ES2725601T3 - Diferenciación de células madre embriónicas humanas - Google Patents

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Abstract

Un método para diferenciar células madre pluripotentes humanas en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, que comprende los pasos de: a. Cultivo de células madre pluripotentes humanas en un sustrato de cultivo tisular recubierto con una matriz extracelular, en donde la matriz extracelular se selecciona del grupo que consiste en una preparación de membrana basal solubilizada extraída de células de sarcoma de ratón, preparación de membrana basal solubilizada reducida por factor de crecimiento extraída de células de sarcoma de ratón, laminina, fibronectina y suero humano; b. Diferenciación de las células madre pluripotentes humanas en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo, tratando las células madre pluripotentes humanas con 1 pg/ml a 100 μg/ml de activina A y 1 ng/ml a 1000 ng/ml de Wnt 3a en un primer medio de cultivo durante 1 a 3 días, seguido de cultivo de células madre pluripotentes humanas con 1 pg/ml de activina A y, opcionalmente, 1 ng/ml a 1000 ng/ml de Wnt-3a en un segundo medio de cultivo durante 1 día a 4 días; c. Diferenciación de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, tratando las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con 1 nM a 1 mM de ácido retinoico y 50 pg/ml a 50 pg/ml de al menos un factor de crecimiento de fibroblastos seleccionado del grupo que consiste en FGF-2, FGF-4 y FGF-10 durante 1 a 3 días; y d. Diferenciación de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, tratando las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con 0,1 μM a 100 μM de L-685,458 durante 3 a 5 días; en donde el paso b comprende opcionalmente además el tratamiento de las células con 1 nM a 1000 nM de un inhibidor de GSK-3B, y en el que el inhibidor de GSK-3B es un inhibidor de GSK-3B XI o un inhibidor de GSK-3B IX.

Description

DESCRIPCIÓN
Diferenciación de células madre embriónicas humanas
[0001] La presente invención proporciona métodos para promover la diferenciación de células madre pluripotentes. En particular, la presente invención proporciona un método mejorado para la formación de endodermo pancreático, células que expresan hormona pancreática y células secretoras de hormona pancreática. La presente invención también proporciona métodos para promover la diferenciación de células madre pluripotentes sin el uso de una capa de células alimentadoras.
ANTECEDENTES
[0002] Avances en la terapia de reemplazo celular para el Tipo 1 diabetes mellitus y la escasez de islotes de Langerhans trasplantables se han centrado el interés en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina, o células p, apropiadas para el injerto. Un enfoque es la generación de células p funcionales a partir de células madre pluripotentes, como, por ejemplo, células madre embrionarias.
[0003] En el desarrollo embrionario de los vertebrados, una célula pluripotente da lugar a un grupo de células que comprenden tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como la gastrulación. Los tejidos como, por ejemplo, la tiroides, el timo, el páncreas, el intestino y el hígado, se desarrollarán a partir del endodermo, a través de una etapa intermedia. La etapa intermedia en este proceso es la formación del endodermo definitivo. Las células endodérmicas definitivas expresan una serie de marcadores, como HNF-3beta, GATA4, Mixll, CXCR4 y Sox-17.
[0004] La formación del páncreas surge de la diferenciación del endodermo definitivo en el endodermo pancreático. Las células del endodermo pancreático expresan el gen homeobox pancreático-duodenal, Pdxl. En ausencia de Pdxl, el páncreas no se desarrolla más allá de la formación de brotes ventrales y dorsales. Por lo tanto, la expresión de Pdxl marca un paso crítico en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene, entre otros tipos de células, tejido exocrino y tejido endocrino. Los tejidos exocrinos y endocrinos surgen de la diferenciación del endodermo pancreático.
[0005] Las células que llevan las características de las células de los islotes según se informa se han derivado a partir de células embrionarias de ratón. Por ejemplo, Lumelsky et al. (Science 292: 1389, 2001) informan la diferenciación de células madre embrionarias de ratón a estructuras secretoras de insulina similares a los islotes pancreáticos. Soria et al. (Diabetes 49: 157, 2000) informan que las células secretoras de insulina derivadas de células madre embrionarias de ratón normalizan la glucemia en ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina.
[0006] En un ejemplo, Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) describe que el tratamiento de células madre embrionarias de ratón con inhibidores de la fosfoinositida 3-quinasa (LY294002) produjo células que se parecían a las células p.
[0007] En otro ejemplo, Blyszczuk et al. (PNAS 100: 998, 2003) informa la generación de células productoras de insulina a partir de células madre embrionarias de ratón que expresan constitutivamente Pax4.
[0008] Micallef et al. informa de que el ácido retinoico puede regular el compromiso de las células madre embrionarias para formar el endodermo pancreático positivo Pdx1. El ácido retinoico es más efectivo para inducir la expresión de Pdx1 cuando se agrega a los cultivos en el día 4 de la diferenciación de células madre embrionarias durante un período correspondiente al final de la gastrulación en el embrión (Diabetes 54: 301, 2005).
[0009] Miyazaki et al. informa sobre una línea de células madre embrionarias de ratón que sobreexpresa Pdx1. Sus resultados muestran que la expresión exógena de Pdx1 mejoró claramente la expresión de los genes de insulina, somatostatina, glucocinasa, neurogenina3, P48, Pax6 y HNF6 en las células diferenciadas resultantes (Diabetes 53: 1030, 2004).
[0010] Skoudy et al. informa que la activina A (un miembro de la superfamilia de TGF p) regula la expresión de genes pancreáticos exocrinos (p48 y amilasa) y genes endocrinos (Pdx1, insulina y glucagón) en células madre embrionarias de ratón.
[0011] Se observó el efecto máximo utilizando 1 nM activina A. También observaron que el nivel de expresión de la insulina y ARNm Pdx1 no se vio afectado por el ácido retinoico; sin embargo, el tratamiento con FGF7 3 nM dio como resultado un aumento del nivel de la transcripción para Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
[0012] Shiraki et al. estudió los efectos de los factores de crecimiento que mejoran específicamente la diferenciación de células madre embrionarias en células Pdx1 positivas. Observaron que el TGF p 2 producía reproduciblemente una mayor proporción de células positivas para Pdx1 (Genes Cells. Junio de 2005; 10 (6): 503-16).
[0013] Gordon et al. demostró la inducción de células endodérmicas braquiquia+/HNF-3beta+ a partir de células madre embrionarias de ratón en ausencia de suero y en presencia de activina junto con un inhibidor de la señalización Wnt (US 2006/0003446A1).
[0014] Gordon et al. (PNAS, Vol. 103, página 16806, 2006) afirma que "la señalización de Wnt y TGF-beta/nodal/activina se requirieron simultáneamente para la generación de la línea primitiva anterior".
[0015] Sin embargo, el modelo de ratón de desarrollo de células madre embrionarias puede no exactamente imitar el programa de desarrollo en los mamíferos superiores, tales como, por ejemplo, seres humanos.
[0016] Thomson et al. isolated embryonic stem cells from human blastocysts (Science 282: 114, 1998). Al mismo tiempo, Gearhart y colaboradores derivaron líneas celulares de germen embrionario humano (hEG) del tejido gonadal fetal (Shamblott y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95: 13726, 1998). A diferencia de las células madre embrionarias de ratón, que se puede evitar que se diferencien simplemente cultivando con factor de inhibición de leucemia (LIF), las células madre embrionarias humanas deben mantenerse en condiciones muy especiales (Patente de Estados Unidos N° 6.200.806; WO 99/20741; WO 01/51616).
[0017] D'Amour et al. describe la producción de cultivos enriquecidos de endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas en presencia de una alta concentración de activina y suero bajo (D'Amour KA et al.
2005). El trasplante de estas células debajo de la cápsula renal de ratones dio como resultado la diferenciación en células más maduras con características de algunos órganos endodérmicos. Las células endodérmicas definitivas derivadas de células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse aún más en células positivas Pdxl después de la adición de FGF-10 (US 2005/0266554A1).
[0018] D'Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)) afirma: "Hemos desarrollado un proceso de diferenciación que convierte las células madre embrionarias humanas (hES) en células endocrinas capaces de sintetizar las hormonas pancreáticas insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático y grelina. Este proceso imita la organogénesis pancreática in vivo al dirigir las células a través de etapas que se asemejan al endodermo definitivo, al endodermo intestinal, al endodermo pancreático y al precursor endocrino en ruta a las células que expresan las hormonas endocrinas ".
[0019] En otro ejemplo, Fisk et al. informa sobre un sistema para producir células de islotes pancreáticos a partir de células madre embrionarias humanas (US2006/0040387A1). En este caso, la vía de diferenciación se dividió en tres etapas. Las células madre embrionarias humanas se diferenciaron primero en endodermo utilizando una combinación de n-butirato y activina A. Las células se cultivaron luego con antagonistas de TGF p como Noggin en combinación con EGF o betacelulina para generar células positivas Pdxl. La diferenciación terminal fue inducida por la nicotinamida.
[0020] En un ejemplo, Benvenistry et al. afirma: "Llegamos a la conclusión de que la sobreexpresión de Pdxl potenció la expresión de genes enriquecidos en el páncreas, la inducción de la expresión de insulina puede requerir señales adicionales que solo están presentes in vivo" (Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24: 1923-1930).
[0021] Por lo tanto, sigue existiendo una importante necesidad de desarrollar condiciones favorables para el establecimiento de líneas de células madre pluripotentes que pueden ampliarse para hacer frente a las necesidades clínicas actuales, al tiempo que conserva el potencial de diferenciarse en células endocrinas pancreáticas, las células que expresan hormona pancreática, o células secretoras de hormona pancreática. Se adoptó un enfoque alternativo para mejorar la eficacia de la diferenciación de células madre embrionarias humanas hacia células endocrinas pancreáticas.
RESUMEN
[0022] En una realización, la presente invención proporciona un método para la diferenciación de células madre pluripotentes, que comprende los pasos de:
a. Cultivar las células madre pluripotentes, y
b. Diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores características del linaje endodérmico definitivo,
c. Diferenciar las células que expresan las características de los marcadores del linaje endodérmico definitivo en células que expresan las características de los marcadores del linaje del endodermo pancreático, y
d. Diferenciar las células que expresan las características de los marcadores del linaje endodérmico pancreático en células que expresan las características de los marcadores de la línea endocrina pancreática.
[0023] En una realización, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se diferencian a partir de células madre pluripotentes mediante el tratamiento de células madre pluripotentes por cualquiera de los métodos siguientes:
a. Cultivar las células madre pluripotentes en un medio que contenga activina A en ausencia de suero, luego cultivar las células con activina A y suero, y luego cultivar las células con activina A y suero de una concentración diferente, o
b. Cultivar las células madre pluripotentes en un medio que contenga activina A en ausencia de suero, luego cultivar las células con activina A con suero de otra concentración, o
c. Cultivar las células madre pluripotentes en un medio que contenga activina A y un ligando Wnt en ausencia de suero, luego retirar el ligando Wnt y cultivar las células con activina A con suero, o
d. Cultivar las células madre pluripotentes en un sustrato de cultivo de tejidos recubierto con una matriz extracelular y cultivar las células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt, o
e. Cultivar las células madre pluripotentes en un sustrato de cultivo de tejidos recubierto con una matriz extracelular, luego cultivar las células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt en un primer medio de cultivo que contenga suero, luego cultivar las células madre pluripotentes con activina A en un segundo cultivo medio que contiene suero, o
f. Cultivar las células madre pluripotentes en un sustrato de cultivo tisular recubierto con una matriz extracelular, luego cultivar las células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt en un primer medio de cultivo que contenga suero, luego cultivar las células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt en un segundo medio de cultivo que contenga suero de una concentración diferente.
[0024] En una realización, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se distinguen de ésta células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante el tratamiento de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo mediante uno cualquiera de los métodos siguientes:
a. Tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con un factor de crecimiento de fibroblastos y un inhibidor de la señal de erizo, luego se elimina el medio que contiene el factor de crecimiento de fibroblastos y el inhibidor de la ruta de señalización de erizo y luego se cultivan las células en un medio que contiene ácido retinoico factor de crecimiento de fibroblastos y el inhibidor de la vía de señalización de erizo, o
b. Tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con ácido retinoico y al menos un factor de crecimiento de fibroblastos, o
c. Tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con ácido retinoico, luego eliminando el ácido retinoico y posteriormente tratando las células con al menos un factor de crecimiento de fibroblastos.
[0025] En una realización, las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se distinguen de ésta células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante el tratamiento de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante uno cualquiera de los métodos siguientes:
a. Cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en un medio que contiene DAPT y exendina 4, luego eliminar el medio que contiene DAPT y exendina 4 y posteriormente cultivar las células en un medio que contenga exendina 1, IGF-1 y HGF, o
b. Cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en un medio que contiene exendina 4, luego eliminar el medio que contiene exendina 4 y posteriormente cultivar las células en un medio que contiene exendina 1, IGF-1 y HGF, o
c. Cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en medio que contiene DAPT y exendina 4, o
d. Cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en un medio que contiene exendina 4, o
e. Tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que inhibe la vía de señalización de Notch.
[0026] En una realización, la presente invención proporciona un método para tratar un paciente que padece diabetes, que comprende las etapas de:
a. Cultivo de células madre pluripotentes,
b. Diferenciación de las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores características del linaje endodérmico definitivo,
c. Diferenciación de las células que expresan las características de los marcadores del linaje endodérmico definitivo en células que expresan las características de los marcadores del linaje del endodermo pancreático. d. Diferenciar las células que expresan marcadores características del linaje endodérmico pancreático en células de un linaje de células p, y
e. Implantación de las células de un linaje de células p en el paciente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0027]
La Figura 1, panel a, muestra la expresión de los marcadores endodérmicos definitivos CXCR4, GATA4, HNF-3beta, Mixl 1, Sox-17 en la línea de células madre embrionarias humanas H9 luego del tratamiento con 100 ng/ml de activina A durante dos, cinco y ocho días. La expresión de marcadores endodérmicos definitivos se ensayó a nivel de ARNm y se normalizó a niveles de expresión en células madre embrionarias humanas no tratadas. El panel b muestra la expresión de los marcadores endodérmicos anteriores de los genes Cerberus, Otx-1 y Hex en la línea de células madre embrionarias humanas H9 después del tratamiento con 100 ng/ml de activina A durante tres y cinco días.
La Figura 2 muestra la expresión de marcadores endodérmicos definitivos en la línea de células madre embrionarias humanas H9 después del tratamiento con 100 ng/ml de activina A durante cinco días. La expresión de los marcadores endodérmicos definitivos se detectó mediante inmunohistoquímica. El panel (a) muestra la expresión de Sox-17. El panel (b) muestra la expresión de HNF-3beta. El panel (c) muestra la expresión de Oct3/4.
La Figura 3 muestra la expresión de marcadores endodérmicos definitivos en la línea de células madre embrionarias humanas H9 siguiendo un protocolo de diferenciación gradual. La expresión de los marcadores endodérmicos definitivos se ensayó a nivel de ARNm y se normalizó a niveles de expresión en células madre embrionarias humanas no tratadas. El panel (a) muestra la expresión GATA4. El panel (b) muestra la expresión de Sox-17. El panel (c) muestra la expresión HNF-3beta. El panel (d) muestra la expresión Mixl 1. Los puntos de datos marcados como "AA: indican el tratamiento con activina A durante uno (1d), tres (3d), cinco (5d) o siete días (7d). Los puntos de datos marcados con "UT" indican controles sin tratar cultivados durante uno (1d), tres (3d), cinco (5d) o siete días (7d).
La Figura 4 muestra la expresión de marcadores endodérmicos extraembrionarios en la línea de células madre embrionarias humanas H9 siguiendo un protocolo de diferenciación gradual. La expresión de los marcadores del endodermo extraembrionario se ensayó a nivel de ARNm y se normalizó a los niveles de expresión en células madre embrionarias humanas no tratadas. El panel (a) muestra el efecto de 100 ng/ml de activina A en la expresión de AFP. El panel (b) muestra el efecto de 100 ng/ml de activina A en la expresión de Sox7. Los puntos de datos marcados como “AA” indican el tratamiento con activina A durante uno (1d), tres (3d), cinco (5d) o siete días (7d). Los puntos de datos marcados con “UT” indican controles no tratados cultivados durante uno (1d), tres (3d), cinco (5d) o siete días (7d).
La Figura 5 muestra la expresión de marcadores de mesodermo y ectodermo en la línea de células madre embrionarias humanas H9 después de un protocolo de diferenciación gradual. La expresión de los marcadores de mesodermo y ectodermo se analizó a nivel de ARNm y se normalizó a los niveles de expresión en células madre embrionarias humanas no tratadas. El panel (a) muestra el efecto de 100 ng/ml de activina A en la expresión de Brachyury. El panel (b) muestra el efecto de 100 ng/ml de activina A en la expresión de Zic1. Los puntos de datos marcados como “AA” indican el tratamiento con activina A durante uno (1d), tres (3d), cinco (5d) o siete días (7d). Los puntos de datos marcados con "UT" indican controles sin tratar cultivados durante uno (1d), tres (3d), cinco (5d) o siete días (7d).
La Figura 6 muestra la expresión de los marcadores endodérmicos definitivos Brachyury (panel a) CXCR4 (panel b), Mixl 1 (panel c), Sox17 (panel d), HNF-3beta (panel e), Oct4 (panel f) en la línea de células madre de embrión humano H7 después del tratamiento con 100 ng/ml de activina A durante uno, tres, cinco y siete días. La expresión de marcadores endodérmicos definitivos se ensayó a nivel de ARNm y se normalizó a niveles de expresión en células madre embrionarias humanas no tratadas.
La Figura 7 muestra la expresión de marcadores endodérmicos definitivos en la línea de células madre embrionarias humanas H9 luego de la aplicación de un protocolo de diferenciación. La expresión de los marcadores endodérmicos definitivos se detectó mediante inmunohistoquímica. Los paneles (a) y (b) muestran la expresión de Sox-17. Los paneles (c) y (d) muestran la expresión HNF-3beta. Los paneles (e) y (f) muestran la expresión GATA4. Los paneles (b), (d) y (f) muestran una tinción contraria de los núcleos con DAPI. Las columnas marcadas como "tratadas" denotan el tratamiento con activina A (100 ng/ml) durante cinco días. Las columnas marcadas como "no tratadas" denotan controles no tratados.
La Figura 8 muestra la expresión de marcadores de endodermo pancreático en la línea de células madre embrionarias humanas H9 luego de la aplicación de un segundo protocolo de diferenciación. La expresión de los marcadores de endodermo pancreático se analizó mediante PCR y se normalizó a los niveles de expresión en células madre embrionarias humanas tratadas con activina A. El panel (a) muestra la expresión de Pdxl. El panel (b) muestra la expresión de GLUT-2. El panel (c) muestra la expresión de PTF1a.
La Figura 9 muestra la expresión de marcadores de endodermo pancreático en la línea de células madre embrionarias humanas H9 luego de la aplicación de un segundo protocolo de diferenciación. La expresión de los marcadores de endodermo pancreático se detectó mediante inmunohistoquímica. El panel (a) muestra la expresión de Pdx1 en el control no tratado, y el panel (b) muestra la expresión de Pdx1 en el cultivo tratado mediante el protocolo de diferenciación gradual.
La Figura 10 muestra la expresión de marcadores endocrinos pancreáticos en la línea de células madre embrionarias humanas H9 luego de la aplicación de un tercer protocolo de diferenciación. La expresión de los marcadores endocrinos pancreáticos se analizó mediante PCR y se normalizó a los niveles de expresión en células madre embrionarias humanas tratadas con activina A. El panel (a) muestra la expresión de NeuroD1. El panel (b) muestra la expresión de Ngn3. El panel (c) muestra la expresión de insulina. El panel (d) muestra la expresión de Hes-1, el nivel de expresión se normaliza a las células del endodermo pancreático.
La Figura 11 muestra la expresión de marcadores de endodermo pancreático en la línea de células madre embrionarias humanas H9 luego de la aplicación de un protocolo de diferenciación. La expresión de los marcadores de endodermo pancreático se analizó mediante PCR y se normalizó a los niveles de expresión en células madre embrionarias humanas tratadas con activina A. El panel (a) muestra la expresión Nkx2.2. El panel (b) muestra la expresión de Pdxl.
La Figura 12 muestra la expresión de PDX-1 en células con cada pasaje (P0, P1 y P2) en cultivo. La expresión de la PDX-1 se analizó mediante PCR y se normalizó a los niveles de expresión en células madre embrionarias humanas tratadas con H9.
La Figura 13 muestra la expresión de marcadores de hepatocitos en la línea de células madre embrionarias humanas H9 luego de la aplicación de un tercer protocolo de diferenciación. La expresión de los marcadores de hepatocitos se analizó mediante PCR y se normalizó a los niveles de expresión en células madre embrionarias humanas tratadas con activina A. El panel (a) muestra la expresión de AFP. El panel (b) muestra la expresión de albúmina.
La Figura 14 muestra la expresión de marcadores de pluripotencia en la línea de células madre embrionarias humanas H9. La expresión de los marcadores de pluripotencia se ensayó mediante inmunohistoquímica. El panel (a) muestra la expresión Oct-4. El panel (b) muestra la expresión de fosfatasa alcalina.
La Figura 15 muestra el cariotipo de la línea celular embrionaria humana H9. El cariotipo se determinó en células en el número de pase P36 que se cultivaron en células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón. La Figura 16 muestra el esquema de un protocolo de diferenciación en esta invención, donde las células madre embrionarias humanas se diferencian en endodermo definitivo en un sistema libre de alimentación.
La Figura 17 representa el perfil FACS de la línea de células madre embrionarias humanas H9 en el paso 44, cultivadas en concentraciones variables de MATRIGEL y expuestas a (0,5-2%) de suero bajo y alto contenido de activina A (100 ng/ml) durante 5 días. La expresión del marcador endodermo definido CXCR4 (CD184) se muestra en el eje Y y la expresión del marcador ES CD9 se muestra en el eje X.
La Figura 18 muestra los resultados de la PCR en tiempo real para marcadores de endodermo definitivo, de cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9 en el pase 44 cultivados en una dilución 1:10 de MATRIGEL (■), una dilución 1:20 de MATRIGEL (■), o una dilución de MATRIGEL (□) a la 1:30 y expuesta al protocolo de diferenciación descrito en el Ejemplo 14. La inducción del pliegue es relativa a células indiferenciadas de la línea de células madre embrionarias humanas H9, en el paso número 44, cultivadas en medio acondicionado utilizando fibroblastos embrionarios de ratón.
La Figura 19 muestra los gráficos de dispersión para la expresión génica global en células madre pluripotentes indiferenciadas y células endodérmicas definitivas obtenidas de la diferenciación de células madre pluripotentes. Los datos mostrados son de cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas línea H9 en el paso 44 cultivadas en fibroblastos embrionarios de ratón (panel derecho) y el paso 83 cultivado en MATRIGEL (panel izquierdo).
La Figura 20 representa la expresión de CXCR4 por FACS en el día 5 para la línea de células madre embrionarias humanas H1 (panel a), la línea de células madre embrionarias humanas H7 (panel b) y la línea de células madre embrionarias humanas H9 (panel c) cultivadas en células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón expuestas al protocolo de diferenciación de endodermo definitivo descrito en el Ejemplo 4.
La Figura 21 muestra los resultados de la PCR en tiempo real de la expresión de los marcadores endodérmicos definitivos indicados en cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H7 (panel a) y la línea de células madre embrionarias humanas H9 (panel b) cultivadas en células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón. Los resultados se expresan como aumento de veces sobre las células no diferenciadas.
La Figura 22 representa la expresión de CXCR4 por FACS en el día 5 para la línea de células madre embrionarias humanas H1 (panel a), la línea de células madre embrionarias humanas H7 (panel b) y la línea de células madre embrionarias humanas H9 (panel c) cultivadas en MATRIGEL (dilución 1:30) y expuestas al protocolo de diferenciación de endodermo definitivo descrito en el Ejemplo 4.
La Figura 23 muestra los resultados de la PCR en tiempo real de la expresión de los marcadores de endodermo definitivos indicados en cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H7 (panel a) y la línea de células madre embrionarias humanas H9 (panel b) y la célula madre embrionaria humana línea H1 (panel c). Los resultados se expresan como aumento de veces sobre las células no diferenciadas. Las células se trataron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 4.
La Figura 24 representa imágenes de contraste de fase de cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9 en el paso 46 en presencia de 100 ng/ml de activina A (panel a) o 100 ng/ml de activina A 20 ng/ml Wnt-3a (panel b). Las células fueron tratadas durante cinco días.
La Figura 25 representa la expresión de CXCR4 por FACS en cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H7 en el paso 44 (paneles a y b) y H9 en el paso 46 (paneles c y d), siguiendo el tratamiento de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 4. Los paneles b y d muestran el efecto de 20 ng/ml de Wnt-3a en la expresión de CXCR4. Los paneles a y c muestran la expresión CXCR4 en ausencia de Wnt-3a. Los resultados se obtuvieron 5 días después del tratamiento.
La Figura 26 muestra los datos de PCR en tiempo real para la expresión de los genes indicados en cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H7 (panel a) y H9 (panel b). Los cultivos se trataron con el protocolo de diferenciación descrito en el Ejemplo 4. Se ensayaron también los efectos de los agonistas de Wnt Wnt-3a (20 ng/ml), Wnt-5a (20 ng/ml) y Wnt-7a (20 ng/ml). como se indica en los paneles. Las células fueron tratadas durante 5 días. Los resultados se expresan como aumento de veces sobre las células no diferenciadas.
La Figura 27 representa la expresión de CXCR4 en cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9 en el paso 46, por FACS a los cinco días después del tratamiento. El panel (a) representa la expresión de CXCR4 en ausencia de Wnt-3a. El panel (b) representa la expresión de CXCR4 después del tratamiento con 10 ng/ml de Wnt-3a. El panel (c) representa la expresión de CXCR4 después del tratamiento con 20 ng/ml de Wnt-3a, y el panel (d) representa la expresión de CXCR4 después del tratamiento con 50 ng/ml de Wnt-3a.
La Figura 28 representa la expresión de marcadores definitivos indicados en cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9 después de 5 días de tratamiento. Los resultados se muestran como un incremento de la expresión en células no tratadas, según lo determinado por PCR en tiempo real. El panel (a) muestra el efecto de 10, 20 y 50 ng/ml de Wnt-3a sobre la expresión de los genes marcadores de endodermo definitivos indicados. El panel (b) muestra el efecto de 1, 5 o 10 ng/ml de Wnt-3a (etiquetas del eje x: 10, 5, 1) sobre la expresión en goosecoid (■) y CXCR4 (□), en 2 (2d) y 5 (5d) días después del tratamiento. El panel (c) muestra el efecto de 1, 5 o 10 ng/ml de Wnt-3a en el número de células, a los 2 días (□) o 5 días (■).
La Figura 29 representa la expresión de CXCR4 en cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9 por FACS, después de un tratamiento de 5 días con el protocolo de diferenciación descrito en el Ejemplo 4. Las células se cultivaron en ausencia de Wnt-3a o inhibidor de GSK-3B (panel a), 20 ng/ml Wnt-3a para el período completo de 5 días (panel b), 1000 nM GSK-3B inhibidor IX durante todo el período de 5 días (panel c), 500 nM GSK-3B inhibidor iX durante todo el período de 5 días (panel d), inhibidor de GSK-3B IX nM 100 nM durante todo el período de 5 días (panel e), inhibidor de GSK-3B 10 nM GS durante todo el período de 5 días (panel f), inhibidor de GSK-3B 100 nM IX para los días 1-2 (panel g), 10 nM de inhibidor de GSK-3B IX para los días 1-2 (panel h).
La Figura 30 representa la expresión génica de marcadores endodérmicos definitivos mediante PCR en tiempo real. Los resultados se expresan como aumento de veces sobre las células no tratadas. El panel (a) muestra datos obtenidos de la línea celular embrionaria humana H9 en el paso número 48, tratados según el protocolo de endodermo definitivo descrito en el Ejemplo 4, que contiene el inhibidor de Wnt-3a o GSK-3B en las concentraciones y los tiempos indicados. El panel (b) muestra los datos obtenidos de la línea celular embrionaria humana H9 en el paso número 46, tratados según el protocolo de endodermo definitivo descrito en el Ejemplo 4, que contiene el inhibidor de Wnt-3a o GSK-3B en las concentraciones y los tiempos indicados.
La Figura 31 representa la expresión de CXCR4 por FACS para líneas de células madre embrionarias utilizadas en la presente invención. Los paneles (a-d) muestran los datos obtenidos de la línea de células madre embrionarias humanas H9 en el paso número 49. Los paneles (e-f) muestran los datos obtenidos de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en el paso número 46. Los datos se obtuvieron 5 días después del tratamiento. Las células se trataron con las siguientes condiciones: Panel (a): 10 ng/ml de activina A durante los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3a durante los primeros dos días; panel (b): 100 ng/ml de activina A durante los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3a durante los primeros dos días; panel (c): 100 ng/ml de activina A durante los cinco días más 100 nM de inhibidor de GSK-3B IX durante los primeros dos días; panel (d): 10 ng/ml de activina A durante los cinco días más 100 nM de inhibidor de GSK-3B IX durante los primeros dos días, panel (e): 100 ng/ml de activina A durante los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3a para los primeros dos días, y panel (f): 10 ng/ml de activina A para los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3a para los primeros dos días.
La Figura 32 representa la expresión génica de marcadores endodérmicos definitivos, según lo determinado por PCR en tiempo real para cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9 en el pasaje 49, tratados con 10, 50 o 100 ng/ml de activina A más 20 ng/ml de Wnt-3a: panel (a): expresión de AFP, Bry, CXCR4, GSC, HNF-3B y POU5F (oct-4) y panel (b): SOX-17 y GATA4. Los resultados se expresan como aumento de veces sobre las células no tratadas.
La Figura 33 representa la expresión de CXCR4 por FACS para la línea de células madre embrionarias H9 en el paso 53. Los datos se obtuvieron 5 días después del tratamiento. Las células se trataron con las siguientes condiciones: Panel (a): 100 ng/ml de activina A durante los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3a durante los primeros dos días y 25 ng/ml de BMP-4 para los días 3-5; panel (b): 100 ng/ml de activina A durante los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3a durante los primeros dos días; panel (c): 100 ng/ml de activina A durante los cinco días más 100 nM de inhibidor de GSK-3B IX durante los primeros dos días; panel (d): 20 ng/ml Wnt-3a 25 ng/ml BMP-4 para los cinco días; panel (e): 100 ng/ml de activina A durante los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3a 100 nm GSK-3B inhibidor IX durante los primeros dos días, y panel (f): 100 ng/ml de activina A 25 ng/ml BMP-4 para los cinco días. Para todos los paneles, el eje X representa la expresión de CD9 y el eje Y representa la expresión de CXCR4 (CD184).
La Figura 34 representa la expresión génica de marcadores endodérmicos definitivos, según lo determinado por PCR en tiempo real para cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en el pase 46, tratados con 10 o 100 ng/ml de activina A más 20 ng/ml de Wnt-3a o 100 NM inhibidor GSK-3B: panel (a): expresión de AFP, Bry, CXCR4, GSC y POU5F (Oct-4) y panel (b): SOX-17, HNF-3B y GATA4. Los resultados se expresan como aumento de veces sobre las células no tratadas.
La Figura 35 representa la expresión génica de marcadores endodérmicos definitivos, según se determinó mediante PCR en tiempo real para cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9 en el pase 49, tratada con 50 o 100 ng/ml de activina A más 10 o 100 nM Inhibidor GSK-3B: panel (a): expresión de AFP, Bry, CXCR4, GSC, HNF-3B y POU5F (Oct-4) y panel (b): SOX-17 y GATA4. Los resultados se expresan como aumento de veces sobre las células no tratadas.
La Figura 36 representa la expresión génica de marcadores endodérmicos definitivos, según lo determinado por PCR en tiempo real para cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9 en el paso 53, tratada con combinaciones de activina A, Wnt-3a, inhibidor de GSK-3 y BMP-4, durante cinco días: panel (a): expresión de AFP, Bry, CXCR4, GSC, HNF-3B, y SOX7 y panel (b): SOX-17, HNF-3B y GATA4.
La Figura 37 representa el porcentaje de expresión de CXCR4, determinado por FACS, en cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9, tratadas con las condiciones enumeradas en el Ejemplo 22.
La Figura 38 representa la expresión de marcadores endodérmicos definitivos según lo determinado por FACS en cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9, cultivadas en fibronectina (panel a) o MATRIGEL™ (panel b).
La Figura 39 representa la expresión de marcadores endodérmicos definitivos según lo determinado por la PCR en tiempo real en cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9, cultivadas en fibronectina (□) o una dilución 1:10 del factor de crecimiento reducido MATRIGEL (1).
La Figura 40 muestra el efecto de varias concentraciones de MATRIGEL en presencia de bajo contenido de suero, 100 ng/ml de activina A y 20 ng/ml de Wnt-3a en la diferenciación de células madre embrionarias humanas en endodermo definitivo. Las células se trataron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 4. Los resultados mostrados son los niveles de expresión de los genes indicados, según lo determinado por PCR en tiempo real.
La Figura 41 muestra el papel de Wnt-3a en la formación definitiva de endodermo por células madre embrionarias humanas mantenidas en MATRIGEL, pero diferenciadas en fibroblastos embrionarios de ratón. Los paneles (a-d) muestran datos de PCR en tiempo real para los genes indicados. Los paneles (por ejemplo) muestran datos FACS para las condiciones indicadas.
La Figura 42 muestra la diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en un sustrato de cultivo de tejidos recubierto con MATRIGEL™ a endodermo definitivo después del tratamiento con el inhibidor de Wnt DKK-1. Los resultados mostrados son la expresión de los genes indicados, según lo determinado por PCR en tiempo real en células H9 tratadas según los métodos descritos en el Ejemplo 4 en presencia de 20 ng/ml de Wnt-3A más 100 ng/ml de DKK1 (DE DKK1), o en ausencia de DKK1 (DE).
La Figura 43 muestra la tinción por inmunofluorescencia de marcadores endodérmicos definitivos en cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9 cultivadas en un sustrato de cultivo de tejidos recubierto con MATRIGEL y diferenciado en suero bajo más 100 ng/ml de activina A sin (panel a), o con panel b) 20 ng/ml de Wnt-3a. Ecad = E-cadherina, NCAM = N-cadherina,
La Figura 44 muestra la diferenciación de la línea de células madre embrionarias humanas SA002 en el paso 38 en el endodermo definitivo. Las células se trataron durante cinco días con las condiciones indicadas y la expresión génica se determinó mediante PCR en tiempo real, para los genes indicados en los paneles.
La Figura 45 muestra la expresión de CXCR4 por FACS en la línea de células madre embrionarias humanas SA002 en el paso 38, después del tratamiento con 100 ng/ml de tratamiento con A (panel a), 100 ng/ml de activina A 20 ng/ml Wnt-3a (panel b), o 100 ng/ml de activina A inhibidor de GSK-3B IX 100 nM (panel c). Las células fueron tratadas durante cinco días.
La Figura 46 muestra la diferenciación de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en el paso 55 en endodermo definitivo en un sustrato de cultivo de tejidos recubierto con suero humano. Las células se trataron con las condiciones indicadas y la expresión génica se determinó mediante PCR en tiempo real, para los genes indicados en los paneles.
La Figura 47 muestra la diferenciación de cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en P54, en un sustrato de cultivo de tejidos recubierto con MATRIGEL™ hasta un endodermo definitivo. Los efectos de varios inhibidores de GSK-B se ensayaron siguiendo un protocolo de DE de cinco días. Los siguientes inhibidores de GSK-3B se evaluaron a 100 nM durante los dos primeros días de tratamiento: GSK-3B VIII, IX, XI y XII.
La Figura 48 muestra la expresión de AFP (panel a), Pdx-1 (panel b), Cdx-2 y Glut-2 (panel c) y HNF-3beta, HNF-6 y somatostatina (panel d) en cultivos de humanos. línea de células madre embrionarias H9 en el paso 49, cultivadas y tratadas según los métodos descritos en el Ejemplo 4 en presencia de 20 ng/ml de Wnt-3a durante los primeros dos días de tratamiento. Después del tratamiento, las células se trataron durante tres días adicionales con 2% de FBS y 1 m de ácido retinoico M, de 0,1 a 1 pM TTNPB (4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametilo-2-naftalenilo)-1-propenilo]ácido benzoico ácido arotinoide), o 0,1-10 pM a M-580 (4-[(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametilo-2-naftalenilo)carboxamido]ácido benzoico). Las células se trataron a continuación durante tres días adicionales en FBS al 2% más 20 ng/ml de bFGF.
La Figura 49 muestra los resultados de la PCR en tiempo real de la expresión de los marcadores endodérmicos definitivos indicados en los paneles a y b. en cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H1 tratadas con activina A y Wnt-1 para los tiempos y concentraciones indicados.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0028] Para mayor claridad de descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en subsecciones que describen o ilustran ciertas características, realizaciones o aplicaciones de la presente invención.
Definiciones
[0029] Las células madre son células no diferenciadas definidas por su capacidad en el nivel de células individuales para auto-renovarse y diferenciarse para producir células de la progenie, incluyendo progenitores de autorenovación, progenitores de no-renovación, y células diferenciadas terminalmente. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, si no todos, los tejidos después de la inyección en blastocistos.
[0030] Las células madre se clasifican por su potencial de desarrollo como: (1) totipotentes, es decir, capaz de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotentes, es decir, capaces de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias; (3) multipotentes, lo que significa que puede dar lugar a un subconjunto de linajes celulares, pero todo dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir progenie que incluyen HSC (renovación automática), progenitores oligopotentes restringidos a las células sanguíneas y todos los tipos y elementos celulares (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotentes, lo que significa que pueden dar lugar a un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madre multipotentes; y (5) unipotentes, lo que significa que pueden dar lugar a un único linaje celular (p. ej., células madre espermatogénicas).
[0031] La diferenciación es el proceso por el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada adquiere las características de una célula especializada como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula diferenciada o inducida por la diferenciación es una que ha adquirido una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometido", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha avanzado en la ruta de diferenciación hasta un punto donde, en circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o un subconjunto de tipos de células, y no puede, en circunstancias normales, diferenciarse en un tipo de célula diferente o revertir a un tipo de célula menos diferenciado. La diferenciación se refiere al proceso mediante el cual una célula vuelve a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se usa en este documento, el linaje de una célula define la herencia de la célula, es decir, de qué células proviene y a qué células pueden dar lugar. El linaje de una célula coloca a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico de linaje se refiere a una característica específicamente asociada con el fenotipo de células de un linaje de interés y se puede usar para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida al linaje de interés.
[0032] "AFP" o "proteína alfa-fetoproteína" como se usa en este documento, se refiere a un antígeno producido al inicio del desarrollo del hígado. La AFP también puede expresarse en células extraembrionarias.
[0033] "Albúmina" es una proteína monomérica soluble que constituye aproximadamente la mitad de todas las proteínas de suero en los adultos.
[0034] "Linaje de células p" se refiere a células con expresión génica positiva para el factor de transcripción PDX-1 y al menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4 y Pax6. Las células que expresan marcadores característicos del linaje de células p incluyen células p.
[0035] Brachyury, como se usa en este documento, es un miembro de la familia de genes de la caja T. Es el marcador para la línea primitiva y células mesodérmicas.
[0036] Las "células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo" como se usa en este documento se refieren a las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: SOX-17, GATA-4, HNF-3 beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, proteína homeobox tipo mezcla, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99 u OTX2. Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo incluyen células precursoras de la línea primitiva, células de la línea primitiva, células del mesendodermo y células endodérmicas definitivas.
[0037] "c-Kit" y "CD117" se refieren a una tirosina quinasa receptora de la superficie celular que tiene una secuencia descrita en el número de registro de Genbank X06182, o una secuencia variante que se produce de forma natural (por ejemplo, variante alélica).
[0038] "CD99", como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína codificada por el gen con el número de acceso NM_002414.
[0039] "Células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático", como se usa en el presente documento se refieren a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores:
PDX-1, HNF-1beta, PTF-1 alfa, HNF-6 o HB9. Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático incluyen células endodérmicas pancreáticas.
[0040] "Células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático", como se usa en el presente documento se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: NGN-3, NeuroD, Islote-1, PDX-1, Nkx6.1, Pax-4, o PTF-1 alfa. Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático incluyen células endocrinas pancreáticas, células que expresan hormona pancreática y células secretoras de hormona pancreática, y células del linaje de células p.
[0041] "CER1" o "Cerebrus" como se usa en el presente documento es un miembro de la superfamilia de nudo de cisteína de las proteínas.
[0042] "CXCR4" como se usa en este documento se refiere al receptor del factor 1 derivado de células estromales (SDF-1), también conocido como "LESTR" o "fusin". En el embrión de ratón de gastrulación, CXCR4 se expresa en el endodermo definitivo y el mesodermo, pero no en el endodermo extraembrionario.
[0043] "Endodermo definitivo", como se usa en el presente documento, se refiere a las células que tienen las características de las células que surgen del epiblasto durante la gastrulación y que forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células endodérmicas definitivas expresan los siguientes marcadores: HNF-3 beta, GATA-4, SOX-17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 y Mixl 1.
[0044] El "endodermo extraembrionario", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: SOX-7, AFP y SPARC.
[0045] "FGF-2", "FGF-4" "FGF-8" "FGF-10", y "FGF-17", como se usa en este documento, son miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos.
[0046] "GATA-4" y "GATA-6" son miembros de la familia de factores de transcripción GATA. Esta familia de factores de transcripción es inducida por la señalización de TGF-p y contribuye al mantenimiento de los marcadores tempranos del endodermo.
[0047] "GLUT-2", como se usa en el presente documento, se refiere a la molécula de transportador de glucosa que se expresa en numerosos tejidos fetales y adultos, incluyendo páncreas, hígado, intestino, cerebro, y riñón.
[0048] "Goosecoid" o "GSC" como se usa en el presente documento, se refiere a un factor de transcripción del homeodominio expresado en el labio dorsal del blastoporo.
[0049] "HB9" como se usa en el presente documento, se refiere al gen 9 de homeobox.
[0050] "HNF-1 alfa", "HNF-1 beta", "HNF-3 beta" y "HNF-6" pertenecen a la familia del factor nuclear hepático de factores de transmisión, que se caracteriza por un dominio de unión a ADN altamente conservado y dos dominios carboxi-terminales cortos.
[0051] "Islote-1" o "Isl-1", como se usa en el presente documento, es un miembro de la familia de factores de transcripción LIM/homeodominio, y se expresa en el páncreas en desarrollo.
[0052] "MafA" como se usa en este documento es un factor de transcripción expresado en el páncreas, y controla la expresión de genes involucrados en la biosíntesis y secreción de insulina.
[0053] Los "marcadores", como se usan en este documento, son moléculas de ácido nucleico o polipéptido que se expresan diferencialmente en una célula de interés. En este contexto, la expresión diferencial significa un nivel incrementado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo. El nivel detectable del ácido nucleico o polipéptido marcador es suficientemente alto o más bajo en las células de interés en comparación con otras células, de manera que la célula de interés puede identificarse y distinguirse de otras células utilizando cualquiera de los diversos métodos conocidos en la técnica.
[0054] "Célula de mesendodermo" como se usa en este documento se refiere a una célula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: CD48, eomesodermina (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 beta, GSC, FGF17, GATA-6.
[0055] "MIXL1" tal como se utiliza aquí, se refiere a un gen homeobox, que es marcador de las células en la línea primitiva, mesodermo y endodermo.
[0056] "NeuroD" como se usa en este documento es un factor de transcripción hélice-bucle-hélice (bHLH) básico implicado en la neurogénesis.
[0057] "NGN-3", como se usa en el presente documento, es un miembro de la familia de neurogeninas de factores básicos de transcripción bucle-hélice-bucle.
[0058] "Nkx-2.2" y "Nkx-6.1" como se usa en el presente documento son miembros de la familia del factor de transcripción Nkx.
[0059] "Nodal", como se usa en el presente documento, es un miembro de la superfamilia de proteínas TGF beta.
[0060] "Oct-4" es un miembro del factor de transcripción POU-dominio y es ampliamente considerado como un sello distintivo de células madre pluripotentes. La relación de Oct-4 con células madre pluripotentes se indica por su expresión estrechamente restringida a células madre pluripotentes no diferenciadas. Tras la diferenciación a los linajes somáticos, la expresión de Oct-4 desaparece rápidamente.
[0061] "Célula endocrina pancreática", o "célula que expresa la hormona pancreática" como se usa en este documento se refiere a una célula capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático.
[0062] "Célula secretora de hormona pancreática", como se usa en este documento, se refiere a una célula capaz de secretar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático.
[0063] "Pax-4" y "Pax-6" como se usa en el presente documento son factores de transcripción específicos de células p pancreáticas que están implicadas en el desarrollo de los islotes.
[0064] "PDX-1" como se usa en el presente documento se refiere a un factor de transcripción de homeodominio implicado en el desarrollo del páncreas.
[0065] "Célula de línea pre-primitiva" como se usa en este documento se refiere a una célula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: Nodal, o FGF8.
[0066] "Célula de línea primitiva", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: braquiosis, proteína homeobox tipo mezcla o FGF4.
[0067] "PTF-1 alfa", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína hélice-bucle-hélice básica de 48 kD que es una subunidad de unión al ADN específica de secuencia del factor-1 de transcripción del páncreas (PTF1).
[0068] "SOX-1", "SOX-2", "SOX-7" y "SOX-17" como se usan en este documento, son miembros de la familia del factor de transcripción SOX, y están implicados en la embriogénesis.
[0069] "SPARC" como se usa en este documento también se conoce como "proteína ácida secretada y rica en cisteína".
[0070] "SSEA-1" (Antígeno-1 Embriónico de Etapa Específica) es un antígeno de superficie de glicolípido presente en la superficie de células madre de teratocarcinoma murino (EC), células germinales embrionarias murinas y humanas (EG) y células madre embrionarias murinas (ES).
[0071] "SSEA-3" (antígeno-3 embrionario de etapa específica) es un antígeno de superficie de glicolípido presente en la superficie de las células madre (EC) del teratocarcinoma humano, las células germinales embrionarias (EG) y las células madre del embrión humano (ES).
[0072] "SSEA-4" (antígeno embrionario-4 de etapa específica) es un antígeno de superficie de glicolípido presente en la superficie de células madre (EC) de teratocarcinoma humano, células germinales embrionarias humanas (EG) y células madre embrionarias humanas (ES).
[0073] "TRA1-60" es un antígeno relacionado con el sulfato de queratina que se expresa en la superficie de las células madre (EC) del teratocarcinoma humano, las células germinales embrionarias humanas (EG) y las células madre embrionarias humanas (ES).
[0074] "TRA1-81" es un antígeno relacionado con el sulfato de queratina que se expresa en la superficie de las células madre (EC) del teratocarcinoma humano, las células germinales embrionarias humanas (EG) y las células madre embrionarias humanas (ES).
[0075] "TRA2-49" es una isozima de fosfatasa alcalina expresada en la superficie de las células madre (EC) del teratocarcinoma humano y las células madre (ES) embrionarias humanas.
[0076] "UTF-1", como se usa en el presente documento, se refiere a un coactivador transcripcional expresado en células madre embrionarias pluripotentes y células extraembrionarias.
[0077] "Zic1" como se usa en este documento es un miembro de la familia del factor de transcripción Zic. Zic1 regula la expresión de genes específicos de la cresta neural y neural y se expresa en las células del tubo neural dorsal y la cresta neural premigratoria.
Aislamiento, expansión y cultivo de células madre pluripotentes.
Caracterización de células madre pluripotentes.
[0078] Las células madre pluripotentes pueden expresar uno o más de los antígenos embrionarios específicos de la etapa (SSEA) 3 y 4, y marcadores detectables usando los anticuerpos designados Tra-1-60 y Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282 : 1145, 1998). La diferenciación de células madre pluripotentes in vitro da como resultado la pérdida de la expresión de SSEA-4, Tra-1-60 y Tra-1-81 (si está presente) y un aumento de la expresión de SSEA-1. Las células madre pluripotentes indiferenciadas típicamente tienen actividad de fosfatasa alcalina, que puede detectarse fijando las células con paraformaldehído al 4% y luego desarrollándose con Vector Red como un sustrato, como lo describe el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, California). Células madre pluripotentes indiferenciadas también típicamente expresan Oct-4 y el TERT, según lo detectado por RT-PCR.
[0079] Otro fenotipo deseable de células madre pluripotentes propagadas es un potencial de diferenciarse en células de las tres capas germinales: tejidos de endodermo, mesodermo y ectodermo. La pluripotencia de las células madre pluripotentes se puede confirmar, por ejemplo, inyectando células en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID), fijando los teratomas que se forman con un 4% de paraformaldehído, y luego examinándolos histológicamente para detectar evidencias de tipos celulares de las tres capas germinales. Alternativamente, la pluripotencia se puede determinar mediante la creación de cuerpos embrioides y la evaluación de los cuerpos embrioides para detectar la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.
[0080] Las líneas de células madre pluripotentes pueden ser cariotipadas utilizando una técnica de bandeo G estándar y se compararon con cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable obtener células que tengan un "cariotipo normal", lo que significa que las células son euploides, en donde todos los cromosomas humanos están presentes y no están notablemente alterados.
Fuentes de células madre pluripotentes.
[0081] Los ejemplos no limitantes de células madre pluripotentes son líneas de células madre embrionarias humanas o células germinales embrionarias humanas establecidas. Otros ejemplos de líneas de células madre embrionarias humanas incluyen las líneas celulares de referencia H1, H7 y H9 (WiCell). También se contempla el uso de las composiciones de esta descripción durante el establecimiento inicial o la estabilización de tales células, en cuyo caso las células de origen serían células pluripotentes primarias tomadas directamente de los tejidos de origen. También son adecuadas las células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivadas en ausencia de células alimentadoras. Las líneas de células madre embrionarias humanas mutantes incluyen, por ejemplo, la línea celular de referencia BGOlv (BresaGen, Athens, GA).
[0082] Las células madre embrionarias humanas de referencia se pueden preparar como se describe por Thomson et al. (Patente de Estados Unidos N° 5.843.780; Science282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 y sig., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92: 7844,1995).
Cultivo de células madre pluripotentes.
[0083] En una realización, las células madre pluripotentes típicamente se cultivan sobre una capa de células alimentadoras que soportan las células madre pluripotentes de diversos modos. Alternativamente, las células madre pluripotentes se cultivan en un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras, pero no obstante, apoya la proliferación de células madre pluripotentes sin sufrir una diferenciación sustancial. El crecimiento de células madre pluripotentes en un cultivo sin alimentadores sin diferenciación se apoya mediante un medio condicionado por el cultivo previo con otro tipo de células. Alternativamente, el crecimiento de células madre pluripotentes en un cultivo sin alimentador sin diferenciación se apoya utilizando un medio químicamente definido.
[0084] Por ejemplo, Reubinoff y otros (Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)) y Thompson y otros (Science 6 de noviembre de 1998: Vol. 282. n° 5391, páginas 1145 - 1147) describen el cultivo de líneas de células madre pluripotentes de referencia de blastocistos humanos que utilizan una capa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón.
[0085] Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003) evaluaron un panel de 11 capas de células alimentadoras adultas, fetales y neonatales humanas diferentes por su capacidad para apoyar el cultivo de células madre pluripotentes. Richards et al, declaran: "las líneas de células madre embrionarias humanas cultivadas en alimentadores de fibroblastos de piel adulta conservan la morfología de células madre embrionarias humanas y siguen siendo pluripotentes".
[0086] El documento US20020072117 describe líneas celulares que producen medios que soportan el crecimiento de células madre pluripotentes de primates en cultivos libres de alimentadores. Las líneas celulares empleadas son líneas celulares mesenquimales y de tipo fibroblasto obtenidas a partir de tejido embrionario o diferenciadas de células madre embrionarias. El documento US20020072117 también describe el uso de las líneas celulares como una capa de células de alimentación primaria.
[0087] En otro ejemplo, Wang et al (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) da a conocer métodos para el crecimiento a largo plazo de células madre pluripotentes humanas en capas de células de alimentación derivadas de células madre embrionarias humanas.
[0088] En otro ejemplo, Stojkovic et al (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) describen un sistema de células de alimentación derivado de la diferenciación espontánea de células madre embrionarias humanas.
[0089] En un ejemplo adicional, Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004) describen una fuente de células de alimentación obtenidas a partir de placenta humana.
[0090] (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) Amit et al, describen una capa de células de alimentación derivadas de prepucio humano.
[0091] En otro ejemplo, Inzunza et al (Stem Cells 23: 544-549, 2005) describen una capa de células de alimentación de fibroblastos humanos del prepucio postnatal.
[0092] El documento US6642048 describe medios que soportan el crecimiento de células madre pluripotentes (pPS) de primates en cultivos libres de alimentador, y líneas celulares útiles para la producción de dichos medios. El documento US6642048 afirma: "Esta invención incluye líneas celulares mesenquimales y fibroblásticas obtenidas a partir de tejido embrionario o diferenciadas de células madre embrionarias. Los métodos para obtener dichas líneas celulares, medios de procesamiento y células madre en crecimiento utilizando los medios acondicionados se describen e ilustran en esta descripción."
[0093] En otro ejemplo, WO2005014799 da a conocer un medio acondicionado para el mantenimiento, la proliferación y la diferenciación de células de mamíferos. El documento WO2005014799 afirma: "El medio de cultivo producido de acuerdo con la presente invención está condicionado por la actividad de secreción celular de las células murinas, en particular, aquellos hepatocitos transgénicos diferenciados e inmortalizados, denominados MMH (Met Hepatocyte Murine)".
[0094] En otro ejemplo, Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004) describe el medio acondicionado obtenido a partir de derivados de células madre embrionarias humanas que se han modificado genéticamente para expresión sobre la telomerasa humana transcriptasa inversa.
[0095] En otro ejemplo, US20070010011 da a conocer un medio de cultivo químicamente definido para el mantenimiento de células madre pluripotentes.
[0096] Un sistema de cultivo alternativo emplea un medio libre de suero suplementado con factores de crecimiento capaces de promover la proliferación de células madre embrionarias. Por ejemplo, Cheon y otros (BioReprod DOI: 10.1095/biolre-prod.105.046870, 19 de octubre de 2005) describen un sistema de cultivo libre de suero y libre de alimentador en el que las células madre embrionarias se mantienen en medio de reemplazo de suero no condicionado (SR) suplementado con diferentes factores de crecimiento capaces de desencadenar la autorenovación de las células madre embrionarias.
[0097] En otro ejemplo, Levenstein et al (Stem Cells 24: 568-574, 2006) describen métodos para el cultivo a largo plazo de las células madre embrionarias humanas en ausencia de fibroblastos o medio acondicionado, utilizando medios suplementados con bFGF.
[0098] En otro ejemplo, US20050148070 da a conocer un método de cultivo de células madre embrionarias humanas en medio definido sin suero y sin células alimentadoras de fibroblastos, comprendiendo el método: cultivar las células madre en un medio de cultivo que contiene albúmina, aminoácidos, vitaminas, minerales, al menos una transferrina o sustituto de transferrina, al menos una insulina o un sustituto de insulina, el medio de cultivo esencialmente libre de suero fetal de mamífero y que contiene al menos aproximadamente 100 ng/ml de un factor de crecimiento de fibroblastos capaz de activar un receptor de señalización del factor de crecimiento de fibroblastos, en donde el factor de crecimiento proviene de una fuente que no es solo una capa de alimentación de fibroblastos, el medio apoyó la proliferación de células madre en un estado indiferenciado sin células de alimentación o medio acondicionado.
[0099] En otro ejemplo, US20050233446 da a conocer un medio definido útil en el cultivo de células madre, incluyendo células madre primordiales de primates no diferenciadas. En solución, el medio es sustancialmente isotónico en comparación con las células madre que están siendo cultivadas. En un cultivo dado, el medio particular comprende un medio base y una cantidad de cada uno de bFGF, insulina y ácido ascórbico necesarios para soportar un crecimiento sustancialmente indiferenciado de las células madre primordiales.
[0100] En otro ejemplo, US6800480 afirma "En una realización, se proporciona un medio de cultivo celular para el cultivo de células madre primordiales de primates derivado en un estado sustancialmente no diferenciado que incluye una presión osmótica baja, medio básico de baja endotoxina que es eficaz para apoyar el crecimiento de células madre primordiales derivadas de primates. El medio básico se combina con un suero nutriente eficaz para apoyar el crecimiento de células madre primordiales derivadas de primates y un sustrato seleccionado del grupo que consiste en células alimentadoras y un componente de matriz extracelular derivado de células alimentadoras. El medio incluye además aminoácidos no esenciales, un antioxidante y un primer factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en nucleósidos y una sal de piruvato".
[0101] En otro ejemplo, US20050244962 establece: "En un aspecto, la invención proporciona un método de cultivo de células madre embrionarias de primates. Se cultivan las células madre en un cultivo esencialmente libre de suero fetal de mamífero (preferiblemente también esencialmente libre de cualquier suero animal) y en presencia de un factor de crecimiento de fibroblastos que se suministra desde una fuente que no sea solo una capa de alimentación de fibroblastos. En una forma preferida, la capa de alimentación de fibroblastos, previamente requerida para mantener un cultivo de células madre, se vuelve innecesaria mediante la adición de factor de crecimiento de fibroblastos suficiente."
[0102] En un ejemplo adicional, WO2005065354 da a conocer un medio de cultivo isotónico definido que es esencialmente libre de alimentador y libre de suero, que comprende: a. un medio basal; b. una cantidad de bFGF suficiente para soportar el crecimiento de células madre de mamíferos sustancialmente indiferenciadas; c. una cantidad de insulina suficiente para soportar el crecimiento de células madre de mamíferos sustancialmente indiferenciadas; y d. una cantidad de ácido ascórbico suficiente para soportar el crecimiento de células madre de mamíferos sustancialmente indiferenciadas.
[0103] En otro ejemplo, WO2005086845 da a conocer un método para el mantenimiento de una célula madre no diferenciada, comprendiendo dicho método la exposición de una célula madre a un miembro de la familia de proteínas de factor de crecimiento transformante beta (TGF p), un miembro de la familia de proteínas de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) o nicotinamida (NIC) en una cantidad suficiente para mantener la célula en un estado indiferenciado durante un tiempo suficiente para lograr el resultado deseado.
[0104] Las células madre pluripotentes se pueden sembrar sobre un sustrato de cultivo adecuado. En una realización, el sustrato de cultivo adecuado es un componente de matriz extracelular, tal como, por ejemplo, los derivados de la membrana basal o que pueden formar parte de acoplamientos de receptor-ligando de molécula de adhesión. En una realización, el sustrato de cultivo adecuado es Matrigel® (Becton Dickenson). Matrigel® es una preparación soluble de células tumorales de Engelbreth-Holm-Swarm que gelifica a temperatura ambiente para formar una membrana basal reconstituida.
[0105] Otros componentes de la matriz extracelular y el componente de mezclas son adecuados como una alternativa. Dependiendo del tipo de célula que prolifere, esto puede incluir laminina, fibronectina, proteoglicano, entactina, sulfato de heparano y similares, solos o en varias combinaciones.
[0106] Las células madre pluripotentes se pueden sembrar en el sustrato en una distribución adecuada y en presencia de un medio que promueve la supervivencia celular, propagación, y la retención de las características deseables. Todas estas características se benefician de una cuidadosa atención a la distribución de la siembra y pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica.
[0107] Medios de cultivo adecuados pueden estar hechos de los siguientes componentes, tales como, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Gibco n° 11965-092; medio de Eagle modificado de Knockout Dulbecco (KO DMEM), Gibco n° 10829-018; Medio basal F12/50% DMEM de Ham; L-glutamina 200 mM, Gibco n° 15039-027; solución de aminoácidos no esenciales, Gibco 11140-050; p-mercaptoetanol, Sigma n° M7522; factor de crecimiento de fibroblastos básicos recombinantes humanos (bFGF), Gibco n° 13256-029.
Diferenciación de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático
[0108] Las células madre pluripotentes de referencia incluyen, por ejemplo, la línea humana embrionaria de células madre H9 (código NIH: WA09), la línea de células madre embrionarias humanas H1 (NIH código: WA01), la línea de células madre embrionarias humanas H7 (código NIH : WA07), y la línea de células madre embrionarias humanas SA002 (Cellartis, Suecia). Adecuadas para usar en la presente invención son células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores característicos de células pluripotentes: ABCG2, cripto, CD9, FoxD3, Conexina43, Conexina45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA -3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
[0109] Los marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se seleccionan del grupo que consiste en SOX17, GATA4, Hnf-3beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, proteína homeobox tipo mezcla, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, c D99 y OTX2. Adecuada para uso en la presente invención es una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo es una célula precursora de línea primitiva. En un aspecto alternativo, una célula que expresa marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo es una célula de mesendodermo. En un aspecto alternativo, una célula que expresa marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo es una célula endodérmica definitiva.
[0110] Los marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático se seleccionan del grupo que consiste en Pdx1, HNF-1beta, PTF1a, HNF-6, HB9 y PROX1. Adecuada para uso en la presente invención es una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático es una célula endodérmica pancreática.
[0111] Los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se seleccionan del grupo que consiste en NGN-3, NeuroD, Islote-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4 y PTF-1 alfa. En una realización, una célula endocrina pancreática es capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático. Adecuada para uso en la presente invención es una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática puede ser una hormona pancreática que expresa células. Alternativamente, la célula endocrina pancreática puede ser una célula secretora de hormona pancreática.
[0112] En un aspecto de la presente invención, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células p. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células p expresa Pdx 1 y al menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, h NF-3 beta, MAFA, Pax4, y Pax6. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células p es una célula p.
Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo.
[0113] Las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo por cualquier método en la técnica o mediante cualquier procedimiento propuesto en esta invención.
[0114] Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
[0115] Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662 (2004).
[0116] Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en McLean et al, Stem Cells 25, 29 - 38 (2007).
[0117] Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).
[0118] Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo mediante el cultivo de células madre pluripotentes en un medio que contiene activina A en ausencia de suero, luego se cultivan las células con activina A y suero, y luego se cultivan las células con activina A y suero de una concentración diferente. Un ejemplo de este método se describe en Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005).
[0119] Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo mediante el cultivo de células madre pluripotentes en un medio que contiene activina A en ausencia de suero, y luego se cultivan las células con activina A con suero de otra concentración. Un ejemplo de este método se describe en D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2005.
[0120] Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo cultivando las células madre pluripotentes en un medio que contiene activina A y un ligando Wnt en ausencia de suero, luego retirando el ligando Wnt y cultivando las células con activina A con suero. Un ejemplo de este método se describe en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).
[0121] En un aspecto de la presente invención, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo al colocar las células madre pluripotentes en un sustrato de cultivo de tejidos recubierto con una matriz extracelular, y luego cultivando las células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt en un primer medio de cultivo que contiene suero durante un período de tiempo, y luego se cultivan las células madre pluripotentes con activina A en un segundo medio de cultivo que contiene una mayor concentración de suero durante aproximadamente otro período de tiempo.
[0122] La concentración de suero en el primer medio de cultivo descrito anteriormente puede ser de aproximadamente cero a aproximadamente 0,5 por ciento, y el tiempo de cultivo puede ser de aproximadamente uno a aproximadamente tres días. La concentración de suero en el segundo medio de cultivo descrito anteriormente puede ser de aproximadamente el 0,5 por ciento a aproximadamente el dos por ciento, y el tiempo de cultivo puede ser de aproximadamente uno a aproximadamente cuatro días.
[0123] En una realización alternativa de la presente invención, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo al colocar las células madre pluripotentes en un sustrato de cultivo de tejidos recubierto con una matriz extracelular, y luego cultivar las células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt en un primer medio de cultivo que contiene suero durante aproximadamente un período de tiempo, y luego se cultivan las células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt en un segundo medio de cultivo que contiene una mayor concentración de suero durante otro período de tiempo.
[0124] La concentración de suero en el primer medio de cultivo descrito anteriormente puede ser de aproximadamente cero a aproximadamente 0,5 por ciento, y el tiempo de cultivo puede ser de aproximadamente una a aproximadamente tres días. La concentración de suero en el segundo medio de cultivo descrito anteriormente puede ser de aproximadamente el 0,5 por ciento a aproximadamente el dos por ciento, y el tiempo de cultivo puede ser de aproximadamente uno a aproximadamente cuatro días.
[0125] En una realización, la presente invención proporciona un método para la diferenciación de células madre pluripotentes que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo, que comprende las etapas de:
a. Recubrir las células madre pluripotentes en un sustrato de cultivo de tejidos recubierto con una matriz extracelular, y
b. Cultivo de células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt.
[0126] El cultivo de células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt se puede realizar en un solo medio de cultivo. Alternativamente, el cultivo de células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt puede realizarse por separado o en conjunto en más de un medio de cultivo. En una realización, el cultivo de las células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt se realiza en dos medios de cultivo.
Matriz extracelular
[0127] En un aspecto de la presente invención, las células madre pluripotentes se cultivan y diferencian sobre un sustrato de cultivo de tejidos recubiertos con una matriz extracelular. La matriz extracelular puede ser una preparación de membrana basal solubilizada extraída de células de sarcoma de ratón (que se vende por BD Biosciences con el nombre comercial MATRIGEL). Alternativamente, la matriz extracelular puede ser MATRIGEL con factor de crecimiento reducido. Alternativamente, la matriz extracelular puede ser fibronectina. En una realización alternativa, las células madre pluripotentes se cultivan y se diferencian en un sustrato de cultivo de tejidos recubierto con suero humano.
[0128] La matriz extracelular se puede diluir antes de recubrir el sustrato de cultivo de tejidos. Ejemplos de métodos adecuados para diluir la matriz extracelular y para recubrir el sustrato de cultivo de tejidos se pueden encontrar en Kleinman, HK, et al., Biochemistry 25: 312 (1986), y Hadley, MA, et al., J. Celell. 101: 1511 (1985).
[0129] En una realización, la matriz extracelular es MATRIGEL. En una realización, el sustrato de cultivo de tejidos se recubre con MATRIGEL a una dilución de 1:10. En una realización alternativa, el sustrato de cultivo de tejidos se recubre con MATRIGEL a una dilución de 1:15. En una realización alternativa, el sustrato de cultivo de tejidos se recubre con MATRIGEL a una dilución de 1:30. En una realización alternativa, el sustrato de cultivo de tejidos se recubre con MATRIGEL a una dilución de 1:60.
[0130] En una realización, la matriz extracelular es el crecimiento reducido del factor de MATRIGEL. En una realización, el sustrato de cultivo tisular se recubre con MATRIGEL con factor de crecimiento reducido a una dilución de 1:10. En una realización alternativa, el sustrato de cultivo de tejidos se recubre con MATRIGEL con factor de crecimiento reducido en una dilución de 1:15. En una realización alternativa, el sustrato de cultivo de tejidos se recubre con MATRIGEL con factor de crecimiento reducido a una dilución de 1:30. En una realización alternativa, el sustrato de cultivo tisular se recubre con MATRIGEL con factor de crecimiento reducido a una dilución 1:60.
Diferenciación de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo en una matriz extracelular, utilizando un solo medio de cultivo
[0131] Cuando se utiliza un medio de cultivo solo, debe contener concentraciones suficientemente bajas de ciertos factores para permitir la diferenciación de células madre pluripotentes a endodermo definitivo, tales como, por ejemplo insulina y el IGF (como se describe en WO2006020919). Esto se puede lograr reduciendo la concentración sérica o, alternativamente, utilizando medios químicamente definidos que carezcan de insulina e IGF. Ejemplos de medios químicamente definidos se describen en Wiles et al (Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247 (1): 241-8).
[0132] El medio de cultivo puede tener una concentración en suero en el intervalo de aproximadamente 0% a aproximadamente 10%. En una realización alternativa, la concentración puede estar en el intervalo de aproximadamente 0% a aproximadamente 5%. En una realización alternativa, la concentración puede estar en el intervalo de aproximadamente 0% a aproximadamente 2%. En una realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente el 2%.
[0133] El tiempo de cultivo con activina A y un ligando Wnt puede variar de aproximadamente 1 día a aproximadamente 7 días. En una realización alternativa, el tiempo de cultivo puede variar desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 3 días. En una realización alternativa, el tiempo de cultivo puede ser de aproximadamente 3 días.
[0134] La activina A se puede usar en cualquier concentración adecuada para causar la diferenciación de las células madre pluripotentes. La concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml. En una realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml. En otra realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En otra realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En otra realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 100 ng/ml.
[0135] La elección del ligando Wnt puede optimizarse para mejorar la eficiencia del proceso de diferenciación. El ligando Wnt puede seleccionarse del grupo que consiste en Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a y Wnt-7a. En una realización, el ligando Wnt es Wnt-1. En una realización alternativa, el ligando Wnt es Wnt-3a.
[0136] El ligando Wnt puede estar a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml. En una realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml.
[0137] El medio de cultivo solo puede contener también un inhibidor de GSK-3B. El inhibidor de GSK-3B puede seleccionarse del grupo que consiste en el inhibidor de GSK-3B IX y el inhibidor de GSK-3B XI. En una realización, el inhibidor de GSK-3B es el inhibidor de GSK-3B IX.
[0138] Cuando se cultivan células madre pluripotentes con un inhibidor de GSK-3B, la concentración del inhibidor de GSK-3B puede ser de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1000 nM. En una realización alternativa, las células madre pluripotentes se cultivan con el inhibidor de GSK-3B a una concentración de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 nM.
[0139] El medio de cultivo solo puede contener también al menos otro factor adicional que puede mejorar la formación de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo a partir de células madre pluripotentes. Alternativamente, al menos otro factor adicional puede aumentar la proliferación de los marcadores que expresan características del linaje de endodermo definitivo formado por los métodos de la presente invención. Además, al menos otro factor adicional puede mejorar la capacidad de los marcadores de expresión característicos del linaje endodérmico definitivo formado por los métodos de la presente invención para formar otros tipos de células, o mejorar la eficiencia de cualquier otra etapa de diferenciación adicional.
[0140] Al menos un factor adicional puede ser, por ejemplo, nicotinamida, miembros de la TGF-p de la familia, incluyendo TGF-p1, 2, y 3, albúmina de suero, miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento a A y BB derivado de las plaquetas, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento de insulina (IGF-I, II), factor de diferenciación del crecimiento (GDF-5, -6, -8, -10, 11), glucagón como el péptido-I y II (GLP-I y II), GLP-1 y GLP-2 imitador a cuerpo, Exendina-4, ácido retinoico, hormona paratiroidea, insulina, progesterona, aprotinina, hidrocortisona, etanolamina, beta mercaptoetanol, factor de crecimiento epidérmico (EGF), gastrina I y II, quelantes de cobre tales como, por ejemplo, trietileno pentamina, forskolina, Na-butirato, activina, betacelulina, ITS, noggin, factor de crecimiento de neurita, ganglio, ácido valórico, tricostatina A, butirato de sodio, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), esfingosina 1, VEGF, MG132 (EMD, CA), N2 y B27 (Gibco, CA), alcaloides esteroides como, por ejemplo, ciclopamina (EMD, CA), factor de flujo de queratinocitos gr (KGF), familia de proteínas Dickkopf, extracto de pituitaria bovina, proteína asociada a la neogénesis de los islotes (INGAP), erizo indio, erizo sónico, inhibidores del proteasoma, inhibidores de la vía de la muesca, inhibidores del erizo sónico, o combinaciones de los mismos.
[0141] Al menos otro factor adicional puede ser suministrado por medios acondicionados obtenidos de líneas de células pancreáticas, tales como, por ejemplo, PANC-1 (ATCC N°: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC N°: HTB-79), BxPC-3 (N° ATCC: CRL-1687), HpAf-II (N° At CC: CRL-1997), líneas celulares hepáticas tales como, por ejemplo, HepG2 (N° ATCC: HTB-8065), líneas celulares intestinales tales como, por ejemplo, FHs 74 (ATCC N°: CCL-241) y células endoteliales primarias o transformadas.
Diferenciación de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo en una matriz extracelular, utilizando dos medios de cultivo.
[0142] La diferenciación de células madre pluripotentes en células de un linaje de endodermo definitivo se puede lograr cultivando las células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt utilizando dos medios de cultivo. Por lo tanto, la diferenciación de las células madre pluripotentes se puede lograr de la siguiente manera:
a. Colocar las células madre pluripotentes en un sustrato de cultivo de tejidos recubierto con una matriz extracelular,
b. Cultivar las células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt en un primer medio de cultivo, y c. Cultivar las células madre pluripotentes con activina A en un segundo medio de cultivo.
[0143] El primer medio de cultivo puede contener suero a una concentración baja, y el segundo medio de cultivo puede contener suero a una concentración más alta que el primer medio de cultivo.
[0144] El segundo medio de cultivo puede contener un ligando Wnt.
[0145] Primer medio de cultivo: El primer medio de cultivo debe contener concentraciones suficientemente bajas de ciertos factores para permitir la diferenciación de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo, como, por ejemplo, insulina e IGF (como se describe en el documento WO2006020919). Esto se puede lograr reduciendo la concentración sérica o, alternativamente, utilizando medios químicamente definidos que carezcan de insulina e IGF. Ejemplos de medios químicamente definidos se describen en Wiles et al (Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247 (1): 241-8).
[0146] En el primer medio de cultivo que puede ser una menor concentración de suero, en relación con el segundo medio de cultivo. El aumento de la concentración sérica en el segundo medio de cultivo aumenta la supervivencia de las células o, alternativamente, puede aumentar la proliferación de las células. La concentración sérica del primer medio puede estar en el rango de aproximadamente 0% a aproximadamente 10%. Alternativamente, la concentración sérica del primer medio puede estar en el intervalo de aproximadamente 0% a aproximadamente 2%. Alternativamente, la concentración sérica del primer medio puede estar en el intervalo de aproximadamente 0% a aproximadamente 1%. Alternativamente, la concentración sérica del primer medio puede ser de aproximadamente el 0,5%.
[0147] Cuando se cultivan las células madre pluripotentes con activina A y un ligando Wnt utilizando al menos dos medios de cultivo, el tiempo de cultivo en el primer medio de cultivo puede variar de aproximadamente 1 día a aproximadamente 3 días.
[0148] La activina A se puede usar a cualquier concentración adecuada para causar la diferenciación de las células madre pluripotentes. La concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml. En una realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml. En otra realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En otra realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En otra realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 100 ng/ml.
[0149] La elección del ligando Wnt puede optimizarse para mejorar la eficiencia del proceso de diferenciación. El ligando wnt se puede seleccionar del grupo que consiste en Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a y Wnt-7a. En una realización, el ligando Wnt es Wnt-1. En una realización alternativa, el ligando Wnt es Wnt-3a.
[0150] El ligando Wnt puede estar a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml. En una realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml.
[0151] El primer medio de cultivo puede contener también un inhibidor de GSK-3B. El inhibidor de GSK-3B puede añadirse al primer medio de cultivo, al segundo medio de cultivo, o al primer y al segundo medio de cultivo.
[0152] El inhibidor de GSK-3B se puede seleccionar del grupo que consiste de inhibidor de GSK-3B IX e inhibidor de GSK-3B XI. En una realización, el inhibidor de GSK-3B es el inhibidor de GSK-3B IX.
[0153] Cuando se cultivan células madre pluripotentes con un inhibidor de GSK-3B, la concentración del inhibidor de GSK-3B puede ser de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1000 nM. En una realización alternativa, las células madre pluripotentes se cultivan con el inhibidor de GSK-3B a una concentración de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 nM.
[0154] El primer medio de cultivo puede contener también al menos otro factor adicional que puede mejorar la formación de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo a partir de células madre pluripotentes. Alternativamente, al menos otro factor adicional puede aumentar la proliferación de las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo formado por los métodos de la presente invención. Además, al menos otro factor adicional puede mejorar la capacidad de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo formado por los métodos de la presente invención para formar otros tipos de células, o mejorar la eficiencia de cualquier otra etapa de diferenciación adicional.
[0155] Al menos un factor adicional puede ser, por ejemplo, nicotinamida, miembros de la familia de TGF-p, incluyendo TGF-p1, 2, y 3, albúmina de suero, miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento-AA y -BB derivado de plaquetas, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento de insulina (IGF-I, II), factor de diferenciación del crecimiento (GDF-5, -6, -8, -10, 11), glucagón como el péptido-I y II (GLP-I y II), GLP-1 y GLP-2 imitador a cuerpo, Exendina-4, ácido retinoico, hormona paratiroidea, insulina, progesterona, aprotinina, hidrocortisona, etanolamina, beta mercaptoetanol, factor de crecimiento epidérmico (EGF), gastrina I y II, quelantes de cobre tales como, por ejemplo, trietileno pentamina, forskolina, Na-butirato, activina, betacelulina, ITS, noggin, factor de crecimiento de neurita, nodal, ácido valvórico, tricostatina A, butirato de sodio, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), esfingosina-1, VEGF, MG132 (EMD, CA), suplementos de N2 y B27 (Gibco, CA), alcaloides esteroides como, por ejemplo, ciclopamina (EMD, CA), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), familia de proteínas Dickkopf, extracto de pituitaria bovina, proteína asociada a la neogénesis de los islotes (INGAP), erizo indio, erizo sónico, inhibidores del proteasoma, inhibidores de la vía de la muesca, inhibidores del erizo sónico, o combinaciones de los mismos.
[0156] Al menos otro factor adicional puede ser suministrado por medios acondicionados obtenidos de líneas de células pancreáticas, tales como, por ejemplo, PANC-1 (ATCC N°: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC N°: HTB-79), BxPC-3 (N° ATCC: CRL-1687), HPAF-II (N° ATCC: CRL-1997), líneas celulares hepáticas como, por ejemplo, HepG2 (N° ATCC: HTB-8065), y líneas celulares intestinales, tales como, por ejemplo, FHs 74 (ATCC N°: Cc L-241).
[0157] Segundo medio de cultivo: El segundo medio de cultivo debe contener ciertos factores, tales como, por ejemplo, la insulina y el IGF (como se describe en WO2006020919), a una concentración suficiente para promover la supervivencia de las células cultivadas. Esto se puede lograr aumentando la concentración sérica o, alternativamente, utilizando medios definidos químicamente en los que las concentraciones de insulina y de IGF aumentan con respecto al primer medio de cultivo. Ejemplos de medios químicamente definidos se describen en Wiles et al (Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247 (1): 241-8).
[0158] En un segundo medio de cultivo con concentraciones más elevadas de suero, la concentración sérica del segundo medio de cultivo puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10%. Alternativamente, la concentración sérica del segundo medio de cultivo puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%. Alternativamente, la concentración sérica del segundo medio de cultivo puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%. Alternativamente, la concentración sérica del segundo medio de cultivo puede ser de aproximadamente el 2%. Cuando se cultivan células madre pluripotentes con el segundo medio de cultivo, el tiempo de cultivo puede variar desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 4 días.
[0159] De manera similar al primer medio de cultivo, la Activina A se puede usar en cualquier concentración adecuada para causar la diferenciación de las células madre pluripotentes. La concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 100 |jg/ml. En una realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 1 jg/ml. En otra realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En otra realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En otra realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 100 ng/ml.
[0160] El ligando Wnt puede estar a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml. En una realización alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml.
[0161] El ligando Wnt puede ser seleccionado del grupo que consiste de Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a y Wnt-7a. En una realización, el ligando Wnt es Wnt-1. En una realización alternativa, el ligando Wnt es Wnt-3a.
[0162] El segundo medio de cultivo puede contener también un inhibidor de GSK-3B. El inhibidor de GSK-3B puede añadirse al primer medio de cultivo, al segundo medio de cultivo, o al primer y al segundo medio de cultivo.
[0163] El inhibidor de GSK-3B se puede seleccionar del grupo que consiste de inhibidor de GSK-3B IX y inhibidor de GSK-3B XI. En una realización, el inhibidor de GSK-3B es el inhibidor de GSK-3B IX.
[0164] Cuando se cultivan células madre pluripotentes con un inhibidor de GSK-3B, la concentración del inhibidor de GSK-3B puede estar desde aproximadamente 1 nM hasta aproximadamente 1000 nM. En una realización alternativa, las células madre pluripotentes se cultivan con el inhibidor de GSK-3B a una concentración de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 nM.
[0165] De forma similar al primer medio de cultivo, el segundo medio de cultivo también puede contener al menos otro factor adicional que puede mejorar la formación de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo de células madre pluripotentes. Alternativamente, al menos otro factor adicional puede aumentar la proliferación de las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo formado por los métodos de la presente invención. Además, al menos otro factor adicional puede mejorar la capacidad de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo formado por los métodos de la presente invención para formar otros tipos de células, o mejorar la eficiencia de cualquier otra etapa de diferenciación adicional.
[0166] Al menos un factor adicional puede ser, por ejemplo, nicotinamida, miembros de TGF-p de la familia, incluyendo TGF-p1, 2, y 3, albúmina de suero, miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento-AA, y -BB derivado de plaquetas, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento de insulina (IGF-I, II), factor de diferenciación del crecimiento (GDF-5, -6, -8, -10, 11), glucagón como el péptido-I y II (GLP-I y II), GLP-1 y GLP-2 imitador a cuerpo, Exendina-4, ácido retinoico, hormona paratiroidea, insulina, progesterona, aprotinina, hidrocortisona, etanolamina, beta mercaptoetanol, factor de crecimiento epidérmico (EGF), gastrina I y II, quelantes de cobre tales como, por ejemplo, trietileno pentamina, forskolina, Na-butirato, activina, betacelulina, ITS, noggin, factor de crecimiento de neurita, nodal, ácido valvórico, tricostatina A, butirato de sodio, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), esfingosina-1, VEGF, MG132 (EMD, CA), suplementos de N2 y B27 (Gibco, CA), alcaloides esteroides como, por ejemplo, ciclopamina (EMD, CA), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), familia de proteínas Dickkopf, extracto de pituitaria bovina, proteína asociada a la neogénesis de los islotes (INGAP), erizo indio, erizo sónico, inhibidores del proteasoma, inhibidores de la vía de la muesca, inhibidores del erizo sónico, o combinaciones de los mismos.
[0167] Al menos otro factor adicional puede ser suministrado por medios acondicionados obtenidos de líneas de células pancreáticas, tales como, por ejemplo, PANC-1 (ATCC N°: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC N°: HTB-79), BxPC-3 (N° ATCC: CRL-1687), HPAF-II (N° ATCC: CRL-1997), líneas celulares hepáticas como, por ejemplo, HepG2 (N° ATCC: HTB-8065), y líneas celulares intestinales, tales como, por ejemplo, FHs 74 (ATCC N°: Cc L-241). Detección de células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo.
[0168] La formación de células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo se puede determinar ensayando la presencia de los marcadores antes y después de seguir un protocolo particular. Las células madre pluripotentes típicamente no expresan tales marcadores. Así, la diferenciación de las células pluripotentes se detecta cuando las células comienzan a expresarlas.
[0169] La eficacia de la diferenciación se puede determinar mediante la exposición de una población celular tratada con un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expresado por células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo.
[0170] Los métodos para evaluar la expresión de marcadores de proteínas y ácidos nucleicos en células cultivadas o aisladas son estándares en la técnica. Incluyen la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), transferencias Northern, hibridación in situ (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds. 2001 suplemento)), e inmunoensayos como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, transferencia de Western y marcadores accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
[0171] Los ejemplos de anticuerpos útiles para detectar ciertos marcadores proteicos se enumeran en la Tabla IA.
Se debe tener en cuenta que los anticuerpos alternativos dirigidos a los mismos marcadores que son reconocidos por los anticuerpos enumerados en la Tabla IA están disponibles, o se pueden desarrollar fácilmente. Dichos anticuerpos alternativos también pueden emplearse para evaluar la expresión de marcadores en las células aisladas de acuerdo con la presente invención.
[0172] Por ejemplo, las características de las células madre pluripotentes son bien conocidas por los expertos en la técnica, y las características adicionales de las células madre pluripotentes siguen siendo identificadas. Los marcadores pluripotentes de células madre incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2, cripto, FoxD3, Conexina43, Conexina45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
[0173] Después de tratar células madre pluripotentes con los métodos de la presente invención, las células diferenciadas pueden purificarse exponiendo una población de células tratadas a un agente (como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador de proteína, como el CXCR4, expresado por células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo.
Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático.
[0174] Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante cualquier método en la técnica o mediante cualquier procedimiento propuesto en esta invención.
[0175] Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).
[0176] Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo se diferencian aún más en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático, tratando las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo con un factor de crecimiento de fibroblastos y el inhibidor de vía de señalización de erizo KAAD-ciclopamina, luego se elimina el medio que contiene el factor de crecimiento de fibroblastos y KAAD-ciclopamina y posteriormente se cultivan las células en medio que contiene ácido retinoico, un factor de crecimiento de fibroblastos y KAAD-ciclopamina. Un ejemplo de este método se describe en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).
[0177] En un aspecto de la presente invención, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se diferencian además en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, tratando las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con ácido retinoico y al menos un factor de crecimiento de fibroblastos por un período de tiempo. Ese período de tiempo puede ser de aproximadamente uno a aproximadamente seis días.
[0178] En un aspecto alternativo de la presente invención, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se diferencian además en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, mediante el tratamiento de las células con ácido retinoico durante un período de tiempo. Ese período de tiempo puede ser de aproximadamente uno a aproximadamente tres días. El ácido retinoico se elimina posteriormente y las células se tratan con al menos un factor de crecimiento de fibroblastos durante otro período de tiempo. Ese período de tiempo puede ser de aproximadamente uno a aproximadamente tres días.
[0179] En una realización, la presente invención proporciona un método para diferenciar células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, que comprende las etapas de:
a. Cultivar células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo, y
b. Tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo con ácido retinoico y al menos un factor de crecimiento de fibroblastos.
[0180] Cualquier célula que exprese marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo es adecuada para diferenciarse en una célula que exprese marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático usando este método.
[0181] En una realización, las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con ácido retinoico y al menos un factor de crecimiento de fibroblastos durante aproximadamente uno a aproximadamente seis días. En una realización, las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con ácido retinoico y al menos un factor de crecimiento de fibroblastos durante aproximadamente seis días.
[0182] Al menos un factor de crecimiento de fibroblastos se selecciona del grupo que consiste en FGF-2, FGF-4 y FGF-10.
[0183] Cualquier marcador de expresión celular característico del linaje de endodermo definitivo es adecuado para diferenciarse en una célula que expresa marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático utilizando este método.
[0184] En una realización alternativa, la presente invención proporciona un método para diferenciar células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, que comprende las etapas de:
a. Cultivo de células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo,
b. Tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo que tratan las células con ácido retinoico, y
c. Eliminación del ácido retinoico y posteriormente tratamiento de las células con al menos un factor de crecimiento de fibroblastos.
[0185] Cualquier célula que expresa marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo es adecuada para diferenciarse en una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático mediante este método.
[0186] En una realización, las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con ácido retinoico durante aproximadamente uno a aproximadamente tres días. En una realización, las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con ácido retinoico durante aproximadamente tres días. En una realización, las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con al menos un factor de crecimiento de fibroblastos durante aproximadamente uno a aproximadamente tres días. En una realización, las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con al menos un factor de crecimiento de fibroblastos durante aproximadamente tres días.
[0187] Al menos un factor de crecimiento de fibroblastos se selecciona del grupo que consiste en FGF-2, FGF-4 y FGF-10.
[0188] Cualquier célula que exprese marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo es adecuada para diferenciarse en una célula que expresa marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático utilizando este método.
[0189] En una realización, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se tratan con ácido retinoico. Alternativamente, se tratan las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo con FGF-2, o alternativamente FGF-4, o alternativamente FGF-10. En una realización alternativa, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo se tratan con al menos uno de los siguientes factores: ácido retinoico, FGF-2, FGF-4 o FGF-10. En una realización alternativa, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo se tratan con ácido retinoico y al menos uno de los siguientes factores de crecimiento de fibroblastos: FGF-2, FGF-4 o FGF-10. En una realización, las células que expresan los marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo se tratan con ácido retinoico y fGF-2. En otra realización, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo se tratan con ácido retinoico y FGF-4. En una realización adicional, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo se tratan con ácido retinoico y FGF-10.
[0190] El ácido retinoico se puede usar a una concentración de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 mM. En una realización, el ácido retinoico se usa a una concentración de 1 pM.
[0191] El FGF-2 se puede usar a una concentración de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml. En una realización, el FGF-2 se usa a una concentración de 50 ng/ml.
[0192] El FGF-4 se puede usar a una concentración de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml. En una realización, el FGF-4 se usa a una concentración de 50 ng/ml.
[0193] El FGF-10 se puede usar a una concentración de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml. En una realización, el FGF-10 se usa a una concentración de 50 ng/ml.
[0194] Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se pueden tratar con al menos otro factor adicional que puede mejorar la formación de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático. Alternativamente, al menos otro factor adicional puede aumentar la proliferación de las células expresando marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático formado por los métodos de la presente invención. Además, al menos otro factor adicional puede mejorar la capacidad de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático formado por los métodos de la presente invención para formar otros tipos de células, o mejorar la eficiencia de cualquier otra etapa de diferenciación adicional.
[0195] Al menos un factor adicional puede ser, por ejemplo, nicotinamida, miembros de TGF-p de la familia, incluyendo TGF-p1, 2, y 3, albúmina de suero, miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento-AA y -BB derivado de plaquetas, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento de insulina (IGF-I, II), factor de diferenciación del crecimiento (GDF-5, -6, -8, -10, 11), glucagón como el péptido-I y II (GLP-I y II), GLP-1 y GLP-2 imitador a cuerpo, Exendina-4, ácido retinoico, hormona paratiroidea, insulina, progesterona, aprotinina, hidrocortisona, etanolamina, beta mercaptoetanol, factor de crecimiento epidérmico (EGF), gastrina I y II, quelantes de cobre tales como, por ejemplo, trietileno pentamina, forskolina, Na-butirato, activina, betacelulina, ITS, noggin, factor de crecimiento de neurita, nodal, ácido valvórico, tricostatina A, butirato de sodio, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), esfingosina-1, VEGF, MG132 (EMD, CA), suplementos de N2 y B27 (Gibco, CA), alcaloides esteroides como, por ejemplo, ciclopamina (EMD, CA), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), familia de proteínas Dickkopf, extracto de pituitaria bovina, proteína asociada a la neogénesis de los islotes (INGAP), erizo indio, erizo sónico, inhibidores del proteasoma, inhibidores de la vía de la muesca, inhibidores del erizo sónico, o combinaciones de los mismos.
[0196] Al menos otro factor adicional puede ser suministrado por medios acondicionados obtenidos de líneas de células pancreáticas, tales como, por ejemplo, PANC-1 (ATCC N°: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC N°: HTB-79), BxPC-3 (N° ATCC: CRL-1687), HPAF-II (N° ATCC: CRL-1997), líneas celulares hepáticas como, por ejemplo, HepG2 (N° ATCC: HTB-8065), y líneas celulares intestinales, tales como, por ejemplo, FHs 74 (ATCC N°: Cc L-241). Detección de células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático.
[0197] Los marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático son bien conocidos por los expertos en la técnica, y se siguen identificando marcadores adicionales característicos del linaje de endodermo pancreático. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje de endodermo pancreático. Los marcadores específicos del linaje del endodermo pancreático incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción como, por ejemplo, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, HNF-1beta.
[0198] La eficacia de la diferenciación se puede determinar mediante la exposición de una población celular tratada con un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expresado por células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático.
[0199] Los métodos para evaluar la expresión de marcadores de proteínas y ácidos nucleicos en células cultivadas o aisladas son estándares en la técnica. Estos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), transferencias Northern, hibridación in situ (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds. 2001 suplemento)), e inmunoensayos como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, transferencia de Western y marcadores accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
[0200] Los ejemplos de anticuerpos útiles para detectar ciertos marcadores de proteínas se enumeran en la Tabla IA. Se debe tener en cuenta que los anticuerpos alternativos dirigidos a los mismos marcadores que son reconocidos por los anticuerpos enumerados en la Tabla IA están disponibles, o se pueden desarrollar fácilmente. Tales anticuerpos alternativos también pueden emplearse para evaluar la expresión de marcadores en las células aisladas de acuerdo con la presente invención.
Formación de células que expresan marcadores del linaje endocrino pancreático:
[0201] Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante cualquier método en la técnica o por cualquier método descrito en esta invención.
[0202] Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático según los métodos descritos en D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)..
[0203] Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático se diferencian adicionalmente en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, cultivando las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático en un medio que contiene DAPT y exendina 4, luego se elimina el medio que contiene DAPT y la exendina 4 y posteriormente se cultivan las células en el medio que contiene la exendina 1, IGF-1 y HGF. Un ejemplo de este método se describe en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).
[0204] Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático se diferencian adicionalmente en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, cultivando las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático en un medio que contiene exendina 4, luego eliminando el medio que contiene exendina 4 y posteriormente cultivando las células en medio que contiene exendina 1, IGF-1 y HGF. Un ejemplo de este método se describe en D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.
[0205] Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático se diferencian adicionalmente en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, cultivando las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático en un medio que contiene DAPT y exendina 4. Un ejemplo de este método se describe en D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.
[0206] Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático se diferencian adicionalmente en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, cultivando las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático en un medio que contiene exendina 4. Un ejemplo de este método se describe en D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.
[0207] En un aspecto de la presente invención, las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se diferencian además en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, tratando las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un factor que Inhibe la vía de señalización de Notch. El factor que inhibe la vía de señalización de Notch puede ser un antagonista para el receptor extracelular Notch. Alternativamente, el factor puede inhibir la actividad biológica del receptor Notch. Alternativamente, el factor puede inhibir o ser un antagonista de un elemento en la vía de transducción de señales de Notch dentro de una célula.
[0208] En una realización, el factor que inhibe la ruta de señalización Notch es un inhibidor de Y-secretasa. En una realización, el inhibidor de Y-secretasa es 1SBencilo-4R-[1-(1S-carbamoílo-2-fenetilcarbamoílo)-1S-3metilbutilcarbamoílo]-52Ridrozi- 5 fenilpentilo] ácido carbámico terc-butilo éster, también conocido como L-685.458.
[0209] L-685.458 se puede usar a una concentración de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 100 pM. En una realización, se utiliza L-685458 a una concentración de aproximadamente 90 pM. En una realización, se utiliza L-685458 a una concentración de aproximadamente 80 pM. En una realización, L-685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 70 pM. En una realización, L-685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 60 pM. En una realización, L-685.458 se utiliza a una concentración de aproximadamente 50 pM. En una realización, L-685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 40 pM. En una realización, L-685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 30 pM En una realización, L-685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 20 pM. En una realización, L-685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 10 pM.
[0210] En una realización, la presente invención proporciona un método para diferenciar células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, que comprende las etapas de:
a. Cultivar células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático, y
b. Tratamiento de las células con un factor que inhibe la vía de señalización de Notch.
[0211] Cualquier célula que exprese marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático es adecuada para diferenciarse en una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático usando este método.
[0212] En una realización, el factor que inhibe la ruta de señalización Notch es un inhibidor de Y-secretasa. En una realización, el inhibidor de Y-secretasa es 1S-bencilo-4R-[1-(1S-carbamoílo-2-fenetilcarbamoílo)-1S-3-metilbutilcarbamoílo]-2R-hidrozi-5-fenilpentilo] ácido carbámico terc-butilo éster, también conocido como L-685.458.
[0213] Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se tratan con el factor que inhibe la vía de señalización de Notch durante aproximadamente uno a aproximadamente cinco días. Alternativamente, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático se tratan con el factor que inhibe la vía de señalización de Notch durante aproximadamente tres a aproximadamente cinco días. Alternativamente, las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático se tratan con el factor que inhibe la vía de señalización de Notch durante aproximadamente cinco días.
[0214] En una realización, el factor que inhibe la ruta de señalización Notch es un inhibidor de Y-secretasa. En una realización, el inhibidor de Y-secretasa es 1S-bencilo-4R-[1-(1S-carbamoílo-2-fenetilcarbamoílo)-1S-3-metilbutilcarbamoílo]-2R-hidrozi-5-fenilpentilo] ácido carbámico terc-butilo éster, también conocido como L-685.458.
[0215] L-685.458 se puede usar a una concentración de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 100 pM. En una realización, se utiliza L-685458 a una concentración de aproximadamente 90 pM. En una realización, se utiliza L-685458 a una concentración de aproximadamente 80 pM. En una realización, L-685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 70 pM. En una realización, L-685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 60 pM. En una realización, L-685.458 se utiliza a una concentración de aproximadamente 50 pM. En una realización, L-685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 40 pM. En una realización, L-685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 30 pM En una realización, L-685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 20 pM. En una realización, L-685.458 se usa a una concentración de aproximadamente 10 pM.
[0216] Las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se pueden tratar con al menos otro factor adicional que puede mejorar la formación de las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. Alternativamente, al menos otro factor adicional puede aumentar la proliferación de las células expresando marcadores característicos del linaje endocrino pancreático formado por los métodos de la presente invención. Además, al menos otro factor adicional puede mejorar la capacidad de las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático formado por los métodos de la presente invención para formar otros tipos de células, o mejorar la eficiencia de cualquier otra etapa de diferenciación adicional.
[0217] Al menos un factor adicional puede ser, por ejemplo, nicotinamida, miembros de la familia TGF-p, incluidos TGF-p 1, 2 y 3, albúmina sérica, miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento-AA y -BB derivado de plaquetas, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento de insulina (IGF-I, II), factor de diferenciación del crecimiento (GDF-5, -6, -8, -10, 11), glucagón como el péptido-I y II (GLP-I y II), GLP-1 y GLP-2 imitador a cuerpo, Exendina-4, ácido retinoico, hormona paratiroidea, insulina, progésterona, aprotinina, hidrocortisona, etanolamina, beta mercaptoetanol, factor de crecimiento epidérmico (EGF), gastrina I y II, quelantes de cobre tales como, por ejemplo, trietileno pentamina, forskolina, Na-butirato, activina, betacelulina, ITS, noggin, factor de crecimiento de neurita, nodal, ácido valvórico, tricostatina A, butirato de sodio, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), esfingosina-1, VEGF, MG132 (EMD, CA), suplementos de N2 y B27 (Gibco, CA), alcaloides ésteroides como, por ejemplo, ciclopamina (EMD, CA), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), familia de proteínas Dickkopf, extracto de pituitaria bovina, proteína asociada a la neogénesis de los islotes (INGAP), erizo indio, erizo sónico, inhibidores del proteasoma, inhibidores de la vía de la muesca, inhibidores del erizo sónico, o combinaciones de los mismos.
[0218] Al menos otro factor adicional puede suministrarse por medios condicionados obtenidos de líneas celulares pancreáticas como, por ejemplo, PANC-1 (ATCC N°: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC N°: HTB-79), BxPC-3 (N° ATCC: CRL-1687), HPAF-II (N° At CC: CRL-1997), líneas celulares hepáticas como, por ejemplo, HepG2 (N° ATCC: HTB-8065), y líneas celulares intestinales, tales como, por ejemplo, FHs 74 (ATCC N°: c Cl-241).
Detección de células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático.
[0219] Los marcadores característicos de las células del linaje endocrino pancreático son bien conocidos por los expertos en la técnica, y los marcadores adicionales característicos del linaje endocrino pancreático continúan siendo identificados. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje endocrino pancreático. Los marcadores específicos del linaje endocrino pancreático incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción como, por ejemplo, NGN-3, NeuroD, Islote-1.
[0220] Los marcadores característicos de células del linaje de células p son bien conocidos por los expertos en la técnica, y los marcadores adicionales característicos del linaje de células p continúan siendo identificados. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje de células p. Las características específicas del linaje de células p incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción como, por ejemplo, Pdxl (gen 1 de homeobox pancreático y duodenal), Nkx2.2, Nkx6.1, Isl 1, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnflb, Hnf -6, Hnf-3beta, y MafA, entre otros. Estos factores de transcripción están bien establecidos en la técnica para la identificación de células endocrinas. Ver, por ejemplo, Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002)).
[0221] La eficacia de la diferenciación se puede determinar mediante la exposición de una población celular tratada con un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expresado por células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. Alternativamente, la eficiencia de la diferenciación puede determinarse exponiendo una población de células tratadas a un agente (como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador de proteína expresado por células que expresan marcadores característicos del linaje de células p.
[0222] Los métodos para evaluar la expresión de marcadores de proteínas y ácidos nucleicos en células cultivadas o aisladas son estándares en la técnica. Estos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), transferencias Northern, hibridación in situ (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)) e inmunoensayos como el análisis inmunohistoquímico de material seccionado, transferencia de Wéstern, y para marcadores que son accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
[0223] Los ejemplos de anticuerpos útiles para detectar ciertos marcadores proteicos se enumeran en la Tabla IA.
Se debe tener en cuenta que los anticuerpos alternativos dirigidos a los mismos marcadores que son reconocidos por los anticuerpos enumerados en la Tabla IA están disponibles, o se pueden desarrollar fácilmente. Dichos anticuerpos alternativos también pueden emplearse para evaluar la expresión de marcadores en las células aisladas de acuerdo con la presente invención.
Terapias
[0224] En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de, o en riesgo de diabetes Tipo 1. Este método implica el cultivo de células madre pluripotentes, diferenciar las células madre pluripotentes in vitro en un linaje de células p, e implantar las células de un linaje de células p en un paciente.
[0225] En otro aspecto, esta invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de, o en riesgo de diabetes tipo 2. Este método implica el cultivo de células madre pluripotentes, diferenciar las células cultivadas in vitro en un linaje de células p, e implantar las células de un linaje de células p en el paciente.
[0226] Si es apropiado, el paciente puede ser tratado adicionalmente con agentes farmacéuticos o bioactivos que faciliten la supervivencia y la función de las células trasplantadas. Estos agentes pueden incluir, por ejemplo, insulina, miembros de la familia TGF-p, incluyendo TGF-p 1, 2 y 3, proteínas morfogénicas óseas (BMP-2, -3, - 4, -5, -6, - 7, -11, -12 y -13), factores de crecimiento de fibroblastos-1 y -2, factor de crecimiento derivado de las plaquetas -A, y -BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento de insulina (IGF-I, II) factor de crecimiento de diferenciación (GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), factor de crecimiento derivado de células endoteliales vasculares (VEGF), plefrofina, endotelina, entre otros. Otros compuestos farmacéuticos pueden incluir, por ejemplo, nicotinamida, glucagon como el péptido-I (GLP-1) y II, minicuerpos GLP-1 y 2, exendina-4, ácido retinoico, hormona paratiroidea, inhibidores de MAPK, como, por ejemplo, compuestos descritos en la solicitud publicada de EE.UU. 2004/0209901 y la solicitud publicada de EE.UU. 2004/0132729.
[0227] Las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en una célula productora de insulina antes del trasplante en un receptor. En una realización específica, las células madre pluripotentes se diferencian completamente en células p, antes del trasplante en un receptor. Alternativamente, las células madre pluripotentes se pueden trasplantar a un receptor en un estado indiferenciado o parcialmente diferenciado. Una mayor diferenciación puede tener lugar en el receptor.
[0228] Las células del endodermo definitivo o, alternativamente, las células del endodermo pancreático, o, alternativamente, células p, puede ser implantado como células dispersadas o formadas en grupos que se pueden infundir en la vena portal hepática. Alternativamente, pueden proporcionarse células en soportes poliméricos degradables biocompatibles, dispositivos porosos no degradables o encapsulados para protegerlos de la respuesta inmune del huésped. Las células pueden implantarse en un sitio apropiado en un receptor. Los sitios de implantación incluyen, por ejemplo, el hígado, el páncreas natural, el espacio subcapsular renal, el omento, el peritoneo, el espacio subserosal, el intestino, el estómago o una bolsa subcutánea.
[0229] Para mejorar aún más la diferenciación, la supervivencia o la actividad de las células implantadas, los factores adicionales, tales como factores de crecimiento, antioxidantes o agentes anti-inflamatorios, se pueden administrar antes de, simultáneamente con, o después de la administración de las células. En ciertas realizaciones, los factores de crecimiento se utilizan para diferenciar las células administradas in vivo. Estos factores pueden ser secretados por células endógenas y expuestos a las células administradas in situ. Las células implantadas pueden inducirse a diferenciarse por cualquier combinación de factores de crecimiento administrados de forma exógena y endógena conocidos en la técnica.
[0230] La cantidad de células usadas en la implantación depende de un número de diversos factores incluyendo la condición y respuesta a la terapia del paciente, y puede ser determinada por un experto en la técnica.
[0231] En un aspecto, esta invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de, o en riesgo de diabetes. Este método implica cultivar células madre pluripotentes, diferenciar las células cultivadas in vitro en un linaje de células p, e incorporar las células en un soporte tridimensional. Las células pueden mantenerse in vitro en este soporte antes de la implantación en el paciente. Alternativamente, el soporte que contiene las células se puede implantar directamente en el paciente sin cultivo adicional in vitro. El soporte puede incorporarse opcionalmente con al menos un agente farmacéutico que facilita la supervivencia y la función de las células trasplantadas.
[0232] Los materiales de soporte adecuados para uso para los fines de la presente invención incluyen plantillas de tejidos, conductos, barreras y depósitos útiles para la reparación de tejidos. En particular, materiales sintéticos y naturales en forma de espumas, esponjas, geles, hidrogeles, textiles y estructuras no tejidas, que se han utilizado in vitro e in vivo para reconstruir o regenerar tejido biológico, así como para administrar agentes quimiotácticos para inducir el crecimiento de tejido, son adecuados para uso en la práctica de los métodos de la presente invención. Ver, por ejemplo, los materiales descritos en la Patente de Estados Unidos 5.770.417, Patente de Estados Unidos 6.022.743, Patente de Estados Unidos 5.567.612, Patente de Estados Unidos 5.759.830, Patente de Estados Unidos 6.626.950, Patente de Estados Unidos 6.534.084, Patente de Estados Unidos 6.306.424, Solicitud de Patente de EE.UU. publicada 2004/0062753 A1, Patente de Estados Unidos 4.557.264 y Patente de Estados Unidos 6.333.029.
[0233] Para formar un soporte incorporado con un agente farmacéutico, el agente farmacéutico se puede mezclar con la solución de polímero antes de formar el soporte. Alternativamente, un agente farmacéutico podría recubrirse sobre un soporte fabricado, preferiblemente en presencia de un vehículo farmacéutico. El agente farmacéutico puede estar presente como un líquido, un sólido finamente dividido o cualquier otra forma física apropiada. Alternativamente, se pueden agregar excipientes al soporte para alterar la velocidad de liberación del agente farmacéutico. En una realización alternativa, el soporte se incorpora con al menos un compuesto farmacéutico que es un compuesto antiinflamatorio, tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la patente de EE.UU.
6.509.369.
[0234] El soporte se puede incorporar con al menos un compuesto farmacéutico que es un compuesto antiapoptótico, tales como, por ejemplo, los compuestos descritos en la patente US 6.793.945.
[0235] El soporte también se puede incorporar con al menos un compuesto farmacéutico que es un inhibidor de fibrosis, tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la patente US 6.331.298.
[0236] El soporte también se puede incorporar con al menos un compuesto farmacéutico que es capaz de aumentar la angiogénesis, tal como, por ejemplo, compuestos descritos en la solicitud publicada de EE.UU. 2004/0220393 y solicitud publicada US 2004/0209901.
[0237] El soporte también se puede incorporar con al menos un compuesto farmacéutico que es un compuesto inmunosupresor, tal como, por ejemplo, compuestos descritos en la solicitud publicada de EE.UU. 2004/0171623.
[0238] El soporte también puede incorporarse con al menos un compuesto farmacéutico que es un factor de crecimiento, como, por ejemplo, miembros de la familia TGF-p, incluyendo TGF-p 1, 2 y 3, proteínas morfogénicas óseas (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12 y -13), factores de crecimiento de fibroblastos 1 y -2, factor de crecimiento derivado de plaquetas AA y -BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento de insulina (IGF-I, II) factor de diferenciación del crecimiento (GDF-5, -6, -8, -10, -15), factor de crecimiento derivado de células endoteliales vasculares (VEGF), pleiotrofina, endotelina, entre otros. Otros compuestos farmacéuticos pueden incluir, por ejemplo, nicotinamida, factor inducible por hipoxia 1 -alfa, glucagón como péptido-I (GLP-1), GLP-1 y GLP-2 mimeticuerpo, y II, Exendina-4, nodal, noggin., NGF, ácido retinoico, hormona paratiroidea, tenascin-C, tropoelastina, péptidos derivados de trombina, catelicidinas, defensinas, laminina, péptidos biológicos que contienen dominios de unión a heparina y células de proteínas de matriz extracelular adhesivas como fibronectina y vitronectina, inhibidores de MAPK, como, por ejemplo, los compuestos descritos en la Solicitud Publicada de EE.UU.
2004/0209901 y la Solicitud Publicada de EE.UU. 2004/0132729.
[0239] La incorporación de las células de la presente invención en un andamio se puede lograr mediante el simple depósito de células sobre el andamio. Las células pueden entrar en el andamio por difusión simple (J. Pediatr. Surg.
23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)). Se han desarrollado varios otros enfoques para mejorar la eficiencia de la siembra de células. Por ejemplo, se han utilizado matraces giratorios en la siembra de condrocitos en soportes de ácido poliglicólico (Biotechnol. Prog. 14 (2): 193-202 (1998)). Otro enfoque para sembrar células es el uso de la centrifugación, que produce un estrés mínimo para las células sembradas y mejora la eficiencia de la siembra. Por ejemplo, Yang et al. desarrolló un método de siembra de células (J. Biomed. Mater. Res. 55 (3): 379-86 (2001)), denominado inmovilización de células por centrifugación (ICC).
[0240] La presente invención se ilustra adicionalmente, pero no se limita por, los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
Ejemplo de referencia 1
Cultivo de células madre embrionarias humanas
[0241] Las líneas de células madre embrionarias humanas H1, H7 y H9 se obtuvieron de WiCell Research Institute, Inc., (Madison, WI) y se cultivaron según las instrucciones proporcionadas por el Instituto fuente. Brevemente, las células se cultivaron en células alimentadoras de fibroblastos embrionarios (MEF) de ratón en medio de células ES que consiste en DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO) suplementado con 20% de reemplazo de suero knockout, 100 nM de aminoácidos no esenciales, 0,5 mM de beta-mercaptoetanol, L-glutamina 2 mM con 4 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico humano (bFGF) (todos de Invitrogen/GIBCO). Las células MEF, derivadas de embriones de ratón E13 a 13.5, se compraron de Charles River. Las células MEF se expandieron en medio DMEM complementado con FBS al 10% (Hyclone), glutamina 2 mM y aminoácidos no esenciales MEM 100 mM. Los cultivos celulares de MEF sub-confluentes se trataron con 10 pg/ml de mitomicina C (Sigma, St. Louis, MO) durante 3 h para detener la división celular, luego se tripsinizaron y se sembraron en placas a 2x104/cm2 en 0,1% de placas recubiertas con gelatina bovina. Las células MEF del paso dos al cuatro se utilizaron como capas de alimentación. Las células madre embrionarias humanas plaqueadas en capas alimentadoras de células MEF se cultivaron a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2/ dentro de un incubador de cultivo de tejido humidificado. Cuando fueron confluentes (aproximadamente 5-7 días después de la siembra), las células madre embrionarias humanas se trataron con colagenasa tipo IV de 1 mg/ml (Invitrogen/GIBCO) durante 5-10 minutos y luego se rasparon suavemente de la superficie con una pipeta de 5 ml. Las células se hilaron a 900 rpm durante 5 minutos, y el sedimento se resuspendió y se volvió a colocar en una proporción de 1:3 a 1:4 de células en medio de cultivo fresco.
Ejemplo de referencia 2
Formación del endodermo definitivo
[0242] Se examinaron los efectos de la activina A en la expresión de marcadores de endodermo definitivo. Se añadió activina A (100 ng/ml) a poblaciones de células madre embrionarias humanas cultivadas en fibroblastos embrionarios de ratón. Las células se cultivaron de forma continua en presencia de activina A y se recogieron en los tiempos indicados. El nivel de expresión de los marcadores endodérmicos definitivos se examinó mediante PCR (Figura 1), FACS (resultados resumidos en la Tabla II) e inmunohistoquímica (Figura 2).
[0243] La activina A provocó un aumento dependiente del tiempo en la expresión de ARNm de CXCR4, GATA4, HNF-3beta, Mixl 1 y Sox-17 en la línea H9 (Figura 1, panel a). También se observó una regulación al alza significativa de los marcadores del endodermo anterior, Cerberus, Otx-1 y Hex (Figura 1, panel b). Se observó un aumento en la proteína CXCR4 mediante análisis FACS después del tratamiento con activina A. La expresión de E-cadherina y N-cadherina no cambió después del tratamiento con activina A (Tabla IIA). Las células positivas para CXCR4 también fueron altamente positivas para C-kit, EPCAM, CD99 y negativas para CD9. El patrón de expresión para estos marcadores fue consistente entre las tres líneas celulares de hES examinadas (Tabla IIB para H7 y Tabla IIC para HI). La inmunocitoquímica realizada en células tratadas con activina A durante cinco días reveló que 30-40% de células en el cultivo tratado eran positivas para Sox17 y HNF-3beta. En paralelo, casi el 100% de las células diferenciadas todavía eran positivas para el Oct4 (Figura 2). Con la disminución en la expresión de marcadores superficiales de pluripotencia, combinada con un aumento en la expresión de marcadores endodérmicos definitivos, estos datos sugieren que la activina A promueve la diferenciación de las células madre embrionarias humanas al endodermo definitivo.
Referencia
Formación de endodermo pancreático
[0244] Los factores de crecimiento conocidos para inducir la diferenciación de células madre embrionarias humanas a endodermo pancreático se añadieron a cultivos celulares. En particular, se agregaron activina A, bFGF y ácido retinoico, que se sabe que inducen la formación de endodermo pancreático, a los cultivos celulares.
[0245] En una primera serie de experimentos, se añadió activina A a las poblaciones de células madre embrionarias humanas cultivadas sobre fibroblastos de embriones de ratón durante un máximo de siete días en DMEM/F12 suplementado con 0% a 2% de suero y activina A (100 ng/ml). Las células se recogieron en los puntos de tiempo indicados en la Figura 3 y se analizaron por PCR para la expresión de los genes mostrados (Figuras 3, 4 y 5). En la Figura 3, el análisis de PCR indicó que las células tratadas con activina expresaban un amplio espectro de genes asociados con el desarrollo del endodermo, incluyendo GATA4 (Figura 3, panel a), Sox-17 (Figura 3, panel b), HNF-3beta (Figura 3, panel c) y Mixl-1 (Figura 3, panel d). Sin embargo, no se observó expresión del gen Pdxl. El mismo patrón de expresión de los marcadores de linaje de endodermo se observó en las células H7 tratadas con activina A (Figura 6, paneles a a f). En esta etapa, no hubo una disminución significativa de la expresión del Oct4.
[0246] La activina A provocó una disminución dependiente del tiempo en la expresión de los marcadores de endodermo extraembrionario Sox7 (Figura 4, panel a) y AFP (Figura 4, panel b). La activina A disminuyó la expresión de Brachyury (Figura 5, panel a), pero no tuvo efecto en la expresión del marcador neuronal Zic1 (Figura 5, panel b).
[0247] En conjunto, estos datos sugieren que el aumento de expresión de Sox-17, MIXL1, Gata4 y HNF-3beta junto con la regulación al alza de los marcadores de endodermo anterior Otx1, CER1 y genes Hex, corresponde a la formación de endodermo definitivo en respuesta a tratamiento de activina A. El análisis de los marcadores endodérmicos definitivos por inmunocitoquímica reveló que la expresión de proteínas para estos genes también reflejaba las tendencias observadas en la expresión de ARNm. Los niveles de expresión para HNF-3beta, Sox-17 y GATA4 fueron bajos en células no tratadas, aproximadamente del 10 al 20% de todas las células. El tratamiento con activina A (100 ng/ml) durante cinco días aumentó la expresión de HNF-3beta, Sox-17 y GATA4 a aproximadamente 50% a 90% de todas las células (Figura 7).
[0248] En una segunda serie de experimentos, los cultivos de células madre embrionarias humanas se mantuvieron en condiciones de cultivo no diferenciadas durante 2-3 días de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1. Después de que las células tuvieran una confluencia del 70-80%, se cambió el medio a DMEM/F12 con 0 a 2% de FBS con adición de activina A a 100 ng/ml y cultivada en presencia de activina A durante tres, cinco o siete días. Después de este intervalo de tiempo, las células se trataron de nuevo durante cinco a seis días con combinaciones de ácido retinoico y bFGF como se muestra en la Figura 8. Los cultivos se recogieron y se recogieron muestras de ARNm para su análisis. También se incluyeron cultivos de control que consistían en células tratadas con activina A sola durante cinco días.
[0249] La expresión de genes reveló que la activina A o ácido retinoico solo no indujo la expresión de PDXL. Se observaron resultados similares en cultivos de células tratadas con ácido retinoico en combinación con FGF y en presencia de activina A (Figura 8, panel a). Sin embargo, el tratamiento de células con ácido retinoico y FGF en ausencia de activina A incrementó aún más la expresión de Pdxl (Figura 8, panel a). Las células tratadas durante tres días con activina A, luego tratadas durante 5 días con ácido retinoico 1 pM y 50 ng/ml de bFGF (también conocido como FGF-2) en ausencia de activina A mostraron un nivel de expresión de Pdx1 que fue aproximadamente 3500 veces mayor que la observada en muestras con tratamiento con activina A sola durante 5 días (Figura 8, panel a). La inmunocitoquímica mostró que del 5 al 20% de todas las células expresaban Pdxl (Figura 9).
[0250] El tratamiento con ácido retinoico 1 pM y bFGF en ausencia de activina A también causó un aumento en la expresión de GLUT-2 y PTF1a (Figura 8, panel c) que no se observó en las células tratadas en presencia de activina A sola. El mayor aumento en la expresión de GLUT-2 y PTF1a se observó en las células tratadas con ácido retinoico 1 pM y 50 ng/ml de bFGF. En conjunto, estos datos sugieren que la formación de endodermo pancreático se mejora aún más mediante la eliminación de la activina A de los cultivos celulares después de que se haya formado el endodermo definitivo.
Ejemplo de referencia 4
Formación de células endocrinas pancreáticas
[0251] Los cultivos de células madre embrionarias humanas se mantuvieron en condiciones de cultivo no diferenciadas durante 3 a 4 días de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1. Después de que las células tuvieran un 50-60% de confluencia, el medio se cambió a DMEM/F 12 sin FBS, que contenía activina A a 100 ng/ml, y las células se cultivaron en este medio durante un día. Después del cultivo de un día, el medio se retiró y se reemplazó con un medio que contenía FBS al 0,5% con 100 ng/ml de activina A, y las células se cultivaron durante un día. Después del segundo cultivo de un día, el medio se eliminó y se reemplazó con un medio que contenía FBS al 2% con 100 ng/ml de activina A, y las células se cultivaron durante un día. Después de este intervalo de tiempo, las células se trataron durante seis días con combinaciones de ácido retinoico y FGF como se describe en el Ejemplo 2, luego se eliminó el medio de cultivo y se reemplazó con medio que comprende DMEM/F12 con 2% de FBS, que contiene inhibidores de Y-secretasa. L-685.458 a 10 |jM durante tres días. Los cultivos se recogieron y se recogieron muestras de ARNm para su análisis. También se incluyeron cultivos de control que consistían en células tratadas con activina A sola durante cinco días.
[0252] La expresión de genes reveló que activina A sola o en combinación con ácido retinoico y FGF no indujo la expresión de Ngn3 o insulina (Figura 10, panel a, c). También se observó una disminución en la expresión de Hes-1 después del tratamiento con L-685.458. La inhibición máxima se observó en el tercer día posterior al tratamiento (Figura 10, panel d). Sin embargo, el tratamiento de células con L-685.458 indujo la expresión de Ngn3 a un nivel aproximadamente 50 veces superior al observado en muestras tratadas con activina A sola o ácido retinoico con FGF en combinación. Se observó un aumento de 70 veces en la expresión de insulina en muestras tratadas con el inhibidor de Y-secretasa. La expresión de NeuroD1 también se incrementó aún más con el tratamiento con L-685.458 (Figura 10, panel a). En conjunto, estos datos sugieren que la formación de células endocrinas se mejora aún más mediante la eliminación del ácido retinoico y los FGF del cultivo celular y la adición de inhibidores de la y-secretasa después de que se haya formado el endodermo pancreático.
Ejemplo de referencia 5
Formación de células endocrinas pancreáticas que expresan Nkx2.2
[0253] Las células endodérmicas definitivas obtenidas según los métodos descritos en el Ejemplo 2 se trataron de la siguiente manera: las células se cultivaron en medio basal, comprendiendo DMEM/F12 con FBS al 2% más 50 ng/ml de activina A, 50 ng/ml de FGF básico y 1 j M de ácido retinoico durante 3 a 5 días. Las células se cultivaron continuamente durante otros 3 a 5 días en medio basal con ácido retinoico a 1 j M, solo o con bFGF. Las muestras de ARN se recolectaron de las células en varios puntos de tiempo a lo largo de este proceso para ayudar a evaluar la diferenciación dirigida de las células. Además, el medio de cultivo y los factores se eliminaron regularmente y se repusieron en todo el protocolo de diferenciación. La adición de activina A mostró un aumento de la expresión de Nkx2.2 aproximadamente 35 veces en comparación con las muestras sin activina A. Las muestras tratadas con activina A durante los primeros tres días de cultivo mantuvieron la expresión de Pdxl a un nivel similar al de las muestras que no contenían activina A (Figura 11). En conjunto, estos datos sugieren que la expresión del marcador endocrino pancreático Nkx2.2 se mejora aún más agregando Activina A a los primeros tres días de tratamiento con ácido retinoico y bFGF.
Ejemplo de referencia 6
Paso y expansión de las células del endodermo pancreático en el cultivo
[0254] Este ejemplo demuestra que las células endodérmicas pancreáticas derivadas de células madre embrionarias humanas en el presente documento pueden mantenerse en cultivo celular y pasarse sin diferenciación adicional. Las células endodérmicas pancreáticas se diferenciaron en presencia de 100 ng/ml de activina A en suero bajo DMEM/F12. El DMEM/F12 bajo en suero contenía 0% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) en el día 1, 0,5% (v/v) de FBS en el día dos y 2% (v/v) de FBS en cada día posterior. Después de cuatro días de diferenciación, las células que se cultivaron en DMEM/F12 con bajo contenido en suero contenían FBS al 2% (v/v), ácido retinoico 1 j M y 50 ng/ml de bFGF durante un total de seis días más. Después de los seis días de diferenciación, las células se mantuvieron en cultivo en un suero bajo de DMEM/F12 que contenía un 2% (v/v) de FBS en presencia de 50 ng/ml de FGF10 durante un total de 6 días. Durante el período de cultivo de seis días, las células del endodermo pancreático se pasaron dos veces y el tiempo de duplicación de la población celular es de aproximadamente 36 a 48 horas durante este cultivo de 6 días. En los días 0, 3 y 6 de cultivo, se usó Q-PCR para medir la expresión de genes marcadores indicativos de endodermo pancreático. La Figura 12 muestra que las células cultivadas en presencia de 50 ng/ml de FGF10 mantuvieron la expresión del marcador de endodermo pancreático Pdx1 durante el período de cultivo de 6 días posterior a su derivación.
Ejemplo de referencia 7
Derivación de los hepatocitos a partir de células madre embrionarias humanas
[0255] Los cultivos de células madre embrionarias humanas se mantuvieron en condiciones de cultivo indiferenciadas durante 2-3 días de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1. Después de que las células tuvieran un 70-80% de confluencia, el medio se cambió a DMEM/F12 con 2% de activina A que contiene FBS a 100 ng/ml, y las células se cultivaron en presencia de activina A durante siete días. Después de 7 días de tratamiento con activina A, las células se trataron durante cinco días con las condiciones que se muestran en la Figura 13.
Después de este tiempo, se recogieron las células y se recogieron muestras de ARNm para su análisis.
[0256] Se observó un incremento en la expresión de a-fetoproteína (AFP) y la albúmina (Figura 13, panel de a) para las células cultivadas en ausencia de activina A. Ésta se incrementó aún más por el ácido retinoico y FGF-4 (Figura 13, panel b). Tomados juntos, estos datos sugieren que los cultivos de células madre embrionarias humanas son capaces de expresar marcadores de hepatocitos siguiendo el tratamiento descrito anteriormente. Además, las células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse en células que expresan marcadores que son característicos de los hepatocitos.
Ejemplo de referencia 8
Caracterización de la línea de células madre embrionarias humanas H9
[0257] La calidad de células H9 se controló en el tiempo mediante la evaluación de la expresión de varios marcadores expresados por las células ES no diferenciadas (Carpenter et al,. 2001; Reubinoff et al., 2000; Thomson et al., 1998a). Las células H9 mostraron expresión recíproca de antígenos embrionarios específicos de la etapa (Tabla III). Las células H9 juegan una fuerte inmunorreactividad para los antígenos SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81, AP y CD9, todos los cuales son característicos de células madre embrionarias humanas no diferenciadas.
[0258] RT-PCR se realizó para evaluar la expresión de genes característicos de las células madre embrionarias, tales como, por ejemplo, OCT3/4, SOX-2, UTF-1, REX-1, Cx43, Cx45, ABCG-2 y TERT, que confirma que las células cultivadas en este ejemplo parecían similares a las células madre embrionarias no diferenciadas descritas previamente (Tabla III). La expresión de la proteína OCT3/4 y la actividad de la fosfatasa alcalina (Chemicon) se confirmaron mediante inmunotinción. La mayoría de las células H9 fueron positivas para OCT3/4 y AP (Figura 14). En general, estos resultados demuestran que las células H9 utilizadas en este ejemplo no fueron significativamente diferentes en morfología, inmunotinción de antígenos o expresión de marcador de pluripotencia cuando se compararon con informes de otros laboratorios.
Ejemplo de referencia 9
Análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)
[0259] Las células adheridas se eliminaron de las placas de cultivo mediante incubación de cinco minutos con una solución TrypLE™ Express (Invitrogen, CA). Las células liberadas se resuspendieron en medio de cultivo de células madre embrionarias humanas y se recuperaron por centrifugación, seguido de lavado y resuspendiendo las células en un tampón de tinción que consiste en BSA al 2%, azida sódica al 0,05% en PBS (Sigma, MO). Según corresponda, las células fueron bloqueadas por el receptor Fc durante 15 minutos utilizando una solución de globulina y (Sigma) al 0,1%. Se incubaron alícuotas (aproximadamente 105 células) con anticuerpos monoclonales conjugados con ficoeririna (PE) o con aloficocianina (APC) (5 ml de anticuerpo por 106 células), como se indica en la Tabla I, o con un anticuerpo primario no conjugado. Los controles incluyeron anticuerpos adecuados para el isotipo, células sin teñir y células teñidas solo con anticuerpos conjugados secundarios. Todas las incubaciones con anticuerpos se realizaron durante 30 minutos a 4°C, después de lo cual las células se lavaron con el tampón de tinción. Las muestras que se tiñeron con anticuerpos primarios no conjugados se incubaron durante 30 minutos adicionales a 4°C con anticuerpos marcados con PE o APC conjugados secundarios. Consulte la Tabla I para obtener una lista de los anticuerpos secundarios utilizados. Las células lavadas se sedimentaron y se resuspendieron en el tampón de tinción, y las moléculas de la superficie celular se identificaron utilizando un instrumento de ensayo FACs (BD Biosciences), que recopilaba al menos 10.000 eventos.
Ejemplo de referencia 10
Inmunocitoquimica
[0260] Las células sembradas en 0,1% de placas revestidas Matrigel (BD) se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 20 min a temperatura ambiente. Las células fijas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS/BSA al 0,1%/suero de pollo normal al 10%/Triton X-100 al 0,5% y luego se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios en PBS/BSA al 0,1%/suero de pollo normal al 10% a 4°C. La lista de anticuerpos primarios y sus diluciones de trabajo se muestran en la Tabla IB. Después de tres lavados en PBS/BSA al 0,1%, los anticuerpos secundarios fluorescentes a una dilución de 1:100 en PBS se incubaron con células durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir la unión. Las muestras de control incluyeron reacciones en las que se omitió el anticuerpo primario o donde el anticuerpo primario se reemplazó con inmunoglobulinas de control negativo coincidentes correspondientes a la misma concentración que los anticuerpos primarios. Las muestras teñidas se enjuagaron; se añadió una gota de PROLONG® (Invitrogen, CA) que contiene diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI) a cada muestra para teñir el núcleo y funcionar como un reactivo anti-desvanecimiento. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio invertido Nikon Confocal Eclipse C-1 (Nikon, Japón) y un objetivo 10-60X.
Ejemplo de referencia 11
Análisis por PCR de células indiferenciadas
[0261] La extracción de RNA, la purificación, y la síntesis de ADNc. Las muestras de ARN se purificaron mediante la unión a una membrana de gel de sílice (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) en presencia de un tampón con alto contenido de sal y etanol, seguido de un lavado para eliminar los contaminantes. El ARN se purificó adicionalmente utilizando un kit libre de ADN de TURBO (Ambion, INC), y el ARN de alta calidad se eluyó en agua. El rendimiento y la pureza se evaluaron mediante lecturas A260 y A280 en un espectrofotómetro. Se hicieron copias de ADNc a partir de ARN purificado utilizando un kit de archivo de ADNc de alta capacidad ABI (ABI, CA).
[0262] Amplificación por PCR en tiempo real y análisis cuantitativo. A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos se adquirieron de Applied Biosystems. Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7900. TAQMAN® UNIVERSAL PCR MASTER MIX® (ABI, CA) se utilizó con 20 ng de RNA transcrito de manera inversa en un volumen de reacción total de 20 pl. Cada muestra de ADNc se ejecutó por duplicado para corregir errores de pipeteo. Los cebadores y las tabletas TAQMAN® etiquetadas con FAM se utilizaron a concentraciones de 200 nM. El nivel de expresión para cada gen diana se normalizó utilizando un control endógeno de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDh ) humano previamente desarrollado por Applied Biosystem. Los conjuntos de cebadores y sondas se enumeran a continuación: Oct3/4 (Hs00742896), SOX-2 (Hs00602736), UTF-1 (Hs00747497), Rex-1 (Hs00399279), Conexina 43 (Hs00748445), Conexina 45 (Hs00271416), ABCG2 (Hs00184979), Otx-1 (Hs00222238), Cerberus (Hs00193796) m, Albúmina (Hs00609411).
[0263] Después de una incubación inicial a 50°C durante 2 minutos seguida de 95°C durante 10 minutos, las muestras se ciclaron 40 veces en dos etapas: una etapa de desnaturalización a 95°C durante 15 segundos seguida de una etapa de recocido/extensión en 60°C durante 1 min. El análisis de los datos se llevó a cabo con el software GENEAMP®7000 Sequence Detection System. Para cada conjunto de cebador/sonda, a valor Ct se determinó como el ciclo en el cual la intensidad de la fluorescencia alcanzó un valor específico en el medio de la región exponencial de amplificación. Los niveles de expresión génica relativos se calcularon utilizando el método Ct comparativo. Brevemente, para cada muestra de ADNc, el valor Ct control endógeno se restó del gen de interés Ct para dar el valor Ct delta (ACt). La cantidad normalizada de diana se calculó como 2' ACt, suponiendo que la amplificación fuera del 100% de eficiencia. Los datos finales se expresaron en relación con una muestra de calibrador.
Ejemplo de referencia 12
Análisis de cariotipo
[0264] El cariotipo de células H9 se determinó mediante análisis de cariotipo de bandas G estándar. Se evaluaron un total de 100 extensiones metafásicas (Applied Genetics Laboratories, Inc.). No se encontraron aberraciones cromosómicas en 100 células analizadas. El análisis citogenético mostró que las células tenían un número normal de autosomas y un número de cromosomas modales de 46. La Figura 15 muestra un cariotipo típico obtenido de la línea de células madre embrionarias humanas H9.
Ejemplo de referencia 13
Cultivo de células madre embrionarias humanas en sustrato de cultivo tisular recubierto con matriz extracelular
[0265] Las líneas de células madre embrionarias humanas H1, H7 y H9 se obtuvieron de WiCell Research Institute, Inc., (Madison, WI) y se cultivaron según las instrucciones proporcionadas por el instituto fuente. Brevemente, las células se cultivaron en células alimentadoras de fibroblastos embrionarios (MEF) de ratón en medio de células ES que consiste en DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO) incluido con 20% de reemplazo de suero knockout, 100 nM MEM aminoácidos no esenciales, 0,5 mM beta-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina con 4 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básicos humanos (bFGF). Las células MEF, derivadas de E13 a 13.5 embriones de ratón, se compraron de Charles River. Las células MEF se expandieron en medio DMEM complementado con FBS al 10% (Hyclone), glutamina 2 mM y aminoácidos no esenciales MEM 100 mM. Los cultivos celulares de MEF sub-confluentes se trataron con 10 pg/ml de mitomicina C (Sigma, St. Louis, MO) durante 3 h para detener la división celular, luego se tripsinizaron y se sembraron en placas a 2x104/cm2 en placas recubiertas con gelatina bovina al 0,1%. Las células MEF del paso dos al cuatro se utilizaron como capas de alimentación. Las células madre embrionarias humanas plaqueadas en capas alimentadoras de células MEF se cultivaron a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2 dentro de una incubadora de cultivo de tejido humidificado. Cuando fueron confluentes (aproximadamente 5 a 7 días después de la siembra), las células madre embrionarias humanas se trataron con 1 mg/ml de colagenasa tipo IV (Invitrogen/GIBCO) durante 5 a 10 minutos y luego se rasparon suavemente de la superficie con una pipeta de vidrio de 5 ml. Las células se centrifugaron a 900 rpm durante 5 minutos, y el sedimento se resuspendió y se volvió a colocar en una proporción de 1:3 a 1:4 de células en placas recubiertas con una dilución de 1:30 de Ma TRIGEL™ reducido por factor de crecimiento (BD Biosciences). Las células se cultivaron posteriormente en medio acondicionado con MEF suplementado con 8 ng/ml de bFGF y colágenasa pasada en placas recubiertas con MATRIGEL durante al menos cinco pases. Las células cultivadas en MATRIGEL™ se pasaron rutinariamente con colagenasa IV (Invitrogen/GIBCO), Dispasa (BD Biosciences) o enzima de Liberasa (Roche, IN).
Ejemplo de referencia 14:
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo tisular recubierto con matriz extracelular de endodermo definitivo
[0266] La diferenciación de células madre embrionarias a endodermo definitivo se llevó a cabo como se describe anteriormente en Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (diciembre de 2005). Brevemente, los cultivos de H9 a aproximadamente 60 a 70% de confluencia se expusieron a medio DMEM:/F12 suplementado con FBS al 0,5% y 100 ng/ml de activina A durante dos días, seguido de tratamiento con medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 2% y 100 ng/ml de activina A (AA) durante tres días adicionales. Las células H9 se cultivaron en placas recubiertas con MATRIGEL con factor de crecimiento reducido a una dilución de 1:30 a 1:10 o en MATRIGEL regular a una dilución de: 30 a 1:10. Las placas se recubrieron con MATRIGEL durante 1 hora a temperatura ambiente.
[0267] En el día 5, los cultivos se analizaron mediante FACS para CXCR4, E-cadherina, CD9, y la expresión de N-cadherina y por PCR en tiempo real para SOX-17, SOX-7, proteína alfa-fetal (AFP), CXCR4, Brychyury (Bry), gooscecoid (GSC), HNF-3 beta y GATA4. AFP y SOX-7 se consideran marcadores endodérmicos viscerales, mientras que GATA4, HNF-3 beta y SOX-17 representan marcadores endodérmicos definidos, y GSC, Bry y CXCR4 representan marcadores de la línea primitiva. Figura 17 representa la expresión de CXCR4 por FACS. Hubo un aumento significativo en la expresión de CXCR4 por células cultivadas en placas recubiertas con MATRIGEL a una dilución de 1:10 en comparación con concentraciones más bajas de MATRIGEL. Además, el factor de crecimiento reducido MATRIGEL no fue tan eficaz en la formación de células endodérmicas definitivas en comparación con MATRIGEL normal.
[0268] Figura 18 muestra los resultados de la PCR en tiempo real que verifican que las células cultivadas en placas recubiertas con una dilución 1:10 de MATRIGEL mostraron una regulación positiva significativa de los marcadores endodérmicos definitivos en comparación con las células cultivadas en una dilución 1:30 de MATRIGEL.
Ejemplo de referencia 15
Análisis de micromatrices de cambios en la expresión génica en células madre embrionarias después de la formación del endodermo definitivo
[0269] El ARN total se aisló a partir de los siguientes cultivos de células madre embrionarias humanas usando un kit RNeasy mini (Qiagen): las células H9P83 cultivadas en placas recubiertas de Matrigel y expuestas a medio DMEM/F 12 suplementado con 0,5% de FBS y 100 ng/ml de activina A durante dos días, seguida de tratamiento con medio DMEM/F 12 suplementado con 2% de FBS y 100 ng/ml de activina A (AA) durante tres días adicionales; las células H9P44 cultivadas en MEF y expuestas a medio DMEM/F 12 suplementado con FBS al 0,5% y 100 ng/ml de activina A durante dos días, seguido de tratamiento con medio DMEM/F 12 suplementado con FBS al 2% y 100 ng/ml de activina A durante tres días adicionales. Los controles para cada grupo incluían células plaqueadas en placas revestidas con MATRIGEL y cultivadas en medio condicionado con MEF o células plaqueadas en MEF y cultivadas en medio ES.
[0270] Preparación de la muestra, la hibridación y análisis de imágenes se realizó de acuerdo con el Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array. Tras la normalización y una transformación de registro, el análisis de los datos se realizó con el software OmniViz® (MA) y GENESIFTER (VizXLabs, WA). La variabilidad dentro de cada tratamiento y entre los diferentes tratamientos se comparó utilizando el coeficiente de correlación de Pearson. La varianza en los perfiles de expresión génica entre los diferentes tratamientos junto con el coeficiente de correlación entre las líneas se muestra en la Figura 19. Las diferencias significativas en la expresión génica entre las muestras se evaluaron mediante el análisis de varianza y una prueba F con un valor de P ajustado (Corrección de Benjamini y Hochberg) de < 0,05. Solo los genes con una presente convocatoria fueron incluidos en el análisis. La Tabla IV enumera los genes que se expresan diferencialmente con una diferencia de al menos 5 veces entre las distintas muestras. Se enumeran el valor de intensidad normalizado de los genes que se expresan significativamente junto con el error estándar de la media (SEM) para cada gen.
Ejemplo de referencia 16
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo de tejido recubierto Con MATRIGEL™ a endodermo definitivo
[0271] La diferenciación de células madre embrionarias a endodermo definitivo se llevó a cabo como se describe anteriormente en Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (diciembre de 2005). Brevemente, los cultivos de células H9, H7 o H1 sembradas en factor de crecimiento con MATRIGEL™ (dilución 1:30) a aproximadamente 60 a 70% de fluidez se expusieron a medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 0,5% y 100 ng/ml de activina A (R&D Systems, MN)) durante dos días, seguido de un tratamiento con medio DMEM/F12 suplementado con 2% de FBS y 100 ng/ml de activina A (AA) durante tres días adicionales. En todos los ejemplos posteriores, a menos que se indique lo contrario, este régimen de tratamiento se denominará protocolo de endodermo definido (DE). En paralelo, las células H9, H7 o H1 cultivadas en alimentadores de MEF también se expusieron al mismo protocolo DE descrito anteriormente.
[0272] En el día 5, los cultivos se analizaron mediante FACS para la expresión CXCR4, E-cadherina, CD9, CD99, y N-cadherina (CD56) y por PCR en tiempo real para SOX-17, SoX-7, la proteína alfa-fetal (AFP), CXCR4, Brychyury (Bry), gooscecoid (GSC), beta HNF-3 y GATA4. AFP y SOX-7 se consideran marcadores endodérmicos viscerales, mientras que GATA4, HNF-3beta y s OX-17 representan marcadores endodérmicos definidos y GSC, Bry y CXCR4 representan marcadores de la línea primitiva.
[0273] Las líneas H cultivadas en alimentadores de ratón y expuestas al protocolo DE resultaron en una expresión robusta de marcadores DE y expresión de CXCR4 por fAc S (Figura 20). También hubo una disminución significativa en la expresión de E-cadherina después del tratamiento con el protocolo DE. Por último, la población de CXCR4 también se tiñó de forma positiva para CD117. La Figura 21 muestra una regulación positiva significativa de los marcadores endodérmicos definitivos en comparación con las células H7 no tratadas (Figura 21, panel a) y células H9 (Figura 21, panel b).
[0274] A diferencia de las líneas H cultivadas en alimentadores MEF, las líneas H cultivadas en MATRIGEL™ (dilución 1:30) y tratadas con el protocolo de endodermo definitivo no mostraron una expresión robusta de marcadores endodérmicos definitivos. En particular, la expresión de CXCR4 por FACS y por PCR en tiempo real fue significativamente menor para las células cultivadas en MATRIGEL™ en comparación con las células cultivadas en fibroblastos embrionarios de ratón. La expresión de marcadores endodérmicos definitivos sigue un patrón de respuesta general con H1 mayor que H9, que es mayor que H7 (Figuras 22 y 23). De la Figura 22, las células H1 mostraron un aumento significativo en la expresión de CXCR4 en comparación con las líneas H7 y H9. Tenga en cuenta que en todos los casos, la expresión de CXCR4 fue menor para las células cultivadas en MATRIGEL™ (dilución 1:30) en comparación con las células cultivadas en fibroblastos embrionarios de ratón. La Figura 23 (paneles ac) muestra los resultados de la PCR en tiempo real que muestran que hubo un aumento moderado en la regulación al alza de los marcadores endodérmicos definitivos en las líneas H7 (Figura 23, panel a) y H9 (Figura 23, panel b). Sin embargo, la línea H1 (Figura 23, panel c) mostró una regulación positiva más robusta de los marcadores de endodermo definitivos en comparación con las líneas H7 y H9.
Ejemplo de referencia 17
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo de tejidos recubierto con MATRIGEL™ a endodermo definitivo (DE)- Papel de los ligandos Wnt
[0275] Las células madre embrionarias H7P44 y H9P46 se cultivaron en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:10) y se expusieron a medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 0,5% y activina A 100 ng/ml (R&D Systems, MN) durante dos días seguido de un tratamiento con medio DMEM/F 12 suplementado con 2% de FBS y 100 ng/ml de activina A (AA) durante tres días adicionales. En algunos de los cultivos, 20 ng/ml Wnt-3a (Catálogo n° 1324-WN-002, R&D Systems, MN), 20 ng/ml Wnt-5a (Catálogo n° 654-WN-010, R&D Systems, MN), 25 ng/ml Wnt-7a (Catálogo n° 3008-WN-025, R&D Systems, MN), o 25 ng/ml de Wnt-5b (Catálogo n° 3006-WN-025, R&D Systems, MN) durante todo el tratamiento de cinco días. La Figura 24 representa imágenes de contraste de fase del cultivo endodermo definitivo H9P46 en presencia de una alta concentración de (a) AA o (b) AA 20 ng/ml de Wnt-3a. La Figura 25 representa la expresión de CXCR4 por FACS en el día 5 para H7P44 y las líneas de H9P46 cultivadas en MATRIGEL™ (dilución 1:30) y expuestas al protocolo DE Wnt-3a (Figura 25, paneles d) y -Wnt-3a.
(Figura 25, paneles a y c). La presencia de Wnt-3a en cultivos de DE dio como resultado una expresión robusta de CXCR4 (CD184) en comparación con los cultivos de DE tratados con suero bajo más alta concentración de AA. La Figura 26 muestra los datos de la PCR en tiempo real para a) H7 y b) cultivos H9 tratados con ligando bajo en suero AA /- Wnt. Para ambas líneas H, la adición de WNT-3a dio como resultado una regulación positiva significativa de los marcadores endodérmicos definitivos. En contraste, Wnt 5a, Wnt-5b y Wnt-7a tuvieron un impacto mínimo en la expresión de los marcadores endodérmicos definitivos.
Ejemplo de referencia 18
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo tisular recubierto con MATRIGEL™ para endodermo definitivo: dosis efectiva de Wnt-3a
[0276] H9P46 células madre embrionarias se cultivaron en platos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1:10) y se expusieron a medio DMEM/F12 suplementado con 0,5% de FbS, 100 ng/ml de activina A (AA), y 10-50 ng/ml de WNT-3a (R&D Systems, MN) durante dos días, seguido de un tratamiento con medio DMEM/F 12 suplementado con 2% de FBS, 100 ng/ml de activina A (AA) y 10-50 ng/ml de Wnt-3a por tres adicionales. dias. Los cultivos de control no se trataron con Wnt-3a. Figura 27, el panel a representa la expresión de CXCR4 por FACS en el día 5 en ausencia de Wnt-3a, b) 10 ng/ml Wnt-3a, c) 20 ng/ml Wnt-3a yd) 50 ng/ml Wnt-3a. En ausencia de Wnt-3a, la expresión de CXCR4 fue muy baja. En contraste, la adición de 10-50 ng/ml de Wnt-3a aumentó significativamente el número de células positivas a CXCR4. Además, la adición de 10 ng/ml de Wnt-3a fue tan efectiva como la adición de 50 ng/ml de Wnt-3a. Los resultados de la PCR en tiempo real (Figura 28, panel a) también confirman este hallazgo.
[0277] En un estudio separado, las células se sembraron en H9p52 1:30 MATRIGEL™ bajo factor de crecimiento. Durante los primeros 2 días del protocolo DE se utilizó un rango de dosis de Wnt3A: 10 ng/ml, 5 ng/ml y 1 ng/ml. La Figura 28, panel b muestra el análisis de PCR de los marcadores DE después de 5 días de tratamiento. El número de células al final del experimento se indica en la Figura 28, panel c. Esto indica que las células están proliferando cuando se usan dosis más altas de Wnt-3a. La extensión a 5 días del tratamiento con Wnt3a (5D) tuvo poco efecto sobre los marcadores DE por PCR y no aumentó significativamente el número de células (Figura 28, panel c). Estos datos indican que 10ng/ml de Wnt3a durante 2 días es suficiente para alcanzar la expansión celular óptima y la diferenciación definitiva del endodermo.
Ejemplo de referencia 19
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo tisular recubierto con MATRIGEL™ a endodermo definitivo (DE)- Efecto del inhibidor de GSK-3B
[0278] Con el fin de confirmar que el efecto de Wnt-3a fue a través de la ruta de Wnt, se usó un inhibidor de GSK-3 para activar los objetivos posteriores de Wnt, como la catenina beta. Las células madre embrionarias H9P46-P48 se cultivaron en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:10) y se expusieron a medio DMEM/F12 complementado con FBS al 0,5%, 100 ng/ml de activina A (AA) e inhibidor IX g Sk-3B 10-1000 nM (Catálogo n° 361550, Calbiochem, CA) durante dos días, seguido de un tratamiento con medio DMEM/F12 suplementado con 2% de FBS, 100 ng/ml de activina A (AA) y 0-1000 nM de inhibidor GSK-3B IX (Catálogo n° 361550, Calbiochem, CA) por tres días adicionales. Los cultivos de control se trataron con suero bajo más dosis altas de activina A /- Wnt-3a.
La Figura 29, panel a representa la expresión de CXCR4 por FACS en el día 5 en ausencia de Wnt-3a o inhibidor GSK-3B, b) 20 ng/ml Wnt-3a, c) 1000 nM inhibidor de GSK-3B IX, d) 500 nM inhibidor de GSK-3B IX, e) 100 nM inhibidor de GSK-3B IX, f) 10 nM inhibidor de GSK-3B IX, g) 100 nM inhibidor de GSK-3B IX durante los días 1-2, y h) 10 nM inhibidor de GSK-3B IX para los días 1-2.
[0279] En ausencia de Wnt-3a o en 10 nm inhibidor de GSK-3B de la expresión de CXCR4 fue muy baja. En contraste, la adición de 20 ng/ml de Wnt-3a o 100-1000 nM de inhibidor de GSK-3B aumentó significativamente el número de células positivas a CXCR4. Además, la adición de inhibidor de GSK-3B 100 nM durante los días 1-2 fue tan efectiva como la adición de inhibidor de GSK-3B 100 nM durante todo el período de cinco días. La Figura 30 representa la expresión génica de marcadores de endodermo definitivos para las células (panel a) H9P48 y las células (panel b) H9P46.
[0280] La Figura 16 representa el esquema de un protocolo de diferenciación en esta invención, donde las células madre embrionarias se diferencian en endodermo definitivo en un sistema libre de alimentación.
Ejemplo de referencia 20
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo tisular recubierto con MATRIGEL™ a endodermo definitivo (DE)- Dosis efectiva de activina A en presencia de inhibidor de GSK-3B o Wnt-3A
[0281] Células madre embrionarias H9P49 y H1P46 se cultivaron en placas recubiertas MATRIGEL™ (dilución 1:10) y se expusieron a DMEM/F 12 suplementado con 0,5% de FBS, 10-100 ng/ml de activina A (AA), y 100 nM inhibidor de GSK-3B IX (n° de catálogo 361550, Calbiochem, CA) o 20 ng/ml de Wnt-3a durante dos días, seguido de un tratamiento con medio DMEM/F 12 suplementado con 2% de FBS, 10-100 ng/ml de activina A (AA) por tres días adicionales.
[0282] Los cultivos de control se trataron con suero bajo más 100 ng/ml de activina A. La Figura 31 representa la expresión de CXCR4 por FACS para H9P49 y H1P46 en el día 5 con a) 10 ng/ml de activina A durante los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3A durante los dos primeros días, b) 100 ng/ml de activina A durante los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3A durante los dos primeros días c) 100 ng/ml de activina A para los cinco días más 100 nM de inhibidor de GSK-3B IX durante los dos primeros días d) 10 ng/ml de activina A durante los cinco días más 100 nM de inhibidor de GSK-3B IX durante los primeros dos días, e) 100 ng/ml de activina A durante los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3A durante los primeros dos días, y f) 10 ng/ml de activina A para los cinco días más 20 ng/ml de Wnt 3A durante los dos primeros días. Los paneles de la Figura 31 son para células H9P49 y los paneles para células H1P46. La Figura 32 representa la expresión génica de marcadores endodérmicos definitivos para cultivos de H9P49 tratados con 10, 50 o 100 ng/ml de activina A más 20 ng/ml de Wnt-3a: panel a: expresión de AFP, Bry, CXCR4, GSC, HNF-3B, y POU5F (oct-4) y panel b: SOX-17 y GATA4. Parece que la expresión robusta de marcadores endodérmicos definitivos se puede obtener utilizando 50 ng/ml de AA 20 ng/ml de Wnt-3A o 100 nM inhibidor de GSK-3B IX. Las dosis más bajas de activina A conducen a la formación de endodermo extraembrionario.
Ejemplo de referencia 21
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo tisular recubierto con MATRIGEL™ a endodermo definitivo (DE)- Combinación de Wnt-3a e inhibidor de GSK-3B
[0283] Las células madre embrionarias H9P53 se cultivaron en placas MATRIGEL™ recubiertas (1:30 dilución) y se expusieron a medio DMEM/F12 suplementado con 0,5% de FBS, 100 ng/ml de activina A (AA), y 100 nM inhibidor de GSK-3B IX (Catálogo n° 361550, Calbiochem, CA) /- 20 ng/ml Wnt-3a durante dos días, seguido de un tratamiento con medio DMEM/F12 complementado con 2% de FBS, 10-100 ng/ml de activina A (AA) durante tres días adicionales. En paralelo, los cultivos de H9P53 se trataron con 25 ng/ml de BMP-4 (Catálogo n° 314-BP-010, R&D Systems, MN) /- 20 ng/ml de Wnt-3A /- 100 ng/ml de activina A. Los cultivos de control se trataron con suero bajo más 100 ng/ml de activina A. La Figura 33 representa la expresión de CXCR4 por FACS en el día 5 con a) 100 ng/ml de activina A durante los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3A durante los primeros dos días y 25 ng/ml de BMP-4 durante los días 3-5, b) 100 ng/ml de activina A para los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3A durante los primeros dos días c) 100 ng/ml activina A para los cinco días más 100 nM de inhibidor de GSK-3B IX durante los dos primeros días d) 20 ng/ml Wnt-3a 25 ng/ml BMP-4 para los cinco días, e) 100 ng/ml de activina A para los cinco días más 20 ng/ml de Wnt-3A 100 nm inhibidor de GSK-3B IX durante los primeros dos días, y f) 100 ng/ml de activina A 25 ng/ml de BMP-4 durante los cinco días. La Figura 34 representa la expresión génica de marcadores endodérmicos definitivos, según lo determinado por PCR en tiempo real para cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas HI en el paso 46, tratados con 10 o 100 ng/ml de activina A más 20 ng/ml de Wnt-3a o 100 NM GSK-3B inhibidor: panel (a): expresión de AFP, Bry, CXCR4, GSC y POU5F (Oct-4) y panel (b): SOX-17, HNF-3B y GATA4. Los resultados se expresan como aumento de veces sobre las células no tratadas. La Figura 35 representa la expresión génica de marcadores endodérmicos definitivos, según se determinó mediante PCR en tiempo real para cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H9 en el pase 49, tratada con 50 o 100 ng/ml de activina A más 10 o 100 nM Inhibidor de GSK-3B: panel (a): expresión de AfP, Bry, CXCR4, GSC, HNF-3B y POU5F (Oct-4) y panel (b):
SOX-17 y GATA4. Los resultados se expresan como aumento de veces sobre las células no tratadas. La Figura 36 representa la expresión génica de marcadores endodérmicos definitivos para el cultivo de H9P53 tratado con combinaciones de activina A, Wnt-3a, inhibidor de GSK-3 y BMP-4: a) expresión de AFP, Bry, CXCR4, GSC, HNF-3B, y SOX7 yb) SOX-17, HNF-3B y GATA4. La adición de BMP-4 al protocolo DE parece inducir la formación del marcador de mesodermo BRY y la combinación de Wnt-3A y el inhibidor de GSK-4B no conduce a una regulación positiva significativa de marcadores de endodermo definitivos en comparación con la adición de cada agente por sí mismo en presencia de la activina A.
Ejemplo de referencia 22
Diferenciación de las células madre embrionarias humanas cultivadas en MEF a endodermo definitivo (DE)-Combinación de Wnt-3a, Activina A, Wnt-5a, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, IL-4 y SDF-1 en bajo suero [0284] Las células H9P44 se sembraron en placas de 6 pocillos previamente recubiertas con fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina (MEF). Las células se cultivaron hasta una confluencia de 70 a 80% en medio de células ES que consistía en DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO) suplementado con 20% de reemplazo de suero knockout, 100 nM MEM no esencial, beta-mercaptoetanol 0,5 mM, 2 mM L-glutamina (todos de Invitrogen/GIBCO) y 8 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básicos humanos (bFGF) (R&D Systems).
[0285] Para la formación de DE, las células se trataron en presencia o ausencia de activina A (100 ng/m1), además de otros factores de crecimiento que se detallan a continuación. Se agregaron factores de crecimiento para aumentar la concentración de FBS de manera gradual como se indica en el siguiente régimen:
Día 0: 0% FBS en DMEM/F 12
Día 1: 0,5% FBS en DMEM/F12
Día 2: 2% FBS en DMEM/F 12.
Día 3: se recogieron las células para análisis FACS y RT-PCR.
[0286] Todos los factores de crecimiento se adquirieron de R&D Systems, MN. A continuación se muestra una descripción detallada y la concentración de los factores de crecimiento para cada grupo de tratamiento.
1. Control: no se agregó factor de crecimiento
2. Activina A (100 ng/ml)
3. Activina A (100 ng/ml) Wnt-3a (10 ng/ml) Wnt5a (10 ng/ml)
4. Activina A (100 ng/ml) Wnt-3a (10ng/ml) Wnt5a (10ng/ml) BMP2 (100ng/ml)
5. Activina A (100 ng/ml) BMP-4 (100 ng/ml)
6. Activina A (100 ng/ml) BMP-6 (100 ng/ml)
7. Activina A (100 ng/ml) BMP-7 (100 ng/ml)
8. Activina A (100 ng/ml) BMP-4 (100 ng/ml) BMP-6 (100 ng/ml) BMP-7 (100 ng/ml)
9. IL-4 (10 ng/ml)
10. SDF1a (20ng/ml)
11. Activina A (100 ng/ml) IL-4 (10 ng/ml) SDF1a (20ng/ml)
12. BMP2 (100ng/ml) BMP-4 (100ng.ml) BMP-6 (100ng/ml) BMP- 7 (
100 ng/ml)
13. Activina A (100 ng/ml) BMP-2 (100 ng/ml) BMP-4 (100 ng/ml) BMP-6 (100 ng/ml) BMP-7 (100 ng/ml)) 14. Activina A (100 ng/ml) IL-4 (10 ng/ml)
15. Activina A (100 ng/ml) (SDF1a (20 ng/ml)
16. Activina A (100 ng/ml) Wnt-3a (10 ng/ml) Wnt-5a (10 ng/ml) Wnt-7a (10 ng/ml)
17. Activina A (100 ng/ml) IL-4 (10 ng/ml) SDF1a (20ng/ml) BMP- 4 (100 ng/ml)
Resultados:
[0287] Las células se recogieron en el día 3 de tratamiento de protocolo DE. Para el análisis, se usó una parte alícuota de células tratadas para la preparación de ARN para RT-PCR y el resto de células se usaron para el análisis FACS. La frecuencia (%) de CXCR4 se muestra en la Figura 37. La adición del (de los) factor(es) de crecimiento anterior(es) no mejoró la expresión de CXCR4 por encima del tratamiento con 100 ng/ml de AA en suero bajo.
[0288] Para el análisis de RT-PCR, se analizaron las células para la expresión de panel seleccionado de marcadores de endodermo definitivo. Los resultados mostrados se calibraron contra células cultivadas en el medio base pero no se trataron con Activina A ni con ninguno de los otros factores de crecimiento. De acuerdo con los datos de FACS, la Tabla V muestra que no hubo una regulación positiva significativa de los marcadores endodérmicos definitivos mediante la adición de factores de crecimiento, como el Wnt-3a a los cultivos tratados con una dosis alta de activina A en suero bajo. Esto contrasta con los ejemplos anteriores que muestran un aumento significativo en los marcadores DE para las células ES cultivadas en condiciones libres de alimentación en presencia de activina A, WNT3A y suero bajo.
Ejemplo de referencia 23
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo tisular recubierto con MATRIGEL™ o fibronectina humana a endodermo definitivo (DE)
[0289] Se cultivaron células H9P55 y se diferenciaron en la fibronectina humana o factor de crecimiento regular de MATRIGEL™ (BD Biociencias). Se añadió 1 ml de DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO) que contenía 1 |jg/ml de fibronectina humana (R&D systems, MN) a cada pocillo de una placa tratada con cultivo tisular de 6 pocillos. Alternativamente, el factor de crecimiento regular MATRIGEL™ se diluyó 1:10 en DMEM/F12 y se añadió 1 ml de MATRIGEL™ diluido a cada pocillo de una placa tratada con cultivo tisular de 6 pocillos. Las células se pasaron con colagenasa. Una vez que las células alcanzaron una confluencia del 80%, se trataron de la siguiente manera: 2 días con FBS al 0,5% que contenía 10 ng/ml de ratón Wnt3a recombinante (R&D) y 100 ng/ml de activina A (R&D). A esto le siguió 3 días de FBS al 2% más 100 ng/ml de Activina A. En la Figura 38, los paneles ab representan la expresión de CXCR4 por células madre embrionarias cultivadas en fibronectina y MATRIGEL, respectivamente. Los resultados de la PCR en tiempo real (Figura 39) confirman que la formación del endodermo definitivo fue equivalente en las placas recubiertas con fibronectina y MATRIGEL™
Ejemplo de referencia 24
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo de tejido recubierto con concentraciones variantes de MATRIGEL™ a endoderm definitivo
[0290] Los cultivos de H9 a aproximadamente 60 a 70% de confluencia se expusieron a medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 0,5%, 20 ng/ml de Wnt-3a y 100 ng/ml de activina A durante dos días, seguido de un tratamiento con medio DMEM/F12. suplementado con 2% de FBS, 20 ng/ml de Wnt-3a y 100 ng/ml de activina A (AA) durante tres días adicionales. Las células H9 se cultivaron en placas recubiertas con MATRIGEL regular a una dilución de 1:60 a 1:10. Las placas se recubrieron con MATRIGEL durante 1 hora a temperatura ambiente.
[0291] en tiempo real resultados de la PCR se muestran en la Figura 40. El tratamiento de células madre de embriones humanos con suero bajo, activina A y Wnt3a condujeron a la expresión de CXCR4, GATA4, goosecoid, HNF-3beta, y SOX-17 genes, lo que sugiere que las células se diferenciaron a la etapa endodérmica definitiva. Sin embargo, no parece que la presencia de la concentración de Wnt-3A del recubrimiento MATRIGEL™ juegue un papel importante en la diferenciación.
Ejemplo de referencia 25
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo tisular recubierto con matriz extracelular y posteriormente cultivadas en MEFS y diferenciadas al papel endodermo definitivo de Wnt-3a
[0292] Las células de la línea H9 de células madre embrionarias humanas cultivadas en MATRIGEL™ durante al menos cinco pasajes fueron sembradas en alimentadores MEF en medios ES. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 60 al 70%, se expusieron a medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 0,5% y 100 ng/ml de activina A durante dos días, seguido de un tratamiento con medio DMEM/F 12 suplementado con FBS al 2% y 100 ng/ml de activina A (AA) durante tres días adicionales. Los grupos de tratamiento adicionales incluyen Wnt-3a a 20 ng/ml durante los cinco días 10-100 ng/ml de activina A.
[0293] En el día 3 y 5, los cultivos se analizaron por PCR en tiempo real para SOX-17, SOX-7, la proteína alfa-fetal (AFP), CXCR4, Brychyury (Bry), gooscecoid (GSC), HNF-3 beta, GATA4, hTERT y oct4. AFP y SOX-7 se consideran marcadores endodérmicos viscerales, mientras que GATA4, HNF-3beta y SOX-17 representan marcadores endodérmicos definidos y GSC, Bry y CXCR4 representan marcadores de la línea primitiva. hTERT y Oct-4 son marcadores de auto renovación y pluripotencia respectivamente. Los resultados de la PCR en tiempo real se muestran en la Figura 41, paneles a-d. El análisis FACs también se realizó los días 3 y 5. Los niveles de expresión de CXCR-4 y CD9 se analizaron y se informaron en la Figura 41, panel e.
[0294] En ausencia de Wnt3a, niveles de expresión AFP de las células cultivadas en 100 ng/ml de activina A son similares a los observados en los controles no tratados. Sin embargo, con la adición de Wnt3a a las células cultivadas en 100 ng/ml de activina A, hay un aumento en la expresión de AFP que aumenta con el tiempo. Cuando se usa una concentración más baja de Activina A, la expresión de AFP es muy alta, independientemente de la presencia de Wnt3a (Figura 41, panel a). Esto sugiere que es necesaria una alta concentración de activina A para evitar que las células se diferencien a los tejidos extraembrionarios.
[0295] Por análisis FACS, las células positivas para CXCR4 oscilaron entre el 32-42% de la población en muestras tratadas con una alta concentración de Activina A pero no tratadas con Wnt3a en comparación con el 23-33% de la población en muestras tratadas con una alta concentración de Activina A y Wnt3a en el día 3 (Figura 41, panel e). Para el día 5 de tratamiento, 28-32% de las células tratadas con una alta concentración de activina A pero no tratadas con Wnt-3a expresaron CXCR4 en comparación con el 43-51% de las células tratadas con una alta concentración de activina A y Wnt3a (Figura 41, panel f). En las células tratadas con una baja concentración de Activina A, hubo más células positivas para CXCR4 en el grupo de tratamiento sin Wnt3a (11 a 20%) en comparación con el grupo tratado con Wnt-3a (3 a 4%) (Figura 41, panel g). En general, Wnt-3a no parece desempeñar un papel significativo en la diferenciación de las células madre embrionarias humanas, cultivadas en MEF, hasta el endodermo definitivo. Esto sugiere que la capa de alimentación probablemente esté segregando suficiente Wnt-3a o un ligando análogo para mejorar la formación de endodermo definitivo inducida por activina A. Ejemplo de referencia 26
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo tisular recubierto con matriz extracelular a endodermo definitivo después del tratamiento con un inhibidor de Wnt-DKK-1
[0296] Para determinar si la adición de Wnt-3a estaba causando el aumento en la diferenciación, se añadió un inhibidor de la señalización de Wnt-3 a los cultivos. Se expusieron cultivos de H9 a aproximadamente 60 a 70% de confluencia a medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 0,5%, 20 ng/ml de Wnt3a, 100 ng/ml de Dikkopf-1 (DKK-1) y 100 ng/ml de activina A durante dos días seguidos de tratamiento con medio DMEM/F 12 suplementado con 2% de FBS y 100 ng/ml de activina A (AA) durante tres días adicionales. Las células H9 se cultivaron en placas recubiertas con MATRIGEL con factor de crecimiento reducido a una dilución de 1:30. Las placas se recubrieron con MATRIGEL durante 1 hora a temperatura ambiente.
[0297] En el día 5, los cultivos se analizaron por PCR en tiempo real para SOX-17, SOX-7, proteína alfa-fetal (AFP), CXCR4, Brychyury (Bry), gooscecoid (GSC), HNF-3 beta, GATA4, hTERT y oct4. AFP y SOX-7 se consideran marcadores endodérmicos viscerales, mientras que GATA4, HNF-3beta y SOX-17 representan marcadores endodérmicos definidos y GSC, Bry y CXCR4 representan marcadores de la línea primitiva. hTERT y Oct-4 son marcadores para la auto renovación y la pluripotencia respectivamente. Los resultados se muestran en la Figura 42.
[0298] En presencia de Wnt3a, las células expresan CXCR4, GATA4, HNF-3beta y SOX17, todos marcadores de endodermo definitivo. Los marcadores de la formación de líneas primitivas, como la goosecoide, también se detectaron en niveles más altos que los detectados en los controles no tratados. Con la adición de DKK1, el nivel de expresión de los marcadores de diferenciación mencionados anteriormente disminuye dramáticamente a niveles similares a los de las células no tratadas. Referencia
Ejemplo de referencia 27
Tinción por imuunofluorescencia de marcadores DE para células madre embrionarias H9 cultivadas en sustrato de cultivo de tejido recubierto con MATRIGEL y diferenciado en suero bajo más activina-a y /- Wnt-3a
[0299] Los cultivos de día 5 DE de células H9 se tiñeron según el Ejemplo 10 para SOX-17, HNF-3B, GATA-4, N-cadherina y E-cadherina. Todos los núcleos se tiñeron a contracorriente con DAPI. 20 ng/ml de Wnt-3a dio como resultado un número significativamente mayor de núcleos positivos para SOX-17, HNF-3beta. y GATA-4 en comparación con los cultivos diferenciados en ausencia de Wnt-3a. Además, la adición de Wnt-3a dio como resultado una pérdida significativa de la expresión de e-cadherina y una expresión mejorada de N-cadherina (Figura 43, panel a y Figura 43, panel b).
Ejemplo de referencia 28
Análisis de micromatrices de los cambios en la expresión génica en células madre embrionarias luego de la formación del endodermo definitivo en MEF frente a MATRIGEL™
[0300] El ARN total se aisló a partir de los siguientes cultivos de células madre embrionarias utilizando un kit RNeasy mini (Qiagen): A) Células H9P33 cultivadas en placas recubiertas con MATRIGEL™ (1:30 dilución) y se expusieron a medio DMEM/F12 suplementado con 0,5% FBS y 100 ng/ml de activina A durante dos días, seguido de un tratamiento con medio DMEM/F12 complementado con 2% de FBS y 100 ng/ml de activina A (AA) durante tres días adicionales; B) Células H9P44 cultivadas en MEF y expuestas a medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 0,5% y 100 ng/ml de Activina A durante dos días, seguido de tratamiento con medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 2% y 100 ng/ml de Activina A para tres días adicionales y C) células H9P48 cultivadas en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) y expuestas a medio DMEM/F 12 suplementado con FBS al 0,5% y 100 ng/ml de activina A más 20 ng/ml de Wnt-3A durante dos días, seguido de un tratamiento con medio DMEM/F 12 suplementado con 2% de FBS y 100 ng/ml de Activina A (AA) durante tres días adicionales. Los controles para cada grupo incluían células plaqueadas en placas revestidas con MATRIGEL y cultivadas en medio condicionado con MEF o células plaqueadas en MEF y cultivadas en medio ES. Todos los grupos contenían tres réplicas biológicas y cada réplica biológica se repitió en dos chips genéticos separados.
[0301] Preparación, hibridación y análisis de imágenes de la muestra se realizaron de acuerdo con el Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array. Tras la normalización y una transformación de registro, el análisis de los datos se realizó con el software OmniViz® (MA) y GENESIFTER (VizXLabs, WA). Las diferencias significativas en la expresión génica entre las muestras se evaluaron mediante el análisis de varianza y una prueba F con un valor de P ajustado (corrección de Benjamini y Hochberg) de < 0,05. Solo se incluyeron en el análisis los genes con una presente llamada en al menos un grupo. La Tabla VI enumera la intensidad de la señal transformada logarítmicamente normalizada media de los genes que muestran al menos 5 veces la diferencia entre el grupo A, el grupo B y el grupo C junto con el valor de P ajustado para cada gen.
Ejemplo de referencia 29
Diferenciación de la línea SA002 ES cultivada en sustrato de cultivo de tejidos recubierto con MATRIGELTM hasta endodermo definitivo (DE)
[0302] Células SA002 P38 (Cellartis, Suecia) previamente cultivadas durante al menos tres pases en placas recubiertas con MATRIGEL (dilución 1:30) en MEF-CM suplementado con 8 ng/ml de bFGF se expusieron a medio DMEM/F 12 suplementado con 0,5% de FBS y 100 ng/ml de activina A (R&D Systems, MN) /- 20 ng/ml de inhibidor de Wnt-3a o 100 nm GSK-3B IX durante dos días, seguido de tratamiento con medio DMEM/F 12 suplementado con 2% de FBS y 100 ng/ml de activina A (AA) durante tres días adicionales. Los resultados de la PCR en tiempo real se muestran en la Figura 44, paneles a y b. Similar a las líneas H1, H7 y H9, la línea SA002 también requirió la adición de Wnt-3A para la expresión robusta de los marcadores DE. La expresión de CXCR4 se representa en la Figura 45: a) Tratamiento de AA b) AA Wnt-3a c) Inhibidor de AA GSK-3B.
Ejemplo de referencia 30
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo de tejido recubierto con suero humano a endodermo definitivo (DE)
[0303] Los cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en el paso 55 se cultivaron y se diferenciaron en placas recubiertas con suero humano (Sigma, n.° HI388, MO). Se añadieron 0,5 ml de suero humano a cada pocillo de una placa tratada con cultivo tisular de 6 pocillos, se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se aspiraron antes de agregar células madre embrionarias humanas. Una vez que las células alcanzaron una confluencia del 80%, se trataron de la siguiente manera: 2 días con FBS al 0,5% que contenía 10 ng/ml de ratón Wnt3a (R&D) recombinante o 100 nM inhibidor de GSK-3B IX (Catálogo n° 361550, Calbiochem, CA) y 100 ng/ml de activina A (I D). Esto fue seguido por 3 días de FBS al 2% más 100 ng/ml de Activina A. Luego se analizaron los cultivos mediante PCR en tiempo real (Figura 46, paneles a y b). Se observó una expresión robusta de marcadores endodérmicos definitivos para las células tratadas con activina A inhibidor de GSK-3B o Wnt-3A en comparación con las células tratadas con activina A. Estos hallazgos son paralelos a nuestros hallazgos para células madre embrionarias humanas cultivadas en MATRIGEL™ o placas recubiertas con fibronectina humana. Referencia
Ejemplo de referencia 31
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo tisular recubierto con MATRIGEL™ para endodermo definitivo (DE)- Evaluación de varios inhibidores de GSK-3B
[0304] La eficacia de un número de inhibidores de GSK-3B disponibles comercialmente se evaluó en formación de DE a partir de células madre embrionarias humanas. Los siguientes inhibidores de GSK-3B se evaluaron a 100 nM: inhibidor de GSK-3B VIII (Catálogo n° 361549, Calbiochem, CA), inhibidor de GSK-3B IX (Catálogo n° 361550, Calbiochem, CA), inhibidor de GSK-3B XI (Catálogo n° 361553, Calbiochem, CA), inhibidor de GSK-3B XII (N° de catálogo 361554, Calbiochem, CA). Las células H1P54 ES se cultivaron en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se expusieron a medio DMEM/F 12 suplementado con FBS al 0,5%, seguían dos ng/ml de activina A (AA) /- varios inhibidores de GSK-3B durante dos días por tratamiento con medio DMEM/F 12 suplementado con 2% de FBS, 100 ng/ml de activina A (AA) durante tres días adicionales. Los cultivos de control se trataron con suero bajo más dosis altas de AA. En la Figura 47, los paneles a y b representan la expresión génica de marcadores endodérmicos definitivos en el día 5. El inhibidor de GSK-3B IX y XI fueron ambos eficaces para inducir la formación de DE en comparación con el inhibidor de GSK-3B VIII y XII.
Ejemplo de referencia 32
Formación de endodermo pancreático por células madre embrionarias humanas cultivadas en condiciones sin alimentador: - Evaluación de análogos de ácido retinoico
[0305] Las células madre embrionarias H9P49 se cultivaron en placas recubiertas de MATRIGEL™ (1:30 dilución) y se expusieron a medio DMEM/F12 suplementado con 0,5% de FbS, 20 ng/ml Wnt-3a (Catálogo n° 1324-WN-002, R & D Systems, MN), y 100 ng/ml de activina A (R&D Systems, MN) durante dos días, seguido de un tratamiento con medio DMEM/F12 suplementado con 2% de FBS y 100 ng/ml de activina A (AA) durante tres días adicionales. En el día 5, las células se recogieron para su evaluación mediante FACS y PCR en tiempo real. Como se indicó en los ejemplos anteriores, este protocolo dio lugar a una fuerte regulación al alza de los marcadores endodérmicos definitivos, como CXCR4 y SOX-17. Las células endodérmicas definitivas resultantes en el día 5 se expusieron a las siguientes condiciones de los medios para inducir la formación del endodermo pancreático: cultivo en medios DMEM/F12 complementados con FBS al 2% y ácido 1 pM todo retinoico trans (RA) (Catálogo n° R2625, Sigma, MO), o 0,1-10 pM AM-580 (4-[(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametilo-2-naftalenil)carboxamido]ácido benzoico, n.° de catálogo A8843, Sigma, MO), o 0,1-1 pM TTNPB (4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametilo-2-naftalenilo)-1-propenilo]ácido benzoico, n.° de catálogo T3757, Sigma, MO) durante 3 días. AM-580 y TTNPB son análogos de ácido retinoico con afinidad por los receptores de ácido retinoico. El tratamiento de la RA fue seguido por un tratamiento adicional de tres días en medio DMEM/F12 suplementado con 2% de FBS y 20-50 ng/ml de bFGF (Catálogo n° F0291, Sigma, MO). Se recogieron los cultivos y se recogieron muestras de ARNm para su análisis.
[0306] La expresión de genes reveló que (Figura 48, paneles a-d) la adición de 1 pM RA seguido de exposición a bFGF regula por incremento significativamente los marcadores de endodermo pancreático, tales como PDX-1.
Además, este protocolo dio como resultado una expresión robusta de marcadores endodérmicos foregut, como CDX-2 y AFP. A una concentración de 1 pM, la adición de análogos de RA dio como resultado endodermo pancreático y marcadores de foregut equivalentes. Sin embargo, la adición de análogos de 1 pM RA dio como resultado una expresión más robusta de AFP en comparación con el ácido retinoico todo trans. Sin embargo, la adición de 10 pM AM-580 suprimió la expresión de AFP y CDX-2 mientras que se mantenía una alta expresión de PDX-1.
Ejemplo de referencia 34
El efecto del tratamiento con Wnt-3a sobre la expresión de citocinas en células madre embrionarias humanas
[0307] El efecto que tiene el tratamiento Wnt-3a en la expresión de citoquinas se analizó utilizando una matriz de proteína. Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H9 se cultivaron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 15. En el pase 54, las células se diferenciaron en presencia de 100 ng/mlActivinaA /- 10 ng/mlWnt3a durante 2 días en FBS al 0,5% DMEM/F12. Las células se cultivaron posteriormente durante tres días adicionales en 100 ng/ml de Activina A y 2% de FBS DMEM/F12. Al final del quinto día, la expresión de CXCR4 se determinó mediante FACS para cada grupo de tratamiento. Las células tratadas con Activina A solo tenían un 1% de células que expresaban CXCR4. Las células tratadas con Activina A y Wnt3a tuvieron un 73% de células positivas para la expresión de CXCR4.
[0308] Los lisados celulares se prepararon a partir de células de cada grupo de tratamiento, con un kit de lisis de células de mamífero (Sigma-Aldrich, MO). Los medios condicionados de cada grupo de tratamiento se recogieron y se concentraron. El análisis de la matriz de citoquinas se completó utilizando los paneles de la matriz de citoquinas proporcionados por RayBiotech, GA (http://www.raybiotech.com/). La Tabla VII enumera las citoquinas, el factor de crecimiento y la expresión del receptor luego de la normalización de los datos y la sustracción del fondo. Para cada panel, también se incluyen controles positivos y negativos. Los datos mostrados son dos muestras independientes por grupo de tratamiento celular (1,2).
[0309] la regulación positiva notable de angiogenina, IGFBP-1 y EGF se ven en el medio acondicionado por células tratadas con Wnt3. Numerosas proteínas están reguladas al alza en los lisados celulares tratados con Wnt3a, incluyendo IGFBP-1, TGFbeta-1 y TGFbeta-3. Estas proteínas reguladas al alza se pueden agregar nuevamente a los medios de diferenciación para reemplazar o mejorar los efectos de Wnt3a en la formación definitiva de endodermo.
Ejemplo de referencia 35
Diferenciación de células madre embrionarias humanas cultivadas en sustrato de cultivo de tejido recubierto con MATRIGEL™ a endoderm definitivo: papel de Wnt1
[0310] Las células H1P55 ES fueron cultivadas en placas recubiertas con MATRIGEL™ (1:30 dilución) y se expusieron a medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 0,5%, y 100 ng/ml de activina A /- 10-20 ng/ml de Wnt 1 (PeproTech, NJ, Catálogo n° 120-17) durante dos días, seguido de un tratamiento con medio DMEM/F12 suplementado con 2% de FBS, 100 ng/ml de activina A (AA) y /- 10 o 20 ng/ml de WNT-1 por tres días adicionales. Se ensayaron las siguientes combinaciones de WNT1 AA:
a) 20 ng/ml de WNT1 100 ng/ml AA en FBS al 0,5% DM-F12 para los días 1-2 seguidos de 2% FBS DM-F12 100 ng/ml AA para el día tres, b) 20 ng/ml de WNT1 100 ng/ml AA en FBS al 0,5% DM-F12 para los días 1-2 seguidos de FBS al 2% DM-F12 100 ng/ml AA para los días 3-5, c) 10 ng/ml de WNT1 100 ng/ml AA en 0,5% FBS DM-F12 para los días 1-2 seguidos de 2% FBS DM-F12 100 ng/ml AA para el día tres, d) 10 ng/ml de WNT1 100 ng/ml AA en FBS al 0,5% DM-F12 para los días 1-2 seguidos de FBS DM-F12 al 2% 100 ng/ml AA para los días 3-5, e) 20 ng/ml de WNT1 100 ng/ml AA en 0,5% de FBS DM-F12 para los días 1-2 seguidos de 2% de FBS DM-F12 100 ng/ml AA 20 ng/ml de WNT1 para el día tres, f) 20 ng/ml de WNT1 100 ng/ml AA en FBS al 0,5% DM-F12 para los días 1-2 seguidos de FBS DM-F12 al 2% 100 ng/ml AA 20 ng/ml de WNT1 para los días 3-5. La Figura 49, paneles a y b muestra los datos de PCR en tiempo real para los marcadores endodérmicos definitivos después del tratamiento de las células H1 con suero bajo, AA y Wnt-1. La adición de 20 ng/ml de Wnt1 en el presente de 100 ng/ml de AA dio como resultado una regulación positiva significativa de los marcadores endodérmicos definitivos (Bry, CXCR4, GSC, SOX17, HNF-3B y GATA-4).
TABLA IA: LISTA DE ANTICUERPOS PRIMARIOS UTILIZADOS PARA FACS Y ANALYSIS DE
INMUNOTINCIÓN.
Figure imgf000042_0002
TABLA IB: LISTA DE ANTICUERPOS CONJUGADOS SECUNDARIOS UTILIZADOS PARA FACS E ANALISIS
POR INMUNOTINCIÓN.
Figure imgf000042_0003
TABLA IIA: CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN LAS CÉLULAS MADRE EMBRIÓNICAS
HUMANAS CON EL TIEMPO, DESPUÉS DE ACTIVAR UN TRATAMIENTO.
Figure imgf000042_0004
TABLA IIB: CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN LAS CÉLULAS MADRE EMBRIÓNICAS
HUMANAS CON EL TIEMPO, DESPUÉS DE ACTIVAR UN TRATAMIENTO.
Figure imgf000042_0001
TABLA HC: CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA EN LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
HUMANAS CON EL TIEMPO
Figure imgf000042_0005
TABLA III: PERFIL DE EXPRESIÓN DE LOS MARCADORES DE PLURIPOTENCIA PARA LA CÉLULA MADRE
EMBRIONARIA UTILIZADA EN LA PRESENTE INVENCIÓN.
Figure imgf000043_0001
TABLA IV: EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES ENTRE LAS
CÉLULAS MADRE EMBRIÓNICAS NO DIFERENCIADAS Y
CÉLULAS DE ETAPA ENDODÉRMICA DEFINITIVA
CULTIVADAS EN FIBROBLASTOS EMBRIÓNICOS
MATRIGELTM O DE RATÓN DESPUÉS DE 5 DÍAS DE
TRATAMIENTO.
Identificador Titulo de gen Gen ID H9P83 en H9P83 en H9P44 en
Figure imgf000044_0001
de genes matrigel etapa MEF
Figure imgf000044_0002
matrigel- DE
DB7811 Homo GATA6 -2.12 0,19 2.82 2.20 -2.56 0.46
sapiens
ARNm para
GATA-6,
completo
cds.
/PROD=GAT
A-6
/FL=gb:U660
75.1
gb:NM_0052
57.1
gb:D87811 1
AW157548 proteína 5 IGFBP5 -3.28 0.17 3.31 2.11 -3.78 0.36
de unión a
factor de
crecimiento de
tipo insulina
/FL=gb:M650
62.1
gb:M62782.1
gb.NM_0005
99.1
gb:AF05503
3.1
NM_001898 Homo CST4 -2.15 126 2.54 1.95 -2.71 0.98
sapiens
cistatina SN
(CST1),
ARNm
/PROD=cyst
alin SN
/FL=gb:J038
70.1
gb:NM_0018
98.1
AK000680 Homo PAG1 -2.87 0.91 1.61 0.22 -4.06 0.50
sapiens
ADNc
FU20673
fis, clon
KAIA4464.
rFL=gt>:AF24
06341
gt>:NM_Cl84
40.1
KIM_022642 Homo - -2.24 0.12 2.97 0.42 -3.78 0.07 2.51 0.44 sapiens
coriónico
somatomam
mol repina
hormona 1
(lactógeno
placen tal)
(CSH1),
transcripto
variante 4,
ARNm
/PROD=chon
ónico
somatomam
motropina
hormona 1
isoforma 4
/FL=gfcNM_
0226421
NM_001317 Homo CSH1 -2.95 0.57 2.69 036 -4.04 0.51 1.86 0.68 sapiens
coriónico
somatomam
motropina
hormonal
(lactógeno
placental)
(CSH1).
transcripto
variante 1
ARNm
rPROD^chori
ónico
somatomam
motropina
hormona 1
isoforma
1 precursor
/FL=9b:NM_
001317.2
gb:J00118.1
BC0C5921 Homo CSH1 -2.26 0.09 3.26 0.23 -2.96 0.37 2.58 0.45 sa piara,
coriónico
somatomam
motropina
hormona 1
(lactógeno
placenta I)
clon
MGC14518,
ARNm
completo
«la.
/PROD=chon
ónico
somatomam
motropina
hormona 1
(lactógeno
placental)
>FL=gb:BCOQ
5921.1
AI796169 GATA- GATA3 -4.45 0.10 0.24 1.30 -4.72 0.13 0.80 205
unión
proteina 3
/FL=gbcNM
002051.1
gb:M69l06,1
gb:BCÜ0307
01
NM_020991 Homo CSH1 -1.27 048 3.19 0.23 -2.91 0.35 2.62 0.54 sapiens
coriónico
somatomam
motropina
hormona 2
(CSH2).
transcripto
variante 1.
ARNm
/PROD-ChOíi
ónico
somatomam
motropina
hormona 2
isoforma
1 precursor
/FL=gb:NM_
020991.2
gb:BC00271
7.1
NM 021627 Homo CCDC81 -0.37 0.35 3.16 2.05 -2.02 1.27 5.25 1.98 isoforma
proteína
hipotética
FLJ23514
(FLJ23514),
ARNm
/PROD=
proteína
hipotética
FU23514
/FL=gb:NM_
021827.1
ABO28021 Cluster Incl. FOXA2 -2.97 0.25 0.59 3.25 -3.43 0.57 4.12 2.57
ABO26021 :H
orno sapiens
HNF-3beta
ARNm para
factor
nuclear
de hepatocito-3 beta
completa cds
fcds=(196,15
69)
/gb=AB028C
21
/gl=4958949
fug=Hs 1556
51 /len=1944
NM_002521 Homo NPPB 1.54 0.11 5.47 1.17 -0.15 0.38 6.24 1.23 sapiens
péptido
natriurético
precursor B
(NPPB),
ARNm
yPROD=
péptido
natriurético
precursor B
/FL=gb:NM_
002521.1
gb;M25296.1
AA352113 ESTs ST8SIA4 -4,01 1.24 -0.99 2.04 -4,79 1.00 1.05 1.62 BM128432 Horro IGFBP5 -2.73 1.11 2.31 2.30 -3.48 0.56 4.45 2.02
sapiens full
inserto de
longitud
completa
clon de ADNc
VA81B05
NM 002770 Homo PRSS1 -2.77 0.33 1.59 2.68 -3.13 0.48 3.88 2.95
sapiens
proteasa
serina, 2
(tripsina 2)
(PRSS2),
ARNm.
/PROD =
proteína, serina,
2 (tripsina 2)
/FL=gb:M276
02.1
gb:NM_0027
70.1
NM_022579 Homo CSH1 -1.58 0.91 2.48 0.38 -3.33 0.13 1.77 0.49 sapiens
coriónico
somatomam
motropina
1 (CSHL1),
transcripción
variante 3,
ARNm.
/PROD =
coriónico
somatomam
motropina
tipo
hormonal,
isoforma 3
/FL=gb:NM_
022579.1
NM_005454 Homo CER1 2.82 0.09 5.76 1.04 1.46 0.05 6.74 1.18 sapiens
cerberos 1
{Xenopus
laevls)
homólogo
{cisterna
superfamilia
(CER1),
AR Nm
/PROD=cerb
erus 1
/FL=gb:NM_
005454.1
NM 022645 Homo CSH1 -2.30 0.33 2.95 0.31 -2.78 0.24 2.45 0.34 sapiens
ex»rió neo
somatomam
molropina
hormona 2
(CSH2),
transcripción
variante 3,
ARNm
/P R O D =■
c o rió n ic a
somatomam
mot repina
hormona 2
isoterm a
3 precursor
fFL=gb:NM_
022645.1
AI621586 ESTs, LOC440981 -3.22 0.97 0.66 3.19 -2.97 0.13 4.22 2.76
Moderadamente
similar a
JE0284 Mm-1 célula
tra n s p la n ta b ilid a d
derivada
asociada a
prote ¡na 1 b
(H.saplsns)
AL121722 a d n humano -2.95 0.36 -0.01 2.69 -3.43 0.38 2.95 2.66
secuencia
del clon
RP4-788L20
en
cromosoma
20 contiene
el HNF3B
(hepatocito
nuclear
factor 3,
beta), gen
novedoso
basado en
EST.E5T
S T S .G S S
>CpG
Islas
NM 001311 Homo CRIP1 1.66 0.17 1.90 007 -296 066 180 0.24 sapiena
rico en cisteina
proteína 1
(intestinal)
(CRIP1).
A R N m .
J PROO-
rico en
cisteina
proteina 1
(intestinal)
/FL=gb:US8S
30.1
gb;BC00273
8.1
gb:NM_0013
11.1
gt>:UG9770_1
AY177407 Homo GSC -4.59 0.18 -1.08 2.89 -464 006 1.89 2.79
sapiere
tomeobox
proteina
piel gallina
ARNm,
cds
completo.
/PROD =
twmeobox
proteína
piel gallina
/ FL = gta: AY17
7407.1
gb:NM_1738
49.1
NM_005442 Homo EOMES -0.16 0.29 2.89 1.70 0.13 0.16 490 1.34 sapiens
eomesodermo
en (Xenopus
laevis)
homólogo
(EOM ES),
ARNm.
/PROD=*om
nedtrmha
(XÉnupw
UBVll
homólogo
/FL=9b;AB03
1038.1
gb*U_Q054
421
L01639 humano CXCR4 0.64 0.26 3.71 1.78 -0.16 0.50 5.48 1.77
(dwi
HBY3RR)
nauopAobdo
íataptor Y
(NPYRJ
AfiHm
« m p ls b
/PFtOO-neuropéptido Y
receptor
/FL-obLQe?
97.1
gb:MMJ)034
67.1
gb:AF02537
5-1
gb:AFH72D
4.1
gb;M99293 l
gb: 1.016391
NM_022646 Homo • -1.57 0.60 2.67 0.26 -1.88 0.98 2.22 0.35
sapiens
COríúnlcD
soma id mam
RHAfcpiru
hcm nera i
ICSMÍJ.
IfínKUptiílfi
valíanle 4.
ARNiH
I PROO = efttri
única
u n i lg n u n i
m flK V ira
hormona 2 r ,
bofanm 4
/FL=gbcNM_
022640.1
AW007532 p,0,*'na IGFBP5 0.31 0.25 4.59 1.53 0.72 0.09 6.19 1.58
i d o
unúnde
Monto
crecimiento
de rvHJÉrva
huevaría
(IGFGP5J
ARI*n
NM 002160 Homo TNC -0.24 029 2.23 0.80 -081 0 81 2.85 0 82 sapiens
hexat) raquial
(UflHCftl
C, citotacbnai
(HXBí,
ARNm.
¿PROO-nenas raquial
(wnssívna C.
clolacUnal
/FL=gt):M5S6
181
gÜ;NM_0021
60.1
AA149250 ESTs, LOC645638 1.27 0.61 433 1 26 -064 040 2.47 123 Oí talmente
■Imitar 4
RATA VMDÍ44
YVDN M 1
PflOTEiNA
PRECURSOR
(R.norvegicu
S)
AW977527 ESTs - -0.91 0.99 1.18 068 -2.52 1.01 159 0.64 NM_022454 Homo SOX17 -1.01 0.33 2.29 2 08 -0.14 0.15 460 173 sapiens
pnltan*
h poté toa
FLJZ2252
«miar a
ceja SRV
que contiene
qwil7
<FU ZSU ). ’
ARNm.
/P R O D -p miara
h p o li l a
FLJ22252
similar a
S R Y -ca ja que
contiene
gen 17
/FL=gb:NM_
0224541
AI640307 protocaderina PCDH10 -1.89 1.37 1.53 1.32 -1.33 0.38 2.99 1.19 n 10
AJ224869 Homo - 0.96 0.18 4.22 1.88 1.34 0.17 6.36 1.49 sapiens
gen C X C R 4
que codifica
receptor
C X C R 4
Al824037 ESTs, FREM1 -1.42 0.36 1.22 1.95 -1.37 0.61 3.48 1.49
Débilmente
similar a
FCE2
R A TÓ N BAJA A FIN ID A D IN M PN O G LO B D LIN A
E P SILO N FC R E C E P TO R
(M.miisculus)
BE222344 ,actorde - 0.50 0.05 3.01 0.93 -0.94 1.18 4.27 0.94
em palm e
rico enargimna
serina 5
NM_001643 Homo APOA2 -2.25 1.05 172 2.60 -1.20 0.44 4.47 2.42 sapiens
apoli pop rotelna
n A-ll
(APOA2).
ARNm .
I PR O D -
apoli poproteína A-II precursor
/FL=gb:M298
62.1
gb:NM_0016
43.1
gb:BC00528
2.1
AIS21669 ESTs - -0,94 0.79 1.71 2 19 -0.89 0-21 3.9i 1,94 NM 002608 Homo PDGFB -0.23 0-82 1.87 0 15 -2.27 0.65 192 0 13
sapien»
t o o * de
CíeeímmnÍD derivado
de plaquetas
bota
poMpépCkto
(sarcoma
sanio
vrai (v-fis)
obcegan
ItH M O flI
iPOGFBí.
ARNfñ
f P-RCO - factor
da cracimiartú
darvado de
placa
bala
poipdpfldo
gurami
am o
viral tv-ssl
orwogen
homaogo)
/FL=gb;M1£7
83.1
gb:NM_002
AW444781 ESTs CDKN2B -3.35 0.90 0 39 0.52 -3.11 088 0.80 0.25 DF223214 ESTs - -0.48 0-08 1.69 2.04 -1.51 025 4.09 1.98 AF154054 Homo GREM1 1.68 0.26 461 0.74 0 62 0.04 3.58 087
sapiens
DRM (DftM)
AHNm
ah
tanpMa
^O D -O R
M
/FL=gb:MM_
013372.1
gtcAFll013
7-2
Ob:AF04580
0,1
gb:AF 15405
4.1
NM_021223 Homo MYL7 1.81 0.05 4.28 0.81 0.17 0.08 4.87 096 sapiens
cadena ligera
de miosina 2 a
(LOC58498),
ARNm.
/P R O D =
cadena ligera
de miosina 2a
I FL = gb: N M _
021223.1
AI817041 receptor CMKOR1 -0.19 0.27 2.67 1.97 0.06 0.1B 5.05 acoplado a
proteína G
NM_0Q367Q Homo BHLHB2 1.09 0.08 3.85 0.10 -0.11 0.17 3.46 sapiens
que contiene
bucle hélice
béslco-dominia
hélice,
clase B, 2
(BHLHB2),
ARNm.
I PROD = geni
que expresa
condrocito de
embrión
diferenciado
/FL=gb:AB00
4066.1
gb:NM_0036
70.1
NM023915 Homo GPR87 -1.70 0.61 1.64 0.18 -2.99 0.06 1.40 sapiens G
receptor 87
acoplado a
pro teína G
(GPR87),
ARNm
/P R O D = G
receptor 87
acoplado a
protema
/FL=gb:NM_
023915.1
gb:AF23776
3.1
NMJW3867 Homo FGF17 -3.05 0.39 0.03 2.07 -2.13 0.41 2.49 sapiens
factor de crecimiento
de fibroblasto
17 (FG F17),
ARNm.
7 PR O D = fibra
crecimiento de blasto
factor 17
/ FL = gb: NM
003867.1
gb: ABOOS24
9.1
NM_024426 Homo WT1 -3.23 0.37 -1.11 0.62 -4.20 0.56 -2.44 1.26 sapiens
Tumor óe Wilms
1 {WT1).
transcripción
vanante D.
ARNm.
I PR O D = Wil
ms tumor 1
isoterma O
/FL=gb;NM_
024424.1
gb:NM_0244
26.1
NM_033136 Homo FGF1 -3.10 1.42 0.09 0.83 -3.16 0.63 -0.78 1.21 sapiens
fibroblasto
factor de crecimiento
1 (ácido)
(FG F1),
transcnpción
vanante 2,
ARNm.
1 PR O D = flbro
credmiento de blasto
factor 1
(ácido)
sote roía
2 precursor
/FL=gb:NM_
033137.1
gb:NM_0331
36.1
X99268 H. sapiens TWIST1 0.10 0.33 3.94 0.24 034 0.22 3.45 0.34
ARNm para B-HLH protelna de
unión a AD N
Figure imgf000057_0001
(asociada con
hipe rea lee mía
humoral de
malignidad)
ARNm
cds
completo
/ FL = gb: J035
80.1
BC029835 Homo LOC646867 -2.66 1.12 1.01 1.85 -1.40 0.41 3.03 1 61 sapiens,
clon
IM AGEN: 5169
759. ARNm.
AI452798 ESTs MYOCD 0,98 0.13 3,31 0.66 -0.07 0.28 2.80 0.98 NM_022559 Homo CSH1 -1.56 0.38 2.00 0.32 -2.07 0.42 1.47 0.28 sapiens
hormona de
crecimiento 1
(GH1),
transcripción
variante 2,
ARNm .
! PR O D =
hormona de
crecimiento
1, Isoforma 2
/FL=gb:NM_
022559.1
NM_001318 Homo CSH1 0.15 0.41 2.83 0.40 -1.30 0.34 2.37 0.50 sapiens
corbnico
somatomatn
motropina
tipo hormona
1 (CSHL1),
transcripción
variante 1,
ARNm .
I PROO=
corbnico
somatomam i
motropina
tipo hormona e
1, isoforma 1
/FL=gb:NM_
001310.2
M65062 factor de 3FBP5 -2.80 1.17 2.19 2.00 -0.99 0.23 4.11 1.81 crecimiento
tipo insulina
proteína
de unión 5
(IGFBP-5)
ARNm
cds
completo
/PROD =
factor de
crecimiento
tipo insulina
proteína de
unión 5 tipo
proteína 3
;FL=gb:M650
62.1
gt>:M627821
gb:NM_0OO5
99.1
gb:AF05503
3.1
AF207990 Homo FER1L3 049 0 40 300 0.81 -0.16 0.09 4.02 0 92 sapiens fer-1
pro te irid 3
(FERXÍ|
AFSJrn
cds
completo
1 P ftO D = fer-l
lipOprOBlwS
íFL-gt»:AF20
7990.1
A1079944 ESTs - -0.78 0.22 0.08 059 -3.56 0.24 -0.13 0.73 BC003070 Homo GATA3 107 0 04 3.23 0 96 0.31 0.26 4.45 0.80 sapiens,
protelna de
mitin 3 a GATA
cion
MGC: 2346.
ARNm
Cds
completo
I PROD =
prole risa de
mitin 3 a
GATA
/FL=gb:NM_
002051 1
M65062 fac to r de 3FBP5 -2.80 1.17 2.19 2.00 -0.99 0.23 4.11 crecimiento
tipo insulina
proteína
de unión 5
(IGFBP-5)
ARNm
cds
completo
/PROD =
factor de
crecimiento
tipo insulina
proteína de
unión 5 tipo
proteína 3
/FL=gb:M650
62.1
gb:M62782-1
gt>:NM_0TO5
991
gb:AF05503
3 1
AF207990 Homo FER1L3 0 49 040 300 0.81 -0.16 0.09 4,02 sapiens fer-1
p ro le in a 3
(FER1L3)
ARNm
cds
completa
/P R O O = tler-1
tipo proleina 3
/FL=gb:AF20
7990-1
AJ079944 ESTs - -0.78 0.22 008 059 -3.56 0.24 -0.13 BC003D70 Homo GATA3 1.07 0.04 3.23 096 0.31 0.26 445
sapiens,
prote Ina da
L íiiin 3 a C A TA
ckm
MGC:2346.
ARNm
CdS
tém plelo
1 P R Q O 5
prole ina de
uiifin 3 a
GATA
/FL=gb:NM_
002051-1
V cerberos
/f=L=9b;MM_
022469.1
NM_001362 Homo DI03 -1.73 0.70 1.99 1.92 -1.05 0 79 4 23 1.51 sapiens
deodnaj*.
yoddronna,
1.po I I
(DI03).
ARNm.
fP R Q O '
Iroxina
deodrtasa
Upo III
/FL=gb'NM_
001362.1
gb:S79B54.1
NM_022581 Homo CSH1 -156 0.07 2.08 0.42 -1 63 080 1.47 053 sapiens
co minien
somal amam
motropma
tipo hormona
1 (C$HL1>,
transcrpciún
varian te 5.
ARr+tv
JPFtOD»
ooróníoa
somatomam
molropina
Upo hormona
1. so forma 5
precursor
/FL=0b:FJM
0225B1.1
NM_013372 Homo GREM1 1.61 0.07 4.15 064 0.91 0.15 3.20 0.81 sapiens
nudo de esterna
superfamla
1.0M P
a ni agonista 1
(C K TSF181),
ARhkn.
/ PROO -dsleina nudo
superfamiia
1. antagonista de BMP 1
antagonista 1
JFL=gb:NM_
013372.1
gb:AF11013
7.2
gb:AF04580
0.1
gb:AF15405
4.1
NM_022561 Homo CSH1 -1.32 060 191 0.25 -1.66 0.46 1.57 0.22 sapiens
hormona de
crecimiento 1
(GH1>,
transcripción
variante 4,
ARNm.
/ RROD =
hormona de
crecimiento
1, isoterma 4
precursor
I FL = qb: NM _
0225611
NW_022659 Homo - -1.58 0.75 -1.24 1.79 -3.62 0.20 -1.81 1.25 sapiens
proteína
hipotética
FLJ11500
Stnilar a
EBF2
(FLJ11500).
ARNm.
I PROD =
proteína
hipotética
FLJ11500
smi lar a
EBF2
I FL = gb: NM
022659.1 "
AF006060 Homo CSH1 -1.21 0.06 1.13 0.05 -3.08 0.63 0.50 0.17 sapiens
hormona de
crecimiento
place ntal
20kDa
¡soforma
(hG H -V ) ARNm,
Figure imgf000063_0001
gb:NM_0132
81.1
AJ601101 Homo FAM84A 0.46 0.38 3.07 0.46 -0.32 0.46 3.82 0.48 sapiens
ADNc:
FLJ21410
lis. clon
COL03938
NM_000325 Homo P1TX2 1.37 0.17 3.51 0.47 089 0.16 4.02 0.47 sapiens
homeodomimo
tipo pareja
transen pción
(actor 2
(PITX2),
ARNm.
/ PROD =
homeodomlmo
tipo pareja
transen pción
factor 2
/FL=gb:NM_
000325.1
gb:U69961.1
gb:AF04672
0.1
AI692659 choque térmico 3RDM1 0.21 0.25 167 0.77 -0.67 0.17 2.61 0.80 proteina 90kD
1, alia
NM 000602 Homo SERPINE1 2.97 0.16 4.75 1.89 1.55 0.22 2.75 1.87 sapiens
serina (o
cisterna)
inhibidor de
proteinasa
ciado E
(nexra.
plasminógeno
activador
tipo inhibidor
1). miembro
1
(SERPINA1).
ARNm
/ PROD = serina
(o cisteina)
prole inata
inhibidor
dado E
(nexha.
plasminógeno
activador
tipo inhibidor
1), miembro
NM_001480 Homo GALR1 -1.90 0.68 0.04 0.73 -2.42 0.72 -0.34 sapiens
receptor de
galanína 1
(GALR1),
I PROD «
receptor de
galanína 1
/FL=gb:NM_
001480.2
gb:U23654.1
gb:L34339.1
gb:U53511.1
NM_000393 Homo COL5A2 4.29 0.14 5.25 0.21 2.62 0.02 548 sapiens
colágeno
tipoV, alfa
2 (COL5A2).
ARNm
/PROD *
colágeno
tipo V,
alfa 2
/FL=gb:NM_
000393.1
N63706 ESTs - 0.06 0.18 1.73 1.89 -0.74 0.13 3.75 AF132818 Homo KLF5 0.63 0.11 3.16 0.50 0.07 0.42 340 sapiens
colon
factor de
tipo Kruppel
(CKLF)
ARNm
cds
completo
/ PROD = colon
factor Kruppel
/FL=gb:AF13
2818.1
gbAF28727
2.1
gb:AB03082
4.1
gb:NM_0017
30.1
gb:D14520.1
X59065 H. sapiens - -1.17 1.11 -0.39 1.06 -2.61 0.26 -0.96 1.01
Gen FGF,
exón 3
/FL=gb:NM_
0008001
gb:M13361.1
R73554 Humano IGFBP5 -0.12 0.15 2.63 1.41 -0.69 0.16 4.00 1.65
. c fraecctoíarl dee nto
tipo nsulina
protelna de
unión 5
(IGFBP5)
ARNm
NM_002149 Homo HPCAL1 -0.18 0.28 1.81 0.44 -1.98 086 1.18 0.22 sapiens
hipocalcina 1
(HPCAL1).
ARNm
/PROD = tipo
hipocalcina 1
/FL=gb:NM_
002149.1
gb:D16227.1
Al093327 ESTs - 0.69 0.11 3.09 0.58 0.45 0.07 2.29 085 NM_003240 Homo PYCR2 6.22 0.16 6.97 0.60 4.16 0.07 7.51 0.68 sapiens
factor asociado
a sangría
endometrial
(determinación
izquierda-derecha
n.factor A;
factor de crecimiento
transformante
beta
su perf amilla)
(EBAF),
ARNm
/ PROD = factor
de creamiento
transformante,
beta 4
/FL=gb:U815
231
gb NM_0032
40 1
gb:AF08151
3.1
Al263909 homólogo ras RHOB 389 0.16 5.88 0.13 3.01 0.15 5.64 0.10 familia de genes.
miembro B
/FL-gb:NM_
004040.1
NM_001792 Homo CDH2 3.83 0.17 6.01 0.11 2.85 0.13 5.74 0 17
sapiens
cadherlna 2,
tipo 1. N-cadherina
(neu roñal)
(CDH2),
ARNm
/ PROD =
cadherlna 2, tipo
1. N- cadherlna
(neu roñal)
/FL=gb:NM_
001792.1
gb:M340641
NM 003897 Homo IER3 5.45 0.15 6.97 0.17 4.33 0.11 675 0.27
sapiens
repuesta
inmediata
temprana 3
(IER3),
mRNA.
/PROD=
repuesta
inmediata
temprana 3
/FL=gb:BC00
5080.1
gb:BC00084
4.1
gb:AF08342
1.1
gb:NM_0038
97 1
AF278532 Homo NTN4 -0.16 0.30 1.70 0.91 -0.67 0.48 2.66 0.74 sapiens
be ta-ne trina
ARNm
cds
completo
I PROD = beta
-netrlna
/FL=gb:AF11
9916.1
gb:AF29771
1.1
gb:NM_0212
29.1
gb:AF27853
2.1
AF348491 Homo CXCR4 1.39 0.21 4.05 1.58 1.45 0.07 5.67 1.65 sapiens
quimioquina
CXCR4
ARNm
cds
completo
/ PROD =
qiimioqulna
receptor
CXCR4
/FL=gb:AF34
8491.1
NM 030781 Homo COLEC12 1.93 0.13 364 1.66 1.96 018 5.68 1.51 sapiens
receptor con
lectina tipo C
(SRCL).
ARNm.
/ PROD = scav
enger
receptor con
lectina tipo C
/FL=gb:NM_
030781.1
NM_000599 Homo IGFBP5 -0.31 0.34 3.03 1.85 0.12 0.24 4.51 1.75 sapiens
factor de
crecimiento
tipo insulina
proteína de
unión 5
(IGFBP5),
ARNm
/ PROD = factor
de crecimiento
tipo insulina
proteinade
unión 5
/FL=gb:M650
62.1
gb:M62782.1
gb:NM_0005
99.1
gb:AF05503
3.1
Al348094 KIAA0882 TBC1D9 0.13 0.26 3.21 1.13 0.96 0.13 4.67 1.08 protefna
BG287862 AHNAK AHNAK 1.47 020 372 051 1.37 0.17 434 0.58
nudeoproteina
(desmcyoquina)
í
AJ676059 ESTs FOXQ1 -0.32 0.55 308 1.63 050 0.17 4.81 1.47 Al 127440 ESTs - -0.85 0.36 0.60 1.22 -0.65 0.27 2.13 1.13 AL574210 se riña (o ERPINE1 2.81 0.24 5.07 0.88 2.13 0.15 3.96 0.86
cisteína)
inhibidor de
proteinasa
ciado E
(nexita,
plasminógeno
activador
tipo inhibidor
1). miembro
1
/FL=gb:NM_
000602.1
gb:M160061
AB037810 Homo SIPA1L2 3.88 004 566 008 3.18 0.11 5 85 0.11 sapiens
ARNm oara
proteína
KIAA1389.
prote Ina
partí al cds.
/PROD=KIA
A1389
prote (na
NM_001394 Homo DUSP4 0.22 0.37 288 1.09 0,50 0.14 4.12 0.99 sapiens1 especificidad
dual
fosfataba
4 (DUSP4).
ARNm.
1 PROD =
especificidad dual
fosfatas*
4
/FL=gb:NM_
001394.2
gb:BC00267
1.1
gb:U48807.1
gb:U21108.1
BC029442 Homo - 2.04 0.20 3.80 0.74 1.18 0-05 4.50 0.65 sapiens,
similar a
inmunidad
proteína
asociada 1.
don
MGC:32707
IMAGEN: 4618
467, ARNm
cds
completo
i PROD =
similar a
inmunidad
prote ina
asociada 1
/FL=gb:BC02
9442.1
NM_000700 Homo ANXA1 5.00 0,16 6.27 1.28 3.67 0.05 4.96 1 25 sapiens
anexina A1
(ANXA1),
ARNm.
/ PROD =
anexina I
/FL=gb;BC00
1275.1
gb:NM_0007
00.1
BCOOQ740 Homo CCKBR 1.06 0.36 3.93 1.84 1.93 0.03 5.66 1.82 sapiens,
receptor de
colecistoquinna B.
dan
MGC: 2199.
ARNm
cds
completo
/ PROO *
receptor de
colecistoquinina B.
/FL=gb:L077
46.1
gb:L08112.1
gb:S70057.1
gb:BC00074
0.1
gb:L044731
gb:NM_0007
31.1
N36408 proteina FOSL2 -0.09 0.40 2.07 0.04 -0 85 0.24 1.71 0.28 hipot ética
F U 23306
/FL=gb:NM_
024530.1
AF072242 Homo MBD2 -3.98 0.38 -0.59 0.27 -3.07 0.22 -1.70 068 sapiens
metilo-CpG
proteina
de unión
MBD2
(MBD2)
ARNm
cds
completo
/ PROD = metlo-CpG
proteina
de unión
MBD2
/FL=gb:NM_
003927.2
gb:AF07224
2.1
AF211891 Homo MIXL1 -0.63 0.38 0.77 0.95 -2.29 0.44 0.92 1.71 sapiens
mezcla
tpo
homeobox
proteina 1
(SUAVE1)
ARNm
cds
completo
/PR O O =
tipo mezcla
homeobox
proteina 1
/FL=gb:AF21
1891 1
BF063186 ESTs CALD1 1.16 0.19 2.03 0.42 -1.20 1.02 1.65 0.27 NM 000362 Homo TIMP3 0.08 0.32 1.98 0.09 -0.34 0.33 1.80 0.26 sapiens
tejido
inhibidor <Je
metaloproteinasa 3
(Sorsby
fondo
distrofia.
pseudoinfia
mato rio)
(TIMP3).
ARNm
/PROO= tejido
inhibidor de
metaloprolelnasa
3precursor
fFL=gb:NM_
000362.2
gb:U14394.1
gb:U67195.1
gb:U02571.1
AK022852 Homo SIPA1L2 2.87 0.12 4.50 0.09 1.87 0.01 4.55 0.09 sapiens
ADNc
FU 12790
fis. clon
NT2RP2001
985. débilmente
similar a
Homo
Sapiens
virus del papiloma
humano de
alto nesgo
E6
prole ¡na
dirigida a
oncoproteinas
E6TP1 alfa
ARNm.
BE500942 Homo C6orf155 3.23 0.10 4.68 0.86 1.95 0.03 3.77 0.96 sapiens
ARNm.
ADNc
DKFZp761M
0111 (de
don
DKFZp761M
0111)
AW665892 paternal mente MFAP5 -1.82 0.54 0.37 060 -1.54 0.39 -0.01 0.28
expresado 3
AK025063 Homo FAM84A -1.34 0.84 0.75 0.45 -2.35 0.85 1.01 0.53 sapiens
ADNc:
FLJ21410
fis. clon
COL03938.
NM 001828 Homo CLC 2.17 0.21 3.53 1.07 0.45 0.08 2.11 1.27 sapiens
Charot- Leyden
proteína de
cristal
(CLC).
ARNm.
I RROO = Char r
ot-Leyden
protelna de
cnstal
/ FL ■ gb NM_
001828 3
interleucra
M15329 IL1A 0.85 0.32 2.72 0.30 -0.88 0.60 2.20 0.22
humana 1-alta (IL1A)
ARNm
cds
completo
/ PROD = inferí |
eucína 1 -alfa
especificidad
/FL=gb:M153
29.1
BC002671 Homo DUSP4 1.79 0.03 4.30 1.39 2.10 0.10 5.60 1.22
sapiens, dual
especificidad
fosfatasa
4, clon
MGC: 3713.
ARNm
cds
completo
/ PROD=
especificidad dual
losfatasa
4
/FL=gb:NM_
001394.2
gb:BC00267
1.1
gb:U488071
gb:U21108.1
AA524250 einünadoen DLC1 1.02 0.05 2.35 0.98 0.10 0.38 3.26 0.96
cáncer de hígado
1
BC001211 Homo KJFC3 -1.53 0.72 0.81 0.38 -208 0.42 0.75 0.16
sapiens,
familia
de quinesina
miembro C3,
don
MGC: 3226.
ARNm
cds
completo
1 PROD = familia
de quinesina
miembro C3,
/FL=gb:BC00
1211.1
gb:NM_0055
50.1
gb:AF00442
6.1
NM_004560 Homo ROR2 0.76 008 2.20 0.81 0.08 0.14 3.06 0.95
sapiens
receptor
tiroslna
tipo qulnasa
huérfano
receptor 2
(ROR2),
ARNm
I PROD =
receptor tirosina
tpo qunasa
huérfano
receptor 2
/FL=gb:M976
39.1
gb:NM_0045
60.1
BC000125 Horno TGFB1 1.16 0.18 3.43 0.08 0.72 0.14 3.30 0.16 sapiens,
similar a
factor de
creamiento '
transformante
beta 1. don
MGC: 3119
ARNm
cds
completo
/ PROD = Simil
ara
factor de
crecimiento
transformante
beta 1
/FL=gb:M384
49.1
gb:BC00118
0.1
gb:BCOOC12
5.1
gb:NM_0006
60.1
NM 016931 Homo NOX4 1.83 0.06 3.31 1.29 1.20 0.14 2.28 1.27 sapiens
NADPH
oxidasa 4
(NOX4).
ARNm.
/ PROD = NAD
PH oxidasa
4
/FL=gb:AF26
1943.1
gb:NM_0169
31.1
gb:AF25462
1.1
gb:AB04103
5.1
BC001830 Homo TGFB1I1 0.95 0.17 3.59 0.73 1.52 0.09 2.74 0.69 sapiens,
similar a
factor de crecimiento
transformante
beta 1
inducido
transcripción 1.
don
MGC: 4078
ARNm
cds
completo
IPROO-similar a
tactor de crecimiento
transformante
beta
1 inducido
transcripción 1
/ F l * gb: _
015927.1
gb:BC00183
0.1
gb AF11634
3.1
NM_024576 Homo OGFRL1 3.15 0.13 449 082 1.63 006 3.30 0.98 sapiens
proteiria
hipotética
FU21079
(FU21079).
ARNm
/ PROD =
pro teína
hipotética
FU21079
/FL=gb:NM_
024576.1
NM_001963 Homo EGF 0.12 022 1.82 1.15 -0.62 0.36 2.68 1.23 sapiens
factor de
crecmiento
epidérmico
(beta-urogastrona)
(EGF).
ARNrrv
I PROO = (actor
de crecimiento
epidémico (betaurogastrona)
/ FL = gb: NM_
001963-2
BE620374 ESTs C6orf155 1.97 0.05 3.35 1.01 0.59 0.17 2.10 1.05 AL359062 Homo COL8A1 -1.31 0.25 2.32 0.94 003 0.12 3.51 1.02 sapiens
ARNm de inserto
de longitud
completo
clon de ADNc
EUROIMAG
E 1913076.
AL117653 Homo MITF -0.12 0.61 2.32 0.10 0.21 0.13 2.56 0.06 sapiens
ARNm;
ADNc
DKFZp586C
0224 (desde
clon
DKFZp586C
0224).
AL021977 Grupo Incl. - 192 0.14 4.53 0.43 2.15 012 466 0.22
AL021977:b
K447C4.1
(MAFF novela
(v-maf
(Ibrosarcoma
musculoapo
neurótico
(aviar)
familia
oncogen.
protelna F)
tipo protelna)
/cds=(0,494)
/gb=AL0219
77
/gi=4914526
/ug=Hs.5130
5/len=2128
NM_003564 Homo TAGLN2 5.43 0.12 6.76 0.06 3.48 0.27 6.69 0.04 sapiens
transgelina 2
(TAGLN2),
ARNm.
/ PROD = tran
sgeJina 2
/ FL = gb: D212
61.1
gb: NM_0035
64.1
BC005107 Homo - 7.08 0.07 6.42 0.26 2.60 0.07 6.93 0.22 sapiens,
don
IMAGEN: 3840
937. ARNm.
cds parcial
/ PROD = des
conocido
(proteína para
IMAGEN: 3840
937)
NM_001124 Homo ADM 4.70 0.22 7.61 0.19 5.21 0.06 7.58 0.21 sapiens
adrenomedul
ina (ADM)
lin (ADM),
ARNm.
/ PROD = adre
nomedulina
/FL=gb:NM_
001124.1
gb:D14874.1
AF280545 Homo NRP2 -0.29 0.33 1.40 0.30 -1.67 0.61 1.22 0.33 sapiens
neuropilina-
(NRP2)
ARNm
cds
completo
alternativamente
empalmado
/ PROD = neur
op!ima-2b (5)
/FL=gb:AF28
0544.1
gb:AF28054
5.1
NM_014624 Homo S100A6 3.08 0.38 3.10 0.18 -0.57 0.37 3.24 0.19 sapiens
proteína A6 de
unión a calcio
(cafcldina)
(S100A6).
ARNm
/ PROD = S10
0 proteína A6
de nilón a calcio
/ FL = gb: NM_
014624.2
gb:BC00143
1.1
AB030824 Homo KLF5 0.57 0.24 2.16 0.49 -0.41 005 2.53 0.17 sapiens
ARNm para
factor de
transcripción
BTEB2.
cds
completo
/ PROD = factor
de transcripción
BTEB2
/FL=gb:AF13
2818.1
gb:AF28727
2,1
gb:AB03082
4.1
gb:NM_0017
30.1
gb:D14520.1
NM 015675 Homo GADD45B 2.47 0.22 4.44 0.46 2.02 0.09 4.64 0.33 sapiens
detención del crecmiento
y ADN mdudble por daño,
beta
(GADD45B)
ARNm.
/ PROD = DKF
ZP566B133
prote ina
/FL=gb:NM_
015675.1
gb:AF09095
0.1
BF347089 inhibidor de teydoTIMP3 0.57 0.13 2.01 0.29 -0.19 0.20 2.09 0.44
de metabprotei
nasa 3
(Soreby
fondo
distrofia.
pseudoinfia
mataono)
/FL=gb:NM_
000362.2
gb:U14394.1
gb:U67195.1
gb:U02571.1
BF056473 ESTs - -0.64 0.87 1.79 0.10 -0.73 0.34 1.57 0.23 AA809487 Homo - 0.52 0.22 3.68 0.43 1.39 0.22 3.89 0.48
sapiens
ADNc:
aj21715
fis, don
COL10287,
altamente simlar
a AF071569
Homo
Sapiens
mult ¡tinción
al
quinasa de proteina II
dependiente de
calmodulina de
caldo
delta2
¡soforma
ARNm
AL575735 colágeno. 5.54 0.11 6.65 0.14 4.57 0.08 6.68 0.07 tipo V. alia
2
/FL=gb:NM_
000393.1
AF003934 Homo GDF15 2.74 0.20 4.01 0.41 0.72 0.17 4.34 0.50 sapiens
factor de
diferenciación
de próstata
ARNm
cds
completo
/ PROD =
factor de
dferenclación
de próstata
/FL=gb:U883
23.1
gb:BC00052
9.1
gb:AF00393
4.1
gb:NM_0048
64.1
gb:AF01977
0.1
gb:AB00058
4.1
NM 000313 Homo PROS1 -1.54 0.10 0.98 0.83 -0.62 0.09 1.79 086 sapiens
prote ¡na S
(alfa)
(PROS1),
ARNm.
/ PROD = prot
eina S (alfa)
/FL=gb:M150
36.1
gb:NM_0003
13.1
NM_016651 Homo DACT1 2.37 0.26 4.79 0.67 2.46 0.14 3.92 0.78 sapiens
carcinoma
hepta celular
nuevo gen-3
proteina
(LOC51339).
ARNm
/ PROD =
carcinoma
heptacelular
nuevo gen-3
proteina
/FL=gb:NM_
016651.2
gb:AF25107
92
NM_020129 Homo LGALS14 136 0.30 3.15 0.70 079 0.04 2.47 0.66 sapiens
Piole InH
placenlel
13 - proielna
(LOCíéflSlJ.
AflNm
! PFtQD = prd
ene placerte
13 frjitma
/ FL - 0b: NM_
02012911
0b- al2bTe5
2.1 (Mía ferina}
NM_013451 Homo FER1L3 1.75 0.15 4.02 0.97 1.59 0.13 5.14 0.82 sapiens fer-l
(Colégeos)-Tipo 3
(mioferlina)
¡FER1L3)
APNm
/pROO-tat-1
(C. alega nsi -ülMcflerihaí
IFL-gbt NM_
013451.1
* AF18231
e.1
R72286 microSbrijr MFAP4 -1.15 060 -1.76 0.61 -2.37 0-22 -0.60 0.72 proteiria
asociada 4
AI417362 ESTs. FUTI 2.42 0.14 2.32 0.72 -046 0.53 1.70 059
Moderada manía
arralara
ALU1_HUIUI
fifi ALU
SUBFAMILIA J ENTRADA DE ADVERTENCIA OE OONTAMItJ
ACIÓN DE SECUENCIA
(H .sapiens)
NM 001553 Homo IGEBP7 341 019 463 1.07 1.65 0.10 3.34 1.16 sapiens
tpo insulina
pro te (na
de unión r
de tactor de
crecimiento
(IGFBP7).
ARNm
/ PROD = factor
de crecimiento i
tipo insulina
proteina
de unión 7
/FL=gb:NM_
001553.1
gb:L19182.1
BG285011 Homo ARID5B 005 0.22 1.79 0.21 -0.95 042 1.16 0.55 sapiens
ARNm:
ADNc
DKFZp586N
012 (de
don
DKFZp586N
012)
BE967311 Homo - 1-99 0.06 4.08 0.92 2.28 0.17 5.01 0.87 sapiens
ARNm;
ADNc
DKFZp7620
1615 (de
don
DKFZp7620
1615)
BC005047 Homo DUSP6 2.50 0.32 404 0.67 1.56 0.16 2.94 0.84 sapiens,
clon
MGC: 12852.
ARNm
cds
completo
I PROD = Des
conocido
(proteína para
MGC:12852)
/FL=gb:NM_
001946.1
gb: AB01338
2.1
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000085_0001
DKFZp564C
2063 (de
clon
OKFZpSMC
2063)
KI69091 ESTs PCDH17 0.59 0.10 1.49 0.68 -1.11 089 2.49 0.78 BF669359 ESTfi PAG1 -1.11 0 52 -0.09 043 -1.54 0.12 0 50 0.13 BF96827Q ESTs SLC35F3 0.37 0.02 184 0 30 0.10 0.17 2-46 0.36 NM 006163 Horco NTS 4.77 0.15 473 1.45 3.01 0 19 3.21 1.47 sapiens
neL/olensina
(MTSt.
AHMm.
/ PROO = wur
oteisna
yFL=gb:hlM_
006183-2
gt>:U9l613,1
D28124 Grupo Incl. NBL1 2.90 0.03 4.24 0.37 2.09 008 4.44 038
D2Sl24:ARMm
humano para
producid
dUCOIBCMOk
cds completo
lcda*{61.603
>
¿gb=D28124
|0<=641B21
Atg=Hs763Q
7flan=1929
AW129593 asociador de TDRD7 1.19 0.19 240 0.87 0.92 0.04 3 27 0.89
tudor con
PCTAI RÉ 2
BE675435 mic*K> KLF6 0.29 0.30 2.91 1.02 0.54 0.24 3.68 0.94 promotor
proteína
Ce uredo
a elementa
¿FL=flb;AFO0
1461 1
gb:BC00031
1.1
gb:IMM_00l3
00.2
g b :A B 0l749
3.1
gb:BC00430
1.1
Al202327 ESTs CPEB2 1.88 0 09 3 42 0.07 099 0 10 3 36 0 03 NM_002228 Homo JUN 2.12 0.16 4.09 0.56 1.62 0.13 4.53 0.41 sapiens v-jun
sarcoma
aviar
virus 17
encogen
nomoiogo
(JUN).
ARNm
/ PROD = v-jun
sarcoma
amar
virus 17
oncogen
homologo
/FL=gb:NM_
002228.2
gb:BC00264
6.1
AF005775 Homo CFLAR 288 0.18 370 1 56 035 0 17 522 1 69
sanie ns
tipo caspasa
apoptosis
prote Ina
reguladora 2
(clarp)
ARNm
alternativamente
empalmado.
cds
completo
/ PROD ■ tipo
caspasa
apoptosis
prote ina
reguladora 2
/FL=gb:AF00
5775.1
NM_007173 Homo PRSS23 3.02 0.10 5.11 0.21 2.90 0.05 5.22 0.23 sapiens
protea sa
sem a. 23
(SPUVE),
ARNm.
/PROD=prot
proteasa. serina,
23
/FL=gb:BC00
1278.1
gb:AF19361
1.1
gb:AF01528
7.1
gb:AL1369l
4.1
gb:NM_0071
73.1
NM_012413 Homo QPCT 1.44 0.09 0.97 0.85 -2.46 0.65 0.19 sapiens
glutamirulo-péptido
dclotransferasa
(giutamnlo
ddasa)
(QPCT).
ARNm
/ PROD =
glutamnib
péptido
dclotransferasa
precursor
/FL=gb:NM_
012413.2
BU683415 Homo KLF6 3.40 0.06 5.28 0.85 3.46 009 601 sapiens,
don
IMAGEN: 4096
273. ARNm
AV729634 DnaJ DNAJC6 0.62 0.20 2.59 0.79 0.99 0.19 3.35
(Hsp40)
homólogo
subfamilia B.
miembro 6
/FL=gb:AB00
7942.1
gb:NM_0147
87.1
BC038556 Homo - -0.79 0.40 0.12 0.99 -2.17 0.62 -0.08 sapiens,
don
IMAGEN: 3446
976,ARNm
NM_014942 Homo ANKRD6 0.62 0.04 2.17 1.11 0.59 0.23 3.30 1.07 sapiens
proteína
KIAA0957
(K1AA0957).
ARNm.
I PROD = KIA
A0957
pro teína
/FL=gb:AB02
3174.1
gb:NM_0149
42.1
AF260333 Homo C4orf18 -1.58 0.10 0.21 1.21 -3.19 1.07 1.60 1.12 sapiens
AD036
ARNm
cds
completo
7PROD=AD0
36
7FL=gb:AF26
0333.1
AA448956 Homo CAMK2D 1.47 0.18 2.75 0.42 0.21 0.21 2.97 0.39 sapiens
ADNc
FU21715
fis. don
COL10287,
altamente similar
a AF071569
Homo
Sapiens
multifundon
al
qumasaoe
protelna II
dependiente de
calmodulina de
calcio
delta2
isoforma
ARNm
/FL=gb:AF07
1569.1
BE349115 ESTs COL22A1 -0.02 0.52 2.04 0.25 0.24 0.06 2.38 0.22 BF209337 Homo LOC541471 4.83 0.17 5.80 0.73 3.13 0.02 484 0.81 sapiens
ADNc
FU 10934
lis. clon
OVARC1000
640
A8019695 H o m o - • 2.43 0.01 4.15 0.40 1.42 0.05 3.50 sapiens
ARNm para
torredoxma
reductasa II
bela,
cds
completo
/ PROO = Itor
edoxlna
reductasa II
bela
/ FL = gb AB01
9695.1
AK090497 Homo LOC284576 -3.78 0.56 -2.87 1.42 -4.94 0.07 -4.74
sapiens
ADNc
FLJ3317B
fis. clon
ADRGL2002
753
NM_006763 Homo BTG2 2.30 0.10 3.28 0.62 0.85 0 25 3.84
sapiens BTG
familia
miembro 2
(BTG2),
ARNm,
I PROO = BTG
familia
miembro 2
/ FL = gb: U7621
49.1
gb: NM 0067
63.1
BC002616 Homo TAGLN2 5.61 0.20 5.56 0.17 2.91 0.18 5.40 sapiens.
transgelina 2,
don
MGC: 2989,
ARNm
cds
completo
/ PROD=
transgelina 2
y FL = gb: BCX)0
2616.1
AF076077 Homo GADD45B 1.30 0.17 3.41 0.31 0.61 0.12 3.05 0.29 sapiens
detención del
crecimiento
y proteína
inducible por
daño a AON
GADD45bet
un ARNm,
cds
completo
I PROD ■
detención del
crecimiento y
proteina
indúcele oor
daño a AON
D45beta
/FL=gb:AF08
7853.1
gb:AF07607
7.1
NM_001854 Homo COL11A1 2.90 0.02 4.06 1.44 1.87 0.06 268 1.43 sapiens
colágeno
tipo XI.
alfa 1
(COL11A1),
ARNm
/ PROD =
colágeno, tipo XI.
alfa 1
/FL=gb:J041
77.1
gb:NM_0018
54.1
A1830201 ESTs KIAA0773 -0.75 0.82 1.24 0.22 -1.87 0.51 0.40 0.22 N95437 ESTs LMCD1 0.74 0.12 272 0.57 0.39 0.14 305 0.42 BC002511 Homo CBR1 3.72 002 103 243 -410 0 16 -1.64 2.36 sapiens,
carbonita
reductasa 1. ,
clon
MGC:1920.
ARNm.
cds
completo
I PROD = carbonlo
reductasa 1
/FL=gb:BC00
2511.1
gb:NM_0017
57.1
gb:J04056.1
AV682252 HIV-1 rev -0.33 0.15 1.78 1.36 -0.24 0.17 0.41 1.29 proteína
de unión 2
AW263497 ESTs SrTL5 -1.05 0.25 1.44 0.38 -0.55 0.41 2.11 0.47 AF130095 Homo - 5.80 0.14 680 0.49 4.54 0.10 7.35 0.36 sapiens
clon
FLC0562
PR02841
ARNm
cds
completo
/PROD=PRO
2841
/FL=gb:AF13
0095.1
H92988 tlrosina 3- C9orf19 2.00 006 354 0.91 1.93 0.14 4.61 081 monoxlgenasa
trlp totano
5- monoxlgenasa
proteína de
activación,
etapolipéptido
ARNm
X02761 humano para FN1 5.67 0.17 665 0.54 4.52 0.21 7.21 0.42 fibronectina
(precursor
FN)
/ PROD = ftoro
nectina
precursor
AI016316 ESTs - 0.24 0.18 119 1.17 -0.33 0.18 0.25 1.18 NM_006622 Homo PLK2 4.64 0.14 588 0.45 3.50 0.06 5.19 0.47 sapiens
suero-
qunasa
(SNK),
ARNm.
/ PROD =
qunasa
inducible
por suero
/FL=gb:AF05
9617.1
gb:NM_0066
22.1
gb:AF22357
4.1
NM_013238 Homo DNAJC15 -2.27 0.60 3.79 2.03 4.07 0.09 5.58 2.31
sapiens
ADNJ
domino
que contiene
(MCJ)
ARNm.
/P R O D = ADN
Dominio J
que contiene
/FL=gb:NM_
013238.1
gb:AF12674
3.1
AK026737 Homo FN1 5.86 0.14 6.85 0.49 4.66 008 7.39 0.37 sapiens
ADNc:
FLJ233084
fis. don
LNG06602.
altamente smilar
a HSFIB1
ARNm
hunano
para fibronectna
(precursor
FN),
NM_001458 Homo FLNC 3.28 0.17 4.17 070 2.11 0.17 3.39 0.64 sapiens
filamina C.
gamma
(protelna 280
de wión a
acdna)
(FLNC),
ARNm.
/ PROD = gamma
fllamma
I FL = gb: AF08
9841.1
gb: NM 0014
58.1
\K025843 Homo PALLD 1.58 0.31 3.38 0.15 1.03 0.20 3.29 sapiens
ADNc:
FLJ22190
lis. clon
HRC01053
/ FL = gD: AF1
1909.1
gb: AF07704
1.1
gb: NM_0160
81.1
BC005858 Homo FN1 5.86 0.10 6.86 0.49 4.70 0.19 7.37 sapiens,
clon
MGC: 3255,
ARNm
cds
completo
I PROD - desconocido
(protelna para
MGC3255)
/FL=gb:BCOO
5858.1
BG491844 v-jun sarcoma JUN 3.53 0.08 5.45 0.47 3.42 0 11 591
aviar
virus 17
on cogen
homólogo
/FL=gb:NM_
002228.2
gb:BC00264
6.1
AA284532 tirosina 3- C9orf19 2.19 0.11 4.12 0.84 2.43 0.08 4.93
monooxigenasa
trl profano
5
activación de
monooxigenasa
proteína, eta
pobpépbdo
AA192306 triadna TRDN -2.54 0.69 0.02 0.61 -1.99 0.31 0.57 0.63
/FL=gb:U189
851
gb.NM_0060
731
AF116676 Homo - 150 0.18 3.31 1.11137 0.15 4.23 1.05 sapiens
PR01957
ARNm
cds
completo
/PROD=PRO
1957
fFL=gbAF11
6676.1
NM_003033 Homo ST3GAL1 -0.08 0.18 1.68 1.040.20 0.16 2.74 0.74 sapiens
sial ilo
transferasa 4a
(beta-galactosidasa
alfa-2,3-
sialltransfer
asa)
(SIAT4A),
ARNm.
/ PROD - sialitransferasa
4 A (beta galactosidasa
alfa-2.3-
siahlransferasa)
/FL-gb:L139
72.1
gb:L29555.1
gb:NM_0030
33.1
Al222435 ESTs - -4.14 1.52 -0.73 0.32 -2.33 0.62 -0.33 0.12 NM_001924 Homo GADD45A 3.59 0.09 5.04 0.44 3.06 0.17 5.38 0.48 sapiens
detención del
crecimiento
y daño a ADN
inducible por
alfa (GADD45A),
ARNm.
/PROD =
detención del
crecimiento e
inducirte por
daño a ADN.
ara
/FL = gb M609
741
gb: NM_0019
242
NM_001425 Homo EMP3 2.76 0.18 3.90 0.64 1.51 0.06 3.13 0.57 sapiens
proteína 3 de
membrana
epitelial
(EMP3),
ARNm.
/PROO*
proteína 3 de
membrana
epitelial
/FL=gb:U521
01.1
gb:NM_00l4
25.1
gb:U87947.1
AB017493 Homo KLF6 1.69 0.20 4.02 1.01 1.80 0.08 4.87 0.87 sapiens
ARNm para
dedo de zinc
de unión al
ADN (GBF).
cds
completo
/ PROD = dedo
zinc de unión
a ADN (GBF)
/FL=gb:AF00
1461.1
gb:BC00031
1.1
gb:NM_0013
00.2
gb:AB01749
3,1
gb:BC00430
1.1
X58851 gen humano . 0.99 0.16 2.75 1.28 1.12 0.15 4.04 1.14
MLCIemb
para alcalina
mbsina
embrionaria
cadena
ligera,
promotor
y el exon 1
BE327172 sarcoma . 0 86 0.15 2.94 0.51 1.14 0 08 3.57 0.45 aviar v-jun
virus 17
oncogen
homólogo
U37283 glicoproteina MFAP5 0.48 0.19 1.87 0.26 0.15 0.35 1.36 0.47 humana
asociada a
microftinlo '
2MAGP-2
ARNm
cds
completo
/ PROD =
glico proteína
asociada a
microfibrilo
2 MAGP-2
/FL=gb:NM_
003480.1
gt>:U37283.1
AI819043 ESTs CREB5 0.92 0.26 2.63 0.73 0.65 0.15 1.80 0.79 NM_001511 Homo CXCL1 1.01 0.13 2.95 0.35 0.31 0.08 2.39 0.27 sapiens
GRQ1
oncogen
(actividad
estimuladora
de crecimiento
mola noma.
alfa)
(G R 01),
ARNm.
I PROD = GR
01
oncogen
(actividad
estimuladora
de crecimiento
de melanoma,
alfa
/FL=gb;NM_
001611.1
NM_006736 Homo DNAJB2 2.23 0.04 3.46 0.44 1.10 0.02 3.75 0-41 prote ína de
choque
térmico,
(HSJIJdo
Ip o ADNJ 1
nfuwd.
ARNm. '
/PPOO-p crhooteqiucea de
térmica
(H S J I)d e
ibo A D H J 1
neuronal.
/FL=gb:NM_
006736.1
AA534817 ESTs, EDG3 2.32 0.06 3.28 1.04 2.06 0.04 4.58 1.04
Débilmente
slmlara
A L U 8 _ E N T R A D A D E
A D V E R T E N C I A D E
C O N T A M I N A C I Ó N
Figure imgf000098_0001
(H.sapiens)
U82164 Proteína CD99 4.73 0.15 569 0.73 3.19 0.07 636 093 transmembrana
humana
cosa tipo II
ARHn,
cds
complelo
/PROD=CD9
9 typell
/FL=gb:BC00
2584.1
gb:NM_0024
14.1
gb:M16279.1
gb:BC00314
7.1
gb;U82164.1
NM_000389 Homo CDKN1A 4.03 0.02 4.20 0.12 1.81 0.07 4.16 0.05 sapiens
nhtidor 1A
de quina»
dependiere
(p21s Cip1)
(CDKN1A).
A R N m
/PROD=cyd¡
inhbldor 1A
de qi*n«a
deperxJienie
/FL=gb:U031
061
gb:BC00027
5.1
gt>BC00193
5 1
gb:L25610.1
gb:U09579.1
gb:NM_0003
89.1
gb:L261651
NM 001299 Homo CNN1 3.75 0.15 5.75 0.50 3.47 0.11 5.14 0.43 sapiens
de ce liria
caIpon na 1
básico,
mil sedo
se™
(Cf* 1),
ARNm
/ PROO ■ Celp
onlna 1. básico,
inúscdo
iirrr
JFL=gbcL370
10.1
gt>;NM_0012
S9.1
glj:D 17406.1
M36172 rn.os.na MYL4 1.55 0.21 3.30 1.05 121 0.13 4.11 1.06 altalna
embrionaria
human
cadena Igera
(U.C1|
ARNm.
cds
completo
/FL=gb:M361
72.1
gb:M24121.1
gb:NM_0024
76.1
ABO33831 Homo PDGFC 0.48 0.21 0.63 0.15 -1.87 0.96 0.21 0.16
sapiens
hSCDGF
ARNm para
factor de
crecimiento
derivado de
médula espinal,
cds
completo
/ PROD =
factor de
crecimiento
derivado de
méd J a espinal
/FL=gb:NM_
016205.1
gb:AB03383
1.1
gb:AF09143
4.1
gb:AF24481
3.1
NM_014333 Homo IGSF4 3.11 0.09 4.12 0.27 1.85 0.06 3.79 0.24
sapiens
superfamilia de
¡nmunodobulina
miembro 4
(K3SF4).
ARNm.
/ PROD *
superfamiia
de inmunotfobulina
miembro 4
/FL=gb:NM_
014333.1
gb:AF13281
1.1
AF345910 Homo TTC29 0.35 0.26 1.53 0.93 -0.51 0.52 0.91 0.72
sapiens
NYD-SP14
ARNm
cds
completo
/PROD=NYD
-SP14
/FL=gb:AF34
5910.1
NM_004297 Homo GNA14 4.59 0.06 4.52 1.59 1.95 0.11 2.95 1.50
sapiens
proteina de
unión a
auanra
nudeótido
(proteina
O).
alfa 14
(GNA14).
ARNm
/ PROO =
proteina de
unión a
guanina
nucleótido
(proteina G),
alfa 14
/FL=gb:AF10
5201.1
gb:NM_0042
97.1
AK057525 Homo - 3.60 0.08 4.45 0.44 2.00 0.16 4.80 0.46 sapiens
ADNc
FU32963
fis. Clon
TESTI20084
05.
BC000893 Homo HIST1H2BK 2.80 0.06 3.99 0.90 2.48 0.09 4.81 0.82 sapiens,
Histona H2B
familia.
miembro A.
cbn
MGC: 5132,
ARNm.
cds
completo
/PROD=H2B
familia de
historias
miembro A
/FL=gb:BC00
08931
NM_007038 Homo ADAMTS5 0.23 0.17 1.80 0.48 0.45 0.28 1.11 0.73 sapiens a
desmtegrma y
metaloproteasa
(tipo
reprolisina)
con trombospondina
tipo 1
motivo.5
(agreca nasa
-2)
(AOAMTS5),
ARNm.
/ PROD = a
desintegrina
y
metaloproteasa
con
trombospondina
motivos-5
preproprotel na
/FL=gb:NM_
007038.1
gb:AF14209
AW241910 ESTs, COL22A1 -0.21 0.12 1.15 0.47 -0.57 0.18 1.90 051
Débilmente
similar a
JX0369
colágeno
alfa 1 (XIX)
cadena
precursor
(H.sapens)
Al860150 ESTs, FOSL2 -0.43 0.55 1.59 0.37 -0.34 0.10 1.08 0.20
Débilmenle
similar a
cadena kappa
reglón V-l
(H.sapens)
NM 005902 Homo SMAD3 1.09 0.41 1.49 0.25 -1.10 0.89 1.73 0.10 sapiens
MAD
(madres
contra
decapentaplegica.
drosofila)
homólogo 3
(MADH3),
ARNm.
/PROD=MAD
(madres
contra
decapentaplegica.
drosofila)
homólogo 3
/FL=gb:U680
19.1
gb:U76622.1
gb:NM_0059
02.1
AA777512 Homo CAMK2D 2.27 0.15 367 0.47 1.67 008 3.99 0.51 sapiens
ADNc:
FLJ21715
fs, don
COL10287.
altamente similar
a A071569
Homo
Sapiens
miitl (unción al
quinasa de
proteina II
dependiente de
calmodulina
de calcio
delta2
Isoterma
ARNm
Al 130705 ESTs. FAM89A 0.80 0.00 1.96 0.99 0.43 0.18 2.70 0.97
Débilmente
similar a
A46302
PTB-
factor de
empalme
asociado,
forma larga
(H.sapiens)
NM_007061 Homo COC42EP1 1.86 0.11 2.51 0.29 0.16 0.27 2.00 0.17 sapiens
prote ina
constituyente
de suero
(MSE55).
ARNm.
/ PROO =
prole ina
constituyente
/FL=gb:M883
38.1
gb:NM_0070
61.1
NM_003407 Homo ZFP36 2.55 0.14 3.53 0.55 1.49 0.28 3.98 0.47 sapiens zinc
de suero
prote ina de
dedo zinc
homólogo
a Zfp-36 en
ratón
(ZFP36|.
ARNm.
I PROD =
proteina de
dedo zinc
homólogo
a Zfp-36
en ratón
/FL=gb:NM_
003407.1
gb:M92843.1
gb:M63625 1
BC033088 Homo LMNA 2.03 0.22 2.89 0.45 0.69 0.24 1.79 0.50 sapiens,
similar a
lamina AC.
clon
MGC: 45654
IMAGEN: 3623
265. ARNm.
cds
completo
/ PROD = simiar
a lamina
A C
/FL=gb:BC03
3088.1
U97075 Homo CFLAR 2.50 0.09 3.39 1.45 0.73 0.08 4.93 1.54 sapiens
prole ma
inhiblona
tipo FU CE
forma corta
ARNm,
ods
completo
/ PROO * FUC
p Ero teína
tnNbtala
forma
corta
/FL=gb:U970
75.1
AF133207 Homo HSPB8 2.54 0.07 4.47 0.62 2.22 0.04 4.88 058 sapiens
qunasa a
protema
(H11>
ARNm
cds
completo
i q PcRinOasDa - de
prole! na
fFL=gb:AF13
3207.1
NM_0Q5979 Homo S100A13 4.10 0.11 5.67 1.17 3.92 002 6.81 1.20
sapeas
protema A13
de unión
a cateto
profetas
(S100A13).
ARNm,
I PROD * S10
0 proteina A13
de unión
a calcio
/FL=gb:BCO0
0632.1
gb:NM_0059
79.1
AL040178 ESTs PEAR1 -0.87 0.08 0.51 0 36 -1.16 0.30 048 026 AL117523 Honro SAMD4A 0.47 0.06 159 0.61 -0.24 0.30 128 0,53 sapiens
ARNm;
ADNc
DKFZp434H
0350 (desde
don
DKFZp434H
0350); cds
parcial
/ PROD =
prole ina
hipotética
AB051826 Homo RHOU 0.55
Figure imgf000106_0001
sapiens
hG28K
ARNm para
proteina 1 de
unión a GTP,
cds
completo
/PROD =
proteína 1 de
unión a GTP
/FL=gb:AF28
2258.1
gb;NM_0212
05.1
gb:AB05182
6.1
BC005961 Homo PTHLH -3.33
Figure imgf000106_0002
sapiens,
hormona de
parafiroides
don
MGC: 14611
ARNm
completo
/PROD =
para
hormona de
tiroides
/FL=gb:BC00
5961.1
Al670948 ESTs NODAL 2.13 0.04 2.37 0.22 0.42 0.13 2.78 0.38 Al585060 caldesmon 1 CALD1 4.34 0.33 6.42 0.73 4.45 0.09 5.63 0.82
/FL=gb:M641
10,1
gb:NM_0043
422
BF797381 Homo CAMK2D 3.16 0.13 4.91 0.65 3.10 0.10 5.49 0.61 sapiens
ADNc
FU21715
fis. clon
COL10287,
altamente similar
a AF071569
Homo
Sapiens
mdtifuncional
quinasa de
proteina II
de calmodulina
dependiente
de calcio
deita2
Isotorma
ARNm
AF026219 Homo DLC1 1.16 0.07 2.28 1.13 0.61 009 3.52 084 sapiens HP
proteina (HR)
ARNm
cds
completo
; p r o d = h p
proteina
/FL=gb:AF02
6219.1
gb AF03511
9.1
gb:NM_0060
942
AK024480 Homo LOC126917 1.64 0.11 2.86 0.24 1.19 0 06 2.58 0.25 sapiens
ARNm para
proteina
FU00074.
cds parcial
I PROD = FLJ
00074
proteina
N29837 ESTs UX1 -1.43 0.15 -0.11 0.33 -1.50 0.45 -0.22 0.22 AK001022 Homo ISL2 0.41 0.34 2.14 0.39 0.32 0.08 1.57 0.49 sapiens
ADMC FLJ1QMO
lis, ciar
MEMBA 1003
545. altamente
añilar a
PROTEINA POTENCI ADORA DE GEN DE INSULINA IS LÍ.
NM_000047 Homo ARSE 1.37 0.11 2.45 1.03 0.59 0.05 3.18 1.23 sapiens
a r lu M a u
E
(condnxtaplMia
punctata 1 )
(AR3EJ.
ARNm.
I PRQO =
antsulfatasa E
pecador
/FL=gbX635
73.1
gb:NM_0000
47.1
NM_006379 Homo SEMA3C 0.24 0.25 1.08 0.00 -0 34 0 05 088 0.16 sapiens
dominio
semai
inmunoglobUina
domine
(Ig). domino
básico
corlo.
(semaforina)
3C
(SEMA3C).
ARNTI.
ÍPROD"
dominio sema,
domnio de
inmunogloóJina
danwiio
básico
cofia.
sec/elado
I se maternal
3C
/FL=gb:NM_
0063791
gb:AB00022
0.1
NM_007127 Homo V1L1 031 0.30 1.92 0.49 0.02 0.22 2.54 0.68 sapiens vitna
1 (VIL1 ),
ARNm
/ PROO ■ mina
1
/FL=gb:NM_
007127.1
U76549 aloqusraina KT8 5.41 o.16 5.87 0.56 3.79 0.05 6.34 0.57 humana 8
ARNm
ods
cómetelo
/ PROD = cite
citoqueralna 8
/FL=gb:BC00
0654.1
gb:U76549.1
gb:NM_0022
73.1
gb:M26324.1
gb:M342251
NM_004904 Homo CREB5 0.92 0.23 184 0.37 000 006 1.21 0.80 sapiens
emp
peoteína de
u r»úfi a
elemento de
respuesta
protei na de
(H_GS165L1
5.1), ARNm,
/PROD-cAM
uñón a
elemento de
respuesta
Proteína CRE-BPa
/FL=gb:NM_
004904.1
gb:L05911.1
AW082836 ESTs, WNK4 -1.17 0.26 0.98 0.38 -0.97 0.20 0.05 0.86
Débilmente
similar a
B34087
pro teína
hipotética
(H.sapiens)
BE568134 receptor 6 TNFRSF21 4.76 006 5.90 0.54 3.94 0.08 628 058 de muerte
/FL=gb:NM_
014452.1
gb:AF06886
8.1
NM 002845 Homo PTPRM 2.50 0.10 3.43 0.46 1.34 019 3.76 0.50 sapiens
protelna
Urosina
fosfatasa
tipo
receptor M
(PTPRM).
ARNm.
/ PROD = protelna
trosina
fosfatasa
tpo
receptor
mupotipéptido
/FL=gb:NM_
002845.1
AI949419 ESTs - -0.11 0.21 1.72 0.64 -0.47 0.01 2.39 0.77 AK024680 Homo NRP2 0.42 0.02 2.65 0.17 0.98 0.09 2.66 0.17 sapiens
ADNc
FLJ21027
lis. clon
CAE07110
/FL=gb:NM_
018534.1
BE542563 ESTs LOC643277 2.20 0.10 0.54 1.49 -3.73 0.40 -1.74 1.96 AW005572 putativo 47 A NKS1B -1.21 0.52 -0.24 0.82 -1.19 0 55 105 0.64 protema kDa
AW665892 expresado MFAP5 -3.87 0.82 -1.56 1.24 -2.40 0.24 -3.49 2.10 paternalmente 3
NM 006206 Homo PDGFRA 0.92 0.18 2.34 0.74 0.72 009 3.18 0.62 sapiens
receptor de
tactor de
crecimiento
derivado de
plaquetas,
alfa
polipéptido
(PDGFRA).
ARNm
/PROO =
receptor de
tactor de
crecimiento
derivado de
plaquetas.
alfapolipéptido
/FL=gb:NM_
0062061
gb:M21574.1
NM_002425 Homo MMP10 -1.21 0.70 1.21 0.88 -0.37 0.28 0.52 0.45 sapiens
matriz
metaloproteinasa 10
(estro melina
2) (MMP10).
ARNm.
/ PROD = matriz
metaloproteinasa 10
preproproteina
/FL=gb:BC00
2591.1
gb:NM_0024
25.1
NM_004338 Homo C18orf1 -0.79 0.22 -0.09 0.39 -1.57 0.43 0 50 0.02 sapiens
cromosoma
18 marco
de lectura
abierto 1
(C180RF1).
ARNm.
I PROO = cromosoma 18
marco
de lectura
abierto 1
/FL=gb:NM_
004338.1
gb:AF00942
6.1
AF052094 Homo EPAS1 0.75 0.12 2.28 0.19 0.42 0.21 1.74 0.33 sapiens
clon 23698
secuencia
de ARNm
/FL=gb:U516
261
gb:U81984.1
gb:NM_0014
30.1
BF126155 ESTs S100A10 -0.32 0.25 1.24 0.28 -0.65 0.33 1.02 0.44 Al860212 fosfoproteina PAG1 -0.17 0.22 1.37 0.28 -0.40 0.23 1.25 0.13 asociada
con GEM
/FL=gb:AF24
0634.1
gb:NM_0184
40.1
AL110298 Homo SLC2A14 5.13 0.06 6.03 0.58 3.97 0.24 6.33 0.73 sapiens
ARNm;
ADNc
DKFZp564K
1672 (de
clon
DKFZp564K
1672); cds
parcial
I PR O D =
prote Ina
hipotética
AY048775 Homo MANEA -0.47 0.40 0.71 0.90 -0.69 0.35 1.23 0.81 sapiens
forma larga
manda se lina
ARNm
cds
completo
1 PROD - mandaselina
forma larga
/FL=gb:AY04
8775.1
M99436 Grupo Incl. TLE2 2.65 0.07 4.05 0.66 1.95 0.13 4.76 0.61 M99436:Hu
transducina
humana
proteína
potenciadora
(TIE2>
ARNm
cds completo
/cds = (25,225
«)
I gb * M99436
I g b= 307511
Ajg=Hs.1730
63 / len = 2271
NM_014061 Homo MAGEH1 2.04 0.23 3.84 1.17 108 0.24 4.86 1.12 sapiens
pro teína
APR-1
(APR-1).
ARNm.
/ PROD = APR
-1 proteína
/FL=gb:AF32
0912.1
gb:AF14323
5.3
gb:NM_0140
611
AL577531 caldesmon 1 CALD1 5.79 0.06 6.06 0.75 4.07 0.06 5.13 0.77
/FL=gb:M641
10.1
gb:NM_0043
42.2
Al082237 proprotema AGLN 1.38 0.21 3.20 0.33 1.55 0.15 2.74 0.44
convertasa
subtiüsírikexina
tipo 7
BF055171 acilo- ACOX3 0.88 0 22 2.52 0.83 1.27 006 3.73 0.81
Coenzima A
oxidasa 3.
pnstanoilo
/FL=gb:NM_
003501.1
AF231124 Homo SPOCK1 2.84 0.09 4.17 0.95 2.71 0.07 5.38 1.00 sapiens
test¡cano-1
ARNm
completo
cds
y PROD = tesbcano-1
/FL=gb:NM_
0045981
gb:AF23112
4.1
AA588092 ESTs SLC40A1 -1.53 0.23 -0.94 0.51 -2.42 0.33 0.27 0.27 AK094809 Homo RASGRF2 3.20 0.05 364 0.77 1.95 0.24 2.95 0.74 sapiens
ADNc
FLJ37490
lis. clon
BRAWH201
4934. altamente
similar a
PROTElNA DE
LIBERACIÓN DE NUCLEÓTIDO DE GUANINA.
NM_013959 Homo NRG1 1.50 0.20 3.22 0.68 1.34 0.13 3.78 0.75 sapiens
neureguiina i
(NRG1).
variante de
transcripción
SMDF,
ARNm
y PROD = neuregulina 1
isoforma
SMDF
/FL=gb:L418
271
gb:NM_0139
591
NM_004887 Homo CXCL14 0.70 0.07 1.70 0.37 -0.15 0.11 2.36 0.63 sapiens
siiifamika B
de cltoqulna
pequeña
nducible
(Cys-X-Cys),
miembro 14
(BRAK)
(SCYB14),
ARNm
/PROO *
subfamilia B
de btoqiina
inducible
pequeña
B(CyS-X-cys).
miembro 14
(BRAK)
/FL=gb:AF14
4103.1
gb:AF10691
1.1
gb:AF07395
7.1
gb:BC00351
31
gb:NM_0048
87.1
T77995 Homo - -0.20 0.16 0.82 0.50 -1.70 0.24 1.17 sapiens
ADNc
FU13392
fe. clon
PLACE 1001
280
NM_030971 Homo SFXN3 -0.43 0.59 -0.01 0.78 -1.92 0.17 -1.25 sapiens
similar a
proteina
portadora
de tricarboxilatO
de rata
ARNm
J PROD=
similar a
oroteína
portadora
de tricarboxllato
de rata
/FL=gb:NM
030971.1
H25097 KIAA1350 USP53 3.25 0.05 4.57 0.20 2.96 0.04 4.47 prote ¡na
NM 004932 Homo CDH6 -3.58 1.16 -1.12 0.51 -2.14 0.63 -0.88 sapiens
cadherina 6.
Upo 2, K-cadherlna
(riñón fetal)
(CDH6).
ARNm
/ PROO = cadherlna
6. tipo
2, ti­
ca dherlna
(riñón fetal)
/FL=gb:D317
841
gb:NM_0049
32.1
N21426 pro teína SVTL2 2.41 0.09 3.44 1.22 1.70 0.06 2.02 1.21
hipotética
FU20163
AA234096 KIAA0963 MGC16121 0.38 0.16 1.74 0.63 -0.13 004 110 065
proteína
AV734843 prote in a OBFC2A 0.62 0.06 1.62 0.79 0.09 0.02 1.25 0.73
hipotética
FU22833
AL519710 rmunogbbuüna IGSF4 3.86 0.02 4.95 0.26 3.22 0.12 4.66 027
su perf amilia
miembro 4
/FL=gb:NM_
014333.1
gb:AF13281
1.1
N32834 HIV-1 rev -0.28 0.36 1.58 0.97 -0.23 0.18 0.33 1.17
prote ira 2
de unión
AF132811 Homo IGSF4 2.23 0 07 385 0.28 2.17 0.10 3.58 0.34 sapiens
nectina
protef na 2
(NECL2)
ARNm
cds
completo
/ P R O D =
proteica
tipo nectina
/FL=gb:NM_
014333.1
gb:AF 13281
1.1
J04177 Grupo Ind. COL11A1 3.28 0.22 4.44 1.22 2.32 0.03 3.03 1.31
J04177:Hum
ano ala- 1
tipo xl
colágeno
(COL11A1)
ARNm,
cds completo
/cds=(161,55
81)
/gb=J04177
/g¡=179729
/ug=Hs.8277
2/len=6158
AI982754 dustenna CLU 0.17 0.14 1.86 0.94 0.39 0.13 0.97 0.83
(complemento
Isis
inhibidor. SP-40.40.
glicoproteína
sulfatada
2 ,
mensaje de
próstata
reprimido por
testosterona 2.
apdipoprotei
na J)
NM_003501 Homo ACOX3 0.43 0.32 2.10 0.91 0.79 0 08 3.19 0.95 sapiens acik>
Coenzima A
oxidasa 3.
pnstanalo
(ACOX3),
ARNm.
/ PROD = acilo-Coenzíma A
oxidasa 3.
pnstanoilo
/FL=gb:NM_
003501.1
AF144103 Homo CXCL14 1.69 0.13 2.16 0.55 0.40 0.21 2.73 0.69 sapiens
NJAC
pro teína
(NJAC)
ARNm.
cds
completo
/PROD=NJA
proteina C
/FL=gb:AF14
4103.1
gb:AF10691
1.1
gb:AF07395
7.1
gb:BC00351
3.1
gb NM_0048
87.1
NM_005451 Homo POLIM7 2.58 0.12 3.12 0.50 1.30 0.16 2.65 0.37 sapiens
enigma
(proteína de
domino LIM)
(ENIGMA).
ARNm.
/ PROO =
proteína de
engma
/FL=gb: BCOO
1093.1
gb:NM_0054
51.2
gb:AF26520
9.1
NM_004472 Homo FOXD1 -0.85 0.80 2.04 0.55 0.71 0.23 1.70 0.74 sapiens
caja de horquilla
D1 (FOXD1),
ARNm.
/ PROO = caja
de horquilla D1
/FL=gb:U598
32.1
gb:NM_0044
72.1
AF332197 Homo SIX2 0.36 0.24 0.72 0.12 -0.44 0.35 1.05 0.15 sapiens adulto
SIX2 (SIX2)
ARNm
cds
completo
/PROD=SIX2
/FL=gb:AF33
2197.1
gb:NM_0169
32.1
gb:AF13694
0.1
AB046817 Homo SYTL2 2.88 0.17 4 09 1.09 2.50 0.05 3.12 1.03 sapiens
ARNm para
KIAA1597
proteina.
cds parcial.
I PROD = KIA
proleina
A1597
AK093435 Homo FLJ36116 4.75 0.02 4 59 1.53 2.46 0.18 6.15 1.46 sapiens
ADNc
FU36116
fis. clon
TESTI20223
38
NMJXM815 Homo ARHGAP29 2.18 0.02 3.18 0.82 1.69 0.03 4.15 0.69 sapiens
RhoGAP 1
asociado a
PTPL1
(PARG1).
ARNm
/PROD=PTP
L1-asodado
RhoGAP 1
/FL=gb:U909
20.1
gb:NM_0048
15.1
BG028597 ESTs COL11A1 0.19 0.02 161 1.02 4J.11 0 38 048 1.09 AB019562 Homo SPP1 0.58 0.14 2.79 1.07 1.10 0.02 1.21 1.06 sapiens
ARNm
expresado
solo en
velosidades
placentales
clon
NM_002346 Homo LY6E 3.54 0.06 392 1.16 1.81 0.23 4.93 1.39 sapiens
linfocito
antige no6
complejo,
locus E
(LY6E),
ARNm,
I PROD = linf
ocito
antigeno 6
complejo
lOCUS E
/FL=gb:U423
76.1
gb:NM_0023
46.1
gb:U56145.1
BF589515 ESTs TMEM16D 0.63 0.24 1.94 0.85 0.90 0.20 1.47 AL037401 receptor IR2F2 -2.00 0.30 0.58 0.67 -2.19 0.13 0.82
nuclear
subfamifia 2.
grupo f
miembro 2
/FL=gb:M644
97.1
NM_000783 Homo CYP26A1 3.92 0.27 6.28 1.06 6.29 0.09 7.31 sapiens
oncogen
homólogo)
(PDGFB).
ARNm.
polpéptido
1
(CYP26A1),
ARNm .
/PROD=C¡tO<
cromo
P450
subfamilia
XXV LA.
polipéptido
1
/FL=gb:NM_
000783.1
gb;AF00541
8.1
U16307 glioma GLIPR1 -0.11 0.03 1.16 0.95 -0.46 0.77 0.35 humano
proteína
relacionada con
patogénesis
(GIPR)
ARNm,
Figure imgf000121_0001
(APEXL2).
ARNm.
y PROD =
endonucleasa
apurinicapirimidinico
(APEXnudeasa)
pro!eirá 2
/FL=gb:AB04
9211.1
gb:NM_0144
81.1
gb:BC00295
9.1
gb:AB02126
0.1
gb:AF11904
6.1
AI912583 HIV-1 rev KRR1 1.10 0.23 2.68 1.04 1.31 0.06 1.53 1.01 pro teína 2
de unión
BI254089 Homo ADAMTS5 -1.40 0.26 -001 0.31 -1.71 0.64 -0.79 0.52 sapiens inserto
de longitud plena
don de ADNc
ZD50E03
BF197655 caveoina 2 CAV2 3.51 0.10 3.54 0.94 2.32 0.09 2.70 0.85
/FL=gb:AF03
5752.1
gb:BC00525
6.1
gb:NM_0012
331
NM_001955 Homo EDN1 2.84 0.15 2.97 0.95 1.01 0.14 1.75 1.03 sapiens
endotelma 1
(EDN1),
ARNm.
/ PROD * endotelina 1
/FL=gb:NM_
001955.1
NM 003319 Homo TTN 1.28 0.19 0.62 0.86 -0.92 0.42 2.00 0.55 sapienstitina
(TTN),
ARNm,
I PROD = fitina
/FL=gb:NM_
0033191
BE965029 Homo MICAL2 0.60 0.21 1.95 0.64 0.21 0.19 0.83 0.78 sapiens
ADNc:
FU22463
fts. clon
HRC10126
AI452457 ESTs C1orf168 -1.48 0.53 0.02 0.93 -1.87 0.07 1.05 0.94 AI733465 colágeno. COL9A2 0.96 0.13 1.99 1.00 1.17 0.14 2.94 0.86 bpo IX.
alfa 2
/FL=gb:NM_
001852.1
NM 006103 Homo WFDC2 4.02 0.11 5.11 1.05 3.39 0.04 6.19 1.10 sapiens
epididimis,
especifico
proteína de suero
de leche ácido.
cuatro disuíuro
núcleo;
putativo
carcinoma
oválico
marcador
(HE4).
ARNm
/ PROO = epidi
dimis
especifico.
prote ina de
suero de leche ácido
tipo cuatro
disulfuro
núcleo:
putativo
carcinoma
ovánco
marcador
/FL=gb:NM_
00610
NM_017540 Homo GALNT10 1.46 0.18 2.68 0.78 0.97 0.23 3.47 0.82 sapiens
pro teína
hipotética
DKFZp586H
0623
(DKFZp506H
0623),
AHNti
/ PKQD =
puaeina
htwlMca
DKFZf>586H
0623
JFL=gb:NM_
017540.1
W72527 losfeserra SLC1A4 -0.65 0.09 0.38 0.80 -063 062 -0.72
amnotrareferasa
NM_003468 Homo FZD5 135 026 3.43 1.21 1.45 0.10 4,43 sapiens
frfizzf
(Drosofila}
fiomúlogch 5
(F2DG).
ARHm
í PROC = liiHi
t í 5
yFL=gb:Nto_
003468-1
gb-J43318.1
H15920 ESTs, MRGPRF 234 0.18 362 102 2.11 0.11 2.87
Pífasem e
(krriw a
RATA KTA RECEPTOR ACOPLADO A FROTE INA O PRO0A0LE
RTA
(R.norvegicu
a)
U83508 Angiopoyetina ANGPT1 1.06 0.11 1.49 0.44 -032 0.27 032 humara
i AfiNm.
cdi
comtffllo
/P R O O * angiopoyobna 1
;FL=gb:NM _
001146.1
gbD 136261
gb, U 63508.1
AF043179 Homo PRSS1 242 0.12 3.07 0.81 1.71 0.10 2.30 060 sapiens T receptor de
caulas T de
cadera beta
(TCRBV13S
1-TCRBJ2S1)
ARNm
cds
cü rip íe te
JPRDO í
re rec" ni de
célJas T da
cad era beta
/FL=gb:AF04
3179.1
AU157541 peo tema 139 0.00 2.12 0.42 0.55 0.18 1,41 Ql77
hifotetca
FU22833
ffUg|b:NM_
022037.1
AF114204 Homo IMEXIM 137 0.21 2.66 0.51 1.72 0 16 196 076
sapiens
clon HH409
ARNm
desconocido
1 p r o c = desconocido
RF965029 Homo MIC AL.2 158 0.19 256 0 51 1.32 013 140 074 sapiens
achc
FLJZ2163
li 3 clan
me ioi ¡s
ABO20976 Homo 5AMD4A 2.09 0.06 3.65 0.66 2.04 0.17 2.78 0.81 sapiens
ARNm para
pro teína
KIAA1053.
cds. parcial
jPROD-KIA
prole ina
A1053
AJ670862 ESTs, FOSL2 0.17 021 2.05 0.57 0.45 016 110 065
D ó b im e ite
smilar 6
M 3134 Kg
cadena kappa
región V-l
(H sapiens)
L03203 prole Ina 22 PMP22 0.37 0.24 1.95 0.84 0.31 0.26 2.77 0.91 de mlelina
periférica
humana
(GAS3)
ARNm
cds
completo
/P R O O =
proteína 22
de mielina
periférica
/FL=gb:L032
031
AI571798 RhoGDP ARHGDIA 0.89 0.06 -0.54 0.26 -3.00 089 -2.58 087 inhibidor de
disociación
(GDI) arfa
X57348 Clustor Incl. - 2.94 0.04 4.07 0.41 2.70 008 369 0.41
X57348:H.sa
piens I ARNm
(clon 9112)
/cds=(165,91
1)
/gb=X57348
/gi=23939
/ug=Hs.1845
10/len=1407
AF051851 Homo SVIL 2.03 0.18 2.28 0.62 1.13 0.20 1.71 0.69 sapiens
supervelosldad
ARNm
cds
completo
I PROD - supervelosldad
/FL=gb:AF05
1851.1
gb:NM_0031
74.2
gb:AF05185
0.1
M95929 proteína 0.07 043 1.27 0.58 -0.02 0.19 0.64 0.61 humana
homeobox
(PHOX1)
ARIMm. 3
extremo.
/ PROD =
homeobox
protelna
BG251266 FOS FOSL1 1.94 0.06 2.41 0.46 1.25 0.05 1.93 0.36 antigeno-1
/FL=gb:NM_
005438.1
AW298375 ESTs - -0.40 0.30 0.46 0.63 -0.09 0.20 -0.58 1.07 NM 004362 Homo CLGN 0.90 0.30 1.95 0.96 069 0.11 3.11 1.01
sapiens
clamegina
(CLGN).
ARNM.
I PROO = Caknegina
/FL=gb:NM_
004362.1
gb:D86322.1
AF001540 ealcineurina- 0.10 0.15 2.84 0.70 0.42 0.44 1.64 0.39 proteína de
unión
ealsarclna-1
NM_001191 Homo BCL2L1 1.21 0.22 0.58 0.35 -189 0.35 -1.09 1.03 sapens
BCL2-I ke 1
(BCL2L1),
ARNm
/PROD=BCL
24ike 1
/FL=gb:NM_
001191.1
NM 003316 Homo TTC3 3.90 0.15 5.15 0.98 3.68 0.12 6.19 0.97 sapiens
repetición de
tetratricopéptldo
domino 3
(TTC3).
ARNm.
/P R O O *
repetición de
tetratncopéptido
domino 3
/FL=gb:D842
95.1
gb:NM_0033
16.1
L16895 lisilo humano -0.66 024 0.53 0.14 -0.63 0.15 014 0.19 gen de
oxidase (LOX).
exon 7
AI912976 ESTs RASGRF2 3.13 0,08 4.05 0.56 2.66 0.16 3.54 0.64 NMQ12242 Homo DKK1 0.47 0.29 0.73 0.04 0.49 0.51 1.09 0.23 sapiens
dlckltopf
(Xenopus
laevis)
homólogo 1
(DKK1),
ARNm.
I PROD - dfCk
kopf
(Xenopus
laevis
homólogo 1
/FL=gb:AF17
7394.1
gb:NM_Q122
42.1
gb;AF12756
3.1
AL096776 secuencia de 1.94
Figure imgf000128_0001
ADN humano
del don
RP4-646B12
en
cromosoma
1q42.11-42.3.
Contiene un
FTH1
(ferrtina
polipéptldo
pesada
1) (FTHL6)
p se Lid ogen
el gen para
una nueva
p rote ¡na de
familia ras,
ESTs. STSs,
GSSs y una
isla putativa
CpG
/Fl=gb:AF28
2258.1
gb:NM_0212
BC005997 Homo - 1.12
Figure imgf000129_0001
sapiens,
don
MGC: 14801,
ARNm
cds
completo
/ PROD = Descornado
(proteica para
MGC: 14801)
/FL=gb:BC00
5997.1
AF074979 Homo RGS20 -0.52
Figure imgf000129_0002
sapiens
regulador de
seftalizaclón-z
proteica G
(RGSZ1)
ARNm
cds
completo
/ PROD = regulador de
señalización
de proteína G
/FL=gbAF06
0877.2
gb:AF07497
9.1
gb:NM_0037
02.2
BF 060767 ESTs ADAMTS5 -0.36
Figure imgf000129_0003
AU151151 Homo LEPR 1.72 sapiens
ADNc
FU13536
lis, don
PLACE 1006
521
L27624 Homo TFP12 3.77
Figure imgf000129_0004
sapiens
factor tisú lar
vía
inhlbtdor-2
ARNm
cds completo
cds.
/ PROD *
Helor tisú lar
vía
inhibidor-2
/FL=gb:D299
92.1
gb:L27624.1
gb:NM_0065
28.1
gb:BC00533
0.1
NM_003174 Homo SVIL 3.15 0.09 3.68 0.44 2.91 0.01 3.27 0.46 sapiens
supervellosidad
(SVIL),
variante de
transcripción 1.
ARNm.
I PROD = sepe (vellosidad
isoforma 1
/FL=gbAF05
1851.1
gb:NM_0031
74.2
gb:AF05185
0.1
AF052127 Homo RELN -3.13 1.04 -1.36 0.26 -0.88 0.17 -0.40 0.11 sapiens
clon 23850
secuencia
de ARNm
AL031290 Secuencia 0.38 0.06 1.39 0.46 0.40 0.05 0.95 0.44
de AON humana
del clon
774124 en
cromosoma
1q24.1-24.3
Contiene
proteína
similar a
proteina de
plasma A
asociada al
embarazo
precursor
neu roñal
Figure imgf000131_0001
NM_006200 Homo PCSK5 3.01 0.21 2.88 0.92 2.28 0.11 1.52 1.25 sapiens
propro teína
convertase
subtilislnkexl
n tipo 5
(PCSK5).
ARNm,
/ PROD = proprotelna
convertasa
subtlllsinkexin
tipo 5
/FL=gb:U563
87.2
gb:NM_0062
00.1
BF342661 KIAA0036 MAP2 -0.77 0.30 -0.19 0.44 0.12 0.17 -2.21 1.64 producto gdnico
AF063824 Homo TRPC4 -3.03 0.39 0.05 049 1.28 0 17 0.21 092 sapiens prote¡na4
relacionada
con tmtruncada
vanante delta
ARNm
cds
completo
I PROD =
proteica 4
relacionada
con trpvariante delta
/FL=gb:AF06
3824.1
AA723810 ADNc para LY6K 0.07 0.20 -0.13 1.23 0.15 0.14 -0.38 1.27
Gen C016
diferencialmente
expresado
/FL=gb:BC00
1291.1
N29877 interieucina - 1.94 0.13 0.51 0.48 0.78 0.64 -1.57 0.65
14
NM 007287 Homo MME 2.59 0.03 1.81 0.40 1.89 0.21 2.14 0.30 sapiens
membrana
metalo*
endopeptida sa
(endopeptidasa neutral,
encefalinasa,
CALLA,
CD 10)
(MME),
transcripción
vanante Ibis.
ARNm
/ PROO = membrana
metalo
endopeptidasa
/FL=gb:NM_
007288.1
gb:NM_0072
87.1
gb:J03779.1
ABO50856 Homo B3GALNT1 1.39 0.05 0.20 0.22 -0.13 0.21 -0.10 0 17 sapiens
beta3GalNA
cT-1 ARNM
para globósido
sintasa,
cds
completo
clon: tipo 2
J PROD = globósido
sintasa
/FL=gb:AB05
0856.1
AI827455 Homo BCL6B 0.65 0.31 0.62 0 21 1.07 0.24 0.90 0.29 sapiens
ADNc:
FLJ21042
fis. don
CAE11204
AF017987 Homo SFRP1 4.15 0.22 4.37 1.24 6.02 0.06 5.74 1.01 sapiens
protelna 2
relacionada
de apoptosis
secretado
(SARP2)
ARNm.
completo
cds
/ PROO =
proteina 2
relacionada
con apoptosis
secretado
/FL=gb:AF05
6087.1
gb:NM_0030
12.2
gb:AF01798
7.1
gb:AF00190
0.1
AL117451 Homo C1orf108 -0.73 0.20 0.68 0.24 1.06 0.05 0.82 sapiens
ARNm;
ADNc
DKFZp586E
2317 (de
don
DKFZp586E
2317).
AW268357 EST. altamente . (jgp32 0.73 0.20 0.36 019 0.70 0.03 0.09
simiar a
AF1551161
NY-REN-60
anttpano
(H sapiens)
BE465243 ESTs ARFGEF1 0.50 0.23 0.16 032 1.03 0.08 0.47 AA993400 ESTs ADAL 0.89 0.22 0.48 0.28 0.83 0.10 0.29 AI970898 Cluster Ind. ACACB 0.69 0.15 051 0.53 1.46 0.11 -0.87
AI970898:wr
21c03.x1
Homo
sapiens
ADNc. 3
extremo
/ clon = IMAG
EN-2488324
/ cton_extremo =
3
/gb=AI97089
8
/gi=5767724
/ug=Hs.2348
98 /len=382
BG026457 ESTs, KIAA1909 0.60 0.07 0.23 0.59 0.98 0.03 -2.11 1.28 Débilmente
similar a
ALU5JHUM
ANALU ENTRADA DE ADVERTENCIA DE CONTAMIN ACIÓN DE SECUENCIA DE SUBFAMILIA SC
(H.sapiens)
BC041933 Homo UBE3C 0.83 0.23 0.11 0.51 0.55 0.05 041 0.92 sapiens,
don
IMAGEN: 5300
703, ARNm
Al638611 KIAA1373 STAMBPL1 2.20 0.17 1.37 0.58 2.32 0.08 -0.39 1.24 prote ¡n a
Al341686 EST. altamente MTRF1 1.36 0.14 0.45 0 48 1.43 0.09 -1.09 0.99 similar a
R F1M H U M
UN PRECURSOR
DE FACTOR
1 DE LIBERACION
DE CADENA
DE PÉPTIDO
MITOCONDRIAL
(H.sapiens)
NM 003182 Homo TAC1 1.89 0.20 1.65 0.13 2.46 0.09 1.48 0.26 sapiens
taqu ¡quinina
precursor 1
(sustancia
K. sustancia
P. neuroquínma
1. neuroqulnina
2,
neuromedina
L, neuroqumina
alfa.
neuropéptido
gamma)
(TAC1),
transcripción
vanante beta.
ARNm.
/ PROO = taqu(quinina 2
precursor,
isotorma beta
/FL - gb: U3
M80634 receptorde FGFR2 3.63 0.06 2.25 0.39 2.79 0.19 2.07 0.84
(actor de
crecimiento de ’
humano
ARNm
cds completo
/ PROD=
receptor de
factor de
crecimiento de
queratínocito
/FL=gb:M806
34.1
gb:NM_0229
69.1
gb:M97193.1
AK021452 Homo ZNF521 -0.20 0.16 -1.15 1.12 1.31 0.05 0.36 0.18 sapiens
ADNc
FLJ11390
lis. clon
HEMBA1000
561, débilmente
similar a
PRO TEINA DE DEDO ZINC
91,
AA541622 ESTs SYNP02 -0.49 0.30 -0.90 0.06 0.35 0.09 -2.58 0.93 N50714 ESTs - -1.13 0.13 -1.34 0.52 0,10 0.12 -0.21 0.28 NM 002674 Homo PMCH 0.62 0.24 1.10 048 164 003 009 080
sapiens
hormona de
concentración
de prometanna
(PMCH),
ARNm
/ PROD ■ promelanina
concentración
de hormona
/FL=gb:NM_
002674.1
gb:M57703.1
BM666010 Homo LOC200169 1.36 0.16 045 0.74 1.49 0.12 -1.65 1.41 sapiens
ADNc
FU23803
fis. clon
HEP22811.
Al343467 Homo - -0.44 0.08 -1.50 0.82 1.11 0.19 -0.64 0.20 sapiens
ADNc
F U 11041
lis. cbn
PLACE1004
405
AA046424 ESTs, ACOT4 0.58 0.27 -0.94 0.66 -1.08 0 38 -1.09 0.25 Débila mente
similar a
YZ28_
N PROTElNA
HIPOTÉTICA HUMANA ZAP128
(H sapiens)
R38389 prole, na DLFM1 4.27 0.11 3.02 0.76 4.53 0.07 2.17 0.96 localizada con
ER relacionada
con olfactomedina
BF724270 ESTs - 2.03 0.22 072 0.42 2.36 0.06 001 0.97 NM_001819 Homo CHGB 1.40 0.18 050 0.75 1.66 005 -0.74 1.03 sapiens
cromogianina B
(secretogranina 1)
(CHGB),
ARNm
/ PROD = cromogranina B
precursor
/FL=gb:BC00
0375.1
gb:NM_0018
19.1
AK026387 Homo - 0.03 0.28 -0.05 0.52 1.23 0.26 0.52 0.67
Figure imgf000138_0001
474, ARNm.
AW205739 ESTs, TYW3 0.47 0.01 0.81 1.35 3.72 0.18 2.46 1.15 Débilmente
similar a
ORF YGL050W
(S.cerevisiae
)
NMJ53262 Homo SYT14 -0.01 0.17 -0.84 0.51 0.00 0.18 -3.88 1.64
sapiens
proteina
hipotética
FLJ34198
(FLJ34198).
ARNm.
/FL=gb:NM_
153262.1
AA156873 albúmina PELO 0.77 0.12 -0.23 0.93 0.65 0.14 -2.33 1.01 BC012375 Homo ARSG -0.46 0.48 -078 0.42 0.57 0.22 -0.41 0.55 sapiens,
Similar a
proteina
KIAA 1001.
don
MGC: 8996
IMAGEN: 3882
163, ARNm
cds
completo
/ PROD = Similar a
proteina
KIAA1001
/FL=gb:AB02
3218.1
gb:NM_0149
60.1
gb:BC01237
5.1
AA843242 ESTs BNC2 2.12 0.37 1.03 0.47 2.89 006 0.43 0.80 BF792954 ESTs HDLBP -1.53 1.04 -2.75 0.91 0.30 0.16 -0.72 0.26 AA780067 sulfato de HS3ST3B1 0.41 0.19 030 061 2.61 0.18 0.78 060 he para no
(glucosamina)
3-0-sulfotransterasa 3b1
AA909330 ESTs RP1-32F7.2 0.98 0.17 -1.67 0.51 0.79 0.02 -0.38 0.12 AF141339 Homo ZNF521 -0.41 0.12 -097 0 93 1.67 0.11 -0.31 0.80 sapiens
proteina LIP3
que interactúa
eonLYST
ARNra
cds parcial
I PROO a
proleina UP3
que mieractüa
BF435123 2.28 0.17 1.31 0.51 270 0.12 1.30 1.00 oonLVST
bromado minio
y dedo que conlene 3
AK056212 Homo • 1.03 0.14 0.14 0.27 1.10 0.07 -1.41 0.51 sapiens
AÜMC FLJ3I6S0
lis. don
NT2RI20040
79.
NM_001446 H. sapiens FABP7 2.07 0.15 0.74 0.29 2.20 0.04 1.08 0.16 protefna 7
de unión
a ácido graso
cerebro
(FABP7)
rpROo =
protelna 7 de
uraon a acido
graso cerebro
/FL=gb:U812
35.1
gb:D88648.1
gb U51338 1
gb:NM_0014
46.1
gb:D50373.1
AW0S1591 ESTs, RNF175 1.41 032 0.22 0.10 2.60 0.06 0.96 0.20
Moderadamente
similar a
producto de
pro tema sin
nombre
(H.sapiens)
BC041970 Homo C9orf122 0.74 0.03 -0.35 0.49 0.76 0 06 -2.31 1.25 sapiens.
Figure imgf000141_0001
expandidle
ds
/D E F IN IC IÓ N
= HUMGCA
PB Homo
Sapiens
pro teína
activadora
de guarníalo
cid asa
(G C AP)
1-4.
cds completo
AW023227 ESTs MKX -0.91 0.60 -1.31 006 0.27 013 -2.90 052 NM_021614 Homo KCNN2 3.45 0.13 2.52 0.83 4.40 014 1.54 0.80 sapiens
potasio
intermedio
conductancia
pequeña
canal activador
de calcio,
subfamilia N.
miembro 2
(KCNN2).
ARNm
I PROD - potasio
intermedio
pequeña
conductancia
canal activador
de calcio,
subfamila N,
miembro 2
/FL=gb:NM_
021614.1
gb:AF23961
3.1
NM_000956 Homo PTGER2 -0.71 0.71 -0.73 0.57 0.63 0.33 -2.38 0.61 sapiens
receptor 2 de
prostaglandina E
(subtipo
EP2), 53kD
(PTGER2),
ARNm.
I PROD=
prostaglandina E
receptor 2
(subtipo
EP2), 53kD
/FL=gb:U194
87.1
gb:NM_0009
56.1
NM_013381 Homo TRHDE 1.96 0.16 0.25 0.36 1.81 0.03 0.82 0.23 sapiens
ectoenzima
agradante
de hormona
liberadora
de tirotropina
(TRHDE).
ARNm.
/PROD =
ectoenzima
agradante
de hormona
liberadora
de tirotropina
/FL=gb:AF12
6372.1
gb:NM_0133
81.1
NM_016354 Homo SLC04A1 2.18 0.06 1.01 0 37 2.35 0.05 -0.91 1.23 sapiens
familia 21 de
portador de soluto
(transportador
de anión
orgánico).
miembro 12
(SLC21A12).
ARNm
/PROO=
transportador
de anión
orgánico
OATP-E
/FL=gb:AB03
1051.1
gb:NM_0163
54.1
gb:AF20507
2.1
gb:AF18781
7.1
BC028359 Homo ZNF141 -1.05 0.39 -0.59 0.65 1.25 0.17 -1.48 0.72 sapiens,
clon
IMAGEN: 4828
886, ARNm,
AI193252 ESTs, LRRN6A 4.38 0.11 2.47 0.43 4.23 0.11 1.90 0.37
Débilmente
similar a
AF 1332701
SLIT2
(H.sapiervs)
H09780 Secuencia 2.04 0.19 0.56 0.07 2.50 0.11 0.12 0.40
de ARNm
humano (don
CTG-A4)
BC040605 Homo - 2.64 0.16 1.61 1.08 3.59 0.09 0.45 1.14 sapiens,
clon
IMAGEN: 5271
039, ARNm.
AW057589 ESTs - -0.96 0.26 -2.77 0.81 0.25 0 24 -1.21 0.35 M31213 proteína RET 0.42 0.10 - 1.86 0.83 1.77 0.12 -0.64 0.15
codificada de
carcinoma de
tiroides
papilar
humano
ARNm
cds
completo
/FL=gb:M312
13.1
secuencia a
Z92546 0.58 0.13 -1.16 0.54 1.07 0.12 -1.27 0.14
ADN humano
del clon
CTA-65A6
en
cromosoma
22q11-12
Contiene la
parte 3 del
gen para el
ortólogo de
rata CAIN
(KIAA0330),
el gen para
ur nuevo
dominio
Sushi
(repetición SCR)
que contene
pro teína
similar a
Mucinas.
ESTs, un
STS, GSSs
y dos,
AA974416 protelna PPP2R2B 4.02 0.16 3.52 0.23 5.22 0.07 3.12 0.15
fosfatasa
2 (anteriormenle
2A).
subunldad
reguladora B
(PR 52)
isoforma beta
AW138143 ESTs SORBS2 3.44 0.16 2.89 0.88 4.47 0.10 1.88 1.15 NM_014862 Homo ARNT2 1.29 0.08 -0.68 0.97 2.00 0.08 0.02 0.24
sapiens
prooucto genético
KIAA0307
(KIAA0307).
ARNm.
I PROO = KIA
producto genético
A0307
/FL=gb:ABO0
2305.1
gb:NM_0148
62.1
AI765540 ESTs - 1.28 0.22 0.07 0.39 1 50 0.07 -0 11 0.26 NM_018013 Homo FLJ10159 1.30 0.21 038 0.39 2.89 0.02 0.62 0.21
sapiens
protelna
hipotética
FLJ10159
(FIJ10159).
ARNm
/ PROD=
protelna
Npot ética
FU10159
/FL=gb:NM_
018013.1
BF382322 ESTs, - -0.40 0.09 -2.09 0.67 -0.12 0.08 -1.73 0.50
Débilmente
similar a
producto
de protei na
sin nombre
(H.sapiens)
AV699347 receptor XIST -1.37 0.38 0.45 1.69 4.28 0.02 2.25 1-53
nuclear
subfamilia 1, ,
grupo I
miembro 3
BC011549 Homo ATP5S 0.69 0.19 0.96 0.68 2.57 0.29 -0.02 0.52 sapiens,
don
MGC: 19945
IMAGEN: 4554
461, ARNm.
cas
completo
/ PROD = DES
conocido
(protei na para
MGC: 19945)
/FL=gb:BC01
1549.1
NM_001889 Homo CRYZ - 1.68 0.26 0.23 1.38 3.75 0.07 1.78 1.11 sapiens
cristalina,
zeta
(quinona
reductasa
(CRYZ).
ARNm
/PROD = cristalina,
zeta
(quinona
reductasa)
/FL=gb:NM_
001889.1
gb:L13278.1
gb:S580391
BC002665 Homo PLP1 4.57 0.15 2.95 0.64 4.70 0.06 2.32 0.52 sapiens,
protelna
proteo lipidica
(enfermedad
Pelizaeus-Merzbacher,
parapleja 2
espástíca, sin
complicaciones),
clon
MGC: 3940
ARNm
cds
completo
/ PROD =
prote (na
proteolipidica
(enfermedad
Pellzaeus-Merzbacher,
paraplefa 2
espastíca. sin
complicaciones),
/FL=gb:BCOO
26651
NM_001243 Homo TNFRSF8 3.75 0.03 1.45 0.35 3.24 0.11 0.69 046 sapiens
receptor de
factor de
necrosis
tu moral
superfamilla
miembro 8
(TNFRSF8).
ARNm
/ PROD = CD3
0 antigeno
(KM
antigeno)
/FL=gb:NM_
001243.1
gb.D86042.1
gb:M83554.1
NM_001195 Homo BFSP1 0.57 0.33 -1.65 130 0.60 0.14 -0.86 0.73 sapiens
proteina 1
estructural de
filamento
perlado,
filen si na
(BFSP1),
ARNm
/ PROD = flensina
/FL=gb:AF03
9655.1
gb:NM_0011
952
gb:Y16717.2
NM 024582 Homo FAT4 2.16 0.27 -0.49 0.30 1.54 0.28 -1.35 1.01 sapiens
prote ¡na
hipotética
FLJ23056
(FLJ23056)
ARNm.
/ PROD =
protema
hipotética
FLJ23056
/FL=gb:NM_
024582.1
NM_000767 Homo CYP2B6 2.60 0.18 0.87 0.96 1.47 0.12 -0.69 1.03 sapiens
citocrom o
P450,
subfamilia IIB
(fenobarbital
hd ucib le),
pollpéptido
6 (C Y P 2B 6 ).
ARNm.
I P R O D = citocromo
P 450.
subfamilia
IIB (fenobar
bit al Inducible).
polipéptido
6
/FL=gb:NM_
000767.2
gb:AF18227
7.1
gb:M298741
AW665509 ESTs MGC42174 -0.10 0.33 -0.87 0.72 1.20 0.08 -2.60 1.40 NM_001104 Homo ACTN3 2.12 0.13 1.64 0.28 3.35 0.03 1.67 0.36 sapiens
actinina. alta
3 (ACTN3),
ARNm.
/ PROO =
actnina
especifica a
músculo
esquelético, alfa
/FL=gb:M864
07.1
gb:NM_0011
04.1
NM_021069 Homo SORBS2 -0.49 0.43 0.30 1.36 2.03 0.07 -1.13 1.15 sapiens
proleinague
interactúa con
ArgAbi
ArgBP2
(ARGBP2).
transcripción
variante 2 ,
ARNm.
/ PROO =
proteina 2 que
interactúa con
ArgAbi
isoterma 2
/FL=gb:AB01
8320.1
gb:NM_0210
69.1
T65020 ESTs - 0.51 0.16 -084 0.26 1.10 0.15 -1.50 0.38 NM_152647 Homo GALK2 0.08 0.56 -1.42 0.52 0.03 0.17 -2.34 091 sapiens
proteina
hipotética
FU32800
(FLJ32800),
ARNm.
/FL=gb:NM_
152647.1
BC036917 Homo C6orf141 -0.82 0.30 -1.18 0.40 0.88 0.11 -2.18 0.62 sapiens,
don
MGC: 46457
IMAGEN: 5201
433, ARNm,
cds completo
I PR O O = D es
conocido
(protelna para
MGC:46457>
/FL=gb:BC03
6917.1
A1969112 Homo PHIP -1.07 0.13 -2.88 091 -0.37 0.02 -2.23 0.33 sapiens,
ción
IMAGEN: 5260
603. ARNm.
cds parcial
AW449813 proleina SLITRK5 0.32 0.26 -1.89 0.50 0.46 0.10 -0.57 0.13
KIAA0918
AW044658 ESTs 0.16 0.16 -1.47 0.25 090 0.14 -089 0.16 Al694300 ESTs - -0.52 0.02 -1.34 0.52 0.27 0.08 -1.00 0.08 NM_017631 Homo FU20035 1.35 0.13 0.05 0.19 1.51 0.17 0.32 0.15 sapiens
prote ina
hipotética
FLJ200035
(FU200035),
ARNm,
/ PROD =
proleí na
hipotética
FU20035
/FL=gb:NM_
017631.1
AF298547 Homo NALP2 1.54 008 1.22 161 5.04 0.05 3.23 1.36 sapiens
proleina 1
de sito de
unión al
nucí eót ido
ARNm
cds
completo
/ PROD =
proleina 1
de sito de
unión a
nudeótido
/FL=gb:AF29
8547.1
NM_030631 Homo SLC25A21 1.96 025 0.33 0.81 2.47 0.11 -0.28 0.63 sapiens
portador de
oxodicarbox ilato
(ODC1),
AFtMii.
t P f lD D -' p g í lf i* r d e
omdnrtxnWg
JFL=gb:NM_
030631.1
BF196255 ESTs • 2.94 0.05 1.18 0.43 3.15 008 0.54 0.57 NM 003247 Horno THBS2 2.62 0.20 1.04 0.28 2.70 004 0.27 045 sapiens
ircrniEo^andria 2
ITHBSZ}
ARNm
I PFtOD i
1ro ni pospondría 2
/FL=gb:NM_
003247.1
gt>;Ll2350 l
KJM 001446 H. sapiens FABP7 095 0.09 -075 0.37 0.20 0 22 -1.73 099
proteína 7
de unidn
a acida grasa
cerebro
<FABP7),
i PR OO ■
proleina 7 de
unión a ácido
graso,
os cobro ,
JFL=gt»:U812
35.1
gb:D06G48.1
go:U5l 338.1
gU:NM_00l4
46.1
gt»:D50373-1
Awoodoie ESTs ST6GAL2 1.57 0.14 089 032 3.30 0 07 1.48 043 AW072790 emtaetin 1 CNTU1 0.50 0.20 0.18 0.98 1.84 0.10 1.01 1.39 AL512686 Homo 0WAO1 2.16 OSO -0-28 1.03 167 0.18 -1.12 037
sapiens
ARNfni
ADNe
DKF2p7E1l1
77 (d»
dan
DKFZp7Gll1
m
Figure imgf000152_0001
genes nucleares
proteina
mltocondrlal I ,
ARNm,
/PROD =
higado
camltina
palmtoiltran
sferasa I
/FL=gb:L392
11.1
gb:NM_0018
76.1
AA903862 ESTs C20orf54 1.61 0.15 -1.17 0.30 0.68 0.21 -1.49 0.23 AI670947 fosfabdlli . 3.91 0.05 0.55 1.54 3.33 0.10 1.17 0.68
nositoM-fosfalo 5-quinasa. tipo
I. beta
AV648405 poimerasa - 0.01 0.11 0.23 0.52 1.73 014 -1.23 1.15
(ARN)III
(ADN
dirigido)
(32kO)
BF435123 bromo do mimo 180 0.13 -1.35 1.01 1.14 0.03 0.37 0.24
y PHD que
contiene dedo. 3
NM 016582 Homo SLC15A3 1.77 0.16 -088 1.35 1.30 0.23 -2.04 1.23 sapiens
transportador
de péptido 3
(LOC51296).
ARNm.
/PROD = pépti
do
transportador 3
/FL=gb:NM_
016582.1
gb:AB02059
8.1
AJ830490 quinasa GK 0.61 0.01 -065 0.79 1.25 0.20 •0.38 0.33
de gllcerol
AW134979 HSPC156 STXBP6 228 0.03 0.55 0.28 2.05 003 030 0.44
proteina
AI354636 ESTs 2.81 0.11 0.68 1.17 3.02 0.20 0.19 0.76 BE672659 ESTs 0.20 0.64 -043 0.61 1.98 0.12 -0.69 0.45 AF284095 Homo ADRA2A 0.63 0.21 -0.74 0.98 1.85 003 0.55 031 sapiens
aía-2A
receptor
adrenérgco
ARNm
cus
completo
íPROD = ala
a-2a
receptor
adre rterg ico
/FL=gb:AF28
4095.1
gb NM 0006
81.1
NM_021136 Homo RTN1 -030 0.03 -1.39 0.35 0.80 0.07 -1.23 039 sapiens
ret culón 1
(RTN1).
ARNm.
/PROD=rebc
ukxi 1
/FL=gb:L103
33.1
gb L10334.1
gb:NM_0211
36.1
NM 014729 Homo TOX 0.34 0.03 -0.46 0.12 0.90 0 18 -1.86 0.40 sapiens
producto genético
KlAMSOe
(KIAA08O8).
ARNm
I PROO = KIA
producto
génco A0808
/FL=gb:AB01
8351.1
gb:NM_0147
29.1
BE674118 ESTs - 0.78 0.07 -1.32 073 0.28 0.19 -0.96 0.74 BC026969 Homo WDR67 2.95 0.11 075 0.92 3.08 008 0.45 061 sapiens.
clon
IMAGEN: 5116
073. ARNm
cds parcial
AF131783 Homo PAP2D -0.42 0 26 -200 1.05 0.31 0.22 -1.56 0.70 sapiens
don 25181
secuencia
de ARNm.
U11058 Homo KCNMA1 1.56 0.09 -0.16 1 08 2.29 0.18 -0.79 0 86
sapiens
conductancia
grande
canal de
potasio
dependiente
de calcio y
voltaje
subunidad
alfa
(MaxK)
ARnm
cds
completo
/ PROO =
conductancia
grande
canal de
potasio
dependiente
de calcio y
velaje
subunidad
a ía
/Fl=gb:U237
67.1
gb:NM_0022
47.1
gb:AF02599
9
BF510715 (broblasto 2.67 0.27 0.84 0.17 3.29 0.01 0.64 0 51 factor de credmiento
4 (proteína
transformadora
de heparína
secretora 1,
sarcoma
Kaposi
oncogén)
/FL=gb:M174
46.1
gb:NM_0020
07.1
BE897866 ESTs ACADSB 1.41 0.23 0.08 0.34 3.10 010 -0.27 0.88 AI735586 ESTs LOC152573 0.60 0.13 0.00 1.14 2.84 0.07 1.12 1.30 AL573058 Componente C1R 0.92 0.14 -1.67 0.38 0.73 0.02 -0.96 0.77 complemen tarto
T, f
Subcompone
nte
AF429305 Homo RMST -0.48 0.03 -2.49 0.51 -0.25 0.20 -1.89 0.27 sapiens
C23up
NCRMS ARNm,
secuencia
parcial;
empalmado
alternativamente
BF195118 ESTs, ATP5J 0.09 0.13 -0.92 0.42 1.57 0.16 -0.53 0.08
Débilmente
simiara
ALU7_HUM
UNA SUBFAMILIA ALU ENTRADA DE ADVERTEN­
CIA DE CONTA­
MINACION DE SECUENCIA SQ
(H.sapiens)
NM_005460 Homo SNCAJP 1.76 0.16 -0.84 0.52 1.61 0.19 -0.92 0 88
sapiens
sinudelna
proteina que
mteractúa alfa
(slnflina)
(SNCAIR).
ARNm.
/ PROD =
sinudetta
proteina que
inleractúa alfa
/FL=gb:AF07
6929.1
gb:NM_0054
60.1
NM_024893 Homo C20orf39 1.16 0.29 -0.56 0.42 2.36 0.15 -0.06 0.17 sapiens
proteína
hipotética
F U 14220
(FLJ14220),
ARNm.
/ PROD =
proteína
hipotética
FU 14220
/FL=gb:NM_
024893 1
NM_022034 Homo CUZD1 1.31 0 08 0.80 0.28 2.78 0.07 0.24 0.58 sapiens
gen regula­
do por
estrógeno 1
(ERG-1).
ARNm.
/ PROO =
gen regula­
do por
estrógeno 1
/FL=gb:AF30
5835.1
gb:NM_0220
34.1
NM_014788 Homo TRIM14 3.12 0.09 1.22 0.59 3.54 0.08 1.02 0.45 sapiens
producto
genético
KIAA0129
(KIAA0129),
ARNm.
I PROD = KIA
producto
génico A0129
/FL=gb:D509
19.1
gb:NM_0147
88.1
AV646597 ESTs, XIST -0.77 0.18 0.06 1.55 3.78 0.25 2 28 0.98
Débimente
smilar a
ALU7_HUM
UNA SUBFA­
MILIA ALU ENTRADA DE ADVERTENCIA DE SECUENCIA
DE CONTAMINA-CIONSQ
(H.sapiens)
BF062629 DKFZP586E TMEM158 400 0.19 2.41 027 4.87 0.00 1.93 0.19
1621 prole loa
AW 440492 ATPasa. ATP1A2 1.33 0.07 -2.12 1.07 1-27 0.06 -0 53 0.11
transportadora
da Na+K*
alfa 2 (t)
poiipépttdo
/FL=gb:NM_
000702.1
AF283777 Homo CD72 -0 08 0.45 -188 1.19 0.41 0.24 -1.42 1.13 sapiens
don
TCBAP07Ü2
secuenca
de ARNm.
NM _005375 Homo MYB 2.11 0.17 -0 52 0.18 2.24 0.03 0.10 0.08 sapiens vmiebMasios
aviares es
encogen
viral
homólogo
(MYB),
ARNiTi
/ PRO D = v-myt)
mieiou asios
avares es
oncogen
viral
homólogo
/FL=gb;NM_
005375.1
gb:AF10486
3.1
gb:M 15024.1
NM_017671 Homo C20orf42 3.19 0.12 0.97 0.70 3.26 0.07 0.16 0.94 sapiens
pretalna
hlpotétca
F U 20116
(FLJ20116),
ARNm.
/PROD=
Proteína
hipotética
FU20116
/FL=gb:NM_
017671.1
BG283790 ESTs MATR3 2.27 0.11 0.95 0.57 353 0.04 0.89 NM 000702 Homo ATP1A2 2.12 0.17 0.76 038 2.93 0.16 0.51 sapiens
ATPasa
transportadora
Na*K+
alfa 2 (+)
polpéptido
(ATP1A2),
ARNm.
/ PROO = ATP
asa. Na+K*
transportadora
alfa 2
(+) pollpéptldo
/FL=gb:NM_
000702.1
NM_025135 Homo FHOD3 1.02 0.18 0.80 0.40 2.34 0.10 -0.77 sapiens
protema
hipotética
FLJ22297
(KIAA1695).
ARNm.
/ PROD=
proteica
hipotética
KIAA1695
/FL=gb:NM_
025135.1
NM 012281 Homo KCND2 1.67 0.30 0.05 0.15 2.70 0.09 -0.26 sapiens
canal de
voltaje de
potasio.
subfamila
relacbnada
con Shai
miembro 2
(KCND2),
ARNm.
/ PROD =
canal de
voltaje de
pota so .
subfam iia
relacionada
con S b a
miembro 2
/FL=gb:NM_
012281.1
gb:AB02896
7.1
gb:AF12110
4.1
BF449063 colágeno )OL14A1 1.61 0.15 0.30 0.38 2.68 0.17 -0.33 0.68 tipo XIV.
alfa 1
(untulna)
AA280904 ESTs C9ori39 0.23 0.21 -1.58 1.26 1.13 014 -0.78 0.42 NM 022467 Homo CHST8 2.11 0.20 -0.51 0.30 2.17 0.10 0.48 0.02 sapiens N-acetiga lactosa mina-4-O-sulfotransferasa
(GALNAC-4-ST1),
ARNm.
y PR O D = N-acetlgalacto
samina-4-O-sulfotransferasa
/FL=gb:NM_
022467.1
gb:AF30061
2.1
BE468066 ESTs RMST 3.26 0.09 149 0.10 3.80 0.09 1.63 0.08 AL120674 ESTs - 1.00 0.11 -1.35 1.73 1.55 0.15 -2.20 0.86 NM 133329 Homo KCNG3 2.18 0.27 0.74 0.29 3.67 0.01 0.26 0.28 sapiens
canal de
volaje de
potasio,
subfamilia G.
miembro 3
(KCNG3),
transcripción
vanante 1,
ARNm,
/ PROD - canal de
voltaje de
potas»,
subfamilia
G, miembro 3
soforma 1
/FL=gb:AF45
45481
gb:AF34898
2.1
gb:AB07060
4.1
gbNM_1333
29.4
AI742043 ESTs - 0.94
Figure imgf000161_0001
NM_005103 Homo FEZ1 2.80 sapiens
fasclculación
y
alargamiento
protelna zeta
1 (zigina I)
( F E Z U
transcripción
variante 1,
ARNm.
/ PROD = zigina 1
. isoterma
1
/FL=gb:U600
60.1
gb:U69139.1
gb:NM_0051
03.2
NM_000277 Homo PAH 0.65
Figure imgf000161_0002
sapiens
fenMalanvia
hkJroxNasa
(PAH)
ARNm.
I PROD = fe
nlo alanina
hidroxlasa
/FL=gb:U498
971
gb.NM_0002
77.1
BF698797 ESTs • 093
Figure imgf000162_0001
BF437747 ESTs, C20orf118 4.26
Débilmente
similar a
ALU7HUM
UNA SUBFA-MIUAALU ENTRADA DE ADVERTENCIA DE CONTAMINA­
CION DE SECUENCIA SO
(H.sapiens)
NM_003020 Homo SCG5 4.03
Figure imgf000162_0002
sapiens
granulo
secretor,
proteína de
neuroend ocrina 1
(proteína 7B2)
(SGNE1).
ARNm.
/ PROD= *
gránulo
secretor,
proteína de
neuroendocnna 1
(proteína 7B2)
/FL=gb:BC00
5349.1
gb:NM_0030
20.1
NM_002800 Homo PSMB9 1.38
Figure imgf000162_0003
sapiens
protea soma
(prosoma
macrodolor)
subunidad, tipo
beta. 9 (proteasa
mulUunciónal
grande 2) (PSMB9
ARNm
I PROD = prot
tipo beta. 9
{prote asa
multlfunciúnal
grande
2 )
/FL=gb:U010
251
gb NM_0028
001
BE972639 ESTs LOC646326 0.00 0.15 -2.71 0.55 0.33 0.22 -2.24 BC044830 Homo C10orf96 1.38 0.12 -0.32 0.82 2.28 0.06 -1.39 sapiens,
Similar a
RIKEN ADNc
1700011 F 14
gen, don
MGC: 35062
IMAGEN 5166
167. ARNm.
oda
completo
/ PROO * Similar a
RIKEN ADNc
1700011 F 14
gen
/FL=gb:BC04
4830.1
AI961231 KIAA0808 TOX 3.28 0.13 1.23 0.06 4.00 0.01 1.13 producto génico
7FL=gb:AB01
8351.1
gb:NM_0147
29.1
U17496 Protea soma PSMB8 3.43 0.21 0.46 1.17 3.30 0.06 0.09 humano
subunidad
LMP7 (alelo
LMP7B)
ARNm
cds
completo
/PROD=prot
easoma
prosoma.
macrodolor)
subunidad
easoma
subunidad
LMP7
/FL=gb:U174
97.1
gb:U17496.1
N23651 ESTs SOK2 -1.16 0.31 -2.65 0.42 1.27 0.09 -2.07 0.75 NM_007015 Homo LECT1 4.83 0.12 2.27 0.84 5.36 0.09 1.83 0.69 sapiens
condromodulina I
precursor
(CHM-I).
ARNm.
/ P R O D =
condromodulina I
prote ina 032
/FL=gb:NM_
007015.1
gb:AB00600
0.1
NM_015474 Homo SAMHD1 2.63 0.17 0.57 0.33 2.89 0.09 0.29 0.22 sapiens
DKFZP564A
032 protein
(DKFZP564
A032).
ARNm.
/ PROD = DKF
ZP564A032
pro teína
/FL=gb:AF22
8421.1
gb:AL05026
7.1
gb:AB01384
7.1
gb:NM_0154
74.1
A F147427 Homo SAMHD1 1.33 0.03 -0.99 0.88 1.35 0.08 -2.30 0.97 nserto de
longitud completa don
de ADNc
YP80A10.
NM_004688 Homo NMI 3.54 0.04 0.96 0.07 3.80 0.07 1.13 0.34 sapiens N-myc(y
STAT)
¡nteractor
( N M I ) ,
ARNm.
/PROD=N-myc and
STAT
¡nteractor
/FL=gb:BC00
1268.1
gb:NM_0046
88.1
gb:U32849.1
AB040812 Homo PAK7 -1.37 0.60 -389 1.62 -0.49 0.07 -4.18 0.12 sapiens
ARNm para
quinasa de
protema
PAK5,
cds completo.
I PROD =
quinasa de
proteína
PAK5
/FL=gb:AB04
0812.1
Al985987 ESTs. SCNN1G -0.28 0.31 -0.99 0.35 0.12 0.19 -2.70 059
Moderadamente
s im lar a
ALU7HUM
UNA SUBFAMILIA ALU J ENTRADA DE ADVERTENCIA DE CONTAMINA
ClON DE
SECUENCIA
(H.sapiens)
NM_001877 Homo CR2 1.50 0.13 -0.43 1.05 2.35 0.14 -1.44 1.51 sapiens
componente
completo
(3dEpstein
Virus de Barr)
receptor 2
(CR2).
ARNm.
I PROD =
complemento
componente
(3dEpstein
Virus de Barr)
receptor 2
/FL=gb:NM_
001877.1
gb:M260041
NM_001351 Homo DAZL 1.69 0.24 -0.81 0.76 1.93 0.12 -0.73 0.06 sapiens
eliminado en
azoospermia
(DAZL),
ARNm.
/ PROD=
eliminado en
azoospermia
/FL=gb:U667
26.2
gb:NM_0013
51.1
gb:U659181
gb:U66078.1
NM_022168 Homo IFIH1 -2.03 1.08 -2.76 0.83 -0.10 0.15 -2.15 0.40 sapiens
prote ina 5
asociada a
diferenciación
de melanoma
(MDA5),
ARNm
/ PROD =
protema 5
asociada a
diferenciación
de melanoma
7FL=gb:AY01
7378.1
gb:NM_0221
68.1
gb:AF09584
4.1
AF052108 Homo LOC157627 1.49 0.33 0.22 1.02 2.26 0.40 -1.33 1.19 sapiens
clon 23687
secuencia
de ARNm.
AI056877 LOC200230 0.11 0.30 -2.37 0.94 1.15 0.18 -1.35 0.75 de ADN
humano
del clon
RP4-530I15
en
aomosoma
20. Contiene
el extremo 3
del PTPN 1
gen para
protefna
fosfatasa
Figure imgf000167_0001
/PROD=
Proteína
hipotética
FU 10261
/FL=gb:NM_
0180431
AF110400 Homo FGF19 2.12 0.14 -0.08 0.34 2.18 0.04 -091 0.18 sapiens
factor da crecím iaño de ífcroWaslo
19 (FGF19)
ARNm
cds
completo
! PROO = factor
de crecimiento
de ftorobiasto 19
/FL=gb:AF11
04001
gb NM_0051
17.1
gb:AB01812
2.1
AK098525 Homo HHIP 1.76 0.14 -0.57 0.63 3.32 0 06 -0.11 0.15 sapiens
ADMc
FLJ256S8
fls. don
TST00427.
altamente similar
a Mus
proteina que
nieractúa con
músculo en20
(cadera)
ARNm.
AV715309 ESTs, C20orf118 4.28 0.13 1 89 0.39 4.76 0.10 1.48 0.42
Déblmerte
similar a
ALU7.HU M
UNA SUBFAMILIA A LU SO ENTRADA DE ADVERTENCIA DE CONTAMINA­
CIO N OE SECUENCIA SO
(H.sapiens)
U96136 Homo CTNND2 0.7B 0.11 -1.33 0.87 1.18 0.12 -1.17 0.67 sapiens
delta-cate nina
ARNm
cds
completo
/ PR O D = deltacate nina
/FL=gb:NM_
001332.1
gb:U72665.1
gb: AB01380
5.1
gb:U96136.1
gb:AF03530
21
NM_002590 Homo PCDH8 -O.BO 034 -0.83 0.82 2.18 0.02 0.12 0.33 sapiens
protoca dherma 8
(PC D H 8),
ARNm.
/ PROD = prot
o cate ni na 8
/FL=gb:NM_
002590.2
gb:AF06157
3.2
AF107846 Homo - 0.44 0.20 -0.25 0.12 2.12 0.14 -2.56 0.81 sapiens
prdteina de
Gotgi especifica
a neiroendocnna
pSS
(XLaías)
gen. exon
XL2 y
cds completos
BG169832 aderílato AK5 0.62 0.36 -2.79 0.50 1.03 0.36 -1.94 0.32
quinasa 5
/FL=gb:NM_
012093.1
gb:AF06259
5.1
BE968806 ESTs, ATF>5S -1.15 0.14 -3.03 0.71 -0.34 0.15 -4.73 0.74
Débilmente
similar a
ALU7_HUM
UNA SUBFAM ILIA ALU ENTRADA DE ADVERTENCIA D E C O N TA M IN A ­
CIÓ N DE SE CU ENC IA SB2
(H .sapen s)
BU729850 p ro ten a I JAKMIP2 2.30 0.07 0.43 1.78 3.86 0.04 -1.56
hipotética
LO0153469
AL832535 Homo LOC157627 2.25 0.18 -0.04 1.00 3.14 0.25 -1.50 sapiens
ARNm;
AD Nc
DKFZp547J1
816 (de
don
DKFZp547J1
816).
NM_000439 Homo PCSK1 -0.63 0.18 -2.66 0.53 0.69 0.30 -3.19 sapiens
proproteína
con veri asa
aubtilslnkexin
tipo 1
(PCSK1),
ARNm.
/ P R O D =
propro teína
convertasa
subtiksinkexin
tipo 1
/FL=gb:NM_
000439.2
gb:M90753.1
M34455 indoleanmina in d o 4.39 0.23 1.58 0.09 5.44 0.08 1.69 human
nducible por
nterferón
gamma
2>
dbxigenasa
(IDO)
ARNm
cds completo
cds.
/FL=gb:NM_
002164.1
gb:M34455.1
AB014737 Homo SMOC2 1.25
Figure imgf000171_0001
sapiens
ARNm para
SMAP-2b,
cds
completo
/PROD=SMA
P-2b
/FL=gb:AB01
4737.1
BM682352 Homo HCN1 -0.41
Figure imgf000171_0002
sapiens
ADNc
FLJ37204
fls. clon
BRALZ2006
976.
TABLA V: EXPRESION RELATIVA DE MARCADORES DE ENDODERMO DEFINIDO
PARA LAS CONDICIONES DESCRITAS EN EL EJEMPLO 10. TODOS
LOS VALORES SE NORMALIZARON AL GRUPO 1 (CONTROL).
Figure imgf000171_0003
TABLA VI: VALORES DE INTENSIDAD NORMALIZADOS MEDIOS (EN EL
FORMATO REGISTRO) DE GENES PARA CELULAS DE ETAPA ENDODÉRMICA DEFINITIVA
DERIVADAS DE CELULAS MADRE EMBRIÓNICAS H9 CULTIVADAS EN MATRIGEL™ O MEFS /- WNT-3A.
Título de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P de DE en DE en suero DE en suero Benjamini suero bajo AA y
- 3A bajo AA
bajo AA Wnt Hochberg en en en MATRIGEL MATRIGEL MEFS
ESTs -4.82708 2.63968 -4.26995 8.62E-05 proteína asociada a microfibrillas 4 0.063791 5.16358 -0.60091 3.48E-03 H. sapiens, colágeno alfa-1 (VI) -3.66187 2.36459 -2.26934 1.45E-04 ESTs -3.43712 2.14508 -2.6475 O.OOE-t-OO H. sapiens cistatina SN (CST1), ARNm. 0.072931 7.53908 4.63955 4.46E-03 /PROD= cistatina SN /FL=gb:J03870.1 gb: NM_001898.1
portador de soluto de la familia 16 (ácido monocarboxflico -0.066405 5.23572 0.279005 4.27E-04 transportistas), miembro 3 /FL=gb:U81800.1 gb: NM_
004207.1
Factor de crecimiento de fibroblastos H. sapiens 17 (FGF17), -0.894644 5.75417 2.4872 4.93E-03 ARNm. /PROD= factor de crecimiento de fibroblastos 17 /FL=gb:NM
003867.1 gb: AB009249.1
Enlace humano proteína mRNA, cds completos. /PROD= enlace -1.93991 3.31348 -1.26346 1.14E-02 proteína /FL=gb:NM_001884.1 gb; U43328.1
H. sapiens soluto portador de la familia 16 (transportadores 0.710321 6.12971 1.72403 O.OOE-t-OO de ácido monocarboxflico), miembro 3 (SLC16A3), ARNm.
/PROD= portador de soluto de la familia 16 (transportadores
de ácido monocarboxflico), miembro 3 /FL=gb:U81800.1 gb: NM_
004207.1
Apolipoproteína Al de H. sapiens (APOA1), ARNm. -1.47073 5.37558 2.46891 5.07E-03 /PROD= Apolipoproteína Al precursor/FL=gb:M27875.1
gb: M11791.1 gb: NM_000039.1 gb: BC005380.1
H. sapiens citidina desaminasa (CDA), ARNm. -3.89129 2.05822 -1.67035 2.23E-03 /PROD= citidina desaminasa /FL=gb:L27943.1 gb: NM_
001785.1
EST, moderadamente similar a JE0284 derivado de células Mm-1 -2.37712 5.75671 4.22227 2.56E-02 Proteína 1b asociada a la transplantabilidad (H.sapiens)
ESTs -0.04716 5.28231 0.966974 O.OOE-t-OO glícoforina B (incluye grupo sanguíneo Ss) -2.85201 3.32812 -0.12969 1.45E-04 H. sapiens homeobox proteína goosecoid ARNm, -4.42042 3.55326 1.89424 2.50E-02 cds completos. /PROD= homeobox proteína goosecoid
/FL=gb:AY 177407.1 gb: NM_173849.1
MCP-1 = proteína quimiotáctica de monocitos (humana, aórtica -2.27571 5.13499 2.95543 2.92E-02 células endoteliales, ARNm, 661 nt). /PROD= MCP-1
H. sapiens proteína homeobox tipo Mix 1 (MILD1) -1.54648 4.47601 0.921971 2.01 E-02 ARNm, cds completos. /PROD= Homeobox tipo Mix
proteína 1 /FL=gb:AF211891.1
ESTs -4.93603 2.17917 -0.23735 1.12E-04 H. sapiens lumican (LUM), ARNm. /PROD= lumican -4.05726 3.21064 0.948822 3.39E-02 /FL=gb:NM 002345.1 gb: U18728.1 gb: U21128.1
ARNM de H. sapiens HNF-3beta para hepatocito nuclear -2.71785 4.68666 2.82506 3.71 E-02 factor-3 beta, cds completos. /PROD= hepatocito nuclear
factor-3 beta /FL=gb:AB 0280211 gb: NM_021784.1
(continúa)
Título de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P de DE en DE en suero DE en suero Benjamini suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens reservado (KCNK12), ARNm. -0.468745 6.28184 3.77969 1.97E-02 /PROD= canal de potasio de dominio de poro en tándem THIK-2 /FL=gb:NM_022055.1 gb: AF287302.1
H. sapiens, proteina 1 que interactúa con ía atrofina 1; activin -4.30828 1.80825 -1.32021 9.63E-03 proteína 1 que ¡nteractúa con el receptor (KIAA0705), ARNm.
/PROD= proteína que interactúa con la atrofina 1; activínreceptor
proteina interactiva 1 /FL=gb:NM_012301.1 gb:
AF038563.1
ESTs -2.33636 2.25176 -2.32124 5.26E-04 H. sapiens glutamato descarboxilasa 1 (cerebro, 67 kD) -2.424 2.31908 -1.87965 4.07E-04 (GAD1), variante de transcripción GAD25, ARNm.
/PROD- glutamato descarboxilasa 1, ¡soforma GAD25
/FL=gb:NM 013445.1 gb: AF178853.1 gb: BC002815.1
ARNm de troponlna C del ventrículo cardiaco H. sapiens, -0.549728 4.89072 1.4377 2.99E-03 cds completos. /PROD- troponina C ventricular cardíaca
/FL=gb:NM_003280,1 gb: AF020769.1
ESTs -2.89554 3.42817 0.926036 2.62E-02 Factor de crecimiento de fibroblastos H. sapiens 8 (inducido -4.32791 2.19561 0.015827 5.91 E-03 porandrógeno) (FGF8), ARNm. /PROD= crecimiento de fibroblastos
factor 8 (inducido por andrógenos)/FL=gb:U 36223.1 gb:
U46212.1 gb: NM 006119.1
ESTs -3.09818 1.66254 -2.20564 8.62E-05 H. sapiens proteína relacionada con la haptog lobina (HPR), -2.6068 2.38009 -1.19632 6.95E-03 ARNm. /PROD= proteina relacionada con la haptogiobina /FL=gb:
NM 020995.1
colágeno, tipo VI, alfa 1 -1.418 3.85952 0.604245 1.21E-02 Humano (clon 8B1) ARNm Br-cadherina. cds completos, -2.17941 2.59894 -1.02624 1.24E-02 /PROD= Br-cadherina /FL=gb:L34057.1 gb: L33477.1 gb:
NM_004061.1
ESTs -1.40092 2.57297 -1.82509 1.45E-04 H. sapiens cistatina SA (CST2), ARNm. -0.102178 5.21645 2.1671 2.40E-02 /PROD= cistatina SA/FL=gb:NM_001322.1
ARNm humano para la apolipoprotelna Al (apo Al) =. 0.215086 5.51109 2.49684 9.57E-03 /PROD= preproapolipoproteína Al
H. sapiens MLL fusión septina (MSF), ARNm. -3.29221 1.70902 -1.49951 2.25E-03 /PROD= MLL fusión tipo septina /FL=gb:AF 123052.1 gb:
NM_006640.1
H. sapiens cistatina S (CST4), ARNm. 0.92448 6.48842 3.87036 7.20E-03 /PROD= cistatina S /FL=gb:NM_001899.1
H. sapiens, proteina del tipo de forbolina MDS019 -1.11883 4.73391 2.40782 7.86E-03 (MDS019), ARNm. fPROD= proteina similar a ia forbolina
MDS019 /FL=gb:AF182420.1 gb: NM 021822.1
Apolipoprotelna A-ll de H. sapiens (APOA2), ARNm. -1.03333 5.80468 4.46856 3.23E-02 /RROD= precursor de apolipoprotelna A-ll /FL=gb:M29882.1
gb:NM_001643.1 gb:BC005282.1
ESTs -1.55475 3.48278 0.420447 2.50E-02 (continúa)
Título de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento V a lo r P de DE en DE en suero DE en suero B e n ja m in i suero bajo AA y bajo AA + Wnt- 3A bajo AA Hochberg en en en MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens glutamato descarboxilasa 1 (cerebro, 67 kO) -3.86752 1.56384 -1.08675 2.52E-02 (GAD1), variante de transcripción GAD67, ARNm,
/PROD= glutamato descarboxilasa 1, isoforma GAD67
/FL=gb:NM_000817.1 gb: M81883.1 gb: L16888.1
ESTs -0.731491 5.43249 3.52168 1.60E-02 ESTs -2.03591 3.38924 0.760984 2.34E-03 Receptor de retlnoldes X de H. sapiens, gamma (RXRG), -2.37496 2.62934 -0.32035 8.83E-04 ARNm. /PROD= receptor rettnoide X, gamma /FL=gb:
NM_006917.1 gb: U38480.1
ESTs -0.648552 4.30576 1.43266 2.19E-03 H. sapiens ADNc FU11550 fis, clon -1.22228 5.37746 4.21644 1.68E-02 HEMBA1002970
ESTs -1.782 3.50391 1.0501 1.85E-02 H. sapiens haptogloblna (HP), ARNm. -1.10114 3.5449 0.477027 8.13E-03 /PROD= haptogloblna /FL=gb:K00422.1 gb: L29394.1 gb:
NM_005143.1
Protefna hipotética del Fl. sapiens FLJ10970 -0.431989 5.14497 3.02045 2.62E-02 (FLJ10970), ARNm. /PROD= proteína hipotética
FLJ 10970 /FL=gb:NM 018286.1
H. sapiens beta-sitio APP enzima de escisión (BACE) -2.0354 3.70648 1.75385 8.00E-03 ARNm, cds completos. /PROD= división de la aplicación del sitio beta
enzima/FL=gb:AF200343.1 gb: AF204943.1 gb:
AF190725.1 gb: AF201468.1 gb: NM_012104.1
Proteína hipotética de H. sapiens FLJ22252 similar a 1.36784 6.82571 4.5979 2.10E-02 SRY-box que contiene el gen 17 (FLJ22252), ARNm.
/PROD= protema hipotética FLJ22252 similar a SRY
boxque contiene el gen 17/FL=gb:NM_022454.1
Clústerincl. AB028021: H. sapiens FINF-3beta -1.5339 5,12418 4.11704 4.47E-02 ARNm para hepatodto nuclear factor 3 beta, completo
cds / cds = (196,1569) / gb = AB028021 / gí = 4958949
/ug=Hs.155651 /len = 1944
H. sapiens péptido liberador de gastona (GRP), ARNm. -2.74071 2.70077 0.509757 2.49E-04 /PROD= péptido liberador de gastrina /FL=gb:NM_002091.1
gb: K02054.1 gb: BC004488.1
H. sapiens dominio sema, siete trombospondina -1.53335 3.78503 1.48732 4.71 E-02 repeticiones (tipo 1 y tipo 1), dominio transmembrana
(TM) y dominio dtoplásmico corto, (semaforina) 5A
(SEMA5A), ARNm. /PROD= dominio sema, siete
repeticiones de trombospondina (tipo 1 y tipo 1),
transmem
ARNm del H. sapiens; ADNc DKFZp586J0624 (de -0.835182 5.22406 3.69882 2.08E-02 clon DKFZp586J0624); cds completos.
/PROD= proteína hipotética /FL=gb:AF215636.1 gb:
NM_014585.1 gb: AF231121.1 gb: AF226614.1 gb: AL
136944.1
ARNm humano para el colágeno alfa-1 tipo II. -2.8736 2.155 -0.38021 5.70E-03 Rho inhibidor de la disociación del PIB (GDI) alfa -1.54385 1.7147 -2.58241 1.71 E-02 (continúa)
Título de gen Tratamiento Tratamiento T r a ta m ie n to v a lo r P de DE en DE en suero D E e n s u e r o B e n ja m in i suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A
en en en Hochberg MATRIGEL MATRIGEL MEFS
neuropilina 1 /FL=gb:AF016050.1 gb: NMJD03873.1 gb: -1.62253 1.95432 -1.9667 8.83E-04 AF018956.1
Secuencia de ADN humano del don RP1 -181C24 en -3.72313 1.68755 -0.37308 1.38E-03 cromosoma 6p11.1-12.2. Contiene el 3 final de ia
Gen BMP5 para la proteina morfogenética ósea 5, EST.
STSs y GSSs /FL=gb:M60314,1 gb: NM_021073.1
proteina dnasa C rica en alanina miristoilado -0.71724 3.51728 0.335725 4.29E-03 (MARCKS, 80K-L) /FL=gb:M68956.1 gb: D10522.1 gb:
NM 002356.4
proteina hipotética FLJ23403 /FL=gb;NM_022068.1 -1.45618 1.81423 -2.31327 1.20E-02 factor nuclear de hepatocitos 4, alfa -4.26574 1.7879 0.445241 3.25E-02 Molécula de adhesión celular de H. sapiens con homología a -0.541188 2.1751 -2.5002 1.16E-03 L1CAM (homólogo cercano de L1) (CHL1), ARNm.
/PROD= molécula de adhesión celular con homología a L1
CAM (homólogo cercano de L1) /FL=gb:AF002246.1 gb:
NM_006614.1
mefaloproteinasa de matriz 14 (Insertada en la membrana) -2.05734 2.36236 -0.5185 1.66E-02 /FL=gb:U41078.1 gb: NM_004995,2
H. sapiens glicoforína B (incluye grupo sanguíneo Ss) -0.947308 3.26089 0.180293 4.83E-04 (GYPB), ARNm. /PROD= precursor de la glicoforína B
/FL=gb:J02982.1 gb: NM_002100.2
Familia de proteínas WAS, miembro 2 /FL=gb:NM_006990.1 gb: -2.18746 1.99129 -1.05968 4.00E-03 AB026542.1
H. sapiens proteína relacionada con frizzled (FRZB), ARNm. 0.56502 5.7261 3.67629 1.75E-02 /PROD= proteina relacionada con frizzled /FL=gb:U24163.1 gb:
U68057.1 gb: NM_001463.1 gb: U91903.1
H. sapiens glutamato descarboxllasa 1 (cerebro, 67 kD) -1.68495 2.27067 -0.96944 8.02E-03 (GAD1), variante de transcripción GAD25, ARNm.
/PROD= glutamato descarboxllasa 1, ¡soforma GAD25
/FL=gb:NM 013445.1 gb: AF178853.1 gb: BC002815.1
ESTs 0.B12766 5.93144 3.91314 4.15E-02 H. sapiens clon 23736 secuencia de ARNm -0.047182 5.79006 4.50744 1.74E-02 Glucorina E del H. sapiens (GYPE), ARNm. -2.01601 1.79002 -1.50134 1.97E-02 /PROD= glicoforína E/FL=gb:NM_002102.1 gb:
M29610.1
ESTs 1.06767 5.63319 3.12487 2.00E-02 ESTs -1.41162 2.5396 -0.57029 1.29E-02 ARNm de Fritz humano, cds completos. /PROD= Fritz /FL=gb: 0.436589 5.69814 3.91514 1.99E-02 U24163.1 gb: U68057.1 gb: NM_001463.1 gb: U91903.1
H. sapiens, clon MGC: 4655, ARNm, cds completos. 2.3772 5.9184 2.47596 1.20E-02 /PROD= Desconocido (proteina para MGC: 4655) /FL=gb:
BC004908.1
Proteína KIAA0878 /FL=gb:NM_014899.1 gb: 1.1189 6.41747 4.78882 2.01 E-02 AB020685.1
(continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento T ra ta m ie n to V a lo r P de DE en DE en suero D E e n s u e r o B e n ja m in i suero bajo AA bajo AA V bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens dominio sema, dominio de inmunoglobulina -0.785987 3.69668 1.27624 2.10E-02 (Ig), dominio básico corto, secretado, (semafbrína) 3E
(SEMA3E), ARNm. /PROD= dominio sema,
dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio corto básioo,
segregado, (semaforina) 3E/FL=gb:NM_012431.1 gb:
AB002329.1
ESTs 1.48084 6.59709 4.81395 1.36E-02 noggin /FL=gb:NM_005450.1 -1.63627 3.28161 1.32958 2.53E-02 Protelna hipotética del H. sapiens FLJ11316 -0.904749 3.35854 0.755319 1.12E-04 (FLJ11316), ARNm. /PROD= proteína hipotética
FLJ11316 /FL=gb:NM _018383.1
H, sapiens angiopoyetina 2 (ANGPT2), ARNm. -2.93044 2.23779 0.59685 3.43E-02 /PROD= angiopoyetina 2 /FL=gb:AB009865.1 gb:
AF004327.1 gb: NM_001147.1
Metaloproteinasa 14 de la matriz de H. sapiens ( -0.723489 2.97262 -0.09689 5.44E-03 insertada en la membrana} (MMP14), ARNm./PROD=
matriz preproteína de metaloproteinasa 14 / FL = gb:
U41078.1 gb: NM_004995.2
Receptor acoplado a protema G 1.50709 6.65228 5.05327 2.00E-02 colágeno, tipo IX. alfa 2 /FL=gb:NM_001852.1 1.27026 5.4659 2.93507 3.19E-03 ESTs 0.521638 3.93176 0.620223 0.00E+00 Protelna KIAA1462 -3.84563 1.65452 0.437064 3.27E-02 La proteína de unión al cartílago H. sapiens 1 (CRTL1), -1.31515 2.27271 -0.80521 2.22E-02 ARNm. /PROD= proteína de unión al cartílago 1 / FL = gb:
NM_001884.1 gb: U43328.1
H. sapiens soluto portador familia 21 (prostaglandina 0.711428 4.89808 2.43304 6.84E-03 transportador), miembro 2 (SLC21A2), ARNm.
/PROD= familia de portadores de solutos 21
(prostaglandintransporter), miembro 2 /FL=gb:U70867.1
gb: NM_005630.1
ESTs 0.307173 4.78515 2.65653 1.72E-02 6-fosfofructo-2-quinasafructosa-2,6-bifosfatasa 4 -0.242865 3.97929 1.59985 5.28E-03 Fosfatasa 4 de especificidad dual de H. sapiens (DUSP4), 0.953857 5.82811 4.12159 4.00E-03 ARNm. /PROD= fosfatasa de especificidad dual 4 /FL=gb:
NM_001394.2 gb: BC002671.1 gb: U48807.1 gb:
U21108.1
EST, débilmente similar a la proteína hipotética T00331 -1.57372 2.70797 0.443622 6.74E-03 KIAA0555 (H.sapiens)
ESTs -3.57414 3.15167 3.37198 8.82E-03 ESTs, altamente similar a IHH_ PRECURSOR HUMANO -0.653989 3.22059 0.590533 5.18E-03 INDIO DE PROTEINA DE ERIZO (H.sapiens)
ESTs, débilmente similares a RECEPTOR FC DE EPSILON 0.494192 5.22522 3.48031 1.97E-02 DE INMUNOGLOBULINA DE AFINIDAD BAJA DE RATÓN FCE2 (M.musculus)
homeobox HB9 ÍFL=gb:NM 005515.1 -1.65563 3.2238 1.63092 5.58E-03 (continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento V a lo r P de DE en DE en suero DE en suero B e n ja m in i suero bajo AA
bajo AA Wnt- 3A bajo AA y en en en Hochberg MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens arilsulfatasa E (condrodisplasia 0.283004 4.95903 3.18424 9.22E-03 punctata 1) (ASS), ARNm. /PROD= arilsulfatasa E
precursor /FL=gb:X83573.1 gb: NM 000047.1
ESTs -0.05909 3.0455 -0.29817 1.47E-02 Proteína hipotética del H. sapiens FLJ23403 -1.48452 1.97473 -1.00431 5.72E-03 (FLJ23403), ARNm. /PROD= proteína hipotética
FLJ23403 /FL=gb:NM _022068.1
ESTs -0.182403 3.01548 -0.18954 3.72E-03 proteína hipotética FLJ23091 0.323388 5.25192 3.77987 3.57E-02 ARNm de dipeptidil peptidasa IV (CD26) humana, completa -3.61145 0.760585 -1.25595 3.07E-02 cds /PROD= dipeptidil peptidasa IV /FL=gb:M74777.1
proteína hipotética FLJ21032 0.355672 4.67756 2.61753 4.59E-02 H. sapiens Kel! grupo sanguíneo (KEL), ARNm. -2.20519 1.89439 -0.38393 1.91E-02 /PROD= antígeno del grupo sanguíneo Kell / FL = gb:
BC 003135.1 gb: NM_000420.1
factor de empalme, rico en arginíneserina 5 0.7481 5.68934 4.27169 2.97E-03 Protelna secretora de la próstata humana 57 ARNm, completa -3.01313 1.46338 -0.40767 1.97E-02 cds /PROD= PSP57 /FL=gb:U22178.1
Protelna de H. sapiens KIAA0878 (KIAA0878), ARNm. 2.0265 7.00937 5.65368 2.85E-02 /PROD= KIAA0878 proteína /FL=gb:NM_014899.1 gb:
AB020685.1
ARNM críptico H. sapiens, cds completos. 0.104874 2.87319 -0.67353 1.61E-03 /PROD= críptico íFL=gb:AF312769.1
H. sapiens ADNc FLJ13221 fis, clon 0.355743 3.98782 130963 138E-03 NT2RP4002075
proteína similar a la forbolina MDS019 -1.11756 2.83853 0.503523 1.59E-02 ARNM de H. sapiens para la proteína KIAA1409, cds 0.368334 2.8009 -1.03191 1.78E-02 parciales. /PROD= proteína KIAA1409
ARNm del H. sapiens; ADNc DKFZp434D0818 (de -2.63427 1.64513 -0.3056 2.52E-02 clon DKFZp434D0818)
ESTs 0.35393 5.14775 3.74875 3.16E-02 H. sapiens TBX3-íso proteína (TBX3-iso), ARNm. -2.34566 2.45238 1.07038 1.31E-02 /PROD= TBX3-iso protefna /FL=gb:NM_016569.1 gb:
AF216750.1
H, sapiens cromosoma 19, cósmido R31181 -0.258871 3.0636 0.223926 158E-03 ARNM de H. sapiens para GATA-6, cds completos. 2.21862 6.8609 5.34263 4.29E-02 ÍPROD= GATA-6/FL=gb:U66075.1 gb; NM_005257.1
gb: D87811.1
H. sapiens anquirina-como con transmembrana -1.10879 3.93484 2.81939 1 29E-02 dominios 1 (ANKTM1), ARNm
Receptor acoplado a proteína G 49 0.265509 4.46257 2.50537 2.19E-02 H. sapiens factor de diferenciación del crecimiento 3 1.67253 5.34944 2.87486 8.62E-05 (GDF3), ARNm. (PROD= factor de diferenciación de
crecimiento 3 precursor
/FL=gb:NM_020634.1 gb; AF263538.1
(continúa)
T ítu lo d e gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor Pd«
DE en DE en suero DE en suero Benjamín suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
Receptor del neuropéptido Y humano (clon HSY3RR) 1,77461 6.70301 5,47995 3.00E-02 (NPYR) ARNm, cds completos. /PROD= neuropéptido Y
receptor /FL=gb:L06797.1 gb: NM_003467.1 gb:
AF025375.1 gb: AF147204.1 gb: M99293.1 gb: L01639.1
H. sapiens tipo VI colágeno alfa 2 precursor de cadena 1.7011 5.33126 2.84458 5.91 E-03 (COL6A2J ARNm, cds completos, empalmados
alternativamente. /PROD= precursor de la cadena alfa 2
de colágeno de tipo VI /FL=gb:
AY029208.1 -0.349726 3.29119 0.824929 4.11 E-03 ESTs -0.903317 1.89777 -1.36429 6.84E-03 ESTs
2.60483 7.10633 5.55242 1.41E-02 Proteina hipotética del H. sapiens FLJ10718
(FLJ10718), ARNm. /PROD= proteina hipotética
FLJ10718 /FL=gb:NM _018192.1
H. sapiens Rho GTPasa activando la proteína 6 -1.10389 1.83053 -1.28521 1.28E-02 (ARHGAP6), variante de transcripción 2, ARNm. /PROD= Rho
GTPasa activando la proteína 6 ¡soforma 2 /FL=gb:
AF022212.2 gb: NM_001174.2
estaniocalcina 1 /FL=gb:U25997.1 gb: NMJJ03155.1 gb: 2.41135 7.29563 6.14284 2.51E-02 U46768.1
Glucorfina humana HeP2 ARNm, cds parciales. -0.843493 2.71108 0.233547 2.98E-04 /PROD= glícoforina HeP2
H. sapiens ADNc FLJ12993 fis, clon 0.147259 4.12241 2.06949 6.84 E-03 NT2RP3000197
H. sapiens factor de estabilización de presenilina b (PSF) -0.86173 2.85614 0.56745 6.09E-03 ARNm, cds completos; empalmado alternativamente.
/PROD= factor de estabilización de presenilina b /FL=gb:
AY113699.1
H. sapiens glícoforina Erlk STA (GPErik) gen -1.19362 2.17108 -0.45439 1.45E-04 cds completos, /PROD= glicoforina Erlk (STA) /FL=gb:
U00178.1
Bromodominio y dedo PHD conteniendo, 3 -2.8472 1.75573 0.369397 8.62E-05 ESTs 0.784344 4.74104 2.71543 7.55E-03 ESTs -1 26251 3.4693 2.27614 3.80E-03 ESTs -1.71713 1.23763 -1.71122 2.99E-02 H. sapiens glutatlón mlcrosomal S-transferasa 2 2.06233 6.81536 5.6918 3.79E-02 (MGST2), ARNm./PROD= glutatión microsomal Stransferasa
2 /FL=gb:NM 002413.1 gb: U77604.1
H. sapiens eomesodermln (Xenopus laevls) 2,65926 6.71627 4.89839 2.76E-02 homólogo (EOMES), ARNm. /PROD= eomesodemnina
(Xenopus laevis) homólogo fFL=gb:AB031038.1 gb: NM_
005442.1
ARNM de H. sapiens para MSX-2, cds completos. 0.407211 4.11145 1.94529 1.35E-02 /PROD= MSX-2/FL=gb:D89377.1
Apollpoproteína A-ll de H. sapiens (APOA2), ARNm. -1.10237 5.10066 4.75899 1.34E-02 /PROD= precursor de apolípoprotelna A-ll /FL=gb:M29882.1
gb: NM 001643.1 gb: BC005282.1
(continua)
T ítu lo d e gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P de DE en DE en suero DE en suero Benjamini
Figure imgf000179_0001
MATRIGEL MATRIGEL mero
H. sapiens adenilato ciclasa 8 (cerebro) (ADCY8), -1.3408 1.12773 -2.26149 1.07E-02 ARNm, /PROD= adenilato ciclasa 8 /FL=gb;NM_
001115.1
H. sapiens transportador de glucosa-6-fosfato (G6PT) -0.193516 3.03064 0.407738 1.38E-03 gen, alelo G 6PT-Dt, cds completos
H. sapiens glutatión S-transferasa A2 (GSTA2), -3.10645 1.11704 -0.4221 5.37E-04 ARNm. (PROD= glutatión S-transferasa A2 /FL=gb:
BC002895.1 gb: M25627.1 gb: M16594.1 gb: M14777.1
gb: M15872.1 gb: M21758.1 gb; NM_000846.1
H. sapiens transportador de fosfato dependiente de sodio, -0.397133 2.78341 0.231961 1.11E-02 ¡soforma MaPI-llb ARNm, cds completos. /PROD= sodio
transportador de fosfato dependiente IsoformaNaPiTlb
/FL=gb:AF111856.1 gb: NM_006424.1 gb: AF146796.1
ESTs 2.77413 7.19192 5.906 3.17E-02 H. sapiens gen parcial de LHX9 para LIM-homeobox 9, -2.2486 1.64952 -0.13424 7.89E-03 3UTR.
ARNm de protelna LIPST de Interacción con LYST de H. sapiens, -0.682149 2.34271 -0.31253 9.87E-03 cds parciales. /PROD= protelna que interactúa con LYST LIP3
proteina putativa de 47 KDa -0.123937 3.2914 1.05247 3.72E-03 H. sapiens protelna S (alfa) (P R O S1), ARNm. 0.577604 4.00035 1.7883 7.89E-03 /PROD= proteína S (alfa) /FL=gb:M15036.1 gb: NM_
000313.1
ESTs -1.63711 0.915477 -2.15328 1.83E-02 protocadherin 10 1.76718 5.1503 2.98569 2.52E-02 Protelna KIAA1511 0.620278 3.86886 1.57543 1.86E-03 H. sapiens ADNc FLJ 13221 fis, Clon 0.282785 3.44178 1.08178 1.31E-03 NT2RP4002075
Receptor 4 del factor de crecimiento de fibroblastos H. sapiens, -1.72385 2.26674 0.747239 6.86E-03 variante de empalme de forma soluble (FGFR4) ARNm, completo
cds /PROD= receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 4,
variante de empalme de forma soluble /FL=gb:NM_022963.1 gb:
AF202063.1
X75208 i FUNCIÓN = ods / DEFINICIÓN = HSPTKR -1.36729 2.60456 1.08204 158E-02 H.saplens HEK2 ARNm para protelna tlroslna qulnasa
receptor
ARNM del receptor de quimioclna H. sapiens CXCR4, 2.30557 6.72969 5.66933 3.31 E-02 cds completos. /PROD= receptor de qulmloquinas CXCR4
/FL=gb:AF348491.1
Protelna KIAA1415 0.185854 3.70346 1.74255 7.78E-04 ESTs -0.048335 3.11786 0.836448 129E-02 H. sapiens estanlocalclna 1 (STC1), ARNm, 2.39435 6.55737 5.28007 2.19E-02 /PROD= estaniocalclna 1 /FL=gb:U 25997.1 gb: NM^
003155.1 gb: U46768.1
ARNm de la proteína-R del grupo de alta movilidad H. sapiens, 1.04695 3.2786 0.095286 2.11 E-02 cds completos. /P R O D - proteína-R del grupo de alta movilidad
/FL=gb:AF176039.1
(continua)
T ítu lo de g e n Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P de DE en DE en suero DE en suero Benjamini suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A Hochberg en en en MATRIGEL MATRIGEL MEFS
ESTs, moderadamente similares a ENTRADA DE -1.10358 1.66331 -0.98371 3.37E-02 ADVERTENCIA DE CONTAMINACIÓN DE SECU ENCIA SB2 DE SUBFAMILIA ALU ALU4 HUMANO (H.sapiens)
H. sapiens arrestina, beta 1 (ARRB1), transcripción -0.158844 2.41791 -0.40915 1.12E-02 variante 1, ARNm. /PROD= arrestina beta 1, ¡soforma A
/FL=gb:BC003636.1 gb: AF084040.1 gb: NM 004041.2
ESTs -1.34399 1.80279 -0.44529 1.60E-03 ARNm (rumano para pro-alfa 1 (II) colágeno 3end C-term. 0.85982 4.1935 2.15657 1.09E-02 dominio no helicoidal triple helicoidal y C-terminal.
/PROD= pro-alfa 1 (II) colágeno (313 AA; AA 975-271c)
/FL=gb:NM_001844,2
Proteína hipotética del H. sapiens DKFZp564B052 1.47773 4.42479 2.00326 1.16E-03 (DKFZp564B052), ARNm. /PROD= proteina hipotética
DKFZp564B052 /FL=gb:NM_030820.1
Testículo mejorado transcripción génica (inhibidor de BAX 1) -0.695228 2.99328 1.31679 1.17E-03 H. sapiens fasdculación y alargamiento de la proteina zeta. 1.86433 4 71354 2.20315 8.62E-05 1 (zygin I) (FEZ1), variante de transcripción 1, ARNm.
/PROD= zygin 1, isoforma 1 /FL=gb:U60060.1 gb:
U69139.1 gb: NM_005103.2
Metaloproteinasa 15 de la matriz de Fl. sapiens -0.298504 3.44582 1.8336 4.80E-03 (insertada en la membrana) (MMP15), ARNm. /PROD= matriz
preproteína de metaloproteinasa 15 /FL=gb:D 86331.1
gb: NM 002428.1
heparan sulfato proteoglicano 2 (perlecan) /FL=gb: -2.53327 0.924726 -0.97212 4.31 E-02 M85289.1 gb: NM_005529.2
H. sapiens dickkopf (Xenopus laevis) homólogo 1 0.981469 3.70716 1.09014 1.76E-03 (DKK1), ARNm. /PROD= dickkopf (Xenopus laevis)
homólogo 1 /FL=gb:AF 177394.1 gb: NM 012242.1 gb:
AF127563.1
ESTs -0.801487 3.37342 2.21393 1.22E-02 ESTs -2.57626 1.40231 0.050493 6.60E-03 ESTs 0.499579 4.10541 2.39934 4.29E-03 H. sapiens proteina ósea morfogenética 2 (BMP2), 2.04506 6.19114 5.02927 4.98E-02 ARNm. /PROD= precursor de la proteína morfogenética ósea 2
/FL=gb:NM _001200.1
ARNm de la proteína 1 de la matriz extracelular (ECM 1) humana, 0,634778 3.65829 1.37564 6.11E-04 cds completos. /PROD= matriz extracelular proteína 1
/FL=gb:NM _004425.2 gb: U65932.1 gb: U68186.1
Subfamilia de receptores nucleares Fl, sapiens 0, grupo B, -1.92783 2.32456 1.27907 2.99E-02 miembro 1 (NR0B1), ARNm. /PROD= hipoplasia suprarrenal
proteina /FL=gb:NM_000475.2
ADNc de H. sapiens: FLJ23067 fia, clon LNG04993. -2 25626 1.95987 0.882498 6.62E-03 Fl. sapiens ADP-ribosilación factor 4 similar (ARF4L), 1.63466 5.70351 4.48037 1.90E-02 ARNm. /PROD= ADP-factor de ribosilacíón 4 /FL=gb:
U25771.1 gb: L 38490.1 gb: NM_001661.1 gb:
BC000043.1
(continúa)
Título de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P de DE en DE en suero DE en suero Benjamini suero bajo AA
bajo AA Wnt- 3A bajo AA y Hochberg en en en MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens ARNm HT016, cds completos. 0.218762 3.97514 2.45222 3.37E-02 /PROD= HT016 /FL=gb;AF225426.1
H. sapiens, tropomodulína. clon MGC: 3643, ARNm, 0.348796 3.54199 1.46427 1.29E-03 cds completos. /PROD= tropomodulína /FL=gb:NM_
003275.1 gb: M77016.1 gb: BC002660.1
Proteína hipotética del H. sapiens FLJ22471 0.903825 4.65366 3.1349 2.48E-02 (FLJ22471), ARNm, /PROD= proteína hipotética
FLJ22471 /FL=gb:NM_025140.1
E5Ts -0.120583 2.94229 0.738304 7.20E-03 ESTs, moderadamente similares a la proteína JC4969 plg-c -2.39713 0.906454 -1.04495 1.69E-02 (Fl.sapiens)
H. sapiens proteína homeobox LIM 1 (LHX1), ARNm. -0.77166 2.27746 0.085559 4.26E-02 /PROD= LIM homeobox proteína 1 /FL=gb:NM 005568.1
gb: U14755.1
H. sapiens, proteína hipotética MGC2865, clon -2.43105 0.646883 -1.50617 8.27E-03 MGC: 20246 IMAGEN: 4635389, ARNm, CdS completos.
/FL=gb;BC016043.1
ESTs -2.01523 2.16773 1.12403 1.99E-02 H. sapiens oxoglutarato deshidrogenasa {lipoamida) -0.032595 2.3997 -0.38533 1.45E-02 (OGDFI), ARNm. /PROD= oxoglutarato deshidrogenasa
(lipoamida)/FL=gb:D10523,1 gb: BC004964.1 gb: NM_
002541.1
EST, débilmente similar a la proteína hipotética T32252 2.20966 5.35974 3.33255 1.12E-04 T15B 7.2 - Caenorhabdltís elegans (C.elegans)
H. sapiens, labio leporino y paladar asociado, 1.31578 3.52357 0.556735 2.92E-03 proteína transmembrana 1, clon MGC: 10593, ARNm,
cds completos. /PROD= labio y paladar hendido asociados
transmembraneproteína 1 /FL=gb:BC 004865.1
H. sapiens clon TUA8 Cri-du-chat reglón ARNm 0.09218 3.37126 1.49746 6.46E-03 H. sapiens activador transcripclonal de la c-fos, 0.666391 4.50481 3.22532 5.80E-03 promotor (CROC4), ARNm. /PROD= transcripclonal
activador del promotor c-fos/FL=gb:NM_006365.1 gb:
U49857.1
Proteína hipotética de H. sapiens FLJ21195 similar a -1.38519 2.23626 0.763963 7.36E-03 proteína relacionada con DAC y cerberus (F L J21195), ARNm.
/PROD= proteína hipotética FLJ21195sim ilara
proteína relacionada con DAC y cerberus /FL=gb:NM_
022469.1
Familia de genes homólogos de ras, miembro B /FL=gb:AF498971.1 -0.123101 2.52093 0.071885 1.86E-02 gb: NM_004040.1
Cartílago que une la proteína 1 0.879449 3.47789 0.987243 1.03E-03 H. sapiens BCL2adenovirus E 1B 19kD-lnteractuando 3.30506 6.91803 5.44746 1.79E-03 ARNm de proteína 3 (BNIP3), cds completos.
/PROD= BCL2adenovlrus E 1B proteína de ¡nteracciún de 19 kD
3 ÍFL=gb:AF002697.1 gb: NM_004052.2 gb: U 15174.1
(continúa)
Título de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento V a lo r P de DE en DE en suero DE en suero B e n ja m in i suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A Hochberg en en en MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens policitemia rubra vera 1; superficie celular -1,19629 2.40987 0.93741 9.40E-03 receptor (PRV1), ARNm. /PROD= policitemia rubra
vera 1 ; receptor de superficie celular /FL=gb:NM _020406.1 gb:
AF 146747.1
Protelna hipotética del H. sapiens FLJ11560 -0.044112 3.42017 1.80688 3.77E-03 (FLJ11560), ARNm. /PROD= proteina hipotética
F L J 11560 /FL=gb:NM _025182.1
plexina A2 0.930527 4.36203 2.74167 1.52E-02 ARNm del H. sapiens; ADNc DKFZp547H236 (de 1.37193 4.24502 2.08129 5.37E-04 clon DKFZp547H236), /PROD= proteína hipotética
H. sapiens cistatina C (argiopatia amiloide y 2.08601 5.30525 3.51965 2.20E-03 hemorragia cerebral) (CST3), ARNm. /PROD= cistatina
C (angiopatia amiloide y hemorragia cerebral)
/FL=gb:NM_000099.1
ESTs, moderadamente similares a N FY-C (H.saplens) -0.749407 2.00148 -0.24268 2.34E-03 ESTs 2.54243 5.75201 3.97307 2.60E-02 Hial sapiens sialiltransferasa (STHM), ARNm. -0.68709 2.89586 1.50348 3.70E-02 /PROD= sialiltransferasa /FL=gb:U 14550.1 gb: NM_
006456.1
H. sapiens SG2NA beta ¡soforma ARNm, cds parciales. -1.15566 1.13989 -1.53439 1.55E-02 /PROD= SG2N A ¡soforma beta
Proteína hipotética del H. sapiens FLJ12838 1.49091 4.80138 3.15205 2.63E-02 (FLJ12838), ARNm. /PROD= proteína hipotética
F U 12838 /FL=gb: NM_024641.1
ARNm portador de soluto sapiens (SLC25A18) ARNm, 0.403706 2.12385 -1.10043 1.78E-02 cds completos; Gen nuclear para producto mitocondrial.
/PROD= transportador de solutos /FL=gb:AY008285.1
Proteina KIAA0346 -1.34736 2.49605 1.41497 3.90E-03 Clon humano 23826 secuencia de ARNm 1.80782 4.07112 1.44315 2.28E-04 H. sapiens receptor tiroslna quinasa huérfano 1.53333 4.73839 3.05612 1.63E-02 receptor 2 (ROR2), ARNm. /PROD= receptor tirosina
receptor huérfano 2 similar a cinasa /FL=gb:M97639.1 gb; NM
004560.1
H. sapiens proteina de dedo de zinc asociada a MYC _g 055559 2.67075 0.511292 2.63E-02 (factor de transcripción de unión a purina) (MAZ), ARNm.
/PROD= proteina de dedo de zinc asociada a MYC
(factor de transcripción de unión a purin) /FL=gb:D85131.1 gb: NM_
002383.1
H. sapiens ADNc FLJ30081 fis, clon 0.677905 3.33728 1.12499 1.12E-04 B G G I12000693, débilmente similar a la PROTEÍNA DE
CROMATINA POLIHOMEOTICPROXIMAL.
H. sapiens alargamiento de ácidos grasos de cadena muy larga 0.099979 3.23372 1.50802 2.59E-03 (FEN1 Eio2, SUR4Elo3, levadura)-t¡po 2 (ELOVL2), ARNm.
/PROD= alargamiento de ácidos grasos de cadena muy larga
(FEN 1 EI02 , SUR4Elo3, levadura)-tipo 2 /FL=gb:NM_
017770.1
(continúa)
T ítu lo de gen T ra tam ien to Tratamiento T ra ta m ie n to V a lo r P de DE en DE en suero DE en s u e ro B en jam in i suero bajo AA b a jo A A
W nt- 3A y ba jo AA
en en en H ochberg MATRÍGEL MATRIGEL M EFS
H. sapiens hormona liberadora de tirotropina (TRH), -1.65672 1.46994 -0.25839 3.02t-02 ARNm. /PROD= hormona liberadora de tirotropina /FL=gb:
NM_007117.1
E3T, débilmente similar al empalme asociado a PTB A46302 0.894051 4.21835 2.69535 1.57E-02 factor, forma larga (H.sapiens)
Gen MLCIemb humano para miosina alcalina embrionaria 1.3489 5.11354 4.03961 1.61E-02 Cadena ligera, promotora y exón 1.
Microsemínoproteina H. sapiens, beta-(MSMB), -2.37904 1.3101 0.169915 2.46E-02 ARNm. /PROD= microsemínoproteina, beta-/FL=gb:NM_
002443,1
H, sapiens ADNc FLJf 1390 fis, don -1.12944 2.02889 0.364373 O.OOE-t-OO HEMBAI 000561, débilmente similar a PROTEINA
DE DEDO ZINC 91.
ESTs, débilmente similares a ALUS HUMAN ALU 2.76608 6.07949 4.57766 1.93E-02 ENTRADA DE ADVERTENCIA DE CONTAMINACIÓN DE SECUENCIAS DE SUBFAMILIA SX
(H.sapiens) -2.92389 0.51764 -0.85322 8.08E-03 H. sapiens ADNc FLJ13810fis, don
TH YR 01000279 1.3099 4.44525 2.76918 7.69E-03 H. sapiens, amlnolevullnato, delta, deshldratasa,
Cton MGC: 5057, ARNm, cds completos.
/PROD= amínolevulinate, delta, deshldratasa /FL=gb:
BC000977.1 gb: M13928.1 gb: NM_000031.1
H. sapiens proteina de membrana N X -17 especifica para el riñón 1.91929 5.08917 3.44968 6.91 E-03 ARNm, cds completos. íPROD= riñón especifico
proteina de membrana NX-17 /FL=gb:AF229179.1
ARNm de H. sapiens alfa 2,8-slallltransferasa, -1.10548 2.36359 1.05469 4.63E-03 cds completos. /PROD= alfa 2,8-siallltransferasa
/FL=gb:L 43494.1 gb: D26360.1 gb: L32S67.1 gb: NM_
003034,1
tlrosina 3-monooxigenasetr¡ptofano 5- 2.98486 6.17918 4.60758 8.01 E-03 Proleína de activación de monooxigenasa, polipéptldo eta
H. sapiens proteína de repetición de anqulrina cardiaca (CARP), -0.002291 3.35645 1.98688 3.44E-02 ARNm. /PROD= proteína de repetición de anquirina cardiaca fFL=gb:
NM_014391.1
H. sapiens puercoespín (MG61), ARNm. 1.51754 4.96311 3.68103 9.86E-03 /PROD= puercoespín /FL=gb:AF317059.1 gb: AF317058.1
gb: NM 022825.1
colágeno, tipo V, alfa 1 /FL=gb:D90279.1 gb: NM_ 1.5875 3.98844 1.66569 1.17E-03 000093,1 gb: M76729.1
H. sapiens caja de horquilla F2 (FOXF2), ARNm. -1.54469 1.02305 -1.11517 6.95E-03 /PROD= caja del cabezal F2/FL=gb;U13220,1 gb: NM_
001452,1
PTPRF proteina Interactiva, proteína de unión 2 (liprin beta -1.92021 3.74378 2.77277 2.10E-02 2 )
H. sapiens ARNm PR01957, cds completos, 1.68941 5.30311 4.22705 1.43E-02 /PROD= PR01957 /FL=gb:AF116676.1
(continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento T ra ta m ie n to V a lo r P de DE en DE en suero D E en s u e ro B en jam ín ! suero bajo AA
bajo AA Wnt- 3A bajo AA y
en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
Protelna hipotética del H. sapiens FLJ23514 0.564613 5.98527 5.24692 2.85E-02 (FLJ23514), ARNm. /PROD= proteína hipotética
FLJ23514 /FL=gb:NM 021827.1
ARNm del H. sapiens; ADNc DKFZp586G2120 (de -1.80897 1.69722 0.523009 2.47E-02 cion DKFZp586G2120); cds completos.
/PROD= proteina hipotética /FL=gb:AL136924.1
Clústerincl. L37033; protelna de unión a FK-506 humana 0.615619 3.478 1.66132 1.54E-02 ARNm homólogo (FKBP38), cds completo / cds =
(140,1207)/ gb = L37033 / gl = 965469 / ug = Hs. 173464
/len = 1613
ESTs -0.004009 3.63657 2.61352 4.29E-02 Apolipoprotelna Cl de H. sapiens (APOC1), ARNm. 3.24954 6.71073 5.50997 2.16E-02 /PROD= precursor de apolipoproteina Cl /FL=gb:NM_
001645.2
ESTs 1.38635 4.93112 3.83641 1.39E-02 H. sapiens ADNc FLJ34035 fis, clon -3.58002 -0.48718 -2.00751 1.46E-02 FCBBF2004788.
H. sapiens, clon IMAGEN: 3509274, ARNm, cds 0.493686 2.94923 0.794513 1.82E-02 parciales
H. sapiens putativa esterol reductasa SR-1 (TM7SF2) 1.66857 4.3767 2.47833 5.37E-04 ARNm, cds completos. /PROD= esterol reductasa putativa
SR-1 /FL=gb: AF096304.1
factor nuclear del potenciador del gen del pollpéptido ligero kappa 2.91463 6.48938 5.47812 1.97E-02 en el inhibidor de células B, alfa /FL=gb:NM_020529.1 gb:
BC002601.1 gb: BC004983.1 gb: M69043.1
protelna hipotética FLJ12666 0.215767 3.10249 1.40459 1.91E-02 Displasla ectodérmlca 1 de H. sapiens, anhldrótica (ED1), 0.796627 4.22895 3.07833 1.01 E-02 ARNm. /PROD= displasla ectodérmica 1, anhidrótlca
/FL=gb:AF060999.1 gb: NM_001399.1 gb: AF040628.1
gb: AF061189.1
glicoproteína M6A /FL=gb:D49958.1 0.274378 3.59045 2.3278 2.64E-02 ESTs 1.04714 3.87608 2.12752 3.75E-02 ESTs -1.48489 1.371 -0.35043 1.88E-03 EST, débilmente similar a la protelna KIAA1330 (H.sapiens) -0.925232 2.41149 1.18187 2.65E-03 proteína putativa de 47 kDa 0.156484 2.78771 0.861726 2.60E-02 Proteina hipotética del H. sapiens FLJ32835 -0.595622 4.84785 3.94683 3.34E-02 (FLJ32835), ARNm. /FL=gb:NM _152506.1
H. sapiens ARNm GS1999ful1, cds completos. 0.137029 2.75189 0.849942 0.00E+00 /FL=gb:AB048286,1
H. sapiens hexabrachion (tenascin C, citotactin) 3.96862 5.66572 2.85391 1.39E-02 (HXB), ARNm. /PROD= hexabrachion (tenascin C,
dtotactlna) /FL=gb:M55618.1 gb: NM _002160.1
H. sapiens Plg10 (PIG10) ARNm, cds completos. 0.129454 2.86013 1.09765 1.16E-03 /PROD= Pig10 /FL=gb:AF059611.1 gb: AF010314.1 gb:
NM_003633.1 gb: BC000418.1 gb: AF005381.1
(continua)
Título de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P de DE en DE en suero DE en suero Benjamini suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en en MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens annexin A6 (ANXA6), variante de transcripción 1, 3.89026 6.43752 4.49981 8.81 E-04 ARNm. /PROD= anexina VI isoforma 1 /FL=gb:D 00510.1
gb: J03578.1 gb: NM_001155.2
H. sapiens c-mer protooncogénico tirosina quinasa 1.78994 4.92901 3.61665 1.84E-02 (MERTK), ARNm. /PROD= protooncogén c-mer
tirosina quinasa /FL=gb:NM_006343,1 gb: U08023.1
Proteína reguladora de la apoptosis similar a caspasa H. sapiens 0.434199 5.04863 5.2167 2.46 E-02 2 (clarp) ARNm, empalmados alternativamente, cds completos.
/PROD= proteína reguladora de la apoptosis similar a caspasa 2
/Fl=gb:AF005775.1
Cadena ligera del álcali de la miosina embrionaria humana (MLC1) 1.94171 5.24959 4.11475 2.11E-02 ARNm, cds completos. /FL=gb:M36172.1 gb: M24121.1
gb: NM 002476.1
H. sapiens fosfatidilinositol-4-fosfato 5- 1.34876 4.12788 2.46657 3.66E-03 quinasa, tipo I, beta (PIP5K1B), ARNm.
/PROD= fosfatidllinositol-4-fosfato 5-quinasa,
typel, beta /FL=gb:NM_003558.1
ARNm del H. sapiens; ADNc DKF2p434E082 (de 1.36443 4.34866 2.94283 2.92E-03 clon DKFZp434E082)
Dlstrofina del H. sapiens (distrofia muscular, 1.40427 4.41881 3.04441 183E-02 Tipos Duchenne y Becker), incluye DXS142,
DXS164, DXS206, DXS230, DXS239, DXS268,
DXS269, DXS270, DXS272 (DMD), variante de transcripción
Dp427p2, ARNm. /PROD= distrofina Dp427p2 isoforma
/FL=gb:NM 004010.1
H. sapiens, clon MGC: 14801, ARNm, cds completos. 2.03928 3.96694 1.51059 5.65E-04 /PROD= Desconocido (proteína para MGC: 14801) /FL=gb:
BC005997.1
Proteína hipotética del H. sapiens BC017868 -0.290244 2.2418 0.40157 6.04E-03 (LOC159091), ARNm. /FL=gb:BC 017868.1 gb: NM_
138819.1
EST, altamente similar a la miosina AF229172 1 clase lll -0.475471 1.94826 0.002417 5.28E-03 (H.sapiens)
H. sapiens soluto portador familia 9 (hidrogeno de sodio 0.047487 2.80601 1.19645 2.80E-03 intercambiador), isoforma 5 (SLC9A5), ARNm. /PROD= soluto
familia de portadores 9 (intercambiador hidrogenado de sodio),
isoforma 5 /FL=gb:AF111173.1 gb: NM_004594.1
H. sapiens F37EI genoma codificador de leucina relacionado -0.128814 3.17069 2.10422 1.54E-02 con el cáncer esofágico (FEZ1), ARNm.
/PROD= F37EI motivo de la cremallera de genecodingleucina
relacionada con el cáncer esofágico /FL=gb:AF123659,1 gb: NM_
021020.1
H. sapiens deiodinasa, yodotironina, tipo lll (DI03), -0.136937 5.08366 4.22897 1.41E-02 ARNm. /PROD= tiroxina deiodinasa tipo lll /FL=gb:
NM_001362.1 gb: S 79854.1
(continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento V a lo r P de DE en DE en suero DE en suero B e n ja m in i suero bajo AA
bajo AA Wnt- 3A bajo AA y en en en Hochberg MATR1GEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens proteína de unión al factor de crecimiento similar 2.6126 5.13945 3.30402 9.72E-04 a la insulina 6 (IGFBP6), ARNm. /PROD= factor de crecimiento
similar a la insulina protelna de unión 6 /FL=gb:BC 005007.1
gb: M62402.1 gb: BC003507.1 gb: NM_002178,1
H. sapiens U2 pequeña ribonucleoproteína nuclear -0.821533 1.81533 0.096512 4.72E-02 factor auxiliar (65kD) (U2AF65), ARNm. /PROD= U2
Factor auxiliar de la ribonucleoproteína nuclear pequeña (55kD)
/FL=gb:NM _Q07279.1
Protelna hipotética del H. sapiens DKFZp434F0318 -1.11464 1.81375 0.394686 9.09E-03 (DKFZP434F0318), ARNm. /PROD= proteína
hipotética DKFZp434F0318 ÍFL=gb:NM 030817.1
H. sapiens ARNm de BACE para la división de APP de sitio beta 0.48553 3.13284 1 44588 4.99E-04 Enzima I-476, cds completos. /PROD= APP de sitio beta
enzima de escisión i-476 fFL=gb:AB 050436.1
ESTs, débilmente similar a ALUC_HUMAN !!!! Clase ALU 1.07951 4.06134 2.7193 2.11 E-02 C ENTRADA DE ADVERTENCIA !!! (H.sapiens)
ARNM de H. sapiens para la proteina KIAAQ876, cds parciales. -0.432037 1.97736 0.073246 3.37E-02 /PROD= proteina KIAA0876
ARNm de H. sapiens para la proteína tírosina quinasa, 0.160986 2.75713 1.04172 2.11E-02 cds completos. /PROD= proteina tírosina quinasa /FL=gb:
U05682.1 gb: D 17517.1 gb: D50479.1
Producto gen KIAA0418 -0.677643 1.83134 0.034385 1.45E-04 H. sapiens foslofructoquinasa, hígado (PFKL), 2.039 4.51747 2.70388 1.28E-03 ARNm. /PROD= fosfofructoquinasa, hígado /FL=gb:NM_
002626.1 gb: BC004920.1 gb: X15573.1
H. sapiens enolasa 2 (gamma, neuronal) (EN02), 2.60624 5.37458 3.92621 3.17E-03 ARNm. /PROD= enolase 2, (gamma, neuronal) /FL=gb:
NM 001975.1 gb: BC002745.1 gb: M22349.1
H. sapiens AD036 ARNm, cds completos. -0.503334 2.65787 1.60278 3.61 E-02 /PROD= AD036 /FL=gb:AF260333.1
ESTs -2.07933 1.00157 -0.1307 2.39E-02 H. sapiens queratina 19 (KRT19), ARNm. 3.80582 6.96535 5.91937 2.11 E-02 /PR O D- queratina 19 /FL=gb:NM_002276.1 gb:
BC002539.1
Adenoma pleiomorfo similar al gen 1 /FL=gb:U72621,3 -0.646793 1.88692 0.221481 4.21 E-03 H. sapiens, similar a la proteína lipasa, clon MGC: -1.16073 1.9994 0.961706 1.89E-02 2843, ARNm, cds completos. /PROD= Similar a la lipasa
proteína/FL=gb:NM_020676.1 gb: BC001698.1
Clúster incl. ABQ02344: ARNm humano para KIAA0346 2.15679 4.91332 3.47797 7.39E-03 gen, cds parcial / cds = (0,4852) / gb - AB002344
I g¡ = 2280479 /ug=Hs.103915 1 len = 6121
Clúster íncl. N80935: zb07g06,s1 ADNcde H. sapiens, 2.12419 4.48236 2 66555 1.50E-02 3 end / clon = IMAGE-301402 / clone end = 3 / gb = N80935
/ g¡ = 1243636 /ug=Hs.22483 / len = 527
triptasa, alfa 2.99108 5.46095 3.76442 1.31 E-03 EST, débilmente similar a Z132_PROTEINA HUMANA 1.04865 3.65906 2.12166 2.43E-02 DE DEDO DE ZINC 13 (H.sapiens)
(continúa)
ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento V a lo r P de DE en DE en suero DE en suero B e n ja m in i suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens núcleo histona macroH2A2.2 1,67293 4.73906 3.66212 3.62E-02 (MACROH2A2), ARNm. /PROD= hisiona central
macroH2A2.2 /FL=gb:AF151534.1 gb: NM 018649.1
ESTs -0.146413 2.69334 1.39451 1.02E-02 ARNM rho GDI humano, cds completos. /PROD= humano 0.019358 1.75075 -0.65155 1.85E-02 rho GDI /FL=gb:M97579.1 gb: D 13989.1 gb: NM_
004309.1
choque térmico 90kD protelna 1, alfa 1.69225 4.20576 2.60887 2.10E-02 H. sapiens BTB (POZ) dominio que contiene 2 (BTBD2), 1.10085 3.7628 2.32464 1.85E-02 ARNm. /PROD= BTB (POZ) dominio que contiene 2 /FL=gb:
NM_017797.1
H. sapiens mandaselina deforma larga ARNm, cds -0.148053 2.58361 1.2296 1.57E-02 completos/PROD= mandaselina de forma larga / FL = gb:
AY 048775.1 transductor de señal y activador de la -0.837261 1.90254 0.560225 8.83E-04 transcripción 3 (factor de respuesta de fase aguda)
Complejo de antigeno 6 de llnfocltos H. sapiens, locus E 0.866364 4.91832 4.92642 2.78E-02 (LY6E), ARNm. /PROD= complejo antlgeno llnfocltlco 6,
locus E /FL=gb:U42376.1 gb: NM 002346.1 gb:
U5614S.1
ESTs -1.24632 1.09042 -0.61316 4.05E-02 H. sapiens, clon IMAGEN: 4047715, ARNm. -2.50816 1.81 1.52693 2.63E-02 Clústerincl. AB002344: ARNm humano para KIAA0346 1.89578 4.61333 3.31717 1.12E-02 gen, cds parcial / cds = (0,4852) / gb = AB002344
/ g¡ = 2280479 /ug=Hs.103915 / len = 6121
H. sapiens chamuscado (Drosofila) (erizo de mar 4.23317 6.74774 5.25403 5.12E-03 Como homólogo fascinante) (SNL), ARNm. /PROD= chamuscado
(Drosofila) (como el erizo de mar, fascomomólogo) /FL=gb:
BC000521.1 gb: NM _003088.1 gb: U03057.1 gb:
U09873.1
ARNm del H. sapiens; ADNc DKFZp586L0120 (de -2.72593 1.58998 1.27994 4.54E-02 clon DKFZp586L0120).
Proteína quinasa 10 activada por mitógeno H. sapiens 0.647994 3.46459 2.28644 6.65E-03 (MAPK10), ARNm. /PROD= proteína activada por mitógeno
quinasa 10 ÍFL=gb:U 07620.1 gb: U34819.1 gb: U34820.1
gb: NM_002753.1
ARNm de la tiroslna quinasa transmembrana de H. sapiens, -0.006089 2.96035 1.93237 7.69E-03 cds completos./PROD= tiroslna quinasa /FL=gb:L 08961.1
ARNm del H, sapiens; ADNc DKFZp762H185 (de 2.83663 5.30784 3.79206 6.22E-03 clon DKFZp762 H 185)
tirosina 3-monooxigenasetriptofano 5- 3.48271 6.19368 4.92556 2.11E-02 Proteína de activación de monooxigenasa, polipéptido eta
ARNm del H. sapiens; ADNc DKFZp434K0621 (de 0.581419 3.38088 2.21428 3.89E-02 clon DKFZp434K0621); cds parciales
ESTs, débilmente similar a ALUF_HUMAN !!!! CLA SE ALU -1.03247 1.75349 0.587598 2.11E-02 F ADVERTENCIA ENTRADA II! (H.saplens)
asociado de repetición de tudor con PCTAIRE 2 2.15771 4.69127 3.27451 2.63E-02 (continúa)
ítu lo de g e n Tratamiento Tratamiento Tratamiento V a lo r P d i DE en DE en suero DE en suero B e n ja m ín suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
ARNm del H. sapiens; ADNc DKFZp564K1672 (de 4.49405 7.38448 6.33474 1.39E-02 don DKFZp564K1672); cds parciales.
/PROD= protelna hipotética
ESTs -0.184212 2.15367 0.554696 1.15E-02 H. sapiens bHLH factor Hes4 (LOC57801), ARNm. 0.47816 3.40725 2.40001 3.16E-02 /PROD= factor bHLH Hes4 /FL=gb;NM _ 021170.1 gb;
AB048791.1
H. sapiens guanilato ciclasa activador IB (retina) -0.714216 1.95339 0.684983 3.38E-03 (GUCA1B), ARNm. /PROD= activador de guanilato ciclasa
1B (retina)/FL=gb:M95174.1 gb; NM_002098.1 gb:
M97496.1
Proteína KIAA0918 -1.39708 0.961939 -0.57499 1.40E-02 ARNM de H. sapiens para la protelna KIAA1161, cds parciales. 0.781796 3.32846 1.98143 6.60E-03 /PROD= proteina KIAA1161
H. sapiens, slmilara la protelna B9, clon MGC: 11339, 1.43881 3.80457 2.29205 8.62E-05 ARNm, cds completos. /PROD= Similar a la proteina B9
/FL=gb:BC 002944.1
proteina hipotética FLJ12666 2.34087 5.11201 4.02837 1.97E-02 H. sapiens forma corta de la protelna inhibitoria tipo FLICE 0.135783 4.45631 4.92758 1.96E-02 ARNm. cds completos. fPROD= inhibidor tipo FLICE
forma corta de proteina /FL=gb:U 97075,1
H. sapiens receptor olfativo, familia 52, subfamilia A, -0.309574 2.08723 0.636487 4.36E-03 miembro 1 (OR52A1), ARNm, /PROD= receptor olfativo,
familia 52, subfamilia A, miembro 1 /FL=gb:NM_012375.1
Secuencia deADN humano del clon RP4-781L3en 2.82768 5.54517 4.43909 2.04E-03 cromosoma 1 p34,3-36.11 contiene un pseudogen
similar a IFITM3 (¡nterferón inducida por transmembrana)
proteína 3 (1-8U), STSs y GSSs
Producto del gen KIAA0127 de H. sapiens (KIAA0127), 2.05236 4.43794 3.00216 3.12E-02 ARNm. /PROD= producto genético KIAA0127 /FL=gb:
D50917.1 gb: NM_014755.1
H. sapiens clon clon HB-2 ARNm secuencia -0.503949 2.27896 1.25171 3.01 E-02 proteina hipotética FLJ23091 -0.76092 3.70916 3.04154 2.45E-02 ESTs -0.403665 2.01868 0.643615 5.11E-04 ESTs 2.14401 4.70353 3.47114 3.15E-03 H. sapiens regulador de la señalización de ía protelna G 5 (RGSS) 3.0091 5.37511 3.95132 1.29E-03 ARNm, cds completos, /PROD= regulador de la proteina G
señalización 5 (FL=gb:AF493929.1
receptor de endotelina tipo A/FL=gb;NM _001957,1 gb: -1.83423 2.54948 1.95432 1.51 E-02 L06622.1
Cadena ligera de miosina embrionaria esquelética H,sapiens 1 0.690058 3.3896 2.36018 3.27E-02 (M LC1) ARNm. /PROD= miosina cadena ligera 1
H. sapiens Factor Kruppel 8 (KLF8), ARNm. 0.326119 2.825 1.63929 3.92E-02 /PROD= Factor Kruppel 8 /FL=gb:U 28282.1 gb: NM_
007250.1
protelna hipotética DKFZp434F2322 0.070576 2.58185 1.42121 5.81 E-03 (continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento T ra ta m ie n to V a lo r P de DE en DE en suero D E e n s u e ro B e n ja m in i suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en on
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens factor de transcripción 2, hepático; LF-B3; -1.12537 3.45355 2.54347 1.15E-02 factor nuclear hepático variante (TCF2), variante de transcripción
a, ARNm. /PROD= factor de transcripción 2, isoforma a
/FL=gb:NM 000458.1
Familia de histonas H2A, miembro X 1.37085 2.48515 -0.04057 1 34E-02 H. sapiens H1 familia de histonas, miembro X (H1FX), 3.21701 5.68105 4.50969 4.29E-03 ARNm. /PROD= familia de histonas H1, miembro X /FL=gb:
D64142.1 gb: BC000426.1 gb; NM_Q06026.1
EST, débilmente similar a la proteína KIAA1399 (H.sapiens) -0.831241 2.82364 2.79997 4.18E-02 ARNM de H. sapiens PNAS-145, cds completos. 2.84962 5.38084 4.2868 8.61 E-03 /PROD= PNAS-145 /FL=gb:U03105.1 gb: NM 006813.1
gb: AF279899.1
H. sapiens banda de proteina de membrana de eritrocitos 4.9 -0.306603 2.11391 0.923806 4.81 E-03 (dematin) (EPB49), ARNm. /PROD= eritrocitos
banda de proteina de membrana 4.9 (dematin) /FL-gb:NM_
001978.1 gb: U28389.1
ESTs 0.783545 3.23146 2.07738 2.13E-02 ESTs 1.17515 3.61815 2.46265 1.56E-03 tipo nudix (resto X unido a difosfato de hucleósido) 2.09472 5.82355 5.68859 3.63E-02 motivo 4
Nuevo ARNm humano del cromosoma 22, -0.533665 3.44679 3.05803 3.99E-02 /PROD= proteína hipotética
ARNm parcial del H. sapiens para el factor nuclear putativo. 1.55224 3.89366 2.67866 1.53E-03 (PROD= factor nuclear putativo /FL=gb:NM_017688.1
H. sapiens BCL2adenovirus proteína 3 que interactúa 4.51142 6.99506 5.92755 2.25E-03 con E1B 19kD (BNIP3), gen nuclear que codifica proteina
mitocondrial, ARNm. /PROD= BCL2adenovirus proteína 3
que ínteractúa con E1B 19kD /FL=gb:AF002697.1 gb: NM_
004052.2 gb: U15f74.1
H. sapiens proteina ósea morfogenética 5 (BMP5), -0.6099 1.76351 0.614791 6.46E-03 ARNm. /PROD= proteina morfogenética ósea 5 /FL=gb:
M60314.1 gb: NM_021073.1
H, sapiens subfamilia de receptores nucleares 0, grupo B, -0.213822 4.14059 3.29782 3.42E-02 miembro f (NR0B1), ARNm. /PROD= hipoplasia suprarrenal
proteína /FL=gb:NM 000475.2
ARNm del H. sapiens; ADNc DKFZp434P228 (de 1.76846 4.196 3.11284 1.23E-02 clon DKFZp434P228)
H. sapiens factor de transcripción similar a piiín (PILB). 3.14467 5.51066 4.38212 3.80E-03 ARNm. /PROD= factor de transcripción tipo pilin /FL=gb:
A F 122004.1 gb: NM 012228.1
Componente 5 del complemento H. sapiens (C5), ARNm. -1 89639 1.65637 1.59643 1.74E-02 /PROD= componente de complemento 5 /FL=gb:M57729.1
gb: NM_001735.1
H. sapiens complejo de proteínas relacionadas con el -0.208283 2.17404 1.07398 1 39E-02 adaptador 3, beta 2 subunidad (AP3B2), ARNm. /PROD=
relacionado con el adaptador
complejo de proteínas 3, subunidad beta 2 (FL=gb:AF022152.1
gb: NM JXM644.1 gb: U37673.1
(continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P de DE en DE en suero DE en suero Benjamini suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H, sapiens dineina, axonema, polipéptido ligero 4 0.458271 2.88755 1.8494 3.66E-03 (DNAL4), ARNm. /PROD= dineina, axonema, luz
polipéptido 4 /FL=gb:BC002968.1 gb: NM 005740.1
H. sapiens, similar al ADNc de RIKEN C330013D18 0.087468 2.45867 1.42701 3.35E-03 gen, clon MGC: 11226, ARNm, cds completos
ADNc de H. sapiens: FLJ22731 fis, clon HSI15841. -2.30948 1.62817 2.24143 4.15E-02 ESTs 0.532996 4.6172 3.79228 2.76E-02 El gen CXCR4 de H. sapiens codifica e¡ receptor CXCR4 3.11086 7.24917 6.36084 3.13E-02 estaniocalcina 1 2.48686 6.20245 5.70081 4.94E-02 Proteína KIAA0761 -2.09591 1.57935 1.05907 1.86E-02 ESTs -1.16374 2.24964 2.52108 3.83E-02 H. sapiens ADNc FLJ36116 fis, clon 3.02587 6.7146 6.15456 3.88E-02 TESTI2022338.
H. sapiens, clon MGC: 24252 IMAGEN: 3932604, -1.53346 2.53854 1.59251 3.91 E-03 ARNm, cds completos. /PROD= Desconocido (proteína para
MGC: 24252) /FL=gb:BC014364.1
H. sapiens ADNc F L J13392 fis, clon -1.90184 1.76129 1.16856 1.47E-02 PLACE1001280
Protelna hipotética de H. sapiens FLJ 12538 similar a 1.70617 5.11419 4.73391 2.71 E-02 proteina relacionada con ras RAB17 (FLJ12538), ARNm,
/PROD= proteína hipotética FLJ12538 similar a la proteína
relacionada con toras RAB17 /FL=gb:AL136645.1 gb: NM_
022449.1
Secuencia de ADN humano del clon R P 11 -446H13 en el -0.889422 2.90076 2.11955 3.52E-02 cromosoma 10. Contiene el extremo 3 del gen para una
nueva proteína similara KIAA1059 (ortólogo de la
proteína del receptor dei dominio V PS10 de ratón SORCS),
un pseudógeno RPL23A (60S ribosmal protelna 23A), STSs un
H. sapiens calmegin (CLGN), ARNm. -0.104278 2.97817 3.11092 1.89E-02 /PROD= calmegin /FL=gb:NM_004362.1 gb: D86322.1
H. sapiens testican 3 (HSAJ1454), ARNm. -2.81226 0.7939 1.55068 3.99E-02 /PROD= testican 3 /FL=gb:NM_016950.1 gb;
BC000460.1 gb: BC003017.1
H. sapiens gelsolina (amiloidosis, tipo finlandés) 1.6198 4.54047 445008 1.07E-02 (GSN), ARNm. /PROD= gelsolina (amiloidosis,
tipo finlandés) /FL=gb:NM_000177.1
Receptor de endotelina H. sapiens tipo A (EDNRA), 0.763007 4.05983 3.55203 3.99E-02 ARNm. /PROD= receptor de endotelina tipo A /FL=gb:NM_
001957.1 gb: L06622.1
ADNc de H. sapiens: FLJ22808 fis, clon KAIA2925. -0.367449 2.7584 2.41394 4.31 E-02 Proteína hipotética de H. sapiens FLJ10312 1.59498 4.6335 4.89157 4.85E-02 (Fl_110312), ARNm. /PROD= protelna hipotética
FLJ10312 /FL=gb:NM _030672.1
ARNm de lipasa de H. sapiens, cds completos. -2.2131 1.0208 0.55849 3.57E-02 /PROD= lipasa /FL=gb:AF225418.1
donde H. sapiens FLC1492 ARNm de PR 03121, -0.300037 -0.46894 -3.39203 1.80E-02 cds completos. /PROD= PRQ3121 /FL=gb:AF130082.1
(continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento T r a ta m ie n to V a lo r P de DE en DE en suero D E e n s u e ro B e n ja m in i suero bajo AA bajo AA V bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
proteasa, serina, 4 (tripsina 4, cerebro) -0.345569 2.86256 3.35886 4.65E-02 H. sapiens protema de dedo ret 2 (RFPL2), ARNm. -2.15511 1.1797 0.503917 1.94E-02 /PROD= ret protein 2 /FL=gb:NM _006605.1 ARNm de
H. sapiens beta3GalNAcT-1 para sintasa -2.73257 0.21269 -0.0984 2.48E-02 de globósido, cds completos, clon: tipo 2, /PROD=
sinteíasa de globos!de /FL=gb:AB 050856.1
H. sapiens protelna hipotética F L J 11155 -3.34565 -0.42738 -0 71255 3.07E-02 (FLJ11155), ARNm. /PROD= proteína hipotética
F L J11155 /FL=gb:NM 018342,1
H. sapiens, especificidad dual fosfatasa 4, clon 2.11487 5.16681 5.60057 3.11E-02 MGC: 3713, ARNm, cds completos. /PROD=
fosfatasa de especificidad dual 4 /FL=gb:NM _001394.2 gb:
BC002671.1 gb: U48807.1 gb: U 21108.1
H. sapiens MAD (madres contra drosofila 0,917516 4.29847 3.5309 2.44E-02 decapentapléjica) homólogo 6 (MADFI6), ARNm. /PROD= MAD
(madres contra decapentapléjica, Drosofila) homólogo
6/FL=gb:U59914.1 gb: NM_Q05585.1
proteína 1 relacionada con frizzled secretada 1 /FL=gb:AF056087 1.64933 4.41286 4.21799 4.12E-02 gb: NM JM 3012.2 gb: AF017987.1 gb: AF001900.1 ARNm de ia
protelna 2 relacionada con apoptosis secretada por H. sapiens 3.18446 5.9316 5.74251 3.31 E-02 (SARP2), cds completos, /PROD=
proteína 2 relacionada con la apoptosis secretada /FL=gb: ■
AF056087.1 gb: NM _003012.2 gb: AF017987.1 gb: AF001900.1
KIAA0882 proteina 2.05587 4.63577 4.67451 4.89E-02 H. sapiens nudix (fracción de nucleósido difosfato ligada 3.91519 6.54632 6.42767 4.63E-02 X) -tipo Motif 4 (NUDT4), ARNm. /PROD= nudix
(fracción X del nucleósido unida al motivo X), motivo 4
/FL=gb:NM_019094.1 gb: AF191653.1 gb: AF191649.1
gb: AF191650.1
ADNc de H. sapiens FLJ31061 fis, clon -1.30452 2.06218 1.20749 1.72E-02 HSYRA2000927. ARNM de
H. sapiens difosfosinositol polrfosfato 2.62612 5.53515 5.12935 3.96E-02 fosfohidrolasa tipo 2 (NUDT4),
cds completos. /PROD= dlfosfolnositol polifosfato
fosfohidrofasetipo 2 beta /FL=gb:NM 019094.1 gb:
A F 191653,1 gb: A F 191649.1 gb: A F 191650.1
H. sapiens fitina (TTN), ARNm. /PROD= tirina /FL=gb: -0.466154 2.46856 2.00309 4.18E-03 NM_003319.1
carboxipeptidasa E /FL=gb:NM 001873.1 2.72316 5.80072 5,15668 2.99E-02 ESTs -1.80443 0.692933 0.613229 1.46E-03 proteína hipotética de H. sapiens FLJ39502 -1.60435 1.6149 2.4204 2.10E-02 (FLJ39502), ARNm. /FL=gb:NM _173648.1
Antígeno de tumor renal de H. sapiens (FtAGE), ARNm. -0.305406 2.4556 2.09136 3.30E-02 /PROD= antígeno del tumor renal /FL=gb:NM_014226,1 gb:
AB022694.1
T-box 3 (síndrome mamarlo cubital) -1.70952 1,31576 0.679584 1.29E-02 (continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento V a lo r P de DE en DE en suero DE en suero B e n ja m in i suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A
en en en Hochberg MATRIGEL MATRIGEL MEFS
Proleína quinasa quinasa quinasa 8 activada por mitógeno -1.14241 1.82177 1.23928 2.48E-02 de H. sapiens (MAP3K8), ARNm. /PROD=
protelna quinasa quinasa quinasa 8 activada por mítógenos
/FL=gb:NM_005204.1 gb: D14497.1
H. sapiens enoil-coenzima A, hidratasa3- 0.226733 3.18231 2.59938 6.22E-03 hidroxiacil Coenzima A deshidrogenasa {EHHADH),
gen nuclear que codifica la proteína mitocondrial, ARNm.
/PROD= enoil-coenzima A, hídratasa3-hidroxiacilo Coenzima A deshidrogenasa /FL=gb:NM_
001966.1 gb: L07077.1
ESTs 1.65525 3.9984 3.98375 1.97E-02 H. sapiens proteína relacionada con frizzled secretada 1 3.91678 7.18429 6.24313 2.35E-02 (SFRP1), ARNm. /PROD= proteina relacionada con frizzled
secretada 1 /FL=gb:AF056087.1 gb: NM_003012.2 gb:
AF017987.1 gb: AF001900.1
ESTs 2.28659 5.21675 4.59884 3.11E-02 Selenoproteína Pde H. sapiens, plasma, 1 (SEPP1), 2.73332 5.13625 5.04138 1.75E-02 ARNm. /PROD= precursor de selenoproteína P /FL=gb:NM_
005410.1
protelna hipotética FLJ12838 /FL=gb:NM_024641.1 2.21522 5.4785 4.50835 4.55E-02 ARNm de H. sapiens; ADNc DKFZp761M1216 (del -2.59761 0.092924 -0.31569 4.19E-02 clon DKFZp761M1216)
ARNm de H. sapiens KPL1 (KPL1), cds completos, -0.08886 2.51294 2.15967 1.97E-02 /PROD= KPL1 /FL=gb:AF081583.1 gb: U89715.1 gb:
NM_021200.1
H, sapiens, sarcoma sinovial, punto de ruptura X 1, clon -1.57209 1.39869 2.12662 6.84E-03 MGC: 5162, ARNm, cds completos. /PROD=
sarcoma sinovial, punto de quiebre X 1 /FL=gb:
BC 001003.2 gb: NM_005635.1
H. sapiens, similar a testican 3, clon MGC: 8506, -2.778 0.563149 1.66935 1.87E-02 ARNm, cds completos. /PROD= Similar a testican 3
/FL=gb:NM_016950.1 gb: BC00Q460.1 gb: BC003017.1
ESTs 0.502949 3.0682 2.72874 2.02E-02 H. sapiens ADNc FLJ32963 fis, clon 1.49644 3.87336 3.68478 6.89E-03 TESTI2008405.
Itiadin /FL=gb:U18985.1 gb: -1.61408 0.713083 0.566175 1.87E-02 NM_006073.1 ARNm de H. sapiens adlican, cds completos. 0.872786 3.20404 3.02406 4.21 E-02 /PROD= adlican /FL=gb:AF245505.1 ARNm de midkina
humano, cds completos. /PROD= midkina 3.55275 5.93819 5.68363 1.89E-02 /FL=gb:NM_002391.1 gb: M69148.1
H. sapiens, sarcoma sinovial, punto de ruptura X 4, clon -0.806785 1.90972 2.5215 4.17E-02 MGC: 12411, ARNm, cds completos. ÍPROD=
sarcoma sinovial, punto de quiebre X 4 /FL=gb:BC 005325,1
ESTs -3.61193 -0.9408 -1.53439 2.43E-03 ESTs -0.619714 1.93617 1.44843 4.14E-02 ESTs 0.446983 3.14315 2.48676 1.98E-02 (continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P de DE en DE en suero DE en suero Benjamini suero bajo AA bajo AA
bajo AA Wnt- 3A
en en en Hochberg MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens flavina que contiene monooxigenasa 5 -0.476203 1.99948 1.55491 3.73E-02 (FMOS), ARNm. /PROD= flavina que contiene
monooxigenasa 5 /FL=gb:L 37080.1 gb: NM 001461.1
H. sapiens ARNm de aminopeptídasa A, cds complelos. -0.758987 2.07596 1.20831 3.00E-02 /PROD= aminopeptídasa A /FL=gb:L12468.1 gb: NM_
001977.1 gb: L 14721.1
proteina hipotética de H. sapiens DKFZp761FI1710 -0.713164 2.03145 1.24823 2.17E-03 (DKFZP761FI1710), ARNm. /PROD= proteina
hipotética DKFZp761 H1710 /FL=gb:NM_031297.1
ESTs -1.94194 0.608912 0.013238 1.72E-02 H. sapiens sialiltransferasa 8 (alfa-2, 8- -1.07243 1.83889 0.855205 2.16E-02 polisialitransferasa) D (SIAT8D), ARNm.
/PROD= sialiltransferasa 8 (alfa-2,8-palisialitransferasa) D/FL=gb:NM 005668.1 gb:
L41680.1
H. sapiens, don IMAGEN: 5194204, ARNm. -2.13256 0.383746 1.02639 4.55E-02 proteína hipotética MGC4342 /FL=gb:NM_024329.1 -0.403018 2.01722 1.41263 1.97E-02 gb: BC003033.1
H. sapiens PHD dedo proteina 1 (PHF1), 0.620171 2.95191 2.42296 2.32E-02 variante de transcripción 2, ARNm. ,'PROD- PHD
proteina de dedo 1, isoforma
b/FL=gb:NM_024165.1 gb: AF052205.1 0.436893 3.11051 2.23625 5.44E-03 actinina, alfa 4 2.38171 4.87071 4.16957 2.90E-03 prolelna quinasa PCTAIRE H. sapiens 1 (PCTK1),
ARNm. /PROD= PCTAIRE proteína quinasa 1 / FL =
gb: NM 006201.1 0.167347 2.56439 1.93736 3.93E-02 Secuencia de ADN humano del don R P 11 -165F24 en el
cromosoma 9. Contiene el extremo 3 del gen para una
nueva proteina (similar a Drosoflla CG6630 y
C G 11376, KIAA1058, rata TRG), un pseudógeno RPL12
(proteína ribosomal L12 60S), EST, STS, GSS
y una proteína de unión al factor de crecimiento similar 0.921068 3.60279 2.67905 4.80E-02 a la insulina C...3 /FL=gb;NM_
000598.1 3.59778 6.12936 6.92649 8.62E-05 H. sapiens, clon IMAGEN: 3840937, ARNm, cds parciales
/PROD= Desconocido (proteina para IMAGEN: 3840937)
4.74364 7.09524 6.43056 2.21 E-02 H. sapiens fosfogluoomutase 1 (PGM1), ARNm.
/PROD= fosfoglucomutasa 1 /FL=gb:NM_002633.1
gb: BCQ01756.1 gb: M83088.1
apolipoproteína Cl 2.77701 5.23054 4.44049 3.39E-02 H. sapiens gen inducido por Insulina 1 (INSIG1), ARNm. 2.11462 4.44128 3.77765 3.21 E-02 /PROD= gen inducido por insulina 1 /FL=gb:NM 005542.1
ARNm de colágeno a6 (IV) humano (COL4A6), cds completos. 0.798849 3.23623 2.41372 1.38E-03 /PROD= Un colágeno de tipo IV /FL=gb:U04845.1
ARNm de H. sapiens para alfa 1,6-fucosiltranslerasa, 1.31479 3.6699 2.90742 3.48E-02 cds completos. /PROD= alfa 1,6-fucosiltransferasa
/FL=gb:AB 049740.2
EST, moderadamente similar a Six5 (M.musculus) 0.434259 2.81512 1.9556 1.23E-02 (continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento T ra ta m ie n to V a lo r P de DE en DE en suero D E e n s u e ro B e n ja m in l suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
portador del soluto familia 2 {transportador de glucosa facilitada), 5.23156 7.63734 6.74444 199E-02 miembro 3 /FL=gb:NM _006931.1 gb: M20681.1 ARNm de
la esfingomieíinasa ácida humana (ASM), 1.03965 3.45689 2.52125 2.62E-02 cds completos . /PROD= esfingomieíinasa ácida /FL=gb:NM_
0005431 gb: M59916.1
EST, débilmente similar a un producto proteico sin nombre 3.0131 541021 4.46614 4.79E-03 (H. sapiens)
H. sapiens ADNc FLJ33178 fis, clon 0.137476 -1.9718 -4.73502 223E-03 ADRGL2002753.
H. sapiens, hormona paratiroidea similar a la hormona, 2.46289 -0.34647 -1.96791 3.05E-02 clon MGC: 14611, ARNm, cds completos.
/PROD= hormona paratiroidea similar a la hormona /FL=gb:
BC005961.1
Protelna relacionada con carcinoma de colon H. sapiens
2.50614 -0.01889 -1.04926 2.52E-02 (LOC51159), ARNm. /PROD=
protema relacionada con el carcinoma de colon /FL=gb:
NM_016206.1 gb: AF099505.1
producto gen KIAA0036 3.05174 -0 66523 -2.2068 262E-02 ADNc de H. sapiens FLJ 13536 fis, clon 4.27968 1.86625 1.70965 1 11E-02 PLACE1006521
H. sapiens ADNc: FLJ22463 fis, clon HRC10126 3.68063 1.24806 1.39728 142E-02 H. sapiens UDP-N-acetilglucosamina: a-1,3-D 2.71164 0.270906 0.433883 198E-02 manósido beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa
IV-homólogo (HGNT) H), ARNm. /PROD= UDP-N
acetilglucosamina: A-1,3-D-manósido beta-1,4-N
acetilglucosaminiltransferasa IV-homolog /FL=gb:
AB024729.1 gb: NM_0
inhibidor de la vía del factor tisular 2 /FL=gb:D29992.1 gb : 4.19529 163281 1.58393 7.53E-03 L27624.1 gb: NM_006528.1 gb: BC005330.1
ESTs 2.8924 0.521234 0.762594 2 82E-02 producto genético putativo -0.518738 -0.66615 1.82038 4.91E-02 ARNm de H. sapiens para proteína KIAA1758, cds parciales. 2.42082 -0 03923 0.213473 1 25E-02 /PROD= KIAA1758 proteína
receptor de prostaglandina E 4 (subtipo EP4) /FL=gb: 2.58497 0.196846 0.527172 142E-02 L25124.1 gb: D28472.1 gb: NM_000958.1 gb: L28175.1
ADNc de H. sapiens: FLJ22463 fis, clon HRC10126
2.85068 0.473875 0.830447 1.97E-02 H. sapiens sulfato de heparano (glucosamina) 3-0
sulfotransferasa 2 (HS3ST2), ARNm. /PROD= 3.18462 0.571052 0.709206 4 54E-02 sulfato de heparano D-glucosaminil3-Q-sulfotransferasa 2 /FL=gb:
AF 105375.1 gb: AF105374.1 gb: NM 006043.1
H. sapiens schwannomin proteina interactiva 1
(SCHIP-1), ARNm. /PROD= 5.5957 3.21054 3.57915 2.11E-02 proteína interactiva de Schwannomin 1 >FL=
gb:AF145713.1 gb: NM _014575.1 Gen de
la lisil oxidasa humana (LOX), exón 7 2.11886 -0.24936 0.138069 2.55E-03 ARNm de nefropontin humano, cds completos. 7.82555 5.27856 5.06542 4.61E-02 /PROD= nefropontin /FL=gb:M83248.1
ARNm humano para el gen KIAA0386, cds completos. 3.9213 1.56305 1.13663 1.93E-02 /FL=gb:AB002384.1
(continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P di DE en DE en suero DE en suero Benjamín suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A
en en en Hochberj MATRIGEL MATRIGEL MEFS
ESTs 3.22146 0.851355 0.404487 3.41 E-03 protelna humana relacionada con patogénesis glioma (GliPR) 3.20187 0.502872 0.348681 1.34E-02 ARNm, cds completo- /PROD= protelna relacionada con la
patogénesis del glioma/FL=gb:NM__006851.1 gb: U 16307.1
ESTs 2.96697 0.440894 0.773495 1.97E-02 ADN de H. sapiens FLJ13384 fis. clon 5.9221 3.48419 3.9531 3.38E-02 PLACE1001062, muy similar al ARNm
de H. sapiens para lislna-ketoglutarato reductasa
sacacopoplna dehldrogenasa.
ARNm del H. sapiens; ADNc DKFZp76111912 (del 6.06894 3.31919 3.4798 4.97E-02 clon DKFZp761 11912)
ESTs 4.12419 1.53997 1.88239 5.68E-03 factor de crecimiento de fibroblastos H. sapiens 2 (básico) (FGF2), 5.49297 2.64534 2.76054 4.71E-02 ARNm, /PROD= factor de crecimiento de fibroblastos 2 (básico) /
FL = gb: NM_002006.1 gb: M27968.1
proteina ribosomal L34 pseudogen 1 3.45116 2.78236 5.10812 2.42E-02 VIH-1 proteína de unión a rev. 2 4.4245 1.47599 1.52824 2.10E-02 H.sapiens FG F gen. exón 3 /FL=gb:NM_000800. 1 gb: 2.04849 -0.34703 -0.95745 3.33E-02 M13361.1
ESTs 2.03304 -0.9164 -0.83676 4.19E-02 ESTs 2.87393 0.428858 1.02011 9.72E-04 H. sapiens don 23700 secuencia ARNm 4.60148 1.64243 1.72052 4.74E-02 ESTs, muy similar a S21424 nestina (H.sapiens) 3.08579 0.725853 1.40345 1.99E-02 H. sapiens actina, gamma 2, músculo (¡so, entérico 7.17155 4.15208 4.18551 4.72E-02 (ACTG2), ARNm. /PROD= actina, propéptido gamma 2
/FL=gb:NM_001615.2
protelna hipotética FLJ22833 2.80785 0.480636 1.25154 2.43E-02 H. sapiens proteina homeobox LIM 6 (LHX6), ARNm. 2.52571 -0.06036 0.459727 4.37E-02 /PROD= LIM homeobox proteina 6 fFL=gb:AB031041.1
gb: NM_014368.1 gb: AL136570.1
H. sapiens, don IMAGEN: 5271039, ARNm. 3,05576 0.189935 0.452681 4.05E-02 Proteína de unión al elemento de respuesta AMPc de H. sapiens 2.90971 0.487264 1.21334 4.24E-02 CR E-BPa (H _GS165L15.1), ARNm. /PROD= proteína
de unión al elemento de respuesta a cAMP CRE-BPa /FL=gb:
NM_004904.t gb: L05911.1
Receptor 1 acoplado a proteína G 1 /FL=gb:NM_005279.1 1.15804 -1.24345 -0.49352 2.28E-03 Neuropilina de H. sapiens (NRP) y tolloid (TLL) 1 3.25525 0.20233 0.301354 2.83E-02 (NET01), variante de transcripción 3. ARNm. /PROD= neuropilina
e ¡soforma 3 de la proteína de tipo tolloide 3precursor íFL-gb
AF448838.1 gb: NM J38966.2
ARNm de H. sapiens para la proteina KIAA0559, cds parciales. 2.37088 -0.29358 0.199028 2.81 E-02 /PROD= proteina KIAA0559
ARNm de fosfoproteina de 65 kilodalton (p65) humano, 3.25522 0.620942 1.15317 2.88E-02 cds completos. /PROD= fosfoproteina p65 /FL=gb:
M22300.1 gb: NM _002298.2 gb: J02923.1
(continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento T ra ta m ie n to V a lo r P de DE en DE en suero DE en s u e ro B en jam in i suero bajo AA
bajo AA Wnt- 3A bajo AA y en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
Secuencia de ADN humano del clon RP11-31K16 en el 4.77522 2.18971 2.77459 4.04E-02 cromosoma 9. Contiene un pseudogén de dominio de
unión a ARNsno, el gen ELAVL2 para ELAV (letal
embrionario, visión anormal, Drosofila), 2, EST, STS,
GSS y una isla CpG
proteína hipotética de la FLJ11006 1.75389 -0.66646 0.100591 7.78E-04 Homo ARNm de sapiens; ADNc DKFZp566A1046 (de 3.97344 1.32598 1.8683 3.19E-02 clon DKFZp566A1046)
ESTs 4.13356 1.60769 2.27415 1.85E-02 gen H.sapiens de PAC 106H8. 3.05906 -0.08711 -0.13845 4.34E-02 receptor de células T humanas región V reorganizada 3.43862 0.94127 1.64514 5.31 E-03 ARNm decadena beta (VDJ), cds completos. /FL=gb:M 15564.1
peptidilprolil isomerasa A (ciclofilina A) 1.76352 0.908832 3.26124 2.19E-02 ARNm H. sapiens para la proteína KIAA1597, cds parciales. 6.20675 3.06104 312403 1.78E-02 /PROD= KIAA1597 proteína
proteína 2 de unión a VIH-1 rev 3.54001 0.617783 0.325316 3.52E-02 H. sapiens nidogen 2 (NID2), ARNm. 3.39549 0.915898 1.65422 4.70E-03 /PROD= nidogen 2 /FL=gb:NM 007361.1 gb: D86425.1
ARNm de H. sapiens; ADNc DKFZp566A1046 (del 3.49826 0.859233 1.46022 3.01 E-02 clon DKFZp566A1046)
H. sapiens musculares (Drosofila) (MBNL), 3.53962 0.508166 0.298438 3.90E-02 ARNm. /PROD= muscleblind (Drosofila)/FL=gb:
NW_021038.1 gb: AB007888.1
proteína hipotética FLJ20163 5.26708 2.17148 2.01643 3.33E-02 KIAA0455 producto genético 3.25374 0.057742 -0.01612 2.66E-02 proteína hipotética FLJ22833/FL=gb:NM_022837.1 2.93229 0.533105 1.40606 3.19E-02 ESTs 2.19313 -0.32822 0.427128 1.87E-02 H. sapiens NADPH oxidasa 4 (NOX4), ARNm 5.57794 2.61602 2.28462 4.04E-02 /PROD= NADPH oxidasa 4 /FL=gb:AF261943.1 gb: NM_
016931.1 gb: AF254621 1 gb:AB0410351
ESTs 3.3266 0.840887 1.69605 0.00E+00 ESTs 1.99635 -0.56359 0.236236 1.39E-02 H. sapiens suero glucocorticoide regulado quinasa 4.81433 2.46478 347797 2.02E-02 (SGK), ARNm. /PROD= glucocorticoides de suero
regulados por quinasa /FL=gb:BC001263.1 gb: NM_005627.1 gb:
AF 153609.1
Una proteína de anclaje de cinasa (PRKA) 2 6.03149 3.65135 4.63469 1.17E-02 ESTs 3.8522 1.17894 0.483367 3.08E-02 H. sapiens similar a la proteína de tipo portador de 1.74077 -1.45032 -1 24979 5.69E-04 tricarboxilato de rata (BA108L7.2), ARNm. /PROD= similar al
portador de tricarboxilato de rata /FL=gb:NM_030971.1
H. sapiens, lectina, unión a galactósido, soluble, 3 4.53668 1.85893 2.59596 3.84E-03 (galectina 3), clon MGC: 2058, ARNm, cds completo.
/PROD= lectina, galactosido de unión, soluble, 3 (galectina
3)/FL=gb:NM_002306.1 gb: M35368.1 gb: BC001120.1
gb: M36682.1 gb: M57710.1 gb: AB00678Q.1
(continúa)
T ítu lo de gen Tratam iento Tratamiento T ra ta m ie n to V a lo r P de DE en DE en suero DE e n s u e ro B en jam in i suero bajo AA
bajo AA Wnt- 3A bajo AA y
en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
ESTs 1.06738 -1.51321 -0.67814 7.68E-03 H. sapiens carcinoma heptacelular gen nuevo-3 5.55437 3,02649 3.91576 2.22E-02 proteína (LOC51339), ARNm. /PROD= carcinoma
heptacelular nuevo gen-3 proteína /FL=gb:NM _016651.2
gb: AF251079.2
H. sapiens, similar al factor de crecimiento transformante 4.82642 2.07249 2.74019 1.03E-02 beta 1, transcripción inducida 1, clon MGC: 4078, ARNm,
cds completos. /PROD=Similar al factor de crecimiento
transformante beta 1 transcripción inducida 1 /FL=
gb:NM_015927.1 gb: BC001830.1 gb: A F116343.1
E S I, altamente similar a FXD3_PROTE ÍNA D3 BOX 3.81523 1.18624 1.98102 4.17E-02 DE HORQUILLA (H.sapiens)
ESTs 4.52094 1.70664 2.3196 2.78E-02 H. sapiens canal activado por calcio de conductancia 3.68048 0.897369 1.5433 1.32E-02 de potasio intermediado, subfamilia N,
miembro 2 (KCNN2), ARNm. /PROD= canal activado
por calcio de conductancia de potasio intermediado,
subfamilia N, miembro 2 /FL=gb:NM 021614.1
gb: AF239613.1
H. sapiens transportador similar a la levadura MRS2 5.68324 3.35483 4.46553 3.00E-03 (MRS2L), ARNm. /PROD= transportador similar a la
levadura MRS2 /FL=gb:AF288288.1 gb: NM _020662.1
H. sapiens: desintegrina y metaloproteasa 4.54713 2.07152 1.10726 5.91 E-03 (tipo reprolisina) con trombospondina tipo 1, 5
(agrecanasa-2) (ADAMTS5) ARNm. /PROD= una
desintegrina y metaloproteasa con
motivos de trombospondina-5 preproteína /FL=
gb:NM _007038.1 gb: AF14209
VIH-1 rev proteína de unión 2 proteína 3.85003 0.823769 0.407316 3.76E-02 humana similar a paratíroides (asociada con 1.73564 -1.5631 -1.41799 4.04E-02 hipercalcemia humoral de malignidad} ARNm,
cds completos . /FL=gb:J03580.1
ESTs 5.27633 2.76577 3.71542 1.39E-02 ESTs 1.7022 -1.29085 -0.81236 1.72E-02 piruvato deshidrogenasa fosfatasa /FL=gb:NM_ 6.62966 4.26189 5.37384 1.04E-03 018444.1 gb: A F155661,1
ESTs 3.90566 111378 1.80307 1.57E-02 H. sapiens DRM (DRM) de ARNm, cds completo. 6.16645 3.12369 3.57831 1.59E-02 /PROD= DRM /FL=gb:NM_013372.1 gb: A F 110137,2 gb:
AF045800.1 gb: AF154054.1
ADNc de H. sapiens: FLJ22769 fis, clon KAIA1316 2.36483 -0.5543 0.025213 1.45E-04 ESTs 4.31647 1.44801 2.11226 2.19E-02 ESTs Hs 1.24891 -1.42983 -0.57145 1.29E-02 sapiens ARNm; ADNc DKFZp586N012 {del 2.85031 0.231102 1.16439 1.08E-02 clon DKFZp586N012)
jagged 1 (síndrome de Alagille) 2.54951 0.151382 1.31733 4.46E-03 (continúa)
Título de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P de DE en DE en suero DE en suero Benjamini suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A Hochberg en en en MATRIGEL MATRIGEL MEFS
ESTs, débilmente similar a 138588 1.16209 -1.26828 -0.1187 3.40E-02 homólogo de transcriptasa inversa (H.sapiens)
proteina KIAA1339 4.41803 2.09451 3.35786 3.90E-02 ESTs 3.83407 0.892884 1.56759 8.98E-03 proteína DKFZP434D156 4.42983 2.05154 3 28988 1.60E-02 ARNm H sapiens expresada solo en las 3.84408 0.705031 1.20856 2.25E-02 vellosidades placentarias. clon SMAP41
Proteína liberadora de guanílo RAS 2 (calcio y 2.7724 0.235409 1.34452 1.96E-02 regulado por DAG)
Producto génico KIAA0164 (FL=gb:NM_014739,1gb: 4.99867 2.5327 3.72535 2.85E-02 079986.1
ARNm deH . sapiens; ADNc DKFZp761 M 0111 (del 5.14752 2.61217 3.76652 3.78E-02 clon DKFZp761 M 0111)
ARNm de H. sapiens NPD009, cds completos. 2.15383 -0.27664 0.990295 2.09E-03 /PROD= NPD009 /FL=gb:NM_020686.1 gb: AF237813.1
musclebllnd (Drosofila) /FL=gb:NM_021038.1 gb: 3.23823 0.467215 1 39628 7.60E-03 AB007888 1
ESTs 4.49318 1.35004 1.91395 3.79E-02 músculo ciego (Drosofila) /FL=gb:NM_021038, 1 gb; 1.84877 -0.57315 0.732468 8.06E-03 AB007888.1
ESTs 6.068 3.42334 4.51189 1.89E-02 ESTs. débilmente similar a un producto de proteína no 3.24528 0.740266 1.98306 3.89E-04 Identificado (H sapiens)
ARNm inhibidor de la cltóllsls del complemento humano 6.50766 4.03647 5,33533 1.77E-02 (CU), cds completos /FL=gb:J 02908.1 gb: NM_001831.1
gb: M64722.1 gb: M25915.1
ESTs 5.36759 2.42249 3,24765 3.23E-03 ESTs 0.957239 -1.43055 -0.04796 5.55E-04 transportador similar a la levadura MRS2 3.77395 1.18311 2.36844 1.83E-02 H. sapiens, similar al regulador para el homólogo de 5.09957 2.72179 4.14116 2.72E-02 resistencia rlbosómlca (S. cerevlsiae), don MGC: 2755,
ARNm. cds completos. 1PROD= Similar al regulador
para la resistencia del rlbosoma
homólogo (S. cerevlsiae) /FL=gb:BC001811.1
relacionado con SWISNF, asociado a la matriz, actlna 2.54229 -0.29226 0.695255 1.89E-02 dependiente de cromailna, subfamilia a, miembro 2 /FL=gb:
NMJJ03070.1 gb: D26155 .1
ARNm de H. sapiens; ADNc DKFZp586L2424 (de 3.34446 0.795373 2.07147 1.03E-02 clon DKFZp586L2424)
ESTs 4.63117 2.08252 3,36946 2.25E-03 H. sapiens bicarbonato proteina relacionada con transportador 3,17407 0.745852 2.17046 1.71 E-03 BTR1 de ARNm, cds completo. /PROD= proteína relacionada
con el transportador de bicarbonato BTR1 íFL=gb:AF336127.1
ESTs 1.08377 -1.27197 0.228305 4.76E-02 ESTs 2.94657 0.127188 1.20032 1.43E-02 (continúa)
T itu lo de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento V a lo r P de DE en DE en suero DE en suero B en jam in i suero bajo AA
bajo AA Wnt- 3A bajo AA y en en en Hochberg MATRIGEL MATRIGEL MEFS
ARNm del H. sapiens; ADNc DKFZp434B2016 (del 2.47798 -0.26439 0.894731 4.51 E-03 clon DKFZp434B2016).
ESTs 2.39983 -104089 -0.57976 3.37E-02 H. sapiens synaptotagmin interacciona con la proteína STIP1 2.11009 -0.57109 0.653181 1.78E-02 ARNm, cds parciales. /PROD=
proteína que interacciona con sinaptotagmina STIP1 ARNm de
H. sapiens conexina 26 (GJB2). 2.86049 -0.57377 -0.09328 4.27E-04 cds completos . /PROD= conexina 26 /FL=gb:NM _0040G4.1 gb:
M86849.2
Factor neurotrófico derivado del cerebro de H. Sapiens (BDNF), 1.71599 -0,79412 0.616733 3.09E-02 ARNm. /PROD= factor neurotrófico derivado del cerebro
/FL=gb:NM_001709.1
EST, débilmente similar a desconocido (H.sapiens) 2.33677 -0.04066 1.5217 1.87E-03 ESTs 2.57265 0.177794 1.74876 2.74E-04 ESTs 2.6809 0.209095 1.70624 1.21E-02 H. sapiens DKC1 gen, exones 1 a 11 4.18307 1.70283 3.20863 2.00E-02 H. sapiens T receptor de células de la cadena beta (TCRBV13S1- 4.45228 1.38318 2.30031 3.27E-03 TCRBJ2S1) ARNm, cds completos. /PROD=
cadena beta del receptor de células T
/FL=gb:AF043179.1 ARNm de H. sapiens PR00066. cds completos. 0.466715 -1.87679 -0.22665 4.25E-03 /PROD= PR00066 /FL=gb:AF113007.1
transporte axonal de vesículas sinápticas 5.20385 2 74124 4.27648 3.33E-03 H. sapiens, similar a la ciclina M2, clon MGC: 12933 0.139313 -2.31405 -0.76333 1.46E-02 IMAGEN: 4308662, ARNm, cds completos. /PROD= Similar
a la ciclina M2 /FL=gb:BC021222.1
clon de H. sapiens CDABP0095 secuencia de 3.87201 2.7936 5.73958 9.63E-03 ARNm de H.sapiens para el homólogo de la proteína L18a ribosomal. 2.00401 0.354674 2.73013 4.70E-04 /PROD= proteína ribosomal L18a homólogo
ESTs, débilmente similar a ALU7_ENTRADA DE ADVERTENCIA 3.43639 0.843826 2.28468 3.37E-02 DE CONTAMINACIÓN DE SECUENCIA SQ DE SUBFAMILIA ALU HUMANA (H.sapiens)
H. sapiens, clon IMAGEN: 5242616, ARNm. -0.525567 -2.07832 0.406964 2.23E-02 H. sapiens ARNm C1orf24, cds completos. 5.17968 2.58724 4.04213 1.98E-04 /PROD= C1orf24 /FL=gb:AF288391.1 gb: AB050477.1
gb: NM_0220831 Clon
H. sapiens IMAGEN: 451939, secuencia de ARNm 5.15776 2 22786 3.40438 2.60E-02 H- sapiens ADNc FLJ14942 fis. don 0.682724 -2.08716 -0.74074 1.45E-02 PLACE1011185, altamente similar al ELEMENTO
DE INSERCIÓN IS1 PROTEÍNA INSB.
protema hipotética FLJ20425/FL=gb:NM_017816.1 4.23689 1.90847 3.69988 1.15E-02 gb: AL136750.1
H. sapiens 10 metaloproteinasa de matriz (estromelisina 2.28308 -0.65903 0.521586 8.87E-03 2) (MMP10), ARNm. /PROD=preproteína de metaloproteinasa
de matriz 10 /FL=gb:BC 002591.1 gb: NM_002425.1
ESTs 3.67167 2.20619 4.86553 3.16E-03 (continúa)
Título de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P de DE en DE en suero DE en suero Benjamín! suero bajo AA bajo AA y bajo AA + Wnt- 3A
en en en Hochberg MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H, sapiens prominin (ratón) 1 (PROML1), 5.46002 2.79737 4.29571 1.38E-03 ARNm. /P R G D - prominin (ratón) 1 /FL=gb:NM_
006017.1 gb: AF027208.1
ARNm de H, sapiens; ADNc DKFZp434M2415 (del 2.40278 -0.68409 0.399469 1.48E-02 don DKFZp434M2415).
Protelna hipotética de H. sapiens FLJ20701 2.1471 0.312211 2.65409 2.28E-04 (FLJ20701). ARNm. /PROD= proteina hipotética
FLJ207Q1 /FL=gb:NM _017933.1
ADNc de H. sapiens FLJ35259 fis, clon 6.79033 3.86627 5.12737 1.23E-03 PROST2004251.
Proteína hipotética de H. sapiens FLJ39553 4.0369 1.34318 2.84336 7.69E-03 (FLJ39553), ARNm. /FL=gb:NM _ 173549.1 ARNm de
glicoprotefna-2 asociada a microfibrillas humana, MAGP-2 3.89326 0.527618 1.35764 1.81E-03 cds completos. /PROD=glicoproteína-2 asociada a
microfibrillas MAGP-2 /FL=gb:NM _003480.1 gb;
U37283 1
H. sapiens proproteína convertasa subtilisinkexina tipo 3.76897 0.368734 1.17396 1.38E-02 5 (PCSK5), ARNm. /PROD= proproteína converlasa
subtillsinkexin tipo 5 /FL=gb:U56387.2 gb: NM_
006200.1
Cluster Incl. AI735391: at10e09.x1 ADNc de H. sapiens. 2.59941 0.203564 2.03637 1.12E-04 3 extremo i clon - IMAGE-2354728 / clon_extremo = 3
/ gb = AI735391 / gi = 5056915 /ug=Hs.20137 / len = 567
ESTs 2.30031 -1.01596 -0.08964 1.46E-02 factor Kruppel 4 (intestino) 3.50041 1.09954 2.95915 1.22E-02 H. sapiens inserto de longitud completa ADNc YI25A03 -1.40946 -3.04877 -0.39378 3.32E-02 ESTs 0.806666 -2.01081 -0.53076 1.91E-02 ARNm de H sapiens; ADNc DKFZp761G02121 (del 3.1892 0.012768 1.13562 1.35E-03 Clon DKFZp761 G 02121); cds parciales de
H. sapiens ARNm de TM EFF2, cds completos. ÍFL=gb: 2.28638 -0.89508 0.225546 1.21E-03 AB017269.1 gb: NM_016192.2 gb: AF179274.2 gb:
AF242222.1
H. sapiens, clon MGC: 3328, ARNm, cds completos. 3.54625 0.772486 2.30168 4.16E-02 /PROD= Desconocido (proteína para MGC: 3328) /FL=gb:
BC001745.1 gb: NM_014392.1
ESTs 2.18149 -0.58303 0.984522 2.68E-02 sinaptojanina 2 4.166 1.83143 3.84199 O.00E+00 de proteínas KIAA0367 1.5999 -1.50555 -0.26286 1.58E-02 ESTs, moderadamente similares a ALD8_ENTRADA DE 0.868185 -1.46804 0.573078 1.69E-02 ADVERTENCIA DE CONTAMINACIÓN DE SECU ENCIA SX DE SUBFAMILIA ALU HUMANA (H.sapiens)
bromodominio adyacente a dominio de dedo de zinc, 1B 1.60872 -1.12544 0.518361 2.11E-02 ARNm inhibidor de la citólisis del complemento humano (CU), 6.61592 3.91665 5.596 1.66E-02 cds completos. /FL=gb:J02908.1 gb: NM_001831.1 gb:
M64722.1 gb; M25915.1
caja de horquilla 01A (rabdomiosarcoma) /FL=gb:NM_ 5.04975 2.59802 4.53545 1.60E-03 002015,2 gb: AF032885 1 gb: U02310.1
(continua)
T itu lo de g e n Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P de DE en DE en suero DE en suero Benjamini suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A Hochberg en en en MATRIGEL MATRIGEL MEFS
ADNc de H. sapiens: FLJ22727 fis, clon HSI15054 4.88391 2.09093 3.68875 1.91E-02 cadherina 6. tipo 2. K-cadherina (riñón fetal) /FL=gb: 3.27371 0.243335 1.61199 2.74E-04 D31784.1 gb: NM_004932.1
ESTs 3.97749 0.786845 1.99803 1.73E-02 endonucleasa G similar 1 /FL=gb:ABQ20523.1 gb : NM_ 1.11519 -2.09018 -0.88324 1.69E-02 005107.1
H. sapiens ADNc FLJ13034 fis, clon 4.59641 0.64328 1.1121 1.66E-02 NT2RP3001232
secuencia de ADN humano de RP4-61404 clon en 2.91607 0.209555 1.92644 1.93E-02 el cromosoma 20q 11,1 -12 contiene la parte 3 del
gen MMP24 (metaloproteinasa de matriz 24 (insertada
por membrana)), de unión a la ITGB4BP (integrina beta 4
proteínas) gen, el extremo 3 de un gen nuevo, ef extremo 3 o...
H. sapiens, mediadora de la respuesta de colapsina proteina-5; 0.672753 -1.75265 0.250803 8.65E-03 Molécula asociada a CRMP3, clon MGC: 11247,
ARNm, cds completos. /PROD= respuesta colapsada
proteína media-5; molécula asociada a
CRMP3 /FL=gb:BC002874.1
EST, moderadamente similar a ALU7_ ENTRADA DE 2.91576 0.289656 2.10334 2.57E-03 ADVERTENCIA DE CONTAMINACIÓN DE SECUENCIA SQ DE SUBFAMILIA ALU HUMANA (H.sapiens)
ESTs, moderadamente similar a CA 1C COLÁGENO DE RATA 6.2681 1.94518 1.82747 4.12E-02 ALFA 1 (XII) CHAIN R. norvegicus) ARNm de
semíaldehído 5.2604 2.72549 4.6685 4.33E-03 sintasa de alfa-aminoadipato de H. sapiens, cds completos
/PROD= alfaaminoadipato semialdehído sintasa /FL=gb:
AF229180.1
Factor inhibitorio de Hnt sapiens Wnt-1 (WIF-1), ARNm. 1.03265 -1.51207 0.433159 8.62E-05 /PROD= Factor inhibitorio de Wnt-1 /FL=gb:AF122922.1 gb:
NM_007191.1
proteina ribosomal S 11
4.95358 2.25158 4.04683 2.98E-04 Factor de necrosis tumoral H. sapiens, proteina alfa-inducida
6 (TNFAIP6), ARNm. /PROD= necrosis tumoral 2.42729 -0.73843 0.613222 1.93E-02 factor, proteína inducida por alfa 6 /FL=gb:NM _0Q7115.1
H. sapiens potenciador peludo de escisión relacionado con
motivo 2 de YRPW (HEY2), ARNm. /PROD= potenciador 2.3848 -0.44154 1.27956 3.16E-03 peludo de escisión relacionado con YRPW motivo2
/FL=gb:NM_012259.1 gb:
A F 311884.1 gb: AB044755.1 gb: AF232238.1 gb:
AF237949.1 gb: A F173901.1
H. sapiens semenogelin semenogeíin I (SEMG1), ARNm. 0.585816 -2.46893 -0.95223 3.05E-02 /PROD= semenogelin I /FL=gb:J04440.1 gb: NM_
003007.1
H. sapiens, similar a cadherina 6, tipo 2, K-cadherina 2.38648 -0.02212 2.14359 2.59E-03 (riñón fetal), clon MGC: 1470, ARNm, cds completos
/PROD= Similar a cadherina 6, tipo 2, K-cadherina
(riñón fetal) /FL=gb:BC000019.1
(continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento T ra ta m ie n to V a lo r P de DE en DE en suero D E e n s u e r o B e n ja m in i suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en «n
MATRIGEL MATRiGEL MEFS
ARNm del H. sapiens; ADNc DKFZp434H0350 (del 2.16899 -0,56794 1.27546 3.16E-03 clon DKFZp434H0350); cds parciales.
/PROD= proteína hipotética
H. sapiens Proteína unida al receptor factor de crecimiento 14 4.2346 1.17569 2.73613 4.80E-03 (GRB14), ARNm. /PROD=proteína unida al receptor del factor
decrecimiento 14 /FL=gb:L 76687,1 gb: NM 0044901
H. sapiens, similar a la ARN polimerasa II similar a TAF5, 2.10954 -0.1313 2.24853 8.24E-04 factor asociada a p300CBP (PCAF),
65kDa, clon MGC: 46101 IMAGEN: 5551246, ARNm,
cds completos. /PROD= Similar a ARN
polimerasa II similar a TAF5, ARNm de H. sapiens asociado
al factor asociado a p300CBP {PCAF);
ADNc DKFZp761 J1324 (del 1.42404 -1.99222 -0.77126 3.21 E-02 clon DKFZp761J1324)
familia de portadores de solutos 30 (transportador de zinc), miembro 2.82535 0.288493 2.38889 0.00E+00 transportador), miembro 1
inhibidor de antizima 3.65887 0.37346 1.74912 1.86E-02 Fi. sapiens oncogén G R 01 (actividad estimulante del crecimiento 2.51473 0.107263 2.38874 7.16E-04 del melanoma, alfa) (GR01), ARNm.
/PROD= G R 01 oncogén (actividad
estimulante del crecimiento dei melanoma. alfa) /FL=gb:NM_001511.
H. sapiens proproteína convertasa subtilisinkexina tipo 4.90999 0.871309 1.52441 1.71 E-02 5 (PCSK5), ARNm. /PROD= proproteína convertasa
subtilisinkexin tipo 5 /FL=gb:U56387.2 gb: NM_
006.200,1
ESTs 0.254736 -1.96122 0.51777 4.00E-02 G-proteína gamma-12 subunidad /FL=gb:NM_018841.1 gb: 3.93653 1.06178 2.88889 5.11E-04 A F 119663.1
crecimiento polipéptido factor alfa derivado de plaquetas 3.50343 0.651246 2.50207 3.99E-03 clusterina (inhibidor de la lisis del complemento, SP-40,40, 2.88196 -0.42677 0.9712 8.48E-03 glicoproteína 2 sulfatada,
mensaje de próstata reprimida con testosterona 2, apolipoproteina J)
ESTs 2.82081 -1.69816 -1.89985 4.10E-02 H. sapiens asociado a insulinoma asociado 1 (INSM1), 2.94347 0.120494 2.02248 1.43E-03 ARNm. /PROD= asociado a insulinoma 1 /FL=gb:NM
002196.1 gb: M93119.1
LBP proteína 32 /FL=gb:NM_014552.1 gb: A F198489.1 2.68546 -0,16678 1.70626 1.87E-03 ESTs, muy similar a T42654 proteína hipotética 2.84504 0.515703 2.95379 7.92E-04 DKFZp434G1115.1 (H.papiens)
Integración 1 del virus de la leucemia de H. sapiens Friend (FLI1), 1.7744 -2.28064 -1.56765 3.14E-02 ARNm. /PROD= Integración del virus de la leucemia de Friend 1
/FL=gb:BC 001670.1 gb: NM_002017.2 gb: M98833.3
ESTs 0.846429 -2.42046 -0.91891 1.57E-02 (continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento T ra ta m ie n to V a lo r P de DE en DE en suero D E en s u e ro B e n ja m in i suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H sapiens oxidativa 3 alfa hidroxiesteroide 1.30153 -1.64227 0.196394 3.20E-03 deshidrogenasa; retinol deshidrogenasa; 3-Epimerasa hidroxiesteroide (RODH), ARNm.
/PROD= 3 alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa oxidativa,
retinol deshidrogenasa; 3-hidroximiesteroide epimerasa /FL=gb:AF016509.1 gb: Un
antígeno de histocompatibilidad menor HA-1 1.89498 -0.37136 2.15157 4.61 E-02 UDP-glucosa pirofosforilasa 2 4.26327 0.968939 2.4776 6.20E-03 H. sapiens regulador de proteína G señalización 2, 24kD 5.42952 3.05504 5.49711 1.21 E-03 (RGS2), ARNm. /PROD= regulador de la protema G
de señalización 2, 24 kD /FL=gb:L13463.1 gb: NM_002923.1
ESTs 4.49987 1.01623 2.35659 1.86E-03 ESTs 0.623422 -1,94907 0.317138 8.95E-04 ESTs 0.326084 -1.69499 1.13586 1.10E-02 ESTs 3.82952 0.673296 2.37112 3.92E-02 H. sapiens ADNc FLJ 10160 fis, clon 2.80876 -0.24405 1.56853 1.39E-02 HEMBA1003545, muy similar a PROTEÍNA POTENCIADORA
DE GEN INSULINA ISL-2.
proteína asociada con el receptor de la hormona tiroidea, 4.66717 2.01883 4.2391 4.63E-03 subunidad 150 kDa /FL=gb:NM_005119.1 gb: A F 117756.1
ESTs 2.4548 -0.3811 1.65212 4.08E-03 ARNm de H. sapiens; ADNc DKFZp667D095 (del 3.13835 0.605922 2.95511 1.53E-03 clon DKFZp667D095)
ARNm de sinaptojanina 2 de H. sapiens, cds completos. 2.94452 0.23595 2.4148 3.63E-04 /PROD= sinaptojanina 2 /FL=gb:AF318616 1
potenciador de endopeptidasa C-endopeptidasa de H. sapiens 3.37999 0.343624 2.21149 1.46E-02 (PCOLCE), ARNm. /PROD= procolágeno
potenciador de la cendopeptidasa /FL=gb:BC 000574.1 gb: NM_
002593.2 gb; AB008549.1 gb: L33799.1
ESTs 3.24495 0.925809 3.52818 1.70E-04 ARNm de H. sapiens para proteína KIAA0930, cds parciales. 3.65772 0.911608 3,09513 8.62E-05 /PROD= proteína KIAA0930
H. sapiens factor de transcripción FOXL2 1.51993 -2.14186 -0.86243 3.75E-02 (BPES), ARNm. /PROD= factor de transcripción de la horquilla
FOXL2 /FL=gb:AF301906.1 gb: NM _023067.1
ESTs 1.9867 -1.5948 -0.2171 2.81 E-03 ESTs, Muy similar a A F174600 1F-caja proteína Fbx20 3.06175 0.202953 2.35691 2.45E-02 (H.sapiens)
H. sapiens anquirina 3, nodo de Ranvier (anquirina G) 3.11644 0.101116 2.09865 2.90E-03 (ANK3), variante de transcripción 2, ARNm. /PROD= anquirina 3,
isoforma 2 /FL=gb:NM _001149.1 gb: U43965.1 Superfamilia del
receptor del factor de necrosis tumoral de H. sapiens, 2.39086 -1.04254 0.558779 1.62E-02 miembro 6 (TNFRSF6), ARNm.
/PRGD= antígeno de apoptosis (APO-1) 1 /FL=gb:NM_
000043.1 gb: M67454.1
(continúa)
T ítu lo de gen Tratamiento Tratamiento T ra ta m ie n to V a lo r P de DE en DE en suero D E e n s u e ro B e n ja m in i suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A en Hochberg en en
MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens ectoenzima degradante de hormona liberadora 1.30849 -1.50688 0.822517 4.91 E-02 de tlrotropína (TRHDE), ARNm. /PROD= ectoenzima
degradante de hormona liberadora /FL=gb:
AF126372.1 gb: N M _013381.1
ESTs 4.65711 0.915563 2.32327 6.29E-03 ARNm de H. sapiens; ADNc DKFZp564N1116 (del 2.36072 -2.02594 -1.25286 1.50E-02 clon DKFZp564N1116)
proteína semejante a la proteína placentarla 13 de H. sapiens 3.55894 0.434263 2.47085 3.48E-03 (LOC56891), ARNm. /PROD= proteina placentarla 13
protema /FL=gb:NM J 20129.1 gb; AF267852.1
H, sapiens, similar al receptor 2.05578 0.178992 3.5007 4.46E-04 huérfano 1 similar a la tlrosina qulnasa, clon MGC: 12687, ARNm,
cds completos . /PROD= Similar al receptor de tlrosina clnasa tipo
receptor huérfano 1 /FL=gb:BC 006374.1
ESTs 0.159066 -2.96514 -0.84976 3.25E-02 H. sapiens, similar a los veterinarios del virus de eritroblastosls 2.22285 -1.58562 -0.1074 2.63E-02 aviar E26 oncogene homólogo 1, clon MGC; 29755
IMAGEN: 3946751, ARNm, cds completos. /PROD= Similar
a v-ets aviar eritroblastosls vlrusE26 oncogén
homólogo 1 de /FL=gb:BC017314.1
ESTs, muy similares a dedicador de cito-kinesls 1 0.83871 -2.29829 -0.12951 1.85E-02 (H.sapiens)
ESTs 1.1465 -1.7403 0.682768 3.99E-02 ESTs 1.7466 -1.67509 0.283174 2.97E-03 ESTs, ligeramente parecidos a PMXB_ PROTElNA 2B HOMEO- 1.03192 -2.44485 -0.51457 1.87E-03 BOX DE MESODERMO HUMANO EMPAREJADO (H.saplens)
ESTs 3.22222 -0.29339 1.59904 7.36E-03 H. sapiens ADNc FLJ10561 fls, clon 2.295 -1.60823 -0.08369 3.93E-03 NT2RP2002672
H. sapiens, similar al producto del gen KIAA0441, don 1.38545 -1.60426 0.86909 2.33E-03 MGC: 45124 IMAGEN: 5578893, ARNm, cds completos.
/PROD= Similar al producto genético KIAA0441 /FL=gb:
BC036731.1
H. sapiens, clon IMAGEN: 4067166, ARNm 0.195869 -2.50507 0.276993 1.16E-03 ESTs 1.5857 -2.61787 -1.30022 1.12E-02 H. sapiens metil-CpG proteína de unión MBD2 0.490598 -3.45465 -1.70163 3.90E-03 (MBD2) ARNm, cds completos. /PROD= melil-CpG
proteica de unión MBD2 /FL=gb:NM 003.927,2 gb:
AF072242.1
proteica KIAA1151 0,642527 -2.04288 1.00885 4.09E-03 H.sapiens ARNm para la proteína de unión de ADN B-HLH. 5.43034 1.56039 3.45122 1.12E-04 /PROD= B-HLH proteina de unión a ADN /FL=gb:NM_
000474.1
H. sapiens, similar a la proteina hipotética FLJ32001, 0.520711 -1.99011 1.26899 2.63E-02 clon MGC: 39559 IMAGEN: 4828136. ARNm,
cds completos . /PROD= Similar a la proteína hipotética
FLJ32001 /FL=gb:BC 036200.1
(continúa)
Título de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento Valor P de DE en DE en suero DE en suero Benjamín! suero bajo AA bajo AA y bajo AA Wnt- 3A
en en en Hochberg MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens tumor de Wilms 1 (WT1). variante de transcripción 2.40462 -2.96375 -2.43546 1.41E-02 D, ARNm. /PROD= tumor de Wilms 1 isoterma D /FL=gb:NM_
024424.1 gb: NM_024426.1
ESTs 1.53104 -1.54553 1.37309 8.14E-03 H. sapiens, similar a cadherina 6, tipo 2, K-cadherina 2.54746 -0.69811 2,13419 1.45E-04 (riñón fetal), don MGC: 1470, ARNm, cds completos.
/PROD= Similar a la cadherina 6. tipo 2, K-cadherina
(riñón fetal) /FL=gb:BC000019.1
ESTs 0.133612 -3.77953 -1.56636 1.40E-02 expresada paternalmente 3 2.87581 -1.67669 -0.0118 2.17E-02 proteína del cristal de Hoto sapiens Charot-leyden (CLC), 3.30086 -0.41644 2.1096 2.08E-02 ARNm. /PROD= protema cristalina de Charot-Leyden /FL=gb:
NM_001828.3 gb: L01664.1
ESTs 3.26198 -0.72777 1.5682 3.16E-03 H. sapiens taquiquinina. precursor 1 (sustancia K, 2.77265 -1.02081 1.48319 4.07E-04 sustancia P, neuroquinina 1, neuroquinina 2, neuromedina L.
neurocinina alfa, neuropéptido K, neuropéptido gamma)
(TA C1). variante de transcripción beta, ARNm.
/PROD= precursor de taquiquinina 2. isoterma beta /FL=gb:U3
ARNm de PN AS-123de 1.59659 -1.46656 1.84663 3.90E-03 H. sapiens, completo cds H. sapiens proteina hipotética -0.359245 -3.46654 -0.06528 2.55E-03 FLJ20075 (FLJ20075), ARNm. /PROD= proteina hipotética
FLJ20075 /FL=gb:NM_017655.1 ARNm
del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano 2.44464 -0.5846 2.90484 3.63E-04 (PDGFRA). exones 13-16
ADNc de H. sapiens: FIJ22547 fis, clon HSI00356 4.29365 -0.10882 2.09548 1.54E-02 H. sapiens proteina H SPC156 . 0.786188 -2.32161 1.29619 8.62E-05 /PROD= proteina H SPC156 /FL=gb:NM_014178.1 gb:
A F 161505.1
ARNm de H. sapiens; ADNc DKFZp586P1124 (del 0.485642 -4.8524 -3.09356 2.02E-02 don DKFZp586P1124)
caldesmon 1 /FL=gb:M64110.1 gb: NM_004342.2 7.09236 2.67863 5.63436 7.47E-03 H. sapiens, similar a la proteina hipotética FLJ10058, 1.69808 -2.74939 0.215566 1.92E-02 clon MGC: 34305 IMAGEN: 5167647, ARNm,
cds completos , /PROD= Similar a la proteína hipotética FLJ
10058/FL=gb:8C 034293.1
H. sapiens, Similar a la proteina 8 homeoboxUM, clon -0.062884 -4.30121 -1.10961 1.16E-02 IMAGEN: 4839343, ARNm.
H. sapiens somatomamotropina hormona coriónica 0.812166 -2.21846 2.21843 3.60E-03 2 (CSH2), variante de transcripción 4, ARNm. /PROD=
somatomamotropina hormona coriónica 2, isoterma 4 /FL=
gb:NM_022646.1
proteína represora relacionada con HES H. sapiens 1 2.80599 -1.19396 2.40562 2.44E-03 ARNm de H E R P 1, cds completos. /PROD=
proteína represora relacionada con HES 1 HERP1
/FL=gb:NM 012259.1 gb: AF311884.1
gb: AB044755.1 gb: AF232238.1 gb: AF237949.1 gb:
AF 173901.1
(continúa)
Título de gen Tratamiento Tratamiento Tratamiento V a lo r P de DE en DE en suero DE en suero B en ja m in i suero bajo AA +AA y bajo AA Wnt- 3A bajo
Hochberg en en en MATRIGEL MATRIGEL MEFS
H. sapiens cadherina 6, tipo 2, K-cadherina ( 0.824752 -3.83509 -0.87634 2.49E-02 riñón fetal) (CDH6), ARNm. /PROD= cadherina 6, tipo 2. K*
cadherin (riñón fetal) /FL=gb:D 31784.1 gb: NM_
004932.1
expresado paternalmente 3 2.87398 -4.12925 -3.49232 2.19E-02 ADNc de H. sapiens FLJ11398 fis, clon 2.5268 -1.71619 1.84868 4.46E-04 HEMBA1000637.
H. sapiens asesino que interactúa con BCL2 (que induce 4.30042 0.023414 3.56237 1.94E-03 apoptosis) (BIK), ARNm. /PROD= asesino que interactúa con BCL2
/FL=gb:NM _001197.2 gb: BC001599.1 gb: U34584.1 gb:
U49730.1
secuencia expresada de testículo de H. sapiens 14 (TEX14), 3.51154 -2.84891 -1.3824 2.18E-02 ARNm. /PROD= secuencia expresada en testículo 14 /FL=gb:
NM_031272.1
H. sapiens hormona de crecimiento 2 (GH2), variante de transcripción 0.922569 -2.77587 1.4679 1.60E-03 2, ARNm. /PROD= hormona de crecimiento 2, isoforma 2
precursor/FL=gb:J03756.1 gb: NM_022557.1
H. sapiens, clon IMAGEN: 4828836, ARNm. 0.972907 -4.24111 -1.48398 1.63E-02 H. sapiens receptor de galanina 1 (GALR1), ARNm 2.50745 -3.13141 -0,33802 3.38E-03 /PROD= receptor de galanina 1 /FL=gb:NM 001480.2 gb:
1)23854.1 gb: L34339.1 gb: U53511.1
H. sapiens, serina (o cisterna) inhibidor de la proteinasa, 1.96851 -4.13943 -1.56568 3.06E-02 clade B (ovalbumin), miembro 3, clon MGC : 12244,
ARNm, cds completos. /PROD= serina (o cisteína)
inhibidor de la proteinasa. cladeB (ovalbúmina), miembro 3
/FL=gb:NM 006919.1 gb: U19556.1 gb: BC005224.1
proteína DKFZP566K1924 2.88225 -2.59632 1.39062 0.00E+00 EST, moderadamente similar a ALU2_ENTRADA DE 4.24074 -0.69782 3.87444 1.12E-04 ADVERTENCIA DE CONTAMINACIÓN DE SECUENCIA SB DE SUBFAMILIA ALU HUMANA (H.sapiens)
ARNm humano regulado al alza durante la apoptosis 0.494505 -4.62912 -0.18915 4.38E-02 inducida por camptotina de células U937.
subfamilia de receptores nucleares 1. grupo I, miembro 3 1.77902 -4.02806 -0.19682 4.34E-02 ESTs -1.3795 -6.08172 -0.94606 6.91 E-04 H. sapiens somatomamotroplna corlónica 1.12437 -3.12138 2.61605 1.12E-04 2 (CSH2). variante de transcripción 1. ARNm. /PROD=
somatomamotropina hormona canónica 2, ¡soforma 1 precursora
/FL=gb:NM JJ209912 gb: BC002717.1
ARNm de H. sapiens para SCCA2b, cds completos. 3.32911 -3.16288 0.568045 1.93E-02 /PROD= SCCA2b /FL=gb:AB046400,1
Producto del gen KIAA0469 de H, sapiens (KIAA0469), 4.03097 -1.94826 2.56518 2.49E-04 ARNm, /PROD= producto genético KIAA0469 /FL=gb:
AB007938.1 gb: NM_014851.1
ESTs 4.45389 -2.40636 5.33359 5.65E-04 TABLA VII: EL EFECTO DEL TRATAMIENTO WNT-3A SOBRE LA EXPRESIÓN DE CITOCINA EN POBLACIONES DE CÉLULAS DE LA LÍNEA DE CÉLULAS H9 MADRE EMBRIÓNICAS HUMANAS
Figure imgf000207_0001
Figure imgf000208_0001
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método para diferenciar células madre pluripotentes humanas en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, que comprende los pasos de:
a. Cultivo de células madre pluripotentes humanas en un sustrato de cultivo tisular recubierto con una matriz extracelular, en donde la matriz extracelular se selecciona del grupo que consiste en una preparación de membrana basal solubilizada extraída de células de sarcoma de ratón, preparación de membrana basal solubilizada reducida por factor de crecimiento extraída de células de sarcoma de ratón, laminina, fibronectina y suero humano;
b. Diferenciación de las células madre pluripotentes humanas en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo, tratando las células madre pluripotentes humanas con 1 pg/ml a 100 pg/ml de activina A y 1 ng/ml a 1000 ng/ml de Wnt 3a en un primer medio de cultivo durante 1 a 3 días, seguido de cultivo de células madre pluripotentes humanas con 1 pg/ml de activina A y, opcionalmente, 1 ng/ml a 1000 ng/ml de Wnt-3a en un segundo medio de cultivo durante 1 día a 4 días;
c. Diferenciación de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, tratando las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con 1 nM a 1 mM de ácido retinoico y 50 pg/ml a 50 pg/ml de al menos un factor de crecimiento de fibroblastos seleccionado del grupo que consiste en FGF-2, FGF-4 y FGF-10 durante 1 a 3 días; y
d. Diferenciación de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, tratando las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con 0,1 pM a 100 pM de L-685,458 durante 3 a 5 días; en donde el paso b comprende opcionalmente además el tratamiento de las células con 1 nM a 1000 nM de un inhibidor de GSK-3B, y en el que el inhibidor de GSK-3B es un inhibidor de GSK-3B XI o un inhibidor de GSK-3B IX.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la matriz extracelular es preparación de membrana basal solubilizada extraída de células de sarcoma de ratón o preparación de membrana basal solubilizada reducida por factor de crecimiento extraído de células de sarcoma de ratón usada a una dilución de 1:60 a 1:10.
3. El método de la reivindicación 1, en el que el primer medio de cultivo en el que se cultivan las células madre pluripotentes humanas contiene suero en una concentración baja, y el segundo medio de cultivo en el que se cultivan las células madre pluripotentes humanas contiene suero en una concentración mayor que el primer medio de cultivo.
4. El método de la reivindicación 1, en el que el segundo medio de cultivo en el que se cultivan las células madre pluripotentes humanas no contiene un ligando Wnt.
5. El método de la reivindicación 1, en el que el primer medio de cultivo en el que se cultivan las células madre pluripotentes humanas contiene suero en una concentración del 0% al 1%.
6. El método de la reivindicación 1, en el que el segundo medio de cultivo en el que se cultivan las células madre pluripotentes humanas contiene suero en una concentración del 2%.
7. El método de la reivindicación 1, en el que el primer medio de cultivo en el que se cultivan las células madre pluripotentes humanas contiene suero a una concentración del 0,5%.
8. El método de la reivindicación 1, en el que la activina A se usa a una concentración de 100 ng/ml.
9. El método de la reivindicación 1, en el que el Wnt-3a se usa a una concentración de 10 ng/ml a 100 ng/ml.
10. El método de la reivindicación 1, en el que el segundo medio de cultivo contiene activina A y Wnt-3a.
11. El método de la reivindicación 1, en el que las células madre pluripotentes humanas se cultivan con el inhibidor de GSK-3B.
12. El método de la reivindicación 11, en el que el inhibidor de GSK-3B es:
a. añadido al primer medio de cultivo en el que se cultivan las células madre pluripotentes humanas;
b. añadido al segundo medio de cultivo en el que se cultivan las células madre pluripotentes humanas; o c. añadido tanto al primer como al segundo medio de cultivo en el que se cultivan las células madre pluripotentes humanas.
13. El método de la reivindicación 11, en el que el inhibidor de GSK-3B es el inhibidor de GSK-3B IX.
14. El método de la reivindicación 1, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo son tratadas con al menos un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en FGF-2, FGF-4 y FGF-10 durante tres días.
15. El método de la reivindicación 14, en el que las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con ácido retinoico en una concentración de 1 pM.
16. El método de la reivindicación 14, en el que las células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo se tratan con al menos un factor de crecimiento a una concentración de 50 ng/ml.
17. El método de la reivindicación 1, en el que las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático se tratan con L-685,458 durante cinco días.
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