ES2369895T3 - Insulina monocatenaria. - Google Patents
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Abstract
Insulina monocatenaria para el tratamiento de la diabetes de tipo 1 y la diabetes de tipo 2 con la fórmula B(1-26)- X 1 - X 2 -X 3 - X 4 - A (1-21) donde X 1 es Thr, Lys o Arg, X 2 es Pro, Lys o Asp, X 3 es Lys, Pro o Glu, X 4 es una secuencia de péptidos con la siguiente de fórmula X a -X b -X c -X d -X e -X f X g (SEC ID NO:129) donde X a es seleccionado del grupo que consiste en L, R, T, A, H, Q, G, S y V; X b es seleccionado del grupo que consiste en W, G, S, A, H, R, y T; X c es seleccionado del grupo que consiste en L, Y, M, H, R, T, Q, K, V, S, A, G y P; X d es seleccionado del grupo que consiste en R, A, Y, M, S, N, H, y G; X e es seleccionado del grupo que consiste en S, R, A, T, K, P, N, M, H, Q, V, y G; X f es seleccionado del grupo que consiste en G y A; y X g es seleccionado del grupo que consiste en K, R, P, H, F, T, I, Q, W, y A, B(1-26) es una cadena de péptidos que consiste en los primeros 26 residuos de aminoácidos de la cadena B de insulina humana contadas desde el extremo N-terminal de la cadena B o un análogo de la cadena B con una adición o una eliminación de uno de los residuos de aminoácidos en la cadena B o derivado de la cadena B modificada químicamente introduciendo un grupo en la cadena lateral en una o más posiciones de la cadena B o por oxidación o reducción de las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos en la cadena B, y A(1- 21) es la cadena A de insulina natural o un análogo de la misma con una adición o una eliminación de uno de los residuos de aminoácidos en la cadena A o derivado de la cadena A modificada químicamente introduciendo un grupo en la cadena lateral en una o más posiciones de la cadena A o por oxidación o reducción de las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos en la cadena A, donde X4 no contiene dos residuos de aminoácidos básicos adyacentes y donde la insulina monocatenaria tiene una afinidad por el receptor de insulina humana de al menos aproximadamente un 20% de la de la insulina humana si la molécula de insulina monocatenaria no está modificada químicamente por acilación.
Description
Insulina monocatenaria
[0001] La presente invención se refiere a insulinas monocatenarias que tienen actividad insulínica y pueden ser usadas para el tratamiento de la diabetes. Las insulinas monocatenarias tienen una alta estabilidad física y una baja tendencia a la fibrilación y serán solubles en pH neutro. La presente invención también se relaciona con una secuencia de ADN que codifica las insulinas monocatenarias, un método para su producción y composiciones farmacéuticas que contienen las insulinas monocatenarias.
[0002] La insulina es una hormona polipéptida segregada por células r del páncreas y que consiste en dos cadenas polipeptídicas, A y B, que están enlazadas por dos puentes de disulfuro. Además, la cadena A muestra un puente de disulfuro intracatenario.
[0003] La hormona se sintetiza como una proinsulina monocatenaria precursora (preproinsulina) que consiste en un prepéptido de 24 aminoácidos seguido de una proinsulina que contiene 86 aminoácidos en la configuración: prepéptido - B - Arg Arg - C - Lys Arg -A, en el que C es un péptido conector de 31 aminoácidos. Arg-Arg y Lys-Arg son sitios de escisión para la escisión del péptido conector de las cadenas A y B para formar la molécula de insulina bicatenaria. La insulina es esencial para mantener una regulación metabólica normal.
[0004] La estructura de dos cadenas de la insulina permite a la insulina asumir múltiples conformaciones, y varios hallazgos han indicado que la insulina tiene propensión a cambios conformacionales considerables y que las restricciones en el potencial para tales cambios reducen considerablemente la afinidad del receptor de insulina para ligandos. La proinsulina tiene una afinidad 100 veces inferior para el receptor de insulina que la insulina nativa. El bloqueo del residuo de aminoácido A1 en insulina también resulta en una unión pobre al receptor, consistente con el dogma que un extremo N-terminal libre de la cadena A y un extremo C-terminal libre de la cadena B de insulina son importantes para la unión al receptor de insulina.
[0005] La estabilidad química y física heredada de la molécula de insulina es una condición básica para la terapia de insulina para la diabetes mellitus. Estas propiedades básicas son fundamentales para la formulación de insulina y para los métodos aplicables de administración de insulina, al igual que para la fecha de caducidad y condiciones de almacenamiento de preparaciones farmacéuticas. El uso de soluciones en la administración de insulina expone la molécula a una combinación de factores, por ejemplo, temperaturas elevadas, interfases variables aéreas-líquidassólidas al igual que fuerzas cortantes, que pueden suponer cambios irreversibles en la conformación, por ejemplo, fibrilación. Esto es particularmente relevante para soluciones de insulina en bombas de infusión, bien se lleven externamente o estén implantadas, que exponen la molécula a una combinación de estos factores al igual que las fuerzas cortantes del movimiento de la bomba durante períodos extendidos de tiempo. Por consiguiente, la fibrilación es especialmente preocupante cuando se usan bombas de infusión como sistema de administración de insulina. Por otra parte, múltiples factores influyen en la solubilidad de la insulina y muestra una clara reducción en el rango de pH de 4.2 a 6.6. La zona de precipitación de pH impone generalmente limitaciones para la formulación, pero también ha sido usado deliberadamente en el desarrollo y formulación de análogos determinados.
[0006] Así, las propiedades de estabilidad y solubilidad de la insulina son aspectos importantes y esenciales para la terapia corriente de insulina. La presente invención se dirige a estos problemas proporcionando análogos de insulina monocatenaria estables por introducción de un péptido C entre la cadena B y A para reducir la flexibilidad molecular y reducir concomitantemente la propensión a la fibrilación y limitar o modificar la zona de precipitación de pH.
[0007] Se muestran las insulinas monocatenarias con actividad insulínica en la EP 1,193,272. Estas insulinas monocatenarias tienen un péptido C modificado de 5-18 aminoácidos y se informa que tienen hasta un 42% de actividad insulínica. El documento EP 1,193,272 muestra los siguientes péptidos C modificados que conectan B30 con A21: Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEC ID NO:1), Arg-Arg-Gly-Pro-Gly- Gly-Gly(SEC ID NO:2), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEC ID NO:3), Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEC ID NO:4), Gly-Gly-Ala- Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEC ID NO:5), Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEC ID NO:6), Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val- Lys-Arg(SEC ID NO:7), Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEC ID NO:8), Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEC ID NO:9), y Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEC ID NO:10). El documento EP 741,188 muestra insulinas monocatenarias con un péptido C modificado que tiene 10-14 residuos de aminoácido y una actividad insulínica de un 14 a 34% y con los siguientes péptidos conectores Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg(SEC ID NO:11) y Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser- Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr(SEC ID NO:12). El documento WO 95/16708 muestra insulinas monocatenarias con un péptido conector de 1-15 residuos de aminoácido y sin Lys o Arg como el residuo de aminoácido C-terminal en el péptido conector. El documento WO 95/16708 muestra las siguientes secuencias de péptido C Gly- Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr(SEC ID NO:13) y Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Ala-Ala
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Ala-Pro-Gln-Thr(SEC ID NO:14). Se dice que estas insulinas monocatenarias tienen actividad insulínica, pero también una afinidad bastante alta al receptor de IGF-1.
[0008] Es el objetivo de la presente invención proporcionar insulinas monocatenarias que tienen propiedades mejoradas frente a los compuestos conocidos con respecto tanto a la actividad insulínica, estabilidad física y solubilidad, como a la farmacocinética, por ejemplo, un perfil de acción prolongado o rápido. Otro objetivo de esta invención es proporcionar un método para fabricar las insulinas monocatenarias y composiciones farmacéuticas que contengan tales compuestos.
[0009] La presente invención se refiere a la insulina monocatenaria para el tratamiento de la diabetes de tipo 1 y la diabetes de tipo 2 con la fórmula
B(1-26) -X1 - X2 -X3 - X4 – A (1-21)
donde X1 es Thr, Lys o Arg, X2 es Pro, Lys o Asp, X3 es Lys, Pro o Glu, X4 es una secuencia peptídica con la
siguiente fórmula X -X-X -X -X -X X (SEC ID NO:129) donde
ab cdefg
X es seleccionada del grupo que consiste en L, R, T, A, H, Q, G, S y V;
a
Xb es seleccionado del grupo que consiste en W, G, S, A, H, R, y T;
X es seleccionado del grupo que consiste en L, Y, M, H, R, T, Q, K, V, S, A, G y P;
c
Xd es seleccionado del grupo que consiste en R, A, Y, M, S, N, H, y G;
X es seleccionado del grupo que consiste en S, R, A, T, K, P, N, M, H, Q, V, y G;
e
Xf es seleccionado del grupo que consiste en G y A; y Xg es seleccionado del grupo que consiste en K, R, P, H, F, T, I, Q, W, y A, B(1-26) es una cadena peptídica que consiste en los primeros 26 residuos de aminoácido de la cadena B de insulina
humana contadas desde el extremo N-terminal de la cadena B o un análogo de la cadena B con una adición o eliminación de uno de los residuos de aminoácido en la cadena B o derivado de la cadena B modificada químicamente mediante la introducción de un grupo en la cadena lateral en una o más posiciones de la cadena B o por oxidación o reducción de las cadenas laterales de los residuos de aminoácido en la cadena B, y A(1-21) es la cadena de insulina natural o un derivado análogo con una adición o una eliminación de uno de los residuos de aminoácido en la cadena A o derivado de la cadena A modificada químicamente mediante la introducción de un grupo en la cadena lateral en una o más posiciones de la cadena A o por oxidación o reducción de las cadenas laterales de los residuos de aminoácido en la cadena A, donde X4 no contiene dos residuos de aminoácido
adyacentes básicos y donde la insulina monocatenaria tiene una afinidad por el receptor de insulina humana de al menos aproximadamente un 20% de la de la insulina humana si la molécula de insulina monocatenaria no está modificada químicamente mediante acilación.
[0010] También se muestra que la insulina monocatenaria se puede acilar en al menos un grupo de lisina en la molécula de insulina monocatenaria. En una parte de la divulgación el B29Lys está acilada. Más adelante en esa divulgación se acila una lisina insertada en la molécula de insulina monocatenaria o se acila el residuo de aminoácido N-terminal B1.
[0011] En otra parte se acila la insulina monocatenaria con un ácido graso de 6 a 24 C, 6-20, 6-18 o 6-14 átomos-C.
[0012] En otro aspecto la presente divulgación se refiere a una insulina monocatenaria siendo soluble en pH neutro y con un pl debajo aproximadamente de 6.5.
[0013] En aún otra parte de la presente divulgación la insulina monocatenaria tiene un pl de aproximadamente de 4.5 hasta aproximadamente debajo de 6.5.
[0014] En otra parte la presente divulgación se refiere a una insulina monocatenaria donde al menos un residuo de lisina ha sido modificada por acilación.
[0015] En otro aspecto de la presente divulgación la insulina monocatenaria contiene al menos un aminoácido adicional básico en la cadena A o B en comparación con las cadenas A y B de naturales humanas. El residuo de aminoácido básico es preferiblemente introducido sustituyendo uno de los residuos de aminoácido natural en el extremo C-terminal de la cadena B o en el extremo N-terminal de la cadena A y en una realización de la presente divulgación el residuo en posición B27 se sustituyó por un Arg.
[0016] En otro aspecto de la presente divulgación la insulina monocatenaria tendrá un residuo de aminoácido en posición A21 de la cadena A que es diferente del residuo de aminoácido natural Asn. Así, Asn en la posición A21 se
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puede sustituir por cualquier otro residuo de aminoácido codificable excepto Cys. En una parte el residuo de aminoácido en posición A21 puede ser seleccionado del grupo que consiste en Ala, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular Gly, Ala, Ser, y Thr. En una otra parte A21 es Gly.
[0017] En otra parte el péptido conector tiene un Gly en el péptido conector en la penúltima posición al primer residuo de aminoácido (A1) en la cadena A.
[0018] En otra forma de realización el péptido conector comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en AGRGSGK (SEC ID NO:15); AGLGSGK (SEC ID NO:33); AGMGSGK (SEC ID NO:45); ASWGSGK (SEC ID NO:48); TGLGSGQ (SEC ID NO:22); TGLGRGK (SEC ID NO:23); TGLGSGK (SEC ID NO:21); HGLYSGK (SEC ID NO:50); KGLGSGQ (SEC ID NO:51); VGLMSGK (SEC ID NO:56); VGLSSGQ (SEC ID NO:27); VGLYSGK (SEC ID NO:28), VGLSSGK (SEC ID NO:30); VGMSSGK (SEC ID NO:65); VWSSSGK (SEC ID NO:76), VGSSSGK (SEC ID NO:16) y VGMSSGK (SEC ID NO:106)
[0019] En un aspecto X1 es Thr, X2 es Pro, y X3 es Lys.
[0020] En una parte uno de los residuos de aminoácido natural en la posición B1, B3; B10; B22; B27; B28; B29, A8; A15; A18, y A21 se sustituye por otro residuo de aminoácido.
[0021] En otra parte la insulina monocatenaria es un análogo de insulina desB1, desB25, desB27, desB28 o desB29.
[0022] La presente divulgación está relacionada con secuencias polinucleótidas que codifican para las insulinas monocatenarias reivindicadas. En otro aspecto la presente invención se refiere a vectores que contienen tales secuencias polinucleótidas y células huésped que contienen tales secuencias polinucleótidas o vectores.
[0023] En otro aspecto, la divulgación se refiere a un proceso para producir las insulinas monocatenarias en una célula huésped, comprendiendo dicho método (i) el cultivo de una célula huésped que comprende una secuencia polinucleótida que codifica las insulinas monocatenarias bajo condiciones adecuadas para la expresión de dichas insulinas monocatenarias; y (II) el aislamiento de las insulinas monocatenarias del medio de cultivo.
[0024] En una forma de realización de la presente divulgación la célula huésped es una célula huésped de levadura y en otra parte más la célula huésped de levadura se selecciona del género Saccharomyces. En otra parte más la célula huésped de levadura se selecciona de las especie Saccharomyces cerevisiae.
[0025] En otra forma de realización la divulgación se refiere a un método donde al menos un residuo de lisina en la molécula de insulina monocatenaria es acilado.
[0026] En otra forma de realización la presente invención se refiere al uso de una insulina monocatenaria como un producto farmacéutico para el tratamiento de la diabetes.
[0027] En otro aspecto más la presente invención se refiere a preparaciones farmacéuticas que comprenden la insulina monocatenaria de la invención y adyuvantes y aditivos adecuados tales como uno o más agentes adecuados para la estabilización, conservación o isotonización, por ejemplo, iones de zinc, fenol, cresol, un parabeno, cloruro sódico, glicerol o manitol. El contenido de zinc de las presentes formulaciones puede ser aproximadamente de entre 0 y 6 átomos de zinc por hexámero de insulina. El pH de la preparación farmacéutica puede estar aproximadamente entre 4 y 8.5, aproximadamente entre 4 y 5 o aproximadamente entre 6.5 y 7.5.
[0028] En otro aspecto más la presente divulgación se refiere a preparaciones farmacéuticas que comprenden la insulina monocatenaria y al menos otro producto farmacéutico tal como análogos de insulina de acción prolongada o de acción rápida, y GLP-1, GLP 2 y exendina y análogos y derivados de las mismas. Las insulinas monocatenarias según la presente invención también pueden ser usadas en tratamiento combinado junto con análogos de insulina de acción prolongada o de acción rápida, y GLP-1, GLP-2 y exendina y análogos y derivados de las mismas o un antidiabético oral tal como un tiazolidindiona, metformina y otras preparaciones farmacéuticas para diabetes de tipo 2 para tratamiento oral.
[0029] En otro aspecto la presente invención se refiere al uso de la insulina monocatenaria para la preparación de una preparación farmacéutica para la reducción de nivel de glucosa en sangre en mamíferos, en particular para el tratamiento de la diabetes.
[0030] En otra forma de realización la presente invención se refiere a un método de reducción del nivel de glucosa en sangre en mamíferos mediante la administración de una dosis terapéuticamente activa de una insulina monocatenaria según la invención a un paciente en necesidad de tal tratamiento.
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[0031]
Fig. 1 muestra la reducción de glucosa en sangre en ratas Wistar normales mediante una insulina monocatenaria según la presente invención en comparación con el efecto de la insulina humana. HI es insulina humana y SCI es insulina monocatenaria,
Fig. 2 muestra la desaparición de una insulina monocatenaria después de la administración subcutánea en un cerdo y
Fig. 3 muestra la desaparición de otra insulina monocatenaria después de la administración subcutánea en un cerdo.
[0032] Las insulinas monocatenarias según la presente invención tendrán actividad biológica de insulina. Además tendrán una afinidad por el receptor de insulina de al mínimo 20% de esta de insulina humana si la molécula de insulina monocatenaria no está químicamente modificada por acilación. Además, tendrán una afinidad receptora IGF-1 similar o inferior a la de la insulina humana. Las insulinas monocatenarias que no están modificadas químicamente por acilación tendrán una afinidad por el receptor de insulina de al menos un 20 por ciento de la de la insulina humana. Las insulinas monocatenarias según la presente invención también se caracterizan por tener una alta estabilidad física.
[0033] Las insulinas monocatenarias con una carga positiva adicional en comparación con la insulina humana y un pl aproximadamente debajo de 6.5 será soluble en pH neutro y tendrán un perfil de acción como insulina humana pero tendrán una estabilidad física mejorada. Si la carga positiva adicional en comparación con la insulina humana se introduce en la molécula de insulina, el pl se moverá en sentido ascendente con una para cada carga positiva adicional. Teniendo dos cargas adicionales positivas en comparación con la insulina humana la insulina monocatenaria adquirirá un perfil prolongado. La insulina monocatenaria también puede hacerse prolongada mediante la introducción de un grupo de acilo en uno o más residuos Lys o en el residuo de aminoácido N-terminal B1. Las insulinas aciladas monocatenarias serán solubles en pH neutro y pueden además ser mezclables con insulinas bicatenarias de acción rápida tal como NovoRapid. Las insulinas monocatenarias pueden ser selectivamente aciladas en eq. B29. Alternativamente uno o más de los residuos naturales de aminoácido en el extremo C-terminal de la cadena B, en la secuencia peptídica conectora o en el extremo N-terminal de la cadena A se puede sustituir con un residuo de Lys que luego a su vez pueden ser acilados de una manera bien conocida como descrita en patente US No.6500645
[0034] Las insulinas monocatenarias de la invención que tienen estabilidad mejorada pueden también ser mezcladas con insulinas solubles de acción prolongada descritas en las patentes US n°. 6500645 y 5,750,497. La combinación resultante retiene un perfil farmacocinético bifásico. Además las insulinas monocatenarias pueden mostrar sustituciones de aminoácido en posición B10 y/o B28 disminuyendo la auto asociación de insulina.
[0035] La insulina monocatenaria se puede acilar con un grupo acilo que puede ser un ácido carboxílico lineal o ramificado teniendo al menos 2 átomos de carbono y siendo saturados o insaturados.
[0036] Ejemplos de ácidos grasos son el ácido cáprico, ácido láurico, ácido tetradecanoico (ácido mirístico), ácido pentadecanoico, ácido palmítico, heptadecanoic ácido, ácido esteárico, ácido dodecanoico, ácido tridecanoico, y ácido tetradecanoico.
[0037] El grupo acilo puede también ser un sustituyente lipofílico seleccionado del grupo que comprende CH3 (CH2 )n CO-, donde n es 4 a 24, tales como CH(CH)CO-, CH(CH)CO-, CH(CH)CO-, CH(CH)CO-, CH(CH)CO
, CH(CH)CO-, CH(CH)CO-, CH(CH)CO- y CH(CH)CO-.
[0038] En una forma de realización de la divulgación el grupo acilo es una cadena linear o ramificada de ácido dicarboxílico alcano a, w. En otra forma de realización de la invención el grupo acilo tiene la fórmula HOOC(CH2)t CO- donde t es un número entero de 2 a 24.
[0039] En otra forma de realización de la descripción el grupo acilo es seleccionado del grupo que comprende HOOC(CH)CO-, donde m es 2 a 24, tales como HOOC(CH)CO-, HOOC(CH)CO-, HOOC(CH)CO-,
2m214216218
HOOC(CH)CO- y HOOC(CH)CO-.
[0040] El grupo acilo se puede unir a la insulina monocatenaria por una molécula separadora, por ejemplo un residuo
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de aminoácido adecuado. El separador y el grupo acilo puede así tener la fórmula CH3(CH2)nCONH-CH(COOH)(CH)CO-, donde n es un número entero de 4-24, 10-24 o 8-24 y p es un número entero de 1-3. En otra forma de
2p
realización el separador y el grupo acilo tienen la fórmula HOOC(CH)CONH-CH(COOH)-(CH)CO-, donde n es
32n2p
un número entero de 4-24 y p es un número entero de 1-3. En otra forma de realización la combinación del separador y el grupo acilo tiene la fórmula CH(CH)CONH-CH(CH)(COOH)CO- donde n es un número entero de
32n2p
4-24 y p es un número entero de 1-3 o HOOC(CH)CONH-CH((CH)COOH)CO-, donde n es un número entero de
2n2p
4-24 y p es un número entero de 1-3.
[0041] Finalmente, el grupo acilo puede ser un ácido litocólico como litocoloil o coloil.
[0042] Si la insulina monocatenaria se acila en otra posición distinta a B29 entonces el residuo natural de lisina en B29 se sustituye con otro residuo de aminoácido por ejemplo Arg y Ala.
[0043] La acilación de las insulinas monocatenarias según la presente invención puede ser hecha mediante métodos análogos a los métodos descritos en las patentes US Nos. 5,750,497 y 5,905,140.
[0044] Las insulinas monocatenarias se producen expresando una secuencia de ADN que codifica la insulina monocatenaria en cuestión en una célula huésped adecuada mediante una técnica conocida como la descrita por ejemplo en la patente US N°. 6500645. La insulina monocatenaria se expresa bien directamente o como una molécula precursora que tiene una extensión N-terminal en la cadena B. Esta extensión N-terminal puede tener la función de aumentar el rendimiento del producto directamente expresado y puede ser de hasta 15 residuos de aminoácidos de longitud. La extensión N-terminal será dividida in vitro después de su aislamiento del caldo de cultivo y por lo tanto tendrá un sitio de escisión junto a B1. Las extensiones N-terminal del tipo adecuado en la presente invención son divulgadas en la patente US n°. 5,395,922, y en la patente europea n°. 765,395A.
[0045] La secuencia polinucleótida que codifica la insulina monocatenaria de la invención puede ser preparada sintéticamente mediante métodos estándar establecidos, por ejemplo el método de fosforamidita descrito por Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869, o el método descrito por Matthes et al. (1984) EMBO Journal 3:801-805. Según el método de fosfoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, purificados, duplicados y ligados para formar el constructo de ADN sintético. Una forma de preparación del constructo de ADN habitualmente preferida es por reacción en cadena de polimerasa (PCR).
[0046] Las secuencia de polinucleótidos puede también ser de origen genómico mezclado, de ADNc y sintético. Por ejemplo, una secuencia genómica o de ADNc que codifica un péptido líder puede ser unida a una secuencia genómica o de ADNc que codifica las cadenas A y B, después del cual la secuencia de ADN puede ser modificada en un sitio insertando oligonucleótidos sintéticos que codifican la secuencia de aminoácidos deseada para una recombinación homóloga conforme a procedimientos bien conocidos o preferiblemente generando la secuencia deseada por PCR usando los oligonucleótidos adecuados.
[0047] En otro aspecto la descripción se refiere a un vector que es capaz de replicación en el microorganismo seleccionado o célula huésped y que lleva una secuencia polinucleótida que codifica la insulina monocatenaria de la invención. El vector recombinante puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un mini-cromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, cuando introducido en la célula huésped, es integrado en el genoma y replicado con el (los) cromosoma(s) donde ha sido integrado. Además, un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total para ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón pueden ser utilizados. El vector puede ser de plásmidos lineales o circulares cerrados y preferiblemente contener un(os) elemento(s) que permite(n) la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
[0048] En una parte, el vector de expresión recombinante es capaz de replicarse en levadura. Ejemplos de secuencias que permiten que el vector se replique en levadura son el plásmido de levadura son los genes de replicación REP 1-3 del plásmido de levadura de 2 Im y el origen de la replicación.
[0049] Los vectores de la presente divulgación puede contener uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares. Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tal como resistencia a la ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Marcadores seleccionables para uso en una célula huésped filamentosa fúngica incluyen amdS (acetamidasa), argB (transferasa de carbamoil de ornitina), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa) y trpC (sintasa de antranilato). Marcadores adecuados para células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3.
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Un marcador seleccionable muy adecuado para levadura es el gen TPI de Schizosacaromyces pompe (Russell (1985) Gene 40:125-130).
[0050] En el vector, la secuencia polinucleótida es operativamente conectada a una secuencia adecuada del promotor. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucléicos que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y se pueden obtener de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o bien heterólogos a la célula huésped.
[0051] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenido del operón lac de E. coli, el gen de agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, el gen de levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, el gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, el gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, el gen de alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amylo-liquefaciens, y el gen de penicilinasa (penP) de Bacillus licheniformis. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción en una célula huésped fúngica filamentosa son los promotores obtenidos de los genes para la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, y la alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger. En un huésped de levadura, promotores útiles son los promotores Ma1, TPI, ADH o PGK de Saccharomyces cerevisiae.
[0052] El constructo polinucleótido de la divulgación también será normalmente conectado operativamente a un terminador adecuado. En la levadura un terminador adecuado es el terminador TPI (Alber et al. (1982) J.Mol. Appl. Genet. 1:419-434).
[0053] Los procedimientos usados para enlazar la secuencia polinucleótida de la invención, el promotor y el terminador, respectivamente, y para insertarlos en un vector adecuado conteniendo la información necesaria para la replicación en el huésped seleccionado, son conocidos por expertos en la técnica. Se entiende que el vector puede ser construido bien por la preparación primero de un constructo de ADN que contiene la secuencia entera de ADN que codifica las insulinas monocatenarias de la invención, y posteriormente la inserción de este fragmento en un vector de expresión adecuado, o la inserción consecutiva de fragmentos de ADN que contienen información genética para los elementos individuales (tal como la señal, propéptido, péptido conector, cadenas A y B) seguidas de ligamiento.
[0054] La presente divulgación también se refiere a células huéspedes recombinantes, que comprenden una secuencia polinucleótida que codifica las insulinas monocatenarias de la invención. Un vector que comprende tal secuencia polinucleótida se introduce en la célula huésped de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracomosómico que se duplica como se ha descrito antes. El término "célula huésped" comprende cualquier descendiente de una célula madre que no es idéntico a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, una procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, una eucariota. Las células unicelulares útiles son células bacterianas tal como bacterias gram positivas incluyendo, pero no limitadas a, una célula de Bacillus, una célula de Streptomyces, o bacterias gram negativas tal como E. coli y Pseudomonas sp. Las células eucariotas pueden ser células de mamífero, insecto, planta, o fúngicas. En una forma de realización preferida, la célula huésped es una célula de levadura. El organismo de levadura usado en el proceso de la divulgación puede ser cualquier organismo de levadura adecuado que, en cultivo, produce cantidades grandes insulina monocatenaria de la invención. Ejemplos de organismos de levadura adecuados son cepas seleccionadas de la especie de levadura Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosacaromyces pombe, Sacchoromices uvarum, Kluyveromices lactis, Hansenula polimorfa, Pichia pastoris, Pichia metanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida, sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp., y Geotrichum fermentans.
[0055] La transformación de las células de levadura puede por ejemplo ser efectuada por formación de protoplasto seguido de una transformación de una manera conocida per se. El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el cultivo de organismos de levadura. El precursor de insulina segregado de la divulgación, del cual una proporción significante estará presente en el medio en forma correctamente procesada, puede ser recuperado del medio por procedimientos convencionales incluyendo separación de las células de levadura mediante centrifugado, filtración o atrapando el precursor de insulina por una matriz de intercambio iónico o por una matriz de absorción de fase inversa, precipitación de los componentes proteínicos del sobrenadante o filtrados mediante una sal, por ejemplo, sulfato de amonio, seguido de purificación por una variedad de procedimientos cromatográficos, por ejemplo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similar.
[0056] Las composiciones que contienen monoinsulinas de esta invención se pueden usar en el tratamiento de estados que son sensibles a la insulina. Así, pueden ser usados en el tratamiento de la diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 e hiperglucemia, por ejemplo como a veces se ha visto en personas con heridas graves y personas que se han sometido a cirugía mayor. El nivel óptimo de dosis para cualquier paciente dependerá de una variedad de
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factores que incluyen la eficacia del derivado específico de insulina empleado, la edad, masa corporal, actividad física, y dieta del paciente, de una posible combinación con otros fármacos, y en la gravedad del estado a ser tratado. Se recomienda que la dosificación diaria del derivado de insulina de esta invención sea determinada para cada paciente individual por expertos en la técnica de una manera similar en cuanto a composiciones de insulina conocidas.
[0057] Normalmente, las preparaciones farmacéuticas de esta invención se administran subcutáneamente. Sin embargo, las insulinas monocatenarias de la invención también pueden ser usadas en bombas de insulina y se pueden formular para administración pulmonar.
[0058] Se espera que las insulinas monocatenarias según la presente invención con al menos un residuo de aminoácido básico en la conexión de secuencia de péptidos B30 o B29 con A1 tengan una actividad de insulina de efecto prolongado. Debido a la carga positiva adicional el punto isoeléctrico será aumentado en comparación con insulina humana y el pH de la fórmula farmacéutica puede por lo tanto preferiblemente estar por debajo del pH neutro por ejemplo debajo aproximadamente de 6. Cuando se inyectan tales preparaciones de insulina monocatenarias éstas se precipitan a los sitios de inyección donde existe pH neutro y luego lentamente se disuelven y se liberan del sitio de inyección. La liberación lenta del sitio de inyección llevará a una acción extendida que puede ser requerido para ciertas aplicaciones. Las preparaciones farmacéuticas de las insulinas monocatenarias reivindicadas contendrán adyuvantes y aditivos usuales y preferiblemente son formulados como una solución acuosa. El medio acuoso se hace isotónico, por ejemplo, con cloruro sódico, acetato sódico o glicerol. Además, el medio acuoso puede contener iones de zinc, tampones y conservantes. El valor de pH de la composición se ajusta al valor deseado y puede estar entre aproximadamente 4 y 8.5, preferiblemente entre 7 y 7.5 dependiendo del punto isoeléctrico, pl, de la insulina monocatenaria en cuestión.
[0059] Por consiguiente, esta invención también se refiere a una composición farmacéutica con una insulina monocatenaria de la invención y opcionalmente uno o más agentes adecuados para la estabilización, conservación
o isotonicidad, por ejemplo, iones de zinc, fenol, cresol, un parabeno, cloruro sódico, glicerol o manitol. El contenido de zinc de las presentes formulaciones puede estar aproximadamente entre 0 y 6 átomos de zinc por hexámero de insulina. Las insulinas monocatenarias también pueden ser formuladas con ligandos IFD como divulgado en WO 2003027081.
[0060] El tampón usado en la preparación farmacéutica según la presente invención puede ser seleccionado del grupo que consiste en acetato sódico, carbonato de sodio, citrato, glicil-glicina, histidina, glicina, lisina, arginina, fosfato dihidrógeno de sodio, fosfato hidrógeno de disodio, fosfato sódico, y tris(hidroximetil)aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas de las mismas. Cada uno de estos tampones específicos constituye una forma de realización alternativa de la invención.
[0061] El conservante farmacéuticamente aceptable puede ser seleccionado del grupo que consiste en fenol, ocresol, m-cresol, p-cresol, metil p-hidroxibenzoato, propil p-hidroxibenzoato, 2-fenoxietanol, butil p-hidroxibenzoato, 2- feniletanol, alcohol benzílico, clorobutanol, y tiomerosal, bronopol, ácido benzoico, imidurea, clorhexidina, deshidroacetato de sodio, clorocresol, etil p-hidroxibenzoato, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3pclorfenoxipropano-1,2-diol) o mezclas de las mismas. En otra forma de realización de la invención el conservante está presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el conservante está presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el conservante está presente en una concentración de 5 mg/ml a 10 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el conservante está presente en una concentración de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada uno de estos conservantes específicos constituyen una forma de realización alternativa de la invención. El uso de un conservante en composiciones farmacéuticas es bien conocido al experto en la materia. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
[0062] El agente de isotonicidad puede ser seleccionado del grupo que consiste en una sal (p. ej. cloruro sódico), un azúcar o alcohol de azúcar, un aminoácido (p. ej. L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), un alditol (p. ej. (glicerina) de glicerol, 1,2-propanodiol (propilenoglicol), 1,3-propanodiol, 1,3butanodiol) polietilenoglicol (p. ej. PEG400), o mezclas de las mismas. Cualquier azúcar tal como mono, di o polisacáridos, o glucanos solubles en agua, incluso por ejemplo fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, almidón de hidroxietilo y carboximetilcelulosa-Na puede ser utilizada. En una forma de realización el aditivo de azúcar es sacarosa. Un alcohol de azúcar se define como un hidrocarburo C4-C8 con al menos un grupo --OH e incluye, por ejemplo, el manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol, y arabitol. En una forma de realización el aditivo de alcohol de azúcar es manitol. Los azúcares o polialcoholes mencionados arriba pueden ser utilizados individualmente o en combinación. No hay un límite fijo a la cantidad usada, puesto que el azúcar o alcohol de azúcar es soluble en la preparación líquida y no afecta adversamente los efectos estabilizantes conseguidos usando los métodos de la invención. En una forma de realización, la concentración de azúcar o de azúcar alcohólica está aproximadamente entre 1 mg/ml y 150 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el agente isotónico está presente en una concentración de 1 mg/ml a 50 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el agente isotónico está presente en una concentración de 1 mg/ml a 7 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el agente isotónico está
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presente en una concentración de 8 mg/ml a 24 mg/ml. En otra forma de realización de la invención el agente isotónico está presente en una concentración de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada uno de estos agentes isotónicos específicos constituye una forma de realización alternativa de la invención. El uso de un agente isotónico en composiciones farmacéuticas es bien conocido al experto en la materia. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, 1995.
[0063] Las insulinas monocatenarias de esta invención también pueden ser mezcladas con otras insulinas monocatenarias, insulina humana o análogos de insulina humana o derivados con una actividad de insulina de acción rápida o prolongado para preparar composiciones de insulina que consisten en una mezcla de insulina de acción rápida y de efecto prolongado. Ejemplos de tales análogos de insulina son descritos por ejemplo en las solicitudes de patente europea con la publicación Nos. EP 214826, EP 375437 y EP 383472.
[0064] Las insulinas monocatenarias según la presente invención también pueden ser mezcladas con otros compuestos farmacéuticamente activos tales como GLP-1, GLP-2 y exendina o análogos o derivados de la misma. Las insulinas monocatenarias según la presente invención también pueden ser usadas en tratamiento combinatorio junto con un antidiabético oral tal como un tiazolidindiona, metformina y otra preparación farmacéutica para tratamiento oral de la diabetes de tipo 2.
[0065] Por una insulina monocatenaria se entiende una secuencia polipeptídica de la estructura general B-C-A donde B es la cadena B de insulina humana o un análogo o derivado de la misma, A es la cadena A de insulina humana o un análogo o derivado y C es una cadena de péptidos de 5-11 residuos de aminoácidos que conectan el residuo de aminoácido C- terminal en la cadena B (normalmente B30) con A1. Si la cadena B es una cadena desB30 el péptido conector conectará B29 con A1. La insulina monocatenaria puede ser derivatizada siendo acilado en un residuo de Lys. La insulina monocatenaria contendrá puentes de disulfuro correctamente situados (tres) como en la insulina humana, esto es entre CysA7 y CysB7 y entre CysA20 y CysB19 y un puente disulfuro interno entre CysA6 y CysA11.
[0066] Los análogos las cadenas B y A de las cadenas B y A de insulina humana son unas cadenas B y A con una mutación, eliminación y/o adiciones de las cadenas de aminoácidos A y/o B en relación a aquel de la molécula de insulina humana. En una forma de realización, la presente invención comprende moléculas análogas con una o más de la posiciones B1, B3; B10; B22; B27; B28; B29, A8; A15 o A22 relativas a la molécula de insulina natural humana como explicada en detalles adicionales más adelante.
[0067] Por desB30 o B(1-29) se entiende una cadena B de insulina natural o un análogo del mismo que carece del residuo de aminoácido B30, B(1-26) es una cadena peptídica que consiste en los primeros 26 residuos de aminoácido de la cadena B de insulina humana contadas desde el extremo N-terminal de la cadena B o un análogo
- o derivados de las mismas. A(1-21) significa la cadena A de insulina natural o un análogo o derivada de la misma y A(1-20) significa los primeros 20 residuos naturales de aminoácido de la cadena A de insulina humana o un análogo
- o derivada de la misma. Los residuos de aminoácidos se indican en el código de aminoácido de tres letras o el código de aminoácido de una letra.
[0068] Con B1, A1 etc. se entiende el residuo de aminoácido en la posición 1 en la cadena B de insulina (contado desde el extremo N- terminal) y el residuo de aminoácido en la posición 1 en la cadena A de insulina (contado desde el extremo N-terminal), respectivamente.
[0069] Por análogo de insulina tal y como se utiliza en este caso se entiende un polipéptido con una estructura molecular que formalmente se puede derivar de la estructura de la insulina humana. La insulina de otros animales así pues se vuelve análoga de la insulina humana. La estructura de un análogo se puede derivar por ejemplo por eliminación y/o substitución al menos un residuo de aminoácido que ocurre en la insulina natural y/o añadiendo al menos un residuo de aminoácido. Los residuos de aminoácidos sustituidos y/o añadidos pueden ser bien unos residuos de aminoácidos codificables, definido como una mutación, u otros residuos de aminoácidos de origen natural, inclusivo aminoácidos D, o residuos de aminoácidos puramente sintéticos taesl como los aminoácidos Nmetilo, definidos como una sustitución. La estructura también puede derivar de una insulina ocurriendo naturalmente por inserción/sustitución de una fracción no-peptídica, por ejemplo un fragmento de retroinverso, o la incorporación de enlaces no-peptídicos tales como un enlace azapéptido (CO sustituido por NH) o enlace pseudo peptídico (p. ej. NH sustituido con CH2).
[0070] La mutación o sustitución de residuos de Asn mejora la estabilidad química de la insulina y las preparaciones farmacéuticas de las mismas. La incorporación de aminoácidos D e intercambio de enlaces de péptido naturales con enlaces no peptídicos pueden crear resistencia hacia enzimas proteolíticas.
[0071] Cuando ocurren residuos de Asp y Glu en la secuencia la cadena peptídica puede continuar mediante
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enlaces de iso-péptidos, es decir mediante los grupos carboxilo 1- o y- enlazados de las cadenas laterales, respectivamente.
[0072] Ejemplos de análogos de insulina son tales donde Pro en la posición 28 de la cadena B se pueden mutar con Asp, Lys, o Ile. En otra forma de realización Lys en la posición B29 se muta con Pro. Además B27 Thr se puede mutar con Lys, Arg o Glu. También, Asn en la posición A21 se puede mutar con Ala, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, en particular con Gly, Ala, Ser, o Thr y preferiblemente con Gly. Además, Asn en la posición B3 se puede mutar con Thr, Lys, Gln, Glu o Asp, y Asn en posición A18 se puede mutar con Gln. Más ejemplos de análogos de insulina son los análogos de eliminación des insulina (B1 Phe); análogos de insulina donde la cadena B tiene una extensión N-terminal y análogos de insulina donde la cadena A tiene una extensión C-terminal, por ejemplo un Lys.
[0073] Por derivado de insulina tal y como se usa en este caso se entiende una insulina de origen natural o un análogo de insulina que ha sido químicamente modificado in vitro, por ejemplo mediante introducción de un grupo en una cadena lateral en uno o más posiciones de la insulina, por ejemplo un grupo nitro en un residuo de tirosina, o yodo en un residuo de tirosina, o mediante conversión de un grupo carboxílico libre a un grupo éster o a un grupo amida, o por conversión de un grupo amino a una amida por acilación, o por acetilar un grupo hidroxilo que representa un éster, o por alquilación de una amina primaria que representa una amina secundaria. Otros derivados se obtienen por oxidación o reducción de las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos en la insulina.
[0074] Las insulinas monocatenarias se nombran según la siguiente regla: la secuencia comienza con la cadena B, continúa con el péptido C y termina con la cadena A. Los residuos de aminoácidos son nombrados después sus equivalentes respectivos en la insulina humana y las mutaciones y acilaciones son explícitamente descritos mientras que residuos de aminoácidos inalterados en las cadenas A y B no son mencionados. Por ejemplo, una insulina con las siguientes mutaciones en comparación con insulina humana A21G, B3Q, B29R, desB30 y el péptido C TGLGKGQ (SEC ID NO:19) que conecta la cadena B de C-terminal y la cadena A de N-terminal es nombrada insulina humana B(1-29)-B3Q-B29R-TGLGKGQ(SEC ID NO:19)-A(1-21)-A18Q-A21G.
[0075] Por grupo acilo se entiende el radical derivado de un ácido orgánico por eliminación del grupo hidróxilo, es decir el radical R- CO-, dónde R puede ser bien hidrógeno, un grupo alquilo o bien un grupo O-alquilo.
[0076] Por acilación se entiende la reacción química por la cual un hidrógeno de un grupo amino o grupo hidroxilo se intercambia por un grupo de acilo.
[0077] Por acilación selectiva o preferencial se entiende una acilación que ocurre en una posición deseada a un grado más alto, preferiblemente al menos a dos o tres grados más alto que en una posición no deseada. En una forma de realización de la presente invención la acilación preferiblemente sólo debería ocurrir en el grupo Eamino en el LisB29 o en un residuo de Lys insertado en otra posición o en el residuo de aminoácido N-terminal B1.
[0078] Por ácido activado se entiende un ácido carboxílico en el que un grupo de salida activado ha sido fijado al carbono de acilo permitiendo la reacción con un grupo amino bajo formación de un enlace amida y la liberación del grupo de salida. Acidos grasos activados pueden ser ésteres activado de ácidos grasos, amidas activadas de ácidos grasos y anhídridos o cloruros. Acidos grasos activados incluyen derivados de los mismos tal como ésteres con 1hidroxibenzotriazola y N-hidroxisuccinimida.
[0079] Por ácido graso o grupo acilo se entiende un ácido lineal o ramificado carboxílico que tiene al menos 2 átomos de carbono y siendo saturado o insaturado. En una forma de realización de la presente invención el grupo acilo es un ácido graso que tiene de 6 a 24 átomos C.
[0080] Cuando se acila una insulina, se da el punto de fijación y el nombre del grupo acilo y en la estructura/secuencia correspondiente y se expanden el residuo y grupo acilo en cuestión. Por ejemplo:
se asigna el nombre: insulina humana B(1-29)-B3Q-B29R-TGLGK((eps)miristoyl)GQ-A(1-21)-A18Q-A21G (SEC ID NO: 133).
[0081] Por insulina monocatenaria con actividad de insulina se entiende una insulina monocatenaria con la capacidad para reducir la glucosa en sangre de mamíferos tal y como se mide en un modelo de animal adecuado, que puede ser un modelo de rata, conejo, o de cerdo, tras la administración adecuada, por ejemplo por administración subcutánea o intravenosa.
[0082] pl es el pH en el que un péptido tiene una carga de red cero. El pl de un péptido se puede calcular mediante la siguiente fórmula:
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donde N es el número de incidencia.
[0083] Por soluble en pH neutro se entiende que una insulina monocatenaria de 0,6mM es soluble en pH neutro.
[0084] Por alta estabilidad física se entiende una tendencia a fibrilación que sea menor de un 50% de la de la insulina humana. La fibrilación puede ser descrita como el tiempo de lapso antes de que se inicie la formación de fibrilla a unas condiciones dadas.
[0085] Por fibrilación se entiende un proceso físico por el que las moléculas de insulina parcialmente desplegadas interactúan entre sí para formar agregados lineales.
[0086] Un polipéptido con receptor de insulina y afinidad por el receptor de IGF-1 es un polipéptido que es capaz de interactuar con un receptor de insulina y un humano receptor de IGF-1 en un ensayo de enlace adecuado. Tales ensayos receptores son bien conocidos en el campo y otros son descritos en los ejemplos. Las insulinas monocatenarias presentes no enlazarán con el receptor de IGF-1 o tendrán una afinidad más bien baja a dicho receptor. Con una mayor precisión las presentes insulinas monocatenarias tendrán una afinidad hacia el receptor de IGF-1 sustancialmente de la misma magnitud o menos que la de la insulina humana cuando medido como se describe en los ejemplos.
[0087] La afinidad de las presentes insulinas monocatenarias hacia el receptor de insulina se mide como descrito en los ejemplos y normalmente está entre un 20 y 200 por ciento de la de la insulina humana.
[0088] “POT" es el gen de triosa fosfato isomerasa de Schizosacaromyces pombe, y "TPI1" es el gen de triosa fosfato isomerasa de S. cerevisiae.
[0089] Por un "líder" se entiende una secuencia de aminoácidos que consiste en un prepéptido (el péptido señal) y un propéptido.
[0090] El término "péptido señal" se entiende que es un prepéptido que está presente como una secuencia Nterminal en la forma precursora de una proteína. La función del péptido señal es la de permitir que la proteína heteróloga facilite la translocación en el retículo endoplásmico. El péptido señal normalmente se corta en el curso de este proceso. El péptido señal puede ser heterólogo u homólogo al organismo de levadura que produce la proteína. Varios péptidos señal que pueden ser usados con el constructo de ADN de la invención incluyendo péptido señal de proteasa aspártica de levadura 3 (YAP3) o cualquier análogo funcional (Egel-Mitani et al. (1990) YEAST 6:127-137 y US 5,726,038) y la señal a-factor del gen MFa1 (Thorner (1981) en The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathern et al., eds., pp 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY y US 4,870,00).
[0091] El término "propéptido” significa una secuencia polipeptídica cuya función es la de permitir que el polipéptido expresado sea dirigido del retículo endoplásmico al aparato de Golgi y adicionalmente a una vesícula secretora para la secreción en el medio de cultivo (es decir, exportación del polipéptido a través de la pared celular o al menos a través de la membrana celular en el espacio periplásmico de la célula de levadura). El propéptido puede ser el propéptido a-factor de levadura, véase US 4,546,082 y 4,870,008. Alternativamente, el propéptido puede ser un propéptido sintético, es decir un propéptido no encontrado en la naturaleza. Propéptidos sintéticos adecuados son aquellos descritos en US 5,395,922, 5,795,746, 5,162,498 y WO 98/32867. El propéptido preferiblemente contendrá un sitio de procesamiento de endopeptidasa en el extremo C-terminal, tal como un secuencia de Lys-Arg o cualquier análogo funcional de la misma.
[0092] En el presente contexto las indicaciones de tres letras o de una sola letra de los aminoácidos han sido usados en sus significados convencionales como indicado a continuación. A menos que se indique explícitamente, los aminoácidos mencionado aquí son L-aminoácidos. Además, los extremos izquierda y derecha de la secuencia de aminoácidos de un péptido son, respectivamente los N- y C-terminales a menos que se especifique de otra manera.
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Abreviaturas para aminoácidos [0093]
- Aminoácido
- Código de tres letras Código de una letra
- Glicina Gly G Prolina Pro P Alanina Ala A Valina Val V Leucina Leu L Isoleucina Ile I Metionina Met M Cisteína Cys C Fenilalanina Phe F Tirosina Tyr Y Triptófano Trp W Histidina His H Lisina Lys K Arginina Arg R Glutamina Gln Q Asparigina Asn N Ácido Glutámico Glu E Ácido Aspártico Asp D Serina Ser S Treonina Thr T
[0094] Las siguientes abreviaturas han sido usadas en la especificación y los ejemplos:
Bzl = Bn: bencilo
10 DIEA: N,N-diisopropiletilamina DMF: N,N-dimetilformamida tBu: terc-butilo Glu: Acido glutámico TSTU: O-(N-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato
15 THF: tetrahidrofurano EtOAc: acetato de etilo DIPEA: diisopropiletilamina HOAt: 1-Hidroxi-7-azabenzotriazola NMP: N-metilpirrolidona-2
20 TEA: amina de trietilo Su: succinimidil= 2,5-dioxopirrolidin-1-yl TFA: ácido trifluoroacético DCM: diclorometano DMSO: sulfóxido de dimetilo
25 RT: temperatura ambiente
[0095] Se describe la presente invención con más detalle en los siguientes ejemplos que de ninguna manera pretenden limitar el ámbito de la invención como se reivindica.
Procedimientos Generales
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[0096] Todos plásmidos de expresión son del tipo C-POT, similares a aquellos descritos en EP 171, 142, que se caracterizan por el hecho de que contienen el gen de triosa fosfato isomerasa (POT) del Schizosaccharomyces pombe para la selección de plásmidos y estabilización en S. cerevisiae. Los plásmidos también contienen promotor y terminador de triosa de fosfata isomerasa de S. cerevisiae. Estas secuencias son similares a las secuencias correspondientes en el plásmido pKFN1003 (descritas en WO 90/100075) como son todas las secuencias excepto la secuencia del fragmento EcoRI-XbaI que codifica la proteína de fusión del líder y el producto de insulina. Para expresar diferentes proteínas de fusión, el fragmento EcoRI-XbaI de pKFN1003 es simplemente sustituido por un fragmento EcoRI-XbaI que codifica la fusión de insulina-líder de interés. Tales fragmentos EcoRI-XbaI pueden ser sintetizados usando oligonucleótidos sintéticos y PCR según técnicas estándar.
[0097] Los transformantes de levadura fueron preparados por transformación de la cepa huésped cepa de S.cerevisiae MT663 (MATalMATa pep4-3/pep4-3 HIS4/his4 tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir+). La cepa de levadura MT663 fue depositada en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares) en relación con la solicitud WO 92/11378 y se le dio el número de depósito DSM 6278.
[0098] MT663 fue cultivado en YPGaL (1% extracto de bacto-levadura, 2% Bacto-peptona, 2% galactosa, 1% lactato) para un O.D. a 600 nm de 0,6. 100 ml de cultivo fueron recogidos por centrifugado, lavado con 10 ml de agua, recentrifugado y resuspendido en 10 ml de una solución conteniendo 1,2 M sorbitol, 25 mM Na2 EDTA pH = 8,0 y 6,7 mg/ml ditiotreitol. La suspensión fue incubada a 30°C durante 15 minutos, centrifugado y las células resuspendidas en 10 ml de una solución conteniendo 1,2 M sorbitol, 10 mM Na2 EDTA, 0,1 M citrato sódico, pH 0 5,8 y 2 mg de Novozim®234. La suspensión fue incubada a 30°C durante 30 minutos, las células recogidas por centrifugado, lavado en 10 ml de 1.2 M sorbitol y 10 ml de CAS (1.2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HCl (Tris = Tris(hidroximetil)aminometano) pH = 7,5) y resuspendido en 2 ml de CAS. Para la transformación, se mezclaron 1 ml de células suspendidas de CAS con aprox. 0.1 mg de ADN plásmido y se dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió 1 ml de (20% glicol de polietileno 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HCl, pH = 7.5) y se dejó la
mezcla otros 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla fue centrifugada y el granulado resuspendido en 0,1 ml
de SOS (1,2 M sorbitol, 33% v/v YPD, 6.7 mM CaCl2) e incubado a 30°C durante 2 horas. La suspensión luego fue centrifugada y el granulado resuspendido en 0,5 ml de 1,2 M sorbitol. Luego se añadió 6 ml de agar blando (the SC medium of Sherman et al. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory) conteniendo 1,2 M sorbitol más 2,5% agar) a 52°C y la suspensión vertida encima de placas con el mismo medio conteniendo sorbitol solidificado con agar.
[0099] La cepa de S. cerevisiae MT663 transformada con plásmidos de expresión fue cultivada en YPD durante 72 h a 30°C.
Ejemplo 1
[0100] Varias insulinas monocatenarias fueron producidas como se describe anteriormente y aisladas del medio de
cultivo y purificadas para más pruebas.
Las insulinas monocatenarias fueron analizadas para determinar si tenían actividad biológica de insulina como
medida por afinidad de enlace al receptor de insulina humana en relación a la de la insulina humana como se
describe abajo.
[0101] Además, la afinidad por el IGF-1 fue analizada como se describe abajo.
Los resultados se muestran en la tabla 1 dónde IR es la unión al receptor de insulina humana en relación a la de la
insulina humana.
TABLA 1
- Insulina monocatenaria (PAK)
- Péptido conector Sustituciones de aminoácidos IR Unión del receptor de UGF-1 humano en relación a la insulina humana
- 1664
- TGSSRGK (SEC ID NO:36) 43%
- 1735
- VGRSSGK (SEC ID NO:31) [A21G] 143%
- 1754
- AGRGSGP (SEQ ID 53%
ES 2 369 895 T3
- 1767
- AGRGSGP (SEC ID NO:18) [A18Q_A21G] 28%
- 1801
- AGRGSGK (SEC ID NO:15) 129%
- 1817
- AGRGSGK (SEC ID NO:15) [A21G] 63%
- 1800
- AGRGSGK (SEC ID NO:15) [A18Q_A21G] 175%
- 1805
- AGRGSGK (SEC ID NO:15) [B3Q_A18Q_A21G] 83%
- 1808
- AGRGSGK (SEC ID NO:15) [B1G_B3Q_A18Q_A 21G] 86%
- 1786001
- AGLGDGK (SEC ID NO: 37) 50%
- 1786017
- AGLGVGK (SEC ID NO:38) 47%
- 1786026
- AGLGMGK (SEC ID NO:39) 35%
- 1786030
- AGLGSGK (SEC ID NO:33) 197%
- 1786036
- AGLGYGK (SEC ID NO:40) 35%
- 1786044
- AGLGQGK (SEC ID NO:41) 22%
- 1786046
- AGLGGGK (SEC ID NO:42) 68%
- 1786053
- AGLGRGK (SEC ID NO:43) 54%
- 1764
- AGLGSGK (SEC ID NO:33) [A18Q_A21G] 120%
- 1816
- AGLGSGQ (SEC ID NO:44) [B3Q_A18Q] 37%
- 1757
- AGLGSGK (SEC ID NO:24) 116%
- 1755
- AGMGSGK (SEC ID NO:45) 137%
- 1762
- AGMGSGP (SEC ID NO:25) [A18Q_A21G] 20%
- 1672
- AGSSSGK (SEC ID NO:46) 31%
- 1784
- WASGSGK (SEC ID NO:47) [A18a_A21G] 23%
- 1785
- ASWGSGK (SEC ID NO:48) [A18a_A21G] 136%
- 1796
- AWSGSGK (SEC ID NO:49) [A18Q_A21G] 102%
- 1781
- TGLGSGQ (SEC ID NO:22) 122%
- 1782
- TGLGSGK (SEC ID NO:21) 130%
ES 2 369 895 T3
- 1783
- TGLGRGK (SEC ID NO:23) 86%
- 1810
- TGLGSGQ (SEC ID NO:22) [A18a_A21G] 73%
- 1811
- TGLGSGK (SEC ID NO:21) [A18Q_A21G] 136%
- 1812
- TGLGRGK (SEC ID NO:23) [A18Q_A21G] 118%
- 1820
- TGLGKGQ (SEC ID NO:19) [B3Q_B29R_A18Q_ A21G] 55%
- 1821
- TGLGSGK (SEC ID NO:21) [B3Q_B29R_A18Q_ A21G] 128%
- 1835
- TGLGKGQ (SEC ID NO:19) [B29E_A18Q] 50%
- 1837
- TGLGKGQ (SEC ID NO:19) [B29A_A18Q] 71%
- 1838
- TGLGKGR (SEC ID NO:19) [B29R_A18Q] 113%
- 1845
- TGLGKGQ (SEC ID NO:19) [B27E_B29A_A18Q] 20%
- 1846
- TGLGKGR (SEC ID NO:20) [B29A_A18Q] 92%
- 1847
- TGLGKGR (SEQ ID [B27E_B29A_A18Q] NO: 20 82%
- 1848
- TGLGKGR (SEC ID NO:20) [B27E_B29E_A18Q] 40%
- 1849
- TGLGKGR (SEC ID NO:20) [B29E_A18Q] 60%
- 1850
- TGLGSGQ (SEC ID NO:22) [B10R] 31%
- 1864
- TGLGSGK (SEC ID NO:21) [B3K_A18Q_A21G] 301%
- 1877
- TGLGSGK (SEC ID NO:21) [B28D_A18Q] 140%
- 1881
- TGLGSGK (SEC ID NO:21) [A18K_A21 G]
- 1891
- TGLGSGQ (SEC ID NO:22) [B10A_A18Q] 34%
- 1892
- TGLGSGQ (SEC ID NO:22) [desB1_B3Q_B10A_ A18Q] 38%
- 1893
- TGLGSGQ (SEC ID NO:22) [B10Q_A18Q] 51%
- 1894
- TGLGSGQ (SEC ID NO:22) [desB1_B3Q_B10Q-A18Q] 38%
- 1791
- HGLYSGK (SEC ID NO:50) [A18Q_A21G] 226%
- 1818
- KGLGSGQ (SEC ID NO:51) [B3Q_B29R_A18Q_ A21G] 125%
- 1727
- VGLSSGD (SEC ID NO:53) 54%
ES 2 369 895 T3
- 1728
- VGLSSGQ (SEC ID NO:54) 151%
- 1730
- VGLRSGK (SEC ID NO:55) 306%
- 1731
- VGLMSGK (SEC ID NO:56) 247%
- 1787
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [A18Q_A21G] 123%
- 1788
- VGLYSGK (SEC ID NO:28) [A18Q_A21G] 323%
- 1789
- VGLRSGK (SEC ID NO:55) [A18Q_A21G] 248%
- 1790
- VGLMSGK (SEC ID NO:56) [A18Q_A21G] 261%
- 1734
- VGLSSGK (SEC ID NO:30) [A21G] 211%
- 1866
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [A18Q] 196%
- 1869
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [B22K_B29A_A18Q] 69%
- 1870
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [B29A_A15K_A18Q]
- 1871
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [B29A_A18K] 82%
- 1872
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [B3K_B29A_A18Q]
- 1854
- HGLYSGK (SEC ID NO:28) [B29E_A18Q] 40%
- 1875
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [B28K_B29A_A18Q] 35%
- 1876
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [B27K_B29A_A18Q] 38%
- 1878
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [B3K_A18K_A21G] 172%
- 1879
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [B29A_A18Q] 92%
- 1880
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [B1G_B3Q_A18Q_A 21G] 54%
- 1855
- VGLYSGK (SEC ID NO:28) [B28D_A18Q] 221%
- 1884
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [B29A_A8K_A18Q] 89%
- 1896
- VGLSSGQ (SEC ID NO:27) [B29A_A18Q_A22K] 38%
- 1863
- HGRGSGK (SEC ID NO:62) [A18Q_A21G] 122%
- 1873
- KGLSSGQ (SEC ID NO:63) [B29A_A18Q] 60%
- 1874
- VKLSSGQ (SEC ID NO:64) [B29A_A18Q] 835
ES 2 369 895 T3
- 1688023
- VGRSSGK (SEC ID NO:31) 97%
- 1688059
- VGMSSGK (SEC ID NO:65) 112%
- 1655
- TGSSSGK (SEC ID NO:66) 43%
- 1656
- TVGSSSGK (SEC ID NO:67) 57%
- 1689007
- LGSSSGK (SEC ID NO:68) 49%
- 1689008
- RGSSSGK (SEC ID NO:69) 54%
- 1689012
- QGSSSGK (SEC ID NO:70) 34%
- 1689021
- GGSSSGK (SEC ID NO:71) 23%
- 1689037
- SGSSSGK (SEC ID NO:72) 49%
- 1724005
- VDSSSGK (SEC ID NO:73) 32%
- 1724012
- VPSSSGK (SEC ID NO:74) 80%
- 1724014
- VESSSGK (SEC ID NO:75) 40%
- 1724015
- VWSSSGK (SEC ID NO:76) 298%
- 1724016
- VTSSSGK (SEC ID NO:77) 51%
- 1724029
- VASSSGK (SEC ID NO:78) 81%
- 1724040
- VSSSSGK (SEC ID NO:79) 73%
- 1724042
- VRSSSGK (SEC ID NO:80) 76%
- 1711
- RGSSSGK (SEC ID NO:120) 65%
- 1674
- VGASSGK (SEC ID NO:86) 49%
- VGSSNGK (SEC ID NO:87)
- 48%
- 1638077
- VGSSRGK (SEC ID NO:17) 61% 0,10%
- 1676
- VGSSAGK (SEC ID NO:119) 22%
- 1723
- VGSSRGK (SEC ID NO:17) [A21G] 33%
- 1617
- VGSSNGK (SEC ID NO:118) 48%
ES 2 369 895 T3
- 1677
- VGSSSAK (SEC ID NO:89) 22%
- 1766
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) 62% 0,05%
- 1724004
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) 72%
- 1760016
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) [B10D] 135%
- 1760023
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) [B10E] 77%
- 1760043
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) [B10Q] 67%
- 1760056
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) [B10E] 83%
- 1760059
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) [B10N] 48%
- 1738
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) [A18Q] 89%
- 1740
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) [B1G_B3Q_A18Q_A 21G] 90%
- 1741
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) [B1G] 112%
- 1744
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) [A18Q_A21G] 80%
- 1860
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) [B3K_A18Q_A21G] 83%
- 1733
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) [A21G] 42%
- 1712
- VGSSSGK (SEC ID NO:16) B27R 85%
- 1719
- VGHSRGK (SEC ID NO:90) 103%
- 1721
- HGSSRGK (SEC ID NO:91) 118%
- VGSASGK (SEC ID NO:92)
- 80%
- 1687009
- VGSNSGK (SEC ID NO:93) 48%
- 1708
- VGSRSGK (SEC ID NO:94) 128% 0,20%
- 1718
- VGSHRGK (SEC ID NO:95) 69%
- 1687030
- VGSGSGK (SEC ID NO:96) 55%
- 1687033
- VGSYSGK (SEC ID NO:97) 80% 0,20%
- 1687046
- VGSMSGK (SEC ID NO:98) 82% 0,10%
- 1688001
- VGPSSGK (SEC ID NO:99) 48%
ES 2 369 895 T3
- 1688005
- VGTSSGK (SEC ID NO:100) 75%
- 1688006
- VGQSSGK (SEC ID NO:101) 56%
- 1688007
- VGYSSGK (SEC ID NO:102) 95% 0,20%
- 1688011
- VGLSSGK (SEC ID NO:30) 132% 0,10%
- 1688012
- VGKSSGK (SEC ID NO: 103) 93%
- 1688014
- VGGSSGK (SEC ID NO:104) 51%
- 1709
- VGRSSGK (SEC ID NO:105) 97% 0,50%
- 1688028
- VGMSSGK (SEC ID NO:106) 127% 0,20%
- 1688056
- VGVSSGK (SEC ID NO:107) 59%
- VGHSSGK (SEC ID NO:108)
- 112% 0,15%
[0102] Unión de insulinas monocatenarias al receptor de insulina con el motivo del péptido conector de TRXXXGR (SEC ID NO:112) en porcentaje de la de la insulina humana
- Cadena B
- XXX Cadena A IR de Unión al receptor de insulina Unión al IGF-1 humano
- B(1-29)
- YGS A(1-21)
- B((1-29)
- SSN A(1-21) 61% 0,1%
- B(1-29)
- LSQ A(1-21) 62% 0,05%
- B(1-29)
- PKS A(1-21) 18%
- B(1-29)
- LGG A(1-21) 43%
- B(1-29)
- VTG A(1-21) 57%
- B(1-29)
- STN A(1-21) 46%
- B(1-29)
- LES A(1-21) 43%
- B(1-29)
- IDS A(1-21) 31%
- B(1-29)
- NSQ A(1-21) 38%
- B(1-29)
- PSY A(1-21) 49%
- B(1-29)
- ENT A(1-21) 34%
- B(1-29)
- TPQ A(1-21) 22%
- B(1-29)
- NRT A(1-21) 22%
ES 2 369 895 T3
Ejemplo 2
[0103] B(1-29)-B3Q-B29R-TGLGK((eps)miristoil)GQ-A(1-21)-A18Q-A21G insulina humana (SEC ID NO:133) (PAK1820)
5 [0104] B(1-29)-B3Q-B29R-TGLGKGQ-A(1-21)-A18Q-A21G insulin humana(SEQ identidad NO:133) (150 mg, 24 Imol) fue disuelto en carbonato de sodio acuoso (100 mM, 2,8 mL) y se le añadió una solución de éster de nhidroxisuccinimida de ácido mirístico (7,7 mg, 24 Imol, se puede preparar según B. Faroux-Corlay et al., J. Med. Chem. 2001, 44, 2188-2203) en N-metil-2-pirrolidona (0,5 mL). A la mezcla resultante se le añadio más N-metil-2
10 pirrolidona (3 mL) y carbonato de sodio acuoso (100 mM, 0.8 mL), a pH 10-11. La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 50 minutos. EL pH fue ajustado a 5.5 con 1 N ácido clorhídrico. El sólido formado fue aislado mediante centrifugado y decantación. El residuo fue purificado por HPLC preparatorio en dos veces en un Jones Kromasil RP18 5Im, columna de 15x225 mm, usando un flujo de 8 mL/min con el siguiente gradiente:
5.00 - 35.0 min: 10% - 50% CH3 CN + 0,1% TFA,
35.0 - 45.0 min: 50% - 90% CH3 CN + 0,1% TFA.
15 [0105] Las fracciones puras fueron agrupadas y liofilizadas para proporcionar 12 mg del compuesto del título.
[0106] Nano-Flow Electrospray MS: m/Z = 6541 (M+1).
20 HPLC: Rt = 15.44 min. Columna: C4, 5I, 150x4 60mm "phenomenex, Jupiter". Inyección 20 Il. Flujo: 1,5 ml/min
25 [0107] Solventes:
A: 80% 0,0125 M Tris, 0,0187 M (NH4)2SO4 pH = 7, 20% CH3CN.
B: 80% CH3CN, 20% agua.
[0108] Gradiente:
- 24.0
- - 25.0 min:
- 25.0
- - 32.0 min:
35 Ejemplo 3
5% - 55% B, 55% - 80% B, 80% B, 80% - 5% B, 5% B.
[0109] La insulina humana B(1-29)-B3Q-B29R-TGLGK((eps)octadecandioil)GQ-A(1-21)-A18Q-A21G (SEC ID NO:133) (PAK1820)
40 [0110] La insulina humana B(1-29)-B3Q-B29R-TGLGKGQ-A(1-21)-Al8Q-A21G (SEC ID NO:133) (150 mg, 24 Imol) fue disuelta en carbonato de sodio acuoso (100 mM, 2.8 mL) y se le añadió una solución de octadecanoato de tercbutil succinimidilo (preparada en analogía con el método descrito en el ejemplo 4 (11 mg, 24 Imol) en acetonitrilo (2 mL). A la mezcla resultante se le añadió más acetonitrilo (2 mL). El pH de la mezcla fue de 10-11. La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 1 hora. El pH fue ajustado a 5.86 con 1 N ácido
45 clorhídrico. El sólido formado fue aislado mediante centrifugado y decantación. El residuo fue purificado mediante HPLC preparativo en dos veces en un Jones Kromasil RP18 5Im, columna de15x225 mm, usando un flujo de 8 mL/min con el siguiente gradiente:
0.00 - 5.00 min: 10% CH3 CN,
5.00 - 35.0 min: 10% - 50% CH3CN,
35.0 - 45.0 min: 50% - 90% CHCN.
ES 2 369 895 T3
[0111] Las fracciones puras fueron agrupadas y liofilizadas a proporcionar 48 mg de intermediario de insulina humana B(1-29)-B3Q-B29R-TGLGK((eps) octadecanediol de terc-butilo)Ga-A(1-21)-A18a-A21G (SEC ID NO:133).
5 [0112] A la insulina humana B(1-29)-B3Q-B29R-TGLGK((eps) octadecanediol de terc-butilo)GQ-A(1-21)-A18Q-A21G (SEQ identidad NO:133) (48 mg) anterior se le añadió ácido trifluoroacético (1,8 ml) y la mezcla fue suavemente agitada a temperatura ambiente durante 35 minutos. La mezcla fue concentrada al vacío y deshecho dos veces con diclorometano. El residuo fue purificado mediante preparativo HPLC en dos veces en un Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleosil 300
10 7 columna C4, usando un flujo de 8 mL/min con el siguiente gradiente:
0.00 - 5.00 min: 10% CH3 CN,
5.00 - 30.0 min: 10% - 50% CH3CN,
30.0 - 35.0 min: 50% - 90% CHCN.
35.0 - 40.0 min: 100% CH3 CN.
[0113] Esto proporcionó 19 mg de insulina humana B(1-29)-B3Q-B29R- TGLGK ((eps) octadecanediol ) GQ-A (1-21)
15 -A18Q -A21G (SEQ identidad NO:133) NanoFlow Electrospray MS: m/Z = 6626 (calculado: 6626) HPLC: Rt = 12,62 min. Columna: C4, 5I, 150x4 60mm "phenomenex, Jupiter". Flujo: 1,5 ml/min
20 [0114] Solventes:
A: 80% 0,0125 M Tris, 0,0187 M (NH4)2SO4 pH = 7, 20% CH3 CN.
B: 80% CH3CN, 20% agua. 25
[0115] Gradiente:
0.00 - 20.00 min: 5% - 55% B,
20.0 - 22.0 min: 55% - 80% B,
22.0 - 24.0 min: 80% B,
- 24.0
- - 25.0 min: 80% - 5% B,
- 25.0
- - 32.0 min: 5% B.
Ejemplo 4
35 [0116] La insulina humana B(1-29)-B3a-B29R-TGLGK((eps)hexadecandioyl-y-L-Glu)GQ-A(1-21)-A18Q-A21G (SEC ID NO:133)(PAK1820)
[0117] Este compuesto fue preparado de manera similar a como se describe en el ejemplo 2 la acilación de la insulina humana B(1-29)-B3Q-B29R- TGLGKGQ-A(1-21)-A18Q-A21G (SEC ID NO:133) con terc-butil 40 hexadecandioyl-y-L-Glu(OSu)-OtBu de, seguido una desprotección de los ésteres del tBu mediada por TFA.
[0118] Datos para el compuesto del título:
MALDI-TOF: m/z= 6727 (calculado: 6727) 45 HPLC: Rt = 10.15 min.
Columna: C4, 5I, 150x4 60mm "phenomenex, Jupiter".
50 Flujo: 1,5 ml/min
ES 2 369 895 T3
[0119] Solventes:
A: 80% 0,0125 M Tris, 0,0187 M (NH4)2SO4pH = 7, 20% CH3CN.
- 5
- B: 80% CH3CN, 20% agua.
- [0120] Gradiente:
- 0.00 - 20.00 min: 20.0 - 22.0 min: 22.0 - 24.0 min: 24.0 - 25.0 min: 25.0 - 32.0 min:
- 5% - 55% B, 55% - 80% B, 80% B, 80% - 5% B, 5% B.
- 10
Preparación de terc-butil hexadecandioil-y-L-Glu(OSu)-OtBu
15 [0121] Se suspendió ácido hexadecandioico (40,0 g, 140 mmol) en tolueno (250 ml) y la mezcla fue calentada a reflujo. Se añadió N,N-dimetilformamida acetálico (76,3 g, 375 mmol) fue añadido gota a gota durante 4 horas. Se reflujó la mezcla durante toda la noche. El solvente fue quitado al vacío a 50°C, y el material bruto fue suspendido en DCM/AcOEt (500 ml, 1:1) y agitado durante 15 mins. Los sólidos fueron recogidos por filtración y triturados con DCM (200 ml). Los filtrados fueron evaporados al vacío para dar mono-terc-butilo hexadecanoato crudo, 30 gramos. Este
20 material fue suspendido en DCM (50 ml), enfriado con hielo durante 10 min, y filtrado. El solvente fue quitado al vacío para dejar 25 gramos de mono-terc-butilo hexadecanoato crudo, que fue recristalizado desde heptano (200 ml) para dar mono-terc-butilo hexadecanoato, 15,9 g (33 %). Alternativamente a la recristalización, el monoéster se puede purificar por elución de cromatografía de gel de sílice con AcOEt/heptano.
25 1H-NMR (CDCl3) 0: 2.35 (t; 2H), 2.20 (t; 2H), 1.65-1.55 (m; 4H), 1.44 (s; 9H), 1.34-1.20 (m, 20 H).
[0122] El éster mono-terc-butil (2 g, 5.8 mmol) fue disuelto en THF (20 ml) y tratado con TSTU (2,1 g, 7,0 mmol) y DIEA (1,2 ml, 7,0 mmol) y agitado durante toda la noche. La mezcla fue filtrada, y el filtrado fue evaporado al vacío. El residuo fue disuelto en AcOEt y lavado dos veces con 0,1 M HCl y agua fría. El secado sobre MgSO4 y
30 evaporación al vacío dio terc-buti succinimidil hexadecanoato, 2,02 g (79%).
1H-NMR (CDCl3) 0: 2.84 (s, 4H), 2.60 (t, 2H), 2.20 (t, 2H), 1.74 (p, 2H), 1.56 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.40 (m, 2H), de
1.30 1.20 (m, 18H).
35 [0123] Terc-butilo succinimidil hexadecanoato (1 g, 2,27 mmol) fue disuelto DMF (15 ml) y tratado con L-Glu- OtBu (0,51 g, 2,5 mmol) y DIEA (0.58 ml, 3.41 mmol) y la mezcla fue agitada durante toda la noche. El solvente fue evaporado al vacío, y el producto crudo fue disuelto en AcOEt, y lavado dos veces con 0,2M HCl, con agua y solución salina. El secado sobre MgSO4 y la evaporación al vacío dio terc-butil de hexadecandioyl-y-L-Glu-OtBu, 1,2 g (100%).
40 1H-NMR (CDCl3) 0: 6.25 (d, 1H), 4.53 (m, 1H), 2.42 (m, 2H), 2.21 (m, 4H), 1.92 (m, 1H), 1.58 (m, 4H), 1.47 (s, 9H),
1.43 (s, 9H), 1.43-1.22 (m, 18H).
[0124] Terc-butil hexadecandioyl-y-L-Glu-OtBu (1.2 g, 2.27 mmol) fue disuelto en THF (15 ml) y tratado con TSTU
45 (0.82 g, 2.72 mmol) y DIEA (0.47 ml, 2.72 mmol) y agitado durante toda la noche. La mezcla fue filtrada, y el filtrado fue evaporado al vacío. El residuo fue disuelto en AcOEt y lavado dos veces con 0,1 M HCl y agua fría. El secado sobre MgSO4 y la evaporación al vacío dio terc-butilo hexadecandioyl-y-L-Glu(OSu)-OtBu, 1,30 g (92%).
1H-NMR (CDCl3) 0: 6.17 (d, 1H), 4.60 (m, 1H), 2.84 (s, 4H), 2.72 (m, 1H), 2.64 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.20 (m, 4H),
50 2.08 (m, 1H), 1.6 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.33-1.21 (m, 20 H).
Ejemplo 5
55 [0125] La insulina humana B(1-29)-B27E-B29A-TGLGK((eps)miristoyl)GQ-A(1-21)-A18Q (SEC ID NO:134) (PAK1845)
ES 2 369 895 T3
[0126] La insulina humana B(1-29)-B27E-B29A-TGLGKGQ-A(1-21)-A18Q (SEC ID NO:134) (117 mg, 20 Imol) fue disuelto en carbonato de sodio acuoso (100 mM, 2.5 mL) y se le añadió una solución de éster de Nhidroxisuccinimida de ácido mirístico (9 mg, se puede preparar según B. Faroux-Corlay et al., J. Med. Chem. 2001, 44, 2188-2203) en acetonitrilo (1.8 mL). La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 65
5 minutos. El pH fue ajustado a 5.5 con 1 N ácido clorhídrico. El sólido formado fue aislado mediante centrifugado y decantación. El residuo fue purificado mediante preparativo de HPLC en un Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7, columna C4, usando un flujo de 10 mL/min con el siguiente gradiente:
0 - 10 min: 20% CH3CN + 0,1 % TFA,
10 - 80 min: 20% - 90% CH3CN + 0,1% TFA,
35.0 - 45.0 min: 50% - 90% CH3CN + 0,1% TFA.
10 [0127] Las fracciones puras fueron agrupadas y liofilizadas para proporcionar 20 mg del compuesto del título.
[0128] MALDI-TOF MS: m/Z = 6509. Calculado: 6518
HPLC: Rt = 11.64 min. columna: "Phenomenex, Jupiter", C4 5I, 150x4 60mm, inyección: 20 Il. Solventes: A: 80 %
15 0,0125 M Tris, 0,0187 M (NH4 ) 2 SO4 pH = 7, 20% CH3 CN; B: 80 % CH3 CN, 20% agua, flujo 1,5 ml/min con el siguiente gradiente:
0 - 20 min: 5 - 55% B,
20 - 22 min: 55 - 80% B,
22 - 24 min: 80% B,
24 - 25 min: 80 - 5% B,
25 - 32 min: 5% B.
20 [0129] HPLC: Rt = 12.95 min. Columna: "Phenomenex, Jupiter", C4 5I, 150x4 60mm, inyección: 20 Il. Solventes: A: 0,1% TFA, 10%CH3 CN, 89, 9 % agua; B: 0.1% TFA, 80 % CH3CN, 19,9% agua, flujo: 1,5 ml/min con el siguiente gradiente:
0 - 17 min: 20 - 90% B,
17 - 21 min: 90% B,
21 - 23 min: 90 - 20% B,
23 - 30 min: 20% B.
Ejemplo 6
[0130] Insulina humana B(1-29)-B29A-TGLGK((eps)miristoyl)GQ-A(1-21)-A18Q (SEC ID NO:135) (PAK1837)
30 [0131] La insulina humana B(1-29)-B29A-TGLGKGO-A(1-21)-A18Q (SEC ID NO:135) (151 mg, 24 Imol) fue disuelto en carbonato de sodio acuoso (100 mM, 5 mL) y se le añadió una solución de éster N-hidroxisuccinimida de ácido mirístico (8 mg) (se puede preparar según B. Faroux-Corlay et al., J. Med. Chem. 2001, 44, 2188-2203) en Nmetilpirrolidin-2-ona (2,5 mL). La mezcla resultante fue agitada a temperatura ambiente durante 45 minutos. El pH fue ajustado a 5.6 con 1 N ácido clorhídrico. El sólido formado fue aislado mediante centrifugado y decantación. El
35 residuo fue purificado por preparativo HPLC en un Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7, columna C4, usando un flujo de 8 mL/min con el siguiente gradiente:
0 - 5 min:
10% CH3 CN + 0,1% TFA,
5 - 35 min: 10% - 90% CH3CN + 0,1 % TFA,
35 - 40 min: 90% CH3CN + 0,1 % TFA,
40 - 45 min: 100% CHCN.
40 [0132] Las fracciones puras fueron agrupadas y liofilizadas para proporcionar 24 mg del compuesto del título.
ES 2 369 895 T3
MALDI-TOF MS: m/Z = 6489.
Calculado: 6498
[0133] HPLC: Rt = 10.97 min. Columna: proteína Vydac, C4 25 cm, cat # 214TP54, inyección: 5 Il. Solventes: 5 A: 80 % 0,01 M Tris, 0,015 M (NH4 ) 2 SO4 pH = 7,3, 20% CH3 CN; B: 80 % CH3 CN, 20% agua, flujo 1,5 ml/min con el siguiente gradiente:
0 - 20 min:
10 - 80% B, 20 - 20.1 min: 80 - 90% B,
20.1 - 21 min: 90 - 10% B, 21 - 25 min: 10% B.
[0134] HPLC: Rt = 13.09 min. Columna: "Phenomenex, Jupiter", C4 5I, 150x4 60mm, inyección: 25 Il. Solventes: A: 0.1% TFA, 10%CH3CN, 89. 9 % agua; B: 0.1% TFA, 80 % CH3CN, 19. 9% agua, flujo: 1.5 ml/min con el siguiente gradiente:
15 0 - 17 min:
20 - 90% B, 17 - 21 min: 90% B, 21 - 23 min: 90 - 20% B, 23 - 30 min: 20% B.
20 [0135] Afinidad por el receptor de insulina humana
- Ejemplo
- IC50 en relación a la insulina humana in %.
- 2
- 2%
- 3
- 0,1 %
- 4
- 0,7%
MÉTODOS FARMACOLÓGICOS
Ensayo (I)
[0136] Unión al receptor de insulina de las insulinas monocatenarias de la invención.
30 [0137] La afinidad de las insulinas monocatenarias de la invención con el receptor de insulina humana fue determinada mediante un ensayo SPA (Análisis de centelleo por proximidad) en una placa microtituladora con anticuerpos de captura. Los gránulos de unión a anticuerpo de ratón SPA PVT (Amersham Biosciences, Cat n°. PRNQ0017) fueron mezclados con 25 ml de tampón de unión (100 mM HEPES pH 7.8, 100 mM cloruro sódico, 10
35 mM MgSO4, 0,025% Tween-20). La mezcla de reagentes para una única placa microtituladora Packard Optiplate (Packard n°. 6005190) se compone de 2.4 Il de un receptor de insulina humana recombinante - exon 11 purificado diluido a 1:5000 -, una cantidad de una solución madre de human insulina A14 Tyr[1251] que corresponde a 5000 cpm por 100 Il de mezcla reactiva, 12 Il de un dilución del 1:1000 de anticuerpo F12, 3 ml de perlas de SPA y tampón de unión para un total de 12 ml. Un total de 100 Il fue añadido después y se hicieron una serie de diluciones
40 a partir de muestras apropiadas. A la serie de diluciones se les añadió luego 100 Il de mezcla reactiva y las muestras fueron incubadas durante 16 horas mientras fueron suavemente agitados. Las fases luego fueron separadas mediante centrifugado durante 1 min y las placas contadas en un Topcounten. Los datos de unión fueron ajustados usando el algoritmo de regresión no lineal en el Prisma GraphPad 2.01 (GraphPad Software, San Diego, CA).
Preparación de anticuerpos mIR monoclonales
ES 2 369 895 T3
[0138] Anticuerpos específicos (F12) fueron producidos por técnica monoclonal: Ratones RBF fueron inmunizados mediante inyección subcutánea de 50 Ig de mIR purificado en FCA seguido de dos inyecciones con 20 Ig de mIR en FIA. Ratones de alta respuesta fueron estimulados con 25 Ig de mIR por vía intravenosa y los bazos fueron cosechados 3 días después. Las células de bazo se fusionaron con la línea celular de mieloma de zorro (Köhler, G & Milstein C. (1976), European J. Immunology, 6:511-19 ; Taggart RT et al (1983), Science 219:1228-30 ). Los sobrenadantes fueron sometidos a revisión para la producción de anticuerpos en un mIR de ELISA específica. Los pocillos positivos fueron clonados y evaluados según transferencia de Western.
Ensayo (II)
[0139] Alternativamente la unión al receptor de insulina fue evaluada en un ensayo de membrana HLRB de la siguiente manera:
Unión de [125l] de insulina humana a un receptor de insulina humana isoforma(hlR-A) recombinante asociada a la membrana.
[0140] Reactivos:
I-insulina: Novo Nordisk A/S, mono 125l -(Tyr A14) insulina humana
Insulina humana: Novo Nordisk A/S,
Albúmina de suero humana: Dade Behring, ORHA 194 C30, lot 455077
Artículos plásticos: Packard OptiPlate™-96; #6,005,290
Centelleante: Amersham Biosciencies, microesferas de PVT revestidos con WGA, #RPNQ0001
Células: Células BHK tk - ts13 expresando la isoforma recombinante de receptor de insulina humana A (hlR1214).
[0141] Extracción de receptores de insulina asociados a la membrana: se cosecharon BHK células en una fábrica celular de diez capas y homogenizadas en 25 ml de tampón muy frío (25 mM HEPES pH 7.4, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 250 mg/l bacitracina, 0,1 mM Pefablock). El homogeneizado fue cuidadosamente puesto en capas sobre almohadones de un 41% de sacarosa, centrifugado en la ultracentrifugadora a 95,000 x g durante 75 minutos en un rotor Beckman SW28 a 4°C. Las membranas de plasma fueron recogidas de la parte superior de la almohadilla de sacarosa, diluido a 1:4 con tampón y centrifugado a 40,000 x g durante 45min en un rotor Beckman SW28. Los gránulos fueron suspendidos en tampón (25 mM HEPES pH 7.4, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 250 mg/l bacitracina,
0.1 mM Pefablock) y almacenado a -80°C. Se realizó una unión de radioligando a receptores de insulina asociados a la membrana por duplicado en placas microtituladoras OptiPlates de 96 pocillos. La proteína de membrana fue incubada durante 150 minutos a 25°C con 50 pM [125I-TyrA14] de insulina humana en un volumen total de 200 ml de tampón de ensayo (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 0.01% Tritón X-100, 0,1% HSA, inhibidores de proteasa sin EDTA de Complete™) y aumentando las concentraciones de insulina humana o análogos de insulina (típicamente entre 0,01 y 300 nM). Se terminó el ensayo mediante la adición de 50 Il de una suspensión de microesferas PVT revestidos con WGA (20 mg/ml). Tras 5 minutos de agitación ligera, la placa fue centrifugada a 1500 r.p.m. durante 6 minutos, y radioactividad unida cuantificado mediante un Packard TopCount NXT después de un retraso de 60 minutos.
[0142] Los resultados se dan como IC50 en relación en % a la insulina humana.
Ensayo (III)
[0143] La potencia de los derivados insulínicos monocatenarios de la invención en relación a insulina humana.
[0144] Se usaron ratas Wistar para examinar la eficacia inferior de glucosa en sangre de SCI af I.V administración de bolo. Tras la administración de bien SCI o insulina humana la concentración de glucosa en sangre es monitoreada
Ensayo (IV)
[0145] Determinación en cerdos de T50% de las insulinas monocatenarias de la invención.
ES 2 369 895 T3
[0146] T50% es el tiempo que ha desaparecido del sitio de inyección un 50% de una cantidad inyectada del derivativo marcado como A14 Tyr[125l] insulina debe ser evaluada y medido con un contador γ externo.
[0147] Los principios de cuidados de animales de laboratorio fueron seguidos. Se usaron cerdas no diabéticas específicamente libres de patógenos LYYD, cruce de Landrace Danés, Yorkshire y Duroc (Homenlund, Haarloev, Dinamarca) para estudios fármacoquinéticos y farmacodinámicos. Los cerdos están conscientes, tienen 4-5 meses de edad y pesan 70-95 kg. Los animales ayunan 18 horas antes del experimento.
[0148] Las preparaciones formuladas de derivados de insulina marcados en TirA14 con 125l son inyectadas subcutáneamente en cerdos tal y como se describe anteriormente (Ribel, U., Jrgensen, K, Brange, J, and Henriksen, U. The pig as a model for subcutaneous insulin absorption in man. Serrano-Rios, M and Lefèbvre, P. J.
891-896. 1985. Amsterdam; New York; Oxford, Elsevier Science Publishers. 1985 (Conference Proceeding)).
[0149] A principios de los experimentos una dosis de 60 nmol del derivado de insulina según la invención (compuesto de prueba) y una dosis de 60 nmol de insulina (ambos 1251 marcados en Tyr A14) se inyectan en dos sitios separados en el cuello de cada cerdo.
[0150] La desaparición del marcador radiactivo del sitio de inyección subcutánea es monitoreada usando una modificación del tradicional método de contado de gamma (Ribel, U. Subcutaneous absorption of insulin analogues. Berger, M. and Gries, F. A. 70-77 (1993). Stuttgart; New York, Georg Thime Verlag (Conference Proceeding )). Con este método modificado es posible medir continuamente la desaparición de radioactividad de un depósito subcutáneo durante varios días usando un dispositivo inalámbrico portátil (Scancis Laboratorieteknik, Værløse, DK3500, Dinamarca). Las mediciones se realizan a intervalos de 1-min, y los valores contados se corrigen para actividad de fondo.
Unión del receptor IGF-1
[0151] La unión del receptor IGF-1 de la insulina monocatenaria fue determinada usando un análisis SPA (análisis de proximidad de centelleo) en una placa microtituladora con captura de anticuerpos similar al usado para determinar la unión al receptor de insulina de los derivados de insulina de la invención, con la excepción que fue usado el receptor de IGF-1 en lugar del receptor de insulina, IGF humano [125l] en lugar de insulina humana [125l] y un anticuerpo con especifidad para el receptor de IGF-1
LISTADO DE SECUENCIAS
[0152]
<110> Novo Nordisk A/S Kjeldsen, Thomas
<120> Cadena monocatenaria
<130> 6807.204-WO
<160> 135
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial
<400> 1
<210> 2
<211> 7
ES 2 369 895 T3
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial
<400> 2
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial 15
<220>
<223> artificial
<400> 3
<210> 4
<211> 7 25 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial
<400> 4
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial
45 <400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
ES 2 369 895 T3
<223> artificial
<400> 6
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial
15 <400> 7
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 25 <223> artificial
<400> 8
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial 35
<220>
<223> artificial
<400> 9
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial
<400> 10
ES 2 369 895 T3
<210> 11
<211> 12
5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial 10
<400> 11
15 <210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> artificial
<400> 12
<210> 13
<211> 11
<212> PRT 30 <213> Artificial
<220>
<223> artificial
35 <400> 13
<210> 14 40 <211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 45 <223> artificial
<400> 14
ES 2 369 895 T3
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial
<400> 15
<210> 16 15 <211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial
<400> 16
- 25
- <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial
- <220> <223> artificial
- 35
- <400> 17
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial
<400> 18
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
ES 2 369 895 T3
<220>
<223> artificial
<400> 19
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial
<400> 20
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial
<400> 21
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> artificial
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<220>
<223> artificial
<220>
<221> aminoácido variable
<222> (3)..(3)
<223> X puede ser cualquier residuo de aminoácido codificable
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<220>
<221> misc feature
<222> (3)..(5)
- <223>
- Xaa puede ser cualquier aminoácido natural 5
<220>
<221> aminoácido variable
<222> (4)..(4)
<223> X puede ser cualquier residuo de aminoácido codificable
<220>
<221> aminoácido variable
<222> (5)..(5)
- <223>
- X puede ser cualquier residuo de aminoácido codificable 15
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<220>
<223> artificial
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<220>
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<223> articial
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<220>
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<220>
<223> artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<223> artificial
<220>
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<222> (6)..(6)
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<210> 124
<211> 7
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<220>
<223> artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
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<211> 7
ES 2 369 895 T3
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<220>
<223> artificial
<220>
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<220>
<223> artificial
<220>
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<211> 7
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<220>
<223> artificial
<220>
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<220>
<223> artificial
<220>
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<400> 128
ES 2 369 895 T3
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<211> 7
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5 <213> Artificial
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<223> artificial
<220>
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<222> (1)..(1)
<223> X puede ser L, R, T, A, H, Q, G, S, V.
15 <220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X puede ser L, Y, M, H, R, T, Q, K, V, S, A, G y P
25 <220>
<221> MTSC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X puede ser R, A, Y, M, S, N, H, y G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X puede ser S, R, A, T, K P, NM, H, Q, V, y G
35 <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X puede ser G y A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X puede ser K, R, P, H, F, T, I, Q, W, y A
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<220>
<223> artificial
55 <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<220>
<221> misc feature
ES 2 369 895 T3
<222> (1)..(1)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
5 <221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<220>
<221> misc feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> MISC_FEATURE 15 <222> (5)..(5)
<220>
<221> misc feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7) 25
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<221> misc feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
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Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Insulina monocatenaria para el tratamiento de la diabetes de tipo 1 y la diabetes de tipo 2 con la fórmula B(1-26)- X1 - X2 -X3 - X4 - A (1-21)donde X1 es Thr, Lys o Arg, X2 es Pro, Lys o Asp, X3 es Lys, Pro o Glu, X4 es una secuencia de péptidos con lasiguiente de fórmula X -X -X -X -X -X X (SEC ID NO:129) dondeabcdefgX es seleccionado del grupo que consiste en L, R, T, A, H, Q, G, S y V;aXb es seleccionado del grupo que consiste en W, G, S, A, H, R, y T; X es seleccionado del grupo que consiste en L, Y, M, H, R, T, Q, K, V, S, A, G y P;cXd es seleccionado del grupo que consiste en R, A, Y, M, S, N, H, y G; X es seleccionado del grupo que consiste en S, R, A, T, K, P, N, M, H, Q, V, y G;eXf es seleccionado del grupo que consiste en G y A; y Xg es seleccionado del grupo que consiste en K, R, P, H, F, T, I, Q, W, y A, B(1-26) es una cadena de péptidos que consiste en los primeros 26 residuos de aminoácidos de la cadena Bde insulina humana contadas desde el extremo N-terminal de la cadena B o un análogo de la cadena B con una adición o una eliminación de uno de los residuos de aminoácidos en la cadena B o derivado de la cadena B modificada químicamente introduciendo un grupo en la cadena lateral en una o más posiciones de la cadena B o por oxidación o reducción de las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos en la cadena B, y A(121) es la cadena A de insulina natural o un análogo de la misma con una adición o una eliminación de uno de los residuos de aminoácidos en la cadena A o derivado de la cadena A modificada químicamente introduciendo un grupo en la cadena lateral en una o más posiciones de la cadena A o por oxidación o reducción de las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos en la cadena A, donde X4 no contiene dos residuos de aminoácidos básicos adyacentes y donde la insulina monocatenaria tiene una afinidad por el receptor de insulina humana de al menos aproximadamente un 20% de la de la insulina humana si la molécula de insulina monocatenaria no está modificada químicamente por acilación.
- 2. Insulina monocatenaria según la reivindicación 1, donde X es seleccionado del grupo que consiste en L, R, T, A, H y V;aXb es seleccionado del grupo que consiste en W, G, S, A, H, R, y T; X es seleccionado del grupo que consiste en L, Y, M, H, R, T, Q, K, V, S, A, G y P;cXd es seleccionado del grupo que consiste en R, A, Y, M, S, N, H, y G; X es seleccionado del grupo que consiste en S, R, A, T, K, P, y N;eXf es G; y Xg es seleccionado del grupo que consiste en K, R, Q, y P;
- 3. Insulina monocatenaria según la reivindicación 1, donde X es seleccionado del grupo que consiste en T, A, V;aXb es G; X es seleccionado del grupo que consiste en L, Y, M, H, R, K;cXd es G; X es seleccionado del grupo que consiste en S, K;e Xf es G, yXg es seleccionado del grupo que consiste en K, R, Q.
-
- 4.
- Insulina monocatenaria según la reivindicación 1, donde X4 tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en AGRGSGK (SEC ID NO:15); AGLGSGK (SEC ID NO:33); AGMGSGK (SEC ID NO:45); ASWGSGK (SEC ID NO:48); TGLGSGQ (SEC ID NO:22); TGLGRGK (SEC ID NO:23); TGLGSGK (SEC ID NO:21); HGLYSGK (SEC ID NO:50); KGLGSGQ (SEC ID NO:51); VGLMSGK (SEC ID NO:56); VGLSSGQ (SEC ID NO:27); VGLYSGK (SEC ID NO:28), VGLSSGK (SEC ID NO:30); VGMSSGK (SEC ID NO:65); VWSSSGK (SEC ID NO:76), VGSSSGK (SEC ID NO:16) y VGMSSGK (SEC ID NO:106)
-
- 5.
- Preparación farmacéutica que comprende una cantidad biológicamente activa de una insulina monocatenaria según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
-
- 6.
- Uso de insulina monocatenaria según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la preparación de una preparación farmacéutica para el tratamiento de la diabetes.
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WO2009129250A2 (en) | 2008-04-14 | 2009-10-22 | Case Western Reserve University | Meal-time insulin analogues of enhanced stability |
MX2010011329A (es) * | 2008-04-22 | 2011-03-15 | Univ Case Western Reserve | Analogos de insulina especificos de isoforma. |
KR20120129875A (ko) | 2008-07-31 | 2012-11-28 | 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 | 염소화 아미노산을 갖는 인슐린 유사체 |
US9200053B2 (en) | 2008-07-31 | 2015-12-01 | Case Western Reserve University | Insulin analogues containing penta-fluoro-Phenylalanine at position B24 |
US20100048482A1 (en) * | 2008-08-15 | 2010-02-25 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods for modulating epsilon protein kinase c-mediated cytoprotection |
CN106317164A (zh) | 2008-09-12 | 2017-01-11 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 酰化肽或蛋白的方法 |
JP5755566B2 (ja) | 2008-12-19 | 2015-07-29 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションIndiana University Research And Technology Corporation | アミド系インスリンプロドラッグ |
CN102256992B (zh) | 2008-12-19 | 2015-04-22 | 印第安纳大学研究及科技有限公司 | 胰岛素类似物 |
CN102307584A (zh) * | 2008-12-19 | 2012-01-04 | 印第安纳大学研究及科技有限公司 | 表现出对胰岛素受体的高活性的基于yl的胰岛素-样生长因子 |
US8399407B2 (en) | 2009-09-17 | 2013-03-19 | Case Western Reserve University | Non-standard insulin analogues |
MX2012006568A (es) | 2009-12-11 | 2012-12-17 | Univ Case Western Reserve | Analogos de insulina con aminoacidos clorados. |
EP2582719B1 (en) | 2010-06-16 | 2016-08-10 | Indiana University Research and Technology Corporation | Single chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor |
CA2802510A1 (en) | 2010-06-23 | 2011-12-29 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives containing additional disulfide bonds |
JP5973427B2 (ja) | 2010-06-23 | 2016-08-23 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 追加のジスルフィド結合を含有するインスリン類似体 |
US8946147B2 (en) | 2010-06-24 | 2015-02-03 | Indiana University Research And Technology Corporation | Amide-based insulin prodrugs |
EP2768520A4 (en) | 2011-10-18 | 2015-07-15 | AmideBio LLC | CHEMICALLY AND THERMODYNAMICALLY STABLE INSULIN ANALOGUES AND IMPROVED PRODUCTION METHODS THEREFOR |
JP6392123B2 (ja) | 2011-12-20 | 2018-09-19 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションIndiana University Research And Technology Corporation | 糖尿病治療のためのctp系インスリンアナローグ |
JP6387008B2 (ja) | 2012-09-26 | 2018-09-05 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションIndiana University Research And Technology Corporation | インスリンアナローグダイマー |
UA116217C2 (uk) | 2012-10-09 | 2018-02-26 | Санофі | Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону |
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JP6735561B2 (ja) | 2012-12-03 | 2020-08-05 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションMerck Sharp & Dohme Corp. | O−グリコシル化カルボキシ末端部分(ctp)ペプチド系のインスリンおよびインスリン類似体 |
KR20150096433A (ko) | 2012-12-21 | 2015-08-24 | 사노피 | 이중 glp1/gip 또는 삼중 glp1/gip/글루카곤 효능제 |
JP6538645B2 (ja) * | 2013-03-14 | 2019-07-03 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションIndiana University Research And Technology Corporation | インスリン‐インクレチン複合物 |
EP2986315A4 (en) * | 2013-04-17 | 2017-03-01 | AmideBio LLC | Chemically and thermodynamically stable insulin analogues and improved methods for their production |
GB201315335D0 (en) | 2013-08-29 | 2013-10-09 | Of Singapore | Amino diacids containing peptide modifiers |
WO2015051052A2 (en) | 2013-10-04 | 2015-04-09 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Glucose-responsive insulin conjugates |
US9402876B2 (en) * | 2013-11-27 | 2016-08-02 | Industrial Technology Research Institute | Method and pharmaceutical composition for hair growth |
GB201321489D0 (en) * | 2013-12-05 | 2014-01-22 | Chemical & Biopharmaceutical Lab Of Patras S A | Biologically active insulin derivatives |
EP3080150B1 (en) | 2013-12-13 | 2018-08-01 | Sanofi | Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/gip receptor agonists |
EP3080154B1 (en) | 2013-12-13 | 2018-02-07 | Sanofi | Dual glp-1/gip receptor agonists |
EP3080152A1 (en) | 2013-12-13 | 2016-10-19 | Sanofi | Non-acylated exendin-4 peptide analogues |
EP3080149A1 (en) | 2013-12-13 | 2016-10-19 | Sanofi | Dual glp-1/glucagon receptor agonists |
AR099569A1 (es) | 2014-02-28 | 2016-08-03 | Novo Nordisk As | Derivados de insulina y los usos médicos de estos |
TW201625670A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自exendin-4之雙重glp-1/升糖素受體促效劑 |
TW201625668A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 作為胜肽性雙重glp-1/昇糖素受體激動劑之艾塞那肽-4衍生物 |
TW201625669A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自艾塞那肽-4(Exendin-4)之肽類雙重GLP-1/升糖素受體促效劑 |
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BR112017004544A2 (pt) * | 2014-10-06 | 2018-01-23 | Univ Case Western Reserve | insulina de cadeia simples, composição farmacêutica e método para tratar diabetes mellitus |
US20170304361A1 (en) * | 2014-10-20 | 2017-10-26 | Case Western Reserve University | Halogenated insulin analogues of enhanced biological potency |
BR122024000903A2 (pt) | 2014-11-21 | 2024-02-27 | Merck Sharp & Dohme Llc | Composto, composição, e, uso do composto |
EP3268384B1 (en) | 2015-03-10 | 2021-11-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for preparing recombinant insulin using microfiltration |
AR105616A1 (es) | 2015-05-07 | 2017-10-25 | Lilly Co Eli | Proteínas de fusión |
CN104805091B (zh) * | 2015-05-13 | 2018-01-30 | 武汉真福医药股份有限公司 | 重组人胰岛素的表达方法及专用表达载体、工程菌和应用 |
AR105319A1 (es) | 2015-06-05 | 2017-09-27 | Sanofi Sa | Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico |
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EP3600381A4 (en) | 2017-03-23 | 2021-06-16 | Merck Sharp & Dohme Corp. | GLUCOSE-ACTIVE INSULIN WITH A THREE-VALUE SUGAR CLUSTER FOR THE TREATMENT OF DIABETES |
AU2018317810A1 (en) | 2017-08-17 | 2020-03-19 | Novo Nordisk A/S | Novel acylated insulin analogues and uses thereof |
US20210388050A1 (en) * | 2018-10-01 | 2021-12-16 | University Of Houston System | Engineered active single-polypeptide chain insulin analogs |
TW202120536A (zh) | 2019-07-31 | 2021-06-01 | 美商美國禮來大藥廠 | 鬆弛素(relaxin)類似物及其使用方法 |
US20220280614A1 (en) * | 2019-08-02 | 2022-09-08 | Case Western Reserve University | Premixed Ultra-Stable Single-Chain Insulin Analogue Formulations |
AU2020402135A1 (en) | 2019-12-11 | 2022-06-02 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin analogues and uses thereof |
WO2022125587A1 (en) * | 2020-12-07 | 2022-06-16 | Case Western Reserve University | Acylated single-chain insulin analogues |
TW202342552A (zh) * | 2022-03-16 | 2023-11-01 | 大陸商北京拓界生物醫藥科技有限公司 | 人胰島素類似物、其融合蛋白及醫藥用途 |
Family Cites Families (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4546082A (en) | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
US4870008A (en) | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
AU600885B2 (en) | 1984-05-25 | 1990-08-30 | Zymogenetics Inc. | Stable DNA constructs |
DK58285D0 (da) * | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
US5008241A (en) * | 1985-03-12 | 1991-04-16 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin peptides |
PH25772A (en) | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
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DK300090D0 (da) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser |
US5304473A (en) | 1991-06-11 | 1994-04-19 | Eli Lilly And Company | A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production |
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DE19947456A1 (de) * | 1999-10-02 | 2001-04-05 | Aventis Pharma Gmbh | C-Peptid zur verbesserten Herstellung von Insulin und Insulinanaloga |
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