KR20130025375A - 만능 줄기 세포로부터 유래된 세포의 정제 방법 - Google Patents

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프란시스 카라뉴
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얀센 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 만능 줄기 세포를 분화시키는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 독특한 표면 마커를 사용하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화된 세포의 특성화 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 농축 또는 분류 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 형성되는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 오염시킬 수 있는 세포를 제거하여, 이에 의해 이식 후에 생체 내에서 종양 형성의 발생률을 감소시키는 방법을 제공한다.

Description

만능 줄기 세포로부터 유래된 세포의 정제 방법{METHODS FOR PURIFYING CELLS DERIVED FROM PLURIPOTENT STEM CELLS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 미국 가특허 출원 제61/309,193호 (출원일: 2010년 3월 1일)에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 만능 줄기 세포를 분화시키는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 독특한 표면 마커를 사용하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화된 세포의 특성화 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 농축 또는 분류 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 형성되는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 오염시킬 수 있는 세포를 제거하여, 이에 의해 이식 후에 생체 내에서 종양 형성의 발생을 감소시키는 방법을 제공한다.
만능 줄기 세포는 모든 신체 조직 및 기관을 비롯한 분화된 세포 유형을 생성할 가능성을 갖는다. 세포 치료법을 사용한 당뇨병의 치료는 인간 췌도세포와 유사하게 작용할 수 있는 다수의 세포의 생성에 의해 가능하게 된다. 따라서, 만능 줄기 세포로부터 유래되는 이들 세포를 생성하는 것뿐 아니라, 이러한 세포의 신뢰성있는 정제 방법이 필요하다.
만능 줄기 세포 및 만능 줄기 세포로부터 유래된 세포 집단에서 관찰되는 단백질 및 기타 세포 표면 마커는 이들 집단의 분리 및 단리를 위한 시약을 제조하는데 유용하다. 또한, 세포 표면 마커는 이들 세포의 추가의 특성화에 유용하다.
일 예에서, 제W02009131568호에는 a) 창자 내배엽 세포를 포함하는 만능 줄기 세포로부터 유래된 세포의 집단을 창자 내배엽 세포 상에서 발현되는 세포 표면 마커에 결합하는 리간드에 노출시키는 단계로서, 상기 세포 표면 마커가 CD49e, CD99, CD165 및 CD334로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및 b) 리간드에 결합하지 않는 만능 줄기 세포로부터 유래된 세포로부터 창자 내배엽 세포를 분리하여, 이에 의해, 상기 창자 내배엽 세포를 정제하는 단계를 포함하는, 창자 내배엽 세포의 정제 방법이 개시되어 있다.
다른 예에서, 제W02010000415호에는 지방세포, 연골세포 및 췌장 분화능을 갖는 줄기 세포의 단리를 위한, CD56에 결합하는 항체 또는 항체의 작용성 단편과 병용한, 또는 단독의, 항원 TNAP에 결합하는 항체, 또는 항체의 작용성 단편의 용도가 개시되어 있다.
다른 예에서, 제US7371576호에는 인슐린 생성 세포 또는 인슐린 생성 세포 응집체로 분화하는 경향이 높은 췌장 줄기 세포의 독특한 서브셋의 선택을 가능하게 하는 선택적 세포 표면 마커의 발견이 개시되어 있다.
다른 예에서, 제US7585672호에는 내배엽 및 췌장 계통의 세포에 대하여 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 배양물을 농축시키는 방법이 개시되어 있으며, 이 방법은 (a) 인간 배아 줄기 세포의 무손상 콜로니를 배양하여, 내장 난황낭 (visceral yolk sac, VYS) 세포에 의해 둘러싸인 전체 무손상 배상체 (embryoid body)를 형성하는 단계로서, 인간 배아 줄기 세포가 Oct-4, 표면 단계-특이적 배아 항원-3/4 (SSEA 3/4) 및 상피 세포 부착 분자 (EpCAM)를 발현하는 것인 단계; (b) 단계 (a)의 배상체를 배상체 세포가 내배엽 및 췌장 계통의 세포를 함유하는 세포 집단으로 분화되게 하는 조건 하에서 배양하는 단계; (c) 단계 (b)의 세포 집단을 단일 세포로 분산시키는 단계; (d) SSEA 3/4 양성 세포의 발현에 대하여 선택하여, 미분화된 세포를 단계 (c)의 세포로부터 제거하는 단계; (e) SSEA-1 양성 세포의 발현에 대하여 선택하여, VYS 세포를 단계 (d)의 남아있는 세포로부터 제거하는 단계; 및 (f) EpCAM 양성 세포의 발현에 대하여 단계 (e)의 남아있는 세포 중에서 선택하여, 내배엽 및 췌장 계통의 세포에 대하여 농축시키는 단계를 포함한다.
제US7585672호에는 또한 내배엽 및 췌장 계통의 세포에 대하여 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 배양물을 농축시키는 방법이 개시되어 있으며, 이 방법은 (a) 인간 배아 줄기 세포의 무손상 콜로니를 배양하여, 내장 난황낭 (VYS) 세포에 의해 둘러싸인 전체 무손상 배상체를 형성하는 단계로서, 인간 배아 줄기 세포가 Oct-4, 표면 단계-특이적 배아 항원-3/4 (SSEA 3/4) 및 상피 세포 부착 분자 (EpCAM)를 발현하는 것인 단계; (b) 단계 (a)의 배상체를 배상체 세포가 내배엽 및 췌장 계통의 세포를 함유하는 세포 집단으로 분화되게 하는 조건 하에서 배양하는 단계; (c) 단계 (b)의 세포 집단을 유효량의 섬유아세포 성장 인자 10 (FGF10)으로 처리하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 세포 집단을 내배엽 및 췌장 계통의 세포에 대하여 농축된 단일 세포로 분산시키는 단계; (e) SSEA-3/4 양성 세포의 발현에 대하여 선택하여, 단계 (d)의 세포로부터 미분화 줄기 세포를 제거하는 단계; (f) SSEA-1 양성 세포의 발현에 대하여 선택하여, VYS 세포를 단계 (e)의 세포로부터 제거하는 단계; 및 (g) EpCAM 양성 세포의 발현에 대하여 단계 (f)의 남아있는 세포 중에서 선택하여, 내배엽 및 췌장 계통의 세포에 대해 농축시키는 단계를 포함한다.
또한, 제US7585672호는 종양형성능을 갖지 않는 줄기 세포 유래의 세포 집단의 생성을 위한 농축 방법을 개시하고 있으며, 상기 방법은 (a) 인간 배아 줄기 세포의 무손상 콜로니를 배양하여, 내장 난황낭 (VYS) 세포에 의해 둘러싸인 전체 무손상 배상체를 형성하는 단계로서, 인간 배아 줄기 세포가 Oct-4, 표면 단계-특이적 배아 항원-3/4 (SSEA 3/4) 및 상피 세포 부착 분자 (EpCAM)를 발현하는 것인 단계; (b) 단계 (a)의 배상체를 배상체 세포가 내배엽 및 췌장 계통의 세포를 함유하는 세포 집단으로 분화되게 하는 조건 하에서 배양하는 단계; (c) 단계 (b)의 세포 집단을 단일 세포로 분산시키는 단계; (d) SSEA 3/4 양성 세포의 발현에 대하여 선택하여, 미분화된 세포를 단계 (c)의 세포로부터 제거하는 단계; (e) SSEA-1 양성 세포의 발현에 대하여 선택하여, VYS 세포를 단계 (d)의 세포로부터 제거하는 단계; 및 (f) EpCAM 양성 세포의 발현을 위하여 단계 (e)의 남아있는 세포 중에서 선택하는 단계로서, 생성된 세포가 면역약화된 마우스에 주입시 기형종을 형성하지 않는 것인 단계를 포함한다.
다른 예에서, 제US20050260749호는 줄기 세포로부터 유래된 배양물을 내배엽 및 췌장 계통의 세포에 대해 농축시키는 방법을 개시하고 있으며, 상기 방법은 줄기 세포를 배상체의 형성으로 배양하는 단계; 및 종의 적절한 세포 표면 단계-특이적 배아의 발현을 위하여 배상체 중에서 선택하고, 내배엽 및 췌장 세포로의 분화를 위하여 세포 표면 단계-특이적 항원을 발현하지 않는 배상체 만을 배양하는 단계를 포함한다.
다른 예에서, 제US20100003749호는 단리된 췌장 줄기 세포 집단을 개시하고 있으며, 여기서, 췌장 줄기 세포 집단은 CD133+CD49f+ 췌장 줄기 세포에 대하여 농축한다.
제US20100003749호는 추가로 췌장 세포, 췌장-유래 세포 또는 위장-유래 세포의 집단으로부터 CD133+, CD49f+ 또는 CD133+CD49f+인 세포를 선택하는 단계; CD15+인 세포를 제거하는 단계로서, 남아있는 세포가 CD15-인 단계; 남아있는 세포를 하나 이상의 성장 인자를 함유하는 무-혈청 배양 배지로 도입하는 단계; 및 남아있는 세포를 배양 배지에서 증식시키는 단계에 의하여 발생하는 일차 췌장 조직으로부터의 췌장 줄기 세포의 단리를 개시하고 있다.
다른 예에서, 도렐 (Dorrell) 등은 "본 발명자들은 인간 췌장의 모든 주요 세포 유형의 단리 및 연구를 위한 세포-표면 마커의 신규한 패널을 개발하였다. 하이브리도마는 무손상 또는 해리된 인간 췌도세포를 사용한 Balb/C 마우스의 감산 면역화 (subtractive immunization) 후에 선택하고, 면역조직화학 및 유세포분석에 의하여 세포-유형 특이성 및 세포-표면 반응성에 대하여 평가하였다. 항체를 췌도세포 (범내분비 (panendocrine) 또는 비특이적) 및 비췌도 세포 서브셋 (외분비 및 관) 상의 표면 항원의 특이적인 결합에 의해 확인하였다. 이들 항체를 개별적으로 또는 조합하여 사용하여, FACS에 의해 주요 인간 췌장으로부터 α, β, 외분비 또는 관세포의 집단을 단리하고, 인간 췌도세포 제제의 상세한 세포 조성을 특성화하였다. 또한, 이들을 사용하여 인간 췌도세포 증식 배양이 비내분비 세포로부터 유래되며, 전사 인자 Pdx-1 및 ngn3의 과발현 및 하위집단 분류에 의하여 인슐린 발현 수준이 정상 췌도 세포의 최대 1%까지 증가할 수 있는 것이 보였으며, 이는 이러한 배양 시스템을 사용한 이전의 결과에 대한 향상이다. 이들 방법은 세포 치료법에 대한 가능성이 있는, 작용이 상이한 췌장 세포 집단의 분석 및 단리를 가능하게 한다."고 기재하였다 (문헌[Stem Cell Research, Volume 1, Issue 3, September 2008, Pages 155-156]).
다른 예에서, 스기야마 (Sugiyama) 등은 "본 발명자들은 결국에는 마우스로부터 NGN3+ 세포를 정제하는데 유용한 CD133 및 CD49f로 지칭되는 2개의 항원을 확인하였다. CD133 (프로미닌-1로도 지칭)은 알려져 있는 조혈 선구세포 (progenitor) 및 신경 줄기 세포의 마커, 및 기능이 알려져 있지 않은 막관통 단백질이다. CD49f는 또한 α6-인테그린으로 지칭되며 라미닌에 대한 수용체 서브유닛이다. CD133 및 CD49f를 인식하는 항체를 조합함으로써, 본 발명자들은 4가지 상이한 췌장 세포 집단을 분별하였다. 면역염색 및 RT-PCR에 의해, CD49fhigh CD133+ 세포 집단 ('분획 I', 투입량의 50%)이 주로 CarbA를 발현하는 분화된 외분비 세포로 이루어져 있음이 드러났다. CD49flow CD133- 분획 ('분획 III', 투입량의 10%)은 인슐린 및 글루카곤과 같은 내분비 생성물을 발현하는 호르몬+ 세포를 포함한다. 대조적으로, CD49flow CD133+ 분획 ('분획 II'로 지칭됨, 투입량의 13%)은 NGN3+ 세포를 함유하였으나, 호르몬+ 세포를 함유하지 않았다. 대략 8%의 분획 II 세포는 면역염색가능한 NGN3을 생성하였다. CD49f- CD133- 분획 ('분획 IV', 투입량의 25%)에서, 본 발명자들은 NGN3, CarbA 또는 췌도세포 호르몬을 발현하는 세포를 검출하지 않았다"고 기재하였다 (문헌[Diabetes, Obesity and Metabolism, Volume 10, Issue s4, Pages 179-185]).
다른 예에서, 푸지카와 (Fujikawa) 등은 "CD45-TER119-side-scatterlow GFPhigh 세포를 분류하는 경우, 높은 성장 능력을 갖는 α-태아 단백질-양성 비성숙 내배엽-특성화된 세포가 이러한 집단에 존재하였다. 클론 분석 및 전자 현미경 평가에 의하여, 이러한 집단의 각각의 단일 세포가 간세포뿐 아니라 담관 상피 세포로 분화할 수 있음이 드러났으며, 이는 이들의 담관계통 (bilineage) 분화 활성을 나타낸다. 표면 마커를 분석하는 경우, 이들은 인테그린-α6 및 -β1에 대하여 양성이나 c-Kit 및 Thy1.1에 대해서는 음성이었다"고 기재하였다 (문헌[Journal of Hepatlogy, Vol 39, pages 162-170]).
다른 예에서, 자오 (Zhao) 등은 "이러한 연구에서, 본 발명자들은 먼저, hES 세포 유도체로부터의 정제를 위한 간 내배엽 세포의 표면 마커로서 N-카드헤린을 확인하였으며, 뮤린 배아 기질 피더 (stromal feeder, STO) 세포와의 공동배양에 의하여, 정제된 간 내배엽 세포로부터 간 선구세포를 생성하였다. 이들 간 선구세포는 100일 초과의 기간 동안 증식하고 계대될 수 있다. 흥미롭게도, 이들은 조기 간 마커 AFP 및 담관 계통 마커 KRT7을 공동발현하였으며, 이는 이들이 간세포 및 담관세포 둘 모두의 공통 선조 (ancestor)임을 시사한다. 더욱이 이들 선구세포는 유전자 발현 및 기능 분석 둘 모두에 의해 입증된 바와 같이 여전히 간세포-유사 세포 및 담관세포-유사 세포로의 이중분화능을 유지하면서 광범위하게 증식할 수 있었다. 따라서, 이러한 작업은 간 발생을 연구하기 위한 새로운 시험관 내 모델뿐 아니라, 간 선구세포에 기초한 세포 치료법을 위한 새로운 공급원을 제공한다"고 기재하였다 (문헌[PLoS ONE 4(7): e6468. doi: 10.1371/joumal.pone. 0006468]).
다른 예에서, 카이 (Cai) 등은 "PDX1+ 세포 순도를 추가로 증가시키기 위하여, 본 발명자들은 Es 세포-유래의 내배엽 세포에 대한 마커인, CXCR4 등을 사용하여, 액틴 A-유도된 세포를 분류하였다. CXCR4를 사용한 분류에 의하여, 내배엽 세포 집단이 농축되었는데, 이는 CXCR4+ 집단에서의 거의 모든 세포가 내배엽 세포 마커 SOX17에 대하여 양성이고, 90% 초과의 세포가 FOXA2에 대하여 양성이었기 때문이다"고 기재하였다(문헌[Journal of Molecular Cell Biology Advance Access originally published online on November 12, 2009. Journal of Molecular Cell Biology 2010 2(1):50-60; doi:10.1093/jmcb/mjp037]).
다른 예에서, 코블라스 (Koblas) 등은 "본 발명자들은 인간 CD133-양성 췌장 세포의 집단이 뉴로게닌-3을 발현하는 내분비 선구세포, 및 인간 텔로머라제, ABCG2, Oct-3/4, 나노그 (Nanog) 및 Rex-1, 만능 줄기 세포의 마커를 발현하는 세포를 함유하는 것을 관찰하였다. 이들 세포는 시험관 내에서 인슐린-생성 세포로 분화할 수 있었으며, 글루코스-의존적 방식으로 C-펩티드를 분비하였다. 본 발명자들의 결과에 기초하여, 본 발명자들은 CD133 분자가 췌장 내분비 선구세포의 확인 및 단리에 적합한 다른 세포 표면 마커를 나타냄을 제안하였다"고 기재하였다 (문헌[ Transplant Proc . 2008 Mar;40(2):415-8]).
다른 예에서, 스기야마 등은 "본 발명자들은 CD133이 NGN3+ 세포에 의해 발현되는 것을 관찰하였다. CD133은 췌장 도관 상피 세포의 첨단막 (apical membrane)에 국소화되는 것으로 보인다"고 기재하였다 (문헌[PNAS 2007 104:175-180]; 게재 전 온라인에 공개 2006년 12월 26일, doi:10.1073/pnas.0609490104).
다른 예에서, 코바야시 (Kobayashi) 등은 "배아 췌장 상피 및 이후의 도관 상피는 발생 중인 췌장의 내분비 및 외분비 세포를 야기하는 것으로 알려져 있으나, 이들 세포에 대한 특이적인 표면 마커가 확인되지 않았다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 마우스 췌장의 발생에서 이들 상피 세포의 특이적 마커로서 돌리코스 비플로러스 아글루티닌 (Dolichos Biflorus Agglutinin, DBA)을 사용하였다. 플루오레세인 (fluorescein)-DBA 및 췌장 특이적 세포 마커를 사용하는 면역형광 연구의 결과로부터, 본 발명자들은 DBA가 상피를 특이적으로 검출하였으나, 분화 중인 내분비 세포 또는 선포세포 중 어느 것도 검출하지 않음을 관찰하였다. 본 발명자들은 추가로 이러한 마커를 면역자성 분리 시스템 (다이나비드 시스템 (Dynabead system))에 적용하여, 혼합된 발생 중인 췌장 세포 집단으로부터 이들 추정의 다능 세포를 정제하였다. 이러한 절차는 발생 중인 췌장에서 분화 및 세포 계통 선택을 연구하기 위해 적용할 수 있으며, 또한 유력한 세포 엔지니어링을 위하여 췌장 전구 세포를 선택하는 것에 적용가능할 수 있다"고 기재하였다 (문헌[Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 293, Issue 2, 3 May 2002, Pages 691-697]).
만능 줄기 세포로부터 유래된 세포에 의해 발현되는 마커의 확인에 의해, 이들 세포의 이해가 확대될 것이며, 생체 내 및 시험관 내에서 이들의 확인에 도움이 될 수 있고, 시험관 내에서 연구 및 용도를 위한 이들의 양성의 농축을 가능하게 할 것이다. 따라서, 만능 줄기 세포로부터 유래된 세포, 특히, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 단리하고 특성화하는데 유용한 도구가 여전히 필요하다.
일 실시형태에서, 본 발명은 만능 줄기 세포의 집단을 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 방법을 제공하며, 이는 하기의 단계를 포함한다:
a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
d. 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계, 및
e. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단으로 분화시키는 단계.
일 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 동물에 이식하며, 여기서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 인슐린 생성 세포를 형성한다. 일 실시형태에서, 인슐린 생성 세포의 형성의 효능은 이식 전에 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 대하여 집단을 농축시킴으로써 증가된다.
일 실시형태에서, 인슐린 생성 세포의 형성의 효능은 이식 후에 C-펩티드의 발현이 검출가능한 수준에 도달하기 위하여 걸리는 시간을 측정함으로써 결정한다.
대안적인 실시형태에서, 농축은 이식 후에, 기형종을 생성하는 이식된 세포의 능력을 감소시킨다.
<도 1>
도 1은 실시간 PCR로 검출시 CD56+CD13-, CD56-CD13- 및 CD56-CD13+ 세포의 집단에서의 NEUROD (패널 a), NGN3 (패널 b), PDX1 (패널 c), NKX6.1 (패널 d), NKX2.2 (패널 e) 및 PAX4 (패널 f)의 발현을 보여준다. 발현 배수를 미분화 H1 배아 줄기 세포에 비해 나타내었다.
<도 2>
도 2는 CD133에 대한 항체를 사용하여 분류한 세포의 집단에서, 실시간 PCR을 통해 검출시, NEUROD (패널 a), NGN3 (패널 b), PDX1 (패널 c), NKX6.1 (패널 d), NKX2.2 (패널 e) 및 PAX4 (패널 f)의 발현을 보여준다. 발현 배수를 미분화 H1 배아 줄기 세포에 비해 나타내었다.
<도 3>
도 3은 CD49c에 대한 항체를 사용하여 분류된 세포의 집단에서, 실시간 PCR을 통해 검출시, NEUROD (패널 a), NGN3 (패널 b), PDX1 (패널 c) 및 NKX6.1 (패널 d)의 발현을 보여준다. 발현 배수를 미분화 H1 배아 줄기 세포에 비하여 나타내었다.
<도 4>
도 4는 CD56 및 CD15에 대한 항체를 사용하여 분류되는 세포의 집단에서 실시간 PCR을 통해 검출시, NEUROD (패널 a), NGN3 (패널 b), PDX1 (패널 c), NKX6.1 (패널 d), 인슐린 (패널 e) 및 글루카곤 (패널 f)의 발현을 보여주었다. 발현 배수를 미분화 H1 배아 줄기 세포에 비하여 나타내었다.
<도 5>
도 5는 CD15에 대한 항체를 사용하여 분류된 세포의 집단에서 실시간 PCR을 통해 검출시, NEUROD (패널 a), NGN3 (패널 b), PDX1 (패널 c), NKX6.1 (패널 d), NKX2.2 (패널 e), PAX-4 (패널 f), 글루카곤 (패널 g) 및 인슐린 (패널 h)의 발현을 보여준다. 발현 배수를 미분화 H1 배아 줄기 세포에 비하여 나타내었다.
<도 6>
도 6은 CD56 및 CD57에 대한 항체를 사용하여 분류된 세포의 집단에서 실시간 PCR을 통해 검출시, NEUROD (패널 a), NGN3 (패널 b), PDX1 (패널 c), NKX6.1 (패널 d), NKX2.2 (패널 e), 인슐린 (패널 f) 및 글루카곤 (패널 g)의 발현을 보여준다. 발현 배수를 미분화 H1 배아 줄기 세포에 비해 나타내었다.
<도 7>
도 7은 CD56 및 CD184에 대한 항체를 사용하여 분류된 세포의 집단에서 실시간 PCR을 통해 검출시, ZIC1 (패널 a), 알부민 (패널 b), CDX2 (패널 c), NGN3 (패널 d), PAX4 (패널 e), NEUROD (패널 f), NKX6.1 (패널 g), PTF1 알파 (패널 h) 및 PDX1 (패널 i)의 발현을 보여준다. 발현 배수를 미분화 H1 배아 줄기 세포에 비해 나타내었다.
<도 8>
도 8은 CD98에 대한 항체를 사용하여 분류된 세포의 집단에서 실시간 PCR을 통해 검출시, NEUROD (패널 a), NGN3 (패널 b), 인슐린 (패널 c) 및 글루카곤 (패널 d)의 발현을 보여준다. 발현 배수를 미분화 H1 배아 줄기 세포에 비해 나타내었다.
<도 9>
도 9는 CD47에 대한 항체를 사용하여 분류된 세포의 집단에서 실시간 PCR을 통해 검출시, NEUROD (패널 a), NGN3 (패널 b), PDX1 (패널 c), NKX6.1 (패널 d), NKX2.2 (패널 e) 및 PAX4 (패널 f)의 발현을 보여준다. 발현 배수를 미분화 H1 배아 줄기 세포에 비해 나타내었다.
<도 10>
도 10은 CD47에 대한 항체를 사용하여 분류된 세포의 집단에서, 실시간 PCR을 통해 검출시, PDX-1 (패널 a), NKX6.1 (패널 b), NKX2.2 (패널 c), PAX-4 (패널 d), PTF1a (패널 e), NGN3 (패널 f), 인슐린 (패널 g) 및 글루카곤 (패널 h)의 발현을 보여준다. 발현 배수를 미분화 H1 배아 줄기 세포에 비해 나타내었다.
<도 11>
도 11은 LIF 수용체에 대한 항체를 사용하여 분류된 세포의 집단에서, 실시간 PCR을 통해 검출시, HNF4 알파 (패널 a) 및 LIF 수용체 (패널 b)의 발현을 보여준다. 발현 배수를 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 II의 2일에서의 분류되지 않은 세포에 비해 나타내었다.
<도 12>
도 12는 자성 비드를 사용하여 SSEA4를 발현하는 세포가 제거된 세포의 집단에서, 실시간 PCR을 통해 검출시, OCT4 (패널 a), 나노그 (패널 b), SOX2 (패널 c) 및 구스코이드 (goosecoid) (패널 d)의 발현을 보여준다. 발현 배수를 미분화 H1 배아 줄기 세포에 비해 나타내었다.
<도 13>
도 13은 FACS를 사용하여 SSEA4를 발현하는 세포가 제거된 세포의 집단에서, 실시간 PCR을 통해 검출시, OCT4 (패널 a), 나노그 (패널 b), SOX2 (패널 c) 및 구스코이드 (패널 d)의 발현을 보여준다. 발현 배수를 미분화 H1 배아 줄기 세포에 비해 나타내었다.
개시내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정 특징, 실시형태 또는 출원을 기술 또는 예시하는 하기 부문으로 구분된다.
정의
"β-세포 계통"은 전사 인자 PDX-1 및 하기 전사 인자들 중 적어도 하나에 대해 양성 유전자 발현을 갖는 세포를 말한다: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF-3 베타, MAFA, PAX4 및 PAX6. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX17, GATA4, HNF-3 베타, GSC, CER1, 노달 (Nodal), FGF8, 브라키어리 (Brachyury), 믹스-유사 호메오박스 (Mix-like homeobox) 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민 (eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CD184, C-Kit, CD99 또는 0TX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
"원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: HNF-1 베타 또는 HNF-4 알파.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX1, HNF-1 베타, PTF-1 알파, HNF6 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 또는 PTF-1 알파. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "완성 내배엽"은 낭배형성동안 배반엽상층으로부터 생기는 세포의 특징을 보유하며 위장관 및 그 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다:
CD184, HNF-3 베타, GATA4, SOX17, 세르베루스 (Cerberus), OTX2, 구스코이드, c-Kit, CD99 및 Mixl1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커에 대해서는 수준 증가 및 음성 마커에 대해서는 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 수준은 다른 세포에 비하여 관심있는 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 관심있는 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되고 구별될 수 있게 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 세포" 또는 "췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전-원시선 세포 (pre-primitive streak cell)"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 노달 또는 FGF8.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질 또는 FGF4.
줄기 세포는 단일 세포 수준에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 선구 세포, 비재생 선구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포 (progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직을 발생시키며, 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 능력에 의해 분류된다: (i) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (ii) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (iii) 세포 계통의 서브셋이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 서브셋이 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성 (예를 들어, 조혈 줄기 세포 (hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC (자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성 (oligopotent) 선구세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소 (예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (iv) 다능 줄기 세포보다 더 제한된 서브셋의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (v) 단일 세포 계통 (예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은 ("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된 (committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 정상 환경 하에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 서브셋으로 계속 분화할 것이며 정상 환경 하에서 상이한 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화 (dedifferentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된 (또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
다양한 용어를 사용하여 배양 중인 세포를 기재한다. "유지"는 일반적으로 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 성장 배지에 세포를 두는 것을 말하며, 이는 보다 큰 세포 집단으로 이어지거나 이어지지 않을 수 있다. "계대"는 세포를 하나의 배양 용기로부터 제거하고, 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 이들을 제2 배양 용기에 두는 과정을 말한다.
세포의 특정 집단, 또는 세포주는 때로는 그가 계대된 횟수를 말하거나 또는 상기 횟수에 의해 특성화된다. 예를 들어, 10회 계대된 배양된 세포 집단은 P10 배양물로서 지칭될 수 있다. 일차 배양, 즉, 조직으로부터 세포의 단리 후의 첫번째 배양물을 P0으로 명명한다. 첫번째 계대배양 (subculture) 후에, 세포를 2차 배양물로 기재한다 (P1 또는 계대 1). 두 번째의 계대배양 후, 세포는 3차 배양물 (P2 또는 계대 2)이 되며, 기타 등등이다. 당업자라면 계대 기간 동안 많은 집단의 배가가 있을 수 있으며; 따라서 배양물의 집단 배가 수는 계대 수보다 크다는 것을 이해할 것이다. 계대 사이의 기간 동안 세포의 증식 (즉, 집단 배가 수)은 접종 밀도, 기질, 배지, 성장 조건, 및 계대 사이의 시간을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 인자에 의존적이다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 농축
일 실시형태에서, 본 발명은 만능 줄기 세포의 집단을 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 방법을 제공하며, 이는 하기의 단계를 포함한다:
a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
d. 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계, 및
e. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단으로 분화시키는 단계.
일 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 동물에 이식하며, 여기서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 인슐린 생성 세포를 형성한다. 일 실시형태에서, 인슐린 생성 세포의 형성의 효능은 이식 전에 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 대하여 집단을 농축시킴으로써 증가된다.
일 실시형태에서, 인슐린 생성 세포의 형성의 효능은 이식 후에 C-펩티드의 발현이 검출가능한 수준에 도달하기 위하여 걸리는 시간을 측정함으로써 결정한다.
대안적인 실시형태에서, 농축은 이식 후에, 기형종을 형성하는 이식된 세포의 능력을 감소시킨다.
췌장 내분비 계통의 마커를 발현하는 세포는 세포의 표면 상에서 관찰되는 항원이 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 시약에 결합함을 통하여 확인하거나 선택한다.
대안적인 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 동물 내로의 이식 전에, 인슐린 생성 세포로 추가로 분화된다. 인슐린 생성 세포는 세포의 표면 상에서 관찰되는 항원이 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 시약에 결합함을 통하여 확인하거나 선택한다.
대안적인 실시형태에서, 본 발명은 만능 줄기 세포의 집단을 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 방법을 제공하며, 이는 하기의 단계를 포함한다:
a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
d. 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 농축시키는 단계,
e. 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계, 및
f. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단으로 분화시키는 단계.
일 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 동물에 이식하며, 여기서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 인슐린 생성 세포를 형성한다. 일 실시형태에서, 인슐린 생성 세포의 형성의 효능은 이식 전에 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 농축시킴으로써 증가된다.
원시 창자관 계통의 마커를 발현하는 세포는 세포의 표면 상에서 관찰되는 항원이 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 시약에 결합함을 통하여 확인하고 선택한다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 농축을 용이하게 하는 표면 항원
일 실시형태에서, 동물로의 이식 전에, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 CD9, CD13, CD15, CD47, CD56, CD73, CD117, CD133, CD184, CD200, CD318, CD326 및 SSEA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커에 결합할 수 있는 적어도 하나의 시약으로 처리한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 시약으로의 처리는 마커 CD56의 발현에 대하여 양성이며, 마커 CD13의 발현에 대하여 음성인 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 야기한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 시약으로의 처리는 마커 CD56의 발현에 대하여 양성이며, 마커 CD15의 발현에 대하여 음성인 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 야기한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 시약으로의 처리는 마커 CD133의 발현에 대하여 음성인 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 야기한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 시약으로의 처리는 마커 CD15의 발현에 대하여 음성인 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 야기한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 시약으로의 처리는 마커 CD184의 발현에 대하여 양성인 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 야기한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 시약으로의 처리는 마커 SSEA4의 발현에 대하여 음성인 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 야기한다.
인슐린 생성 세포의 농축을 용이하게 하는 표면 항원
일 실시형태에서, 동물 내로의 이식 전에, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 인슐린 생성 세포의 집단으로 추가로 분화된다. 인슐린 생성 세포의 집단은 CD47, CD56, CD57 CD98 및 SSEA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커에 결합할 수 있는 적어도 하나의 시약으로 처리한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 시약으로의 처리는 마커 CD56 및 CD57의 발현에 대하여 양성인 인슐린 생성 세포의 집단을 야기한다. 대안적으로, 인슐린 생성 세포의 집단은 CD98의 발현에 대하여 양성일 수 있다. 대안적으로, 인슐린 생성 세포의 집단은 CD47의 발현에 대하여 음성일 수 있다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 시약으로의 처리는 마커 SSEA4의 발현에 대하여 음성인 인슐린 생성 세포의 집단을 야기한다.
CD13은 대부분의 말초 혈액 단핵구 및 과립구 상에서 발현된다. 또한, 이는 대부분의 급성 골수성 백혈병, 골수 모구성 발증에서의 만성 골수성 백혈병, 더 적은 백분율의 림프구 백혈병 및 골수 세포주에 의해 발현된다. 또한, CD13은 섬유아세포 및 내피 세포와 같은 일부 유형의 비조혈 세포에서 관찰되며, 혈장에서 용해성 형태로 관찰된다. CD13은 B 세포, T 세포, 혈소판 또는 적혈구에서 발현되지 않는다. CD13은 생물학적 활성 펩티드 물질대사, 성장 및 분화의 조절, 식세포작용 및 살균성/항종양 (tumoricidal) 활성에서 역할을 수행한다. 또한, CD13은 인간 코로나바이러스 (HCV)에 대한 수용체로 소용된다.
CD15는 당단백질, 당지질 및 프로테오글리칸 상에서 발현될 수 있는 탄수화물 부착 분자이다. CD15는 호중구 상에서 관찰되는 식작용 및 화학주성을 매개하며; 호지킨병, 일부 Β-세포 만성 림프구 백혈병, 급성 림프모구 백혈병 및 대부분의 급성 비림프구 백혈병이 있는 환자에서 발현된다. 이는 또한 루이스 (Lewis) x 및 SSEA-1 (단계 특이적 배아 항원 1)로 지칭되며, 뮤린 만능 줄기 세포에 대한 마커를 나타내고, 여기서, 이는 착상전 배아 내의 세포의 부착 및 이동에 중요한 역할을 수행한다.
CD47은 막 단백질이며, 이는 세포외 매트릭스로의 세포 부착 시에 발생하는 세포내 칼슘 농도의 증가에 수반된다. 또한, 단백질은 트롬보스폰딘의 C-말단 세포 결합 도메인에 대한 수용체이며, 이는 막 수송 및 신호 전달에서 역할을 수행할 수 있다.
신경 세포 부착 분자 (Neural Cell Adhesion Molecule, NCAM)로도 알려져 있는 CD56은 신경, 아교, 골격근 및 자연 살해 세포의 표면 상에서 발현되는 동종친화성 (homophilic) 결합 당단백질이다. NCAM은 세포-세포 부착, 신경돌기 생장, 시냅스 가소성 및 교육 및 기억에서 역할을 갖는 것으로 나타났다.
HNK-1 또는 Leu-7로도 알려져 있는 CD57은 특정 세포 유형의 세포외 단백질 상에서 검출되는 항원 올리고당류 부분이다. 혈액에서, CD57은 NK 및 T 세포의 서브셋을 포함하는 단핵 세포의 15 내지 20%에서 관찰되지만, 적혈구, 단핵구, 과립구 또는 혈소판에서는 그렇지 않다. 또한, CD57 발현은 다양한 신경 세포 유형 상에서 관찰될 수 있다.
CD98은 대형 중성 아미노산 수송체 (LAT1)의 경 (light) 서브유닛을 포함하는 당단백질이다. LATl는 중성 분지형 (발린, 류신, 아이소류신) 및 방향족 (트립토판, 티로신) 아미노산을 우선적으로 수송하는 헤테로다이머 막 수송 단백질이다.
CD133은 프로미닌 (Prominin) 1 (PROM1)로서 인간 및 설치류에서도 알려져 있는 당단백질이다. 이는 세포 돌기에 특이적으로 국소화되는 펜타스팬 (pentaspan) 막관통 당단백질 (5-막관통, 5-TM)의 구성원이다. CD133은 조혈 줄기 세포, 내피 선구세포, 교모세포종, 신경 및 아교 줄기 세포에서 발현한다. 문헌[Corbeil et al, Biochem Biophys Res Commun 285 (4): 939-44, 2001. doi:10.1006/bbrc.2001.5271. PMID 11467842]을 참조한다.
원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 농축을 용이하게 하는 표면 항원
대안적인 실시형태에서, 본 발명은 만능 줄기 세포의 집단을 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 방법을 제공하며, 이는 하기의 단계를 포함한다:
a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
d. 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 농축시키는 단계,
e. 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계, 및
f. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단으로 분화시키는 단계.
일 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 동물 내로 이식하며, 여기서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 인슐린 생성 세포를 형성한다. 일 실시형태에서, 인슐린 생성 세포의 형성의 효능은 이식 전에 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 농축시킴으로써 증가된다.
원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 LIF 수용체에 결합할 수 있는 적어도 하나의 시약으로 처리한다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포, 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포, 또는 인슐린 생성 세포는 실시예에 추가로 기재된 바와 같이 농축, 제거, 단리, 분리, 분류 및/또는 정제할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "농축된" 또는 "정제된" 또는 다른 알려져 있는 세포 집단의 제거에 기인하여 농축되거나 정제된은 세포를 일부 선택 과정으로 처리하여, 집단이 농축되고/거나 정제되게 하는 것을 나타낸다. 또한, 대상체 세포는 상대적으로 농축되고/거나 정제되는 것으로도 고려되며, 즉, 다른 세포 집단에 비하여, 또는 "농축" 또는 "정제" 전의 만능 줄기 세포에 비하여, 또는 원래 또는 초기 세포 배양물에 비하여, 특정 분화된 세포 집단이 유의미하게 더 많이 존재한다.
주어진 분화된 세포 유형의 농축 또는 정제는 다른 세포 유형으로부터 하나 이상의 공지되어 있는 세포 유형을 "제거하는 것" 또는 "분리하는 것" 또는 "분류하는 것"을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 세포의 집단을 원치않는 분화된 세포 유형을 제거함으로써 정제할 수 있다. 공지되어 있거나 공지되지 않은 세포 유형의 배양물을 제거함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 농축하고 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방식으로, 농축되거나 정제된 세포 집단은 결합되거나 부착된 항체를 갖지 않을 것이다. 정제된 집단으로부터 항체를 제거할 필요가 없기 때문에, 세포 치료법을 위한 농축되거나 정제된 세포의 사용이 개선될 수 있다.
농축, 제거, 단리, 분리, 분류 및/또는 정제 방법은 예를 들어, 선택적 배양 조건을 포함할 수 있으며, 여기서, 배양 조건은 임의의 원치않는 세포 유형에 유해하다.
농축, 제거, 단리, 분리, 분류 및/또는 정제 방법은 또한, 예를 들어, 항체-코팅된 자성 비드, 친화성 크로마토그래피 및 고체 매트릭스 또는 고체상 포획 수단, 예컨대 플레이트, 컬럼에 부착된 항체를 사용한 "패닝 (panning)" 또는 다른 편리하고 이용가능한 기술을 포함할 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 기술은 유세포분석 방법을 포함하며, 이는 세포 표면 및 세포내 파라미터뿐 아니라, 형상 변화 및 입도를 측정하는데 유용하며, 항체- 또는 프로브-결합 시약으로 사용되는 비드의 분석에 유용하다. 유세포분석으로부터의 판독은 개별 형광 항체-검출된 세포 표면 분자 또는 사이토카인과 관련된 평균 형광, 또는 평균 형광 세기, 중간 형광 세기, 형광 세기의 변이 또는 이들 간의 일부 관계를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
유세포분석을 포함하는 분석 단계를 사용하는 실시형태의 일부 태양에서, 비드의 특징 또는 최소 파라미터는 스캐터 (FS 및/또는 SS) 및 적어도 하나의 형광 파장이다. 유세포분석을 사용하여 파라미터, 예컨대 세포 표면 단백질의 존재 또는 그의 입체구조 또는 번역후 변형; 세포내 또는 분비된 단백질을 정량화할 수 있으며, 여기서, 투과성은 항체 (또는 프로브) 접근 등을 가능하게 한다. 유세포분석 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 하기에 기재되어 있다: 문헌[Flow Cytometry and Cell Storing (Springer Lab Manual), Radbruch, Ed., Springer Verlag, 2000]; 문헌[Ormerod, Flow Cytometry, Springer Verlag, 1999]; 문헌[Flow Cytometry Protocols (Methods in Molecular Biology , No 91), Jaroszeski and Heller, Eds., Humana Press, 1998]; 문헌[Current Protocols in Cytometry, Robinson et al., eds, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2000].
세포의 염색 세기는 유세포분석에 의해 모니터링할 수 있으며, 여기서, 레이저는 정량적 수준의 형광색소를 검출한다(이는 특이적 시약, 예컨대 항체에 결합된 세포 표면 마커의 양에 비례함). 또한, 유세포분석 또는 FACS를 사용하여 특이적 시약에 대한 결합의 세기뿐 아니라 세포 크기 및 광산란과 같은 다른 파라미터에 기초하여 세포 집단을 분리할 수 있다. 절대 염색 수준이 특정 형광색소 및 시약 제제에 따라 상이할 수 있지만, 데이터를 대조군에 대하여 정규화시킬 수 있다.
분포를 대조군에 대하여 정규화시키기 위하여, 각각의 세포를 특정 염색 세기를 갖는 데이터 점으로 기록한다.
분포를 대조군에 대하여 정규화시키기 위하여, 각각의 세포를 특정 염색 세기를 갖는 데이터 점으로 기록한다. 이들 데이터점은 로그 스케일(log scale)에 따라 나타낼 수 있으며, 여기서 측정의 단위는 임의적인 염색 세기이다. 일 예에서, 집단 내의 가장 밝은 세포는 가장 낮은 염색의 수준을 갖는 세포보다 4 로그 만큼 더 강한 것으로 지정한다. 이러한 방식으로 나타내는 경우, 가장 높은 로그의 염색 세기에 속하는 세포가 밝은 것인 한편, 가장 낮은 세기에서의 것이 음성인 것이 명백하다. 2 내지 3 로그의 염색 세기에 속하는 "저" 염색 세포는 음성 및 양성 세포와는 독특한 특성을 가질 수 있다. 대안적인 대조군은 그의 표면, 예컨대 제작된 비드 또는 세포주 상에 정의된 밀도의 마커를 갖는 기재를 사용할 수 있으며, 이는 세기에 대한 양성의 대조군을 제공한다. 명칭 "저"는 염색의 수준이 아이소형 매치된 대조군의 밝기를 초과하는 것을 나타내나, 집단에서 통상 관찰되는 가장 밝게 염색되는 세포만큼 강하지는 않다.
선택된 파라미터의 판독치는 동시에, 또는 예컨대, 세포 표면 분자에 대한 형광 항체의 사용을 통해서와 같이, 단일의 분석 동안에 순차적으로 판독할 수 있다. 일 예로서, 이들은 상이한 형광색소, 형광 비드, 태그, 예컨대 양자점 등으로 태그화되어, 유세포분석에 의하여 동시에 최대 4개 이상의 형광 색상의 분석을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 명칭 음성은 염색의 수준이 아이소형 매치된 음성 대조군의 밝기이거나 그 미만인 것을 나타내는 한편; 명칭 딤 (dim)은 염색의 수준이 음성 스트레인(strain)의 수준 근처에 있을 수 있으나, 아이소형 매치된 대조군보다 더 밝을 수 있음을 나타낸다.
개별 세포, 예컨대 상이한 세포 유형 또는 세포 유형 변이형의 식별자는 예컨대, 본 명세서에서 상술된 바와 같은 상이한 수준의 형광 화합물 등을 사용한 상이한 단위 세포 유형의 표지와 같이, 형광일 수 있다. 2개의 세포 유형을 혼합하는 실시형태의 일부 태양에서, 한 세포 유형은 표지하며, 다른 세포 유형은 표지하지 않는다. 셋 이상의 세포 유형이 포함되는 실시형태의 일부 태양에서, 각 세포 수준은 상이한 농도의 표지 화합물 또는 상이한 시간 동안의 인큐베이션에 의하여 상이한 수준의 형광으로 표지될 수 있다. 다수의 세포의 식별자로서, 둘 이상의 상이한 형광 색상의 형광 표지 세기의 매트릭스를 사용하여, 확인되는 별개 단위 세포 유형의 개수가 하나의 색, 예컨대 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE)의 형광 수준의 개수 곱하기 제2 색, 예컨대 테트라메틸로다민 아이소티오시아네이트(TRITC) 등의 사용되는 형광 수준의 개수 곱하기 제3 색의 수준의 개수 등등이게 할 수 있다. 대안적으로, 상이한 세포 유형의 고유광 산란 특성, 또는 분석에 포함되는 시험 파라미터의 BioMAP의 특징을 단위 세포 유형 식별자로서 형광 표지에 더하여, 또는 이것 대신에 사용할 수 있다.
다른 태양에서, 세포를 통상의 친화성 또는 항체 기법을 사용하여 농축, 제거, 분리, 분류 및/또는 정제할 수 있다. 예를 들어, 리간드 및/또는 항체를 표지, 예컨대 자성 비드; 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 대하여 높은 친화성으로 결합하는 비오틴; 형광 활성화된 세포 분류기로 사용될 수 있는 형광색소; 합텐 등과 컨쥬게이트시켜, 특정 세포 유형의 분리가 용이하게 할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 리간드, 제제 및/또는 항체를 자성 시약, 예컨대 초상자성 마이크로입자 (마이크로입자)에 직접적으로 또는 간접적으로 컨쥬게이트시킬 수 있다. 자성 입자로의 직접적인 컨쥬게이션은 해당 분야에 알려져 있는 바와 같은 다양한 화학적 연결기의 사용에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 헤테로작용성 가교결합 시약 및 측쇄 아미노 또는 설프하이드릴기를 통하여 마이크로입자에 커플링된다.
다수의 헤테로작용성 화합물이 엔티티 (entity)에 대한 결합에 이용가능하다. 예를 들어, 항체 상에 반응성 설프하이드릴기를 가지며, 자성 입자 상에 반응성 아미노기를 갖는 적어도, 3-(2-피리딜다이티오)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스테르 (SPDP) 또는 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실산 N-하이드록시석신이미드 에스테르 (SMCC)를 사용할 수 있다. 자성 분리 장치의 일 예는 본 명세서에 그 전체가 참고로 포함되는 제WO 90/07380호, 제PCT/US96/00953호 및 제EP 438,520호에 기재되어 있다.
정제된 세포 집단은 임의의 적절한 배지에 수집할 수 있다. 적합한 배지는 예컨대 종종 우태아혈청 (FCS), 소 혈청 알부민 (BSA), 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 스템프로(등록상표)hESC SFM이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium, dMEM), 행크 기본 염 용액 (Hank's Basic Salt Solution, HBSS), 둘베코 인산염 완충된 염수 (Dulbecco's phosphate buffered saline, dPBS), RPMI, 이스코브 변형 둘베코 배지 (Iscove's modified Dulbecco's medium, IMDM), 5 mM EDTA가 있는 인산염 완충 염수 (PBS) 등을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하지 않는 세포를 선택하는 적어도 하나의 제제로의 처리에 의하여 농축한다. 대안적인 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 인슐린-생성 세포를 선택하는 적어도 하나의 제제로의 처리에 의하여 농축한다.
본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, 세포 집단 또는 세포 배양물은 미처리 세포 집단 또는 세포 배양물에 비하여 적어도 약 2 내지 약 1000배 세포 함유량이 농축될 수 있다. 일부 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 미처리 세포 집단 또는 세포 배양물에 비하여 적어도 약 5배 내지 약 500배 농축될 수 있다. 다른 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 미처리 세포 집단 또는 세포 배양물에 비하여 적어도 약 10배 내지 약 200배 농축될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 미처리 세포 집단 또는 세포 배양물에 비하여 적어도 약 20배 내지 약 100배 농축될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 미처리 세포 집단 또는 세포 배양물에 비하여 적어도 약 40배 내지 약 80배 농축될 수 있다. 특정 실시형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 미처리 세포 집단 또는 세포 배양물에 비하여 적어도 약 2배 내지 약 20배 농축될 수 있다.
만능 줄기 세포로부터 유래된 세포의 특성화
만능 줄기 세포로부터 분화된 세포의 형성은 주어진 분화된 세포 유형의 특징적인 마커의 발현을 결정함으로써 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분화된 세포의 확인 및 특성화는 특정 마커의 발현 또는 1개 초과의 마커의 상이한 발현 수준 및 패턴에 의해서 이루어진다.
구체적으로, 하나 이상의 마커 (들)의 존재 또는 부재, 고발현 또는 저발현은 세포 유형에 전형적이며, 이에 의해 세포 유형을 확인할 수 있다. 또한, 특정 마커는 일시적인 발현을 가질 수 있으며, 이에 의하여, 마커는 하나의 발생 단계 동안 고도로 발현되며, 다른 발생 단계에서는 불충분하게 발현된다. 특정 마커의 발현은 세포 배양 또는 세포 집단의 세포에 마커가 존재하는 수준을 표준화되거나 정규화된 대조군 마커에 비해 측정함으로써 결정할 수 있다. 이러한 과정에서, 마커 발현의 측정은 정성적이거나 정량적일 수 있다. 마커 유전자에 의해 생성되는 마커의 발현을 정량화하는 한 방법은 정량적 PCR (Q-PCR)의 사용을 통해 이루어진다. Q-PCR을 수행하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한, 당업계에 알려져 있는 다른 방법을 사용하여 마커 유전자 발현을 정량화할 수 있다. 예를 들어, 마커 유전자 생성물의 발현은 대상 마커 유전자 생성물에 특이적인 항체를 사용하여 검출할 수 있다 (예컨대, 웨스턴 블롯, 유세포분석 등). 특정 실시형태에서, 분화된 세포의 특징적인 마커 유전자의 발현뿐 아니라 분화된 세포의 특징적인 마커 유전자의 유의미한 발현의 결여를 결정할 수 있다.
또한, 조직-특이적 유전자 생성물의 발현을 표준 증폭 방법에서 노던 블롯 분석, 돗트-블롯 혼성화 분석, 또는 서열-특이적 프라이머를 사용하는 역전사효소 개시된 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 mRNA 수준에서 검출할 수 있다. 추가의 상세사항에 대해서는 미국 특허 제5,843,780호를 참조한다. 이러한 개시내용에 열거된 특정 마커에 대한 서열 데이터는 진뱅크 (GenBank)와 같은 공개 데이터베이터로부터 수득할 수 있다.
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원 (SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra 1-60, 및 Tra 1-81 발현 (존재한다면)의 소실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼리성 포스파타제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈 (Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드 (Vector Red)를 이용하여 발현시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, OCT4 및 TERT를 발현한다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 PDX1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민 (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CD184, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 및 PTF-1 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1 및 하기의 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 베타, MAFA, PAX4 및 PAX6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
만능 줄기 세포
만능 줄기 세포의 특성화
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원 (SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson et al ., Science 282:1145 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60 및 Tra-1-81 발현 (존재한다면)의 소실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼리성 포스파타제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈)가 설명한 바와 같이 기질로서 벡터 레드를 이용하여 발현시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 다능성 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출시 Oct-4 및 TERT를 발현한다.
증식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 마우스 내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배상체를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배상체를 평가함으로써 결정할 수 있다.
증식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 전-배아(pre-embryonic) 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 그러나 전형적으로 약 10-12주 임신 전일 필요는 없는 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후 형성된 조직으로부터 유래된 만능 세포의 확립된 주를 포함한다. 비-제한적 예는 구축된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아 생식 세포주 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7 및 H9 (와이쎌 (WiCell))이다. 이러한 세포의 초기 확립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 만능 세포일 것이다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단과, 영양 세포의 존재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BGOlv (BresaGen (Athens, GA))가 또한 적합하다. 성인 체세포로부터 유래된 세포, 예를 들어 문헌[Takahashi et al, Cell 131: 1-12 (2007)]에 개시된 세포가 또한 적합하다.
일 실시형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨 (Thomson) 등 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; 문헌[Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995])에 개시된 바와 같이 제조된다.
체세포로부터 유래된 만능 줄기 세포가 또한 고려된다. 일 실시형태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 문헌[Takahashi et al (Cell 126: 663-676, 2006)]에 기재된 방법에 따라 유도할 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 문헌[Li et al (Cell Stem Cell 4: 16-19,2009)]에 기재된 방법에 따라 유도할 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 문헌[Maherali et al (Cell Stem Cell 1: 55-70,2007)]에 기재된 방법에 따라 유도할 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 문헌[Stadtfeld et al (Cell Stem Cell 2: 230-240)]에 기재된 방법에 따라 유도할 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 문헌[Nakagawa et al (Nature Biotechnology 26: 101-106, 2008)]에 기재된 방법에 따라 유도할 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 문헌[Takahashi et al (Cell 131: 861-872,2007)]에 기재된 방법에 따라 유도할 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 센토코 알앤디 인코포레이티드 (Centocor R&D, Inc.)에 양도된 미국 특허 출원 제61/256,149호에 기재된 방법에 따라 유도할 수 있다.
만능 줄기 세포의 배양
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 본 발명의 방법에 따른 배양 이전에 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 세포외 매트릭스 단백질 또는 영양 세포의 층 상에서 배양된다. 예를 들어, 만능 줄기 세포는 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 영양 세포 층 상에서 배양된다. 분화 없이 영양 세포 층 상에서의 만능 줄기 세포의 성장은 (i) 영양 세포 층을 포함하는 배양 용기를 얻는 것; 및 (ii) 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지, 또는 비-조절 배지, 예를 들어, 무혈청 배지 또는 심지어 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
다른 예에서, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양 세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 (i) 하나 이상의 세포외 매트릭스 단백질을 갖는 고형 기재 표면 상의 흡착층; 및 (ii) 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지, 또는 비-조절 배지, 예를 들어, 무혈청 배지 또는 심지어 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
대안적인 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 적어도 약 0.5% N, 17.2% 이상의 O와 N의 합계 및 적어도 약 13.9도의 접촉각을 갖는 표면 개질 플레이트 상에서, 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지, 또는 비-조절 배지, 예를 들어, 무혈청 배지 또는 심지어 화학적 규명 배지에서 배양된다.
배양 배지: 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 일 예는 미국 특허 출원 공개 제20020072117호에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 제6642048호에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 국제 특허 공개 제WO2005014799호에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 문헌[Xu et al, (Stem Cells 22: 972-980, 2004)]에서 찾을 수 있다 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 출원 공개 제20070010011호에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 문헌[Cheon et al . (BioReprod DOI: 10.1095/biolreprod. 105.046870; 19 Oct 2005)]에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 문헌[Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006)]에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 출원 공개 제20050148070호에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 출원 공개 제20050233446호에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 제6800480호에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예는 미국 특허 출원 공개 제20050244962호에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예를 국제 특허 공개 제W02005065354호에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 배지의 다른 예를 국제 특허 공개 제W02005086845호에서 찾을 수 있다.
또한, 적합한 배양 배지는 하기의 성분, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 집코 (Gibco) 번호 11965-092; 낙아웃 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 집코 번호 10829-018; 햄 (Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 집코 번호 15039-027; 비필수 아미노산 용액, 집코 11140-050; β-머캅토에탄올, 시그마 (Sigma) 번호 M7522; 인간 재조합 기본 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 집코 번호 13256029로부터 제조할 수 있다.
만능 줄기 세포의 분화
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 배양에서 증식되며, 이어서 다른 세포 유형으로의 그들의 분화를 촉진하는 방식으로 처리한다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여 형성되는 만능 줄기 세포는 제W02007030870호에 개시된 방법에 따라 신경 선구세포 또는 심근세포로 분화될 수 있다.
다른 예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포는 미국 특허 제6,458,589호에 개시된 방법에 따라 간세포로 분화될 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포의 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화
본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al , Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al , Development 131, 1651 - 1662 (2004)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al , Stem Cells 25, 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al , Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
다른 예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포는 라이프스캔, 인코포레이티드 (LifeScan, Inc.)에 양도된 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
다른 예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포는 라이프스캔, 인코포레이티드에 양도된 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
다른 예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포는 라이프스캔, 인코포레이티드에 양도된 미국 특허 출원 제12/493,741호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
다른 예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포는 라이프스캔, 인코포레이티드에 양도된 미국 특허 출원 제12/494,789호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성은 특정 프로토콜을 이행하기 전후에 마커의 존재에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다. 만능 줄기 세포는 전형적으로 그러한 마커를 발현하지 않는다. 따라서, 만능 세포의 분화는 세포가 그들을 발현하기 시작할 때 검출된다.
본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포의 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화
본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D' Amour et al , Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 (hedgehog) 신호전달 경로 억제제 KAAD-사이클로파민으로 처리한 다음, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지를 제거하고, 이어서, 세포를 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지에서 배양하는 것에 의하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시되어 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득된 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 라이프스캔 인코포레이티드에 양도된 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 및 하나의 섬유아세포 성장 인자로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 (미국 미주리주 소재의 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)) 및 엑센딘 (exendin) 4로 처리한 다음, DAPT (미국 미주리주 소재의 시그마-알드리치) 및 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 이어서 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 세포를 배양하는 것에 의하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시되어 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득된 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology , 2006]에 개시되어 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 DAPT (미국 미주리주 소재의 시그마-알드리치) 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology , 2006]에 개시되어 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시되어 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔, 인코포레이티드에 양도된 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 노치 신호전달 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔, 인코포레이티드에 양도된 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 노치 신호전달 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔, 인코포레이티드에 양도된 미국 특허 출원 제60/953,178호에 개시된 방법에 따라 노치 신호전달 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔, 인코포레이티드에 양도된 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 노치 신호전달 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포의 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화
본 발명의 방법을 사용하여 형성된 만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득된 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology , 2006]에 개시되어 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 DAPT (미국 미주리주 소재의 시그마-알드리치) 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology , 2006]에 개시되어 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시되어 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔, 인코포레이티드에 양도된 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 노치 신호전달 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔, 인코포레이티드에 양도된 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 노치 신호전달 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔, 인코포레이티드에 양도된 미국 특허 출원 제60/953,178호에 개시된 방법에 따라 노치 신호전달 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔, 인코포레이티드에 양도된 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 노치 신호전달 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이에 의해 제한되지는 않는다.
실시예
실시예 1
우태아혈청의 부재 하에서의 세포주 H1의 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
다양한 계대수 (p40 내지 p52)의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔 (MATRIGEL) (1:30 희석) 코팅된 접시 상에서 배양하고, 후술되는 바와 같은 다단계 프로토콜을 사용하여 췌장 계통으로 분화시켰다:
a. 단계 I (완성 내배엽): 인간 배아 줄기 세포를 1일 동안 2% 지방산이 없는 BSA (카달로그 번호 68700, 미국 루이지애나주 소재의 프롤리언트 (Proliant)) 및 100 ng/ml 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈 (R&D Systems))에 더하여 20 ng/ml WNT-3a (카달로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 더하여, 8 ng/ml의 bFGF (카달로그 번호 100-18B, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크 (PeproTech))가 보충된 RPMI 배지에서 배양. 그 다음, 세포를 추가 2일 동안 2% BSA 및100 ng/ml 액티빈 A에 더하여 8 ng/ml의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 처리, 이어서
b. 단계 II (원시 창자관): 세포를 2 내지 3일 동안 RPMI + 2% 지방산이 없는 BSA 및 50 ng/ml FGF7 및 0.25 μΜ SANT-1 (#S4572, 미국 미주리주 소재의 시그마)로 처리, 이어서
c. 단계 III (후기 앞창자): 세포를 4일 동안 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐 (Invitrogen))의 1:200 희석액 및 0.1% BSA (리피드 리치 (Lipid Rich)) (인비트로겐 카달로그 번호 11021-045), 50ng/ml FGF7, 0.25 μΜ SANT-1, 2 μΜ 레틴산 (RA) (미국 미주리주 소재의 시그마), 100 ng/ml의 노긴 (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) 및 20 ng/ml의 액티빈 A가 보충된 DMEM/고글루코스로 처리; 특정 변형에서, 노긴은 2 μΜ의 농도에서 AMPK 억제제 6-[4-(2-피페리딘-1-일에톡시)페닐]-3-피리딘-4-일피라졸로[1,5-a]피리미딘 (시그마 번호 P5499)으로 대체. 또 다른 변형에서, P38 억제제 (4-[4-(4-플루오로페닐)-1-(3-페닐프로필)-5-피리딘-4-일-1H-이미다졸-2-일]부트-3-인-1-올) (미국 특허 제6,521655호에 기재되어 있음)을 2.5 μΜ로 첨가, 이어서
d. 단계 IV (췌장 내분비 전구체): 세포를 3일 동안 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석액 및 0.1% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 100 ng/ml 노긴, 1 μΜ ALK5 억제제 (SD-208, 문헌[Molecular Pharmacology 2007 72:152-161]에 개시되어 있음)가 보충된 DMEM/고글루코스로 처리, 이어서
e. 단계 V (췌장 내분비 세포): 세포를 7일 동안 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석액, 0.1% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 1 μΜ ALK5 억제제 II (카달로그 번호 616452, 미국 캘리포니아주 소재의 칼바이오켐 (Calbiochem))가 보충된 DMEM/고-글루코스로 처리, 이어서
f. 단계 VI (성숙 췌장 내분비 세포): 세포를 7일 동안 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 의 1:200 희석액, 0.1% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)가 보충된 DMEM/고-글루코스로 처리하면서, 격일로 배지를 교환.
실시예 2
농축된 다양한 췌장 세포 계통의 유세포분석 특성화 및 분류
실시예 1에 약술된 분화 과정의 다양한 단계를 형성하는 신규한 세포 집단의 단리 및 특성화를 용이하게 하기 위하여, 다양한 단계로부터 수득한 세포의 상세한 특성화를 유세포분석으로 행하였다. 다양한 분화 단계의 표면 마커의 발현 수준 및 사용되는 항체의 완전한 목록은 표 I에 나타나 있다.
다양한 계대수 (p40 내지 p52)의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔-코팅된 플레이트 상에서 배양하였으며, 실시예 1에 기재된 프로토콜을 사용하여 췌장 내분비 세포로 분화시켰다.
다양한 성숙 단계의 세포 (후기 앞창자 (단계 III), 내분비 전구 세포 (단계 IV), 췌장 내분비 세포 (단계 V) 또는 성숙 췌장 내분비 세포 (단계 VI))는 37℃에서 2 내지 3분 동안 TrypLE 익스프레스 (Express) (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐 번호 12604) 중에서의 인큐베이션에 의하여, 온건하게 분리시켰으며, 2% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 BD 번호 554657)를 함유하는 BD FACS 염색 완충액에 2회 세정하였다. 대략 0.5-1x106개 세포를 100-200 ㎕의 블로킹 완충액 (염색을 위한 염색 완충액 (미국 캘리포니아주 소재의 BD) 중에 1:4로 희석한 0.5% 인간 감마-글로불린)에서 재현탁화시켰다. 직접 컨쥬게이트된 일차 항체를 사용한 염색을 위하여, 적절한 항체를 1:20의 최종 희석으로 세포에 첨가하고, 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 비컨쥬게이트된 항체를 위하여, 일차 항체를 1:50 내지 1:100 희석으로 세포에 첨가하고, 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 염색 완충액에서 2회 세정하였다. 그 다음, 세포를 1:500 희석으로 적절한 2차 항체 중에서 인큐베이션시켰다. 염색된 세포를 BD FACS 칸토 (Canto) II 상에서의 분석 전에, 300 ㎕ 염색 완충액, 및 생/사 세포 판별을 위해 첨가하는 5-10 ㎕의 7AAD 중에 재현탁화시켰다.
세포 분류를 위하여, 대략 3천만 내지 4천만개 세포를 유세포 분석에서와 유사하게 처리하였다. 세포를 표 II에 나타낸 바와 같은 적절한 항체로 염색하였다. 세포를 표 II에 약술된 바와 같이 2개 또는 3개의 하위-집단 중 어느 하나로 분류하였다. 세포 분류 게이트 (gate)를 아이소형 매치된 대조군에 기초하여 확립하였다. 분류된 세포의 분취물을 분류에 이어서 주요 췌장 마커의 발현을 위한 PCR 분석 후에, 순도에 대하여 분석하였다. RNA를 알엔이지 미니 키트 (Rneasy Mini Kit) (미국 캘리포니아주 소재의 퀴아젠 (Qiagen))를 사용하여 수집하고, 사전분류된 샘플 및 다양한 분획으로부터 수집하였다.
분류를 위해 사용되는 세포 표면 마커를 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 다양한 단계에서 분석한 세포의 집단에서의 다양한 마커의 발현에 기초하여 선택하였다. 본 연구에 사용되는 마커를 표 II에 개시하였다. 간단하게, 표 II에 개시된 표면 마커는 다양한 세포의 집단을 분류하기 위하여 단일로 또는 조합하여 사용하였다. 분류된 세포의 샘플을 취하여, 리얼-타임 (real-time) PCR에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현을 분석하였다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 분류
CD56 및 CD13에 대한 항체를 사용하여, 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 IV로부터 수득한 세포의 집단을 분류하였다. 3개의 세포의 집단을 확인하였다: a) CD56+CD13-, b) CD56-CD13- 및 c) CD56-CD13+ 세포 집단. CD56+CD13- 집단을 분류 후에 대략 1.3배 농축하고, 분류된 세포를 단계 IV 또는 CD56-CD13- 세포 집단 또는 CD56-CD13+ 세포 집단에서의 미분류된 세포에 비하여, NEUROD, NGN3, PDX1, NKX6.1, NKX2.2 및 PAX-4를 비롯한 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대해 고도로 농축시켰다. 도 1, 패널 a 내지 f를 참조한다.
두번째 시리즈의 실험에서, CD133에 대한 항체를 사용하여, 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 IV로부터 수득한 세포의 집단을 분류하였다. 2개의 세포 집단을 확인하였다: a) CD133+ 및 b) CD133- 세포 집단. CD133- 집단을 분류 후에 대략 1.9배 농축하고, 분류된 세포는 단계 IV의 미분류 세포 또는 CD133+ 집단 세포에 비하여, NEUROD, NGN3, PDX1, NKX6.1, NKX2.2 및 PAX-4를 비롯한 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대해 고도로 농축시켰다. 도 2, 패널 a 내지 f를 참조한다.
세번째 시리즈의 실험에서, CD49c에 대한 항체를 사용하여 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 IV로부터 수득한 세포의 집단을 분류하였다. 2개의 세포 집단을 확인하였다: a) CD49cHI 및 b) CD49cLO 세포 집단. CD49cLO 세포를 분류 후에 대략 3.1배 농축하고, 분류된 세포를 미분류 세포 또는 CD49cHI 세포에 비하여, NEUROD, NGN3, PDX1 및 NKX6.1을 비롯한 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대해 고도로 농축시켰다. 도 3, 패널 a 내지 d를 참조한다.
네번째 시리즈의 실험에서, CD56 및 CD15에 대한 항체를 사용하여, 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 IV로부터 수득한 세포의 집단을 분류하였다. 하기의 세포 집단을 확인하였다: a) CD56+CD15LO, b) CD56+CD15HI, c) CD15+ 및 d) CD15- 세포 집단. CD15- 세포 집단을 분류 후에 대략 1.1배 농축시켰다. CD56+CD15lo 세포의 집단을 미분류 세포 또는 CD56+CD15hi 세포 집단에 비하여, NEUROD, NGN3, PDX1, NKX6.1, 인슐린 및 글루카곤을 비롯한 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대해 고도로 농축시켰다. 도 4, 패널 a 내지 f를 참조한다. 유사하게, 단일 마커를 사용하여 분류된 CD15- 세포의 집단을 미분류 세포 또는 CD15+ 세포 집단에 비하여, NEUROD, NGN3, PDX1, NKX6.1, NKX2.2, PAX-4, 글루카곤 및 인슐린 세포를 비롯한 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대하여 고도로 농축시켰다. 도 5, 패널 a 내지 h를 참조한다.
다섯번째 시리즈의 실험에서, CD56 및 CD57에 대한 항체를 사용하여, 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 IV로부터 수득한 세포의 집단을 분류하였다. 2개의 세포 집단을 확인하였다: a) CD56+CD57+ 및 b) CD56+CD57- 세포 집단. CD56+CD57+ 세포 집단을 분류 후에 대략 1.9배 농축시켰다. CD56+CD57+ 세포를 미분류 세포 또는 CD56+CD57- 세포 집단에 비하여, NEUROD, NGN3, PDX1, NKX6.1, NKX2.2뿐 아니라, 인슐린 및 글루카곤을 비롯한 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커의 발현에 대하여 고도로 농축시켰다. 도 6, 패널 a 내지 g를 참조한다. 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 V의 세포의 집단을 CD56 및 CD57에 대한 항체를 사용하여 분류하는 경우 유사한 결과를 수득하였다.
여섯번째 시리즈의 실험에서, CD56 및 CD184에 대한 항체를 사용하여 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 IV로부터 수득한 세포의 집단을 분류하였다. 3개의 세포의 집단을 확인하였다: a) CD184+, b) CD184- 및 c) CD56+CD184- 세포 집단. 표 IV는 농축 전과 후에, 세포에서의 CD184의 발현을 요약한 것이다. CD184+ 세포의 집단을 PAX4, NEUROD, NKX6.1, PDX1 및 PTF1 알파를 비롯한 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대하여 농축하였다. ZIC1, 알부민 및 CDX2의 발현이 감소되었다. 도 7, 패널 a 내지 i를 참조한다.
인슐린 생성 세포의 분류
CD98에 대한 항체를 사용하여, 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 VI로부터 수득한 세포의 집단을 분류하였다. 2개의 세포 집단을 확인하였다: a) CD98+(Hi) 및 b) CD98-( Lo ) 세포 집단. CD98+( Hi ) 세포 집단을 분류 후에 대략 1.6배 농축시켰다. CD98+( Hi ) 세포를 NEUROD, NGN3, 인슐린 및 글루카곤의 발현에 대하여 농축시켰다.
도 8, 패널 a 내지 d를 참조한다.
다른 시리즈의 실험에서, CD47에 대한 항체를 사용하여, 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 V로부터 수득한 세포의 집단을 분류하였다. 2개의 세포 집단을 확인하였다: a) CD47Hi(+) 및 b) CD47Lo(-) 세포 집단. CD47Lo(-) 세포를 분류 후에 대략 3.3배 농축시켰다. CD47Lo(-) 세포를 NEUROD, NGN3, PDX I, NKX6.1, NKX2.2 및 PAX4의 발현에 대하여 농축시켰다. 도 9, 패널 a 내지 f를 참조한다.
다른 시리즈의 실험에서, CD47에 대한 항체를 사용하여, 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 VI로부터 수득한 세포의 집단을 분류하였다. 2개의 세포 집단을 확인하였다: a) CD47Hi(+) 및 b) CD47Lo(-) 세포 집단. CD47Lo(-) 세포를 PDX-1, NKX6.1, NKX2.2, PAX-4, PTF1a, NGN3, 인슐린 및 글루카곤의 발현에 대하여 농축시켰다. 도 10, 패널 a 내지 h를 참조한다.
실시예 3
원시 창자관 단계 (단계 2)에서의 Lif 수용체 양성 세포의 분류
계대수 44에서 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔 코팅된 플레이트 상에서 배양하고, 하기 프로토콜을 이용하여 인슐린 생성 세포로 분화시켰다:
a. 1일 동안 2% 지방산이 없는 BSA (카탈로그 번호 68700, 미국 루이지애나주 소재의 프롤리언트) 및 100 ng/ml 액티빈-A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 더하여 20 ng/ml WNT-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 더하여 8 ng/ml의 bFGF (카탈로그 번호 100-18B, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크)가 보충된 RPMI 배지에 이어서, 추가 2일 동안 2% BSA 및 100 ng/ml 액티빈-A에 더하여 8 ng/ml의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 처리 (단계 1), 이어서
b. 3일 동안 RPMI + 2% BSA + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μΜ SANT-1 (#S4572, 미국 미주리주 소재의 시그마) (단계 2), 이어서
c. 4일 동안 DMEM/고-글루코스 + ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석액 + 0.1% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 50 ng/ml FGF7 (미국 뉴저지주 소재의 페프로테크) + 0.25 μΜ SANT-1+ 2 μΜ 레틴산 (RA) (미국 미주리주 소재의 시그마) + 100 ng/ml의 노긴 (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) 및 20 ng/ml의 액티빈 A (단계 3), 이어서
d. DMEM/고-글루코스 + ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석액 + 0.1% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) + 100 ng/ml 노긴 + 1 μΜ ALK5 억제제 (SCI0120) + 3일 동안 (단계 4).
단계 2 세포를 TrypLE 익스프레스 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)를 사용하여 단일 세포로 분산시키고, 단계 4 기본 배지 (DM-Hg + ITS-X + BSA)에서 세정하였다.
분리된 세포를 회전시키고, 생성된 세포 펠렛을 PBS (미국 미주리주 소재의 시그마) 중의 2% BSA, 0.05% 아지드화나트륨으로 이루어진 염색 완충액 중에 현탁화시켰다. 적절할 경우, 세포를 0.1% γ-글로불린 (시그마) 용액을 사용하여 15분 동안 Fc-수용체를 차단하였다. 분취물 (대략 105개 세포)을 Lif 수용체-피코에리트린 (PE) (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) 컨쥬게이트된 모노클로널 항체 (106개 세포당 5 ㎕ 항체)와 함께 인큐베이션시켰다. 대조군은 적절한 아이소형 매치된 항체 및 비염색 세포를 포함하였다. 항체를 사용한 모든 인큐베이션을 4℃에서 30분 동안 수행하고, 이후에, 세포를 염색 완충액으로 세정하였다. 염색된 세포를 FACS 아리아 (Aria) (미국 캘리포니아주 소재의 BD) 상에서 분류하였다. RNA (알엔이지 미니 키트, 미국 캘리포니아주 소재의 퀴아젠)를 사전분류된 샘플, Lif 수용체+ 분획 및 Lif 수용체 음성 분획으로부터 수집하였다. Lif 수용체 발현 수준 및 패턴을 표 III에 요약하였다.
표 III은 단계 2의 2일 및 3일의 Lif 수용체의 발현을 요약한 것이다. 단계 2의 3일까지, 대략 70%의 세포가 Lif 수용체를 발현하였다. 표 III에 요약된 바와 같이, Lif 수용체의 높은 발현은 단계 2 세포에 독특한 것이며, 단계 3 및 4에서, 세포는 최소의 Lif 수용체의 발현을 보여주었다. 도 11, 패널 a 및 b에 나타낸 바와 같이, Lif 수용체에 대하여 농축한 단계 2 세포는 미분류 세포 또는 Lif 수용체 음성 세포에 비하여, HNF4 알파의 발현의 유의미한 증가를 보여주었다. 리얼-타임 PCR로 측정시, Lif 수용체 mRNA의 발현은 또한 Lif-수용체 양성 세포를 함유하는 세포 분획에서 증가하였다.
실시예 4 생체 내에서 종양 형성을 감소시키기 위한 SSEA -4+ 세포의 제거를 위한 세포에 대한 자성 비드 분류
SSEA4 항원의 발현은 인간 배아 줄기 세포에서의 만능의 주요 지표이며, 이러한 마커의 발현은 분화 과정 동안 크게 하향 조절된다. 그러나, 잔류 SSEA-4 양성 세포는 부분적으로 분화된 세포의 이식 후에 관찰되는 종양 및/또는 기형종의 원인일 수 있다. 기형종 형성을 줄이기 위하여, 이식 전에 분화된 세포로부터 오염 SSEA4+ 세포를 제거하기 위한 방법을 개발하였다.
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (계대수 40-52)를 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 다양한 단계로 분화시켰다. SSEA-4 제거의 개념 및 효능의 증거를 시험하기 위하여, 이러한 연구를 먼저 오직 원시 창자관 단계로만 분화된 세포 (실시예 1에 약술된 분화 프토토콜에서의 단계 2)를 사용하여 행하여, 세포가 여전히 더 높은 수준의 SSEA-4 발현을 유지하도록 보장하였다. 이후의 실험에서, SSEA-4를 발현하는 세포는 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 4에서 분화된 세포의 집단에서 제거하였다. 관찰된 결과에 대해서는 표 V를 참조한다. 세포를 37℃에서 2 내지 3분 동안의 TrypLE 익스프레스 (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐 번호 12604)에서의 인큐베이션에 의하여 온건하게 단일 세포로 분리하였다. 제거 동안의 세포 생존 및 생존력을 증가시키기 위하여, 10μΜ Y-27632 (카달로그 번호 Y 0503, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마) 또는 0.5μΜ 티아조비빈 (카달로그 번호 04-0017, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 스템젠트(Stemgent))을 포함하는 항세포사멸제 (anti-apoptotic agent)를 수집 전에 세포에 첨가하고, 모든 분리용 완충액에 첨가하였다.
세포를 0.1 % BSA 및 2mM EDTA가 보충된, Ca2+ 및 Mg2+가 없는 인산염 완충된 염수 (PBS)를 함유하는 분리 완충액에서 세정하였다. 10-100 x 106개 세포를 500 ㎕당 5 x 106개 세포의 최종 세포 밀도로 분리 완충액에 재현탁화시켰다. 500 ㎕의 세포당 25 ㎕의 SSEA-4 항체를 첨가하고, 세포를 온건한 락커(rocker) 상에서 실온에서 15 내지 20분 동안 인큐베이션하여, 지속적인 혼합을 보장하였다. 세포를 300xg에서 8분 동안 회전시킴으로써 분리 완충액에서 세정하였다. 상층액을 제거하고, 세포를 원래 완충액 부피에서 재현탁화시키고, 매 500 ㎕의 세포 현탁액에 대하여 50 ㎕의 사전세정된 SSEA-4 제거 비드 (다이나비드(등록상표) SSEA-4, 인비트로겐, 번호 11160D)를 첨가하였다. 세포와 비드를 혼합하고, 실온에서 15 내지 20분 동안 인큐베이션하면서 지속적으로 온건하게 기울이고 흔들었다. 세포를 온건하게 피펫팅함으로써 혼합하고, 자석 위에 5분간 두었다. SSEA-4 음성 세포를 함유하는 상층액을 새로운 튜브에 옮기고, 과정을 2 내지 3번 반복하여, 잔류 비드를 제거하였다. 비드-결합된 SSEA4+ 세포를 자기장으로부터 분리하고, 두 세포 집단 모두를 FACS 및 PCR 분석을 위해 계수하고 처리하였다. 사전-분류된 세포 분획 및 분류된 세포 분획 둘 모두에서 미분화 H1 세포, 원시 창자 세포 및 단계 IV 세포 내의 SSEA4의 발현 수준은 표 V에 약술되어 있다.
실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 II에서 분리된 세포의 집단에서, 분류 전에, 20.5 %의 세포가 SSEA4 마커를 발현하였다. 대조적으로, 분류 후에 오직 1.8%의 세포만이 SSEA4를 발현하였다 (표 V). 제거에 의해, 91.2 %의 SSEA-4 양성 세포의 제거가 야기되었다. 내분비 전구 세포를 사용하는 다른 실험에서, 제거 전에 25.3%의 세포가 SSEA-4를 발현하였으나, 오직 0.9%만이 제거 후에 SSEA-4를 발현하여, SSEA-4 양성 세포의 95.5 % 제거를 초래하였다 (표 V). 분화된 세포와 대조적으로, 미분화 배아 줄기 세포의 집단의 91.2%가 SSEA4를 발현하였다.
분류된 SSEA4+ 세포는 OCT4, 나노그, SOX2 및 구스코이드를 비롯한 만능 마커의 발현에 대하여 고도로 농축시켰다 (도 12, 패널 a 내지 d).
실시예 5
FACS에 의한 SSEA4+ (HI) 및 SSEA4 -(LO) 세포의 분류
유세포분석에 의해 분화된 세포로부터 만능-마커 (SSEA-4+) 농축된 세포의 제거를 조사하고 확인하기 위하여, 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 단계 VI로 분화시켰다. 세포를 TrypleE 익스프레스 세포 해리 완충액을 사용하여 배양물로부터 분리시키고, 실시예 2에 기재된 바와 같은 분류를 위하여 세포를 준비하였다. SSEA-4 항체 (미국 미네소타주 미니애폴리스 소재의 알앤디 시스템즈, 카달로그 번호 FAB1435P)를 사용하여 SSEA-4(+)Hi 및 SSEA-4(-)Lo 세포로 확인된 2개의 세포 분획을 분리하였다. 분리된 세포 분획을 실시예 4에 기재된 바와 같이 RT- PCR에 의해 만능 마커의 발현에 대하여 분석하였다. 실시예 5에 기재된 바와 같이, 자성 비드 분리를 사용하여 수득된 SSEA-4 제거 및 농축 분획과 유사하게, 분류된 SSEA-4(+)Hi 세포는 SSEA-4(-)Lo 세포와 달리, 만능 마커 OCT4, 나노그, SOX2 및 구스코이드의 발현에 대하여 고도로 농축된 것이다. 도 13 패널 a 내지 d를 참조한다.
실시예 6
생체 내에서 세포의 SSEA-4 제거된 집단의 이식
파일럿 (pilot) 실험에서, SSEA-4 제거된 세포를 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 IV로 분화시킨 다음, 마우스의 신장 피막에 이식시켜, 세포 생존 및 생착을 시험하였다. 이식된 마우스로부터의 데이터를 표 VI에 약술하였다.
5 내지 6주령 수컷 스키드-베이지 (scid-beige) 마우스 (C.B-Igh-1b/GbrnsTac-Prkdescid-Lystbg N7) 를 타코닉 팜즈 (Taconic Farms)로부터 구매하였다. 마우스는 마이크로단리 (microisolator) 케이지에서 가두고 멸균된 먹이와 물을 마음대로 먹게 하였다. 수술 준비에서, 마우스를 귀 태깅에 의해 식별하고, 그의 체중을 측정하고, 그의 혈당을 휴대용 혈당측정기 (원터치 (One Touch), 라이프스캔)로 측정하였다. 아이솔플루란 및 산소의 혼합물을 사용해 마우스를 마취시키고 수술 부위를 작은 동물 클리퍼를 사용해 면도하였다. 수술전에 마우스에 0.1 ㎎/㎏ 부프레넥스 (Buprenex)를 피하 투여하였다. 70% 아이스프로필 알코올, 10% 포비돈-요오다이드 및 70% 아이스프로필 알코올의 연속 세정으로 수술 부위를 준비하고, 피부 및 근육층을 통한 좌측 삽입부를 만들었다. 좌측 신장을 떼어내고, 0.9% 염화나트륨으로 촉촉하게 유지시켰다. 24G x 3/4" 정맥내 카데터를 사용하여 신장 피막을 침투시키고, 바늘을 제거하였다. 다음, 카테터를 신장 피막 밑에서 신장의 원위부 극 (distal pole)으로 두었다.
마우스의 수술전 준비 동안에, 세포를 1.5 mL 마이크로퓨즈 (microfuge) 튜브에서 원심분리시키고, 상층액의 대부분을 제거하여, 세포의 펠렛을 수집하기에 충분한 정도만 남겼다. 세포는 라이닌 포스-D (Rainin Pos-D) 용적형 피펫 (positive displacement pipette) 내로 수집하고, 피펫은 세포가 중력에 의해 침강되도록 거꾸로 하였다. 여분의 배지를 디스펜스하여 (dispensed) 이식용의 패킹된 (packed) 세포 제제가 남게 하였다.
이식을 위하여, 포스-D 피펫 팁을 카테터의 허브에 단단하게 놔두고, 세포를 신장 피막 아래의 카테터를 통하여 피펫으로부터 디스펜스하고, 신장의 원위부 극에 전달하였다. 카테터의 루멘을 소량의 배양 배지로 플러싱하여, 잔여 세포를 전달시키고, 카테터를 제거하였다. 신장 피막을 저온 소작에 의해 밀봉하고, 신장을 그의 원래의 해부학적 위치에 되돌려 놓았다. 근육을 5-0 바이크릴을 사용하여 연속 봉합사로 닫고, 피부를 창상용 클립을 사용하여 닫았다. 수술 후에 마우스에 1.0 ㎎/㎏ 메타캄을 피하 투여하였다. 마우스에서 마취를 없애고, 마우스를 완전히 회복시켰다.
이식 후, 마우스를 1주 당 1회 칭량하고, 혈당을 1주에 2회 측정하였다. 이식 후 다양한 간격으로, 3g/㎏ 글루코스를 마우스에 복강내 투여하고, 소량의 헤파린을 함유하는 마이크로퓨즈 튜브에 후안구동을 통해 글루코스를 주사한 지 60분째에 혈액을 빼내었다. 혈액을 원심분리하고, 혈장을 제2 마이크로퓨즈 튜브 내에 넣고, 드라이아이스에서 냉동시키고, 이어서 인간 c-펩티드 분석을 수행할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 인간 C-펩티드 수준은 제조처의 지시에 따라 메르코디아/알프코 다이아그노스틱스 울트라센서티브 (Mercodia/ALPCO Diagnotics Ultrasensitive) c-펩티드 ELISA를 사용해 측정하였다.
희생 시에, 혈액을 상술된 바와 같이 수집하고, 마우스를 안락사시켰다. 이식을 신장 피막으로부터 수집하고, 리얼-타임 qPCR, 면역조직화학 및 병리학에 의해 분석하였다.
3개 그룹의 마우스를 약 330만개 세포로 이식시키고, 각 세포는 i) 세포 클러스터, ii) 단일 세포 (미제거) 및 iii) SSEA4 제거 단일 세포를 포함한다. 단계 IV로 분화된 세포를 SSEA-4 제거를 위해 온건한 스카핑 (scarping)으로 분리시켜 작은 세포 클러스터를 만들거나, 또는 TrypleE를 사용하여 단일 세포로 분리시켰다. 실시예 5에 약술된 바와 같은 SSEA-4 제거 후에, 세포 클러스터 및 단일 세포 제제 둘 모두를 이식 전에 전구 (단계 IV) 세포 분화 배지에서 하룻밤 저 부착 플레이트 (미국 뉴욕주 소재의 코스타, 코닝 인코포레이티드 (Costar, Corning Incorporated) 카달로그 번호 3471)에 다시 플레이팅하였다. rock 억제제 Y-27632 다이하이드로클로라이드 모노하이드레이트 (시그마, 카달로그 번호 Y0503)를 10 μΜ의 농도로 하룻밤 배양물에 첨가하였다. 이식 후에, 마우스를 상술된 바와 같이 이식 후 최대 12주 동안 모니터링하였다. 이식편 생존은 단일 세포 수여자 (제거 또는 비제거)에서 가시적으로 나타나지 않았으나 세포 클러스터를 제공한 5마리의 마우스 중 2마리에서 나타났다. 세포 클러스터를 투여한 5마리의 마우스 중 1마리는 이식 12주 후에 검출가능한 c-펩티드 수준을 가졌다. 불량한 이식편 생존은 파일럿 실험에서 이식한 감소된 세포 품질 및 낮은 세포 개수가 원인이었다.
인간 배아 세포의 완성 내배엽 (DE), 췌장 내배엽 (PE) 및 췌장 전구체를 포함하는 몇몇 중간 단계를 통한 성숙, 췌장 내분비 세포로의 다단계 분화는 표면 마커의 발현에서의 활발한 변화와 관련이 있다. 분화 프로토콜이 아직까지 정의되지 않은 것으로, 외배엽 및 중배엽 세포 유형을 비롯한 다수의 계통의 이종 세포 집단을 생성할 수 있지만, 췌장 분화 배지 내의 표면 마커의 발현의 변화를 추적함에 의하여, 세포 농축 및 정제에 잠재적으로 유용한 마커를 확인할 수 있었다. 표 VII은 발현의 증가 또는 감소 중 어느 하나를 나타내는 표면 마커의 요약을 보여주며, 이는 췌장 내배엽 세포의 음의 또는 양의 선택에 유용할 수 있다. 분화 과정 동안 발현이 감소되는 마커는 CD117, CD133, CD181, CD184, CD200, CD221, CD326, CD55, CD57, CD9 및 CD98을 포함한다. 분화 과정 동안 발현이 증가된 마커는 CD13, CD141, CD15, CD318, CD46, CD47, CD49c, CD49e, CD56 및 CD73을 포함한다. 이들 마커는 단일로 또는 다양한 조합으로 사용하여, 췌장 내배엽 및 전구체에 대하여 농축된 세포 집단을 정제할 수 있다.
실시예 7
유세포분석 분류 절차
다양한 성숙 단계의 세포를 37℃에서 2 내지 3분 동안 TrypLE 익스프레스 (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐 번호 12604)에서의 인큐베이션에 의하여 온건하게 분리하고, 2% BSA를 함유하는 BD FACS 염색 완충액 (미국 캘리포니아주 소재의 BD 번호 554657)에서 2회 세정하였다. 세포 수율에 기초하여, 20-50x106개 단일 세포는 염색을 위하여 2 내지 3 ml의 블로킹 완충액 (염색 완충액에 1:4 희석한 0.5% 인간 감마-글로불린) (미국 캘리포니아주 소재의 BD)에 재현탁화시켰다. 형광단 컨쥬게이트된 일차 항체를 1:20의 최종 희석으로 세포에 첨가하고, 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세정 후에, 염색된 세포를 2 내지 3 ml 염색 완충액에 재현탁화시키고, 50 내지 60 ㎕의 7AAD를 분석 및 세포 분류 전에 생/사 세포 판별을 위해 첨가하였다. 아이소형 매치된 대조군 IgG 항체를 음성 대조군 염색을 위하여 사용하였다. 분류 전에 형광단 보정값을 계산하기 위하여, 세포를 단일 형광단 플루오로세인 아이소티오시아네이트 (FITC), 피코에리트린 (PE) 또는 알로피코시아닌 (APC) 핵 염료 7-아미노액티노뮤신 D (7-AAD)로 염색되거나 염색되지 않게 두었다.
세포 분류를 BD FACSAria 세포 분류기 및 BD FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 행하였다. 아이소형 매치된 대조군 세포를 사용하여 각 세포 분류에 대한 음성 게이트를 확립하였다. 각 세포 분류 실험을 위하여, 광전자 증배관 (PMT) 전압 설정을 적절한 형광단 보정값을 사용하여 조정하여, 밝은 집단 (양성 (+) 또는 Hi) 및 딤 집단 또는 세포 서브셋 (음성 (-) 또는 Lo)을 생성하였다. 전형적으로, 양성의 세포 집단 (+ 또는 Hi)은 일만 이상 (104)의 집단인 한편, 음성 집단은 일백 내지 일천 (102-103)이다. 확립된 게이트를 사용하여, 세포를 100 μΜ 노즐 (nozzle) 및 1.0의 유속을 사용하여 분류하였다. 분류 후에, 적은 세포 분취물을 분석하여, 분류된 세포 서브셋의 순도를 평가하였다. RNA를 RT-PCR 분석을 위하여 알엔이지 미니 키트 (미국 캘리포니아주 소재의 퀴아젠)를 사용하여 사전분류된 세포 및 분류된 세포로부터 수집하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 공개문헌은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 측면은 실시예 및 바람직한 실시형태를 참조로 하여 상기 예시되었음에도, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명에 의해서가 아니라 본 특허 법칙의 원칙 하에 적절하게 의도되는 하기 청구항에 의해 정의되는 것으로 생각될 것이다.
[표 I]
Figure pct00001
Figure pct00002
[표 II]
Figure pct00003
Figure pct00004
[표 III]
Figure pct00005
[표 IV]
Figure pct00006
[표 V]
Figure pct00007
[표 VI]
Figure pct00008
[표 VII]
Figure pct00009

Claims (5)

  1. a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계,
    b. 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계,
    c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
    d. 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계,
    e. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단으로 분화시키는 단계, 및
    f. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 적어도 일부를 포유 동물에 이식하는 단계를 포함하는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로부터의 인슐린-생성 세포의 생성 증가 방법.
  2. 제1항에 있어서, 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 농축시키는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 원시 창자관 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 Lif 수용체에 결합할 수 있는 시약과 접촉시킴으로써 원시 창자관의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 농축시키는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 CD9, CD13, CD15, CD47, CD56, CD73, CD117, CD133, CD184, CD200, CD318, CD326 및 SSEA4로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커에 결합할 수 있는 적어도 하나의 시약과 접촉되게 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
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