164.1	4164.1	단일동위원소

유사한 방식으로, 표 4의 하기 펩티드가 합성될 수 있다:

유사한 방식으로 합성될 수 있는 펩티드의 목록.

SEQ ID NO

19

실시예 3: 안정성 및 용해도

펩티드 화합물의 용해도 및 안정성을 방법에 기재된 바와 같이 평가하였다. 결과는 표 5에 제공된다.

안정성 및 용해도

SEQ ID NO	안정성[%]		용해도[mg/ml]
	pH 4.5	pH 7.4	pH 4.5	pH 7.4
7	89	100	8 초과	8 초과
8	98	100	8 초과	8 초과
14	93	100	8 초과	8 초과
15	96	96	8 초과	8 초과

실시예 4: GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체에 대한 시험관내 데이터

인간 글루카곤 수용체(h글루카곤 R), 인간 GIP 수용체(hGIP-R) 또는 인간 GLP-1 수용체(hGLP-1 R)를 발현하는 세포를 증가하는 농도의 상기 나열된 화합물에 노출시키고, 형성된 cAMP를 방법에 기재된 바와 같이 측정함으로써 GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체에서의 펩티드 화합물의 효능을 결정하였다.

결과를 표 6에 나타낸다.

GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체에서의 엑센딘-4 유도체의 EC50 값(pM로 표시됨)

SEQ ID NO	EC50 hGLP-1R	EC50 h글루카곤-R	EC50 hGIP-R
1	0.4	10000000 초과	12500.0
6	14.1	136.0	2760.0
7	3.4	101.3	7617.5
8	2.3	28.1	2140.0
9	6.4	15.4	1160.0
10	3.5	52.4	890.0
11	10.3	261.0	13400.0
12	3.7	130.0	8290.0
13	1.8	22.8	2390.0
14	4.1	194.0	6530.0
15	2.4	42.6	1855.0
16	2.0	42.0	1870.0
17	2.8	16.2	906.0
18	8.3	8.6	2160.0

실시예 5: 비교 시험

위치 14에 관능화된 아미노산을 포함하는 본 발명의 엑센딘-4 유도체의 선택을 상기 위치 14에 '관능화되지 않은' 아미노산을 갖고 다른 경우에는 동일한 아미노산 서열을 갖는 상응하는 화합물 대비 시험하였다. 참조 페어 화합물 및 GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체에서 상응하는 EC50 값(pM로 표시됨)을 표 7에 제공한다. 나타낸 바와 같이, 본 발명의 엑센딘-4 유도체는 위치 14에 '관능화되지 않은' 아미노산을 갖는 화합물에 비해 더 우수한 활성을 나타낸다.

또한, 위치 27에 Aib를 포함하는 본 발명의 엑센딘-4 유도체의 선택을 천연 엑센딘-4에서와 같이 상기 위치에서 리신 잔기를 갖고 다른 경우에는 동일한 아미노산 서열을 갖는 상응하는 화합물 대비 시험하였다. 참조 페어 화합물 및 GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체에서 상응하는 EC50 값(pM로 표시됨)을 표 8에 제공한다. 나타낸 바와 같이, 본 발명의 엑센딘-4 유도체는 천연 엑센딘-4에서와 같이 위치 27에 Lys을 갖는 상응하는 유도체에 비해 GIP 수용체 상에서 감소된 활성을 나타낸다.

위치 14에 관능화되지 않은 아미노산을 포함하는 엑센딘-4 유도체 대 위치 14에 관능화된 아미노산 및 다른 경우에는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 엑센딘-4 유도체의 비교. GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체에서의 EC50 값은 pM로 표시된다(K=리신, Nle=노르류신, L=류신, γE-x53=(S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, γE-x70=(S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, Ac=아세테이트, γE-γE-x53=(S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-)

SEQ ID NO	EC50 hGLP-1R	EC50 h글루카곤-R	EC50 hGIP-1	위치 14에서의 잔기
24	8.0	3090.0	114000.0	L
23	52.5	42900.0	177000.0	K
8	2.3	28.1	2140.0	K( γE - γE -x53)
9	6.4	15.4	1160.0	K( γE -x70)
10	3.5	52.4	890.0	K( γE -x53)
15	1.2	394.0	11900.0	L
21	1.2	3.2	193.0	K( γE - γE -x53)

위치 27에 Aib를 포함하는 엑센딘-4 유도체 대 위치 27에 Lys 및 다른 경우에는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 엑센딘-4 유도체의 비교. GLP-1, 글루카곤 및 GIP 수용체에서의 EC50 값은 pM로 표시된다.

SEQ ID NO	EC50 hGLP-1R	EC50 h글루카곤-R	EC50 hGIP-1	위치 27에서의 잔기
21	1.2	3.2	193.0	K
8	2.3	28.1	2140.0	Aib
22	1.8	5.9	148.0	K
7	3.4	101.3	7617.5	Aib

실시예 6: 약동학 시험

약동학 프로파일을 방법에 기재된 바와 같이 결정하였다. 계산된 T_1/2 및 Cmax 값은 표 9에 제시된다.

엑센딘-4 유도체의 약동학 프로파일.

	마우스(1 mg/kg)		미니 돼지(0.1 mg/kg)
SEQ ID NO	T_1/2[h]	Cmax [ng/ml]	T_1/2[h]	Cmax [ng/ml]
7	3.1	5510.0	29	667
8	3.8	4360.0	18.1	476

실시예 7: 암컷 식이-유도 비만( DIO ) C57BL /6 마우스에서 혈당 및 체중에 대한 bid 피하 치료 후 SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8의 급성 및 만성 효과

1) 글루코스 프로파일

혈당 기준선 수준을 결정하기 위한 혈액 샘플링 후, 사육 식이-유도 비만 암컷 C57BL/6 마우스에 50 ㎍/kg의 SEQ ID NO: 7, 50 ㎍/kg의 SEQ ID NO: 8 또는 인산염 완충 용액(표준 또는 고지방 식이 상의 비히클 대조군)를 피하 투여하였다. 소정 시점에, 더 많은 혈액 샘플을 수집해서 혈당을 측정하고, 24 h에 걸쳐 혈당 프로파일을 생성하였다.

SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8은 화합물 투여 후 t=1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h 및 24 h 시점에 있어서 DIO 대조군 마우스에 비해 혈당에서 유의미한 감소를 나타내었다(p<0.0001, 2-W-ANOVA-RM, 사후 두네트 검정; 평균 ± SEM; 도 4 참조).

2) 체중

암컷 비만 C57BL/6 마우스에 4 주 동안 1 일 2 회 50 ㎍/kg SEQ ID NO: 7, 50 ㎍/kg SEQ ID NO: 8 또는 비히클로 피하 치료하였다. 체중을 매일 기록하고, 체지방 함량을 치료 시작 전 및 4 주 후 결정하였다.

50 ㎍/kg SEQ ID NO: 7을 이용한 치료는 7 일째에 시작해서 연구 말기까지 계속 1 일 체중에 있어서 비히클 DIO 대조군 마우스와 비교하는 경우, 통계적으로 유의미한 감소를 나타내었다(연구 말기에 p>0.0001). 50 ㎍/kg SEQ ID NO: 8을 이용한 치료는 5 일째에 시작해서 연구 말기까지 계속 비히클 DIO 대조군 마우스와 비교하는 경우 체중을 유의미하게 감소시켰다(연구 말기에 p>0.0001, 표 10, 도 1 및 2). 이들 변화는 체지방 함량에서의 절대 변화로 제시되는 바와 같이(표 10, 도 3), 체지방의 감소로 야기되었다.

4 주 치료 기간에 걸쳐 DIO 마우스에서의 체중 변화(평균 ± SEM)

예(용량)	전반적 체중 변화(g)	체지방 변화(g)
대조군 표준 식이	+ 0.94 ± 0.4	+ 2.56 ± 0.4
대조군 고지방 식이	+ 3.83 ± 0.5	+ 5.00 ± 0.5
SEQ ID NO: 7(50 ㎍/kg bid)	- 5.49 ± 0.9	- 3.73 ± 0.8
SEQ ID NO: 8(50 ㎍/kg bid)	- 5.38 ± 0.5	- 3.81 ± 0.6

실시예 8: 암컷 식이-유도 비만( DIO ) C57BL /6 마우스에서 혈당 및 체중에 대한 qd 피하 치료 후 SEQ ID NO: 15의 급성 및 만성 효과

1) 글루코스 프로파일

혈당 기준선 수준을 결정하기 위한 혈액 샘플링 후, 사육 식이-유도 비만 암컷 C57BL/6 마우스에 50 ㎍/kg의 SEQ ID NO: 15 또는 인산염 완충제(표준 또는 고지방 식이 상의 비히클 대조군)를 1 일 1 회 피하 투여하였다. 소정 시점에, 더 많은 혈액 샘플을 수집해서 혈당을 측정하고, 24 h에 걸쳐 혈당 프로파일을 생성하였다.

SEQ ID NO: 15는 화합물 투여 후 t=1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h 및 24 h 시점에 있어서 DIO 대조군 마우스에 비해 혈당에서 유의미한 감소를 나타내었다(p<0.001, 2-W-ANOVA-RM, 사후 두네트 검정; 평균 ± SEM)(도 5 참고).

2) 체중

암컷 비만 C57BL/6 마우스에 4 주 동안 1 일 1 회 50 ㎍/kg SEQ ID NO: 15 또는 비히클로 피하 치료하였다. 체중을 매일 기록하고, 체지방 함량을 치료 시작 전 및 4 주 후 결정하였다.

50 ㎍/kg SEQ ID NO: 15를 이용한 치료는 4 일째에 시작해서 연구 말기까지 계속 1 일 체중에 있어서의 비히클 DIO 대조군 마우스와 비교하는 경우, 통계적으로 유의미한 감소를 나타내었다(연구 말기에 p>0.001, 표 11, 도 6). 이들 변화는 체지방 함량에서의 절대 변화로 제시되는 바와 같이(표 11, 도 7), 체지방의 감소로 야기되었다.

4 주 치료 기간에 걸친 DIO 마우스에서의 체중 변화(평균 ± SEM)

예(용량)	전반적 체중 변화(g)	체지방 변화(g)
대조군 표준 식이	+ 1.71 ± 0.3	+ 0.71 ± 0.4
대조군 고지방 식이	+ 5.41 ± 0.5	+ 3.26 ± 0.4
SEQ ID NO: 15(50 ㎍/kg qd)	- 4.59 ± 1.1	- 4.01 ± 0.68

서열

SEQ. ID	서열
1	H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
2	H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K-E-F-I-A-W-L-V-K-G-R-NH2
3	H-S-Q-G-T-F-T-S-D-Y-S-K-Y-L-D-S-R-R-A-Q-D-F-V-Q-W-L-M-N-T-OH
4	H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K(γE-x53)-E-F-I-A-W-L-V-R-G-R-G-OH
5	Y-A-E-G-T-F-I-S-D-Y-S-I-A-M-D-K-I-H-Q-Q-D-F-V-N-W-L-L-A-Q-K-G-K-K-N-D-W-K-H-N-I-T-Q-OH
6	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-x70)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-dAla-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
7	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-γE-x53)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-dAla-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
8	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-γE-x53)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
9	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-x70)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
10	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-x53)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
11	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-x53)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-dAla-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
12	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-γE-x53)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-S-dAla-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
13	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-γE-x53)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-S-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
14	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-γE-x53)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-K-dAla-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
15	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-γE-x53)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-K-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
16	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(AEEAc-AEEAc-γE-x53)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
17	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(AEEAc-AEEAc-γE-x70)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
18	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(AEEAc-AEEAc-AEEAc-x70)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
19	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(AEEAc-AEEAc-γE-x99)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
20	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-dAla-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
21	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-γE-x53)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
22	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-γE-x53)-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-K-A-dAla-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
23	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
24	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-L-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-Aib-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
25	H-Aib-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-L-D-E-Q-R-A-K-L-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2

SEQUENCE LISTING <110> Sanofi <120> Exendin-4 Derivatives as peptidic dual GLP-1/Glucagon Receptor Agonists <130> DE2014/029 <150> EP14305501.0 <151> 2014-04-07 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Amidated C-terminus <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyryl) <400> 4 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln 35 40 <210> 6 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-carboxy-4-octadecanoylamino-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Xaa is D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 6 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Xaa Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 7 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylami no)-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Xaa is D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 7 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Xaa Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 8 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylami no)-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 8 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 9 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-Carboxy-4-octadecanoylamino-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 9 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 10 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 10 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 11 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Xaa is D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 11 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Xaa Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 12 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylami no)-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Xaa is D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 12 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ser Xaa Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 13 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylami no)-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 13 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ser Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 14 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylami no)-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Xaa is D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 14 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Lys Xaa Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 15 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylami no)-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 15 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 16 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-Carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylami no]-ethoxy}-ethoxy)-acetylamino]-ethoxy}-ethoxy)-acetyl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 16 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 17 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-Carboxy-4-octadecanoylamino-butyrylami no]-ethoxy}-ethoxy)-acetylamino]-ethoxy}-ethoxy)-acetyl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 17 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 18 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys([2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-Octadecanoylamino-ethoxy)-ethoxy]-ace tylamino}-ethoxy)-ethoxy]-acetylamino}-ethoxy)-ethoxy]-acetyl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 18 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 19 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-Carboxy-4-(17-carboxy-heptadecanoyl)am ino-butyrylamino]-ethoxy}-ethoxy)-acetylamino]-ethoxy}-ethoxy)-ac etyl) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 19 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 20 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Xaa is D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 20 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Xaa Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 21 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylami no)-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 21 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 22 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-Carboxy-4-((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyrylami no)-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Xaa is D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 22 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Xaa Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 23 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 23 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 24 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 24 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Xaa Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 25 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Amidated C-terminus <400> 25 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Ala Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35

Claims

화학식 (I)의 펩티드 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물:
H₂N-His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Asp-Glu-Gln-Arg-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Aib-X28-X29-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-R¹ (I)
(X14는 Lys, Orn, Dab 또는 Dap으로 구성된 군으로부터 선택된, 관능화된 -NH₂ 측쇄기를 갖는 아미노산 잔기를 나타내며, 상기 -NH₂ 측쇄기는 -Z-C(O)-R⁵에 의해 관능화되며, 여기서
Z는 모든 입체이성질체 형태의 링커를 나타내고,
R⁵는 최대 50 개 탄소 원자 그리고 N 및 O로부터 선택된 헤테로원자를 포함하는 모이어티이고,
X28은 Ala, Lys 및 Ser으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
X29는 D-Ala 및 Gly으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
R¹은 NH₂ 또는 OH임).
제1항에 있어서, R¹이 NH₂인 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 펩티드 화합물이 글루카곤 수용체에서 천연 글루카곤에 비해 적어도 0.09%의 상대 활성을 가지는 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 화합물이 GLP-1 수용체에서 GLP-1(7-36)-아미드에 비해 적어도 0.1%의 상대 활성을 나타내는 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys을 나타내며, 상기 -NH₂ 측쇄기가 -Z-C(O)R⁵ 기로 관능화되고, 여기서
Z는 γE, γE-γE, AEEAc-AEEAc-γE 및 AEEAc-AEEAc-AEEAc로부터 선택된 기를 나타내고,
R⁵는 펜타데카닐, 헵타데카닐 또는 16-카복시-헥사데카닐로부터 선택된 기를 나타내는 화합물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys을 나타내며, 상기 -NH₂ 측쇄기가 -Z-C(O)R⁵ 기로 관능화되고, 여기서
Z는 γE, γE-γE, AEEAc-AEEAc-γE 및 AEEAc-AEEAc-AEEAc로부터 선택된 기를 나타내고,
R⁵는 펜타데카닐 또는 헵타데카닐로부터 선택된 기를 나타내는 화합물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys을 나타내며, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, [2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-옥타데카노일아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸-로 관능화되고,
X28이 Ala를 나타내고,
X29가 D-Ala 및 Gly으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
R¹이 NH₂를 나타내는 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys을 나타내며, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-로 관능화되고,
X28이 Ser을 나타내고,
X29가 D-Ala 및 Gly으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
R¹이 NH₂를 나타내는 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys을 나타내며, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-로 관능화되고,
X28이 Lys을 나타내고,
X29가 D-Ala 및 Gly으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
R¹이 NH₂를 나타내는 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys을 나타내며, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-로 관능화되고,
X28이 Ala, Lys 및 Ser으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
X29가 D-Ala를 나타내고,
R¹이 NH₂를 나타내는 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys을 나타내며, 상기 -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴-, (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, (2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸아미노]-에톡시}-에톡시)-아세틸, [2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-옥타데카노일아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸아미노}-에톡시)-에톡시]-아세틸-로 관능화되고,
X28이 Ala, Lys 및 Ser으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
X29가 Gly을 나타내고,
R¹이 NH₂를 나타내는 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
X14가 Lys을 나타내며, -NH₂ 측쇄기가 (S)-4-카복시-4-((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴아미노)-부티릴-로 관능화되고,
X28이 Ala를 나타내고,
X29가 Gly 및 D-Ala로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고,
R¹이 NH₂를 나타내는 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO: 19의 화합물뿐만 아니라 이의 염 또는 용매화물로부터 선택되는 화합물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO: 18의 화합물뿐만 아니라 이의 염 또는 용매화물로부터 선택되는 화합물.
약물, 특히 인간 약물에서 사용하기 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 화합물.
제15항에 있어서, 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 약학적 조성물에서 활성제로 존재하는 사용하기 위한 화합물.
제15항 또는 제16항에 있어서, 적어도 하나의 추가 치료 활성제와 함께 사용하기 위한 화합물로서, 추가 치료 활성제가 일련의 인슐린 및 인슐린 유도체, GLP-1, GLP-1 유사체 및 GLP-1 수용체 효능제, 중합체 결합된 GLP-1 및 GLP-1 유사체, 이중 GLP1/글루카곤 효능제, 이중 GLP1/GIP 효능제, PYY3-36 또는 이의 유사체, 췌장 폴리펩티드 또는 이의 유사체, 글루카곤 수용체 효능제, GIP 수용체 효능제 또는 길항제, 그렐린 길항제 또는 역 효능제, 제닌 및 이의 유사체, DDP4 억제제, SGLT2 억제제, 이중 SGLT2/SGLT1 억제제, 비구아니드 티아졸리딘디온, 이중 PPAR 효능제, 설포닐우레아, 메글리티니드, 알파-글루코시다제 억제제, 아밀린 및 아밀린 유사체, GPR119 효능제, GPR40 효능제, GPR120 효능제, GPR142 효능제, 전신 또는 저흡수성 TGR5 효능제, 사이클로셋, 11-베타-HSD의 억제제, 글루코키나제의 활성제, DGAT의 억제제, 단백질 티로신포스파타제 1의 억제제, 글루코스-6-포스파타제의 억제제, 프룩토스-1,6-비스포스파타제의 억제제, 글리코겐 포스포릴라제의 억제제, 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제의 억제제, 글리코겐 합성효소 키나제의 억제제, 피루베이트 탈수소효소 키나제의 억제제, 알파2-길항제, CCR-2 길항제, 글루코스 트랜스포터-4의 조정자, 소마토스타틴 수용체 3 효능제, HMG-CoA-환원효소 억제제, 피브레이트, 니코틴산 및 이의 유도체, 니코틴산 수용체 1 효능제, PPAR-알파, 감마 또는 알파/감마) 효능제 또는 조정자, PPAR-델타 효능제, ACAT 억제제, 콜레스테롤 흡수 억제제, 담즙산-결합 물질, IBAT 억제제, MTP 억제제, PCSK9의 조정자, 간 선택적 갑상샘 호르몬 수용체 β 효능제에 의한 LDL 수용체 상향-조절인자, HDL-상승 화합물, 지질 대사 조정자, PLA2 억제제, ApoA-I 증강제, 갑상샘 호르몬 수용체 효능제, 콜레스테롤 합성 억제제, 오메가-3 지방산 및 이의 유도체, 비만 치료를 위한 활성 물질, 예컨대 시부트라민, 테소펜신, 오를리스타트, CB-1수용체 길항제, MCH-1 길항제, MC4 수용체 효능제 및 부분 효능제, NPY5 또는 NPY2 길항제, NPY4 효능제, 베타-3-효능제, 렙틴 또는 렙틴 모사체, 5HT2c 수용체의 효능제 또는 부프로피온/날트렉손(CONTRAVE), 부프로피온/조니스아미드(EMPATIC), 부프로피온/펜터민 또는 프람린티드/메트렐렙틴, QNEXA(펜터민과 토피라메이트)의 조합물, 리파제 억제제, 혈관신생 억제제, H3 길항제, AgRP 억제제, 삼중 모노아민 흡수 억제제(노르에피네프린 및 아세틸콜린), MetAP2 억제제, 칼슘 채널 차단제 딜티아젬의 비강 제형물, 섬유아세포 성장 인자 수용체 4의 생산에 대한 안티센스, 프로히비틴 표적화 펩티드-1, 고혈압, 만성 심장기능상실 또는 죽상경화증에 영향을 주는 약물, 예컨대 안지오텐신 II 수용체 길항제, ACE 억제제, ECE 억제제, 이뇨제, 베타-차단제, 칼슘 길항제, 중추 작용 고혈압제, 알파-2-아드레날린 수용체의 길항제, 중성 엔도펩티다제의 억제제, 혈소판 응집 억제제로부터 선택되는 화합물.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스 불내성, 인슐린 내성, 전-당뇨병, 증가된 공복시 글루코스, 고혈당증, 타입 2 당뇨병, 고혈압, 이상지질혈증, 죽상경화증, 관상 심장 질환, 말초 동맥 질환, 뇌졸중 또는 이들 개별 질환 성분의 임의의 조합의 치료를 위해 사용하기 위한 화합물.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 식욕, 급식 및 칼로리 섭취의 제어, 에너지 소비의 증가, 체중 증가의 예방, 체중 감소의 촉진, 과도한 체중의 감소 및 병적 비만을 포함하는 비만의 총괄적 치료를 위해 사용하기 위한 화합물.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 고혈당증, 타입 2 당뇨병, 비만의 치료 또는 예방을 위해 사용하기 위한 화합물.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병 및 비만의 동시 치료를 위해 사용하기 위한 화합물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 화합물 또는 이들 중 임의의 생리학적으로 허용되는 염 또는 용매를 포함하는 약학적 조성물.