CN101538323B - 一种纯化艾塞那肽的方法 - Google Patents
一种纯化艾塞那肽的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101538323B CN101538323B CN2009101049870A CN200910104987A CN101538323B CN 101538323 B CN101538323 B CN 101538323B CN 2009101049870 A CN2009101049870 A CN 2009101049870A CN 200910104987 A CN200910104987 A CN 200910104987A CN 101538323 B CN101538323 B CN 101538323B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phase
- purifying
- exenatide
- purification
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Abstract
本发明公开了一种纯化艾塞那肽的方法，包括如下步骤：将固相合成所得粗肽用注射用水溶解，用固定相为四烷基硅烷键合硅胶、八烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶柱，流动相为磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；将纯化后的高纯度肽采用阴离子交换转成醋酸盐。本发明提出的一条适于产业化纯艾塞那肽的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化纯艾塞那肽，并用阴离子交换转盐，不仅能得到HPLC纯度大于98.0％的精肽，而且能够规模化生产，达到纯度高、收率高、产业化的要求。
Description
技术领域
本发明属于HPLC技术领域，尤其是涉及一种规模化纯化艾塞那肽(Exenatide)的方法。
背景技术
糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，高血糖主要由胰岛素分泌或作用的缺陷引起。糖尿病可分两种，胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(II型糖尿病)，其中II型糖尿病患者占90％以上。WHO统计结果显示，目前全球已经诊断的II型糖尿病达到1.3亿人，我国已超过4000万人，是继印度之后的第二大糖尿病大国。
常用的II型糖尿病治疗药物包括：双胍类、磺脲类、α-葡萄糖甘酶抑制剂、噻唑烷二酮类及胰岛素等。但研究发现，这几类常用药物都有可能造成身体的不良反应，特别是二甲双胍，有导致患者乳酸性酸中毒的危险性；而胰岛素治疗也常导致低血糖的发生。因此，迫切需要研制出新的II型糖尿病治疗药物。
1995年，美国专利(US5424286)公开了一种从南美大毒蜥Gilka monster，Heloderma Horridum)的唾液中分离出来的一种含有39个氨基酸的多肽，Exendin-4
(H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2)。其结构与人的胰高血糖素(Glucagon)有48％的同源性，与人的GLP-1(胰高血糖素样肽-1)有53％的同源性。
研究表明，作为GLP-1的类似物，Exendin-4能够与GLP-1受体作用，通过刺激胰岛β细胞再生，促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的释放，减慢胃排空速率，抑制食物摄入。其促胰岛素分泌作用是根据血糖水平进行的，故可降低低血糖的发生率，且对其他促胰岛素分泌剂不敏感的II型糖尿病病人仍有降糖作用，同时GLP-1还可以减轻II型糖尿病患者的体重，是一类全新的糖尿病治疗药物。
2005年4月，美国礼来公司和Amylin公司共同开发的糖尿病药物倍它(Byetta，化学名Exenatide(人工合成的Exendin-4))获美国FDA批准上市。与此同时，国外许多制药公司如诺和诺德制药公司、默克制药公司也在争相研发与倍它属于同类型的药物。另外，国内外也少有对Exendin-4进行固相直接合成的相关文献，但还没有文献具体研究Exenatide相关纯化的方法，特别是规模化纯化Exenatide的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一条适于产业化纯艾塞那肽的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化纯艾塞那肽，并用阴离子交换转盐，纯度高且收率好，达到产业化要求，解决现有技术存在的缺陷。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种纯化艾塞那肽的方法，包括以下步骤：
1)将固相合成所得粗肽用注射用水溶解，用固定相为四烷基硅烷键合硅胶、八烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶柱，流动相为磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；
3)将纯化后的高纯度肽采用阴离子交换转成醋酸盐。
优选的方案是：所述的步骤1)和步骤3)之间还包括步骤2)将收集目的峰值的肽溶液减压旋蒸浓缩。
更为优选的方案是：所述A相的磷酸盐缓冲溶液pH为3.0至5.3之间。
更为优选的方案是：所述A相的磷酸盐缓冲溶液pH为3.5至4.3之间。
更为优选的方案是：所述色谱纯乙腈的浓度为10-65％，检测波长为230nm。
更为优选的方案是：所述色谱纯乙腈的浓度为15-55％。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
本发明提出的一条适于产业化纯艾塞那肽的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化纯艾塞那肽，并用阴离子交换转盐，不仅能得到HPLC纯度大于98.0％的精肽，而且能够规模化生产，达到纯度高、收率高、产业化的要求。
具体实施方式
实施例1
1、样品处理：将合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(浓度约为50mg/mL，用孔径为0.45μm滤膜过滤后收集滤液备用。
2、纯化：
纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：A相：磷酸二氢钠水溶液用分析纯的磷酸溶液调pH至3.5-4.3；B相：色谱纯乙腈。流速：50-70ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：20％～48％ 66-78min。进样量为1.3-2g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为26-40ml样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约50-100g/ml后备用。
3、转盐：取55g阴离子交换树脂Amberlite IRA-93置于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样10-20g，减压抽滤并收集滤液，滤液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约5-8g/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98％的醋酸艾塞那肽，纯化收率可达48％以上。
实施例2
1、样品处理：将合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(浓度约为50mg/mL，用孔径为0.45μm滤膜过滤后收集滤液备用。
2、纯化：
纯化条件：色谱柱：以四烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：A相：磷酸二氢钠水溶液用分析纯的磷酸溶液调pH至3.0-4.8；B相：色谱纯乙腈。流速：50-70ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：10％～35％ 50-75min。进样量为1.1-1.8g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为26-40ml样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约50-100g/ml后备用。
3、转盐：取50g阴离子交换树脂Wofatit AD-41置于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样10-20g，减压抽滤并收集滤液，滤液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约5-8g/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98％的醋酸艾塞那肽，纯化收率可达45％以上。
实施例3
1、样品处理：将合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(浓度约为50mg/mL，用孔径为0.45μm滤膜过滤后收集滤液备用。
2、纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：A相：磷酸二氢钠水溶液用分析纯的磷酸溶液调pH至3.8-5.3；B相：色谱纯乙腈。流速：50-70ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：15％～55％ 60-78min。进样量为1.5-2.0g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为30-35ml样品溶液。线性梯度洗脱，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约50-100g/ml后备用。
3、转盐：取55g阴离子交换树脂Amberlite IRA-93置于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样10-20g，减压抽滤并收集滤液，滤液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约5-8g/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98％的醋酸艾塞那肽，纯化收率可达52％以上。
实施例4
1、样品处理：相合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(浓度约为50mg/mL，用孔径为0.45μm滤膜过滤后收集滤液备用。
2、纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：15cm×25cm。流动相：A相：磷酸二氢钠水溶液用分析纯的磷酸溶液调pH至3.8-5.3；B相：色谱纯乙腈。流速：450-550ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：15％～65％ 70-88min。进样量为8-15g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为160ml-300ml样品溶液。线性梯度洗脱70-88min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于不超过37℃下减压旋蒸浓缩至约80-200g/ml后备用。
3、转盐：取105g阴离子交换树脂置Wofatit AD-41于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样30-40g，减压抽滤并收集滤液，滤液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约5-8g/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98％的醋酸艾塞那肽，纯化收率可达55％以上。
实施例5
1、样品处理：相合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(浓度约为50mg/mL，用孔径为0.45μm滤膜过滤后收集滤液备用。
2、纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×25cm。流动相：A相：磷酸二氢钠水溶液用分析纯的磷酸溶液调pH至3.8-5.3；B相：色谱纯乙腈。流速：1900-2200ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：15％～65％ 85-100min。进样量为45-65g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为900ml-1300ml样品溶液。线性梯度洗脱60-80min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约60-180g/ml后备用。
3、转盐：取210g阴离子交换树脂Amberlite IRA-93置于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，可上样50-60g，减压抽滤并收集滤液，滤液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约5-8g/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98％的醋酸艾塞那肽，纯化收率可达57％以上。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种纯化艾塞那肽的方法，包括如下步骤：
1)将固相合成所得粗肽用注射用水溶解，用固定相为四烷基硅烷键合硅胶、八烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶柱，流动相为磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；
2)将收集目的峰值的肽溶液减压旋蒸浓缩；
3)将纯化后的高纯度肽采用阴离子交换转成醋酸盐；
所述A相的磷酸盐缓冲溶液pH为3.0～5.3；
所述色谱纯乙腈的浓度为10-65％，检测波长为230nm。
2.如权利要求1所述纯化艾塞那肽的方法，其特征在于：所述A相的磷酸盐缓冲溶液pH为3.5～4.3。
3.如权利2所述纯化艾塞那肽的方法，其特征在于：所述色谱纯乙腈的浓度为15-55％。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述的阴离子交换法为通过采用能够提供醋酸根的阴离子交换树脂进行离子交换实现，所述的阴离子交换树脂是Amberlite IRA-93或Wofatit AD-41。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009101049870A CN101538323B (zh) | 2009-01-13 | 2009-01-13 | 一种纯化艾塞那肽的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009101049870A CN101538323B (zh) | 2009-01-13 | 2009-01-13 | 一种纯化艾塞那肽的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101538323A CN101538323A (zh) | 2009-09-23 |
| CN101538323B true CN101538323B (zh) | 2012-05-09 |
Family
ID=41121729
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009101049870A Expired - Fee Related CN101538323B (zh) | 2009-01-13 | 2009-01-13 | 一种纯化艾塞那肽的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101538323B (zh) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102219849B (zh) * | 2011-04-27 | 2013-08-28 | 滨海吉尔多肽有限公司 | 一种大规模分离纯化艾塞那肽的方法 |
| UA116217C2 (uk) | 2012-10-09 | 2018-02-26 | Санофі | Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону |
| ES2688367T3 (es) | 2012-12-21 | 2018-11-02 | Sanofi | Derivados de exendina-4 como agonistas duales de GLP1/GIP o trigonales de GLP1/GIP/glucagón |
| TW201609795A (zh) | 2013-12-13 | 2016-03-16 | 賽諾菲公司 | 作為雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑的艾塞那肽－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）胜肽類似物 |
| EP3080152A1 (en) | 2013-12-13 | 2016-10-19 | Sanofi | Non-acylated exendin-4 peptide analogues |
| EP3080154B1 (en) | 2013-12-13 | 2018-02-07 | Sanofi | Dual glp-1/gip receptor agonists |
| WO2015086733A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Sanofi | Dual glp-1/glucagon receptor agonists |
| TW201625668A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物 |
| TW201625669A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑 |
| TW201625670A (zh) | 2014-04-07 | 2016-07-16 | 賽諾菲公司 | 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑 |
| CN103992401B (zh) * | 2014-04-30 | 2017-05-17 | 杭州阿诺生物医药科技股份有限公司 | 一种制备艾塞那肽的方法 |
| CN103995062B (zh) * | 2014-05-14 | 2015-06-17 | 浙江圣兆药物科技股份有限公司 | 一种高效液相色谱法测定艾塞那肽及其杂质的方法 |
| US9932381B2 (en) | 2014-06-18 | 2018-04-03 | Sanofi | Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists |
| AR105319A1 (es) | 2015-06-05 | 2017-09-27 | Sanofi Sa | Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico |
| TW201706291A (zh) | 2015-07-10 | 2017-02-16 | 賽諾菲公司 | 作為選擇性肽雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑之新毒蜥外泌肽（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）衍生物 |
-
2009
- 2009-01-13 CN CN2009101049870A patent/CN101538323B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101538323A (zh) | 2009-09-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101538323B (zh) | 一种纯化艾塞那肽的方法 | |
| CN103613655B (zh) | 一种低成本纯化艾塞那肽的方法 | |
| CN108640985B (zh) | 一种纯化索玛鲁肽的方法 | |
| CN102219849B (zh) | 一种大规模分离纯化艾塞那肽的方法 | |
| CN101372504B (zh) | 一种纯化去氨加压素的方法 | |
| CN101440127B (zh) | 高纯度盐酸万古霉素的制备方法 | |
| CN102070690B (zh) | 一种同时制备腺苷、虫草素、n6-(2-羟乙基)腺苷化学对照品的方法 | |
| CN101787071B (zh) | 一种伐普肽的纯化方法 | |
| CN112661815B (zh) | 一种Tirzepatide的纯化方法 | |
| CN102690329B (zh) | 一种戈舍瑞林多肽的纯化生产方法 | |
| CN105017381A (zh) | 一种纯化利拉鲁肽的方法 | |
| CN108794618A (zh) | 一种纯化利拉鲁肽的方法 | |
| CN102827258A (zh) | 一种纯化恩夫韦肽的方法 | |
| CN101108871A (zh) | 从大枣中提取环磷酸腺苷的工艺方法 | |
| CN101463080B (zh) | 一种纯化奈西利肽的方法 | |
| CN103275209A (zh) | 制备利拉鲁肽的方法 | |
| CN101798334B (zh) | 一种人甲状旁腺激素(1-34)的纯化方法 | |
| CN108210566A (zh) | 一种柠檬苦素类提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用 | |
| CN102863517B (zh) | 一种戈舍瑞林的纯化方法 | |
| CN101525382B (zh) | 一种纯化普兰林肽的方法 | |
| CN101596183A (zh) | 一种紫锥菊口服液及其制备方法 | |
| CN111269309B (zh) | 一种glp-1类似多肽的纯化方法 | |
| CN116444645A (zh) | 一种替西帕肽制备方法 | |
| CN111363024A (zh) | 多肽的纯化方法 | |
| CN101549010A (zh) | 一种补骨脂总苷提取物的制备方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120509 Termination date: 20220113 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |