JP6527487B2 - 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法 - Google Patents
多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法Info
- Publication number
- JP6527487B2 JP6527487B2 JP2016110884A JP2016110884A JP6527487B2 JP 6527487 B2 JP6527487 B2 JP 6527487B2 JP 2016110884 A JP2016110884 A JP 2016110884A JP 2016110884 A JP2016110884 A JP 2016110884A JP 6527487 B2 JP6527487 B2 JP 6527487B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- cell population
- characteristic
- pancreatic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/37—Digestive system
- A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
Description
本願は、2010年3月1日出願の米国特許仮出願第61/309,193号の優先権
を主張する。
本発明は、多能性幹細胞を分化させる方法を目的とする。具体的には、本発明は、膵内
分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させた細胞を、特有の表面マーカ
ーを利用して性質決定する方法を提供する。本発明は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを
発現している細胞を、濃縮又は選別する方法も提供する。本発明は、本発明の方法により
形成される膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団に混入する恐れのある
細胞を枯渇させることで、移植後にインビボで形成される腫瘍の発生率を減少させる方法
も提供する。
潜在能力を有する。細胞治療による糖尿病の処置は、ヒト膵島細胞と同様に機能し得る大
量の細胞を産生することにより容易になる。したがって、多能性幹細胞から誘導されるこ
れらの細胞を産生することと、並びにこのような細胞を精製するための信頼性の高い方法
とが必要とされている。
の細胞表面マーカーは、これらの集団を分離及び単離するための試薬を調製する際に有用
である。細胞表面マーカーは、これらの細胞を更に特徴付けるのにも有用である。
腸内胚葉細胞を含む細胞集団を、腸内胚葉細胞で発現している細胞表面マーカーに結合す
るリガンドに曝露すること(ここで、上記細胞表面マーカーは、CD49e、CD99、
CD165、及びCD334からなる群から選択される);並びにb)腸内胚葉細胞を、
多能性幹細胞から誘導された、リガンドと結合しない細胞から分離することで、上記腸内
胚葉細胞を精製すること、を含む、腸内胚葉を精製する方法を開示する。
への分化能を有する幹細胞を単離する際に、単独で、あるいはCD56に結合する抗体又
は抗体の機能断片と組み合わせで、TNAP抗原に結合する抗体又は抗体の機能断片を使
用することを開示する。
細胞の凝集塊へと分化する傾向が非常に高い膵幹細胞の特有の画分を選別することを可能
にする、選択的な細胞表面マーカーの発見について開示する。
ら内胚葉系及び膵臓系の細胞を濃縮するための方法を開示し、この方法は、(a)ヒト胚
性幹細胞のインタクトなコロニーを培養して、臓側卵黄嚢(VYS)細胞により取り囲ま
れた、完全なインタクトな胚様体を形成させる工程であって、この際、ヒト胚性幹細胞は
、Oct−4、発生段階特異的な胚表面抗原−3/4(SSEA 3/4)、及び上皮細
胞接着分子(EpCAM)を発現する、工程;(b)胚葉体細胞を、内胚葉系及び膵臓系
の細胞を含有している細胞集団へと分化させる条件下で、工程(a)の胚様体を培養する
工程;(c)工程(b)の細胞集団を単独の細胞へと分散させる工程;(d)SSEA
3/4の発現が陽性の細胞を選別することで、工程(c)の細胞から未分化の細胞を除去
する工程;(e)SSEA−1の発現が陽性の細胞を選別することで、工程(d)の残り
の細胞からVYS細胞を除去する工程;及び(f)工程(e)の残りの細胞から、EpC
AMの発現が陽性の細胞を選別することで、内胚葉系及び膵臓系の細胞を濃縮する工程、
を含む。
び膵臓系の細胞を濃縮するための方法も開示し、この方法は、(a)ヒト胚性幹細胞のイ
ンタクトなコロニーを培養して、臓側卵黄嚢(VYS)細胞により取り囲まれた、完全な
インタクトな胚様体を形成させる工程であって、この際、ヒト胚性幹細胞は、Oct−4
、発生段階特異的な胚表面抗原−3/4(SSEA 3/4)、及び上皮細胞接着分子(
EpCAM)を発現する、工程;(b)胚葉体細胞を、内胚葉系及び膵臓系の細胞を含有
している細胞集団へと分化させる条件下で、工程(a)の胚様体を培養する工程;(c)
工程(b)の細胞集団を有効量の線維芽細胞増殖因子10(FGFI 0)により処理す
る工程;及び(d)工程(c)の細胞集団を単独の細胞へと分散させ、内胚葉及び膵臓系
の細胞を濃縮する工程、(e)SSEA−3/4の発現が陽性の細胞を選別することで、
工程(d)の細胞から未分化の幹細胞を除去する工程;(f)SSEA−1の発現が陽性
の細胞を選別することで、工程(e)の細胞からVYS細胞を除去する工程;及び(g)
工程(f)の残りの細胞からEpCAMの発現が陽性の細胞を選別することで、内胚葉系
及び膵臓系の細胞を濃縮する工程、を含む。
を作製するための濃縮方法も開示し、この方法は、(a)ヒト胚性幹細胞のインタクトな
コロニーを培養して、臓側卵黄嚢(VYS)細胞により取り囲まれた完全なインタクトな
胚様体を作製する工程であって、この際、ヒト胚性幹細胞は、Oct−4、発生段階特異
的な胚表面抗原−3/4(SSEA 3/4)、及び上皮細胞接着分子(EpCAM)を
発現する、工程;(b)胚葉体細胞を、内胚葉系及び膵臓系の細胞を含有している細胞集
団へと分化させる条件下で、工程(a)の胚様体を培養する工程;(c)工程(b)の細
胞集団を単独の細胞へと分散させる工程;(d)SSEA 3/4の発現が陽性の細胞を
選別することで、工程(c)の細胞から未分化の細胞を除去する工程;(e)SSEA−
1の発現が陽性の細胞を選別することで、工程(d)の細胞からVYS細胞を除去する工
程;並びに(f)工程(e)の残りの細胞から、EpCAMの発現が陽性の細胞を選別す
る工程、を含み、得られる細胞は、免疫不全状態のマウスに注入した場合に腫瘍を形成し
ない。
ら、内胚葉系及び膵臓系の細胞を濃縮する方法を開示し、この方法は、幹細胞を培養して
胚様体を形成させる工程;及び胚葉体から、適切な種類の発現段階特異的な胚表面抗原を
発現している胚葉体を選別する工程、並びに内胚葉細胞及び膵臓細胞へと分化させるにあ
たり、発現段階特異的な細胞表面抗原を発現しない胚様体のみを培養する工程、を含む。
、この案件では、膵臓幹細胞集団は、CD133+CD49f+膵臓幹細胞に関し濃縮さ
れている。
又は胃腸由来の細胞集団から、CD133+、CD49f+、又はCD133+CD49
f+の細胞を選別すること;CD15+の細胞を除去することであって、ここで、残りの
細胞はCD15−である、除去すること;残りの細胞を、増殖因子を1種以上含有してい
る無血清培養培地に導入すること;並びに残りの細胞を培養培地で増殖させること、で生
じる、プライマリーな膵臓組織(primary pancreatic tissue)からの膵臓幹細胞の単離
を開示する。
胞型の単離及び研究用の細胞表面マーカーに関する新規パネルを開発した。インタクトな
、又は解離させたヒト膵島細胞によるBalb/Cマウスの差引き免疫化後にハイブリド
ーマを選別し、免疫組織化学及びフローサイトメトリーにより細胞型特異性及び細胞表面
反応性を評価した。膵島(膵内分泌腺(panendocrine)又は膵島α細胞(α-specific)
)上の及び膵島のものではない膵臓細胞のサブセット(外分泌腺及び管)上の表面抗原へ
の特異的な結合性により、抗体を識別した。これらの抗体を別個に又は組み合わせて使用
することで、FACSにより、プライマリーなヒト膵臓からα細胞集団、β細胞集団、外
分泌細胞集団、又は管細胞集団を単離し、ヒト膵島調製物の詳細な細胞組成について特徴
付けした。これらの抗体は、ヒト膵島の増殖培養物が非内分泌細胞に由来したことと、亜
集団を選別し、転写因子Pdx−1及びngn3を過剰発現させることにより、インスリ
ン発現レベルを最大で通常の島細胞の1%にまで上昇させることができることとを示す際
にも採用され、この培養系により、前述の結果は大きく改善された。これらの方法は、細
胞治療に可能性のある、機能的に異なる膵臓細胞集団の解析及び単離を可能にする」(S
tem Cell Research,Volume 1,Issue 3,Septe
mber 2008,Pages 155〜156)と記載している。
GN3+細胞を精製するのに有用な、CD133及びCD49fと呼ばれる2つの抗原を
同定した。CD133(プロミニン(prominin)−1とも呼ばれる)は、機能未知の膜貫
通型タンパク質であり、かつ造血細胞前駆体及び神経幹細胞の既知のマーカーである。C
D49fは、α6−インテグリンとも呼ばれ、ラミニンの受容体サブユニットである。C
D133及びCD49fを認識する抗体を組み合わせることで、我々は4種の異なる膵臓
細胞集団を分取した。免疫染色及びRT−PCRにより、細胞集団CD49fhigh
CD133+(「フラクションI」、使用量のうち50%)は、CarbAを発現してい
る分化した外分泌細胞により主に構成されることが明らかになった。CD49flow
CD133−フラクション(「フラクションIII」、使用量のうち10%)は、インス
リン及びグルカゴンなどの内分泌腺分泌物を発現しているホルモン+細胞を包含していた
。対照的に、CD49flow CD133+フラクション(名称「フラクションII」
、使用量のうち13%)は、NGN3+細胞を含有していたものの、ホルモン+細胞は含
有していなかった。フラクションIIの細胞のうち、およそ8%は免疫染色可能なNGN
3を産生していた。CD49f−CD133−フラクション(「フラクションIV」、使
用量のうち25%)では、我々はNGN3、CarbA又は膵島ホルモンを発現している
細胞を検出できなかった」(Diabetes,Obesity and Metabo
lism,Volume 10,Issue s4,Pages 179〜185)と記
載している。
e−scatterlow GFPhigh細胞を選別したところ、高い増殖性を持つ、
α−フェトプロテイン陽性の未熟内胚葉と特徴付けられる細胞がこの集団に存在していた
。クローン解析及び電子顕微鏡による評価により、この集団中の各単独の細胞が、肝細胞
だけでなく、胆嚢上皮細胞ヘも分化することができ、二系統への分化活性を示すことが明
らかになった。それらは、表面マーカーを解析した場合には、インテグリン−α6及び−
β1に関し陽性であったが、c−Kit及びThy1.1に関しては陰性であった」(J
ournal of Hepatlogy,Vol 39,pages 162〜170
)と記載している。
体から精製するにあたり、肝内胚葉細胞の表面マーカーとして最初にN−カドヘリンを同
定し、ネズミ胚性間質フィーダー(STO)細胞と共培養することで、精製肝内胚葉細胞
から肝前駆細胞を生成した。これらの肝前駆細胞は、100日超にわたり増殖させ及び継
代することができる。興味深いことに、これらは初期肝臓マーカーAFP及び胆嚢系マー
カーKRT7を共発現していたことから、肝細胞及び胆管細胞の両方の共通の祖先細胞で
あることが示唆された。更に、これらの前駆細胞は、遺伝子発現及び機能アッセイの両方
により確認されるように、肝細胞様細胞及び胆管細胞様細胞への二分化能を維持させつつ
広範に拡張することができた。したがって、本研究により、肝臓の発達を研究するための
新規のインビトロモデル、並びに肝前駆細胞に基づく細胞治療用の新規資源が提供される
ことになる。」(PLoS ONE 4(7):e6468.doi:10.1371/
joumal.pone.0006468)と記載している。
我々はCXCR4などの、ES細胞から誘導される内皮細胞のマーカーを用い、アクチビ
ンA誘導型の細胞を選別した。CXCR4+集団のほとんどすべての細胞で内皮細胞マー
カーSOX17が陽性であり、かつ90%超の細胞でFOXA2が陽性であったことから
、CXCR4を高発現している内皮細胞集団が選別された。」(Journal of
Molecular Cell Biology Advance Access or
iginally published online on November 12
,2009.Journal of Molecular Cell Biology
2010 2(1):50〜60;doi:10.1093/jmcb/mjp037)
と記載している。
胞集団が、ニューロゲニン−3を発現している内分泌腺前駆細胞、並びに多能性幹細胞の
マーカー(ヒトテロメアーゼ、ABCG2、Oct−3/4、Nanog、及びRex−
1)を発現している細胞を包含していることを見出した。これらの細胞は、インビトロで
インスリン産生細胞ヘと分化させることができるものであり、及びグルコース依存性の様
式でC−ペプチドを分泌した。我々の研究結果に基づき、我々は、CD133分子が、膵
内分泌系前駆細胞の同定及び単離に好適な別の細胞表面マーカーを提示するものと仮定し
ている」(Transplant Proc.2008 Mar;40(2):415−
8)と記載している。
33を発現していることを見出した。CD133は、明らかに膵管上皮細胞の頂端膜に局
在している。」(PNAS 2007 104:175〜180;書籍として出版される
前にインターネットで公開、2006年12月26日,doi:10.1073/pna
s.0609490104)と記載している。
、膵臓が発達するにつれて内分泌及び外分泌細胞が増加することが既知であるが、同定さ
れたこれらの細胞に関する特異的な表面マーカーは存在しない。この度、我々は、マウス
膵臓の発達時に、これらの上皮細胞に特異的なマーカーとしてDolichos Bif
lorus Agglutinin(DBA)を利用した。フルオレセインDBA及び膵
臓特異的な細胞マーカーを用いる免疫蛍光研究の結果から、我々は、DBAは特異的に上
皮を検出する一方で、内分泌細胞又は腺房細胞のいずれも区別しなかったことを見出した
。我々は、膵臓細胞集団の発達時の混合物からこれらの推定上の多能性細胞を精製するた
めに、このマーカーを更に免疫磁気ビーズによる分離系(Dynabead系)において
マーカーとして利用した。この手順は、膵臓の発達において、分化研究及び細胞系の選別
に使用することができ、また、細胞工学に使用できる可能性のある膵臓前駆細胞の選別に
も使用することができる。」(Biochemical及びBiophysical R
esearch Communications,Volume 293,Issue
2,2002年5月3日,691〜697頁)と記載している。
らの細胞に対する理解を深めることができ、インビボ及びインビトロでのそれらの同定の
一助となる場合があり、並びに研究及び使用に際しては、インビトロにおいて、それらの
発現が陽性である細胞を濃縮することが可能になり得る。したがって、多能性幹細胞から
誘導された細胞、具体的には、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、単
離及び特徴付けするのに有用なツールが未だに必要とされている。
現している細胞集団へと分化させる方法を提供し、この方法は以下の工程を含む:
a.多能性幹細胞集団を培養する工程、
b.多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へ
と分化させる工程、
c.胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、初期腸管系に特徴的
なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程、
d.初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、膵内胚葉系に特徴的な
マーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程、並びに
e.膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、膵内分泌系に特徴的な
マーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程。
され、この場合、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞はインスリン産生細
胞を形成する。一実施形態では、インスリン産生細胞の生成効率は、移植前に、膵内分泌
系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を濃縮することで増加する。
検出可能なレベルに到達するまでにかかる時間を測定することで判定される。
減少する。
態」を本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を、説明又は例示する下記の小項目に分
割する。
「β細胞系」は、転写因子PDX−1、及び以下の転写因子、すなわち、NGN3、N
KX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF−3 β、MAFA、PA
X4、及びPAX6のうちの少なくとも1つについて遺伝子の発現が陽性である細胞を指
す。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、β細胞が挙げられる。
は、以下のマーカー、すなわちSOX17、GATA4、HNF−3 β、GSC、CE
R1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix様ホメオボックスタンパク質
、FGF4 CD48、エオメソダーミン(eomesodermin)(EOMES)、DKK4、
FGF17、GATA6、CD184、C−Kit、CD99又はOTX2のうちの少な
くとも1つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞
としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げ
られる。
、HNF−1 β、又はHNF−4 αのうちの少なくとも1つを発現している細胞を指
す。
以下のマーカー、すなわち、PDX1、HNF−1 β、PTF−1 α、HNF6、又
はHB9のうちの少なくとも1つを発現している細胞を指す。膵内胚葉系に特徴的なマー
カーを発現している細胞としては、膵内胚葉細胞が挙げられる。
管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保有している細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、
以下のマーカー、すなわち、CD184、HNF−3 β、GATA4、SOX17、ケ
ルベロス、OTX2、グースコイド、c−Kit、CD99、及びMixl1を発現する
。
酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレ
ベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチド
の検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低
いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細
胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
のホルモンのうちの少なくとも1つを発現することが可能な細胞を指す:インスリン、グ
ルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。
くとも1つを分泌できる細胞を指す:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵
臓ポリペプチド。
1つを発現する細胞を指す:Nodal、又はFGF8。
つを発現している細胞を指す:Brachyury、Mix様ホメオボックスタンパク質
、又はFGF4。
らの両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再
生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉層(
内胚葉、中胚葉及び外胚葉)から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、
また移植後に複数の胚葉層の組織を生じ、胚盤胞への注入後、すべてではないとしても殆
どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
を有することを意味する分化全能性、(ii)すべての胚性細胞のタイプを生ずる能力を
有することを意味する分化万能性、(iii)細胞系のサブセットを生ずる能力を有する
が、それらがすべて特定の組織、臓器、又は生理学的システムのものであるような分化多
能性(例えば、造血幹細胞(HSC)は、HSC(自己複製性)、血球限定的寡能性前駆
細胞、及び血液の通常の成分であるすべての細胞型及び要素(例、血小板)を含む子孫細
胞を生じ得る)、(iv)多能性幹細胞よりも限定された細胞系のサブセットを生ずる能
力を有することを意味する分化寡能性、及び(v)単一の細胞系(例、精原幹細胞)を生
ずる能力を有することを意味する分化単一性に分類される。
えば、神経細胞又は筋細胞などの専門化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分
化細胞又は分化を誘導された細胞は、細胞系内でより専門化された(「分化決定された」
)状況を呈している細胞である。分化のプロセスについて用いられる場合、「分化決定さ
れた」なる用語は、通常の条件下で特定の細胞型又は細胞型のサブセットにまで分化し続
けるが、通常の条件下では異なる細胞型には分化できず、分化のより未熟な細胞型にも戻
ることができない点にまで分化経路を進んだ細胞のことを指す。脱分化とは、細胞が、細
胞系においてより専門化(又は分化決定)されていない位置にまで戻るプロセスのことを
指す。本明細書で使用するとき、細胞系とは、その細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの
細胞から生じたものであり、どのような細胞を生じ得るか、ということを定義するもので
ある。ある細胞系とは、発生及び分化の遺伝スキーム内にその細胞を位置付けるものであ
る。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を
指し、分化決定されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用する
ことができる。
団の増加をもたらし得る又はもたらし得ない、細胞の成長及び/又は***を促進する条件
下で、増殖培地中に細胞を置くことを意味する。「継代」は、細胞増殖及び/又は細胞分
裂を促進する条件下で、細胞を1番目の培養容器から取り出し、それらの細胞を2番目の
培養容器へと設置するプロセスを指す。
られる。例えば、10回継代された培養細胞集団はP10培養物と呼ばれる場合がある。
初代培養、すなわち組織から細胞を単離した後の最初の培養はP0と称される。最初の継
代培養の後、細胞は2次培養(P1又は継代数1)と記載される。2回目の継代培養の後
では細胞は3次培養物(P2又は継代数2)となる、といった具合である。当業者であれ
ば、継代期間中に集団は何度も倍加し得るものであり、したがってある培養の集団倍加の
回数は継代数よりも大きいことは理解されるであろう。各継代間の期間での細胞の増殖(
すなわち集団倍加数)は、播種密度、基質、培地、培養条件、及び継代間の時間が挙げら
れるがこれらに限定されない多くの因子に依存する。
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞集団を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発
現している細胞集団へと分化させる方法を提供し、この方法は以下の工程を含む:
a.多能性幹細胞集団を培養する工程、
b.多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へ
と分化させる工程、
c.胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、初期腸管系に特徴的
なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程、
d.初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、膵内胚葉系に特徴的な
マーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程、並びに
e.膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、膵内分泌系に特徴的な
マーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程。
され、この場合、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞はインスリン産生細
胞を生成する。一実施形態では、インスリン産生細胞の生成効率は、移植前に、膵内分泌
系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を濃縮することで増加する。
検出可能なレベルに到達するまでにかかる時間を測定することで判定される。
減少する。
に特異的に結合する試薬に対する抗原の結合により、同定又は選別される。
する前に、インスリン産生細胞へと更に分化させる。インスリン産生細胞は、細胞表面上
に見出される、細胞表面抗原に特異的に結合する試薬に対する抗原の結合により、同定又
は選別される。
を発現している細胞集団へと分化させる方法を提供し、この方法は以下の工程を含む:
a.多能性幹細胞集団を培養する工程、
b.多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へ
と分化させる工程、
c.胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、初期腸管系に特徴的
なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程、
d.初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を濃縮する工程、
e.初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、膵内胚葉系に特徴的な
マーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程、並びに
f.膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、膵内分泌系に特徴的な
マーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程。
され、この場合、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞はインスリン産生細
胞を形成する。一実施形態では、インスリン産生細胞の生成効率は、移植前に、初期腸管
系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を濃縮することで増加する。
特異的に結合する試薬に対する抗原の結合により、同定又は選別される。
一実施形態では、動物に移植する前に、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している
細胞集団は、CD9、CD13、CD15、CD47、CD56、CD73、CD117
、CD133、CD184、CD200、CD318、CD326及びSSEA4からな
る群から選択されるマーカーに結合することのできる、少なくとも1種の試薬により処理
される。
現が陽性であり、かつマーカーCD13の発現が陰性である、膵内分泌系に特徴的なマー
カーを発現している細胞集団が得られる。
現が陽性であり、かつマーカーCD15の発現が陰性である、膵内分泌系に特徴的なマー
カーを発現している細胞集団が得られる。
発現が陰性である、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団が得られる。
現が陰性である、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団が得られる。
発現が陽性である、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団が得られる。
発現が陰性である、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団が得られる。
一実施形態では、動物に移植する前に、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している
細胞集団を、インスリン産生細胞集団へと更に分化させる。インスリン産生細胞集団を、
CD47、CD56、CD57 CD98及びSSEA4からなる群から選択されるマー
カーと結合することのできる少なくとも1種の試薬により処理する。
CD57の発現が陽性であるインスリン産生細胞集団が得られる。あるいは、インスリン
産生細胞集団は、CD98の発現が陽性であってもよい。あるいは、インスリン産生細胞
集団は、CD47の発現が陰性であってもよい。
発現が陰性であるインスリン産生細胞集団が得られる。
の急性骨髄性白血病、急性転化した慢性骨髄性白血病、少数のリンパ性白血病及び骨髄細
胞株でも発現されている。CD13は、線維芽細胞及び内皮細胞などの数種類の非造血細
胞でも、並びに血漿中で可溶性の形態でも見出される。CD13は、B細胞、T細胞、血
小板、又は赤血球では発現しない。CD13は、活性ペプチドの代謝、増殖及び分化の調
節、貪食作用、並びに殺菌性/殺腫瘍性において役割を果たす。CD13もヒトコロナウ
イルス(HCV)の受容体として働く。
接着分子である。CD15は、好中球で見られる貪食作用及び走化性を介在するものであ
り、ホジキン病患者、一部のB細胞型慢性リンパ球性白血病患者、急性リンパ性白血病患
者、及びほとんどの急性非リンパ性白血病患者で発現される。CD15はLewis x
及びSSEA−1(ステージ特異的胚抗原1)とも呼ばれ、マウス多能性幹細胞のマーカ
ーにもなり、着床前胚において、細胞の接着及び移動に重要な役割を果たす。
胞内のカルシウム濃度の上昇に関与する。このタンパク質はまた、トロンボスポンジンの
C末端にある細胞結合ドメインの受容体でもあり、膜輸送及びシグナル伝達で機能し得る
。
なう糖タンパク質であり、神経細胞、神経膠細胞、骨格筋細胞及びナチュラルキラー細胞
の表面に発現する。NCAMは、細胞間接着、神経突起伸長、シナプス可塑性、並びに学
習及び記憶に機能することが示唆されている。
質で検出された、抗原性のオリゴ糖断片である。血液中では、CD57はNK及びT細胞
のサブセットを包含する単核細胞の15〜20%で見られるが、赤血球、単球、顆粒球、
又は血小板では見られない。同様に、CD57の発現は様々な神経系細胞型でも見出すこ
とができる。
ク質である。LAT1はヘテロ二量体の膜輸送タンパク質であり、中性の分枝状(バリン
、ロイシン、イソロイシン)及び芳香族(トリプトファン、チロシン)アミノ酸を選択的
に輸送する。
ある糖タンパク質である。CD133は膜貫通型糖タンパク質のペンタスパン(pentaspa
n)(5−膜貫通型、5−TM)のメンバーであり、細胞の突起に特異的に局在する。C
D133は、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞、神経膠芽腫、神経幹細胞、及び膠幹細胞で
発現される。Corbeil et al.,Biochem Biophys Res
Commun 285(4):939〜14,2001.doi:10.1006/b
brc.2001.5271.PMID 11467842を参照されたい。
代替的実施形態では、本発明は、多能性幹細胞集団を、膵内分泌系に特徴的なマーカー
を発現している細胞集団へと分化させる方法を提供し、この方法は以下の工程を含む:
a.多能性幹細胞集団を培養する工程、
b.多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へ
と分化させる工程、
c.胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、初期腸管系に特徴的
なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程、
d.初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を濃縮する工程、
e.初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、膵内胚葉系に特徴的な
マーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程、並びに
f.膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、膵内分泌系に特徴的な
マーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程。
され、この場合、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞はインスリン産生細
胞を形成する。一実施形態では、インスリン産生細胞の生成効率は、移植前に、初期腸管
系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を濃縮することで増加する。
とのできる少なくとも1種の試薬により処理する。
発現している細胞又はインスリン産生細胞を、実施例に更に記載されるように濃縮、枯渇
、単離、選別、及び/又は精製することもできる。本明細書で使用するとき、用語「濃縮
した」又は「精製した」、あるいは「他の既知の細胞集団を枯渇させることにより濃縮し
た又は精製した」とは、細胞集団が濃縮及び/又は精製されるよう、細胞を何らかの選別
プロセスにかけたことを示す。同様に、対象とする細胞が、比較的濃縮され及び/又は精
製されている場合も考慮され、すなわち、別の細胞集団と比較して、「濃縮」又は「精製
」前の多能性幹細胞と比較して、あるいは元の細胞培養物又は開始時細胞培養物と比較し
て、特定の分化細胞集団が有意に多い場合も考慮される。
「枯渇」又は「分離」又は「選別」も包含され得る。一実施形態では、細胞集団は、不必
要な分化細胞型を枯渇させることにより精製され得る。既知の又は未知の細胞型の培養物
を枯渇させることにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を濃縮及び
精製することが有利である場合がある。この方法では、濃縮又は精製した細胞集団は、抗
体に対して結合又は付着しない。精製する集団から抗体を除去する必要がないことから、
細胞治療用に濃縮又は精製された細胞を使用することは、改良され得る。
法が挙げられる。この方法では、任意の望ましくない細胞型にとって、培養条件が有害な
ものである。
グした磁気ビーズ法、アフィニティクロマトグラフィー、並びに固体マトリックス若しく
は固相補足培地、例えばプレート、カラムに取り込んだ抗体による「パニング」、又はそ
の他の都合の良いかつ利用可能な技術も挙げられる。正確に分離する技術としては、細胞
表面及び細胞内のパラメーター、加えて形状変化及び粒度の測定に有用であり、並びに抗
体又はプローブ結合試薬として使用されるビーズの解析に有用である、フローサイトメト
リーが挙げられる。フローサイトメトリーアッセイによる読み取り情報としては、限定す
るものではないが、別個の蛍光抗体により検出される細胞表面分子若しくはサイトカイン
に関連する、平均蛍光値又は平均蛍光強度、蛍光強度の分散、あるいはこれらの間の何ら
かの関係性が挙げられる。
ラメーター、又はビーズの特性は、少なくとも1つの蛍光波長における散乱(FS及び/
又はSS)である。フローサイトメトリーを使用することで、細胞表面タンパク質、又は
それらの立体構造的な修飾若しくは翻訳後修飾の有無;細胞内タンパク質又は分泌タンパ
ク質の有無などのパラメーターを定量化することができる。この場合、透過処理により抗
体(又はプローブ)の接近が可能になる。フローサイトメトリー法は当該技術分野におい
て既知であり、以下の文献に記載されている:Flow Cytometry and
Cell Storing(Springer Lab Manual),Radbru
ch,Ed.,Springer Verlag,2000;Ormerod,Flow
Cytometry,Springer Verlag,1999;Flow Cyt
ometry Protocols(Methods in Molecular Bi
ology,No 91),Jaroszeski and Heller,Eds.,
Humana Press,1998;Current Protocols in C
ytometry,Robinson et al.,eds,John Wiley
& Sons,New York,N.Y.,2000。
トメトリーでは、蛍光色素の定量的レベルをレーザーが検出する(特異的な試薬、例えば
固体が結合している、細胞表面マーカーの量を比例する)。フローサイトメトリー、すな
わちFACSを使用することで、特異的な試薬への結合強度に基づき、並びに細胞の大き
さ及び光散乱などの他のパラメーターに基づき、細胞集団を分離することもできる。完全
な染色の程度は特定の蛍光色素及び試薬製品によって異なり得るが、データは、対照に対
して標準化化することができる。対照に対し分布を標準化するために、各細胞を、特定の
染色強度を有するデータポイントとして記録する。
トとして記録する。これらのデータポイントは対数スケールに従って示すことができ、任
意の染色強度が測定ユニットになる。一例では、集団中で最も明るい細胞は、染色強度の
最も低い細胞と比較して、4log以上の強度があるものとして記載される。この方式で
示される場合、染色強度の対数値が最も大きい細胞が明るく、その一方、染色強度の最も
低い細胞は陰性であることが明白である。染色強度が2〜3logになる染色強度の「低
い」染色細胞は、陰性及び陽性細胞と比べ特有の特性を有する場合がある。別の対照は、
表面におけるマーカーの密度が明確である基材、例えば、強度が陽性である対照を提供す
るよう作製されたビーズ又は細胞株を用いることができる。「低い」という表記は、染色
レベルが、対照と一致するアイソタイプの輝度を上回るものの、その強度が、集団で標準
的に見られる最も輝度の高い染色細胞には及ばないことを示す。
えば、蛍光抗体を細胞表面分子に対して使用することにより、順番に行なうこともできる
。例として、これらは、フローサイトメトリーによる4種以上の蛍光色素の同時解析を可
能にする、異なる蛍光色素、蛍光ビーズ、タグ、例えば、量子ドットなどによりタグ付け
することができる。例えば、表記「陰性」は、染色レベルが、陰性対照と一致するアイソ
タイプの輝度以下であることを意味するのに対し、表記「薄暗い」は、染色レベルが陰性
の染色のレベルに近いものであることを意味するが、ただし、対照と一致するアイソタイ
プよりも輝度が高い場合もある。
を含む細胞種ユニットの差異について標識するにあたり、個別の細胞の識別子に関する、
例えば、異なる細胞種又は細胞型変異体に関する識別子は、蛍光物質であり得る。実施形
態の一部の態様では、2種の細胞種が混合され、ここで、1つは標識され、もう1つは未
標識である。実施形態の一部の態様では、3種以上の細胞種が包含され、各細胞種は、異
なる濃度の標識化合物とインキュベーションすること、又は異なる時間にわたってインキ
ュベーションすることにより、異なるレベルの蛍光標識がされ得る。別個の単位の細胞種
が、複数種の蛍光の強度、例えば、カルボキシフルオレスセインスクシンイミジルエステ
ル(CFSE)などの第1の蛍光色の蛍光強度、テトラメチルローダミンイソチオシアネ
ート(TRITC)などの選択された第2の蛍光色の蛍光強度、及び第3の蛍光色の蛍光
強度などにより互いに識別されるように、大量の細胞集団の識別子として2色以上の異な
る蛍光色の強度を標識する蛍光マトリックスを使用することができる。あるいは、異なる
細胞種の固有光散乱特性、又は解析に包含される試験パラメータのBioMAPの特徴を
、細胞種識別子のユニットとして蛍光標識に加え、又は蛍光標識の代わりに使用すること
もできる。
び/又は精製することもできる。例えば、リガンド及び/又は抗体に、標識、例えば、磁
気ビーズ;アビジン又はストレプトアビジンに対して高親和性で結合するビオチン;蛍光
標示式細胞分取器で使用することのできる蛍光色素;ハプテン;及び同様物などを結合さ
せることで、特定の細胞種の分離を容易にすることもできる。
は間接的に超常磁性微小粒子(微小粒子)などの磁気試薬と結合させることもできる。当
該技術分野において既知の様々な化学的連結基を使用することで、磁性粒子に直接結合さ
せることもできる。一部の実施形態では、側鎖アミノ基又はスルフヒドリル(sufhydryl
)、及びヘテロ官能性(heterofunctional)架橋剤により、抗体を微小粒子に結合させる
。
、少なくとも、抗体上に、反応性スルフヒドリル基を有する3−(2−ピリジジチオ(py
ridyidithio))プロピオン酸N−ヒドロキシこはく酸イミドエステル(SPDP)又は
4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−l−カルボン酸N−ヒドロキシこはく
酸イミドエステル(SMCC)、及び磁性粒子上に反応性アミノ基を使用することができ
る。磁気分離デバイスの一例は、参照によりその全体が本案件に組み込まれる、国際公開
第90/07380号、PCT/US第96/00953号、及び欧州特許第438,5
20号に記載されている。
としては、ダルベッコ変法イーグル培地(dMEM)、ハンクス平衡緩衝塩溶液(HBS
S)、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(dPBS)、RPMI、イスコフ改変ダルベッ
コ培地(IMDM)、5mMのEDTAを添加したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)など
が挙げられ、しばしばウシ胎児血清(FCS)、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト血
清アルブミン(HSA)、及びStemPro(登録商標)hESC SFMが添加され
る。
くとも1種の剤で処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞が
濃縮される。別の実施形態では、インスリン産生細胞を選別する少なくとも1種の剤で処
理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞が濃縮される。
胞含量が少なくとも約2倍〜約1000倍になるよう、細胞集団又は細胞培養物を濃縮す
ることができる。一部の実施形態では、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細
胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約5倍〜約500倍に濃縮
され得る。他の実施形態では、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、未
処理の細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約10倍〜約200倍に濃縮され得
る。更に他の実施形態では、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、未処
理の細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約20倍〜約100倍に濃縮され得る
。更に他の実施形態では、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、未処理
の細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約40倍〜約80倍に濃縮され得る。特
定の実施形態では、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、未処理の細胞
集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約2倍〜約20倍に濃縮され得る。
幹細胞から分化させた細胞の編成は、所定の分化細胞型に特徴的なマーカーの発現を判
定することにより特定され得る。一部の実施形態では、分化細胞の同定及び特徴付けは、
特定のマーカーの発現又は発現レベルの違い、及び1種以上のマーカーのパターンにより
なされる。
化及び同定することができる。同様に、特定のマーカーは一過性発現する場合があり、こ
れにより、マーカーは発達時の一ステージでは高発現し、発達時の別のステージでは発現
が乏しくなる場合がある。特定のマーカーの発現は、細胞培養物又は細胞集団の、そのマ
ーカーが標準化又は基準化した対照マーカーと比較して細胞中に存在するレベルを測定す
ることで判定できる。このようなプロセスでは、マーカーの発現の測定は、定性的なもの
であるか又は定量的なものであり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現
を定量化する方法の一つは、定量的PCR(Q−PCR)の使用を介するものである。Q
−PCRを実施する方法は、当該技術分野において周知である。当該技術分野において既
知である他の方法を使用して、マーカー遺伝子の発現を定量化することもできる。例えば
、マーカー遺伝子産物の発現は、対象とするマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用い検
出することができる(例えば、ウエスタンプロット及びフローサイトメトリー解析など)
。特定の実施形態では、分化した細胞に特徴的なマーカー遺伝子の発現に加えて、分化し
た細胞に特徴的なマーカー遺伝子の発現の有意な欠失も判定される。
イゼーション解析、又は標準的な増幅方法で配列特異的なプライマーを用いる逆転写ポリ
メーラーぜ連鎖反応(RT−PCR)により、mRNAレベルで判定することもできる。
更に詳細には、米国特許第5,843,780号を参照されたい。本開示に列挙される特
定のマーカーに関する配列データは、GenBankなどの公共のデータベースから入手
することができる。
0及びTra−1〜81と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの1つ以上を
発現している(Thomson et al.,Science 282:1145,1
998)。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、SSEA−4、Tra−1〜60
、及びTra−1〜81の発現が減少し(存在する場合)、SSEA−1の発現が上昇す
る。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した
後、製造業者(Vector Laboratories(Burlingame Ca
lif.))によって記載されるようにVector Redを基質として現像すること
によって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有しする。未分化の多能
性幹細胞はまた、RT−PCRにより検出されるように、一般にOCT4及びTERTも
発現する。
、HB9及びPROX1からなる群から選択される。膵内胚葉系に特徴的なこれらのマー
カーのうちの少なくとも1つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明
の一態様では、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内胚葉細胞であ
る。
、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix様ホメオボックスタン
パク質、FGF4、CD48、エオメソダーミン(EOMES)、DKK4、FGF17
、GATA6、CD184、C−Kit、CD99、及びOTX2からなる群から選択さ
れる。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも1つを発現している細胞は本
発明での使用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発
現している細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマ
ーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴
的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、PDX1と、以下の転写
因子、すなわち、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、H
NF3 β、MAFA、PAX4、及びPAX6のうちの少なくとも1つを発現している
。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞であ
る。
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、発生段階特異的胚性抗原(SSEA)3及び4のうちの1つ以上、及
びTra−1〜60及びTra−1〜81と呼ばれる抗体を用いて検出可能なマーカーを
発現し得る(Thomson et al.,Science 282:1145,19
98)。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、SSEA−4、Tra−1〜60、
及びTra−1〜81の発現が消失し(存在する場合)、SSEA−1の発現が増大する
。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、次
いで製造業者(Vector Laboratories(Burlingame Ca
lif.))によって記載されるようにVector Redを基質として現像すること
によって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有する。未分化の多能性
幹細胞は、典型的には、RT−PCRによって検出されるOct−4及びTERTも発現
している。
胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば
、細胞を重症複合免疫不全症(SCID)マウスに注入し、形成される奇形腫を4%パラ
ホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを3胚葉由来の細胞型の根拠について組織学的に
調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この
胚様体を3つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定すること
ができる。
されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は「正常な核型」
を有することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がす
べて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。
使用可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期(必ずしもではない
が、通常は妊娠約10〜12週よりも前)に採取した前胚性組織(例えば胚盤胞など)、
胚性組織、胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株化細胞系
が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚性幹細胞株H1、H7及びH9(WiCel
l)などのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株である。更に、こうした細胞の初
期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、
供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される1次多能性細胞である。フィーダー
細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から得られる細胞も、フィーダー細胞
の存在下で既に培養された多能性幹細胞集団と同様、好適である。例えば、BG01v(
BresaGen,Athens,GA)などの変異型ヒト胚幹細胞株も好適である。例
えば、Takahashi et al.(Cell 131:1〜12(2007))
によって開示される細胞などの成人ヒト体細胞から誘導される細胞も好適である。
,843,780号、Science 282:1145,1998、Curr.Top
.Dev.Biol.38:133 ff.,1998、Proc.Natl.Acad
.Sci.U.S.A.92:7844,1995)に記載されているように調製される
。
好適な多能性幹細胞は、Takahashi et al.(Cell 126:663
〜676,2006)に記載の方法に従って誘導することができる。
ell Stem Cell 4:16〜19,2009)に記載の方法に従って誘導す
ることができる。
al.(Cell Stem Cell 1:55〜70,2007)に記載の方法に
従って誘導することができる。
t.al(Cell Stem Cell 2:230〜240)に記載の方法に従って
誘導することができる。
al.(Nature Biotechnology 26:101〜106,200
8)に記載の方法に従って誘導することができる。
t al.(Cell 131:861〜872,2007)に記載の方法に従って誘導
することができる。
56,149号(Centocor R&D,Inc.に譲渡)に記載の方法に従って誘
導することができる。
一実施形態では、多能性幹細胞は、本発明の方法に従って培養するのに先立って、様々
な点で多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞又は細胞外マトリクスタンパク質の層上で
培養する。例えば、多能性幹細胞を、細胞を実質的に分化させずに多能性幹細胞の増殖を
支持するフィーダー細胞層上で培養する。フィーダー細胞層上での分化をともなわない多
能性幹細胞の増殖は、(i)フィーダー細胞層を含んでいる培養容器を得て、(ii)別
の細胞型と予め培養することによって馴化させた培地を用いることで、又は例えば無血清
又は更には化学合成培地などの非馴化培地を用いることで支持される。
に分化させずに増殖を支持する培養系で多能性幹細胞を培養する。無フィーダー細胞培養
での分化をともなわない多能性幹細胞の増殖は、(i)1種以上の細胞外マトリクスタン
パク質を有する固体基質表面上の吸着層、及び(ii)別の細胞型と予め培養することに
よって馴化させた培地、又は、例えば無血清又は更には化学合成培地などの非馴化培地を
用いることで支持される。
、又は、例えば無血清又は更には化学合成培地などの非馴化培地中、少なくとも約0.5
%の窒素を含有し、酸素と窒素の合計量が17.2%以上であり、接触角が少なくとも約
13.9°である表面改質プレート上で培養する。
20072117号に見出すこともできる。本発明での使用に適した細胞培養培地の別の
例を、米国特許第6642048号に見出すこともできる。本発明での使用に適した細胞
培養培地の別の例を、国際公開第2005014799号に見出すこともできる。本発明
での使用に適した細胞培地の別の例を、Xu et al.(Stem Cells 2
2:972〜980,2004)に見出すこともできる。本発明での使用に適した細胞培
地の別の例を、米国特許出願公開第20070010011号に見出すこともできる。本
発明での使用に適した細胞培地の別の実施例を、Cheon et al.(BioRe
prod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870;1
9 Oct 2005)に見出すこともできる。本発明での使用に適した細胞培地の別の
例を、Levenstein et al.(Stem Cells 24:568〜5
74,2006)に見出すこともできる。本発明での使用に適した細胞培地の別の例を、
米国特許第20050148070号に見出すこともできる。本発明での使用に適した細
胞培地の別の例を、米国特許第20050233446号に見出すこともできる。本発明
での使用に適した細胞培地の別の例を、米国特許第6800480号に見出すこともでき
る。本発明での使用に適した細胞培地の別の例を、米国特許出願公開第20050244
962号に見出すこともできる。本発明での使用に適した細胞培地の別の例を、国際公開
第2005065354号に見出すこともできる。本発明での使用に適した細胞培地の別
の例を、国際公開第2005086845号に見出すこともできる。
Gibco No.11965−092;ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地(K
O DMEM)、Gibco No.10829−018;ハムF12/50% DME
M基礎培地;200mL L−グルタミン、Gibco No.15039−027;非
必須アミノ酸溶液、Gibco No.11140−050;β−メルカプトエタノール
、Sigma No.M7522;ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)
、Gibco No.13256−029などから調製することもできる。
一実施形態では、多能性幹細胞を培地で増殖させ、次いで別の細胞型への分化を促進す
るような方式で処理する。例えば、本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、
国際公開第2007030870号に開示されている方法に従って神経前駆細胞及び心筋
細胞へと分化させることもできる。
8,589号に開示されている方法に従って肝細胞へと分化させることもできる。
を発現している細胞への分化
本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞を、当該技術分野の任意の方法により
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることもできる。
al.,Nature Biotechnology 23,1534〜1541(20
05)に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している
細胞に分化させることもできる。
t al.,Development 131,1651〜1662(2004)に開示
されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化さ
せることもできる。
l.,Stem Cells 25,29〜38(2007)に開示されている方法に従
って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることもできる。
al.,Nature Biotechnology 24,1392〜1401(20
06)に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している
細胞に分化させることもできる。
Inc.に譲渡された、米国特許出願公開第11/736,908号に開示されている方
法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることも
できる。
Inc.に譲渡された、米国特許出願公開第11/779,311号に開示されている方
法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることも
できる。
Inc.に譲渡された、米国特許出願公開第12/493,741号に開示されている方
法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることも
できる。
Inc.に譲渡された、米国特許出願第12/494,789号に開示されている方法に
従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることもでき
る。
ルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより判定することができる。多能性
幹細胞は、典型的にはそのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化
は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出されることになる。
発現している細胞への分化
本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞は、当該技術分野の任意の方法により
、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させることもできる。
chnology 24,1392〜1401(2006)に開示されている方法に従っ
て、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることもできる。
いる細胞は、この胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を線維芽細胞増殖
因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤KAAD−シクロパミンで処理し、次いで
線維芽細胞増殖因子及びKAAD−シクロパミンを含有する培地を除去した後に、レチノ
イン酸、線維芽細胞増殖因子及びKAAD−シクロパミンを含有する培地中で培養するこ
とにより、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方
法の例は、Nature Biotechnology 24,1392〜1401(2
006)に開示されている。
いる細胞は、この胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第
11/736,908号(LifeScan,Inc.に譲渡)に開示された方法に従い
レチノイン酸及び1種の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、膵内胚
葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
いる細胞を、レチノイン酸(Sigma−Aldrich,MO)及びエキセンディン4
で処理し、次いでDAPT(Sigma−Aldrich,MO)及びエキセンディン4
を含有している培地を除去し、続いてエキセンディン1、IGF−1及びHGFを含む培
地で細胞を培養することにより、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと
更に分化させる。この方法の例は、Nature Biotechnology 24,
1392〜1401(2006)に開示されている。
る細胞は、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン4を含有
している培地で培養し、次にエキセンディン4を含有している培地を除去し、続いて細胞
をエキセンディン1、IGF−1及びHGFを含有している培地で培養することにより、
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、
D’Amour et al.,Nature Biotechnology,2006
に開示されている。
る細胞は、DAPT(Sigma−Aldrich,MO)及びエキセンディン4を含有
している培地で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞
へと更に分化する。この方法の例は、D’Amour et al.,Nature B
iotechnology,2006に開示されている。
る細胞は、エキセンディン4を含有している培地で培養することにより、膵内分泌系に特
徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、D’Amour
et al.,Nature Biotechnology,2006に開示されてい
る。
細胞は、LifeScan,Inc.に譲渡された、米国特許出願第11/736,90
8号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理すること
により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
細胞は、LifeScan,Inc.に譲渡された、米国特許出願第11/779,31
1号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理すること
により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
953,178号(LifeScan,Inc.に譲渡)に開示された方法に従って、ノ
ッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することにより、膵内分泌系に特徴的なマー
カーを発現している細胞へと更に分化する。
細胞は、米国特許出願第60/990,529号(LifeScan,Inc.に譲渡)
に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することによ
り、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
発現している細胞への分化
本発明の方法を使用して形成される多能性幹細胞は、当該技術の任意の方法により、膵
内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることもできる。
る細胞は、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン4を含有
している培地で培養し、次にエキセンディン4を含有している培地を除去し、続いて細胞
をエキセンディン1、IGF−1及びHGFを含有している培地で培養することにより、
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、
D’Amour et al.,Nature Biotechnology,2006
に開示されている。
る細胞は、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、DAPT(Sigma
−Aldrich,MO)及びエキセンディン4を含有している培地で培養することによ
り、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例
は、D’Amour et al.,Nature Biotechnology,20
06に開示されている。
る細胞は、エキセンディン4を含有している培地で培養することにより、膵内分泌系に特
徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、D’Amour
et al.,Nature Biotechnology,2006に開示されてい
る。
細胞は、LifeScan,Inc.に譲渡された、米国特許出願第11/736,90
8号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理すること
により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
細胞は、LifeScan,Inc.に譲渡された、米国特許出願第11/779,31
1号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理すること
により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
953,178号(LifeScan,Inc.に譲渡)に開示された方法に従って、ノ
ッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することにより、膵内分泌系に特徴的なマー
カーを発現している細胞へと更に分化する。
る細胞は、米国特許出願第60/990,529号(LifeScan,Inc.に譲渡
)に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することに
より、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
れるものではない。
ウシ胎児血清の非存在下での、ヒト胚性幹細胞株H1の、膵内分泌細胞への分化
様々な継代数のヒト胚性幹細胞株H1細胞(p40〜p52)を、マトリゲル(1:3
0希釈)をコーティングしたディッシュで培養し、以下の複数工程プロトコルを用い膵臓
系に分化させた:
a.ステージI(胚体内胚葉):ヒト胚性幹細胞を、2%のBSA(脂肪酸不含)(カ
タログ番号68700,Proliant,IA)、及び100ng/mLのアクチビン
A(R&D Systems,MN)に加え、20ng/mLのWNT−3a(カタログ
番号1324−WN−002,R&D Systems,MN)及び8ng/mLのbF
GF(カタログ番号100−18B,PeproTech,NJ)を添加したRPMI培
地で1日間培養した。次いで、細胞を、2%のBSA及び100ng/mLのアクチビン
Aに加え8ng/mLのbFGFを添加したRPMI培地で更に2日間処理した。次いで
b.ステージII(初期腸管):細胞を、RPMI+2%のBSA(脂肪酸不含)及び
50ng/mLのFGF7及び0.25μMのSANT−1(#S4572,Sigma
,MO)で2〜3日間処理した。次いで
c.ステージIII(前腸後部(Posterior foregut)):細胞を、1:200希釈し
たITS−X(Invitrogen,CA)及び0.1% BSA(Lipid Ri
ch)(Invitrogen,カタログ番号11021−045)、50ng/mLの
FGF7、0.25μMのSANT−1、2μMのレチノイン酸(RA)(Sigma、
MO)、100ng/mLのノギン(R&D Systems,MN)、及び20ng/
mLのアクチビンAを添加したDMEM/高グルコースで4日間処理した;特定の変法で
は、ノギンを濃度2μMのAMPK阻害剤6−[4−(2−ピペリジン−1−イルエトキ
シ)フェニル]−3−ピリジン−4−イルピラゾロ[1,5−a]ピリミジン(Sigm
a,製品番号.P5499)で置き換えた。更に他の変法では、P38阻害剤(4−[4
−(4−フルオロフェニル)−1−(3−フェニルプロピル)−5−ピリジン−4イル−
1H−イミダゾール−2−イル]ブタ−3−イン−1−オール)(米国特許第6,521
655号に開示)を2.5μMで添加した。次いで、
d.ステージIV(膵内分泌前駆体):細胞を、1:200希釈したITS−X(In
vitrogen,CA)及び0.1%のBSA(Invitrogen,Ca)、10
0ng/mLのノギン、1μMのALK5阻害剤(SD−208,Molecular
Pharmacology 2007 72:152〜161に開示)を添加したDME
M/高グルコースで3日間処理した。次いで、
e.ステージV(膵内分泌細胞):細胞を、1:200希釈したITS−X(Invi
trogen,CA)、0.1%のBSA(Invitrogen,Ca)、1μMのA
LK5阻害剤II(カタログ番号616452,Calbiochem,Ca)を添加し
たDMEM/高グルコースで7日間処理した。次いで、
f.ステージVI(成熟膵内分泌細胞):細胞を、1:200希釈したITS−X(I
nvitrogen,CA)、0.1%のBSA(Invitrogen,Ca)を添加
したDMEM/高グルコースで7日間処理し、培地は1日おきに交換した。
フローサイトメトリーによる特徴付け及び濃縮した様々な膵細胞系の選別
実施例1に概説される分化プロセスの様々なステージを形成する新規細胞集団の単離及
び特徴付けを促進するために、様々なステージから得た細胞の詳細な特徴付けをフローサ
イトメトリーにより行った。使用した抗体、及び様々な分化ステージにおける表面マーカ
ーの発現レベルの、完全な一覧を表Iに示す。
ィングしたプレートで培養し、実施例1に記載のプロトコルを用い膵内分泌細胞ヘと分化
させた。
テージIV)、膵内分泌細胞(ステージV)又は成熟膵内分泌細胞(ステージVI)を3
7℃で2〜3分間TrypLE Express(Invitrogen製品番号126
04,CA)中でインキュベーションすることで、穏やかに遊離させ、2%のBSA(B
D製品番号554657,CA)を含有しているBD FACS染色緩衝液で2度洗浄し
た。およそ0.5〜1×106個の細胞を、染色に備え100〜200μLのブロッキン
グ緩衝液(染色緩衝液(BD,CA)に1:4希釈した0.5%のヒトγ−グロブリン)
に再懸濁させた。一次抗体を直接結合させる染色に際し、適切な抗体を最終希釈濃度1:
20で細胞に添加し、細胞を4℃で30分間インキュベートした。未結合の抗体に関し、
一次抗体を希釈率1:50〜1:100で細胞に添加し、細胞を4℃で30分間インキュ
ベートし、染色緩衝液で2度洗浄した。次いで、細胞を、1:500希釈した適切な二次
抗体中でインキュベートした。染色した細胞を300μLの染色緩衝液に再懸濁し、生細
胞/死細胞を識別するため、BD FACS Canto IIでの解析前に5〜10μ
Lの7AADを添加した。
に同様に加工した。細胞を、表IIに示すような適切な抗体で染色した。細胞を、表II
に要約されるように2つ又は3つの下位集団に選別した。細胞選別ゲートは、対照に一致
するイソタイプに基づいて設定した。選別した細胞のアリコートを選別後に純度に関し解
析した後、重要な膵臓マーカーの発現に関しPCR解析した。予選別した試料及び様々な
画分から、Rneasyミニキット(Qiagen,CA)を用いRNAを回収した。
テージにて解析される細胞集団の、多様なマーカーの発現に基づいて選択した。本研究で
採用したマーカーを表IIに開示する。簡潔に言えば、表IIに開示される表面マーカー
を、単独で、又は組み合わせて用いて様々な細胞集団を選別した。選別した細胞試料を用
い、膵内分泌系に特徴的なマーカーの発現についてリアルタイムPCRにより解析した。
実施例1に概説される分化プロトコルのステージIVから得た細胞集団の選別には、C
D56及びCD13に対する抗体を使用した。3つの細胞集団:a)細胞集団CD56+
CD13-、b)細胞集団CD56-CD13-、及びc)細胞集団CD56-CD13+を
識別した。CD56+CD13-集団は、ステージIVの選別されていない細胞、又はCD
56-CD13-細胞集団、又はCD56-CD13+細胞集団と比較した場合に、選別後に
およそ1.3倍に濃縮され、選別された細胞は、NEUROD、NGN3、PDX1、N
KX6.1、NKX2.2及びPAX−4を包含する膵内分泌系に特徴的なマーカーの発
現に関し非常に濃縮されていた。図1のパネルa〜fを参照のこと。
た細胞集団を、CD133に対する抗体を使用して選別した。2つの細胞集団:a)細胞
集団CD133+、及びb)細胞集団CD133-を識別した。CD133-集団は、ステ
ージIVの選別されていない細胞、又はCD133+細胞集団と比較した場合に、選別後
におよそ1.9倍に濃縮され、選別された細胞は、NEUROD、NGN3、PDX1、
NKX6.1、NKX2.2及びPAX−4を包含する膵内分泌系に特徴的なマーカーの
発現に関し非常に濃縮されていた。図2のパネルa〜fを参照のこと。
た細胞集団を、CD49cに対する抗体を使用して選別した。2つの細胞集団:a)細胞
集団CD49cHI、及びb)細胞集団CD49cLOを識別した。CD49cLO細胞は、選
別されていない細胞、又はCD49cHI細胞集団と比較した場合に、選別後におよそ3.
1倍に濃縮され、選別された細胞は、NEUROD、NGN3、PDX1、及びNKX6
.1を包含する膵内分泌系に特徴的なマーカーの発現に関し非常に濃縮されていた。図3
のパネルa〜dを参照のこと。
た細胞集団を、CD56及びCD15に対する抗体を使用して選別した。次の細胞集団を
識別した:a)細胞集団CD56+CD15LO、b)細胞集団CD56+CD15HI、c)
細胞集団CD15+及びd)細胞集団CD15-。細胞集団CD15-は選別後におよそ1
.1倍に濃縮された。細胞集団CD56+CD15loは、選別されていない細胞、又は細
胞集団CD56+CD15hiと比較した場合に、選別後非常に濃縮され、選別された細胞
は、NEUROD、NGN3、PDX1、NKX6.1、インスリン及びグルカゴンを包
含する膵内分泌系に特徴的なマーカーの発現に関し非常に濃縮されていた。図4のパネル
a〜fを参照のこと。同様にして、単一マーカーを使用して選別した細胞集団CD15-
は、選別されていない細胞、又は細胞集団CD15+と比較した場合に、NEUROD、
NGN3、PDX1、NKX6.1、NKX2.2、PAX−4、グルカゴン及びインス
リンを包含する膵内分泌系に特徴的なマーカーの発現に関し非常に濃縮されていた。図5
のパネルa〜hを参照のこと。
た細胞集団を、CD56及びCD57に対する抗体を使用して選別した。2つの細胞集団
:a)細胞集団CD56+CD57+、及びb)細胞集団CD56+CD57-を識別した。
細胞集団CD56+CD57+は、選別後におよそ1.9倍に濃縮された。CD56+CD
57+細胞は、選別されていない細胞、又は細胞集団CD56+CD57-と比較した場合
に、NEUROD、NGN3、PDX1、NKX6.1、NKX2.2並びにインスリン
及びグルカゴンを包含する膵内胚葉系に特徴的なマーカーの発現に関し非常に濃縮されて
いた。図6のパネルa〜gを参照されたい。実施例1に概説される分化プロトコルのステ
ージVの細胞集団を、CD56及びCD57に対する抗体を用い選別した場合にも、同様
の結果が観察された。
た細胞集団を、CD56及びCD184に対する抗体を使用して選別した。3つの細胞集
団を識別した:a)細胞集団CD184+、b)細胞集団CD184-、及びc)細胞集団
CD56+CD184-。表IVは、濃縮前後の細胞におけるCD184の発現について要
約する。細胞集団CD184+を、PAX4、NEUROD、NKX6.1、PDX1及
びPTF1 αを包含する膵内分泌系に特徴的なマーカーの発現に関し濃縮した。ZIC
1、アルブミン及びCDX2の発現は減少していた。図7のパネルa〜iを参照のこと。
実施例1に概説される分化プロトコルのステージVIから得た細胞集団の選別には、C
D98に対する抗体を使用した。2つの細胞集団を識別した:a)細胞集団CD98+(Hi
)、及びb)細胞集団CD98-(Lo)。細胞集団CD98+(Hi)は、選別後におよそ1.6
倍に濃縮された。NEUROD、NGN3、インスリン、及びグルカゴンの発現に関しC
D98+(Hi)細胞を濃縮した。図8のパネルa〜dを参照のこと。
細胞集団を、CD47に対する抗体を使用して選別した。2つの細胞集団:a)細胞集団
CD47Hi(+)、及びb)細胞集団CD47Lo(-)を識別した。細胞CD47Lo(-)は選別
後におよそ3.3倍に濃縮された。NEUROD、NGN3、PDX1、NKX6.1、
NKX2.2及びPAX4の発現に関しCD47Lo(-)細胞を濃縮した。図9のパネルa
〜fを参照のこと。
た細胞集団を、CD47に対する抗体を使用して選別した。2つの細胞集団:a)細胞集
団CD47Hi(+)、及びb)細胞集団CD47Lo(-)を識別した。CD47Lo(-)細胞を、
PDX−1、NKX6.1、NKX2.2、PAX−4、PTF1a、NGN3、インス
リン及びグルカゴンの発現に関し濃縮した。図10のパネルa〜hを参照のこと。
初期腸管ステージ(ステージ2)のLif受容体陽性細胞の選別
継代数44のヒト胚性幹細胞株H1の細胞を、マトリゲルをコーティングしたプレート
で培養し、以下のプロトコルを用いてインスリン産生細胞へと分化させた:
a.2%のBSA(脂肪酸不含)(カタログ番号68700,Proliant,IA
)、及び100ng/mLのアクチビンA(R&D Systems,MN)に加え20
ng/mLのWNT−3a(カタログ番号1324−WN−002,R&D Syste
ms,MN)及び8ng/mLのbFGF(カタログ番号100−18B,PeproT
ech,NJ)を添加したRPMI培地で1日処理した後に、2%のBSA、100ng
/mLのアクチビンA、8ng/mLのbFGFを添加したRPMI培地で更に2日間処
理し(ステージ1)、次いで
b.RPMI+2%のBSA+50ng/mLのFGF7+0.25μMのSANT−
1(#S4572,Sigma,MO)で3日間処理し(ステージ2)、次いで
c.DMEM/高グルコース+1:200希釈したITS−X(Invitrogen
,CA)+0.1%のBSA(Invitrogen,Ca)+50ng/mLのFGF
7(Peprotech,NJ)+0.25μMのSANT−1+2μMのレチノイン酸
(RA)(Sigma,MO)+100ng/mLのノギン(R & D System
s,MN)及び20ng/mLのアクチビンAで4日間処理し(ステージ3)、次いで
d.DMEM/高グルコース+1:200希釈したITS−X(Invitrogen
,CA)+0.1% BSA(Invitrogen,Ca)+100ng/mLのノギ
ン+1μMのALK5阻害剤(SCI0120)+で3日間処理した(ステージ4)
lsbad,CA)を用い単独の細胞へと分散させ、ステージ4の基本培地(DM−Hg
+ITS−X+BSA)で洗浄した。放出された細胞をスピンダウンし、得られた細胞ペ
レットを、2%のBSA、0.05%のアジ化ナトリウム/PBS(Sigma,MO)
からなる染色緩衝液に懸濁した。必要に応じて、0.1%γ−グロブリン(Sigma)
溶液を使用して、細胞のFc−受容体を15分間ブロックした。アリコート(およそ10
5個の細胞)を、モノクローナル抗体と結合させた(106個の細胞あたり抗体5μL)L
if受容体−フィリコエリトリン(PE)(R & D Systems,MN)と共に
インキュベートした。対照には、適切なアイソタイプと一致する抗体と、未染色の細胞を
包含させた。抗体を用いるインキュベーションは、すべて4℃で30分間行い、その後細
胞を染色緩衝液で洗浄した。染色した細胞をFACS Aria(BD,Ca)で選別し
た。予分類試料(presort sample)、Lif受容体+フラクション及びLif受容体陰性
フラクションから、RNA(Rneasy Mini Kit,Qiagen,CA)を
回収した。Lif受容体の発現レベル及び発現パターンを表IIIに要約する。
ジ2の3日目では、細胞のおよそ70%がLif受容体を発現していた。表IIIに要約
されるように、ステージ2の細胞ではLif受容体が高発現であったことが特徴的であっ
たが、ステージ3及び4の細胞ではLif受容体の発現は最低限のものであった。図11
中のパネルa〜bに示されるとおり、Lif受容体が豊富であるステージ2の細胞は、未
選別の細胞又はLif受容体陰性の細胞と比較して、HNF4 αの発現が有意に上昇し
た。リアルタイムPCRにより測定されたLif受容体mRNAの発現は、Lif−受容
体陽性細胞を含有している細胞フラクションでも豊富であった。
インビボでの腫瘍形成を低減させるためにSSEA−4+細胞を枯渇させるための磁気
ビーズによる細胞選別
SSEA4抗原の発現はヒト胚性幹細胞の多能性の重要な指標であり、分化過程でこの
マーカーの発現は非常に下方制御される。しかしながら、残りのSSEA−4陽性細胞も
、ある程度分化させた細胞を移植させた後に観察される腫瘍及び/又は奇形腫に対して応
答性である恐れがある。奇形腫の形成を低減させるにあたり、分化させた細胞集団に混入
しているSSEA4+細胞を移植前に枯渇させるための方法が開発されてきた。
の様々なステージへと分化させた。SSEA−4を枯渇させる概念及び有効性を証明する
ために、本実験では、まず始めに、細胞がSSEA−4を依然として高発現していること
を保証するために、細胞をただ初期腸管ステージ(実施例1に概説される分化プロトコル
のステージ2)に分化させた。続く実験において、実施例1に概説される分化プロトコル
のステージ4で、分化させた細胞集団からSSEA−4を発現している細胞を枯渇させた
。観察結果については表Vを参照されたい。37℃で2〜3分間、TrypLE Exp
ress(Invitrogen # 12604,CA)と共にインキュベートするこ
とで、細胞を単独の細胞へと穏やかに遊離させた。枯渇時の、細胞の生存性及び活性を向
上させるため、細胞を回収する前に、すべての単離緩衝液に10μMのY−27632(
カタログ番号Y 0503,Sigma,St Louis MO)又は0.5μMのT
hiazovivin(カタログ番号04−0017,Stemgent,San Di
ego,CA)を含む抗アポトーシス剤を細胞に添加した。
Ca2+及びMg2+は不含)からなる分離緩衝液で、細胞を洗浄した。10〜100×10
6個の細胞を、500μLあたりの最終的な細胞密度が5×106個になるように分離緩衝
液に再懸濁した。細胞500μLあたり25μLのSSEA−4抗体を添加し、持続的に
混合するために穏やかに揺らす装置を用い、細胞を室温で15〜20分間インキュベート
した。300xgで8分間スピンさせて、分離緩衝液で細胞を洗浄した。上清を除去し、
細胞を元の容量の緩衝液に再懸濁し、細胞懸濁液500μL毎に、予洗浄したSSEA−
4 Depletion beads(DynaBeads(登録商標)SSEA−4,
Invitrogen,#11160D)を50μL加えた。細胞及びビーズを混合し、
持続的に穏やかに傾斜及び回転させながら室温で15〜20分間インキュベートした。穏
やかにピペッティングすることで細胞を混合し、磁気上に5分間配置した。SSEA−4
陰性細胞を含有している上清を新しいチューブに移し、残留ビーズを取り除くために、こ
のプロセスを2〜3回繰り返した。ビーズに結合したSSEA4+細胞を磁場から放出さ
せ、両方の細胞集団を計数し、FACS及びPCR解析のために加工した。未分化のH1
細胞、初期腸細胞及びステージIVの細胞の、細胞の選別前及び選別後のSSEA4の発
現レベルを、どちらも表Vに要約する。
に細胞の20.5%がSSEA4マーカーを発現していた。対照的に、選別後には細胞の
1.8%がSSEA4を発現していた(表V)。枯渇により、SSEA−4陽性細胞のう
ち91.2%が除去されたことになる。内分泌腺前駆細胞を用いる別の実験では、枯渇前
には細胞の25.3%がSSEA−4を発現していたが、枯渇後にはわずかに0.9%の
みがSSEA−4を発現しており、SSEA−4陽性細胞のうち95.5%が除去されて
いた(表V)。分化細胞とは対照的に、未分化の胚性幹細胞集団では91.2%がSSE
A4を発現していた。
包含する多能性マーカーを非常に高発現していた(図12のパネルa〜d)。
FACSによるSSEA4+(HI)及びSSEA4(LO)細胞の選別
分化細胞から多能性マーカー(SSEA−4+)に富む細胞をフローサイトメトリーに
より枯渇させることの調査及びその確認のため、細胞を実施例1に記載のようにステージ
VIヘと分化させた。TrypleE Expressの細胞解離緩衝液を用い、培養物
から細胞を解離させ、実施例2で記載されたように選別するにあたり細胞を調製した。S
SEA−4抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN,カタログ番
号FAB1435P)を使用し、SSEA−4(+)Hi細胞群及びSSEA−4(−)
Lo細胞群として識別される2つの細胞画分へと分離した。分離した細胞画分を、実施例
4に記載されるようにRT−PCRにより、多能性マーカーの発現について解析した。実
施例5に記載されるように、磁気ビーズを用い分離した、SSEA−4を枯渇させた画分
及び濃縮させた画分も同様に、選別されたSSEA−4(+)Hi細胞では、SSEA−
4(−)Lo細胞とは異なり多能性マーカーのOCT4、NANOG、SOX2及びグー
スコイドの発現度が非常に高かった。図13のパネルa〜dを参照のこと。
SSEA−4を枯渇させた細胞集団のインビボ移植
予備実験では、SSEA−4を枯渇させた細胞を、実施例1に概説される分化プロトコ
ルのステージIVへと分化させ、次いでマウスの腎被膜ヘと移植し、細胞が生存し、生着
するかを試験した。移植したマウスから得たデータを表VIに要約する。
ac−Prkdcscid−Lystbg N7)をTaconic Farmsより購入した
。滅菌した餌と水を自由に利用できるような状態で、マウスをmicroisolato
rケージ内に収容した。外科手術を準備するため、マウスをイヤータグで同定し、体重を
測定し、手持ち式glucometer(LifeScan;One Touch)を用
いて血糖を測定した。マウスにイソフルランと酸素の混合物で麻酔をかけ、手術部位を小
動物用はさみで剪毛した。マウスには手術前に皮下に0.1mg/kgのBuprene
xを投与した。70%イソプロピルアルコール、10%ポビドンヨード、及び70%イソ
プロピルアルコールで連続的に洗浄して手術部位の用意をし、皮膚層と筋層を貫通させて
左側切開部を作製した。左腎を露出させ、0.9%塩化ナトリウムで保湿させた。24G
×3/4”I.V.カテーテルを使用して腎臓被膜を貫通させた後、針を除去した。次い
で腎臓被膜下でカテーテルを腎臓の遠位端まで前進させた。
回収するのに十分な量の培地を残しつつほとんどの上清を除去した。細胞をRainin
製Pos−Dポジティブディスプレイスメント式ピペットに回収し、ピペットを反転させ
て重力により細胞を沈降させた。移植用に充填した細胞調製物を残して過剰な培地を除去
した。
臓皮膜下でカテーテルを通してピペットから細胞を分配し、腎臓の遠位極に供給した。カ
テーテルの内腔に少量の培地を流し、残留している細胞を放出させ、カテーテルを引き抜
いた。腎臓皮膜を低温焼灼でシールし、腎臓を解剖学的な元の位置に戻した。5−0 v
icrylを用いて連続縫合することで筋を縫合し、皮膚を創傷クリップにより閉じた。
マウスには手術後に1.0mg/kg Metacamを皮下投与した。マウスを麻酔か
ら覚めさせ、完全に回復させた。
は様々な間隔で3g/kgグルコースを腹腔内投与し、グルコース注入の60分後に、ヘ
パリンを少量含有している遠心管に後眼窩静脈洞から血液を吸引した。血液を遠心分離し
、2本目の遠心管中に血漿を配置し、ドライアイス上で凍結させ、その後、ヒトcペプチ
ドアッセイを実施するまでの間−80℃で保管した。ヒトc−ペプチドレベルは製造者に
よる取扱説明書に従って、Mercodia/ALPCO社の診断用超高感度Cペプチド
ELISAを用いて測定した。
採取し、リアルタイムqPCR、免疫組織化学、及び病理の面から解析した。
iii)SSEA4を枯渇させた単独の細胞、から構成される3.3×106個の細胞を
移植した。ステージIVへと分化させた細胞は、SSEA−4の枯渇に際し、穏やかに掻
き取って小さな細胞クラスターにするか、又はTrypleEにより単独の細胞へと剥離
させるかした。実施例5に概説されるようなSSEA−4の枯渇後、移植する前に、低接
着プレート(Costar,Coming Incorporated,NYカタログ番
号3471)を用い、細胞クラスター及び単独の細胞調製物のどちらも、前駆(ステージ
IV)細胞分化培地に一晩再播種した。10μMの濃度で、rock阻害剤Y−2763
2ジヒドロクロリド一水和物(Sigma,カタログ番号Y0503)を一晩培養物に添
加した。移植後、マウスを上記のように最大で12週間にわたって監視した。移植片の生
存率は、単独の細胞レシピエント(枯渇又は未枯渇)では視覚的には確認されなかったが
、5匹中2匹のマウスで細胞クラスターの受容が観察された。細胞クラスターを受容した
、5匹中1匹のマウスでは、移植後12週間の時点ではC−ペプチド濃度が検出可能なレ
ベルになっていた。予備実験では移植片の生存率が低かったのは、細胞の品質が低下して
いたこと、及び移植細胞数が少なかったことが原因である。
くつかの中間段階を経て、成熟した、膵内分泌細胞ヘと分化させる複数工程は、表面マー
カーの発現の動的な変化と関連付けられるものである。この分化プロトコルでは、外胚葉
細胞型及び中胚葉細胞型を含む、限定されていない複数系統の細胞の不均一な集団が生じ
るが、膵分化培地において表面マーカーの発現の変化を追うことで、細胞の濃縮及び精製
に有用であり得るマーカーを識別することができる。表VIIは、発現の増加又は減少の
いずれかが証明された表面マーカーの要約を示す。これらの表面マーカーの発現は、膵内
胚葉細胞の陰性又は陽性の選別に有用であり得る。分化プロセス中に発現が減少したマー
カーとしては、CD117、CD133、CD181、CD184、CD200、CD2
21、CD326、CD55、CD57、CD9、及びCD98が挙げられる。分化プロ
セス中に発現が減少したマーカーとしては、CD13、CD141、CD15、CD31
8、CD46、CD47、CD49c、CD49e、CD56、及びCD73が挙げられ
る。これらのマーカーを単独で、又は様々に組み合わせて使用することで、膵臓内胚葉及
び前駆細胞に関し濃縮された細胞集団を精製することができる。
フローサイトメトリーによる選別手順
成熟段階が異なる細胞を、TrypLE Express(Invitrogen#
12604,CA)で37℃で2〜3分インキュベートすることで穏やかに剥離させ、2
%のBSAを含有させたBD FACS染色緩衝液(BD # 554657,CA)で
2回洗浄した。染色させるため、細胞の収率に基づき、20〜50×106個の単独細胞
を、2〜3mLのブロッキング緩衝液(0.5%のヒトγ−グロブリンを染色緩衝液(B
D,CA)に1:4希釈させたもの)に再懸濁した。フルオロフォアを結合させた一次抗
体を最終希釈率1:20で細胞に添加し、細胞を4℃で30分間インキュベートした。洗
浄後、染色した細胞を2〜3mLの染色緩衝液に再懸濁した。解析及び細胞選別に先立ち
、生細胞/死細胞の識別のために、50〜60μLの7AADを添加した。対照IgG抗
体と一致するアイソタイプを陰性対照の染色に使用した。選別前のフルオロフォアの補償
値を算出するにあたり、細胞は未染色のままにするか、あるいは、フルオレセインイソチ
オシアネート(FITC)、フィリコエリトリン(PE)又はアロフィコシアニン(AP
C)、核染料7−アミノアクチノマイシン(Aminoactinomucin)D(7−AAD)のうち
のいずれかのフルオロフォアで染色するかした。
胞選別を実施した。対照細胞と一致するアイソタイプを使用して、各細胞選別の陰性ゲー
トを設定した。各細胞選別実験に関し、光電子増倍管(PMT)の電圧設定は適切なフル
オロフォア補償値を用い調整し、明るい集団(陽性(+)又はHi)及び暗い集団又は細
胞サブセット(陰性(−)又はLo)を検出した。典型的には、陽性細胞集団(+又はH
i)は、第3 decade以上のオーダー(104)であるのに対し、陰性集団は第1
〜第2 decade(102〜103)にあった。設定されたゲートを用い、100μM
のノズルを用い、流速1.0で細胞を選別した。選別後に細胞の少量のアリコートを分析
して、選別した細胞サブセットの精製具合を評価した。RT−PCR解析にあたり、Rn
easyミニキット(Qiagen,CA)を使用し、予選別及び選別細胞からRNAを
回収した。
ものとする。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明し
たが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈さ
れる以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。
・「表面マーカーに関連する変化」は、細胞が胚体内胚葉(DE,ステージI)から膵内胚葉(PE,ステージIII)へと、及び最終的には内分泌細胞(ステージV/VI)へと分化する場合に、特定の表面マーカーの発現レベルが増加するのか又は減少するのかについて記載する。
本発明は次の実施態様を含む。
(1) 膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団からのインスリン産生細胞の生成効率を増加させる方法であって:
a.多能性幹細胞集団を培養する工程、
b.前記多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程、
c.前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程、
d.前記初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程、並びに
e.前記膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程、並びに
f.前記膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、哺乳動物に少なくともある程度の量移植する工程、を含む、方法。
(2)前記初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団が濃縮されている、上記(1)に記載の方法。
(3)前記初期腸管に特徴的なマーカーを発現している細胞集団が、前記初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、Lif受容体に結合することのできる試薬と接触させることで濃縮される、上記(2)に記載の方法。
(4)前記膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、CD9、CD13、CD15、CD47、CD56、CD73、CD117、CD133、CD184、CD200、CD318、CD326及びSSEA4からなる群から選択されるマーカーと結合することのできる少なくとも1種の試薬と接触させる、上記(1)に記載の方法。
(5)前記哺乳動物がヒトである、上記(1)に記載の方法。
Claims (7)
- 膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団からのインスリン産生細胞の生成効率を増加させる方法であって:
a.多能性幹細胞集団を培養する工程、
b.前記多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程、
c.前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程、
d.前記初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程、
e.前記膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団へと分化させる工程、並びに
f.下記の細胞集団:
(i.) CD56陽性でCD13陰性である膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団、
(ii.) CD133陰性である膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団、
(iii.) CD49cLOである膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団、
(iv.) CD56陽性でCD15loである膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団、又は
(v.) CD56及びCD57が双方とも陽性である膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団、
の一つ以上を単離し、これにより濃縮された細胞集団を生成することで、前記膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、NEUROD、NGN3、PDX1及びNKX6.1の発現について濃縮する工程
を含む、方法。 - 前記初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を濃縮する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団が、前記初期腸管系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団を、Lif受容体に結合することのできる試薬と接触させることで濃縮される、請求項2に記載の方法。
- 前記膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団が、
下記の細胞集団:
(i.) CD56陽性でCD13陰性である膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団、
(ii.) CD56陽性でCD15loである膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団、又は
(iii.) CD56及びCD57が双方とも陽性である膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞集団、
の一つ以上を単離し、これにより濃縮された細胞集団を生成することにより、
濃縮されるものである、請求項1に記載の方法。 - 前記細胞がフローサイトメトリーを用いて濃縮されるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞がFACSを用いて濃縮されるものである、請求項1に記載の方法。
- 膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞が膵内分泌前駆細胞である、請求項1及び4〜6のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US30919310P | 2010-03-01 | 2010-03-01 | |
US61/309,193 | 2010-03-01 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012556130A Division JP6013196B2 (ja) | 2010-03-01 | 2011-02-28 | 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017012159A JP2017012159A (ja) | 2017-01-19 |
JP6527487B2 true JP6527487B2 (ja) | 2019-06-05 |
Family
ID=44505394
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012556130A Active JP6013196B2 (ja) | 2010-03-01 | 2011-02-28 | 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法 |
JP2016110884A Active JP6527487B2 (ja) | 2010-03-01 | 2016-06-02 | 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012556130A Active JP6013196B2 (ja) | 2010-03-01 | 2011-02-28 | 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9969981B2 (ja) |
EP (1) | EP2542667A4 (ja) |
JP (2) | JP6013196B2 (ja) |
KR (2) | KR101928299B1 (ja) |
CN (2) | CN107189979B (ja) |
AR (1) | AR080434A1 (ja) |
AU (1) | AU2011223900A1 (ja) |
BR (1) | BR112012022145A2 (ja) |
CA (1) | CA2791476C (ja) |
MX (1) | MX358451B (ja) |
PH (1) | PH12018501127A1 (ja) |
RU (2) | RU2702198C2 (ja) |
SG (2) | SG183535A1 (ja) |
WO (1) | WO2011109279A2 (ja) |
ZA (1) | ZA201708538B (ja) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107189979B (zh) * | 2010-03-01 | 2021-05-04 | 詹森生物科技公司 | 纯化衍生自多能干细胞的细胞的方法 |
WO2012175633A1 (en) | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Novo Nordisk A/S | Efficient induction of definitive endoderm from pluripotent stem cells |
RU2668798C2 (ru) * | 2011-12-22 | 2018-10-02 | Янссен Байотек, Инк. | Способы in vitro пошаговой дифференцировки полюрипотентных клеток |
WO2014030166A1 (en) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of isolating distinct pancreatic cell types |
JP6514689B2 (ja) | 2013-06-11 | 2019-05-15 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | SC−β細胞及び組成物並びにその生成方法 |
US10190096B2 (en) | 2014-12-18 | 2019-01-29 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived β cells and uses thereof |
WO2016100898A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof |
CN113234661A (zh) | 2014-12-18 | 2021-08-10 | 哈佛学院校长同事会 | 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法 |
USD772896S1 (en) | 2015-02-06 | 2016-11-29 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Display screen or portion thereof with icon |
KR101643555B1 (ko) * | 2015-03-12 | 2016-07-28 | 한국과학기술원 | Stra6를 이용한 기능적으로 성숙된 인간 줄기세포 유래 간세포의 선별 방법 |
US10590392B2 (en) | 2017-01-09 | 2020-03-17 | Trustees Of Boston University | Generation of airway epithelial organoids from human pluripotent stem cells |
US10386368B2 (en) | 2017-02-24 | 2019-08-20 | Trustees Of Boston University | Isolation of human lung progenitors derived from pluripotent stem cells |
US10767164B2 (en) | 2017-03-30 | 2020-09-08 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation |
JP7428653B2 (ja) | 2017-11-15 | 2024-02-06 | バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 島細胞製造組成物および使用方法 |
CA3108275A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived islet differentiation |
WO2020243665A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
US20220234006A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-07-28 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
EP3976237A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates Inc. | Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances |
AU2020284245B2 (en) | 2019-05-31 | 2023-10-05 | Viacyte, Inc. | A biocompatible membrane composite |
WO2021042283A1 (zh) * | 2019-09-04 | 2021-03-11 | 京东方科技集团股份有限公司 | 纹路识别装置及显示装置 |
DE112022001490T8 (de) * | 2021-03-15 | 2024-03-07 | Tohoku Steel Co., Ltd. | Lastsensor und lasterfassungsvorrichtung |
CA3231258A1 (en) * | 2021-09-22 | 2023-03-30 | Ngoc THAI | Compositions and methods for propogating insulin and glucagon secreting cells from type 1 diabetic pancreatic tissue and therapeutic uses thereof |
Family Cites Families (264)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3209652A (en) * | 1961-03-30 | 1965-10-05 | Burgsmueller Karl | Thread whirling method |
AT326803B (de) * | 1968-08-26 | 1975-12-29 | Binder Fa G | Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben |
US3935067A (en) * | 1974-11-22 | 1976-01-27 | Wyo-Ben Products, Inc. | Inorganic support for culture media |
CA1201400A (en) | 1982-04-16 | 1986-03-04 | Joel L. Williams | Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture |
US4499802A (en) * | 1982-09-29 | 1985-02-19 | Container Graphics Corporation | Rotary cutting die with scrap ejection |
US4537773A (en) * | 1983-12-05 | 1985-08-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | α-Aminoboronic acid derivatives |
US4557264A (en) * | 1984-04-09 | 1985-12-10 | Ethicon Inc. | Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene |
US5089396A (en) * | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US5215893A (en) * | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US4737578A (en) * | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
US5863531A (en) * | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
CA1340581C (en) * | 1986-11-20 | 1999-06-08 | Joseph P. Vacanti | Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices |
US5567612A (en) * | 1986-11-20 | 1996-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making |
US5804178A (en) * | 1986-11-20 | 1998-09-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue |
NZ229354A (en) | 1988-07-01 | 1990-09-26 | Becton Dickinson Co | Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface |
EP0363125A3 (en) | 1988-10-03 | 1990-08-16 | Hana Biologics Inc. | Proliferated pancreatic endocrine cell product and process |
US5837539A (en) * | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
WO1992019759A1 (en) | 1991-04-25 | 1992-11-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor |
US5449383A (en) * | 1992-03-18 | 1995-09-12 | Chatelier; Ronald C. | Cell growth substrates |
GB9206861D0 (en) * | 1992-03-28 | 1992-05-13 | Univ Manchester | Wound healing and treatment of fibrotic disorders |
CA2114282A1 (en) * | 1993-01-28 | 1994-07-29 | Lothar Schilder | Multi-layered implant |
JP3525221B2 (ja) | 1993-02-17 | 2004-05-10 | 味の素株式会社 | 免疫抑制剤 |
WO1994023572A1 (en) | 1993-04-08 | 1994-10-27 | Human Cell Cultures, Inc. | Cell culturing method and medium |
US5523226A (en) * | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
GB9310557D0 (en) * | 1993-05-21 | 1993-07-07 | Smithkline Beecham Plc | Novel process and apparatus |
TW257671B (ja) * | 1993-11-19 | 1995-09-21 | Ciba Geigy | |
US6703017B1 (en) * | 1994-04-28 | 2004-03-09 | Ixion Biotechnology, Inc. | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US6001647A (en) * | 1994-04-28 | 1999-12-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof |
US5834308A (en) * | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
US6083903A (en) * | 1994-10-28 | 2000-07-04 | Leukosite, Inc. | Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses |
EP0800829B2 (en) | 1994-12-29 | 2012-07-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Use of a pm-1 antibody or of a mh 166 antibody for enhancing the anti-tumor effect of cisplatin or carboplatin |
US5843780A (en) * | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US7410773B2 (en) * | 1995-02-02 | 2008-08-12 | Ghazi Jaswinder Dhoot | Method of preparing an undifferentiated cell |
US5718922A (en) * | 1995-05-31 | 1998-02-17 | Schepens Eye Research Institute, Inc. | Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation |
US5908782A (en) * | 1995-06-05 | 1999-06-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells |
US5681561A (en) | 1995-06-07 | 1997-10-28 | Life Medical Sciences, Inc. | Compositions and methods for improving autologous fat grafting |
US5969210A (en) * | 1996-01-22 | 1999-10-19 | Research Development Foundation | Methods for the characterization of compounds which stimulate STF-1 expression in pancreatic islet cells |
PT1028954E (pt) | 1997-04-24 | 2003-11-28 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Imidazoles substituidos uteis no tratamento de doencas inflamatorias |
US6261549B1 (en) * | 1997-07-03 | 2001-07-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Human mesenchymal stem cells from peripheral blood |
US6670127B2 (en) * | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
ATE462004T1 (de) * | 1997-09-16 | 2010-04-15 | Centocor Inc | Methoden zur kompletten chemischen synthese und zusammensetzung von genen und genomen |
AU1197699A (en) | 1997-10-23 | 1999-05-10 | Geron Corporation | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells |
US6372779B1 (en) * | 1997-12-29 | 2002-04-16 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Anti-inflammatory compounds |
ATE316795T1 (de) * | 1998-03-18 | 2006-02-15 | Osiris Therapeutics Inc | Mesenchymale stammzellen für die prävention und behandlung von immunantworten bei transplantationen |
MY132496A (en) * | 1998-05-11 | 2007-10-31 | Vertex Pharma | Inhibitors of p38 |
US6413773B1 (en) | 1998-06-01 | 2002-07-02 | The Regents Of The University Of California | Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation |
US7410798B2 (en) | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
US6610540B1 (en) | 1998-11-18 | 2003-08-26 | California Institute Of Technology | Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells |
US6413556B1 (en) * | 1999-01-08 | 2002-07-02 | Sky High, Llc | Aqueous anti-apoptotic compositions |
CA2359159A1 (en) * | 1999-01-21 | 2000-07-27 | Vitro Diagnostics, Inc. | Immortalized cell lines and methods of making the same |
US6815203B1 (en) * | 1999-06-23 | 2004-11-09 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods of making pancreatic islet cells |
US6306424B1 (en) * | 1999-06-30 | 2001-10-23 | Ethicon, Inc. | Foam composite for the repair or regeneration of tissue |
US6333029B1 (en) * | 1999-06-30 | 2001-12-25 | Ethicon, Inc. | Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue |
CA2385628A1 (en) | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Ammon B. Peck | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US6685936B2 (en) * | 1999-10-12 | 2004-02-03 | Osiris Therapeutics, Inc. | Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation |
US20030082155A1 (en) | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
US6753153B2 (en) * | 1999-12-13 | 2004-06-22 | The Scripps Research Institute | Markers for identification and isolation of pancreatic islet α and β progenitors |
US7439064B2 (en) | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
US7005252B1 (en) * | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
US6436704B1 (en) * | 2000-04-10 | 2002-08-20 | Raven Biotechnologies, Inc. | Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof |
US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
CN1449439A (zh) * | 2000-06-26 | 2003-10-15 | 株式会社雷诺再生医学研究所 | 细胞级分包括能分化为神经细胞的细胞 |
CZ20031125A3 (cs) * | 2000-10-23 | 2003-10-15 | Smithkline Beecham Corporation | Nové sloučeniny |
YU46603A (sh) | 2000-12-08 | 2006-05-25 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical Inc. | Indazolil-supstituisana jedinjenja pirolina, kao inhibitori kinaze |
EP1345946B1 (en) | 2000-12-08 | 2005-08-10 | Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. | Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors |
US6599323B2 (en) * | 2000-12-21 | 2003-07-29 | Ethicon, Inc. | Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use |
JP2005503759A (ja) * | 2001-01-24 | 2005-02-10 | アメリカ合衆国 | 幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化方法 |
EP1360189A1 (en) * | 2001-01-25 | 2003-11-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Formulation of boronic acid compounds |
US6656488B2 (en) * | 2001-04-11 | 2003-12-02 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering |
JP2004527249A (ja) * | 2001-04-19 | 2004-09-09 | デヴェロゲン アクチエンゲゼルシャフト フュア エントヴィックルングスビオローギッシェ フォルシュング | 幹細胞をインスリン産生細胞に分化する方法 |
EP1391505B1 (en) | 2001-04-24 | 2009-01-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Stem cells and method of separating the same |
CA2447015A1 (en) | 2001-05-15 | 2002-11-21 | Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences | Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells |
US6626950B2 (en) * | 2001-06-28 | 2003-09-30 | Ethicon, Inc. | Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue |
KR100418195B1 (ko) | 2001-07-05 | 2004-02-11 | 주식회사 우리기술 | 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법 |
GB0117583D0 (en) * | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
US7432104B2 (en) * | 2001-08-06 | 2008-10-07 | Bresgen Inc. | Methods for the culture of human embryonic stem cells on human feeder cells |
US6617152B2 (en) * | 2001-09-04 | 2003-09-09 | Corning Inc | Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate |
EP1298201A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-02 | Cardion AG | Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state |
JP2005506074A (ja) | 2001-10-18 | 2005-03-03 | イクシオン・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド | 肝臓の幹細胞および前駆細胞の膵臓機能細胞への転換 |
DE60233248D1 (de) | 2001-11-15 | 2009-09-17 | Childrens Medical Center | Verfahren zur isolierung, expansion und differenzierung fötaler stammzellen aus chorionzotte, fruchtwasser und plazenta und therapeutische verwendungen davon |
CN101240262A (zh) * | 2001-12-07 | 2008-08-13 | 杰龙公司 | 源自人胚胎干细胞的胰岛细胞 |
CN1630526B (zh) * | 2001-12-07 | 2010-05-05 | 马克罗珀尔生物外科公司 | 用加工的脂肪抽吸细胞来治疗患者的***和方法 |
WO2003054169A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-03 | Thromb-X Nv | Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability |
US20050095703A1 (en) | 2001-12-28 | 2005-05-05 | Henrik Semb | Method for the establishment of a pluripotent human blastocyst - derived stem cell line |
US20030162290A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-08-28 | Kazutomo Inoue | Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells |
US20030180268A1 (en) | 2002-02-05 | 2003-09-25 | Anthony Atala | Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ |
DE10214095C1 (de) * | 2002-03-28 | 2003-09-25 | Bernd Karl Friedrich Kremer | Dedifferenzierte, programmierbare Stammzellen monozytären Ursprungs, sowie deren Herstellung und Verwendung |
JPWO2003087349A1 (ja) * | 2002-04-17 | 2005-08-18 | 大塚製薬株式会社 | 間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法 |
US20040161419A1 (en) * | 2002-04-19 | 2004-08-19 | Strom Stephen C. | Placental stem cells and uses thereof |
ATE387444T1 (de) | 2002-05-08 | 2008-03-15 | Janssen Pharmaceutica Nv | Substituierte pyrroline als kinase inhibitoren |
US20060003446A1 (en) * | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
EP1507848A4 (en) | 2002-05-28 | 2005-11-23 | Becton Dickinson Co | EXPANSION AND TRANSDIFFERENCING OF HUMAN AZINUS CELLS |
US6987110B2 (en) * | 2002-06-05 | 2006-01-17 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Substituted pyrrolines as kinase inhibitors |
GB0212976D0 (en) | 2002-06-06 | 2002-07-17 | Tonejet Corp Pty Ltd | Ejection method and apparatus |
CN1171991C (zh) | 2002-07-08 | 2004-10-20 | 徐如祥 | 人神经干细胞的培养方法 |
US6877147B2 (en) * | 2002-07-22 | 2005-04-05 | Broadcom Corporation | Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison |
US7838290B2 (en) * | 2002-07-25 | 2010-11-23 | The Scripps Research Institute | Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith |
US20040110287A1 (en) | 2002-07-29 | 2004-06-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose responsive cells |
US20040063204A1 (en) | 2002-08-14 | 2004-04-01 | Lijun Yang | Bone marrow cell differentiation |
AU2003268534A1 (en) * | 2002-09-06 | 2004-03-29 | Amcyte Inc. | Cd56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells |
US9969977B2 (en) * | 2002-09-20 | 2018-05-15 | Garnet Biotherapeutics | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
US20040062753A1 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Alireza Rezania | Composite scaffolds seeded with mammalian cells |
US20060252150A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-11-09 | Linzhao Cheng | Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same |
US7144999B2 (en) * | 2002-11-23 | 2006-12-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression |
US20060040385A1 (en) | 2002-12-05 | 2006-02-23 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Cultured human pancreatic islets, and uses thereof |
SI1572984T1 (sl) | 2002-12-16 | 2016-07-29 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Kulturni sistem brez hranilnih celic, brez kseno-komponent, za humane embrionalne matične celice |
RU2359671C2 (ru) | 2003-01-29 | 2009-06-27 | Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед | Способ получения препарата с покрытием |
CA2514539C (en) | 2003-01-29 | 2012-03-06 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Process for producing coated preparation |
US20070155661A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University | Methods and compositions for modulating the development of stem cells |
WO2005045001A2 (en) | 2003-02-14 | 2005-05-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Insulin-producing cells derived from stem cells |
US20070020242A1 (en) | 2003-03-27 | 2007-01-25 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway |
WO2004090110A2 (en) | 2003-03-31 | 2004-10-21 | Bresagen Inc. | Compositions and methods for the control, differentiation and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway |
US20090203141A1 (en) | 2003-05-15 | 2009-08-13 | Shi-Lung Lin | Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents |
WO2005038012A2 (en) | 2003-06-27 | 2005-04-28 | Ethicon Incorporated | Cartilage and bone repair and regeneration using postpartum-derived cells |
IL161903A0 (en) | 2003-07-17 | 2005-11-20 | Gamida Cell Ltd | Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs |
ITRM20030395A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero. |
US7569385B2 (en) * | 2003-08-14 | 2009-08-04 | The Regents Of The University Of California | Multipotent amniotic fetal stem cells |
US7157275B2 (en) | 2003-08-15 | 2007-01-02 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for enhanced cell attachment and growth |
EP1670900A4 (en) | 2003-08-27 | 2008-06-11 | Stemcells California Inc | ENHANCED PANCREATIC STEM CELL AND PRECURSOR CELL POPULATIONS AND METHOD OF IDENTIFYING, INSULATING AND ENRICHING SUCH POPULATIONS |
CA2550010A1 (en) * | 2003-12-17 | 2005-06-30 | Allergan, Inc. | Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b |
US20060030042A1 (en) * | 2003-12-19 | 2006-02-09 | Ali Brivanlou | Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime |
GB0329498D0 (en) | 2003-12-19 | 2004-01-28 | Novartis Ag | Organic compounds |
US7541185B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-06-02 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
CN109628371B (zh) | 2003-12-23 | 2021-02-19 | 维亚希特公司 | 定形内胚层 |
US20050266554A1 (en) * | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
MX2009009225A (es) * | 2003-12-23 | 2009-09-28 | Cythera Inc | Endodermo definitivo. |
US7625753B2 (en) * | 2003-12-23 | 2009-12-01 | Cythera, Inc. | Expansion of definitive endoderm cells |
US20050233446A1 (en) * | 2003-12-31 | 2005-10-20 | Parsons Xuejun H | Defined media for stem cell culture |
TWI334443B (en) * | 2003-12-31 | 2010-12-11 | Ind Tech Res Inst | Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells |
US7794704B2 (en) | 2004-01-23 | 2010-09-14 | Advanced Cell Technology, Inc. | Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration |
US20080241107A1 (en) | 2004-01-23 | 2008-10-02 | Copland Iii John A | Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells |
GB2441530B (en) | 2004-02-12 | 2009-09-23 | Univ Newcastle | Stem Cells |
JP4901471B2 (ja) | 2004-02-19 | 2012-03-21 | 国立大学法人京都大学 | 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法 |
US20060281174A1 (en) | 2004-03-09 | 2006-12-14 | Gang Xu | Methods for generating insulin-producing cells |
WO2005086845A2 (en) | 2004-03-10 | 2005-09-22 | Regents Of The University Of California | Compositions and methods for growth of embryonic stem cells |
RU2375448C2 (ru) | 2004-03-23 | 2009-12-10 | Асубио Фарма Ко., Лтд. | Способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток |
WO2005097980A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Geron Corporation | New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells |
CA2555571C (en) * | 2004-04-01 | 2012-10-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage |
EP1740612B1 (en) | 2004-04-27 | 2019-08-07 | Viacyte, Inc. | Pdx1 expressing endoderm |
CA2966883A1 (en) | 2004-07-09 | 2006-02-16 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
US8187878B2 (en) | 2004-08-13 | 2012-05-29 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods for increasing definitive endoderm differentiation of pluripotent human embryonic stem cells with PI-3 kinase inhibitors |
US20080268533A1 (en) | 2004-08-25 | 2008-10-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells |
DE102004043256B4 (de) | 2004-09-07 | 2013-09-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension |
EP1791948B1 (en) | 2004-09-08 | 2012-03-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Medium and culture of embryonic stem cells |
NZ553235A (en) | 2004-09-08 | 2009-11-27 | Wisconsin Alumni Res Found | Culturing human pluripotent stem cells |
GB2437689B (en) | 2005-01-28 | 2009-10-28 | Novathera Ltd | Culture and screening methods |
JP2008528038A (ja) | 2005-01-31 | 2008-07-31 | エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド | 胚性幹細胞の指示された分化及びその利用 |
WO2006088867A2 (en) | 2005-02-15 | 2006-08-24 | Medistem Laboratories, Incorporated | Method for expansion of stem cells |
ES2627419T3 (es) | 2005-03-04 | 2017-07-28 | Lifescan, Inc. | Células estromales adultas derivadas del páncreas |
GB0505970D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof |
CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
WO2006113470A2 (en) | 2005-04-15 | 2006-10-26 | Geron Corporation | Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities |
EP1875234B1 (en) | 2005-04-26 | 2011-06-22 | Aarhus Universitet | Biosurface structure array |
JP5092124B2 (ja) | 2005-05-24 | 2012-12-05 | 国立大学法人 熊本大学 | Es細胞の分化誘導方法 |
AU2006202209B2 (en) | 2005-05-27 | 2011-04-14 | Lifescan, Inc. | Amniotic fluid derived cells |
AU2006257859B2 (en) | 2005-06-10 | 2009-12-10 | Irm Llc | Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells |
WO2006138433A2 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of California | Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides |
US20080199959A1 (en) | 2005-06-21 | 2008-08-21 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method For Cell Culture |
WO2007002086A2 (en) | 2005-06-22 | 2007-01-04 | Geron Corporation | Suspension culture of human embryonic stem cells |
CA2611438C (en) | 2005-06-30 | 2014-01-07 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Cyclic anilino-pyridinotriazines |
WO2007016485A2 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-08 | Athersys, Inc. | Use of a gsk-3 inhibitor to maintain potency of cultured cells |
GB2443370A (en) | 2005-07-29 | 2008-04-30 | Australian Stem Cell Ct Ltd | Compositions and methods for growth of pluripotent cells |
WO2007025234A2 (en) | 2005-08-26 | 2007-03-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes |
EP1962719A4 (en) | 2005-08-29 | 2011-05-04 | Technion Res And Dev Of Foundation Ltd | MEDIA FOR BREEDING STEM CELLS |
CN101341245A (zh) | 2005-09-02 | 2009-01-07 | 新加坡科技研究局 | 获取祖细胞系的方法 |
AU2006292021B2 (en) | 2005-09-12 | 2012-05-31 | Es Cell International Pte Ltd. | Cardiomyocyte production |
US8409859B2 (en) | 2005-10-14 | 2013-04-02 | Regents Of The University Of Minnesota | Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype |
ES2743202T3 (es) | 2005-10-27 | 2020-02-18 | Viacyte Inc | Endodermo de intestino proximal dorsal y ventral que expresa PDX1 |
EA018039B1 (ru) | 2005-12-13 | 2013-05-30 | Киото Юниверсити | Ядерный фактор перепрограммирования |
WO2007082963A1 (es) | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad | Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas |
SG10201405107YA (en) | 2006-02-23 | 2014-10-30 | Viacyte Inc | Compositions and methods useful for culturing differentiable cells |
US7695965B2 (en) | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
SG10201405380QA (en) * | 2006-03-02 | 2014-10-30 | Cythera Inc | Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production |
EP2021462B1 (en) | 2006-04-28 | 2019-01-09 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
US8685730B2 (en) | 2006-05-02 | 2014-04-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage |
GB2452186B (en) | 2006-05-02 | 2011-01-26 | Wisconsin Alumni Res Found | Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage |
WO2007139929A2 (en) | 2006-05-25 | 2007-12-06 | The Burnham Institute For Medical Research | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
CN101541953A (zh) | 2006-06-02 | 2009-09-23 | 佐治亚大学研究基金会 | 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织 |
US20090298169A1 (en) | 2006-06-02 | 2009-12-03 | The University Of Georgia Research Foundation | Pancreatic and Liver Endoderm Cells and Tissue by Differentiation of Definitive Endoderm Cells Obtained from Human Embryonic Stems |
WO2007149182A2 (en) | 2006-06-19 | 2007-12-27 | Geron Corporation | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells |
CN100494359C (zh) | 2006-06-23 | 2009-06-03 | 中日友好医院 | 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法 |
US20080003676A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
AU2007297575A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-03-27 | Lifescan, Inc. | Pluripotent stem cell culture |
GB2454386B (en) | 2006-07-06 | 2011-07-06 | Es Cell Int Pte Ltd | Method for embryonic stem cell culture on a positively charged support surface |
AU2007277364B2 (en) | 2006-07-26 | 2010-08-12 | Viacyte, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
ES2874223T3 (es) | 2006-08-02 | 2021-11-04 | Technion Res & Dev Foundation | Métodos de expansión de células madre embrionarias en un cultivo en suspensión |
KR101331510B1 (ko) | 2006-08-30 | 2013-11-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 |
JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
WO2008039521A2 (en) | 2006-09-26 | 2008-04-03 | Nmt Medical, Inc. | Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth |
US20100323442A1 (en) | 2006-10-17 | 2010-12-23 | Emmanuel Edward Baetge | Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells |
JP5343267B2 (ja) | 2006-10-17 | 2013-11-13 | スティーフェル・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | タラロゾール代謝物 |
CA2666789C (en) | 2006-10-18 | 2016-11-22 | Yong Zhao | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
WO2008056779A1 (fr) | 2006-11-09 | 2008-05-15 | Japan As Represented By The President Of International Medical Center Of Japan | Procédé destiné à la culture et au passage d'une cellule souche embryonnaire de primate, et procédé destiné à induire la différenciation de la cellule souche embryonnaire |
US8217027B2 (en) | 2006-12-21 | 2012-07-10 | Abbott Laboratories | Sphingosine-1-phosphate receptor agonist and antagonist compounds |
WO2008086005A1 (en) | 2007-01-09 | 2008-07-17 | University Of South Florida | Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof |
CA2676044C (en) | 2007-01-30 | 2019-10-22 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (mmc) |
GB0703188D0 (en) | 2007-02-19 | 2007-03-28 | Roger Land Building | Large scale production of stem cells |
WO2008148105A1 (en) | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Medistem Laboratories, Inc. | Endometrial stem cells and methods of making and using same |
DK2173863T3 (en) | 2007-06-29 | 2019-01-21 | Fujifilm Cellular Dynamics Inc | Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture |
WO2009006399A1 (en) | 2007-07-01 | 2009-01-08 | Lifescan | Single pluripotent stem cell culture |
MX2010000746A (es) | 2007-07-18 | 2010-07-05 | Lifescan Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
CN101952415B (zh) * | 2007-07-31 | 2017-06-27 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
JP6087043B2 (ja) | 2007-07-31 | 2017-03-01 | ライフスキャン・インコーポレイテッドLifescan,Inc. | ヒトフィーダー細胞を用いた多能性幹細胞の分化 |
WO2009027644A2 (en) | 2007-08-24 | 2009-03-05 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut | Composition |
WO2009061442A1 (en) | 2007-11-06 | 2009-05-14 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells |
CA3123528A1 (en) * | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic cells |
SG154367A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-28 | Es Cell Int Pte Ltd | Method of differentiating stem cells |
WO2009096049A1 (ja) | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Kyoto University | 人工多能性幹細胞由来分化細胞 |
EP2250252A2 (en) | 2008-02-11 | 2010-11-17 | Cambridge Enterprise Limited | Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained |
CA2715878C (en) | 2008-02-21 | 2017-06-13 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Methods, surface modified plates and compositions for cell attachment, cultivation and detachment |
WO2009110215A1 (ja) | 2008-03-03 | 2009-09-11 | 独立行政法人 科学技術振興機構 | 繊毛細胞の分化誘導方法 |
WO2009116951A2 (en) | 2008-03-17 | 2009-09-24 | Agency For Science, Technology And Research | Microcarriers for stem cell culture |
RU2359030C1 (ru) | 2008-03-19 | 2009-06-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" | Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты) |
US8338170B2 (en) | 2008-04-21 | 2012-12-25 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
DK2283117T3 (da) * | 2008-04-21 | 2014-01-20 | Viacyte Inc | Fremgangsmåde til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller |
WO2009132083A2 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells |
US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
US7939322B2 (en) | 2008-04-24 | 2011-05-10 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm |
EP2297319B1 (en) | 2008-06-03 | 2015-10-07 | Viacyte, Inc. | Growth factors for production of definitive endoderm |
US20090298178A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-03 | D Amour Kevin Allen | Growth factors for production of definitive endoderm |
DE102008032236A1 (de) | 2008-06-30 | 2010-04-01 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential |
EP2942392B1 (en) | 2008-06-30 | 2018-10-03 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
US20100028307A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | O'neil John J | Pluripotent stem cell differentiation |
WO2010022395A2 (en) | 2008-08-22 | 2010-02-25 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of reprogramming cells |
ES2727950T3 (es) | 2008-10-31 | 2019-10-21 | Janssen Biotech Inc | Diferenciación de células madre embrionarias humanas en linaje endocrino pancreático |
AU2009308967C1 (en) | 2008-10-31 | 2017-04-20 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
CA2742583C (en) | 2008-11-04 | 2022-09-27 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof |
CN102282254B (zh) | 2008-11-14 | 2015-12-16 | 维赛特公司 | 源于人多能干细胞的胰腺细胞的包封 |
CN107267442A (zh) | 2008-11-20 | 2017-10-20 | 詹森生物科技公司 | 微载体上的多能干细胞培养 |
US20110229441A1 (en) | 2008-12-05 | 2011-09-22 | Association Francaise Contre Les Myopathies | Method and Medium for Neural Differentiation of Pluripotent Cells |
KR20170118969A (ko) | 2009-07-20 | 2017-10-25 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
CN102482640B (zh) | 2009-07-20 | 2015-03-11 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
CN103952372B (zh) | 2009-07-20 | 2016-10-05 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
CA2770753C (en) | 2009-08-12 | 2019-01-15 | Kyoto University | Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural precursor cells |
CA2778817A1 (en) | 2009-10-29 | 2011-05-19 | Janssen Biotech, Inc. | Pluripotent stem cells |
CA3080762A1 (en) | 2009-11-12 | 2011-05-19 | Technion Research & Development Foundation Limited | Culture media, cell cultures and methods of culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state |
FI20096288A0 (fi) | 2009-12-04 | 2009-12-04 | Kristiina Rajala | Formulations and methods for culturing stem cells |
MX343786B (es) | 2009-12-23 | 2016-11-22 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
KR101923537B1 (ko) | 2009-12-23 | 2018-11-29 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
WO2011081222A1 (ja) | 2009-12-29 | 2011-07-07 | 武田薬品工業株式会社 | 膵ホルモン産生細胞の製造法 |
CN107189979B (zh) * | 2010-03-01 | 2021-05-04 | 詹森生物科技公司 | 纯化衍生自多能干细胞的细胞的方法 |
EP2542666A4 (en) | 2010-03-02 | 2014-05-07 | Univ Singapore | CULTURE ADDITIVES FOR PROMOTING A STEM CELL PROGRAMMING AND DIFFERENTIATION REACTION |
CN102959076B (zh) | 2010-03-31 | 2015-09-16 | 斯克里普斯研究所 | 重编程细胞 |
WO2011139628A1 (en) | 2010-04-25 | 2011-11-10 | Mount Sinai School Of Medicine | Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells |
SG10201503652WA (en) | 2010-05-12 | 2015-08-28 | Janssen Biotech Inc | Differentiation of human embryonic stem cells |
US8932857B2 (en) | 2010-06-15 | 2015-01-13 | Kyoto University | Method for selecting reduced differentiation resistance human induced pluripotent stem cells |
WO2011160066A1 (en) | 2010-06-17 | 2011-12-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Production of insulin producing cells |
BR112013002811A8 (pt) | 2010-08-05 | 2020-01-28 | Wisconsin Alumni Res Found | meios básicos simplificados para cultura celular pluripotente de humano |
US9181528B2 (en) | 2010-08-31 | 2015-11-10 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
MY177150A (en) | 2011-02-28 | 2020-09-08 | Stempeutics Res Malaysia Sdn Bhd | Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof |
WO2013055834A2 (en) | 2011-10-11 | 2013-04-18 | The New York Stem Cell Foundation | Er stress relievers in beta cell protection |
US8951798B2 (en) | 2011-10-13 | 2015-02-10 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells |
US9670463B2 (en) | 2011-10-14 | 2017-06-06 | Children's Medical Center Corporation | Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes |
RU2668798C2 (ru) | 2011-12-22 | 2018-10-02 | Янссен Байотек, Инк. | Способы in vitro пошаговой дифференцировки полюрипотентных клеток |
US10519422B2 (en) | 2012-02-29 | 2019-12-31 | Riken | Method of producing human retinal pigment epithelial cells |
DK3450542T3 (da) | 2012-06-08 | 2021-11-01 | Janssen Biotech Inc | Differentiering af humane embryonale stamceller til endokrine pancreatiske celler |
CN104903440B (zh) | 2012-09-03 | 2018-04-06 | 诺和诺德股份有限公司 | 使用小分子从多能干细胞产生胰内胚层 |
US10138465B2 (en) | 2012-12-31 | 2018-11-27 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using HB9 regulators |
WO2014127164A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | Allergan, Inc. | Substituted dihydropyrazoles as sphingosine receptor modulators |
US8859286B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-14 | Viacyte, Inc. | In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells |
JP6602745B2 (ja) | 2013-03-15 | 2019-11-06 | ザ ジャクソン ラボラトリー | 非胚性幹細胞の単離とその使用 |
-
2011
- 2011-02-28 CN CN201710473353.7A patent/CN107189979B/zh active Active
- 2011-02-28 SG SG2012063954A patent/SG183535A1/en unknown
- 2011-02-28 US US13/036,476 patent/US9969981B2/en active Active
- 2011-02-28 BR BR112012022145-0A patent/BR112012022145A2/pt active Search and Examination
- 2011-02-28 KR KR1020187006094A patent/KR101928299B1/ko active IP Right Grant
- 2011-02-28 JP JP2012556130A patent/JP6013196B2/ja active Active
- 2011-02-28 MX MX2012010181A patent/MX358451B/es active IP Right Grant
- 2011-02-28 EP EP11751136.0A patent/EP2542667A4/en not_active Withdrawn
- 2011-02-28 KR KR1020127025161A patent/KR20130025375A/ko active Search and Examination
- 2011-02-28 SG SG10201501503VA patent/SG10201501503VA/en unknown
- 2011-02-28 CN CN201180011846.XA patent/CN102791851B/zh active Active
- 2011-02-28 RU RU2016149540A patent/RU2702198C2/ru active
- 2011-02-28 RU RU2012141652A patent/RU2607380C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-02-28 WO PCT/US2011/026443 patent/WO2011109279A2/en active Application Filing
- 2011-02-28 AU AU2011223900A patent/AU2011223900A1/en not_active Abandoned
- 2011-02-28 CA CA2791476A patent/CA2791476C/en active Active
- 2011-03-01 AR ARP110100624A patent/AR080434A1/es unknown
-
2016
- 2016-06-02 JP JP2016110884A patent/JP6527487B2/ja active Active
-
2017
- 2017-12-15 ZA ZA2017/08538A patent/ZA201708538B/en unknown
-
2018
- 2018-05-14 US US15/978,918 patent/US10329534B2/en active Active
- 2018-05-28 PH PH12018501127A patent/PH12018501127A1/en unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6527487B2 (ja) | 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法 | |
KR101658876B1 (ko) | 다능성 세포의 처리 | |
CN101952415B (zh) | 人胚胎干细胞的分化 | |
KR20150030709A (ko) | 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 | |
CN102257132B (zh) | 用于在平面基底上进行细胞附着和培养的方法和组合物 | |
CN107787363B (zh) | 真正的胰腺祖细胞的分离 | |
AU2017276263B2 (en) | Methods for enriching primitive gut tube | |
Chaddah | Clonal derivation of neural stem cells from human embryonic stem cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170425 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170718 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170925 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180206 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180507 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180911 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181205 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190207 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190311 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190416 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190510 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6527487 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |