MX2014007626A - Compuestos anti-diabetes. - Google Patents

Compuestos anti-diabetes.

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Gopinath Vedachalam Annathur
Palani Balu
Rory Francis Finn
Jie Huang
Oliver Alexandre Laurent
Nancy Jane Levin
Nicholas Gary Luksha
Joseph Patrick Martin Jr
Haim Moskowitz
Moorthy Sitharamaiah Suriyanarayana Lanki
Gregory Allan Waszak
Jin Xie
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Abstract

La presente invención proporciona una composición de la fórmula: [FGF21-1er Iigador]-[Ab]-[2do Ligador-Ex4]; en donde FGF21 es un homólogo de FGF2I; y Ex4 es un homólogo de Exendin4; y Ab es un anticuerpo catalítico de aldolasa o porción de enlace de antígeno del mismo; y el ler ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de proteína en FGF21 y para un sitio de combinación del anticuerpo, y el 2do ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de péptido en Ex4 y a un sitio de combinación del anticuerpo, y en donde el primer ligador y el segundo ligador son iguales o diferentes. Se proporcionan varios usos de los compuestos, que incluyen métodos para prevenir o tratar la diabetes o condiciones relacionadas con la diabetes.

Description

COMPUESTOS ANTI-DI ABETES La presente invención se refiere a compuestos novedosos que promueven la secreción de insulina y menores niveles de glucosa en sangre, y métodos para elaborar y utilizar estos compuestos.
ANTECEDENTES La diabetes Tipo II es la forma más frecuente de la diabetes. La enfermedad es ocasionada por la resistencia a la insulina y la falla de la cél u I a ß , lo cual resulta en una reducida secreción de insulina estimulada por la glucosa. Se ha identificado que el factor de crecimiento de fibroblasto (FGF)21, un miembro de la familia FGF, como un regulador metabolico y es expresado de manera preferente en el hígado y el tejido adiposo y ejerce sus actividades biológicas a través de un complejo de superficie celular compuesto de FGFRIc y ß-Kiotho en las células objetivo tales como los tejidos hepático y adiposo (WO0136640, y WO0118172) . Se considera que el complejo receptor activa la señalización citoplásmica y sobre-regula la expresión GLUT1 a través de la vía Ras/MAP cinasa. Sus habilidades para proporcionar control de glucosa y lípido sostenido, y mejorar la sensibilidad insulina y la función de célula-ß, sin ocasionar efectos adversos aparentes en las instalaciones pre-clínicas, han convertido a FGF21 en un atractivo agente terapéutico para la diabetes tipo II y sus trastornos metabólicos asociados.
Se han realizado varios esfuerzos para el desarrollo de terapias en base a FGF21. Los documentos WO2006065582 , WO2006028714, WO2006028595, y WO2005061712 se refieren a muteínas de FGF21, que comprenden sustituciones aminoácido individuales. WO2006078463 está dirigido a un método para tratar enfermedad cardiovascular utilizando FGF21. WO2005072769 se refiere a métodos para tratar la diabetes utilizando combinaciones de FGF21 y tiazolidindiona. WO03059270 se refiere a métodos para reducir la mortalidad de pacientes críticamente enfermos que comprende administrar FGF21. WO03011213 se refiere a un método para tratar la diabetes y la obesidad que comprende administrar FGF21.
Sin embargo, muchas de estas terapias propuestas, tienen el problema de que FGF21 tiene una vida media in vivo de entre 1.5 y 2 horas en seres humanos. Se han realizado ciertos intentos para superar esta desventaja. WO2005091944, WO2006050247 y WO2008121563 describen moléculas de FGF21 enlazadas a PEG a través de residuos de Usina o cisteína, grupos glicosilo y residuos aminoácido no-naturales, respectivamente. WO2005113606 describe moléculas de FGF21 fusionadas de manera recombinante a través de su extremo-C a moléculas de albúmina e inmunoglobulina utilizando ligadores de poliglicina.
Sin embargo, el desarrollo de conjugados de proteína en productos farmacéuticos útiles, con una buena relación costo-beneficio presenta un número de retos significativos y con frecuencia competitivos: se debe buscar un equilibrio entre la eficacia in vivo, la vida media in vivo, la estabilidad para almacenamiento in vitro, y la facilidad y eficiencia de elaboración, incluyendo la eficiencia y especificidad de la conjugación. En general, es un imperativo que el proceso de conjugación no elimine ni reduzca de manera significativa la acción biológica deseada de la proteína en cuestión. Las interacciones proteína-proteína requeridas para el funcionamiento pueden requerir que múltiples regiones de la proteína actúen en concordancia, y la alteración de cualquiera de estas con la presencia cercana de un conjugado puede interferir con el o los sitios activos, u ocasionar suficientes alteraciones a la estructura terciaria a fin de reducir la función de sitio-activo. A menos de que la conjugación sea a través del extremo N' o C, se puede requerir de las mutaciones internas para facilitar el enlace. Estas mutaciones pueden tener efectos im predecibles en la estructura y función de la proteína. Existe por lo tanto una necesidad de agentes terapéuticos en base a FGF21 alternativos.
Las incretinas son compuestos que estimulan la secreción de insulina dependiente de glucosa e inhiben la secreción de glucagón, han surgido como atractivos candidatos para el tratamiento de la diabetes tipo II. la amida de péptido (7-36) de tipo glucagón (GLP1) es uno de los miembros de la familia de la incretina, y ha demostrado incrementar la secreción de insulina, reducir la secreción de glucagón, estimular la transcripción de gen pro-insulina, desacelerar el tiempo de vaciado gástrico y reducir la ingesta alimenticia (WO98019698) . GLP1 ejerce sus efectos fisiológicos mediante enlace al receptor de péptido 1 de tipo glucagón (GLP1R), un receptor de dominio de transmemebrana siete putativo.
Una desventaja del uso terapéutico de GLP1 es su corta vida media in vivo (1-2 minutos). Esta breve vida media es el resultado de la rápida degradación del péptido mediante dipeptidil peptidasa 4 (DPP-IV). Esto ha conducido a la identificación de homólogos GLP1 que exhiben incrementadas vidas medias en tanto que conservan la habilidad para agonizar la actividad GLP1R. Los ejemplos de estos homólogos incluyen exendin4 y GLP1-Gly8.
WO2009020802 describe un método para reducir el peso corporal que comprende administrar un compuesto de FGF21 en combinación con un compuesto de GLP1.
La referencia a cualquier técnica en esta especificación no es, y no será considerada como, un reconocimiento de cualquier forma o sugerencia de que la técnica referida forma parte del conocimiento general común.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En ciertos aspectos, la invención proporciona una composición de la fórmula: [FGF21]-[1er Ligador]-[Ab]-[2nd Ligador]-[Ex4] en donde FGF21 es un homólogo FGF21; y Ex4 es un homólogo Exendin4; y Ab es un anticuerpo catalítico de aldolasa o porción de enlace de antígeno del mismo; y el 1er ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de proteína en FGF21 y al sitio de combinación del anticuerpo, y el 2do ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de péptido en Ex4 y al sitio de combinación del anticuerpo, y en donde el primer ligador y el segundo ligador son iguales o diferentes; o estereoisómeros, tautómeros, solvatos, profármacos, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
En ciertos aspectos, la presente invención se refiere a una composición que comprende una molécula FGF21 fijada de manera covalente a un primer sitio de combinación de un anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo a través de un primer ligador, en donde el primer ligador es fijado de modo covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de proteína dentro de FGF21, y que comprende además un homólogo de Exendin4 fijado de manera covalente a un segundo sitio de combinación del anticuerpo a través de un segundo ligador, en donde el segundo ligador es fijado de modo covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de péptido dentro del homólogo de Exendin4; o estereoisómeros, tautómeros, solvatos, profármacos, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
En ciertos aspectos, la invención comprende la formula: [FGF21]-[1er Ligador]-[Anticuerpo]-[2do-Ligador]-[Ex4] en donde FGF21 es un homólogo de FGF21, y puede ser seleccionado a partir del grupo que consta de NOs ID SEC: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24; y Ex4 es un homólogo de Exendin4, y puede ser seleccionado a partir del grupo que consta de NOs ID SEC: 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, y 72, y el Anticuerpo es un anticuerpo catalítico de aldolasa o porción de enlace de antígeno del mismo; y el 1er ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de proteína en FGF21 y al sitio de combinación del anticuerpo, y el 2d0 ligador es fijado de modo covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de péptido en Ex4 y al sitio de combinación del Anticuerpo, y en donde el primero y segundo ligador son iguales o diferentes. Cada uno del 1ro y 2d° ligador puede ser de manera independiente seleccionado a partir del grupo que consta de L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9 y L10.
El residuo de enlace de proteína puede ser cisteína o lisina. El residuo de enlace de proteína puede estar ubicado en una posición seleccionada a partir del grupo que consta de números de residuo de aminoácido 56, 59, 69, 79, 86, 122, 125 y 129, de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 1. El residuo de enlace de proteína puede estar ubicado en una posición seleccionada a partir del grupo que consta de números de residuo de aminoácido 56, 59, 86, and 122 de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 1. El residuo de enlace de proteína puede ser ubicado en una position seleccionada a partir del grupo que consta del residuo 79, 125 y 129 de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 1. El residuo de enlace de proteína puede ser ubicado en una posición seleccionada a partir del grupo que consta de los residuos 125 y 129 de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 1.
La cadena lateral del residuo de enlace de proteína puede comprender un grupo tiol. El residuo de enlace de proteína puede ser cisteína.
La molécula FGF21 puede comprender NO ID SEC: 3. La molécula FGF21 puede comprender NO ID SEC: 4. La molécula FGF21 puede comprender una secuencia seleccionada a partir del grupo que consta de NO ID SEC: 3, NO ID SEC: 4, NO ID SEC: 5, NO ID SEC: 6, NO ID SEC: 7, NO ID SEC: 8, NO ID SEC: 9, NO ID SEC: 10, NO ID SEC: 11 , NO ID SEC: 12, y NO ID SEC: 13.
El residuo de enlace de proteína puede estar ubicado en la posición 125 de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 1. La molécula FGF21 puede comprender una secuencia seleccionada a partir de NO ID SEC: 3, NO ID SEC: 4, NO ID SEC: 5, NO ID SEC: 6, y NO ID SEC: 7. En ciertas modalidades, la secuencia FGF21 es NO ID SEC: 7.
El residuo de enlace de proteína puede estar ubicado en la posición 129 de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 1. La molécula FGF21 puede comprender una secuencia seleccionada a partir de NO ID SEC: 3, NO ID SEC: 4, NO ID SEC: 8, NO ID SEC: 9, y NO ID SEC: 10. En ciertas modalidades, la secuencia FGF21 es NO ID SEC: 10. La molécula FGF21 puede comprender NO ID SEC: 8, NO ID SEC:9 o NO ID SEC: 10.
El residuo de enlace de proteína puede estar ubicado en la posición 79 de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 1. La molécula FGF21 puede comprender una secuencia seleccionada a partir de NO ID SEC: 3, NO ID SEC: 4, NO ID SEC: 11 , NO ID SEC: 12, y NO ID SEC: 13. En ciertas modalidades, la secuencia FGF21 es NO ID SEC: 13.
En ciertas modalidades, el residuo de enlace de proteína puede estar ubicado en una posición seleccionada a partir del grupo que consta de 1 , 2, 56, 59, 69, y 122 de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 1. En ciertas modalidades, el residuo de enlace de proteína puede estar ubicado en una posición seleccionada a partir del grupo que consta de 1 , 2, 56, 59, and 122 de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 1. El residuo de enlace de proteína puede ser Usina. La molécula FGF21 puede comprender NO ID SEC: 17. La molécula FGF21 puede comprender una secuencia seleccionada a partir del grupo que consta de NO ID SEC: 18, NO ID SEC: 19, NO ID SEC: 20, NO ID SEC: 21 , y NO ID SEC: 23.
En ciertos aspectos, el homólogo Exendin4 puede comprender la fórmula: Hx2 EGTFT8DL8KQMEEEAVRLFIEWLKNGGP88GAPPP8x40 (NO ID SEC: 38 en donde x2 es Aib y x40 es un residuo de enlace de péptido que comprende cualquier aminoácido o está ausente y en donde uno de L10, S11, K12, Q13, M14, E16, E17, V19, R20, L2 , E24, L26, K27 ?28 S32 S33; Q34 ^5 p36 _ p38 _ 539 Q ?40 co m p re n d e Q ES sustituido con un residuo de enlace de péptido [LR] de modo que el residuo de enlace de péptido comprende una cadena lateral nucleofílica o grupo carboxilo de extremo-C enlazado de manera covalente al segundo sitio de combinación del anticuerpo a través del segundo ligador, y en donde es enlazable a través de la cadena lateral nucleofílica, el residuo de péptido que es seleccionado a partir del grupo que consta de K, K(SH), K(S-MAL) , R, Y, C, T, S, homocisteina, homoserina, Dap, y Dab.
El residuo de enlace de péptido puede estar ubicado en una posición seleccionada a partir del grupo que consta de los números de residuo aminoácido 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 24, 27, 28, 39, y 40, de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 38. En ciertas modalidades, el residuo de enlace de péptido está ubicado en una de las posiciones de 12, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 21, 24, de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 38. En ciertas modalidades, el homólogo Exendin4 comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consta de NO ID SEC: 46, NO ID SEC: 48, NO ID SEC: 49, NO ID SEC: 50, NO ID SEC: 51, NO ID SEC: 52, NO ID SEC: 53, NO ID SEC: 54, y NO ID SEC: 55.
En ciertas modalidades, el residuo de enlace de péptido está ubicado en una de las posiciones de 13, 14, 16, 17, 19, 20, 21, 24, de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 38. En ciertas modalidades, el homólogo Exendin4 comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consta de NO ID SEC: 46, NO ID SEC: 48, NO ID SEC: 49, NO ID SEC: 50, NO ID SEC: 51 , NO ID SEC: 52, NO ID SEC: 53, y NO ID SEC: 54 En ciertas modalidades, el residuo de enlace de péptido está ubicado en una de las posiciones de 12, 14, 17, 19, 20, o 21 , de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 38. En ciertas modalidades, el homólogo Exendin4 comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consta de NO ID SEC: 48, NO ID SEC: 49, NO ID SEC: 50, NO ID SEC: 51 , NO ID SEC: 53, y NO ID SEC: 55.
En ciertas modalidades, el residuo de enlace de péptido está ubicado en una de las posiciones de 12, 14, 19, 20, 21 , o 40 de acuerdo con la numeración de SEQ ID NO: 38.
El homólogo Exendin4 puede comprender NO ID SEC: 60. En ciertas modalidades, el homólogo Exendin4 comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consta de NO ID SEC: 48, NO ID SEC: 49, NO ID SEC: 50, NO ID SEC: 53, NO ID SEC: 55, NO ID SEC: 60, NO ID SEC: 61 , NO ID SEC: 62, NO ID SEC: 63, NO ID SEC: 64, NO ID SEC: 65, NO ID SEC: 66, NO ID SEC: 67, NO ID SEC: 68, NO ID SEC: 69, NO ID SEC: 70, NO ID SEC: 71 , y NO ID SEC: 72.
El homólogo Exendin4 puede comprender NO ID SEC: 60 cuando x40 está ausente. En ciertas modalidades, el homólogo Exendin4 comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consta de NO ID SEC: 48, NO ID SEC: 49, NO ID SEC: 50, NO ID SEC: 53, NO ID SEC: 55, NO ID SEC: 60, NO ID SEC: 61 , NO ID SEC: 62, NO ID SEC: 63, NO ID SEC: 64, NO ID SEC: 65, NO ID SEC: 66, NO ID SEC: 67, NO ID SEC: 68, NO ID SEC: 69, and NO ID SEC: 70.
En ciertas modalidades, el residuo de enlace de péptido está ubicado en una de las posiciones de 14, 19, 20, o 21, de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 60. En ciertas modalidades, el homólogo Exendin4 comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consta de NO ID SEC: 48, NO ID SEC: 49, NO ID SEC: 50, NO ID SEC: 53, NO ID SEC: 63, NO ID SEC: 64, NO ID SEC: 65, NO ID SEC: 66, NO ID SEC: 67, NO ID SEC: 68, NO ID SEC: 69, y NO ID SEC: 70.
En ciertas modalidades, el residuo de enlace de péptido está ubicado en la posición 14, de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 60. En ciertas modalidades, el homólogo Exendin4 comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consta de NO ID SEC: 53, NO ID SEC: 63, NO ID SEC: 64 y NO ID SEC: 77. En ciertas modalidades, el homólogo Exendin4 comprende NO ID SEC: 53. En ciertas modalidades, el homólogo Exendin4 comprende NO ID SEC: 63. En ciertas modalidades, el homólogo Exendin4 comprende NO ID SEC: 64. En ciertas modalidades, el homólogo de Exendin4 comprendes NO ID SEC: 77.
El residuo de enlace de péptido puede comprender una cadena lateral nucleofílica enlazada de manera covalente al segundo ligador. El residuo de enlace de péptido puede ser seleccionado a partir del grupo que consta de K, Y, C, Dap, Dab, K(SH) y K(S- AL). La cadena lateral del residuo de enlace de péptido puede comprender un grupo tiol.
El residuo de enlace de péptido [LR] puede comprender la estructura: K(S-MAL) donde u es 1 , 2 o 3, y L es el segundo ligador. En ciertas modalidades u es 1. En ciertas modalidades, u es 2. En ciertas modalidades, u es 3. A menos de que se indique de otro modo, cuando se usa K(SMAL)en los ejemplos, u = 2.
En ciertas modalidades, el residuo de enlace de péptido comprende la estructura K(SH), en donde u es 1, 2 o 3: En donde u = 2, K(SH) = A menos de que se indique lo contrario, cuando se usa K(SH) en los ejemplos y listado de secuencia, u = 2 En ciertos aspectos, el homólogo Exendin4 comprende además un grupo de nivelación amino-terminal R1 seleccionado a partir del grupo que consta de CH3, C(0)CH3, C(0)CH2CH3, C(0)CH2CH2CH3, o C(0)CH(CH3)CH3. En ciertos aspectos, el homólogo Exendin4 comprende además un grupo de nivelación de término carboxi R2 seleccionado a partir del grupo que consta de OH, NH2, NH(CH3), NHCH2CH3, NHCH2CH2CH3, NHCH(CH3)CH3l NHCH2CH2CH2CH3, NHCH(CH3)CH2CH3, NHC6H5, NHCH2CH2OCH3, NHOCH3, NHOCH2CH3, un grupo protector carboxi, un grupo de ácido graso lípido o un carbohidrato. En ciertas modalidades, R1 es C(0)CH3. En ciertas modalidades, R2 es NH2. En modalidades em donde el péptido Ex4 comprende NO ID SEC: 64 y R1 es C(0)CH3 y R2 es NH2, el péptido Ex4 puede ser designado como NO ID SEC: 77.
En ciertos aspectos, el homólogo de Exendin4 comprende la fórmula: Ó Cada uno del primer ligador y el segundo ligador desempeñan un rol crítico en la presentación de la proteína y el péptido respectivamente. Es esencial que la composición y la longitud del ligador sean optimizadas tanto para la proteína como para el péptido a fin de aumentar al máximo la habilidad de cada uno para interactuar con su respectivo cognado. Una complicación adicional con la molécula bifuncional asimétrica (es decir, una que presenta una proteína/péptido diferente en cada uno de los dos brazos) es la importancia de que la disposición ligador-péptido o funcionalidad de uno de los brazos no interfiera con la disposición I igador-proteína o funcionalidad del otro brazo, y vice versa. En ciertas modalidades, una mayor longitud de ligador tiene la tendencia a reducir la interferencia entre los diferentes brazos. Sin embargo, en equilibrio contra esto, existe la tendencia de que ligadores más grandes ofrezcan protección contra proteasas. Además, en ciertas circunstancias, un ligador más corto puede permitir que un péptido o una proteína sea presentada de manera óptima para interacción de cognado: incrementar la longitud del ligador puede incrementar la flexibilidad, y así pierde esta ventaja. De manera inversa, se mejoran algunas interacciones de proteína o péptido con el objetivo respectivo a través de una cierta cantidad flexibilidad en el ligador. Por tanto, es crítico encontrar la longitud de ligador y composición óptimas para cada proteína/péptído, y equilibrar cada uno de manera holística a través de toda la molécula ensamblada a fin de hallar el correcto equilibrio entre la vida media y la actividad de cada proteína y péptido. Todo esto debe ponerse en contraposición después con el costo de manufactura adicional y la complejidad inherente de tener un ligador diferente para cada proteína/péptido. Utilizando el mismo ligador para cada molécula active tienen eficiencias de costo y manufactura evidente.
Se describen ciertos ligadores adecuados en US2009098130, los contenidos del cual están incorporados a la presente mediante referencia. En particular, se incluyen aquí aspectos de US2009098130 que pertenecen a las formulas generales que describen ligadores, estructura de ligador específico, síntesis de ligadores y combinaciones de diferentes elementos de los grupos X, Y (que también pueden ser escritos como yy) y Z como se describe de manera específica y general en ese documento. El primero y/o segundo ligador puede ser lineal o ramificado, e incluye de manera opcional uno o más grupos carbocíclicos o heterocíclicos. La longitud de ligador se puede visualizar en términos del número de átomos lineales, con porciones cíclicas tales como los anillos aromáticos y similares para ser contados al tomar la ruta más corta alrededor del anillo. En ciertas modalidades, el primero y/o segundo ligador tiene una extensión lineal de entre 5-15 átomos, en otras modalidades 15-30 átomos, en otras modalidades más 30-50 átomos, en otras modalidades más 50-100 átomos, y en otras modalidades más 100-200 átomos. Otras consideraciones de ligador incluyen el efecto sobre las propiedades físicas o farmacocinéticas del compuesto resultante, tales como solubilidad, lipofilicidad, hidrofilicidad, hidrofobicidad, estabilidad (más o menos estable así como la degradación planeada), rigidez, flexibilidad, inmunogenicidad, y modulación de enlace de anticuerpo, la habilidad para ser incorporado dentro de una micela o liposoma, y similares.
El primero y/o segundo ligador pueden comprender la fórmula: X-Y-Z, en donde X es una cadena conectora biológicamente compatible que incluye cualquier átomo seleccionado a partir del grupo que consta de C, H, N, O, P, S, F, Cl, Br, e I, y puede comprender un polímero o co-polímero de bloque, y está enlazado de manera covalente al residuo de enlace de proteína y/o el residuo de enlace de péptido en donde el ligador es lineal, Y es un grupo de reconocimiento opcionalmente presente que comprende por lo menos una estructura de anillo; y Z es una porción de unión que comprende un enlace covalente a una cadena lateral de aminoácido en un sitio de combinación de un anticuerpo.
Cuando está presente, Y puede tener la estructura opcionalmente sustituida: en donde a, b, e, d, y e son de manera independiente carbono o nitrógeno; f es carbono, nitrógeno, oxigeno, o azufre; Y es fijado a X y Z de modo independiente en cualquiera de las dos posiciones de anillo de valencia suficiente; y no más de cuatro de a, b, e, d, e, o f son de manera simultánea nitrógeno y de preferencia cada uno de a, b, e, d, y e en la estructura de anillo es carbono. En ciertos aspectos, Y puede ser fenilo. Aunque no se desea enlazarse a teoría alguna, se considera que el grupo Y puede ayudar en la colocación del grupo reactive dentro de un sitio de combinación del anticuerpo de modo que el grupo Z puede reaccionar con una cadena lateral de aminoácido.
El primero y/o segundo ligador puede ser diseñado de manera que contenga un grupo reactive capaz de formar de manera covalente o no covalente un enlace con una macromolécula, tal como un anticuerpo, proteina, o fragmento de la misma. El grupo reactivo es seleccionado para uso con un residuo reactive en un sitio de combinación particular. Por ejemplo, una porción química para modificación por medio de un anticuerpo de aldolasa puede ser una cetona, dicetona, beta lactama, halocetona de éster activo, lactona, anhídrido, maleimida, alfa-haloacetamida, ciclohexil dicetona, epóxido, aldehido, amidina, guanidina, ¡mina, enamina, fosfato, fosfonato, epóxido, aziridina, tioepóxido, dicetona enmascarada o protegida (cetal por ejemplo), lactama, halocetona, aldehido, y similares. En ciertas modalidades de la presente invención en el enlace de un péptido de la invención con un ligador, Z es el grupo reactivo.
En ciertas modalidades, Z, antes de la conjugación con la cadena lateral de un residuo en el sitio de combinación de un anticuerpo, incluye uno o más grupos C = 0 colocados para formar una azitidinona, dicetona, una acil beta-lactama, un éster activo, una halocetona, un grupo ciclohexil dicetona, un aldehido, una maleimida, un alqueno activado, un alquileno activado o, en general, una molécula que comprende un grupo saliente susceptible a desplazamiento nucleofílico o electrof ílico. Otros grupos pueden incluir lactona, un anhídrido, una alfa-haloacetamida, una ¡mina, una hidrazida, o un epóxido. Los grupos reactivos electrofílicos ligadores ilustrativos que se enlazan de manera covalente a un grupo nucleofílico reactivo (por ejemplo, una cadena lateral de lisina o cisteína) en un sitio de combinación de anticuerpo incluye acil beta-lactama, dicetona simple, éster activo de succinimída, maleimida, haloacetamida con ligador, halocetona, ciclohexil dicetona, aldehido, amidina, guanidina, imina, enamina, fosfato, fosfonato, epóxido, aziridina, tioepóxido, una dicetona enmascarada o protegida (un cetal por ejemplo), lactama, sulfonato, y similares, grupos C = 0 enmascarados tales como ¡minas, cetales, acétales, y cualquier otro grupo electrof ílico conocido. En ciertas modalidades, el grupo reactivo incluye uno o más grupos C = 0 colocados para formar acil beta-lactama, dicetona simple, éster activo de succinimida, maleimida, haloacetamida con ligador, halocetona, ciclohexil dicetona, o aldehido. Z puede ser un alquilo sustituido, cicloa Iquilo sustituido, arilo sustituido, a r i I a I q u i I o sustituido, heterociclo sustituido, o heterocicloalquilo sustituido, en donde por lo menos un sustituyente es una porción 1 ,3-dicetona, una acil beta- lactama, un éster activo, una alfa-halocetona, un aldehido, una maleimida, una lactona, un anhídrido, una alfa-haloacetamida, una amina, una hidrazida, o un epóxido. En ciertos aspectos, el grupo Z es enlazado de manera covalente a una adaptación de macromolécula que puede proporcionar incrementada vida media a los péptidos de la invención. En ciertos aspectos, el grupo Z si está presente es enlazado de manera covalente al sitio de combinación de un anticuerpo.
En ciertos aspectos, antes de la conjugación (por ejemplo, con el sitio de combinación de un anticuerpo), Z tiene la estructura: en donde q = 0-5. q puede ser 1 o 2. q puede ser 1. En otros aspectos, q puede ser 2.
En ciertos aspectos, después de la conjugación con el sitio de combinación de anticuerpo, Z tiene la estructura: en donde q = 0-5 y Anticuerpo-N- es un enlace covalente a una cadena lateral en un sitio de combinación de un anticuerpo (en donde el NH es el grupo e-amino de una cadena lateral de Usina en el sitio de combinación del anticuerpo), q puede ser 1 o 2. q puede ser 1. En otros aspectos, q puede ser 2.
X puede ser un grupo que comprende tres componentes; Xp-Xs-Xy, en donde Xp es un grupo específicamente adaptado para ser combinable con la cadena lateral del residuo de enlace de proteína de la proteína FGF21 y/o el residuo de enlace de péptido de un homólogo Exendin4, Xs es una región separadora del grupo X, y Xy es un grupo adaptado para enlazarse al grupo Y. En ciertos aspectos, Xy es seleccionado a partir de un enlace amida, un enlace enamina, o un enlace guanidinio. Xy puede ser seleccionado a fin de proporcionar una molécula de hidrógeno adyacente (dentro de dos átomos) al grupo Y. en tanto que nos e desea enlazarse a teoría, se considera que el átomo H puede ayudar en el reconocimiento de grupo Y de un paquete hidrofóbico a través de interacción de enlace-H, en particular con respecto al paquete hidrofóbico de la hendidura de enlace de un anticuerpo catalítico, tal como h38C2. Por tanto, el enlace amida, por ejemplo, puede estar orientado de modo que el grupo NH es enlazado directamente al grupo Y, proporcionado el H del grupo NH para el enlace hidrógeno. De manera alternativa, el grupo C = 0 de una amida puede ser enlazado al grupo Y, con el H del grupo NH y 2 átomos adyacentes al grupo Y, aunque disponible aún para enlace-H. En ciertas modalidades, Xy está ausente. En ciertas modalidades el grupo Xy tiene la formula: ciertos aspectos, Xs es seleccionado de modo que Xs proporciona grupos altamente reactivos. Xs puede ser seleccionado a fin de proporcionar una longitud general del grupo Xs de entre 2-15 átomos. Xs puede ser seleccionado de modo que la longitud general del grupo X está entre 2 y 10 átomos. Xs puede ser seleccionado de modo que la longitud general del grupo X es 4-8 átomos. Xs puede ser seleccionado de modo que la longitud general del grupo X es 5 átomos. Xs puede ser seleccionado de manera que la longitud general del grupo X es de 6 átomos. En ciertos aspectos, Xs puede comprender una de las siguientes fórmulas: en donde n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, y m está presente o ausente; n puede ser 1, 2, 3, 4, 5, o 6; n puede ser 1, 2, 3, o 4; n puede ser 1; n puede ser 2; n puede ser 3; n puede ser 4.
En ciertos aspectos, Xs comprende una de las siguientes fórmulas: (ejemplificado en L1 y L2) (ejemplificado en L3 y L7) (ejemplificado en L4) (ejemplificado en L5) (ejemplificado en L6) (ejemplificado en L8) Xp idealmente es seleccionado a fin de permitir una estrategia de enlace covalente direccional específico al residuo de enlace de proteína de la proteína FGF21 y/o el residuo de enlace de péptido del homólogo Exendin4. Por ejemplo, en donde el residuo de enlace comprende un grupo nucleofílico, Xp puede ser un grupo electrof ílico y vice versa. Por ejemplo, si la cadena lateral residuo de enlace comprende un grupo amina, tal como K, H, Y, ornitina, Dap, o Dab, Xp puede ser COOH, u otro electrófilo de reactividad similar. Si el residuo de enlace es DorE, Xp puede comprender un grupo nucleofílico, tal como un grupo amina. Cualquiera de estas estrategias permite que se forme un enlace covalente entre el grupo Xp y el residuo de enlace a través de estrategias de formación de enlace amida. Cuando el residuo de enlace comprende un grupo amina, Xp puede comprender la fórmula: Cuando el residuo de enlace es C, los homólogos de C, u otro grupo tiol que contiene residuos tales como (SH), Xp puede comprender un grupo maleimida (o similar) que permite una estrategia de reacción de adición tiol-maleimida para enlazar de manera covalente el grupo Xp al residuo de enlace. En ciertos aspectos, Xp puede comprender un grupo tiol, permitiendo que se forme un enlace disulfuro entre el residuo de enlace y el grupo Xp. En ciertos aspectos, Xp puede ser maleimida: en donde la flecha indica el punto de unión al residuo de enlace y la línea paralela representa la unión al grupo Y del ligador Cuando el residuo de enlace es un residuo cisteína u otra cadena lateral que tiene tiol, el mecanismo de conjugación es como sigue: en donde PLR es el residuo de enlace de proteína o residuo de enlace de péptido, y S es el átomo de azufre del grupo tiol de la cisteína u otro aminoácido que tiene tiol, como K(SH).
En ciertos aspectos, el grupo Xp comprende una maleimida sustituida: Producto mayor Producto menor En ciertos aspectos, los componentes XY del ligador antes d la conjugación y después de la conjugación se pueden seleccionar partir de los siguientes: XY 1 Los componentes XY-1, XY-2, XY-3, y XY-4 son de particular utilidad en modalidades que conjugan para una cadena lateral que tiene grupo tiol en el residuo de enlace.
En ciertas modalidades, el ligador puede ser Ligador-1 (L1): Cuando L1 es conjugado para PLR, el complejo L1-PLR puede comprender la fórmula Cuando L1 es conjugado para el anticuerpo y PLR, el complejo anticuerpo-L1 -PLR puede comprender la fórmula En ciertas modalidades, el ligador puede ser Ligador-2 (L2): Cuando L2 es conjugado para PLR, el complejo L2-PLR puede comprender una de las siguientes fórmulas: Cuando L2 es conjugado para el anticuerpo y PLR, el complejo anticuerpo-L2-PLR puede comprender una de las siguientes fórmulas: En ciertas modalidades, el ligador puede ser Ligador-3 (L3): Cuando L3 es conjugado para PLR, el complejo L3-PLR puede comprender una de las siguientes fórmulas Cuando L3 es conjugado para el anticuerpo y PLR, el complejo anticuerpo-L3-PLR puede comprender la fórmula: ciertas modalidades, el ligador puede ser Ligador-4 (L4) Cuando se conjuga para el PLR, el complejo L4-PLR puede comprender la fórmula: L4- PLR Cuando L4 es conjugado para el anticuerpo y PLR, el complejo anticuerpo-L4-PLR puede comprender la fórmula: En ciertas modalidades, el ligador puede ser Ligador-5 (L5): Cuando L5 es conjugado para PLR, el complejo L5-PLR puede comprender la fórmula: Cuando L5 es conjugado para el anticuerpo y molécula PLR, el complejo anticuerpo-L5-PLR puede comprender la fórmula: NH-PLR Anticuerpo ° Ab-L5-PLR, en donde NH es el grupo amino en el extreme de una cadena lateral del LR, tal como Usina.
En ciertos aspectos, el ligador puede ser Ligador-6 (L6).
Cuando L6 es conjugado para PLR, el complejo L6-PLR puede comprender la misma fórmula que aquella para L5-PLR1. De manera similar, cuando L6 es conjugada para el anticuerpo y PLR, el complejo anticuerpo-L6-PLR puede comprender la misma fórmula que aquella para Ab-L5- PLR.
En ciertas modalidades, el ligador puede ser Ligador-7 (L7): Cuando se conjuga para PLR, el complejo L7-PLR puede comprender la fórmula: Cuando se conjuga para el anticuerpo y PLR, el complejo anticuerpo- L7-PLR puede comprender la fórmula: En ciertas modalidades, el ligador puede ser Ligador-8 (L8): Cuando L8 es conjugado para PLR, el complejo L8-PLR puede comprender la fórmula: Cuando L8 es conjugado para el anticuerpo y PLR, el complejo anticuerpo-L8-PLR puede comprender la fórmula: En ciertas modalidades, el ligador puede ser de la fórmula en donde el Anticuerpo es un enlace covalente para sitio de combinación de un anticuerpo, S-PLR es el enlace covalente para una cadena lateral que tiene tiol en el residuo de enlace de proteína y/o el residuo de enlace de péptido, n = 1, o 2, o 3, o 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; n puede ser 1, 2, 3, 4, 5, o 6; n puede ser 1; n puede ser 2; n puede ser 3; n puede ser 4. M puede estar ausente. M puede estar presente.
En ciertas modalidades, el 1er y/o 2do ligador, cuando es conjugado para el anticuerpo y PLR, puede ser de la fórmula: en donde el Anticuerpo es un enlace covalente para el sitio de combinación de un anticuerpo, S-PLR es un enlace covalente para una cadena lateral que tiene tiol en el residuo de enlace de proteína y/o el residuo de enlace de péptido, n = 1, o 2, o 3, o 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; n puede ser 1, 2, 3, 4, 5, o 6; n puede ser 1; n puede ser 2; n puede ser 3; n puede ser 4.
En ciertas modalidades, la composición comprende la fórmula: en donde el Anticuerpo es un enlace covalente para el sitio de combinación de un anticuerpo, y S-PLR es un enlace covalente para una cadena lateral que tiene tiol en el residuo de enlace de proteína y/o el residuo de enlace de péptido.
En ciertas modalidades, el residuo de enlace de proteína comprende una cadena lateral que tiene amino o tiol. En ciertas modalidades, el residuo de enlace de proteína comprende lisina o cisteína. En ciertas modalidades, el residuo de enlace de proteína comprende cisteína.
En ciertas modalidades, el residuo de enlace de proteína está ubicado en uno de los números de residuo 56, 59, 69, 79, 86, 122, 125 y 129, de acuerdo con la numeración de NO ID SEC :1 En ciertas modalidades, la molécula FGF21 NO ID SEC: 10. En ciertas modalidades, la molécula FGF21 comprende NO ID SEC: 7.
En ciertas modalidades, el residuo de enlace de péptido está ubicado en una de las posiciones de 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 19,20,21,24,26,27,28,32,33,34,35,36,37,38,39, o 40 de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 60.
En ciertas modalidades, el 1er y 2do ligadores son iguales. En ciertas modalidades, el 1er y 2do ligador comprenden L1.
En ciertos aspectos, la estructura del residuo de enlace de proteína [S-PLR] y/o el residuo de enlace de péptido [S-PLR] cuando se fija al anticuerpo es de la fórmula: en donde v es 1 o 2, t es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, y es 0, 1 o 2; s es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, y q es 1, 2, 3, 4, o 5. En ciertos aspectos, v es 2 , t es 2 , y es 1 , s es 0 y q es 2.
En ciertos aspectos, la invención proporciona un compuesto de la fórmula: en donde cada uno, de manera independiente, de v, y v2 es 1 o 2, de modo independiente cada uno de ^ y t2 es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, de modo independiente cada uno de y e y2 es 0, 1 o 2; de modo independiente cada uno de Si y s2 es 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, y de modo independiente cada uno de y q2 es 1 , 2, 3, 4, o 5. En ciertos aspectos v-¡ y v2 son 2. En ciertos aspectos t, y t2 son 2. En ciertos aspectos y-, e y2 son 1. En ciertos aspectos s-, y s2 son 0. En ciertos aspectos qi y q2 son 2.
En ciertos aspectos, la invención proporciona una composición de la fórmula: en donde cada uno del primero y segundo ligador son conectados de manera covalente a uno de los dos sitios de combinación de anticuerpo, y el anticuerpo comprende NO ID SEC: 25 y NO ID SEC: 26, y S— Ex4 denota un enlace covalente a través de un grupo tiol para K(SH) de NO ID SEC: 64, y S— FGF21 denota un enlace covalente a través de un grupo tiol para C129 de NO ID SEC: 10.
En ciertos aspectos, la estructura del residuo de enlace de péptido [LR] cuando se fija al segundo ligador y el segundo sitio de combinación del anticuerpo es de la fórmula: en donde u es 1 , 2 o 3; v es 1 o 2, t es 1 , 2, o 3, y es 1 o 2; s es 0, 1 o 2 y q es 1 o 2. En ciertos aspectos, u es 2, v es 2, t es 2, y es 1, s es O y q es 2.
En ciertos aspectos de la invención, el homólogo Exendin4 y el segundo ligador comprenden la fórmula: en donde u es 1 , 2 o 3; v es 1 o 2, t es 1 , 2, o 3, y es 1 o 2; s es 0, 1 o 2 y q es 1 o 2, y [LR] es el residuo de enlace de péptido. En ciertos aspectos, u es 2, v es 2 , t es 2 , y es 1 , S es O y q es 2. En ciertos aspectos, [LR] es K, K(S-MAL), o K(SH).
En ciertas modalidades, la invención se refiere a una composición de la fórmula: [FGF21-1er Ligador]1 -[Ab]-[2nd_Ligador-Ex4]1 en donde FGF21 es un homólogo FGF21; y Ex4 es un homólogo Exendin4; y Ab es un anticuerpo catalítico de aldolasa; y el 1er ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de proteína en FGF21 y al sitio de combinación del anticuerpo, y el 2do ligador es fijado de modo covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de péptido en Ex4 y al sitio de combinación del anticuerpo, y en donde el primer ligador y el segundo ligador son iguales o diferentes, de modo que la vida media subcutánea del complejo proteína-anticuerpo conjugado es por lo menos de aproximadamente 20hrs en modelos de murino. En ciertas modalidades, la vida media SC es de por lo menos aproximadamente 25 horas. En ciertas modalidades, la vida media SC es de por lo menos aproximadamente 30 horas. En ciertas modalidades, la vida media SC es de por lo menos aproximadamente 33 horas. En ciertas modalidades, la vida media SC es de por lo menos aproximadamente 40 horas en modelos de primate. En ciertas modalidades, la vida media SC es de por lo menos aproximadamente 45 horas en modelos de primate. En ciertas modalidades, la vida media SC es por lo menos de 48 horas en modelos de primate. En ciertas modalidades, la invención proporciona un complejo anticuerpo-proteína conjugado con una vida media IV de por lo menos aproximadamente 28 horas en modelos de murino. En ciertas modalidades, la invención proporciona un complejo anticuerpo-proteína conjugado con una vida media IV de por lo menos aproximadamente 30 horas en modelos de murino. En ciertas modalidades, la invención proporciona un complejo anticuerpo-proteína conjugado con una vida media IV de por lo menos aproximadamente 34 horas en modelos de murino. En ciertas modalidades, la invención proporciona un complejo anticuerpo-proteína conjugado con una vida media IV de por lo menos aproximadamente 40 horas en modelos de murino. En ciertas modalidades, la invención proporciona un complejo anticuerpo-proteína conjugado con una vida media IV de por lo menos aproximadamente 50 horas en modelos de primate. En ciertas modalidades, la invención proporciona un complejo anticuerpo-proteína conjugado con una vida media IV de por lo menos aproximadamente 55 horas en modelos de primate. En ciertas modalidades, la invención proporciona un complejo anticuerpo-proteína conjugado con una vida media IV de por lo menos aproximadamente 60 horas en modelos de primate.
En ciertas modalidades, la invención se refiere a una composición de la fórmula: [FGF21-1er Ligador]-[Anticuerpo]-[2nd_Ligador-Ex4] en donde FGF21 es un homólogo FGF21; yEx4 es un homólogo Exendin4; y Anticuerpo es un anticuerpo catalítico de aldolasa; y el 1er ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de proteína en FGF21 y al sitio de combinación del anticuerpo, y el 2do ligador es fijado de modo covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de péptido en Ex4 y al sitio de combinación del anticuerpo, y en donde el primer ligador y el segundo ligador son iguales o diferentes, de modo que la biodisponibilidad subcutánea de el complejo anticuerpo-proteína conjugado es por lo menos de aproximadamente 80% en modelos de murino. En ciertas modalidades, la biodisponibilidad SC es de por lo menos aproximadamente 85 %. En ciertas modalidades, la biodisponibilidad SC es de por lo menos aproximadamente 90%. En ciertas modalidades, la biodisponibilidad SC es de por lo menos aproximadamente 50% en modelos de primate. En ciertas modalidades, la biodisponibilidad SC es de por lo menos aproximadamente 55% en modelos de primate. En ciertas modalidades, la biodisponibilidad SC es de por lo menos aproximadamente 60% en modelos de primate.
En ciertas modalidades, la invención se refiere a una composición de la fórmula: [FGF21-1er Ligador]-[Anticuerpo]-[2do_Ligador-Ex4] en donde FGF21 es un homólogo FGF21; y Ex4 es un homólogo Exendin4; y Anticuerpo es un anticuerpo catalítico de aldolasa; y el 1er ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de proteína en FGF21 y al sitio de combinación del anticuerpo, y el 2do ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de péptido en Ex4 y al sitio de combinación del anticuerpo, y en donde el primer ligador y el segundo ligador son iguales o diferentes, de modo que la biodisponibilidad subcutánea del complejo anticuerpo-proteína conjugado tiene una potencia Ee50 en un ensayo hGLP-1R (iAMP) de menos de aproximadamente 1nM. En ciertos aspectos, la potencia Ee50 en el ensayo hGLP-1R (iAMP) es menor a aproximadamente 500pm. En ciertos aspectos, la potencia Ee50 en el ensayo hGLP-1R (iAMP) es menor a aproximadamente 100pm. En ciertos aspectos, la potencia Ee50 en el ensayo hGLP-1R (iAMP) es menor a aproximadamente 50pm. En ciertos aspectos, la potencia Ee50 en el ensayo hGLP-1 R (iAMP) está entre aproximadamente 10-50pm.
En ciertas modalidades, la invención se refiere a una composición de la fórmula: [FGF21-1er Ligador]-[Anticuerpo]-[2nd_Ligador-Ex4] en donde FGF21 es un homólogo FGF21; y Ex4 es un homologo Exendin4; y Anticuerpo es un anticuerpo catalítico de aldolasa; y el 1er ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de proteína en FGF21 y al sitio de combinación del anticuerpo, y el 2do ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de péptido en Ex4 y al sitio de combinación del anticuerpo, y en donde el primer ligador y el segundo ligador son ¡guales o diferentes, de manera que el complejo anticuerpo-proteína conjugado tiene una potencia Ee50 en un ensayo Glutl Taqman menor a aproximadamente 5nM. En ciertas modalidades, la potencia Ee50 en un ensayo Glutl Taqman es menor a aproximadamente 4nM. En ciertas modalidades, la potencia Ee50 en un ensayo Glutl Taqman es menor a aproximadamente 3nM. En ciertas modalidades, la potencia Ee50 en un ensayo Glutl Taqman es menor a aproximadamente 2nM. En ciertas modalidades, la potencia Ee50 en un ensayo Glutl Taqman es menor a aproximadamente 1nM.
En ciertas modalidades, el complejo anticuerpo-proteina conjugado combina dos o más ventajas favorables, tales como la vida media SC, vida media IV, admisión de glucosa, potencia, biodisponibilidad, facilidad de elaboración, eficiencia de conjugación, estabilidad in vivo, estabilidad in vitro, resistencia a la hidrólisis, y compatibilidad entre anticuerpo, ligador y proteína.
En ciertos aspectos, la invención proporciona una composición que comprende una molécula FGF21 covalentemente conectada a por lo menos una porción incrementadora de vida media en un residuo de enlace ubicado en el número de residuo 171 de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 1. En ciertos aspectos, la molécula FGF21 es conectada de manera covalente a una porción incrementadora de vida media. En ciertos aspectos, la molécula FGF21 es conectada de forma covalente a más de una porción incrementadora de vida media. En ciertos aspectos, el residuo de enlace es seleccionado a partir del grupo que consta de los números de residuo 79, 129, y 171. En ciertos aspectos, el residuo de enlace está en la posición 171. La molécula FGF21 puede comprender NO ID SEC: 73. La molécula FGF21 puede comprender NO ID SEC: 74. La molécula FGF21 puede comprender NO ID SEC: 75. La "porción incrementadora de vida media" se refiere a cualquier molécula que cuando se conecta a la molécula FGF21, incrementa la vida media circulante de la molécula FGF21 y/o inhibe o reduce depuración renal de la molécula FGF21. Los Ejemplos de porciones incrementadoras de vida media incluyen PEG, mPEG, polímeros que contiene fosforilcolina, dominios Fe, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, scFv, VH, VL, diacuerpos, minicuerpos, anticuerpos, anticuerpos catalíticos (descritos más adelante), proteínas (tales como albúmina), y otras macromoléculas conocidas en la técnica.
Anticuerpos "Alrededor de" o "aproximadamente", cuando se utiliza en conexión con una variable numérica medible, se refiere al valor indicado de la variable y a todos los valores de la variable que están dentro del error experimental del valor indicado (por ejemplo, dentro del intervalo de confianza del 95% para la media) o dentro del 10 por ciento del valor indicado, cualquiera que sea mayor.
Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina susceptible de enlace específico a un objetivo, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etcétera, a través de por lo menos un sitio de reconocimiento de antígeno, ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" abarca no sólo los anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también cualquier fragmento de enlace de antígeno (es decir, "porción de enlace de antígeno") o cadena sencilla del mismo, proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno incluyendo, por ejemplo, sin limitación, scFv, anticuerpos de dominio sencillo (por ejemplo, anticuerpos de tiburón y de camélido), maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase por ejemplo, Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136). Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA, o IgM (o sub-case de los mismos), y el anticuerpo no necesita ser de ninguna clase particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácido de anticuerpo de la región constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas pueden ser divididas adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, I g A 1 e lgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son llamadas alfa, delta, epsilon, gamma, y mu, respectivamente. Se conocen también estructuras de subunidad y las configuraciones tri-dimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas.
Se conocen dos tipos de regiones constantes de cadena ligera humana: lambda (CL-?) y kappa (CL- ). Hay tres variantes CL-K conocidas, en base a los polimorfismos V/A en la posición 46 y A/L en la posición 84 (numeración de acuerdo con NO ID SEC: 78). Los 3 polimorfismos CL-? identificados son Km(1 ): V 6/L84, Km(1,2): A 6/L84, y Km(3) A46/V84). Los anticuerpos de la presente invención pueden comprender por lo tanto un dominio kappa constante de acuerdo con cualquiera de Nos ID SEC: 78, 79, 80 o 81, o variantes de los mismos que comprende no más de 5, 4, 3, 2, o 1 inserciones, sustituciones o eliminaciones de aminoácido. La persona con experiencia en la técnica comprende que el residuo R1 de NOs ID SEC: 78, 79, 80 y 81 a través de ciertos métodos de conteo pueden ser incluidos en el dominio variable, y que se puede considerar por tanto que los dominios constantes inician también a partir del residuo T2 de dichas secuencias.
El término "porción de enlace de antígeno " de un anticuerpo, como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto que retiene la habilidad para enlazarse de manera especifica a un antígeno determinado (por ejemplo, objetivo X). Las funciones de enlace de antígeno de un anticuerpo pueden ser efectuadas por fragmentos de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de enlace comprendidos dentro del término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo incluyen Fab; Fab'; F(ab')2; un fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo de dominio sencillo (dAb) (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), y una región de determinación de complementariedad aislada (CDR).
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera de anticuerpo o la región variable de la cadena pesada de anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Como se conoce en la técnica, cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera constan de cuatro regiones de estructura (FRs) conectadas por medio de tres regiones de determinación de complementariedad (CDRs) conocidas también como regiones hipervariables, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígeno de los anticuerpos. Si se desean variantes de una región variable de sujeto, en particular con sustitución en residuos aminoácido fuera de una región CDR (es decir, en la región de estructura), se puede identificar la sustitución aminoácido apropiada, de preferencia, sustitución aminoácido conservadora, a través de la comparación de la región variable de sujeto para las regiones variables de otros anticuerpos que contienen secuencias CDR1 y CDR2 en la misma clase canónica que la región variable de sujeto (Chothia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987). Cuando se selecciona FR para flanquear CDRs de sujeto, por ejemplo, cuando se humaniza u optimiza un anticuerpo, se prefieren las FRs a partir de anticuerpos que contienen secuencias CDR1 y CDR2 en la misma clase canónica.
Una "CDR" de un dominio variable son residuos de aminoácido dentro de la región variable que son identificados de acuerdo con las definiciones de Kabat, Chothia, la acumulación tanto de Kabat como Chothia, AbM, contacto, y/o definiciones de conformación o cualquier método de determinación CDR bien conocido en la técnica. Las CRDs de anticuerpo pueden ser identificadas como las regiones hipervariables originalmente definidas por Kabat et al. Véase por ejemplo, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Las posiciones de las CDRs también pueden ser identificadas como las estructuras de ciclo estructural originalmente descritas por Chothia and others. Véase por ejemplo, Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883. Otros enfoques para la identificación de CDR incluyen la "definición AbM", la cual es un compromiso entre Kabat y Chothia y se derive utilizando el software de modelado de anticuerpo Oxford Moleculares AbM (ahora Accelrys®), o la "definición de contacto" de CDRs en base a contactos de antígeno observados, establecida en MacCallum et al., 1996, J. Mol. B i o I . , 262:732-745. En otro enfoque, referido en la presente como la "definición de conformación" de CDRs, las posiciones de las CDRs pueden ser identificadas como los residuos que hacen contribuciones entálpicas al enlace de antígeno. Véase por ejemplo, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. Otras definiciones de límite CDR pueden no seguir de manera estricta uno de los enfoques anteriores, aunque se traslapan con por lo menos una porción de las CDRs de Kabat, aunque pueden ser recortadas o ampliadas a la luz del pronóstico o hallazgos experimentales de que residuos o grupos de residuos particulares o incluso CDRs completas no impactan de manera significativa el enlace de antígeno. Como se usa en la presente, una CDR se puede referir a CDRs definidas por cualquier enfoque conocido en la técnica, incluyendo combinaciones de enfoques. Los métodos utilizados en la presente pueden usar las CDRs definidas de acuerdo con cualquiera de estos enfoques. Para cualquier modalidad determinada que contenga más de una CDR, las CDRs pueden ser definidas de acuerdo con cualesquiera definiciones de Kabat, Chothia, extendidas, AbM, de contacto, y/o de conformación.
Los contenidos de US2006205670 están incorporados en la presente mediante referencia - US2006205670 describe un número de composiciones y técnicas directamente aplicables a la presente aplicación, en particular los párrafos
[0153]-
[0233] , que describen anticuerpos, fragmentos útiles y variantes y modificaciones de los mismos, sitios de combinación y CDRs, preparación de anticuerpo, expresión, humanización, modificación aminoácido, glicosilación, ADCC, CDC, incrementar la vida media en suero de los anticuerpos, vectores de expresión, sistemas huésped de mamífero, y plegamiento, entre otros elementos de la tecnología de anticuerpo.
"Sitio de combinación", como se usa en la presente, (conocido también como el sitio de enlace de anticuerpo) se refiere a la región de la inmunoglobulina o dominios Ig que combina (o puede combinar) con el determinante de un antígeno apropiado (o una proteina estructuralmente similar). El término generalmente incluye las CDRs y los residuos de estructura adyacentes que están involucrados en el enlace de antígeno.
Anticuerpos de aldolasa" como se usa en la presente, se refiere a anticuerpos que contienen porciones de sitio de combinación que, cuando no están comprometidos (por ejemplo mediante conjugación), catalizan una reacción de adición de aldol entre un donador cetona alifático y un aceptor aldehido. Los anticuerpos de aldolasa son susceptibles a ser generados mediante inmunización de un animal con respuesta inmune con un inmunógeno que incluye un 1,3 dicetona hapteno de la fórmula: acoplado a una proteína de vehículo, y caracterizado además por tener una Usina con un grupo e-amino reactivo en el sitio de combinación del anticuerpo. Los anticuerpos de aldolasa están caracterizados además por su actividad catalítica que está sometida a inhibición con el 1,3-dicetona hapteno mediante la formación de un complejo entre el 1,3-dicetona hapteno y el grupo e-amino de la lisina del anticuerpo catalítico.
Como se describió, en ciertas modalidades, ciertos anticuerpos que pueden ser usados en conjunción con compuestos de la invención pueden requerir de una cadena lateral reactiva en el sitio de combinación de anticuerpo. Una cadena lateral reactiva puede estar presente de manera natural o puede ser colocada en un anticuerpo a través de mutación. El residuo reactivo del sitio de combinación del anticuerpo puede estar asociado con el anticuerpo, de modo que cuando el residuo es codificado por el ácido nucléico presente en la célula linfoide identificado primero para elaborar el anticuerpo. De manera alternativa, el residuo aminoácido puede surgir a través de la mutación intencionada del ADN para codificar el residuo particular (por ejemplo, WO 01/22922). El residuo reactivo puede ser un residuo no natural que surge, por ejemplo, a través de la incorporación biosintética utilizando un codón único, ARNt, y aminoacil-ARNt como se describe en la presente. En otro enfoque, el residuo aminoácido o sus grupos funcionales reactivos (por ejemplo, un grupo amino nucleofílíco o grupo sulfhidrilo) puede ser fijado a un residuo aminoácido en el sitio de combinación de anticuerpo. Por tanto, el enlace covalente con el anticuerpo que ocurre "a través de un residuo aminoácido en un sitio de combinación de un anticuerpo" como se usa en la presente significa que el enlace puede ser directamente a un residuo aminoácido de un sitio de combinación de anticuerpo o a través de una porción química que es enlazada a una cadena lateral de un residuo aminoácido de un sitio de combinación de anticuerpo. En ciertas modalidades, el aminoácido es cisteína, y el grupo reactivo de la cadena lateral es un grupo sulfhidrilo. En otras modalidades, el residuo aminoácido es lisina, y el grupo reactivo de la cadena lateral es el grupo e-amino. En ciertas modalidades, el aminoácido es Lys93 en la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat. En ciertas modalidades, el aminoácido es Lys-99 en HC h38C2 (NO ID SEC: 26).
Los anticuerpos catalíticos son una fuente de anticuerpos con sitios de combinación adecuados que comprenden una o más cadenas laterales de aminoácido reactivas. Dichos anticuerpos incluyen anticuerpos de aldolasa, anticuerpos de beta lactamasa, anticuerpos de esterasa, y anticuerpos de amidasa.
Una modalidad comprende un anticuerpo de aldolasa tal como los anticuerpos monoclonales de ratón mAb 33F12 y mAb 38C2, así como las versiones adecuadamente quiméricas y humanizadas de esos anticuerpos (por ejemplo h38C2, NOs ID SEC: 25 y 26). mAb 38C2 de ratón (y h38C2) tienen una lisina reactiva cercana a pero fuera de HCDR3, y es el prototipo de una nueva clase de anticuerpos catalíticos que fueron generados a través de inmunización reactiva e imitan de manera mecánica las enzimas de aldolasa naturales. Véase C.F. Barbas 3rd et al., Science 278:2085-2092 (1997). Otros anticuerpos catalíticos de aldolasa que pueden ser utilizados incluyen los anticuerpos producidos por el hibridoma 85A2, que tiene un número de acceso ATCC PTA-1015; hibridoma 85C7, que tiene un número de acceso ATCC PTA-1014; hibridoma 92F9, que tiene un número de acceso ATCC PTA-1017; hibridoma 93F3, que tiene un número de acceso ATCC PTA-823; hibridoma 84G3, que tiene un número de acceso ATCC PTA-824; hibridoma 84G11, que tiene un número de acceso ATCC PTA-1018; hibridoma 84H9, que tiene un número de acceso ATCC PTA-1019; hibridoma 85H6, que tiene un número de acceso ATCC PTA-825; hibridoma 90G8, que tiene un número de acceso ATCC PTA-1016. A través de una Usina reactiva, estos anticuerpos catalizan reacciones de aldol y retro-aldol usando el mecanismo enamina de las aldolasas naturales. Los anticuerpos de aldolasa y los métodos para generar anticuerpos de aldolasa se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,210,938, 6,368,839, 6,326,176, 6,589,766, 5,985,626, y 5,733,75, que están incorporadas a la presente mediante referencia.
Los compuestos de la invención se pueden formar también a través de enlace de un compuesto de la invención a una cisteína reactiva, tales como aquellas encontradas en los sitios de combinación de anticuerpos catalíticos de tioesterasa y esterasa. Los anticuerpos catalíticos de tioesterasa adecuados se describen en .O. Janda er al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 91:2532-2536 (1994).
Los anticuerpos de esterasa adecuados son descritos por P. Wirsching et al., Science 270:1775-1782 (1995). Los anticuerpos que contienen aminoácido reactive pueden ser preparados a través de medios bien conocidos en la técnica, que incluyen mutación de un residuo de sitio de combinación de anticuerpo para codificar el aminoácido reactivo o derivar químicamente una cadena lateral de aminoácido en un sitio de combinación de anticuerpo con un ligador que contiene el grupo reactivo.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado. Cuando los compuestos de la invención son enlazados de manera covalente al sitio de combinación de un anticuerpo, y dichos anticuerpos son humanizados, es importante que dichos anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad de enlace para el grupo Z. Están consideradas varias formas de anticuerpos de aldolasa de murino humanizadas. Una modalidad emplea el anticuerpo catalítico de aldolasa humanizado h38c2 I g G 1 o h38c2 Fab con dominios constantes humanos CK y Cy11. C. Rader et al., J. Mol. Bio. 332:889-899 (2003) describe las secuencias de gen y vectores que pueden ser utilizados para producir h38c2 Fab y h38c2 I g G 1. Las líneas germinales humana Vk de gen DPK-9 y gen Jk humano JK4 fueron utilizadas como estructuras para la humanización del dominio variable de cadena ligera kappa de m38c2, y el gen de línea germinal humana DP-47 y gen JH humano JH4 fueron utilizados como las estructuras para la humanización del dominio variable de cadena pesada de m38c2. La Figura 1 ¡lustra una alineación de secuencia entre las cadenas ligera y pesada variables en m38c2, h38c2, y las líneas germinales y líneas germinales. h38c2 puede utilizar dominios constantes IgG 1 , lgG2, lgG3, o lgG4, que incluyen cualquiera de los alotipos de los mismos. En ciertas modalidades de los compuestos de la invención en donde el anticuerpo es h38c2 I g G 1 con el alotipo G1m(f), Z se enlaza a la cadena lateral del residuo lisina en la posición 99 de la cadena pesada. Otra modalidad usa un anticuerpo quimérico que comprende los dominios variables (VL y VH) de h38c2 (NOs ID SEC: 27 y 28) y los dominios constantes a partir de un I g G , lgG2, lgG3, o lgG4. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, scFv, VH, VL, diacuerpo, o minicuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitude completa y puede ser selecionado a partir del grupo que consta de IgG 1 , lgG2, lgG2Aa, lgG3, lgG4, lgG4Ab, lgG4Ac, lgG4 S228P, lgG4Ab S228P e lgG4Ac S228P. El anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo puede comprender los dominios VH y VL a partir de h38c2. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo que comprende los dominios VL y VH a partir de h38c2 y urna región constante selecionada a partir del grupo que comprende I g G , lgG2, lgG2Aa, lgG3, lgG4, lgG4Ab, lgG4AC, lgG4 S228P, lgG4Ab S228P e lgG4AC S228P. El anticuerpo puede ser h38C2 lgG1 (Nos ID SEC: 25 y 26). El anticuerpo puede ser h38C2 lgG2 (Nos ID SEC: 25 y 76). El anticuerpo puede ser urna versión humanizada de um anticuerpo de aldolasa de murino que compreende urna región constante a partir de um anticuerpo IgG, IgA, IgM, IgD, o IgE humano. En otra modalidad, el anticuerpo es um anticuerpo quimérico que comprende la región VL y VH a partir de um anticuerpo de aldolasa de murino y urna región constante a partir de um anticuerpo IgG, IgA, IgM, IgD, o IgE humano. En ciertas modalidades, el anticuerpo comprende las regiones VL y VH a partir de m38C2 (NOs ID SEC: 29 y 30). En modalidades adicionales, el anticuerpo es una versión completamente humana de un anticuerpo de aldolasa de murino que comprende una secuencia de polipéptido a partir de anticuerpo IgG, IgA, IgM, IgD, o IgE humano natural o nativo. En ciertos aspectos, el anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una VL CDR1 , VL CDR2, y VL CDR3 de la secuencia VL mostrada en NO ID SEC: 27; y una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una VH CDR1 , VH CDR2, y VH CDR3 de la secuencia VH mostrada en NO ID SEC: 28 Como se describió con anterioridad, las CDRs pueden ser determinadas a través de vários métodos conocidos em la técnica.
En ciertos aspectos, el anticuerpo comprende urna cadena ligera por lo menos 95% idéntica al NO ID SEC: 25 y una cadena pesada al menos 95% idéntica a NO ID SEC: 26. La cadena ligera puede ser al menos 96% idéntica al NO ID SEC 25. La cadena ligera puede ser al menos 96% idéntica al NO ID SEC 25. La cadena ligera puede ser al menos 97% idéntica al NO ID SEC 25. La cadena ligera puede ser al menos 98% idéntica al NO ID SEC 25. La cadena ligera puede ser al menos 99% idéntica al NO ID SEC: 25. La cadena pesada puede ser al menos 96% idéntica al NO ID SEC: 26. La cadena pesada puede ser al menos 97% idéntica al NO ID SEC: 26. La cadena pesada puede ser al menos 98% idéntica al NO ID SEC: 26. La cadena pesada puede ser al menos 99% idéntica al NO ID SEC: 26. Em ciertos aspectos, la cadena ligera puede diferir de NO ID SEC: 25 por um aminoácido. Em ciertos aspectos, la cadena pesada puede diferir de NO ID SEC: 26 en un aminoácido. En ciertos aspectos, las diferencias entre la cadena ligera y NO ID SEC: 25 pueden localizarse en la región constante solamente. En ciertos aspectos, las diferencias entre la cadena pesada y NO ID SEC: 26 pueden localizarse sólo en la región constante.
Están consideradas también varias formas de fragmentos de anticuerpo de aldolasa humanizados. Una modalidad utiliza h38c2 F(ab')2. h38c2 F(ab')2 puede ser producido a través de digestión proteolítica de h38c2 I g G 1. Otra modalidad emplea un h38c2 scFv que comprende los dominios VL y VH a partir de h38c2 los cuales son conectados de manera opcional a través de un ligador intercalado (Giy4Ser)3 (NO ID SEC: 31). Como una alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, es posible ahora producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, al ser inmunizados (o mediante inmunización reactiva en el caso de los anticuerpos catalíticos) de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de ¡nmunoglobulina endógena.
De manera alternativa, la tecnología de exhibición en fago se puede utilizar a fin de producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo ¡n vitro utilizando repertorios de gene de dominio variable (V) de ¡nmunoglobulina a partir de donadores inmunizados. Como se indicó con anterioridad, los anticuerpos humanos también pueden ser generados por medio de células B activadas in vitro, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,567,610 y 5,229,275.
Están consideradas la(s) modif icación(es) de secuencia de aminoácido de los anticuerpos descritos en la presente. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácido son preparadas por medio de la introducción de cambios de nucleótido adecuados dentro del ácido nucléico del anticuerpo, o mediante síntesis de péptido. Esas modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones a partir de, inserciones dentro de, y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácido del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se efectúa para lograr la construcción final, a condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácido pueden alterar también los procesos post-translacionales del anticuerpo, tal como el cambio del número o posición de los sitios de glicosilación.
Un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención pueden ser derivados o enlazado a otra molécula (por ejemplo otro péptido o proteína). En general, los anticuerpos o porción de los mismos son derivados de modo que la habilidad del ligador que se conjugará de manera covalente para la combinación de anticuerpo no es afectada de manera adversa por la derivación o marcado. En consecuencia, los anticuerpos y las porciones de anticuerpo de la invención están destinados a incluir formas tanto intactas como modificadas de los anticuerpos aquí descritos. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede ser funcionalmente enlazado (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares, como otro anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que pueden mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o un marcador de polihistidina).
En otras modalidades, el anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo de la invención puede ser un anticuerpo de fusión o un anticuerpo enlazado a otro polipéptido. En ciertos aspectos, sólo las regiones variables del anticuerpo son enlazadas al polipéptido. En ciertos aspectos, el anticuerpo es conjugado de modo covalente a un péptido de tal manera que no interfiere con la afinidad de enlace del sitio de combinación.
El polipéptido puede ser un agente terapéutico, tal como un agente objetivo (o de direccionamíento), péptido, agonista de proteína, antagonista de proteína, regulador metabólico, hormona, toxina, factor de crecimiento u otra proteína reguladora, o puede ser un agente de diagnóstico, tal como una enzima que puede ser fácilmente visualizada, tal como peroxidasa de rábano. Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los cuales dos (o más) anticuerpos de cadena sencilla son enlazados entre sí. Esto es útil si se desea crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena de polipéptido sencilla, o si se desea crear un anticuerpo biespecíf ico.
Un tipo de anticuerpo derivado es producido a través de entrelazamiento de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos, por ejemplo para crear anticuerpos biespecíf icos) . Los entrelazadores adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos reactivos distintos separados por un separador adecuado (por ejemplo éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) o homobifuncional (por ejemplo suberato de disuccinimidilo).
Otro tipo de anticuerpo derivado es un anticuerpo marcado. Los agentes de detección útiles con los cuales se puede derivar un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención incluyen compuestos fluorescentes, que incluyen fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1 -naftalensulfonilo, ficoeritrina, fósforos de lantánido y similares. Un anticuerpo también puede ser marcado con enzimas que son útiles para la detección, como peroxidasa de rábano, galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, oxidasa de glucosa y similares. Cuando un anticuerpo es marcado con una enzima detectable, es detectado mediante la adición de reactivos adicionales que la enzima utiliza a fin de producir un producto de reacción que puede ser diferenciado. Por ejemplo, cuando el agente está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción con color, el cual es detectable. Un anticuerpo también puede ser marcado con biotina, y detectado a través de medición indirecta de enlace de avidina o estreptavidina. Un anticuerpo puede ser marcado con un agente magnético, tal como gadolinio. Un anticuerpo también puede ser marcado con epítopes polipéptido predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de par de cierre de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace metálico, marcadores epítope). En ciertas modalidades, los marcadores son fijados por brazos separadores de varias longitudes para reducir el potencial impedimento estérico.
El anticuerpo también puede ser derivado con un grupo químico tal como polietilen glicol (PEG), un grupo metilo o etilo, o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo para incrementar la vida media en suero o para incrementar en enlace a tejido.
Proceso de conjugación La invención proporciona procesos para generar compuestos de la fórmula: [FGF21 -1 er Ligador] 1 -[Ab]-[2do_Ligador-Ex4]1 en donde FGF21 es un homólogo FGF21; y Ex4 es un homólogo Exendin4; y Ab es un anticuerpo catalítico de aldolasa o porción de enlace de antígeno del mismo; y el 1er ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de proteína en FGF21 y al sitio de combinación del anticuerpo, y el 2do ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de péptido en Ex4 y al sitio de combinación del anticuerpo, y en donde el primer ligador y el segundo ligador son ¡guales o diferentes. De acuerdo con una modalidad, la invención proporciona un proceso que comprende las etapas: (i) mezclar FGF21 y el 1er ligador juntos en una relación de entre aproximadamente 1:4 y aproximadamente 1:1 para formar el complejo [FGF21-1st ligador]; (ii) mezclar [FGF21-1er ligador] y Ab juntos en una relación de entre aproximadamente 1.1:1 y aproximadamente 1:5 para formar una mezcla que contiene [Ab], [Ab]-[FGF21 -1 er ligador]! [Ab]- [FGF21 -1 er ligador]2; (iii) extraer las moléculas [Ab]-[FGF2 -1 er ligador]! de la mezcla formada en (ii); (iv) mezclar Ex4 y 2do ligador juntos en una relación de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2, para formar el complejo [2do I igador-Ex4] ; (v) mezclar [Ab]-[FGF21 -1 er ligador]! con [2do ligador-Ex4] en una relación de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2 para formar una mezcla que contiene [FGF21-1er ligador]i-[Ab]-[2do Mgador-Ex4]i .
Conjugación de FGF21 con 1er ligador En ciertas modalidades, el homólogo FGF21 es proporcionada en aproximadamente 20mM Tris, aproximadamente 50mM NaCI, pH = aproximadamente 7. En ciertas modalidades, el homólogo FGF21 es proporcionado en aproximadamente 25mM MES pH = aproximadamente 6.5. En ciertas modalidades, se puede agregar tris(2- carboxietil)fosfina (TCEP) a una concentración final 0.1X hasta 10X veces en comparación a FGF21 (se ha demostrado que 0.5X y 0.75X funcionan de modo particularmente adecuado). Esto tiene la ventaja de reducir al mínimo la tendencia de FGF21 LIH-A129C para dimerizar, tal como a aproximadamente 2:75% de la proteína que está en su forma monomérica. Si la proteína es dimerizada, entonces TCEP lo dividirá para volver a ser monómero. Además de TCEP, se pueden utilizar mercaptoetanol (ß-??) o ditiotreitol (DTT) en concentraciones entre 0.1X hasta 10X para dividir el dímero y dividir a monómero. Los reactivos tales como ß-mercaptoetanol (ß-??) o ditiotreitol (DTT) reaccionan también con FGF21 y forman un enlace covalente con tiol azufre, y TCEP no forma un enlace covalente con FGF21. Otros reactivos tales como cloruro de tetraquis-hidroximetil fosfonio y tris-dietilaminometil fosfina pueden reducir fácilmente el disulfuro y son útiles para reducir el dímero a monómero. En ciertas modalidades, el 1er ligador es proporcionado en aproximadamente 100% DIVISO a una concentración de aproximadamente 10mM.
En ciertos aspectos, FGF21 y el 1er ligador pueden ser conjugados juntos por medio de incubación aproximadamente a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos con agitación moderada. Los complejos [FGF21-1er ligador] se pueden obtener mediante elución de la mezcla a través de una columna Zeba pre-equilibrada, de modo que el ligador en exceso permanece en la resina de columna Zeba.
La conjugación de FGF21 con el 1er ligador se puede llevar a cabo a una relación de entre aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:4. En ciertas modalidades, la conjugación entre FGF21 y el 1er ligador se puede efectuar en un rango de relaciones, en donde el límite inferior se selecciona a partir del grupo que consta de aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:1.25, aproximadamente 1:1.5, aproximadamente 1.75, aproximadamente 1:2, y el límite superior es seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:2.25, aproximadamente 1:2.5, aproximadamente 1:2.75, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:3.5, y aproximadamente 1:4. En ciertos aspectos, la cantidad de enlazador se puede incrementar hasta aproximadamente 2- hasta aproximadamente 4- veces en exceso en base equivalente en comparación con FGF21. La cantidad incrementada del 1er ligador puede ayudar a agilizar el tiempo de conjugación. Sin embargo, la adición de ligador en exceso en más de 4 veces no produce ningún incremento adicional en la formación de producto o el tiempo de reacción. Es preferible un exceso de aproximadamente 2 veces del 1er ligador lo cual proporciona el material de FGF21 -ligador. La reducción de la cantidad del 1er ligador hasta menos de 1 equivalente resulta en cantidad reducida de formación de producto. A medida que la cantidad descendió hasta aproximadamente 0.9 equivalente, y aproximadamente 0.8 equivalente, 0.7 equivalente, y así sucesivamente, se reduce la cantidad de producto formado. La mayor cantidad de producto formado es cuando la relación de FGF21 y el 1er ligador está entre aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:2.
Conjugación de [FGF21-1er ligador] para anticuerpo En ciertos aspectos, el [FGF21-1er ligador] es conjugado para el anticuerpo en una solución reguladora MES o de fosfato, a una concentración entre aproximadamente 25 mM y aproximadamente 150 mM, con un rango de pH de aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 7.5, o aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 7.0, entre aproximadamente 0°C y 37°C, y de preferencia entre aproximadamente 4°C y aproximadamente Temperatura Ambiente. En ciertos aspectos, el [FGF21-1er ligador] es conjugado para el anticuerpo en una solución reguladora de fosfato 100 mM con un rango de pH de aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 6.5 a Temperatura Ambiente. El [FGF21-1er ligador] puede ser conjugado para el anticuerpo en una reacción que se lleva a cabo durante un tiempo seleccionado a partir del grupo que consta de por lo menos 30 minutos, por lo menos aproximadamente 60 minutos, por lo menos aproximadamente 90 minutos, por lo menos aproximadamente 2 horas, por lo menos aproximadamente 3 horas, por lo menos aproximadamente 4 horas, por lo menos aproximadamente 6 horas, por lo menos aproximadamente 12 horas, por lo menos aproximadamente 18 horas y por lo menos aproximadamente 24 horas.
Extracción de Ab-[FGF21 -1 er ligador] En ciertos aspectos, es ventajoso extraer moléculas Ab- [FGF21-1er ligador]i a partir de la mezcla formada en (ii) mediante cromatografía de fase inversa. En parte, la invención se basa en la aplicación sorpresiva de cromatografía de fase inversa para aislar Ab- [FGF21-1er ligador]-, a elevada pureza.
En ciertos aspectos, la cromatografía de fase inversa es conducida sobre una columna de butilo de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC, por sus siglas en inglés). La resina de HIC comprende de manera común esferas (por ejemplo de polímero metilacrilado hidroxilado) unido de manera covalente a ligandos butilo (-OCH2CH2CH2CH3). En ciertos aspectos, la invención proporciona un proceso para extraer Ab-[FGF21 -1 er ligador]! a partir de una mezcla de anticuerpo no conjugado, [FGF21-1er ligador] no conjugado, Ab-[FGF21-1 er l¡gador]i, y Ab-[FGF21 -1 er ligador]2, mediante cromatografía de fase inversa sobre una columna de butilo.
El tamaño de partícula de las esferas de columna puede ser menor a aproximadamente 50 µ?. El tamaño de partícula de las esferas de columna puede ser menor a aproximadamente 40 µ . El tamaño de partícula de las esferas de columna puede estar entre aproximadamente 50 µ? y aproximadamente 20 µ?. El tamaño de partícula de las esferas de columna puede estar entre aproximadamente 40 µ? y aproximadamente 30 µ?. El tamaño de partícula de las esferas de columna puede estar de aproximadamente 35 µ?. En ciertos aspectos, se puede usar una columna de butilo de grado "S".
En ciertos aspectos, los lechos pueden comprender poros por lo menos de aproximadamente 500 A. En ciertos aspectos, las esferas pueden comprender poros por lo menos de aproximadamente 750 A. En ciertos aspectos, las esferas pueden comprender poros por lo menos de aproximadamente 1000 A. En ciertos aspectos, las esferas pueden comprender poros de entre aproximadamente 450 A y 1050 A. En ciertos aspectos, las esferas pueden comprender poros de entre aproximadamente 950 A y 1050 A.
En ciertos aspectos, la columna HIC puede comprender esferas de resina conjugada de butilo de aproximadamente 35 µ? que comprenden poros de entre aproximadamente 1000 A. En ciertos aspectos, la columna puede ser una columna de butilo 650 S.
Esta puede estar a una temperatura de entre aproximadamente 0°C y 37°C. Puede estar a Temperatura Ambiente (aproximadamente 15°C hasta aproximadamente 25°C). Puede estar a una temperatura de entre aproximadamente 15°C hasta aproximadamente 20°C. Puede estar entre aproximadamente 16°C hasta aproximadamente 18°C. En ciertos aspectos de la invención, una temperatura demasiado elevada puede resultar en especies Ab-[FGF21 -1 er l i g ad o r]2 en exceso, en tanto que una temperatura demasiado bajo, la columna no atrapa suficientes de las especies Ab-[FG F21 - 1 er I i g a d o r] ? deseadas.
En ciertos aspectos, la columna de butilo puede ser sometida a una etapa de lavado ¡socrático que comprende 1 ,6 hexandiol a una concentración de aproximadamente 2% hasta aproximadamente 3%, de preferencia entre aproximadamente 2.2% y aproximadamente 2.6%, y de mayor preferencia de aproximadamente 2.4%. La solución reguladora de lavado puede estar entre aproximadamente pH 6.5 y aproximadamente 7.5, y de mayor preferencia puede estar a aproximadamente pH 7.0. La solución reguladora de lavado puede comprender 50 mM fosfato de sodio. En ciertos aspectos, el 1 ,6 hexandiol puede ser sustituido con un diol orgánico alternativo, tal como propilen glicol o unoxol. Los alcoholes como el isopropanol no proporcionaron resultados satisfactorios.
Las columnas HIC comúnmente son operadas sobre una concentración de sal que se reduce de manera progresiva: la presente invención se basa en parte en el descubrimiento sorpresivo de las ventajas particulares asociadas con la operación de una solución reguladora de elución con concentración de sal relativamente baja con una creciente concentración de diol en el aislamiento de las especies AB-[FGF21 - 1 er ligado^ a partir de la reacción de conjugación.
En ciertos aspectos, la elución en la columna de butilo se puede conducir utilizando un gradiente lineal con una solución reguladora que comprende 1,6 hexandiol. El gradiente lineal de elución puede avanzar desde una concentración inicial de entre aproximadamente 2% hasta aproximadamente 3%, y de preferencia entre aproximadamente 2.2% y aproximadamente 2.6%, y de mayor preferencia aproximadamente 2.4%.
La elución de diol puede ser operada en un volumen de columna grande (por lo menos 20, de preferencia al menos 25 volúmenes de columna (CV). En dichas modalidades, en tanto que la concentración inicial de diol puede ser como se describió con anterioridad, la concentración final del gradiente lineal puede ser superior al 20% y puede ser de alrededor del 25%. En ciertas modalidades, la etapa de elución es operada entre 5 y 15 CV, de preferencia entre 8 y 13 CV, de mayor preferencia entre 10 y 12 CV, de la mayor preferencia 11 CV. En dichas modalidades, puede ser ventajoso limitar la concentración final del gradiente lineal a entre aproximadamente 6% hasta aproximadamente 10%, de preferencia entre aproximadamente 7% y aproximadamente 9%, de mayor preferencia entre aproximadamente 7.5% y aproximadamente 8.5 %, de la mayor preferencia de aproximadamente 8%. La solución reguladora de elución puede estar entre aproximadamente pH 6.5 y aproximadamente pH 7.5, y puede estar a aproximadamente pH 7.0. La solución reguladora de elución puede comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 mM fosfato de sodio. La solución reguladora de elución puede comprender entre aproximadamente 20 mM y aproximadamente 80 mM fosfato de sodio. La solución reguladora de elución puede comprender entre aproximadamente 40 mM y aproximadamente 60 mM fosfato de sodio. La solución reguladora de elución puede comprender 50 mM fosfato de sodio.
Este material puede ser diafiltrado después en solución reguladora adecuada (por ejemplo, 30 mM lactato de sodio pH 4.8 o 20 mM glutamato de sodio pH 4.5).
Generación de [2do ligador-Ex4] En ciertos aspectos, el homólogo Exendin4 y el 2do ligador se pueden mezclar juntos en una relación de entre aproximadamente 2:1 hasta aproximadamente 1:2 para formar el complejo [2do ligador-Ex4]. En ciertos aspectos, el mezclado del homólogo Exendin4 y el 2do ligador juntos se puede hacer una relación de aproximadamente 1.5:1, para formar el complejo [2do ligador-Ex4]. En ciertos aspectos, el mezclado del homólogo Exendin4 y el 2do ligador juntos se puede hacer en una relación de aproximadamente 1:1, para formar el complejo [2do ligador-Ex4]. En ciertos aspectos, el mezclado del homólogo Exendin4 y el 2do ligador juntos se puede hacer en una relación de aproximadamente 1:1.5, para formar el complejo [2do Mgador-Ex4]. En ciertos aspectos, el mezclado del homólogo Exendin4 y el 2nd ligador juntos se puede hacer en una relación de aproximadamente 1:2, para formar el complejo [2do Mgador-Ex4].
En ciertos aspectos de la invención, los homólogos Exendin4 de la invención comprenden un residuo de enlace de péptido cuya cadena lateral comprende un grupo tiol. En ciertas modalidades, este grupo tiol puede experimentar después una reacción de Michael o adiciones de conjugación al anillo maleimida de ciertos ligadores descritos en la presente.
Las adiciones de conjugación entre homólogos Exendin4 adecuados y 2do ligadores se puede llevar a cabo en un amplio rango de solventes que incluyen dimetil sulfóxido, dimetil formamida, diclorometano, agua, etanol, acetonitrilo acetona, propilen glicol, y cualquier combinación de los solventes anteriores. En ciertos aspectos, el solvente para la reacción Exendin4/2do ligador se selecciona a partir del grupo que consta de dimetil sulfóxido, dimetil formamida y agua. La reacción de conjugación se puede efectuar también en sistema de solvente mezclado tal como acetonitrilo-agua, dimetil sulfóxido-agua y dimetil formamida-agua. El uso de solventes de dimetil sulfóxido, dimetil formamida, agua-acetonitirlo es la elección preferida debido a la facilidad de solubilidad de Exendin4 péptidos y el 2do ligador, la eficiencia de la reacción de conjugación y la subsecuente facilidad de purificación de producto. El criterio clave es la solubilidad de los homólogos a concentraciones que serían adecuadas para la conjugación y la eficiencia de conjugación con mínimos productos secundarios. Si el péptido Exendin4 y el 2do ligador son moderadamente solubles (por ejemplo, menos de aproximadamente 0.1 M) se reducirá entonces la eficiencia de conjugación.
La presencia de una base orgánica o base inorgánica facilita en gran medida la formación del anión tiolato en los péptidos Exendin4 y la subsecuente conjugación para el 2do ligador. Por lo general no se prefieren las aminas primarias y las aminas secundarias debido a su reactividad con el ligador. Sin embargo, las aminas primarias o aminas secundarias pueden ser utilizadas en ciertas modalidades, a condición de que reaccionen de manera escasa con el ligador, se pueden usar aminas terciarias como trimetilamina, trietilamina, dietilmetilamina, diisopropilmetilamina, dietilisopropilamina, triisopropilamina, tributilamina, N-metilmorfolina, y N-metilpiperdina en las reacciones de conjugación. La mayoría de las bases amina arriba listadas son adecuadas para la reacción de conjugación. Sin embargo, la eficiencia de la reacción es diferente entre las diferentes bases. Ciertas bases son más resistentes a reaccionar con el ligador que otras. En general se prefieren las bases más voluminosas, ya que estas bases no reaccionan fácilmente con el ligador. Se prefieren bases tales como diisopropiletilamina, triisopropilamina y dietilisopropilamina ya que ofrecen un buen equilibrio casi sin reactividad con el ligador y eficiente formación de producto.
Las reacciones también se pueden llevar a cabo en sistema acuoso usando bases inorgánicas tales como bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de potasio, carbonato de potasio, bicarbonato de litio, carbonato de litio, a condición de que estas bases no reaccionen con el ligador o péptido. Las reacciones también se pueden efectuar en sistemas regulados acuosos con o sin un co-solvente orgánico. La adición de tiol a enlace doble se logra más fácilmente cuando el pH es de aproximadamente 7 y superior. La reacción de conjugación es más lenta a un pH de aproximadamente 7. Las reacciones de conjugación entre Ex4 y el ligador pueden tener lugar generalmente entre pH de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8. Sin embargo bajo condiciones más básicas los ligadores son menos estables. El pH más cercano al nivel neutro ofrece tanto la eficiencia como la estabilidad. Se puede utilizar un amplio rango de soluciones reguladoras para facilitar las reacciones. Muchas de las soluciones reguladoras son adecuadas par alas reacciones de conjugación que incluyen aunque no se limitan a solución reguladora de fosfato, solución reguladora de citrato, solución reguladora de glicina/histidina, solución reguladora de 2-amino-2-hidroximetil-propan-1 ,3-diol, ácido 4-2-hidroxietil-1 -piperazinetansulfónico, y ácido 3-(N-morfolino)propansulfónico.
Conjugación de [2do ligador-Ej 4] para Ab-[FGF21 -ligador]! En ciertos aspectos, Ab-[FG F21 - 1 er ligador]! y el [2do ligador-Ex4] puede ser combinado en una relación de aproximadamente Ab-[FGF21-1er I i g a d o r] 1 :[2do ligador-Ex4] de entre aproximadamente 0.7:1 hasta aproximadamente 2:1. En ciertos aspectos, la relación es de aproximadamente 1.1:1 hasta aproximadamente 1.7:1. En ciertos aspectos, la relación es de aproximadamente 1:3:1 hasta aproximadamente 1.5:1. La relación puede ser de aproximadamente 1.4:1.
En ciertos aspectos, Ab-[FGF21 -1 er ligador], y [2do ligador-Ex4] se pueden combinar a un pH de entre aproximadamente 5.5 y aproximadamente 6.5. En ciertos aspectos, Ab-[1er FGF21 -ligador]-! y [2do Mgador-Ex4] se pueden combinar a un pH de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 6.5. En ciertos aspectos, Ab-[FGF21-1er I i g a d o r] 1 y [2do Mgador-Ex4] se pueden combinar a un pH de aproximadamente 6.3.
En ciertos aspectos, Ab-[FGF21 -1 er I i g a d o r] 1 y [2do ligador-Ex4] se pueden combinar a Temperatura Ambiente. En ciertos aspectos, Ab-[FGF21 -1 er I i g a d o r ] 1 y [2do ligador-Ex4] se pueden combinar entre aproximadamente 17°C hasta aproximadamente 22°C. En ciertos aspectos, Ab-[FG F21 -1 er ligador]! y [2do Mgador-Ex4] se puede combinar a aproximadamente 19°C.
En ciertos aspectos, Ab-[FGF21 -1 er I igador] 1 y [2do ligador-Ex4] se pueden combinar después de una reacción de por lo menos 6 horas. En ciertos aspectos, Ab-[FGF21 -1 er ligador]! y [2do ligador-Ex4] se pueden combinar después de una reacción de por lo menos 8 horas. En ciertos aspectos, Ab-[FGF21-1 er ligador], y [2do ligador-Ex4] se puede combinar después de una reacción de por lo menos 12 horas. De acuerdo a otra modalidad de un proceso para generar compuestos de la invención, el proceso comprende las etapas: (i) mezclar Ex4 y 2do ligador juntos en una relación de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2, para formar el complejo [2do ligador-Ex4]; (ii) mezclar [2do ligador-Ex4] y Ab juntos a una relación de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:3 para formar una mezcla que contiene [Ab], [Ab]-[2do ligador-Ex4]1 y [Ab]-[2do ligador-Ex4]2; (iii) extraer las moléculas [Ab]-[2do ligador][Ex4]1 a partir de la mezcla formada en (ii); (iv) mezclar FGF21 y el 1er ligador juntos en una relación de entre aproximadamente 1:4 y aproximadamente 1:1 para formar el complejo [FGF21-1er ligador]; (v) mezclar [FGF21-1er ligador] con [Ab]-[2do ligador-Ex4] en una relación de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2 para formar la mezcla que contiene [FGF21-1er ligador]! -[Ab]-[2do Mgador-Ex4]1.
[FGF21-1er ligador] y [Ex4-2do ligador] puede ser preparado como se describió con anterioridad.
Generación de [Ex4-2nd ligador]1-Ab En ciertas modalidades, [2do Mgador-Ex4] y Ab puede ser conjugados juntos en una relación desde aproximadamente 0.5:1 hasta aproximadamente 1:3 para formar [Ab]-[2do ligador-Ex4] 1. En ciertas modalidades, la relación puede ser de aproximadamente 0.6:1. En ciertas modalidades, la relación puede ser de aproximadamente 0.7:1. En ciertas modalidades, la relación puede ser de aproximadamente 0.75:1. En ciertas modalidades, la relación puede ser de aproximadamente 0.8:1. En ciertas modalidades, la relación puede ser de aproximadamente 0.9:1. En ciertas modalidades, la relación puede ser de aproximadamente 1:1. En ciertas modalidades, la relación puede ser de aproximadamente 1.1:1. En ciertas modalidades, la relación puede ser de aproximadamente 1.2:1. En ciertas modalidades, la relación puede ser de entre aproximadamente 1 :1 y aproximadamente 0.5:1. En ciertas modalidades, la relación puede ser de aproximadamente 0.7:1.
En ciertas modalidades, cuando la relación de [2do Mgador-Ex4] y Ab es de aproximadamente 1 :1 , esto proporciona la cantidad máxima de especies [Ab]-[2do ligador-Ex4]1 , con relación a Ab no conjugado y [Ab]-[2do ligador-Ex4]2. Cuando la relación es de aproximadamente 1 :1 , se observa una distribución favorable de aproximadamente 40-50% [Ab]-[2do ligador-Ex4]1 , juntos con aproximadamente 25% de Ab no conjugado, y aproximadamente 25% Ab-[2do ligador-Ex4]2.
Sin embargo, a fin de purificar [Ab]-[2do Mgador-Ex4]i a partir de la mezcla, es ventajoso intentar reducir al mínimo la cantidad de [Ab]-[2do ligador-Ex4]2, ya que estas especies pueden interferir con la extracción de Ab-[2do ligador-Ex4]-, . Además, [Ab]-[2do ligador-Ex4]2 representa el material que no puede ser reciclado. Por lo tanto, es ventajoso también reducir al mínimo la formación de Ab- [2do ligador-Ex4]2. Para hacer esto, la cantidad de [2do ligador-Ex4] puede ser reducida desde aproximadamente 1 equivalente hasta aproximadamente 0.7 equivalente, o incluso tan bajo como y 0.5 equivalente (en comparación al anticuerpo). Al reducir la cantidad de [2do ligador-Ex4] en comparación a Ab, se puede reducir al mínimo la formación de las especies [Ab]-[2do ligador-Ex4]2.
En tanto que la reducción de la relación de [2do ligador-Ex4] a Ab puede ayudar a mejorar el equilibrio de los productos formados para favorecer Ab-[2do Mgador-Ex4]1 en relación a [Ab]-[2do ligador-Ex4]2, esto necesita compensar la necesidad de la reacción para proporcionar un rendimiento tolerable, y para reducir al mínimo la cantidad de anticuerpo no conjugado y, por tanto, estrictamente innecesario, al final de la reacción. Por lo tanto, la reducción de la relación de [2do I igador-Ex4] : [Ab] por debajo de aproximadamente 0.5:1 puede reducir el rendimiento general de Ab-[2do Mgador-Ex4]1. Se ha encontrado de manera sorpresiva que la relación óptima de [2do ligador-Ex4]:[Ab] está entre aproximadamente 0.5:1 y aproximadamente 1:1. En ciertas modalidades, la relación de reacción puede estar dentro de un rango de dos relaciones, definido por un límite inferior seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 0.5:1, aproximadamente 0.6:1, aproximadamente 0.7:1, aproximadamente 0.8:1, aproximadamente 0.9:1 y un límite superior seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 0.6:1, aproximadamente 0.7:1, aproximadamente 0.8:1, aproximadamente 0.9:1 y aproximadamente 1:1. En ciertos aspectos, la relación es de entre aproximadamente 0.6:1 y aproximadamente 0.8:1. En ciertos aspectos, la relación es de aproximadamente 0.7:1.
Las relaciones ventajosas de [2do iigador-Ex4]:[Ab] de la invención ayudan a reducir al mínimo la formación de [Ab]-[2do ligador-Ex4]2 en tanto que se mantiene la cantidad de formación de [Ab]- [2do I igador-Ex4] ! . Al reducir la cantidad de [2do ligador-Ex4], se puede convertir el péptido en tanto que se mantienen aún los rendimientos. Al incrementar la cantidad de [2do ligador-Ex4] más allá de 1 equivalente (por ejemplo, [2do I igador-Ex4] : [Ab] = aproximadamente 1.25:1 hasta aproximadamente 2:1), la formación de especies Ab-[2do ligador-Ex4]2 se incrementa drásticamente y se reduce la cantidad de Ab-[2do Mgador-Ex4] 1 , el producto deseado. Cantidades superiores de [2do ligador-Ex4] en comparación a Ab (en base equivalente) resulta en una drástica caída en la cantidad de formación de Ab-[2do ligador-Ex4]-i .
La formación de [Ab]-[2do ligador-Ex4] entre péptido Ex4 y anticuerpo puede ocurrir a un pH entre aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8. En ciertas modalidades, especialmente cuando el 2do ligador es L1, el ligador conectado a Ex4 es relativamente más estable que bajo condiciones ácidas. Sin embargo, bajo condiciones ácidas la reacción de conjugación es más lenta. Bajo condiciones básicas (pH aproximadamente 7) la reacción de conjugación es más rápida; sin embargo, el ligador fijado a Ex4 puede experimentar hidrólisis. Por lo tanto es crítico identificar una condición que muestra estabilidad razonable y conjugación eficiente.
Las condiciones más cercanas a pH neutro (aproximadamente 6.5-aproximadamente 7.5) muestran mayor estabilidad para el ligador con eficiencia de reacción acompañante. En tanto que la conjugación funciona a un pH de aproximadamente 7, parece que la estabilidad del ligador y la eficiencia de conjugación son mejores a un pH de aproximadamente 6.5.
En tanto que la reacción es viable en agua simple, es mucho más deseable tener un sistema regulado en pH en donde se puede mantener el pH a fin de mejorar la eficiencia de conjugación. Varios sistemas reguladores de pH que incluyen formulación de solución reguladora de pH (conformada por glicina, histidina, sacarosa), solución reguladora de pH de (ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinetanesulfónico), solución reguladora de ácido N-ciclohexil-3-aminopropansulfónico, solución reguladora de ácido 3-(N-morfolino)propansulfónico, solución reguladora de ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico, solución reguladora de ácido 3-[4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinil]propansulfónico.
En ciertos casos se puede utilizar solución reguladora de pH de fosfato, aunque puede promover la agregación de anticuerpo. Se pueden emplear otras soluciones reguladoras de pH para mantener el pH entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. El pH apropiado, junto con la solución reguladora de pH adecuada, desempeña un rol crítico en la formación de la cantidad máxima de Ex4 y aducto de anticuerpo. La solución reguladora de fusión de anticuerpo (que comprende histidina, sacarosa, glicina, pH 6.5-7.5, de preferencia pH de aproximadamente pH 7) parece tener todas las cantidades que se esperan en una solución reguladora de pH para la reacción de conjugación. Dependiendo de la solución reguladora de pH, el tiempo de reacción para conjugar Ex4 para el anticuerpo puede variar en cualquier rango entre aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 24 horas. En la mayoría de las soluciones reguladoras de pH, los tiempos de reacción son de entre aproximadamente 6 hasta aproximadamente 14 horas. En la solución reguladora de fusión de anticuerpo, la reacción es completada en aproximadamente 12 hasta aproximadamente 15 horas. El tiempo de reacción para conjugar [2do ligador-Ex4] para Ab puede estar entre dos puntos de tiempo; el más bajo de los cuales puede ser de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 4, aproximadamente 6, aproximadamente 8, aproximadamente 12 horas o aproximadamente toda la noche, y el punto superior de los cuales puede ser de aproximadamente 2, aproximadamente 4, aproximadamente 6, aproximadamente 8, aproximadamente 12, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 36, y aproximadamente 48, horas.
En ciertas modalidades, la reacción de conjugación entre [2do ligador-Ex4] y Ab puede ocurrir entre aproximadamente 5°C y aproximadamente 40°C. A mayor temperatura, la reacción de conjugación es más rápida. Sin embargo, la estabilidad del péptido y ligador puede estar comprometida al mantenerlos a mayor temperatura durante más tiempo. A medida que se reduce la temperatura, se mejora la estabilidad del anticuerpo, péptido y el ligador, aunque la eficiencia de conjugación es sometida a graduación de temperatura. La temperatura entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 25°C es la de mayor preferencia. La temperatura entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C ofrece eficiente conjugación y estabilidad de los reactivos y productos. La temperatura a la cual se conjuga [2do ligador-Ex4] para Ab puede estar dentro de un rango definido por un límite inferior y uno superior; el límite inferior de I os cuales puede ser de aproximadamente 10, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21 grados Celsius, y el lí m ite superior de los cua les puede ser de aproximadamente 1 , aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 18, aproximadamente 20, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, y aproximadamente 34, grados Celsius.
Extracción de [2do I igador-Ex4] 1 -Ab La mezcla de conjugación contiene el anticuerpo libre ([Ab]), el anticuerpo con un péptido Ex4 conjugado ([Ab]-[2do Mgador-Ex4]1), y el anticuerpo con 2 péptidos Ex4 conjugados ([Ab]-[2do ligador-Ex4]2), además de los conjugados libres [2do Mgador-Ex4]. La siguiente etapa involucra la purificación de [Ab]-[2do ligador-Ex4] 1 del resto de los materiales. En ciertos aspectos, el material puede ser purificado utilizando columnas de cromatografía tal como columna de butilo, columna de carboximetilo y columna de intercambio iónico tal como columna de intercambio de catión fuerte. Los solventes adecuados para eluir los conjugados de anticuerpo incluyen soluciones reguladas. El pH de las soluciones reguladoras puede estar entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. Las soluciones reguladoras de pH acuosas pueden estar conformadas por cualquiera de una o la combinación de sulfato de amonio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, cloruro de sodio, acetato de sodio, hidróxido de amonio, o ácido 2-amino-2-hidroximetil-propan-1 ,3-diol 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1 -iljetansulfónico, con o sin un co-solvente orgánico tal como isopropanol, propanol, butanol, o alcohol etílico.
Conjugación de Ab-[2do Mgador-Ex4]1 con [FGF21-1er ligador] El mezclado del [1er ligador-FGF21 ] con [Ab]-[2do Mgador-Ex4]1 en una relación de entre aproximadamente 3:1 hasta aproximadamente 1 :1 resulta en la formación de la molécula [FGF21-1er I i g a d o r] 1 -[Ab]-[2do ligador-Ex4] 1. En tanto que una relación de aproximadamente 1 :1 proporciona una cantidad razonable de producto, el incremento de la cantidad de [FGF21-1er ligador] hasta aproximadamente 2-veces mejoró la formación de la molécula [FGF21-1er I ¡gado r] -[Ab]-[2d o ligador-Ex4]1 , y en aproximadamente 3 veces, se mejoró de manera adicional la formación de [FGF21-1er ligador] 1 -[Ab]-[2do Mgador-Ex4 . Sin embargo, el incremento de la cantidad de [FGF21-1er ligador] en más de aproximadamente 3 veces no mejora la eficiencia de formación de la molécula [FGF21-1er ligador] 1-[Ab]-[2do ligador-Ex4]1.
En ciertas modalidades, la conjugación de [2do ligador-Ex4] con [Ab] en la relación de 0.7:1 utilizando el proceso de la invención como se describió produce aproximadamente 35% de anticuerpo nó conjugado; aproximadamente 48% [Ab]-[2do ligador-Ex4] , ; y aproximadamente 17% [Ab]-[2do Mgador-Ex4]2 en la etapa (ii) anterior. En ciertas modalidades, el anticuerpo conjugado, [Ab]-[2do ligador-Ex4] 1 ; y [Ab]-[2do Mgador-Ex4]2 fueron separados utilizando HPLC equipada con columna CM Sepharose empleando solución reguladora de carga (sulfato de amonio entre 0.6M hasta 0.9M, fosfato de sodio entre 25 mM hasta 75 mM, pH entre 6.5 y 7.5) y eluído con una solución reguladora de elución (15 hasta 25% alcohol isopropílico en 25 mM hasta 75 mM fosfato de sodio, pH entre = 6.5 y 7.5). Se consideró también NaCI en lugar del sulfato de amonio como un componente en la solución reguladora de carga. La separación de anticuerpo no conjugado, [Ab]-[2do ligador-Ex4]1 ; y [Ab]- [2do ligador-Ex4]2 utilizando sulfato de amonio fue comparable a NaCI. La columna HPLC fue empacada con resina CM Sepharose como fase estacionaria. La columna fue equilibrada con la solución reguladora de carga mencionada con anterioridad. El rango de las concentraciones de solución reguladora y pH's funcionaría en aislamiento de [Ab]-[2do ligador-Ex4]i como se mencionó antes. Se encontró que la separación utilizando solución reguladora de carga (sulfato de amonio 0.75 , fosfato de sodio 50 mM, pH = 7) y eluído con una solución reguladora de elución (20% alcohol isopropílico en 50 mM fosfato de sodio, pH = 7) proporcionó un rendimiento consistentemente mejor. Las fracciones que contienen [Ab]-[2do ligador-Ex4] 1 se combinaron, extrajeron por medio de UF/DF en una Solución Reguladora de Fusión de Anticuerpo, que comprende histidina (5 mM hasta 25 mM), glicina (5 mM hasta 25 mM), y sacarosa (0.5 hasta 5%) y pH entre 6 hasta 8. La solución reguladora que contiene 10mM Histidina, 10mM Glicina, 2% Sacarosa, pH = aproximadamente 6.5, proporcionó un rendimiento consistentemente mejor. El anticuerpo no conjugado separado desde [Ab]-[2do ligador-Ex4]1 usando las condiciones de solución reguladora puede ser ciclado x3 para lograr un índice de extracción de aproximadamente 70%.
Composiciones Farmacéuticas Otro aspecto de la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden composiciones y/o compuestos de la invención. Las agentes que comprenden composiciones de la invención pueden ser formulados y administrados de manera sistémica. Las técnicas para formulación y administración se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA.
Para inyección, las composiciones de la invención pueden ser formuladas en soluciones acuosas, emulsiones o suspensiones, o soluciones no acuosas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o polvos estériles o liofilizados adecuados para reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. Ejemplos de diluyentes, solventes, y vehículos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como propilen glicol, polietilen glicol, glicerol, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites. Se puede mantener o mejorar la fluidez, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, a través de mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de agentes tensioactivos.
Las composiciones de la invención pueden ser formuladas en soluciones acuosas que contienen soluciones reguladoras fisiológicamente compatibles tales como citrato, acetato, histidina o fosfato. Cuando sea necesario, esas formulaciones pueden contener también varios agentes de ajuste de tonicidad, agentes de solubilización y/o agentes de estabilización (por ejemplo, sales como cloruro de sodio, azúcares tales como sacarosa, manitol, y trehalosa, proteínas tales como albúmina, aminoácidos tales como glicina e histidina, agentes tensioactivos tales como polisorbatos (Tweens), o cosolventes como etanol, polietilen glicol y propilen glicol). Las composiciones de la invención pueden contener también adyuvantes, como agentes de humectación, agentes de emulsificación y suspensión, agentes de dispersión, y agentes de conservación. Las composiciones de la invención también pueden comprender agentes de suspensión, tales como agar-agar, metahidróxido de aluminio, bentonita, alcoholes isoestearílicos etoxilados, celulosa microcristalina, polioxietilen sorbitol y ésteres de sorbitan, y tragacanto, o mezclas de los mismos.
Las composiciones de la invención pueden comprender también varios agentes antibacteriales y antifungales, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio, y similares. La absorción prolongada de las composiciones inyectables de la invención puede ser afectada por el uso de agentes capaces de retrasar la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las composiciones de la invención pueden contener materiales de formulación para modificar, mantener, o preservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, aunque no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina, o Usina), antimicrobiales, antioxidantes (tales como ácido L-metionina ascórbico, sulfito de sodio, o hidrogen-sulfito de sodio), soluciones reguladoras (tales como acetato de sodio, lactato, borato, bicarbonato, Tris-HCI, citratos, fosfatos, u otros ácidos orgánicos), agentes volumétricos (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (como ácido etilendiamin tetraacético (EDTA), OPTA), agentes formados de complejo (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina, o hidroxipropil- beta-ciclodextrina), rellenos, monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos (tales como glucosa, mañosa, o dextrinas), proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas), agentes colorantes, saborizantes y diluyentes, agentes de emulsificación, polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de sal (tal como sodio), conservadores (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico, o peróxido de hidrógeno), solventes (tales como glicerina, propilen glicol, o polietilen glicol), alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol), agentes de suspensión, agentes tensioactivos o agentes de humectación (tales como Pluronics™; PEG; ésteres de sorbitan; polisorbatos tales como polisorbato 20 o polisorbato 80; tritón; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapal), agentes mejoradores de estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol), agentes mejoradores de tonicidad (como aluros de metal alcalino, de preferencia cloruro de sodio o de potasio, manitol o sorbitol), vehículos de suministro, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos.
Los componentes de formulación pueden estar presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Las soluciones reguladoras de pH pueden ser utilizadas para mantener la composición en un pH fisiológico o en un pH ligeramente menor, de manera común dentro de un rango de pH desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8.
En ciertos aspectos, se pueden preparar composiciones farmacéuticas de la invención en donde los compuestos de la invención son formulados para la liberación controlada o sostenida del compuesto. Los ejemplos incluyen ácido hialurónico y similares, geles poliméricos, esferas, partículas, microesferas inyectables, liposomas, películas, microcápsulas, matrices de liberación sostenida, y dispositivos de suministro de fármaco implantables.
En ciertos aspectos, se proporcionan composiciones farmacéuticas de la invención en jeringas pre-llenadas de cámara individual o multi-cámara.
En ciertos aspectos, la invención proporciona un equipo que comprende por lo menos un compuesto o composición de la invención junto con por lo menos un ingrediente adicional adecuado para uso en una composición farmacéutica. En ciertos aspectos, la invención proporciona un equipo que comprende por lo menos un compuesto o composición de la invención junto con al menos un medio para suministro de dicha composición a un paciente.
La invención también es acerca de composiciones que comprenden [FGF21 -1 er Ligador]-[Ab]-[2d0-Ligador-Ex4]; en donde FGF21 es un homólogo de FGF21; y Ex4 es un homólogo de Exendin4; y Ab es un anticuerpo catalítico de aldolasa o porción de enlace de antígeno del mismo; y el 1er ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de proteína en FGF21 y a un sitio de combinación del anticuerpo, y el 2d0 ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de péptido en Ex4 y a un sitio de combinación del anticuerpo, y en donde el primero y segundo ligador son iguales o diferentes para uso en una o más terapias como se describe en la presente. Se proporciona también el uso de composiciones de la invención en el tratamiento de una o más condiciones descritas en la presente. Asimismo se proporciona el uso de composiciones de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una o más enfermedades o padecimientos como se describieron en la presente.
Métodos de uso Para uso terapéutico en humanos, un anticuerpo humano, humanizado, o quimérico humano o porción de enlace de antígeno del mismo es una forma preferida de la porción de anticuerpo del compuesto o composición de la invención.
Un aspecto de la invención es un método para tratar la diabetes o una condición relacionada con la diabetes que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención a un sujeto que padece de diabetes o una condición relacionada con la diabetes.
Otro aspecto de la invención es un método para incrementar la secreción de insulina en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para reducir los niveles de glucosa en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para tratar la obesidad en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para controlar o reducir los niveles de peso en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para tratar la dislipidemia en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para tratar la hipertensión en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para tratar la esteatosis hepática en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para tratar enfermedad cardiovascular en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para reducir los niveles de glucagón en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para reducir los niveles de triglicéridos en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para incrementar los niveles de ácidos grasos libres no-esterificados en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para reducir los niveles de colesterol de baja densidad en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para reducir los niveles de proteína C-reactiva en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para reducir los niveles de fructosamina en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para controlar el control glicémico en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para incrementar los niveles de adipsina en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma.
Otro aspecto de la invención es un método para incrementar los niveles de HDL en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o un derivado farmacéutico de la misma En ciertos aspectos, la invención proporciona un método para tratar condiciones relacionadas con la diabetes, obesidad, dislipidemia, hipertensión, esteatosis hepática, o enfermedad cardiovascular; o controlar o reducir los niveles de peso; o controlar el control glicémico; o incrementar la secreción de insulina, o los niveles de ácidos grasos libres no esterif icados, HDL o adipsina; o reducir los niveles de glucosa en sangre, glucagón, triglicérido, fructosamina, colesterol de baja densidad, o proteína C-reactiva; que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o una composición farmacéutica de la invención a un sujeto.
En ciertos aspectos, la invención proporciona el uso de una composición o una composición farmacéutica de la invención en la preparación de un medicamento parta tratar condiciones relacionadas con la diabetes, obesidad, dislipidemia, hipertensión, esteatosis hepática, o enfermedad cardiovascular; o controlar o reducir los niveles de peso; o controlar el control glicémico; o incrementar la secreción de insulina, HDL, o niveles de ácidos grasos libres no esterificados; o reducir los niveles de glucosa en sangre, glucagón, triglicérido, fructosamina, colesterol de baja densidad, o proteína C-reactiva.
El término "dosis terapéuticamente efectiva", como se usa en la presente, representa aquella cantidad de compuesto, composición o composición farmacéutica de la invención que provoca la respuesta biológica o medicinal en un sistema de tejido, animal, o ser humano buscada por un investigador, médico, u otro personal clínico, la cual incluye alivio de los síntomas de una enfermedad o padecimiento que se está tratando.
Métodos de Administración y Dosificaciones Las rutas de administración de la composición de la invención pueden incluir suministro parenteral, que incluye inyecciones intramusculares, SC, o intramedulares, así como suministro intratecal, intraventricular directo, IV, e intraperitoneal. En ciertas modalidades, la administración es intravenosa. Las composiciones de la invención pueden ser administradas a través de cualesquiera de las rutas parenterales ya sea mediante inyección directa de la formulación o por medio de infusión de una mezcla de la formulación de la composición de la invención con una matriz de infusión tal como solución salina normal, D5W, solución de Ringers lactato u otro medio de infusión normalmente utilizado.
Para tratar a mamíferos, que incluyen seres humanos, que tienen diabetes o una condición relacionada con diabetes (o en ciertos aspectos, una o más de las siguientes condiciones: diabetes, obesidad, dislipidemia, hipertensión, esteatosis hepática, enfermedad cardiovascular, altos niveles de glucosa en sangre, bajos niveles de insulina, o cualquiera de las condiciones descritas en la presente o una condición asociada con los síntomas aquí descritos), se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención o derivado farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, una composición de la invención puede ser administrada como una infusión IV diaria desde aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal. En consecuencia, algunas modalidades proporcionan una dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg de peso corporal. Otras modalidades proporcionan una dosis de aproximadamente 0.75 mg/kg de peso corporal. Otras modalidades proporcionan una dosis de aproximadamente 1.0 mg/kg de peso corporal. Otras modalidades proporcionan una dosis de aproximadamente 2.5 mg/kg de peso corporal. Otras modalidades proporcionan una dosis de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. Otras modalidades proporcionan una dosis de aproximadamente 10.0 mg/kg de peso corporal. Otras modalidades proporcionan una dosis de aproximadamente 15.0 mg/kg de peso corporal. Las dosis de una composición de la invención o derivado farmacéuticamente aceptable será administrada en intervalos desde aproximadamente una vez al día hasta 2 veces por semana, o de modo alternativo, desde aproximadamente una vez por semana hasta una vez por mes. En ciertas modalidades, una dosis es administrada para lograr concentraciones pico de plasma de una composición de la invención de acuerdo a la invención o derivado farmacéuticamente aceptable de la misma desde aproximadamente 0.002 mg/ml hasta 30 mg/ml. Esto se puede lograr por medio de inyección estéril de una solución de los ingredientes administrados en una formulación apropiada (se pueden usar cualesquiera soluciones de formulación adecuada conocidas por aquellos con experiencia en la técnica química). Los niveles en sangre deseables se pueden mantener a través de una infusión continua de la composición de la invención de acuerdo con la invención como se determino mediante los niveles en plasma medidos a través de metodología analítica validada.
Un método para administrar una composición de la invención a un individuo comprende administrar un conjugado FGF21 -ligador al individuo y permitir que forme el compuesto covalente con un sitio de combinación de un anticuerpo apropiado in vivo. La porción de anticuerpo de una composición de la invención que se forma in vivo puede ser administrada al individuo antes, al mismo tiempo o después de la administración del conjugado FGF21 -ligador. De modo alternativo, o adicional, un anticuerpo puede estar presente en la circulación del individuo después de la inmunización con un inmunógeno adecuado. Por ejemplo, los anticuerpos catalíticos pueden ser generados a través de inmunización con un intermediario reactivo del sustrato conjugado para una proteína portadora. En particular, anticuerpos catalíticos de aldolasa pueden ser generados mediante la administración con hemocianina de lapa californiana enlazada a la porción dicetona.
Por lo tanto la composición puede ser administrada como una dosis individual, como dos o más dosis (la mayor de las cuales puede contener la misma cantidad de la molécula deseada) a través del tiempo, o como una infusión continua a través de un dispositivo de implantación o catéter. La refinación adicional de la dosificación apropiada es efectuada de manera rutinaria por aquellos con experiencia en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas que ellos realizan de modo rutinario. Las dosificaciones adecuadas pueden ser determinadas a través del uso de datos de respuesta a dosis apropiados.
La ruta de administración de una composición farmacéutica es de conformidad con métodos conocidos, por ejemplo por vía oral, a través de inyección por rutas inyección SC, IV, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquinmal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, o intralesión; por medio de sistemas de liberación sostenida; o a través de dispositivos de implantación. Cuando se desee, las composiciones pueden ser administradas a través de inyección de bolo o continuamente a través de infusión, o mediante dispositivo de implantación.
De modo alternativo o adicional, la composición puede ser administrada a nivel local a través de implantación de una membrana, esponja u otro material adecuado sobre el cual se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se utiliza un dispositivo apropiado, el dispositivo puede ser implantado dentro de cualquier tejido adecuado u órgano, y el suministro de la molécula puede ser a través de difusión, bolo liberado de manera temporizada, o administración continua.
Terapias de Combinación En otro aspecto de la invención, se puede usar una composición de la invención en combinación con otros agentes terapéuticos empleados para tratar la diabetes o condiciones relacionadas con la diabetes, o para incrementar la secreción de insulina o reducir los niveles de glucosa en sangre, o para tratar cualquiera de las condiciones descritas en la presente. En una modalidad, una composición de la invención puede administrada en combinación con insulina, como por ejemplo insulina humana sintética, que incluye insulina de acción rápida, de corta duración, de acción intermedia, o de acción prolongada. En otras modalidades, una composición de la invención puede ser administrada en combinación con compuestos que pertenecen a las familias de inhibidor de a-glucosidasa, sulfonilurea, meglitinida, biguanida, o tiazolidindiona (TZD). Las composiciones de la invención también pueden ser administradas en combinación con proteínas o péptidos modificadores de metabolismo tales como glucocinasa (GK), proteína reguladora de glucocinasa (GKRP), proteínas de desacoplamiento 2 y 3 (UCP2 y UCP3), glucagón, péptido similar a glucagón 1 y 2 (G i p 1 y Glp2), una exendina, (tal como Exendin4), polipéptido inhibidor gástrico (GIP), receptor a activado por proliferador de Glp2peroxisoma (PPARa), receptor de leptina (OB-Rb), inhibidores DPP-IV, sulfonilureas, u otros péptidos de incretina. Alguien con experiencia en la técnica conocería una amplia variedad de agentes que son utilizados actualmente en el tratamiento de la diabetes o condiciones relacionadas con la diabetes.
A fin de evaluar la eficacia terapéutica potencial de una composición de la invención o derivado farmacéuticamente aceptable de la misma en combinación con otros agentes terapéuticos usados para tratar la diabetes o condiciones relacionadas con la diabetes, incrementar la secreción de insulina, o reducir los niveles de glucosa en sangre, estas combinaciones pueden ser probadas utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la habilidad de una combinación de una composición de la invención y otro agente terapéutico para incrementar la secreción de insulina se puede medir utilizando un ensayo de secreción de insulina glucosa-estimulada in vitro. En dicho ensayo, se trataron células ß pancreáticas con varias concentraciones de glucosa durante un período establecido, y se midieron los niveles de insulina empleando métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo un radioinmunoensayo. El efecto de las composiciones de la invención y otros agentes terapéuticos sobre la secreción de insulina también se puede medir in vivo, a través de la administración de los agentes directamente a un sujeto y medir los niveles de insulina en las muestras de fluidos corporales en varios puntos de tiempo. Los métodos para la administración de los agentes terapéuticos conocidos a un sujeto para uso en las terapias de combinación serán bien conocidos por los prestadores de servicios de cuidado de la salud.
Las dosificaciones efectivas de la composición de la invención que se van a administrar pueden ser determinadas a través de procedimientos bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica los cuales resuelven parámetros tales como vida media biológica, biodisponibilidad, y toxicidad. Las cantidades efectivas de agentes terapéuticos que se usarán en combinación con la composición de la invención o derivados farmacéuticamente aceptables de la misma se basan en las dosis recomendadas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica para estos agentes. Estos niveles recomendados o conocidos se reducirán de manera preferible en 10% hasta 50% de la dosificación citada después de probar la efectividad de estas dosificaciones en combinación con una composición de la invención o un derivado farmacéuticamente aceptable. Se observará que el medico tratante sabría como y cuando terminar, interrumpir, o ajustar la terapia para reducir la dosificación debido a la toxicidad, disfunciones de médula ósea, hígado o riñon o interacción fármaco-fármaco adversa. El médico tratante también sabría como ajustar el tratamiento a niveles superiores si la respuesta clínica es inadecuada (que excluye la toxicidad).
Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a aquella cantidad del compuesto suficiente para dar como resultado un mejoramiento de los síntomas o una prolongación de la sobrevivencia en un paciente. La concentración in vitro efectiva de una composición de la invención se puede determinar al medir la toxicidad EC50. La toxicidad y la eficacia terapéutica de esos agentes in vivo se puede determinar a través de procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivo celulares y los estudios en animal pueden ser utilizados en la formulación de un rango de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos radica de preferencia dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con menor o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma dosificación empleada y la ruta de administración empleada. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva se puede calcular inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos de animal para lograr un rango de concentración en plasma circulante que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición media máxima de la producción RT a partir de células infectadas en comparación con el control no tratado como se determinó en cultivo celular). Dicha información puede ser utilizada a fin de determinar de modo más preciso las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, a través de cromatografía en líquido de alto rendimiento (HPLC).
En aquellas modalidades en donde las composiciones de la invención son administradas en combinación con otros agentes terapéuticos, el efecto combinado de los agentes se puede calcular a través del método de análisis de fármaco múltiple de Chou y Talalay (T.C. Chou and P. Talalay, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55 (1984)) utilizando la ecuación: en donde Cl es el índice de combinación, (Dx), es la dosis de fármaco 1 requerida para producir x efecto porcentual x solo, D-¡ es la dosis de fármaco 1 requerida para producir el mismo efecto porcentual x en combinación con D2. Los valores de (Dx)2 y (D)2 son derivados de manera similar a partir del fármaco 2. El valor de a es determinado a partir de la gráfica de la curva de efecto de dosis utilizando la ecuación de efecto medio: en donde fa es la fracción afectada por la dosis D, fu es la fracción no infectada, Dm es la dosis requerida para 50% de efecto y m es la inclinación de la curva de efecto de dosis. Para fármacos mutuamente exclusivos (es decir, modos similares de acción), ambos fármacos solos y sus líneas paralelas en la gráfica de efecto medio. Los fármacos mutuamente no exclusivos fes decir, modo de acción independiente) producirán líneas paralelas en la gráfica de efecto medio, aunque en la mezcla producirá una curva ascendente cóncava. Si los agentes son mutuamente exclusivos a es 0, y si son mutuamente no-exclusivos, a es 1. Los valores obtenidos asumiendo fármacos mutuamente no exclusivos siempre serán mayores que los de fármacos mutuamente exclusivos. Los valores Cl de <1 indican sinergia, los valores >1 indican antagonismo y los valores iguales a 1 indican efectos aditivos. Los efectos de fármaco combinados también pueden ser calculados utilizando el paquete de software CalcuSyn a partir de Biosoft (Cambridge, UK).
Los compuestos de acuerdo con la invención pueden ser solvatados, en especia hidratados. La hidratación puede ocurrir durante la elaboración de los compuestos o composiciones que comprenden los compuestos, o la hidratación puede ocurrir con el paso del tiempo debido a la naturaleza higroscópica de los compuestos. Los compuestos de la invención pueden ser Iiofilizados.
La invención proporciona también estereoisómeros, tautómeros, solvatos, profármacos, y sales farmacéuticamente aceptables de compuestos de la invención. La invención proporciona también compuestos de acuerdo con cualquiera de las secuencias aquí descritas.
DEFINICIONES "Alrededor de" o "aproximadamente", cuando se usa en relación con una variable numérica medible, se refiere al valor indicado de la variable y a todos los valores de la variable que están dentro del error experimental del valor indicado (por ejemplo, dentro del 95% de intervalo de confianza para la media) o dentro del 10 por ciento del valor indicado, cualquiera que sea mayor.
Aib es ácido 2-aminoisobutírico, y tiene la estructura: Homólogo Exendin4" representa una molécula con por lo menos 80%, y de preferencia por lo menos 85%, de mayor preferencia por lo menos 90% y de la mayor preferencia por lo menos 95% de identidad con Exendin4 de tipo natural (NO ID SEC: 35), y que enlaza el receptor péptido 1 similar a glucagón (GLP1R) con una afinidad igual a o mayor que aquella de Exendin4 tipo natural, o dentro de por lo menos 2 log inferior. Los homólogos Exen di n4 incluyen variantes (que comprenden eliminaciones, adiciones y sustituciones de aminoácido natural) y derivados (que comprenden adiciones y sustituciones de aminoácido no-natural y/o modificación química adicional). En ciertos aspectos, el homólogo de Exendin4 puede ser seleccionado a partir de una de las secuencias Ex4 proporcionadas en la presente.
"Homólogo FGF21" representa una molécula con por lo menos 80%, y de preferencia por lo menos 85%, de mayor preferencia por lo menos 90% y de la mayor preferencia por lo menos 95% de identidad con FGF21 humano tipo natural (NO ID SEC: 2), y se enlaza a cada uno de FGFRIe y 13-Kiotho con una afinidad igual a o mayor que aquella del FGF21 tipo natural, o dentro de por lo menos 2 log inferior. Los homólogos de FGF21 incluyen variantes (que comprenden eliminaciones, adiciones y sustituciones de aminoácido natural) y derivados (que comprenden adiciones y sustituciones de aminoácido no-natural y modificación química adicional). Están incluidos también los polmorfismos conocidos (tal como P/L146). En ciertos aspectos, el homólogo de FGF21 puede ser seleccionado a partir de una de las secuencias de FGF21 proporcionadas en la presente.
SECUENCIAS NO ID SEC: 1 muestra la proteína expresada residuo-181 en donde H1 es opcional y el residuo 146 puede ser L o P. las porciones de residuo probadas para la conjugación están subrayadas y en negrillas. Se usa la numeración de NO ID SEC: 1.
Se muestra también la secuencia de aminoácido de la cadena ligera y pesada (NOs ID SEC:25 y 26, respectivamente) de una modalidad de un 38c2 I g G 1 humanizado. Las regiones variables (VC y VH) son subrayadas y las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) presentadas en negrillas. Lisina 99, cuya cadena lateral se combina de modo covalente con los ligadores descritos en la presente, está adyacente a HC CDR3.
Breve Descripción de los Dibujos Figura 1. Alineación de secuencia de aminoácido de los dominios variables de m38c2, h38c2, y líneas germinales humanas. Las regiones de estructura (FR) y CDRs están definidas de acuerdo con Kabat et al. Los asteriscos marcan diferencias entre m38c2 y h38c2 o entre h38c2 y las líneas germinales humanas.
Figura 2A, 2B, y 2C. Estudios farmacocinéticos de ratón de dosis única con Ab-FGF21 ??-?129C conjugado con Ligador-1 (L-1) en comparación con L-2, L-3, o L-4. Ratones machos adultos jóvenes Swiss-Webster fueron dosificados IV o SC a 3 mg/kg. En todos los casos, el conjugado con L-1 tuvo un mejor comportamiento con respecto a la vida media (-33 horas SC e IV para conjugado L-1, 13-23 horas SC y 22-37 horas IV para conjugados L-2, -3, y -4) y/o biodisponibilidad SC (~ 100% para conjugado L-1, 48-53% para conjugados L-2, -3, o -4).
Figura 3A. Estudio farmacocinético de rata de dosis única con Ab-FGF21 ??-?129e conjugado con L-1 en comparación con L-2. Ratas macho adulto Sprague Dawley fueron dosificadas ya sea IV o SC a 3 mg/kg. Para ambas rutas de administración, el conjugado con L-1 tuvo un mejor comportamiento que el conjugado L-2 con respecto a la vida media (~ 39 horas SC y ~ 60 horas IV para el conjugado L-1, ~ 33 horas SC y ~ 52 horas IV para conjugado) y biodisponibilidad SC (~ 52% para conjugado L-1, 36% para conjugado L-2). Figura 3B. Comparación de PK de Ab-L1-FGF21 ?1 H-D79C, Ab-L7-FG F21 ??-D79C, y Ab-L8-FGF21 AH-D79C.
Figuras 4A y 4B. Área bajo la curva de glucosa (AUC) durante las prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) en ratones ob/ob a los que se suministró una dosis única SC (AUC de Glucosa Media (% de control de vehículo) en corchetes):Vehículo [100], FGF21A1H (1 mg/kg [74]), FGF21 ? 1 H (0.6 mg/kg [103]) (no mostrado en Figura 4B para claridad), Ab-FGF21 ??-?125C (3 mg/kg [66] y 1mg/kg [87]) (conjugado con L1), Ab-FGF21 ??-?59 (3 mg/kg [105]) (conjugado con L5), Ab-FGF21 ??-Knull-HIK (3 mg/kg [100]) (conjugado con L5), Control austero [56]. *P<0.05, **P<0.01 vs PBS mediante ANOVA unidireccional.
Figura 5A y 5B. Peso corporal acumulativo (A) y cambio de peso del hígado (B) durante OGTT en ratones ob/ob a los que se suministró una dosis única SC (peso corporal medio (g) en corchetes, peso de hígado medio (g) en llaves): Vehículo [2.6] {2.4}, FGF21 L1H (1 mg/kg [2.5] {2.2}), FGF21 ?? (0.6 mg/kg [3.2] {2.4}), Ab-FGF21 ??-?129C (3 mg/kg [1.7] {2.0}) (conjugado con L1), Ab-FGF21 AH-K59 (3 mg/kg [2.7] {2.4}) (conjugado con L5), Ab-FGF21 ??-Knull-HI K (3 mg/kg [2.6] {2.4}) (conjugado con L5), control austero [0.6] {1.0}. *P<0.05, **P<0.01 vs PBS mediante ANOVA bidireccional (A) y ANOVA unidireccional(B).
Figure 6A. Cambio de peso corporal acumulativo en ratones ob/ob a los que se suministró una dosis única (peso corporal medio (g) en corchetes): Vehículo [1.7], FGF21 ?? [1.9], FGF21 AH-D79C (2mg/kg [2.1]), Ab-FGF21 AH-D79C (10mg/kg [1.4]), Ab-FGF21 ??-H125C (10mg/kg [0.8]), y Ab-FGF21 ??-?1290 (10 mg/kg [0.9]), vehículo austero [0.6]. dO: día 0. Todos los conjugados usaron L1. **P<0.01 vs PBS medíante ANOVA bidireccional.
Figura 6B. AUC de Glucosa durante OGTT en ratones ob/ob se suministró una dosis única (AUC de glucosa media % en corchetes): vehículo [100], FGF21 ?? [63], Ab- FGF21 AH-D79C (2mg/kg [86]), FGF21 AH-D79C (10mg/ml [54]), Ab-FGF21 ??-?125C (10mg/ml [51]), y Ab-FGF21 ??-?129C (10 mg/kg [54]), control austero [48]. Todos los conjugados Ab usaron L1. **P<0.01 vs Vehículo mediante ANOVA unidireccional.
Figura 6C. AUC de Glucosa durante OGTT en ratones ob/ob a los que se suministró FGF21 ?? y Ab-FGF21 AH-D79C, (10 mg/kg). Ab-FGF21 AH-D79C fue conjugado con Ligador-1. **P<0.01 vs Vehículo.
Figura 6D. AUC de Glucosa durante OGTT en ratones ob/ob a los que se suministró FG F21 ? H y Ab-FGF21 ? H-D79C (10 mg/kg) en el día 6. Ab-FGF21 ? H-D79C fue conjugado con L1. **P<0.01 vs ob/ob-PBS.
Figura 6E. AUC de Glucosa durante OGTT conducido en d6 en ratones ob/ob a los que se suministró una dosis única de Ab-FG F21 ? H-A 129C en el dia 0, 1, 2, o 3 (3 mg/kg). Ab-FG F21 ??-A129C fue conjugado con L1. *P<0.05, ***P<0.001 vs PBS mediante ANOVA unidireccional.
Figure 6F. Una dosis única de Ab-FGF21 ??-?129C incrementa la expresión Ucp1 en tejido adiposo blanco en ratones ob/ob (10 mg/kg). Ab-FGF21 ??-?129C fue conjugado con fue conjugado con L1.
Figure 6G. Una dosis única de Ab-FG F21 ? H-A 129C reduce los triglicéridos hepáticos en ratones ob/ob (10 mg/kg). Ab-FGF21 AH-A129C fue conjugado con L1. *P<0.05, ***P<0.001 vs Vehículo mediante ANOVA unidireccional.
Figure 6H. Cambio de peso corporal acumulativo en ratones ob/ob a los que se suministro una dosis única de Ab-FGF21AH-A129C en el día 0, 1, 2, o 3 (10 mg/kg). Ab-FGF21 ??-?129C fue conjugado con L1.
Figura 7A. Dosis repetida de Ab-FGF21 ? H-A129C (10 mg/kg en el día 0 y 7) mejora la tolerancia de glucosa en ratones DIO. OGTT fue conducido en el día 10. Ab-FGF21 ? H-A129C fue conjugado con L1. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs Vehículo mediante ANOVA unidireccional.
Figura 7B. Cambio de peso corporal acumulativo en ratones DIO a los que se suministraron dos dosis de Ab-FGF21 ??-?129C en el día 0 y 7 (10 mg/kg). Ab-FGF2111H-A129C fue conjugado con L1. *P<0.05, vs Vehículo mediante ANOVA bidireccional.
Figura 7C. Dosis repetida de Ab-FGF21 ??-?129C incrementa la expresión Ucp1 en tejido adiposo blanco en ratones DIO (10 mg/kg). Ab-FG F21 H-A129C fue conjugado con L1. **P<0.01 vs Vehículo mediante ANOVA unidireccional.
Figura 7D. Ab-FGF21 ??-?129C reduce los triglicéridos en suero en ratones DIO (10 mg/kg). Figura 7E. Ab-FGF21 ??-?129C reduce los ácidos grasos no esterif icados en suero en ratones DIO (10 mg/kg). Figura 7F. Ab-FGF21 ??-?129C Peso del hígado. Ab-FGF21 LIH-A129C fue conjugado con L1. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs Vehículo (A, B) y vs PBC (C) mediante ANOVA unidireccional.
Figura 7G, 7H, 71. Efecto de Ab-FGF21 ??-?129C en la Expresión de Gen Hepático en Ratones oblob. (7G) SCD1 : estearoil-CoA desaturasa 1 , (7H) MOGAT2: monoaciglicerol aciltransferasa 2 (7i) FoxA2: factor de transcripción en forma de horquilla A2. Ab-FGF21 LIH-A129C fue conjugado con L1. **P<0.01 vs Vehículo mediante ANOVA unidireccional.
Figura 8. Glucosa en sangre durante OGTT 3 días después de la inyección SC repetida de compuestos en ratones db/db. Ab[FGF21]2= h38C2( 1 gG2)-[NO ID SEC: 10-L1 ]2. Ab[Ex4]2 = h38C2(1gG1)-[NO ID SEC: 64-L1]2. ABC-1= [NO ID SEC: 10-L1]i-[h38C2-lgG1]-[L1-NO ID SEC: 64],.
EJEMPLOS La versatilidad de la invención está ilustrada por los siguientes Ejemplos, los cuales muestran las modalidades comunes de la invención y no limitan las reivindicaciones o la especificación en forma alguna.
Ejemplo 1 identificación de sitio de enlace óptimo en FGF-21 Se realizó un estudio para identificar el sitio óptimo para conjugación de FGF21 a través de un ligador para un sitio de combinación de anticuerpo catalítico. Se consideraron dos estrategias de conjugación a través de una cadena lateral de lisina de superficie, y la conjugación a través de una cadena lateral de cisteína de superficie. De manera general, las proteínas globulares no tienen residuos cisteína apareados en su superficie, y por tanto se puede utilizar la incorporación de una cisteína individual en la superficie de proteína para modificar un sitio individual para conjugación específica. Sin embargo, la mutación de los residuos de superficie con cisteína con frecuencia pueden ocasionar problemas tales como dimerización i nter-molecu lar, apareo erróneo de los enlaces disulfuro nativos, e interferencia con el enlace de receptor.
Por estas razones, la conjugación de proteína es afectada de modo más común a través de los residuos lisina.
Modelado de homología de receptor FGF21 y su mecanismo de activación FGF21 se enlaza a FGFRIc y FGFR4, aunque el complejo receptor sólo puede ser activado a través de FGFRIc. Aunque FGFRIb y FGFRIc comparten 87% de identidad (FGFRI b es idéntico a FGFRIc excepto por la región de empalme alternativa 111 b/c) , FGF21 solamente reconoce de manera específica FGFRIc. Aquí, el modelado de homología de la estructura compleja de FGF21-FGFR1c se realizó mediante el uso de la estructura de cristal FGFR2-FGFR1c como una plantillas. Se utilizó el software MOE para modelado de homología y análisis estructurales. La activación del receptor requiere de otro receptor de superficie de célula, Kiotho. Kiotho tiene dos dominios que son muy similares (~ 35% idéntico) a la ß-glucosidasa citosólica humana. La estructura ß?????? humana fue modelada a través del uso de ß-glucosidasa citosólica humana, y al estructura en la estructura de modelado de FGF21-FGFR1c alineada. Esta estructura de complejo de modelado proporcionó guías razonables para los sitios de conjugación de lisina óptimos y la incorporación óptima del residuo de cisteína en FGF21 , que no interrumpiría las ¡nterfaces de enlace entre FGF21 y FGFRIc y entre FGF21 y pKiotho.
Se utilizaron los siguientes criterios para la selección de sitio de conjugación: (1) los residuos serán expuestos al solvente en la estructura tanto como sea posible; (2) los residuos estarán alejados del enlace disulfuro; (3) los residuos estarán alejados de las superficies de enlace de receptor y ß-Kiotho.
La exposición a solvente se puede determinar en base al área de superficie accesible (ASA). Se realizó el cálculo de ASA a partir de la estructura de modelado de FGF21 con software CCP4 (The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography". (1994) Acta Cryst. D050, 760-763) y un programa interno. En resumen, el programa en CCP4 calcula un valor en angstroms cuadrados por residuo en archive logarítmico. A fin de calcular la fracción de ASA (fASA), se utilizó un programa interno para normalizar ASA por residuo. El Cuadro 1 muestra los residuos de ASA así como fASA. Los residuos cuya cadena lateral es pronosticada para ser oscurecida en la superficie no son incluidos. La Columna 1 es el nombre de aminoácido, 2 es el número de residuo, 3 es ASA (como angstrom cuadrado), 4 es la fracción expuesta. El valor fASA define la accesibilidad de solvente para el residuo aminoácido en un polipéptido determinado. Un valor fASA cercano a cero indica que se pronostica que el residuo es inaccesible para el solvente, sugiriendo que es más improbable que sea accesible para los ligadores para conjugación. Se utilizó un valor fASA mínimo absoluto de 0.3, con valores de área de superficie >1.00 sugestivos de sitios de conjugación potenciales particularmente más probables.
En base al análisis ASA, K122 (área de superficie de 164.4) y K59 (área de superficie de 117.2) fueron considerados los sitios potenciales más promisorios para la conjugación. K69 (área de superficie 91) y K56 (área de superficie 73) también fueron conjugados para fines de comparación Cuadro 1 Comparación de residuos de superficie de FGF21. Ejemplo 2 Generación de proteínas FGF21 y mutantes FGF21 ADNc fue adquirido a partir de ATCC. Los vectores de expresión de mamífero y bacterial se construyeron mediante el uso de pcADN3.1 (Invitrogen® and pET21b (EMD), respectivamente. Para las variantes de mutación de FGF21, las mutaciones fueron introducidas en los vectores de expresión utilizando un equipo de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® (Stratagene®) . La presencia de las mutaciones deseadas fue verificada mediante secuenciación ADN.
Para expresión de mamífero, células HEK293F (Invitrogen®) fueron transfectadas con el vector de expresión de mamífero de FGF21 usando reactivo 293fectina (Invitrogen®) y cultivado en medio libre de suero. Los medios acondicionados, filtrados-estériles fueron dializados contra una solución reguladora A (20 mM Tris-HCI, pH 7.5) y cargados en una columna HiTrap Q (GE healthcare®) preequilibrada con solución reguladora A. La proteína FGF21 fue eluida con un gradiente lineal a partir de la solución reguladora A para la solución reguladora B (20 mM Tris-HC1, pH 7.5, y 100 mM NaCI). La fracción combinada fue concentrada y cargada en Sephadex 300 con solución salina reguladora de fosfato (PBS, pH 7.4). La solución de proteína resultante fue concentrada y almacenada por debajo de -80°C. La pureza fue confirmada mediante SDS-PAGE y RP-HPLC.
Para la producción de FGF21LAH a partir de Ecoli, el vector de expresión bacterial fue transformado en la cepa huésped BL21-(DE3)-RIL (Stratagene®) . Las células transformadas fueron cultivadas en 1 litro de medio LB a 37°C, y se inició la expresión mediante adición de 1 mM isopropil ß-D-tiogalactopiranosida. Después de 4 horas, las células fueron recolectadas y congeladas a -20°C. La pasta celular congelada fue suspendida en solución reguladora de lisis (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.5), y pasada a través del microfluidificador 4 veces. Después de 30 minutos de centrifugación a 17,000 X g, 4°C, el cuerpo de inclusión (IB) que contiene pella fue suspendido de nuevo en 50 mM Tris, pH 7.5. La pasta de IB lavada fue centrifugada (30 min, 17,000 X g, 4°C). La pella IB fue almacenada a -80°C. la pella IB congelada fue solubilizada con 7 M urea, 5 mM DTT y 50 mM bis-tris propano, pH 10.5 a 1 hasta 10 mg/ml FGF21 y sometida a agitación durante 1 hora para disolver y reducir la proteína. El IB solubilizado fue diluido después 10 veces en 50 mM Bis-Tris propano, pH 8.0. La concentración de proteína final fue de 0.1 hasta 1 mg/ml. La solución fue sometida a agitación durante ~ 2 días y dializada contra 4 litros de 20 mM Tris- HCI, pH7.5. la solución de proteína fue centrifugada a 14,000 X g durante 30 minutos. El sobrenadante fue cargado a HiTrap Q HP (GE Healthcare®) y equilibrado con la solución reguladora A (véase arriba). Las proteínas bacteriales no enlazadas fueron lavadas con solución reguladora A y la proteína FGF21 fue eluida con un gradiente lineal de solución reguladora B. la fracción FGF21 fue cargada después en una columna HP de quelación HiTrap (GE Healthcare®) pre-equilibrada con solución reguladora PBS. La proteína FGF21 fue eluida con un gradiente lineal desde PBS para solución reguladora PBS más 100 mM imidazol (el pH fue ajustado a 7.4). Las fracciones fueron recolectadas y concentradas (hasta 50 mg/ml) y la solución de proteína aplicada a una columna de exclusión molecular (Hiload 26/60, Superdex 300) equilibrada con PBS (Gibco®, pH7.4). La proteína purificada fue esterilizada mediante filtro de 0.22 pm y almacenada a -80°. El rendimiento común de FG F21 ? H a partir de 8L de medio de cultivo fue de 600 ~ 700 mg. La pureza típica fue de > 95%. El nivel de endotoxina común fue de ~ 1 EU/mg. Lo mutantes de cisteina y lisina-a-arginina de FGF21 se produjeron y purificaron de una manera similar a FGF21 AH. Un rendimiento común de proteína purificada fue de 350 ~ 400 mg. La cisteina libre fue confirmada mediante el uso de reactive de Ellman.
Ejemplo 3 Síntesis de Ligador 1 Síntesis de Ligador 1 : Paladio sobre carbono (por ejemplo aproximadamente 1.0 g, aproximadamente 0.47 mmol} fue agregado en una porción seguido por ácido clorhídrico (por ejemplo aproximadamente 2.5 mi, aproximadamente 30.2 mmol} mediante goteo a una suspensión de 13A (por ejemplo aproximadamente 5 g, aproximadamente 20.1 mmol} en metanol (por ejemplo aproximadamente 200 mi) a aproximadamente 35°C bajo una atmósfera de nitrógeno. Se burbujeo hidrógeno lentamente en la solución a aproximadamente 35°C y la solución fue sometida a agitación durante aproximadamente 2 horas a esa temperatura. El sólido fue filtrado a través de un lecho de celita, y recolectado. El filtrado fue concentrado bajo presión reducida y el sólido fue secado bajo vacío para dar 13B como sal de clorhidrato. El compuesto 13B fue mezclado con diclorometano (por ejemplo aproximadamente 200 mi) y solución saturada de bicarbonato de sodio (por ejemplo, aproximadamente 250 mi), y la capa de diclorometano fue separada. La capa de diclorometano fue lavada con cloruro de sodio saturado (por ejemplo aproximadamente 250 mi) y secada sobre sulfato de sodio. La capa orgánica fue filtrada, concentrada bajo presión reducida y purificada utilizando cromatografía en columna rápida (S i 02 , aproximadamente 60% acetato de etilo en hexanos) para dar un rendimiento de aproximadamente 68% (por ejemplo aproximadamente 2.94 g) de 13C. Una solución de 13C (por ejemplo aproximadamente 4.65 g, aproximadamente 21.3 mmol), 13D (por ejemplo aproximadamente 7.00 g, aproximadamente 21.3 mmol) clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (por ejemplo aproximadamente 3.3 g, aproximadamente 21.3 mmol), y ?,?-diisopropiletilamina (por ejemplo aproximadamente 2.75 g, aproximadamente 21.3 mmol) en diclorometano (por ejemplo aproximadamente 200 mi) a aproximadamente 0°C bajo nitrógeno fue sometida a agitación durante 5 minutos y a temperatura ambiente durante aproximadamente 4 horas. La capa orgánica fue lavada con solución de bicarbonato de sodio diluida y solución de cloruro de sodio saturada, concentrada bajo vacío y purificada utilizando cromatografía de columna rápida (Si02, acetonitrilo) para obtener el Ligador 1 (por ejemplo aproximadamente 8.25 g de un rendimiento de aproximadamente 73%).
Ejemplo 4 Síntesis de Ligador 2 Una solución de anhídrido citracónico, 14 (por ejemplo aproximadamente 2.0 mg, aproximadamente 16.7 mmol), ß-alanina, 17 (por ejemplo aproximadamente 1.5 g, aproximadamente 16.7 mmol) en DMF (por ejemplo aproximadamente 10 mi) fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 horas. Después la solución de reacción fue enfriada hasta aproximadamente 0°C y se agregó una solución de DMF (por ejemplo aproximadamente 10 mi) que contienen düsopropilcarbodiimida (por ejemplo aproximadamente 2.6 mi, aproximadamente 16.7 mmol) y HOBT (por ejemplo aproximadamente 1.9 g, aproximadamente 16.7 mmol). Se agregó diisopropiletilamina (por ejemplo aproximadamente 5 eq, aproximadamente 83.5 mmol) y la mezcla de reacción fue calentada hasta temperatura ambiente y sometida a agitación durante aproximadamente 16 horas más. La reacción fue vertida en agua, acidificada con 1N HCI, y extraída con acetato de tilo (por ejemplo aproximadamente 3x aproximadamente 30 mi). La capa orgánica fue lavada con agua (por ejemplo aproximadamente 2 X aproximadamente 30 mi) y salmuera (por ejemplo aproximadamente 30 mi), y después secada sobre sulfato de sodio. El solvente fue removido bajo vacío y la mezcla cruda fue purificada mediante cromatografía de columna. Las fracciones deseadas fueron combinadas y concentradas bajo presión reducida para dar 17A.
El compuesto 17A (por ejemplo aproximadamente 0.5 g, aproximadamente 2.09 mmol) fue sometido a agitación en ácido trifluoroacético aproximadamente al 15% en diclorometano a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas y concentrado hasta deshidratación bajo presión reducida. El ácido libre 18 fue agregado a N-hidroxisuccinimida (por ejemplo aproximadamente 0.25 g, aproximadamente 2.09 mmol) en tetrahidrofurano (por ejemplo aproximadamente 20 mi), seguido por diisopropilcarbodiimida (por ejemplo aproximadamente 0.33 mi, aproximadamente 2.09 mmol) y se sometió a agitación durante aproximadamente 4 horas a temperatura ambiente. Se filtró d i ¡so pro pi I urea. El filtrado fue evaporado hasta deshidratación. Se agregó éter de petróleo (por ejemplo aproximadamente 30 mi) al residuo, se trituró, fue sometido a agitación y la capa de éter de petróleo fue decantada. Este procedimiento se repitió una vez más con éter de petróleo y el producto 18 secado al vacío.
Se agregó amina-peg2-tbutil éster, 19 (por ejemplo aproximadamente 0.5 g, 2.09 mmol) a una solución de THF del activado 18 seguido por DIPEA en exceso (por ejemplo aproximadamente 3 equi alentes). La solución fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante un mínimo de 1 hora y purificada mediante HPLC-recolección MS Mass de 343 y 399. Las fracciones que contienen el producto deseado fueron combinadas y liofilizadas para recolectar 20. El residuo fue disuelto en ácido trif luoroacético aproximadamente al 15% en diclorometano y una cuantas gotas de agua y sometida a agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. La reacción fue concentrada a aproximadamente 1 mi y tratada con agua para precipitar el producto. El material crudo fue purificado utilizando HPLC-MS para producir 21 (M + 343).
Una solución de ácido 21 (por ejemplo aproximadamente 60 mg, aproximadamente 0.18 mmol), HBTU (por ejemplo aproximadamente 137 mg, aproximadamente 0.36 mmol), y clorhidrato de anilina 13B (por ejemplo aproximadamente 45 mg, aproximadamente 0.18 mmol), diisopropiletilamina (por ejemplo aproximadamente 0.14 mi, aproximadamente 0.90 mmol) en DMF (por ejemplo aproximadamente 2 mi) fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos y purificada en HPLC-MS. La fracción deseada fue combinada y concentrada para recolectar L2 (por ejemplo aproximadamente 16 mg, aproximadamente 0.03 mmol).
Ejemplo 5 Síntesis de Ligador 3 Una solución de anhídrido citracónico, 14 (por ejemplo aproximadamente 0.5 g, aproximadamente 16.4 mmol), amina-peg2-butil éster 23 (por ejemplo aproximadamente 1.0 g, aproximadamente 4.2 mmol) en DMF (por ejemplo aproximadamente 10 mi) fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. Diisopropilcarbodiimida (por ejemplo aproximadamente 0.8 mi, aproximadamente 5.2 mmol) y HOBT (por ejemplo aproximadamente 0.7 g, aproximadamente 6.1 mmol) fueron agregados y la reacción fue calentada a aproximadamente 80°C durante aproximadamente 2 horas. Se permitió el enfriamiento de la reacción hasta temperatura ambiente durante la noche y la urea filtrada. El filtrado fue vertido en agua y extraído con DCM. La capa orgánica fue lavada con salmuera y concentrada para aceite. El producto crudo fue disuelto aproximadamente 50% 6N HCI en acetonitrilo para desproteger el ácido. El producto fue disuelto en DMF, filtrado, y purificado utilizando HPLC-MS para recolectar 24 (por ejemplo aproximadamente 208 mg, aproximadamente 0.7 mmol).
Una solución de maleimida, 24 (por ejemplo aproximadamente 0.16 g, aproximadamente 0.6 mmol) y clorhidrato de anilina 13B (por ejemplo aproximadamente 150 mg, aproximadamente 0.6 mmol) en DMF se agregó HBTU en exceso y DI EA (por ejemplo aproximadamente sobre 3 equivalentes de cada uno). El material crudo fue purificado a través de aproximadamente 2 inyecciones en una HPLC-MS. Las fracciones deseadas que contienen el material más puro fueron combinadas y liofilizadas para recolectar L3 (por ejemplo aproximadamente 17.3 mg, aproximadamente 36.7 mmol).
Una solución de anhídrido citracónico (14, por ejemplo aproximadamente 510 mg, aproximadamente 4.55 mmol) y ácido trans-4-aminometil ciclohexan carboxílico (13, por ejemplo aproximadamente 716 mg, aproximadamente 4.55 mmol) en dimetilformamida (por ejemplo aproximadamente DMF, aproximadamente 5 mi) bajo nitrógeno (N2) fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 6 horas. La solución de reacción fue enfriada hasta aproximadamente 0°C, y se agregaron DIPEA (por ejemplo aproximadamente 1.98 mi, aproximadamente 11.4 mmol) seguida por pentafluorofenil trifluoroacetato (por ejemplo aproximadamente 1.96 mi, aproximadamente 11.4 mmol) en DMF (por ejemplo aproximadamente 3 mi). La mezcla de reacción fue calentada hasta temperatura ambiente y sometida a agitación durante aproximadamente 16 horas más bajo N2. El sólido fue filtrado, y el filtrado fue vertido hasta aproximadamente 30 mi de agua, extraída con diclorometano (por ejemplo aproximadamente 2x aproximadamente 30 mi) y la capa de diclorometano fue secada sobre Na2S04. El solvente fue removido bajo vacío y la mezcla cruda fue purificada mediante cromatografía de columna para producir aproximadamente 550 mg del intermediario de pentafluorofenil éster (15, por ejemplo aproximadamente 29% de rendimiento).
N-Metil morfolino (por ejemplo aproximadamente 290 pL, aproximadamente 2.64 mmol) fue agregado a la solución del intermediario de pentafluorofenil éster (15, por ejemplo aproximadamente 550 mg, aproximadamente 1.32 mmol) y terl-butil éster de ácido 3-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-propiónico (por ejemplo aproximadamente 295 mg, aproximadamente 1.32 mmol) en terahidrofurano (THF, por ejemplo aproximadamente 5 mi) y sometida a agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. El solvente fue removido bajo vacío y el residuo fue disuelto en DMF y purificado mediante HPLC preparatoria. El intermediario de ter-butil éster obtenido fue tratado con aproximadamente ácido trifluoroacético 50% en diclorometano (por ejemplo aproximadamente 4ml) durante aproximadamente 30 minutos. El solvente fue removido bajo vacío y el residuo fue purificado mediante HPLC preparatoria para obtener aproximadamente 300 mg del intermediario ácido 16 como un sólido de color blanco (por ejemplo aproximadamente 55% de rendimiento; MS: 411.2 (M + H + )).
Una solución del intermediario ácido anterior (16, por ejemplo aproximadamente 33 mg, aproximadamente 0.08 mmol), 1-[3-(4-amino-fenil)-propionil]-azetidin-2-ona (138 por ejemplo aproximadamente 18 mg, aproximadamente 0.08 mmol), HOBT (por ejemplo aproximadamente 25 mg, aproximadamente 0.16 mmol) y HBTU (por ejemplo aproximadamente 61 mg, aproximadamente 0.16 mmol), y N-metil morfolino (por ejemplo aproximadamente 44 pL, aproximadamente 0.4 mmol) en DMF (por ejemplo aproximadamente 1 mi) fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. La mezcla cruda fue purificada mediante HPLC preparatoria para obtener L4 como un aceite incoloro (por ejemplo aproximadamente 22 mg, 45% de rendimiento; MS: 611.4 (MH + )).
Ejemplo 7 Síntesis de Ligador 5 Düsopropil carbodiimida (por ejemplo aproximadamente 3.11 mi, aproximadamente 19.86 mmol, aproximadamente 2.95 eq) fue agregada a una solución de Ligador 6 (por ejemplo aproximadamente 6.63 g, aproximadamente 20.69 mmol, aproximadamente 3.07 eq) y N-hidroxisuccinimida (por ejemplo aproximadamente 2.29 g, aproximadamente 19.86 mmol, aproximadamente 2.95 eq) en tetrahidrofurano deshidratado (por ejemplo aproximadamente 500 mi) a aproximadamente 0°C. La mezcla fue sometida a agitación a aproximadamente 0°C durante aproximadamente 1 hora y después sometida a agitación a temperatura ambiente durante la noche. El solvente fue removido in vacuo y la residuo fue lavado con éter de petróleo (por ejemplo aproximadamente 2 X aproximadamente 200 mi) y el polvo fue deshidratado bajo vacío durante aproximadamente 2 horas, y usado en las etapas subsecuentes.
Ejemplo 8 Síntesis de Ligador 6 Ejemplo 9 Síntesis de Ligador 7 Una solución de I (por ejemplo aproximadamente 438 mg, aproximadamente 4.47 mmol) y II (por ejemplo aproximadamente 1.04 g, aproximadamente 4.47 mmol) en dimetil formamida (por ejemplo aproximadamente 25 mi) fue sometida a agitación bajo una atmósfera de nitrógeno durante aproximadamente 2.5 horas. La reacción fue enfriada hasta aproximadamente 0°C utilizando un baño de hielo. 1-Hidroxipirrolidin-2,5-diona (por ejemplo aproximadamente 647 mg, aproximadamente 5.62 mmol), y clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropyi)-N'-etilcarbodiimida (por ejemplo aproximadamente 1.71 g, aproximadamente 8.92 mmol) fueron agregados y sometida a agitación aproximadamente a temperatura ambiente durante la noche. La capa orgánica fue diluida con diclorometano, lavada con agua, concentrada bajo presión reducida y purificada utilizando cromatografía de columna rápida (Si02, aproximadamente 75% acetato de etilo en hexanos hasta aproximadamente 5% metanol en diclorometano para obtener III (por ejemplo aproximadamente 767 mg). Una solución de III (por ejemplo aproximadamente 573 mg, aproximadamente 1.83 mmol) en diclorometano (por ejemplo aproximadamente 15 mi) y ácido trifluoroacético (por ejemplo aproximadamente 1.16 mi) fue sometida agitación durante aproximadamente 9.5 horas a aproximadamente temperatura ambiente. El material fue concentrado bajo presión reducida y secada en una bomba de vacío durante la noche para obtener IV. El crudo IV fue disuelto en diclorometano (por ejemplo aproximadamente 15 mi), y dimetil formamida (aproximadamente 2 gotas) y agitada con cloruro de oxalilo (por ejemplo aproximadamente 465 mg, aproximadamente 3.66 mmol) durante aproximadamente 2 horas. El solvente fue removido bajo presión reducida y el aceite fue secado bajo vacío durante 1 hora. El aceite fue disuelto en diclorometano (por ejemplo aproximadamente 15 mi) y sometido a agitación con 138 (por ejemplo aproximadamente 464 mg, aproximadamente 1.83 mmol) y diisopropil etilamina (por ejemplo aproximadamente 2.9 mi, aproximadamente 16.5 mmol) bajo nitrógeno durante aproximadamente 30 minutos la capa orgánica fue lavada con solución de bicarbonato de sodio saturada, solución de cloruro de sodio saturada, concentrada bajo presión reducida y purificada utilizando cromatografía de columna rápida (Si02, aproximadamente 85% acetato de etilo en hexanos hasta aproximadamente 100% acetato de etilo) para obtener Ligador 7 (por ejemplo aproximadamente 323 mg, aproximadamente 39%).
Ejemplo 10 Síntesis de Ligador 8 Una solución de V (por ejemplo aproximadamente 980 mg, aproximadamente 1.91 mmol), 13C (por ejemplo aproximadamente 484 mg, aproximadamente 1.91 mmol), diisopropiletilamina (por ejemplo aproximadamente 2 mi, aproximadamente 11.5 mmol) en diclorometano fue sometida a agitación durante aproximadamente 6 horas aproximadamente a temperatura ambiente. Aproximadamente otro 1 eq de 13C (por ejemplo aproximadamente 484 mg, aproximadamente 1.91 mmol) y aproximadamente 3 eq de diisopropiletilamina (por ejemplo aproximadamente 1 mi, aproximadamente 5.73 mmol) fueron agregados y sometidos a agitación aproximadamente a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción fue lavada con solución de bicarbonato de sodio saturada, solución de cloruro de sodio saturada, secada (sulfato de sodio), filtrada, concentrada bajo presión reducida y purificada utilizando cromatografía de columna rápida (aproximadamente 100% acetato de etilo hasta aproximadamente 5% metanol en acetato de etilo hasta aproximadamente 10% metanol en acetato de etilo) para obtener Ligador 8 (por ejemplo aproximadamente 285 mg, aproximadamente 24%) Ejemplo 11 Conjugación de proteína y ligador Las proteínas mutantes FGF21 se hicieron reaccionar con el ligador relevante a una relación molar de 1:10 a temperatura ambiente durante 2 horas. Todas las proteínas FGF21 fijadas a ligador fueron purificadas después utilizando columna PD-10 y solución reguladora intercambiada en 20 mM Trís-HCI, 20 mM NaCI, pH 7.0.
Ejemplo 12 Conjugación de complejo proteína-ligador con anticuerpo Todas las proteínas FGF21 fijadas a ligador fueron fusionadas con h38C2 IgG 1 (Nos ID SEC: 25 y 26) (20 mM Tris-HCI, 20 mM NaCI, pH 7.0) a relación molar de 6:1 a temperatura ambiente durante la noche. Los complejos de proteína-ligador-anticuerpo fueron purificados por medio de SEC. La eficiencia de conjugación se confirmó mediante análisis LCMS.
Ejemplo 13 Ensayo de producción de Proteína Todas las proteínas FGF21 fueron expresadas en E. coli. Las proteínas FGF21 bacterialmente expresadas fueron encontradas en cuerpos de inclusión. Después de la lisis de las células y la remoción del sobrenadante, las pellas fueron disueltas en 7 M urea, 50 mM Bis-Tris propano, pH 10.5 a 4°C. los cuerpos de inclusión solubilizados fueron diluidos en 50 mM Bis-Tris propano, 10 mM glutatión oxidado, ph 9.0 y sometidos a agitación durante 2 horas, seguidos por diálisis contra 20 mM Tris-Hel, ph 7.5 a 4°C durante la noche. Las fracciones solubles fueron purificadas mediante columna HiTrap Q. las proteínas fueron caracterizadas por medio de análisis SDS-PAGE. Los niveles de expresión de los mutantes de Usina fueron 10-50 mg/L.
Ejemplo 14 Ensayo Glutl Taqman Los adipocitos 3T3-L1 diferenciados fueron usados para medir la expresión Glutl ARNm a través del método qPeR. Adipocitos 3T3-L1 diferenciados con 10-14 días carentes de suero durante la noche fueron tratados con compuestos durante 6 horas. El ARN total fue extraído a partir de estas células, y se midió la expresión Glutl y la expresión GAPDH ARNm usando un equipo Quantitect Probé RT-PeR y operando una reacción PeR en tiempo real cuantitativa en una máquina Taqman (Applied Biosystems®). La bioactividad de los compuestos se determine a través de un cambio múltiplo en los niveles de Glutl ARNm normalizados mediante los niveles GAPDH ARNm de cada muestra. Los valores EC50 como mediciones de la potencia de los compuestos se obtuvieron a partir de las curvas de respuesta de dosis en el ensayo.
Ejemplo 15 Ensayo de Admisión de Glucosa Los adipocitos 3T3-L1 diferenciados fueron tratados con compuestos en ausencia de suero durante 24 horas. Las células fueron incubadas después con 14C-2-desoxiglucosa durante 1 hora y se cuantificó la admisión de glucosa en las células en un instrumento Wailac 1450 MicroBeta (Trilux). La admisión de glucosa fue expresada en conteos por minuto (CPM). Los valores EC50 como mediciones de la potencia de los compuestos se obtuvieron a partir de las curvas de respuesta de dosis en el ensayo.
Ejemplo 16 Farmacocinética de Ratón El PK de los conjugados de anticuerpo FGF21 fue examinado en ratones después de administración IV o SC. Los conjugados de anticuerpo fueron inyectados dentro de ratones macho adultos jóvenes Swiss-Webster (20-25 g), y se obtuvieron muestras de sangre en puntos de tiempo desde 5 minutos hasta 120 horas después de la dosificación. Las concentraciones de conjugado de anticuerpo en suero se determinaron utilizando un ELISA que capturó la porción FGF21 de los conjugados de anticuerpo a través de un anticuerpo monoclonal anti-hFGF21 enlazado a una placa de 96-pozos. Los conjugados de anticuerpo FGF21 enlazados a la placa fueron detectados a través de un anticuerpo monoclonal anti-hFc y se determinaron las concentraciones usando una curva estándar de la solución de dosificación PK diluida en solución reguladora de ensayo que contiene suero. Se calculó la biodisponibilidad SC como la relación del área bajo la curva (AUC) del perfil de concentración de suero dividida entre el AUC del perfil de concentración en suero IV.
Ejemplo 17 Eficacia de Ratón La eficacia de los conjugados de anticuerpos FGF21 se evaluó en dos modelos de ratón ob/ob resistentes a insulina obesos de murino y ratones con dieta inducida con alto contenido de grasa. Para ambos modelos, ratones macho (6-8 semanas de edad para ob/ob, 12-14 semanas de edad para DIO con dieta alta en grasas iniciada a las 6 semanas de edad) fueron alojados 2-4/jaula y los conjugados de anticuerpo FGF21 fueron administrados mediante inyección SC. Se midió diariamente el peso corporal por la mañana. Se determinó la tolerancia a la glucosa a través de prueba de tolerancia a la glucosa oral. En resumen, los ratones fueron colocados en ayuno durante 4-5 horas por la mañana del día de la prueba. Se obtuvo una muestra de sangre basal y se determinaron los niveles de glucosa en sangre usando un glucómetro portátil. Después de la muestra basal, se administró glucosa a través de sonda oral, y las muestras de sangre fueron extraídas desde 15 hasta 120 minutos después. La tolerancia a la glucosa fue calculada como el AUC a partir de la línea basal hasta el punto de tiempo de 120 minutos.
Ejemplo 18 K56 Actividad de Ab-L5-FGF21 ??-?56 Se generó FGF21 ? H-K56-K59R-K69R-K122R (NO ID SEC: 18) y fue purificado como se describió anteriormente. Se encontró que FGF21AH-K56-K59R-K69R-K122R es potente en el ensayo Glutl Taqman (EC50= 0.9nM; n = 2). Se mostró que la admisión de glucosa es 5.5 nM. FGF21 AH-K56-K59R-K69R-K122R fue combinado con L5 a K56 y conjugado con h38e2 como se describió para formar Ab-L5-FGF21AH-K56. Ab-L5- FG F21 ? H-K56 retuvo la potencia en el ensayo Glutl Taqman (EC50= 1.9nM; n = 1), y mostró una vida media IV de 17 horas, y una vida media SC de 13 horas. La biodisponibilidad fue de 66%.
Ejemplo 19 K59 Actividad Ab-L5-FGF21 ??-?59 Se generó FGF21 ? H-K56R-K59-K69R-K122R (NO ID SEC: 19) y fue purificado como se describió. FGF21 AH-K56R-K59-K69R-K122R fue potente en el ensayo G I ut 1 Taqman (EC50 = 0.6 nM; n = 1). La admisión de glucosa fue de 0.9 nM. FGF21 ? H-K56R-K59-K69R-K122R se combinó con L5 a K59 y fue conjugado con h38e2 para formar Ab-L5-FGF21 ??-?59. Ab-L5-FGF21 ??-?59 retuvo la potencia in vitro en el ensayo Glutl Taqman (EC50= 6.5 nM; n = 2) y mostró una vida media IV de 13 horas.
Ejemplo 20 K69 Actividad Ab-L5-FGF21 ??-?69 Se generó FGF21 AH-K56R-K59R-K69-K122R (NO ID SEC: 20) y fue purificado como se describió. Se encontró que FG F2 ? H-K56R-K59R-K69-K122R es potente tanto en el ensayo Glutl Taqman (EC50 = 1.3 nM; n = 1) como en un ensayo de admisión de glucosa (EC50= 5.2 nM). FGF21 AH-K56R-K59R-K69-K122R se combinó con L5 a K69, y fue conjugado con h38e2 para formar Ab-L5-FGF21 ??-?69.
Ejemplo 21 K122 Actividad Ab-L5-FGF21 ??-?122 Se generó FGF21 AH-K56-K59R-K69R-K122 (NO ID SEC: 21) y fue purificado como se describió. FGF21 AH-K56-K59R-K69R-K122 fue potente tanto en el ensayo Glutl Taqman (EC50= 2.6 nM; n = 2) como en el ensayo de admisión de glucosa (EC5o = 1-7 nM). FGF21 AH-K56-K59R-K69R-K 22 se combinó con L5 a K122, y fue conjugado con h38e2 para formar Ab-L5-FGF21 ??-?122. Ab-L5-FGF21AH-K122 retuvo la potencia in vitro (EC50= 1.6 nM en el ensayo G I ut 1 Taqman; n = 2) y mostró una vida media IV de 16 horas, y una vida media SC de 14 horas. La biodisponibilidad fue de 40%.
Ejemplo 22 K-null-P2 Actividad Ab-L5-FGF21 ??-??????-?2 Se generó FGF21 AH- null-P2 (NO ID SEC: 22) y fue purificado como se describió. FGF21 AH-Knull-P2 fue potente en el ensayo G I ut 1 Taqman (EC50 = 1-2 nM; n = 2). FG F21 ? H-Kn u I I-P2 se combinó con en el extremo N' de P2 con L5, y conjugado con h38e2 para formar Ab-L5-FGF21 AH-Knull-P2. Ab-L5-FGF21 ? H-Knull-P2 exhibió reducida potencia in vitro (EC50 = 16.6 nM en el ensayo G I ut 1 Taqman; n = 1) y una vida media IV de 17 horas.
Ejemplo 23 Knull-H1K Ab-L5-FGF21 H-Kn u 11 -H 1 K acti ity Se generó FGF21 ??-Knull-HI K (NO ID SEC: 23) y fue purificado como se describió. FGF21 ??-Knull-HI K fue potente en el ensayo Glutl Taqman (EC50 = 6.4 nM; n = 2). FGF21 ??-Knull-HI K se combinó con L5 a H1K y conjugado con h38e2 para formar Ab-L5-FGF21 ??-Knull-HI K. FG F21 ? H-Knu 11- H 1 K retuvo la potencia in vitro (EC50 = 4.3 nM en el ensayo Glutl Taqman; n = 2), y mostró una vida media IV de 16 horas, una vida media SC de 11 horas y biodisponibilidad SC de 51%.
Ejemplo 24 K-null-S181K Actividad Ab-L5-FGF21 ??-Knull-SI 81 K Se generó FGF21 ??-Knull-SI 81 K (NO ID SEC: 24) y purificado como se describió. FGF21 ??-Knull-SI 81 K fue potente en el ensayo Glut 1 Taqman (EC50 = 7.5 nM; n = 2). FGF21 ??-Knull-SI 81 K se combinó con L5 a S181K y conjugado con h38e2 para formar Ab-L5-FGF21 AH-Knull-S181 K. Ab-L5-FGF21 ??-Knull-SI 81 K mostró una perdida de potencia in vitro (EC50 = >500 nM en el ensayo Glutl Taqman; n = 2).
Ejemplo 25 Resumen de resultados de actividad de mutantes de Usina Todas las proteínas mutantes de Usina estuvieron activas en el ensayo Glutl Taqman. Cuando fueron conjugadas, la mayoría de los conjugados (K56, K59, K122, Knull-H1K) retuvieron su actividad en el ensayo Taqman, con valores EC50 similares a aquellos de la proteína FGF21 nativa. El conjugado Knull-P2 mostró cierta reducción en la potencia inicial y el conjugado Knull-S181K mostró perdida de actividad en el ensayo Taqman.
Ejemplo 26 Identificación de los sitios de enlace óptimos en FGF21 utilizando conjugación cisteína-maleimida Uno de los retos cuando se introduce una mutación de sustitución de cisteína como un residuo de enlace es que el residuo cisteína puede encontrarse en contacto con otros residuos, y/o forma un enlace de sal o enlace de hidrógeno. Aunque puede ser difícil pronosticar las distancias de nivel de átomo utilizando estructuras de modelado, se seleccionaron varios residuos en base a potencial para estar ubicados distantes desde los sitios de enlace de FGFRIe y pKiotho: His1 , Thr40, Asp79, Leu86, His125 y Alai 29.
Los seis residuos son distintos entre sí en términos de elementos estructurales (giro y ciclo), área de superficie accesible (ASA), y forma de ambiente (cóncavo y convexo), y todos fueron modelados en el lado opuesto de la proteína para las interacciones FGFRIe (Cuadro 2). En particular, His1, Asp79, Leu86 y H is 25 fueron identificados por ser sitios de conjugación potencialmente atractivos debido a los elevados valores ASA asociados con estos sitios Cuadro 2 Comparación de residuos potenciales para sustitución de cisteína.
Ejemplo 27 H1C FGF21 ??-?1 C Se generó y expresó FGF21 ??-? 1 C (NO ID SEC: 16). Sin embargo, los mutantes FGF21AH-H1C carecieron del grupo cisteína N', y por lo tanto se descontinuo la investigación de este muíante.
Ejemplo 28 T40C FGF21AH-T40C La generación de FGF21AH-T40C (NO ID SEC: 15) presentó desafíos importantes. La mutación de cisteína de la treonina en la posición 40 ocasionó múltiples especies de FGF21AH-T40C en RP-HPLe después del replegamiento. Se realizaron intentos adicionales para mejorar el proceso de replegamiento mediante el cambio de la concentración de la proteína y el pH, con y sin adición de glutatión. El proceso de replegamiento fue monitoreado a través de RP-HPLC. La adición de glutatión resultó en un replegamiento eficiente de T40e; sin embargo, se encontró que el glutatión se unió en FGF21, muy probablemente a través de la cisteína introducida en la posición 40. El aducto de glutatión mostró la misma actividad biológica que FGF21AH tipo natural, indicando que la posición 40 no está involucrada en la activación de receptor mediante FGF21.
Ejemplo 29 D79C Actividad de Ab-L1 -FGF21 AH-D79C Se generó FGF21AH-D79C (NO ID SEC: 12) y fue purificado como se describió. FGF21AH-D79C fue potente en el ensayo G I ut 1 Taqman (EC50 = 2.1 nM; n=4). FGF21AH-D79C se combinó con L1 en D79C y fue conjugado con h38e2 para formar Ab-L1 -FGF21 AH-D79C. Ab-L1 -FGF21 AH-D79C retuvo la potencia in vitro (EC50 = 3.7nM en el ensayo Glutl Taqman; n = 3), y mostró una vida media IV de 17 and 19 horas (n = 2), una vida media SC de 20 y 20 horas (n = 2) y biodisponibilidad SC de 55% y 70 (n = 2).
Ejemplo 30 Ensayo de estabilidad de FGF21AH-D79C Se produjo la proteína mutante FGF21 AH-D79C en E. coli y fue purificado como se describió con anterioridad. FGF21 AH-D79C fue expresado a partir de 1 L de cultivo. Se obtuvo un cuerpo de inclusión de 150 mg y se obtuvieron 85 mg de proteína purificada, lo que representa un rendimiento del 60%. Para probar la estabilidad de FGF21AH-D79C así como FGF21 ?? (NO ID SEC: 2), muestras recién descongeladas fueron mantenidas a 4°C durante siete días y se examinó su integridad por medio de RP-HPLC, SEC-HPLC, ensayo de Ellman y SDS-PAGE en el día 0, 3 y 7. Se encontró que FGF21AH-D79C es estable a pH neutro 7.4: solamente ligeras cantidades de FGF21 AH-D79C aparecieron oxidadas y dimerizadas incluso después de la incubación de siete días a 4°C, en tanto que más de la mitad de FGF21 AH-D79C se oxidó a menor pH 6.0 después de incubación de tres días a 4°C. PBS (pH7.4) y 20 mM Trís-Hel 50 mM Nael (pH7.5) no marcaron diferencia significativa en la estabilidad de FGF21 AH-D79C.
No hay una razón aparente de porque la cisteína libre de FGF21AH-D79C fue más estable en pH 7.4 que en pH 6.0. El punto isoeléctrico calculado (p¡) de WT FGF21 fue de 5.43 (e.e., FGF21-H1-P146); el pi de FG F21 ? H fue de 5.27; y el pi de FGF21 AH-D79C fue de 5.47. Es posible que la solubilidad de FGF21 AH-D79C se pueda reducir a pH6.0. La estabilidad de FGF21 AH-D79C fue examinada en múltiples ciclos de congelación/descongelación. Las proteínas fueron repetidas para congelación (-80°C) y descongelación (4°C) 9 veces. Ninguna muestra mostró ninguna diferencia entre el ciclo 1 y el ciclo 9 en RP-HPLC, SEC y ensayo de Ellman. En conclusión, FGF21AH-D79C apareció ser significativamente menos estable a 4°C que a -80°C.
Ejemplo 31 L86C FGF21AH-L86C Se generó y purificó FGF21 AH-L86C (NO ID SEC: 14) como se describió. Aunque la mayoría de los residuos hidrofóbicos son enterrados en núcleos de proteína, ciertos residuos son expuestos a solvente lo cual puede ocasionar insolubilidad de la proteína. Leu86 es un residuo hidrofóbica, y parece estar expuesto a solvente en la estructura modelada de FGF21. Se postuló que la mutación L86C puede brindar beneficios de solubilidad.
La mutación L86C resultó en replegamiento ineficiente y bajo rendimiento de proteína. La adición de glutatión resultó en replegamiento eficiente de L86C; sin embargo, se encontró que más de un glutatión se fijó en una molécula FGF21 , muy probablemente a través de la C86 introducida así como los residuos de cisteína nativa. El aducto de glutatión mostró una reducción de aproximadamente 10 veces de la actividad biológica, y por lo tanto se descontinuó la investigación de FG F21 ? H-L86C .
Ejemplo 32 H125C Actividad de Ab-L1 -FGF21 ??-?125C Se generó y purificó FGF21 ? H-H 125C (NO ID SEC: 7) como se describió. FGF21 ??-?125C fue potente en el ensayo Glutl Taqman (EC50=1.2 nM; n = 3). FGF21 ??-?125C se combinó con L1 y fue conjugado con h38e2 a H125e para formar Ab-L 1 -FGF21 ? H-H 125C.
Cuando se conjugó, Ab-L 1 -FGF21 ? H-H 125C retuvo la potencia in vitro (EC50 = 3.2nlvl en el ensayo G I ut 1 Taqman; n=4), y mostró una vida media IV de 37 horas, una vida media SC de 32 horas y biodisponi ilidad SC de 67%.
Ejemplo 33 A129C Actividad de Ab-L1 -FGF21 ??-?129C Se generó y purificó FGF21 ??-?129C (NO ID SEC: 10) como se describió. FGF21 ??-?129C fue potente en el ensayo G I u 1 Taqman (EC50=1.4 nM; n = 6). FGF21 H-A129e se combinó con L1 atA129e y conjugado con h38e2 para formar Ab-L1 -FGF21 ??-?129C. Ab-L1 -FGF21 ??-?129C retuvo la potencia in vitro (EC5Q = 2.7 nM en el ensayo G I ut 1 Taqman; n = 7), y mostró una vida media IV de 33 horas, una vida media SC de 37 horas y biodisponibilidad SC de 69% (en ratones). Ab-L1 -FGF21 ??-?129C mostró una vida media en ratas de 60 horas, una vida media SC en ratas de 39 horas, y biodisponibilidad SC en ratas de 52%. En monos, la vida media IV fue de 65 horas, la vida media SC fue de 48 horas, y la biodisponibilidad SC fue de 68%.
Ejemplo 34 Mejoramiento de Pureza de Endotoxina Se produjeron FGF21 ??-? 125C y la proteína FGF21 ??-?129C mediante cultivo de fermentación de E. coli. Para reducir los niveles de endotoxina, se utilizó una etapa adicional Q después del primer Q que redujo los niveles de endotoxina de 10 EU/ml -> 0.1 EU/ml. El protocolo de purificación se modificó como sigue. Se obtuvieron aproximadamente 10 g de IB a partir de 1L de medio de cultivo, y se solubilizó con 40 ml_ de 7M Urea, 5 mM DTT, 50 mM BTP (Bis-tris Propano) pH 10.5 (1-2 horas). La reducción de la proteína FGF21 fue monitoreada mediante RP-HPLC. La proteína solubilizada fue replegada mediante dilución en 400 mol de 50 mM BTP, pH 8.0 (24-36 horas). La oxidación del enlace disulfuro nativo de FGF21 fue monitoreada mediante RP-HPLC. Una vez que el replegam iento estuvo casi completo, la solución fue dializada dos veces contra 4L de 20 mM Tris-HCI, pH 7.5. Las proteínas no solubilizadas fueron precipitadas mediante centrifugación a 20,000 X g durante 60 minutos, 4°C. El sobrenadante fue cargado en Hitrap Q FF y la proteína FGF21 fue eluida con 0 - 200 mM gradiente NaCI (20 CV, 20 mM Tris-HCI, 0.01 mM TCEP, pH 7.5). Las fracciones recolectadas fueron cargadas en Hitrap Ni-NTA FF con 0 ~ 100 mM gradiente imidazol (10 CV, 0.01 mM TCEP, PBS, pH 7.4) para remover el ADN residual de manera eficiente. Las fracciones deseadas fueron dializadas dos veces contra 4L de 20 mM Tris-HCI, 0.01 mM TCEP, pH 7.5 y cargadas en una columna Hitrap Q HP con 0 ~ 100 mM gradiente NaCI (20 CV, 20 mM Tris-HCI, pH 7.5) para elución. Las fracciones de proteína purificadas fueron recolectadas, esterilizadas con un filtro de 0.22 mm y almacenadas a -80°.
El rendimiento común a partir de 1L de medio de cultivo fue de aproximadamente 350 hasta aproximadamente 400 mg. El rendimiento común de proteína purificada fue de aproximadamente 220 hasta aproximadamente 280 mg. Esta técnica de purificación produjo una proteína con una pureza de >95%, y un nivel de endotoxina típico de aproximadamente 1 EU/mg. El uso de un fermentador en lugar de matraces de agitación mejoró el rendimiento aproximadamente 4 hasta aproximadamente 5 veces.
Ejemplo 35 Selección de ligador Se sabe que el anillo de maleimida de L1, a continuación, puede ser susceptible a apertura y subsecuente degradación de producto con el paso del tiempo (Woodnutt, G; IBC Conference "Beyond Antibodies/Protein Engineering Design", San Diego, 21-23rd September 2009).
El ligador de maleimida tal como L1 puede reaccionar con tiol para formar un aducto de tiol con la parte de maleimida como se muestra en el Esquema 1. Esta reacción de adición de tiol a maleimida es referida como una reacción de Michael. De manera subsecuente, un grupo que contiene amina (tal como el anticuerpo h38C2) puede reaccionar con AZD (ß-lactama) como se muestra en el Esquema 1 para producir 6. El aducto tiol-succinimida resultante es estable. Sin embargo, el anillo de succinimida puede experimentar una lenta escisión hidrolítica con el paso del tiempo resultando en 7 y/u 8. Por lo tanto, es deseable tener un anillo maleimida con estabilidad mejorada para al escisión hidrolítica, en tanto que conserva su habilidad para experimentar la reacción de Michael.
Esquema 1 Ejemplo 36 Modificación de Maleimida En consecuencia, se examine la estabilidad del anillo maleimida en L1, con la expectativa de que podrían generarse ligadores más estables al modificar el anillo maleimida. A fin de desacelerar la potencial escisión hidrolítica del anillo maleimida mediante agua, se tomaron tres diferentes enfoques (L2-L4) para modificar el anillo y mejorar la estabilidad.
En primer lugar, se considera que un pequeño grupo alquilo unido al anillo podría desacelerar la escisión hidrolítica del anillo succinimida. Se preparó el Ligador 2, que tiene un grupo metilo en el anillo succinimida. Para que el anillo experimente la escisión hidrolítica, se agrega una molécula de agua al grupo carbonilo y forma un intermediario tetraédrico como estado de transición. La presencia del grupo metilo limitaría esteárica e hidrol ¡ticamente la formación del intermediario tetraédrico, y desaceleraría el índice de hidrólisis de manera considerable.
La segunda modificación estuvo enfocada en el grupo propionamida carbonilo en estrecha proximidad al grupo carbonilo del anillo maleimida. Los grupos carbonilo en general atraen agua. El tener un grupo carbonilo en estrecha proximidad con el anillo maleimida ayuda a atraer agua y facilita el ataque sobre el grupo carbonilo del anillo maleimida. Al remover el grupo propionamida carbonilo, se desacelera la reacción de apertura de anillo hidrolítico. Esta modificación se puede observar en L3.
La tercera modificación fue la introducción de un grupo ciclohexilmetileno en lugar del grupo propionamida como se observa en L4. La naturaleza hidrofóbica voluminosa del anillo ciclohexilo interferiría tanto electrónica como esteáricamente para la formación de un intermediario tetraédrico mediante la adición de agua al grupo carbonilo del anillo lo cual se requeriría para la escisión hidrolítica abierta del anillo. Se anticipó que esto desaceleraría la escisión hidrolítica.
Estudios de Estabilidad Para los estudios de estabilidad, se removió la porción 1-(3-(4-aminofenil)propanoil)azetidin-2-ona de los ligadores L1-L4. Se elaboraron cuatro compuestos de prueba (30-33) donde la maleimida fue conjugada con glutatión, un péptido de tres aminoácidos.
Ejemplo 37 Síntesis del compuesto 30 Una solución de ácido 3-(2-(2-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H- pirrol-1 -il)propanamido)-etoxi)etoxi)propanóico (164 mg, 0.5 mmol) y glutatión reducido (154 mg, 0.5 mmol) en dimetilsulfóxido (5 mi) fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 17 horas. Se agregó acetato de etilo (25 mi) a la mezcla de reacción y se filtró el sólido. El sólido fue lavado con 25 mi adicionales de acetato de etilo, y secado para dar 252 mg de compuesto 30.
Ejemplo 38 Síntesis de compuesto 31 Una solución de ácido 3-(2-(2-(3-(3-metil-2, 5-dioxo-2, 5-dihidro- 1 H-pirrol-1 -il)propanamido)etoxi)ethoxi)propanóico (42 mg, 0.12 mmol) y glutatión reducido (37 mg, 0.12 mmol) en dimetilsulfóxido (1.2 mi) fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 22 horas. Se agregó acetato de etilo al 50% en éter (10 mi) a la mezcla de reacción y se filtró el sólido. El sólido fue lavado con 25 mi adicionales de acetato de etilo, secado para dar 67 mg del compuesto 31.
Ejemplo 39 Síntesis de compuesto 32 Una solución de ácido 3-(2-(2-(3-metil-2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)etoxi)etoxi)propanóico (50 mg, 0.2 mmol) y glutatión reducido (61 mg, 0.2 mmol) en dimetilsulfóxido (2 mi) fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 25 horas. Se agregó acetato de etilo al 65% en éter (30 mi) a la mezcla de reacción y se filtró el sólido. El sólido fue lavado con 25 mi adicionales de acetato de etilo, secado para dar 92 mg del compuesto 32.
Ejemplo 40 Síntesis de compuesto 33 Una solución de ácido 3-(2-(2-(4-((3-metil-2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)metil)ciclohexancarboxamido)etoxi)etoxi)propanóico (50 mg, 0.12 mmol) y glutatión reducido (37 mg, 0.12 mmol) en dimetilsulfóxido (1.2 mi) fue sometida a agitación a temperatura ambiente durante 22 horas. Se agregó acetato de etilo al 50% en éter (10 mi) a la mezcla de reacción y se filtró el sólido. El sólido fue lavado con 25 mi adicionales de acetato de etilo, secado para dar 75 mg del compuesto 33.
Ejemplo 41 Estudio de Estabilidad de Compuestos 30-33 L4 33 Los compuestos 30, 31, 32, y 33 fueron monitoreados en LC-MS para la formación de los productos de anillo abierto así como la separación de glutatión. Estos nuevos homólogos fueron examinados para su estabilidad en pH = 6.5 solución reguladora a 40°C, a pH = 7.5 solución regulador a 40°C y un pH = 7.5 solución reguladora a 4°C, todos sobre un período de dos semanas (Cuadros 3A-C).
Los compuestos 30, 31 , 32, y 33 fueron disueltos en una solución reguladora a temperatura ambiente. Las muestras fueron incubadas a 40°C y la solución reguladora de pH fue analizada en los intervalos fijados. En los intervalos definidos, 10 pL de la solución reguladora de pH fueron inyectados en cromatografía en líquido de alto rendimiento Agilent y espectrómetro de masa para análisis. Los eluyentes a partir de la columna fueron monitoreados utilizando espectrómetro UV a 210 y 254 nm y utilizando también espectrómetro de masa. Los sub-productos de hidrólisis fueron monitoreados usando espectrómetro de masa y la hidrólisis porcentual se calculó en base a la corriente de ion total de una masa particular.
Fue evidente a partir de los datos LC-MS que muestran % de hidrólisis en los Cuadros 3A-3C que los anillos de maleimida modificados de L2, L3 y L4 (31-33) fueron 5-10 veces más estables a pH = 6.5 a 40°C en comparación con el anillo maleimida en L1 (30), 4-15 veces más estables a pH = 7.5 solución reguladora a 40°C, y hasta 20 veces más estables a pH = 7.5 solución reguladora a 40°C. Los resultados de las conjugaciones de glutatión (que incluyen los datos en los Cuadros 3A, 38 y 3C) se discutieron en IBC Conference "Beyond Antibodies/Protein Engineering Design", San Diego, 21-23rd Septiembre 2009.
Cuadro 3A Estudios de Estabilidad a 40°C, pH = 6.5 (10mM His, 130mM Gly, solución reguladora 130nM Suc).
Cuadro 3B Estudios de Estabilidad a 40°C, pH = 7.5 (100mM His, 200mM Gly, 200mM Suc).
Cuadro 3C Estudios de Estabilidad a 4°C, pH = 7.5 (100 mH His, 200 mM Gly, 200 mM Suc).
Ejemplo 42 Estabilidad de Ligadores L1-L4 conjugados para FGF21 Se efectuó el siguiente experimento para investigar la estabilidad química durante 2 semanas de los cuatro ligadores a la conjugación para FGF21: cada ligador fue conjugado para FGF21, colocado en condiciones de almacenamiento a +4°C, y se removieron las alícuotas y se extinguieron mediante congelación en puntos de tiempo específicos, y se monitoreó la estabilidad de ligador mediante análisis LCMS.
Los cuatro ligadores fueron disueltos en DMSO a partir de material concentrado liofilizado. La proteína FG F21 ? H-A 129C fue parcialmente reducida con O.lmM TCEP durante 30 minutos antes de la adición de ligador en una relación de ligador: proteína de 1:1; la concentración de proteína FGF21 ??-? 29C en la reacción de conjugación fue de 5 mg/ml. L1 se hizo reaccionar con proteína durante 30 minutos; L2, L3 y L4 se hicieron reaccionar durante 2 horas. La reacción de conjugación fue apagada mediante remoción de ligadores en exceso a través de resina de exclusión molecular. La proteína FGF21 ??-? 29C conjugada fue colocada a +4°C para almacenamiento de estabilidad. Se removieron las alícuotas a t = 0 (antes del almacenamiento de estabilidad) y a t = 1, 3, 8, y 14 días. El análisis de estabilidad de se realizó mediante análisis LC-MS para determinar la cantidad relativa de proteína no conjugada, conjugación proteína + ligador, y eventos de hidrólisis simple y doble de proteína + ligador conjugado.
La hidrólisis de ligador es la variable analítica crítica en este experimento. La hidrólisis fue monitoreada mediante observación de la adición subsecuente de H20 al complejo FGF21 -ligador. Una adición individual de H20, +(1) H20, indica probablemente la hidrólisis del grupo AZD activado que está presente en los 4 ligadores. La adición de una segunda molécula de H20, +(2) H20, es un fuerte indicador de hidrólisis (por ejemplo, inestabilidad química) en el ligador. L1 es particularmente susceptible debido a la presencia de un grupo funcional maleimida.
Los resultados experimentales en el Cuadro 4 a continuación demuestran que L1 experimenta el mayor incremento en +(2) H20. A t = 0, cada uno de L1-L4 tuvo un valor medido de +(2) H20 entre 6-8% de la proteína medida total. Durante las 2 semanas estas muestras fueron monitoreadas, la +(2) H20 observada en L1 había incrementado hasta 18% en tanto que el valor para cada uno de los ligadores restantes L2-L4 fue constante a 6-8%. Estos datos sugieren que L1 es relativamente inestable en comparación con L2-L4.
Cuadro 4 Análisis de Hidrólisis de L1-L4 conjugados con FGF21.
Ejemplo 43 Ab-FGF21 ??-?129C conjugado con L1-L4 Se ha demostrado previamente que L2-L4 son más adecuados que L1 con las conjugaciones de glutatión bajo varias condiciones (véanse los Cuadros 3A-C) y FGF21 (Cuadro 4). Los ligadores maleimida modificados L2-L4 fueron fusionados a FGF2111H-A129C (eficiencias de conjugación mostradas en el Cuadro 5), y mostraron actividad en el ensayo G I ut 1 Taqman (Cuadro 5): los valores EC50 son normalizados contra el valor relativo para FGF21AH).
Cuadro 5 Eficiencias de Conjugación de L1-L4.
Sin embargo, a pesar de lo anterior, cada uno de Ab-L2- FGF21 ??-?129C, Ab-L3-FGF21 ??-?129C, Ab-L4-FGF21 ? H-A129C fueron menos estables in vivo que Ab-L -FGF21 ??-?129C. Esto fue evidente como menores niveles sostenidos en la circulación después de la dosificación IV, y menor pico y niveles sostenidos en la circulación después de la dosificación SC (Figuras 2A-C, Cuadro 6). De manera sorpresiva, estos resultados son contrarios a los resultados de los estudios de estabilidad conducidos con los ligadores fusionados a un pequeño péptido en los sistemas de solución reguladora de pH.
Cuadro 6 Parámetros PK de Ratón de conjugados FGF21 con L1, L2, L3, y L4 después de la administración IV y SC a 3 mg/kg.
Estos resultados fueron confirmados en un estudio adicional en suero de ratón. FGF21 ??-?129C fue conjugado para h38e2 utilizando cada uno de L1, L2, L3 y L4. Cada muestra fue diluida en suero de ratón hasta 0.3 mg/ml e incubada a 37°C antes de la congelación, seguida por análisis subsecuente a través de 2DLC/MS. Comparado contra un estándar de referencia, se detectó Ab-L1-FGF21 ??-?129C a 149% después de 5 minutos, 66% después de 34 horas, 81% después de 72 horas y no fue detectable a las 120 horas. En contraste, Ab-L2-FGF21 AH-A129C, Ab-L3-FGF21 AH-A129C, Ab-L4-FGF21 ??-?129C no fueron detectables en ninguna de las muestras.
Ejemplo 44 Estudio en rata de Ab-FGF21 ??-?129C conjugado con L1 & L2 Las farmacoci néticos de dosis única (P ) de dos versiones de Ab-FGF21 ??-?129e que difieren por el ligador usado para conjugar la proteína FGF21 para el anticuerpo adaptador se determinaron en ratas macho Sprague Dawley. Se dosificó a las ratas por vía IV o SC (3 mg/kg) ya sea Ab-L1 -FGF21 ? H-A129C (ligador maleimida) o Ab-L2-FGF21 ? H-A129C (ligador metil maleimida), y se tomaron muestras de sangre en intervalos desde 5 minutos hasta 14 días post dosis. Se determinaron los niveles de Ab-FGF21 ??-?129C en suero mediante ELISA, en el cual el conjugado FGF21 fue capturado a través de un anticuerpo monoclonal específico para FGF21 y detectado por medio de Fe anti-humano. Los datos PK resultantes demostraron que el conjugado Ab-L1 -FGF21 ??-?129C tuvo características PK superiores (T1/2: IV= 60 horas, SC= 38 horas; biodisponibilidad SC =52%) en comparación con el conjugado Ab-L2-FGF21 ??-?129C (T1r2: IV= 52 horas, SC = 33 horas; biodisponibilidad SC = 36%), (Figura 3A y Cuadro 7). Estos resultados no se anticiparon dados los resultados de los estudios de estabilidad conducidos en los sistemas de solución reguladora de pH con estos ligadores fusionados a un pequeño péptido.
Cuadro 7 Parámetros PK de Rata de conjugados FGF21 con L1 y L2 después de administración IV y SC a 3 mg/kg (para Fig 3A).
Ejemplo 45 Efecto de Ab-FGF21 ??-?129C con L1 y L2 en Glutl ARN Los adipocitos 3T3-L1 fueron cultivados en el día 8 en placas de cultivo de tejido de 24-pozos (Falcon®, Cat#353047), e incubados en medio completo DMEM (10% F8S, 2 mM L-glutamina, 1% P/S) a 37°C, 5% C02. Las células fueron sub-alimentadas (día 12) con medio DMEM libre de suero con 0.2% BSA durante la noche y tratadas con Ab-L1 -FGF21 ??-?129C y Ab-L2-FGF21 ??-?129C en DMEM libre de suero que contiene 0.2% BSA a 37°C durante 6 horas. El medio fue aspirado, y después se extrajo ARN desde las células utilizando RNeasy mini Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midió ARN a A260nm usando el espectrofotómetro Spectramax® Plus.
Cuadro 8 PCR en tiempo real cuantitativo Taqman La estimulación de adipocitos 3T3-L1 mediante FGF21 ??, FGF21 AH-A129C, Ab-L1 -FGF21 ??-?129C, y Ab-L2-FGF21 ??- A129C resultó en inducción Glutl dependiente de dosis. Ab-L 1 - FGF21 ??-?129C pareció ser más potente que Ab-L2- FGF21 ??-?129C (Cuadro 8) Ejemplo 46 Estudio de longitud de Ligador AD-L1-FGF21 AH-D79C, Ab-L7-FGF21 AH-D79C, y Ab-L8-FGF21AH-D79C fueron probados unos contra otros para determinar la tolerancia de la longitud de ligador. Todos mostraron PK similar (Figura 38 y Cuadro 9) y potencia comparable (datos no mostrados) en ensayos en base a célula.
Cuadro 9 Parámetros PK de Ratón de conjugados FGF21 con ligadores L1, L7, y L8 después de la administración IV a 3 mg/kg (para Fig 3B).
Ejemplo 47 Resumen de posiciones de residuo y selección de ligador H1C, T40C, D79C, L86C, H125C y A129C fueron probados como sitios de conjugación potenciales usando una estrategia de conjugación tiol-maleimida. De estos, H1C, T40C y L86C mostraron problemas con la expresión y replegamiento. D79C, H125C y A129C fueron explorados de manera adicional ya que todos mostraron niveles aceptables de producción de proteína y demostraron que la proteína mutante no conjugada se mantuvo potente. Ab-FGF21 ??- D79C, Ab-FGF21 ??-?125C, y Ab-FG F21 ? H-A 129C mostraron bioactividad similar a FGF21AH, sugiriendo que la conjugación del anticuerpo en estas ubicaciones no interfiere con el enlace de receptor. D79C, H125C y A129C tienen estabilidad y bioactividad similar a FGF21 ??.
Todos los conjugados de anticuerpo muíante de lisina probados demostraron PK de ratón inferior para los conjugados de anticuerpo H125C y A129C, con vidas medias IV de 13-17 horas (Cuadro 10).
Cuadro 10 Resumen de sitios de conjugación en FGF21. *3 días después de una dosis única de 3 mg/kg, excepto 10 mg/kg para D79C y 1 mg/kg Qd para FG F21 d H . **proteína; ND: no determinado.
Aunque Ala129 no tuvo una alta exposición al solvente, menor a D79 o H125, de manera sorpresiva FGF21 AH-A129C fue uno de los mutantes más estables y la mejor posición probada para la conjugación de anticuerpo. Esto fue inesperado ya que la mutación es no-conservadora. Aunque no se desea enlazarse a teoría, hay varias razones posibles para la adecuación única de conjugación en A129C. En primer lugar; Ala129, así como His125, están ubicadas en la región de ciclo que es flexible en la estructura modelada de FGF21. Estas regiones usualmente son sitios de enlace de heparina para otros miembros FGF de enlace de heparina. Ya que FGF19, FGF21 y FGF23 no interactúan con heparina, el mantenimiento de la fidelidad de secuencia de esta región puede no ser crítico para su función biológica. La flexibilidad de la posición puede ser benéfica para la conjugación de anticuerpo a fin de evitar la interferencia de enlace de receptor. En segundo lugar; Ala129 está rodeado por residuos con carga positiva, a saber His125, Arg126, Arg131, y Arg135. Este parche de carga positiva puede evitar la dimerización SS de FGF21 ??-?129C debido a la fuerte repulsión cargada. En tercer lugar; estos residuos cargados pueden favorecer la estabilización del ligador maleimida L1, que en su ausencia, puede generar un carboxilato después de la apertura de anillo de maleimida. Por tanto, cuando se conjuga FGF21 usando una estrategia de enlace de maleimida, el enlace en la posición de residuo específica de A129 parece ser particularmente ventajoso.
Ab-L1-FGF21 AH-A129C y Ab-L 1 -FG F21 ? H-H 125C muestran elevadas vidas medias IV y vidas medias SC de por lo menos 30 horas en modelos de murino así como buena biodisponibilidad. Ambos conjugados demuestran potencia por debajo de 4nM en el ensayo G I ut 1 Taqman. En general, Ab-L 1 -FGF21 ? H-A129C muestra una vida media y potencia ligeramente mejoradas en comparación con Ab-L1-FGF21 AH-H125C. El uso de L1 en Ab-L 1 -FG F21 ? H-A129C mostró también ventajas in vivo sorpresivas sobre lo que sugirieron las pruebas in vitro, y en general pareció ser el ligador más ventajoso en comparación con aquellos probados.
La combinación específica de los componentes de Ab-L1-FGF21 ??-?129C, (anticuerpo, ligador, posición de residuo de enlace, residuo de enlace, proteína) parece brindar el nivel óptimo en vida media, biodisponibilidad, potencia, actividad, facilidad de producción, y resistencia a la hidrólisis en comparación con múltiples alternativas.
Ejemplo 48 Eficacia de compuestos Se probó la tolerancia a la glucosa para ratones ob/ob tratados con compuestos Ab-FGF21 ?-?56 y Ab-FGF21 ??-Knull-HI K. Ambos compuestos se compararon de manera deficiente contra Ab-FG F21 ? H-H 125C (Figura 4A y 4B) y Ab-FGF21 ??-?129ß (Figura 5A y 5B). En contraste, Ab-FGF21 ??-079? y Ab-FGF21 ??-?1250 demostraron una mejoría de la tolerancia a la glucosa y reducen la ganancia de peso corporal (Figuras 4A, 4B, 6A, 6B, 6C, 6D, y Cuadro 11).
Cuadro 11 AUC de Glucosa durante OGTT conducida en el día 6 después de inyección SC de Ab-FGF21 AH-079C a 10 mg/kg en el tiempo indicado en ratones ob/ob (véanse Figuras 6C y 6D).** p<0.01 vs vehículo (AUC de glucosa) mediante ANOVA unidireccional con post-pruebas de Dunnett.
Se encontró que Ab-FGF21 ??-?129C mejora la tolerancia a la glucosa, y redujo la ganancia de peso corporal, debido al incrementado gasto de energía evidenciado por incrementada expresión Ucp1 en tejido adiposo blanco (WAT), e invierte la esteatosis hepática en ratones ob/ob (Figuras 6E, 6F, 6G, 6H y Cuadro 12). Para la expresión Ucp1, muestras WAT viscerales congeladas recolectadas a partir de los estudios de eficacia in vivo fueron homogenizadas. Se extrajo ARN total desde los homogenados de tejido, y se midió la expresión G I ut 1 y GAPDH ARNm utilizando un equipo Quantitect Probé RT-PCR y operando una reacción PCR en tiempo real cuantitativa en una máquina Taqman (Applied Biosystems). El efecto de tratamiento se determine mediante un cambio múltiplo en los niveles de G I u 11 ARNm normalizados mediante los niveles GAPDH ARNm de cada muestra. Ab-FGF21 ??-?129C ocasionó pérdida de peso corporal debido al incrementado gasto de energía como se sugiere mediante expresión incrementada Ucp1 en WAT, redujo los triglicéridos en suero y los niveles de ácido graso en ratones DIO y redujo el peso hepático (Figuras 7A, 7B, 7C, 7D, 7E, y Cuadro 13). Se observó también una reducción en peso hepático en ratones ob/ob (Figura 7F y Cuadro 14). Pruebas adicionales en ratones ob/ob demostraron una reducción en los niveles de ARN de estearoil-coenzima A desnaturasa- 1 (SCD1), y monoacilglicerol O-aciltransferasa (MOGAT2), y un incremento en los niveles de ARN de caja en forma de horquilla box A2 (FoxA2), (Figuras 7G, 7H y 71 y Cuadro 15).
Cuadro 12 Resultados después de una inyección SC única de Ab-FGF21 ??-?129C en el día 6 en ratones ob/ob; véanse las Figuras 6E, 6F, 6G, 6H. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs vehículo mediante ANOVA unidireccional con post-pruebas de Dunnett. Valores SEM en paréntesis.
Cuadro 13 Resultados en el día 10 después de una inyección SC repetida de Ab-FGF21 ??-?129C a 10 mg/kg en el día O & 7 en ratones DIO (véanse las Figuras 7A, 7B, 7C, 7D, 7E). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs vehículo mediante ANOVA unidireccional con post-pruebas de Dunnett. Valores SEM proporcionados en paréntesis.
Cuadro 14 Peso del hígado en el día 6 después de una inyección SC única de Ab-FGF21 ??-?129C a 10 mg/kg en el tiempo indicado en ratones ob/ob (para Fig 7F). **p<0.01, ***p<0.001 vs vehículo medíante ANOVA unidireccional con post-pruebas de Dunnett. valores SEM proporcionados en paréntesis.
Cuadro 15 Cambios de pliegue medio de expresión ARNm usando qPCR a partir de muestras de tejido hepático recolectadas en el día 6 después de una inyección SC única de Ab-FGF21 ??-?129C a 10 mg/kg en el tiempo indicado en ratones ob/ob (para Fig 7G, 7H, 71). **p<0.01 vs vehículo mediante ANOVA unidireccional con postpruebas de Dunnett. Valores SEM proporcionados en paréntesis.
Ejemplo 49: Ensayo GSIS en Compuestos Exendin4 Se probó la habilidad de ciertos homólogos Exendin4 para estimular la secreción de insulina a partir de células ß pancreáticas in vitro usando un ensayo de secreción de insulina glucosa-estimulada (GSIS). En resumen, el homologo Exendin4 relevante fue conjugado para ambos sitios de combinación de h38e2, y esta molécula conjugada fue aplicada, junto con glucosa, a varias concentraciones a cultivos de célula ß pancreática. Se detectó la secreción de insulina al medir los niveles de insulina a través del tiempo. Se calculó EC50 para cada compuesto. Los resultados de este ensayo se establecen en el Cuadro 16 a continuación.
Ejemplo 50: Prueba de Tolerancia de Glucosa (GTT), Cambio de Peso Corporal e Ingesta Alimenticia en compuestos Exendin4 Se evaluó la eficacia ín vivo de homólogos Exendin4 ilustrativos utilizando un paradigma de prueba de tolerancia de glucosa de dosis única o repetida. Ratones macho adultos jóvenes ob/ob (Jackson Laboratories, Bar Harbar, ME) recibieron dosis con 0.3 mg/kg de compuestos de prueba de la invención por vía subcutánea (SC) en la región medía-escapular, utilizando restricción manual breve, con volúmenes de inyección de 0.2-0.3 mi. Ratones de control de carnada delgados (n = 8/grupo, Jackson Laboratories, Bar Harbar, ME) fueron dosificados de manera similar con Vehículo. Se monitorearon la ingesta alimenticia y el cambio de peso corporal acumulativo diariamente en la mañana (08:00-09:00 H; encendido de luz a las 06:00 H y apagado a las 18:00 H). Los resultados se muestran como valores promedio durante los días 0-9, así como el valor en el día 9. Cada compuesto fue probado con 8-10 animales.
Los ratones experimentaron prueba de tolerancia de glucosa oral (OGTT) siguiendo un protocolo estándar. En resumen, los ratones fueron sometidos a ayuno durante 4-5 horas al inicio de la fase de encendido de luz en la colonia. Al final de este período (primeras horas de la tarde), los ratones fueron sangrados por la cola inmediatamente antes de y en intervalos regulares desde 15 hasta 120 minutos después de un desafío de glucosa oral (1.5 g/kg). Se reasumió la alimentación en las jaulas después de la recolección del punto de tiempo de 120 minutos. Los niveles de glucosa fueron determinados utilizando medidores de glucosa en sangre de auto-control, y el área bajo la curva (AUC) para glucosa como una función de tiempo después del desafío de glucosa oral se calculó utilizando una ecuación trapezoidal lineal. Los resultados se calcularon como % del control de vehículo, y se muestran para pruebas de 48 y 72 horas (Cuadro 16).
Cuadro 16 Análisis de péptidos Exendin4.
El enlace en la posición 23 (NO ID SEC: 47) no redujo el peso corporal ni la alimentación ni mejoró la tolerancia de glucosa @ 48 horas. El enlace en las posiciones 17, 24, 38 y en el extremo C (NOs ID SEC: 51, 46, 39, y 38) redujo el peso corporal y la alimentación aunque no mejoró la tolerancia de glucosa a 72 horas. En enlace en la posición 26 (NO ID SEC: 45) no redujo el peso corporal ni la alimentación aunque mejoró la tolerancia de glucosa a 48 horas. Se observaron ventajas evidentes para el enlace en las posiciones 12, 14, 19, 20 y 21. Se observe que el enlace en la posición 14 proporciona la mayor ventaja general. Todos los ejemplos utilizaron residuos K o K(SH) como el residuo de enlace.
Ejemplo 51 Determinación de parámetros para generar conjugados de anticuerpo bifuncional asimétrico Se examinaron diferentes relaciones de fusión entre [2do ltgador-Ex4] y Ab en la solución reguladora de formulación (10 mM histidina, 10 mM glicina, 2% sacarosa, pH = 7) a temperatura ambiente. A medida que se incrementó la cantidad de [2do ligador-Ex4], aumentó también la formación de [Ab]-[2do Mgador-Ex4]1 , y se mantuvo a aproximadamente 45% (Cuadro 17). Incrementos adicionales en [2do ligador-Ex4] resultaron en una cantidad incrementada de [Ab]-[2do ligador-x4]2.
Cuadro 17 Eficiencia de Conjugación de [L1-NO ID SEC: 64] para h38C2 Se examinó la conjugación de [2do ligador-Ex4] y [Ab] (20 mg/ml; relación 0.6:1) para formar Ab-[2do ligador-Ex4]i usando diferentes sistemas co-solventes. Se agregaron estos diferentes co-solventes (mostrados en el Cuadro 18) para ver si se podría mejorar la formación de Ab-[2do ligador-Ex4]1. El incremento de las concentraciones de co-solventes como etanol, alcohol isopropílico (IPA), dimetil formamida (DMF), dimetil sulfóxido (DMSO) desde 5% hasta 10% hasta 15% no afectaron la formación de Ab-[2do ligador-EX4]T aunque afectaron la formación de Ab-[2do ligador-Ex4]2, y la recuperación de anticuerpo no conjugado. Parece que a medida que se incrementó la cantidad de co-solvente orgánico, una mayor cantidad de anticuerpo permaneció sin conjugación. De modo similar, a medida que se incrementó la concentración de co-solvente, hubo una reducción en la formación de Ab-[2do Mgador-Ex4]2. Los co-solventes tales como el etanol, DMF, y D SO inhiben la formación de Ab-[2do Mgador-Ex4]2, en tanto que propilen glicol no tuvo efecto alguno en la formación de Ab-[2do ligador-Ex4]1 o Ab-[2do ligador-Ex4]2. El análisis se efectuó utilizando HPLC.
Cuadro 18 Eficiencia de conjugación de [L1-NO ID SEC: 64] para h38C2.
Se examinaron los efectos de la urea (0.5, 1.0 y 2M) y EDTA (5, 10 y 15 mM) sobre la formación de Ab-[2do Mgador-Ex4]1. Ni la urea ni EDAT tienen ningún efecto notorio sobre la formación de Ab-[2do Mgador-Ex4]1 o Ab-[2do Mgador-Ex4]2.
Se examinó también el efecto del clorhidrato de guanidina sobre la formación de Ab-[2do ligador-Ex4]1 a partir de [2do ligador-Ex4] y [Ab] (20 mg/ml) en diferentes concentraciones de clorhidrato de guanidina (0, 0.2, 0.4 y 0.5 M) y relaciones de [2do Mgador-Ex4]i : Ab (0.85:1 y 1 :1). En ambas relaciones, el incremento de las concentraciones de clorhidrato de guanidina redujo la formación de Ab-[2do Mgador-Ex4]2, aunque no oreció una mejoría significativa en el rendimiento de Ab-[2do Mgador-Ex4]1.
Se investigó el efecto de la concentración de NaCI (0, 100, 250, 500 mM) sobre la reacción de conjugación entre [2do ligador-Ex4] y el anticuerpo (20 mg/ml) en relaciones de 0.5:1, 0.75:1 y 1:1, utilizando la solución reguladora de formulación (10 mM histidina, 10 mM glicina, y 2% sacarosa, pH = 7). No se observe diferencia significativa en la generación de Ab-[2do Mgador-Ex4]1 a través de las concentraciones de NaCI probadas.
Se estudió el efecto del pH sobre la reacción de conjugación entre [2do Mgador-Ex4]i y el anticuerpo (20 mg/ml) utilizando la solución reguladora de formulación (10 mM histidina, 10 mM glicina, y 2% sacarosa). Los resultados se muestran en el Cuadro 19. La formación de [2d0 ligador-Ex4] fue la más elevada a pH = 6.5 y 7. [2do Mgador-Ex4]1 : PH % Anticuerpo % Ab-[2nd ligador- % Ab-[2do Anticuerpo no conjugado Ex4], ligado r-Ex4]2 1 5 44 43 12 1 1 5.5 38 45 16 1 1 6 26 45 29 1 6.5 40 47 22 1 7 29 47 23 Cuadro 19 Eficiencia de conjugación de [L1-NO ID SEC: 64] para h38C2.
Se estudió una investigación sistemática de la relación entre [1er ligador-FGF21]: [Ab]-[2do ligador- Ex4]1 para evaluar la formación de [FGF21-1er ligador]1-[Ab]-[2do ligador-Ex4]1. El Cuadro 20 muestra la concentración de [Ab]-[2do I igador-Ex4] , y [1er ligador-FGF21] y la formación de [FGF21 -1 er ligador]1-[Ab]-[2do ligador-Ex4]! . Las relaciones se establecieron utilizando HPLC equipada con columnas HIC. Se varió la concentración de [Ab]-[2do Mgador-Ex4] a medida que varió la cantidad agregada de [1er ligador-FGF21]. En base a estos resultados, parece que la eficiencia máxima de la formación de [FG F21 - 1 er ligador]-, [Ab]-[2do ligador-Ex4] i se logró cuando la concentración de [Ab]-[2do ligador-Ex4]1 estuvo entre 2 y 5 mg, y la cantidad de [1er ligador-FGF21 ] estaba entre 3 hasta 6 veces en exceso en comparación a [Ab]-[2do ligador-Ex4] -i .
Cuadro 20 Eficiencia de conjugación de h38C2-[L1-NO ID SEC: 64] para [FGF21 ??-?129C-L1 ].
Se estudió la concentración de TCEP requerida para separar el enlace ínter disulfuro entre el dímero FG F21 ? H-A 29C sin afectar el enlace intra disulfuro dentro de FGF21 ? H-A129C. Los resultados se muestran en el Cuadro 21. Una muestra que contiene FGF21AH-A129C en 20mM Tris, 50mM NaCI, pH= 7 (aproximadamente 2 mg/ml) fue tratada con varias concentraciones de TCEP durante 30 minutos. Las muestras fueron analizadas mediante LC-MS. En base a los datos, 0.3 m de TCEP es la concentración óptima para separar el enlace ínter disulfuro entre la proteína FGF21 ??-? 29C sin afectar el enlace intra disulfuro.
Cuadro 21 Análisis de formación de dímero FGF21 ??-?129C.
La reducción del enlace Ínter disulfuro fue seguida utilizando HPLC durante 140 minutos utilizando tres diferentes concentraciones de TCEP. Todos los enlaces ínter disulfuro fueron escindidos utilizando TCEP dentro de 30 hasta 40 minutos. Estos experimentos sugieren que el enlace ínter disulfuro puede ser escindido utilizando 0.3 mM TCEP en un lapso de 30 minutos (Cuadro 22).
Cuadro 22 Efecto de diferentes relaciones molares de TC Ejemplo 52 Generación de conjugados bif uncionales asimétricos (Estrategia 1 ) Reacción H38C2 + Exendin 4: 2.76 gm de h38C2 (NO ID SEC: 25 y NO ID SEC: 26) (en "lOmM Histidina, 10mM Glicina, 2% sacarosa, pH 6.5, 136 mi) fue tratado con 62.3 mg de Ex4 péptido (NO ID SEC: 64 con K(SH) como residuo de enlace de péptido) conjugado para el ligador L1 en 1.29 mi (concentración 10 mM) de agua desionizada y se deja a temperatura ambiente durante la noche. Una pequeña cantidad de material fue analizado utilizando cromatografía en líquido de alto rendimiento equipada con columna HIC-Butilo y espectroscopia de masa para monitorear la formación de Ab-[L1-NO ID SEC: 64],.
Extracción de especies Ab-Exendin 4 1FA: Una mezcla de reacción cruda que contiene mezcla de anticuerpo, Ab-[ L1-NO ID SEC: 64], y Ab-[L1-NO ID SEC: 64]2 (2.7 gm en 136 mol de solución reguladora de 10 mM histidina, 10 mM glicina, 2% sacarosa, pH = 6.5) fue diluida con 409 mi de solución reguladora (50 mM fosfato de sodio, 1 M cloruro de sodio, pH = 7.0) y cargado a una columna empacada con 681 mi de resina de sefarosa CM. El producto fue eluido en fracciones utilizando gradiente de solvente B (50 mM fosfato de sodio, pH = 7.0 + 20% isopropanol) en A (0.75 M sulfato de amonio y 50 mM fosfato de sodio, pH = 7.0). Las fracciones que contienen Ab-[L1-NO ID SEC: 64], se combinaron. (1100 mi). Dispositivo de ultrafiltración-Diafiltración equipado con membrana 50 KD fue higienizado con 1N hidróxido de sodio y equilibrado con una solución reguladora que contiene 20 mM 2-Amino-2-hidroximetil-propan-1 ,3-diol, 50 mM cloruro de sodio a pH = 7.0. La fracción combinada anterior que contiene Ab-[L1-NO ID SEC: 64], fue intercambiado con solución reguladora utilizando 20 mM tris(hidroximetil) aminometano, 50 mM cloruro de sodio, pH = 7.0 y concentrada hasta 62 mi y filtrada a través de filtro 0.2 µ?t? para dar 1.02 g de Ab-[L1-NO ID SEC: 64]t en 20 mM tris(hidroximetil) aminometano +50 mM cloruro de sodio a pH = 7.0.
La separación de Cromatogra ía de Interacción H ¡drof óbica (HIC) se basa en la interacción entre la fase estacionaria y características hidrofóbicas de las moléculas. El anticuerpo h38C2 es menos hidrofóbica que Ab-[L1-NO ID SEC: 64]!, el cual es menos hidrofóbico que Ab-[L1-NO ID SEC: 64]2. Durante la elución, el anticuerpo sin reaccionar se eluye primero, seguido por Ab-[L1-NO ID SEC: 6 ]L Ab-[L1-NO ID SEC: 64]2 eluye al final. Mediante el ajuste de la relación del anticuerpo a péptido, los tres diferentes compuestos antes mencionados pueden variar en %.
El anticuerpo sin reaccionar ha sido aislado y sometido a UF/DF y absorbido en 10 mM Histidina, 10 mM Glicina, 2% Sacarosa, solución reguladora pH = 6.5. Este anticuerpo aislado fue fusionado de nuevo con péptido Ex4 (NO ID SEC: 64 con K(SH) como residuo de enlace de péptido) y purificado. En ciertos aspectos de la invención, esto puede ser ciclado 3 veces para producir -70% Ab-[L1-NO ID SEC: 64] L FGF21 + liqador: FG F21 ? H-A 129C (715 mg en 105 mol de 20 mM tris(hidroximetil)-aminometano +50 mM cloruro de sodio a pH = 7.0) fue tratado con tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (0.3 mM solución) durante 40 minutos FGF21 ? H-A129C puede tener un problema con la formación de dímero debido al tiol sin reaccionar en la posición 129, los cual puede ser particularmente desventajoso si la proteína sin reaccionar será almacenada entre la generación y subsecuente fijación al ligador. Este problema se puede superar mediante la adición de TCEP a una concentración final de aproximadamente 0.1 mM.
L1 (3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -i -N-^-^-ÍS-oxo-S-H-^-oxo-S-^-oxoazetidin-l-i pro i fenilamino^ropox etox eti propanamida, (27.2 mg en 2.57 mi dimetil sulfóxido) se agregó a la solución FGF21 ??-?129C (a aproximadamente 2:1 de relación molar de ligadonproteína) y se dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos con oscilación intermitente. L1 se mantuvo generalmente a 10 m (48.28 mg/ml) en 100% DMSO, aunque también son adecuados otros solventes, tal como dimetil formamida, metanol, etanol, agua, propilen glicol y mezclas de los mismos. L1 tiene potencial para experimentar la hidrólisis tanto en metanol como en etanol. La solubilidad de L1 es superior tanto en dimetil sulfóxido como dimetil formamida. Ya que el dimetil sulfóxido se mezcla fácilmente con el sistema de solución reguladora usado en la conjugación ligador-proteína, se prefiere el dimetil sulfóxido para preparar la solución concentrada L1.
Una membrana UFDF fue sanitizada con 1N hidróxido de sodio durante 30 minutos y equilibrada con 20 mM tris(hidroximetil) aminometano + 50 mM cloruro de sodio a pH = 7.0. La mezcla de incubación anterior FGF21 ??-?129C fue concentrada utilizando UFDF, para dar 613 mg de [L1 -FGF21 ??-?129C] en 81 mol de solución reguladora.
La solución de [L1 -FGF21 ??-?129C] fue diluida con 42 mol de 20 mM tris(hidroximetil)aminometano +50 mM cloruro de sodio a pH = 7.0 y se agregó a Ab-[L1-NO ID SEC: 64]1 (1.02 g, en 61 mol de 20 mM tris(hidroximetil) aminometano + 50 mM cloruro de sodio a pH = 7.0) y la mezcla de reacción se dejo reposar durante la noche. Esta mezcla de incubación (184 mi) fue diluida después con 366 mol de solución reguladora A (0.75 M sulfato de amonio +50 mM fosfato de sodio pH 7.0) y purificado en columna de HIC-butilo utilizando solución reguladora B (50 mM fosfato de sodio + 20% isopropanol, pH = 7.) en solución reguladora A. Se ha encontrado que la columna de HIC-butilo tiene la ventaja de ser escalada de manera adecuada a cantidades apropiadas para elaboración comercial. Las fracciones que contienen moléculas [FGF21 ??-?129C-L1 ],-Ab-[L1 - NO ID SEC: 64], fueron recolectadas para dar 970 mi.
Un cartucho UF/DF 50kD 50cm2 fue sanitizado con hidróxido de sodio 1 N y la membrana UF/DF fue equilibrada con un regulador que contiene 20 mM 2-am¡no-2-hidroximetil-propan-1 ,3-diol, 50 mM cloruro de sodio a pH = 7.0. La fracción combinada anterior fue concentrada utilizando la membrana UF/DF y 20mM Tris, 50mM cloruro de sodio, pH = 7 para dar 594 mg de [FGF21 AH-A129C-L1]1-Ab-[L1- NO ID SEC: 64]: en 67 mi de solución reguladora la cual fue filtrada a través de filtro 0.2 µ??.
Después de la concentración, la muestra fue filtrada a través de una membrana 0.2um, y almacenada a 4°C. La muestra final fue analizada para endotoxina, y la pureza y la identidad estructural se establecieron mediante HPLC HIC-butilo y espectrómetro de masa. El análisis de la muestra utilizando HPLC equipada con columna de HIC-butilo mostró un rendimiento de aproximadamente 78% [FGF21 AH-A129C-L1]i-Ab-[L1- NO ID SEC: 64]! y aproximadamente 22% Ab-[L1- NO ID SEC: 64]i sin reaccionar.
Ejemplo 53 Estrategia Alternativa para desarrollar moléculas ABC La presente invención proporciona una primera estrategia (estrategia 1) para el proceso de conjugación en donde Ab-[Ex4-2do ligador^ es conjugado para [FGF21-1er ligador]. En tanto que este proceso es ventajoso, requiere de dos etapas de cromatografía de alta resolución para el anticuerpo biespecífico final ABC-1 : un HIC para Ab-[Ex4-2do ligador] 1 y el otro para la purificación ABC-1 de producto. En ciertos aspectos favorables, el proceso dio el producto final ABC-1 con 74% de pureza con 14% de intermediario de proceso Ab-[Ex4-2do ligador]! sin reaccionar y otras impurezas en escaso rendimiento.
La presente invención proporciona también un método alternativo para producir conjugados de anticuerpo bifuncional asimétrico, de acuerdo con la estrategia 2. La estrategia 2 proporciona ventajas significativas sobre la estrategia 1 : mejora drásticamente la estequ iometría FGF21 (-1.25x relación molar en la estrategia 2 vs. 3x en la estrategia 1) y reducción de la cantidad de FGF21 requerido, resultando en significativos ahorros de costo.
La Estrategia 2 también redujo las etapas de cromatografía a solamente una cromatografía HIC para purificación de intermediario de proceso Ab-[NO ID SEC: 10-L 1 ] -, . La eficiencia de conjugación de [L1-NO ID SEC: 64] con intermediario Ab-[NO ID SEC: 10-L1], para formar ABC-1 estuvo cerca de la completación usando material de partida bien definido [L1-NO ID SEC: 64] en la Estrategia 2.
Se desarrolló una etapa cromatográfica de fase inversa Butil 650 S para generar Ab-[NO ID SEC: 10-L1]-, como intermediario de proceso. Las especies Ab-[NO ID SEC: 10- L 1 ] conjugadas individuales fueron recuperadas de manera selectiva en un alto rendimiento > 90% y alta pureza > 90% en la etapa de elución y se resolvió de manera adecuada a partir de las otras especies de reacción de conjugación que incluyen [NO ID SEC: 10-L 1 ] libre, [NO ID SEC: 10-L1]2 dimérico, Ab-[SEQ ID N0:10-L1]2 conjugado de manera doble, agrega una especie h38C2 libre. El escalamiento del proceso se demostró de manera exitosa en una escala 19 L.
El [L1-NO ID SEC: 64] en exceso a partir de la segunda conjugación fue removido con rapidez mediante flujo a través de cromatografía Capto-O para purificar el anticuerpo biespecífico ABC-1. La Estrategia 2 demostró un rendimiento sin precedente de aproximadamente 40% calculado a partir de h38C2 completamente reactivo en ABC-1 , y excelente pureza de aproximadamente 91% de ABC-1 mediante SEC. La eficiencia de proceso general se incrementó drásticamente al reducir la utilización de material costoso FGF21 y la reducción al mínimo de las etapas de cromatografía Ejemplo 54 Mejoramiento de los parámetros de conjugación para ABCs Efecto de relación molar de [FGF21 -ligador]: Ab en rendimiento de Ab-[FGF21-ligador]1 Se llevo a cabo Una evaluación preliminar de diferentes relaciones de [FGF21-1er ligador]:Ab para aumentar al máximo el rendimiento para el intermediario de proceso Ab-[NO ID SEC: 10-L 1 ] i . La relación molar óptima de [FGF21-1er ligador]: Ab fue de aproximadamente 1.25:1 con un rango aceptable de aproximadamente 1.5:1 hasta aproximadamente 1 :1 (véase el Cuadro 23). Una relación de aproximadamente 1.25:1 dio aproximadamente 42% de rendimiento del intermediario deseado con el menor % de agregados.
Cuadro 23 Efecto de relación molar de [NO ID SEC: 10-11] Anticuerpo en rendimiento de Ab-[NO ID SEC: 10-L1] Selección de solución reguladora. PH V temperatura de conjugación para Ab-ÍFGF21 -lioadorlL Se seleccionaron diferentes parámetros para mejorar la eficiencia de conjugación, incluyendo soluciones reguladoras MES (ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico) y fosfato, pHs (pH 6 & 7), y temperaturas (RT vs. 4°C). Los resultados (Cuadro 24) indicaron % de agregados que permanecieron adecuados a través de pH, temperatura, y diferentes rangos de concentración tanto para MES como para solución reguladora de fosfato. 100 mM solución reguladora de fosfato pH 6.0 a Temperatura Ambiente produjo significativamente más Ab-[FGF21]1 en comparación con otras condiciones. La conjugación a 4°C mostró un perfil de producto similar aunque con menores rendimientos para h38C2-[NO ID SEC: 10 - L ] ! . Las condiciones de operación aceptables para la conjugación de h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]i se identificaron utilizando una MES o solución reguladora de fosfato, a una concentración entre aproximadamente 25 mM y aproximadamente 150 mM, con un rango de pH de aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 7.5, o aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 7.0, entre aproximadamente 0°C y 37°C, y de preferencia entre aproximadamente 4°C y aproximadamente Temperatura Ambiente. Las condiciones de conjugación óptimas para h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]i comprendieron aproximadamente 100 mM de una solución reguladora de fosfato con un rango de pH de aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 6.5 a Temperatura Ambiente.
Cuadro 24 Resultados de eficiencia de conjugación a 0°C y Temp. Ambiente mediante SEC: Condiciones de conjugación: volumen total: 0.5 mi; h38C2 = 4.9 mg/ml; relación molar de [NO ID SEC: 10-L1]: h38C2 = 0.8:1; 4°C, 26 horas; Temp. Ambiente durante la noche.
Estudio de curso de tiempo oara Ab-fFGF21 -LiaadorlL Se generó un estudio de curso de tiempo para uso en el modelado de la conjugación de [FGF21-1 er ligador] con h38C2. Después de 18 horas a Temperatura Ambiente, la eficiencia de conjugación para el intermediario h38C2-[NO ID SEC: ^0-L^]^ alcanzó el nivel máximo como se muestra en el Cuadro 25. En consecuencia, la reacción de conjugación se puede llevar a cabo durante un tiempo seleccionado a partir del grupo que consta de por lo menos 30 minutos, por lo menos aproximadamente 60 minutos, por lo menos aproximadamente 90 minutos, por lo menos aproximadamente 2 horas, por lo menos aproximadamente 3 horas, por lo menos aproximadamente 4 horas, por lo menos aproximadamente 6 horas, por lo menos aproximadamente 12 horas, por lo menos aproximadamente 18 horas y por lo menos aproximadamente 24 horas.
Temperatura Ambiente SEC: Condiciones de conjugación: volumen total: 0.5 mi; h38C2 = 4.0 mg/ml; relación molar: [FGF21 -1 er ligador]-: Anticuerpo = 0.8:1; Temp. Ambiente; en 25 mM MES pH 6.0.
Aiuste fino de condiciones de conjugación para FGF21 -liaador: Se realizaron amplificaciones de laboratorio a diferentes escalas con una variedad de soluciones reguladoras y pHs optimizados. La eficiencia de conjugación para h38C2-[NO ID SEC: 0 - L 1 ] ! se mantuvo comparable en el rango de aproximadamente 40%-aproximadamente 45% (Cuadro 26). Ya que la hidrólisis de grupo reactivo de NO ID SEC:10-L1 ocurre en el curso del tiempo (Cuadro 27), la diafiltración de post activación de NO ID SEC: 10-L1 será operada entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10°C. La cantidad de NO ID SEC: 10- L1 después de la diafiltración de post activación variada en diferentes experimentos, y la diferencia podría contribuir a la variación de la eficiencia de conjugación para 38C2-[ NO ID SEC: 10- L1]!. Aproximadamente 100 mM Fosfato pH aproximadamente 6.3 dieron el ultimo agregado y el mayor % h38C2 remanente para fines de reciclado. comparación de eficiencia de conjugació reactive de [NO ID SEC: 10-L1] a 4°C mediante cromatografía FGF21 RP. Condiciones de activación: volumen total: 1.0 mi; [NO ID SEC: 10-L1] = 1.8 mg/ml; relación molar: TCEP: [NO ID SEC: 10-L1] = 0.5:1, tratamiento TCEP 60 minutos; después relación molar: NO ID SEC: 64: [NO ID SEC: 10-L1] = 1.4:1; activación de ligador 30 minutos; TA; en 25 mM Tris pH 7.5 y 200 mM Na2S04.
Selección de solución reguladora v pH para conjugación de í2do Haador-Ex41 v Ab-ÍFGF21 -ligador : La solución de reacción de conjugación a partir de la primera etapa de conjugación que involucra [NO ID SEC: 10-L1] activado y h38C2 fue purificada en una etapa de cromatografía de fase inversa Butyl 650 S para generar h38C2-[NO ID SEC: 10- L 1 ] 1. Este material fue diafiltrado después en solución reguladora adecuada (ya sea 30 mM de lactato de sodio pH 4.8 o 20 mM de glutamato de sodio pH 4 5). La reacción de fusión selectiva espontánea entre el anillo AZD de un ligador tal como L1 y K99 de NO ID SEC: 26 normalmente tiene lugar a pH 6.5, aunque no a pH 4.5. Se investigó el parámetro de pH óptimo para conjugación de h38C2-[NO ID SEC: 10-11], para [L1-NO ID SEC: 64], 100 mM solución reguladora MES pH 7.0 se utilizó para ajustar el pH de la solución h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]-,. Los resultados (Cuadros 28 y 29) indicaron el rango óptimo de entre aproximadamente pH 6.0 y aproximadamente pH 6.5. Se logró una mayor eficiencia de conjugación en MES/solución reguladora de lactato. Se logró excelente eficiencia de fusión para ABC-1 ([NO ID SEC: 10 - L 1 ] 1 -h38C2 (lgG1)-[L1-NO ID SEC: 64]t usando la mayor relación molar de [2do ligador-Ex4]: Ab-[FGF21-1er ligador] = aproximadamente 1.3:1.
PH %Ab % Ab -[Ex4-L1], ÍAb-[FG F21 ??-?129C], ABC-1 6.5 0.9 3.4 10.3 82 5 6.0 1.0 3.3 10.9 81 9 5.9 1.0 3.2 2.3 80 2 5.65 1.1 3.1 13.7 79 2 5.4 1.2 3.0 15.4 77 7 5.1 1.6 2.9 23.7 68 3 4.75 2.2 2.9 33.8 54 2 Cuadro 28 Resultados de segunda eficiencia de conjugación en solución MES/glutamato a diferente pH mediante HIC: Condiciones de conjugación: volumen total: 0.5 mi; h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]-, = 10.0 mg/ml; relación molar: [L1-NO ID SEC: 64]:/ h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]! = 1:1; TA; en solución de MES/glutamato.
Cuadro 29 Resultados de segunda eficiencia de conjugación en solución de MES/Lactato a diferente pH mediante HIC: Condiciones de conjugación: volumen total: 0.2 mi; h38C2-[NO ID SEC: ^0-L^]^ = 6.0 mg/ml; relación molar: [L1-NO ID SEC: 64]: / h38C2-[NO ID SEC: 10 - L 1 ] ! = 1.3:1 ; TA; en solución M ES/Lactato .
Estudio de curso de tiempo oara í2do Haador-Ex4Zt-Ab-íFGF21 -ligador] ^ Se generó un estudio de curso de tiempo para uso en el modelado de conjugación de h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]i con [UNO ID SEC :64]. Después de 18 horas a TA, la eficiencia de conjugación para h38C2-[NO ID SEC: 10- L 1 ] ! se aproximó a un nivel máximo como se muestra en el Cuadro 30.
Cuadro 30 Datos cinéticos para ABC-1 a TA mediante HIC: Condiciones de conjugación; volumen total: 1.0 mi; h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]! = 6.0 mg/ml; relación molar: [L1-NO ID SEC :64]: h38C2-[NO ID SEC: 'lO-LI]! = 1.3:1 ; TA; en solución de MES/Glutamato, pH 5.8.
Ejemplo 55 Conjugación de FGF21 para ligador La relación de monómero y dimero para FGF21 se revisó antes del experimento. El análisis mostró FGF21 RHPLC que la relación monómero: dimero fue 27%:73%. 0.207 mM de NO ID SEC: 10 (17.1 g en 20mM TRIS, 50 mM NaCI, 2.346 L, pH 7.0 fue diluido primero con 100 mM solución reguladora MES pH 7.0 (1.920 L) hasta concentración de objetivo 4 g/L como se midió a través de absorbancia a 280 nm. Se agregaron después 7.631 mi de solución concentrada de TCEP (50 g/L). La mezcla fue mezclada completamente durante 5 minutos y después la mezcla se redujo a condición ambiente. La reacción duró 90 minutos. Después de la reducción con TCEP, la muestra fue analizada .mediante FGF21 RF que muestra que la relación monómero: dímero fue de 89%:6.3% como el control en proceso.
Después de 90 minutos, el L1 (656.7 mg) fue disuelto en 8.76 mi de DMSO (la concentración final de L1 fue 0.29 mM, o aproximadamente 0.15 mg/ml), y la solución fue agregada a la solución NO ID SEC:10. El recipiente de L1 fue enjuagado con solución reguladora para asegurar que se agregó todo el L1. La activación inició después de que todo el L1 había sido agregado a la combinación [NO ID SEC: 10]. La reacción fue mezclada completamente durante 5 minutos y después la mezcla se redujo a TA. Esta mezcla fue dejada a TA durante 30 minutos con oscilación para completar la reacción entre NO ID SEC: 10 y el ligador L1. La temperatura de activación podría reducirse de ser necesario. El análisis adicional mediante HPLC de fase inversa (RP) de FGF21 mostró 73% de formación de [NO ID SEC:10-L1].
La muestra anterior fue pasada adicionalmente a través de UFDF para remover ligador en exceso y TCEP. La membrana fue sanitizada con 1N NaOH durante 30 minutos, drenada y equilibrada con 100 mM MES, pH 7.0. Solución reguladora 100 mM MES, pH 7.0 fue utilizada para diafiltración (7 X diafiltración) . La diafiltración se efectuó a 4 g/L concentración de material retenido. Se pueden evitar el espumado y la salpicadura durante UF/DF. La hidrólisis del grupo reactivo de [NO ID SEC: 10-L1] ocurrió durante el proceso de diafiltración. El tiempo de retención para post-activación de combinación DF se reducirá al mínimo. UF puede ser operado a 2-10°C usando membrana 10K Sartorius Hydrosart. Las especies combinadas [NO ID SEC: 10-L1] confirmadas mediante RP FGF21 descendieron desde 73% hasta 64% después de UF/DF.
La concentración fue estimada mediante UV 280nm utilizando coeficiente de extinción de 0.47 OD igual 1 mg para NO ID SEC: 10 (Combinación Q Seph Filtrado) y [NO ID SEC: 10-L1] (Combinación UF/DF post activación). Este mecanismo de reacción, y las variaciones del mismo, también son adecuados para uso en la estrategia 1, así como con otras variantes FGF21 y ligadores.
Ejemplo 56 Conjugación de [FGF21 -ligador] para Ab 95.0 g de h38C2 (NO ID SEC: 25 y NO ID SEC: 26: 17.05 g/L, 5.6 L en 10 mM histidina, 10 mM glicina, pH 6.5) fueron diluidos con 100 mM de solución reguladora de fosfato (14.4 L, pH 6.2). Después 17.72 gm de [NO ID SEC: 10-L1] en 100 solución reguladora MES pH 7.0 (4.4 g/L, 3.8 L, 1.35 mols [NO ID SEC: 10-L1 ]: 1 mol h38C2 fue agregada a la mezcla h38C2. La mezcla de reacción final fue de aproximadamente 4 g/L de h38C2 a TA. La reacción inició una vez que se agregó el componente [NO ID SEC: 10-L1]. La reacción fue mezclada completamente durante aproximadamente 5 minutos y después la mezcla fue reducida a TA. Esta mezcla fue dejada a TA durante la noche, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20 horas con agitación moderada. Se tomó una pequeña cantidad de material para análisis mediante cromatografía SEc para confirmar la formación del conjugado h38C2-[SEQ ID NO: 10- L 1 ] ! en la mezcla. El análisis SEC mostró el rendimiento de la etapa de conjugación de h38C2-[NO ID SEC: 10-L1], como 40% según se muestra en el Cuadro 33. El rendimiento de la etapa de conjugación fue calculado como pureza de valencia h38C2-[NO ID SEC: 10-L 1 ] n mediante SEC (%)¦ Ejemplo 57 Enriquecimiento del intermediario de proceso Ab-[FGF21 -ligador] i reactivo h38C2-[NO ID SEC: 10-L1 ]¦, fue enriquecido utilizando una columna escala 19 L empacada con resina Tosoh© Butyl 650S usando una columna XK de 35 cm de diámetro empacada para una altura de lecho de 20 cm. La columna fue pre-equilibrada y lavada con 3 CV (volumen de columna) de WFI y 5 CV de 50 mM fosfato de sodio pH 7.0. La combinación de conjugación filtrada de h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]1 fue cargada a 5 mg/mol en la columna Butyl 650S a 17°C. Después la carga Butyl 650S fue procesada a través de la resina Tosoh Butyl 650 S utilizando un método Unicorn programado en la cromatografía automatizada operado a 17-18°C. Se realizó la elución utilizando un gradiente lineal: primero con lavado de 2.4% 1 ,6 hexandiol ¡socrático (88% Solución Reguladora A (50 mM fosfato de sodio, pH 7.0) y 12% Solución Reguladora B (50 mM fosfato de sodio, 20% hexandiol, pH 7.0) con 7 CV; seguido por un gradiente de elución de 88% A+ 12% B hasta 60% A+ 40% B con 11 CV; retención de gradiente a 60% A+ 40% B con 5 CV. Las fracciones fueron recolectadas y analizadas mediante ensayo SEC de pureza para determinar que fracciones serían combinadas. Los resultados analíticos SEC para la combinación final se muestran en el Cuadro 31. h38C2-[NO ID SEC: 10- L 1 ] ! fue recuperado de manera selectiva a elevado rendimiento el cual corresponde a -90% de recuperación de especies h38C2-[NO ID SEC: 10- L 1 ] 1 cargadas en la columna y también con elevada pureza > 90% en la etapa de solución y tuvo una buena resolución a partir de las otras especies de reacción de conjugación que incluyen [NO ID SEC: 10-L1] libre, dímeros [NO ID SEC: 10-L1]2, h38C2-[NO ID SEC: 10-L1 ]2, especies h38C2 ( + 0 FGF21) agregadas y libres. Las fracciones a partir de cromatografía Butyl 6508 fueron combinadas juntas y concentradas de manera adicional y diafiltradas. Se calculó la concentración mediante UV 280 nm utilizando extinción de 1.47 igual 1mg de proteína.
Cuadro 31 Eficiencia de conjugación para h38C2-[NO ID SEC: 10-L1] i Ejemplo 58 Conjugación de [2do ligador-Ex4] para Ab-[FGF21-ligador], 34.6 9 de h38C2-[NO ID SEC: 10-L1], en 30 mM solución reguladora de lactato de sodio pH 4.8 (9.7 g/L, 3.569 L) fueron tratados con 25 mM solución reguladora MES pH 7.0 (2.1 L) para ajustar el pH a 6.3. Después 1.81 g de [L1-NO ID SEC: 64] disueltos en 90.2 mi de WFI (agua para inyección) (la concentración final de [L1-NO ID SEC: 64] fue de 0.065 mM, o aproximadamente 0.31 m9/ml) fueron agregados a la solución h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]i. El recipiente de [NO ID SEC: 10- L1] fue lavado con solución reguladora para asegurar que se agregó todo el péptido. La mezcla de reacción final puede ser 6.0 9/L para h38C2-[NO ID SEC: 10-L 1 ] . La reacción fue completamente mezclada durante alrededor de 5 minutos y después se redujo la mezcla a TA. Esta mezcla fue dejada a TA durante la noche, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20 horas con agitación moderada. Se tomó una pequeña cantidad de material para análisis mediante cromatografía HIC para confirmar la formación de [NO ID SEC: 10-L1]-[NOs ID SEC:25 y 26]-[L1-NO ID SEC: 64], (ABC-1). El análisis HIC mostró un 90% de rendimiento de (ABC-1). El rendimiento de etapa de conjugación se calculó como pureza de [NO ID SEC: 10-L1]-[NOs ID SEC:25 y 26]-[L1-NO ID SEC: 64]1 (ABC-1) valencia +2 por medio de HIC (%).
El [L1-NO ID SEC: 64] en exceso fue removido utilizando cromatografía de intercambio aniónico Capto Q, y las fracciones a partir de la cromatografía Capto Q fueron combinadas juntas y concentradas adicionalmente y diafiltradas para dar la sustancia de fármaco final.
Ejemplo 59 Enriquecimiento de Ab completamente reactivo utilizando columna de Phenyl 650 S El Ab completamente reactivo (h38e2) fue enriquecido utilizando una columna escala 9.5 L empacada con resina Tosoh Phenyl 6508 utilizando una columna de 30 cm de diámetro empacada para una altura de lecho de 14 cm. La columna fue pre-equilibrada y lavada con 2 CV (volumen de columna) de WFI y 5 CV de 20 mM fosfato de sodio, 1 M NaCI, pH 7.0. La combinación h38e2 (153 g) fue cargada a 15 mg/mol en la columna Phenyl 6508 a TA. Después la carga h38e2 fue procesada a través de las resinas Tosoh Phenyl 650 S usando un método Unicorn programado en la cromatografía automatizada. Se realizó la elución con lavado 1 CV utilizando 20 mM fosfato de sodio, 1 M NaCI, pH 7.0; después la reducción de sal desde 100% A (20 mM fosfato de sodio, 1M NaCI, pH 7.0) hasta 67% B (20 mM fosfato de sodio, pH 7.0) en 7 CV, retención al 67% B para 6 CV, después hasta 100% B en 3 CV, seguida por elución desde 100% B hasta 70% C (20 mM fosfato de sodio, 20% hexandiol, pH 7.0) en 1 CV, después retención de gradiente a 70% C para 5 CV. Las fracciones fueron recolectadas y analizadas mediante ensayo HCI de pureza para determinar que fracciones serían combinadas. El h38e2 completamente conjugable puede servir como material de alimentación para etapas de bioconjugación subsecuentes que conducen al producto deseado final.
Conclusiones: Se desarrollaron tres etapas de conjugación como parte del proceso de producción para sustancia de fármaco de anticuerpo biespecífico bioconjugado ABC-1. Se exploraron dos estrategias diferentes para conjugar y purificar los intermediarios de proceso que conducirían a la generación de la sustancia de fármaco final. La estrategia 2 fue amplificada de manera exitosa en el laboratorio y tuvo un desempeño consistente en pruebas repetidas.
Ejemplo 60 Optimización de Butyl RP para purificación de Ab-[NO ID SEC: 10-L1], Protocolos experimentales: Se realizaron experimentos de cromatografía a escala de 4 mL o 103 mi usando los protocolos y las condiciones de operación que se muestran a continuación: Columna de 4 mi - 0.5 cm de diámetro x 20 cm de altura operada bajo condiciones ambiente Solución Reguladora A: 50 mM Fosfato pH 7.0 Solución Reguladora B: 50 mM Fosfato pH 7.0, 20% 1 ,6-hexandiol Solución Reguladora C: 50 mM Fosfato pH 6.5 Velocidad de Flujo: 125 cm/hr 2ml_ fracciones a través de lavado y gradiente fueron recolectadas utilizando Frac 950 equipado con placa de microtitulo de pozo profundo de VWR.
Cuadro 32 Detalle de experimento con gradientes para cada operación. Cada operación fue pre-equilibrada WFI con 3 volúmenes de columna (CV). El equilibrio tiene lugar con 5 CV, después de lo cual las columnas fueron cargadas con las combinaciones de conjugación FGF21 a 4 mg/ml. Durante la etapa de elución de gradiente, la composición de fase móvil que la columna experimenta en cualquier etapa determinada es expresada como una mezcla de solución reguladora A y solución reguladora B las cuales son mezcladas en las relaciones especificadas. Por ejemplo, una etapa de gradiente desde 12% B hasta 40% B significa que una composición de partida de una mezcla de 12% B +88% A cambia linealmente con el tiempo hasta la composición final de 40% B + 60% A lo largo de los 11 volúmenes de columna. Después de la etapa de elución de gradiente, cada operación de columna fue lavada con 5CV de 100% Solución Reguladora B. Después de esto, cada operación de columna fue limpiada con 5CV de 0.5 N NaOH en una dirección ascendente, y después lavada con 5CV 0.1N NaOH. Se realizaron todas las evaluaciones preliminares utilizando una columna de 4 mL (0.5 cm de diámetro x 20 cm de altura) empacada con resina Tosoh Butyl 650S.
Operación #1 8: La primera operación de columna Butyl 650 S #118 ser realizó a una carga de columna de 5 mg/ml usando solución de reacción de conjugación h38C2-[NO ID SEC: 10- L 1 ] 1. La columna fue cargada sin sal liotrópica agregada y operada bajo condiciones de temperatura ambiente. La columna fue pre-equilibrada y lavada con 3 CV (volumen de columna) de WFI y 5 CV de 100% solución reguladora A (50 mM fosfato de sodio pH 7.0). La combinación de conjugación filtrada de h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]-, fue cargada a 5 mg/mol en la columna Butyl 650S y después procesada a través de la resina Butyl 650 S usando un método Unicorn programado. La columna fue lavada con 5 CV de 100% solución reguladora A, después se operó un gradiente lineal desde 100% A+ 0% B (50 mM fosfato de sodio, 20% hexandiol, pH 7.0) hasta 10% A+ 90% B en 10 CV; el gradiente se mantuvo al 100% B con 5 CV. Las fracciones fueron recolectadas y analizadas mediante ensayo SEC. Los resultados analíticos SEC se muestran en el Cuadro 33.
Los resultados indican buena separación de entre Ab-[NO ID SEC: 10-L1]i desde Ab-[NO ID SEC: 10-L1]2 y FGF21 libre. Aunque se encontró que algunas de las especies mAb ( + 0) libres se co-eluyen en el extremo frontal del pico de producto Ab-[NO ID SEC: 10-L ] ! la mayor parte de las especies mAb ( + 0) se eluyeron posteriormente en el gradiente 1 ,6-hexandiol.
Cuadro 33 Resultados SEC de carga y fracciones de columna para operación # 118.
Operación #128: El efecto del incremento de la carga de proteína a 10 mg/mL se determinó en la operación de columna #128, en tanto que el gradiente se mantuvo igual que en la operación de columna #118. Para este experimento se utilizó una reacción de conjugación diferente como material de carga. Esta reacción había sido optimizada para la concentración relativa superior de Ab-[NO ID SEC: 10-L1]-, (es decir, 44.7%) aunque tuvo de igual modo una concentración relativa superior de Ab-[NO ID SEC: 10- L 1 ]2 (es decir, 24.4 %) y menor concentración de especies mAb 24.7% mediante ensayo SEC en comparación con la solución de carga usada en la operación de columna # 118. Se esperan que mayores niveles de especies Ab-[NO ID SEC: 10-L1]2 y mayor carga de proteína impacten el rendimiento de columna y la composición de producto de combinación de elución. Como es evidente en el Cuadro 34 la carga incrementada resulta en resolución reducida de especies Ab-[NO ID SEC: 10-L1]2 a partir de Ab-[NO ID SEC: 10-LljV para operación #128 Operación #132: Para mejorar la resolución de las especies Ab-[NO ID SEC: 10 - L 1 ] ! se realizó una elución de gradiente superficial (100% A+ 0% B hasta 10% A+ 90% B en 20 CVs) en la operación de columna #132 a una carga de columna de 5 mg/mL que utiliza el mismo material de carga empleado en la operación de columna #128. El Cuadro 35 muestra el perfil de elución y la pureza relativa de varias especies conjugadas según se determinó mediante SEC para fracciones de elución. Una separación mejorada entre especies Ab- [NO ID SEC: 10-L1]2 y especies Ab-[NO ID SEC: 10-L1]1 se obtuvo con 1,6 hexandiol superficial, lo cual sugiere que sería benéfica la elución de una etapa diseñada para eluir la mayor parte de las especies Ab-[[NO ID SEC: 10-L1]2 con una cierta concentración reducida de 1,6 hexandiol. Una operación de lavado de hexandiol al 5% de columna # 134 después 5 mg/ml de carga resultó en elución de todas las especies enlazadas (datos no mostrados). para operación #132 Operación #138: Subsecuentemente se realizó un experimento con lavado de 1 ,6-hexandiol ¡socrático al 2.4% (es decir, operación de columna #138) seguido por un gradiente de elución de 2.4%-18% en 30 CVs a una densidad de carga de 5 mg/ml. El Cuadro 36 muestra el perfil de elución desde esta operación con el ensayo SEC de las fracciones. La separación mejorada se obtuvo utilizando la etapa de lavado al 2.4% que precede al gradiente de elución como se observa en este perfil de elución. En base a esto, se determine que 12% de Solución Reguladora B y 88% de Solución Reguladora A proporcionan una concentración inicial adecuada de 1,6 hexandiol para la elución de gradiente lineal sobre 30 CV, en tanto que la operación de columna #134 pareció lavar demasiado Ab-[NO ID SEC: 10-L1], inicialmente, debido a la concentración inicial de 1,6 hexandiol ligeramente superior.
Con c. (mg/mL) % Agregado % Agregado % Ab-[FGF21AH- % Ab-FGF21 ??- %Ab Grande A129C-L1]2 A129C-L1], A5 0.20 0.0 0.7 9.6 84.6 5.1 A10 0.15 0.0 1.0 83.6 11.5 3.8 A12 0.17 0.1 0.8 87.9 9.4 1.8 C8 0.10 0.2 0.7 9.9 11.1 78.2 C11 0.11 0.2 1.7 11.9 34.0 52.1 C12 0.12 0.2 2.0 10.0 531 34.8 D1 0.15 0.1 2.0 7.1 72.4 18.3 D5 0.39 0.1 0.9 1.5 93.3 4.2 D8 0.27 0.0 1.5 2.3 89.7 6.4 D9 0.24 0.1 2.2 3.0 86.0 8.7 E2 0.13 0.2 5.6 3.2 34.1 56.9 E4 0.10 0.2 7.9 1.4 21.9 68 S E9 0.28 0.0 0.3 0.0 0.0 99.7 Cuadro 36 Resultados SEC de carga y fracciones de co para operación #138 Efecto de temperatura y pH Operación #148: Se ha demostrado que la temperatura y el pH son parámetros de proceso importantes que influyen en el rendimiento y resolución de columna de las diversas especies conjugadas. Se evaluó el impacto de baja temperatura en la operación de columna #148 para la separación de especies Ab-[NO ID SEC: 10 - L 1 ] i de las otras especies en este estudio. Para este experimento la columna y las soluciones reguladoras fueron almacenadas y operadas a 17°C en un refrigerador de temperatura controlada. La columna fue cargada hasta 5 mg/mL y lavada y eluida utilizando un protocolo similar a la operación de columna #138. La reducción de temperatura desde 22°C hasta 17°C resultó en una capacidad de enlace enormemente disminuida para las especies Ab-[NO ID SEC: 10- L 1 ] 2 · Se encontró que la operación de la columna a la temperatura reducida (es decir, aproximadamente 17°C) mejora la separación de las especies Ab-[NO ID SEC: 10 - L 1 ] 2 en la etapa de lavado y mejoró la resolución de producto Ab-[NO ID SEC: 10 - L 1 ] n como es evidente en el perfil mostrado en el Cuadro 37.
Cuadro 37 Resultados SEC de carga y fracciones de columna para operación #148 a 17°C.
Operación #152: Se encontró que el equilibrio de la columna a un menor pH de 6.5 pero ejecutando la elución a un mayor pH de 7.0 es nocivo para el rendimiento de separación en 152. Se observa que las especies Ab-[NO ID SEC: 10-L1]2 se enlazan fuertemente a la columna en un bajo pH y se observó un desplazamiento hacia la derecha en el perfil de elución que resulta en escasa separación entre las especies Ab-[NO ID SEC: 10 - L 1 ] 2 y las especies Ab-[NO ID SEC: 10-L1], (Cuadro 38).
Cuadro 38 Resultados SEC de carga y fracciones de columna para operación #152.
Desarrollo de condiciones finales y demostración de consistencia de proceso Operación #156: La combinación seleccionada de condiciones de operación por ejemplo pH, temperatura, condiciones de lavado y elución de gradiente lineal usada en la operación de columna #148 proporcionaron la resolución adecuada de las especies Ab-[NO ID SEC: 10-L1]i a partir de las especies Ab-[NO ID SEC: 10-L1]2. Se exploró el mejoramiento adicional en la separación para lograr la resolución de las especies Ab-[NO ID SEC: 10-L1]i a partir de las especies mAb en la operación de columna #156 usando una etapa de retención de 1 ,6-hexanediol isocrático al 8% durante la elución de gradiente. En 1 ,6-hexandiol al 8% la mayoría de las especies Ab-[NO ID SEC: 10 - L ] i son eluidas a partir de la columna que deja una gran proporción de las especies mAb unidas todavía a la columna. Las especies mAb fueron eluidas de manera subsecuente durante la etapa de regeneración con un lavado de 1 ,6-hexandiol isocrático al 100%. Los resultados SEC de las fracciones a partir de la operación de columna #156 realizada a una densidad de carga de columna de 5 mg/mL se muestran en el Cuadro 39. El pico de elución observado a la mitad de la etapa de gradiente es enriquecido en especies Ab-[NO ID SEC: 10- L 1 ] ! con niveles muy bajos de especies Ab-[NO ID SEC: 0- L 1 ] 2 y ciertas especies mAb. Se prepare una combinación representativa a partir de las fracciones # C8-D6 resultando en una concentración de proteína de combinación de 0.225 mg/mL que corresponde a un rendimiento de proteína de columna de 24%.
Cuadro 39 Resultados SEC de carga y fracciones de columna para operación #156.
Operación #160: El rendimiento de ampliación fue evaluado en la operación de columna #160 usando una columna de 103 ml_ empacada utilizando una columna XK con diámetro de 2.6 cm empacada para una altura de lecho de 20 cm. La columna fue cargada hasta 5 mg/mL y lavada y eluida utilizando un protocolo similar a la operación de columna #156. Los resultados SEC de las fracciones a partir de la operación de columna # 160 ejecutada a una densidad de carga de columna de 5 mg/mL se muestran en el Cuadro 40. El pico de elución en la etapa del gradiente lineal contenía fracciones de muy alta pureza enriquecidas en las especies Ab-[NO ID SEC: 10-L1]L Se preparó una combinación de elución mediante fracciones de combinación D2-F1 que contenían 36.4 % de la proteína total que correspondió a > 85% de recuperación de +1 especies cargadas en la columna.
Cuadro 40 Resultados SEC de carga y fracciones de columna para operación #160.
Se realizaron varias operaciones de columna de amplificación (#178, #180 y #182) bajo condiciones idénticas a fin de probar la capacidad de reproducción del rendimiento a una carga de 5 mg/mL. Se preparó una combinación de elución para cada operación y los perfiles de combinación de elución a partir de las 3 operaciones realizadas bajo las mismas condiciones de operación se muestran en el Cuadro 41, y los resultados han indicado la consistencia de los mismos. amplificación Conclusiones: Se seleccionó Butyl 650 S como la resina potencial preferida parta la etapa de purificación cuando el proceso de conjugación se llevó a cabo con proteína FGF-21 que fue acoplada primero a mAb seguida por el péptido Exendin4. La resina proporcionó una buena capacidad de enlace de 5 mg/mL en ausencia de sal liotrópica. La elución de producto enlazado se logró utilizando gradiente de 1 ,6-hexandiol a pH 7.0. Las especies Ab-[NO ID SEC: 10-L1]i conjugadas individuales fueron enriquecidas y eluidas de manera selectiva usando una estrategia de elución secuencial es decir, etapa de lavado ¡socrático con hexandiol al 2.4% seguido por elución de gradiente lineal de hexandiol al 2.4%-8%. Se obtuvo > 85% de rendimiento para las especies mAb +1 FGF 21 cargadas en la columna.
Se encontró que la concentración de hexandiol durante la etapa de lavado, la densidad e carga de la columna, el pH y la temperatura son importantes parámetros que impactaron la capacidad de enlace, la resolución y rendimiento de columna. La etapa de purificación fue amplificada de manera exitosa en el laboratorio hasta escala 100mL y tuvo un comportamiento consistente en las pruebas repetidas.
Ejemplo 61 Ensayos In Vitro de moléculas ABC En el ensayo Glutl Taqman, se utilizaron adipocitos 3T3-L1 diferenciados para medir la expresión de Glutl ARNm mediante el método PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR) descrito más adelante. Adipocitos 3T3-L1 diferenciados con 10-14 días carentes de suero durante la noche fueron tratados como compuestos durante 6 horas. El ARN total fue extraído a partir de estas células, y se midió la expresión G I ut 1 y GAPDH ARNm utilizando un equipo Quantitect Probé RT-PCR y operando una reacción PCR cuantitativa en tiempo real en una máquina Taqman. Se determine la bioactividad de los compuestos mediante cambio múltiplo en los niveles G I u 11 ARNm normalizados mediante los niveles GAPDH ARNm a partir de cada muestra. En el ensayo cAMP, células de ovario de hámster chino (CHO) que sobre-expresan GLP-1R humano (CHO-hGLP-1 R) fueron cultivadas en placas de 96 pozos en un medio libre de suero con 300 uM IBMX. Se incubaron células con compuestos a TA durante 1 hora. Se midieron los niveles cAMP usando un Equipo CisBio cAMP de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se determine la bioactividad de los compuestos a través de los valores EC50 obtenidos a partir del ensayo (véase el Cuadro 42).
Cuadro 42 Potencia In vitro de compuestos en ensayos G I ut 1 Taqman y cAMP.
Ejemplo 62 Ensayos in vivo ABC en modelos de murino Farmocinéticos. Los farmacocinéticos de [NO ID SEC: 10-L1]i-h38e2-(lgG1 )-[L1 -NO ID SEC: 64]? referidos también como Conjugado Bifuncional Asimétrico-1 (ABC-1 ), fueron evaluados en ratones Swiss Webster macho (22-24g). Se administró a los ratones compuestos IV y SC a 3 mg/kg, y se tomaron muestras de sangre de 3 ratones por punto de tiempo en los diferentes puntos de tiempo hasta 120 horas. Se prepararon muestras de suero y fueron analizadas a través de dos ensayos ELISA. En el ensayo GLP-1, los conjugados fueron capturados mediante anticuerpo específico e-terminal Exendin4 y detectados mediante mAb específico N-terminal GLP-1. En el ensayo FGF21, los conjugados fueron capturados con anticuerpo anti-ld y detectados por medio de un mAb FGF21. Las estimaciones de parámetro PK se resumen en el Cuadro 43. administración IV y SC a 3 mg/kg en ratones Swiss Webster.
Peso corporal v AUC de glucosa. Se evaluó la eficacia in vivo de ABe-1 en un estudio de dosis única en ratones ob/ob. Los compuestos fueron dosificados SC en el día O a 1 o 3 mg/kg, y se condujo un OGTT en el día 3. ABe-1 redujo de manera significativa peso corporal a 1 y 3 mg/kg, y tolerancia de glucosa significativamente mejorada a 3 mg/kg 3 días después de una dosis única (Cuadro 44) Cuadro 44 Cambio de peso corporal desde el día O medido en el día 3, y AUC de Glucosa durante OGTT medido en el día 3, después de una inyección SC única de ABe-1 en ratones ob/ob. *p<0.05, ***p<0.001 vs vehículo ANOVA unidireccional con post-pruebas de Dunnett. Valores SEM proporcionados en paréntesis.
Comparación de diferentes moléculas ABC in vivo. Dos moléculas ABC bifuncionales asimétricas (ABCs) fueron comparadas: ABC-1 y ABC-2. Ambas ABCs comprenden la fórmula: [NO ID SEC: 10-L1 ]i-[Ab]-[L1 -NO ID SEC: 64]^ Ambas ABCs comprenden una versión de h38e2 como el anticuerpo: ABC-1 comprende una versión lgG1 de h38e2 (NOs ID SEC: 25 y 26) y ABe-2 comprende una versión lgG2 de h38e2 (NOs ID SEC: 25 y 76). Se evaluó una comparación de la potencia in vitro de ABC-1 y ABC-2 en ensayos basados en célula (ensayo Giut para brazo FGF21 y ensayo cAMP para brazo GLP-1), y sus actividades comparables.
Los farmacocinéticos de ABC-2 fueron evaluados en ratones macho Swiss Webster (22-24g). Se administró por vía IV y SC los compuestos a 3 mg/kg, y se tomaron muestras de sangre de 3 ratones por punto de tiempo en los diferentes puntos de tiempo hasta 120 horas. Se prepararon muestras de suero y fueron analizadas por medio de dos ensayos ELISA. En el ensayo GLP-1, los conjugados fueron capturados mediante anticuerpo anti-ld y detectados por medio de mAb específico N-terminal GLP-1. En el ensayo FGF21, los conjugados fueron capturados con anticuerpo anti-ld y detectados por medio de un mAb FGF21. Las estimaciones de parámetro PK se resumen en el Cuadro 45.
Cuadro 45 Estimaciones de parámetro PK de ABe-2 después de administración IV y SC a 3 mg/kg en ratones Swiss Webster.
La eficacia in vivo de ABe-1 y ABe-2 fue evaluada en un estudio de dosis única en ratones ob/ob. Los compuestos fueron dosificados SC en el día O a 0.3 o 3 mg/kg, y se condujo OGTT en el día 3. Ambos compuestos a 3 mg/kg redujeron de manera significativa el peso corporal y tolerancia a la glucosa mejorada 3 días después de una dosis única (Cuadro 46).
Cuadro 46 Cambio de peso corporal a partir de día O a día 3, y AUC de Glucosa durante OGTT en día 3, después de una inyección SC única de ABe-1 y ABe-2 en ratones ob/ob. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs vehículo mediante ANOVA unidireccional con postpruebas de Dunnett. Valores SEM proporcionados en paréntesis.
Ejemplo 63 Ensayos in vivo ABC en monos cynomolgus Los farmacocinéticos de ABe-1 también fueron investigados en el mono cynomolgus macho después de administración de bolo única IV y SC a un nivel de dosis de 3 mg/kg. Las muestras de sangre fueron recolectadas a partir de los animales en los puntos de tiempo designados hasta 21 días. Las muestras de suero fueron preparadas y analizadas a través de dos ensayos ELISA. En el ensayo GLP-1, los conjugados fueron capturados mediante anticuerpo específico e- terminal exendin4 y detectados mediante mAb específico N-terminal GLP-1. En el ensayo FGF21, los conjugados fueron capturados con anticuerpo anti-ld y detectados por medio de mAb FGF21. Las estimaciones de parámetro PK se resumen en el Cuadro 47.
Cuadro 47 Las estimaciones de parámetro PK de ABe-1 después de una administración IV y SC única a 3 mg/kg en monos cynomolgus.
Ejemplo 64 Eficacias de dosis de ABC-1 Eficacia de dosis de repetición de ABC-1. La eficacia de dosis de repetición de ABC-1 fuer evaluada en comparación con Ab-[NO ID SEC: 10-L1 ]2 (referido también como Ab[FGF21]2) y Ab[L1-NO ID SEC: 64]2 (referido también como Ab[Ex4]2) en ratones db/db. Los compuestos fueron dosificados en el día O y 7. Se midió el peso corporal dos veces por semana y se condujo un OGTT en el dia 10. En el día 11 , se recolectaron muestras de hígado, páncreas y suero para análisis de lípido e inmunohistoquímica (IHC). ABC-1 (10 mg/kg) redujo de manera significativa la ganancia de peso corporal en comparación con los grupos tratados con vehículo 3 días después de la segunda dosis, y también se normalizó el nivel de glucosa en sangre en ayuno y tolerancia de glucosa significativamente mejorada hasta una mayor extensión que los agentes individuales solos 3 días después de la segunda dosis en esos ratones (Cuadro 48). Además, ABe-1 redujo de manera significativa los niveles de triglicéridos y los niveles de colesterol en suero, y redujo el contenido de triglicéridos en el hígado en -43% en comparación con el grupo tratado con vehículo (Cuadro 49). En el páncreas, se observó un incremento importante en la masa de célula beta por 2.7 veces analizado mediante IHe en los ratones tratados con ABe-1 (Cuadro 49).
Cuadro 48 Cambio de peso corporal a partir del día O en el día 10, y AUC de Glucosa durante OGTT en el día 3, después de la inyección SC de repetición de compuestos en ratones db/db. *p<0.05, ***p<0.001 vs vehículo mediante ANOVA unidireccional con postpruebas de Dunnett. valores SEM proporcionados en paréntesis.
Tratamiento (mg/kg) Triglicérido en Suero Colesterol en Suero Triglicérido en Hígado Masa Célula Beta Medio (mg/dL) (SEM) Medio (mg/dL) (SEM) Medio (mg/g hígado) Media (mg) (SEM) (SEM) Vehículo 542 (91) 177 (8.3) 13.0(2.2) 0.67 (0.09) Ab[Ex4]2 (3) 302 (21)* 167 (4.9) 17.4(1.4) 1.39 (0.23) Ab[FGF21]2 (10) 356 (35) 171(7.3) 9.6 (2.2) 1.60 (0.13)* ABC-1 (10) 234 (42)** 120 (8.3)*** 7.4 (1.8) 1.82 (0.30)** Control austero (vehículo) ND ND ND 1.23 (0.21) Cuadro 49 Lípidos en suero, niveles de triglicérido en hígado, y masa celular beta pancreática en día 11 después de inyección SC de repetición de compuestos en ratones db/db. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0 001 vs vehículo mediante ANOVA unidireccional con postpruebas de Dunnett. Valores SEM proporcionados en paréntesis.
Se recolectaron los datos de eficacia de dosis de repetición adicionales con ABe-1 en comparación con los agentes individuales Ab[FGF21]2 y Ab[Ex4]2 en ratones db/db para definir mejor los efectos de la molécula sobre la función pancreática y la masa celular beta. Los compuestos fueron dosificados en el día 0 y 7, y se condujo un OGTT en el día 10. En el punto de tiempo de 15 minutos de OGTT, se recolecto sangre para medición de la secreción de insulina en plasma glucosa-estimulada. En el día 11, se recolectaron muestras de páncreas para análisis bioquímicos e inmunohistoquímicos. Todos los tratamientos mejoraron de modo significativo la tolerancia de glucosa en comparación con los controles tratados con vehículo. Se observó la potenciación de la secreción de insulina glucosa-inducida y la proliferación incrementada de células insulina-inmunoreactivas (% PCNA células beta positivas) en todos los grupos de tratamiento en comparación con los controles tratados con vehículo, con excepción de la dosis más elevada de ABC- (10 mg/kg). Por tanto en las dosis más bajas de ABC-1 tratadas, los efectos del compuesto en el páncreas son consistentes con aquellos de los agentes individuales. De manera inesperada, la dosis de 10 mg/kg de ABC-1 estuvo asociada con tinción insulina-inmunoreactiva incrementada (masa celular beta) y contenido de insulina pancreática sin un incremento significativo en la proliferación de células beta o en secreción de insulina glucosa-estimulada. Estos datos sugieren que en dosis de ABC-1 asociada con mayor pérdida de peso (véase Cuadro 48 anterior y los estudios en ratones DIO a continuación), un efecto de sensibilización a la insulina sobrepasa el impulso de proliferación de las células beta y la secreción de insulina, resultando en una acumulación de insulina en células beta prexistentes.
Tratamiento (mg/kg) AUC de Glucosa Insulina en plasma Masa de Célula Beta % Células Beta Contenido de Insulina Media (% de control Media a 15 min Media (mg) (SEM) Positivas PCNA Pancreática Media de vehículo) (ng/ml) (SEM) (SEM) (proteina total ug/mg) (SEM) Vehículo 100 4.2 (0.6) 0.32 (0.02) 1.1(0.4) 2.26 (0.54) Ab[Ex4]2 (3) 61*** 7.8 (1.0) 0.54 (0.08) 3.3 (0.4)* 2.25 (0.42) Ab[FGF21]2 (10) 73" 5.8(1.2) 0.49 (0.05) 4.4 (0.3)** 4.21(0.88) ABC-1 (1) 53*** 7.1(1.3) 0.44 (0.05) 3.6 (0.7)* 2.72 (0.61) ABC-1 (3) 39*** 10.2 (1.8)** 0.77 (0.12)** 4.4 (1.0)** 6.40 (2.86) ABC-1 (10) 36*** 3.7 (0.8) 0.71(0.13)** 2.4 (0.3) 15.98 (3.57)*" Cuadro 50 Tolerancia a la glucosa, secreción de insulina glucosa-estimulada, y estatus de célula beta pancreática en el día 11 después de la inyección SC de repetición de compuestos en ratones db/db. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs vehículo mediante ANOVA unidireccional con post-pruebas de Dunnett. Valores SEM proporcionados en paréntesis.
Eficacia de dosis sub crónica. Se evaluó la eficacia de dosis sub-crónica de ABC-1 en comparación con Ab[FGF21]2 y Ab[EX4]2 en ratones DIO (resultados mostrados en el Cuadro 51). Todos los compuestos fueron dosificados SC una vez por semana, se midieron el peso corporal y la ingesta alimenticia dos veces por semana y se condujo un OGTT en el día 17, 3 días después de la 3rs dosis semanal. En el día 20, se recolectaron muestras de hígado y suero para análisis de lípido. ABe-1 dependiente de dosis redujo de manera significativa el peso corporal. A 3 mg/kg, ABe-1 ocasionó mayor pérdida de peso que los agentes individuales por si solos en la misma dosis. ABe-1 inhibió la ingesta alimenticia, hasta la cantidad de Ab[EX4]2 a 3 mg/kg, indicando el efecto GLP-1 de ABe-1. Sin embargo, la cantidad de inhibición de la ingesta alimenticia no podría explicar la enorme pérdida de peso ocasionada por ABe-1, sugiriendo que la pérdida de peso ABe- -inducida debe ser ocasionada por la combinación de ambos brazos FGF21 y GLP-1. Todos los grupos de tratamiento ABC redujeron de manera significativa los niveles de glucosa en sangre en ayunas y mejoraron la tolerancia de glucosa 3 días después de la 3ra dosis semanal, y redujo también de modo importante los contenidos de triglicéridos en hígado 6 días después de la 3ra dosis semanal De forma similar, como se observe en los ratones db/db, el tratamiento ABC-1 una vez por semana resultó en reducción significativa de los niveles de colesterol en suero en ratones DIO, en tanto que ninguno de los agentes individuales tuvo demasiado efecto.
Cuadro 51 Cambio de Peso Corporal, ingesta alimenticia acumulativa, glucosa en sangre basal y AUC de glucosa durante OGTT en el día 17, y colesterol en suero y niveles de triglicérido en hígado en el día 20, después de la tercera inyección SC semanal de los compuestos en ratones DIO. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs vehículo mediante ANOVA unidireccional con post-pruebas de Dunnett. Valores SEM proporcionados en paréntesis.
Duración del efecto. Para determinar la duración del efecto de ABC-1 in vivo, se condujo un estudio de eficacia de dosis única en ratones DIO. Se administraron 3 mg/kg de ABC-1 por vía SC en el día O, se midió diariamente el peso corporal, y se condujo OGTT en el día 13. ABC-1 demostró eficacia sostenida para ocasionar y mantener la pérdida de peso y mejorar la tolerancia de glucosa hasta 13 días después de una dosis única de ratones DIO.
Cuadro 52 Cambio de peso corporal hasta día 13 después de una inyección SC única de 3 mg/kg ABC-1 en ratones DIO. ***p<0.001 vs vehículo mediante prueba-t no apareada. Valores SEM proporcionados en paréntesis.
Cuadro 53 AUC de Glucosa durante OGTT 13 días después de una inyección SC única de 3 mg/kg de ABC-1 en ratones DIO. **p<0.01 vs vehículo mediante ANOVA unidireccional con postpruebas de Dunnett.
Para determinar la duración del efecto de ABC-1 en comparación con Ab[FGF21]2 y Ab[Ex4]2 solos, y la combinación física de los dos in vivo, se condujo un estudio de eficacia de dosis única en ratones DIO. Todos los compuestos fueron administrados SC en el día 0, se midió el peso corporal dos veces por semana, y se condujo OGTT en el día 7, 13, y 21. Los resultados se muestran en el Cuadro 54. ABC-1 demostró eficacia sostenida para ocasionar y mantener la pérdida de peso y mejorar la tolerancia de glucosa hasta 21 días después de una dosis única en ratones DIO. ABC-1-indujo pérdida de peso en mayor medida que los agentes individuales por sí solos, y comparable con la combinación de Ab[FGF21]2 y Ab[Ex4]2 juntos. Sin embargo, la AUC de glucosa durante OGTT en el grupo de combinación regresaron a los niveles del grupo tratado con vehículo, en tanto que aquellos del grupo tratado con ABC-1 se redujeron de manera aún más significativa que el grupo tratado con vehículo. Estos datos indican la eficacia superior y sostenida de ABC-1 en comparación con los agentes individuales por sí solos, así como la combinación física de los dos. La eficacia sostenida de ABC-1 in vivo soporta la dosificación una vez por semana del compuesto.
Cuadro 54 Cambio de peso corporal, y AUC de Glucosa durante OGTT, en el día 7, 13, y 21 después de una inyección SC única de los compuestos en ratones DIO. # no disponible debido a terminación del grupo. *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 vs vehículo mediante ANOVA unidireccional con post-pruebas de Dunnett. Valores SEM proporcionados en paréntesis.
Eficacia de dosis sub-crónica. Se evaluó también la eficacia de dosis sub-crónica de ABC-1 en comparación con la combinación física de Ab[FGF21]2 y Ab[Ex4]2 en ratones DIO (Cuadro 55). Todos los compuestos fueron administrados por vía SC una vez a la semana. Se midió el peso corporal dos veces por semana, y se condujo OGTT 3 días después de la 3ra dosis semanal. ABC-1 redujo de manera significativa la pérdida de peso y mejoró la tolerancia de glucosa hasta el grado similar que los grupos de combinación de la misma cantidad total de dosis o dosis similares igualadas con la potencia in vitro.
Cuadro 55 Cambio de peso corporal y AUC de Glucosa durante OGTT en el día 17, y los niveles de colesterol en suero en el día 18, después de la tres inyecciones SC semanales de compuestos en ratones DIO. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs vehículo mediante ANOVA unidireccional con post-pruebas de Dunnett. valores SEM proporcionados en paréntesis.
Se observaron reducciones de mayor magnitud en la ganancia de peso corporal inducidas por el tratamiento con ABC-1 en ausencia de mayores reducciones en la ingesta alimenticia que aquellas inducías por los agentes individuales Ab[FGF21]2 o Ab[Ex4]2 (véanse los Cuadros 51 y 55). Se llevaron a cabo estudios de calorimetría indirecta en ratones DIO para determinar si la perdida de peso adicional inducida por ABC-1 en comparación con los agentes individuales se debido a un incremento en el gasto de energía. Los compuestos fueron inyectados por vía SC en el día O y día 7, y se evaluaron los parámetros de manera continua durante 48 horas iniciando inmediatamente después de la segunda dosis. Ab[Ex4]2 (1 mg/kg) no alteró el consumo de 02, la producción de C02, la producción de calor, ni el coeficiente respiratorio. Ab[FGF21]2 (10 mg/kg) incrementó el consumo de 02, la producción de C02, y la producción de calor, aunque no afecto el coeficiente respiratorio. De manera inesperada, los efectos de ABC-1 (10 mg/kg) sobre el consumo de 02, la producción de C02 y la producción de calor fueron comparables con y no mayores que aquellas de Ab[FGF21]2 (10 mg/kg). Por lo tanto la incrementada pérdida de peso corporal inducida por ABC-1 no puede ser explicada por el incrementado gasto de energía mayor a aquel del efecto de los agentes individuales.
Ejemplo 65 Análisis de matriz génica Los análisis de matriz génica se realizaron para supervisor un mayor número de candidatos en el hígado y el tejido adiposo blanco para esclarecer el mecanismo de la incrementada pérdida de peso ocasionada por ABC-1. Los ratones DIO recibieron dosis una vez por semana durante tres semanas de ABC-1 (10 mg/kg), Ab[FGF21]2 (10 mg/kg), o Ab[Ex4]2 (3 mg/kg), y se identificaron genes regulados de manera diferencial por el tratamiento ABC-1 aunque no por Ab[FGF21]2 o Ab[Ex4]2. De los > 45000 genes evaluados por matriz, los análisis qPCR subsecuentes confirmaron la regulación ascendente y descendente de un subconjunto de genes en el hígado de ratones tratados con ABC-1 aunque no en ratones tratados con Ab[FGF21]2 o Ab[Ex4]2 (Cuadro 56). Algunos de los genes identificados fueron particularmente inesperados y sugieren mecanismos de acción novedosos para el terapéutico ABC-1 no anticipados por ninguno de Ab[FGF21]2 o Ab[Ex4]2 por ejemplo Acot3, Saa1/2). Estos genes también pueden ser marcadores farmacodinámicos predictivos útiles.
Cuadro 56 Cambios de expresión de gen en día 20, después de tres inyecciones SC semanales de compuestos en ratones DIO.
En consecuencia, en ciertos aspectos, la invención proporciona un método para evaluar o determinar la adecuación de un paciente para un tratamiento para un padecimiento metabólico, que comprende medir los niveles de expresión de gen de uno o más genes seleccionados a partir del grupo que consta de Abcd2, Acot3, Cidea, Cyp2b9, Cyp4a14, Fmo2, Gstm5, Hmgcrk, Klb, Lepr, Saa1/2, Scd1, y Srebf2, y comparar el nivel de expresión de gen con el nivel de expresión de gen respectivo después de un período inicial de tratamiento. En ciertos aspectos, los genes son seleccionados a partir del grupo que consta de Acot3 y Saa1/2. Las mediciones de expresión de gen pueden ser in vítro. Las mediciones de expresión de gen pueden ser extracorporales.
En ciertos aspectos, la invención proporciona un método para determinar los niveles de expresión relativa de un gen seleccionado a partir del grupo que consta de Abcd2, Acot3, Cidea, Cyp2b9, Cyp4a14, Fmo2, Gstm5, Hmgcrk, Klb, Lepr, Saa1/2, Scd1, y Srebf2 que comprende medir los niveles de expresión de gen antes y después del tratamiento con un compuesto de la invención, o uno o ambos de un agonista de receptor FGF21 y/o un agonista de receptor GLP1. Esa determinación puede ser utilizada después en la recomendación del curso clínico de acción.
En ciertos aspectos, los métodos comprenden medir la expresión de dichos genes en el hígado. En ciertos aspectos, el método se refiere a determinar la probabilidad de que un paciente pierda peso como resultado de tratamiento con un compuesto de la invención; dicho método se apoya en un incremento de la expresión de Acot3 y/o una reducción en la expresión de Saa1/2 para sugerir que es más probable que el paciente experimente pérdida de peso como un resultado del tratamiento con un compuesto de la invención o un agonista de receptor FGF21 y/o un agonista de receptor GLP1.
Ejemplo 66 Estabilidad de h38C2-[NO ID SEC: 7-L1]2 & h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]2 Se prepararon varias formulaciones de h38C2-[NO ID SEC: 7-L1]2 (Ab-[FGF21 ??-? 125C-L1 ]2) y h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]2 (Ab- [FGF21 AH-A129C-L1]2) y fueron sometidas a un rango de condiciones de esfuerzo (los detalles completos se encuentran en US2011/13289533, US6 /579 ,609 , y PCTI I B2011 /054874, los contenidos de cada uno de los cuales, en particular los Ejemplos 72-76 están incorporados en la presente). La comparación de los datos de varias pruebas de estabilidad, tales como un ensayo de apariencia, cromatografía de exclusión molecular (SEC), electroforesis capilar procesada gráficamente (iCE), y u Itracentrif ugado analítico, el perfil de estabilidad general de Ab-[L1-FGF21 ??-?129C]2 pareció ser superior a Ab-[L1-FGF21 AH-H125C]2. Es evidente también que la reducción del pH de la formulación (por ejemplo acetato, pH 4) proporcionó mejor estabilidad en comparación con el pH más elevado (por ejemplo pH 6-8).
Ejemplo 67 Formulaciones de [FGF21 -L1]i-[Ab]-[L1 -EX4]! y Ab-[L1-FGF21AH-A129C]2 Aunque se pueden utilizar formulaciones líquidas con los compuestos de la invención, las formulaciones liofilzadas pueden proporcionar mayor longevidad de estabilidad (véanse los Ejemplos 72-76 de US2011/13289533, US61 /579.609, y PCT/182011 /054874 , los contenidos de cada uno de los cuales están incorporados en la presente). En consecuencia, en ciertos aspectos la invención proporciona una formulación que comprende entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 200 mg/ml de ABC o Ab-[L1 -FGF2 ??-A129C]2 y entre aproximadamente 1 y 150 mM ácido láctico o acetato de sodio, pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5.5; y por lo menos uno de los siguientes: (i) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 150 mg/ml de crioprotector; (ii) entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 1.0 mg/ml de quelante; (iii) entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 10 mg/ml de anti-oxidante; (iv) entre aproximadamente 0.02-2.0 mg/ml de agente tensioactivo.
En ciertos aspectos, las formulaciones de la invención comprenden dos o más de (i) a (iv). En ciertos aspectos las formulaciones de la invención comprenden tres o más de (i) hasta (iv). En ciertos aspectos, las formulaciones de la invención comprenden (i), (ii), (iii), y (iv).
En ciertos aspectos la invención proporciona una formulación liofilizada que comprende: (i) entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 200 mg/ml de un ABC; (ii) entre aproximadamente 1 y 150 mM de ácido láctico pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5.5; y (iii) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 150 mg/ml de crioprotector; (iv) entre aproximadamente 0.02-2.0 mg/ml de agente tensioactivo.
En ciertos aspectos, la formulación liofilizada puede comprender además entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 1.0 mg/ml de quelante. El quelante puede ser EDTA o DTPA, y puede estar presente en una cantidad de entre aproximadamente 0.02 hasta aproximadamente 0.5 mg/ml. El quelante puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.05 mg/ml.
En ciertos aspectos, la formulación liofilizada puede comprender además entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 10 mg/ml de anti-oxidante. En ciertos aspectos, el antioxidante puede ser L-metionina. El antioxidante puede estar presente en una cantidad de entre aproximadamente 0.02 y aproximadamente 5 mg/ml. El antioxidante puede estar presente en una cantidad de entre aproximadamente 0.05 y aproximadamente 0.2 mg/ml. El antioxidante puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 mg/ml.
En ciertos aspectos, el ABC es un compuesto de la invención como se describe en la presente. En ciertos aspectos, el ABC es la especie específica [NO ID SEC: 56-L 1 ] 1 -h38C2-[NO ID SEC: 10-L1]i . En ciertos aspectos, el ABC está presente en una cantidad de entre aproximadamente 5mg/ml y aproximadamente 200 mg/ml. En ciertos aspectos, el ABC está presente en una cantidad de entre aproximadamente 5mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml. En ciertos aspectos, el ABC está presente en una cantidad de entre aproximadamente 5mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml. En ciertos aspectos, el ABC está presente en una cantidad de aproximadamente 10 mg/ml.
En ciertos aspectos, el ácido láctico está presente en una cantidad de entre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mM. En ciertos aspectos, el ácido láctico está presente está presente en una cantidad de entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50mM. En ciertos aspectos, el ácido láctico está presente en una cantidad de aproximadamente 30 mM. El pH puede estar entre aproximadamente 4.3 y aproximadamente 5.3. El pH puede estar entre aproximadamente 4.8± 0.5. El pH puede ser de aproximadamente 4.8.
En ciertos aspectos, el crioprotector es seleccionado a partir del grupo que consta de dihidrato de trehalosa, sacarosa, y manitol. El crioprotector puede ser dihidrato de trehalosa. El crioprotector puede estar presente en una cantidad de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 120 mg/ml. El crioprotector puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 90 mg/ml.
En ciertos aspectos, el agente tensioactivo puede ser seleccionado a partir del grupo que consta de polisorbato 80, polisorbato 20 y poloxámero. El agente tensioactivo puede ser polisorbato 20. En ciertos aspectos, el agente tensioactivo está presente en una cantidad de aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 1.0 mg/ml. En ciertos aspectos el agente tensioactivo está presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 0.5 mg/ml. En ciertos aspectos, el agente tensioactivo está presente en una cantidad de aproximadamente 0.2 mg/m I .
En ciertos aspectos, la invención comprende una formulación adecuada para liofilización que comprende lo siguientes: (i) aproximadamente 10 mg/mL ABC; (ii) aproximadamente 30 mM ácido láctico, pH 4.8 ± 0.5; (iii) aproximadamente 90 mg/mL de dihidrato de trehalosa; (iv) aproximadamente 0.05 mg/mL de dihidrato EDTA disódico; (v) aproximadamente 0.1 mg/mL de L-metionina; y (vi) aproximadamente 0.2 mg/ml de polisorbato 20.
Lo anterior (todos los Ejemplos 66 y 67) se refiere también a formulaciones que comprenden Ab-[L 1 -FGF21 ? H-A129C]2. En consecuencia, en ciertos aspectos la invención proporciona una formulación liofilizada que comprende: (i) entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 200 mg/ml de Ab-[L1-FGF21 AH-A129C]2; (ii) entre aproximadamente 1 y 150 mM ácido láctico pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5.5; y (iii) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 150 mg/ml de crioprotector; (iv) entre aproximadamente 0.02-2.0 mg/ml de agente tensioactivo.
La invención proporciona también formulaciones liofilizadas que son liofilizadas después de la pre-dilución de la formulación de partida por medio de una cantidad deseada (por ejemplo 2x, 3x) para obtener propiedades más deseables del polvo o torta liofilizada (por ejemplo esponjosidad, porosidad) resultando en superior tiempo de reconstitución (es decir toma menos tiempo para la reconstitución) y método de preparación de dosis amigable con el paciente. La invención proporciona también formulaciones liofilizadas que pueden ser reconstituidas a una mayor o menos concentración de los ingredientes (por ejemplo 0.33x, 0.5x, 1x, 2x, 3x, 4x), en comparación con la composición de formulaciones líquidas pre-liofilizadas ( p re- 1 i o ) , mediante la adición de menor o mayor volumen de diluyente (por ejemplo 3x, 2x, 1x, 0.5x, 0.33x, 0.25x), respectivamente. Los ejemplos de diluyentes son agua, solución salina, solución salina regulada con fosfato, solución de dextrosa (por ejemplo 5%), o una solución acuosa que contiene un agente farmacéutico, enzima, agente tensioactivo, azúcar, etcétera.
En ciertos aspectos, la invención comprende la siguiente formulación: (i) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 60 mg/mL Ab-[L1-FGF21 AH-A129C]2; (ii) entre aproximadamente 5 y aproximadamente 30 mM ácido láctico, pH 4.8 ± 0.5; (iii) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 90 mg/mL de dihidrato de trehalosa; (iv) entre aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 0.1 mg/mL de dihidrato de EDTA disódico; (v) entre aproximadamente 0.01 hasta 0.1 mg/mL de L- metionina; y (vi) aproximadamente 0.04 hasta aproximadamente 0.2 mg/mL de polisorbato 20.
En ciertos aspectos, la invención comprende la siguiente formulación: (í) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20 mg/mL de Ab-[L1-FGF21 AH-A129C]2; (¡i) aproximadamente 10 mM ácido láctico, pH 4.8 ± 0.5; (¡ii) aproximadamente 30 mg/mL dihidrato de trehalosa; (¡v) aproximadamente 0.017 mg/mL dihidrato EDTA disódico; (v) aproximadamente 0.033 mg/mL L-metionina; y (vi) aproximadamente 0.067 mg/mL de polisorbato 20 En ciertos aspectos, la invención comprende la siguiente formulación: (i) entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 mg/mL Ab-[L1-FGF21AH-A129C]2; (i) aproximadamente 15 mM ácido láctico, pH 4.8 ± 0.5; (ii) aproximadamente 45 mg/mL de dihidrato de trehalosa; (iii) aproximadamente 0.025 mg/mL de dihidrato EDTA disódico; (iv) aproximadamente 0.05 mg/mL de L-metionina; y (v) aproximadamente 0.1 mg/mL de polisorbato 20.
En ciertos aspectos, la invención comprende la siguiente formulación: (i) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 mg/mL de Ab-[L1-FGF21 AH-A129C]2; (ü) aproximadamente 30 mM ácido láctico, pH 4.8 ± 0.5; (iii) aproximadamente 90 mg/mL de dihidrato de trehalosa; (iv) aproximadamente 0.05 mg/mL de dihidrato EDTA disódico; (v) aproximadamente 0.1 mg/mL de L-metionina; y (vi) aproximadamente 0.2 mg/ml de polisorbato 20.
En ciertos aspectos, la invención comprende la siguiente formulación: (i) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 mg/mL de Ab-[L1-FGF21 AH-A129C]2; (ii) aproximadamente 15 mM ácido láctico, pH 4.8 ± 0.5; (iii) aproximadamente 45 mg/mL de dihidrato de trehalosa; (iv) aproximadamente 0.025 mg/mL de dihidrato EDTA disódico; (v) aproximadamente 0.05 mg/mL de L-metionina; y (vi) aproximadamente 0.1 mg/ml de polisorbato 20.
En ciertos aspectos, la invención comprende la siguiente formulación: (i) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 60 mg/mL de Ab-[L1-FGF21 AH-A129C]2; (ii) aproximadamente 30 mM ácido láctico, pH 4.8 ± 0.5; (iii) aproximadamente 90 mg/mL de dihidrato de trehalosa; (iv) aproximadamente 0.05 mg/mL de dihidrato EDTA disódico; (v) aproximadamente 0.1 mg/mL de L-metionina; y (vi) aproximadamente 0.2 mg/ml de polisorbato 20.
En ciertos aspectos, la invención comprende la siguiente formulación: (i) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 mg/mL de Ab-[L1-FGF21 AH-A129C]2; (ii) aproximadamente 30 hasta 60 m ácido láctico, pH 4.8 ± 0.5; (Mi) aproximadamente 90 hasta 180 mg/mL de dihidrato de trehalosa; (iv) aproximadamente 0.05 hasta 0.1 mg/mL de dihidrato EDTA disódico; (v) aproximadamente 0.1 hasta 0.2 mg/mL de L-metionina; y (vi) aproximadamente 0.2 hasta 0.4 mg/ml de polisorbato 20.
En ciertos aspectos, la invención comprende la siguiente formulación: (i) entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 25 mg/mL de Ab-[L1-FGF21 AH-A129C]2; (ii) aproximadamente 30 mM ácido láctico, pH 4.8 ± 0.5; (iii) aproximadamente 90 mg/mL de dihidrato de trehalosa; (iv) aproximadamente 0.05 de dihidrato EDTA disódico; (v) aproximadamente 0.1 mg/mL de L-metionina; y (vi) aproximadamente 0.2 mg/ml de polisorbato 20.
En ciertos aspectos, la invención comprende la siguiente formulación: (i) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 mg/mL de Ab-[L1-FGF21 AH-A129C]2; (ii) aproximadamente 30 ácido láctico, pH 4.8 ± 0.5; (iii) aproximadamente 90 mg/mL de dihidrato de trehalosa; (iv) aproximadamente 0.05 mg/mL de dihidrato EDTA disódico; (v) aproximadamente 0.1 mg/mL de L-metionina; y (vi) aproximadamente 0.2 mg/ml de polisorbato 20.
En ciertos aspectos, la invención comprende la siguiente formulación: (i) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25 mg/mL de Ab-[L1-FGF21 AH-A129C]2; (ii) apro imadamente 15 mM ácido láctico, pH 4.8 ± 0.5; (iii) aproximadamente 45 180 mg/mL de dihidrato de trehalosa; (iv) aproximadamente 0.025 0.1 mg/mL de dihidrato EDTA disódico; (v) aproximadamente 0.05 mg/mL de L-metionina; y (vi) aproximadamente 0.1 mg/ml de polisorbato 20.
Cada una de las formulaciones anteriores puede comprender también elementos adicionales como se describe en la presente. Además, cada una de las formulaciones anteriores puede ser adecuada también para liofilización subsecuente y reconstitución a un menor volumen. En ciertos aspectos, las formulaciones pueden ser concentradas entre aproximadamente 2x y aproximadamente 3x.
Ejemplo 68 Estabilidad de [FGF21]-[1er Ligador]-[Anticuerpo]-[2nd_Ligador]-[Ex4] Se prepararon varias formulaciones de [FGF21]-[1er ligador]-[Anticuerpo]-[2nd_Ligador]-[Ex4] mediante intercambio de solución reguladora utilizando casetes de diálisis de recorte de peso molecular 10 kDa, y luego filtradas de manera estéril (todos los experimentos utilizaron ABC-1). Las formulaciones fueron sometidas a un rango de condiciones de esfuerzo (véase Cuadro 57). Las muestras fueron analizadas después utilizando ensayo de Apariencia, UV (absorbancia ultravioleta), y Cromatografía de Exclusión molecular (SEC). Las muestras fueron analizadas en varios puntos de tiempo (Cuadro 57) a fin de determinar la tendencia de estabilidad.
Ensayo de Apariencia La turbidez de incrementa durante almacenamiento a varias temperaturas. Tanto la formulación de 20mM ácido láctico como de 20mM histidina, pH5.8 (Formulaciones e y D) mostraron incrementos de turbidez después de una semana de almacenamiento a 40°C o 2 semanas a 25°C o 2 semanas a 40°C. Estos datos sugieren que las formulaciones D y E conducen a inestabilidad de las formulaciones de [FGF21]-[1er Mgador]-[Anticuerpo]-[2nd_Ligador]-[Ex4]. Cuando son sometidos a condiciones de esfuerzo, tanto el acetato de sodio pH4.0 como el ácido glutámico pH4.0 no mostraron incremento de turbidez a pesar de la condición de almacenamiento.
No se observó cambio significativo en UV con el paso del tiempo lo que indica que incluso si se observó formación de partículas en ciertas formulaciones listadas en el Cuadro 57, la concentración neta de proteína no fue afectada de manera importante con el paso del tiempo.
Formación de especies de alto peso molecular (HMW) Se utilizó SE-HPLC para medir la formación de HMW para varias formulaciones listadas en el Cuadro 57. SE-HPLC es capaz de separar de manera confiable HMW, y es un importante ensayo indicador de estabilidad para [FGF21]-[1er ligador]-[Anticuerpo]-[2nd_Ligador]-[Ex4]. HMW en el ensayo SE-HPLC está definido como las especies que se eluyen antes del pico de [FGF21]-[1er ligador]-[Anticuerpo]-[2nd_Ligador]-[Ex4]. Las Formulaciones en 20mM histidina, pH5.8 y 20mM fosfato, pH8.0 mostraron una alta, asi como dependiente de tiempo, formación inicial de HMW.
Se conoce en la literatura la tendencia de agregación no lineal de las formulaciones de proteína con el paso del tiempo. Las formulaciones en 20mM acetato de sodio, pH4.0 y 20mM ácido glutámico pH4.0 mostraron la menor cantidad de HMW cuando se comparó con otras formulaciones. Por lo tanto, las formulaciones en 20mM acetato de sodio, pH4.0 y ácido glutámico, pH4.0 proporcionan estabilidad superior para la formación de HMW.
% HMW (especies de alto peso molecular) medido a través de SE-HPLC. Las condiciones SE-HPLC incluyen: Toso Biosep G3000SWXL 5µ??, columna 7.8 x 300mm SEC, Fase Móvil: 200mM Fosfato de sodio 100mM solución reguladora de Cloruro de Sodio (pH7.0), Temperatura de columna: 25°C, Velocidad de Flujo: 0.3ml/min (Isocrática) , Detección: absorbancia UV a 214 nm, Tiempo de Operación: 42 minutos.
Ejemplo 69 Análisis pH-Solución Reguladora de [FGF21]-[1 Ligado r]- [A nticuerpo]-[2do-Li gado r]-[Ex4] La estabilidad de [FGF21]-[1er I igador]-[Anticuerpo]-[2nd- Ligador]-[Ex4] en varias soluciones reguladoras acuosas fue investigada con el objetivo de encontrar un medios de estabilización adecuado que también puede ser liofilizado (todos los experimentos utilizaron ABC-1). El Ejemplo 68 demostró el resultado sorpresivo de que los compuestos de la invención fueron más adecuados en acetato de sodio y ácido glutámico a pH 4.0. Sin embargo, el acetato de sodio se sublime y, en consecuencia, es difícil de incorporar dentro de una solución reguladora liofilizada. Existe por lo tanto la necesidad de desarrollar una solución regulador para los compuestos de la invención que proporciona óptima estabilidad a largo plazo en una formulación liofilizada. La inestabilidad del Ligador, así como cualquier recorte hidrolítico de los componentes de proteína da como resultado la generación de especies de bajo peso molecular (LMW). De modo adicional, las especies de alto peso molecular se pueden formar si los conjugados se agregan en la formulación probada. Las formulaciones fueron preparadas mediante intercambio de solución reguladora en de la formulación deseada con una concentración de proteína de objetivo en el rango de 7-9mg/ml. Las formulaciones fueron filtradas utilizando filtro 0.21 µ?t?, empacadas en envases de vidrio y almacenadas a la temperatura deseada. Se analizaron muestras en puntos de tiempo indicados.
Ensavo de Apariencia La turbidez se incrementa en el almacenamiento a varias temperaturas y condiciones: Tanto la formulación de 20m ácido cítrico (todos los pHs) como la de 20mM ácido succínico (>pH4.8) (Formulaciones A-C, K y L) mostraron incrementos de turbidez ya sea después del almacenamiento durante dos semanas a 25°C o 2 semanas a 30°C. Cuando fueron sometidas a condiciones de esfuerzo, tanto las muestras de ácido glutámico como las de ácido láctico mostraron mínimo incremento de turbidez sin importar la condición de almacenamiento.
Con excepción de las muestras de ácido cítrico, no se observe cambio significativo en UV con el paso del tiempo lo que indica que incluso si se observó formación de partículas en ciertas formulaciones listadas en el Cuadro 57, la concentración neta de la proteína no fue significativamente afectada con el paso del tiempo.
Medición HMW a través de SE-HPLC y monitoreo LMW mediante SDS-PAGE El efecto pronunciado de la solución reguladora y el pH fue observado ante el esfuerzo de temperatura durante 2 semanas. Los datos se presentan en el Cuadro 59. En el punto de tiempo inicial, se observó una tendencia de incremento de HM en las formulaciones de ácido cítrico y formulaciones de mayor pH (>4.8).
Las formulaciones de ácido glutámico, pH 4.2 y 4.5 mostraron rendimiento relativamente superior para % HMW.
La tendencia LMW fue directamente proporcional al pH. En el almacenamiento a 30°C durante 1 semana, las formulaciones de menor pH mostraron incremento pronunciado en % LMW presumiblemente debido a la fragmentación. Entre las formulaciones de ácido glutámico, es necesario un equilibrio de pH de las formulaciones a fin de evitar la fragmentación excesiva debida a la inestabilidad del ligador y el recorte de proteína. Por ejemplo, la formulación D, pH 4.2, en estado líquido, produce fragmentación sustancial en comparación a otras formulaciones de ácido glutámico. La tendencia de %LMW pH-dependiente sugiere que una formulación de pH4.5 es adecuada (confirmado por SOS PAGE, datos no mostrados) .
ID Formulación %HMW %H W después %HMW % HMW al inicio de 1 semana a después de 2 después de 2 30°C semanas a semanas a 30°C 25°C A 20mM ácido cítrico pH 4.2 34 4.8 4.7 4.8 B 20mM ácido cítrico pH 4.5 3.5 5.5 5.4 5.6 e 20mM ácido cítrico pH 4.8 3.2 52 5.2 5.6 D 20mM ácido glutámico, pH 4.2 2.5 2.2 2.2 2.0 E 20m ácido glutámico, pH 4.5 2.6 2.4 2.3 2.3 F 20mM ácido glutámico, pH 4.8 2.7 2.7 2.6 2.7 G 20mM ácido láctico, pH 4.2 2.6 3.1 2.6 2.8 H 20mM ácido láctico, pH 4.5 2.6 30 2.5 2.6 1 20mM ácido succínico, pH 4.2 2.6 2.6 2.3 2.6 J 20mM ácido succínico, pH 45 2.7 3.1 2.8 3.2 K 20mM ácido succínico, pH 4.8 2.9 3.6 3.3 3.9 L 20mM ácido succínico, pH 5.3 3.1 4.0 3.8 4.4 Cuadro 59 Datos SEC de formulaciones de [FGF21 ]-[1 er-Ligador]-[Anticuerpo]-[2do-Ligador]-[Ex4] Adicionalmente, la formulación de ácido glutámico pH 4.5 fue usada también para evaluar si los conjugados son solubles en solventes de solución reguladora acuosa a elevada concentración y para evaluar la estabilidad a elevada concentración. Se observó un incremento relacionado de concentración (A280) en %HMW durante el almacenamiento. Los resultados se muestran en el Cuadro 60.
Cuadro 60 Datos de alta concentración de [FGF21 ]-[1 er-Ligador]-[Anticuerpo]-[2do-Ligador]-[Ex4] Ejemplo 70 Formulaciones Liofilizadas de [FGF21]-[1er Ligador]-[Anticuerpo]-[2do-Ligador]-[Ex4] Aunque se pueden usar formulaciones líquidas con los compuestos de la invención, las formulaciones liofilizadas pueden proporcionar mayor longevidad de la estabilidad. Los Ejemplos 68 y 69 muestran esas formulaciones de [FGF21]-[1er ligador]-[Anticuerpo]-[2nd-Ligador]-[Ex4] sólo con ácido glutámico, aunque superior a otras soluciones reguladoras tales como histidina, puede no proporcionar la estabilidad adecuada para el uso a mayor plazo deseado (todos los experimentos utilizaron ABC-1). La combinación de ácido glutámico con varios tipos de estabilizadores tales como un azúcar o poliol que sirve como crioprotector y lioprotector (por ejemplo trehalosa, sacarosa, manitol), y un agente tensioactivo para estabilidad de agitación (por ejemplo polisorbato 80, polisorbato 20, poloxámero), y un quelante (por ejemplo, EDTA, DTPA) proporciona mejoramiento sinergístico de estabilidad. Por lo tanto, las combinaciones mejoran claramente la estabilidad de [FGF21]-[1er ligado r]- [A nticuerpo]-[2nd-Ligador]-[Ex4].
Las Formulaciones fueron preparadas mediante intercambio de solución reguladora y adición de excipiente con una concentración de proteína de objetivo que varió entre las formulaciones (todos los experimentos usaron ABC-1). Las formulaciones preparadas fueron filtradas utilizando filtro 0.2 pm, y empezadas en envases de vidrio. Para preparar las formulaciones liof ilizadas, los envases fueron liofilizados, tapados y reforzados. En los puntos de tiempo indicados, se probaron muestras a través de varios métodos analíticos que incluyen SEC, ¡CE, y cGE reducido. De modo adicional, las formulaciones líquidas también fueron evaluadas durante 4 semanas para evaluar la tendencia de estabilidad de las formulaciones líquidas. Se probó el contenido de agua de las formulaciones liofilizadas después de la liofilización, y todas estuvieron por debajo del 0.5%.
Las formulaciones liofilizadas fueron almacenadas bajo varias condiciones de esfuerzo de temperatura, y el Cuadro 61 muestra datos SEC, ¡CE, y CGE reducido (electroforesis de gel capil) en puntos de tiempo indicados. cGE produce estimación semi-cuantitativa de fragmentos de proteína. Las formulaciones liofilizadas mostraron mejor estabilidad cuando se compararon con sus contrapartes liquidas en todos los frentes ( ? % H W , L1% especies ácidas y A%Frag). Las formulaciones liofilizadas de ácido glutámico en presencia de agentes de estabilización (en presencia de a crioprotector/lioprotector) mostraron buena estabilidad. Por lo tanto, se concluye que las formulaciones de ácido glutámico liofilizadas son apropiadas para prueba de estabilidad en almacenamiento a largo plazo. Finalmente, se espera que los quelantes metálicos (por ejemplo EDTA, DTPA) sean benéficos para lograr la estabilidad.
Las muestras de formulación Lio también fueron probadas para bioactividad relativa. La bioactividad fue medida y expresada como % relativo para un material de referencia utilizando tanto un ELISA de Enlace no competitivo (FGF21) y el ensayo de potencia GLP-1 Exendin (Ex4 péptido). Los datos de bioactividad son preparados en el Cuadro 62. Estos datos proporcionan un grado de confianza adicional en la estabilidad y la integridad funcional suministradas por los componentes de formulación Lio.
Ejemplo 71 Estabilidad de [FGF21]-[1er Ligador]-[Anticuerpo]-[2do-Ligador]-[Ex4] contra agitación Se preparó la formulación ácido glutám¡co/trehalosa/EDTA/PS80 mediante intercambio de solución reguladora y adición de excipiente con una concentración de proteína de objetivo en el rango de 15mg/ml. Las formulaciones preparadas fueron filtradas usando un filtro 0.21 pm, empacadas en envases de vidrio. Se aplicó agitación utilizando un agitador orbital a una velocidad de 300 rpm. En puntos de tiempo indicados, se probaron las muestras. Los resultados en el Cuadro 63 demuestran que la presencia de poiisorbato 80 ayuda a evitar la inestabilidad inducida por agitación (todos los experimentos usaron ABC-1).
Cuadro 63 Datos de estabilidad de formulaciones contra esfuerzo de agitación En consecuencia, en ciertos aspectos la invención proporciona la formulación que comprende entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 200mg/ml de [FGF21]-[1er ligador]-[Anticuerpo]-[2nd-Ligador]-[Ex4] y entre aproximadamente 1 y 150m ácido glutámico, pH entre aproximadamente 4.0 y aproximadamente 5.0; y por lo menos uno de los siguientes: (i) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 150mg/ml de crioprotector; (¡i) entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 1.0 mg/ml de quelante; (iii) entre aproximadamente 0.02-2.0mg/mL de agente tensioactivo.
En ciertos aspectos, las formulaciones de la invención comprenden uno o más de (i) a (iv). En ciertos aspectos las formulaciones de la invención comprenden dos o más de (i) a (iv). En ciertos aspectos, las formulaciones de la invención comprenden (i), (ii), y (iii).
En ciertos aspectos la invención proporciona una formulación liofilizada que comprende: (i) entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 200mg/ml de FGF21-conjugado (ii) entre aproximadamente 1 y 150mM ácido glutámico pH entre aproximadamente 4.0 y aproximadamente 5.0; y (iii) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 150mg/ml de crioprotector; (iv) entre aproximadamente 0.02-2.0mg/ml_ de agente tensioactivo En ciertos aspectos, la formulación liofilizada puede comprender además entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 1.0mg/ml quelante. El quelante puede ser EDTA o DTPA, y puede estar presente en una cantidad de entre aproximadamente 0.02 hasta aproximadamente 0.5mg/ml. El quelante puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.05mg/ml.
En ciertos aspectos, el [FGF21]-[1er ligador]-[Anticuerpo]-[2nd-Ligador]-[Ex4] es un compuesto de la invención como se describe aquí. En ciertos aspectos, el FGF21 -Ex4-conjugado es [FGF21]-[1er ligador]-[Anticuerpo]-[2nd_Ligador]-[Ex4]. En ciertos aspectos, el FGF21-Ex4- conjugado está presente en una cantidad de entre aproximadamente 5mg/ml y aproximadamente 200mg/ml. En ciertos aspectos, el FGF21 -Ex4-conjugado está presente en una cantidad de entre aproximadamente 5mg/ml y aproximadamente 90mg/ml. El FG F21 -Ex4-conj ugado está presente en una cantidad de entre aproximadamente 5mg/ml y aproximadamente 50mg/ml. El FGF21-conjugado está presente en una cantidad de aproximadamente 1 Omg/ml.
En ciertos aspectos, el ácido glutámico está presente en una cantidad de entre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100mM. En ciertos aspectos, el ácido glutámico está presente en una cantidad de entre aproximadamente 10mM y aproximadamente 50m . En ciertos aspectos, el ácido glutámico está presente en una cantidad de aproximadamente 20 mM. El pH puede estar entre aproximadamente 4.2 y aproximadamente 5.3. El pH puede ser de aproximadamente 4.5± 0.5. El pH puede ser de aproximadamente 4.5.
En ciertos aspectos, el crioprotector es seleccionado a partir del grupo que consta de dihidrato de trehalosa, sacarosa, y manitol. El crioprotector puede ser dihidrato de trehalosa. El crioprotector puede estar presente en una cantidad de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 120 mg/ml. El crioprotector puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 85 mg/ml.
En ciertos aspectos, el agente tensioactivo puede ser seleccionado a partir del grupo que consta de polisorbato 80, polisorbato 20 y poloxámero. El agente tensioactivo puede ser polisorbato 20. En ciertos aspectos, el agente tensioactivo está presente en una cantidad de aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 1.0 mg/ml. En ciertos aspectos el agente tensioactivo está presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 0.5mg/ml. En ciertos aspectos, el agente tensioactivo está presente en una cantidad de aproximadamente 0.2mg/ml.
En ciertos aspectos, la invención comprende una formulación adecuada para liofilización que comprende lo siguiente: (i) entre aproximadamente 30 y aproximadamente 60mg/mL de [IFGF21]-[1er ligador]-[Anticuerpo]-[2nd-Ligador]-[Ex4]; (ii) entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 mM ácido glutámico, pH 4.5 ± 0.5; (Mi) entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 mg/mL de dihidrato de trehalosa; (iv) entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 0.0 mg/mL de dihidrato EDTA disódico; (v) entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 0.3mg/ml de polisorbato 20.
En ciertos aspectos, la invención comprende una formulación adecuada para liofilización que comprende lo siguiente: (i) aproximadamente 30mg/mL [IFGF21 ]-[1 er Ligador]-[Anticuerpo]-[2nd_Ligador]-[Ex4]; (ii) aproximadamente 20mM ácido glutámico, pH 4.5 ± 0.5; (iii) aproximadamente 85mg/ml_ de dihidrato de trehalosa; (iv) aproximadamente 0.05mg/mL dihidrato EDTA disódico; (v) aproximadamente 0.2mg/ml_ de polisorbato 20.
En ciertos aspectos, la invención comprende una formulación adecuada para liofilización que comprende: (i) aproximadamente 30mg/ml [FGF21]-[1er Ligador]-[Anticuerpo]- [2do-Ligador]-[Ex4]; (ii) aproximadamente 20mM ácido glutámico, pH 4.5 ± 0.5; (iii) aproximadamente 8.5% dihidrato de trehaiosa; (iv) aproximadamente 0.005% dihidrato EDTA disódico; y (v) aproximadamente 0.02% polisorbato 80.
Ejemplo 72 Proceso de enriquecimiento de anticuerpo En ciertas situaciones cuando se incuba h38C2 con un péptido o proteína para conjugación, la reacción no llega a complementación, y parte del anticuerpo permanece sin reaccionar. Un ensayo HIC analítico (método descrito más adelante) para investigar los 2 picos de elución inicial separados por fenómeno (de manera común aproximadamente 0.6-1.8% de proteína, y 16.9 y 19.4% de proteína respectiva) y un pico principal (de modo común aproximadamente 75.2-79.5% de proteína, aunque se observaron variaciones de hasta 73.5%o y 83.3% de proteína). La proteína pico principal fue completamente reactiva en tanto que el pico 1 y 2 no fueron reactivos. Por lo tanto, hubo la necesidad de desarrollar un proceso mejorado para la purificación del anticuerpo h38C2.
Método HIC Esta sección describe el uso de la cromatografía HIC para evaluar el porcentaje de diferentes isoformas presentes en las muestras de anticuerpo h38C2 y de sustancia de fármaco en proceso. Se considera que estas especies son los componentes de material de partida que conjugarán cero (pico 1), uno (pico 2), o dos péptidos (pico principal) en la ubicación Lys-99 (uno para cada uno de los dos Fabs por h38C2). La separación y elución ocurren por medio de un gradiente de reducción de sal con un incremento simultáneo en el solvente orgánico (alcohol isopropflico) sobre el gradiente en este método, lo cual incrementa la afinidad de las proteínas más hidrofóbicas para la fase móvil, como en la cromatografía de fase inversa. Las áreas pico son integradas para determinar la abundancia relativa de cada isoforma.
Se desarrolló un método HIC analítico con una columna TSK Gel Phenyl-5PW, (7.5mm x 75mm, 10 pm, TOSOH) para separar el pico principal mAb no reactivo (P1.P2) y reactivo a partir del anticuerpo h38C2 I g G 1. Las fases móviles son A: 0.75M sulfato de amonio, 50mM fosfato de potasio, pH7.0 y 8:50 mM fosfato de potasio, pH 7.0, 10% IPA. La columna es operada a 0.65 ml/minuto a 35°C con la absorbancia medida a 214 nm. Se preparó una muestra de 100 pg para inyección mediante dilución de la muestra o estándar hasta 1mg/ml con diluyente (fase móvil A: agua, 50:50).
Cuadro 64 Método HIC Analítico. Las fases móviles son A: 0.75M sulfato de amonio, 50mM fosfato de potasio, pH7.0 y B: 50 mM fosfato de potasio, pH7.0, 10% IPA.
Ejemplo 73 ¡CE, Correlación de datos Met-Ox para incremento en h38C2 no reactivo Se realizó un estudio de retención a 25°C con caldo de cultivo aclarado de h38C2. Las muestras fueron congeladas en los tiempos designados. Las muestras fueron descongeladas y purificadas a través de columnas de centrifugado de Protein A y sometidas a ensayos. Hubo una correlación entre el incremento en especies acidas y oxidadas y el incremento en la forma no reactiva de mAb (Cuadro 65). Puede haber otros factores involucrados en la elaboración de h38C2 no reactivo aunque las especies ácidas y la oxidación de porciones de azufre parecen ser dos de los factores involucrados.
Cuadro 65 Resultados de Estudio de Retención de Caldo para los niveles de ¡CE, Met-Ox y Unreactive h38C2 Ejemplo 74 Selección de Columna Inicialmente, se usó una columna TSK gel Phenyl-5PW (10 µ? tamaño de partícula) para desarrollar un ensayo HIC para separar el mAb conjugable de la forma no reactiva. Una columna TSK gel Phenil-5PW (20 µ? tamaño de partícula) fue amplificada para producir h38C2 completamente reactiva. La capacidad de columna fue de 4-5 g/L y operada bajo presión elevada. Se había utilizado el método siguiente para elaborar material para estudios de conjugación. La columna fue equilibrada con 0.5 hasta 1 M NaCI en 50mM de fosfato de sodio, pH 7 y cargada a 4-5 g/L de resina. La columna no fue lavada y fue sometida a una solución reguladora de elución que comprende 50mM fosfato de sodio, 20% IPA, pH7. Se desarrolló un gradiente lineal de 42-60% de solución reguladora de elución en 50mM fosfato de sodio, pH7 sobre volúmenes de columna de 4.8 (CV), elevando después la concentración hasta 100% de la solución reguladora respectiva hasta que el material fue recolectado y la absorbancia devuelta casi a los niveles de línea de base. Aunque este método fue adecuado para los suministros a escala de laboratorio, se requirió un método de mayor rendimiento con mayor capacidad de carga. Se consideró o se probó una variedad de resinas HIC (Cuadro 66).
Cuadro 66 Resinas HIC utilizadas para prueba analítica y purificación de h38C2. NA = No disponible Para la cromatografía Phenyl 5 PW, Phenyl 600 M, Butyl 600 M , y Phenyl 650 S, la solución reguladora de equilibrio fue 20mM fosfato de sodio, 1 M NaCI, pH 7.0. la carga fue ajustada para una composición similar, que tiene el mismo pH y conductividad. Las cargas variaron desde 4-50 g/L de resina en Phenyl 600 M (5-10g/L, y 20 g/L), TSK gel Phenyl 5 PW, y Butyl 600 M. Las cargas en las columnas de Phenyl 650 S fueron 15-22g mAb/L de resina. Las columnas fueron equilibradas con 5CV de solución reguladora de equilibrio (Cuadro 67), después la columna fue cargada y lavada con 1-2 CV de solución reguladora de equilibrio, lavada después con 0-2CV de solución reguladora de base. El mAb fue eluido con un gradiente de etapa de 1-2 CV de 40-43% solución reguladora de elución que consta de 20mM fosfato de sodio, 20% IPA, pH7.0. A continuación, un gradiente lineal de 5-10CV con 40-63% de solución reguladora de elución. Finalmente la columna fue sometida a 3-6 CV de solución reguladora de elución para asegurar la elución del mAb remanente. La proteína eluida durante el curso de 3-15 CV dependió de que tan rápido se desarrollaran los gradientes. Los rendimientos fueron 0-43% para las resinas de Phenyl 5 PW, Phenyl 600 M, y Butyl 600 con el producto en concentraciones de 0.5-2mg/ mL. El equilibrio de masa comúnmente fue de ~90-100%. Los resultados para Phenyl 650 S se describen a continuación.
Cuadro 67 El método HIC usado para análisis de columna inicial. Solución Reguladora B = 20mM fosfato de sodio pH7 con 20% IPA. resina Phenyl 5 PW (20 µ?) fue probada en una columna de 4ml aunque no fue efectiva en el enriquecimiento del pico principal, mostrando sólo 90% de h38C2 reactivo. Además, Phenyl 5 PW no fue escalable ya que operó a una alta presión con el tamaño de microesfera 20 µ? y tuvo baja capacidad, ~4-5g/L de resina. Cuando la columna Butyl 600 M fue cargada a 23g/L, no proporcionó ningún enriquecimiento. La columna Phenyl 600 M cargada a 20g/L mostró buen enriquecimiento del pico principal a 91-92% aunque el rendimiento general de aproximadamente 43% fue menor que el mínimo esperado de aproximadamente 50% de rendimiento y aproximadamente 95% de pico principal. Cuando la misma columna tuvo una menor carga a 5g/L de resina, la fracción de pico tenía menos pico principal que el material de carga demostrando una relación entre la mayor carga de columna y la mayor pureza de producto. Se probó después la resina Phenyl 650 S con microesferas de 351 µ?. Las microesferas más pequeñas proporcionan más área de superficie y sitios de enlace, lo cual proporciona mejor resolución. Mediante el ajuste fino de las concentraciones de sal y la duración de las etapas de lavado, la mayor parte de la forma inactiva del anticuerpo fue eliminada en tanto que más del h38C2 completamente reactivo (FR) permaneció enlazado a la resina. Se obtuvieron rendimientos de hasta 57-58% y combinaciones de producto que contienen 92-95% de pico principal.
Ejemplo 75 Desarrollo de Etapas de Lavado de Reducción de Sal, Plato, y Solución Reguladora Se evaluaron varios parámetros durante el desarrollo de las tres etapas de lavado para aumentar al máximo el rendimiento y la pureza de producto. Durante la etapa de gradiente lineal de reducción de sal, se probaron la inclinación, duración y concentración final del lavado. Después de esto, es necesario establecer la concentración óptima y duración del lavado de plato, y la duración óptima del lavado de solución reguladora. Los resultados de las diversas operaciones experimentales importantes se muestran en el Cuadro 68, con el Cuadro 69 que compara los datos de ensayo HIC a partir de dos de estas operaciones experimentales.
Cuadro 68 Definición del Protocolo de Lavado de Reducción de Sal para Columna Phenyl 650 S.NA =- no disponible.* Este no fue un lavado de solución reguladora de base, contenía también NaCI como se listó. ** Esta operación uso 20 mM fosfato de sodio, 1, 6, hexandiol, pH 7.0, los otros fueron eluidos con 20% IPA en solución reguladora de base. reactivos/parcialmente activos. El pico principal es completamente reactivo en las reacciones de conjugación. * El estándar de referencia ha sido medido a 73.5-83.3% en el ensayo HIC en diferentes días.
La operación de Phenyl 650 S 140 (Cuadro 68) mostró una cantidad significativa de proteina tanto en la fase de lavado como de elución de la operación. En estas operaciones iniciales, se usó un 1 M a 0M gradiente lineal de NaCI sobre 10CV. El gradiente fue seguido por 2CV de solución reguladora de base de 20mM fosfato de sodio. Esta fue la primera operación que demostró el potencial para remover el componente no reactive y obtener rendimientos más aceptables de h38C2 completamente reactivo. Esto se muestra en mayor detalle en el Cuadro 69, en donde la fracción 6 (lavado) contiene 86.2 % de h38C2 no reactivo aunque sólo 10.2% de pico principal. Durante la elución con 20% IPA, 3 fracciones contenían 90% de mAb reactivo y la cantidad de mAb no reactivo se redujo hasta -10%.
La operación Phenyl 650 S 143 (Cuadro 68) usó un gradiente lineal 0.75 hasta 0M NaCI sobre 8CV. El gradiente fue seguido por un lavado de solución reguladora de base 5CV la cual tenía mucho más proteína en la fase de lavado que la operación previa, con un bajo rendimiento acompañante de 11%. En base al rendimiento sorprendentemente escaso obtenido a partir de esta operación, se postuló que la resina puede beneficiarse a partir del equilibrio de sal a fin de proporcionar enlace de proteína más fuerte. Se postuló también que se debe lograr un equilibrio entre el uso de un volumen suficiente de solución reguladora de base para remover la sal y el mAb no reactivo, en tanto que se reduce al mínimo la pérdida de producto.
Muchas de las operaciones subsecuentes utilizaron 2-3 volúmenes de solución reguladora de base en vez de 5CV. La operación Phenyl 650 S 152 usó un gradiente lineal 1 M a 0.30M NaCI sobre 7CV. El gradiente fue seguido por un lavado de plato 3CV con 0.30 M NaCI en solución reguladora de base y después un lavado de plato 3CV con 0.10M NaCI en solución reguladora de base que contenía incluso menos proteína en el lavado y un incremento concomitante en el pico de elución, dando un rendimiento de 53% (Cuadro 68). El inicio de un plato en la etapa de reducción de sal a 300mM NaCI fue un descubrimiento crítico que condujo finalmente a las mejoras requeridas. Dos fracciones de elución a partir de la operación 152 contenían 94 y 97% de pico principal (Cuadro 69) demostrando que el método funcionó para lograr el objetivo de >50% de rendimiento y >90% de pico principal en la combinación de producto Phenyl 650 S. la fracción de lavado 10 tuvo 31.5% de pico principal que demostró que un lavado de plato con más de 0.30 M NaCI podría retener posiblemente más producto en la columna.
La operación Phenyl 650 S 155 usó un gradiente lineal 1 hasta 0.35M NaCI sobre 3CV (Cuadro 68). El gradiente fue seguido por un lavado de plato 3CV con 0.35M NaCI en solución reguladora de base lo que suministró un rendimiento de 43%, menor que la operación previa. Un factor fue que se aplicó una carga doble, 45g/L a la columna. La mayor parte de la proteína salió de la columna en el flujo pasante y el lavado, formando de manera efectiva la carga de 16g/L. la inclinación escalonada del gradiente de reducción de sal, el cual lavó más del pico principal, redujo también el rendimiento.
La operación Phenyl 650 S 159 usó un gradiente lineal 1 M hasta 0.44M NaCI sobre 7CV (Cuadro 68). El gradiente fue seguido por un lavado de plato 4CV con 0.44M NaCI en solución reguladora de base, seguida por un lavado de plato 4CV con 0.3M NaCI en solución reguladora de base a 2CV de lavado de plato con solución reguladora de base lo que suministró un rendimiento de 50%, el cual fue menor a la operación previa. Sin embargo, la optimización del lavado de solución reguladora de base fue otro descubrimiento clave que ayudo a aumentar al máximo tanto la pureza como los rendimientos.
La operación de Phenyl 650 S 167 usó un gradiente lineal 1 M hasta 0.3 NaCI sobre 7CV (Cuadro 68). El gradiente fue seguido por un lavado de plato 8CV con 0.3M NaCI en solución reguladora de base, seguido por un lavado de plato 2CV con la solución reguladora de base. El rendimiento fue de 51%. Se postuló que el rendimiento puede haber sido mayor de haber tenido una concentración mayor del lavado 0.3M NaCI.
La operación Phenyl 650 S 171 usó un gradiente lineal 1 M hasta 0.33M NaCI sobre 7CV (Cuadro 68). El gradiente fue seguido por un lavado de plato 6CV con 0.33M NaCI en solución reguladora de base, seguido por un lavado de plato 2CV con solución reguladora de base lo que suministró un rendimiento de 57%.
Se condujo una operación de desarrollo de proceso final para el ajuste fino de las condiciones para eliminar NaCI durante el lavado de 20mM fosfato. Las etapas de lavado se establecieron durante el curso de varios experimentos, los refinamientos finales en las etapas de lavado fueron completados como se muestra en las operaciones 171 y 185 (Cuadro 68) las cuales proporcionaron la elución de la mayor parte del mAb no reactivo. Después la columna fue cargada y lavada con 1CV de 1 solución reguladora NaCI, un gradiente lineal 1-0.33M NaCI sobre 7CV removió de manera eficiente el mAb no reactivo. Un lavado de plato de 0.33 M NaCI para 5-6CV permitió que el material no reactivo sea completamente lavado desde la columna. Un lavado de 2-3CV con solución reguladora de base removió la sal restante para acondicionar la columna para elución, y se estableció como el método de elección. De manera subsecuente par alas operaciones de planta piloto a escala 33L, del lavado 0.33M NaCI se redujo hasta 5CV y el 20mM fosfato de sodio fue reducido hasta 2CV sin perdida de la calidad del producto.
La solución reguladora de elución fue cambiada desde 14% IPA hasta 15% 1,6 hexandiol. El objetivo fue eliminar el potencial de flamabilidad de IPA a gran escala. La concentración de IPA en la solución reguladora de elución se estableció a 14% ya que un alto rendimiento del h38C2 completamente reactivo fue recolectado a escala de laboratorio, usualmente dentro de 1.5CV. La solución reguladora de elución de hexandiol fue probada en menor escala en la operación 177 (Cuadro 68). La combinación de producto fue recolectada en 1.5CV, con un rendimiento de 73% y contenía 88% de pico principal. Las fracciones individuales fueron recolectadas par alas operaciones de columna a escala de laboratorio. Las fracciones combinadas fueron recolectadas de manera general a 200mAU en el pico ascendente y entre 200 y 400mAU en el pico descendente. Después de revisar la calidad de producto de los bordes, fueron suficientemente elevados en % de pico principal de modo que la estrategia de combinación para las operaciones de columna 33L fue colectar el pico de producto desde 100 AU hasta lOOmAu.
Ejemplo 76 Análisis de elución acuosa Otra consideración fue encontrar una columna que pudiera ser eluida sin componentes orgánicos en la solución reguladora de elución en tanto que se enriquece aún el h38C2 totalmente reactivo. Se seleccionaron más columnas hidrofílicas para este análisis de manera que el mAb no se enlazaría tan fuertemente a la resina. Con la proteína enlazada menos estrechamente, fue mayor el potencial para eluir el mAb con una solución reguladora acuosa. A fin de ser un enfoque efectivo el método aún necesita separar el h38C2 totalmente reactivo y el no reactivo. Las columnas de PPG 600 M, Butyl HP, y Phenyl HP fueron probadas utilizando metodología muy similar a la de los procesos desarrollados con la columna Phenyl 650 S descrita en la presente (Cuadro 70). Para la cromatografía PPG 600 M, Butyl HP, y Phenyl HP (escala 4 ml_) la solución reguladora de equilibrio fue 20mM fosfato de sodio, 2.5M NaCI, pH7.0. La carga fue ajustada para una composición similar que tiene el mismo pH y conductividad. La carga de resina 18-19g mAb/L fue seguida por un lavado 5CV con solución reguladora de equilibrio. A continuación, un lavado de reducción de sal a partir de 2.5M hasta 0M NaCI sobre 13-15CV, seguido por 3CV de 20mM solución reguladora de fosfato. De manera alternativa, una operación de la columna de Butyl tuvo un lavado de reducción de sal desde 1 M hasta 0.3M NaCI, seguido por 3CV de 20mM de solución reguladora de fosfato. Las columnas fueron lavadas con 5CV 20mM fosfato de sodio, 20% IPA, pH7.0.
Cuadro 70 Condiciones de operación para columnas PPG 600M, Butyl HP y Phenyl HP. A = 20 mM fosfato de sodio, 1M NaCI, pH 7. B = 20 mM fosfato de sido, pH 7.
La columna PPG 600 M fue ligeramente sobrecargada a 18g/L con aproximadamente 5% del mAb que fluye durante el lavado con alto contenido de sal. El mAb se eluyó a medida que descendió la conductividad. Sin embargo, hubo un pico grande y amplio sin definición lo que indica una separación de las especies reactiva/no reactiva. La columna Butyl HP mantuvo la cantidad más promisoria, de hecho sustancial, del mAb eluido durante la menor elución de sal. Sin embargo, los resultados del ensayo HIC mostraron que la combinación contenía las especies 43% de pico 2 y 53% de pico principal. El h38C2 no eluye en la fase acuosa durante el lavado de reducción de sal a partir de la columna Phenyl HP. El h38C2 enriquecido sólo fue eluido con un gradiente IPA. Ya que el mAb solamente podría ser eluido con IPA, la columna Phenyl HP no fue adecuada para un método de elución acuosa. Por lo tanto, ninguna de estas columnas fue capaz de proporcionar una estrategia de purificación alterna o una razón para cambiar de la resina Phenyl 650 S.
Ejemplo 77 Proceso de Purificación Phenyl 6505 Refinado h38C2 a 20g/L mAb fue descongelado y diluido 1:1 con 40mM fosfato de sodio, 2M NaCI, pH7, filtrado a través de un filtro 0.45/0.2µ?, y fue cargado a 16-18g/L en una columna Phenyl 650 S HIC (TOSOH) que fue equilibrada con 20mM fosfato de sodio, 1 M NaCI, pH 7.0 (Cuadro 71). La columna fue lavada con 1 CV de solución reguladora de equilibrio, después se desarrolló un gradiente 7CV desde 1 hasta 0.33M NaCI en 20mM fosfato de sodio, pH7. El gradiente fue mantenido a 0.33M NaCI en 20mM fosfato de sodio, pH7.0 para 5CV y fue seguido por un lavado 2CV con la solución reguladora de base, 20mM fosfato de sodio, pH7. Las formas menos reactivas de h38C2 se eluyeron durante la aplicación de estas etapas de lavado. Para la fase de elución, se desarrolló un gradiente de 0-15% 1,6 hexandiol sobre 1 CV y fue mantenido a 15% hasta que se completó la elución. El producto h38C2 completamente reactivo fue recolectado como una combinación de aproximadamente 1-2CV. de flujo es de abajo hacia arriba. Todas las demás etapas tienen una dirección de flujo de arriba hacia abajo. La velocidad de alimentación fue limitada por una presión de sistema máxima de 3 bar. El enlace de proteína bajo estas condiciones de carga fue de 100%. Todas las operaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente (18-22°C). B: 20mM fosfato de sodio, pH7.0.
La combinación de producto de Phenyl 650 S que contiene 90-95% h38C2 completamente reactivo fue diafiltrada después en 10 mM histidina (8 diavolumenes) con una membrana 30kD Hydrosart (3m2 de Sartorius) a 130-280 g de mAb/m2 de membrana. El material retenido UF fue ajustado hasta 25g/L con la cantidad apropiada de enjuague UF de solución reguladora UF. Una solución concentrada que contiene una cantidad 4-5x de los excipientes remanentes fue adicionada en la solución de proteína diafiltrada para establecer la formulación intermedia de sustancia de fármaco a granel final. La formulación final fue: 10mM histidina, 10mM glicina, 2% sacarosa, pH6.5 ± 0.3. la solución intermedia DS formulada fue pasada a través de un filtro final 0.45/0.2 µ? y almacenada después en bolsas Stedium de tamaño apropiado o equivalente hasta por seis meses @ 2-8°C. Para almacenamiento más prolongado, el intermediario DS fue congelado a -70 hasta -80°C en botellas 1L o 4L PETG.
Los Cuadros 72 & 73 muestran rendimientos a partir de operaciones de proceso de grado GLP y GMP usando el proceso Phenyl 650 S refinado.
Cuadro 72 Cuadro de Purificación de h38C2completamente reactive (FR) a Escala 1.1 kg para estándar GLP (Buenas Prácticas de Laboratorio) *A error de muestreo ocurrido y no se obtuvo la combinación de producto real. La muestra analizada tuvo una concentración de proteína de 2 g/L en vez de 11.4 g/L.
Cuadro 73. Cuadro de Purificación de h38C2 completamente reactivo (FR) a Escala 1.2 kg para estándar GMP (Buenas Prácticas de Manufactura). *A ocurrió un error de programa que omitió la etapa de lavado de reducción de sal y de plato, desplazando parte de la proteína desde la columna. Se repitió la etapa de lavado completa. El pico principal en la fracción fue de 94.3%, ligeramente superior a 91.3% en el ciclo B. el rendimiento estuvo dentro del rango de 60-75%.
Ejemplo 78 Eficiencia de conjugación de h38C2 completamente reactive con Ex4-ligador La relación entre los resultados del ensayo HIC que reportan el pico principal en muestras y la habilidad de ambos sitios de conjugación para reaccionar con el sustrato se muestran en el (Cuadro 74) más adelante. Después de las diferentes etapas de purificación HIC, cada muestra de h38C2 fue incubada con una relación molar 1 :3 de [NO ID SEC: 53-L1], y después el número de conjugaciones E4-ligador por anticuerpo fue contado utilizando la cromatografía de exclusión molecular.
La operación h38C2 FR 171 fue purificada en Phenyl 650 S de acuerdo con el proceso refinado del Ejemplo 77 y estuvo contenida en una solución de la solución reguladora de base y 15% IPA. Las fracciones de elución que totalizan 3CV a partir de la operación h38C2 FR 171 fueron combinadas y la combinación mostró 92.4% de pico principal por medio de ensayo HIC. El h38C2 fue incubado con una relación molar 1:3 de Ex4-ligador. La reacción de conjugación fue hasta el 87.8% de completacion y 11.8% del mAb que reaccionó con un péptido.
La operación h38C2 FR 177 fue purificada en Phenyl 650 S de acuerdo con el proceso refinado del Ejemplo 77 y estuvo contenida en una solución de la solución reguladora de base y 15% 1,6 hexandiol, fue diafiltrada después en 10 mM glicina, 10 mM histidina pH6.5. Las fracciones de elución que totalizan 1.5CV a partir de la operación h38C2 FR 177 fueron combinadas y la combinación mostró 88% del pico principal. El h38C2 fue incubado con una relación molar 1:3 de Ex4-ligador. La reacción de conjugación fue del 96% de completacion y 3.9% del mAb reaccionó con un péptido.
En las operaciones de comparación 171 y 177, fue evidente que IPA interfirió con la reacción ya que la operación 177 tuvo mayor eficiencia de conjugación sin IPA, y todo lo demás fue equivalente.
La operación h38C2 FR "E-tox' fue purificada en Phenyl 650 S de acuerdo con el proceso refinado del Ejemplo 77 y estuvo contenida en una solución de solución reguladora de base y 15% IPA. Las fracciones de elución que totalizan 5CV a partir de la operación h38C2 FR ?-tox' fueron combinadas y la combinación mostró 90.7% del pico principal mediante ensayo HIC. El h38C2 fue incubado con una relación molar 1:3 de Ex4-ligador. La reacción de conjugación fue hasta 93.2% de completacion y 6.7% del mAb que reaccionó con un péptido.
Se puede ver a partir del Cuadro 74 que el análisis de exclusión, el cual mide la cantidad de anticuerpo completamente reactive en una muestra, se correlaciona muy bien con el análisis de pico principal . ligador Ejemplo 79 Importantes hallazgos de desarrollo de Phenyi 650 S Se seleccionó la columna Phenyi 650 S después de analizar varias resinas HIC a partir de TOSOH™ y otros proveedores. La resina tuvo una alta capacidad de carga (rango desde aproximadamente 16 hasta aproximadamente 18 g/L, para una resina HIC. El tamaño de particular 35 µ ofrece la resolución necesaria para remover el mAb no conjugable en tanto que enriquece la forma reactiva del anticuerpo. A gran escala, se han utilizado las columnas con alturas de lecho de 10, 13.5, y 20cm. Las velocidades de flujo son de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4 veces mayores para las dos columnas más cortas, y en consecuencia, la invención proporciona el uso de altura de lecho de columna de aproximadamente 10 cm hasta aproximadamente 20cm, y de preferencia aproximadamente 10 cm hasta aproximadamente 15 cm, que permite un procesamiento más eficiente a menor presión. Una altura de lecho de columna de 20cm podría ser utilizada para cubrir los requerimientos de procesamiento aunque requeriría de mayores tiempos de proceso. El rango de carga de columna y estrategia de lavado antes descritos han sido optimizados tanto para enriquecimiento como para rendimiento de h38C2 completamente reactivo. Las estrategias previas y las otras resinas suministraron recuperaciones de proteína de aproximadamente 11 hasta aproximadamente 55% y no alcanzaron los niveles de enriquecimiento deseados de h38C2 completamente reactivo. El desarrollo a pequeña escala utilizó 20% IPA en 20mM fosfato de sodio, pH7.0 como la solución reguladora de elución. La presente invención proporciona el uso de 1 ,6, hexandiol a fin de evitar el uso de IPA para evitar los problemas de flamabilidad a gran escala.
La columna Phenyl 650 S es robusta y tiene una capacidad de carga cuatro veces mayor que la columna Phenyl 5PW, logra mayores velocidades de flujo que la columna Phenyl 5 PW, debido al mayor tamaño de partícula, y es escalable y reproducible.
Los resultados con el proceso desarrollado utilizando Phenyl 650 S en escalas de 4ml, 75ml, 9.5L, y 33L con métodos de purificación similares logran excelentes rendimientos y produjeron h38C2 completamente reactivo. La operación a escala 9.5L suministró 110g de h38C2 FR (por encima del objetivo de 80-90g) que representó un rendimiento de proteína total de 72%. El ensayo HIC mostró que el pico principal comprendió 93% de la proteína total.
La presente invención proporciona un proceso para suministrar el h38C2 completamente reactive a un rendimiento de pico principal de por lo menos aproximadamente 85% y de preferencia de por lo menos aproximadamente 90%, de mayor preferencia por lo menos de aproximadamente 92%, de mayor preferencia por lo menos de aproximadamente 95%, con un rendimiento de proteína total de por lo menos aproximadamente 65%, de mayor preferencia por lo menos de aproximadamente 70%, y de la mayor preferencia de por lo menos aproximadamente 72%.
El proceso de purificación suministró el h38C2 completamente requerido para conjugación para FGF21 y subsecuentemente para el péptido Ex4 para la preparación de ABC1.
Los rendimientos de proteína totales a grandes escalas con la columna Phenyl 650 S han sido optimizados para lograr por lo menos de aproximadamente 55%, de preferencia por lo menos aproximadamente 60%, de mayor preferencia por lo menos aproximadamente 65%, de mayor preferencia por lo menos aproximadamente 68%, de mayor preferencia por lo menos aproximadamente 70%, y de la mayor preferencia por lo menos de aproximadamente 75%. La presente invención proporciona también un proceso para suministrar por lo menos aproximadamente 85%, de preferencia por lo menos de aproximadamente 88%, de mayor preferencia por lo menos de aproximadamente 90% del h38C2 completamente reactivo.
El enriquecimiento exitoso de h38C2 completamente reactive para conjugación se logró con la resina Phenyl 650 S. La capacidad de carga máxima de la columna de Phenyl 650 S fue de aproximadamente 20-22g/L.
La capacidad de carga máxima es determinada a través del equilibrio de la columna con solución reguladora aplicando después la carga de proteína hasta que se observa una irrupción o rompimiento de la absorbancia. El nivel de irrupción se fija usualmente en 5-10% de absorbancia máxima. La carga de columna es detenida y la irrupción es recolectada mientras se lava la columna con solución reguladora de equilibrio. La diferencia entre la masa de proteína aplicada menos la cantidad de irrupción o rompimiento de la proteína es la capacidad de carga máxima. En otra operación de columna, la carga máxima calculada es aplicada a la columna para verificar si esa cantidad de proteína se fijará a la columna.
La columna 650 S brindó óptimo rendimiento cuando fue cargada a por lo menos 2/3 de capacidad. Las cargas de columna fueron por lo general de ~15-18g/L, lo cual es aproximadamente 70-80% de la capacidad de carga máxima. Se encontró que es ventajoso cargar las columnas cerca de la capacidad de enlace de la columna. Si la columna tiene muchos sitios de enlace disponibles después de la carga entonces la elución del mAb no reactivo se podría retardar durante las etapas de lavado y no ser removidos antes de la elución de la forma completamente conjugable. En consecuencia, en ciertos aspectos, la columna puede ser cargada por lo menos a aproximadamente 50% de capacidad, y de mayor preferencia de por lo menos aproximadamente 60%, de mayor preferencia de por lo menos aproximadamente 70%, incluso de mayor preferencia de por lo menos aproximadamente 80%. En la operación 155 (Cuadro 67) la columna fue sobrecargada a 45g/L y la mayor parte del material no se enlazó a la columna. La operación de columna se continuó y la proteína recuperada desde el resto de la operación. El cálculo de la carga total menos la cantidad de proteína en la irrupción dio una carga práctica de 16g/L. La columna fue sobrecargada pasando el punto de irrupción normal y se lavó más proteína de la columna que la esperada. La capacidad de enlace de la columna Phenyl 650 S es de entre aproximadamente 22-30g/L, cerca o sobre los 22 g/L probados sin considerar la irrupción o rompimiento.
Una parte importante de la purificación es definir un lavado de reducción de sal acuoso de 3 etapas que eluye el anticuerpo no reactivo. Mediante ajuste fino de las concentraciones de sal de objetivo, la inclinación del lavado de reducción de sal, y la duración del lavado, la mayoría de la forma inactiva fue eluida desde la columna en tanto que la mayor parte del h38C2 completamente reactivo permanece enlazado a la resina. La elución se logró en el modo de fase inversa mediante alcohol isopropílico (IPA) o 1 ,6 hexandiol. Aunque se efectuó la prueba de columna adicional para identificar condiciones de elución acuosa, no se identificó un método adecuado.
En consecuencia, en ciertos aspectos, la invención proporciona el refinado sorpresivo de un proceso para purificar h38C2. En ciertos aspectos, h38C2 comprende NO ID SEC: 25 y 26. En ciertos aspectos, la invención proporciona un proceso para la refinación de h38C2 y variantes del mismo. En este contexto, "variantes del mismo" se refiere a anticuerpos que comprenden una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una VL CDR1, Vu CDR2, y VL CDR3 de la secuencia VL mostrada en NO ID SEC: 27; y una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una VH CDR1, VH CDR2, y VH CDR3 de la secuencia VH mostrada en NO ID SEC: 28. De preferencia, el h38C2 es un anticuerpo lgG1. De preferencia la variante h38C2 comprende la VL como se establece en NO ID SEC: 27 y la VH como se establece en NO ID SEC: 28, y comprende además una región constante de cadena ligera por lo menos 95% idéntica a uno o más de Nos ID SEC: 78, 79, 80 y 81, y una región constante de cadena pesada al menos 95% idéntica al NO ID SEC: 82. En ciertos aspectos, la identidad de cada cadena constante independientemente para uno de NO ID SEC: 27 o 28 puede ser al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%. En ciertos aspectos, la región constante de cadena ligera difiere en no más de 5 residuos aminoácido a partir de uno o más de Nos ID SEC: 78, 79, 80 y 81. En ciertos aspectos, la región constante de cadena ligera comprende NO ID SEC: 81. En ciertos aspectos, la región constante de cadena ligera difiere en no más de 5, 4, 3, 2, o 1 amino ácido a partir de NO ID SEC: 81.
En ciertos aspectos, la invención proporciona un proceso para extraer h38C2 completamente reactivo o variante del mismo a partir de una mezcla de h38C2 parcialmente no reactivo o variante del mismo y h38C2 completamente no reactivo o variante del mismo, que comprende someter la muestra a cromatografía de fase inversa sobre una columna de fenilo.
En ciertos aspectos, la invención se refiere a una composición que comprende h38C2 completamente reactivo o variante del mismo. Una muestra de h38C2 reactivo o variante del mismo puede ser definida como una muestra de h38C2 o variante del mismo en donde ambos sitios de enlace de antígeno están completamente disponibles para enlace de antígeno en por lo menos aproximadamente 85%, aproximadamente 88%, aproximadamente 90%, de los anticuerpos en la muestra.
Cuando el anticuerpo es un anticuerpo catalítico tal como h38C2 o variante del mismo, los sitios de enlace de antígeno reactivo estarán disponibles para catalizar la reacción respectiva, y en el caso de h38C2 o variante del mismo, forma conjugados covalentes para ligadores de las fórmulas X-Y-Z como se describe en la presente. Sin el deseo de unirse a teoría, una hipótesis para la presencia de anticuerpos parcial y completamente no reactivos en una muestra es cuando uno o ambos sitios de enlace de antígeno de un anticuerpo se han enlazado con moléculas pequeñas "adhesivas" presentes de manera natural en cierto punto a través del ciclo de producción precedente.
El tamaño de partícula de las esferas de columna puede ser menor a aproximadamente 50 pm de diámetro. El tamaño de particular de las esferas de columna puede ser menores a aproximadamente 40 pm. El tamaño de partícula de las esferas de columna puede ser de entre aproximadamente 50 pm y aproximadamente 20 pm. El tamaño de partícula de las esferas de columna puede estar entre aproximadamente 40 pm y aproximadamente 30 pm. El tamaño de partícula de las esferas de columna puede ser de aproximadamente 35 pm. En ciertos aspectos, se puede usar una columna de fenilo de grado "S".
En ciertos aspectos, las esferas pueden comprender poros al menos de aproximadamente 500A. En ciertos aspectos, las esferas pueden comprender poros de por los menos aproximadamente 650Á. En ciertos aspectos, las esferas pueden comprender poros de por los menos aproximadamente 700A. En ciertos aspectos, las esferas pueden comprender poros de entre aproximadamente 500A y 1000A. En ciertos aspectos, las esferas pueden comprender poros de entre aproximadamente 700A and 800A.
En ciertos aspectos, la columna HIC puede comprender esferas de resina conjugada de fenilo de aproximadamente 351 pM que comprenden poro de aproximadamente 750A. En ciertos aspectos, la columna puede ser una columna Phenyl 650 S.
La HIC se puede llevar a cabo entre aproximadamente 0°C y 37°C. Esto puede ser a TA (aproximadamente 15°C hasta aproximadamente 25°C). Esto puede ser a una temperatura de entre aproximadamente 16°C hasta aproximadamente 23°C.
La velocidad de flujo lineal de la columna puede estar entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 cm/hr. Las velocidades de flujo preferidas pueden estar entre aproximadamente 50 y aproximadamente 90 cm/hr.
La solución reguladora de base puede comprender un agente regulador de pH seleccionado a partir del grupo que consta de fosfato de sodio, fosfato de potasio, fosfato de amonio, HEPES, Tris, o bis-Tris, y de preferencia fosfato de sodio, en una concentración de entre aproximadamente 15mM y aproximadamente 100 mM, y de preferencia entre aproximadamente 20mM y aproximadamente 70mM, y de mayor preferencia entre aproximadamente 20mM y aproximadamente 50mM, y de la mayor preferencia de aproximadamente 20mM. Por debajo de una concentración de aproximadamente 5mm, es probable que haya una concentración de sal muy débil para regular el pH de manera efectiva, y por encima de aproximadamente 100 mM la incrementada concentración de sal puede impactar de manera negativa la solubilidad de la solución. El pH puede estar entre aproximadamente 6.5 y aproximadamente 7.5, y de mayor preferencia entre aproximadamente 6.8 y aproximadamente 7.2, y de la mayor preferencia aproximadamente 7.
En ciertos aspectos, la columna puede ser sometida a un lavado de equilibrio de pre-carga antes de la carga. El lavado de equilibrio de pre-carga puede comprender solución reguladora de base y entre aproximadamente 0.5M y aproximadamente 1.5M de sal.
En ciertos aspectos, la columna puede ser sometida a un lavado de equilibrio post-carga, que comprende solución reguladora de base y que comprende además entre aproximadamente 0.5M y aproximadamente 1.5M de sal.
La sal para cualquiera de las etapas (que incluye soluciones reguladoras de equilibrio de pre-carga, carga y post carga) puede estar en un rango de concentración cuyo límite inferior es seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.75M y 0.8M, y cuyo límite superior es seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 0.8M, 0.9M, 1M, 1.1M, 1.2M, 1.3M, 1.4M y 1.5M. La concentración de sal puede ser de aproximadamente 0.75 M. La concentración de sal puede ser de aproximadamente 0.5M. La concentración de sal puede ser de aproximadamente 1M. La sal puede ser seleccionada a partir del grupo que consta de NaCI, KCI, y citrato monosódico. La sal puede ser NaCI. La sal puede ser NaCI aproximadamente a 1M.
En ciertos aspectos, la columna puede ser sometida a gradiente de sal lineal en la solución reguladora de base, en donde la concentración de sal inicial está entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 1.5M, y de preferencia es de aproximadamente 1M, y cuya concentración final está entre aproximadamente 0.25 y aproximadamente 0.4M, y de preferencia es de entre aproximadamente 0.3M y aproximadamente 0.35M, y de mayor preferencia es de aproximadamente 0.33M. Se ha encontrado que se obtienen resultados particularmente ventajosos cuando la reducción en la concentración de la sal (en particular NaCI) a través del gradiente iguala una reducción de 90-100mM por 1CV (por ejemplo, entre aproximadamente 10-11CV se utilizaría para reducir la concentración de sal desde 1.5M hasta 0.5M). En consecuencia, en ciertos aspectos, el gradiente de sal lineal está caracterizado por una reducción en la concentración de sal de entre aproximadamente 90mM y 100mM por 1 CV. Consecuentemente, se ha encontrado que cuando se utiliza un gradiente NaCI, es deseable mantener por lo menos aproximadamente 0.65-0.7 M NaCI por aproximadamente 7CV, y en ciertos aspectos aproximadamente 0.67M de NaCI por aproximadamente 7CV. El gradiente lineal puede comprender al menos aproximadamente 4, de preferencia por lo menos aproximadamente 4.5, y de mayor preferencia al menos aproximadamente 5CV. Un volumen muy pequeño de gradiente lineal puede resultar en que la inclinación del gradiente sea demasiado pronunciada, y no haya tiempo suficiente para que se eluya el material no reactivo. En ciertos aspectos, el gradiente de sal lineal puede comprender entre aproximadamente 4 y aproximadamente 10CV. En ciertos aspectos, el gradiente de sal lineal puede comprender entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7CV. En ciertos aspectos, el gradiente de sal lineal puede comprender aproximadamente 7CV. La sal se puede seleccionar a partir del grupo que consta de NaCI, KCI, y citrato monosódico. La sal puede ser NaCI.
De manera favorable, la columna puede ser sometida después a un lavado de plato en solución reguladora de base, que comprende entre aproximadamente 0.25M y aproximadamente 0.4M de sal (como antes), y de preferencia 0.33M sal, para entre aproximadamente 4CV y aproximadamente 7CV, y de preferencia aproximadamente 6CV, y de mayor preferencia aproximadamente 5CV. La sal puede ser NaCI. El NaCI puede estar a 0.33M.
En ciertos aspectos, la columna puede ser sometida después a un lavado adicional con solución reguladora de base en un rango de CVs cuyo límite inferior es seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 1, 2, 3, 4, y 5, y cuyo límite superior es seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, y 10, y en donde el rango puede estar entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10, o aproximadamente 2 y aproximadamente 8, o aproximadamente 3 y aproximadamente 8, o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 6. En ciertos aspectos, el lavado adicional en la solución reguladora de base está entre aproximadamente 2 hasta aproximadamente 3 CV de solución reguladora de base.
En ciertos aspectos, la elución en la columna puede ser conducida utilizando solución reguladora de base y un gradiente de concentración lineal de 1,6 hexandiol. El gradiente de elución lineal puede avanzar desde una concentración inicial de 1,6 hexandiol de entre aproximadamente 0 hasta aproximadamente 1%, y de preferencia aproximadamente 0%, hasta un límite superior seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21%, y aproximadamente 22%. La elución de hexandiol se puede incrementar sobre un volumen de columna de entre aproximadamente 0.5CV y aproximadamente 3CV de solución reguladora de elución o hasta que se recolecta la combinación de elución. En ciertos aspectos, se puede operar una etapa de elución adicional, que comprende la solución reguladora de base y 1,6 hexandiol a una concentración seleccionada a partir del grupo que consta de aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21%, y aproximadamente 0% hasta aproximadamente 22%, hasta para 5CV o hasta que se recolecta la combinación de elución. En ciertos aspectos, el CV de elución total es de aproximadamente 7CV. En ciertos aspectos el CV de elución total es de aproximadamente 6CV.
Aunque 20% hexandiol funcionó bien, se encontró que 15% permitió una mejor velocidad de flujo en UF/DF.
El h38C2 eluido puede ser diafiltrado después en la solución reguladora adecuada (por ejemplo, aproximadamente 10 mM histidina, aproximadamente 10 mM glicina, aproximadamente 2% sacarosa pH 6.5 +/- 0.3).
En ciertos aspectos, la invención proporciona un proceso para purificar una muestra de h38C2 en donde ambos sitios de antígeno están completamente disponibles para enlace de antígeno en por lo menos aproximadamente 85% de los anticuerpos en la muestra que comprende (i) Equilibrar una columna HIC con un lavado de equilibrio de pre-carga que comprende una solución reguladora de base que comprende entre aproximadamente 15mM y aproximadamente 100mM fosfato de sodio, fosfato de potasio o fosfato de amonio HEPES, Tris and bis-Tris, entre aproximadamente pH6.5 hasta aproximadamente 7.5, y que comprende además una sal seleccionada a partir del grupo que consta de NaCI, KCI, y citrato de sodio, a una primera concentración de entre aproximadamente 0.5M y 1.5M; en donde la columna HIC comprende esferas de resina conjugada de fenilo por debajo de aproximadamente 501Jm de diámetro y que comprenden poros de por lo menos aproximadamente 500A; (ii) Cargar la columna con una muestra de h38C2 entre aproximadamente 4 y aproximadamente 80g/L en solución reguladora de carga que comprende la solución reguladora de base y que comprende además la sal en la primera concentración; (iii) Lavar la columna con lavado de equilibrio post-carga que comprende la solución reguladora de base y la sal en la primera concentración; (iv) Lavar la columna con un gradiente de sal, que comprende la solución reguladora de base y comprende además un gradiente de concentración lineal desde aproximadamente 1.5M hasta aproximadamente 0.25M de la sal, caracterizada en que la concentración de sal se reduce entre aproximadamente 90mM y 100 mM por 1 CV; (v) Lavar la columna con un pequeño lavado de plato de sal, que comprende entre aproximadamente 4CV y aproximadamente 8CV de la sal entre aproximadamente 0.25M y aproximadamente 0.4M en la solución reguladora de base, (vi) Lavar la columna con un lavado de solución reguladora que comprende la solución reguladora de base; (vii) Eluir el h38C2 con una solución reguladora de elución, que comprende la solución reguladora de base y un gradiente de concentración lineal de 1,6 hexandiol que inicia a una concentración de entre aproximadamente 0 hasta aproximadamente 1% de 1,6 hexandiol y que termina en un límite superior seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21%, y 22%, aproximadamente 0% hasta aproximadamente 22% de 1,6 hexandiol para entre aproximadamente 0.5CV hasta aproximadamente 3CV o hasta que se recolecta la combinación de elución. (viii) Operar de manera opcional una etapa de elución adicional que comprende la solución reguladora de base y 1,6 hexandiol a una concentración seleccionada a partir del grupo que consta de aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21%, y 22%, aproximadamente 0% hasta aproximadamente 22%, hasta para 5CV o hasta que se recolecta la combinación de elución.
En ciertos aspectos, la invención proporciona un proceso para purificar una muestra de h38C2 o variante del mismo en donde ambos sitios de enlace de antígeno están completamente disponibles para enlace de antígeno por lo menos en aproximadamente 85% de los anticuerpos en la muestra que comprende (i) Equilibrar una columna Phenyl 650 S HIC con un lavado de equilibrio de pre-carga que comprende aproximadamente 20mM fosfato de sodio, aproximadamente 1 M NaCI, aproximadamente pH7; (ii) Cargar la columna con una muestra de h38C2 entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20g/L en aproximadamente 20mM fosfato de sodio a aproximadamente pH7; (iii) Lavar la columna con lavado de equilibrio de post-carga que comprende aproximadamente 1 CV de 1 M NaCI en aproximadamente 20mM fosfato de sodio a aproximadamente pH7; (iv) Lavara la columna con un gradiente de NaCI, que comprende 20mM fosfato de sodio, pH7, y que comprende además un gradiente de concentración lineal desde aproximadamente 1 M hasta aproximadamente 0.33M de NaCI, caracterizada en que la concentración de sal se reduce entre aproximadamente 90mM y 100m por 1CV; (v) Lavar la columna con un lavado de plato NaCI, que comprende aproximadamente 5 CV, aproximadamente 0.33M de NaCI en aproximadamente 20mM fosfato de sodio a aproximadamente pH 7; (vi) Lavar la columna con un lavado de solución reguladora que comprende aproximadamente 2CV de 20mM fosfato de sodio a aproximadamente pH7; (vii) Eluir el h38C2 con una solución reguladora de elución, que comprende 20mM fosfato de sodio, pH7 y un gradiente de concentración lineal de 1,6 hexandiol que inicia en una concentración de entre aproximadamente 0 hasta aproximadamente 1% de 1,6 hexandiol y que termina en un límite superior seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, o aproximadamente 16%, de 1,6 hexandiol para aproximadamente 1CV. (viii) Operar una etapa de elución adiciona que comprende 20mM fosfato de sodio, pH7 y 1,6 hexandiol a una concentración seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, y aproximadamente 16%, durante aproximadamente 2 hasta aproximadamente 5CV o hasta que se recolecta la combinación de elución.
Ejemplo 80 Análisis de adipocito posterior a tratamiento ABC-1 Además del análisis de expresión de gen mediante matriz en tejido adiposo blanco, se realizó la evaluación histoquímica en tejido adiposo blanco a partir de ratones DIO tratados con ABC-1, Ab[Ex4]2 o Ab[FGF21]2. Los compuestos fueron dosificados una vez por semana (días O y 7), y se midieron el peso corporal y la ingesta alimenticia dos veces por semana. En el día de terminación (día 10), un depósito adiposo blanco gonadal fue extirpado, pesado, fijado, incrustado en parafina y seccionado para análisis histoquímico de tamaño de célula y apoptosis (tinción TUNEL). ABC-1 redujo de manera significativa el peso corporal y el peso húmedo de tejido adiposo, así como el tamaño de adipocito, con una tendencia hacia la apoptosis de adipocito reducida.
Cuadro 75 Cambio de peso corporal, ingesta alimenticia, peso depósito adiposo, tamaño de adipocito y tinción TUNEL en el día 10, después de inyección SC dos veces por semana de compuestos en ratones DIO.
Ejemplo81 Efecto de ABC-1 en monos después de dieta con alto contenido de grasa En un estudio diseñado para investigar la eficacia de ABC-1 en monos cynomolgus después de la alimentación en una dieta con alto contenido de grasa durante 6 meses, 8 machos adultos fueron dosificados con ABC-1 por vía intravenosa dos veces por semana durante dos semanas a niveles de dosis de 1.0mg/kg (Semanas 1 y 2), 3.0mg/kg (Semanas 3 y 4) y 10 mg/kg (Semanas 5 y 6). Se tomaron escaneos DXA de cuerpo completo bajo anestesia después de un ayuno durante la noche en la línea de base y al final del período de dosificación de 6 semanas. La composición de los 3 compartimientos corporales que consta de masa grasa, masa corporal magra y contenido mineral óseo (BMC) fue analizada y calculada. No se observe un cambio notorio en los pesos corporales entre la línea de base y los períodos de dosificación de 1.0mg/kg y 3.0mg/kg. Sin embargo, al final del tratamiento de 10.0mg/kg se observó una reducción considerable en el peso corporal medio (9.0% con un error estándar de + 5.4%). Los valores de índice de Masa Corporal medio (BMI) fueron menores en 12.09% al final del período de dosificación (Semana 6) en comparación con los valores de línea de base medios. El análisis de composición corporal DXA mostró valores porcentuales medios inferiores para la grasa porcentual tisular (-34.9 ±12.9%) y regional (-35.6 ±12.9%) y la masa grasa (-42.1 ±14.0 %) que involucra el tronco y cuerpo completo registrados al final de los períodos de dosificación (Semana 6), con relación a los valores de línea de base. No se observaron cambios notorios en la masa tisular magra, contenido mineral óseo (BMC), y la masa total observada durante los períodos de observación completos, sugiriendo que la pérdida de peso inducida por ABC-1 está dirigida únicamente a una pérdida de masa grasa.
Cuadro 76 Efecto de ABC-1 en monos cynomolgus después dieta con alto contenido de grasa de 6-meses.
A menos de que se indique de otro modo, cuando se usa el término "Ab-L1 -FGF21 ??-?129C" en el contexto de los ejemplos específicos, se refiere al anticuerpo h38C2 (NO ID SEC: 25 y 26), con cada brazo del anticuerpo enlazado de manera covalente a través de KS9 de NO ID SEC: 26 al I ig ador- 1 ( L 1 ) , y cada molécula L1 conjugado de modo covalente para el grupo tiol de Cys 29 en NO ID SEC: 10 (de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 1). El compuesto puede ser descrito también como Ab-(FGF21 ??-?129C- L1)2, h38C2-(FGF21 ??-?129C-L1 )2, y h38C2-(NO ID SEC: 10-L1)2. Será evidente que pueden ser posibles modificaciones menores a la secuencia del anticuerpo, Mgador específico y molécula FGF21, en particular sitios polimórficos conocidos, tal como la posición 146, la cual puede ser L o P. Se observa que las variantes P146 y L146 de FGF21 no parecen mostrar ninguna diferencia biológica.
Cuando las moléculas de conjugado bifuncional asimétrico (ABC) e intermediarios y derivados de los mismos se describen en el contexto de ejemplos específicos, un subíndice 1 o 2 denota el número de especies proteína-ligador o péptido-iigador conjugado por anticuerpo.
Cuando se utilizan letras en el contexto de descripción de grupos ligadores, o variables químicas (por ejemplo Y para definir un grupo de reconocimiento), la fórmula puede ser representada por una combinación de la versión de mayúsculas y minúsculas de la letra, o doble minúscula, para evitar cualquier posible confusión entre la fórmula representada por la letra individual y un aminoácido o nucleótido denotado por el código IUPAC de una letra. Por tanto, Y, como un grupo de reconocimiento, también puede ser descrito como Yy o yy.
Por tanto se ha descrito e ilustrado ampliamente la invención con referencia a las modalidades representativas antes descritas. Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que se pueden hacer varias modificaciones a la presente invención sin apartarse del espíritu y alcance de la misma. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, y patentes publicadas, están incorporadas mediante referencia en la presente hasta el grado mismo como si cada publicación, solicitud de patente o patente publicada individual estuviese específica e individualmente indicada para ser incorporada mediante referencia en su totalidad. Las definiciones que están contenidas en el texto incorporadas mediante referencia están excluidas hasta el grado que contradigan las definiciones en esta descripción.
Se aprecia que ciertas características de la invención, que están, para fines de claridad, descritas en el contexto de modalidades separadas, se pueden proporcionar también en combinación con una modalidad individual. De modo inverso, varias características de la invención que, por razones de brevedad, están escritas en el contexto de una modalidad individual, pueden ser proporcionadas también por separado o en cualquier sub-combinación adecuada.
Se considera de manera específica que cualquier limitación descrita con respecto a una modalidad de la invención puede aplicar para cualquier otra modalidad de la invención. Además, cualquier composición de la invención puede ser usada en cualquier método de la invención, y cualquier método de la invención puede ser empleado para producir o para utilizar cualquier composición de la invención. En particular, se entiende que cualquier aspecto de la invención descrito en las reivindicaciones, solo o en combinación con una o más reivindicaciones adicionales y/o aspectos de la descripción, es combinable con otros aspectos de la invención establecidos en cualquiera de las reivindicaciones y/o la descripción.
El uso del término "o" en las reivindicaciones es empleado para representar "y/o" a menos de que se indique de modo explícito para referirse a alternativas solamente o las alternativas son mutuamente exclusivas, aunque la descripción soporta una definición que se refiere solamente a alternativas e "y/o".
Como se usa en la presente la especificación, "un" o "una" puede representar uno o más, a menos de que claramente se indique lo contrario. Como se utiliza en la presente en las reivindicaciones, cuando se usa en conjunción con la palabra "que comprende" las palabras "un" o "una" pueden representar uno o más de uno. Como se emplea en la presente "otro" puede representar por lo menos un segundo o más.
Las palabras "comprende/que comprende" y las palabras "que tiene/que incluye" cuando son usadas en la presente con referencia a la presente invención se emplean para especificar la presencia de características, enteros, etapas o componentes establecidos aunque no impide al presencia o adición de una o más características, enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos.
Cuadro 57 Formulaciones de [FGF21 ]-[1 er Ngador]-(Anticuerpo)-(2do-Ligador]-(Ex4] (ABC- 1 ) Cuadro 58 Apariencia y datos UV de [FGF21]-[1er ligador)-[Anticuerpo]-(2nd_L¡gador]-[Ex4) (ABC-1) Cuadro 62 Datos de bioactivldad (% relativo) de formulaciones liofilizadas seleccionadas de (FGF21]-[1er Ligador|-|Anticuerpo]-(2do. Ligador]-|Ex4) listadas en el Cuadro 6

Claims (35)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de la fórmula: [FGF21-1er Ligador]-[Ab]-[2nd_Ligador-Ex4]; en donde FGF21 es un homólogo FGF21; y Ex4 es un homólogo Exendin4; y Ab es un anticuerpo catalítico de aldolasa o porción de enlace de antígeno del mismo; y el 1er ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de proteína en FGF21 y a un sitio de combinación del anticuerpo, y el 2do ligador es fijado de manera covalente a la cadena lateral de un residuo de enlace de péptido en Ex4 y a un sitio de combinación del anticuerpo, y en donde el primer ligador y el segundo ligador son iguales o diferentes; o a una sal, solvato, estereoisómero o tautómero de los mismos..
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el 1er ligador es fijado de manera covalente al homólogo FGF21 a través de la cadena lateral de un residuo aminoácido de enlace de proteína ubicado en una de las posiciones 129, 125 o 79 de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 3.
3. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el homólogo FGF21 comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consta de NO ID SEC: 3, NO ID SEC: 4, NO ID SEC: 5, NO ID SEC: 6, NO ID SEC: 7, NO ID SEC: 8, NO ID SEC: 9, NO ID SEC: 10, NO ID SEC: 11 , NO ID SEC: 12, y NO ID SEC: 13.
4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula FGF21 comprende NO ID SEC: 8, NO ID SEC: 9, NO ID SEC: 10.
5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el 2do ligador es fijado de manera covalente al homólogo Exendin4 a través de la cadena lateral de un residuo amionoácido de enlace de péptido ubicado en una de las posiciones 12, 14, 19, 20, 21 o 40, de acuerdo con la numeración de NO ID SEC: 60.
6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el homólogo Exendin4 comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consta de NO ID SEC: 38, NO ID SEC: 48, NO ID SEC: 49, NO ID SEC: 50, NO ID SEC: 53, NO ID SEC: 55, 60, NO ID SEC: 61 , NO ID SEC: 62, NO ID SEC: 63, NO ID SEC: 64, NO ID SEC: 65, NO ID SEC: 66, NO ID SEC: 67, NO ID SEC: 68, NO ID SEC: 69, NO ID SEC :70, NO ID SEC: 71 , NO ID SEC: 72 y NO ID SEC: 77.
7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el homólogo de Exendin4 comprende un grupo de terminación de cadena terminal amino seleccionado a partir del grupo que comprende CH3, C(0)CH3, C(0)CH2CH3, C(0)CH2CH2CH3, y C(0)CH(CH3)CH3, y de preferencia C(0)CH3 y de manera opcional, compreende además um grupo de terminación de cadena terminal carbóxilo seleccionado a partir del grupo que consta de OH, NH2, NH(CH3), NHCH2CH3, NHCH2CH2CH3, NHCH(CH3)CH3, NHCH2CH2CH2CH3, NHCH(CH3)CH2CH3, NHC6H5, NHCH2CH2OCH3, NHOCH3, NHOCH2CH3, um grupo protector carboxi, um grupo de ácido graso lípido o um carbohidrato, y de preferencia NH2.
8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el homólogo Exendin4 comprende la secuencia NO ID SEC: 77.
9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el primero y/o segundo ligador comprende la formula X-Y-Z; en donde X es una cadena de conexión biológicamente compatible que incluye cualquier átomo seleccionado a partir del grupo que consta de C, H, N, O, P, S, F, Cl, Br, e I, y puede comprender un polímero o co-polímero de bloque, y es enlazado de manera covalente al residuo de enlace de péptido- o de proteína en donde el ligador es lineal, Y es un grupo de reconocimiento opcionalmente presente que comprende al menos una estructura de anillo; y Z es una porción de fijación que comprende un enlace covalente a una cadena lateral de aminoácido en un sitio de combinación del anticuerpo.
10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque Y tiene la estructura opcionalmente sustituida: en donde a, b, e, d, y e son de manera independiente carbono o nitrógeno; f es carbono, nitrógeno, oxígeno o azufre, y Y puede ser fenilo.
11. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-10, caracterizada porque Z tiene la fórmula cuando se une de manera covalente al anticuerpo y q= 1 o 2.
12. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que comprende la fórmula: en donde cada uno, de manera independiente de v-? y v2 es 1 o 2, cada uno independientemente de y t2 es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, cada uno, de manera independiente de yi e y2 es 0, 1 o 2; cada uno, de manera independiente de Si y s2 es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, y cada uno, de manera independiente de q-, y q2 es 1, 2, 3, 4, o 5, S— Ex4 denota un enlace covalente a través de un grupo tiol al residuo de enlace de péptido de Ex4, y S— FGF21 denota un enlace covalente a través de un grupo tiol al residuo de enlace de proteína de FGF21.
13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, que comprende la fórmula
14. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el anticuerpo es un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, scFv, VH, VL, diacuerpo, o minicuerpo, o es un anticuerpo de longitud completa, y de preferencia es seleccionado a partir del grupo que consta de I g G 1 , lgG2, lgG2Aa , lgG3, e lgG4, , lgG4Ab, lgG4Ac, lgG4 S228P, lgG4Ab S228P and lgG4Ac S228P.
15. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada uno del primero y segundo ligador son conjugados de manera covalente para el grupo e-amino de un residuo lisina de una de las cadenas pesadas del anticuerpo, la lisina que está ubicada en la posición 93 de la cadena pesada de acuerdo con la numeración Kabat.
16. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una VL CDR1, VL CDR2, y VL CDR3 de la secuencia VL mostrada en la NO ID SEC: 27; y una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una VH CDR1, VH CDR2, y VH CDR3 de la secuencia VH mostrada en el NO ID SEC: 28.
17. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende NO ID SEC: 25 y una cadena pesada que comprende NO ID SEC: 26.
18. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende la fórmula en donde cada uno del primero y segundo ligador está conectado de manera covalente a uno de los dos sitios de combinación de anticuerpo, y el anticuerpo comprende NO ID SEC: 25 y NO ID SEC: 26, y S— Ex4 denota un enlace covalente a través de un grupo tiol para K(SH) de NO ID SEC: 64, y S— FGF21 denota un enlace covalente a través de un grupo tiol para C 29 de NO ID SEC: 10.
19. Un proceso para preparar la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende (i) mezclar el homólogo FGF21 y el 1er ligador juntos a una relación de entre aproximadamente 1:4 y aproximadamente 1:1 para formar el complejo [FGF21-1er ligador]; (¡i) mezclar [FGF21-1er ligador] y Ab juntos a una relación de entre aproximadamente 1.1:1 y aproximadamente 1:5 para formar una mezcla que contiene [Ab], [Ab]-[FGF21 -1 er ligador]! y [Ab]-[FGF21-1er ligador]2; (iii) extraer las moléculas de [Ab]-[FGF21 -1 er ligador]! desde la mezcla formada en (ii); (iv) mezclar Ex4 y el 2do ligador juntos en una relación de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2, para formar el complejo [2do ligador-Ex4]; (v) mezclar [Ab]-[FGF2 -1 er ligador]! con [2do ligador-Ex4] a una relación de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2 para formar una mezcla que contiene [FGF21-1er ligador]!-[Ab]-[2do Mgador-Ex4]! .
20. El proceso de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque las moléculas [Ab]-[FGF21 -1 er ligador]i son extraídas a partir de la mezcla formada en (ii) por medio de cromatografía de fase inversa.
21. El proceso de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la cromatografía de fase inversa es sobre una columna de butilo.
22. El proceso de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado porque la columna de butilo comprende esferas de resina conjugada de butilo de entre aproximadamente 30 µ? y aproximadamente 40 µ de diámetro, las esferas que comprenden poros de entre aproximadamente 950A y 1050Á.
23. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22, caracterizado porque la especie [FGF21-1er I i g ad o r] i es extraída utilizando una solución reguladora que comprende un gradiente lineal de 1 ,6 hexandiol, en donde el gradiente lineal inicia a una concentración de 1 ,6 hexandilol de entre aproximadamente 2% y aproximadamente 3%, y termina a una concentración de 1 ,6, hexandiol de entre aproximadamente 6% y aproximadamente 5%
24. Un proceso para preparar la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1.18, que comprende (i) mezclar Ex4 y 2do ligador juntos en una relación de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1 :2, para formar el complejo [2do ligador-Ex4]; (ii) mezclar el [2do Mgador-Ex4] y Ab juntos en una relación de entre aproximadamente 1 :1 y aproximadamente 1 :3 para formar una mezcla que contiene [Ab], [Ab]-[2do Mgador-Ex4]1 y [Ab]-[2do ligador-Ex4]2; (iii) extraer las moléculas de [Ab]-[2do ligador-Ex4]i a partir de la mezcla formada en (¡i); (iv) mezclar FGF21 y el 1er ligador juntos en una relación de entre aproximadamente 1:4 y aproximadamente 1 :1 para formar el complejo [FGF21-1er ligador]; (v) mezclar [FGF21-1er ligador] con [Ab]-[2do ligador-Ex4]1 en una relación de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1 :2 para formar una mezcla que contiene [FGF21-1er ligador]1-[Ab]-[2do Mgador-Ex4] .
25. Una composición producida de acuerdo con un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-24.
26. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con cualquiera de las rei indicaciones 1-18 o la reivindicación 25, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
27. Una formulación que comprende entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 200mg/ml de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18 o 25, y que comprende además entre aproximadamente 1 y 150mM de ácido glutámico, pH entre aproximadamente 4.0 y aproximadamente 5.0; y por lo menos uno de los siguientes: (i) entre aproximadamente 10 hasta aproximadamente 150mg/ml de crioprotector; (ii) entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 1.0mg/ml de quelante; (iii) entre aproximadamente 0.02-2.0mg/ml_ de agente tensioactivo.
28. Una formulación adecuada para liofilizacion que comprende aproximadamente 30mg/ml_ de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18 y 25, y que comprende además: (i) aproximadamente 20mM de ácido glutámico, pH 4.5 ± 0.5; (ii) aproximadamente 8.5% de dihidrato de trehalosa; (iii) aproximadamente 0.005% dihidrato EDTA disódico; y (iv) aproximadamente 0.02% polisorbato 80.
29. Un método para tratar la diabetes, condiciones relacionadas con la diabetes, obesidad, dislipidemia, hipertensión, esteatosis hepática, o enfermedad cardiovascular; o controlar o reducir los niveles de peso; o controlar el control glícémico; o incrementar la secreción de insulina, o los niveles de ácidos grasos libres no-esterificados o adipsina; o reducción de los niveles de glucosa en sangre, glucagón, triglicérido, fructosamina, colesterol de baja densidad, o proteína C-reactiva; que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, 25 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, o la formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-28 a un sujeto.
30. Uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, o 25, la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, o la formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-28 en la preparación de un medicamento para tratar condiciones relacionadas con la diabetes, obesidad, dislipidemia, hipertensión, esteatosis hepática, o enfermedad cardiovascular; o controlar o reducir los niveles de peso; o controlar el control glicémico; o incrementar la secreción de insulina, o los niveles de ácidos grasos libres no esterificados; o reducir los niveles de glucosa en sangre, glucagón, triglicéridos, fructosamina, colesterol de baja densidad, o proteina C-reactiva .
31. Un método para evaluar la adecuación de paciente para un régimen de tratamiento para una condición, que comprende (i) medir los niveles de expresión génica de uno o más genes seleccionados a partir del grupo que consta de Abcd2, Acot3, Cidea, Cyp2b9, Cyp4a14, Fmo2, Gstm5, Hmgcrk, Klb, Lepr, Saa1/2, Scd1, y Srebf2 antes del tratamiento; (ii) medir los niveles de expresión de los genes medidos en la etapa (i) después de que el paciente ha sido tratado con la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18 o 25; la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, o la formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-28; (iii) comparar los niveles de expresión de génica a partir de las etapas (i) y (ii) e identificar los incrementos o decrementos en la expresión; (iv) continuar el tratamiento del paciente con un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19 o 26, la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 27, o la formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28-29; en base a un cambio en la expresión génica de uno o más genes seleccionados a partir del grupo que consta de Abcd2, Acot3, Cidea, Cyp2b9, Cyp4a14, Fmo2, Gstm5, Hmgcrk, Klb, Lepr, Saa1/2, Scd1 , y Srebf2.
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la continuación del tratamiento se basa en uno o más de un incremento en la expresión génica de Acot3 y una reducción en la expresión génica de Saa1/2.
33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-32, caracterizado porque la condición es seleccionada a partir del grupo que consta de obesidad, dislipidemia, hipertensión, esteatosis hepática, o enfermedad cardiovascular; o control o reducción de los niveles de peso; o control del control glicémico; o incremento de la secreción de insulina, o niveles de ácidos grasos libres no esterificados; o reducción de los niveles de glucosa en sangre, glucagón, triglicérido, fructosamina, colesterol de baja densidad, o proteína C-reactiva.
34. Un proceso para purificar una muestra de anticuerpo h38C2 o variante del mismo, en donde ambos sitios de enlace de antígeno están completamente disponibles para enlace de antígeno en al menos aproximadamente 85% de los anticuerpos en la muestra, que comprende: (iv) Equilibrar una columna HIC con un lavado de equilibrio de pre-carga que comprende una solución reguladora de base que comprende entre aproximadamente 15mM y aproximadamente 100mM de fosfato de sodio, fosfato de potasio o fosfato de amonio HEPES, Tris y bis-Tris, aproximadamente entre pH6.5 hasta aproximadamente 7.5, y que comprende además una sal seleccionada a partir del grupo que consta de NaCI, KCI, y citrato monosódico, a una primera concentración de entre aproximadamente 0.5M y 1.5M; en donde la columna HIC comprende esferas de resina conjugada de fenilo por debajo de aproximadamente 50pm de diámetro y que comprenden poros de al menos aproximadamente 500A; (v) Cargar la columna con una muestra de h38C2 entre aproximadamente 4 y aproximadamente 80g/L en solución reguladora de carga que comprende la solución reguladora de base y que comprende además la sal en la primera concentración; (vi) Lavar la columna con lavado de equilibrio de post-carga que comprende la solución reguladora de base y la sal a la primera concentración; ( ü) Lavar la columna con un gradiente de sal, que comprende la solución reguladora de base y comprende además un gradiente de concentración lineal desde aproximadamente 1.5 hasta aproximadamente 0.25M de la sal, caracterizada porque la concentración de sal se reduce entre aproximadamente 90mM y 100mM por 1CV; (viii) Lavar la columna con un lavado de plato de sal, que comprende entre aproximadamente 4CV y aproximadamente 8CV de la sal entre aproximadamente 0.25M y aproximadamente 0.4M en la solución reguladora de base; (ix) Lavar la columna con un lavado de solución reguladora que comprende la solución reguladora de base; (x) Eluir el h38C2 con una solución reguladora de elución, que comprende la solución reguladora de base y un gradiente de concentración lineal de 1,6 hexandiol que inicia a una concentración de entre aproximadamente 0 hasta aproximadamente 1% de 1,6 hexandiol y que termina en un límite superior seleccionado a partir del grupo que consta de aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21%, y 22% aproximadamente 0% hasta aproximadamente 22% de 1,6 hexandiol para entre aproximadamente 0.5CV hasta aproximadamente 3CV o hasta que se recolecta la combinación de elución. (x¡) De manera opcional operar una etapa de elución adicional que comprende la solución reguladora de base y 1,6 hexandiol a una concentración seleccionada a partir del grupo que consta de aproximadamente 13%, aproximadamente 14%, aproximadamente 15%, aproximadamente 16%, aproximadamente 17%, aproximadamente 18%, aproximadamente 19%, aproximadamente 20%, aproximadamente 21%, y 22% aproximadamente 0% hasta aproximadamente 22%, hasta para 5CV o hasta que se recolecte la combinación de elución; en donde el anticuerpo h38C2 o variante del mismo es un anticuerpo I g G 1 que comprende una región variable de cadena ligera (VL) como se establece en NO ID SEC: 27; y una región variable de cadena pesada (VH) como se establece en NO ID SEC. 28.
35. El proceso de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el anticuerpo comprende además una región constante de. cadena ligera al menos 95% idéntica a una o más de los NOs ID SEC: 78, 79, 80 y 81, y una región constante de cadena pesada al menos 95% idéntica al NO ID SEC: 82.
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