KR20150030709A - 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 - Google Patents

인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리함으로써, 다능성 세포가 배양액 중에서 효과적으로 증가되어 분화될 수 있는 다능성 세포의 처리 방법에 관한 것이다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 {DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS INTO PANCREATIC ENDOCRINE CELLS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 2012년 6월 14일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/741,776호의 이익을 주장한다.
본 발명은 다능성 세포(pluripotent cell)를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리함으로써, 다능성 세포가 배양액 중에서 효과적으로 증가되어 분화될 수 있는 다능성 세포의 처리 방법에 관한 것이다.
제I형 진성 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 치료법에서의 진전에서는 생착(engraftment)에 적절한 인슐린-생산 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는데 관심이 집중되었다. 한 가지 접근법은 예를 들어, 배아 줄기 세포와 같은 다능성 세포로부터 기능성 β 세포를 생성하는 것이다.
척추동물 배아 발생에서, 다능성 세포는 낭배형성(gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층 (외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽(definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 다수의 마커, 예컨대 HNF-3 베타, GATA-4, Mixl1, CXCR4 및 SOX-17을 발현한다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, PDX-1을 발현한다. PDX-1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, PDX-1 발현은 췌장 기관 형성에 있어서 중요한 단계가 된다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
이식을 위한 충분한 양의 세포 물질의 생성은 배양액 중에서 효과적으로 증가되어, 대상 조직, 예를 들어 기능성 β 세포로 효과적으로 분화될 수 있는 세포 물질 공급원을 필요로 한다.
인간 배아 줄기 세포를 배양하기 위한 현재 방법은 복잡하며; 이는 세포가 그의 다능성을 잃지 않고 증식하도록 외인성 인자 또는 화학적으로 규명된 배지(chemically defined medium)의 사용을 필요로 한다. 게다가, 배아 줄기 세포의 분화에 의해, 종종 배양액 중에서 증가하는 세포가 감소된다.
일례를 들면, 문헌 [Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005)]은 배아 줄기 세포 자가 재생을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자가 보충된 컨디셔닝되지 않은 혈청 대체(serum replacement, SR) 배지에서 배아 줄기 세포가 유지되는 영양세포가 없는(feeder-free) 무혈청(serum-free) 배양계를 개시하고 있다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는데 유용한 규명된 배지를 개시한다. 용액에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 주어진 배양물에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는데 필요한 양의 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.
다른 예에서, 국제특허 출원 공개 제WO2005086845호는 미분화 줄기 세포의 유지 방법을 개시하며, 상기 방법은 원하는 결과를 성취하기에 충분한 시간 동안 미분화 상태의 세포를 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타(transforming growth factor-beta) (TGF-β) 패밀리 단백질의 구성원, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 패밀리 단백질의 구성원, 또는 니코틴아미드 (NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.
글리코겐 합성효소 키나제-3 (GSK-3)의 저해제는 성체 줄기 세포의 증식 및 증가를 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 일례에서, 문헌 [Tateishi et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications (2007) 352: 635)]에는 GSK-3의 저해가 신생아 또는 성인 심장으로부터 회수된 중간엽 특성을 갖는 인간 심장 줄기 세포 (hCSC)의 성장 및 생존을 향상시키는 것으로 나타나있다.
예를 들어, 문헌 [Rulifson et al. (PNAS 144, 6247-6252, (2007))]에는 "Wnt 시그널링이 섬(islet) β 세포 증식을 자극하는 것으로 개시되어 있다.
다른 예에서, 국제 특허 출원 공개 제WO2007016485호에는 만능성 성인 전구 세포(multipotent)를 비롯한 비배아 줄기 세포의 배양액에 GSK-3 저해제를 첨가하면, 증가 시에 다능성 표현형 유지를 유도하며, 훨씬 더 강한 분화 반응을 일으키는 것으로 보고되어 있다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제US2006030042호는 영양세포층을 사용하지 않고 배아 줄기 세포를 유지하도록 Wnt 또는 GSK-3 효소 활성의 소분자 저해제를 첨가하여 GSK-3를 저해하는 방법을 사용한다.
다른 예에서, 국제 특허 출원 공개 제WO2006026473호에는 GSK-3B 저해제를 첨가하여, c-myc의 전사 활성화 및 c-myc 단백질의 안정화를 통해 다능성 세포를 안정화시키는 것으로 보고되어 있다.
다른 예에서, 국제 특허 출원 공개 제WO2006100490호에는 마우스 또는 인간 배아 줄기 세포를 비롯한 다능성 줄기 세포의 자가 재생 집단을 유지하도록 GSK-3 저해제 및 gp130 작용제를 함유하는 줄기 세포 배양 배지의 용도가 보고되어 있다.
다른 예에서, 문헌 [Sato et al. (Nature Medicine (2004) 10:55-63)]에는 GSK-3을 특정한 약리학적 화합물로 저해하여, 배아 줄기 세포의 미분화 표현형을 유지하고, 다능성 상태에 특이적인 전사 인자, 예컨대 Oct-3/4, Rex-1, 및 Nanog의 발현을 유지할 수 있는 것으로 나타나 있다.
다른 예에서, 문헌 [Maurer et al. (Journal of Proteome Research (2007) 6:1198-1208)]에는 GSK-3 저해제로 처리된 성인 뉴런 줄기 세포가 특히 b-카테닌 표적 유전자의 전사를 향상시켜, 아폽토시스를 감소시킴으로써, 뉴런 분화를 향상시키는 것으로 나타나 있다.
다른 예에서, 문헌 [Gregory et al. (Annals of the New York Academy of Sciences (2005) 1049:97-106)]에는 GSK-3B 저해제가 시험관 내에서(in vitro) 골형성을 향상시키는 것으로 보고되어 있다.
다른 예에서, 문헌 [Feng et al (Biochemical and Biophysical Research Communcations (2004) 324:1333-1339)]에는 배아 줄기 세포의 조혈 분화가 Wnt/b-카테닌 경로의 하향 조절과 관련되어 있으며, Wnt가 GSK3의 천연 저해제인 것으로 나타나 있다.
따라서, 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 또는 췌장 호르몬 분비 세포로의 분화능을 보유하면서, 현재의 임상적 필요성에 대처하게 증가될 수 있도록 다능성 줄기 세포의 처리 방법을 개발하는 것이 여전히 상당히 필요하다.
본 발명은 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리하여, 다능성 세포를 증가 및 분화시키는 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은:
a. 다능성 세포를 배양하는 단계, 및
b. 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리하는 단계를 포함하는 다능성 세포의 증가 및 분화 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 다능성 세포는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화된다.
60/913475에 개시된 방법에 따르면, 다능성 세포는 인간 배아 줄기 세포일 수 있거나, 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포일 수 있다.
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (I)의 화합물이다:
Figure pct00001
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (II)의 화합물이다:
Figure pct00002
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (III)의 화합물이다:
Figure pct00003
도 1은 관찰된 핵 수에 의해서 측정된 세포수 (도 1a) 및 면역형광염색도(intensity of immunofluorescent staining)에 의해서 측정된 Sox-17 발현 (도 1b)에 대한 화합물 #221의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 (Cell Analyzer) 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
도 2는 관찰된 핵 수에 의해서 측정된 세포수 (도 2a) 및 면역형광염색도에 의해서 측정된 Sox-17 발현 (도 2b)에 대한 화합물 #206의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
도 3은 관찰된 핵 수에 의해서 측정된 세포수 (도 3a) 및 면역형광염색도에 의해서 측정된 Sox-17 발현 (도 3b)에 대한 화합물 #223의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
도 4는 관찰된 핵 수에 의해서 측정된 세포수 (도 4a) 및 면역형광염색도에 의해서 측정된 Sox-17 발현 (도 4b)에 대한 화합물 #47의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
도 5는 관찰된 핵 수에 의해서 측정된 세포수 (도 5a) 및 면역형광염색도에 의해서 측정된 Sox-17 발현 (도 5b)에 대한 화합물 #103의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
도 6은 관찰된 핵 수에 의해서 측정된 세포수 (도 6a) 및 면역형광염색도에 의해서 측정된 Sox-17 발현 (도 6b)에 대한 화합물 #133의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
도 7은 관찰된 핵 수에 의해서 측정된 세포수 (도 7a) 및 면역형광염색도에 의해서 측정된 Sox-17 발현 (도 7b)에 대한 화합물 #136의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
도 8은 관찰된 핵 수에 의해서 측정된 세포수 (도 8a) 및 면역형광염색도에 의해서 측정된 Sox-17 발현 (도 8b)에 대한 화합물 #198의 농도 범위 효과를 나타낸다. 그 결과는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 (백색 막대) 또는 인간 배아 줄기 세포주 H9의 세포 (흑색 막대)로부터 얻어졌다.
도 9는 실시예 8에 기재된 방법에 따라, 도시된 화합물로 처리된 세포에 대한 면역형광염색 및 유세포분석(flow cytometric analysis)에 의해 측정된 세포 표면의 CXCR4 발현을 나타낸다.
도 10은 실시예 8에 기재된 방법에 따라, 도시된 화합물로 처리된 세포에서의 실시간 PCR에 의해 측정된 CXCR4 (도 10a), HNF-3 베타 (도 10b), 및 Sox-17 (도 10c)의 발현을 나타낸다.
도 11은 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (도 11a) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 Pdx-1 발현 (도 11b)에 대한 도시된 화합물의 농도 범위 효과를 나타낸다. 세포를 실시예 9에 기재된 방법에 따라 처리하였다.
도 12는 실시간 PCR에 의해 측정된 Pdx-1 발현 (백색 막대) 및 HNF-6 (흑색 막대)에 대한 도시된 화합물의 농도 범위 효과를 나타낸다. 세포를 실시예 9에 기재된 방법에 따라 처리하였다.
도 13은 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (도 13a) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 인슐린 발현 (도 13b)에 대한 도시된 화합물의 농도 범위 효과를 나타낸다. 세포를 실시예 10에 기재된 방법에 따라 처리하였다.
도 14는 실시간 PCR에 의해 측정된 Pdx-1 발현 (백색 막대) 및 인슐린 (흑색 막대)에 대한 도시된 화합물의 농도 범위 효과를 나타낸다. 세포를 실시예 10에 기재된 방법에 따라 처리하였다.
도 15는 IN 세포 분석장치 1000 (GE Healthcare)을 사용하여, 관찰된 핵 수에 의해 측정된 세포수 (도 15a) 및 면역형광염색도에 의해 측정된 인슐린 발현 (도 15b)에 대한 도시된 화합물의 농도 범위 효과를 나타낸다. 세포를 실시예 11에 기재된 방법에 따라 처리하였다.
개시 내용의 명확함을 위하여, 그리고 제한하지 않고서, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 특정한 특성, 실시 형태, 또는 응용을 설명하거나 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 수준에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 전구 세포, 비재생 전구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직을 발생시키며, 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 능력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성; (3) 세포 계통의 하위집단이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위집단이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성 (예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 선구체 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소 (예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 만능 줄기 세포(multipotent stem cell)보다 더 제한된 하위집단의 세포 계통이 생기게 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통 (예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은 ("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 정상 환경 하에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 계속 분화할 것이며 정상 환경 하에서 다른 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
"β-세포 계통"은 전사 인자 PDX-1 및 하기 전사 인자들 중 적어도 하나에 대해 양성 유전자 발현을 갖는 세포를 말한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, 믹스-유사 호메오박스(Mix-like homeobox) 단백질, FGF4 CD48, 에오메소더민(eomesodermin) (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1베타, PTF-1 알파, HNF-6, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, 또는 PTF-1 알파. 췌장 내분비 계통에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "완성 내배엽"은 낭배형성 동안에 상배엽으로부터 생기는 세포의 특징을 보유하며, 위장관을 형성하는 세포 및 이의 파생 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: HNF-3 베타, GATA-4, SOX-17, Cerberus, OTX2, 구스코이드(goosecoid), C-Kit, CD99, 및 Mixl1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "배아외 내배엽"은 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포 집단을 말한다: SOX-7, AFP, 및 SPARC.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 수준은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "중내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: CD48, 에오메소더민 (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 베타, GSC, FGF17, GATA-6.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "췌장 내분비 세포" 또는 "췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전(pre)-원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: Nodal, 또는 FGF8.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: Brachyury, 믹스-유사 호메오박스 단백질 또는 FGF4.
일 실시 형태에서, 본 발명은 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리하는 것을 포함하는 다능성 세포의 증가 및 분화 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은:
c. 다능성 세포를 배양하는 단계, 및
d. 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리하는 단계를 포함하는 다능성 세포의 증가 및 분화 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 다능성 세포는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화된다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, Hnf-3베타, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소데르민 (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, 및 OTX2로 구성된 군로부터 선택된다. 본 명세서에서는 완성 내배엽 계통의 특징의 특징적인 마커 중 적어도 하나를 발현하는 다능성 세포로부터 유래된 세포를 고려한다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
다능성 세포는 약 1 내지 약 72 시간 동안 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리될 수 있다. 대안적으로, 다능성 세포는 약 12 내지 약 48 시간 동안 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리될 수 있다. 대안적으로, 다능성 세포는 약 48 시간 동안 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리될 수 있다.
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 약 100 nM 내지 약 100 μM 농도로 사용된다. 대안적으로, GSK-3B 효소 활성 저해제는 약 1 μM 내지 약 10 μM 농도로 사용된다. 대안적으로, GSK-3B 효소 활성 저해제는 약 10 μM 농도로 사용된다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 화합물
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (I)의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00004
.
상기 식에서,
R1은 페닐, 페닐 치환기가 C1-5알킬, 할로겐, 니트로, 트라이플루오로메틸 및 니트릴로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페닐, 또는 피리미디닐이고;
R2는 페닐, 페닐 치환기가 C1-5알킬, 할로겐, 니트로, 트라이플루오로메틸 및 니트릴로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페닐, 또는 임의로 C1-4알킬 치환된 피리미디닐이며, R1 및 R2 중 적어도 하나는 피리미디닐이고;
R3은 수소, 2-(트라이메틸실릴)에톡시메틸, C1-5알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 아릴C1-5알킬옥시카르보닐, 아릴C1-5알킬, 하나 이상의 아릴 치환기가 C1-5알킬, C1-5알콕시, 할로겐, 아미노, C1-5알킬아미노, 및 다이C1-5알킬아미노로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환된 아릴C1-5알킬, 프탈이미도C1-5알킬, 아미노C1-5알킬, 다이아미노C1-5알킬, 석신이미도C1-5알킬, C1-5알킬카르보닐, 아릴카르보닐, C1-5알킬카르보닐C1-5알킬 및 아릴옥시카르보닐C1-5알킬이며;
R4는 -(A)-(CH2)q-X이고;
A는 비닐렌, 에티닐렌 또는
Figure pct00005
이며;
R5는 수소, C1-5알킬, 페닐 및 페닐C1-5알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
q는 0 내지 9이며;
X는 수소, 하이드록시, 비닐, 하나 이상의 비닐 치환기가 각각 불소, 브롬, 염소 및 요오드로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 비닐, 에티닐, 에티닐 치환기가 불소, 브롬, 염소 및 요오드로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 에티닐, C1-5알킬, 하나 이상의 알킬 치환기가 각각 C1-5알콕시, 트라이할로알킬, 프탈이미도 및 아미노로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 C1-5알킬, C3-7사이클로알킬, C1-5알콕시, 알킬 치환기가 프탈이미도 및 아미노로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 C1-5알콕시, 프탈이미도옥시, 페녹시, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1-5알킬, 할로겐 및 C1-5알콕시로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페녹시, 페닐, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1-5알킬, 할로겐 및 C1-5알콕시로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페닐, 아릴C1-5알킬, 하나 이상의 아릴 치환기가 각각 C1-5알킬, 할로겐 및 C1-5알콕시로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 아릴C1-5알킬, 아릴옥시C1-5알킬아미노, C1-5알킬아미노, 다이C1-5알킬아미노, 니트릴, 옥심, 벤질옥시이미노, C1-5알킬옥시이미노, 프탈이미도, 석신이미도, C1-5알킬카르보닐옥시, 페닐카르보닐옥시, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1-5알킬, 할로겐 및 C1-5알콕시로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페닐카르보닐옥시, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1-5알킬, 할로겐 및 C1-5알콕시로 구성된 군으로부터 선택되는 페닐C1-5알킬카르보닐옥시, 아미노카르보닐옥시, C1-5알킬아미노카르보닐옥시, 다이C1-5알킬아미노카르보닐옥시, C1-5알콕시카르보닐옥시, 하나 이상의 알킬 치환기가 각각 메틸, 에틸, 아이소프로필 및 헥실로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 C1-5알콕시카르보닐옥시, 페녹시카르보닐옥시, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1-5알킬, C1-5알콕시 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페녹시카르보닐옥시, C1-5알킬티오, 알킬 치환기가 하이드록시 및 프탈이미도로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 C1-5알킬티오, C1-5알킬설포닐, 페닐설포닐, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 브롬, 불소, 클로라이드, C1-5알콕시 및 트라이플루오로메틸로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페닐설포닐로 구성된 군으로부터 선택되되, 단, A가
Figure pct00006
이고, q가 0이고, X가 H이면, R3은 2-(트라이메틸실릴)에톡시메틸일 수 없다.
본 발명의 일례는 R1이 치환된 페닐이고, R2가 피리미딘-3-일인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 일례는 R1이 4-플루오로페닐인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 일례는 R3이 수소, 아릴C1-5알킬, 또는 치환된 아릴C1-5알킬인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 일례는 R3이 수소 또는 페닐C1-5알킬인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 일례는 A가 에티닐렌이고, q가 0 내지 5인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 일례는 X가 석신이미도, 하이드록시, 메틸, 페닐, C1-5알킬설포닐, C3-6사이클로알킬, C1-5알킬카르보닐옥시, C1-5알콕시, 페닐카르보닐옥시, C1-5알킬아미노, 다이C1-5알킬아미노 또는 니트릴인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
화학식 (I)의 화합물은 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 동일 출원인에 의한 미국 특허 제6,214,830호에 개시되어 있다.
본 발명의 일례는 하기 표 A에 열거된 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화학식 (I)의 화합물을 포함한다:
[표 A]
Figure pct00007
Figure pct00008
본 발명의 일례는 하기 화학식의 화합물 A-5인 화학식 (I)의 화합물을 포함한다.
Figure pct00009
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (II)의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00010
상기 식에서,
R은 Ra, -C1-8알킬-Ra, -C2-8알케닐-Ra, -C2-8알키닐-Ra 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택되고;
Ra는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되며;
R1은 수소, -C1-8알킬-R5, -C2-8알케닐-R5, -C2-8알키닐-R5, -C(O)-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-O-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -C(O)-NH(C1-8알킬-R9), -C(O)-NH(아릴-R8), -C(O)-N(C1-8알킬-R9)2, -SO2-(C1-8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -사이클로알킬-R6, -헤테로사이클릴-R6, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 선택되며;여기서, 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴은 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 고리 탄소 원자를 통해 하나의 위치에서 아자인돌 질소 원자에 부착되며;
R5는 수소, -O-(C1-8)알킬, -O-(C1-8)알킬-OH, -O-(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬, -O-(C1-8)알킬-NH2, -O-(C1-8)알킬-NH(C1-8알킬), -O-(C1-8)알킬-N(C1-8알킬)2, -O-(C1-8)알킬-S-(C1-8)알킬, -O-(C1-8)알킬-SO2-(C1-8)알킬, -O-(C1-8)알킬-SO2-NH2, -O-(C1-8)알킬-SO2-NH(C1-8알킬), -O-(C1-8)알킬-SO2-N(C1-8알킬)2, -O-C(O)H, -O-C(O)-(C1-8)알킬, -O-C(O)-NH2, -O-C(O)-NH(C1-8알킬), -O-C(O)-N(C1-8알킬)2, -O-(C1-8)알킬-C(O)H, -O-(C1-8)알킬-C(O)-(C1-8)알킬, -O-(C1-8)알킬-CO2H, -O-(C1-8)알킬-C(O)-O-(C1-8)알킬, -O-(C1-8)알킬-C(O)-NH2, -O-(C1-8)알킬-C(O)-NH(C1-8알킬), -O-(C1-8)알킬-C(O)-N(C1-8알킬)2, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)알킬, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)알킬, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬), -C(O)-N(C1-8알킬)2, -SH, -S-(C1-8)알킬, -S-(C1-8)알킬-S-(C1-8)알킬, -S-(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬, -S-(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬-OH, -S-(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬-NH2, -S-(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬-NH(C1-8알킬), -S-(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬-N(C1-8알킬)2, -S-(C1-8)알킬-NH(C1-8알킬), -SO2-(C1-8)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-8알킬), -SO2-N(C1-8알킬)2, -N-R7, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로, 옥소, -사이클로알킬-R6, -헤테로사이클릴-R6, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이고;
R6은 수소, -C1-8알킬, -C2-8알케닐, -C2-8알키닐, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)알킬, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)알킬, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬), -C(O)-N(C1-8)알킬)2, -SO2-(C1-8)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-8알킬), -SO2-N(C1-8알킬)2, -(C1-8)알킬-N-R7, -(C1-8)알킬-(할로)1-3, -(C1-8)알킬-OH, -아릴-R8, -(C1-8)알킬-아릴-R8 및 -(C1-8)알킬-헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기이되; 단, R6이 탄소 원자에 부착된 경우, R6은 -C1-8알콕시, -(C1-8)알콕시-(할로)1-3, -SH, -S-(C1-8)알킬, -N-R7, 시아노, 할로, 하이드록시, 니트로, 옥소 및 -헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 추가로 선택되며;
R7은 수소, -C1-8알킬, -C2-8알케닐, -C2-8알키닐, -(C1-8)알킬-OH, -(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬, -(C1-8)알킬-NH2, -(C1-8)알킬-NH(C1-8알킬), -(C1-8)알킬-N(C1-8알킬)2, -(C1-8)알킬-S-(C1-8)알킬, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)알킬, -C(O)-O-(C1-8)알킬, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬), -C(O)-N(C1-8알킬)2, -SO2-(C1-8)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-8알킬), -SO2-N(C1-8알킬)2, -C(N)-NH2, -사이클로알킬-R8, -(C1-8)알킬-헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8, -(C1-8)알킬-아릴-R8 및 -(C1-8)알킬-헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 2개의 치환기이고;
R8은 수소, -C1-8알킬, -(C1-8)알킬-(할로)1-3 및 -(C1-8)알킬-OH로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기이되; 단, R8이 탄소 원자에 부착된 경우, R8은 -C1-8알콕시, -NH2, -NH(C1-8알킬), -N(C1-8알킬)2, 시아노, 할로, -(C1-8)알콕시-(할로)1-3, 하이드록시 및 니트로로 구성된 군으로부터 추가로 선택되고;
R9은 수소, -C1-8알콕시, -NH2, -NH(C1-8알킬), -N(C1-8알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시 및 니트로로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이고;
R2는 수소, -C1-8알킬-R5, -C2-8알케닐-R5, -C2-8알키닐-R5, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬-R9), -C(O)-N(C1-8알킬-R9)2, -C(O)-NH(아릴-R8), -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SO2-(C1-8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -사이클로알킬-R6, -아릴-R6 및 -(C1-8)알킬-N-R7로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개의 치환기이되; 단, R2가 탄소 원자에 부착된 경우, R2는 -C1-8알콕시-R5, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, 옥소, -헤테로사이클릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 추가로 선택되고;
R3은 수소, -C1-8알킬-R10, -C2-8알케닐-R10, -C2-8알키닐-R10, -C1-8알콕시-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬-R9), -C(O)-N(C1-8알킬-R9)2, -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SO2-(C1-8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬-R8, -헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8 및 -헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 3개의 치환기이고;
R4는 수소, -C1-8알킬-R10, -C2-8알케닐-R10, -C2-8알키닐-R10, -C1-8알콕시-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬-R9), -C(O)-N(C1-8알킬-R9)2, -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SH, -S-(C1-8)알킬-R10, -SO2-(C1-8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-8알킬-R9), -SO2-N(C1-8알킬-R9)2, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬-R8, -헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8 및 -헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기이며;
R10은 수소, -NH2, -NH(C1-8알킬), -N(C1-8알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로 및 옥소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이고;
Y 및 Z는 O, S, (H,OH) 및 (H,H)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되되; 단, Y 및 Z 중 하나는 O이고, 나머지는 O, S, (H,OH) 및 (H,H)로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 R이 Ra, -C1-4알킬-Ra, -C2-4알케닐-Ra, -C2-4알키닐-Ra 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
본 발명의 실시 형태는 Ra가 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, Ra는 다이하이드로-피라닐, 페닐, 나프틸, 티에닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 아자인돌릴, 인다졸릴, 벤조푸릴, 벤조티에닐, 다이벤조푸릴 및 다이벤조티에닐로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 R1이 수소, -C1-4알킬-R5, -C2-4알케닐-R5, -C2-4알키닐-R5, -C(O)-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-O-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -C(O)-NH(C1-4알킬-R9), -C(O)-NH(아릴-R8), -C(O)-N(C1-4알킬-R9)2, -SO2-(C1-4)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -사이클로알킬-R6, -헤테로사이클릴-R6, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 선택되며; 여기서, 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴이 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 고리 탄소 원자를 통해 하나의 위치에서 아자인돌 질소 원자에 부착되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R1은 수소, -C1-4알킬-R5, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 선택되며; 여기서, 헤테로아릴은 헤테로아릴 고리 탄소 원자를 통해 하나의 위치에서 아자인돌 질소 원자에 부착된다.
일 실시 형태에서, R1은 수소, -C1-4알킬-R5 및 -나프틸-R6으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 R5가 수소, -O-(C1-4)알킬, -O-(C1-4)알킬-OH, -O-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬, -O-(C1-4)알킬-NH2, -O-(C1-4)알킬-NH(C1-4알킬), -O-(C1-4)알킬-N(C1-4알킬)2, -O-(C1-4)알킬-S-(C1-4)알킬, -O-(C1-4)알킬-SO2-(C1-4)알킬, -O-(C1-4)알킬-SO2-NH2, -O-(C1-4)알킬-SO2-NH(C1-4알킬), -O-(C1-4)알킬-SO2-N(C1-4알킬)2, -O-C(O)H, -O-C(O)-(C1-4)알킬, -O-C(O)-NH2, -O-C(O)-NH(C1-4알킬), -O-C(O)-N(C1-4알킬)2, -O-(C1-4)알킬-C(O)H, -O-(C1-4)알킬-C(O)-(C1-4)알킬, -O-(C1-4)알킬-CO2H, -O-(C1-4)알킬-C(O)-O-(C1-4)알킬, -O-(C1-4)알킬-C(O)-NH2, -O-(C1-4)알킬-C(O)-NH(C1-4알킬), -O-(C1-4)알킬-C(O)-N(C1-4알킬)2, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)알킬, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬), -C(O)-N(C1-4알킬)2, -SH, -S-(C1-4)알킬, -S-(C1-4)알킬-S-(C1-4)알킬, -S-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬, -S-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬-OH, -S-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬-NH2, -S-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬-NH(C1-4알킬), -S-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬-N(C1-4알킬)2, -S-(C1-4)알킬-NH(C1-4알킬), -SO2-(C1-4)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4알킬), -SO2-N(C1-4알킬)2, -N-R7, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로, 옥소, -사이클로알킬-R6, -헤테로사이클릴-R6, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R5는 수소, -O-(C1-4)알킬, -N-R7, 하이드록시 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이다.
일 실시 형태에서, R5는 수소, -O-(C1-4)알킬, -N-R7, 하이드록시, -이미다졸릴-R6, -트라이아졸릴-R6 및 -테트라졸릴-R6으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이다.
본 발명의 일 실시 형태는 R6이 수소, -C1-4알킬, -C2-4알케닐, -C2-4알키닐, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)알킬, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬), -C(O)-N(C1-4)알킬)2, -SO2-(C1-4)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4알킬), -SO2-N(C1-4알킬)2, -(C1-4)알킬-N-R7, -(C1-4)알킬-(할로)1-3, -(C1-4)알킬-OH, -아릴-R8, -(C1-4)알킬-아릴-R8 및 -(C1-4)알킬-헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기이되; 단, R6이 탄소 원자에 부착된 경우, R6은 -C1-4알콕시, -(C1-4)알콕시-(할로)1-3, -SH, -S-(C1-4)알킬, -N-R7, 시아노, 할로, 하이드록시, 니트로, 옥소 및 -헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 추가로 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R6은 수소이다.
본 발명의 실시 형태는 R7이 수소, -C1-4알킬, -C2-4알케닐, -C2-4알키닐, -(C1-4)알킬-OH, -(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬, -(C1-4)알킬-NH2, -(C1-4)알킬-NH(C1-4알킬), -(C1-4)알킬-N(C1-4알킬)2, -(C1-4)알킬-S-(C1-4)알킬, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬, -C(O)-O-(C1-4)알킬, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬), -C(O)-N(C1-4알킬)2, -SO2-(C1-4)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4알킬), -SO2-N(C1-4알킬)2, -C(N)-NH2, -사이클로알킬-R8, -(C1-4)알킬-헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8, -(C1-4)알킬-아릴-R8 및 -(C1-4)알킬-헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 2개의 치환기인 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서 R7은 수소, -C1-4알킬, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬, -C(O)-O-(C1-4)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4알킬) 및 -SO2-N(C1-4알킬)2로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 2개의 치환기이다.
본 발명의 실시 형태는 R8이 수소, -C1-4알킬, -(C1-4)알킬-(할로)1-3 및 -(C1-4)알킬-OH로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1 내지 4개의 치환기이되; 단, R8이 탄소 원자에 부착된 경우, R8은 -C1-4알콕시, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 시아노, 할로, -(C1-4)알콕시-(할로)1-3, 하이드록시 및 니트로로 구성된 군으로부터 추가로 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R8은 수소이다.
본 발명의 실시 형태는 R9이 수소, -C1-4알콕시, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시 및 니트로로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R9는 수소이다.
본 발명의 실시 형태는 R2가 수소, -C1-4알킬-R5, -C2-4알케닐-R5, -C2-4알키닐-R5, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬-R9), -C(O)-N(C1-4알킬-R9)2, -C(O)-NH(아릴-R8), -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SO2-(C1-4)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -사이클로알킬-R6, -아릴-R6 및 -(C1-4)알킬-N-R7로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개의 치환기이되; 단, R2가 탄소 원자에 부착된 경우, R2는 -C1-4알콕시-R5, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, 옥소, -헤테로사이클릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 추가로 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R2는 수소, -C1-4알킬-R5, -C2-4알케닐-R5, -C2-4알키닐-R5, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)알킬-R9, -사이클로알킬-R6, -아릴-R6 및 -(C1-4)알킬-N-R7로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개의 치환기이되; 단, R2가 질소 원자에 부착된 경우, 4차 염이 형성되지 않고; R2가 탄소 원자에 부착된 경우, R2는 -C1-4알콕시-R5, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, 옥소, -헤테로사이클릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 추가로 선택된다.
일 실시 형태에서, R2는 수소, -C1-4알킬-R5 및 -아릴-R6으로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개의 치환기이되; 단, R2가 질소 원자에 부착된 경우, 4차 염이 형성되지 않고; 단, R2가 탄소 원자에 부착된 경우, R2는 -N-R7, 할로겐, 하이드록시 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 추가로 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 R3이 수소, -C1-4알킬-R10, -C2-4알케닐-R10, -C2-4알키닐-R10, -C1-4알콕시-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬-R9), -C(O)-N(C1-4알킬-R9)2, -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SO2-(C1-8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -N-R7, -(C1-4)알킬-N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬-R8, -헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8 및 -헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 3개의 치환기인 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R3은 수소, -C1-4알킬-R10, -C2-4알케닐-R10, -C2-4알키닐-R10, -C1-4알콕시-R10, -C(O)H, -CO2H, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 시아노, 할로겐, 하이드록시 및 니트로로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개의 치환기이다.
일 실시 형태에서, R3은 수소, -C1-4알킬-R10, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 할로겐 및 하이드록시로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개의 치환기이다.
본 발명의 실시 형태는 R4가 수소, -C1-4알킬-R10, -C2-4알케닐-R10, -C2-4알키닐-R10, -C1-4알콕시-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬-R9), -C(O)-N(C1-4알킬-R9)2, -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SH, -S-(C1-4)알킬-R10, -SO2-(C1-4)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4알킬-R9), -SO2-N(C1-4알킬-R9)2, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬-R8, -헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8 및 -헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기인 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R4는 수소, -C1-4알킬-R10, -C2-4알케닐-R10, -C2-4알키닐-R10, -C1-4알콕시-R10, -C(O)H, -CO2H, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬, -헤테로사이클릴, -아릴 및 -헤테로아릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기이다.
일 실시 형태에서, R4는 수소, C1-4알킬-R10, C1-4알콕시-R10, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 할로겐 및 하이드록시로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기이다.
일 실시 형태에서, R4는 수소, C1-4알킬-R10, C1-4알콕시-R10, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 염소, 불소 및 하이드록시로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기이다.
본 발명의 실시 형태는 R10이 수소, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로 및 옥소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, R10은 수소 및 (할로)1-3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이다.
일 실시 형태에서, R10은 수소 및 (플루오로)3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기이다.
본 발명의 실시 형태는 Y 및 Z가 O, S, (H,OH) 및 (H,H)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되되; 단 Y 및 Z 중 하나는 O이고, 나머지는 O, S, (H,OH) 및 (H,H)로 구성된 군으로부터 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, Y 및 Z는 O, 및 (H,H)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되되; 단 Y 및 Z 중 하나는 O이고, 나머지는 O 및 (H,H)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서, Y 및 Z는 O로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 (II)의 화합물은 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 동일 출원인에 의한 미국 특허 제7,125,878호에 개시되어 있다.
본 발명의 일례는 하기 표 B에 열거된 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다:
[표 B]
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
본 발명의 일례는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 화학식 (II)의 화합물을 포함한다:
Figure pct00014
일 실시 형태에서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (III)의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00015
여기서,
A 및 E는 수소 치환된 탄소 원자 및 질소 원자로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서,
Figure pct00016
는 1H-인돌, 1H-피롤로[2,3-b]피리딘, 1H-피라졸로[3,4-b]피리딘 및 1H-인다졸로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;
Z는 O로부터 선택되고; 대안적으로, Z는 다이하이드로로부터 선택되고; 여기서, 각각의 수소 원자는 단일 결합에 부착되고;
R4 및 R5는 옥소로 임의로 치환된 C1-8알킬, C2-8알케닐 및 C2-8알키닐로부터 독립적으로 선택되고;
R2는 -C1-8알킬-, -C2-8알케닐-, -C2-8알키닐-, -O-(C1-8)알킬-O-, -O-(C2-8)알케닐-O-, -O-(C2-8)알키닐-O-, -C(O)-(C1-8)알킬-C(O)- (여기서, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 연결 기 중 임의의 것은 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, -C(O)O-(C1-8)알킬, -C1-8알킬-C(O)O-(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시, 하이드록시(C1-8)알킬 및 옥소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환된 선형 탄소 쇄이고; 여기서, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 연결 기 중 임의의 것은 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬, 헤테로아릴(C1-8)알킬, 스피로사이클로알킬 및 스피로헤테로사이클릴 (여기서, 상기 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기 중 임의의 것은 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서, 상기 헤테로사이클릴 치환기 중 임의의 것은 옥소로 임의로 치환됨)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기로 임의로 치환됨), 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 (여기서, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서, 헤테로사이클릴은 옥소로 임의로 치환됨), -(O-(CH2)1-6)0-5-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -(O-(CH2)1-6)0-5-NR6-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-, -(O-(CH2)1-6)0-5-S-, -O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-, -NR6-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-, -NR6-C(O)-, -C(O)-NR6-, -C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-, -NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-, -NR6-C(O)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7- 및 -SO2- (여기서, R6, R7 및 R8은 수소, C1-8알킬, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 하이드록시(C1-8)알킬, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬 및 헤테로아릴(C1-8)알킬 (여기서, 상기 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기는 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서, 헤테로사이클릴은 옥소로 임의로 치환됨)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨)로 구성된 군으로부터 선택되되; 단, A 및 E가 수소 치환된 탄소 원자로부터 선택되면, R2는 -C2-8알키닐-, -O-(C1-8)알킬-O-, -O-(C2-8)알케닐-O-, -O-(C2-8)알키닐-O-, -C(O)-(C1-8)알킬-C(O)- (여기서, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 연결 기 중 임의의 것은 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, -C(O)O-(C1-8)알킬, -C1-8알킬-C(O)O-(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시, 하이드록시(C1-8)알킬 및 옥소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환된 선형 탄소 쇄이고; 여기서, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 연결 기 중 임의의 것은 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬, 헤테로아릴(C1-8)알킬, 스피로사이클로알킬 및 스피로헤테로사이클릴 (여기서, 상기 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기 중 임의의 것은 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서, 상기 헤테로사이클릴 치환기 중 임의의 것은 옥소로 임의로 치환됨)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기로 임의로 치환됨), 사이클로알킬 (여기서, 사이클로알킬은 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 임의로 치환됨), -(O-(CH2)1-6)1-5-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -(O-(CH2)1-6)1-5-NR6-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-, -(O-(CH2)1-6)0-5-S-, -O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-, -NR9-C(O)-, -C(O)-NR9-, -C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-, -NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-, -NR6-C(O)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S- 및 -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7- (여기서, R6, R7 및 R8은 수소, C1-8알킬, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 하이드록시(C1-8)알킬, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬 및 헤테로아릴(C1-8)알킬 (여기서, 상기 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기는 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서, 헤테로사이클릴은 옥소로 임의로 치환됨)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서, R9는 C1-8알킬, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨), 하이드록시(C1-8)알킬, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬 및 헤테로아릴(C1-8)알킬 (여기서, 상기 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기는 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고;여기서, 헤테로사이클릴은 옥소로 임의로 치환됨)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨)로 구성된 군으로부터 선택되고;
R1 및 R3은 수소, C1-8알킬, C2-8알케닐, C2-8알키닐 (여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 C1-8알콕시, 알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), (할로)1-3, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시, 하이드록시(C1-8)알킬 및 옥소로 구성된 군으로부터 선택되는 치환기로 임의로 치환됨), C1-8알콕시, C1-8알콕시카르보닐, (할로)1-3(C1-8)알콕시, C1-8알킬티오, 아릴, 헤테로아릴 (여기서, 아릴 및 헤테로아릴은 C1-8알킬, C1-8알콕시, 알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 치환기로 임의로 치환됨), 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 시아노, 할로겐, 하이드록시 및 니트로로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일 실시 형태에서, 화학식 (III)의 화합물은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
여기서, 모든 다른 변수는 상기에 정의된 바와 같다.
일 실시 형태에서, 화학식 (III)의 화합물은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pct00020
여기서, 모든 다른 변수는 상기에 정의된 바와 같다.
화학식 (III)의 화합물은 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 동일 출원인에 의한 미국 특허 제6,828,327호에 개시되어 있다.
본 발명의 일례는 하기 표 C에 열거된 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화학식 (III)의 화합물을 포함한다:
[표 C]
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
본 발명의 일례는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 화학식 (III)의 화합물을 포함한다:
Figure pct00024
본 발명의 일례는 하기 표 D에 열거된 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 포함한다:
[표 D]
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
본 발명의 다른 예는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 포함한다:
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
본 발명의 방법에 따른 처리에 적합한 세포
본 발명에서 사용하기에 적합한 다능성 세포는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 다능성 마커 중 적어도 하나를 발현한다: ABCG2, 크립토(cripto), FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, 및 Tra1-81.
일 실시 형태에서, 다능성 세포는 배아 줄기 세포이다. 다른 실시 형태에서, 다능성 세포는 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포이다. 일 실시 형태에서, 배아 줄기 세포는 인간이다.
인간 배아 줄기 세포의 단리, 증가 및 배양
인간 배아 줄기 세포의 특징: 인간 배아 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen) (SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌 [Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 인간 배아 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra- 1-60, 및 Tra-1-81 발현 (존재하는 경우)의 소실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 인간 배아 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (Vector Laboratories, Burlingame Calif.)가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 다능성 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출된 Oct-4 및 TERT를 발현한다.
번식된 인간 배아 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽 층의 세포, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽 조직으로 분화할 가능성이 있다. 인간 배아 줄기 세포의 다능성은 예를 들어, 세포를 SCID 마우스에 주사하여, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정시킨 다음에, 삼배엽층으로부터의 세포형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배양체(embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
번식된 인간 배아 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하여, 대응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며, 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
인간 배아 줄기 세포의 공급원: 사용될 수 있는 인간 줄기 세포형은 전배아(pre-embryonic) 조직 (예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 중에, 그러나 전형적으로 반드시 약 10 내지 12 주간의 임신 전은 아닌 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후에 형성된 조직으로부터 유래된 수립된 인간 배아 세포주를 포함한다. 비제한적인 예로는 수립된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아 생식 세포주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 다능성 세포일 것이다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 다능성 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (BresaGen, Athens, GA)가 또한 적합하다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨 등 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌 [Science 282:1145, 1998]; [Curr. Top. Dev. 38:133 ff., 1998]; [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995])에 개시된 바와 같이 제조된다.
인간 배아 줄기 세포의 배양액: 일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 영양 세포가 본질적으로 존재하지 않는 배양계 중에서 배양되지만, 그럼에도 불구하고 실질인 분화를 행하지 않고 인간 배아 줄기 세포의 증식을 지지한다. 영양세포가 없는 배양액 중에서의 분화 없는 인간 배아 줄기 세포의 성장은 미리 다른 세포형을 사용하여 배양함으로써 컨디셔닝된 배지를 사용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양액 중에서 분화 없는 인간 배아 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 사용하여 지지된다.
다른 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 다양한 방법으로 인간 배아 줄기 세포를 지지하는 영양세포의 초기 배양층이다. 그 다음에, 인간 배아 줄기 세포는 기본적으로 영양세포를 포함하지 않는 배양계로 이동되지만, 그렇다 하더라도 실질적인 분화를 행하지 않고, 인간 배아 줄기 세포 증식을 지지한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 컨디셔닝된 배지의 예는 미국 특허 출원 공개 제20020072117, 제6642048, 국허 특허 출원 공개 제WO2005014799, 및 문헌 [Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004)])에 개시되어 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 화학적 규명 배지의 일례는 미국 특허 출원 공개 제US20070010011에 발견될 수 있다.
적합한 배양 배지는 하기의 성분, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) (DMEM), 집코(Gibco) # 11965-092; 낙아웃 둘베코 변형 이글 배지(Knockout Dulbecco's modified Eagle's medium) (KO DMEM), 집코 # 10829-018; 햄(Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 집코 # 15039-027; 비필수 아미노산 용액, 집코 11140-050; b- 머갑토에탄올, Sigma # M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF), 집코 # 13256-029로부터 제조할 수 있다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 본 발명의 방법에 따라 처리되기 전에 처리된 적절한 배양 기질에 플레이팅된다. 일 실시 형태에서, 처리는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막에서 유래되거나 또는 접착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 일 실시 형태에서, 적절한 배양 기재는 매트리젤(Matrigel)® (Becton Dickenson)이다. 매트리젤®은 실온에서 젤화되어 재구성된 기저막을 형성하는 엥겔브레스-홀름-스웜(Engelbreth-Holm-Swarm) 종양 세포로부터의 용해성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
인간 배아 줄기 세포는 바람직한 특성을 갖는 세포 생존, 번식, 및 유지를 증진하는 배지의 존재하에 적절한 분포로 기질에 플레이팅된다. 모든 이들 특성은 시딩 분포에 세심한 주의를 기울여 이익을 얻으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포의 단리, 증가 및 배양
일 실시 형태에서, 다능성 마커를 발현하는 세포는,
a. 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 인간 배아 줄기 세포를 완성 내배엽 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
c. 세포를 제거하고, 이어서 세포를 배양하기 전에, 세포를 단백질 또는 세포외 매트릭스로 전처리되지 않은 조직 배양 기질에서 저산소 조건하에 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된다.
일 실시 형태에서, 다능성 마커를 발현하는 세포는,
a. 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계, 및
b. 세포를 제거하고, 이어서 세포를 단백질 또는 세포외 매트릭스로 전처리되지 않은 조직 배양 기질에서 저산소 조건하에 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된다.
단백질 또는 세포외 매트릭스로 전처리되지 않은 조직 배양 기질에서의 저산소 조건하에서의 세포 배양
일 실시 형태에서, 세포는 세포외 매트릭스로 코팅되지 않은 조직 배양 기질에서 약 1 내지 약 20 일간 저산소 조건하에 배양된다. 다른 실시 형태에서, 세포는 세포외 매트릭스로 코팅되지 않은 조직 배양 기질에서 약 5 내지 약 20 일간 저산소 조건하에 배양된다. 다른 실시 형태에서, 세포는 세포외 매트릭스로 코팅되지 않은 조직 배양 기질에서 약 15 일간 저산소 조건하에 배양된다.
일 실시 형태에서, 저산소 조건은 약 1% O2 내지 약 20% O2이다. 다른 실시 형태에서, 저산소 조건은 약 2% O2 내지 약 10% O2이다. 다른 실시 형태에서, 저산소 조건은 약 3% O2이다.
세포는 혈청, 액티빈(activin) A, 및 Wnt 리간드를 포함하는 배지 중에서 단백질 또는 세포외 매트릭스로 전처리되지 않은 조직 배양 기질에서 저산소 조건하에 배양될 수 있다. 대안적으로, 배지는 또한 IGF-1을 포함할 수 있다.
배양 배지는 약 2% 내지 약 5% 범위의 혈청 농도를 가질 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 혈청 농도는 약 2%일 수 있다.
액티빈 A는 약 1 pg/mL 내지 약 100 ㎍/mL의 농도로 사용될 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/ml 내지 약 1 ㎍/ml일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/ml 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 100 ng/ml일 수 있다.
Wnt 리간드는 Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a 및 Wnt-7a로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-1이다. 대안적 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-3a이다.
Wnt 리간드는 약 1 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, Wnt 리간드는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, Wnt 리간드의 농도는 약 20 ng/mL이다.
IGF-1은 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, IGF-1은 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, IGF-1의 농도는 약 50 ng/mL이다.
본 발명의 방법에 의해 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포는 단백질 또는 세포외 매트릭스로 전처리되지 않은 조직 배양 기질에서 저산소 조건하에 배양액 중에서 증가될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포는 ABCG2, 크립토, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, 및 Tra1-81로 구성된 군으로부터 선택되는 다능성 마커 중 적어도 하나를 발현한다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 추가의 분화
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌 [D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민으로 처리한 다음에, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지를 제거하고, 그 후에 세포를 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 일례는 문헌 [D' Amour et al, Nature Biotechnology, 24: 1392-1401, (2006)]에 개시되어 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들은 Pdx1, HNF-1베타, PTF1a, HNF-6, HB9 및 PROX1로 구성된 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 추가의 분화
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌 [D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, 및 PTF-1 알파로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. b 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 검출
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성은 특정 프로토콜을 따르기 전과 후에 마커의 존재에 대해 시험함으로써 결정할 수 있다. 다능성 줄기 세포는 전형적으로 그러한 마커를 발현하지 않는다. 따라서, 다능성 세포의 분화는 세포가 그들을 발현하기 시작할 때 검출된다.
분화 효율은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 작용제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정될 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서 일반적이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR), 노던 블롯(Northern blot), 원위치 혼성화 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역검정법, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석 (FACS) (예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
소정의 단백질 마커를 검출하는데 유용한 항체의 예는 표 IA 및 표 IB에 열거된다. 표 IA 및 표 IB에 열거된 항체에 의해 인식되는 동일한 마커에 대해 유도된 대안적 항체가 이용가능하거나, 또는 쉽게 개발될 수 있음이 주목되어야 한다. 그러한 대안적 항체는 또한 본 발명에 따라 단리된 세포에서 마커의 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 다능성 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 다능성 줄기 세포의 추가 특징은 계속 확인되고 있다. 다능성 줄기 세포 마커는 예를 들어, 하기 중 하나 이상의 발현을 포함한다: ABCG2, 크립토, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
다능성 줄기 세포를 본 발명의 방법으로 처리한 후, 분화된 세포는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 작용제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 검출
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내배엽 계통 특이적 마커는 예를 들어, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, HNF-1베타와 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
분화 효율은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 작용제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서 일반적이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 혼성화 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역검정법, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석 (FACS) (예를 들어 문헌 [Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
소정의 단백질 마커를 검출하는데 유용한 항체의 예는 표 IA 및 표 IB에 열거된다. 표 IA 및 표 IB에 열거된 항체에 의해 인식되는 동일한 마커에 대해 유도된 대안적 항체가 이용가능하거나, 또는 쉽게 개발될 수 있음이 주목되어야 한다. 그러한 대안적 항체는 또한 본 발명에 따라 단리된 세포에서 마커의 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 검출
췌장 내분비 계통의 세포의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내분비 계통의 특징적인 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내분비 계통 특이적 마커는 예를 들어, NGN-3, NeuroD, Islet-1과 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
β 세포 계통의 세포의 특징적인 마커는 당업계에 잘 알려져 있으며, β 세포 계통의 특징적인 추가 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는, 본 발명에 따라 처리된 세포가 β 세포 계통의 특징적인 특성을 획득하기 위해 분화되었음을 확인하는데 사용될 수 있다. β 세포 계통의 특이적인 특징은 하나 이상의 전사 인자, 예를 들어 특히 Pdx1 (췌장 및 십이지장 호메오박스 유전자-1), Nkx2.2, Nkx6.1, Isl1, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnf1b, Hnf-6, Hnf-3베타, 및 MafA의 발현을 포함한다. 이들 전사 인자는 내분비 세포의 확인을 위해 당업계에서 잘 확립되어 있다.예를 들어, 문헌 [Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002)]) 참고.
분화 효율은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 작용제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다. 대안적으로, 분화 효율은 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 작용제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서 일반적이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 혼성화 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역검정법, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌 [Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
소정의 단백질 마커를 검출하는데 유용한 항체의 예는 표 IA 및 표 IB에 열거된다. 표 IA 및 표 IB에 열거된 항체에 의해 인식되는 동일한 마커에 대해 유도된 대안적 항체가 이용가능하거나, 또는 쉽게 개발될 수 있음이 주목되어야 한다. 그러한 대안적 항체는 또한 본 발명에 따라 단리된 세포에서 마커의 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 더 설명되지만, 이에 의해 제한되지는 않는다.
실시예 1
인간 배아 줄기 세포 배양
줄기 세포는 단일 세포 수준에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 전구 세포, 비재생 전구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직을 발생시키며, 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
인간 배아 줄기 세포주 H1, H7 및 H9를 WiCell Research Institute, Inc. (Madison, WI)로부터 입수하였으며 공급처인 상기 인스티튜트에 의해 제공된 설명서에 따라 배양하였다. 요약하면, 세포를 20% 녹아웃(knockout) 혈청 대체물로 보충된 DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO), 100 nM MEM 비필수 아미노산, 0.5 mM 베타-머갑토에탄올, 2 mM L-글루타민 - 4 ng/mL 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)를 포함함 - (모두 Invitrogen/GIBCO부터 입수)으로 구성된 ES 세포 배지에서 마우스 배아 섬유아세포 (MEF) 영양 세포 상에서 배양하였다. E13 내지 13.5 마우스 배아로부터 유래된 MEF 세포를 Charles River로부터 구매하였다. MEF 세포를 10% FBS (Hyclone), 2 mM 글루타민, 및 100 mM MEM 비필수 아미노산으로 보충된 DMEM 배지에서 증가시켰다. 서브-컴플루언트(Sub-confluent) MEF 세포 배양물을 3시간 동안 10 μg ㎍/ml 마이토마이신 C (Sigma, St. Louis, MO)로 처리하여 세포 분열을 중지시키고, 이어서 트립신처리하고 0.1% 소 젤라틴-코팅된 디쉬에 2×104/㎠로 플레이팅하였다. 2 내지 4 계대로부터의 MEF 세포를 영양세포층으로 사용하였다. MEF 세포 영양세포층 상에 플레이팅된 인간 배아 줄기 세포를 가습된 조직 배양 인큐베이터 내에서 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 배양하였다. 컨플루언트(confluent)일 때 (플레이팅 후 약 5 내지 7일), 인간 배아 줄기 세포를 5 내지 10분간 1 mg/mL의 제 IV 형 콜라게나아제 (Invitrogen/GIBCO)로 처리한 다음에, 5 mL 피펫을 이용하여 표면으로부터 부드럽게 긁어내었다. 세포를 5분 동안 900 rpm으로 회전시키고, 펠릿을 재현탁시키고 신선한 배양 배지에서 1:3 내지 1:4 비의 세포로 재플레이팅하였다.
동시에, H1, H7, 및 H9 인간 배아 줄기 세포를 1:30 희석율의 성장 인자가 감소된 매트리젤™ (BD Biosciences)로 코팅된 플레이트에 시딩하여, 8 ng/mL bFGF가 보충된 MEF로 컨디셔닝된 배지에서 배양하였다. 매트리젤™ 상에서 배양된 세포를 콜라게나아제 IV (Invitrogen/GIBCO), 디스파아제 (Dispase) (BD Biosciences) 또는 리베라아제(Liberase) 효소 (Source)를 이용하여 일상적으로 계대시켰다. 인간 배아 줄기 세포 배양액 일부를 저산소 조건하에 (약 3% O2) 인큐베이션하였다.
실시예 2
인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포의 유래 및 배양
인간 배아 줄기 세포주 H1 및 H9의 여러 계대 (계대 30 내지 54)의 세포를 적어도 3 계대 동안 저산소 조건하에 (약 3% O2) 배양하였다. 실시예 1에 따라, 세포를 8 ng/ml bFGF가 보충된 MEF-CM에서 배양하여, 매트리젤로 코팅된 플레이트에 플레이팅하였다.
그 다음에, 세포를 0.5% FBS, 20 ng/mL WNT-3a (Catalog # 1324-WN-002, R&D Systems, MN), 및 100 ng/mL 액티빈-A (R&D Systems, MN)가 보충된 DMEM/F12 배지로 2일간 처리한 다음에, 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈-A (AA)가 보충된 DMEM/F12 배지로 추가로 3 내지 4일간 처리하였다. 이러한 프로토콜에 의해, 완성 내배엽 마커가 상당히 상향 조절되었다.
그 다음에, 세포를 TrypLE™ 익스프레스 솔루션(Express solution) (Invitrogen, CA)으로 5분간 처리하였다. 유리된 세포를 DMEM-F12 + 2% FBS 배지에 재현탁시켜, 원심분리로 회수하여, 혈구계를 사용하여 카운트하였다. 유리된 세포를 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS)으로 처리된 플라스크에 1000 내지 10,000 개의 세포/㎠로 시딩하여, 표준 조직 배양 인큐베이터에서 37℃에서 저산소 조건하에 (약 3% O2) DMEM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT-3A에서 배양하였다. TCPS 플라스크를 매트리젤 또는 다른 세포외 매트릭스 단백질로 코팅하지 않았다. 배지를 날마다 교체하였다. 일부의 배양에서는, 배지를 추가로 10 내지 50 ng/mL의 IGF-I (인슐린 성장 인자-I (R&D Systems, MN)) 또는 1X ITS (인슐린, 트랜스페린, 및 셀레늄 (Invitrogen, CA))으로 보충하였다. 일부의 배양 조건에서, 기본 배지 (DM-F12 + 2% FBS)를 추가로 0.1 mM 머캅토에탄올 (Invitrogen, CA) 및 비필수 아미노산 (1X, NEAA (Invitrogen, CA))으로 보충하였다.
5 내지 15일간의 배양 후에, 상이한 세포 콜로니가 노화 시에 나타나는 다수의 거대 세포(enlarged cell)로 둘러싸여 나타났다. 약 50 내지 60% 컨플루언시(confluency)에서, 실온에서 5 분간 TrypLE™ 익스프레스 솔루션에 노출시켜 계대 배양시켰다. 유리된 세포를 DMEM-F12 + 2% FBS 배지에 재현탁시켜, 원심분리로 회수하여, 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS)으로 처리된 플라스크에 DMEM-F12 + 2%FBS + 100 ng/ml 액티빈-A + 20 ng/ml WNT-3A +/- 50 ng/ml의 IGF-I 중에 10,000개의 세포/㎠로 시딩하였다. 이 배지를 "성장 배지"로서 추가로 지칭할 것이다.
실시예 3A
인간 배아 줄기 세포의 단세포 현탁액으로부터의 다능성 마커를 발현하는 세포의 유래
인간 배아 줄기 세포주 H1 P33 및 H9 P45의 세포를 적어도 3 계대 동안 저산소 조건하에 (약 3% O2) 배양하였다. 실시예 1에 따라, 세포를 8 ng/ml bFGF가 보충된 MEF-CM에서 배양하여, 매트리젤로 코팅된 플레이트에 플레이팅하였다. 대략 60% 컨플루언시에서, 배양액을 5 분간 TrypLE™ 익스프레스 솔루션 (Invitrogen, CA)에 노출시켰다. 유리된 세포를 DMEM-F12 + 2% FBS 배지에 재현탁시켜, 원심분리로 회수하여, 혈구계를 사용하여 카운트하였다. 유리된 세포를 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS)으로 처리된 플라스크에 1000 내지 10,000개의 세포/㎠로 시딩하여, 표준 조직 배양 인큐베이터에서 37℃에서 저산소 조건하에 (약 3% O2) DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/mL 액티빈-A + 20 ng/mL WNT-3A + 50 ng/mL의 IGF-I + 0.1 mM 머캅토에탄올 (Invitrogen, CA) 및 비필수 아미노산 (1X, NEAA (Invitrogen, CA))에서 배양하였다. TCPS 플라스크를 매트리젤 또는 다른 세포외 매트릭스 단백질로 코팅하지 않았다. 배지를 날마다 변경하였다. 제1 계대 세포는 P1으로 명명된다.
실시예 3B
인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포의 증가에 유용한 다양한 성장 배지
인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포를 적어도 2 내지 30 계대 동안 하기 배지 조성물에서 성공적으로 배양하였다:
1. DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/ml AA + 20 ng/ml WNT-3A
2. DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/ml AA + 20 ng/ml WNT-3A + 50 ng/ml IGF-I
3. DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/ml AA + 20 ng/ml WNT-3A + 10 ng/ml IGF-I
4. DM-F12 + 2% FBS + 50 ng/ml AA + 20 ng/ml WNT-3A + 50 ng/ml IGF-I
5. DM-F12 + 2% FBS + 50 ng/ml AA + 10 ng/ml WNT-3A + 50 ng/ml IGF-I
6. DM-F12 + 2% FBS + 50 ng/ml AA + 20 ng/ml WNT-3A + 10 ng/ml IGF-I
7. DM-F12 + 2% FBS + 100 ng/ml AA + 10 ng/ml WNT-3A + 10 ng/ml IGF-I
8. HEScGRO 규명된 배지 (Chemicon, CA)
상기에 나타낸 배지의 기본 성분은 유사한 배지, 에컨대 RPMI, DMEM, CRML, 녹아웃 ™DMEM, 및 F12로 교체될 수 있다.
실시예 4
다능성 마커를 발현하는 세포 생존율에 대한 GSK-3β 효소 활성 저해제의 효과
다능성 마커를 발현하는 세포의 유래 및 유지를 실시예 2에 기재된 바와 같이 행하였다. 세포를 2% FCS (Invitrogen), 100 ng/mL 액티빈 A, 20 ng/mL Wnt-3a, 및 50 ng/mL IGF (R&D Biosystems)가 보충된 DMEM:F12에서 성장시켰다. 세포를 팔콘(Falcon) 폴리스티렌 플라스크에서 10,000개의 세포/㎠의 밀도로 시딩하여, 37℃, 5% CO2, 저산소에서 단층 배양액에서 성장시켰다. 60 내지 70% 컨플루언스에 도달한 후에, 단층을 PBS로 세정하고, TrypLE (Invitrogen)로 3 내지 5 분간 인큐베이션하여, 분리 및 단세포 분산시키도록 세포를 계대시켰다.
GSK-3B 효소 활성을 저해하는 이들의 능력에 대하여 선택되는 소분자의 전용 라이브러리(proprietary library)의 시험 화합물을 사용하여 스크리닝을 행하였다. 이러한 라이브러리의 화합물은 50 mM HEPES, 30% DMSO 중에서의 96-웰 플레이트 포맷에서 1 mM 스톡으로서 이용할 수 있었다. 분석을 위해, 다능성 마커를 발현하는 세포를 세정하고, 카운트하여, 96-웰 클리어-바텀, 다크-웰 플레이트 (Costar)에서 20,000 세포/웰의 시딩 밀도로 표준 배양 배지에서 플레이팅하였다. 하룻밤 배양 시에 최적 단층 형성을 얻기 위해, 상기 시딩 밀도를 미리 결정하였다. 다음 날, 배양 배지를 제거하고, 세포 단층을 PBS로 3회 헹구고, 시험 화합물을 80 μl 분취량으로 웰에 첨가하고, 각각을 10 μM의 최종 분석 농도로 분석 배지 중에 희석하였다. 분석 2일째에, 배지를 각각의 웰로부터 제거하고, 분석 배지 중에 희석된 시험 화합물의 새로운 분취량으로 교체하였다. 배양 1일째 및 2일째의 분석 배지는 0.5% FCS 및 100 ng/ml 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12로 구성되었다. 배양 3일째 및 4일째에, 배지를 각각의 웰로부터 제거하고, 2% FCS 및 100 ng/ml 액티빈 A로 보충된 DMEM:F12 (시험 화합물 없음)로 교체하였다. 분석 4 일째에, MTS (Promega) 15 μl를 각각의 웰에 첨가하고, 스펙트라맥스(SpectraMax) (Molecular Devices) 인스트루먼트에서 490 nm에서 광학 밀도를 리딩하기 전에, 플레이트를 37℃에서 1.5 내지 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 평균, 표준 편차, 및 변동 계수로 구성되는 통계적 측정은 각각의 이중 세트에 대하여 계산하였다. 양성 대조군에 대한 각각의 시험 웰에 관하여 독성을 계산하였다 (웰을 배양 1 일째 및 2 일째에 액티빈 A 및 Wnt3a로 처리하였다).
표 II는 모든 스크리닝 결과의 편집이다. 다능성 마커를 발현하는 세포를 초기에 이 분석에서 컨플루언트 단층으로서 플레이팅하였기 때문에; 결과는 4일 배양 기간에 걸친 독성 측정치를 나타낸다. 결과는 대조군의 생존율로서 나타내며, 사용된 10 μM 스크리닝 농도에서 일부의 화합물에 대한 가변 독성을 증명한다. 높은 비율의 화합물은 이러한 세포에 기초한 분석에서 최소 독성을 나타내거나 측정가능한 독성을 나타내지 않는다.
선택되는 화합물의 작은 패널을 상기에 기재된 유사한 분석으로 다시 다능성 마커를 발현하는 세포를 사용하여 좁은 용량 적정 범위에 걸쳐서 반복 시험하였다. 표 III은 이러한 결과의 요약이며, 독성 화합물 및 무독성 화합물의 범위에 대한 가변 용량 적정 효과를 증명한다.
실시예 5
하이 컨텐트 스크리닝 분석을 이용하여 측정한 인간 배아 줄기 세포의 분화 및 증식에 대한 GSK-3β 효소 활성 저해제의 효과
인간 배아 줄기 세포 (H9 세포주)의 유지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 행하였다. 세포 콜로니를 평균적으로 4일 마다 계대하면서, 미분화 다능성 상태로 유지하였다. 세포 배양액을 콜라게나아제 용액 (1 mg/ml; Sigma-Aldrich)에 10 내지 30분간 37℃에서 노출시킨 후, 피펫 팁으로 부드럽게 긁어내어 세포 클러스터를 회수함으로써 계대를 수행하였다. 클러스터를 중력에 의해 침강시킨 다음에, 세정하여, 잔류 콜라게나아제를 제거하였다. 세포 클러스터를 통상적인 유지 배양을 위해서는 1:3 비율 또는 즉각적인 분석을 위해서는 1:1 비율로 분할하였다. 사용된 인간 배아 줄기 세포주를 계대 50 미만의 계대 수로 유지하여, 통상적으로 정상 핵형 표현형 및 마이코플라스마 오염 결손을 평가하였다.
분석에 사용된 세포 클러스터를 표준 배양 배지에 균등하게 재현탁시켜, 100 μl/웰의 체적으로 매트리젤로 코팅된 96-웰 팩커드 뷰플레이츠(Packard VIEWPLATES) (PerkinElmer)에 플레이팅하였다. 8 ng/mL bFGF가 보충된 MEF로 컨디셔닝된 배양 배지를 초기 플레이팅 및 회수를 위해 사용하였다. 각각의 웰의 쓰고 난 배양 배지를 흡인하여, 동일 체적의 새로운 배지로 교체함으로써 매일 공급을 행하였다. 플레이트를 분석 지속 기간을 통해 가습 박스에서 37℃, 5% CO2로 유지하였다.
GSK-3B 효소 활성을 저해하는 이들의 능력에 대하여 선택되는 소분자의 전용 라이브러리의 시험 화합물을 사용하여 스크리닝을 행하였다. 이러한 라이브러리의 화합물은 50 mM HEPES, 30% DMSO 중에서의 96-웰 플레이트 포맷에서 1 mM 스톡으로서 이용할 수 있었다. 스크리닝 화합물을 삼중 또는 이중 세트로 시험하였다. 각각의 웰로부터 배양 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 일차 스크리닝 분석을 개시하였다. 0.5% FCS (HyClone) 및 100 ng/ml 액티빈 A (R&D Biosystems)에다가, 10 μM 시험 화합물이 보충된 DMEM:F12 기본 배지 (Invitrogen)를 포함하는 80 내지 100 μl/웰의 시험 체적을 다시 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물 대신에 10 내지 20 ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)를 사용한 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 0.5% FCS 및 액티빈 A 단독 (AA 만)을 포함하거나, 그 대안으로는 액티빈 A 또는 Wnt3a (미처리)를 함유하지 않는 0.5% FCS를 포함하는 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 웰을 흡인하여, 동일한 용액을 다시 공급하였다. 3일 및 4일 째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 2% FCS 및 100 ng/ml 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12 (시험 화합물 또는 Wnt3a를 함유하지 않음)로 전환시키고; 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS 및 액티빈 A (AA 만)를 포함하거나, 그 대안으로는 액티빈 A (미처리)를 함유하지 않는 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지 중에 유지시켰다.
배양 종료시에, 96-웰 플레이트의 세포를 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS로 3회 세정한 다음에, 실온에서 20분간 0.5% 트리톤(Triton) X-100으로 투과화(permeabilization)하였다. 대안적으로, 세포를 얼음 냉각된 70% 에탄올로 밤새 -20℃에서 고정시키고, PBS로 3회 세정한 다음에, 4℃에서 5분간 트리톤 X-100으로 투과화하였다. 고정 및 투과화 후에, 세포를 다시 PBS로 3회 세정한 다음에, 실온에서 30분간 PBS 중에서 4% 닭 혈청 (Invitrogen)으로 블로킹하였다. 일차 항체 (염소 항-인간 Sox17 및 염소 항-인간 HNF-3베타; R&D Systems)를 4% 닭 혈청 중에서 1:100으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 PBS로 3회 세정한 후에, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 콘쥬케이션 이차 항체 (닭 항-염소 IgG; Molecular Probes)를 PBS 중에 1:200으로 희석하여, 첨가하였다. 핵을 대비염색하기 위해, 5 mM 드래크(Draq)5 (Alexis Biochemicals)를 실온에서 5분간 첨가하였다. 세포를 PBS로 1회 세정한 다음에, 이미지화를 위해 100 mL/웰 PBS에 정치시켰다.
드래크5 및 알렉사 플루오르 488을 사용해 염색된 세포에 대한 51008bs 이염색단을 이용하는 IN 세포 분석기 1000 (GE Healthcare)을 사용하여 세포를 이미지화하였다. 노출 시간은 양성 대조군 웰을 사용하여 그리고 미처리 음성 대조군에 경우에서만 단지 이차를 갖는 웰을 사용하여 최적화하였다. 처리 및 염색 절차시에 임의의 세포 손실을 보상하기 위해 12개의 필드/웰을 얻었다. Sox-17 및 HNF-3베타에 관한 전체 세포수 및 전체 세포 강도를 IN 셀 디벨로퍼 툴박스(Cell Developer Toolbox) 1.6 (GE Healthcare) 소프트웨어를 이용하여 측정하였다. 회색조 수준(grey-scale level) (베이스라인 범위 100 내지 300) 및 핵 사이즈에 기초하여, 핵분열을 측정하였다. 반복 실험에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 단백질 발현을 세포 × 세포 면적의 전체 형광성으로서 정의되는 전체 강도 또는 집적 강도로서 기록하였다. 배경은 300 내지 3000의 회색조 범위의 허용 기준 및 0.4 이상의 폼 팩터(form factor)를 바탕으로 제거하였다. 각 웰에 대한 총 강도를 Wnt3a/액티빈 A 양성 대조군에 대한 평균 총 강도로 나누어서, 총 강도 데이터를 정규화하였다. 각각의 복제 세트에 대한 평균 및 표준 편차에 대하여 정규화 데이터를 계산하였다.
표 IV는 모든 스크리닝 결과의 대표 요약이다. 표 V는 이러한 스크린으로부터의 히트(hit)의 목록이다. 강한 히트는 대조군 값의 120% 이상으로서 정의되고; 중간 히트는 대조군 값의 60 내지 120%의 범위 내에 포함되는 것으로서 정의된다. 상당수의 화합물은 이러한 분석에서 두가지의 증식 반응을 유도한다. 동시에, 상당수의 화합물은 Sox17 및 Hnf-3b 전사 인자의 단백질 발현에 의해 측정된 바와 같이, 이러한 분석에서 분화를 유도한다.
실시예 6
플레이트 리더 분석을 이용하여 측정한 인간 배아 줄기 세포의 증식에 대한 GSK-3b 효소 활성 저해제의 효과
인간 배아 줄기 세포 (H9 또는 H1 세포주)의 유지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 행하였다. 세포 콜로니를 평균적으로 4일 마다 계대하면서, 미분화 다능성 상태로 유지하였다. 세포 배양액을 콜라게나아제 용액 (1 mg/ml; Sigma-Aldrich)에 10 내지 30분간 37℃에서 노출시킨 후, 피펫 팁으로 부드럽게 긁어내어 세포 클러스터를 회수함으로써 계대를 수행하였다. 클러스터를 침강시킨 다음에, 세정하여, 잔류 콜라게나아제를 제거하였다. 세포 클러스터를 통상적인 배양을 위해서는 1:3 단층 면적 비율 또는 즉각적인 분석을 위해서는 1:1 비율로 분할하였다. 이러한 실시예를 위하여 사용된 인간 배아 줄기 세포주를 50 미만의 계대 수로 유지하여, 통상적으로 정상 핵형 표현형 및 마이코플라스마 오염 결손을 평가하였다.
분석에 사용된 세포 클러스터를 표준 배양 배지에 균등하게 재현탁시켜, 100 μl/웰의 체적으로 매트리젤로 코팅된 96-웰 팩커드 뷰플레이츠 (PerkinElmer)에 플레이팅하였다. 8 ng/mL bFGF가 보충된 MEF로 컨디셔닝된 배지를 초기 플레이팅 및 회수를 위해 사용하였다. 각각의 웰의 쓰고 난 배양 배지를 흡인하여, 동일 체적의 새로운 배양 배지로 교체함으로써 매일 공급을 행하였다. 플레이트를 분석 지속 기간을 통해 가습 박스에서 37℃, 5% CO2로 유지하였다.
각각의 웰로부터 배양 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 일차 스크리닝 분석을 개시하였다. 0.5% FCS (HyClone), 100 ng/ml 액티빈 A (R&D Biosystems) 및 10 μM 시험 화합물이 보충된 DMEM:F12 기본 배지 (Invitrogen)를 포함하는 80 내지 100μl/웰의 시험 체적을 다시 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 10 내지 20 ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)로 교체한 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A 또는 Wnt3a를 함유하지 않고, 0.5% FCS를 함유하는 기본 배지를 포함하였다. 스크리닝 화합물을 삼중으로 시험하였다. 분석 2일째에, 웰을 흡인하여, 동일한 용액을 다시 공급하였다. 3일 및 4일째에, 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하는 것을 제외하고는, 모든 분석 웰을 흡인하여, 2% FCS 및 100 ng/mL 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12로 전환하였다.
분석 4일째에, 15 내지 20μL의 MTS (Promega)를 각각의 웰에 첨가하여, 플레이트를 37℃에서 1.5 내지 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 몰레큘러 디바이스(Molecular Devices) 분광광도계 플레이트 리더를 사용하여, OD490에서 농도 리딩을 측정하였다. 복제 세트에 대한 평균 리딩을 표준 편차 및 변동 계수에 따라 계산하였다. 실험 웰을 액티빈 A/Wnt3a 양성 대조군과 비교하여, 증식도로서 퍼센트 대조값을 계산하였다.
표 VI는 모든 스크리닝 결과의 대표 요약이다. 표 VII은 이러한 스크린으로부터의 히트의 목록이다. 강한 히트는 대조군 값의 120% 이상으로서 정의되고; 중간 히트는 대조군 값의 60 내지 120%의 범위 내에 포함되는 것으로서 정의된다. 상당수의 화합물은 이러한 분석에서 증식 반응을 유도한다.
실시예 7
인간 배아 줄기 세포의 분화 및 증식에 대한 GSK-3b 효소 저해제의 효과: 리드(Lead) 화합물의 용량 적정
일차 스크리닝으로부터 특정된 히트 활성을 확인하고, 추가로 용량 적정에 의해 활성 범위를 분석하는 것이 중요하였다. 일차 스크리닝 히트의 선택적 서브세트의 새로운 샘플을 건조 분말로 얻어, 가용화시켜 새로운 스톡 시약을 형성하고, 이차적 확인 분석시료로 희석시켜, 인간 배아 줄기 세포에 대한 효과를 평가하였다.
2개의 인간 배아 줄기 세포 (H1 및 H9)의 배양을 실시예 1에 기재된 바와 같이 행하였다. 세포 콜로니를 표면을 코팅하도록 DMEM:F12 중의 매트리젤™ 의 1:30 희석율을 사용하여, 매트리젤™ (Invitrogen)으로 코팅된 폴리스티렌 플라스틱 상에서 미분화 다능성 상태로 유지하였다. 세포를 평균적으로 4일 마다 효소 계대에 의해 분할하였다. 세포 단층을 콜라게나아제 용액 (1 mg/ml; Sigma-Aldrich)에 10 내지 60분간 37℃에서 노출시킨 후, 피펫 팁으로 부드럽게 긁어내어 세포 클러스터를 회수함으로써 계대를 수행하였다. 클러스터를 중력에 의해 침강시킨 다음에, 세정하여, 잔류 콜라게나아제를 제거하였다. 세포 클러스터를 유지 배양을 위해서는 1:3 비율 또는 후속 분석을 위해서는 1:1 비율로 분할하였다. 인간 배아 줄기 세포주를 계대 50 미만으로 유지하여, 통상적으로 정상 핵형 표현형 및 마이코플라스마 오염 결손을 평가하였다.
분석용 세포의 제조: 분석에 사용된 H1 또는 H9 인간 배아 줄기 세포주의 세포 클러스터를 배양 배지에 균등하게 재현탁시켜, 100 μl/웰의 체적으로 매트리젤™으로 코팅된 96-웰 팩커드 뷰플레이츠 (PerkinElmer)에 플레이팅하였다. 8 ng/mL bFGF가 보충된 MEF로 컨디셔닝된 배지를 초기 플레이팅 및 증가를 위해 사용하였다. 각각의 웰의 쓰고 난 배양 배지를 흡인하여, 동일 체적의 새로운 배지로 교체함으로써 매일 공급을 행하였다. 분석을 개시하기 전에 플레이팅 후에 배양을 1일 내지 3일간 증가시켰다. 플레이트를 분석 지속 기간 동안 가습 박스에서 37℃, 5% CO2로 유지하였다.
화합물 및 분석 배지의 제조: 일차 스크리닝에서 얻어진 히트 서브세트를 추적(follow-up) 조사 및 후속 이차 분석에 사용하였다. 건조 분말로서 이용가능한 20개의 화합물을 DMSO 중의 10 mM 스톡으로서 가용화하여, 사용시까지 -20℃로 건조시켜 보관하였다. 분석 직전에, 화합물 스톡을 1:1000으로 희석시켜, 0.5% FCS (HyClone) 및 100 ng/ml 액티빈 A (R&D Biosystems)가 보충된 DMEM:F12 기본 배지 (Invitrogen) 중의 10 μM 시험 화합물을 제조하였다. 이것을 추가로 연속적으로 2배 희석하여, 0.5% FCS 및 100 ng/ml 액티빈 A를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지 중에서도 각각의 화합물에 대하여 7단계 희석 곡선(seven point dilution curve)을 형성하였다.
이차 스크리닝 분석: 각각의 웰의 세포 단층으로부터 배양 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 분석을 개시하였다. 0.5% FCS, 및 100 ng/ml 액티빈 A를 함유하고, Wnt3a를 함유하지 않는 상이한 농도의 저해제 화합물을 포함하는 배지를 포함하는 웰 당 100 μl의 시험 체적을 다시 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물의 부재하에 0.5% FCS 및 20 ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A, Wnt3a, 또는 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 분석 웰을 흡인하여, 동일한 농도의 시험 화합물 또는 대조 용액을 다시 공급하였다. 3 및 4일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 시험 화합물 또는 Wnt3a의 부재하에 2% FCS 및 100 ng/ml 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12를 공급하였다. 3 및 4일째에, 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하였다.
분석 평가: 배양 종료시에, 96-웰 플레이트의 세포를 PBS로 2회 세정한 다음에, 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS로 3회를 초과하여 세정한 다음에, 실온에서 20분간 0.5% 트리톤 X-100으로 투과화하였다. 고정 및 투과화 후에, 세포를 다시 PBS로 3회 세정한 다음에, 실온에서 30분간 PBS 중에서 4% 닭 혈청 (Invitrogen)으로 블로킹하였다. 일차 항체 (염소 항-인간 Sox17; R&D Systems)를 4% 닭 혈청 중에서 1:100으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 PBS로 3회 세정한 후에, 알렉사 플루오르 488 콘쥬케이션 이차 항체 (닭 항-염소 IgG; Molecular Probes)를 PBS 중에 1:200으로 희석하여, 각각의 웰에 첨가하였다. 핵을 대비염색하기 위해, 2μg/ml 훽스트(Hoechst) 33342 (Invitrogen)를 실온에서 10분간 첨가하였다. 세포를 PBS로 1회 세정하고, 이미지화를 위해 100 μl/웰에 정치시켰다.
훽스트 33342 및 알렉사 플루오르 488을 사용해 염색된 세포에 대한 51008bs 이염색단을 이용하는 IN 세포 분석기 1000 (GE Healthcare)을 사용해 세포를 이미지화하였다. 노출 시간은 양성 대조군 웰을 사용하여 그리고 미처리 음성 대조군으로서 이차 항체 단독으로 염색된 웰을 사용하여 최적화하였다. 처리 및 염색 절차시에 임의의 세포 손실을 보상하기 위해 15개의 필드/웰의 이미지를 획득하였다. 각각의 웰에 대하여 전체 세포수 및 전체 Sox-17 강도의 측정값을 IN 셀 디벨로퍼 툴박스 1.7 (GE Healthcare) 소프트웨어를 이용하여 얻었다. 회색조 수준 (베이스라인 범위 100 내지 300) 및 핵 사이즈에 기초하여, 핵분열을 측정하였다. 각각의 복제 데이터 세트에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 Sox17 단백질 발현을 세포 × 세포 면적의 전체 형광성으로서 정의되는 전체 강도 또는 집적 강도로서 기록하였다. 배경은 300 내지 3000의 회색조 범위의 허용 기준 및 0.4 이상의 폼 팩터를 바탕으로 제거하였다. 각 웰에 대한 총 강도를 Wnt3a/액티빈 A 양성 대조군에 대한 평균 총 강도로 나누어서, 총 강도 데이터를 정규화하였다. 각각의 복제 세트에 대한 평균 및 표준 편차에 대하여 정규화 데이터를 계산하였다.
결과
결과는 이러한 이차 분석에서 적정에 의해 활성이 확인되고, 효능이 측정된 8개의 GSK-3B 효소 저해제에 대하여 나타낸다. 나타낸 데이터는 각각의 데이터 점을 이중 세트로부터 평균하고, 동일한 필드 및 웰로부터의 각각의 파라미터에 대하여 측정된 세포수 및 Sox17 강도에 대한 화합물 효과를 나타낸다. 본 실시예에서, Sox17 발현은 완성 내배엽 분화를 나타낸다. H1 인간 배아 줄기 세포주를 이용한 각각 세포수 및 Sox17 강도에 대한 결과는 표 VIII 및 IX에 나타낸다. H9 인간 배아 줄기 세포주에 관한 결과는 표 X 및 XI에 나타낸다. 양성 대조군 값을 세포수 및 Sox17 강도에 대하여 1.000로 정규화하였다. 음성 대조군 값은 두가지의 세포주에 대하여 세포수가 0.388 미만, Sox17 강도가 0.065 미만이었다. 두가지의 인간 배아 줄기 세포주를 비교한, 각각의 화합물의 용량 적정을 포함하는 이들 데이터의 그래픽 묘사가 도 1 내지 8에 주어진다. 세포수는 패널 A에 나타내며; Sox 17 강도는 패널 B에 나타낸다. 이러한 데이터는 각각의 화합물이 hES 세포 증식 및 완성 내배엽 분화를 촉진시킬 수 있고, 최적의 활성 범위를 식별할 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 8
완성 내배엽과 관련된 추가의 마커의 발현에 대한 GSK-3β 효소 저해제의 효과
리드 화합물은 또한 전사 인자 Sox17 이외에, 완성 내배엽 분화를 나타내는 다른 마크를 유도할 수 있다는 것을 증명하는 것이 중요하였다. 히트의 선택적 서브세트를 CXCR4, 표면 수용체 단백질 및 HNF-3 베타, 및 또한 완성 내배엽 분화와 관련된 전사 인자의 발현을 촉진시키는 이들의 능력에 대해서 시험하였다.
분석용 세포의 제조: 분석에 사용된 H1 인간 배아 줄기 세포주의 세포 클러스터를 배양 배지에 균등하게 재현탁시켜, 2 ml/웰의 체적으로 매트리젤™으로 코팅된 (1:30 희석율) 6-웰 플레이트 (Corning)에 플레이팅하였다. 8 ng/mL bFGF가 보충된 MEF로 컨디셔닝된 배지를 초기 플레이팅 및 증가를 위해 사용하였다. 각각의 웰의 쓰고 난 배양 배지를 흡인하여, 동일 체적의 새로운 배지로 교체함으로써 매일 공급을 행하였다. 분석을 개시하기 전에 플레이팅 후에 배양을 1일 내지 3일간 증가시켰다. 플레이트를 분석 지속 기간 동안 37℃, 5% CO2로 유지하였다.
화합물 및 분석 배지의 제조: 일차 스크리닝에서 얻어진 7개 히트의 서브세트를 추적 조사 및 후속 이차 분석에 사용하였다. 순수한 화합물을 DMSO 중의 10 mM 스톡으로서 가용화하여, 사용시까지 -20℃로 건조시켜 보관하였다. 분석 직전에, 화합물 스톡을 0.5% FCS (HyClone) 및 100 ng/ml 액티빈 A (R&D Biosystems)가 보충된 DMEM:F12 기본 배지 (Invitrogen) 중의 1 μM 내지 5 μM의 범위의 최종 농도로 희석시켰다.
분석: 각각의 웰의 세포 단층으로부터 배양 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 분석을 개시하였다. 0.5% FCS, 및 100 ng/ml 액티빈 A를 함유하고, Wnt3a를 함유하지 않는 상이한 농도의 저해제 화합물을 포함하는 배지를 포함하는 2 mL/웰의 시험 체적을 다시 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS, 및 100 ng/ml 액티빈 A 및 20 ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A, Wnt3a, 또는 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS를 함유하는 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 분석 웰을 흡인하여, 동일한 농도의 시험 화합물 또는 대조 용액을 다시 공급하였다. 3 및 4일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 시험 화합물 또는 Wnt3a의 부재하에 2% FCS 및 100 ng/ml 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12를 공급하였다. 3 및 4일째에, 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하였다.
분석 평가: 배양 종료시에, 세포 단층을 PBS로 세정하고, TrypLE™ 익스프레스 솔루션 (Invitrogen, CA)으로 5분간 인큐베이션하여, 배양 플레이트로부터 수확하였다. 세포를 MEF로 컨디셔닝된 배지에 재현탁시켜, 2개의 동일한 샘플로 분할하였다. 한 세트의 샘플을 추가로 다양한 형광 표지 항체로 염색하여, 유세포 (FACS) 분석을 행하였다. 대응하는 제2 세트의 샘플에 대하여 정량적 PCR을 행하였다.
FACS 분석용 세포를 PBS로 세정하고, 4℃에서 15분간 0으로 블로킹하였다. 125% 인간 감마-글로불린 (시그마 cat# G-4386)을 PBS 및 BD FACS 염색 완충액 중에 희석하였다. 세포 분취량 (각각 약 105개의 세포)을 형광 태그에 직접 콘쥬게이트되고, CD9 PE (BD#555372), CD99 PE (Caltag#MHCD9904), 또는 CXCR-4 APC (R&D Systems cat# FAB173A)에 대한 특이성을 갖는 항체로 4℃에서 30분간 염색하였다. BD FACS 염색 완충액 중에서의 일련의 세정 후에, 세포를 7-AAD (BD# 559925)로 염색하여, 생존율을 평가하고, 적어도 10,000 이벤트를 수집하는 BD FACS 어레이 인스트루먼트(Array instrument) (BD Biosciences)에서 분석하였다. PE 및 APC에 대한 마우스 IgG1k 아이소타입 대조 항체를 사용하여, 양성 세포 퍼센트를 게이트(gate)하였다.
정량적 PCR용 세포를 RNA 추출, 정제, 및 cDNA 합성으로 처리하였다. 에탄올 함유, 고염 완충액의 존재하에서 실리카 겔 막 (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA)에 결합시킨 후 세정하여 오염물질을 제거함으로써 RNA 샘플을 정제하였다. 터보(TURBO) DNA 비함유 키트 (Ambion, Inc.)를 이용하여 RNA를 추가로 정제하고, 이어서 고 품질 RNA를 물에 용출시켰다. 수율과 순도를 분광광도계의 A260 및 A280 리딩에 의해 평가하였다. cDNA 카피(copy)는 Applied Biosystems, Inc. (ABI, CA)의 고용량 cDNA 아카이브 키트(high capacity cDNA archive kit)를 이용하여 정제 RNA로부터 제조하였다.
달리 지정하지 않는 한, 실시간 PCR 증폭 및 정량을 위한 모든 시약을 ABI로부터 구입하였다. 실시간 PCR 반응을 ABI 프리즘(PRISM) 7900 시퀀스 디텍션 시스템(Sequence Detection System)을 이용하여 행하였다. 택맨 유니버설 PCR 마스터 믹스(TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX (ABI, CA))는 20 μl의 총 반응 체적 내 20 ng의 역전사 RNA와 함께 사용하였다. 각각의 cDNA 샘플을 두벌씩 실행하여 피펫팅 오류에 대해 보정하였다. 프라이머 및 FAM 표지 택맨 프로브를 200 nM의 농도로 사용하였다. 각 표적 유전자의 발현 수준은 ABI에 의해 이전에 개발된 인간 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나아제 (GAPDH) 내인성 대조군(endogenous control)을 이용하여 정규화하였다. 프라이머 및 프로브 세트는 하기에 열거되어 있다: CXCR4 (Hs00237052), GAPDH (4310884E), HNF3b (Hs00232764), SOX17 (probe part # 450025, forward and reverse part # 4304971).
50℃에서 2분 동안, 이어서 95℃에서 10분 동안 초기 인큐베이션한 후, 샘플을 2단계, 95℃에서 15초 동안의 변성 단계, 이어서, 60℃에서 1분 동안의 어닐링/연장 단계에서 40회 순환시켰다. 데이터 분석은 진앰프(GENEAMP) 7000 시퀀스 디텍션 시스템 소프트웨어(Sequence Detection System software)를 사용하여 수행하였다. 각각의 프라이머/프로브 세트에 대하여, 형광 강도가 증폭의 지수 영역의 중간의 특정 값에 도달하는 사이클 수로서 Ct 값을 결정하였다.상대적인 유전자 발현 수준을 비교 Ct 방법을 이용하여 계산하였다. 간략하게는, 각각의 cDNA 표본에 대해, 내인성 대조군 Ct 값을 대상으로 하는 유전자의 Ct에서 제하여, 델타 Ct값 (ΔCt))을 수득하였다. 표적의 정규화된 양은 2-ΔCt로서 계산하였고, 이는 증폭이 100% 효율인 것으로 가정하였다. 최종 데이터를 보정 샘플에 대하여 나타내었다.
결과
도 9는 다양한 GSK3 저해제로 처리한 후에 CXCR4 표면 수용체를 발현하는 양성 세포 퍼센트의 FACS 분석을 나타낸다. 각각의 화합물의 1 μM 내지 5 μM 범위의 두 농도를 세포의 미처리 집단 (음성 대조군) 또는 액티빈 A 및 Wnt3으로 처리된 세포 (양성 대조군)에 대해서 나타낸다. 도 10의 패널 a, b, 및 c는 또한 완성 내배엽의 마커인 것으로 고려되는 CXCR4, Sox17, 및 HNF3베타에 대한 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. FACS 및 실시간 PCR 분석에 의해, 미처리 대조 세포에 비하여 분화 세포에서 관찰된 이들 마커 각각의 현저한 증가가 증명된다. 이들 완성 내배엽 마커의 발현 수준은 경우에 따라서는 양성 대조군에 상당하는데, 이는 GSK3 저해제가 이러한 분화 단계에서 Wnt3a 대신에 사용될 수 있음을 증명한다.
실시예 9
췌장 내배엽의 형성에 대한 GSK-3β 효소 저해제의 효과
완성 내배엽 유도 시에 GSK3β 저해제로 처리하면, 다른 세포형, 예를 들어 췌장 내배엽의 후속 분화를 저지하지 않는 것을 증명하는 것이 중요하였다. 히트의 선택적 서브세트에 대하여, PDX1 및 HNF6, 췌장 내배엽과 관련된 주요 전사 인자의 발현을 촉진시키는 이들의 능력을 시험하였다.
인간 배아 줄기 세포 (H1 및 H9 세포주)의 유지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 행하였다. 세포 콜로니를 평균적으로 4일 마다 계대하면서, 미분화 다능성 상태로 유지하였다. 세포 배양액을 콜라게나아제 용액 (1 mg/ml; Sigma-Aldrich)에 10 내지 30분간 37℃에서 노출시킨 후, 피펫 팁으로 부드럽게 긁어내어 세포 클러스터를 회수함으로써 계대를 수행하였다. 클러스터를 중력에 의해 침강시킨 다음에, 세정하여, 잔류 콜라게나아제를 제거하였다. 세포 클러스터를 통상적인 유지 배양을 위해서는 1:3 비율 또는 후속 분석을 위해서는 1:1 비율로 분할하였다. 사용된 인간 배아 줄기 세포주를 계대 50 미만으로 유지하여, 통상적으로 정상 핵형 표현형 및 마이코플라스마 오염 결손을 평가하였다.
분석용 세포 제조: 분석에 사용된 H1 인간 배아 줄기 세포주의 세포 클러스터를 배양 배지에 균등하게 재현탁시켜, 1 ml/웰의 체적으로 매트리젤™으로 코팅된 (1:30 희석율) 24-웰 플레이트 (블랙 웰; Arctic White)에 플레이팅하였다 8 ng/mL bFGF가 보충된 MEF로 컨디셔닝된 배지를 초기 플레이팅 및 증가를 위해 사용하였다. 제 2 실험에서, H9 세포주로부터의 hES 세포 클러스터를, 이전에 마이토마이신 C (Sigma Chemical Co)로 처리하여 불활성화된 마우스 배아 영양세포 (MEF) 층에서 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. MEF 단층의 hES 세포 배양 배지를, 최소 필수 아미노산 (Invitrogen), L-글루타민, 및 2-머캅토에탄올이 보충된 20% 녹아웃 혈청 리플레이서(Replacer) (Invitrogen)를 포함하는 DMEM:F12로 구성하였다. 각각의 웰의 쓰고 난 배양 배지를 흡인하여, 동일 체적의 새로운 배지로 교체함으로써 매일 공급을 행하였다. 분석을 개시하기 전에 플레이팅 후에 배양을 1일 내지 3일간 증가시켰다. 플레이트를 분석 지속 기간 동안 37℃, 5% CO2로 유지하였다.
화합물 및 분석 배지의 제조: 일차 스크리닝에서 얻어진 8개 히트의 서브세트를 추적 조사 및 후속 이차 분석에 사용하였다. 순수한 화합물을 DMSO 중의 10 mM 스톡으로서 가용화하여, 사용시까지 -20℃로 건조시켜 보관하였다. 분석 직전에, 화합물 스톡을 첨가제를 포함하는 기본 배지 중의 1μM 내지 5 μM의 범위의 최종 농도로 희석시켰다.
분석: 이러한 분석에서, 완성 내배엽 분화 단계의 1 및 2일째에만 Wnt3a 대신에 GSK3 저해제를 포함하였다. 각각의 웰의 세포 단층으로부터 배양 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 매트리젤™에서 배아 줄기 세포 배양을 상기 실시예 7 및 8에 기재된 바와 같이 개시하였다. 완성 내배엽으로의 분화를 위해, 0.5% FCS, 및 100 ng/ml 액티빈 A를 함유하고, Wnt3a를 함유하지 않는 상이한 농도의 저해제 화합물을 포함하는 DMEM:F12 배지를 포함하는 시험 체적 (24-웰 플레이트에 대해서는 0.5 ml/웰, 96-웰 플레이트에 대해서는 100 μl/웰)을 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물의 부재하에 0.5% FCS, 및 100 ng/ml 액티빈 A 및 20 ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A, Wnt3a, 또는 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 분석 웰을 흡인하여, 동일한 농도의 시험 화합물 또는 대조 용액을 다시 공급하였다. 3 및 4일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 시험 화합물 또는 Wnt3a의 부재하에 2% FCS 및 100 ng/ml 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12를 공급하였다. 3 및 4일째에, 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하였다. 췌장 내배엽으로의 분화를 위해, 세포를 3일간 처리하고, 0.25 μM KAAD 사이클로파민 (EMD Biosciences) 및 20 ng/ml FGF7 (R&D Biosystems)과 함께 2% FCS를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지를 매일 공급하였다. 이어서, 세포를 추가 4일간 처리하고, 1% B27 (Invitrogen), 0.25 μM KAAD 사이클로파민, 2 μM 레틴산 (RA; Sigma-Aldrich) 및 20 ng/ml FGF7을 함유하는 DMEM:F12를 매일 공급하였다. 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지 중에서 (단계 2) 또는 1% B27을 함유하는 DMEM:F12 기본 배지 (단계 3) 중에서 다른 첨가제 없이 계속 유지시켰다.
대응하는 H9 인간 배아 세포의 배양액을 MEF 영양세포층에서 성장시켜, 췌장 내배엽으로 분화시켰다. 1일 째에 혈청을 함유하지 않는 RPMI-1640 (Invitrogen)로 구성된 배지 중에서 세포를 배양하고, 2일 및 3일 째에 상이한 농도의 저해제 화합물 및 100 ng/ml 액티빈 A와 함께 0.2% FCS로 구성된 배지 중에서 세포를 배양하여 완성 내배엽 분화를 성취하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물의 부재하에 100 ng/ml 액티빈 A 및 20 ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)가 포함된 동일한 기본 배지 (혈청을 포함하거나 또는 포함하지 않음)를 함유하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A, Wnt3a, 또는 시험 화합물의 부재하에, 혈청 함유 또는 비함유의 동일한 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 분석 웰을 흡인하여, 동일한 농도의 시험 화합물 또는 대조 용액을 다시 공급하였다. 3일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 시험 화합물 또는 Wnt3a의 부재하에 2% FCS 및 100 ng/ml 액티빈 A가 보충된 RPMI-1640을 공급하였다. 3일째에, 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 RPMI-1640 기본 배지에서 유지하였다. 세포를 4일간 처리하고, 0.25 mM KAAD 사이클로파민 (EMD Biosciences) 및 50 ng/mL FGF10 (R&D Biosystems)과 함께 2% FCS를 함유하는 RPMI-1640 기본 배지를 매일 공급하여, 세포를 췌장 내배엽으로 분화하였다. 이어서, 세포를 3일 동안 처리하고, 1% B27 (Invitrogen), 0.25 mM KAAD 사이클로파민, 2 mM 레틴산 (RA; Sigma-Aldrich) 및 50 ng/ml FGF10을 함유하는 RPMI-1640를 매일 공급하였다. 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 함유하는 RPMI-1640 기본 배지 중에서 (단계 2) 또는 1% B27을 함유하는 RPMI-1640 기본 배지 (단계 3) 중에서 다른 첨가제 없이 계속 유지시켰다.
분석 평가: 분화 종료시에, 세포를 실시간 PCR에 의해 유전자 발현을 실시예 8에 기재된 바와 같이 조사하였다. 하이컨텐트 형광 염색을 위해, 96-웰 플레이트의 세포를 PBS로 2회 세정한 다음에, 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS로 3회를 초과하여 세정한 다음에, 실온에서 20분간 0.5% 트리톤 X-100으로 투과화하였다. 고정 및 투과화 후에, 세포를 다시 PBS로 3회 세정한 다음에, 실온에서 30분간 PBS 중에서 4% 닭 혈청 (Invitrogen)으로 블로킹하였다. 일차 항체 (염소 항-인간 Pdx1; Santa Cruz)를 4% 닭 혈청에서 1:100으로 희석하여, 실온에서 2시간 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 PBS로 3회 세정한 후에, 알렉사 플루오르 488 콘쥬케이션 이차 항체 (닭 항-염소 IgG; Molecular Probes)를 PBS 중에 1:200으로 희석하여, 각각의 웰에 첨가하였다. 핵을 대비염색하기 위해, 2μg/ml 훽스트 33342 (Invitrogen)를 실온에서 10분간 첨가하였다. 세포를 PBS로 1회 세정하고, 이미지화를 위해 100 μl/웰에 정치시켰다.
훽스트 33342 및 알렉사 플루오르 488을 사용해 염색된 세포에 대한 51008bs 이염색단을 이용하는 IN 세포 분석기 1000 (GE Healthcare)을 사용해 세포를 이미지화하였다. 노출 시간은 양성 대조군 웰 및 이차 항체 단독으로 염색된 웰을 사용하여 최적화하였다. 처리 및 염색 절차시에 임의의 세포 손실을 보상하기 위해 15개의 필드/웰의 이미지를 획득하였다. 각각의 웰에 대하여 전체 세포수 및 전체 Pdx1 강도의 측정값을 IN 셀 디벨로퍼 툴박스 1.7 (GE Healthcare) 소프트웨어를 이용하여 얻었다. 회색조 수준 (베이스라인 범위 100 내지 300) 및 핵 사이즈에 기초하여, 핵분열을 측정하였다. 각각의 복제 데이터 세트에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 Pdx1 단백질 발현을 세포 × 세포 면적의 전체 형광성으로서 정의되는 전체 강도 또는 집적 강도로서 기록하였다. 배경은 300 내지 3000의 회색조 범위의 허용 기준을 바탕으로 제거하였다. 각 웰에 대한 총 강도를 Wnt3a/액티빈 A 양성 대조군에 대한 평균 총 강도로 나누어서, 총 강도 데이터를 정규화하였다. 각각의 복제 세트에 대한 평균 및 표준 편차에 대하여 정규화 데이터를 계산하였다.
정량적 PCR용 세포를 RLT 완충액 (Qiagen)에 용해시킨 다음에, RNA 추출, 정제, 및 cDNA 합성으로 처리하였다. 에탄올 함유, 고염 완충액의 존재하에서 실리카 겔 막 (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA)에 결합시킨 후 세정하여 오염물질을 제거함으로써 RNA 샘플을 정제하였다. 터보 DNA 비함유 키트 (Ambion, Inc.)를 이용하여 RNA를 추가로 정제하고, 이어서 고 품질 RNA를 물에 용출시켰다. 수율과 순도를 분광광도계의 A260 및 A280 리딩에 의해 평가하였다. cDNA 카피는 Applied Biosystems, Inc. (ABI, CA)의 고용량 cDNA 아카이브 키트를 이용하여 정제 RNA로부터 제조하였다.
달리 지정하지 않는 한, 실시간 PCR 증폭 및 정량을 위한 모든 시약을 ABI로부터 구입하였다. 실시간 PCR 반응을 ABI 프리즘 7900 시퀀스 디텍션 시스템을 이용하여 행하였다. 택맨 유니버설 PCR 마스터 믹스는 20 μL의 총 반응 체적 내 20 ng의 역전사된 RNA와 함께 사용하였다. 각각의 cDNA 샘플을 두벌씩 실행하여 피펫팅 오류에 대해 보정하였다. 프라이머 및 FAM 표지 택맨 프로브를 200 nM의 농도로 사용하였다. 각 표적 유전자의 발현 수준은 ABI에 의해 이전에 개발된 인간 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나아제 (GAPDH) 내인성 대조군을 이용하여 정규화하였다. 프라이머 및 프로브 세트는 하기에 열거되어 있다: PDX1 (Hs00236830_m1), GAPDH (4310884E), 및 HNF6 (Hs00413554_m1).
50℃에서 2분 동안, 이어서 95℃에서 10분 동안 초기 인큐베이션한 후, 샘플을 2단계, 95℃에서 15초 동안의 변성 단계, 이어서, 60℃에서 1분 동안의 어닐링/연장 단계에서 40회 순환시켰다. 데이터 분석은 진엠포(
Figure pct00032
)7000 시퀀스 디텍션 시스템 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 각각의 프라이머/프로브 세트에 대하여, 형광 강도가 증폭의 지수 영역의 중간의 특정 값에 도달하는 사이클 수로서 Ct 값을 결정하였다.상대적인 유전자 발현 수준을 비교 Ct 방법을 이용하여 계산하였다. 간략하게는, 각각의 cDNA 표본에 대해, 내인성 대조군 Ct 값을 흥미있는 Ct의 유전자에서 제하여, 델타 Ct값 (ΔCt)을 수득하였다 표적의 정규화된 양은 2-ΔCt로서 계산하였고, 이는 증폭이 100% 효율인 것으로 가정하였다. 최종 데이터를 보정 샘플에 대하여 나타내었다.
결과
결과는 8개의 GSK-3β 효소 저해제에 대해서 나타낸다. 하이컨텐트 분석으로부터의 도 11에 나타낸 데이터는 각각의 데이터 점을 이중 샘플 세트로부터 평균하고, 동일한 필드 및 웰로부터의 각각의 파라미터에 대하여 측정된 H1 hES 세포주에 대한 세포수 (패널 A) 및 Pdx1 강도 (패널 B)에 대한 효과를 나타낸다. 실시간 PCR로부터의 도 12에 나타낸 데이터는 2개의 전사 인자, Pdx1 및 HNF6의 유도 발현에 대한 이들 소분자 저해제의 효과를 나타낸다. 이들 실시예에서, Pdx1 및 HNF6 발현은 췌장 내배엽 분화를 나타낸다. 이들 분석에서 GSK3b 저해제 화합물은 세포 계통 결정의 초기 단계 시에 Wnt3a 대신에 사용되어; 세포가 분화의 후속 순차적 단계 시에 췌장 내배엽을 형성하는 능력을 유지하게 할 수 있다.
실시예 10
췌장 내분비 세포의 형성에 대한 GSK-3β 효소 저해제의 효과
완성 내배엽 유도 시에 GSK3 저해제로 처리하면, 다른 세포형, 예를 들어 췌장 내분비 세포 또는 인슐린 생성 세포의 후속 분화를 저지하지 않는 것을 증명하는 것이 중요하였다. 히트의 선택적 서브세트에 대하여, 췌장 호르몬의 발현을 촉진시키는 이들의 능력을 시험하였다.
분석용 세포 제조: 실시예 9에 기재된 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 세포 (96-웰 플레이트 및 24-웰 플레이트에서 배양됨)를, 계속해서 세포를 췌장 호르몬 발현 세포로 분화시키는 작용제에 노출시켰다.
각각의 웰의 세포 단층으로부터 배양 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 매트리젤™에서 H1 인간 배아 줄기 세포주의 배양액 분석을 상기 실시예 7 내지 9에 기재된 바와 같이 개시하였다. 완성 내배엽으로의 분화를 위해, 0.5% FCS, 및 100 ng/ml 액티빈 A를 함유하고, Wnt3a를 함유하지 않는 상이한 농도의 저해제 화합물을 포함하는 배지를 포함하는 시험 체적 (24-웰 플레이트에 대해서는 0.5 ml/웰, 96-웰 플레이트에 대해서는 100 μl/웰)을 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS, 및 100 ng/ml 액티빈 A 및 20 ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A, Wnt3a, 또는 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 분석 웰을 흡인하여, 동일한 농도의 시험 화합물 또는 대조 용액을 다시 공급하였다. 3, 4 및 5일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 시험 화합물 또는 Wnt3a의 부재하에 2% FCS 및 100 ng/ml 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12를 공급하였다. 3, 4, 및 5일째에, 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하였다. 췌장 내배엽으로의 분화를 위해, 세포를 3일간 처리하고, 0.25 μM KAAD 사이클로파민 (EMD Biosciences) 및 20 ng/ml FGF7 (R&D Biosystems)과 함께 2% FCS를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지를 매일 공급하였다. 이어서, 1% B27 (Invitrogen), 0.25 μM KAAD 사이클로파민, 2 μM 레틴산 (RA; Sigma-Aldrich) 및 20 ng/ml FGF7을 함유하는 DMEM:F12를 매일 공급하면서, 세포를 4일간 처리하였다. 2 단계 및 3단계 동안 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지 또는 1% B27을 함유하는 DMEM:F12 기본 배지 중에서 다른 첨가제 없이 계속 유지시켰다. 췌장 내배엽의 형성 후에, 세포를 추가로 6일간의 지속 기간 동안 처리하고, 1 μM DAPT (감마 세크리타아제 저해제: EMD Biosciences) 및 50 ng/ml 엑센딘 4 (Sigma-Aldrich)와 함께 1% B27을 함유하는 DMEM:F12 기본 배지를 매일 공급하였다. 그 다음에, 세포를 추가로 3일간의 지속 기간 동안 처리하고, 1% B27, 50 ng/mL 엑센딘 4, 50 ng/mL IGF (R&D Biosystems) 및 50 ng/mL HGF (R&D Biosystems)를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지를 매일 공급하였다. 대응하는 음성 대조군 웰을 1% B27을 함유하고 임의의 다른 첨가제를 함유하지 않는 DMEM:F12 기본 배지를 통해 유지하였다.
분석 평가: 배양 종료시에, 세포를 하이컨텐트 분석 또는 실시간 PCR에 의해 상기 실시예 7 및 8에서와 같이 처리하였다.
하이컨텐트 형광 염색을 위해, 96-웰 플레이트의 세포를 PBS로 2회 세정한 다음에, 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS로 3회를 초과하여 세정한 다음에, 실온에서 20분간 0.5% 트리톤 X-100으로 투과화하였다. 고정 및 투과화 후에, 세포를 다시 PBS로 3회 세정한 다음에, 실온에서 30분간 PBS 중에서 4% 닭 혈청 (Invitrogen)으로 블로킹하였다. 일차 항체 (기니피그 항-돼지 인슐린(guinea pig anti-swine insulin), 인간 인슐린과 교차 반응성임; DakoCytomation)를 4% 염소 혈청 중에서 1:500으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 PBS로 3회 세정한 후, 4% 염소 혈청 중에 1:100으로 희석시킨 알렉사 플루오르 488 콘쥬게이션 이차 항체 (염소 항-기니피그 IgG; Molecular Probes)로 염색하였다. 핵을 대비염색하기 위해, 2 μg/ml 훽스트 33342 (Invitrogen)를 실온에서 10분간 첨가하였다. 세포를 PBS로 1회 세정하고, 이미지화를 위해 100 μl/웰에 정치시켰다.
훽스트 33342 및 알렉사 플루오르 488을 사용해 염색된 세포에 대한 51008bs 이염색단을 이용하는 IN 세포 분석기 1000 (GE Healthcare)을 사용해 세포를 이미지화하였다. 노출 시간은 양성 대조군 웰 및 이차 항체 단독으로 염색된 웰을 사용하여 최적화하였다. 처리 및 염색 절차시에 임의의 세포 손실을 보상하기 위해 15개의 필드/웰의 이미지를 획득하였다. 각각의 웰에 대하여 전체 세포수 및 전체 인슐린 강도의 측정값을 IN 셀 디벨로퍼 툴박스 1.7 (GE Healthcare) 소프트웨어를 이용하여 얻었다. 회색조 수준 (베이스라인 범위 100 내지 300) 및 핵 사이즈에 기초하여, 핵분열을 측정하였다. 각각의 복제 데이터 세트에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 인슐린 단백질 발현을 세포 × 세포 면적의 전체 형광성으로서 정의되는 전체 강도 또는 집적 강도로서 기록하였다. 배경은 300 내지 3000의 회색조 범위의 허용 기준을 바탕으로 제거하였다. 각 웰에 대한 총 강도를 Wnt3a/액티빈 A 양성 대조군에 대한 평균 총 강도로 나누어서, 총 강도 데이터를 정규화하였다. 각각의 삼중 세트에 대한 평균 및 표준 편차에 대하여 정규화 데이터를 계산하였다.
정량적 PCR용 세포를 RLT 완충액 (Qiagen)에 용해시킨 다음에, RNA 추출, 정제, 및 cDNA 합성으로 처리하였다. 에탄올 함유, 고염 완충액의 존재하에서 실리카 겔 막 (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA)에 결합시킨 후 세정하여 오염물질을 제거함으로써 RNA 샘플을 정제하였다. 터보 DNA 비함유 키트 (Ambion, INC)를 이용하여 RNA를 추가로 정제하고, 이어서 고 품질 RNA를 물에 용출시켰다. 수율과 순도를 분광광도계의 A260 및 A280 리딩에 의해 평가하였다. cDNA 카피는 Applied Biosystems, Inc. (ABI, CA)의 고용량 cDNA 아카이브 키트를 이용하여 정제 RNA로부터 제조하였다.
달리 지정하지 않는 한, 실시간 PCR 증폭 및 정량을 위한 모든 시약을 ABI로부터 구입하였다. 실시간 PCR 반응을 ABI 프리즘®7900 시퀀스 디텍션 시스템을 이용하여 행하였다. 택맨® 유니버설 PCR 마스터 믹스® (ABI, CA)는 20 μL의 총 반응 체적μl 내 20 ng의 역전사 RNA와 함께 사용하였다. 각각의 cDNA 샘플을 두벌씩 실행하여 피펫팅 오류에 대해 보정하였다. 프라이머 및 FAM 표지 택맨®프로브는 200 nM의 농도로 사용하였다. 각 표적 유전자의 발현 수준은 ABI에 의해 이전에 개발된 인간 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나아제 (GAPDH) 내인성 대조군을 이용하여 정규화하였다. 프라이머 및 프로브 세트는 하기에 열거되어 있다: PDX1 (Hs00236830_m1), 인슐린 (Hs00355773), 및 GAPDH (4310884E).
50℃에서 2분 동안, 이어서 95℃에서 10분 동안 초기 인큐베이션한 후, 샘플을 2단계, 95℃에서 15초 동안의 변성 단계, 이어서, 60℃에서 1분 동안의 어닐링/연장 단계에서 40회 순환시켰다. 데이터 분석은 진앰프®7000 시퀀스 디텍션 시스템 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 각각의 프라이머/프로브 세트에 대하여, 형광 강도가 증폭의 지수 영역의 중간의 특정 값에 도달하는 사이클 수로서 Ct 값을 결정하였다. 상대적인 유전자 발현 수준을 비교 Ct 방법을 이용하여 계산하였다. 간략하게는, 각각의 cDNA 표본에 대해, 내인성 대조군 Ct값을 흥미있는 Ct의 유전자에서 제하여, 델타 Ct 값 (ΔCt)을 수득하였다. 표적의 정규화된 양은 2-ΔCt로서 계산되었고, 이는 증폭이 100% 효율인 것으로 가정하였다. 최종 데이터를 보정 샘플에 대하여 나타내었다.
결과
결과는 8개의 GSK-3B 효소 저해제에 대하여 나타낸다. 하이컨텐트 분석으로부터의 도 13에 나타낸 데이터는 각각의 데이터 점을 삼중 세트로부터 평균하고, 동일한 필드 및 웰로부터의 각각의 파라미터에 대하여 측정된 H1 hES 세포주에 대한 세포수 (패널 A) 및 인슐린 강도 (패널 B)에 대한 화합물 효과를 나타낸다. 실시간 PCR로부터의 도 14에 나타낸 데이터는 Pdx1 및 인슐린에 대한 화합물 효과를 나타낸다. 이들 실시예에서, Pdx1 및 인슐린 발현은 췌장 내배엽 분화 및 호르몬 양성 세포의 생성을 나타낸다. 인슐린 면역 염색 및 실시간 PCR로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 이들 분석에 있어서의 선택적 GSK3b 저해제 화합물은 세포 계통 결정의 초기 단계 시에 Wnt3a 대신에 사용될 수 있으며, 분화의 후속 순차적 단계 시에 췌장 베타 세포 형성을 유도하여 유지할 수 있다.
실시예 11
췌장 내분비 세포의 형성에 대한 GSK-3β 효소 저해제의 상가 효과(additive effect)
GSK3β 저해제로 처리하면, 다수의 세포 운명 결정 단계시에 첨가되는 경우, 췌장 베타 세포 분화를 향상시킬 수 있음을 증명하는 것이 중요하였다. 히트의 선택적 서브세트를 췌장 호르몬 양성 세포와 관련된 인슐린 발현을 향상시키도록 순차적 시한 첨가(sequential timed addition)에 의해 시험하였다.
분석용 세포의 제조: 분석용 세포 제조: 실시예 9 및 10에 기재된 방법에 따라 얻어진 췌장 내배엽 세포 (96-웰 플레이트 상에서 배양됨)를, 계속해서 세포를 췌장 호르몬 발현 세포로 분화시키는 작용제에 노출시켰다.
각각의 웰의 세포 단층으로부터 배양 배지를 흡인한 다음에, PBS로 3회 세정하여, 잔류 성장 인자 및 혈청을 제거함으로써, 매트리젤™에서 H1 인간 배아 줄기 세포주의 배양액 분석을 상기 실시예 7 내지 9에 기재된 바와 같이 개시하였다. 완성 내배엽으로의 분화를 위해, 0.5% FCS, 및 100 ng/ml 액티빈 A를 함유하고, Wnt3a를 함유하지 않는 상이한 농도의 저해제 화합물을 포함하는 배지를 포함하는 시험 체적 (96-웰 플레이트에 대해서는 100 μl/웰)을 첨가하였다. 양성 대조군 웰은 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS, 및 100 ng/ml 액티빈 A 및 20 ng/mL Wnt3a (R&D Biosystems)를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 음성 대조군 웰은 액티빈 A, Wnt3a, 또는 시험 화합물의 부재하에, 0.5% FCS를 함유하는 동일한 기본 배지를 포함하였다. 분석 2일째에, 분석 웰을 흡인하여, 동일한 농도의 시험 화합물 또는 대조 용액을 다시 공급하였다. 3, 4 및 5일째에, 모든 분석 웰을 흡인하여, 시험 화합물 또는 Wnt3a의 부재하에 2% FCS 및 100 ng/ml 액티빈 A가 보충된 DMEM:F12를 공급하였다. 3, 4, 및 5일째에, 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 포함하는 DMEM:F12 기본 배지에서 유지하였다. 췌장 내배엽으로의 분화를 위해, 세포를 3일간 처리하고, 0.25 μM KAAD 사이클로파민 (EMD Biosciences) 및 20 ng/ml FGF7 (R&D Biosystems)과 함께 2% FCS를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지를 매일 공급하였다. 이어서, 세포를 4일간 처리하고, 1% B27 (Invitrogen), 0.25 μM KAAD 사이클로파민, 2 μM 레틴산 (RA; Sigma-Aldrich) 및 20 ng/ml FGF7을 함유하는 DMEM:F12를 매일 공급하였다. 대응하는 음성 대조군 웰을 2% FCS를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지 중에서 또는 1% B27을 함유하는 DMEM:F12 기본 배지 중에서 다른 첨가제 없이 계속 유지시켰다. 췌장 내배엽의 형성 후에, 세포를 추가로 6일간의 지속 기간 동안 처리하고, 1 μM DAPT (감마 세크리타아제 저해제: EMD Biosciences) 및 50 ng/ml 엑센딘 4 (Sigma-Aldrich)와 함께 1% B27을 함유하는 DMEM:F12 기본 배지 및 1 μM TGF베타 R1 저해제 II (ALK5 저해제; EMD Biosciences)를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지를 번갈아서 매일 공급하였다. 이러한 6일 기간 동안, 분화의 초기에서 이전의 처리와 동일한 농도를 사용하여 GSK3β 저해제를 각각의 웰에 다시 첨가하였다. 이어서, 세포를 추가로 3일 동안 처리하였고, 1% B27, 50 ng/ml 엑센딘 4, 50 ng/ml IGF (R&D Biosystems) 및 50 ng/ml HGF (R&D Biosystems)를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지 및 1 μM TGF베타 R1 저해제 II (ALK5 저해제; EMD Biosciences)를 함유하는 DMEM:F12 기본 배지를 번갈아서 매일 공급하였다. 이러한 3일 기간 동안, 분화의 초기에서 이전의 처리와 동일한 농도를 사용하여 GSK3β 저해제를 각각의 웰에 다시 첨가하였다. 양성 대조군 웰의 대응하는 세트를 20 ng/mL Wnt3a의 존재하에서 또는 부재하에서 처리하였다. 대응하는 음성 대조군 웰을 1% B27을 함유하고 임의의 다른 첨가제를 함유하지 않는 DMEM:F12 기본 배지를 통해 유지하였다.
분석 평가: 배양 종료시에, 세포를 하이컨텐트 분석에 의해 평가하기 위해 상기 실시예 10에서와 같이 처리하였다.
하이컨텐트 형광 염색을 위해, 96-웰 플레이트의 세포를 PBS로 2회 세정한 다음에, 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS로 3회를 초과하여 세정한 다음에, 실온에서 20분간 0.5% 트리톤 X-100으로 투과화하였다. 고정 및 투과화 후에, 세포를 다시 PBS로 3회 세정한 다음에, 실온에서 30분간 PBS 중에서 4% 닭 혈청 (Invitrogen)으로 블로킹하였다. 일차 항체 (기니피그 항-돼지 인슐린, 인간 인슐린과 교차 반응성임; DakoCytomation)를 4% 염소 혈청 중에서 1:500으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 세포에 첨가하였다. 세포를 PBS로 3회 세정한 후, 4% 염소 혈청 중에 1:100로 희석시킨 알렉사 플루오르 488 콘쥬게이션 이차 항체 (염소 항-기니피그 IgG; Molecular Probes)로 염색하였다. 핵을 대비염색하기 위해, 2μg/ml 훽스트 33342 (Invitrogen)를 실온에서 10분간 첨가하였다. 세포를 PBS로 1회 세정하고, 이미지화를 위해 100 μl/웰에 정치시켰다.
훽스트 33342 및 알렉사 플루오르 488을 사용해 염색된 세포에 대한 51008bs 이염색단을 이용하는 IN 세포 분석기 1000 (GE Healthcare)을 사용해 세포를 이미지화하였다. 노출 시간은 양성 대조군 웰 및 이차 항체 단독으로 염색된 웰을 사용하여 최적화하였다. 처리 및 염색 절차시에 임의의 세포 손실을 보상하기 위해 15개의 필드/웰의 이미지를 획득하였다. 각각의 웰에 대하여 전체 세포수 및 전체 인슐린 강도의 측정값을 IN 셀 디벨로퍼 툴박스 1.7 (GE Healthcare) 소프트웨어를 이용하여 얻었다. 회색조 수준 (베이스라인 범위 100 내지 300) 및 핵 사이즈에 기초하여, 핵분열을 측정하였다. 각각의 복제 데이터 세트에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 인슐린 단백질 발현을 세포 × 세포 면적의 전체 형광성으로서 정의되는 전체 강도 또는 집적 강도로서 기록하였다. 배경은 300 내지 3000의 회색조 범위의 허용 기준을 바탕으로 제거하였다. 각 웰에 대한 총 강도를 Wnt3a/액티빈 A 양성 대조군에 대한 평균 총 강도로 나누어서, 총 강도 데이터를 정규화하였다. 각각의 삼중 세트에 대한 평균 및 표준 편차에 대하여 정규화 데이터를 계산하였다.
결과
결과는 8개의 GSK-3B 효소 저해제에 대하여 나타낸다. 하이컨텐트 분석으로부터의 도 15에 나타낸 데이터는 각각의 데이터 점을 삼중 세트로부터 평균하고, 동일한 필드 및 웰로부터의 각각의 파라미터에 대하여 측정된 H1 hES 세포주에 대한 세포수 (패널 A) 및 인슐린 강도 (패널 B)에 대한 화합물 효과를 나타낸다. 본 실시예에서, 인슐린 발현은 호르몬 양성 췌장 세포로의 분화를 나타낸다. 이들 분석에 있어서의 선택적 GSK3β 저해제 화합물은 세포 계통 결정의 초기 단계 시에 Wnt3a 대신에 사용될 수 있으며, 분화의 후속 단계 시에 첨가되는 경우, 양성 대조군 샘플에 대한 인슐린 발현 증가를 촉진시키는 것으로 보인다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 다양한 본 발명의 측면이 실시예 및 바람직한 실시 형태를 참조하여 상기에서 예시되었지만, 본 발명의 범위가 상술한 설명에 의해 한정되지 않으나, 특허법의 원칙하에 적절히 추론된 하기의 특허청구범위에 의해 한정되는 것을 인지할 것이다.
[표 IA]
Figure pct00033
[표 IB]
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[표 II]
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[표 III]
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[표 IV]
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[표 V]
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[표 VI]
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[표 VII]
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[표 VIII]
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[표 IX]
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[표 X]
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[표 XI]
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[표 XII]
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Figure pct00072
[표 XIII]
Figure pct00073

Claims (126)

  1. a. 다능성 세포(pluripotent cell)를 배양하는 단계, 및
    b. 다능성 세포를 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리하는 단계
    를 포함하는 다능성 세포의 증가 및 분화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 다능성 세포는 배아 줄기 세포인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 다능성 세포는 배아 줄기 세포로부터 유래된 다능성 마커를 발현하는 세포인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 다능성 마커를 발현하는 세포는 ABCG2, 크립토(cripto), FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, 및 Tra1-81로 구성된 군으로부터 선택된 다능성 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 다능성 세포는 완성 내배엽 계통(definitive endoderm lineage)의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 다능성 세포는 약 1 내지 약 72 시간 동안 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 다능성 세포는 약 12 내지 약 48 시간 동안 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 다능성 세포는 약 48 시간 동안 GSK-3B 효소 활성 저해제로 처리되는 방법.
  9. 제1항에 있어서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 약 100 nM 내지 약 100 μM의 농도로 사용되는 방법.
  10. 제1항에 있어서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 약 1 μM 내지 약 10 μM의 농도로 사용되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 약 10 μM의 농도로 사용되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (I)의 화합물인 방법.
    Figure pct00074
  13. 제12항에 있어서, R1은 페닐, 페닐 치환기가 C1-5알킬, 할로겐, 니트로, 트라이플루오로메틸 및 니트릴로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페닐, 또는 피리미디닐인 방법.
  14. 제12항에 있어서, R2는 페닐, 페닐 치환기가 C1-5알킬, 할로겐, 니트로, 트라이플루오로메틸 및 니트릴로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페닐, 또는 임의로 C1-4알킬 치환된 피리미디닐이며, R1 및 R2 중 적어도 하나는 피리미디닐인 방법.
  15. 제12항에 있어서, R3은 수소, 2-(트라이메틸실릴)에톡시메틸, C1-5알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 아릴C1-5알킬옥시카르보닐, 아릴C1-5알킬, 하나 이상의 아릴 치환기가 C1-5알킬, C1-5알콕시, 할로겐, 아미노, C1-5알킬아미노, 및 다이C1-5알킬아미노로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환된 아릴C1-5알킬, 프탈이미도C1-5알킬, 아미노C1-5알킬, 다이아미노C1-5알킬, 석신이미도C1-5알킬, C1-5알킬카르보닐, 아릴카르보닐, C1-5알킬카르보닐C1-5알킬 및 아릴옥시카르보닐C1-5알킬인 방법.
  16. 제12항에 있어서, R4는 -(A)-(CH2)q-X인 방법.
  17. 제16항에 있어서, A는 비닐렌, 에티닐렌 또는
    Figure pct00075
    인 방법.
  18. 제17항에 있어서, R5는 수소, C1-5알킬, 페닐 및 페닐C1-5알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  19. 제16항에 있어서, q는 0 내지 9인 방법.
  20. 제16항에 있어서, X는 수소, 하이드록시, 비닐, 하나 이상의 비닐 치환기가 각각 불소, 브롬, 염소 및 요오드로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 비닐, 에티닐, 에티닐 치환기가 불소, 브롬, 염소 및 요오드로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 에티닐, C1-5알킬, 하나 이상의 알킬 치환기가 각각 C 1-5알콕시, 트라이할로알킬, 프탈이미도 및 아미노로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 C1-5알킬, C3-7사이클로알킬, C1-5알콕시, 알킬 치환기가 프탈이미도 및 아미노로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 C1-5알콕시, 프탈이미도옥시, 페녹시, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1-5알킬, 할로겐 및 C1-5알콕시로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페녹시, 페닐, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1-5알킬, 할로겐 및 C1-5알콕시로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페닐, 아릴C1-5알킬, 하나 이상의 아릴 치환기가 각각 C1-5알킬, 할로겐 및 C1-5알콕시로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 아릴C1-5알킬, 아릴옥시C1-5알킬아미노, C1-5알킬아미노, 다이C1-5알킬아미노, 니트릴, 옥심, 벤질옥시이미노, C1-5알킬옥시이미노, 프탈이미도, 석신이미도, C1-5알킬카르보닐옥시, 페닐카르보닐옥시, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1-5알킬, 할로겐 및 C1-5알콕시로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페닐카르보닐옥시, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1-5알킬, 할로겐 및 C1-5알콕시로 구성된 군으로부터 선택되는 페닐C1-5알킬카르보닐옥시, 아미노카르보닐옥시, C1-5알킬아미노카르보닐옥시, 다이C1-5알킬아미노카르보닐옥시, C1-5알콕시카르보닐옥시, 하나 이상의 알킬 치환기가 각각 메틸, 에틸, 아이소프로필 및 헥실로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 C1-5알콕시카르보닐옥시, 페녹시카르보닐옥시, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 C1-5알킬, C1-5알콕시 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페녹시카르보닐옥시, C1-5알킬티오, 알킬 치환기가 하이드록시 및 프탈이미도로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 C1-5알킬티오, C1-5알킬설포닐, 페닐설포닐, 하나 이상의 페닐 치환기가 각각 브롬, 불소, 클로라이드, C1-5알콕시 및 트라이플루오로메틸로 구성된 군으로부터 선택되는 치환된 페닐설포닐로 구성된 군으로부터 선택되되, 단, A가
    Figure pct00076
    이고, q가 0이고, X가 H이면, R3은 2-(트라이메틸실릴)에톡시메틸일 수 없고; 그의 약학적으로 허용가능한 염인 방법.
  21. 제12항에 있어서, R1은 치환된 페닐이고, R2는 피리미딘-3-일인 방법.
  22. 제12항에 있어서, R1은 4-플루오로페닐인 방법.
  23. 제12항에 있어서, R3은 수소, 아릴C1-5알킬, 또는 치환된 아릴C1-5알킬인 방법.
  24. 제12항에 있어서, R3은 수소 또는 페닐C1-5알킬인 방법.
  25. 제16항에 있어서, A는 에티닐렌이고, q는 0 내지 5인 방법.
  26. 제16항에 있어서, X는 석신이미도, 하이드록시, 메틸, 페닐, C1-5알킬설포닐, C3-6사이클로알킬, C1-5알킬카르보닐옥시, C1-5알콕시, 페닐카르보닐옥시, C1-5알킬아미노, 다이C1-5알킬아미노 또는 니트릴인 방법.
  27. 제12항에 있어서, 화학식 I의 화합물은 4-(4-플루오로페닐)-2-(4-하이드록시부틴-1-일)-1-(3-페닐프로필)-5-(4-피리딜)이미다졸인 방법.
  28. 제1항에 있어서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (II)의 화합물인 방법.
    Figure pct00077
  29. 제28항에 있어서, R은 Ra, -C1-8알킬-Ra, -C2-8알케닐-Ra, -C2-8알키닐-Ra 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  30. 제29항에 있어서, Ra는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  31. 제28항에 있어서, R1은 수소, -C1-8알킬-R5, -C2-8알케닐-R5, -C2-8알키닐-R5, -C(O)-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-O-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -C(O)-NH(C1-8알킬-R9), -C(O)-NH(아릴-R8), -C(O)-N(C1-8알킬-R9)2, -SO2-(C1-8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -사이클로알킬-R6, -헤테로사이클릴-R6, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 선택되며; 여기서, 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴은 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 고리 탄소 원자를 통해 하나의 위치에서 아자인돌 질소 원자에 부착되는 방법.
  32. 제31항에 있어서, R5는 수소, -O-(C1-8)알킬, -O-(C1-8)알킬-OH, -O-(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬, -O-(C1-8)알킬-NH2, -O-(C1-8)알킬-NH(C1-8알킬), -O-(C1-8)알킬-N(C1-8알킬)2, -O-(C1-8)알킬-S-(C1-8)알킬, -O-(C1-8)알킬-SO2-(C1-8)알킬, -O-(C1-8)알킬-SO2-NH2, -O-(C1-8)알킬-SO2-NH(C1-8알킬), -O-(C1-8)알킬-SO2-N(C1-8알킬)2, -O-C(O)H, -O-C(O)-(C1-8)알킬, -O-C(O)-NH2, -O-C(O)-NH(C1-8알킬), -O-C(O)-N(C1-8알킬)2, -O-(C1-8)알킬-C(O)H, -O-(C1-8)알킬-C(O)-(C1-8)알킬, -O-(C1-8)알킬-CO2H, -O-(C1-8)알킬-C(O)-O-(C1-8)알킬, -O-(C1-8)알킬-C(O)-NH2, -O-(C1-8)알킬-C(O)-NH(C1-8알킬), -O-(C1-8)알킬-C(O)-N(C1-8알킬)2, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)알킬, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)알킬, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬), -C(O)-N(C1-8알킬)2, -SH, -S-(C1-8)알킬, -S-(C1-8)알킬-S-(C1-8)알킬, -S-(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬, -S-(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬-OH, -S-(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬-NH2, -S-(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬-NH(C1-8알킬), -S-(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬-N(C1-8알킬)2, -S-(C1-8)알킬-NH(C1-8알킬), -SO2-(C1-8)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-8알킬), -SO2-N(C1-8알킬)2, -N-R7, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로, 옥소, -사이클로알킬-R6, -헤테로사이클릴-R6, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 방법.
  33. 제31항에 있어서, R6은 수소, -C1-8알킬, -C2-8알케닐, -C2-8알키닐, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)알킬, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)알킬, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬), -C(O)-N(C1-8)알킬)2, -SO2-(C1-8)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-8알킬), -SO2-N(C1-8알킬)2, -(C1-8)알킬-N-R7, -(C1-8)알킬-(할로)1-3, -(C1-8)알킬-OH, -아릴-R8, -(C1-8)알킬-아릴-R8 및 -(C1-8)알킬-헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기이되; 단, R6이 탄소 원자에 부착된 경우, R6은 -C1-8알콕시, -(C1-8)알콕시-(할로)1-3, -SH, -S-(C1-8)알킬, -N-R7, 시아노, 할로, 하이드록시, 니트로, 옥소 및 -헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 추가로 선택되는 방법.
  34. 제33항에 있어서, R7은 수소, -C1-8알킬, -C2-8알케닐, -C2-8알키닐, -(C1-8)알킬-OH, -(C1-8)알킬-O-(C1-8)알킬, -(C1-8)알킬-NH2, -(C1-8)알킬-NH(C1-8알킬), -(C1-8)알킬-N(C1-8알킬)2, -(C1-8)알킬-S-(C1-8)알킬, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)알킬, -C(O)-O-(C1-8)알킬, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬), -C(O)-N(C1-8알킬)2, -SO2-(C1-8)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-8알킬), -SO2-N(C1-8알킬)2, -C(N)-NH2, -사이클로알킬-R8, -(C1-8)알킬-헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8, -(C1-8)알킬-아릴-R8 및 -(C1-8)알킬-헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 2개의 치환기인 방법.
  35. 제31항에 있어서, R8은 수소, -C1-8알킬, -(C1-8)알킬-(할로)1-3 및 -(C1-8)알킬-OH로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기이되; 단, R8이 탄소 원자에 부착된 경우, R8은 -C1-8알콕시, -NH2, -NH(C1-8알킬), -N(C1-8알킬)2, 시아노, 할로, -(C1-8)알콕시-(할로)1-3, 하이드록시 및 니트로로 구성된 군으로부터 추가로 선택되는 방법.
  36. 제31항에 있어서, R9는 수소, -C1-8알콕시, -NH2, -NH(C1-8알킬), -N(C1-8알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시 및 니트로로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 방법.
  37. 제28항에 있어서, R2는 수소, -C1-8알킬-R5, -C2-8알케닐-R5, -C2-8알키닐-R5, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬-R9), -C(O)-N(C1-8알킬-R9)2, -C(O)-NH(아릴-R8), -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SO2-(C1-8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -사이클로알킬-R6, -아릴-R6 및 -(C1-8)알킬-N-R7로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개의 치환기이되; 단, R2가 탄소 원자에 부착된 경우, R2는 -C1-8알콕시-R5, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, 옥소, -헤테로사이클릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 추가로 선택되는 방법.
  38. 제28항에 있어서, R3은 수소, -C1-8알킬-R10, -C2-8알케닐-R10, -C2-8알키닐-R10, -C1-8알콕시-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬-R9), -C(O)-N(C1-8알킬-R9)2, -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SO2-(C1-8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬-R8, -헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8 및 -헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 3개의 치환기인 방법.
  39. 제38항에 있어서, R10은 수소, -NH2, -NH(C1-8알킬), -N(C1-8알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로 및 옥소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 방법.
  40. 제28항에 있어서, R4는 수소, -C1-8알킬-R10, -C2-8알케닐-R10, -C2-8알키닐-R10, -C1-8알콕시-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8알킬-R9), -C(O)-N(C1-8알킬-R9)2, -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SH, -S-(C1-8)알킬-R10, -SO2-(C1-8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-8알킬-R9), -SO2-N(C1-8알킬-R9)2, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬-R8, -헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8 및 -헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기인 방법.
  41. 제40항에 있어서, R10은 수소, -NH2, -NH(C1-8알킬), -N(C1-8알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로 및 옥소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 방법.
  42. 제28항에 있어서, Y 및 Z는 O, S, (H,OH) 및 (H,H)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되되; 단, Y 및 Z 중 하나는 O이고, 나머지는 O, S, (H,OH) 및 (H,H)로 구성된 군으로부터 선택되고; 그의 약학적으로 허용가능한 염인 방법.
  43. 제28항에 있어서, R은 Ra, -C1-4알킬-Ra, -C2-4알케닐-Ra, -C2-4알키닐-Ra 및 시아노로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  44. 제29항에 있어서, Ra는 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  45. 제29항에 있어서, Ra는 다이하이드로-피라닐, 페닐, 나프틸, 티에닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 아자인돌릴, 인다졸릴, 벤조푸릴, 벤조티에닐, 다이벤조푸릴 및 다이벤조티에닐로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  46. 제28항에 있어서, R1은 수소, -C1-4알킬-R5, -C2-4알케닐-R5, -C2-4알키닐-R5, -C(O)-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-O-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -C(O)-NH(C1-4알킬-R9), -C(O)-NH(아릴-R8), -C(O)-N(C1-4알킬-R9)2, -SO2-(C1-4)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -사이클로알킬-R6, -헤테로사이클릴-R6, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 선택되며; 여기서, 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴은 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 고리 탄소 원자를 통해 하나의 위치에서 아자인돌 질소 원자에 부착되는 방법.
  47. 제28항에 있어서, R1은 수소, -C1-4알킬-R5, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 선택되고; 여기서, 헤테로아릴은 헤테로아릴 고리 탄소 원자를 통해 하나의 위치에서 아자인돌 질소 원자에 부착되는 방법.
  48. 제28항에 있어서, R1은 수소, -C1-4알킬-R5 및 -나프틸-R6으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  49. 제31항에 있어서, R5는 수소, -O-(C1-4)알킬, -O-(C1-4)알킬-OH, -O-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬, -O-(C1-4)알킬-NH2, -O-(C1-4)알킬-NH(C1-4알킬), -O-(C1-4)알킬-N(C1-4알킬)2, -O-(C1-4)알킬-S-(C1-4)알킬, -O-(C1-4)알킬-SO2-(C1-4)알킬, -O-(C1-4)알킬-SO2-NH2, -O-(C1-4)알킬-SO2-NH(C1-4알킬), -O-(C1-4)알킬-SO2-N(C1-4알킬)2, -O-C(O)H, -O-C(O)-(C1-4)알킬, -O-C(O)-NH2, -O-C(O)-NH(C1-4알킬), -O-C(O)-N(C1-4알킬)2, -O-(C1-4)알킬-C(O)H, -O-(C1-4)알킬-C(O)-(C1-4)알킬, -O-(C1-4)알킬-CO2H, -O-(C1-4)알킬-C(O)-O-(C1-4)알킬, -O-(C1-4)알킬-C(O)-NH2, -O-(C1-4)알킬-C(O)-NH(C1-4알킬), -O-(C1-4)알킬-C(O)-N(C1-4알킬)2, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)알킬, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬), -C(O)-N(C1-4알킬)2, -SH, -S-(C1-4)알킬, -S-(C1-4)알킬-S-(C1-4)알킬, -S-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬, -S-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬-OH, -S-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬-NH2, -S-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬-NH(C1-4알킬), -S-(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬-N(C1-4알킬)2, -S-(C1-4)알킬-NH(C1-4알킬), -SO2-(C1-4)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4알킬), -SO2-N(C1-4알킬)2, -N-R7, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로, 옥소, -사이클로알킬-R6, -헤테로사이클릴-R6, -아릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 방법.
  50. 제31항에 있어서, R5는 수소, -O-(C1-4)알킬, -N-R7, 하이드록시 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 방법.
  51. 제31항에 있어서, R5는 수소, -O-(C1-4)알킬, -N-R7, 하이드록시, -이미다졸릴-R6, -트라이아졸릴-R6 및 -테트라졸릴-R6으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 방법.
  52. 제31항에 있어서, R6은 수소, -C1-4알킬, -C2-4알케닐, -C2-4알키닐, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)알킬, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬), -C(O)-N(C1-4)알킬)2, -SO2-(C1-4)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4알킬), -SO2-N(C1-4알킬)2, -(C1-4)알킬-N-R7, -(C1-4)알킬-(할로)1-3, -(C1-4)알킬-OH, -아릴-R8, -(C1-4)알킬-아릴-R8 및 -(C1-4)알킬-헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기이되; 단, R6이 탄소 원자에 부착된 경우, R6은 -C1-4알콕시, -(C1-4)알콕시-(할로)1-3, -SH, -S-(C1-4)알킬, -N-R7, 시아노, 할로, 하이드록시, 니트로, 옥소 및 -헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 추가로 선택되는 방법.
  53. 제31항에 있어서, R6은 수소인 방법.
  54. 제33항에 있어서, R7은 수소, -C1-4알킬, -C2-4알케닐, -C2-4알키닐, -(C1-4)알킬-OH, -(C1-4)알킬-O-(C1-4)알킬, -(C1-4)알킬-NH2, -(C1-4)알킬-NH(C1-4알킬), -(C1-4)알킬-N(C1-4알킬)2, -(C1-4)알킬-S-(C1-4)알킬, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬, -C(O)-O-(C1-4)알킬, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬), -C(O)-N(C1-4알킬)2, -SO2-(C1-4)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4알킬), -SO2-N(C1-4알킬)2, -C(N)-NH2, -사이클로알킬-R8, -(C1-4)알킬-헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8, -(C1-4)알킬-아릴-R8 및 -(C1-4)알킬-헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 2개의 치환기인 방법.
  55. 제33항에 있어서, R7은 수소, -C1-4알킬, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬, -C(O)-O-(C1-4)알킬, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4알킬) 및 -SO2-N(C1-4알킬)2로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 2개의 치환기인 방법.
  56. 제31항에 있어서, R8은 수소, -C1-4알킬, -(C1-4)알킬-(할로)1-3 및 -(C1-4)알킬-OH로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기이되; 단, R8이 탄소 원자에 부착된 경우, R8은 -C1-4알콕시, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 시아노, 할로, -(C1-4)알콕시-(할로)1-3, 하이드록시 및 니트로로 구성된 군으로부터 추가로 선택되는 방법.
  57. 제31항에 있어서, R8은 수소인 방법.
  58. 제31항에 있어서, R9는 수소, -C1-4알콕시, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시 및 니트로로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 방법.
  59. 제31항에 있어서, R9는 수소인 방법.
  60. 28항에 있어서, R2는 수소, -C1-4알킬-R5, -C2-4알케닐-R5, -C2-4알키닐-R5, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬-R9), -C(O)-N(C1-4알킬-R9)2, -C(O)-NH(아릴-R8), -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SO2-(C1-4)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -사이클로알킬-R6, -아릴-R6 및 -(C1-4)알킬-N-R7로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개의 치환기이되; 단, R2가 탄소 원자에 부착된 경우, R2는 -C1-4알콕시-R5, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, 옥소, -헤테로사이클릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 추가로 선택되는 방법.
  61. 제28항에 있어서, R2는 수소, -C1-4알킬-R5, -C2-4알케닐-R5, -C2-4알키닐-R5, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)알킬-R9, -사이클로알킬-R6, -아릴-R6 및 -(C1-4)알킬-N-R7로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개의 치환기이되; 단, R2가 질소 원자에 부착된 경우, 4차 염이 형성되지 않고; R2가 탄소 원자에 부착된 경우, R2는 -C1-4알콕시-R5, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, 옥소, -헤테로사이클릴-R6 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 추가로 선택되는 방법.
  62. 제28항에 있어서, R2는 수소, -C1-4알킬-R5 및 -아릴-R6으로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 또는 질소 원자에 부착된 1개의 치환기이되; 단, R2가 질소 원자에 부착된 경우, 4차 염이 형성되지 않고; R2가 탄소 원자에 부착된 경우, R2는 -N-R7, 할로겐, 하이드록시 및 -헤테로아릴-R6으로 구성된 군으로부터 추가로 선택되는 방법.
  63. 제28항에 있어서, R3은 수소, -C1-4알킬-R10, -C2-4알케닐-R10, -C2-4알키닐-R10, -C1-4알콕시-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬-R9), -C(O)-N(C1-4알킬-R9)2, -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SO2-(C1-8)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -N-R7, -(C1-4)알킬-N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬-R8, -헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8 및 -헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 3개의 치환기인 방법.
  64. 제28항에 있어서, R3은 수소, -C1-4알킬-R10, -C2-4알케닐-R10, -C2-4알키닐-R10, -C1-4알콕시-R10, -C(O)H, -CO2H, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 시아노, 할로겐, 하이드록시 및 니트로로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개의 치환기인 방법.
  65. 제28항에 있어서, R3은 수소, -C1-4알킬-R10, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 할로겐 및 하이드록시로 구성된 군으로부터 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개의 치환기인 방법.
  66. 제28항에 있어서, R4는 수소, -C1-4알킬-R10, -C2-4알케닐-R10, -C2-4알키닐-R10, -C1-4알콕시-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4알킬-R9), -C(O)-N(C1-4알킬-R9)2, -C(O)-사이클로알킬-R8, -C(O)-헤테로사이클릴-R8, -C(O)-아릴-R8, -C(O)-헤테로아릴-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)알킬-R9, -C(O)-O-아릴-R8, -SH, -S-(C1-4)알킬-R10, -SO2-(C1-4)알킬-R9, -SO2-아릴-R8, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4알킬-R9), -SO2-N(C1-4알킬-R9)2, -N-R7, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬-R8, -헤테로사이클릴-R8, -아릴-R8 및 -헤테로아릴-R8로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기인 방법.
  67. 제28항에 있어서, R4는 수소, -C1-4알킬-R10, -C2-4알케닐-R10, -C2-4알키닐-R10, -C1-4알콕시-R10, -C(O)H, -CO2H, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 시아노, 할로겐, 하이드록시, 니트로, -사이클로알킬, -헤테로사이클릴, -아릴 및 -헤테로아릴로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기인 방법.
  68. 제28항에 있어서, R4는 수소, C1-4알킬-R10, C1-4알콕시-R10, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 할로겐 및 하이드록시로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기인 방법.
  69. 제28항에 있어서, R4는 수소, C1-4알킬-R10, C1-4알콕시-R10, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 염소, 불소 및 하이드록시로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 탄소 원자에 부착된 1개 내지 4개의 치환기인 방법.
  70. 제38항 또는 제41항에 있어서, R10은 수소, -NH2, -NH(C1-4알킬), -N(C1-4알킬)2, 시아노, (할로)1-3, 하이드록시, 니트로 및 옥소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 방법.
  71. 제38항 또는 제41항에 있어서, R10은 수소 및 (할로)1-3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 방법.
  72. 제38항 또는 제41항에 있어서, R10은 수소 및 (플루오로)3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기인 방법.
  73. 제28항에 있어서, Y 및 Z는 O, S, (H,OH) 및 (H,H)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되되; 단, Y 및 Z 중 하나는 O이고, 나머지는 O, S, (H,OH) 및 (H,H)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  74. 제28항에 있어서, Y 및 Z는 O 및 (H,H)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되되; 단, Y 및 Z 중 하나는 O이고, 나머지는 O 및 (H,H)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  75. 제28 항에 있어서, Y 및 Z는 O로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  76. 제28항에 있어서, 화학식 II의 화합물은 3-[1-(3-하이드록시프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-[2-(트라이플루오로메틸)페닐]-1H-피롤-2,5-다이온인 방법.
  77. 제28항에 있어서, 화학식 II의 화합물은 3-[1-(3-하이드록시프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-(1-메틸-1H-피라졸-3-일)-1H-피롤-2,5-다이온인 방법.
  78. 제28항에 있어서, 화학식 II의 화합물은 3-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-다이온인 방법.
  79. 제28항에 있어서, 화학식 II의 화합물은 3-(2,4-다이메톡시-피리미딘-5-일)-4-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-피롤-2,5-다이온인 방법.
  80. 제28항에 있어서, 화학식 II의 화합물은 4-{3-[4-(2,4-다이메톡시-피리미딘-5-일)-2,5-다이옥소-2,5-다이하이드로-1H-피롤-3-일]-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일}-부티로니트릴인 방법.
  81. 제28항에 있어서, 화학식 II의 화합물은 4-{3-[4-(1-메틸-1H-피라졸-3-일)-2,5-다이옥소-2,5-다이하이드로-1H-피롤-3-일]-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일}-부티로니트릴인 방법.
  82. 제28항에 있어서, 화학식 II의 화합물은 3-(2,4-다이메톡시-피리미딘-5-일)-4-(1-페네틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일)-피롤-2,5-다이온인 방법.
  83. 제1항에 있어서, GSK-3B 효소 활성 저해제는 화학식 (III)의 화합물인 방법.
    Figure pct00078
  84. 제83항에 있어서, A 및 E는 수소 치환된 탄소 원자 및 질소 원자로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고 여기서,
    Figure pct00079
    는 1H-인돌, 1H-피롤로[2,3-b]피리딘, 1H-피라졸로[3,4-b]피리딘 및 1H-인다졸로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  85. 제83항에 있어서, Z는 O로부터 선택되고; 대안적으로는, Z는 다이하이드로로부터 선택되고; 여기서, 각각의 수소 원자는 단일 결합에 의해서 부착되는 방법.
  86. 제83항에 있어서, R4 및 R5는 옥소로 임의로 치환된 C1-8알킬, C2-8알케닐 및 C2-8알키닐로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  87. 제83항에 있어서, R2는 -C1-8알킬-, -C2-8알케닐-, -C2-8알키닐-, -O-(C1-8)알킬-O-, -O-(C2-8)알케닐-O-, -O-(C2-8)알키닐-O-, -C(O)-(C1-8)알킬-C(O)- (여기서, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 연결 기 중 임의의 것은 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, -C(O)O-(C1-8)알킬, -C1-8알킬-C(O)O-(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시, 하이드록시(C1-8)알킬 및 옥소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환된 선형 탄소 쇄이고; 여기서, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 연결 기 중 임의의 것은 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬, 헤테로아릴(C1-8)알킬, 스피로사이클로알킬 및 스피로헤테로사이클릴 (여기서, 상기 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기 중 임의의 것은 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서, 상기 헤테로사이클릴 치환기 중 임의의 것은 옥소로 임의로 치환됨)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기로 임의로 치환됨), 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴 (여기서, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서, 헤테로사이클릴은 옥소로 임의로 치환됨), -(O-(CH2)1-6)0-5-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -(O-(CH2)1-6)0-5-NR6-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-, -(O-(CH2)1-6)0-5-S-, -O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-, -NR6-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-, -NR6-C(O)-, -C(O)-NR6-, -C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-, -NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-, -NR6-C(O)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7- 및 -SO2- (여기서, R6, R7 및 R8은 수소, C1-8알킬, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 하이드록시(C1-8)알킬, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬 및 헤테로아릴(C1-8)알킬 (여기서, 상기 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기는 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서, 헤테로사이클릴은 옥소로 임의로 치환됨)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨)로 구성된 군으로부터 선택되되; 단, A 및 E가 수소 치환된 탄소 원자로부터 선택되면, R2는 -C2-8알키닐-, -O-(C1-8)알킬-O-, -O-(C2-8)알케닐-O-, -O-(C2-8)알키닐-O-, -C(O)-(C1-8)알킬-C(O)- (여기서, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 연결 기 중 임의의 것은 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, -C(O)O-(C1-8)알킬, -C1-8알킬-C(O)O-(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시, 하이드록시(C1-8)알킬 및 옥소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환된 선형 탄소 쇄이고; 여기서, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐 연결 기 중 임의의 것은 헤테로사이클릴, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬, 헤테로아릴(C1-8)알킬, 스피로사이클로알킬 및 스피로헤테로사이클릴 (여기서, 상기 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기 중 임의의 것은 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서, 상기 헤테로사이클릴 치환기 중 임의의 것은 옥소로 임의로 치환됨)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 2개의 치환기로 임의로 치환됨), 사이클로알킬 (여기서, 사이클로알킬은 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 치환기로 임의로 치환됨), -(O-(CH2)1-6)1-5-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -(O-(CH2)1-6)1-5-NR6-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-, -(O-(CH2)1-6)0-5-S-, -O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-, -NR9-C(O)-, -C(O)-NR9-, -C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-, -NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-, -NR6-C(O)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S- 및 -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7- (여기서, R6, R7 및 R8은 수소, C1-8알킬, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 하이드록시(C1-8)알킬, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬 및 헤테로아릴(C1-8)알킬 (여기서, 상기 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기는 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서, 헤테로사이클릴은 옥소로 임의로 치환됨)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서, R9는 C1-8알킬, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 하이드록시(C1-8)알킬, 헤테로사이클릴(C1-8)알킬, 아릴(C1-8)알킬 및 헤테로아릴(C1-8)알킬 (여기서, 상기 헤테로사이클릴, 아릴 및 헤테로아릴 치환기는 C1-8알킬, C1-8알콕시, C1-8알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 4개의 치환기로 임의로 치환되고; 여기서, 헤테로사이클릴은 옥소로 임의로 치환됨)로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택됨)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  88. 제83항에 있어서, R1 및 R3은 수소, C1-8알킬, C2-8알케닐, C2-8알키닐 (여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 C1-8알콕시, 알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), (할로)1-3, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시, 하이드록시(C1-8)알킬 및 옥소로 구성된 군으로부터 선택되는 치환기로 임의로 치환됨), C1-8알콕시, C1-8알콕시카르보닐, (할로)1-3(C1-8)알콕시, C1-8알킬티오, 아릴, 헤테로아릴 (여기서, 아릴 및 헤테로아릴은 C1-8알킬, C1-8알콕시, 알콕시(C1-8)알킬, 카르복실, 카르복실(C1-8)알킬, 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 아미노(C1-8)알킬 (여기서, 아미노는 수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 할로겐, (할로)1-3(C1-8)알킬, (할로)1-3(C1-8)알콕시, 하이드록시 및 하이드록시(C1-8)알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 치환기로 임의로 치환됨), 아미노 (수소 및 C1-4알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환됨), 시아노, 할로겐, 하이드록시 및 니트로로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; 그의 약학적으로 허용가능한 염인 방법.
  89. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 6,7,9,10,12,13,15,16-옥타하이드로-23H-5,26:17,22-다이메테노-5H-다이피리도[2,3-k:3',2'-q]피롤로[3,4-n][1,4,7,10,19]트라이옥사다이아자사이클로헤니코신-23,25(24H)-다이온인 방법.
  90. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-데카하이드로-9,4:24,29-다이메테노-1H-다이피리도[2,3-n:3',2'-t]피롤로[3,4-q][1,4,7,10,13,22]테트라옥사다이아자사이클로테트라코신-1,3(2H)-다이온인 방법.
  91. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26-도데카하이드로-9,4:27,32-다이메테노-1H-다이피리도[2,3-q:3',2'-w]피롤로[3,4-t][1,4,7,10,13,16,25]펜타옥사다이아자사이클로헵타코신-1,3(2H)-다이온인 방법.
  92. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 6,7,9,10,12,13-헥사하이드로-20H-5,23:14,19-다이메테노-5H-다이벤조[h,n]피롤로[3,4-k][1,4,7,16]다이옥사다이아자사이클로옥타데신-20,22(21H)-다이온인 방법.
  93. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 6,7,9,10,12,13,15,16-옥타하이드로-23H-5,26:17,22-다이메테노-5H-다이벤조[k,q]피롤로[3,4-n][1,4,7,10,19]트라이옥사다이아자사이클로헤네이코신-23,25(24H)-다이온인 방법.
  94. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-데카하이드로-9,4:24,29-다이메테노-1H-다이벤조[n,t]피롤로[3,4-q][1,4,7,10,13,22]테트라옥사다이아자사이클로테트라코신-1,3(2H)-다이온인 방법.
  95. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 화합물 1a인 방법.
  96. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-[1-[3-[(2-하이드록시에틸)메틸아미노]프로필]-1H-인다졸-3-일]-4-[1-(3-피리디닐)-1H-인돌-3-일]-1H-피롤-2,5-다이온인 방법.
  97. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3,5-다이클로로-N-[3-클로로-4-[(3,4,12,12a-테트라하이드로-1H-[1,4]티아지노[3,4-c][1,4]벤조다이아제핀-11(6H)-일)카르보닐]페닐]-벤즈아미드인 방법.
  98. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-[1-(2-하이드록시-에틸)-1H-인돌-3-일]-4-(1-피리딘-3-일-1H-인돌-3-일)-피롤-2,5-다이온인 방법.
  99. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-(2-메톡시-페닐)-4-(1-피리딘-3-일-1H-인돌-3-일)-피롤-2,5-다이온인 방법.
  100. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 6-[[2-[[4-(2,4-다이클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴인 방법.
  101. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-(5-클로로-1-메틸-1H-인돌-3-일)-4-[1-(3-이미다졸-1-일-프로필)-1H-인다졸-3-일]-피롤-2,5-다이온인 방법.
  102. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-(5-클로로-1-메틸-1H-인돌-3-일)-4-[1-(3-[1,2,3]트라이아졸-1-일-프로필)-1H-인다졸-3-일]-피롤-2,5-다이온인 방법.
  103. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-(1-메틸-1H-피라졸-3-일)-피롤-2,5-다이온인 방법.
  104. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 화합물 10a인 방법.
  105. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-[1-(3-하이드록시-3-메틸-부틸)-1H-인다졸-3-일]-4-(1-피리딘-3-일-1H-인돌-3-일)-피롤-2,5-다이온인 방법.
  106. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-[1-(2-하이드록시-에틸)-1H-인다졸-3-일]-4-(1-피리미딘-5-일-1H-인돌-3-일)-피롤-2,5-다이온인 방법.
  107. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-[1-(2-하이드록시-에틸)-1H-인돌-3-일]-4-(1-피리미딘-5-일-1H-인돌-3-일)-피롤-2,5-다이온인 방법.
  108. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 (11Z)-8,9,10,13,14,15-헥사하이드로-2,6:17,21-다이(메테노)피롤로[3,4-h][1,15,7]다이옥사자사이클로트라이코신-22,24(1H,23H)-다이온인 방법.
  109. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-(5-클로로-1-피리딘-3-일-1H-인돌-3-일)-4-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-인다졸-3-일]-피롤-2,5-다이온인 방법.
  110. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-(2-메톡시-페닐)-4-[1-(3-메톡시-프로필)-1H-피롤로[3,2-c]피리딘-3-일]-피롤-2,5-다이온인 방법.
  111. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-[1-(3-하이드록시-프로필)-1H-인다졸-3-일]-4-[1-(테트라하이드로-피란-4-일)-1H-인돌-3-일]-피롤-2,5-다이온인 방법.
  112. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 2-{3-[4-(5-클로로-1-메틸-1H-인돌-3-일)-2,5-다이옥소-2,5-다이하이드로-1H-피롤-3-일]-인다졸-1-일}-N-(2-하이드록시-에틸)-아세트아미드인 방법.
  113. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 4-(3-클로로-페닐)-6-(3-다이메틸아미노-프로필)-5,6-다이하이드로-4H-2,4,6-트라이아자-사이클로펜타[c]플루오린-1,3-다이온인 방법.
  114. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 14-에틸-6,7,9,10,13,14,15,16-옥타하이드로-12H,23H-5,26:17,22-다이메테노다이벤조[k,q]피롤로[3,4-n][1,4,7,10,19]다이옥사트라이아자사이클로헤네이코신-23,25(24H)-다이온인 방법.
  115. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 14-벤질-6,7,9,10,13,14,15,16-옥타하이드로-12H,23H-5,26:17,22-다이(메테노)다이벤조[k,q]피롤로[3,4-n][1,4,7,10,19]다이옥사트라이아자사이클로헤니코신-23,25(24H)-다이온인 방법.
  116. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-(1-{2-[2-(2-하이드록시-에톡시)-에톡시]-에틸}-1H-인돌-3-일)-4-[1-(2-하이드록시-에틸)-1H-인돌-3-일]-피롤-2,5-다이온인 방법.
  117. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 6,7,8,9,10,11,12,13-옥타하이드로-8,11-다이메틸-5,23:14,19-다이메테노-20H-다이벤조[k,q]피롤로[3,4-n][1,4,7,10]테트라아자사이클로옥타데신-20,22(21H)-다이온인 방법.
  118. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 7,8,9,10,12,13,16,17,18,19-데카하이드로-8,17-다이메틸-15H,26H-5,29:20,25-다이메테노-6H-다이벤조[k,q]피롤로[3,4-n][1,4,7,10,19,22]다이옥사테트라아자사이클로테트라코신-26,28(27H)-다이온인 방법.
  119. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 14-(2-푸릴메틸)-6,7,9,10,13,14,15,16-옥타하이드로-12H,23H-5,26:17,22-다이(메테노)다이벤조[k,q]피롤로[3,4-n][1,4,7,10,19]다이옥사트라이아자사이클로헤니코신-23,25(24H)-다이온인 방법.
  120. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 14-(2-티에닐메틸)-6,7,9,10,13,14,15,16-옥타하이드로-12H,23H-5,26:17,22-다이(메테노)다이벤조[k,q]피롤로[3,4-n][1,4,7,10,19]다이옥사트라이아자사이클로헤니코신-23,25(24H)-다이온인 방법.
  121. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 14-(1-나프틸메틸)-6,7,9,10,13,14,15,16-옥타하이드로-12H,23H-5,26:17,22-다이(메테노)다이벤조[k,q]피롤로[3,4-n][1,4,7,10,19]다이옥사트라이아자사이클로헤니코신-23,25(24H)-다이온인 방법.
  122. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 14-(피리딘-4-일메틸)-6,7,9,10,13,14,15,16-옥타하이드로-12H,23H-5,26:17,22-다이(메테노)다이벤조[k,q]피롤로[3,4-n][1,4,7,10,19]다이옥사트라이아자사이클로헤니코신-23,25(24H)-다이온인 방법.
  123. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-[1-(2-{2-[2-(1,2,3,4-테트라하이드로-나프탈렌-1-일아미노)-에톡시]-에톡시}-에틸)-1H-인돌-3-일]-4-{1-[2-(1,2,3,4-테트라하이드로-나프탈렌-1-일아미노)-에틸]-1H-인돌-3-일}-피롤-2,5-다이온인 방법.
  124. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-[1-(3-다이메틸아미노-페닐)-1H-인돌-3-일]-4-[1-(2-하이드록시-에틸)-1H-인다졸-3-일]-피롤-2,5-다이온인 방법.
  125. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 3-[5-클로로-1-(6-다이메틸아미노-피리딘-3-일)-1H-인돌-3-일]-4-[1-(2-하이드록시-에틸)-1H-인다졸-3-일]-피롤-2,5-다이온인 방법.
  126. 제83항에 있어서, 화학식 (III)의 화합물은 5-(5-클로로-3-{4-[1-(2-하이드록시-에틸)-1H-인다졸-3-일]-2,5-다이옥소-2,5-다이하이드로-1H-피롤-3-일}-인돌-1-일)-니코틴산 메틸 에스테르인 방법.
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