JP4688793B2 - 多能性幹細胞の増殖方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞の増殖方法及び遺伝子導入法、更には当該方法により調製された多能性幹細胞に関する。

生物は自己の生命を維持するため、生体の欠失した細胞・組織を速やかに補完・修復する能力を有しており、この能力を「再生能」と呼ぶ。高等動物における「再生能」の例としては、皮膚や血管等の創傷治癒が一般によく知られているが、肝臓や腎臓といった大型の実質臓器においても、組織傷害に対して速やかにその組織恒常性を回復させるべく、細胞の増殖や組織の再構築が起こることが知られている。近年、この生物個体が生来有している「再生能」を利用して、各種疾病や創傷を治癒・改善させる試みが進められており、これらは「再生医療」と呼ばれ、新しい医療技術として注目されている。
「再生医療」を実施するにあたり、中心的な役割を果たすのが「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」である。一般に「幹細胞」とは、ある特定の、または複数の機能的細胞に分化する能力、及び自らと同じ細胞を繰り返し産生できる自己複製能とを有する未分化な細胞と定義することができる。各種組織・細胞には固有の幹細胞が存在し、例えば、赤血球やリンパ球、巨核球等の一連の血液細胞は、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）と呼ばれる幹細胞から当該細胞に由来する前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を経て産生され、骨格筋細胞は、筋衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ）や筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔｓ）と呼ばれる幹細胞／前駆細胞から生じる。その他、脳や脊髄等の神経組織に存在し、神経細胞やグリア細胞を産生する神経幹細胞、表皮細胞や毛根細胞を産生する表皮幹細胞、肝細胞や胆管細胞を作る卵円形細胞（肝幹細胞）、心筋細胞を作る心幹細胞等がこれまでに特定されている。
幹細胞又は当該細胞に由来する前駆細胞を用いた再生医療法の一部は既に実用化されており、白血病や再生不良性貧血等、血球系細胞の不足・機能不全に起因する疾患の治療のため、造血幹細胞又は造血前駆細胞を注入移植する方法がよく知られている。ところが、脳や心臓、肝臓等の実質臓器内に存在する幹細胞の場合、生体組織からの採取及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏ培養が技術的に困難であり、しかも一般にこれらの幹細胞は増殖能が低い。一方、当該幹細胞を死体組織から回収することも可能であるが、この様にして得られた細胞を医療に用いることは、倫理的に問題がある。そのため、神経疾患や心疾患等を対象とした再生治療を実施するためには、この様な対象組織内に存在する幹細胞以外の細胞を用いて、所望する細胞種を作製する技術の開発が必要である。
この様な観点に基く試みとしては、まず「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」を利用する方法が挙げられる。「多能性幹細胞」とは、試験管内（以下、ｉｎ ｖｉｔｒｏと称する）培養により未分化状態を保ったまま、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）すべての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞と定義される。現在、多能性幹細胞としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、及びその類似細胞であり、胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＧ細胞）が最もよく知られており、様々な研究に利用されている。
ＥＳ細胞は、胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）期胚の内部にある内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）と呼ばれる細胞集塊をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に移し、細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより、未分化幹細胞集団として単離できる。また、当該細胞は、マウス胎児組織に由来する初代培養の線維芽細胞（Ｍｕｒｉｎｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；以下、ＭＥＦ細胞）や、ＳＴＯ細胞等の間質系細胞を用いて作製したフィーダー細胞上で、適切な細胞密度を保ち、頻繁に培養液を交換しながら継代培養を繰り返すことにより、未分化幹細胞の性質を保持したまま細胞株として樹立することが可能である。また、ＥＳ細胞の別の特徴としてテロメラーゼを有することが挙げられ、染色体のテロメア長を保持する活性を呈する当該酵素の存在により、ＥＳ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるほぼ無制限な細胞***能を有している。
この様にして作製されたＥＳ細胞株は、正常核型を維持しながらほぼ無限に増殖と継代を繰り返すと共に、様々な種類の細胞に分化する能力、すなわち、多分化能を有している。例えば、ＥＳ細胞を動物個体の皮下や腹腔内、精巣内等に移植すると、奇形腫（テラトーマ）と呼ばれる腫瘍が形成されるが、当該腫瘍は神経細胞や骨・軟骨細胞、腸管細胞、筋細胞等、様々な種類の細胞・組織が混ざり合ったものである。また、マウスの場合、ＥＳ細胞を胚盤胞期胚に注入移植したもの又は８細胞期胚と凝集させて作らせた集合胚を偽妊娠マウスの子宮内に移植することにより、体内のすべて、若しくは一部の器官・組織内に、ＥＳ細胞に由来した分化細胞をある割合で含む仔個体、いわゆるキメラマウスを作出することができる。この技術は、所望の遺伝子を人為的に破壊、若しくは改変を加えたマウス個体、いわゆるノックアウトマウスを作製するための基幹技術として頻用されている。
さらに、ＥＳ細胞は、試験管内培養においても、多種多様な細胞種に分化誘導できることが知られている。細胞種によりその詳細な方法は異なるが、ＥＳ細胞を浮遊培養により凝集させ、擬似胚状態の細胞塊、いわゆる胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ；以下、ＥＢと略す）を形成させることによって分化を誘導する方法が一般的に用いられる。この様な方法により、胎児期の内胚葉や外胚葉、中胚葉の性質を有した細胞や、血球細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイト、脂肪細胞等の分化細胞を作製することができる。この様にしてｉｎ ｖｉｔｒｏ培養下で作製された分化細胞は、臓器・組織中に存在する細胞と、構造的から機能的にほぼ同じ形質を有しており、実験動物を用いた移植実験により、ＥＳ細胞由来細胞が臓器・組織中に定着し、正常に機能することが示されている。
以上、ＥＳ細胞の特性や培養法、及びそのｉｎ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化能に関する総説として、複数の参考書籍、例えば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）（非特許文献１参照）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）（非特許文献２参照）等を参照することができる。
また、ＥＧ細胞は、始原生殖細胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ）と呼ばれる胎児期の生殖細胞を、ＥＳ細胞の場合と同様、ＭＥＦ細胞やＳＴＯ細胞等のフィーダー細胞上で、白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ；以下、ＬＩＦと略す）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：以下、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２）若しくはフォルスコリン等の薬剤で刺激することにより作製することができる（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７０：８４１，１９９２参照；Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：１２３５，１９９６参照）。ＥＧ細胞は、ＥＳ細胞ときわめて類似した性質を有しており、分化多能性を有していることが確認されている（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＆ Ｏｄｏｒｉｃｏ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５３，２０００）。そのため、以下、「ＥＳ細胞」と表記した場合は、「ＥＧ細胞」も含むことがある。
１９９５年、Ｔｈｏｍｓｏｎらが初めて霊長類（アカゲザル）からＥＳ細胞を樹立したことにより、多能性幹細胞を用いた再生医療の実用化が現実味を帯びてきた（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７８４４，１９９５）。続いて同様の方法により、彼らはヒト初期胚からＥＳ細胞株を単離・樹立することに成功した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８）。その後、オーストラリアとシンガポールの研究グループからも同様の報告（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００；国際公開番号第００／２７９９５号）がなされており、現在、米国・国立衛生研究所（ＮＩＨ）のリスト（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ）には２０種以上のヒトＥＳ細胞株が登録されている。一方、Ｇｅａｒｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．は、ヒト始原生殖細胞からヒトＥＧ細胞株を樹立することに成功している（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８；米国特許第６，０９０，６２２号）。
これらの多能性幹細胞を研究材料若しくは再生医療製品の作製のために使用する場合、当該細胞の未分化性及び高い増殖能を保持する方法で継代培養することが不可欠である。一般的にＥＳ／ＥＧ細胞は、ＭＥＦ細胞若しくはその類似細胞（ＳＴＯ細胞など）をフィーダーとして用いることにより、当該細胞の未分化性及び増殖能を維持することができる。培養液に添加する牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ；以下、ＦＢＳ）の存在も重要であり、ＥＳ／ＥＧ細胞の培養に適したＦＢＳを選定し、当該ＦＢＳを通常、１０〜２０％量添加することが肝要である。さらに、マウス胚に由来するＥＳ／ＥＧ細胞の場合、その未分化状態を維持する因子としてＬＩＦが同定されており（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｈｏｏｐｅｒ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２１：１，１９８７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６８８，１９８８；Ｒａｔｈｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４：２３０８，１９９０）、培養液中にＬＩＦを添加することにより、より効果的に未分化状態を保つことができる（以上、参考書籍として、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４（非特許文献１）や、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）（非特許文献２）等を参照のこと）。
ところが、これらの古典的なＥＳ／ＥＧ細胞の培養法は、特にヒトＥＳ（又はＥＧ）細胞を、再生医療またはその他の実用的な目的のために使用する場合、適した方法であるとは言えない。その理由として、第一に、ヒトＥＳ細胞はＬＩＦに対する反応性を有しておらず、フィーダー細胞が存在しないと当該細胞は死滅するか又は未分化性を失って異種細胞に分化してしまう（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８）ことが挙げられる。また、フィーダー細胞の使用自体にも問題があり、この様な共培養系は生産コストを高めるとともに培養スケールの拡大を困難にし、しかもＥＳ細胞を実際に使用する際に、ＥＳ細胞をフィーダー細胞から分離・精製する必要が生じてくる。また、将来的にヒトＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞を再生医療用、特に細胞移植治療用の細胞ソースとして使用する場合、ＭＥＦ細胞やＦＢＳ等、非ヒト動物に由来する細胞や製品の使用は、ＥＳ細胞が異種動物由来のウイルスに感染する可能性や、異種抗原として認識され得る抗原分子に対する汚染等が危惧され、好ましくない（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１１：２２８，２００５）。
そのため、ＥＳ／ＥＧ細胞の培養法を、より洗練され、将来的な実用化に適した方法に改良するため、ＦＢＳ代替品の開発（国際公開番号ＷＯ９８／３０６７９）や、ＭＥＦ細胞の代わりにヒト細胞をフィーダーとして用いる試み（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：９３３，２００２；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：１３１，２００３；Ｈｏｖａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄ．１８：１４０４，２００３；Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６８：２１５０，２００３）が精力的に進められている。また、フィーダーを使用しない培養法の開発も目覚しい。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ及びその共同研究者らは、ＥＳ細胞をマトリゲル又はラミニンでコーティングした培養プレートに播種し、ＭＥＦ細胞の培養上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を培養液に添加することにより、ヒトＥＳ細胞を未分化かつ分化多能性を保有した状態で長期間培養できることを報告した（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９７１，２００１（非特許文献３）；国際公開番号第０１／５１６１６号（特許文献１）参照）。さらに、同グループは、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２や幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ；以下、ＳＣＦ）を添加した無血清培地を開発することにより、より効果的なＥＳ細胞培養系の構築に成功した（国際公開番号第０３／０２０９２０号（特許文献２）参照）。同様の無血清培地を用いた、フィーダー不要のＥＳ細胞培養系が、イスラエルの研究グループからも報告されている（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７０：８３７，２００４（非特許文献４）参照）。また、最近では、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２と、骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）アンタゴニストであるノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）を添加することにより、ヒトＥＳ細胞の未分化性を維持する方法も報告された（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２：１８５，２００５）。一方、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ：ＧＳＫ）−３阻害剤を培養液に添加するだけで、特に成長因子等の添加をしなくても、フィーダー細胞を使わずにマウス及びヒトＥＳ細胞の未分化性を効率的に維持できることも示されている（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１０：５５，２００４（非特許文献５）参照）。
この様に、フィーダー細胞を使用しない多能性幹細胞の培養法に関し、新しい方法が考案されつつあるが、当該細胞の実用化及び産業的な使用のためには、多能性幹細胞の増殖効果及び培養法の至便性を、より一層、高めることが必要である。
マウスＥＳ／ＥＧ細胞の未分化状態を維持し、かつ、その増殖能を高める因子としては、上記のＬＩＦが公知であり、ＬＩＦに類似するＩＬ−６ファミリー分子もその範疇に含まれる（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４５：１６３，１９９４；Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：１２３５，１９９６参照）が、その他の例はほとんど報告されていない。最近、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２やＳＣＦを添加した無血清培地が、ヒトＥＳ細胞の増殖能を著明に亢進することが報告された（国際公開番号第０３／０２０９２０号（特許文献２）参照）。
従来はそもそもＥＳ細胞の特性、すなわち、当該細胞の増殖性が他の細胞と比較して旺盛であることから増殖能に係る知見を得る試みは少なく、かつ、再生医療現場のニーズから当該細胞の増殖性を高める必要性がある。
現状における多能性幹細胞の培養に関する課題の１つとして、当該細胞は一般に堅固なコロニーを形成するため、継代培養等の際の取り扱いが困難であることが挙げられる。未分化なＥＳ／ＥＧ細胞は、通常、細胞同士が互いに強く接着した状態を呈し、１つ１つの細胞の境界が不明瞭になるほどの細胞集塊、すなわち、コロニーを形成する。そのため、ＥＳ／ＥＧ細胞の継代や、分化誘導等の実験に供する際には、トリプシン等のタンパク質分解酵素溶液で処理し、できるだけ短時間でコロニーを分散させる必要がある。しかしながら、その場合、ＥＳ／ＥＧ細胞のコロニーを分散させ、単一細胞とするためには、比較的高濃度のタンパク質分解酵素処理及び／又は激しい機械的撹拌を施す必要があり、これらの操作はＥＳ／ＥＧ細胞の生存性や生着性を著しく低下させる。
さらに、ＥＳ／ＥＧ細胞は、密集した状態で培養を続けると自発的に分化が進んでしまうので、継代時に単一細胞になるまで分散させること、また、コロニーが過度な大きさに成長する前に継代を行なうことが必要である。例えばマウスＥＳ細胞の場合、通常、２〜３日ごとに継代をする必要があるが、その際、適切な方法で継代を行なわないと、未分化状態を逸脱した細胞が集団中に出現して、使用に適さない細胞となってしまう。これは、単にＥＳ／ＥＧ細胞の未分化性を維持する因子、例えば、上記のＬＩＦやＧＳＫ−３阻害剤を十分量添加しただけでは解決できず、過剰なコロニーの成長は、分化形質を有した細胞の出現を誘起する。そのため、ＥＳ／ＥＧ細胞がコロニーを形成しない状態で、すなわち、細胞が１つずつ分散した状態で増殖させる方法は、ＥＳ／ＥＧ細胞を産業上の利用に供する場合、きわめて有用であると考えられる。しかしながら、この様な試み及び／又は成功例は、これまで皆無であった。
以前、発明者らは、胚性癌腫細胞の一種であり、通常はコロニーを形成して増殖することが知られているＦ９細胞を、Ｅ−カドヘリンをコーティングした培養プレート（Ｎａｇａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４：１８５７，２００２（非特許文献６）参照）に播種することにより、当該細胞のコロニーが形成されなくなることを見い出した（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２００２．０４．１４〜１６、台北、台湾；第１回日本再生医療学会、２００２．４．１８〜１９．、京都、日本）。すなわち、Ｆ９細胞の細胞接着分子として知られるＥ−カドヘリンを無処理のポリスチレン製培養プレートに固相化した培養プレート（以下、Ｅ−ｃａｄプレート）上において、Ｆ９細胞は分散型の細胞形態を呈した。
Ｆ９細胞は、ＥＳ／ＥＧ細胞の特異マーカーとして知られるアルカリ性フォスファターゼ（ＡＬｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；以下、ＡＬＰ）やＳＳＥＡ−１、Ｏｃｔ−３／４等を発現する等、一部、ＥＳ細胞に似た形質を呈する（Ｌｅｈｔｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３３：１０５，１９８９，Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．，３５：３８９，１９９１）。しかしながら、Ｆ９細胞の場合、フィーダー細胞やＬＩＦ等は当該細胞の未分化性を維持するために必要とはされず、その未分化維持機構には差異が認められる。また、ＥＳ細胞は三胚葉への分化能を有しているのに対し、Ｆ９細胞の分化は内胚葉系細胞に限られており、キメラ形成能も有さない。すなわち、Ｆ９細胞は、ある種の実験ではＥＳ／ＥＧ細胞のモデル系として使用される場合もあるけれども、培養法や培養条件に関しては、ＥＳ／ＥＧ細胞と異なる点が多い。
そのため、上記Ｅ−ｃａｄプレートを、フィーダー細胞を必要としないＥＳ細胞培養法に適用し得るか、また、その様な方法で培養したＥＳ細胞が未分化性及び分化多能性を保持した状態で継代培養し得るか、さらには当該ＥＳ細胞の増殖能を促進し得るか等の点に関しては、科学的根拠に基づいて予測することはできなかった。実際、Ｅ−ｃａｄプレートで培養したＦ９細胞の増殖能は、従来の細胞培養用プレートで培養したＦ９細胞とほぼ同等であり、ＥＳ細胞の増殖能を促進し得ることを類推できる事実は得られなかった。
Ｅ−カドヘリンは、未分化なマウスＥＳ細胞で発現していることが公知であり、また、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を遺伝子工学的に欠失させたＥＳ細胞では、その細胞間接着が著しく阻害されることが知られている（Ｌａｒｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：３１８５，１９９６）。しかしながら、ＥＳ／ＥＧ細胞の培養法において、Ｅ−カドヘリンを接着基質として使用する試みは、これまで皆無であった。
上記の効率的な増殖法に加え、ＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞を、研究材料若しくは再生医療製品の作製のために使用する場合、当該細胞に対し、所望する外来遺伝子を効率的に細胞内に導入し、発現させるための方法の構築も必要とされる。特にＥＳ細胞を様々な疾患治療等の再生医療に応用していくためには、当該細胞の増殖能や分化能などの細胞特性、又は薬剤感受性などを変えることも１つの手段として考えられ、その実現のためには、適当な外来遺伝子を細胞内に導入し、発現させる方法が好適である。また、マウスＥＳ細胞の場合、その遺伝子を人為的に改変することにより、いわゆるトランスジェニックマウスやノックアウトマウス等の作製ができることも広く公知であり、この場合も効率的な遺伝子導入法はきわめて有用である。
一般的に細胞に外来遺伝子を導入する場合、リン酸カルシウムやＤＥＡＥ−デキストラン、更にはカチオン性脂質製剤等を用いる方法が頻用される。しかし、これらの方法をＥＳ細胞に適用した場合、他の細胞系と比較してその効率は低いことが知られている（Ｌａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：５３１，２００４（非特許文献８）参照）。また、外来遺伝子を導入するための方法として、各種ウイルスベクターを用いた方法も報告されている。例えば、レトロウイルス・ベクター（Ｃｈｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０：７４１９，２０００）やアデノウイルス・ベクター（Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ５：５１，２００３）、レンチウイルス・ベクター（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１０７７８，２０００；Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：１６２，２００２；国際公開番号第ＷＯ０２／１０１０５７）、センダイウイルス・ベクター（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：２０３，２００５；日本国特許公開番号第２００４−３４４００１）等が公知である。しかしながら、ウイルスベクターの構築及び作製には比較的煩雑かつ長期の作業を必要とするとともに、用いるウイルスによっては生物学的安全性の問題も懸念され、簡便かつ汎用的な方法とは言えない。
そのため、ＥＳ細胞に外来遺伝子を導入する場合、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる方法が頻用される。本法は、細胞に電気パルスをかけることにより、細胞膜に一過的に孔を開け、外来遺伝子を細胞内に導入させる方法であり、汎用性が高い。最近では、方法の改良法として、外来遺伝子を細胞核内にまで導入し、その発現効率を著しく向上させる、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎと呼ばれる方法も確立されている（Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．２６：１５８９，２００４；Ｌａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：５３１，２００４（非特許文献８）参照）。ただし、これらの方法は特別な電気パルス発生装置を必要とし、至適条件の設定も難しい。また、細胞をいったんトリプシン等の蛋白分解酵素で処理して単一細胞に分散させる必要もあり、細胞傷害性も比較的高い。
そのため、ＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞の遺伝子導入法において、安価に購入できる、又は簡便に作製できる遺伝子導入剤を用い、細胞を培養器上で培養したままの状態で効率的に外来遺伝子を導入し得る方法は、きわめてその有用性が高いと考えられる。
［非特許文献１］Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４
［非特許文献２］Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）
［非特許文献３］Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９７１，２００１
［非特許文献４］Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７０：８３７，２００４
［非特許文献５］Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１０：５５，２００４
［非特許文献６］Ｎａｇａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４：１８５７，２００２
［非特許文献７］Ｎａｇａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：２４３，２００３
［非特許文献８］Ｌａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：５３１，２００４
［特許文献１］国際公開番号第０１／５１６１６号
［特許文献２］国際公開番号第０３／０２０９２０号
発明の概要
以上の様な背景から、本発明では、ＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞を、フィーダー細胞を用いずに培養する方法に関し、当該細胞の増殖能を促進する方法、及び遺伝子導入効率を高める方法の提供を課題とする。
上記課題を解決するために、発明者らは、ＥＳ細胞を、コロニーを形成しない状態、すなわち、分散状態で培養することにより、当該細胞の増殖能が促進される可能性、及び遺伝子導入効率が促進される可能性について検討を行なった。
上述のように、本発明者らは、胚性癌腫細胞の一種であるＦ９細胞を、コロニーを形成しない状態、すなわち、分散状態で培養することに成功している。Ｅ−カドヘリンを固相表面に固定又はコーティングした細胞培養プレート（Ｅ−ｃａｄプレート）を作製し、そのプレート上にＦ９細胞を播種したところ、当該Ｆ９細胞はコロニーを形成せず、分散型の細胞形態を呈した。その際、Ｅ−ｃａｄプレートで培養したＦ９細胞と、通常プレートで培養したＦ９細胞の増殖能はほぼ同じであった。
ＥＳ細胞をＥ−ｃａｄプレートに播種してみたところ、ほぼすべての細胞が当該プレートに付着し、Ｆ９細胞と同様に、コロニーを形成せず、分散型の細胞形態を呈することがわかった。特筆すべきことに、本培養条件において、Ｅ−ｃａｄプレートに播種したＥＳ細胞の増殖能は、通常プレートで培養したＥＳ細胞の増殖能よりも有意に高いことが示された。また、外来遺伝子の導入効率並びに発現量も有意に高いことが示された。
Ｅ−ｃａｄプレート上で複数回継代培養したＥＳ細胞は、液体培地に未分化性を維持する因子等を添加することにより、未分化状態を保ち、多分化能を維持できることも確認できた。また、当該方法により調製されたＥＳ細胞は、既知の方法を用いることにより神経細胞や心筋細胞といった機能的分化細胞を分化誘導できること、さらにはマウス初期胚に移植することによりキメラマウスを作製できることも併せて証明し、本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は、第１の態様において、ＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞の増殖方法に関し、フィーダー細胞を使用しない新規の増殖方法を提供する。本発明の方法は、多能性幹細胞が接着性を有する分子を一定濃度で基材固相表面に固定又はコーティングした培養容器を用いることを特徴とし、当該細胞を分散状態で培養させ、その増殖能を高めることが可能である。この様にして調製された多能性幹細胞は、未分化性及び分化多能性を保持している。
第２の態様において、本発明の方法は、多能性幹細胞が接着性を有する分子を一定濃度で基材固相表面に固定又はコーティングした培養容器を用いることを特徴とし、当該細胞を分散状態で培養させることにより、当該細胞に対する遺伝子導入効率を高めることが可能である。
別の実施態様として、本発明は、本発明で開示された方法により調製された、未分化性及び分化多能性を有した多能性幹細胞に関する。本開示において、多能性幹細胞の「未分化な」状態とは、少なくとも１つ以上の未分化マーカーの発現により確認することができる。
また別の実施態様において、本発明は、本発明で開示された方法により調製された多能性幹細胞から、適当な分化誘導処理により作製した分化細胞に関する。分化細胞としては、一般的に多能性幹細胞から分化誘導することができる種の細胞であれば、特にこれを限定しない。具体的には、外胚葉細胞又は外胚葉由来の細胞、中胚葉細胞又は中胚葉由来の細胞、内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞等が挙げられる。
さらに別の実施態様として、本発明は、本発明で開示された方法により調製された多能性幹細胞を用いてキメラ胚又はキメラ動物を作製する方法、及び作製したキメラ胚またはキメラ動物に関する。
本発明は主に以下の事項に関する。
（１）多能性幹細胞の増殖方法において、液体培地と、当該多能性幹細胞と接着性を有する分子を基材固相表面に固定又はコーティングした培養容器とを用いることにより、当該多能性幹細胞を、フィーダー細胞を使用せずに、その未分化性及び分化多能性を保持したまま分散状態で、増殖させることを特徴とする、前記方法。
（２）多能性幹細胞の遺伝子導入法において、液体培地と、当該多能性幹細胞と接着性を有する分子を基材固相表面に固定又はコーティングした培養容器とを用いることにより、当該多能性幹細胞に効率的に遺伝子を導入、発現させることを特徴とする、前記方法。
（３）前記多能性幹細胞と接着性を有する分子が、前記多能性幹細胞において発現する分子であるか、又は当該分子と構造的に類似性を有する分子であって当該多能性幹細胞と同種親和性の結合能を有する分子である、前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記多能性幹細胞と接着性を有する分子が、カドヘリン・ファミリーに属する分子である、前記（３）に記載の方法。
（５）前記カドヘリン・ファミリーに属する分子が、Ｅ−カドヘリンであるか、又は当該分子と構造的に類似性を有する分子であってＥ−カドヘリンに係るＥＣ１ドメイン並びにＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、ＥＣ４ドメイン及びＥＣ５ドメインのうち１つ以上のドメインを含み、かつ、前記多能性幹細胞と同種親和性の結合能を有する分子である、前記（４）に記載の方法。
（６）前記Ｅ−カドヘリンが哺乳動物由来である、前記（５）に記載の方法。
（７）前記Ｅ−カドヘリンがヒト又はマウス由来である、前記（６）に記載の方法。
（８）前記多能性幹細胞と接着性を有する分子が、免疫グロブリンのＦｃ領域と融合され、当該Ｆｃ領域を介して前記基材固相表面に固定される、前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記多能性幹細胞が、哺乳動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）である、前記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法により製造された多能性幹細胞。

図１：ポリスチレン製プレートにコーティングしたＥ−ｃａｄ−Ｆｃに対するＥＳ細胞（Ｒ１細胞株とＥＢ３細胞株）の接着性を示す。接着率はゼラチン（０．１％）をコーティングしたプレートへのＥＳ細胞の接着数を１００％とした時の相対値を示す。ＢＳＡ：０．１％ウシ血清アルブミンをコーティングしたプレートにＥＳ細胞を接着させた群。※：ゼラチン群に対し、ｐ＜０．０１。
図２：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種したＥＳ細胞の形態を示す。ＥＳ細胞をゼラチン、Ｉ型コラーゲン、フィブロネクチン、又はＥ−ｃａｄ−Ｆｃをコーティングしたプレート（図中、それぞれＧｅｌ．、Ｃｏｌ．、Ｆｎ．、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃと表記）に播種した後２日目の細胞像。
図３Ａ：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種したＥＳ細胞の増殖能を示す。ＥＳ細胞をゼラチン・プレート（図中Ｃｏｎｔ）又はＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種し、３日目の細胞数を比較した。※：Ｃｏｎｔ群に対し、ｐ＜０．０１。
図３Ｂ：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種したＥＳ細胞のＢｒｄＵ取り込み能を示す。ＥＳ細胞（ＥＢ３）をゼラチン・プレート（図中Ｃｏｎｔ）又はＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種し、ＢｒｄＵで標識した。３日後に細胞内に取り込まれたＢｒｄＵを、蛍光色素を用いた抗体染色により検出し、その蛍光強度を測定した。※：Ｃｏｎｔ群に対し、ｐ＜０．０１。
図４Ａ：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種したＥＳ細胞における未分化マーカーの発現。ＥＳ細胞（ＥＢ３細胞株）をゼラチン・プレート（図中Ｃｏｎｔ）又はＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種し、培養１４日目にＡＬＰ活性の検出を行なった。図中ＬＩＦ（＋）及び（−）は、それぞれ培養用培地にＬＩＦを添加／未添加したことを示す。
図４Ｂ：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種したＥＳ細胞における未分化マーカーの発現。ＥＳ細胞（ＥＢ３細胞株）をゼラチン・プレート（図中Ｃｏｎｔ）又はＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種し、培養１４日目にＯｃｔ−３／４タンパク質の検出を行なった。ＤＡＰＩによる核染色像。Ｍｅｒｇｅｄ：ＤＡＰＩとＯｃｔ−３／４抗体による染色像を重ね合わせたもの。
図５：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種したＥＳ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現。ＥＳ細胞をゼラチン・プレート（図中Ｃｏｎｔ）又はＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種し、培養１４日目にＯｃｔ−３／４及びＲｅｘ−１遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法で調べた。図中＋及び−は、それぞれ、培養用培地へのＬＩＦの添加と非添加を示す。
図６：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種したＥＳ細胞のＬＩＦ反応性を示す。ＥＳ細胞（Ｒ１株）をゼラチン・プレート（図中Ｃｏｎｔ）又はＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種し、各種ＬＩＦ濃度で培養した後にコロニーを形成させ、そのＡＬＰ活性を検出することにより、「未分化型」コロニーの割合を測定した。※：Ｃｏｎｔ／ＬＩＦ １０００Ｕ／ｍＬ群に対し、ｐ＜０．０５。
図７：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで継代培養したＥＳ細胞の分化多能性。ゼラチン・プレート（図中Ｃｏｎｔ）又はＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種し、継代培養したＥＳ細胞（Ｒ１株）を回収し、ＬＩＦ非添加培地中でＥＢを形成させることにより分化誘導を行なった。ＥＢ形成後１６日目に回収したサンプル（図中、ＥＢ）を用い、各種分化マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法にて検討した。対照群として、上記の継代培養を行なう前のＥＳ細胞、及び当該細胞を用いて形成させた１６日目のＥＢ（それぞれ、図中の左から１番目と２番目）を用いた。Ｔ／Ｂｒａ：Ｔ／Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、βＨｌ：ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、ＡＦＰ：α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＴＴＲ：ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ、ＧＡＰＤＨ：ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ。
図８：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで継代培養したＥＳ細胞の分化多能性を示す。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種したＥＳ細胞（Ｒ１株）を神経細胞（上）及び心筋細胞（下）に分化誘導した。分化誘導後１２日目に細胞を固定し、神経細胞及び心筋細胞に特異的なマーカー分子の抗体で染色した像を示す。
図９：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞の生殖細胞寄与能を示す。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞から作出したキメラマウスを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６系マウスと交配して得られた仔マウスについて、２種のマイクロサテライト・マーカーを用いてＰＣＲ解析を行った。Ｍ：ＤＮＡサイズ・マーカー、ＥＳ：ＥＳ細胞（ＥＢ３株）、Ｂ６：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、＃１〜＃４：毛色からＥＳ細胞が寄与していないと予想した個体、＃５〜＃８：毛色からＥＳ細胞が寄与していると予想した個体。縦軸の数値はＤＮＡのサイズ（ｂｐ）を示す。
図１０：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種したＥＳ細胞の遺伝子導入・発現効率を示す。ＥＳ細胞（ＥＢ３）をゼラチン・プレート（図中Ｃｏｎｔ）又はＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種し、ＧＦＰ発現ベクターを遺伝子導入した。１日後に細胞内のＧＦＰ蛋白を、蛍光色素を用いた抗体染色により検出し、その蛍光強度を測定した。※：Ｃｏｎｔ群に対し、ｐ＜０．０１。
図１１：ヒト型Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種したＥＳ細胞の形態を示す。ＥＳ細胞をゼラチン（Ｃｏｎｔ）又はＥ−ｃａｄ−Ｆｃをコーティングしたプレートに播種した後２日目の細胞像。
発明の詳細な説明
定義
本明細書中に使用するとき、用語「多能性幹細胞」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養により未分化状態を保ったまま、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）すべての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞をいう。「多能性幹細胞」は、初期胚より単離されるＥＳ細胞、及びその類似細胞であり、胎児期の始原生殖細胞から単離されるＥＧ細胞を含むが、これに限定されない。本明細書中、「ＥＳ細胞」と表記した場合は「ＥＧ細胞」も含むこともある。
本明細書中に使用するとき、用語「未分化性」とは、多能性幹細胞において、少なくとも１つ以上の未分化マーカー、例えばＡＬＰ活性やＯｃｔ−３／４遺伝子（産物）の発現、または種々の抗原分子の発現により確認することができる未分化な状態を呈する性質を意味する。多能性幹細胞における未分化な状態とは、多能性幹細胞が、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉すべての系譜の細胞に分化する能力をもった状態を意味する。
本明細書中に使用するとき、用語「分化多能性」とは、様々な種類の細胞に分化する能力をいう。分化細胞としては、一般的に多能性幹細胞から分化誘導することができる種の細胞であれば、特にこれを限定しない。具体的には、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞、中胚葉細胞または中胚葉由来の細胞、内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞等が挙げられる。
本明細書中に使用するとき、用語「液体培地」とは、多能性幹細胞を継代培養する従来の方法に適用することができる液体培地をすべて含む。
本明細書中に使用するとき、用語「多能性幹細胞と接着性を有する分子」とは、多能性幹細胞と親和性をもって結合・付着する分子であればよく、タンパク質、ペプチド、糖鎖、低分子化合物（薬剤）等、形状は特に問わない。多能性幹細胞の接着分子としては、当該細胞に発現し、同種親和性の結合能を有した分子が好ましく、例えばカドヘリン・ファミリー分子が挙げられる。未分化なＥＳ細胞の場合、Ｅ−カドヘリンを発現していることが知られており、当該分子の利用が好適であるが、特にこれに限定しない。これらの接着性分子がタンパク質性またはペプチド性分子である場合、そのペプチド断片が当該タンパク質またはペプチド分子と同様の接着活性を有するものであれば、これも使用できる。
多能性幹細胞と接着性を有する分子は、培養容器または培養基材（以下、培養基材とする）の固相表面に固定又はコーティングすることにより、本発明の培養法に使用することができる。本発明の培養基材としては、プレートやフラスコ等、従来から細胞培養に用いられているもののいずれをも使用できる。これらの培養基材は、ガラス等の無機材料、またはポリスチレンやポリプロピレン等の有機材料のいずれかからなることができるが、滅菌可能な耐熱性及び耐水性を有している材料からなるものが好ましい。
多能性幹細胞と接着性を有する分子を、培養基材の固相表面に固定又はコーティングする方法としては、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。また、前もって接着性分子に人為的に抗原性分子を付加・融合させておき、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもできる。この場合、特異抗体を、前もって培養基材の固相表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって、固定又はコーティングしておく必要がある。
上述の様に作製した培養基材は、多能性幹細胞の通常の培養法にそのまま使用することができる。すなわち、適当数の多能性幹細胞を、通常用いられる液体培地又は細胞培養液に懸濁し、それを当該培養基材に添加すればよい。その後の液体培地の交換や継代も、従来法と同様に行なうことができる。
本明細書中に使用するとき、用語「同種親和性の結合」とは、細胞接着において、細胞−細胞又は細胞−基材間の接着性分子を介した結合において、同じ種類の接着性分子同士が結合又は会合することによりなされているものを意味する。
本明細書中に使用するとき、用語「フィーダー細胞」とは、支持細胞とも称され、単独では生存・培養できない細胞を培養する際に、あらかじめ培養され、培地中に不足する栄養分や増殖因子の補給などの役割を担う別の細胞をいう。「フィーダー細胞」には、ＭＥＦ細胞や、ＳＴＯ細胞等の間質系細胞を含むが、これに限定されない。
本明細書中に使用するとき、用語「分散状態」とは、細胞が培養基材表面に接着した状態で生育している場合において、明確なコロニーを形成せず、個々の細胞が他の細胞と接触していない、または、一部接触していても、その接触領域がごく小さい状態を意味する。
本明細書中に使用するとき、用語「遺伝子」とは遺伝物質を指し、転写単位を含む核酸を言う。遺伝子はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、天然由来又は人為的に設計された配列であり得る。また、遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、例えば遺伝子はリボザイムやｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ／ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｅｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）等の機能的ＲＮＡをコードするものであってもよい。
本発明の上記効果や他の利点および特徴を、以下の好適な実施態様の詳細な説明において詳述する。
本発明の実施において、分子生物学や組換えＤＮＡ技術等の遺伝子工学の方法及び一般的な細胞生物学の方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＆ Ｓｔｒｉｌｉｎｇ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００３）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ第３版（Ｍａｓｔｅｒｓ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ａｎｔｉｂｏｉｄｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．＆ Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８７）等を参照のこと。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＳｉｇｍａ社やＡｌｄｒｉｃｈ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社等の市販業者から入手可能である。
また、多能性幹細胞を用いた細胞培養、及び発生・細胞生物学実験の一般的方法について、実施者は、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）が含まれる。本明細書において参照される細胞培養、発生・細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社やＳｉｇｍａ社等の市販業者から入手可能である。
マウス及びヒトの多能性幹細胞の作製、継代、保存法については、すでに標準的なプロトコールが確立されており、実施者は、前項で挙げた参考書籍に加えて、複数の参考文献（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７０：８４１，１９９２；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，０９０，６２２号；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００；国際公開番号第００／２７９９５号）等を参照することにより、これらの多能性幹細胞を使用し得る。また、その他の動物種に関しても、例えばサル（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８４３，７８０号；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，７８４４，１９９６）やラット（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３：２８８，１９９４；Ｌｏｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，国際公開番号第９９／２７０７６号）、ニワトリ（Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：２３３９，１９９６；米国特許第５，３４０，７４０号；米国特許第５，６５６，４７９号）、ブタ（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：５６３，１９９４；Ｓｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５７：１０８９，１９９７）等に関してＥＳ細胞又はＥＳ細胞様細胞の樹立方法が知られており、各記載の方法に従って、本発明に用いられるＥＳ細胞を作製することができる。
ＥＳ細胞とは、胚盤胞期胚の内部にある内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）と呼ばれる細胞集塊をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に移し、細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより、未分化幹細胞集団として単離した多能性幹細胞である。マウス由来ＥＳ細胞としては、Ｅ１４、Ｄ３、ＣＣＥ、Ｒ１、Ｊ１、ＥＢ３等、様々なものが知られており、一部はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社やＣｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｔｈｒｏｍｂ−Ｘ社等から購入することも可能である。ヒト由来ＥＳ細胞は、現在、全世界で５０種以上が樹立されており、米国・国立衛生研究所（ＮＩＨ）のリスト（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ）には２０種以上の株が登録されている。その一部はＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社やＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎから購入することが可能である。
ＥＳ細胞は、一般に初期胚を培養することにより樹立されるが、体細胞の核を核移植した初期胚からもＥＳ細胞を作製することが可能である（Ｍｕｎｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：９８９，２０００；Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：７４０，２００１；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：１６６９，２００４）。また、異種動物の卵細胞、又は脱核した卵細胞を複数に分割した細胞小胞（ｃｙｔｏｐｌａｓｔｓやｏｏｐｌａｓｔｏｉｄｓと称される）に、所望する動物の細胞核を移植して胚盤胞期胚様の細胞構造体を作製し、それを基にＥＳ細胞を作製する方法も考案されている（国際公開番号第９９／４５１００号；第０１／４６４０１号；０１／９６５３２号；米国特許公開第０２／９０７２２号；０２／１９４６３７号）。また、単為発生胚を胚盤胞期と同等の段階まで発生させ、そこからＥＳ細胞を作製する試み（米国特許公開第０２／１６８７６３号；Ｖｒａｎａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１１９１１−６）や、ＥＳ細胞と体細胞を融合させることにより、体細胞核の遺伝情報を有したＥＳ細胞を作る方法も報告されている（国際公開番号第００／４９１３７号；Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：１５５３，２００１）。本発明で使用されるＥＳ細胞は、この様な方法により作製されたＥＳ細胞又はＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。
本発明に使用できるＥＧ細胞は、始原生殖細胞と呼ばれる胎児期の生殖細胞を、ＥＳ細胞の場合と同様、ＭＥＦ細胞やＳＴＯ細胞、Ｓｌ／Ｓｌ^４−ｍ２２０細胞等のフィーダー上で、ＬＩＦ及びｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２、又はフォルスコリン等の薬剤で刺激することにより作製されたものであり（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７０：８４１，１９９２；Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：１２３５，１９９６）、ＥＳ細胞ときわめて類似した性質を有している（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＆ Ｏｄｏｒｉｃｏ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５３，２０００）。ＥＳ細胞の場合と同様、ＥＧ細胞と体細胞を融合させて作製したＥＧ細胞（Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：６５１０，１９９７；Ａｎｄｒｅｗら）やＥＧ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学的手法により改変したものも、本発明の方法に使用することができる。
また、本発明に係る増殖方法を用いることができる多能性幹細胞は、ＥＳ細胞やＥＧ細胞のみに限らず、哺乳動物の胚や胎児、臍帯血、又は成体臓器や骨髄等の成体組織、血液等に由来する、ＥＳ／ＥＧ細胞に類似した形質を有するすべての多能性幹細胞が含まれる。例えば生殖細胞を特殊な培養条件下で培養することにより得られるＥＳ様細胞は、ＥＳ／ＥＧ細胞ときわめて良く似た形質を呈しており（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１９：１００１，２００４）、多能性幹細胞として使用することができる。その他の例としては、骨髄細胞から単離され、三胚葉すべての系譜の細胞に分化能を有する多能性成体幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ／ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＭＡＰＣ）を挙げることができる。また、毛根鞘細胞やケラチノサイト（国際公開番号第０２／５１９８０号）、腸管上皮細胞（国際公開番号第０２／５７４３０号）、内耳細胞（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：１２９３，２００３）等を特別な培養条件下で培養することにより得られた多能性幹細胞や、血液中の単核球細胞（又はその細胞核分に含まれる幹細胞）をＭ−ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ；マクロファージコロニー刺激因子）＋ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ）処理（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：２４２６，２００３）、又はＣＲ３／４３抗体処理（Ａｂｕｌｊａｄａｙｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｏｐｉｎｉｏｎ １９：３５５，２００３）することにより作製される多能性幹細胞等に関しても、ＥＳ／ＥＧ細胞と類似の形質を有する幹細胞であればすべて含まれる。この場合、ＥＳ／ＥＧ細胞と類似の形質とは、当該細胞に特異的な表面（抗原）マーカーの存在や当該細胞特異的な遺伝子の発現、さらにはテラトーマ形成能やキメラマウス形成能といった、ＥＳ／ＥＧ細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義することができる。
本発明は、ＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞の培養法に関し、多能性幹細胞と接着性を有する分子（以下、多能性幹細胞の接着性分子ともいう）を用いることを特徴とする。本発明の実施において、多能性幹細胞の接着性分子は、培養容器又は培養器材（以下、培養基材ともいう）の固相表面に固定又はコーティングされることにより、本発明の培養法に使用される。本発明の培養基材としては、多能性幹細胞を培養できるものであればいかなるものでも用いることができるが、好ましくは従来から細胞培養用に用いられるものが望ましい。細胞培養用の培養基材としては、例えば、ディッシュやプレート、フラスコ、チャンバースライド、チューブ、セルファクトリー、ローラーボトル、スピンナーフラスコ、フォロファイバー、マイクロキャリア、ビーズ等が挙げられる。これらの培養基材は、ガラス等の無機材料又はポリスチレン等の有機材料のいずれからなっていてもよいが、蛋白質やペプチド等に対する吸着性が高いポリスチレン等の材料や、又は吸着性を高める処理、例えば親水処理や疎水処理等を施した材料の使用が好適である。また、滅菌可能な耐熱性及び耐水性を有している材料からなるのが好ましい。そのための好適な器材の一例としては、主に大腸菌等の培養に頻用される、細胞培養用の処理を特にしていないポリスチレン製ディッシュ及び／又はプレート（以下、無処理ポリスチレン製プレートと称する）を挙げることができ、当該培養基材は一般に市販されている。 多能性幹細胞の接着性分子とは、多能性幹細胞と親和性をもって結合・付着する分子であればよく、タンパク質、ペプチド、糖鎖、低分子化合物、又はこれらの２種以上から構成される分子等、形状は特に問わない。未分化状態のＥＳ／ＥＧ細胞に対する接着性分子に関しては、あまり報告例がないが、例えば、イムノグロブロリン・スーパーファミリーに属するＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ等が発現していることが知られている（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５７：５６１，１９９７）。多能性幹細胞の接着性分子は、好ましくは、使用する多能性幹細胞の細胞膜表面に発現していること、さらに好ましくは同種親和性の結合能を有した分子が望ましい。細胞接着における同種親和性の結合とは、細胞−細胞又は細胞−基質間の接着性分子を介した結合において、同じ種類の接着性分子同士が結合・会合することによりなされているものを意味する。この様な性質を示す接着分子としては、ＮＣＡＭやＬ１、プレキシン、カドヘリン等が知られているが、その中でも接着性の強さからカドヘリン・ファミリー分子の使用が好適である。未分化状態のＥＳ細胞の場合、Ｅ−カドヘリンが特異的に発現している（Ｌａｒｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：３１８５，１９９６）ことが報告されているため、当該分子の使用が更に好適である。しかしながら、使用する接着性分子としては、Ｅ−カドヘリンのみに限定されるわけではなく、使用する多能性幹細胞に発現しているカドヘリン・ファミリー分子又は同種親和性の接着性分子であれば、使用することができる。また、通常のＥＳ細胞に発現していなくても、遺伝子工学的手法により、同種親和性の結合能を有した分子をコードする遺伝子の全長若しくは一部分を恒常的に発現する様、ＥＳ細胞に遺伝子改変を加えることにより、当該分子を本発明の方法に使用することも可能である。
カドヘリンとは、接着結合又はアドヘレンス・ジャンクション（ａｄｈｅｒｅｎｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）と呼ばれるＣａ^２＋依存性の細胞間接着・結合に関与する接着分子であり、Ｅ（上皮）型、Ｎ（神経）型、Ｐ（胎盤）型の３種が代表例として知られている。これらのカドヘリン分子は、７００〜７５０アミノ酸残基からなる膜結合型糖タンパク分子であり、その細胞外領域には、約１１０アミノ酸残基からなる繰り返し構造、いわゆるＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＥＣ）ドメインと呼ばれる領域が５個存在する。例えば、ヒトＥ−カドヘリン（そのアミノ酸配列を配列番号１に示す）の場合、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５の各ドメインは、それぞれ１５７〜２６２、２６５〜３７５、３７８〜４８６、４８７〜５９５、５９６〜７００に相当する（数値は配列番号１に示すアミノ酸配列内の残基の番号である）。また、マウスＥ−カドヘリン（そのアミノ酸配列を配列番号２に示す）の場合、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５の各ドメインは、それぞれ１５９〜２６４、２６７〜３７７、３８０〜４８８、４８９〜５９７、５９８〜７０２に相当する（数値は配列番号２に示すアミノ酸配列内の残基の番号である）。これらのＥＣドメインは、異なるカドヘリン分子種の間で相同性を有しており、特にＮ末端側に位置するドメイン（ＥＣ１、ＥＣ２）の相同性が高い。この様な類似の構造を呈するカドヘリン分子としては、現在、５０種類以上のものが知られており、これらの分子を総称してカドヘリン・ファミリーと呼ぶ。以上、カドヘリンに関する総説としては、Ｔａｋｅｉｃｈｉ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：６１９，１９９５；Ｍａｒｒｓ ＆ Ｎｅｌｓｏｎ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１６５：１５９，１９９６；Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３：１１９，１９９７；Ｙａｇｉ ＆ Ｔａｋｅｉｃｈｉ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：１１６９，２０００；Ｇｕｍｂｉｎｅｒ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４８：３９９，２０００、等を参照のこと。
Ｅ−カドヘリン（別名、カドヘリン−１）は、肝臓や腎臓、肺等の内臓臓器の実質細胞やケラチノサイト等の上皮細胞に広く発現し、その細胞間接着を担う重要な接着分子であることが知られている（総説として、Ｍａｒｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７：２２７，１９９３；Ｍａｙｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．６０：７６３，１９９５；Ｅｌ−Ｂａｈｒａｗｙ ＆ Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉ、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．４３：２２４，１９９８；Ｎｏｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：７７，１９９９）。また、Ｅ−カドヘリンは、未分化なマウスＥＳ細胞にも強く発現しており、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を遺伝子工学的に欠失させたＥＳ細胞は、細胞間接着が著しく阻害されることが知られている（Ｌａｒｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：３１８５，１９９６）。また、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の公的な遺伝子発現データベースに登録されている情報から、Ｅ−カドヘリン遺伝子がヒトＥＳ細胞株でも発現していることが確認できる。
本発明の実施において、Ｅ−カドヘリンをはじめとするカドヘリン分子又はその他の接着性分子を作製する方法としては、特にこれを限定しないが、当該分子がタンパク質性又はペプチド性の分子であれば、分子生物学的手法を用いてリコンビナント・タンパク質を作製・精製し、これを使用することが望ましい。その他にも、同様の効果を示す方法であれば、いずれをも用いることができ、例えば、多能性幹細胞の接着性分子を、生体組織・細胞から抽出、精製して使用すること、又は当該ペプチドを化学的に合成して使用することも可能である。
多能性幹細胞の接着性分子に関し、そのリコンビナント・タンパク質を作製するための方法、及び当該分子をコードする遺伝子を取得する方法は、すでに標準的なプロトコールが確立されており、実施者は、上記で挙げた参考書籍を参照することができるが、特にこれを限定しない。Ｅ−カドヘリンを例とした場合、Ｅ−カドヘリン遺伝子は、既にヒト（配列番号１）、マウス（配列番号２）、ラット等の動物で単離・同定され、その塩基配列が、ＮＣＢＩ等の公的なＤＮＡデータベースにおいて利用可能である（アクセス番号：（ヒト）ＮＭ＿００４３６０；（マウス）ＮＭ＿００９８６４；（ラット）ＮＭ＿０３１３３４）。そのため、当業者であれば、Ｅ−カドヘリン遺伝子に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、Ｅ−カドヘリン遺伝子のｃＤＮＡを取得・使用することが可能である。また、Ｅ−カドヘリン遺伝子のｃＤＮＡは、理化学研究所ジーンバンク（日本・筑波）やＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／ＲｅｓＧｅｎ等からも購入することができる。使用する接着性分子をコードする遺伝子としては、多能性幹細胞が由来する種と同種の動物由来のものが好ましく、例えば、マウスＥＳ細胞を用いて本発明を実施する場合、マウスのＥ−カドヘリンｃＤＮＡの使用が望ましい。しかし、異種動物由来のもの、即ち、ヒトやサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、又は鳥類（例えば、ニワトリ等）、又は両生類（例えば、アフリカツメガエル等）由来のＥ−カドヘリンｃＤＮＡも使用することができる。
本発明を実施するために用いる接着性分子のリコンビナント・タンパク質を作製するための好適な方法の一例は、当該分子をコードする遺伝子を、ＣＯＳ細胞や２９３細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞に導入し、発現させることを特徴としている。好ましくは、当該遺伝子は、広範な哺乳動物細胞における遺伝子の転写および発現を可能にする核酸配列、いわゆるプロモーター配列と、当該プロモーターの制御下に転写・発現が可能になる様な形で連結される。また、転写・発現させる遺伝子は、さらにポリＡ付加シグナルと連結されることが望ましい。好適なプロモーターとしては、ＳＶ（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ）４０ウイルスやサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏ Ｖｉｒｕｓ；ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）等のウイルスに由来するプロモーターや、β−アクチン・プロモーター、ＥＦ（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター等が挙げられる。
上記のリコンビナント・タンパク質を作製するために用いる遺伝子は、当該分子をコードする遺伝子の全長領域を含むものである必要はなく、部分的な遺伝子配列であっても、その部分配列がコードするタンパク質またはペプチド分子が、本来の当該分子と同程度、又はそれ以上の接着活性を有するものであればよい。例えば、本発明の好適な事例に用いられるＥ−カドヘリンの場合、細胞外領域をコードする、Ｎ末端側から６９０〜７１０アミノ酸残基を含む部分配列から作製されるリコンビナント・タンパク質、すなわちＥＣ１〜ＥＣ５ドメインを含むタンパク質を使用することができる。また、一般的にカドヘリン分子は、最もＮ末端側に位置するドメイン（ＥＣ１）が、当該分子の結合特異性、すなわち、同種親和性を規定している（Ｎｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６１：１４７，１９９０）ため、少なくともＥＣ１を含み、それ以外のドメインの１個又は数個を除いたタンパク質分子を作製、使用することも可能である。さらには、上記のタンパク質分子と、アミノ酸レベルで８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を示し、かつ、接着活性を有するタンパク質も使用することができる。
また、上記のリコンビナント・タンパク質は、他のタンパク質やペプチドとの融合タンパク質として作製することも可能である。例えば、イムノグロブリンのＦｃ領域やＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タンパク質、ＭＢＰ（Ｍａｎｎｎｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質、アビジン・タンパク質、Ｈｉｓ（オリゴ・ヒスチジン）タグ、ＨＡ（ＨｅｍＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｒｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）タグ等との融合タンパク質として作製し、プロテインＡ／Ｇカラムや特異的抗体カラム等を用いることにより、リコンビナント・タンパク質の精製を容易に、しかも効率よく行なうことができる。特にＦｃ融合タンパク質は、ポリスチレン等を材料とした培養基材に吸着する能力が高まるため、本発明の実施において好適である。
イムノグロブリンのＦｃ領域をコードする遺伝子は、既にヒトをはじめとする哺乳動物で、多数、単離・同定されている。その塩基配列も数多く報告されており、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＦｃ領域を含む塩基配列の配列情報は、ＮＣＢＩ等の公的なＤＮＡデータベースにおいて利用可能であり、それぞれ、アクセス番号：ＡＪ２９４７３０、ＡＪ２９４７３１、ＡＪ２９４７３２、及びＡＪ２９４７３３として登録されている。したがって、当業者であれば、Ｆｃ領域に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、Ｆｃ領域部分をコードするｃＤＮＡを取得・使用することが可能である。この場合、使用するＦｃ領域をコードする遺伝子としては、動物種やサブタイプは特にこれを限定しないが、プロテインＡ／Ｇとの結合性が強いヒトＩｇＧ１やＩｇＧ２、又はマウスＩｇＧ２ａやＩｇＧ２ｂ等のＦｃ領域をコードする遺伝子が好ましい。また、Ｆｃ領域に変異を導入することによりプロテインＡとの結合性を高める方法も知られており（Ｎａｇａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：２４３，２００３（非特許文献７）参照）、当該法により遺伝子改変を加えたＦｃタンパク質も使用することもできる。
なお、本発明を実施するための好適に用いられるＥ−カドヘリンの場合、当該リコンビナント・タンパク質の作製法の一例として、発明者らの既報告論文を挙げることができる（Ｎａｇａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４：１８５７，２００２（非特許文献６）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：２４３，２００３（非特許文献７）参照）。
また、マウス又はヒトのＥ−カドヘリンの細胞外領域をコードするｃＤＮＡに、ヒトＩｇＧのＦｃ領域部分をコードする配列及びＨｉｓタグ配列のｃＤＮＡを連結させた融合遺伝子をマウス細胞に導入し、これを発現させて作製した精製リコンビナント・タンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｔｅｃｈｎｅ社）が市販されており、マウス又はヒト由来のＥ−カドヘリン・タンパク質として使用することもできる。
本発明で開示される方法の実施において、多能性幹細胞の接着性分子を、上記の培養基材固相表面に固定又はコーティングする方法としては、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。接着性分子がタンパク質性やペプチド性の分子、又は糖鎖を含む高分子化合物等である場合、プレート等の培養基材固相表面に当該分子の溶液を接触させ、一定時間後に溶媒を除去することにより、簡便に当該分子を吸着させることができる。さらに具体的には、例えば、蒸留水やＰＢＳ等を溶媒とする接着性分子の溶液を、ろ過、滅菌した後、プレート等の培養基材に接触させ、数時間から一昼夜放置するだけで、当該接着性分子が固定又はコーティングされた細胞培養用基材が得られる。好ましくは、蒸留水やＰＢＳ等で数回洗浄し、ＰＢＳ等の平衡塩溶液等で置換してから使用する。
また、接着性分子に前もって人為的に抗原性分子が付加・融合させている場合は、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもでき、接着性分子を効率的に基材表面に修飾することができるため、より好ましい。この場合、特異抗体を前もって培養基材表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって固定又はコーティングしておく必要がある。例えば、接着性分子にＩｇＧのＦｃ領域タンパク質を融合させたリコンビナント・タンパク質の場合、培養基材に前もって修飾しておく抗体としては、ＩｇＧのＦｃ領域を特異的に認識するものを使用することができる。接着性分子に各種タンパク質やタグ配列ペプチドを融合させたリコンビナント・タンパク質の場合、融合させた分子に特異的な抗体を、培養基材に前もって修飾することにより、使用することができる。
本発明の実施において、細胞培養基材の固相表面に固定又はコーティングされる接着性分子は少なくとも１種であるが、２種以上の接着性分子を組み合わせて用いてもよい。その場合、各々の接着性分子の溶液を混合し、その混合溶液を上述の方法に基き、修飾すればよい。
上記の接着性分子溶液の濃度は、当該分子の吸着量及び／又は親和性、さらには当該分子の物理学的性質によって適宜、検討する必要があるが、Ｅ−カドヘリンの細胞外領域にＦｃ領域を融合させたリコンビナント・タンパク質の場合、０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ程度までの濃度範囲とし、好ましくは、０．１〜２００μｇ／ｍＬ程度、さらに好ましくは１〜５０μｇ／ｍＬ、そして最も好ましくは５〜１０μｇ／ｍＬである。
本発明の実施において、多能性幹細胞は、上記の方法により作製された培養基材に播種される。多能性幹細胞の培養方法や培養条件は、当該培養基材を使用することを除き、多能性幹細胞の通常の培養方法や培養条件をそのまま使用することができる。多能性幹細胞の通常の培養方法や培養条件は、上記の参考書籍、すなわち、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）や、参考文献（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７０：８４１，１９９２；Ｔｈｏｍｓｏｎら、米国特許第５，８４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．米国特許第６，０９０，６２２号；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００；国際公開番号第００／２７９９５号）等を参照することができるが、特にこれらに限定されない。
多能性幹細胞を培養するための液体培地としては、多能性幹細胞を継代培養する従来の方法に適用することができるものであれば、すべて使用可能である。その具体例としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられ、通常、２ｍＭ程度のグルタミン及び／又は１００μＭ程度の２−メルカプトエタノールを添加して使用する。また、ＥＳ細胞培養用培地として市販されているＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）や、ＥＳ ｃｅｌｌ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴＸ−ＷＥＳ（Ｔｈｒｏｍｂ−Ｘ社）等も用いることができる。これらの培地にはＦＢＳを５〜２５％程度添加することが好ましいが、無血清培養することも可能で、例えば、１５〜２０％のＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を代用することができる。また、ＭＥＦ細胞の培養上清やｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２、ＳＣＦ等を添加した培地を使用してもよく、その詳細な方法は公知である（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９７１，２００１；国際公開番号第０１／５１６１６号；国際公開番号第０３／０２０９２０号；Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７０：８３７，２００４）。
上記の多能性幹細胞を培養するための液体培地には、多能性幹細胞の未分化状態を維持する作用を有する物質・因子を添加することが望ましい。具体的な物質・因子としては、特にこれを限定しないが、マウスＥＳ／ＥＧ細胞の場合、ＬＩＦが好適である。ＬＩＦは既報告論文（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｈｏｏｐｅｒ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２１：１，１９８７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６８８，１９８８；Ｒａｔｈｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４：２３０８，１９９０）や、ＮＣＢＩの公的なＤＮＡデータベースにアクセス番号Ｘ１３９６７（ヒトＬＩＦ）、Ｘ０６３８１（マウスＬＩＦ）、ＮＭ＿０２２１９６（ラットＬＩＦ）等で公知のタンパク質性因子であり、そのリコンビナント・タンパク質は、例えばＥＳＧＲＯ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）の商品名で購入することができる。また、ＧＳＫ−３阻害剤を培養液に添加することにより、特に他の成長因子・生理活性因子等の添加をしなくても、マウス及びヒトＥＳ細胞の未分化性を効率的に維持することができる（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１０：５５，２００４）。この場合、ＧＳＫ−３の活性を阻害できる作用を有した物質であれば、すべて使用可能であり、例えばＷｎｔファミリー分子（Ｍａｎｏｕｋｉａｎ ＆ Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８４：２０３，２００２；Ｄｏｂｌｅ ＆ Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１６：１１７５，２００３）等を挙げることができる。
本発明の実施において、従来の方法に基づき継代維持した多能性幹細胞を、上記の方法により作製された培養基材に播種し、かつ、上記の培養条件・方法に基いて培養することにより、当該細胞を分散した状態で、しかも当該細胞が本来有する未分化な状態を保持したまま継代培養することが可能である。この様な状態で培養した多能性幹細胞は、細胞***の際に物理的な抑制がかからないため、及び／又は細胞間接触に起因する細胞増殖抑制機構が作用しないため、及び／又は細胞の生存性が高まり、死細胞数が減少するため、細胞の著しい増加や増殖が認められる。一つの事例として、本発明の方法によりマウスＥＳ細胞を培養した場合、従来の方法で培養した場合と比較して、少なくとも１．２５倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上の増殖能を呈することが可能である。また、当該条件で４代ほど継代すると、従来法と比べて少なくとも３倍、好ましくは１０倍以上の細胞を回収することが可能である。増殖能は、単位時間における細胞数の増加率や倍化速度等の指標で表すことができ、その計測・算出方法としては、一般の細胞を用いた実験で使用され、公知となっている方法であれば、いずれも用いることができる。
上述のように、多能性幹細胞における未分化な状態とは、多能性幹細胞が、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉すべての系譜の細胞に分化する能力をもった状態を意味する。また、好ましくは、多能性幹細胞のその他の特性、例えば、テロメアーゼ活性の維持やテラトーマ形成能、又はキメラ形成能等の性質のうち、少なくとも１つを有していることが望ましい。これらの性質・特性を調べる方法は、既に標準的なプロトコールが確立されており、例えば、上記の参考書籍、即ち、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）等を参照することにより、容易に実施することができるが、特にこれらに記載の方法には限定されない。
また、未分化状態の多能性幹細胞は、以下に記載する少なくとも１つ、好ましくは複数の方法により、少なくとも１つ、好ましくは複数のマーカー分子の存在が確認できる細胞と定義することもできる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的な種々のマーカーの発現は、従来の生化学的又は免疫化学的手法により検出される。その方法は特に限定されないが、好ましくは、免疫組織化学的染色法や免疫電気泳動法の様な、免疫化学的手法が使用される。これらの方法では、未分化状態の多能性幹細胞に結合する、マーカー特異的ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を使用することができる。個々の特異的マーカーを標的とする抗体は市販されており、容易に使用することができる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的なマーカーとしては、例えばＡＬＰ活性や、Ｏｃｔ−３／４またはＲｅｘ−１／Ｚｆｐ４２等の遺伝子産物の発現が利用できる。また、各種抗原分子も用いることができ、マウスＥＳ細胞ではＳＳＥＡ−１、ヒトＥＳ細胞ではＳＳＥＡ−３やＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＧＣＴＭ−２等が未分化マーカーとして挙げられる。これらの未分化マーカーの発現は、ＥＳ細胞が分化することにより低減、消失する。
あるいは、未分化状態の多能性幹細胞マーカーの発現は、特にその手法は問わないが、逆転写酵素介在性ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）やハイブリダイゼーション分析といった、任意のマーカー・タンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出、解析するための従来から頻用される分子生物学的方法により確認できる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的なマーカー・タンパク質（例えば、Ｏｃｔ−３／４やＲｅｘ−１／Ｚｆｐ４２、Ｎａｎｏｇ等）をコードする遺伝子の核酸配列は既知であり、ＮＣＢＩの公共データベース等において利用可能であり、プライマー又はプローブとして使用するために必要とされるマーカー特異的配列を容易に決定することができる。
多能性幹細胞への遺伝子導入法としての利用
本発明の別の態様として、本発明記載の方法は、所望する外来遺伝子を、多能性幹細胞の細胞内に効率的に導入する方法として使用することができる。導入する外来遺伝子としては、特に制限はないが、例えば増殖因子や受容体、酵素、転写因子等の天然の蛋白質や、例えば、遺伝子工学的手法を用いて改変、作製した、人工的な蛋白質である。また、導入遺伝子としては、リボザイムやｓｉＲＮＡ等の機能的ＲＮＡでも良い。更には、外来遺伝子として、遺伝子の導入効率または発現安定性等を評価するためのマーカー遺伝子、例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）やβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどをコードする遺伝子も利用可能である。
好適な実施態様の１つとして、導入する外来遺伝子は、遺伝子の転写及び発現を可能にする核酸配列、いわゆるプロモーター配列と、当該プロモーターの制御下に転写・発現が可能になる様な形で連結される。又、この場合、当該遺伝子は、更にポリＡ付加シグナルと連結されることが望ましい。多能性幹細胞において外来遺伝子の転写および発現を可能にするプロモーターとしては、ＳＶ４０ウイルスやＣＭＶ、ラウス肉腫ウイルス等のウイルスに由来するプロモーターや、β−アクチン・プロモーター、ＥＦ１αプロモーター等が挙げられる。また、目的の如何によっては、ある種の細胞／組織又はある分化段階の細胞で特異的に遺伝子の転写および発現を可能にする核酸配列、いわゆる細胞／組織特異的プロモーター配列や分化段階特異的プロモーター、或いはＲＮＡの発現に適したＰｏｌ．ＩＩＩプロモーター等も使用できる。これらプロモーターの塩基配列は、ＮＣＢＩ等の公共のＤＮＡデータベースにおいて利用可能であり、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、所望の遺伝子配列を利用した遺伝子ベクターを作製することが可能である。また、これらのプロモーターを利用可能なベクターが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社や、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ａｍｂｉｏｎ社等から購入可能である。
上記の遺伝子（ベクター）の導入のための方法としては、特にこれを制限せず、例えばリン酸カルシウムやＤＥＡＥ−デキストランを用いたトランスフェクション法を挙げることができる。また、遺伝子導入対象の細胞が細胞内に取りこむことが可能であり、かつ、細胞毒性の低い脂質製剤、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）やＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ社）等を用いて、目的とする遺伝子とリポソーム−核酸複合体を形成させた上でトランスフェクションする方法も好適である。更には、レトロウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターに目的の遺伝子を組み込み、その組み換えウイルスを細胞に感染させる方法等も使用可能である。この場合、ウイルスベクターとは、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの全長若しくは一部を欠損・変異させた核酸配列に、目的とする遺伝子を組み込み、発現することができる様にした構築物である。
本発明の方法により増殖させた多能性幹細胞の利用
本発明に係る増殖方法により増殖させた多能性幹細胞は、引き続き、公知の方法による細胞回収法を用いることにより、未分化な状態を維持した多能性幹細胞を、効率的かつ多量に得ることができる。また、本発明に係る遺伝子導入法により、所望する遺伝子を導入・発現させた多能性幹細胞を効率的かる多量に得ることができる。この様にして得られた多能性幹細胞を、以下、本発明により調製された多能性幹細胞と呼ぶ。
多能性幹細胞の回収法としては、多能性幹細胞の一般的な継代培養法において用いられる、公知の酵素消化による方法が挙げられる。その具体例としては、多能性幹細胞を培養している培養容器から培地を除き、ＰＢＳを用いて数回、好ましくは２〜３回洗浄し、適当なタンパク質分解酵素を含む溶液（例えば、トリプシンやディスパーゼ等のタンパク質分解酵素を含む溶液）を加え、３７℃で適当時間、好ましくは１〜２０分間、より好ましくは３〜１０分間程度培養した後、上記のＥＳ細胞培養用培地等の適当な溶液に懸濁し、単一細胞状態とする方法が挙げられる。また、酵素を用いない方法も使用することができ、例えば、多能性幹細胞を培養している培養容器から培地を除き、ＰＢＳを用いて数回、好ましくは２〜３回洗浄した後、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を終濃度０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭになる様に添加し、３７℃で適当時間、好ましくは１〜６０分間、好ましくは１０〜３０分間程度処理して細胞を剥離させ、更にＥＳ細胞培養用培地等の適当な溶液に懸濁し、単一細胞状態とする方法が挙げられる。また、ＥＤＴＡの代わりにエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）溶液を、同様の方法で用いることもできる。
また、本発明は、本発明により調製された多能性幹細胞から適当な分化誘導処理により作製した分化細胞をも提供する。分化細胞としては、一般的に多能性幹細胞から分化誘導することができる種の細胞であれば、特にこれを限定しない。具体的には、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞、中胚葉細胞または中胚葉由来の細胞、内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞等が挙げられる。
外胚葉由来の細胞とは、神経組織、松果体、副腎髄質、色素体および表皮組織といった組織・器官を構成する細胞であるが、これらに限定されない。中胚葉由来の細胞とは、筋組織、結合組織、骨組織、軟骨組織、心臓組織、血管組織、血液組織、真皮組織、泌尿器および生殖器といった組織・器官を構成する細胞であるが、これらに限定されない。内胚葉由来の細胞とは、消化管、呼吸器、胸腺、甲状腺、副甲状腺、膀胱、中耳、肝臓および膵臓といった組織・器官を構成する細胞であるが、これらに限定されない。
本発明により調製された多能性幹細胞、及び／又は当該細胞から作製した分化細胞は、各種生理活性物質（例えば、薬物）や機能未知の新規遺伝子産物などの薬理評価や活性評価に有用である。例えば、多能性幹細胞や種々の分化細胞の機能調節に関する物質や薬剤、及び／又は多能性幹細胞や種々の分化細胞に対して毒性や障害性を有する物質や薬剤のスクリーニングに利用することができる。特に現状では、ヒト細胞を用いたスクリーニング法はほとんど確立しておらず、本発明により調製された多能性幹細胞に由来する各種分化細胞は、当該スクリーニング法を実施するための有用な細胞ソースとなる。
さらに、本発明は、本発明で開示された方法により調製された多能性幹細胞を用いてキメラ胚またはキメラ動物を作製する方法、及び作製したキメラ胚またはキメラ動物をも提供する。キメラ胚またはキメラ動物を作製する方法は、既に標準的なプロトコールが確立されており、例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）等を参照することにより、容易に実施することができるが、特にこれを限定しない。

以下の実施例において本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の単なる例示であり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１：リコンビナントＥ−カドヘリン・タンパク質の調製
マウスＥ−カドヘリンの細胞外領域と、ＩｇＧのＦｃ部分（ＩｇＧ／Ｆｃ）の融合タンパク質（以下、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃと称する）を発現するベクターの構築並びに当該タンパク質の産生及びその精製法は、発明者らが報告した方法（Ｎａｇａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４：１８５７，２００２（非特許文献６）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：２４３，２００３（非特許文献７））に準じている。まず、マウスＥ−カドヘリンの全長を含むｃＤＮＡ（理化学研究所ジーンバンクより分譲；ＲＤＢ Ｎｏ．１１８４）を鋳型として、Ｅ−カドヘリンｃＤＮＡの細胞外ドメイン（Ｅ−ｃａｄ−ＥＣＤ）をコードするＤＮＡ断片（アミノ酸残基番号１〜６９９に相当）を増幅した。マウスＩｇＧ／ＦｃをコードするＤＮＡ断片は、マウスＩｇＧ１を発現するハイブリドーマからｍＲＮＡを調製し、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅにより逆転写を行って作製したｃＤＮＡから単離した。両ＤＮＡ断片とも塩基配列を確認した後、発現ベクターｐＲＣ−ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込み、Ｅ−ｃａｄ−ＥＣＤ及びＩｇＧ／Ｆｃ配列を含む発現ベクター、ｐＲＣ−Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃを構築した。
Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質を産生するために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（理科学研究所〔筑波〕より入手）を用いた。直鎖化したｐＲＣ−Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ（１．０μｇ）を５．０μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合し、製品添付書記載の推奨プロトコールの方法に従い、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に遺伝子導入を行った。引き続き、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質を恒常的かつ大量に産生する細胞クローンを得るため、遺伝子導入の２日後に細胞を回収し、９６ウェル・プレート（ＩＷＡＫＩ）に１ウェル当たり０．２個の細胞が入る様に播種した。４００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地で７日間培養した後、生存している細胞が存在するウェルから培養上清を回収し、培養上清中のＥ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質量を測定した。この様にして最もＥ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質産生量の高い細胞クローン（４Ｇ７株）を単離し、以後の実験に使用した。これらの細胞は、無血清培地（ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に馴化させた後、スピナーフラスコを用いた大量培養を行い、培養上清を回収した。
培養上清は、０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、ポアサイズ１００ｋＤａの限外濾過膜（ＹＭ１００；Ａｍｉｃｏｎ社）および攪拌式セル（ａｍｉｃｏｎ ８２００；ａｍｉｃｏｎ社）を用いて濃縮した。この濃縮液を２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で透析した後、常法により、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて精製したものを以下の実験に使用した。
実施例２：Ｅ−ｃａｄ−ＦｃプレートへのＥＳ細胞の接着
Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質をコーティングした細胞培養用プレート（以下、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレート）へのＥＳ細胞の接着性を検討した。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質のＰＢＳ希釈溶液を各種サイズの無処理ポリスチレン製培養プレートに注ぎ、３７℃で一晩、コーティング処理をした。洗浄後、細胞の非特異的接着を抑えるため、細胞を播種する前に、０．１％ＢＳＡ溶液で１〜２時間のブロッキング処理を行った。なお、コントロールとして、ＢＳＡ（０．１％）やゼラチン（０．１％）、Ｉ型コラーゲン（０．０１％；ＫＯＫＥＮ社）、フィブロネクチン（５．０μｇ／ｍＬ；ＫＯＫＥＮ社）でコーティングしたプレートを使用した。
ＥＳ細胞株としては、ＥＢ３細胞（丹羽仁史博士〔理科学研究所〕より恵与）、Ｒ１細胞（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８４２４，１９９３）、及び１２９ＳＶ細胞（大日本製薬株式会社より購入）を用いたが、総じてＥＳ細胞種の違いによる実験結果の相違はみられなかった。これらのＥＳ細胞は、１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸液、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含むＫｎｏｃｋｏｕｔ−ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）培地（以下、ＥＳＭと称する）に１０００Ｕ／ｍＬのＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を添加したものを用い、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）等に記載の方法に従い、未分化な形質を保ちながら継代培養したものを実験に供した。以下、この条件で継代培養したＥＳ細胞を、通常の培養条件下で継代培養したＥＳ細胞と称する。
通常の培養条件下で継代培養したＥＳ細胞を無血清培地で２回洗浄後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシン溶液で処理して単一細胞状態にし、ＥＳＭに懸濁した。以下、特に明示しない限り、ＥＳ細胞をプレートから剥離し、継代培養その他の実験に使用する際は、当該条件を用いた。精製したＥ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質を上記の方法で、無処理９６ウェル・プレート（ＩＷＡＫＩ社）にコーティングし、その上に３．０×１０^５細胞／ｍＬに調製した細胞懸濁液を１００μＬずつ播種し、４時間培養した。無血清培地で洗浄後、１０％のＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を含む培地と交換し、４時間反応させた後に吸光度を測定し、生細胞数の指標とした。
結果を図１に示す。ＥＳ細胞は一般的な線維芽細胞や上皮系細胞と比べて接着力が強くなく、無処理又はＢＳＡでコーティングしたポリスチレン製プレートにはほとんど接着できず、培地中で細胞凝集塊を形成してしまうが、培養プレートをゼラチンやコラーゲン、フィブロネクチン等で前処理しておくと、通常の細胞培養用プレートに播種した時と同様に接着することができる。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃの濃度を変えてコーティングしたプレートを用いてＥＳ細胞の接着性を検討したところ、５．０μｇ／ｍＬ以上の濃度条件で、Ｒ１細胞株及びＥＢ３細胞株ともに良好な接着性を示した。なお、ＥＳ細胞は無血清条件下でもＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートへ接着することが可能であり、当該プレートへの接着は、血清中の接着分子、例えばフィブロネクチン等を介したものではないことが明らかである。
Ｅ−カドヘリンを介した結合はＣａ^２＋依存性であることが知られている（Ｍａｒｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７：２２７，１９９３；Ｔａｋｅｉｃｈｉ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：６１９，１９９５；Ｍａｒｒｓ ＆ Ｎｅｌｓｏｎ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１６５：１５９，１９９６）。Ｅ−ｃａｄ−ＦｃプレートへのＥＳ細胞の接着性に及ぼすキレート剤添加の影響を調べるため、上記と同様にＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレート上で４時間培養したＥＳ細胞を、終濃度５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）溶液で３０分間処理し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、上記と同様にＡｌａｍａｒＢｌｕｅによる細胞数の測定を行なった。金属イオンに対する選択性が低いＥＤＴＡで処理した場合、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ及びフィブロネクチンに対するＥＳ細胞の接着をどちらとも解離したが、Ｃａ^２＋選択性の高いＥＧＴＡで処理した場合、フィブロネクチンに対する結合は阻害されず、Ｅ−カドヘリンに対する結合のみが特異的に解離された。また、ＥＧＴＡ処理の際に５ｍＭのＭｇ^２＋を添加してもその効果は抑制されなかった。以上の結果から、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃプレートへのＥＳ細胞の接着は、ＥＳ細胞の表面上に存在するＥ−カドヘリン分子と、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレート固相表面に固定されたＥ−カドヘリン分子との相互作用であることが示唆された。
次に、通常の培養条件下で継代培養したＥＳ細胞を、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレート又は他の基質でコーティングした２４ウェル・プレート（ＩＷＡＫＩ社）に播種し、培養を行なった。一般にＥＳ細胞は、フィーダー細胞上又は細胞培養用の通常プレート上では堅固な、盛り上がった状態のコロニーを形成することが知られている。今回、無処理ポリスチレン製培養プレートにゼラチンやＩ型コラーゲン、フィブロネクチンをコーティングしたプレートの場合も、ＥＳ細胞は同様に明瞭な、堅固なコロニーを形成した（図２参照）。ところが、特筆すべきことに、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種したＥＳ細胞は、ＥＢ３細胞株とＲ１細胞株の両者とも、播種して２、３日後においても明暸なコロニーをほとんど形成せず、１つ１つの細胞が分散して増えている状態が観察された。
実施例３：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートを用いたＥＳ細胞の培養
Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレート上におけるＥＳ細胞の増殖能を検討するため、通常の培養条件下で継代培養したＥＳ細胞を回収し、５００個のＥＳ細胞をＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレート又はゼラチン・プレート（９６ウェル・プレート）に播種し、３日間乃至４日間培養した。細胞を無血清培地で洗浄した後、上記と同様にＡｌａｍａｒＢｌｕｅによる細胞数の測定を行なった。その結果、培養３日目において、ゼラチン・プレートで培養したＥＳ細胞に対し、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞の数は、ＥＢ３細胞株とＲ１細胞株の両者とも、有意に多かった（図３Ａ参照）。また、培養４日目には両ＥＳ細胞株とも、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレート群の細胞数は約２倍程度多かった。更に、同様の継代培養を４回行なった後にＥＳ細胞を回収し、その数を計測したところ、通常のゼラチン・プレートで培養したものに比べ、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞の数は３〜５倍以上多かった。ＥＳ細胞を播種した直後の接着率は両プレート間で差はなく、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞の方が高い増殖能及び生存能を有していることが示唆される。なお、上記と同様の実験をＦ９細胞で行った場合、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレート培養群と通常プレート培養群の細胞増殖能に差異は認められなかった。
引き続き、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（５−Ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ；ＢｒｄＵ）の取り込みを指標にＥＳ細胞のＤＮＡ合成能を検討した。上記条件下で３日間培養したＥＳ細胞をＢｒｄＵ（１０μＭ）で３０分間標識した後に単一細胞として回収し、９６ウェル・プレートに再播種した。４時間後、付着したＥＳ細胞をＦｉｘＤｅｎａｔ溶液（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）で固定し、ＰＢＳで洗浄後、抗ＢｒｄＵ抗体（ＢＭＧ ６Ｈ８；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）（１００倍希釈）と反応させた後、シアノーゲン３（Ｃｙ３）標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）（１：１０００希釈）を用いて染色した。また、細胞核は４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）溶液（０．１μｇ／ｍＬ）で染色した。これらの抗体や色素による染色像を、ＡｒｒａｙＳｃａｎ^ＴＭシステム（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社）下にて観察した。その結果、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレート培養群は通常プレート培養群よりも有意に高いＢｒｄＵ取り込み率を示した（図３Ｂ参照）。
一般的に、ＥＳ細胞は密集し、コロニーを形成した状態では自発的に分化が進むことが知られている。そのため、本検討で用いた３種のマウスＥＳ細胞の場合、通常のプレートで培養する際は、２日又は３日ごとに継代をしないと、コロニーが過度な大きさに成長し、形態の異なる、分化型の細胞が出現する。一方、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養した場合は、最初の播種数を少なくすることにより、５日〜７日間に一度程度の継代で十分となり、この様な培養条件下においても、コロニーの過形成や分化細胞の出現は認められなかった。そこで、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレート上で培養したＥＳ細胞が未分化状態を維持しているか、また、複数回の継代培養を経ても、ＥＳ細胞の分散状態及び未分化状態が維持されるのかを確認するため、当該プレート上で数回の継代を行い、その後のＥＳ細胞の特性を調べた。
まず、ＥＳ細胞の分化状態を確認するため、未分化なＥＳ細胞の指標であるＡＬＰ活性及びＯｃｔ−３／４タンパク質の発現を検討した。ＡＬＰ活性の検出は、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅキット（シグマ社）を用いて行なった。培養したＥＳ細胞（ＥＢ３細胞株とＲ１細胞株）をＰＢＳで洗浄した後、６６％アセトン／３％ホルマリンを含むクエン酸溶液で固定し、ＰＢＳで洗浄後、上記キットに付属するｎａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＢＩ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｋａｌｉｎｅ染色液で１５分間処理し、発色反応を行った（図４Ａ参照）。
Ｏｃｔ−３／４タンパク質の発現は免疫染色法を用いて調べた。すなわち、培養したＥＳ細胞を８％ホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）で固定し、ＰＢＳで洗浄後、抗Ｏｃｔ−３／４抗体（品番；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）（１：２００希釈）と反応させた後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ標識抗体（Ａｌｅｘａ−４８８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）（１：１０００希釈）を用いて染色した。また、細胞核はＤＡＰＩ溶液（０．１μｇ／ｍＬ）で染色した。これらの抗体や色素による染色像を、蛍光顕微鏡下にて観察した（図４Ｂ参照）。
その結果、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで１４日間培養したＥＳ細胞では、対照群として用いたゼラチンでコーティングしたプレート（以下、ゼラチン・プレート）で培養したＥＳ細胞と同様、高いＡＬＰ活性（図４Ａ参照）及びＯｃｔ−３／４タンパク質の発現（図４Ｂ参照）を確認することができた。
次に、未分化なＥＳ細胞のマーカーとなるＯｃｔ−３／４、及びＲｅｘ−１／Ｚｆｐ４２遺伝子の発現を調べた。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレート若しくはゼラチン・プレートで１４日間培養したＥＳ細胞を回収し、１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して全ＲＮＡを調製した。続いて、常法に従い、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）により各種遺伝子断片の増幅を行なった。
Ｏｃｔ−３／４〔増幅サイズ：５２８ｂｐ〕
５’−プライマー：５’−ＧＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＣＣ−３’（配列番号３）
３’−プライマー：５’−ＧＣＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＴＣＧＴＴＧＧ−３’（配列番号４）
Ｒｅｘ−１〔増幅サイズ：９３０ｂｐ〕
５’−プライマー：５’−ＡＡＡＧＴＧＡＧＡＴＴＡＧＣＣＣＣＧＡＧ−３’（配列番号５）
３’−プライマー：５’−ＴＣＣＣＡＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＴＡＧＣＡ−３’（配列番号６）
Ｎａｎｏｇ〔増幅サイズ：７１０ｂｐ〕
５’−プライマー：５’−ＧＡＧＧＡＡＧＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧ−３’（配列番号７）
３’−プライマー：５’−ＡＡＧＴＴＡＴＧＧＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号８）
ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）〔増幅サイズ：８５８ｂｐ〕
５’−プライマー：５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧ−３’（配列番号９）
３’−プライマー：５’−ＣＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＴＴＧＣ−３’（配列番号１０）
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社）を使用し、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰ（ＴａＫａＲａ社）を用いて行った。まずｃＤＮＡを含むＰＣＲ反応液を９４℃で加熱した後、９４℃：３０秒→５９℃：３０秒→７２℃：６０秒の加熱サイクルを２２回繰り返し、最後に７２℃で５分加熱した後、４℃で冷却した。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ＴＡＫＡＲＡ社）で染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ ８６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で検出した。
結果を図５に示す。通常のゼラチン・プレートで培養したＥＳ細胞は、ＬＩＦ存在下で、Ｏｃｔ−３／４及びＲｅｘ−１、Ｎａｎｏｇの強い発現が認められ、ＬＩＦ非存在下ではその発現が有意に減少した。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞でも同様であり、ＬＩＦ存在下ではＯｃｔ−３／４及びＲｅｘ−１、Ｎａｎｏｇを強く発現していることが示された。なお、同じサンプルを用いて神経系細胞や中胚葉系細胞、内胚葉系細胞の指標となる分化マーカー遺伝子、例えば、ＮｅｕｒｏＤ３やＳｏｘ−１、Ｔ／Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｆｌｋ−１、ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ等の発現も同様に調べてみたが、ＬＩＦ存在下では、ゼラチン・プレート及びＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞のどちらにおいても、分化マーカー遺伝子の発現は認められなかった。図４Ａ、図４Ｂ、及び図５の結果から分かるように、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞は、コロニーを形成せず、通常の培養時と異なる形態を呈しながら増殖するが、その未分化状態が保持されていることが確認された。
続いて、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞のＬＩＦに対する反応性が変化するか否かを検討した。通常のゼラチン・プレート、及びＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで継代したＥＳ細胞を、０〜１０００Ｕ／ｍＬのＬＩＦ濃度下で５日間、継代をせずに培養し、その後、両群の細胞ともゼラチン・プレートに播き直して、さらに３日間培養した（ＬＩＦ濃度は培養期間中一定）。プレート上に形成されたＥＳ細胞コロニーのＡＬＰ活性を、上記と同様の方法で検出し、未分化状態に維持されているコロニーの割合を計測した。コロニー中、８０％以上の細胞にＡＬＰ活性が認められるコロニーを「未分化型」と判定した。
ゼラチン・プレートで培養したＥＳ細胞は、最初の５日間の培養が終わった時点で、過大なコロニーを形成していたが、この時点では明瞭に分化型細胞と判断し得る細胞は観察されなかった。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞は、上記実験と同様、コロニーを形成せずに増殖し、分散した状態を維持した。再播種後、通常プレートで培養したＥＳ細胞は、１０００Ｕ／ｍＬのＬＩＦ濃度を添加した群ではほとんどのコロニーがＡＬＰ活性を維持していたが、処理したＬＩＦ濃度が低くなるのに伴い、未分化型コロニーの割合も低くなった（図６参照）。一方、前もってＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞は、１００Ｕ／ｍＬのＬＩＦ濃度でもほとんどのコロニーが未分化型の性質を維持することができた。その際、ＬＩＦ濃度の低下に伴う増殖能の抑制は認められなかった。この結果、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートを用いて培養することにより、ＬＩＦ等、ＥＳ細胞の培養に必要な添加因子の量を、従来法の場合より低減させ得ることが示唆された。
続いて、ＥＳ細胞をフィーダー非依存性に馴化させる際に、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートを利用することができるかどうかを検討した。一般に、ＥＳ／ＥＧ細胞はフィーダー細胞との共培養により継代・維持されているが、このフィーダー依存的な培養状態をフィーダー非依存的な状態に馴化させることができる。しかし、その場合にはＥＳ細胞を高密度で、しかも高濃度のＬＩＦ（通常の約５〜１０倍量）を添加した培地中で継代培養を繰り返す必要がある。例えば、フィーダー依存的な状態で継代培養されたＥＳ細胞（Ｒ１株）をフィーダー非依存的な状態に馴化させるためには、５．０ ｘ １０^４細胞／ｃｍ^２程度の細胞密度で播種し、１ ｘ １０^４Ｕ／ｍＬのＬＩＦを添加する必要がある。しかしながら、５００細胞／ｃｍ^２の細胞密度でＥＳ細胞をＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種し、１ ｘ １０^３Ｕ／ｍＬのＬＩＦを添加したＥＳＭで継代培養を行なったところ、従来法と同様、ＥＳ細胞をフィーダー非依存的な状態に馴化することができた。この様にして調製したＥＳ細胞は、その未分化性及び分化多能性を十分に保持していることも確認できた。
実施例４：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞の分化能の検討
Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで複数回の継代培養を行なったＥＳ細胞が、その分化多能性を有していることの確認を行なった。まず、当該ＥＳ細胞をＬＩＦ非存在下で浮遊培養して胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ：ＥＢ）を形成させ、その自発的な分化の進行を、分化マーカー遺伝子の発現を指標に検討した。具体的には、ＥＳ細胞からＥＢを形成させるため、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで３回以上継代したＥＳ細胞を回収して、単一細胞状態にし、引き続き、ＬＩＦ非添加のＥＳＭ １５μＬ中に５００個の細胞を含む液滴を作製して懸滴（ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ）培養を行った。懸滴中に形成されたＥＢは経時的に回収し、上記の方法と同様にＲＮＡの調製、並びにｃＤＮＡの合成を行なった。このｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、各種マーカー遺伝子断片の増幅を行なった。
ＮｅｕｒｏＤ３〔増幅サイズ：４０５ｂｐ〕
５’−プライマー：５’−ＣＡＴＣＴＣＴＧＡＴＣＴＣＧＡＣＴＧＣ−３’（配列番号１１）
３’−プライマー：５’−ＣＣＡＧＡＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＧＧＣＧ−３’（配列番号１２）
Ｓｏｘ−１〔増幅サイズ：４０７ｂｐ〕
５’−プライマー：５’−ＧＣＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＴＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号１３）
３’−プライマー：５’−ＡＣＡＴＣＣＧＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣ−３’（配列番号１４）
Ｔ／Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ〔増幅サイズ：５２８ｂｐ〕
５’−プライマー：５’−ＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＡＴＡＴＡＴＴＧＣＣ−３’（配列番号１５）
３’−プライマー：５’−ＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＧＴＣＡＣＡＡＣ−３’（配列番号１６）
Ｆｌｋ−１〔増幅サイズ：３９８ｂｐ〕
５’−プライマー：５’−ＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＣＣＣＡＴＡＣＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１７）
３’−プライマー：５’−ＴＧＧＣＣＧＧＣＴＣＴＴＴＣＧＣＴＴＡＣＴＧ−３’（配列番号１８）
ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ〔増幅サイズ：４１５ｂｐ〕
５’−プライマー：５’−ＡＡＣＣＣＴＣＡＡＴＧＧＣＣＴＧＴＧＧ−３’（配列番号１９）
３’−プライマー：５’−ＴＣＡＧＴＧＧＴＡＣＴＴＧＴＧＧＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号２０）
α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ〔増幅サイズ：９９７ｂｐ〕
５’−プライマー：５’−ＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＧ−３’（配列番号２１）
３’−プライマー：５’−ＡＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＣＣ−３’（配列番号２２）
ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ〔増幅サイズ：４４０ｂｐ〕
５’−プライマー：５’−ＡＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＣＣＧＡＧ−３’（配列番号２３）
３’−プライマー：５’−ＴＣＡＧＡＧＧＴＣＧＧＧＣＡＧＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号２４）
結果を図７に示す。通常のゼラチン・プレートで培養したＥＳ細胞では、ＬＩＦを培地中から除きＥＢの自発的分化を誘導したところ、外胚葉（ＮｅｕｒｏＤ３、Ｓｏｘ−１）、中胚葉（Ｔ／Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｆｌｋ−１、ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）、及び内胚葉（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）のすべての胚葉特異的マーカー遺伝子の発現がみられた。一方、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞の場合も、すべての胚葉マーカーの遺伝子発現が、ゼラチン・プレート群とほぼ同様の強さで確認できた。
引き続き、当該ＥＳ細胞の神経細胞及び心筋細胞への分化能を検討した。ＥＳ細胞を、培養プレート上に前もって播種したストローマ系細胞をフィーダー細胞として共培養することにより、神経細胞及び／又は心筋細胞への分化を誘導できることが報告されている（Ｙａｍａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：２６１，２００２；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：４０１８，２００３）。そこで、ＥＳ細胞の神経細胞への分化能を、ＰＡ６細胞を用いた分化系で、心筋細胞への分化能を、ＳＴ２細胞を用いた系で調べた。ＰＡ６細胞又はＳＴ２細胞（両細胞とも理研・細胞バンクから購入）を細胞培養用６ウェル・プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１０％のＦＢＳを添加した培地を用いてコンフルエント状態にまで培養したものをフィーダー細胞として使用した。引き続き、単一細胞状態にしたＥＳ細胞の懸濁液を調製し、フィーダー細胞をＰＢＳで２回洗浄後、各ウェルに２０００細胞ずつ播種した。翌日、培養液を神経分化系（ＰＡ６フィーダー）の場合、２０％ ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＥＳＭに、一方、心筋分化系（ＳＴ２フィーダー）の方は１０％ ＦＢＳを含むＥＳＭに交換した。培養後１２日目に細胞を７０％エタノール溶液で固定し、１次抗体として抗Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ−２（ＭＡＰ−２）抗体（ＡＢ５６２２；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、又は抗サルコメア・ミオシン抗体（ＭＦ２０；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社）を反応させ、引き続きＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識２次抗体（ヒストファイン シンプルステインＰ０（Ｒ）又はＰ０（Ｍ）；ニチレイ社）と順次反応させ、最後にＡＣＥ（３−ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ）基質液（ニチレイ社）を用いた呈色反応を行った後、光学顕微鏡下にて観察を行った。結果を図８に示す。
この培養条件において、通常のゼラチン・プレートで培養したＥＳ細胞をＰＡ６細胞上に播種した場合、培養開始後数日以内に肉眼で観察できる大きさのコロニーを形成し、培養７日目前後から明暸な神経突起様の構造を呈した分化細胞へと形態的変化を示した。この細胞は神経細胞マーカーであるＭＡＰ−２強陽性であり、ＥＳ細胞が神経細胞へ分化したことがわかる。また、ＳＴ２細胞上に播種したＥＳ細胞は、培養１２日目前後から自立的拍動を呈する細胞コロニーを形成し、当該細胞コロニーは心筋細胞マーカーであるサルコメア・ミオシン強陽性であることから、ＥＳ細胞が心筋細胞へ分化したことが明らかであった。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞を用いた場合も、コントロール群と同様に神経細胞及び心筋細胞への分化を確認することができた。以上の実験結果より、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化多能性を保持していることが証明された。
さらに、当該ＥＳ細胞のテラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ：奇形腫）形成能を検討した。テラトーマは、ＥＳ細胞をマウス等の動物の体内に移植した場合に生じる、内胚葉、中胚葉、外胚葉の三胚葉に由来する胎児性組織および成熟性組織を含む腫瘍であり、テラトーマ形成能はＥＳ細胞の分化多能性を示す指標の１つとして用いられる。
ＥＳ細胞（ＥＢ３株）を、ゼラチン・プレート及びＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種し、３日ごとに５回の継代培養を行なった。これらのＥＳ細胞を、常法によりＢａｌｂ／ｃ系ヌードマウスの精巣（約２００個ずつ）に注入したところ、６０日後にはＥＳ細胞を移植した全ての精巣においてテラトーマの形成が認められ、ゼラチン・プレート培養群とＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレート培養群において、腫瘍サイズの差異は認められなかった。また、常法に基き組織切片を作製し、その組織像を観察したところ、両群のテラトーマの中には、表皮様組織や各種神経マーカー（βＩＩＩ−チューブリン、ＧＦＡＰ、ニューロフィラメントＭ、ＧＡＰ−４３）陽性の神経細胞といった外胚葉性組織／細胞、骨や軟骨、骨格筋様組織等の中胚葉性組織／細胞、腸管や気管支上皮様組織等の内胚葉性組織／細胞の形成が観察され、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞が、テラトーマ形成能を維持していることが確認できた。
実施例５：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞のキメラ形成能の検討
Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで複数回の継代培養を行なったＥＳ細胞がキメラ形成能を保持していることの確認を行なった。同一ロット細胞においてキメラ形成能が確認されている凍結ストックから起こしたＥＳ細胞（ＥＢ３細胞株）を、ゼラチン・プレート及びＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種し、３日ごとに５回の継代培養を行なった。これらのＥＳ細胞を、常法によりＣ５７ＢＬ／６系マウスの胚盤胞（約１００個ずつ）へ注入し、偽妊娠ＩＣＲマウス（８−１０週齢）の子宮に移植し、出産させた。本来、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの毛色は黒であるが、得られた産仔中、体の一部（５〜８０％）にＥＳ細胞に由来する野ネズミ（ａｇｏｕｔｉ）色の毛を有する個体が存在しており、この様なキメラマウスが、ゼラチン・プレート培養したＥＳ細胞からは計４匹、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレート培養したＥＳ細胞からは計７匹得られた。
引き続き、このキメラマウスを正常なＩＣＲ系マウスと交配して仔マウスを出産させ、ＥＳ細胞に由来する毛色が次世代に伝達することを確認した。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレート培養したＥＳ細胞の移植により作製されたキメラマウス雄２匹からそれぞれ１４匹、１７匹の産仔を得たところ、ホスト胚盤胞として用いたＣ５７ＢＬ／６マウスに由来する毛色を呈する個体の中に、ＥＳ細胞に由来する毛色を呈する個体が各５匹及び６匹得られた。これらの個体がＥＳ細胞に由来する遺伝形質を有していることは、系統特異的なマイクロサテライト・マーカーによる解析からも確認することができた（図９）。即ち、各仔個体から、常法に基きゲノムＤＮＡを回収し、ＥＳ細胞が由来する１２９系マウスと、キメラマウス作製及び交配に用いたＣ５７ＢＬ／６系マウスの遺伝子の差異を認識することができるＤ４Ｍｉｔ７２、Ｄ４Ｍｉｔ１１６、Ｄ７Ｍｉｔ２７６、Ｄ１０Ｍｉｔ１８６の４種のマイクロサテライト・マーカーの検出を行った。その結果、毛色からＥＳ細胞の遺伝的寄与がないと予想された個体（図中、＃１〜４）では、すべてのマイクロサテライト・マーカーにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスと同じパターンが見られた。一方、毛色からＥＳ細胞の遺伝的寄与があると予想された個体（図中、＃５〜８）では、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスのパターンと、ＥＳ細胞に特異的なパターンの両方が共に認められ、これらの個体ではＥＳ細胞の遺伝子が伝達していることが確認できた。
実施例６：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞に対する遺伝子導入効率の検討
ゼラチン・プレート及びＥ−ｃａｄ−Ｆｃ・プレート上で３日間培養したＥＳ細胞に、ＧＦＰ発現ベクターであるｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を、常法に基きＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて導入した。１日後に単一細胞として回収し、９６ウェル・プレートに再播種した。その４時間後、付着したＥＳ細胞を８％ホルマリン溶液で１０分間固定し、さらに０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳ溶液、Ｉｍａｇｅ−ｉＴ ＦＸ ｓｉｇｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で処理した。ＰＢＳで洗浄後、抗ＧＦＰモノクローナル抗体（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社）と反応させた後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６標識抗ラットＩｇＧ抗体を用いて染色した。細胞核はＤＡＰＩ溶液（０．１μｇ／ｍＬ）で染色した。これらの抗体や色素による染色像を、ＡｒｒａｙＳｃａｎ^ＴＭシステム（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社）下にて観察した。その結果、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレート培養群では、通常プレート培養群よりも有意に高いＧＦＰの発現が認められ、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートで培養したＥＳ細胞は、通常の培養法で培養したＥＳ細胞と比較して、遺伝子の導入効率及び／又は発現効率が高いことが示された（図１０参照）。
実施例７：ヒトＥ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質の調製とその有用性の検討
ヒトＥ−カドヘリンの細胞外領域とＩｇＧ／Ｆｃの融合タンパク質（以下、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃと称する）を発現するベクターを構築するため、ヒト扁平上皮癌細胞株であるＡ４３１細胞由来ｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＥ−カドヘリンｃＤＮＡの細胞外ドメイン（ｈＥ−ｃａｄ−ＥＣＤ）をコードするＤＮＡ断片（アミノ酸残基番号１〜６９７に相当）を増幅した。塩基配列を確認した後、実施例１記載のＩｇＧ／Ｆｃ配列を含む発現ベクターに組み込み、ｐＲＣ−ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃを構築した。当該ベクターを用いたｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃの作製及び精製は、実施例１記載の方法に基づいて行った。
ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質をコーティングした細胞培養用プレート（以下、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレート）へのマウスＥＳ細胞の接着および増殖性を検討した。ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートの作製法は、上記実施例２記載の方法と同じである。即ち、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質のＰＢＳ希釈溶液を無処理ポリスチレン製培養プレートに注ぎ、３７℃で一晩、コーティング処理をしたものを、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートとして使用した。ＥＳ細胞（ＥＢ３株およびＲ１株）を当該プレートに播種したところ、マウス型Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質をコーティングしたプレートを使用した時と同様、強い接着性を示した。また、ｈＥ−ｃａｄ−Ｆｃプレートに播種したＥＳ細胞は、播種して２、３日後においても明瞭なコロニーをほとんど形成せず、１つ１つの細胞が分散して、活発に増えている状態が観察された（図１１）。ＥＳ細胞の未分化性および分化多能性に関しても、マウス型Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃプレートを用いて培養した時と同様、維持されていた。

本発明の増殖方法を用いることにより、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞を、フィーダー細胞を使用することなく、効率的かつ大量に生産することが可能になる。その際、多能性幹細胞を分散状態で培養することができるため、継代培養や細胞の回収がきわめて容易になる。また、培養用液体培地に添加するＬＩＦ等の因子を低減することも可能である。更には、本発明の方法を用いることにより、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞に、所望する遺伝子を効率的に導入すること、更には強く発現させることが可能になる。この様にして作製された多能性幹細胞は、既知の適当な分化誘導処理法を用いることにより、各種の機能的分化細泡を作製することに利用することができ、各種生理活性物質や機能未知の新規遺伝子産物などの薬理評価および活性評価に有用である。

Claims (7)

1. 多能性幹細胞の増殖方法において、液体培地と、当該多能性幹細胞と接着性を有するカドヘリン・ファミリーに属する分子を基材固相表面に固定又はコーティングした培養容器とを用いることにより、当該多能性幹細胞を、フィーダー細胞を使用せずに、その未分化性及び分化多能性を保持したまま分散状態で、増殖させることを特徴とする、前記方法。
2. 多能性幹細胞の遺伝子導入法において、液体培地と、当該多能性幹細胞と接着性を有するカドヘリン・ファミリーに属する分子を基材固相表面に固定又はコーティングした培養容器とを用いることにより、当該多能性幹細胞を、フィーダー細胞を使用せずに、その未分化性及び分化多能性を保持したまま分散状態で、遺伝子を導入、発現させることを特徴とする、前記方法。
3. 前記カドヘリン・ファミリーに属する分子が、E-カドヘリンであるか、又は当該分子と構造的に類似性を有する分子であってE-カドヘリンに係るEC1ドメイン並びにEC2ドメイン、EC3ドメイン、EC4ドメイン及びEC5ドメインのうち１つ以上のドメインを含み、かつ、前記多能性幹細胞と同種親和性の結合能を有する分子である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記E-カドヘリンが哺乳動物由来である、請求項３に記載の方法。
5. 前記E-カドヘリンがヒト又はマウス由来である、請求項４に記載の方法。
6. 前記多能性幹細胞と接着性を有するカドヘリン・ファミリーに属する分子が、免疫グロブリンのFc領域と融合され、当該Fc領域を介して前記基材固相表面に固定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記多能性幹細胞が、哺乳動物の胚性幹細胞（ES細胞）又は胚性生殖細胞（EG細胞）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

Images