RU2702198C2 - Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток - Google Patents

Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток Download PDF

Info

Publication number
RU2702198C2
RU2702198C2 RU2016149540A RU2016149540A RU2702198C2 RU 2702198 C2 RU2702198 C2 RU 2702198C2 RU 2016149540 A RU2016149540 A RU 2016149540A RU 2016149540 A RU2016149540 A RU 2016149540A RU 2702198 C2 RU2702198 C2 RU 2702198C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
cell
population
markers characteristic
pancreatic
Prior art date
Application number
RU2016149540A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2016149540A (ru
RU2016149540A3 (ru
Inventor
Фрэнсис КАРАНУ
Алиреза РЕЗАНИА
Original Assignee
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Инк.
Publication of RU2016149540A publication Critical patent/RU2016149540A/ru
Publication of RU2016149540A3 publication Critical patent/RU2016149540A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2702198C2 publication Critical patent/RU2702198C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению клеток первичной кишечной трубки. Способ включает контактирование популяции, содержащей клетки первичной кишечной трубки, полученные последовательным дифференцированием плюрипотентных стволовых клеток человека, за исключением способа, где плюрипотентные стволовые клетки человека получены путем использования эмбриона человека, с лигандом или антителом, которые связывают Lif-рецептор. Затем осуществляют отбор клеток, с которыми лиганд или антитело связываются, где клетки, с которыми лиганд или антитело связываются, являются клетками первичной кишечной трубки. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 14 з.п. ф-лы, 13 ил., 7 табл., 7 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет в отношении предварительной заявки № 61/309193, поданной 01 марта 2010 года.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способам дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток. В частности, в настоящем изобретении предложены способы характеризации клеток, дифференцировавших в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, на основании анализа уникальных маркеров клеточной поверхности. В настоящем изобретении также предложены способы обогащения или сортировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. В настоящем изобретении также предложены способы уменьшения количества клеток, которые могут загрязнять популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, сформированные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, таким образом, снижая частоту возникновения опухолей in vivo после трансплантации.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Плюрипотентные стволовые клетки могут давать начало типам дифференцированных клеток, содержащих все соматические ткани и органы. Лечению диабета с помощью клеточной терапии способствует производство большого количества клеток, которые могут функционировать аналогично островкам поджелудочной железы человека. Таким образом, существует необходимость в получении таких клеток из плюрипотентных стволовых клеток, а также в надежных способах их очистки.
Белки и другие маркеры клеточной поверхности, которые обнаруживают на плюрипотентных стволовых клетках и производных клеточных популяциях, успешно используются для получения реагентов, предназначенных для разделения и выделения этих популяций. Маркеры клеточной поверхности также используют для дополнительной характеризации этих клеток.
В одном примере в публикации № WO2009131568 описан способ очистки энтодермальных клеток кишечника, содержащий: a) воздействие на популяцию клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток, содержащих клетки кишечной энтодермы, лигандом, связывающимся с маркером клеточной поверхности, который экспрессируют клетки кишечной энтодермы, причем указанный маркер клеточной поверхности выбран из группы, состоящей из CD49e, CD99, CD165 и CD334; и b) отделение клетки кишечной энтодермы от клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток, не связывающихся с данным лигандом, посредством чего выполняется очистка указанной клетки кишечной энтодермы.
В другом примере в публикации № WO2010000415 описано использование антитела, которое связывается с антигеном TNAP, или функциональных фрагментов этого антитела, одного или в комбинации с антителом, которое связывается с CD56, или функциональных фрагментов этого антитела для выделения стволовых клеток с потенциалом к дифференцированию адипоцитов, хондроцитов и панкреатических клеток.
В другом примере в публикации № US7371576 описано обнаружение селективного маркера клеточной поверхности, который позволяет отбирать уникальную субпопуляцию стволовых панкреатических клеток, имеющих высокую предрасположенность к дифференцированию в клетки или агрегаты инсулин-продуцирующих клеток.
В другом примере в публикации № US7585672 описан способ обогащения культуры клеток, производных от эмбриональных стволовых клеток человека, клетками энтодермальной и панкреатической линий дифференцирования, а именно способ, содержащий стадии (а) культивирования интактных колоний эмбриональных стволовых клеток человека с образованием цельных интактных эмбриоидных тел, окруженных клетками висцерального листка желточного мешка (VYS), причем эмбриональные стволовые клетки человека экспрессируют Oct-4, поверхностный стадиеспецифический эмбриональный антиген-3/4 (SSEA 3/4) и молекулу адгезии эпителиальных клеток (EpCAM); (b) культивирования эмбриональных тел, полученных на стадии (a), в условиях, способствующих дифференцированию эмбриональных тел в клеточную популяцию, содержащую клетки энтодермальной и панкреатической линий дифференцирования; (c) диспергирования клеточной популяции, полученной на стадии (b), на отдельные клетки; (d) отбора клеток, экспрессирующих SSEA 3/4, для отделения недифференцированных клеток от клеток, полученных на стадии (c); (e) отбора клеток, экспрессирующих SSEA-1, для удаления клеток VYS из числа оставшихся клеток, полученных на стадии (d); и (f) отбора клеток, экспрессирующих EpCAM, из числа оставшихся клеток, полученных на стадии (e), для обогащения клетками энтодермальной и панкреатической линий дифференцирования.
В публикации № US7585672 также описан способ обогащения культуры клеток, производных от эмбриональных стволовых клеток человека, клетками энтодермальной и панкреатической линий дифференцирования, а именно способ, содержащий стадии (а) культивирования интактных колоний эмбриональных стволовых клеток человека с образованием цельных интактных эмбриоидных тел, окруженных клетками висцерального листка желточного мешка (VYS), причем эмбриональные стволовые клетки человека экспрессируют Oct-4, поверхностный стадиеспецифический эмбриональный антиген-3/4 (SSEA 3/4) и молекулу адгезии эпителиальных клеток (EpCAM); (b) культивирования эмбриональных тел, полученных на стадии (a), в условиях, способствующих дифференцированию эмбриональных тел в клеточную популяцию, содержащую клетки энтодермальной и панкреатической линий дифференцирования; (c) обработки клеточной популяции, полученной на стадии (b), эффективной дозой фактора роста фибробластов 10 (FGF10); и (d) диспергирования клеточной популяции, полученной на стадии (c), на отдельные клетки, обогащенные клетками энтодермальной и панкреатической линий дифференцирования; (e) отбора клеток, экспрессирующих SSEA 3/4, для отделения недифференцированных клеток от клеток, полученных на стадии (d); (f) отбора клеток, экспрессирующих SSEA-1, для удаления клеток VYS из числа клеток, полученных на стадии (e); и (g) отбора клеток, экспрессирующих EpCAM, из числа оставшихся клеток, полученных на стадии (f), для обогащения клетками энтодермальной и панкреатической линий дифференцирования.
В публикации № US7585672 также описан способ обогащения для создания популяции клеток, производных от стволовых клеток, которая не обладает туморогенным потенциалом, содержащий стадии (а) культивирования интактных колоний эмбриональных стволовых клеток человека с образованием цельных интактных эмбриоидных тел, окруженных клетками висцерального листка желточного мешка (VYS), причем эмбриональные стволовые клетки человека экспрессируют Oct-4, поверхностный стадиеспецифический эмбриональный антиген-3/4 (SSEA 3/4) и молекулу адгезии эпителиальных клеток (EpCAM); (b) культивирования эмбриональных тел, полученных на стадии (a), в условиях, способствующих дифференцированию эмбриональных тел в клеточную популяцию, содержащую клетки энтодермальной и панкреатической линий дифференцирования; (c) диспергирования клеточной популяции, полученной на стадии (b), на отдельные клетки; (d) отбора клеток, экспрессирующих SSEA 3/4, для очистки недифференцированных клеток от клеток, полученных на стадии (c); (e) отбора клеток, экспрессирующих SSEA-1, для удаления клеток VYS из числа клеток, полученных на стадии (d); и (f) отбора клеток, экспрессирующих EpCAM, из числа оставшихся клеток, полученных на стадии (e), при этом полученные клетки не образуют тератом после инъекции мышам с ослабленным иммунитетом.
В другом примере в публикации № US20050260749 описан способ обогащения культуры клеток, производных от стволовых клеток, клетками энтодермальной и панкреатической линий дифференцирования, а именно способ, содержащий стадии культивирования стволовых клеток с образованием эмбриоидных тел; и отбора эмбриоидных тел для экспрессии соответствующих видоспецифических и стадиеспецифических эмбриональных антигенов клеточной поверхности и культивирования только тех эмбриоидных тел, которые не экспрессируют стадиеспецифического антигена клеточной поверхности для дифференцирования в энтодерму и панкреатические клетки.
В другом примере в публикации № US20100003749 описана выделенная популяция панкреатических стволовых клеток, причем популяция панкреатических стволовых клеток обогащена панкреатическими стволовыми клетками CD133+CD49f+.
В публикации № US20100003749 дополнительно описан способ выделения панкреатических стволовых клеток из первичной ткани поджелудочной железы путем отбора из популяции панкреатических клеток, клеток панкреатического или желудочно-кишечного происхождения CD133+, CD49f+ или CD133+CD49f+; удаления клеток CD15+, при этом оставшиеся клетки являются клетками CD15-; культивирования оставшихся клеток в бессывороточной культуральной среде, содержащей один или более факторов роста; и пролиферации оставшихся клеток в культуральной среде.
В другом примере Dorrell et al. заявляют: «Мы разработали новую панель маркеров клеточной поверхности для выделения и изучения всех основных типов клеток поджелудочной железы человека. Гибридомы отбирали после субтрактивной иммунизации мышей линии Balb/C интактными или диссоциированными островками поджелудочной железы человека и оценивали на предмет клеточной специфичности и реактивности клеточной поверхности с помощью иммуногистохимии и проточной цитометрии. Антитела выявляли по специфическому связыванию поверхностных антигенов островковых (панэндокринных или α-специфичных) и неостровковых субпопуляций клеток поджелудочной железы (экзокринных или протоковых). Эти антитела использовали по отдельности или в комбинации для выделения популяций α, β, экзокринных или протоковых клеток из первичных тканей поджелудочной железы человека методом проточной цитометрии (FACS), а также подробной характеризации клеточной композиции препаратов островков поджелудочной железы человека. Антитела также использовали для демонстрации того, что культуры, используемые для размножения человеческих островковых клеток, происходят от неэндокринных клеток, и что уровень экспрессии инсулина можно повысить до 1% от уровня экспрессии обычных островковых клеток с помощью субпопуляционной сортировки и гиперэкспрессии транскрипционных факторов Pdx-1 и ngn3, что указывает на улучшение результатов, полученных ранее в данной культуральной системе. Эти способы позволяют выполнять анализ и выделение функционально различных популяций клеток поджелудочной железы, обладающих потенциалом, необходимым для клеточной терапии» (Stem Cell Research, том 1, вып. 3, сентябрь 2008 г., стр. 155-156).
В другом примере Sugiyama et al. заявляют: «В результате мы выявили два антигена, которые назвали CD133 и CD49f, пригодные для очистки мышиных NGN3+ клеток. CD133 (также известен как проминин-1) является трансмембранным белком с неизвестной функцией и известным маркером гемопоэтических предшественников и нейронных стволовых клеток. CD49f также известен как интегрин α6 и является компонентом рецептора ламинина. Комбинируя антитела, которые распознают CD133 и CD49f, мы фракционировали четыре популяции панкреатических клеток. Иммунное окрашивание и ОТ-ПЦР подтвердили, что популяция клеток CD49fhigh CD133+ («фракция I», 50% исходных клеток) содержала главным образом дифференцированные экзокринные клетки, экспрессирующие CarbA. Фракция клеток CD49flow CD133- («фракция III», 10% исходных клеток) включала гормон+ клетки, экспрессирующие эндокринные продукты, такие как инсулин и глюкагон. В противоположность этому фракция CD49flow CD133+ (обозначаемая «фракция II», 13% исходных клеток) содержала NGN3+, но не гормон+ клетки. Приблизительно 8% клеток фракции II вырабатывали иммунноокрашиваемый NGN3. В составе фракции CD49f- CD133- («фракция IV», 25% исходных клеток) нам не удалось выявить клетки, экспрессирующие NGN3, CarbA или гормоны островков поджелудочной железы» (Diabetes, Obesity and Metabolism, том 10, вып. s4, стр. 179-185).
В другом примере Fujikawa et al. заявляют: «После сортировки CD45-TER119- GFPhigh клеток с боковым рассеянием света в этой популяции мы обнаружили незрелые клетки энтодермы, экспрессирующие α-фетопротеин и имеющие высокий потенциал роста. С помощью клонального анализа и электронной микроскопии было выявлено, что каждая отдельная клетка этой популяции может дифференцироваться не только в гепатоциты, но и в билиарные эпителиальные клетки, демонстрируя свою двунаправленную дифференцировочную активность. Анализ маркеров клеточной поверхности выявил наличие интегрина α6 и интегрина β1, но отсутствие экспрессии c-Kit и Thy1.1» (Journal of Hepatlogy, том 39, стр. 162-170).
В другом примере Zhao et al. заявляют: «В этом исследовании мы сначала выявили N-кадгерин как маркер клеточной поверхности клеток печеночной энтодермы, подходящий для их очистки из смеси производных эмбриональных стволовых клеток (hES) человека, а затем получили печеночные клетки-предшественники, используя очищенные клетки печеночной энтодермы и культивируя их вместе с мышиными эмбриональными стромальными питающими клетками (STO). Эти печеночные клетки-предшественники способны размножаться и могут быть пассированы в течение более чем 100 дней. Интересно, что они коэкспрессируют ранний печеночный маркер AFP и маркер билиарной линии дифференцирования KRT7, что позволяет предположить, что эти клетки являются общими предшественниками как гепатоцитов, так и холангиоцитов. Более того, эти клетки-предшественники могут активно размножаться, сохраняя при этом двойной потенциал дифференцирования в гепатоцитоподобные клетки и холангиоцитоподобные клетки, что подтверждается как анализом генной экспрессии, так и функциональными исследованиями. Таким образом, в данной работе предложена новая модель изучения развития печени, а также новый источник материала для клеточной терапии, основанной на использовании печеночных клеток-предшественников» (PLoS ONE 4(7): e6468. doi: 10.1371/journal.pone. 0006468).
В другом примере Cai et al. заявляют: «Для дополнительного повышения тонкости очистки клеток PDX1+ мы сортировали активин A-индуцированные клетки с помощью CXCR4, который является маркером энтодермальных клеток ES-происхождения. Сортировка с помощью CXCR4 позволила обогатить популяцию энтодермальных клеток, поскольку практически все клетки в популяции CXCR4+ были положительно окрашены антителами к энтодермальному маркеру SOX17 и >90% клеток были положительны по отношению к FOXA2» (Journal of Molecular Cell Biology Advance Access, оригинальная публикация в электронном виде от 12 ноября 2009 г. Journal of Molecular Cell Biology 2010 2(1):50-60; doi:10.1093/jmcb/mjp037).
В другом примере Koblas et al. заявляют: «Мы обнаружили, что популяция человеческих CD133- положительных панкреатических клеток содержит эндокринные клетки-предшественники, экспрессирующие нейрогенин-3, и клетки, экспрессирующие человеческую теломеразу, ABCG2, Oct-3/4, Nanog и Rex-1, маркеры плюрипотентных стволовых клеток. Эти клетки были способны дифференцироваться в инсулин-продуцирующие клетки in vitro и секретировали C-пептид в ответ на воздействие глюкозы. На основании полученных данных мы сделали предположение о том, что CD133 является еще одним маркером клеточной поверхности, который можно использовать для выявления и выделения панкреатических эндокринных клеток-предшественников» (Transplant Proc., март 2008 г.; 40(2):415-8).
В другом примере Sugiyama et al. заявляют: «Мы обнаружили, что клетки NGN3+ экспрессировали CD133. Оказалось, что CD133 локализуется в апикальной мембране протоковых эпителиальных панкреатических клеток» (PNAS 2007 104:175-180; электронная публикация до выхода в печать от 26 декабря 2006 г., doi:10.1073/pnas.0609490104).
В другом примере Kobayashi et al. заявляют: «Эмбриональный панкреатический эпителий и - позднее - протоковый эпителий, как известно, дают начало эндокринным и экзокринным клеткам формирующейся поджелудочной железы, однако никаких специфичных маркеров клеточной поверхности для этих клеток выявлено не было. В настоящей работе мы использовали агглютинин Dolichos Biflorus Agglutinin (DBA) в качестве специфичного маркера таких эпителиальных клеток в составе формирующейся поджелудочной железы у мышей. По результатам иммунофлуоресцентного анализа с использованием меченого флуоресцином DBA и клеточных маркеров, специфичных для панкреатических клеток, мы обнаружили, что DBA специфически выявляет эпителиальные, но не выявляет ни дифференцирующиеся эндокринные, ни ацинарные клетки. Мы дополнительно использовали этот маркер в иммуномагнитной системе разделения клеток (система Dynabead) для очистки таких предположительно мультипотентных клеток из смеси развивающихся панкреатических клеток. Эту процедуру можно использовать для изучения дифференцирования и отбора клеточной линии дифференцирования при формировании поджелудочной железы. Кроме того, ее также можно использовать для отбора панкреатических клеток-предшественников для потенциальной клеточной инженерии» (Biochemical and Biophysical Research Communications, том 293, вып. 2, 3 мая 2002 г., стр. 691-697).
Выявление маркеров, экспрессируемых клетками, которые являются производными плюрипотентных стволовых клеток, позволит получить больше информации об этих клетках, научиться выявлять их in vivo и in vitro и проводить их положительное обогащение in vitro для изучения и использования. Таким образом, сохраняется потребность в инструментах, которые можно использовать для выделения и характеризации клеток, являющихся производными от плюрипотентных стволовых клеток, в частности, клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ дифференцирования популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, включающий в себя следующие стадии:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы;
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки;
d. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы; и
e. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, трансплантируют животному, при этом клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, дают начало инсулин-продуцирующим клеткам. В одном варианте осуществления эффективность образования инсулин-продуцирующих клеток повышается за счет обогащения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, до трансплантации.
В одном варианте осуществления эффективность образования инсулин-продуцирующих клеток определяют путем измерения времени, необходимого для экспрессии С-пептида на уровне обнаружения после трансплантации.
В альтернативном варианте осуществления обогащение снижает способность трансплантируемых клеток формировать тератомы после трансплантации.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг. 1 представлена экспрессия NEUROD (панель а), NGN3 (панель b), PDX1 (панель c), NKX6.1 (панель d), NKX2.2 (панель e) и PAX4 (панель f) в популяциях клеток CD56+CD13-, CD56-CD13- и CD56-CD13+, как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени. Кратность повышения экспрессии приведена в сравнении с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками H1.
На фиг. 2 представлена экспрессия NEUROD (панель a), NGN3 (панель b), PDX1 (панель c), NKX6.1 (панель d), NKX2.2 (панель e) и PAX4 (панель f), как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени в популяциях клеток, отсортированных с использованием антитела к CD133. Кратность повышения экспрессии приведена в сравнении с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками H1.
На фиг. 3 представлена экспрессия NEUROD (панель a), NGN3 (панель b), PDX1 (панель c) и NKX6.1 (панель d), как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени в популяциях клеток, отсортированных с использованием антитела к CD49c. Кратность повышения экспрессии приведена в сравнении с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками H1.
На фиг. 4 представлена экспрессия NEUROD (панель a), NGN3 (панель b), PDX1 (панель c), NKX6.1 (панель d), инсулина (панель e) и глюкагона (панель f), как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени в популяциях клеток, отсортированных с использованием антител к CD56 и CD15. Кратность повышения экспрессии приведена в сравнении с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками H1.
На фиг. 5 представлена экспрессия NEUROD (панель а), NGN3 (панель b), PDX1 (панель c), NKX6.1 (панель d), NKX2.2 (панель e), PAX-4 (панель f), глюкагона (панель g) и инсулина (панель h), как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени в популяциях клеток, отсортированных с использованием антитела к CD15. Кратность повышения экспрессии приведена в сравнении с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками H1.
На фиг. 6 представлена экспрессия NEUROD (панель а), NGN3 (панель b), PDX1 (панель c), NKX6.1 (панель d), NKX2.2 (панель e), инсулина (панель f) и глюкагона (панель g), как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени в популяциях клеток, отсортированных с использованием антител к CD56 и CD57. Кратность повышения экспрессии приведена в сравнении с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками H1.
На фиг. 7 представлена экспрессия ZIC1 (панель a), альбумина (панель b), CDX2 (панель c), NGN3 (панель d), PAX4 (панель e), NEUROD (панель f), NKX6.1 (панель g), PTF1 альфа (панель h) и PDX1 (панель i), как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени в популяциях клеток, отсортированных с использованием антител к CD56 и CD184. Кратность повышения экспрессии приведена в сравнении с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками H1.
На фиг. 8 представлена экспрессия NEUROD (панель a), NGN3 (панель b), инсулина (панель c) и глюкагона (панель d), как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени в популяциях клеток, отсортированных с использованием антитела к CD98. Кратность повышения экспрессии приведена в сравнении с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками H1.
На фиг. 9 представлена экспрессия NEUROD (панель a), NGN3 (панель b), PDX1 (панель c), NKX6.1 (панель d), NKX2.2 (панель e) и PAX4 (панель f), как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени в популяциях клеток, отсортированных с использованием антитела к CD47. Кратность повышения экспрессии приведена в сравнении с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками H1.
На фиг. 10 представлена экспрессия PDX-1 (панель а), NKX6.1 (панель b), NKX2.2 (панель c), PAX-4 (панель d), PTF1a (панель e), NGN3 (панель f), инсулина (панель g) и глюкагона (панель h), как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени в популяциях клеток, отсортированных с использованием антитела к CD47. Кратность повышения экспрессии приведена в сравнении с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками H1.
На фиг. 11 представлена экспрессия HNF4 альфа (панель а) и LIF-рецептора (панель b), как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени в популяциях клеток, отсортированных с использованием антитела к LIF-рецептору. Кратность повышения экспрессии приведена в сравнении с несортированными клетками на 2 ДЕНЬ стадии II протокола дифференцирования, приведенного в примере 1.
На фиг. 12 представлена экспрессия OCT4 (панель a), NANOG (панель b), SOX2 (панель c) и goosecoid (панель d), как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени в популяциях клеток после удаления клеток, экспрессирующих SSEA4 с помощью магнитных бус. Кратность повышения экспрессии приведена в сравнении с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками H1.
На фиг. 13 представлена экспрессия OCT4 (панель а), NANOG (панель b), SOX2 (панель c) и goosecoid (панель d), как определяют с помощью реакции ПЦР в реальном времени в популяциях клеток после удаления клеток, экспрессирующих SSEA4 с помощью FACS. Кратность превышения экспрессии приведена в сравнении с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками H1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для четкости описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Используемый в настоящей заявке термин «β-клеточная линия дифференцирования» относится к клеткам, положительным в отношении экспрессии гена транскрипционного фактора PDX-1 и по меньшей мере одного из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF-3 бета, MAFA, PAX4 и PAX6. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для β-клеточной линии дифференцирования, включают в себя β-клетки.
Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX 17, GATA4, HNF-3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксный белок, FGF4, CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CD184, C-Kit, CD99 или OTX2. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дифференцирования в клетки дефинитивной энтодермы, включают в себя клетки-предшественники клеток первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезоэнтодермы и клетки дефинитивной энтодермы.
Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки» подразумевает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: HNF-1 бета или HNF-4 альфа.
Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, HNF-1 бета, PTF-1 альфа, HNF6 или HB9. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, включают в себя клетки панкреатической энтодермы.
Используемый в настоящей заявке термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4 или PTF-1 альфа. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, включают в себя панкреатические эндокринные клетки, панкреатические клетки, экспрессирующие гормоны, и панкреатические клетки, секретирующие гормоны, а также клетки β-клеточной линии дифференцирования.
Используемый в настоящей заявке термин «дефинитивная энтодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в процессе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют следующие маркеры: CD184, HNF-3 бета, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, c-Kit, CD99 и Mixl1.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет выявлять интересующую клетку и отличать ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.
Термин «панкреатическая эндокринная клетка» или «клетка, экспрессирующая панкреатические гормоны» в настоящем документе относится к клеткам, способным к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулина, глюкагона, соматостатина и панкреатического полипептида.
Используемый в настоящей заявке термин «панкреатическая клетка, секретирующая гормоны» относится к клеткам, способным к секреции по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулина, глюкагона, соматостатина и панкреатического полипептида.
Используемый в настоящей заявке термин «клетка-предшественник клетки первичной полоски» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Nodal или FGF8.
Используемый в настоящей заявке термин «клетка первичной полоски» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Brachyury, Mix-подобный гомеобоксный белок или FGF4.
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцировать с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцировать in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от множества зародышевых листков и вносить существенный вклад в формирование большинства или даже всех тканей после введения в бластоцисты.
По потенциалу развития стволовые клетки классифицируются следующим образом: (i) тотипотентные, то есть способные давать начало всем эмбриональным и внеэмбриональным типам клеток; (ii) плюрипотентные, то есть способные давать начало всем эмбриональным типам клеток; (iii) мультипотентные, то есть способные давать начало группе клеточных линий дифференцирования в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы (например, гематопоэтические стволовые клетки (HSC) могут давать таких потомков, как HSC (самообновление), олигопотентные предшественники, ограниченные клетками крови, и все типы клеток и клеточных элементов (например, тромбоциты), являющиеся нормальными компонентами крови); (iv) олигопотентные, то есть способные давать начало более ограниченному набору клеточных линий дифференцирования, чем мультипотентные стволовые клетки; и (v) унипотентные, то есть способные давать начало единственной клеточной линии дифференцирования (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная (некоммитированная) или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное (коммитированное) положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированный» применительно к способу дифференцирования относится к клетке, дошедшей в процессе дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцирование до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, во время которого клетка возвращается к менее специализированному (коммитированному) положению в линии дифференцирования. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которая может использоваться для оценки дифференцирования некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцирования.
Для описания клеток в процессе культивирования используют различные термины. Термин «поддержание» по существу относится к клеткам, помещенным в ростовую среду в условиях, которые способствуют росту и (или) делению клеток, в результате чего популяция клеток может расти или не расти. Термин «пассирование» означает способ изъятия клеток из одного культурального сосуда и переноса их в другой культуральный сосуд в условия, которые способствуют росту и (или) делению клеток.
Конкретная популяция клеток, или клеточная линия, иногда описывается или характеризуется числом выполненных с ней пассирований. Например, десятикратно пассированную культивируемую популяцию клеток можно описывать как культуру десятого пассирования (или культуру P10). Первичную культуру, то есть первую культуру после выделения клеток из ткани, обозначают P0. После первого пересева клетки описывают как вторичную культуру (P1, или культура первого пассажа). После второго пересева клетки превращаются в третичную культуру (P2, или культура второго пассажа) и т.д. Специалист в данной области определит, что за промежуток времени между последовательными пассированиями популяция клеток может удваиваться многократно, поэтому число удвоения популяций в культуре превышает номер пассажа. Степень размножения клеток (то есть число удвоения популяции) за промежуток времени между последовательными пассированиями зависит от многих факторов, включая, помимо прочего, плотность посева, носитель, среду, условия роста и периоды времени между пассированиями.
Обогащение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ дифференцирования популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, включающий в себя следующие стадии:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы;
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки;
d. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы; и
e. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, трансплантируют животному, при этом клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, дают начало инсулин-продуцирующим клеткам. В одном варианте осуществления эффективность образования инсулин-продуцирующих клеток повышается за счет обогащения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, до трансплантации.
В одном варианте осуществления эффективность образования инсулин-продуцирующих клеток определяют путем измерения времени, необходимого для экспрессии С-пептида на уровне обнаружения после трансплантации.
В альтернативном варианте осуществления обогащение снижает способность трансплантируемых клеток формировать тератомы после трансплантации.
Клетки, экспрессирующие маркеры, линии панкреатических эндокринных клеток выявляют или отбирают путем связывания антигенов, обнаруживаемых на поверхности клеток, с реагентами, которые специфически связываются с поверхностными клеточными антигенами.
В альтернативном варианте осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, дополнительно дифференцируют до трансплантации животному в инсулин-продуцирующие клетки. Инсулин-продуцирующие клетки выявляют или отбирают путем связывания антигенов, обнаруживаемых на поверхности клеток, с реагентами, которые специфически связываются с поверхностными клеточными антигенами.
В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ дифференцирования популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, включающий в себя следующие стадии:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы;
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки;
d. обогащение популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки;
e. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы; и
f. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, трансплантируют животному, при этом клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, дают начало инсулин-продуцирующим клеткам. В одном варианте осуществления эффективность образования инсулин-продуцирующих клеток повышается за счет обогащения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки, до трансплантации.
Клетки, экспрессирующие маркеры, линии первичной кишечной трубки выявляют или отбирают путем связывания антигенов, обнаруживаемых на поверхности клеток, с реагентами, которые специфически связываются с поверхностными клеточными антигенами.
Поверхностные антигены, способствующие обогащению клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
В одном варианте осуществления настоящего изобретения до трансплантации животному популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, обрабатывают по меньшей мере одним реагентом, который может связываться с маркером, выбранным из группы, состоящей из CD9, CD13, CD15, CD47, CD56, CD73, CD117, CD133, CD184, CD200, CD318, CD326 и SSEA4.
В одном варианте осуществления в результате обработки по меньшей мере одним реагентом получают популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, и являющихся положительными в отношении экспрессии маркера CD56 и отрицательными в отношении экспрессии маркера CD13.
В одном варианте осуществления в результате обработки по меньшей мере одним реагентом получают популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных линий, и являющихся положительными в отношении экспрессии маркера CD56 и отрицательными в отношении экспрессии маркера CD15.
В одном варианте осуществления в результате обработки по меньшей мере одним реагентом получают популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, и являющихся отрицательными в отношении экспрессии маркера CD133.
В одном варианте осуществления в результате обработки по меньшей мере одним реагентом получают популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, и являющихся отрицательными в отношении экспрессии маркера CD15.
В одном варианте осуществления в результате обработки по меньшей мере одним реагентом получают популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, и являющихся положительными в отношении экспрессии маркера CD184.
В одном варианте осуществления в результате обработки по меньшей мере одним реагентом получают популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, и являющихся отрицательными в отношении экспрессии маркера SSEA4.
Поверхностные антигены, способствующие обогащению инсулин-продуцирующих клеток
В одном варианте осуществления до трансплантации животному популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, дополнительно дифференцируют с образованием популяции инсулин-продуцирующих клеток. Популяцию инсулин-продуцирующих клеток обрабатывают по меньшей мере одним реагентом, который может связываться с маркером, выбираемым из группы, состоящей из CD47, CD56, CD57 CD98 и SSEA4.
В одном варианте осуществления в результате обработки по меньшей мере одним реагентом получают популяцию инсулин-продуцирующих клеток, являющихся положительными в отношении экспрессии маркеров CD56 и CD57. В альтернативном варианте осуществления популяция инсулин-продуцирующих клеток может быть положительной в отношении экспрессии CD98. В альтернативном варианте осуществления популяция инсулин-продуцирующих клеток может быть отрицательной в отношении экспрессии CD47.
В одном варианте осуществления в результате обработки по меньшей мере одним реагентом получают популяцию инсулин-продуцирующих клеток, являющихся отрицательными в отношении экспрессии маркера SSEA4.
CD13 экспрессирует большинство моноцитов и гранулоцитов периферической крови. Этот маркер также экспрессируется в большинстве случаев острого миелолейкоза, хронического миелолейкоза в миелоидный бластный криз, реже при лимфолейкозе, а также миелоидными клеточными линиями. CD13 также обнаруживают на нескольких типах негемопоэтических клеток, таких как фибробласты и эндотелиальные клетки, а также в растворимой форме в плазме крови. B-клетки, T-клетки, тромбоциты или эритроциты не экспрессируют CD13. CD13 играет роль в метаболизме биологически активных пептидов, в контроле роста и дифференцирования, в процессе фагоцитоза и бактерицидной/тумороцидной активности. CD13 также играет роль рецептора коронавирусов человека (HCV).
CD15 является углеводной молекулой клеточной адгезии, экспрессируемой в комплексе с гликопротеинами, гликолипидами и протеогликанами. CD15 опосредует фагоцитоз и хемотаксис, выявляется на поверхности нейтрофилов, экспрессируется у пациентов с болезнью Ходжкина, в ряде случаев хронических Β-клеточных лимфолейкозов, при остром лимфобластном лейкозе и при большинстве острых нелимфоцитарных лейкозов. Его также называют Lewis x и SSEA-1 (стадиеспецифический эмбриональный антиген 1). Он представляет собой маркер мышиных плюрипотентных стволовых клеток, в которых он играет важную роль в процессах адгезии и миграции клеток в составе эмбриона в стадии преимплантации.
CD47 является мембранным белком, отвечающим за повышение концентрации внутриклеточного кальция, которое происходит в результате присоединения клетки к внеклеточному матриксу. Этот белок также является рецептором С-концевого связывающего домена тромбоспондина и может играть роль в мембранном транспорте и при проведении сигнала внутрь клетки.
CD56, также известный под названием «молекула клеточной адгезии нервных клеток» (NCAM), является гомофильно связывающимся гликопротеином, экспрессируемым на поверхности нейронов, нейроглии, скелетной мускулатуры и естественных киллерных клеток. NCAM предположительно играет роль в межклеточной адгезии, росте нейритов, синаптической пластичности, процессах обучения и запоминания.
CD57 также известен под названием HNK-1 или Leu-7. Он является антигенным олигосахаридным фрагментом, выявляемым на внеклеточных белках определенных типов клеток. В крови CD57 обнаруживается на 15-20% мононуклеарных клеток, включая субпопуляции NK и T-клеток, но отсутствует на эритроцитах, моноцитах, гранулоцитах или тромбоцитах. Также экспрессия CD57 может быть выявлена в различных типах нервных клеток.
CD98 является гликопротеином, имеющим в составе легкую субъединицу транспортера больших нейтральных аминокислот (LAT1). LAT1 представляет собой гетеродимерный мембранный транспортный белок, предпочтительно транспортирующий нейтральные разветвленные (валин, лейцин, изолейцин) и ароматические (триптофан, тирозин) аминокислоты.
CD133 является гликопротеином, также известным под названием проминин 1 (PROM1) и встречающимся у человека и грызунов. Он является членом трансмембранных гликопротеинов пентаспанов (5-трансмембранный, 5-TM), которые специфически локализуются в клеточных протрузиях. CD133 экспрессируется в кроветворных стволовых клетках, эндотелиальных клетках-предшественниках, нейрональных и глиальных стволовых клетках. См. публикацию Corbeil et al., Biochem Biophys Res Commun 285 (4): 939-44, 2001. doi:10.1006/bbrc.2001.5271. PMID 11467842.
Поверхностные антигены, способствующие обогащению клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки
В альтернативном варианте осуществления предложен способ дифференцирования популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, включающий в себя следующие стадии:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы;
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки;
d. обогащение популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки;
e. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы; и
f. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, трансплантируют животному, при этом клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, дают начало инсулин-продуцирующим клеткам. В одном варианте осуществления эффективность образования инсулин-продуцирующих клеток повышается за счет обогащения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки, до трансплантации.
Популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки, обрабатывают по меньшей мере одним реагентом, который может связываться с LIF-рецептором.
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии первичной кишечной трубки, или инсулин-продуцирующие клетки можно обогащать, удалять, выделять, разделять, сортировать и (или) очищать, как это дополнительно проиллюстрировано примерами. Термин «обогащенный» или «очищенный», которые используются в настоящем документе, либо обогащенный или очищенный вследствие удаления других известных клеточных популяций, означают, что клетки подверглись определенному процессу отбора, так что популяция является обогащенной и (или) очищенной. Также клетки считаются относительно обогащенными и (или) очищенными, то есть в популяции есть значительно большее количество дифференцированных клеток определенной линии в сравнении с другой клеточной популяцией, в сравнении с плюрипотентными стволовыми клетками до «обогащения» или «очистки» или в сравнении с оригинальной или первоначальной клеточной культурой.
Обогащение или очистка определенного типа дифференцированных клеток может включать в себя «удаление», «разделение» или «сортировку» одного или более известных типов клеток от других типов клеток. В одном варианте осуществления популяцию клеток можно очищать путем удаления нежелательных типов дифференцированных клеток. Обогащение и очистка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем очистки культуры клеток от известных или неизвестных клеточных типов может иметь благоприятный эффект. Таким образом, обогащенная или очищенная популяция клеток не будет содержать связанного или присоединенного антитела. Поскольку при этом нет необходимости удалять антитело из очищенной популяции, можно оптимизировать использование обогащенных или очищенных клеток для клеточной терапии.
Способы обогащения, удаления, выделения, разделения, сортировки и (или) очистки могут включать в себя, например, выборочные условия культивирования, при этом условия культивирования неблагоприятны для любого из нежелательных типов клеток.
Способы обогащения, удаления, выделения, разделения, сортировки и (или) очистки могут также включать в себя, например, покрытые антителами магнитные бусы, аффинную хроматографию и пэннинг с антителом, присоединенным к твердому матриксу или твердой фазе, например, культуральному планшету, колонке, или другой удобный и доступный метод. Методы, обеспечивающие точное разделение клеток, включают в себя методы проточной цитометрии, которые применимы для анализа параметров клеточной поверхности и внутриклеточных параметров, для оценки изменений формы и степени гранулярности, а также для анализа бус, используемых в качестве реагентов, связанных с антителами или диагностическими пробами. Считываемые показатели анализов проточной цитометрии включают в себя, помимо прочего, средний показатель флуоресценции, ассоциированный с отдельными молекулами клеточной поверхности или цитокинами, определяемыми при связывании с флуоресцентными антителами, или усредненную интенсивность флуоресценции, среднюю интенсивность флуоресценции, вариативность интенсивности или некоторую взаимосвязь между этими параметрами.
В некоторых аспектах вариантов осуществления с аналитическими стадиями, включающими использование проточной цитометрии, минимальными параметрами или характеристиками бус являются рассеяние света (прямое и (или) боковое) и по меньшей мере один показатель флуоресценции. Проточную цитометрию можно использовать для количественной оценки параметров, таких как наличие поверхностных белков или их конформационная или посттрансляционная модификация, наличие внутриклеточных или секретируемых белков, когда пермеабилизация обеспечивает доступ для антитела (или пробы) и т.п. Методы проточной цитометрии известны специалистам в данной области и описаны в следующих публикациях: Flow Cytometry and Cell Storing (Springer Lab Manual), Radbruch, ред., Springer Verlag, 2000 г.; Ormerod, Flow Cytometry, Springer Verlag, 1999 г.; Flow Cytometry Protocols (Methods in Molecular Biology, № 91), под ред. Jaroszeski и Heller, Humana Press, 1998 г.; Current Protocols in Cytometry, под ред. Robinson et al., John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2000 г.
Интенсивность окрашивания клеток можно контролировать с помощью проточной цитометрии, когда лазерами определяют количественный уровень флуорохрома (он пропорционален количеству маркера клеточной поверхности, связавшегося со специфическими реагентами, например, антителами). Проточную цитометрию (FACS) можно также использовать для разделения клеточных популяций на основании интенсивности связывания со специфическим реагентом, а также на основании других параметров, таких как размер клеток и показатель рассеяния света. Хотя абсолютный уровень окрашивания может быть разным в зависимости от конкретного флуорохрома и реагента, данные могут быть нормализованы по отношению к контролю. Для нормализации распределения относительно контроля каждую клетку регистрируют как отдельную точку данных, которая имеет определенную интенсивность окрашивания.
Для нормализации распределения относительно контроля каждую клетку регистрируют как отдельную точку данных, которая имеет определенную интенсивность окрашивания. Эти точки данных могут отображаться по логарифмической шкале, в которой единицы измерения представляют собой условную интенсивность окрашивания. В одном примере наиболее яркие клетки в популяции определяют клетки, которые имеют большую на 4 логарифмических показателя интенсивность окрашивания, чем клетки, имеющие самый низкий уровень окрашивания. При отображении таким способом становится ясно, что клетки, имеющие самый большой логарифмический показатель интенсивности окрашивания, являются яркими, а те, которые имеют самую низкую интенсивность, являются отрицательно окрашенными. Клетки с «низким» окрашиванием, имеющие логарифмический показатель окрашивания, равный 2-3, могут иметь уникальные свойства в сравнении с клетками с отрицательным и положительным окрашиванием. В качестве альтернативного контроля можно использовать носитель, имеющий определенную плотность маркера на поверхности, например, бусы или клеточную линию, которые обеспечивают положительный контроль интенсивности. Обозначение «низкий» указывает на то, что уровень окрашивания выше яркости контрольных образцов, окрашенных контрольным антителом такого же изотипа, но меньше интенсивности окрашивания наиболее ярко окрашенных клеток, обычно выявляемых в популяции.
Показатели выбранных параметров возможно считывать одновременно или последовательно во время одного анализа, например, при использовании флуоресцентно меченных антител к молекулам клеточной поверхности. Например, антитела могут быть помечены разными флуорохромами, флуоресцентными бусами, метками, например, квантовыми точками и т.д., позволяющими выполнять одновременный анализ до 4 или более флуоресцентных окрасок с помощью проточной цитометрии. Например, клетки считаются отрицательно окрашенными, если уровень окрашивания находится на уровне или ниже яркости контрольных образцов, окрашенных контрольным антителом такого же изотипа. В то же время «тусклое» окрашивание указывает на уровень окрашивания, который приближается к отрицательному окрашиванию, но который может быть ярче уровня окрашивания контрольным антителом такого же изотипа.
Идентификаторы отдельных клеток, например, клеток различных типов или вариантов, могут быть флуоресцентными, например, могут представлять собой окрашивание флуоресцентным соединением различных типов клеток в разной степени интенсивности и т.п., как описано выше в настоящем документе. В некоторых аспектах вариантов осуществления при необходимости смешивания двух типов клеток один из типов метят, а второй оставляют немеченым. В некоторых аспектах вариантов осуществления при необходимости оперировать тремя или более типами клеток каждый из типов может быть мечен до различных уровней интенсивности флуоресценции путем инкубации с различными концентрациями окрашивающего соединения или путем инкубации с различной продолжительностью. В качестве идентификаторов большого количества клеток можно использовать матрицу интенсивности флуоресцентного окрашивания двумя или большим количеством флуоресцентных окрасок, так что количество разных выявляемых единиц типов клеток представляет собой ряд уровней флуоресценции одного цвета, например, сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина (CFSE), умноженное на число уровней флуоресценции второго используемого цвета, например, изотиоцианата тетраметилродамина (TRITC) и т.п., умноженное на число уровней третьей окраски и т.д. В альтернативном варианте внутренние характеристики рассеяния света, характерные для различных типов клеток, или характеристики BioMAPs тестовых параметров, включенных в анализ, можно использовать в дополнение или вместо флуоресцентных меток в качестве идентификаторов единиц клеточных типов.
В другом аспекте клетки могут быть обогащены, удалены, выделены, разделены, отсортированы и (или) очищены с использованием стандартных методик аффинного разделения или использования антител. Например, лиганд и (или) антитело могут быть конъюгированы с метками для упрощения разделения определенного типа клеток, например, с помощью магнитных бус; биотином, который связывает с высокой аффинностью с авидином или стрептавидином; флуорохромами, которые можно использовать в проточной цитометрии с сортировкой клеток; гаптенами и т.п.
В одном варианте осуществления лиганд, агент и (или) антитела, описанные в настоящем документе, могут быть напрямую или опосредованно конъюгированы с магнитным реагентом, таким как суперпарамагнитная микрочастица (микрочастица). Прямое конъюгирование к магнитной частице может быть достигнуто с помощью различных химических связывающих групп, что хорошо известно специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления антитело соединено с микрочастицами с помощью боковых цепей амино- или сульфгидрильных групп и гетерофункциональных поперечно-сшивающих реагентов.
В распоряжении имеется большое число гетерофункциональных соединений для сшивания частиц. Например, можно использовать по меньшей мере N-гидроксисукцинимидный эфир 3-(2-пиридилдитио)-пропионовой кислоты (SPDP) или N-гидроксисукцинимидный эфир 4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоновой кислоты (SMCC), которые взаимодействуют с реактивной сульфгидрильной группой антитела и реактивной аминогруппой на магнитной частице. Пример устройства для магнитного разделения описан в публикациях №№ WO 90/07380, PCT/US96/00953, а также в патенте № EP 438520, полностью включенных в настоящий документ путем ссылки.
Очищенные популяции клеток можно собирать в любую подходящую культуральную среду. Допустимые среды могут включать в себя, например, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (dMEM), основной солевой раствор Хэнка (HBSS), фосфатный буферный раствор Дульбекко (DPBS), среду RPMI, модифицированную по способу Искова среду Дульбекко (IMDM), фосфатный буферный раствор (PBS) с 5 мМ ЭДТК и т.д., часто с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), бычьего сывороточного альбумина (BSA), сывороточного альбумина человека (HSA), а также бессывороточную среду для культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток StemPro®hESC SFM.
В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, обогащают путем обработки по меньшей мере одним агентом, который выполняет отбор клеток, не экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. В альтернативном варианте осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, обогащают путем обработки по меньшей мере одним агентом, который выполняет разделение инсулин-продуцирующих клеток.
Используя описанные в настоящем документе способы, клеточные популяции или культуры клеток, можно обогащать клеточное содержание в по меньшей мере от приблизительно 2 до приблизительно 1000 раз в сравнении с необработанными клеточными популяциями или клеточными культурами. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, можно обогащать клеточным содержанием в по меньшей мере от приблизительно 5 до приблизительно 500 раз в сравнении с необработанными клеточными популяциями или клеточными культурами. В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, можно обогащать клеточным содержанием в по меньшей мере от приблизительно 10 до приблизительно 200 раз в сравнении с необработанными клеточными популяциями или клеточными культурами. В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, можно обогащать клеточным содержанием в по меньшей мере от приблизительно 20 до приблизительно 100 раз в сравнении с необработанными клеточными популяциями или клеточными культурами. В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, можно обогащать клеточным содержанием в по меньшей мере от приблизительно 40 до приблизительно 80 раз в сравнении с необработанными клеточными популяциями или клеточными культурами. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, можно обогащать клеточным содержанием в по меньшей мере от приблизительно 2 до приблизительно 20 раз, в сравнении с необработанными клеточными популяциями или клеточными культурами.
Характеризация клеток, являющихся производными от плюрипотентных стволовых клеток
Формирование дифференцированных клеток из плюрипотентных стволовых клеток можно выявлять путем обнаружения экспрессии маркеров, характерных для данного типа дифференцированных клеток. В некоторых вариантах осуществления выявление и характеризация дифференцированных клеток осуществляется путем оценки экспрессии определенного маркера или различных уровней экспрессии и особенностей экспрессии более чем одного маркера.
В частности, присутствие или отсутствие, высокий или низкий уровень экспрессии одного или более маркера(-ов) может характеризовать и идентифицировать клеточный тип. Также некоторые маркеры могут иметь транзиторный характер экспрессии, когда высокая экспрессия маркера характерна для определенной стадии развития, а низкая - для другой стадии развития. Экспрессию некоторых маркеров можно выявлять путем измерения уровня маркера в клетках клеточной культуры или клеточной популяции в сравнении со стандартизированным или нормализованным контрольным маркером. Во время этого анализа оценка экспрессии маркера может быть качественной или количественной. Одним из способов количественной оценки экспрессии маркеров, продуцируемых генами, кодирующими маркер, является количественная ПЦР (К-ПЦР). Способ проведения К-ПЦР хорошо известен специалистам в данной области. Другие способы, тоже известные специалистам в данной области, также можно использовать для количественной оценки экспрессии генов. Например, экспрессию продукта маркерного гена можно определять с использованием антител, специфически распознающих данный продукт (например, с помощью Вестерн-блоттинга, проточно-цитометрического анализа и т.п.). В некоторых вариантах осуществления можно определять экспрессию маркерных генов, характерных для дифференцированных клеток. Кроме того, можно определять отсутствие значительной экспрессии таких генов.
Экспрессию тканеспецифичных генных продуктов также можно определять на уровне мРНК методом Нозерн-блоттинга, дот-блот гибридизации или инициированной обратной транскриптазой полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием специфичных для первичной нуклеотидной последовательности праймеров в стандартной реакции амплификации. Для получения дополнительной более подробной информации см. патент США № 5843780. Данные в отношении первичной последовательности отдельных маркеров, указанных в настоящем документе, могут быть получены из общедоступных баз данных, таких как GenBank.
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадиеспецифических эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначаемыми как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998 г.). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при наличии) и повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных плюрипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которую можно обнаружить путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, г. Берлингейм, штат Калифорния). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ОТ-ПЦР.
Маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, выбирают из группы, состоящей из PDX1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HB9 и PROX1. Для целей настоящего изобретения пригодны клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатической энтодермы. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, представляет собой клетку панкреатической энтодермы.
Маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, выбирают из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобного гомеобоксного белка, FGF4, CD48, эомезодермина (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CD184, C-Kit, CD99 и OTX2. Для целей настоящего изобретения пригодны клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии дефинитивной энтодермы. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку-предшественника первичной полоски. В альтернативном аспекте клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой мезэнтодермальную клетку. В альтернативном аспекте клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку дефинитивной энтодермы.
Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, выбирают из группы, состоящей из NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 и PTF-1 альфа. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка может экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Соответствующей целям настоящего изобретения является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, экспрессирующую гормоны. В альтернативном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, секретирующую гормоны.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку, экспрессирующую маркеры, характерные для β-клеточной линии дифференцирования. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для β-клеточной линии дифференцирования, экспрессирует PDX1, а также по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 бета, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для β-клеточной линии дифференцирования, представляет собой β-клетку.
Плюрипотентные стволовые клетки
Характеризация плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадиеспецифических эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначаемыми как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998 г.). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81 (при наличии) и повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных плюрипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которую можно обнаружить путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, г. Берлингейм, штат Калифорния). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют Oct-4 и TERT, обнаруживаемые ОТ-ПЦР.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных клеток является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в энтодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксации образующихся тератом с использованием 4% параформальдегида и их гистологического исследования на предмет наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентность можно определить по образованию эмбриоидных тел и их анализа на предмет присутствия маркеров, которые ассоциируются с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», то есть эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
К типам плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся стабильные линии плюрипотентных клеток, получаемых из ткани, которая образуется после беременности, в том числе из преэмбриональной ткани (такой как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в период беременности, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Неограничивающими примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека или эмбриональных зародышевых клеток человека, например, линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке композиций во время первоначального установления или стабилизации таких клеток. В этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей-источников. Также пригодны для целей настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, ранее культивируемых в отсутствие питающих клеток, или из популяции плюрипотентных стволовых клеток, ранее культивируемых в присутствии питающих клеток. Также пригодны для целей настоящего изобретения линии мутантных эмбриональных стволовых клеток человека, такие как BG01v (BresaGen, г. Афины, штат Джорджия). Также пригодны для целей настоящего изобретения клетки, полученные из соматических клеток взрослого человека, например, клетки, описанные в публикации Takahashi et al., Cell 131: 1-12 (2007 г.).
В одном варианте осуществления эмбриональные стволовые клетки человека готовят, как описано в публикации Thomson et al. (патент США № 5843780, Science 282:1145, 1998 г.; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998 г.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:7844, 1995 г.).
Также предполагается, что плюрипотентные стволовые клетки происходят от соматических клеток. В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки, допустимые для использования в целях настоящего изобретения, могут быть получены в соответствии со способами, описанными Takahashi et al. (Cell 126: 663-676, 2006 г.).
В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки, допустимые для использования в целях настоящего изобретения, могут быть получены в соответствии со способами, описанными Li et al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009 г.).
В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки, допустимые для использования в целях настоящего изобретения, могут быть получены в соответствии со способами, описанными Maherali et al. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007 г.).
В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки, допустимые для использования в целях настоящего изобретения, могут быть получены в соответствии со способами, описанными Stadtfeld et al. (Cell Stem Cell 2: 230-240).
В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки, допустимые для использования в целях настоящего изобретения, могут быть получены в соответствии со способами, описанными Nakagawa et al. (Nature Biotechnology 26: 101-106, 2008 г.).
В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки, допустимые для использования в целях настоящего изобретения, могут быть получены в соответствии со способами, описанными Takahashi et al. (Cell 131: 861-872, 2007 г.).
В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки, допустимые для использования в целях настоящего изобретения, могут быть получены в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 61/256149, принадлежащей Centocor R&D, Inc.
Культивирование плюрипотентных стволовых клеток
В одном варианте осуществления перед культивированием в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, плюрипотентные стволовые клетки культивируют на слое питающих клеток или белка внеклеточного матрикса, которые различным образом поддерживают плюрипотентные стволовые клетки. Например, плюрипотентные стволовые клетки культивируют на слое питающих клеток, который поддерживает пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток без их существенного дифференцирования. Рост плюрипотентных стволовых клеток на слое питающих клеток без дифференцирования поддерживают путем использования (i) культурального сосуда с имеющимся слоем питающих клеток; и (ii) среды, кондиционированной путем предварительного культивирования клеток иного типа, или некондиционированной среды, например, не содержащей сыворотки среды или даже среды с химически определенным составом.
В другом примере плюрипотентные стволовые клетки культивируют в культуральной системе, по существу свободной от питающих клеток, но, тем не менее, способной поддерживать пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток без существенного дифференцирования. Рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживают путем использования (i) адсорбированного слоя на твердом носителе, содержащего один или более белков внеклеточного матрикса; и (ii) среды, кондиционированной путем предварительного культивирования клеток иного типа, или некондиционированной среды, например, не содержащей сыворотки среды или даже среды с химически определенным составом.
В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки культивируют на поверхностно-модифицированном планшете, содержащем от по меньшей мере приблизительно 0,5% N, с суммарным содержанием O и N не ниже 17,2% и с углом смачивания по меньшей мере приблизительно 13,9 градуса, в среде, кондиционированной путем предварительного культивирования клеток иного типа, или некондиционированной среде, например, не содержащей сыворотки среде или даже среде с химически определенным составом.
Культуральная среда. Пример соответствующей целям настоящего изобретения клеточной культуральной среды приведен в публикации № US20020072117. Другой пример клеточной культуральной среды, соответствующей целям настоящего изобретения, приведен в публикации № US6642048. Другой пример клеточной культуральной среды, соответствующей целям настоящего изобретения, приведен в публикации № WO2005014799. Другой пример клеточной культуральной среды, соответствующей целям настоящего изобретения, приведен в публикации Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004 г.). Другой пример клеточной культуральной среды, соответствующей целям настоящего изобретения, приведен в публикации № US20070010011. Другой пример клеточной культуральной среды, соответствующей целям настоящего изобретения, приведен в публикации Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870; 19 октября 2005 г.). Другой пример клеточной культуральной среды, соответствующей целям настоящего изобретения, приведен в работе Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006 г.). Другой пример клеточной культуральной среды, соответствующей целям настоящего изобретения, приведен в публикации № US20050148070. Другой пример клеточной культуральной среды, соответствующей целям настоящего изобретения, приведен в публикации № US20050233446. Другой пример клеточной культуральной среды, соответствующей целям настоящего изобретения, приведен в публикации № US6800480. Другой пример клеточной культуральной среды, соответствующей целям настоящего изобретения, приведен в публикации № US20050244962. Другой пример клеточной культуральной среды, соответствующей целям настоящего изобретения, приведен в публикации № WO2005065354. Другой пример клеточной культуральной среды, соответствующей целям настоящего изобретения, приведен в публикации № WO2005086845.
Допустимая культуральная среда также может быть приготовлена из указанных ниже компонентов, таких как, например, модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаут-среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко (KO DMEM), Gibco № 10829-018, основная среда Хэма F12/50% DMEM, 200 мM L-глутамина, Gibco № 15039-027, раствор неосновных аминокислот, Gibco № 11140-050, β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522, человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.
Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки размножаются в культуре, после чего их обрабатывают таким образом, чтобы индуцировать их дифференцирование в клетки иного типа. Например, плюрипотентные стволовые клетки, сформированные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в нервные клетки-предшественники или кардиомиоциты в соответствии со способами, описанными в публикации № WO2007030870.
В другом примере плюрипотентные стволовые клетки, сформированные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в гепатоциты в соответствии со способами, описанными в патенте США № 6458589.
Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток, сформированных способами, составляющими предмет настоящего изобретения, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы
Плюрипотентные стволовые клетки, сформированные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, любым известным специалистам способом.
Например, плюрипотентные стволовые клетки, сформированные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, как описано в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005 г.).
Например, плюрипотентные стволовые клетки, сформированные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации Shinozaki et al, Development 131, 1651-1662 (2004 г.).
Например, плюрипотентные стволовые клетки, сформированные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации McLean et al, Stem Cells 25, 29-38 (2007 г.).
Например, плюрипотентные стволовые клетки, сформированные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006 г.).
В другом примере плюрипотентные стволовые клетки, сформированные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, раскрытыми в заявке на патент США № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
В другом примере плюрипотентные стволовые клетки, сформированные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, раскрытыми в заявке на патент США № 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.
В другом примере плюрипотентные стволовые клетки, сформированные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, раскрытыми в заявке на патент США № 12/493741, принадлежащей LifeScan, Inc.
В другом примере плюрипотентные стволовые клетки, сформированные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, раскрытыми в заявке на патент США № 12/494789, принадлежащей LifeScan, Inc.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, может быть выявлено путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют такие маркеры. Таким образом, дифференцирование плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.
Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток, сформированных способами, составляющими предмет настоящего изобретения, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы
Плюрипотентные стволовые клетки, сформированные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, любым известным специалистам способом.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, способами, описанными в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006 г.).
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, фактором роста фибробластов и ингибитором сигнального пути Hedgehog KAAD-циклопамином с последующим удалением среды, содержащей фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин, и последующим культивированием клеток в среде, содержащей ретиноевую кислоту, фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин. Пример использования данного способа приведен в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006 г.).
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, ретиноевой кислотой и одним фактором роста фибробластов в течение периода времени, соответствующего способам, описанным в заявке на патент США № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, ретиноевой кислотой (Sigma-Aldrich, штат Миссури) и экзендином 4 и последующего удаления среды, содержащей DAPT (Sigma-Aldrich, штат Миссури) и экзендин 4 с дальнейшим культивированием клеток в среде, содержащей экзендин 1, IGF-1 и HGF. Пример использования данного способа приведен в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006 г.).
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, средой, содержащей экзендин 4, а затем удаления среды, содержащей экзендин 4, с последующим культивированием клеток в среде, содержащей экзендин 1, IGF-1 и HGF. Пример использования данного способа приведен в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2006 г.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, средой, содержащей DAPT (Sigma-Aldrich, штат Миссури) и экзендин 4. Пример использования данного способа приведен в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2006 г.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, средой, содержащей экзендин 4. Пример использования данного способа приведен в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2006 г.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США № 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США № 60/953178, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США № 60/990529, принадлежащей LifeScan, Inc.
Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток, сформированных способами, составляющими предмет настоящего изобретения, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
Плюрипотентные стволовые клетки, сформированные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, сформированной любым известным специалистам способом.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, средой, содержащей экзендин 4, а затем удаления среды, содержащей экзендин 4, с последующим культивированием клеток в среде, содержащей экзендин 1, IGF-1 и HGF. Пример использования данного способа приведен в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2006 г.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, средой, содержащей DAPT (Sigma-Aldrich, штат Миссури) и экзендин 4. Пример использования данного способа приведен в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2006 г.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, средой, содержащей экзендин 4. Пример использования данного способа приведен в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology, 2006 г.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США № 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США № 60/953178, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, дополнительно дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США № 60/990529, принадлежащей LifeScan, Inc.
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется, помимо прочего, следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 в панкреатические эндокринные клетки в отсутствие эмбриональной бычьей сыворотки
Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 при различных пассажах (от 40 до 52) культивировали на планшетах, покрытых препаратом MATRIGEL (разведение 1:30) и дифференцировали в клетки панкреатической линии дифференцирования по следующему многостадийному протоколу:
а. стадия I (дефинитивная энтодерма): человеческие эмбриональные стволовые клетки культивировали в среде RPMI с добавлением 2% обезжиренного BSA (№ по каталогу 68700, Proliant, г. Лос-Анджелес) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, штат Миннесота) с добавлением 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, штат Миннесота) и 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 100-18B, PeproTech, штат Нью-Джерси) в течение одного дня. Затем клетки обработали средой RPMI с добавлением 2% BSA и 100 нг/мл активина A и 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней, затем
b. стадия II (первичная кишечная трубка): клетки обрабатывали RPMI + 2% обезжиренного BSA и 50 нг/мл FGF7 и 0,25 мкМ SANT-1 (№ по каталогу S4572, Sigma, штат Миссури) в течение двух-трех дней, затем
c. стадия III (задняя часть передней кишки): клетки обрабатывали средой DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением ITS-X в разведении 1:200 (Invitrogen, штат Калифорния) и 0,1% BSA (LipidRich) (Invitrogen, № по каталогу 11021-045), 50 нг/мл FGF7, 0,25 мкМ SANT-1, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, штат Миссури), 100 нг/мл Noggin (R&D Systems, штат Миннесота) и активина A в концентрации 20 нг/мл в течение четырех дней; в некоторых вариантах Noggin заменяли ингибитором AMPK 6-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси)фенил]-3-пиридин-4-илпиразоло[1,5-а]пиримидина (Sigma, № P5499) в концентрации 2 мкМ. В других вариантах ингибитор P38 (4-[4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-пиридин-4-ил-1H-имидазол-2-ил]бут-3-ин-1-ол) (описанный в патенте США № 6521655) добавили в концентрации 2,5 мкМ, затем
d. стадия IV (панкреатический эндокринный предшественник): клетки обрабатывали средой DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением ITS-X в разведении 1:200 (Invitrogen, штат Калифорния) и 0,1% BSA (Invitrogen, штат Калифорния), 100 нг/мл Noggin, 1 мкМ ингибитора ALK5 (SD-208, описан в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161) в течение трех дней, затем
e. стадия V (панкреатические эндокринные клетки): клетки обрабатывали средой DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением ITS-X в разведении 1:200 (Invitrogen, Калифорния) и 0,1% BSA (Invitrogen, штат Калифорния), 1 мкМ ингибитора II ALK5 (№ по каталогу 616452, Calbiochem, штат Калифорния) в течение семи дней, затем
f. стадия VI (зрелые панкреатические эндокринные клетки): клетки обрабатывали средой DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением ITS-X в разведении 1:200 (Invitrogen, штат Калифорния) и 0,1% BSA (Invitrogen, штат Калифорния) в течение семи дней со сменой культуральной среды через день.
Пример 2
Проточно-цитометрическая характеризация и сортировка различных обогащенных линий панкреатических клеток
Для облегчения выделения и характеризации новых клеточных популяций, получаемых на различных стадиях процесса дифференцирования, описанного в примере 1, клетки, получаемые на разных стадиях, детально охарактеризовали с помощью проточной цитометрии. Полный список используемых антител и уровней экспрессии маркеров клеточной поверхности на разных стадиях дифференцирования показаны в таблице I.
Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 при различных пассажах (от 40 до 52) культивировали на планшетах, покрытых препаратом MATRIGEL, и дифференцировали в панкреатические эндокринные клетки по протоколу, описанному в примере 1.
Клетки на различных стадиях созревания (задняя часть передней кишки (стадия III), эндокринные клетки-предшественники (стадия IV), панкреатические эндокринные клетки (стадия V) или зрелые панкреатические эндокринные клетки (стадия VI)) осторожно высвобождали инкубацией в TrypLE Express (Invitrogen, № по каталогу 12604, штат Калифорния) в течение 2-3 минут при 37°C и дважды промывали в буферном растворе для окрашивания BD FACS, содержащем 2% BSA (BD № по каталогу 554657, штат Калифорния). Приблизительно 0,5-1×106 клеток ресуспендировали в 100-200 мкл блокирующего буферного раствора (0,5% человеческого гамма-глобулина, разведенного 1:4 в буферном растворе для окрашивания (BD, штат Калифорния) для окрашивания. Для окрашивания напрямую конъюгированными первичными антителами соответствующее антитело добавляли к клеткам в конечном разведении 1:20 и инкубировали клетки в течение 30 минут при 4°C. При использовании неконъюгированных антител первичные антитела добавляли к клеткам в разведении 1:50-1:100 и инкубировали клетки в течение 30 минут при 4°C, после чего дважды промывали в буферном растворе для окрашивания. Затем клетки инкубировали с соответствующими вторичными антителами в разведении 1:500. Окрашенные клетки ресуспендировали в 300 мкл буферного раствора для окрашивания и добавляли 5-10 мкл 7AAD, чтобы отличить живые клетки от мертвых, прежде чем провести анализ с использованием проточного цитометра BD FACS Canto II.
Для сортировки клеток приблизительно 30-40 миллионов клеток обрабатывали так же, как и для выполнения проточно-цитометрического анализа. Клетки окрашивали соответствующими антителами, как указано в таблице II. Клетки сортировали на две или три субпопуляции, как указано в таблице II. Цитометрические параметры для сортировки клеток определяли на основании анализа клеток, окрашенных соответствующими контрольными антителами того же изотипа. Образец отсортированных клеток анализировали для оценки чистоты популяции с последующим ПЦР-анализом экспрессии основных панкреатических маркеров. РНК выделяли с помощью набора Rneasy Mini Kit (Qiagen, штат Калифорния) и осуществляли ее забор из несортированного образца и различных фракций.
Маркеры клеточной поверхности, использованные для сортировки, были отобраны на основании результатов оценки экспрессии различных маркеров в популяциях клеток, проанализированных на разных стадиях протокола клеточного дифференцирования, описанного в примере 1. Маркеры, использованные в настоящем исследовании, описаны в таблице II. Коротко говоря, маркеры клеточной поверхности, описанные в таблице II, использовали для сортировки различных популяций клеток либо по отдельности, либо в комбинации. Образцы отсортированных клеток были отобраны для анализа экспрессии маркеров, характерных для панкреатической эндокринной линии дифференцирования с помощью реакции ПЦР в реальном времени.
Сортировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
Антитела к CD56 и CD13 использовали для сортировки популяции клеток, полученных на стадии IV протокола дифференцирования, описанного в примере 1. Были идентифицированы три популяции клеток: a) CD56+CD13-, b) CD56-CD13- и c) CD56-CD13+. После сортировки популяцию CD56+CD13- обогатили приблизительно в 1,3 раза. Отсортированные клетки были значительно обогащены в отношении экспрессии маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток, включая NEUROD, NGN3, PDX1, NKX6.1, NKX2.2 и PAX-4, в сравнении с несортированными клетками на стадии IV, или популяциями клеток CD56-CD13-, или популяциями клеток CD56-CD13+. См. фиг. 1, панели a-f.
Во второй серии экспериментов антитела к CD133 использовали для сортировки популяции клеток, полученных на стадии IV протокола дифференцирования, описанного в примере 1. Были идентифицированы две популяции клеток: a) CD133+ и b) CD133-. После сортировки популяцию CD133- обогатили приблизительно в 1,9 раз. Отсортированные клетки были значительно обогащены в отношении экспрессии маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток, включая NEUROD, NGN3, PDX1, NKX6.1, NKX2.2 и PAX-4, в сравнении с несортированными клетками на стадии IV, или популяциями клеток CD133+. См. фиг. 2, панели a-f.
В третьей серии экспериментов антитела к CD49c использовали для сортировки популяции клеток, полученных на стадии IV протокола дифференцирования, описанного в примере 1. Были идентифицированы две популяции клеток: a) CD49cHI и b) CD49cLO. После сортировки клетки CD49cLO обогатили приблизительно в 3,1 раза. Отсортированные клетки были значительно обогащены в отношении экспрессии маркеров, характерных для панкреатической эндокринной линии дифференцирования, включая NEUROD, NGN3, PDX1 и NKX6.1, в сравнении с несортированными клетками или клетками CD49cHI. См. фиг. 3, панели a-d.
В четвертой серии экспериментов антитела к CD56 и CD15 использовали для сортировки популяции клеток, полученных на стадии IV протокола дифференцирования, описанного в примере 1. Были идентифицированы следующие популяции: а) CD56+CD15LO, b) CD56+CD15HI, c) CD15+ и d) CD15-. После сортировки популяции клеток CD15- обогатили приблизительно в 1,1 раза. Популяции клеток CD56+CD15LO были значительно обогащены в отношении экспрессии маркеров, характерных для панкреатической эндокринной линии дифференцирования, включая NEUROD, NGN3, PDX1 и NKX6.1, инсулин и глюкагон, в сравнении с несортированными клетками или популяциями клеток CD56+CD15HI. См. фиг. 4, панели a-f. Аналогичным образом, популяции клеток CD15-, отсортированных с помощью единственного маркера, были значительно обогащены в отношении экспрессии маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток, включая NEUROD, NGN3, PDX1, NKX6.1, NKX2.2, PAX-4, глюкагон и инсулин, в сравнении с несортированными клетками или популяциями клеток CD15+. См. фиг. 5, панели a-h.
В пятой серии экспериментов антитела к CD56 и CD57 использовали для сортировки популяции клеток, полученных на стадии IV протокола дифференцирования, описанного в примере 1. Были идентифицированы две популяции клеток: a) CD56+CD57+ и b) CD56+CD57-. После сортировки популяции клеток CD56+CD57+ обогатили приблизительно в 1,9 раза. Клетки CD56+CD57+ были значительно обогащены в отношении экспрессии маркеров, характерных для линии панкреатической энтодермы, включая NEUROD, NGN3, PDX1, NKX6.1, NKX2.2, а также инсулин и глюкагон, в сравнении с несортированными клетками или популяциями клеток CD56+CD57-. См. фиг. 6, панель a-g. Аналогичные результаты наблюдали, когда популяции клеток, полученных на стадии V протокола дифференцирования, описанного в примере 1, сортировали с помощью антител к CD56 и CD57.
В шестой серии экспериментов антитела к CD56 и CD184 использовали для сортировки популяции клеток, полученных на стадии IV протокола дифференцирования, описанного в примере 1. Были идентифицированы три популяции клеток: a) CD184+, b) CD184- и c) CD56+CD184-. В таблице IV представлены результаты анализа экспрессии CD184 в клетках до и после обогащения. Популяции клеток CD184+ были обогащены в отношении экспрессии маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток, включая PAX4, NEUROD, NKX6.1, PDX1 и PTF1 альфа. Экспрессия ZIC1, альбумина и CDX2 была снижена. См. фиг. 7, панели a-i.
Сортировка инсулин-продуцирующих клеток
Антитела к CD98 использовали для сортировки популяции клеток, полученных на стадии VI протокола дифференцирования, описанного в примере 1. Были идентифицированы две популяции клеток: a) CD98+(Hi)и b) CD98-(Lo). После сортировки популяции клеток CD98+(Hi) обогатили приблизительно в 1,6 раза. Клетки CD98+(Hi) были обогащены в отношении экспрессии NEUROD, NGN3, инсулина и глюкагона. См. фиг. 8, панели a-d.
В другой серии экспериментов антитела к CD47 использовали для сортировки популяции клеток, полученных на стадии V протокола дифференцирования, описанного в примере 1. Были идентифицированы две популяции клеток: a) CD47Hi(+) и b) CD47Lo(-). После сортировки популяции клеток CD47Lo(-) обогатили приблизительно в 3,3 раза. Клетки CD47Lo(-) были обогащены в отношении экспрессии NEUROD, NGN3, PDX1, NKX6.1, NKX2.2 и PAX4. См. фиг. 9, панели a-f.
В другой серии экспериментов антитела к CD47 использовали для сортировки популяции клеток, полученных на стадии VI протокола дифференцирования, описанного в примере 1. Были идентифицированы две популяции клеток: a) CD47Hi(+) и b) CD47Lo(-). Клетки CD47Lo(-) были обогащены в отношении экспрессии PDX-1, NKX6.1, NKX2.2, PAX-4, PTF1a, NGN3, инсулина и глюкагона. См. фиг. 10, панели a-h.
Пример 3
Сортировка клеток, экспрессирующих Lif-рецептор на стадии первичной кишечной трубки (стадия 2)
Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1, пассаж 44, культивировали на планшетах, покрытых препаратом MATRIGEL, и дифференцировали в инсулин-продуцирующие клетки по следующему протоколу:
а. среда RPMI с добавлением 2% обезжиренного BSA (№ по каталогу 68700, Proliant, штат Айова), 100 нг/мл активина A (R&D Systems, штат Миннесота), 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, штат Миннесота) и 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 100-18B, PeproTech, штат Нью-Джерси) в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% BSA и 100 нг/мл активина A с добавлением 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем
b. RPMI + 2% BSA+50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкМ SANT-1 (№ по каталогу S4572, Sigma, штат Миссури) в течение трех дней (стадия 2), затем
c. DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением ITS-X в разведении 1:200 (Invitrogen, штат Калифорния) + 0,1% BSA (Invitrogen, штат Калифорния), 50 нг/мл FGF7 (Peprotech, штат Нью-Джерси) + 0,25 мкМ SANT-1 + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, штат Миссури) + 100 нг/мл Noggin (R&D Systems, штат Миннесота) и 20 нг/мл активина A в течение четырех дней (стадия 3), затем
d. DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением ITS-X в разведении 1:200 (Invitrogen, штат Калифорния) + 0,1% BSA (Invitrogen, штат Калифорния) + 100 нг/мл Noggin + 1 мкМ ингибитора ALK5 (SCIO120) в течение трех дней (стадия 4).
Клетки на стадии 2 диспергировали на отдельные клетки с помощью TrypLE Express (Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния) и промывали на стадии 4 основной средой (DM-Hg + ITS-X + BSA). Высвободившиеся клетки осаждали и полученный клеточный осадок суспендировали в буферном растворе для окрашивания, состоящем из 2% BSA, 0,05% азида натрия в PBS (Sigma, штат Миссури). В зависимости от ситуации, на клетках в течение 15 минут блокировали Fc-рецептор путем инкубации с 0,1%-ным раствором γ-глобулина (Sigma). Образцы (приблизительно 105 клеток) инкубировали с моноклональными антителами к Lif-рецептору, конъюгированными с фикоэритрином (PE) (R&D Systems, штат Миннесота) (5 мкл антитела на 106 клеток). Для контроля использовали неокрашенные клетки и клетки, окрашенные контрольными антителами с тем же изотипом. Инкубацию с любыми антителами проводили в течение 30 минут при 4°C, после чего клетки отмывали буферным раствором для окрашивания. Окрашенные клетки сортировали с помощью FACS Aria (BD, штат Калифорния). РНК (Rneasy Mini Kit, Qiagen, штат Калифорния) получали из образцов клеток до сортировки, фракции Lif-рецептор+ и Lif-рецептор-. Уровень и характер экспрессии Lif-рецептора представлены в таблице III.
В таблице III представлены данные, характеризующие экспрессию Lif-рецептора на 2-й и 3-й дни стадии 2. На 3-й день стадии 2 приблизительно 70% клеток экспрессируют Lif-рецептор. Как показано в таблице III, высокий уровень экспрессии Lif-рецептора был отмечен только на стадии 2, так как клетки на стадии 3 и 4 демонстрировали минимальную экспрессию Lif-рецептора. Как показано на фиг. 11 (панели a-b), клетки на стадии 2, обогащенные по уровню экспрессии Lif-рецептора, демонстрируют значительное усиление экспрессии HNF4 альфа по сравнению с несортированными клетками или клетками, не экспрессирующими Lif-рецептор. Экспрессия мРНК Lif-рецептора, которую оценивают по ПЦР в реальном времени, также была усилена в клеточной фракции, содержащей клетки, экспрессирующие Lif-рецептор.
Пример 4
Сортировка клеток с помощью магнитных бус, основанная на удалении клеток SSEA-4+, для снижения частоты образования опухолей in vivo
Экспрессия антигена SSEA4 является основным показателем плюрипотентности человеческих эмбриональных стволовых клеток, при этом экспрессия этого маркера значительно снижается в процессе клеточного дифференцирования. Тем не менее, остаточные SSEA-4-положительные клетки могут нести ответственность за образование опухолей и (или) тератом, которое наблюдается после трансплантации частично дифференцированных клеток. Для снижения частоты образования тератом были разработаны способы удаления загрязняющих клеток SSEA4+ из популяции дифференцированных клеток до трансплантации.
Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (пассаж 40-52) дифференцировали до различных стадий протокола дифференцирования, описанного в примере 1. Чтобы оценить правильность концепции и эффективность извлечения клеток, экспрессирующих SSEA-4, сначала было проведено исследование с клетками, дифференцированными только до стадии первичной кишечной трубки (стадия 2 протокола дифференцирования, описанного в примере 1), чтобы гарантировать высокий уровень экспрессии SSEA-4. В последующих экспериментах клетки, экспрессирующие SSEA-4, извлекали из популяций клеток, дифференцированных до стадии 4 протокола дифференцирования, описанного в примере 1. См. таблицу V, в которой представлены полученные результаты. Клетки осторожно высвобождали в суспензии, инкубируя в TrypLE Express (Invitrogen, № по каталогу 12604, штат Калифорния) в течение 2-3 минут при 37°C. Для улучшения выживаемости и жизнеспособности клеток во время извлечения к клеткам до забора и во все буферные растворы, используемые для изоляции, добавляли агенты, противодействующие процессу апоптоза, включая 10 мкМ Y-27632 (№ по каталогу Y 0503, Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури) или 0,5 мкМ тиазовивина (№ по каталогу 04-0017, Stemgent, г. Сан-Диего, штат Калифорния).
Клетки промывали буферным раствором для выделения, состоящим из фосфатного буферного раствора (PBS), не содержащего Ca2+ и Mg2+, с добавлением 0,1% BSA и 2 мM ЭДТК. От 10 до 100×106 клеток ресуспендировали в буферном растворе для выделения, так что окончательная плотность клеток составила 5×106 клеток на 500 мкл. В 500 мкл клеток добавили двадцать пять мкл антитела к SSEA-4 и клетки инкубировали в течение 15-20 минут при комнатной температуре с осторожным покачиванием для обеспечения непрерывности перемешивания. Клетки промывали в буферном растворе для выделения, центрифугируя при 300×g в течение 8 минут. Супернатант удаляли и клетки ресуспендировали в исходном объеме буферного раствора, затем к каждым 500 мкл клеточной суспензии добавляли 50 мкл предварительно промытых бус для извлечения SSEA-4 (DynaBeads® SSEA-4, Invitrogen, № по каталогу 11160D). Клетки и бусы перемешивали и инкубировали в течение 15-20 минут при комнатной температуре с непрерывной ротацией в наклонном положении. Клетки перемешивали осторожным пипетированием и помещали на магнит на 5 минут. Супернатант, содержащий SSEA-4-отрицательные клетки, переносили в новую пробирку, и процесс повторяли 2-3 раза для удаления остаточных бус. Связанные с бусами клетки SSEA4+ высвобождали из магнитного поля и обе клеточные популяции подсчитывали и использовали во время проточно-цитометрического и ПЦР-анализа. Данные, характеризующие уровень экспрессии SSEA4 в недифференцированных клетках H1, клетках первичной кишечной трубки и клетках на стадии IV, как в сортированной, так и в несортированной клеточных фракциях, представлены в таблице V.
В популяциях клеток, выделенных на стадии II протокола дифференцирования, охарактеризованного в примере 1, 20,5% клеток экспрессировали маркеры SSEA4 до сортировки. В противоположность этому только 1,8% клеток экспрессировали SSEA4 после сортировки (таблица V). Процедура извлечения привела к удалению 91,2% SSEA-4-положительных клеток. В другом эксперименте, в котором используются эндокринные клетки-предшественники, 25,3% клеток экспрессировали SSEA-4 до извлечения, но только 0,9% экспрессировали SSEA-4 после извлечения, что означало удаление 95,5% SSEA-4-положительных клеток (таблица V). В отличие от дифференцированных клеток, 91,2% популяции недифференцированных эмбриональных стволовых клеток экспрессировали SSEA4.
Сортированные SSEA4+ клетки были значительно обогащены в отношении экспрессии маркеров плюрипотентности, включая OCT4, NANOG, SOX2 и goosecoid (фиг. 12, панели a-d).
Пример 5
Сортировка клеток SSEA4 +(HI) и SSEA4 -(LO) проточной цитометрией
Для изучения и подтверждения возможности извлечения клеток, обогащенных по экспрессии маркера плюрипотентности (SSEA-4+), из популяции дифференцированных клеток методом проточной цитометрией клетки дифференцировали до стадии VI, как описано в примере 1. Клетки высвобождали из культуры с помощью буферного раствора для диссоциации клеток TrypLE Express и приготавливали для сортировки, как описано в примере 2. Антитело к SSEA-4 (R&D Systems, г. Миннеаполис, штат Миннесота, № по каталогу FAB1435P) использовали для выделения двух клеточных фракций, идентифицированных как клетки SSEA-4(+)Hi и SSEA-4(-)Lo. Выделенные клеточные фракции анализировали на предмет экспрессии маркеров плюрипотентности с помощью ОТ-ПЦР, как описано в примере 4. Аналогично фракциям, извлеченным и обогащенным SSEA-4, которые были получены при разделении магнитными бусами, как описано в примере 5, сортированные клетки SSEA-4(+)Hi были значительно обогащены для экспрессии маркеров плюрипотентности OCT4, NANOG, SOX2 и goosecoid, в отличие от клеток SSEA-4(-)Lo. См. фиг. 13, панели a-d.
Пример 6
Трансплантация популяций клеток после извлечения клеток, экспрессирующих SSEA-4, in vivo
В пробных экспериментах клетки после извлечения SSEA-4-положительных клеток дифференцировали до стадии IV протокола дифференцирования, описанного в примере 1, а затем трансплантировали мышам под капсулу почки для оценки выживаемости клеток и их приживления. Данные, полученные в экспериментах с мышиными трансплантатами, представлены в таблице VI.
Мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, вызванным врожденным отсутствием клеток-киллеров (C,B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdescid-Lystbg N7), возрастом от пяти до шести недель, были приобретены в Taconic Farms. Мышей содержали в клетках-микроизоляторах со свободным доступом к стерилизованной пище и воде. Во время подготовки к хирургической операции мыши были помечены идентификационной меткой, нанесенной на ухо, была измерена масса их тела, а также содержание глюкозы в крови с помощью ручного глюкометра (LifeScan, One Touch). Для анестезии использовали смесь изофлурана и кислорода. Шерсть на месте операции выстригли малыми ножницами, предназначенными для животных. Перед операцией мышам подкожно вводили 0,1 мг/кг бупренекса. Для подготовки место операции обработали 70%-ным изопропиловым спиртом, 10%-ным повидон-йодом и 70%-ным изопропиловым спиртом, затем с левой стороны выполнили боковой разрез кожи и мышечных слоев. Открыли левую почку, которую поддерживали во влажном состоянии путем смачивания 0,9%-ным раствором хлорида натрия. Для проникновения через почечную капсулу использовали катетер для внутривенных введений 24G×¾ дюйма, после чего иглу извлекли. Затем катетер продвинули под почечной капсулой к дистальному концу почки.
Во время предоперационной подготовки мышей клетки отцентрифугировали в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, большую часть супернатанта удалили, оставив количество среды, достаточное только для отбора клеточного дебриса. Клетки отобрали с помощью пипетки с объемным вытеснением Rainin Pos-D, после чего пипетку перевернули, чтобы клетки могли осесть под действием силы тяжести. Излишки среды вытеснили, оставив компактный препарат клеток для трансплантации.
Для трансплантации наконечник пипетки Pos-D плотно вставили во втулку катетера и клетки выдавили через катетер под почечную капсулу на дистальном конце почки. Просвет катетера промыли небольшим объемом культуральной среды для введения оставшихся клеток, после чего катетер извлекли. Почечную капсулу загерметизировали, используя низкотемпературное прижигание, после чего почку вернули в первоначальное анатомическое положение. Мышцы сшили непрерывным швом с помощью викриловой нити 5-0, а кожу стянули клипсами для ран. После операции мышам подкожно вводили 1,0 мг/кг метакама. Мышей вывели из наркоза и им дали возможность полностью восстановиться.
После трансплантации мышей взвешивали раз в неделю, а дважды в неделю брали анализ крови для определения уровня глюкозы. На разных сроках после трансплантации мышам интраперитонеально вводили 3 г/кг глюкозы. Через 60 минут после введения глюкозы через ретроорбитальный синус отбирали кровь и помещали ее в микроцентрифужные пробирки, содержащие небольшое количество гепарина. Кровь центрифугировали, плазму собирали во вторую микроцентрифужную пробирку, замораживали на сухом льду и хранили при -80°C до проведения анализа на человеческий С-пептид. Концентрацию человеческого C-пептида определяли с помощью диагностического сверхчувствительного набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) Mercodia/ALPCO C-peptide ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя.
При эвтаназии осуществляли забор крови, как описано выше. Осуществляли забор трансплантата из-под почечной капсулы и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени, иммуногистохимии и патологического исследования.
Мышам, разделенным на три группы, трансплантировали по приблизительно 3,3 миллиона клеток каждой, в виде i) клеточных кластеров, ii) отдельных (неизвлеченных) клеток и iii) отдельных извлеченных клеток SSEA4. Клетки, дифференцированные до стадии IV, высвобождали из культуры осторожным соскребанием, чтобы получить небольшие клеточные кластеры, или с помощью TrypLE Express, получая суспензии отдельных клеток, для извлечения SSEA-4-положительных клеток. После извлечения SSEA-4-положительных клеток, как описано в примере 5, как клеточные кластеры, так и препараты отдельных клеток вновь помещали на планшеты с низкой степенью прилипания клеток (Costar, Corning Incorporated, г. Нью-Йорк, № по каталогу 3471) и инкубировали в течение ночи в среде для дифференцирования клеток-предшественников (стадия IV) до трансплантации. Ингибитор Y-27632 моногидрат дигидрохлорида (Sigma, № по каталогу Y0503) добавляли в культуру в течение ночи в концентрации 10 мкМ. После трансплантации мышей контролировали, как описано выше, в течение 12 недель. Выживаемость трансплантата не была явно продемонстрирована у реципиентов отдельных клеток (извлеченных или неизвлеченных), но была продемонстрирована у 2 из 5 мышей, получивших клеточные кластеры. Одна из 5 мышей, получивших клеточные кластеры, имела определяемые уровни С-пептида на 12 неделе после трансплантации. Плохая выживаемость трансплантата объяснялась сниженным качеством клеток и меньшим числом клеток, трансплантированных во время пробного эксперимента.
Многоступенчатое дифференцирование человеческих эмбриональных клеток в зрелые панкреатические эндокринные клетки, осуществляющееся через несколько промежуточных стадий, включая дефинитивную энтодерму (DE), панкреатическую энтодерму (PE) и панкреатические клетки-предшественники, ассоциируется с динамическими изменениями экспрессии маркеров клеточной поверхности. Хотя с помощью протокола дифференцирования можно формировать еще не идентифицированные гетерогенные клеточные популяции множественных линий дифференцирования, включая эктодермальные и мезодермальные клеточные типы, анализ изменений экспрессии маркеров клеточной поверхности в панкреатической дифференцировочной среде может позволить выявлять маркеры, потенциально полезные для обогащения клеток и их очистки. В таблице VII представлены итоговые результаты анализа маркеров клеточной поверхности, показывающих усиление или снижение экспрессии, что может быть полезным для отрицательного или положительного отбора клеток панкреатической энтодермы. Маркеры, экспрессия которых снижается в процессе дифференцирования, включают в себя CD117, CD133, CD181, CD184, CD200, CD221, CD326, CD55, CD57, CD9 и CD98. Маркеры, экспрессия которых возрастает в процессе дифференцирования, включают в себя CD13, CD141, CD15, CD318, CD46, CD47, CD49c, CD49e, CD56 и CD73. Такие маркеры можно использовать по отдельности или в различных комбинациях для очистки клеточных популяций, обогащенных клетками панкреатической энтодермы и клетками-предшественниками.
Пример 7
Процедуры проточно-цитометрической сортировки
Клетки на различных стадиях созревания осторожно высвобождали путем инкубации с TrypLE Express (Invitrogen, № по каталогу 12604, штат Калифорния) в течение 2-3 минут при 37°C и дважды промывали буферным раствором для окрашивания BD FACS, содержащим 2% BSA (BD, № по каталогу 554657, штат Калифорния). В зависимости от количества получаемых клеток 20-50×106 отдельных клеток ресуспендировали в 2-3 мл блокирующего буферного раствора (0,5% человеческого гамма-глобулина в разведении 1:4 в буферном растворе для окрашивания (BD, штат Калифорния)) для окрашивания. Флуорофор-конъюгированные первичные антитела добавляли к клеткам в конечном разведении 1:20 и клетки инкубировали в течение 30 минут при 4°C. После промывания окрашенные клетки ресуспендировали в 2-3 мл буферного раствора для окрашивания и добавляли 50-60 мкл 7AAD для выявления живых и мертвых клеток для анализа и сортировки клеток. Контрольные антитела к IgG того же изотипа использовали для окрашивания в качестве отрицательного контроля. Для расчета показателей компенсации флуорофора до сортировки клетки либо оставляли неокрашенными, либо окрашивали одним флуорофором, таким как изотиоцианат флуоресцеина (FITC), фикоэритрин (PE) или аллофикоцианин (APC) и ядерный краситель 7-аминоактиномицин D (7-AAD).
Сортировку клеток выполняли с помощью клеточного сортера BD FACSAria и программного обеспечения BD FACSDiva. Клетки, окрашенные контрольными антителами того же изотипа, использовали для выявления отрицательной популяции при каждой сортировке клеток. Для каждого эксперимента с сортировкой клеток показатели напряжения фотомультипликатора (PMT) устанавливали с помощью соответствующих показателей компенсации для флуорофора, чтобы получать яркую популяцию (положительные (+) или Hi) и тусклую популяцию или субпопуляцию клеток (отрицательные (-) или Lo). Как правило, положительно окрашенные клеточные популяции (+ или Hi) имели порядок трех десятков или выше (104), когда отрицательно окрашенные популяции имели порядок первого-второго десятка (102-103). Используя установленные параметры сортировки, клетки сортировали с помощью сопла 100 мкМ при скорости потока 1,0. По окончании клеточной сортировки небольшие образцы клеток анализировали для оценки чистоты сортированных клеточных субпопуляций. РНК выделяли из клеток, отобранных из числа сортированных и несортированных популяций с использованием Rneasy Mini Kit (Qiagen, штат Калифорния), для последующего анализа ОТ-ПЦР.
Публикации, цитируемые в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ путем ссылки. Хотя различные аспекты настоящего изобретения проиллюстрированы выше путем ссылки на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что сущность настоящего изобретения ограничивается не указанным выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.
Таблица I
Проточно-цитометрическая характеристика экспрессии маркеров клеточной поверхности на различных стадиях энтодермального/панкреатического дифференцирования
Обозначения: Н/О=не определено, +/-=0-10%, +=10-50%, ++=50-85%, +++=85-100%
Антитело Синонимы Поставщик/№ hES Дефинитивная энтодерма
(стадия I)		 Первичная кишечная трубка (стадия 2) Задняя часть передней кишки (стадия 3) Эндокринные клетки-предшественники (стадия 4) Эндокринные клетки (стадия 5) Зрелые эндокринные клетки (стадия 6)
BLT-R BD № 552836 Н/О +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD105 Эндоглин Millipore № C
BL418F		 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD112 PRR2 BD № 551057 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD117 c-kit BD № 341096 + ++ ++ + +/- +/- +/-
CD118 LIFR, gp190 R&D № FAB2
49P		 +/- +/- + +/- +/- +/- +/-
CD126 IL-6R BD № 551850 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD13 Аминопептидаза N BD № 555394 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD130 IL-6Rβ, gp130 BD № 555757 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD132 BD № 555900 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD133 AC133, проми-нин-подобный 1 MILTENYI
№ 130-090-
854		 + + ++ + + + +
CD134 OX-40 BD № 554848 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD135 Flt3/Flk2 BD № 558996 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD137 BD № 550890 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD137
Лиганд		 BD № 559446 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD140a PDGFRα BD № 556002 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD140b PDGFRβ BD № 558821 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD142 BD № 550312 +/- +/- +/- +/- + + +
CD146 MUC18 BD № 550315 + + + +/- + + Н/О
CD15 BD № 551376 +/- + + + + + +
CD161 BD № 340536 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD164 BD № 551298 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD178 FasL, CD95L BD № 555293 +/- +/- +/- +/- +/- +/- Н/О
CD180 BD № 551953 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD181 CXCR1, IL-8RA BD № 555939 +/- + +/- +/- +/- +/- Н/О
CD183 CXCR3 BD № 550967 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD184 CXCR4, фузин BD № 555976 +/- ++ + +/- +/- +/- +
CD185 CXCR5 BD № 551959 +/- +/- +/- +/- +/- + Н/О
CD193 CCR3 BD № 558165 +/- + +/- +/- +/- +/- +/-
CD195 CCR5 BD № 555992 +/- +/- +/- +/- +/- +/- Н/О
CD1b BD № 555969 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD20 BD № 555622 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD200 OX-2 BD № 552475 + ++ ++ + + ++ ++
CD205 BD № 558069 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD220 Инсулин-R BS № 559955 +/- +/- +/- +/- +/- +/- Н/О
CD221 IGF-1 Rα BD № 555999 + ++ ++ + +/- + +/-
CD24 BD № 555428 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
CD243 MDR-1;
P-gp		 BD № 557002 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD252 Лиганд OX-40 BD № 558164 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD26 BD № 555436 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD271 NGFR BD № 557198 +/- Н/О +/- +/- +/- +/- Н/О
CD275 BD № 552502 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD28 BD № 555728 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD29 Интегрин β1 BD № 559883 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
CD305 LAIR1 BD № 550811 +/- +/- +/- +/- +/- +/- Н/О
CD309 VEGFR2,
KDR		 BD № 560494 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD318 CDCDP1 R&D № FAB2
6662P		 +/- +/- +/- +/- + + +
CD326 Ep-CAM BD № 347197 +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++
CD33 BD № 555450 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD332 FGFR2,
KGFR2		 R&D № FAB6
84A		 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD340 ErbB-2,
HER2/neu		 BD № 340553 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD36 BD № 550956 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +
CD39 BD № 555464 +/- +/- +/- +/- +/- +/- Н/О
CD42b BD № 555472 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD43 BD № 555475 +/- +/- +/- +/- +/- +/- Н/О
CD44 BD № 559942 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD46 BD № 555949 + +/- +/- +/- + + Н/О
CD47 BD № 556046 +/- +/- + +++ ++ ++ ++
CD49b Интегрин α2, VLA-2 BD № 555669 + +/- + + + + +/-
CD49c Интегрин α3, VLA-3 Abcam № ab3
0489		 + + + + + + +
CD49e Интегрин α5, VLA-5 BD № 555617 + +++ +++ ++ + + +
CD49f Интегрин α6, VLA-6 BD № 555735 + +/- + + + + +/-
CD55 BD № 555696 + ++ + +/- + + +
CD56 NCAM BD № 555518 + + + + +++ ++ +++
CD57 BD № 555619 +++ +++ +++ ++ + + +
CD58 LFA-3 BD № 555920 + +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD63 LIMP. LAMP-3 BD № 557288 Н/О +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD66 BD № 551480 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD71 BD № 551374 + + + + +/- + +
CD73 BD № 550257 +/- +/- +/- + + + Н/О
CD74 BD № 555540 +/- +/- +/- +/- +/- +/- Н/О
CD88 C5aR BD № 550494 +/- + +/- +/- +/- +/- +/-
CD9 P24, MRP-1 BD № 555372 + + +/- +/- +/- +/- +/-
CD91 BD № 550496 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
CD95 Apo-1, Fas BD № 555674 +/- +/- +/- +/- +/- +/- Н/О
CD98 BD № 556076 +++ +++ +++ +++ ++ ++ +
CD99 MIC2, E2 +/- +++ +++ +++ +++ +++ ++
CDw210 IL-10 R BD № 556013 +/- + +/- +/- +/- +/- +/-
DLL1 R&D № FAB1
818A		 Н/О Н/О Н/О +/- +/- +/- Н/О
EGFR ErbB-1, HER1 BD № 555997 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
fMLP BD № 556016 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
MICA/B BD № 558352 +/- + +/- +/- +/- +/- Н/О
Notch1 BD № 552768 +/- + +/- +/- +/- +/- Н/О
SSEA-4 R&D № FAB1
435P		 +++ +++ ++ + + + +
TGFBR3 Lifespan № LS
-C76502		 +/- Н/О + +/- +/- + Н/О
TRA1-60 BD № 560193 +++ +++ + + + + +
TRA1-81 BD № 560161 +++ +++ + + + + +
TWEAK BD № 552890 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
Таблица II
Маркеры клеточной поверхности, используемые для обогащения панкреатических клеток-предшественников
Использованные маркеры клеточной поверхности (одиночные/в комбинации) Стадия
развития сортируемых клеток		 Производитель/
№		 Фенотип
обогащенных
популяций		 %
исходной популяции		 % сортированной популяции Кратность
обогащения
CD56/CD13 Эндокринные клетки-предшественники (С4) BD № 555518/№ 55593 CD56+CD13- 64,1 82,1 ~1,3
CD133 Эндокринные клетки-предшественники (С4) Miltenyi, № 130-090-854 CD133- 48,6 92,0 ~1,9
CD49c (интегрин
α-3)		 Эндокринные клетки-предшественники (С4) Abcam, № ab30489 CD49cLo(-) 31,7 95,9 ~3,1
CD56/CD15 Эндокринные клетки-предшественники (С4) BD № 555518/
№ 551376		 CD56+CD15Lo(-) 26-80 Н/О Н/О
CD15 Эндокринные клетки-предшественники (С4) BD № 551376 CD15- 89,6 97,5 ~1,1
CD56/CD57 Эндокринные клетки-предшественники (С4)
Эндокринные клетки (С5)		 BD № 555518/№ 555619 CD56+CD57+ 31,3 59,1 ~1,9
CD98 Эндокринные клетки (С6) BD № 556076 CD98+ 61,3 98,9 ~1,6
CD47 Эндокринные клетки (С5, С6) BD № 556046 CD47- 22,8 75,1 ~3,3
Таблица III
Уровни экспрессии LIF-рецептора
Стадия дифференцирования Стадия 2, день 2 Стадия 2, день 3 Стадия 3, день 4 Стадия 4, день 3
Уровень экспрессии (%) 47% 70% 5% 1%
Таблица IV
Уровни экспрессии CD184 до и после обогащения
До сортировки Обогащение
Фракция CD184+ Фракция CD184-
Описание CD184+
CD56-		 CD184+
CD56+		 CD184-CD56- CD184-CD56+ CD184+ CD184+
Экспрессия
(%)		 1% 8% 20% 70% 79% 0,6%
Таблица V
Уровни экспрессии антигена к SSEA-4
Клетки Стадия дифференцирования Экспрессия SSEA-4 (%) % извлечения клеток
До извлечения клеток После извлечения клеток
H1 Недифференцированные 91,2 Н/О Н/О
H1 Первичная кишечная трубка (стадия II) 20,5 1,8 91,2
H1 Эндокринные клетки-предшественники (стадия IV) 20,1 0,9 95,5
Таблица VI
Сводные результаты анализа мышей после трансплантации клеток, очищенных от SSEA-4-положительных клеток
Группа Клеточный тип Общее кол-во клеток Кол-во мышей Трансплантаты на 12 неделе C-пептид на 12 неделе
1 Клеточные
кластеры		 3,3 миллиона 5 3/5 мышей
с видимыми
трансплантатами		 1/5 мышей с С-пептидом на уровне обнаружения
2 Единичные клетки без извлечения 3,3 миллиона 5 0/5 мышей с видимыми трансплантатами 0/5 мышей с С-пептидом на уровне обнаружения
3 Единичные клетки после извлечения клеток SSEA-4 3,3 миллиона 2 0/2 мышей с видимыми трансплантатами 0/2 мышей с С-пептидом на уровне обнаружения
Таблица VII
Маркеры клеточной поверхности, ассоциированные с дифференцированием человеческих эмбриональных стволовых клеток в клетки панкреатической и энтодермальной линий дифференцирования
Изменения маркеров клеточной поверхности в процессе дифференцирования DE→PE→эндокринные Изменения, ассоциированные с маркерами клеточной поверхности* Маркеры клеточной поверхности, используемые для обогащения панкреатической энтодермы/
эндокринных клеток		 Обогащенные клеточные фракции
CD117 Снижение Н/О -
CD13 Повышение Да CD13-
CD133 Снижение Да CD133-
CD142 Повышение Н/О -
CD15 Повышение Да CD15-
CD181 Снижение Н/О -
CD184 Снижение Да CD184+
CD200 Снижение Н/О -
CD221 Снижение Н/О -
CD318 Повышение Н/О -
CD326 Снижение Н/О -
CD46 Повышение Н/О -
CD47 Повышение Да CD47-
CD49c Повышение Да CD49c-
CD49e Повышение Н/О -
CD55 Снижение Н/О -
CD56 Повышение Да CD56+
CD57 Снижение Да CD57+
CD73 Повышение Н/О -
CD9 Снижение Н/О -
CD98 Снижение Да CD98+
• Изменения, ассоциированные с маркерами клеточной поверхности, указывают на повышение или снижение уровня экспрессии маркеров клеточной поверхности по мере дифференцирования от стадии дефинитивной энтодермы (DE, стадия I) до стадии панкреатической энтодермы (PE, стадия III) и, наконец, к стадии эндокринных клеток (стадии V/VI).

Claims (20)

1. Способ получения популяции клеток первичной кишечной трубки, включающий:
контактирование популяции, содержащей клетки первичной кишечной трубки с лигандом или антителом, которые связывают Lif-рецептор; и
отбор клеток, с которыми лиганд или антитело связываются,
где клетки, с которыми лиганд или антитело связываются, являются клетками первичной кишечной трубки, где популяцию клеток получают последовательным дифференцированием плюрипотентных стволовых клеток человека, и за исключением способа, где плюрипотентные стволовые клетки человека получены путем использования эмбриона человека.
2. Способ по п. 1, где стадия отбора включает сортировку клеток.
3. Способ по п. 2, где клетки сортируют, используя проточную цитометрию.
4. Способ по п. 2, где клетки сортируют, используя FACS.
5. Способ по п. 1, где популяция клеток содержит клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, выбранные из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобного гомеобоксного белка, FGF4, CD48, эомезодермина (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CD184, C-Kit, CD99 и OTX2.
6. Способ по п. 5, где популяцию клеток получают дифференцированием клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в клетки первичной кишечной трубки.
7. Способ по п. 5 или 6, где популяция клеток включает клетки-предшественники клеток первичной полоски.
8. Способ по п. 5 или 6, где популяция клеток включает клетки мезоэнтодермы.
9. Способ по п. 5 или 6, где популяция содержит клетки дефинитивной энтодермы.
10. Способ по п. 6, где популяция клеток первичной кишечной трубки имеет увеличенную экспрессию HNF4 альфа.
11. Способ по п. 1, где плюрипотентные стволовые клетки человека представляют собой клетки, полученные из соматических клеток взрослого человека.
12. Способ по п. 1, где плюрипотентные стволовые клетки человека являются клетками из линий эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7 или H9.
13. Способ по п. 1, где популяцию, содержащую клетки первичной кишечной трубки, получают способом, включающим
а. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток человека в популяцию клеток дефинитивной энтодермы; и
b. дифференцирование популяции клеток дефинитивной энтодермы в клетки первичной кишечной трубки.
14. Способ по п. 13, где способ дополнительно включает культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток человека.
15. Способ по п. 1, дополнительно включающий дифференцирование популяции полученных клеток задней части передней кишки в панкреатические эндокринные клетки-предшественники.
RU2016149540A 2010-03-01 2011-02-28 Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток RU2702198C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30919310P 2010-03-01 2010-03-01
US61/309,193 2010-03-01

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012141652A Division RU2607380C2 (ru) 2010-03-01 2011-02-28 Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2016149540A RU2016149540A (ru) 2018-11-05
RU2016149540A3 RU2016149540A3 (ru) 2018-11-05
RU2702198C2 true RU2702198C2 (ru) 2019-10-04

Family

ID=44505394

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012141652A RU2607380C2 (ru) 2010-03-01 2011-02-28 Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток
RU2016149540A RU2702198C2 (ru) 2010-03-01 2011-02-28 Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012141652A RU2607380C2 (ru) 2010-03-01 2011-02-28 Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток

Country Status (15)

Country Link
US (2) US9969981B2 (ru)
EP (1) EP2542667A4 (ru)
JP (2) JP6013196B2 (ru)
KR (2) KR20130025375A (ru)
CN (2) CN107189979B (ru)
AR (1) AR080434A1 (ru)
AU (1) AU2011223900A1 (ru)
BR (1) BR112012022145A2 (ru)
CA (1) CA2791476C (ru)
MX (1) MX358451B (ru)
PH (1) PH12018501127A1 (ru)
RU (2) RU2607380C2 (ru)
SG (2) SG183535A1 (ru)
WO (1) WO2011109279A2 (ru)
ZA (1) ZA201708538B (ru)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6013196B2 (ja) * 2010-03-01 2016-10-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法
JP6312591B2 (ja) 2011-06-21 2018-04-18 ノヴォ ノルディスク アー／エス 多能性幹細胞からの胚体内胚葉の効率的な誘導
KR102203056B1 (ko) * 2011-12-22 2021-01-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로의 분화
CN104583392A (zh) * 2012-08-22 2015-04-29 耶达研究与发展有限公司 分离不同胰腺细胞类型的方法
KR102580225B1 (ko) 2013-06-11 2023-09-20 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법
US10190096B2 (en) 2014-12-18 2019-01-29 President And Fellows Of Harvard College Methods for generating stem cell-derived β cells and uses thereof
CN107614678B (zh) 2014-12-18 2021-04-30 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
US10443042B2 (en) 2014-12-18 2019-10-15 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
USD772896S1 (en) 2015-02-06 2016-11-29 Samsung Electronics Co., Ltd. Display screen or portion thereof with icon
KR101643555B1 (ko) * 2015-03-12 2016-07-28 한국과학기술원 Stra6를 이용한 기능적으로 성숙된 인간 줄기세포 유래 간세포의 선별 방법
WO2018129507A2 (en) * 2017-01-09 2018-07-12 Trustees Of Boston University Generation of airway epithelial organoids from human pluripotent stem cells
CA3049847A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Trustees Of Boston University Isolation of human lung progenitors derived from pluripotent stem cells
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
EP3710021A4 (en) 2017-11-15 2021-08-11 Semma Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR THE MANUFACTURE OF ISLAND CELLS AND METHODS OF USE
CA3108275A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
JP2022534545A (ja) 2019-05-31 2022-08-01 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティド 生体適合性メンブレン複合体
CN114206407A (zh) 2019-05-31 2022-03-18 W.L.戈尔及同仁股份有限公司 生物相容性膜复合材料
WO2020243668A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
AU2020282355B2 (en) 2019-05-31 2023-11-02 Viacyte, Inc. A biocompatible membrane composite
EP4027190A4 (en) 2019-09-04 2022-08-10 BOE Technology Group Co., Ltd. LINE RECOGNITION DEVICE AND DISPLAY DEVICE
WO2022196391A1 (ja) * 2021-03-15 2022-09-22 国立大学法人東北大学 荷重センサおよび荷重検出装置
WO2023049079A2 (en) * 2021-09-22 2023-03-30 Imagine Pharma Llc Compositions and methods for propogating insulin and glucagon secreting cells from type 1 diabetic pancreatic tissue and therapeutic uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2333243C2 (ru) * 2002-03-28 2008-09-10 Бластикон Биотехнологише Форшунг Гмбх Дедифференцированные программируемые стволовые клетки моноцитарного происхождения и их получение и применение
WO2009018453A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells

Family Cites Families (262)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) * 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) * 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) * 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) * 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) * 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) * 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5089396A (en) * 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5215893A (en) * 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) * 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) * 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
CA1340581C (en) * 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US5759830A (en) * 1986-11-20 1998-06-02 Massachusetts Institute Of Technology Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo
US5567612A (en) * 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
US5837539A (en) * 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
ES2134212T3 (es) 1991-04-25 1999-10-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo humano reconstituido contra el receptor de la interleuquina 6 humano.
US5449383A (en) * 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) * 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) * 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
JP2813467B2 (ja) 1993-04-08 1998-10-22 ヒューマン・セル・カルチャーズ・インコーポレーテッド 細胞培養法および培地
US5523226A (en) * 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) * 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ru) * 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US6001647A (en) * 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6703017B1 (en) * 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US5834308A (en) * 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6083903A (en) * 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
KR100252743B1 (ko) 1994-12-29 2000-09-01 나가야마 오사무 Il-6 안타고니스트를 함유하는 항종양제의 작용증강제
US5843780A (en) * 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US7410773B2 (en) * 1995-02-02 2008-08-12 Ghazi Jaswinder Dhoot Method of preparing an undifferentiated cell
US5718922A (en) * 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) * 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
US5681561A (en) 1995-06-07 1997-10-28 Life Medical Sciences, Inc. Compositions and methods for improving autologous fat grafting
US5969210A (en) * 1996-01-22 1999-10-19 Research Development Foundation Methods for the characterization of compounds which stimulate STF-1 expression in pancreatic islet cells
EP1028954B1 (en) 1997-04-24 2003-07-02 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases
AU8476698A (en) * 1997-07-03 1999-01-25 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells from peripheral blood
US6670127B2 (en) * 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
AU9393398A (en) * 1997-09-16 1999-04-05 Egea Biosciences, Inc. Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes
CA2307807C (en) 1997-10-23 2008-09-02 Andrea G. Bodnar Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
ZA9811898B (en) * 1997-12-29 2000-06-28 Ortho Mcneil Pharm Inc Anti-Inflammatory Compounds.
AU755888B2 (en) * 1998-03-18 2003-01-02 Mesoblast International Sarl Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
MY132496A (en) * 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) * 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
AU2515600A (en) * 1999-01-21 2000-08-07 Vitro Diagnostics, Inc. Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) * 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6333029B1 (en) * 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
US6306424B1 (en) * 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
CA2385628A1 (en) 1999-09-27 2001-04-05 Ammon B. Peck Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6685936B2 (en) * 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
EP1240518A4 (en) * 1999-12-13 2006-05-17 Scripps Research Inst MARKERS FOR THE IDENTIFICATION AND INSULATION OF PRE-GENERIC CELLS OF A AND B PANCREAS ISOLATED CELLS
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US7005252B1 (en) * 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US6436704B1 (en) * 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
WO2002000849A1 (fr) * 2000-06-26 2002-01-03 Renomedix Institute Inc. Fraction cellulaire contenant des cellules capables de se differencier en cellules du systeme nerveux
CA2426654C (en) * 2000-10-23 2010-12-21 Smithkline Beecham Corporation 2,4,8-trisubstituted-8h-pyrido[2,3-d}pyrimidin-7-one compounds
EP1345946B1 (en) 2000-12-08 2005-08-10 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors
PT1362047E (pt) 2000-12-08 2006-09-29 Ortho Mcneil Pharm Inc Compostos de pirrolina substituidos com indazolilo como inibidores de cinase
US6599323B2 (en) * 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
US20040121460A1 (en) * 2001-01-24 2004-06-24 Lumelsky Nadya L Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
EP3078667B1 (en) * 2001-01-25 2018-11-21 The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Formulation of boronic acid compounds
US6656488B2 (en) * 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
DE10290025T1 (de) 2001-04-19 2003-10-09 Develogen Ag Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen in Insulin-produzierende Zellen
ATE421991T1 (de) 2001-04-24 2009-02-15 Ajinomoto Kk Stammzellen und verfahren zu deren trennung
CA2447015A1 (en) 2001-05-15 2002-11-21 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells
US6626950B2 (en) * 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) * 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
CA2456981C (en) * 2001-08-06 2012-02-28 Bresagen, Inc. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) * 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
US20030138951A1 (en) 2001-10-18 2003-07-24 Li Yin Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
DE60233248D1 (de) 2001-11-15 2009-09-17 Childrens Medical Center Verfahren zur isolierung, expansion und differenzierung fötaler stammzellen aus chorionzotte, fruchtwasser und plazenta und therapeutische verwendungen davon
IL162131A0 (en) * 2001-12-07 2005-11-20 Geron Corp Islet cells from human embryonic stem cells
CN1630526B (zh) * 2001-12-07 2010-05-05 马克罗珀尔生物外科公司 用加工的脂肪抽吸细胞来治疗患者的***和方法
AU2002218893A1 (en) 2001-12-21 2003-07-09 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
IL162663A0 (en) 2001-12-28 2005-11-20 Cellartis Ab A method for the establishment of apluripotent human blastocyst-derived stem cell line
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
US20030180268A1 (en) 2002-02-05 2003-09-25 Anthony Atala Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ
AU2003231358A1 (en) * 2002-04-17 2003-10-27 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. METHOD OF FORMING PANCREATIC Beta CELLS FROM MESENCHYMAL CELLS
US20040161419A1 (en) * 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
WO2003095452A1 (en) 2002-05-08 2003-11-20 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituted pyrroline kinase inhibitors
US20060003446A1 (en) * 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
AU2003273573A1 (en) 2002-05-28 2003-12-19 Becton, Dickinson And Company Expansion and transdifferentiation of human acinar cells
KR20050008787A (ko) * 2002-06-05 2005-01-21 얀센 파마슈티카 엔.브이. 키나제 저해제로서의 비스인돌릴-말레이미드 유도체
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) * 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) * 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
EP1539930A4 (en) 2002-07-29 2006-08-09 Es Cell Int Pte Ltd METHOD IN MULTIPLE STAGES OF DIFFERENTIATION OF POSITIVE INSULIN-SENSITIVE CELLS, GLUCOSE
WO2004016747A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
WO2004023100A2 (en) * 2002-09-06 2004-03-18 Amcyte Inc. Cd56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
US9969977B2 (en) * 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) * 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
AU2003285172A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 The Johns Hopkins University Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) * 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
EP1567639A4 (en) 2002-12-05 2005-12-21 Technion Res & Dev Foundation CULTURE OF HUMAN PANCREATIC ISLANDS AND USES THEREOF
CN100549163C (zh) 2002-12-16 2009-10-14 技术研究及发展基金有限公司 制备无饲养细胞、无异源的人胚胎干细胞的方法以及使用该方法制备的干细胞培养物
KR101114808B1 (ko) 2003-01-29 2012-02-15 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 피복 제제의 제조법
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
WO2005045001A2 (en) 2003-02-14 2005-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
US20070155661A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
US20070020242A1 (en) 2003-03-27 2007-01-25 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
US20060194315A1 (en) * 2003-03-31 2006-08-31 Condie Brian G Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
CA2530533C (en) * 2003-06-27 2015-02-10 Ethicon, Incorporated Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making and using the same
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
WO2005017117A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Martin Haas Multipotent amniotic fetal stem cells (mafsc) and banking of same
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
CA2536067A1 (en) 2003-08-27 2005-03-10 Stemcells California, Inc. Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations
JP2007515433A (ja) 2003-12-17 2007-06-14 アラーガン　インコーポレイテッド Ｃｙｐ２６ａおよびｃｙｐ２６ｂの選択的阻害剤を使用するレチノイド反応性障害の処置方法
GB0329498D0 (en) 2003-12-19 2004-01-28 Novartis Ag Organic compounds
US20060030042A1 (en) * 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
US7625753B2 (en) * 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
US20050266554A1 (en) * 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
CN1946838A (zh) 2003-12-23 2007-04-11 赛瑟拉公司 定形内胚层
US7541185B2 (en) 2003-12-23 2009-06-02 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
MX2009009225A (es) * 2003-12-23 2009-09-28 Cythera Inc Endodermo definitivo.
TWI334443B (en) * 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US20050233446A1 (en) * 2003-12-31 2005-10-20 Parsons Xuejun H Defined media for stem cell culture
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
US20080241107A1 (en) 2004-01-23 2008-10-02 Copland Iii John A Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells
WO2005080551A2 (en) 2004-02-12 2005-09-01 University Of Newcastle Upon Tyne Stem cells
US7964401B2 (en) 2004-02-19 2011-06-21 Kyoto University Screening method for somatic cell nuclear reprogramming substance affecting ECAT2 and ECAT3
AU2005221095A1 (en) 2004-03-09 2005-09-22 John J. O'neil Methods for generating insulin-producing cells
CA2558486A1 (en) 2004-03-10 2005-09-22 Alberto Hayek Compositions and methods for growth of embryonic stem cells
SG150567A1 (en) 2004-03-23 2009-03-30 Akaike Toshihiro Pluripotent stem cell growing method
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
WO2005097977A2 (en) 2004-04-01 2005-10-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
KR101278421B1 (ko) 2004-04-27 2013-07-15 비아싸이트, 인크. Ｐｄｘ１ 발현 내배엽
CA2966883A1 (en) 2004-07-09 2006-02-16 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
EP1791952A4 (en) 2004-08-13 2008-06-11 Univ Georgia Res Found COMPOSITIONS AND METHODS OF SELF-RENEWAL AND DIFFERENTIATION IN HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS
US20080268533A1 (en) 2004-08-25 2008-10-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
JP2008518585A (ja) 2004-09-08 2008-06-05 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション ヒト胚幹細胞の培養
AU2005282510B2 (en) 2004-09-08 2010-12-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Medium and culture of embryonic stem cells
AU2006208944A1 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Imperial College Innovations Limited Methods for embryonic stem cell culture
AU2006210955A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
US20060182724A1 (en) 2005-02-15 2006-08-17 Riordan Neil H Method for expansion of stem cells
SG160373A1 (en) 2005-03-04 2010-04-29 John Oaeneil Adult pancreatic derived stromal cells
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
ATE553198T1 (de) 2005-04-15 2012-04-15 Geron Corp Behandlung von krebs durch die kombinierte hemmung der proteasom- und telomeraseaktivitäten
US20080208351A1 (en) 2005-04-26 2008-08-28 Aarhus Universitet Biocompatible Material for Surgical Implants and Cell Guiding Tissue Culture Surfaces
JP5092124B2 (ja) 2005-05-24 2012-12-05 国立大学法人 熊本大学 Ｅｓ細胞の分化誘導方法
AU2006202209B2 (en) 2005-05-27 2011-04-14 Lifescan, Inc. Amniotic fluid derived cells
CA2610598A1 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Irm Llc Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
WO2006137787A1 (en) 2005-06-21 2006-12-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for cell culture
EP1910516B1 (en) 2005-06-22 2019-06-19 Asterias Biotherapeutics, Inc. Suspension culture of human embryonic stem cells
JP5345388B2 (ja) 2005-06-30 2013-11-20 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 環式アニリノ−ピリジノトリアジン
GB2443370A (en) 2005-07-29 2008-04-30 Australian Stem Cell Ct Ltd Compositions and methods for growth of pluripotent cells
WO2007016485A2 (en) 2005-07-29 2007-02-08 Athersys, Inc. Use of a gsk-3 inhibitor to maintain potency of cultured cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
EP1962719A4 (en) 2005-08-29 2011-05-04 Technion Res And Dev Of Foundation Ltd MEDIA FOR BREEDING STEM CELLS
WO2007027156A1 (en) 2005-09-02 2007-03-08 Agency For Science, Technology And Research Method of deriving mesenchymal stem cells
WO2007030870A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Es Cell International Pte Ltd Cardiomyocyte production
EP1941032A2 (en) 2005-10-14 2008-07-09 Regents Of The University Of Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
ES2743202T3 (es) 2005-10-27 2020-02-18 Viacyte Inc Endodermo de intestino proximal dorsal y ventral que expresa PDX1
EP4223769A3 (en) 2005-12-13 2023-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
CN101410509B (zh) 2006-02-23 2016-05-18 维亚赛特公司 用于培养可分化细胞的组合物和方法
WO2007103282A2 (en) * 2006-03-02 2007-09-13 Cythera, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
EP3527658A1 (en) 2006-04-28 2019-08-21 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US20070259423A1 (en) 2006-05-02 2007-11-08 Jon Odorico Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
US8685730B2 (en) 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
US7964402B2 (en) 2006-05-25 2011-06-21 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
CA2654196A1 (en) * 2006-06-02 2007-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems
WO2007149182A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
ES2610812T3 (es) 2006-06-26 2017-05-03 Lifescan, Inc. Cultivo de células madre pluripotentes
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
GB2454386B (en) 2006-07-06 2011-07-06 Es Cell Int Pte Ltd Method for embryonic stem cell culture on a positively charged support surface
WO2008013664A2 (en) 2006-07-26 2008-01-31 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
DK2733203T3 (en) 2006-08-02 2019-02-04 Technion Res & Dev Foundation PROCEDURES FOR EXPANSION OF EMBRYONAL STEM CELLS IN A SUSPENSION CULTURE
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008039521A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Nmt Medical, Inc. Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
CN101611016B (zh) 2006-10-17 2012-01-25 斯蒂菲尔实验室公司 他拉罗唑代谢物
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
CA2666789C (en) 2006-10-18 2016-11-22 Yong Zhao Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
WO2008056779A1 (fr) 2006-11-09 2008-05-15 Japan As Represented By The President Of International Medical Center Of Japan Procédé destiné à la culture et au passage d'une cellule souche embryonnaire de primate, et procédé destiné à induire la différenciation de la cellule souche embryonnaire
US8217027B2 (en) 2006-12-21 2012-07-10 Abbott Laboratories Sphingosine-1-phosphate receptor agonist and antagonist compounds
WO2008086005A1 (en) 2007-01-09 2008-07-17 University Of South Florida Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
CN101641436A (zh) 2007-01-30 2010-02-03 佐治亚大学研究基金会 用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞（mmc）的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
WO2008148105A1 (en) 2007-05-25 2008-12-04 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
DK2173863T3 (en) 2007-06-29 2019-01-21 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture
KR20170116172A (ko) 2007-07-01 2017-10-18 라이프스캔, 인코포레이티드 단일 다분화성 줄기 세포 배양
KR101555824B1 (ko) 2007-07-18 2015-09-25 라이프스캔, 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
RU2010107181A (ru) 2007-07-31 2011-09-20 Лайфскен, Инк. (Us) Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток с использованием питающих клеток человека
WO2009027644A2 (en) 2007-08-24 2009-03-05 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Composition
WO2009061442A1 (en) 2007-11-06 2009-05-14 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells
RU2473684C2 (ru) 2007-11-27 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
EP2250252A2 (en) 2008-02-11 2010-11-17 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
KR102026622B1 (ko) 2008-02-21 2019-09-30 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
WO2009110215A1 (ja) 2008-03-03 2009-09-11 独立行政法人 科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
WO2009116951A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
RU2359030C1 (ru) 2008-03-19 2009-06-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты)
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
DK2727998T3 (da) 2008-04-21 2019-08-26 Viacyte Inc Fremgangsmåder til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller
US8728812B2 (en) 2008-04-22 2014-05-20 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of PDX1+ pancreatic cells
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
DK2993226T3 (da) 2008-06-03 2021-02-22 Viacyte Inc Vækstfaktorer til fremstilling af en definitiv endoderm
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
WO2010002846A1 (en) 2008-06-30 2010-01-07 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
WO2010022395A2 (en) 2008-08-22 2010-02-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of reprogramming cells
CN102272291B (zh) 2008-10-31 2018-01-16 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
EP2350265B1 (en) 2008-10-31 2019-04-17 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
WO2010053472A1 (en) 2008-11-04 2010-05-14 Novocell, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
EP2356227B1 (en) 2008-11-14 2018-03-28 Viacyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
MX356756B (es) 2008-11-20 2018-06-11 Centocor Ortho Biotech Inc Células madre pluripotentes en microportadores.
US20110229441A1 (en) 2008-12-05 2011-09-22 Association Francaise Contre Les Myopathies Method and Medium for Neural Differentiation of Pluripotent Cells
KR102058901B1 (ko) 2009-07-20 2019-12-24 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
RU2540016C2 (ru) 2009-07-20 2015-01-27 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
MX340952B (es) 2009-07-20 2016-07-29 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
ES2590036T3 (es) 2009-08-12 2016-11-17 Kyoto University Método para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en células precursoras neurales
AR078805A1 (es) 2009-10-29 2011-12-07 Centocor Ortho Biotech Inc Celulas madre pluripotentes
WO2011058558A2 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Technion Research & Development Foundation Ltd. Culture media, cell cultures and methods of culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
US9150833B2 (en) 2009-12-23 2015-10-06 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
KR101841271B1 (ko) 2009-12-23 2018-03-22 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
CA2785966C (en) 2009-12-29 2020-10-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for manufacturing pancreatic-hormone-producing cells
JP6013196B2 (ja) * 2010-03-01 2016-10-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法
US20120322152A1 (en) 2010-03-02 2012-12-20 Michael Raghunath Culture Additives To Boost Stem Cell Proliferation And Differentiation Response
CA2800498C (en) 2010-03-31 2021-11-16 The Scripps Research Institute Reprogramming cells
US9234170B2 (en) 2010-04-25 2016-01-12 Mount Sinai School Of Medicine Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells
EP2569419B1 (en) 2010-05-12 2019-03-20 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
JP5936134B2 (ja) 2010-06-15 2016-06-15 国立大学法人京都大学 ヒト人工多能性幹細胞の選択方法
WO2011160066A1 (en) 2010-06-17 2011-12-22 Regents Of The University Of Minnesota Production of insulin producing cells
EP2601288B1 (en) 2010-08-05 2016-04-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Simplified basic media for human pluripotent cell culture
CA2809305C (en) 2010-08-31 2019-06-11 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
MY177150A (en) 2011-02-28 2020-09-08 Stempeutics Res Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
WO2013055834A2 (en) 2011-10-11 2013-04-18 The New York Stem Cell Foundation Er stress relievers in beta cell protection
WO2013056072A1 (en) 2011-10-13 2013-04-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells
EP2766474B1 (en) 2011-10-14 2020-10-07 Children's Medical Center Corporation Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes
KR102203056B1 (ko) 2011-12-22 2021-01-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로의 분화
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
CN108103006A (zh) 2012-06-08 2018-06-01 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化
CN104903440B (zh) 2012-09-03 2018-04-06 诺和诺德股份有限公司 使用小分子从多能干细胞产生胰内胚层
KR101942769B1 (ko) 2012-12-31 2019-01-28 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
US8987471B2 (en) 2013-02-14 2015-03-24 Allergan, Inc. Substituted dihydropyrazoles as sphingosine receptor modulators
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
TW201522637A (zh) 2013-03-15 2015-06-16 Jackson Lab 非胚胎幹細胞之單離及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2333243C2 (ru) * 2002-03-28 2008-09-10 Бластикон Биотехнологише Форшунг Гмбх Дедифференцированные программируемые стволовые клетки моноцитарного происхождения и их получение и применение
WO2009018453A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAHERON L. et al. LIF/STAT3 signaling fails to maintain self-renewal of human embryonic stem cells, Stem Cells, 2004, 22(5), pp.770-778. *

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012022145A2 (pt) 2020-10-06
SG183535A1 (en) 2012-10-30
US10329534B2 (en) 2019-06-25
JP6013196B2 (ja) 2016-10-25
RU2607380C2 (ru) 2017-01-10
CN102791851B (zh) 2017-07-14
AU2011223900A1 (en) 2012-09-13
US20180258401A1 (en) 2018-09-13
JP6527487B2 (ja) 2019-06-05
WO2011109279A2 (en) 2011-09-09
CN107189979A (zh) 2017-09-22
JP2017012159A (ja) 2017-01-19
RU2012141652A (ru) 2014-04-10
US9969981B2 (en) 2018-05-15
SG10201501503VA (en) 2015-04-29
CN107189979B (zh) 2021-05-04
MX2012010181A (es) 2012-10-03
RU2016149540A (ru) 2018-11-05
KR20180024041A (ko) 2018-03-07
EP2542667A2 (en) 2013-01-09
EP2542667A4 (en) 2013-07-31
KR101928299B1 (ko) 2018-12-12
ZA201708538B (en) 2019-05-29
JP2013520992A (ja) 2013-06-10
PH12018501127A1 (en) 2019-02-11
KR20130025375A (ko) 2013-03-11
US20110212067A1 (en) 2011-09-01
MX358451B (es) 2018-08-20
RU2016149540A3 (ru) 2018-11-05
CA2791476A1 (en) 2011-09-09
AR080434A1 (es) 2012-04-11
WO2011109279A9 (en) 2012-01-19
CA2791476C (en) 2020-06-30
CN102791851A (zh) 2012-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2702198C2 (ru) Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток
CN101952415B (zh) 人胚胎干细胞的分化
Hentze et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies
Shim et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate
CN104250632B (zh) 单个多能干细胞培养
Cheng et al. Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells
CN102317443B (zh) 用人饲养细胞进行的多能干细胞分化
CN102105580B (zh) 多潜能细胞的处理
RU2547925C2 (ru) Способы и композиции для закрепления и культивирования клеток на плоских носителях
KR20210019599A (ko) 줄기세포 및 전구세포를 배양하는 방법
KR20150030709A (ko) 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
CA2434362A1 (en) Pluripotent adult stem cells derived from regenerative tissue
CA2902857C (en) Generation of thymic epithelial progenitor cells in vitro
CN107787363A (zh) 真正的胰腺祖细胞的分离
AU2017276263B2 (en) Methods for enriching primitive gut tube
Rao et al. Flow Cytometric Characterization of Neural Progenitors Derived from Human Pluripotent Stem Cells
AU2002244652A1 (en) Pluripotent adult stem cells derived from regenerative tissue