KR20090129434A - 피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 ｊａｋ2 키나제 억제제로서의 이의 용도 - Google Patents

피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 ｊａｋ2 키나제 억제제로서의 이의 용도 Download PDF

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하리프라사드 반카얄라파티
샤오-휘 리우
데이비드 제이. 베어스
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수퍼젠, 인크.
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Abstract

JAK2 키나제 억제제로서 활성을 갖는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 암 및 기타 JAK2 키나제 관련 질환 치료에 이를 사용하는 약제학적 조성물 및 방법이 개시된다.
JAK2 키나제 억제제, 암, 단백질 키나제, 항종양

Description

피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 ＪＡＫ2 키나제 억제제로서의 이의 용도 {Pyrimidine-2,4-diamine derivatives and their use as JAK2 kinase inhibitors}
관련 출원의 교차-참조
본원은 35 U.S.C. § 119(e)에 의하여 2007년 3월 1일자에 출원된 미국 특허 가출원번호 60/892,385 및 2007년 4월 13일에 출원된 미국 특허 가출원번호 60/911,776을 우선권으로 주장하는데, 이들 가출원은 참조에 의해 이의 전체가 본원에 혼입된다.
기술 분야
본 발명은, 일반적으로, 단백질 키나제 활성을 억제하는 화합물, 및 이와 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
야누스(Janus) 키나제 (JAKs)는 인터루킨, 인터페론은 물론 수 많은 호르몬을 포함한 세포밖의 싸이토카인으로부터 신호하는데 필수적인, 포유동물에 4개 (JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2) 있는, 키나제의 한 종류이다 (Aringer, M., et al., Life Sci, 1999. 64(24): p. 2173-86; Briscoe, J., et al., Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 1996. 351(1336): p. 167-71; Ihle, J.N., Semin Immunol, 1995. 7(4): p. 247-54; Ihle, J.N., Philos Trans R Soc Lond B Bio Sci, 1996. 351(1336): p. 159-66; Firmbach-Kraft, I., et al., Oncogene, 1990. 5(9): 1329-36; Harpur, A.G., et al., Oncogene, 1992. 7(7): p. 1347-53; Rane, S.G. 및 E.P. Reddy, Oncogene, 1994. 9(8): p. 2415-23; Wilks, A.F., Methods Enzymol, 1991. 200: p. 533-46). 이러한 비-수용체 티로신 키나제는 다양한 싸이토카인 수용체와 관련되고 세포질에 결합한 세포 밖의 리간드-수용체로부터의 신호를 형질도입하도록 작용하는데, 이것은 STAT (신호 형질도입기 및 전사의 활성화제)를 인산화반응시킴으로써 할 수 있고, STAT는 그 후에 성장 및 증식에 관련된 다양한 표적 유전자의 직접 전사에 진입한다 (Briscoe, J., et al.; Ihle, J.N. (1995); Ihle, J.N.(1996); Rawlings, J.S., K.M. Rosler 및 D.A. Harrison, J Cell Sci, 2004. 117(Pt 8): p. 1281-3.). 세포 생존에서 이러한 키나제의 중요성은 JAKs의 손실이 동물 모델에서 면역결핍 및 비-생존능력과 함께 빈번히 동반한다는 사실로 명백하다 (Aringer, M., et al.). 효소의 JAK 종류는 카복시-말단 단백질 티로신 키나제 도메인 (JH1) 및 JH1 도메인의 활성을 조절한다고 여겨지는 인접한 키나제 같은 도메인 (JH2)을 포함한 다수의 JAK 상동 (homology)이다 (Harpur, A.G., et al.). 4개의 JAK 이소폼(isoforms)은 상이한 신호를 특정 싸이토카인 수용체와 특별하게 결합시키고 하위(downstream) 유전자의 서브셋(subset) 을 활성화함으로써 변환한다. 예를 들어, JAK2는 싸이토카인 수용체를 인터루킨-3 (Silvennoinen, O., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(18): p. 8429-33), 에리스로포이에틴 (Witthuhn, B.A., et al., Cell, 1993. 74(2): p. 227-36), 과립구 군체 자극 인자 (granulocyte colony stimulating factor) (Nicholson, S.E., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1994. 91(8): p. 2985-8), 및 성장 호르몬 (Argetsinger, L.S., et al., Cell, 1993. 74(2): p. 237-44)와 결합시킨다.
효소의 JAK 종류는 다양한 혈액 및 면역 장애의 흥미있는 한 세트의 표적이 되었고; JAK2는, 증식에 관여하는 이의 하위 효과기(effector)의 활성 때문에, 신생 질환 (neoplastic disease), 특히 백혈병 및 림프종 (Benekli, M., et al., Blood, 2003. 101(8): p. 2940-54; Peeters, P., et al., Blood, 1997. 90(7): p. 2535-40; Reiter, A., et al., Cancer Res, 2005. 65(7): p. 2662-7; Takemoto, S., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(25): p. 13897-902)은 물론 고형 종양 (solid tumors) (Walz, C., et al., J Biol Chem, 2006. 281(26); p. 18177-83) 및 진성 적혈구 증가증 (polycythemia vera)과 같은 기타 골수증식성 장애 (myeloproliferative disorders) (Baxter, E.J., et al., Lancet, 2005. 365(9464): p. 1054-61; James, C., et al., Nature, 2005. 434(7037): p. 1144-8; Levine, R.L., et al., Cancer Cell, 2005. 7(4): p. 387-97; Shannon, K. 및 R.A. Van Etten, Cancer Cell, 2005. 7(4): p. 291-3)에 대한 실행가능한 (viable) 표적으로서 현재 특별히 연구가 진행중이다. JAK2는 또한 혈액암 (hematologic malignancies)에서 돌연변이되어, 싸이토카인 수용체에 결합한 리간드를 더 이상 필요로 하지 않고 대신에 구조적 활성 상태에 있는다고 알려져 있다. 이것은, JAK2 유전자와, ETV6, BCR 또는 PCM1 단백질을 암호화(encode)하는 유전자 사이의 전 좌(translocation)를 통하여 발생하여 (Peeters, P., et al.; Reiter, A., et al.,; Griesinger, F., et al., Genes Chromosomes Cancer, 2005. 44(3): p. 329-33; Lacronique, V., et al., Science, 1997. 278(5341): p. 1309-12) 만성적 골수성 백혈병에서 보이는 BCR-ABL 단백질과 유사한 암발생적 퓨전 단백질을 생성하도록 할 수 있다. JAK2의 과활성화는 또한 JAK2 서열 자체의 돌연변이를 통하여 발생할 수 있는데; 예를 들어, 골수증식성 진성 적혈구 증가증은 아미노산 617 (JAK2 V617F)에서 발린-에서-페닐알라닌 (valine-to-phenylalanine) 치환을 일으키는 점 돌연변이와 관련된다 (Walz, C., et al.). 이의 신생 및 골수증식성 장애와의 관련 및 탈규제하기 때문에, 사람 악성종양 치료용 작은 분자 JAK2 억제제가 매우 중요하다.
JAK2 억제제가 다수의 사람 악성종양에 관련되어 있음에 기초하여, JAK2 키나제 단백질에 의해 매개되고/매개되거나 관련이 있는 암 및 기타 질환의 치료를 위해, 특이적이고 선택적인 억제제를 계획해 볼 필요가 있다. 본 발명은 이러한 필요를 충족하는 것으로 기타 관련된 이점을 제공한다.
간단한 요약
본 발명은 일반적으로 화합물 (본원에서는 '피리미딘-2,4-디아민 유도체'라고도 칭함) 및 당해 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 상기 화합물은 입체이성질체 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 하기 화학식 I 또는 II의 화합물이다.
Figure 112009057886861-PCT00001
Figure 112009057886861-PCT00002
상기 식에서, R1, W1, W2, X1, X2, Y1, Y2 및 Z는 본원에서 하기 정의한 바와 같다.
상기 화합물은 넓은 범위의 치료적 적응증에 사용될 수 있으며 JAK2 단백질 키나제에 의해 매개되고/매개되거나 적어도 부분적으로 관련되는 암과 같은 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서, 본원에 기술된 화합물은 당해 화합물을 필요한 대상체에 투여하기 위해 약제학적으로 허용되는 조성물로 제형화된다.
다른 측면에서, 본 발명은 JAK2 단백질 키나제-매개된 질환(예: 암)을 치료 하거나 예방하는 방법을 제공하며, 당해 방법은 본원에 기술된 화합물의 치료적 유효량 내지 상기 화합물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 유효량을, 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
다른 측면은 생물학적 샘플에서 JAK2 단백질 키나제 활성을 억제하는 것에 관한 것으로, 당해 방법은 생물학적 샘플을 본원에 기술된 화합물 또는 당해 화합물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 측면은 환자에서 JAK2 단백질 키나제 활성을 억제하는 방법에 관한 것으로, 당해 방법은 본원에 기술된 화합물 또는 당해 화합물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 또는 기타 측면은 아래 상세한 설명을 참조할 때 더욱 명확해질 것이다. 이러한 목적을 위해, 특정 특허 및 기타 문헌이 본원 발명의 다양한 측면을 더욱 상세히 나타내기 위해 본원에서 인용된다. 상기 문헌 각각은 참조에 의해 이의 전체가 본원에 혼입된다.
본 발명의 일반적 측면에 따르면, JAK2 단백질 키나제 억제제로서 유용한 화합물 및 이와 관련된 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 화합물은, 입체이성질체 및 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 하기 화학식 I 또는 II의 구조를 나타낸다.
[화학식 I]
Figure 112009057886861-PCT00003
[화학식 II]
Figure 112009057886861-PCT00004
상기 식에서, Z는 CH 또는 N이고;
W1 및 W2는 독립적으로 직접 결합, -C(=O)- 또는 -O(CH2)n-이고;
R1는 -H, -CF3, -OCF3, -OCHF2, -OCH3, -CH3, -OH, -NO2, -NH2 또는 할로겐이고;
X1 및 X2는 독립적으로 -H, -CF3, -OCF3, -OCHF2, -OCH3, -CH3, -OH, -NO2, -NH2, 할로겐 또는
Figure 112009057886861-PCT00005
(여기서, X1 또는 X2 의 하나가
Figure 112009057886861-PCT00006
일 때, Q는 O 또는 N이고, R은 존재하지 않거나 R은 -C1-6 알킬이다);
Y1 및 Y2는, Y1 및 Y2 둘 다 -H가 아니면, 독립적으로 -H, -CN, 할로겐, 또는 -CN로 치환된 C1-4 알킬기이고;
n은 1, 2 또는 3 이다.
본원 명세서 및 특허청구범위에 사용된 하기 용어들은 다른 언급이 없으면 다음에서 설명되는 의미를 갖는다.
'할로겐'은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오드 및 대체적으로 플루오로 또는 클로로를 의미한다.
'C1-6 알킬'은 탄소수가 1 내지 6인 포화 직쇄 (straight) 또는 측쇄 (branched), 포화 또는 비포화, 사이클릭 또는 비사이클릭 (noncyclic) 탄화수소 라디칼을 나타내며, 반면 'C1-4 알킬'은 동일한 의미를 갖지만 탄소수가 1 내지 4이다. 대표적인 포화 직쇄 또는 측쇄 C1-4 알킬 및 C1-6 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2급-부틸 (sec-butyl) 및 3급-부틸이고, C1-6 알킬은 n-펜틸, n-헥실 및 상응하는 측쇄를 추가로 포함한다. 대표적인 포화 사이클릭 알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, -CH2-사이클로펜틸, 사이클로헥실 등을 포함하며, 반면 비포화 사이클릭 알킬은 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐 등을 포함한다. 불포화 알킬은 인접한 탄소 원자 사이에 적어도 하나의 이중 결합 또는 삼중 결합을 함유한다(각각 "알케닐" 또는 "알키닐"이라 칭한다). 대표적인 직쇄 및 측쇄 알케닐은 에틸레닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐 등을 포함하며, 반면, 대표적 직쇄 및 측쇄 알키닐은 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 3-메틸-1-부티닐 등을 포함한다.
상기 화학식 I 및 II의 더욱 구체적 측면에서, Z는 CH이고 화합물은, 입체이성질체 및 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 하기 화학식 III 및 IV의 화합물이다.
Figure 112009057886861-PCT00007
Figure 112009057886861-PCT00008
상기 화학식 I 및 II의 다른 측면에서, Z는 N이고 화합물은, 입체이성질체 및 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 하기 화학식 V 및 IV의 화합물이다.
Figure 112009057886861-PCT00009
Figure 112009057886861-PCT00010
상기 화학식 III 및 V의 더욱 구체적 양태에서, X1 는 피페라지닐이고, R은 메틸이고, W1 및 W2는 둘 다 직접 결합이고, 화합물은 각각 하기 화학식 VII 및 VIII의 화합물이다.
Figure 112009057886861-PCT00011
Figure 112009057886861-PCT00012
상기 화학식 VII 및 VIII의 더욱 구체적 양태에서, X2는 -F이고, 화합물은 각각 하기 화학식 IX 및 X의 화합물이다.
Figure 112009057886861-PCT00013
Figure 112009057886861-PCT00014
상기 화학식 VII 및 VIII의 다른 추가적 구체적 양태에서, X2는 -H이고, 화합물은 각각 하기 화학식 XI 및 XII의 화합물이다.
Figure 112009057886861-PCT00015
Figure 112009057886861-PCT00016
상기 화학식 III의 다른 구체적 양태에서, X2는 피페라지닐이고, R은 메틸이고, W2는 -O(CH2)3-이고 W1는 직접 결합이고, 화합물은 하기 화학식 XIII의 화합물이다.
Figure 112009057886861-PCT00017
상기 화학식 XIII 의 더욱 구체적 양태에서, X1는 -OCH3 이다.
상기 화학식 III의 다른 구체적 양태에서, X1는 피페라지닐이고, W1는 -C(=O)- 이며 W2는 직접 결합이고, 화합물은 하기 화학식 XIV의 화합물이다.
Figure 112009057886861-PCT00018
상기 화학식 XIV의 추가적 구체적 양태에서, X2는 -H이고, R은 메틸이거나 R 은 클로로헥실이다.
상기 화학식 I, II, III, IV, V, Vl, VII, VIII, IX, X, Xl, XII, XIII 및 XIV의 구체적 양태에서, Y1 및 Y2는 할로겐이고, 더욱 구체적으로 Y1는 클로로이고 Y2는 플루오로이다.
상기 화학식 I, III, V, VII, VIII, IX, X, Xl 및 XII의 구체적 양태에서, Y1 및 Y2는 -CN 및 할로겐이고, 더욱 구체적으로 Y1는 -CN이고 Y2는 플루오린이다.
상기 화학식 I, III, IV, V, Vl, VII, VIII, IX, X, Xl, XII, XIII 및 XIV의 구체적 양태에서, Y1 및 Y2는 -H 및 -CN으로 치환된 C1-4알킬기이고, 더욱 구체적으로 Y1는 -CH2CN이고 Y2는 -H이다.
상기 화학식 II, IV 및 VI의 구체적 양태에서, R1는 -F이거나 R1는 -CF3이다.
동일한 분자식을 갖지만 이의 원자 결합의 종류 또는 순서, 또는 원자의 공간 배열이 상이한 화합물을 "이성질체"라 부른다. 공간에서의 원자 배열이 상이한 이성질체를 "입체이성질체"라 한다. 서로의 거울상이 아닌 입체이성질체를 "부분입체이성질체"라 하며, 서로 포개어지지 않는 거울상 이성질체를 "에난티오머"라 한다. 화합물이 비대칭 중심을 가질 때, 예를 들어, 4개의 상이한 그룹에 결합되면 한 쌍의 에난티오머가 가능하다. 에난티오머는 이의 비대칭 중심의 절대 배열에 의해 구별될 수 있으며, Cahn 및 Prelog의 R- 및 S-배열 룰에 따라 정의되거나 [참조: Cahn, R., Ingold, C, 및 Prelog, V. Angew. Chem. 78:413-47, 1966; Angew. Chem. Intemat. Ed. Eng. 5:385-415, 511, 1966], 편광 면에서 회전하는 분자의 방식에 따라 우선성 또는 좌선성(즉, 각각, (+) 또는 (-)-이성질체)으로 정의된다. 키랄 화합물은 각각의 에난티오머로 존재하거나 이의 혼합물 형태로 존재할 수 있다. 동일한 비율의 에난티오머를 함유하는 혼합물을 "라세믹 혼합물"이라 한다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있으며, 따라서 당해 화합물은 개별적인 (R)- 또는 (S)-입체이성질체 또는 이의 혼합물로 제조될 수 있다. 다른 언급이 없다면, 본원 명세서 및 특허청구범위의 특정 화합물에 대한 정의 및 명칭은 개별 에난티오머 및 이의 라세믹 혼합물 모두를 포함하는 의미이다. 입체화학의 동정 방법 및 입체이성질체의 분리 방법은 당업자에게 공지되어 있다[참조: "ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY"의 4장 참조, 4th edition, March, J., John Wiley 및 Sons, New York City, 1992].
본 발명의 화합물은 토토머 현상 및 구조 이성질 현상이 나타날 수 있다. 본 발명은 JAK2-2 키나제 활성을 조절하는 능력을 가진, 임의의 토토머 또는 구조 이성질 형태 및 이의 혼합물을 포함하며, 어떤 하나의 토토머 또는 구조 이성질 형태에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물은 사람과 같은 유기체의 체내 효소에 의해 대사되어 단백질 키나제 활성을 조절할 수 있는 대사체를 생성시킬 수 있음이 고려된다. 상기 대사체는 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염은 이 자체로 사람을 포함한 환자에게 투여되거나 상기 화합물을 적당한 담체 또는 부형제와 혼합한 약제학적 조성물 형태로 투여될 수 있다. 약물을 제형화하고 투여하는 기술은 예를 들어 문헌[REMINGTON'S PHARMACOLOGICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition]에 기술되어 있다.
"약제학적 조성물"은 본원에 기술된 하나 이상의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염과, 약제학적으로 허용되는 부형제와 같은 기타 화학 성분의 혼합물을 나타낸다. 약제학적 조성물의 목적은 유기체에 화합물의 투여를 용이하게 하기 위한 것이다.
"약제학적으로 허용되는 부형제"는 화합물의 투여를 더욱 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 성분을 말한다. 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 백당 및 전분류, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물유 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
"약제학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하는 모 화합물의 염을 나타낸다. 상기 염은 (1) 모 화합물의 유리 염기와, 무기산(예: 염산, 브롬산, 질산, 인산, 황산 및 과염소산 등) 또는 유기산(예: 아세트산, 옥살산, (D)- 또는 (L)-말산, 말레산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 타타르산, 구연산, 숙신산, 말론산 등)(바람직하게는 염산 또는 (L)-말산)과의 반응에 의해 수득된 산 첨가염; 또는 (2) 모 화합물 내 존재하는 산성 양자를 금속 이온(예: 알칼리금속 이온, 알칼리토금속 이온 또는 알루미늄 이 온)으로 대체할 때 생성되는 염; 또는 유기 염기(예: 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등)와의 배위 결합물을 포함한다.
"치료적 유효량"은 치료되어야 할 장애의 하나 이상의 증상이 어느 정도 경감되도록 투여되는 화합물의 양을 나타낸다. 암의 치료와 관련하여, 치료적 유효량은 (1) 종양의 크기를 감소시키는 효과, (2) 종양 전이를 억제하는 효과, (3) 종양 성장을 억제하는 효과, 및/또는 (4) 암과 관련된 하나 이상의 증상을 경감시키는 효과를 갖는 양을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "JAK2 단백질 키나제-매개된 병" 또는 "질환"은 JAK2 단백질 키나제가 역할을 하는 것으로 알려진 모든 질환 혹은 기타 해로운 병을 의미한다. 용어 "JAK2 단백질 키나제-매개된 병" 또는 "질환"은 또한, 하기에 상세히 설명하는 암을 포함하는, JAK2 단백질 키나제 억제제로 치료하여 경감되는 질환 혹은 병을 의미한다.
본원에서 사용된 "투여한다" 또는 "투여"는 단백질 키나제와 관련된 장애의 예방 또는 치료의 목적으로 유기체에 본 발명의 화합물, 약제학적으로 허용되는 이의 염, 본 발명의 화합물이나 약제학적으로 허용되는 이의 염을 함유하는 약제학적 조성물을 전달하는 것을 나타낸다.
적합한 투여 경로는 경구, 직장, 경점막 또는 장내 투여 또는 근육 내, 피하, 골수 내, 척수강 내, 직접 심실 내, 정맥 내, 유리체 내, 복강 내, 비강 내 또는 안내 주사를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 양태에서, 바람직한 투여 경로는 경구 및 정맥 투여이다.
또는, 화합물은 전신적인 방식이 아닌 국소적 투여 방식으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 디포(depot)나 서방형 제형으로 화합물을 고형 종양에 직접 주사하는 방법이 있다.
더욱이, 화합물은 표적화된 전달 시스템에 의해 투여될 수 있으며, 예를 들어 종양-특이적 항체로 피복된 리포솜에 의해 투여될 수 있다. 이러한 방식에서 상기 리포솜은 종양을 표적화하고 종양에 선택적으로 흡수될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 보통의 혼합, 용해, 과립화, 드라제(dragee)-제조, 침강, 에멀젼화, 캡슐화, 트랩핑 및/또는 동결건조 과정에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 용도에 사용되는 약제학적 조성물은, 유효 화합물을 약제학적으로 사용될 수 있도록 제제화시키는 공정을 돕는 부형제 및 보조제를 포함하는, 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하는 임의의 통상의 방법으로 제형화될 수 있다. 적당한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.
주사용으로 본 발명의 화합물은 수성 용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액(예: 한크스 용액, 링거 용액)이나 생리적 염수 완충액 중 제형화될 수 있다. 경점막 투여용으로 투여 장벽을 투과시키기에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 상기 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
경구 투여용으로는 본 화합물은 유효 화합물을 당업자에게 익히 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 제형화될 수 있다. 상기 담체는 환자의 경구 섭취를 위해 본 발명의 화합물을 정제, 환제, 라진즈(lozenge), 드라제, 캡슐, 액 제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제 등으로 제형화시킬 수 있다. 경구용 약제학적 제제는 고체 부형제를 사용하고, 생성된 혼합물을 임의로 분쇄하고 필요한 경우 기타 적합한 보조제를 추가한 후 과립 혼합물을 제조하여 정제 또는 드라제 핵을 수득함으로써 제조될 수 있다. 유용한 부형제는 특히 충진제(예: 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소비톨을 포함한 백당), 셀룰로스 제제(예: 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분) 및 기타 재료(예: 젤라틴, 트래거컨트 검, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스나트륨 및/또는 폴리비닐-피롤리돈(PVP))이다. 바람직한 경우, 붕괴제(예: 교차 결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천 또는 알긴산)가 첨가될 수 있다. 알긴산나트륨과 같은 염이 또한 사용될 수 있다.
드라제 핵에 적합한 코팅제가 제공된다. 이러한 목적을 위해, 농축된 백당 용액이 사용될 수 있으며, 상기 백당 용액은 아라비아검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 라커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 임의로 함유할 수 있다. 사용된 유효 화합물의 상이한 배합을 확인하거나 구별하기 위해 정제나 드라제 코팅제에 색소 또는 안료가 첨가될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 약제학적 조성물은, 젤라틴으로 된 푸쉬-핏(push-fit) 캡슐과, 젤라틴과 가소제(예: 글리세롤 또는 소비톨)로 이루어진 연질의 밀봉된 캡슐을 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 유효 화합물을 충진제(예: 락토스), 결합제(예: 전분) 및/또는 윤활제(예: 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트) 및 임의 성분인 안정화제와 혼합하여 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 유효 화합물은 적합한 액 제(예: 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액상 폴리에틸렌 글리콜) 중 용해시키거나 현탁시킬 수 있다. 안정화제를 또한 상기 제형에 첨가할 수 있다. 사용될 수 있는 약제학적 조성물은 경질 젤라틴 캡슐을 포함한다. 캡슐 또는 환제를 갈색 유리 또는 플라스틱 병 내에 보관하여 유효 성분을 빛으로부터 보호할 수 있다. 유효 화합물 캡슐 제형을 함유하는 용기는 바람직하게 조절된 실온(15 내지 30℃)에서 저장된다.
흡입 투여용으로, 본 발명에서 사용되는 화합물은 다수의 기존 기술로 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 예를 들어, 에어로졸 스프레이는 가압된 팩 또는 네불라이저, 및 적합한 추진제(예: 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라-플루오로에탄 또는 이산화탄소이나 이에 한정되지 않음)를 사용할 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우, 용량 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 조절될 수 있다. 흡입기 또는 취입기 내 사용되는 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물과 적합한 분말 기재(예: 락토스 또는 전분)의 분말 혼합물을 함유하여 제형화될 수 있다. 또한, 화합물은 추진제가 존재하지 않는 에어로졸 형태로 전달될 수 있다.
본 화합물은 또한 비경구 투여(예: 1회 주사 또는 지속 주입)용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 보존제와 함께 단위 용량 형태, 예를 들어 앰플 내 또는 다용량 용기 내 존재할 수 있다. 조성물은 오일 또는 수성 비히클 중 현탁제, 용제 또는 에멀젼 형태일 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화 성분을 함유할 수 있다.
비경구 투여용 약제학적 조성물은 이에 제한됨 없이 유효 성분의 염과 같은 수용성 형태의 수성 용액을 포함한다. 추가적으로, 유효 화합물의 현탁제는 친지질성 비히클 중에서 제조될 수 있다. 적합한 친지질성 비히클은 지방 오일(예: 참기름, 합성 지방산 에스테르(예: 에틸 올레에이트 및 트리글리세리드) 또는 물질(예: 리포솜)을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 성분(예: 카복시메틸 셀룰로스 나트륨, 소비톨 또는 덱스트린)을 함유할 수 있다. 임의적으로, 상기 현탁액은 적합한 안정화제, 및/또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고농축된 용액의 제조가 가능하게 하는 제제를 또한 함유할 수 있다.
또는, 상기 유효 성분은 적합한 비히클, 예를 들어 무균의 병원균 비함유수과 사용 전 구성되는 분말 형태일 수 있다.
본 화합물은 또한 예를 들어 일반적인 좌제 베이스(예: 코코아 버터 또는 기타 글리세리드)를 사용하여, 좌제 또는 정체 관장과 같은 직장 조성물로 제형화될 수 있다.
앞서 언급한 제형 외에, 본 화합물은 또한 데포(depot) 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 장기간 작용하는 제형은 이식(예: 피하 또는 근육내)이나 근육 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 적합한 중합체 또는 소수성 물질(예: 약리학적으로 허용되는 오일의 에멀젼 형태), 이온 교환 수지, 또는 난용성 유도체(예: 제한됨 없이 난용성 염)의 투여 경로로 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물에 대한 약제학적 담체의 비제한적 예는 벤질 알코올, 비극성 계면활성제, 수-혼화성 유기 중합체 및 수상(예: VPD 공용매계)을 포함하는 공 용매계이다. VPD는 무수 에탄올 중에서 용적을 조정한, 3% w/v 벤질 알코올, 8% w/v 비극성 계면활성제 폴리소르베이트 80 및 65% w/v 폴리에틸렌 글리콜 300의 용액이다. 상기 VPD 공용매계(VPD:D5W)는 수용액 중 5% 덱스트로스로 1:1 희석된 VPD로 이루어진다. 상기 공용매계는 소수성 화합물을 양호하게 용해시킬 뿐 아니라 전신 투여시 독성이 낮다. 물론, 상기 공용매계의 비율은 당해 공용매계의 용해도 및 독성 특성을 훼손하지 않으면서 상당히 달라질 수 있다. 더욱이, 상기 공용매 성분의 동일성도 달라질 수 있는데, 예를 들어 폴리소르베이트 80 대신에 기타 저-독성 비극성 계면활성제가 사용될 수 있고, 폴리에틸렌 글리콜의 분획 크기도 달라질 수 있으며, 기타 생적합성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어 폴리비닐 피롤리돈으로 대체될 수 있고, 기타 백당 또는 다당류가 덱스트로스를 대신할 수 있다.
또는, 약제학적 화합물에 대한 기타 전달 시스템이 사용될 수 있다. 리포솜 및 에멀젼은 소수성 약물에 대한 잘 알려진 전달 비히클 또는 담체의 예이다. 추가로, 비록 빈번하게 더 큰 독성을 감수해야 하지만, 특정 유기 용매(예: 디메틸설폭시드)가 또한 사용될 수 있다.
추가적으로, 본 화합물은 서방형계(예: 치료제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스)를 사용하여 전달될 수 있다. 다양한 서방형 부재가 확립되어 있으며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 서방형 캡슐은 이의 화학적 특성에 따라 화합물을 몇주 내지 100일 이상까지 방출할 수 있다.
본 약제학적 조성물은 또한 적합한 고체 또는 겔상 담체 또는 부형제를 포함 할 수 있다. 상기 담체 또는 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 백당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴 및 중합체(예: 폴리에틸렌 글리콜)를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다수의 JAK2 단백질 키나제-조절 화합물은 생리학적으로 허용되는 염으로 제공될 수 있으며, 여기서 화합물은 음전하로 하전되거나 양전하로 하전된 종을 형성할 수 있다. 본 화합물이 양전하 하전된 잔기를 형성하는 염의 예는 염산염, 황산염, 탄산염, 젖산염, 주석산염, 말산염, 말레산염, 숙신산염과 같은 염을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화합물이 음전하로 하전된 종을 형성하는 경우 염은 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 및 마그네슘염을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용도에 적합한 약제학적 조성물은 유효 성분이 의도한 목적, 예를 들어 JAK2 단백질 키나제 활성 조절 및/또는 JAK2 단백질 키나제-관련 장애의 치료 또는 예방을 달성하기에 충분한 양으로 함유된 조성물을 포함한다.
더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 질환의 증상을 예방, 경감 또는 호전시키거나, 치료 대상체의 수명을 연장시키기에 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량은 당업자의 역량 안에서 결정될 수 있으며, 특히 본원에 기술된 상세한 설명을 참조하여 결정될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료적 유효량 또는 용량은 세포 배양 검사에 의해 초기에 측정될 수 있다. 다음으로, 상기 용량은 동물 모델에서 사용되기 위해 제형화되어, 세포 배양에서 측정 된 IC50(즉, 단백질 키나제 활성을 절반-최대 억제하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 순환하는 농도 범위를 얻을 수 있다. 이러한 정보는 다음으로 사람에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 화합물의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 절차에 의해, 예를 들어 대상 화합물에 대해 IC50 및 LD50을 측정함으로써 결정될 수 있다. 상기 세포 배양 검사 및 동물 연구에서 수득된 데이터는 사람에서 상용량의 범위를 정하는 데 사용될 수 있다. 상기 용량은 사용된 용량 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태에 맞추어 의사 개인에 의해 선택될 수 있다[참조예: GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Ch. 3, 9th ed., Ed. by Hardman, J., 및 Limbard, L., McGraw-Hill, New York City, 1996, p.46].
용량 및 투여 간격은 JAK2 키나제 조절 작용을 유지하기에 충분한 유효 성분 종의 혈장 수준을 제공하도록 개인마다 조정될 수 있다. 상기 혈장 수준을 최소 유효 농도(MEC)라 한다. 상기 MEC는 각각의 화합물마다 다를 수 있으나 in vitro 데이터로부터 측정될 수 있으며, 예를 들어 키나제의 50 내지 90% 억제를 달성하기에 필요한 농도가 본원에 기술된 검사를 이용하여 확인될 수 있다. MEC를 달성하기에 필요한 용량은 개인의 특성 및 투여 경로에 따라 다르다. HPLC 검사 또는 생검이 혈장 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다.
투여 간격 역시 MEC 값을 사용하여 결정될 수 있다. 화합물은 혈장 수준이 10 내지 90%의 시간 동안, 바람직하게는 30 내지 90%의 시간 동안, 더욱 바람직하게는 50 내지 90%의 시간 동안 MEC를 초과하도록 하는 복용법을 사용하여 투여되어야 한다.
현재, 본 발명의 화합물의 치료적 유효량은 일일 대략 2.5 mg/m2 내지 1500 mg/m2의 범위일 수 있다. 추가적인 예시 용량은 0.2 내지 1000mg/qid, 2 내지 500mg/qid, 및 20 내지 250mg/qid의 범위이다.
국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우, 본 약물의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련이 없을 수 있으며, 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 정확한 투여량과 투여 간격을 정할 수 있다.
투여되는 조성물의 양은 물론 치료 대상체, 병의 중증도, 투여 방식, 처방하는 의사의 판단 등에 따라 달라질 것이다.
본 조성물은 필요하다면 팩이나 디스펜서(dispenser) 장치(예: FDA 승인된 키트) 내 존재할 수 있으며, 당해 장치는 유효 성분을 함유하는 하나 이상의 단일 용량 형태를 함유할 수 있다. 상기 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일(예: 블리스터 팩)을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 설명서가 첨부될 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서는 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 관청에 의해 규정된 형태의, 용기에 결합된 문구를 수반할 수 있으며, 상기 문구는 조성물의 형태 또는 사람이나 동물 투여가 해당 관청의 승인을 받은 것임을 나타낸다. 상기 문구는, 예를 들어 미국 FDA에 의해 승인된 라벨링이거나 승 인된 제품 삽입물일 수 있다. 또한, 적합한 약제학적 담체 내 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 제조하고, 적합한 용기 내 위치시키고 적응증의 치료를 위해 라벨링될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 화합물 및 조성물은 JAK2 단백질 키나제에 의해 매개되는 넓은 범위의 질환 및 병에 활용할 수 있을 것이다. 상기 질환은, 예를 들어, 혈액암 (예: 급성 골수성 백혈백 (AML) 및 만성 골수성 백혈병 (CML)), 폐암, NSCLC(비소세포폐암), 연맥 세포암, 골암, 췌장암, 피부암, 피부섬유육종, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장-직장암, 항문 주위 암, 위암, 결장암, 유방암, 부인과 종양(예: 자궁 육종, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암 또는 외음부암), 홉킨스 질환, 간세포암, 식도암, 소장암, 내분비계암(예: 갑상선암, 췌장암, 부갑상선암 또는 부신암), 연질 조직 육종, 요도암, 페니스암, 고환암, 전립선암(예: 특히 호르몬-난치성), 만성 또는 급성 백혈병, 소아기 고형암, 과다호산구증가증, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 요관 암(예: 신장 세포 육종, 신우 육종), 소아 종양, 중추신경계 종양(예: 원발성 CNS 림프종, 척추 종양, 수모세포종, 뇌간 교종, 뇌하수체선종)과 같은 암, 바렛 식도(전-암성 증후군), 신생 피부 질환, 건선, 균상식육종 및 양성 전립선 비대증, 당뇨 관련 질환(예: 당뇨병성 망막증, 망막 허혈 및 망막 신생혈관증), 간경변증, 혈관신생증, 심혈관 질환(예: 죽상동맥경화증), 면역 질환(예: 자가 면역 질환) 및 신장 질환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 다른 화학요법제와 배합하여 사용될 수 있 다. 본 발명의 화합물의 용량은 임의의 약물-약물 상호작용으로 조정될 수 있다. 한 양태에서, 화학요법제는 유사분열 억제제, 알킬화제, 항대사제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제(예: CAMPTOSAR(irinotecan)), 생물학적 반응 개질제, 항호르몬제, 항혈관신생제(예: MMP-2, MMP-9 및 COX-2 억제제), 항안드로겐제, 백금 배위 착체(시스플라틴 등), 치환된 우레아(예: 하이드록시우레아), 메틸하이드라진 유도체(예: 프로카바진), 부신피질 억제제(예: 미토탄, 아미노글루테티미드), 호르몬 및 호르몬 길항제(예: 부신피질 스테로이드(예: 프레드리손), 프로게스틴(예: 하이드록시프로게스테론 카프로에이트), 에스트로겐(예: 디에틸스틸베스테롤), 항에스트로겐제(예: 타목시펜), 안드로겐제(예: 테스토스테론 프로피오네이트), 및 아로마타제 억제제(예: 아나스트로졸) 및 AROMASIN(엑세메스탄)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기 방법에서 함께 배합되어 사용될 수 있는 알킬화제의 예는, 플루오로우라실(5-FU) 단독 또는 류코보린과 추가 배합; 기타 피리미딘 유사체(예: UFT, 카페시타빈, 겜시타빈 및 시타라빈), 알킬 설포네이트(예: 부설판(만성 과립구성 백혈병 치료제로 사용됨), 임프로설판 및 피포설판); 아지리딘(예: 벤조데파, 카보쿠온, 메투레데파 및 우레데파); 에틸렌이민 및 메틸멜라민(예: 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤멜라민); 및 질소 머스타드(예: 클로람부실(만성 림파구성 백혈병, 원발성 마크로글로불린혈증 및 비-홉킨스 림프종 치료제), 사이클로포스파미드(홉킨스 질환, 다발성 골수종, 신경모세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 윌름스 종양 및 횡문근육증의 치료에 사용됨), 에스트라무스틴, 이포스파미드, 노벰브리친, 프레드니무스틴 및 우라실 머스타드(원발성 혈소판증가증, 비-홉킨스 림프종, 홉킨스 질환 및 난소암 치료에 사용됨); 및 트리아진(예: 다카바진(연질 조직 육종 치료에 사용됨))을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에서 배합되어 사용될 수 있는 항대사제 화학요법제의 예는, 엽산 유사체(예: 메토트렉세이트(급성 림파구성 백혈병, 융모막암종, 균상식육종, 유방암, 두경부암 및 골육종의 치료에 사용됨) 및 프테로프테린); 및 푸린 유사체(예: 급성 과립구증, 급성 림프구증 및 만성 과립구성 백혈병 치료에 사용되는, 머캅토푸린 및 티오구아닌)를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에서 배합되어 사용될 수 있는 천연 생성물계 화학요법제의 예는 빈카 알카로이드(예: 빈블라스틴(유방암 및 고환암 치료에 사용됨), 빈크리스틴 및 빈데신); 에피포도필로톡신(예: 에토포시드 및 테니포시드, 두 약물 모두 고환암 및 카포시 육종 치료에 유용함); 항생제 화학요법제(예: 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신(위암, 자궁경부암, 결장암, 유방암, 방광암 및 췌장암 치료에 사용), 닥티노마이신, 테모졸로미드, 플리카마이신, 블레오마이신(피부, 식도 및 비뇨생식기암 치료에 사용); 및 효소 화학요법제(예: L-아스파라기나제)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
유용한 COX-II 억제제의 예는 비옥스(Vioxx), 셀레브렉스(셀레콕시브), 발데콕시브, 파라콕시브, 로페콕시브 및 콕스(Cox) 189를 포함한다.
유용한 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제의 예가 WO 96/33172 (1996. 10. 24. 발행), WO 96/27583 (1996. 3. 7. 발행), 유럽 특허 출원 제97304971.1호 (1997. 7. 8. 출원), 유럽 특허 출원 제99308617.2호(1999. 10. 29. 출원), WO 98/07697 (1998. 2. 26. 발행), WO 98/03516 (1998. 1. 29. 발행), WO 98/34918 (1998. 8. 13. 발행), WO 98/34915 (1998. 8. 13. 발행), WO 98/33768 (1998. 8. 6. 발행), WO 98/30566 (1998. 7. 16. 발행), 유럽 특허 공보 제606,046호 (1994. 7. 13. 발행), 유럽 특허 공보 제931,788호(1999. 7. 28. 발행), WO 90/05719 (1990. 5. 31. 발행), WO 99/52910 (1999. 10. 21. 발행), WO 99/52889 (1999. 10. 21. 발행), WO 99/29667 (1999. 6. 17. 발행), PCT 국제 출원 제PCT/IB98/01113호 (1998. 7. 21. 출원), 유럽 특허 출원 제99302232.1호 (1999. 5. 25. 출원), 영국 특허 출원 제9912961.1호(1999. 6. 3. 출원), 미국 특허 제5,863,949호(1999. 1. 26. 등록), 미국 특허 제5,861,510호(1999. 1. 19. 등록), 및 유럽 특허 공보 제780,386호(1997. 6. 25. 발행)에 기재되어 있으며, 이들 문헌 모두는 참조에 의해 전체가 본원에 혼입된다. 바람직한 MMP-2 및 MMP-9 억제제는 MMP-1 억제 활성이 거의 없거나 전혀 없는 것이다. 더욱 바람직하게는 다른 매트릭스-메탈로프로테이나제(즉, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 및 MMP-13)에 비해 MMP-2 및/또는 MMP-9를 선택적으로 억제하는 것이다.
본 발명에서 유용한 특정 MMP 억제제의 구체적인 예는 AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 및 다음에서 선택된 화합물이다:
3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-하이드록시카바모일-사이클로펜틸)-아미노]-프로피온산; 3-엑소-3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8- 옥사-바이사이클로[3.2.1]옥탄-3-카복실산 하이드록시아미드; (2R,3R) 1-[4-(2-클로로-4-플루오로-벤질옥시)-벤젠설포닐]-3-하이드록시-3-메틸-피페리딘-2-카복실산 하이드록시아미드; 4-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-피란-4-카복실산 하이드록시아미드; 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-하이드록시카바모일-사이클로부틸)-아미노]-프로피온산; 4-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-피란-4-카복실산 하이드록시아미드; (R) 3-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-피란-3-카복실산 하이드록시아미드; (2R,3R) 1-[4-(4-플루오로-2-메틸벤질옥시)-벤젠설포닐]-3-하이드록시-3-메틸-피페리딘-2-카복실산 하이드록시아미드; 3-[[(4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(1-하이드록시카바모일-1-메틸-에틸)-아미노]-프로피온산; 3-[[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐]-(4-하이드록시카바모일-테트라하이드로-피란-4-일)-아미노]- 프로피온산; 3-엑소-3-[4-(4-클로로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-바이사이클로[3.2.1]옥탄-3-카복실산 하이드록시아미드; 3-엔도-3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-8-옥사-바이사이클로[3.2.1]옥탄-3-카복실산 하이드록시아미드; 및 (R) 3-[4-(4-플루오로-페녹시)-벤젠설포닐아미노]-테트라하이드로-푸란-3-카복실산 하이드록시아미드; 및 이들 화합물의 약제학적으로 허용되는 염 및 용매화물.
기타 항-혈관신생제, 기타 COX-II 억제제 및 기타 MMP 억제제가 또한 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 기타 시그날 전달 억제제(예: EGFR(상피 성장 인자 수용체) 반응을 억제하는 제제(예: EGFR 항체, EGF 항체 및 EGFR 억제제인 분자)); VEGF(혈관 내피 성장 인자) 억제제; 및 erbB2 수용체 억제제(예: erbB2 수용체 억제제에 결합하는 유기 분자 또는 항체(예: HERCEPTIN(제조원: 캘리포니아, 사우쓰 샌프란시스코, 제네테크, 인크.)))와 함께 사용될 수 있다. EGFR 억제제는 예를 들어 WO 95/19970(1995. 7. 27. 발행), WO 98/14451(1998. 4. 9. 발행), WO 98/02434 (1998. 1. 22. 발행) 및 미국 특허 제5,747,498호 (1998. 5. 5. 등록)에 기술되어 있으며, 당해 성분들은 본원에 기술된 바와 같이 본 발명에 사용될 수 있다.
EGFR-억제제는 단일클론 항체 C225 및 항-EGFR 22Mab(제조원: 뉴욕주, 뉴욕시 소재, 임클론 시스템스, 인크.), 화합물 ZD-1839(아스트라제네카), BIBX-1381(베링거 인겔하임), MDX-447(제조원: 뉴욕 앤널달 소재, 메다렉스 인크.) 및 OLX-103(제조원: 뉴 저지, 화이트하우스 스테이션, 머크 앤드 코.) 및 EGF 푸젼 톡신(제조원: 매사추세츠, 홉킨톤 소재, 세라젠 인크.)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 및 기타 EGFR-억제제는 본 발명에서 사용될 수 있다. VEGF 억제제(예: SU-5416 및 SU-6668)(제조원: 캘리포니아, 사우쓰 샌프란시스코, 수젠 인크.)가 또한 본 발명의 화합물과 배합될 수 있다. VEGF 억제제는 예를 들어 WO 01/60814 A3 (2001. 8. 23. 발행), WO 99/24440 (1999. 5. 20. 발행), PCT 국제 출원 PCT/IB99/00797 (1999. 5. 3. 출원), WO 95/21613 (1995. 8. 17. 발행), WO 99/61422 (1999. 12. 2. 발행), 미국특허 제5,834,504호(1998. 11. 10. 등록), WO 01/60814, WO 98/50356 (1998. 11. 12. 발행), 미국 특허 등록 제5,883,113호 (1999. 3. 16. 등록), 미국 특허 등록 제5,886,020호(1999. 3. 23. 등록), 미국 특허 등록 제5,792,783호(1998. 8. 11. 등록), WO 99/10349 (1999. 3. 4. 발행), WO 97/32856 (1997. 9. 12. 발행), WO 97/22596 (1997. 6. 26. 발행), WO 98/54093 (1998. 12. 3. 발행), WO 98/02438 (1998. 1. 22. 발행), WO 99/16755 (1999. 4. 8. 발행), 및 WO 98/02437 (1998. 1. 22. 발행)에 기재된 것으로, 상기 모든 문헌은 참조에 의해 전체가 본원에 혼입된다. 본 발명에 유용한 몇몇의 구체적인 VEGF 억제제의 다른 예는 IM862 (제조원: 와싱턴 커크랜드 소재, 사이트랜 인크.); 항-VEGF 단일클론 항체(제조원: 제넨테크, 인크.); 및 앤지오자임, 리보자임으로부터의 합성 리보자임(콜로라도, 보울더 소재) 및 키론(캘리포니아, 에머리빌 소재)이다. 상기한 및 기타 VEGF 억제제가 본원에 기술된 바와 같이 본 발명에 사용될 수 있다. pErbB2 수용체 억제제(예: GW-282974, 글락소 웰컴 피엘씨) 및 단일클론 항체 AR-209(제조원: 아로넥스 파마슈티칼즈 인크., 텍사스 우드랜드 소재) 및 2B-1(키론)이 본 발명의 화합물과 추가 배합될 수 있으며, 예를 들어 WO 98/02434 (1998. 1. 22. 발행), WO 99/35146 (1999. 7. 15. 발행), WO 99/35132 (1999. 7. 15. 발행), WO 98/02437 (1998. 1. 22. 발행), WO 97/13760 (1997. 4. 17. 발행), WO 95/19970 (1995. 7. 27. 발행), 미국 특허 제5,587,458호 (1996. 12. 24. 등록) 및 미국 특허 제5,877,305호 (1999. 3. 2. 등록)에 기술된 것으로, 이들 문헌 모두는 참조에 의해 본원에 전체가 혼입된다. 본 발명에서 유용한 ErbB2 수용체 억제제는 미국 특허 제6,284,764호 (2001. 9. 4. 등록)에 또한 기술되어 있으며, 당해 문헌은 참조에 의해 이의 전체가 본원에 혼입된다. 전술한 PCT 출원, 미국 특허 및 미국 가출원에 기술된 ErbB2 수용체 억제제 화합물 및 성분 뿐만 아니라, ErbB2 수용체를 억제하는 다른 화합물 및 성분도 본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 암을 치료하는 데 유용한 기타 제제, 예를 들어 항종양 면역 반응을 개선시킬 수 있는 제제(예: CTLA4(시토톡식 림포사이트 안티젠 4) 항체 및 CTLA4를 차단할 수 있는 기타 제제) 및 항증식제(예: 기타 파네실 단백질 전이효소 억제제(예: 미국 특허 제6,258,824 B1의 '배경기술' 항목에서 인용된 참조 문헌에 기술된 파네실 단백질 전이효소 억제제))와 함께 사용될 수 있다.
상기 방법은 또한 방사선 요법과 병행하여 실시될 수 있으며, 여기서 방사선 요법과 병행되는 본 발명의 화합물의 양은 상기 질환을 치료하는 데 있어 유효한 양이다.
실시예 1
컴퓨터계에 기초한 모핵(Lead) 동정
템플릿(template)으로서 Pan-Janus 키나제 억제제와 복합된 JAK2 키나제의 결정형 구조에 기초하여 가상 스크리닝 계산(virtual screening calculations)을 실시하였다(PDB ID: 2B7A). 가상 라이브러리로부터의 화합물과 같은 ~200 인-하우스 및 ~230만의 집중된 및/또는 다양한 약물을 컴퓨터 스크리닝하여, Otava 케미컬 스(www.Otavachemicals.com)로부터 구입한 라이브러리 중 후보 화합물을 선택하였다. 3개의 화합물이 인-하우스로부터 낮은 마이크로몰 범위에서 활성인 것으로 밝혀졌으며(<42 nM 내지 1.25 μM), Otava 화합물 중 하나는 직접 JAK2 키나제 결합 검사에서 <10 μM 활성인 것으로 밝혀졌다. 특이적 JAK2 키나제 활성에 중요한 분자 부분의 동정에서 가장 활성인 화합물은 피리미딘-2,4-디아민 유도체에 속하는 것으로 밝혀졌다. 아래 표 1에 기술된 바와 같이, 위 스크리닝에서 선택된 화합물들은 결합 모드, QikProp(용해도, 투과성) Lipinski-유사 criteria 및 목적하는 파마코포어 그룹의 존재에 기초하여 걸러졌다.
Figure 112009057886861-PCT00019
Figure 112009057886861-PCT00020
Figure 112009057886861-PCT00021
실시예 2
피리미딘-2,4-디아민 유도체의 일반 합성
본 발명의 화합물은 화학 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 아래 일반 반응식 외, 통상적인 합성 공정을 이용하여 제조될 수 있다.
일반 반응식:
Figure 112009057886861-PCT00022
요약해서, 2,4-디클로로피리미딘(1)을 적합하게 치환된 아닐린(2)와 반응시켜 중간체(3)를 수득한다. 중간체(3)를 이후 추가로 적합하게 치환된 아민(4)와 반응시켜 화학식 I의 화합물을 수득한다. 또는, 중간체(3)를 적합하게 치환된 아민(5)과 추가 반응시켜 화학식 II의 화합물을 수득한다. 특정 언급이 없다면, 모든 용매 및 시약은 Aldrich 또는 VWR 케미칼스로부터 구입하며, 공급된 데로 사용되거나, 필요에 따라 표준 실험 방법(standard laboratory methods)에 의해 정제되어 사용될 수 있다.
실시예 3
피리미딘-2,4-디아민 유도체의 합성
A. 2-클로로-4-치환된 피리미딘(3)의 제조를 위한 일반 공정
Figure 112009057886861-PCT00023
30mL의 이소프로판올(IPA) 중 2,4-디클로로피리미딘(1)(10 mmol), 아닐린(2)(10 mmol) 및 디이소프로필에틸 아민(DIPEA)(1.5 mmol)을 함유하는 반응 혼합물을 밤새 환류시켰다. 용매를 제거하고 잔류물을 Combiflash Companion system(10 내지 70%의 헥산/EtOAc)을 사용하여 정제함으로써 목적하는 2-클로로-4-치환된 피리미딘(3)을 수득하였다.
2-클로로-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)피리미딘-4-아민 (7)
Figure 112009057886861-PCT00024
2-프로판올(20 mL) 중 2,4-디클로로피리미딘(1)(1 g, 6.71 mmol, Sigma-Aldrich), 3-클로로-4-플루오로아닐린(6)(0.977 g, 6.71 mmol, Sigma-Aldrich) 및 디이소프로필에틸아민(DIPEA) (3.47 g, 26.8 mmol)의 반응 혼합물을 18시간 동안 환류시켰다. 용매를 증발시키고, 70% 헥산 내지 순수한 디클로로메탄(DCM) 및 20% 에틸아세테이트(EtOAc) 용매 시스템(런 타임, 50분, 40g 정상 RediSep Flash colunm)을 사용한 Combiflash Companion으로 정제하여, 화합물(7)(0.8g)을 수득하였다(TLC, Rf=O.6 , EtOAc). 백색 고체, 수득율: 46.2%. 1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) 10.18(s, 1H), 8.20(d, J=6.2Hz, 1H), 7.90(m,1 H), 7.50(m, 1H), 7.43(t, J=8.9Hz, 1H), 6.74(d, J=5.8Hz, 1H). ESI/MS m/z 258.0 (100%), 259.9 (78%), 261.9 (18%).
5-(2-클로로피리미딘-4-일아미노)-2-플루오로벤조니트릴(9)
Figure 112009057886861-PCT00025
2-프로판올(50mL) 및 1mL의 DIPEA 중, 2,4-디클로로피리미딘(1)(1 g, 6.71 mmol), 5-아미노-2-플루오로벤조니트릴(8) (0.914 g, 6.71 mmol)의 반응 혼합물을 밤새 교반시켰다. 용매를 증발시키고, 조 물질을 Combiflash(12g, DCM to 10% MeOH/DCM)로 정제하여 318mg의 화합물(9) (TLC, Rf=O.1, 6%MeOH/DCM)를 수득하였다. 백색 고체, 수득률: 19%. 1H NMR (400MHz, CD3OD) 8.15(m, 2H), 7.89(m, 1H), 7.35(t, J=9.23Hz, 1H), 6.70(d, J=5.6Hz, 1H). ESI/MS m/z 248.9 (100%), 250.9 (33%).
2-(3-아미노페닐)아세토니트릴 (11 )
Figure 112009057886861-PCT00026
3-니트로페닐 아세토니트릴(10)을 농축된 HCl(15ml) 및 에탄올(15ml)의 혼합물에 용해시켰다. 에탄올(25ml) 중 SnCl2 이수화물의 용액을 빙냉하에 서서히 점적하고 혼합물을 5시간 동안 실온에서 교반하였다. TLC(EtOAc/헥산 1:1) Rf=O.1은 80% 완성도를 나타내었다. 용매를 증발시킨 후, 잔류물을 NaOH로 pH 9로 처리하였다. EtOAc로의 추출 및 combiflash(12g, 헥산/EtOAc 10% 내지 50%, 70 분)로 노란색 오일의 1.182g의 화합물(11)을 수득하였다. 1H-NMR(400Mhz, CDCl3) 7.12(t, J=7.5Hz, 1H), 6.65(m, 3H), 3.72(br-s, 1H), 3.64(s, 2H).
2-(3-(2-클로로피리미딘-4-일아미노)페닐)아세토니트릴 (12)
Figure 112009057886861-PCT00027
2-프로판올(40mL) 및 15mmol의 트리에틸아민(TEA) 중, 2,4-디클로로피리미딘(1)(1.127 g, 7.57 mmol) 및 2-(3-아미노페닐아세토니트릴)(11)(1g, 7.57 mmol)의 반응 혼합물을 2일 동안 환류시켰다. 용매를 증발시키고, combiflash(12g, 2회, CHCl3)로 정제하여 연녹색 결정의 932mg의 화합물(12)을 수득하였다. 수득률: 50%. 1H-NMR (400MHz, CDCl3) 8.16(d, J=6.15Hz, 1H), 7.41(m, 1H), 7.33(m, 2H), 7.18(d, J=7.5Hz, 1H), 6.96(br-s, 1H), 6.58(d, J=5.8Hz, 1H), 3.77(s, 2H).
B. 2,4-이치환된 피리미딘(I)을 제조하기 위한 일반 공정
Figure 112009057886861-PCT00028
7mL 이소프로판올 중, 2-클로로-4-치환된 피리미딘(3)(0.25 mmol), 아민(4) 또는 아민(5)(Apollo Scientific and Bionet Building Blocks, 영국) (0.25 mmol) 및 TFA (0.5 mmol)를 함유하는 반응 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 NaOH(0.6 mmol)를 첨가하였다. 용매를 제거하고 잔류물을 combiflash(4g, DCM to 20% MeOH/DCM)로 정제하여 아래 기재된 바와 같은 화학식 I 또는 II의 화합물을 수득하였다.
N4-(3-클로로페닐)-N2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)피리미딘-2,4-디아민 (화합물 1-1)
Figure 112009057886861-PCT00029
2-프로판올(10 mL) 중 2-클로로-N-(3-클로로페닐)피리미딘-4-아민 (13) (100 mg, 0.417 mmol)의 용액에 4-(트리플루오로메틸)아닐린(14)(67.1 mg, 0.417 mmol)을 첨가하고, 촉매 트리플루오로아세트산을 첨가한 후, 밤새 환류 온도에서 교반하였다. 용매를 증발시키고, DCM 및 5% MeOH 용매 시스템(유속 18ml/분, 런 타임 50분, 4g 정상 RediSep 플래쉬 컬럼)을 사용한 combiflash companion으로 정제하여 화합물 1-1을 수득하였다. (TLC, Rf=0.4, 10% MeOH/DCM). 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) 8.08(d, J=6.15Hz, 1H), 7.8(s, 2H), 3.39(m, 1H), 7.82(d, J=8.2Hz, 2H), 7.66(d, J=8.2Hz, 2H), 7.46(d, J=6.84Hz, 1H), 7.36(t, J=8.2Hz, 1H), 7.15(d, J=8.18Hz, 1H), 6.42(d, J=6.15Hz, 1H) ESI/MS m/z 365.0 (M+H)+.
N4-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N2-(4-플루오로페닐)피리미딘-2,4-디아민 (화합물 1-2)
Figure 112009057886861-PCT00030
2-프로판올(10 ml) 중 2-클로로-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)피리미딘-4-아민(7)(60 mg, 0.232 mmol)의 용액에 4-플루오로아닐린(15) (25.8 mg, 0.232 mmol)을 첨가하고, 촉매 트리플루오로아세트산을 첨가하고, 밤새 환류 온도에서 교반하였다. 반응 혼합물에 트리에틸아민을 첨가한 후 1시간 동안 교반하고, TLC로 반응 종결을 확인하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 헥산 70% 및 DCM 용매 시스템(유속 18ml/분, 런 타임 50분, 4g 정상 RediSep 플래쉬 컬럼)을 사용한 combiflash companion으로 정제하여 화합물 1-2를 수득하였다. (TLC, Rf=0.35, 5% MeOH/DCM). 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) 8.01 (m, 2H), 7.64(m, 2H), 3.39(m, 2H), 7.49(m, 1H), 7.35(t, J=8.23Hz, 1H), 7.11 (m, 2H), 6.22(m, 1H), ESI/MS m/z 333.0 (M+H)+.
N4-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N2-(4-모폴리노페닐)피리미딘-2,4-디아민 (화합물 1-3)
Figure 112009057886861-PCT00031
2-프로판올(10mL) 중 2-클로로-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)피리미딘-4-아민 (7) (60 mg, 0.232 mmol)의 용액에 4-모폴리노아닐린(16) (41.4 mg, 0.232 mmol)을 첨가하고, 촉매 트리플루오로아세트산을 첨가한 후, 밤새 환류 온도에서 교반하였다. 조 잔류물을 DCM 용매 시스템에서 10% MeOH을 사용한 combiflash companion(유속 26ml/분, 런 타임 40분, 4g 정상 RediSep 플래쉬 컬럼)으로 정제하여 화합물 1-3을 수득하였다. (TLC, Rf=0.45, 10% MeOH/DCM) HPLC=94%. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) 8.03(m, 1H), 7.90(m, 1H), 3.39(m, 2H), 7.31 (d, J=8.54Hz, 2H), 6.98(d, J=8.55Hz, 2H), 6.33(d, J=6.83Hz, 1H), 3.74(m, 4H), 3.10(s, 4H) ESI/MS m/z 400.1 (M+H)+.
N4-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민 (화합물 1-4)
Figure 112009057886861-PCT00032
2-클로로-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)피리미딘-4-아민(7) (100 mg, 0.387 mmol), 4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐린(17) (74.1 mg, 0.387 mmol, 제조원: Apollo Scientific, 영국), DIPEA (2ml, 11.48 mmol), 및 1-부탄올 중 디메틸아미노피리딘(DMAP)를 밤새 환류시켰다. TLC(6% MeOH/DCM)로 반응 종결을 확인하였다. 농축 및 CombiFlash 정제(4g, DCM to 100% EtOAc)로 7 mg의 화합물 1-4를 수득하였다. 당해 화합물은 포스포몰리브딕산 염색 하에 자주색이었다. 수득률: 48%. 1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) 9.45(s, 1H), 8.98(s, 1H), 8.08(m, 1H), 7.98(d, J=4.5Hz, 1H), 7.45(m, 3H), 7.30(t, J=9.2Hz, 1H), 6.86(d, J=8.9Hz, 2H), 6.10(d, J=5.8Hz, 1H), 3.04(m, 4H), 2.43 (m, 4H), 2.20 (s, 3H). ESI/MS m/z 413.3 (100%), 415.2 (33%).
N4-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N2-(4-메톡시-3-(3-(4-메틸피페라진-1-일)프로폭시)페닐)피리미딘-2,4-디아민 (화합물 1-5)
Figure 112009057886861-PCT00033
디메틸포름아미드(DMF) (20 mL) 중 2-메톡시-5-니트로페놀(18) (2 g, 11.82 mmol), 3-클로로프로필 브로마이드(2.234 g, 23.65 mmol)의 혼합물에 K2CO3 (3.27 g)을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 3시간 동안 80℃로 가열하였다. TLC(EtOAc)로 반응 종결을 확인하였다. 반응 혼합물을 이후 물(100 mL) 및 에틸아세테이트 (150 mL) 사이에 분배시켰다. 유기 층을 포화된 NaHCO3 및 물로 세척하고 이후 MgSO4로 건조시키고, 여과하였다. 용액을 농축하여 연노란색 고체(3.9g)의 화합물(19)을 수득하였다. 화합물(19)(1.5 g, 6.11 mmol)에 20mL의 1,4-디옥산 중 N-메틸피페라진 및 요오드화나트륨(1.373 g, 9.16 mmol)을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 30시간 동안 100℃로 가열하였다. 오랜지색 혼합물을 농축시켜 1,4-디옥산을 제거하고 이후 50mL의 에틸아세테이트로 희석시켰다. 0.5시간 동안 교반한 후, 여과하여 염을 제거하였다. 유기 층을 NaOH 용액(20mL) 및 물(3 x 20 mL)로 세척하였다. MgSO4로 건조하고 농축하여 오랜지색 오일 1.00g의 화합물(20)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 7.90(dd, J1=2.3Hz, J2=8.9Hz, 1H), 7.75(d, J=2.3Hz, 1H), 6.88(d, J=8.8Hz, 1H), 4.14(m, 2H), 3.94(s, 3H), 2.58(m, 10H), 2.43(br-s, 3H), 2.03(m, 2H).
화합물 (20)을 5시간 동안 Parr 쉐이커에서 이소프로판올 중 10% Pd/Cd의 존재하에 수소화시켰다. TLC(15% MeOH/DCM)로 반응 종결을 확인하였다. 셀라이트를 통해 여과하고 농축하여 갈색 오일의 화합물(21)(1 g)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 6.68(d, J=8.2Hz, 1H), 6.30(d, J=2.4Hz, 1H), 6.20(dd, J1=2.4Hz, J2=8.2Hz, 1H), 3.99(t, J=6.5Hz, 2H), 3.75(s, 3H), 3.46(s, 3H), 2.55(br-m, 10H), 2.32(s, 3H), 2.01 (m, 2H).
TFA ( 1 mL) 및 2-프로판올 (10 mL) 중 화합물(21)(100 mg, 0.387 mmol) 및 화합물(7)(108 mg, 0.387 mmol)을 함유하는 반응 혼합물을 밤새 환류시켰다. TLC (6% DCM/MeOH)로 화합물(7)의 완전한 소모를 확인하였다. 반응 혼합물을 농축하고 MeOH 중에 재용해시켰다. TFA를 NaOH 첨가로 퀀칭(quench)시켰다. 농축 및 CombiFlash 정제(4g, DCM to 15% MeOH/DCM)로 갈색 포움 형태의 화합물 1-5, 219 mg을 수득하였다. 1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) 9.49 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.04 (m, 1H), 8.00 (d, J=5.8Hz, 1H), 7.4(br-s, 1H), 7.29(t, J=9.3Hz, 1H), 7.20(m, 2H), 6.85(d, J=8.8Hz, 1H), 6.13(d, J=5.8Hz, 1H), 3.86 (t, J=6.15Hz, 2H), 3.88(s, 3H), 2.48(s, 8H), 2.35(s, 3H), 1.83(m, 2H). ESI/MS m/z, 501.2 (100%), 503.3 (33%).
N4-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N2-(6-(트리플루오로메틸)피리딘-3-일)피리미딘-2,4-디아민 (화합물 1-6)
Figure 112009057886861-PCT00034
2-프로판올 (10 mL) 중, 화합물(7) (100 mg, 0.387 mmol) 및 5-아미노-2-(트리플루오로메틸)피리딘(22) (62.8 mg, 0.387 mmol)의 혼합물에 TEA를 첨가하고, 반응 혼합물을 24시간 동안 환류시켰다. TLC (EtOAc, Rf=O.3)로 반응 종결을 확인하였다. 혼합물을 농축시켜 이소프로판올을 제거하고 메탄올에 재용해시켰다. NaOH를 첨가하여 TFA를 중화시켰다. 농축 및 CombiFlash 정제(4g, 헥산/EtOAc 15% to 90%, 50 분)로, 106 mg의 화합물 1-6를 고체로서 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 8.69(s, 1H), 8.42(d, J=8.5Hz, 1H), 8.11 (d, J=5.4Hz, 1H), 7.59(m, 1H), 7.53(m, 1H), 7.15(m, 3H), 6.49(s, 1H), 6.19(d, J=5.5Hz, 1H). ESI/MS m/z, 384.0(100%), 386.0(33%)
2-(3-(2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐)아세토니트릴 (화합물 1-7)
Figure 112009057886861-PCT00035
화합물 (12) (100 mg, 0.409 mmol) 및 화합물 (17) (78 mg, 0.409 mmol, Apollo Scientific, 영국)을 10 mL의 2-프로판올에 용해시키고 TEA (1mL)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 밤새 환류시켰다. TLC(20% MeOH/DCM, Rf=0.2)로 반응 종결을 확인하였다. NaOH를 첨가하고 약간의 백색 침전물이 생성되었다. 농축 및 CombiFlash 정제(0-25% MeOH/DCM)로, 백색 고체인 화합물 1-7 (186 mg)이 수득되었다. 1H NMR은 약간의 아닐린이 내부에 있을 수 있음을 보여주었다. 수득률: 114%. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 7.88(d, J=6.1 Hz, 1H), 7.79(s, 1H), 7.44(m, 3H), 7.27(t, J=7.86Hz, 1H), 7.00(m, 3H), 6.15(d, J=6.1 Hz, 1H), 3.75(s, 2H), 3.27(m, 4H), 2.96(m, 4H), 2.59 (s, 3H). ESI/MS m/z, 400.1(100%).
2-(3-(2-(4-메톡시-3-(3-(4-메틸피페라진-1-일)프로폭시)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐)아세토니트릴 (화합물 1-8)
Figure 112009057886861-PCT00036
2-프로판올 (10 mL) 중, 화합물 (12) (100 mg, 0.409 mmol) 및 화합물 (21) (114 mg, 0.409 mmol)의 혼합물에 TFA를 첨가하고, 이를 밤새 환류시켰다. TLC (20% MeOH/DCM, Rf=O.1)로 반응 종결을 확인하였다. NaOH를 첨가하여 백색 침전물이 생성되었다. 농축 및 Combiflash 정제(0 내지 25% MeOH : DCM)로, 고체 포움 형태의 화합물 1-8 (236 mg)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.90(d, J=5.8Hz, 1H), 7.78(s, 1H), 7.45(d, J=8.2Hz, 1H), 7.26(m, 2H), 6.98(m, 3H), 6.16(d, J=6.2Hz, 1H), 3.91(t, J=5.8Hz, 2H), 3.84(s, 3H), 3.74(s, 2H), 3.34(s, 2H), 2.71 (br-m, 2H), 2.56(s, 3H), 1.96(m, 2H). ESI/MS m/z, 488.2(100%).
N4-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)피리미딘- 2,4-디아민 (화합물 1-9)
Figure 112009057886861-PCT00037
2-프로판올 (7 mL) 중 화합물 (7) (60 mg, 0.232 mmol) 및 화합물 (14) (37.5 mg, 0.232 mmol)의 혼합물에 TFA를 첨가하고 이를 밤새 환류시켰다. TLC (6% MeOH/DCM, Rf=O.15)로 반응 종결을 확인하였다. NaOH을 첨가하여 TFA를 중화시켰다. 조 생성물을 농축 및 CombiFlash 정제(4g, 0 내지 10% MeOH/DCM, 50 분)하여 백색 고체인 화합물 1-9 (70 mg)를 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 7.99(d, J=5.8Hz, 1H), 7.95(dd, J1=2.7Hz, J2=6.8Hz, 1H), 7.79(d, J=8.5Hz, 2H), 7.53(d, J=8.5Hz, 2H), 7.44(m, 1H), 7.17(t, J=8.9Hz, 1H), 6.23(d, J=5.8Hz, 1H). ESI/MS m/z , 383.1 (100%), 385.1(33%).
2-플루오로-5-(2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노) 벤조니트릴 (화합물 1-10)
Figure 112009057886861-PCT00038
화합물 (9) (60mg, 0.241 mmol) 및 화합물 (17) (46.2 mg, 0.241 mmol, Apollo Scientific, 영국)의 혼합물을 10mL의 2-프로판올에 용해시키고, 촉매로서 TFA를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 밤새 환류시켰다. TLC (20% MeOH/DCM, Rf=O.1)로 반응 종결을 확인하였다. NaOH를 첨가하여 TFA를 중화시켰다. 농축 및 CombiFlash 정제(유속 26 mL/분, 0-20% MeOH/DCM, 런 타임 40분, 4 g 정상 RediSep 플래쉬 컬럼)하여 백색 고체인 화합물 1-10 (82 mg, 84%)를 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 8.35(m, 1H), 7.92(d, J=5.8Hz, 1H), 7.70(m, 1H), 7.40(d, J=8.9Hz, 2H), 7.23(t, J=9.8Hz, 1H), 7.01(d, J=9.2Hz, 2H), 6.12(d, J=5.8Hz, 1H), 3.23(m, 4H), 2.70(br-s, 4H), 2.40(s, 3H). ESI/MS m/z 404.1 (M+H)
2-(3-(2-(3-플루오로-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐)아세토니트릴 (화합물 1-11)
Figure 112009057886861-PCT00039
2-프로판올 (7 mL) 및 촉매적 TFA 중, 화합물 (12) (60 mg, 0.245 mmol) 및 3-플루오로-4-(4-메틸피페라진-1-일)아닐린 (23) (51.3 mg, 0.245 mmol, 제조원: Apollo Scientific, 영국)의 혼합물을 밤새 환류시켰다. TLC(20% MeOH/DCM, Rf=0.2)로 반응 종결을 확인하였다. NaOH을 첨가하여 백색 침전물을 수득하였다. 농축 및 CombiFlash 정제(4g, 0-20% MeOH/DCM)하여 백색 고체인 화합물 1-11 (115 mg)을 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 7.93(d, J=6.1 Hz, 1H), 7.73(s, 1H), 7.61 (dd, J1=2.4Hz, J2=4.7Hz, 1H), 7.53(d, J=7.8Hz, 1H), 7.32(t, J=8.2Hz, 1H), 7.20(d, J=8.9Hz, 1H), 7.00(m, 2H), 6.20(d, J=5.8Hz, 1H), 3.84(s, 2H), 3.16(br-s, 4H), 2.92(br-s, 4H), 2.56(s, 3H). ESI/MS m/z 418.1 (M+H).
2-(3-(2-(6-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-3-일아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐)아세토니트릴 (화합물 1-12)
Figure 112009057886861-PCT00040
2-프로판올 (7 mL) 및 촉매적 TFA 중, 화합물 (12) (60 mg, 0.245 mmol) 및 6-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-3-아민 (24) (47.1 mg, 0.245 mmol, 제조원: Bionet Building blocks, 영국)의 혼합물을 24시간 동안 환류시켰다. TLC (20% MeOH/DCM, Rf=O.1)로 반응 종결을 확인하였다. NaOH를 첨가하여 TFA를 중화시켰다. 농축 및 CombiFlash 정제(4g, 0-20% MeOH/DCM)하여, 고체인 화합물 1-12 (97 mg)을 수득하였다. 수득률: 99%. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 8.35 (d, J=2.7Hz, 1H), 7.88(d, J=6.2Hz, 1H), 7.83(s, 1H), 7.76(dd, J1=2.7Hz, J2=9.2Hz, 1H), 7.37(d, J=8.5Hz, 1H), 7.27(t, J=7.9Hz, 1H), 7.01 (d, J=7.5HZ, 1H), 6.88(d, J=9.2Hz, 1H), 6.16(d, J=5.8Hz, 1H), 3.81 (s, 2H), 3.61 (br-s, 4H), 2.87(br-s, 4H), 2.56(s, 3H)
N4-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N2-(6-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-3-일)피리미딘-2,4-디아민 (화합물1-13)
Figure 112009057886861-PCT00041
2-프로판올 (7 mL) 및 촉매적 TFA 중, 화합물 (7) (60 mg, 0.232 mmol) 및 화합물 (24) (44.7 mg, 0.232 mmol)의 혼합물을 24시간 동안 환류시켰다. TLC (20% MeOH/DCM)로 반응 종결을 확인하였다. NaOH을 첨가하고 혼합물을 농축시키고, CombiFlash 정제(4g, 100% DCM 내지 25% MeOH/DCM)를 실시하여 백색 고체인 화합물 1-13 (86.7 mg)을 수득하였다. 수득률: 90%. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 8.23(d, J=2.4Hz, 1H), 7.92(m, 1H), 7.90(d, J=5.8Hz, 1H), 7.82(dd, J1=9.2Hz, J2=2.7Hz, 1H), 7.35(m, 1H), 7.12(t, J=8.9Hz, 1H), 6.88(d, J=9.2Hz, 1H), 3.61 (br-s, 4H), 2.90(m, 4H), 2.59(s, 3H) ESI/MS m/z 414.1 (M+H).
N4-(3-클로로-4-플루오로페닐)-N2-(3-플루오로-4-(4-메틸피페라진-일)페닐) 피리미딘-2,4-디아민 (화합물 1-14)
Figure 112009057886861-PCT00042
2-프로판올 (7 mL) 및 촉매적 TFA 중, 화합물 (7) (60 mg, 0.232 mmol) 및 화합물 (23) (48.7 mg, 0.232 mmol)의 혼합물을 24시간 동안 환류시켰다. TLC (20% MeOH/DCM, Rf = 0.1)로 반응 종결을 확인하였다. 실온에서 3일 후, 약간의 백색 고체가 형성되었다(103 mg). 여과 및 1H NMR은 생성물이 TFA 염임을 보여주었다. NaOH를 첨가하고 혼합물을 농축시키고 CombiFlash companion(4g, DCM to 25% MeOH)으로 정제하여 백색 고체인 화합물 1-14 (88.8 mg)를 수득하였다. 수득률은 89%이었다. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 7.90(m, 2H), 7.47(m, 2H), 7,27(dd, J1=9.6Hz, J2=2.4Hz, 1H), 7.14(t, J=6.4Hz, 1H), 6.99(t, J=9.6Hz, 1H), 6.15(d, J=5.8Hz, 1H), 3.10(br-s, 4H), 2.75(br-s, 4H), 2.43(s, 3H). ESI/MS m/z 431.0 (M+H).
(4-(4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)피리미딘-2-일아미노)페닐)(4-메틸피페라진-1-일)메탄온 (화합물 1-15).
Figure 112009057886861-PCT00043
CH3CN 중 4-니트로벤조일 클로라이드(25) (1g, 5.39 mol)의 용액을 10분 동안 10℃에서 1-메틸피페라진(26)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 추가 1시간 동안 교반하고 TEA (1.49 mL, 2eq)을 첨가한 후, 추가 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수(150 mL)로 희석시키고 EtOAc(4x 150 mL)로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조하고 농축시켜, 노란색 고체인 1.1g(수득률: 82%)의 (4-메틸피페라진-1-일)(4-니트로페닐)메탄온 (27)을 수득하였다. TLC: 10% MeOH/DCM, Rf=0.6. 1NMR (400 MHz, CDCl3) 8.28(d, J=8.5Hz, 2H), 7.56(d, J=8.5Hz, 2H), 3.88(br-s, 4H), 3.46(br-s, 4H), 2.40(s, 3H) ESI/MS m/z 250.0 (M+H)
20 mL의 에탄올 중, (4-메틸피페라진-1-일)(4-니트로페닐)메탄온 (27) (200 mg, 0.802 mmol) 및 10% Pd/C (60 mg) 함유 혼합물을 4시간 동안 H2 (60 psi) 하에서 진탕시켰다. 반응 종결 및 여과 후, 농축하여 화합물 (28)(83.8 mg, 수득률: 48%)을 연노란색 오일로 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 7.19 (dd, J1=2.0Hz, J2=6.5Hz, 2H), 6.68(dd, J1=2.7Hz, J2=6.5Hz, 2H), 3.64(br-s, 4H), 2.44(br-s, 4H), 2.31 (s, 3H) ESI/MS m/z 220.0 (M+H).
2-프로판올 (5 mL) 및 촉매 TFA 중, 화합물 (7) (50 mg, 0.194 mmol) 및 화합물 (28) (33 mg, 0.150 mmol)의 혼합물을 150℃에서 1시간 동안 마이크로웨이브(microwave)시켰다. TLC로 반응 종결을 확인하였다. HPLC로 가능한 주요 새로운 스폿(spot)을 나타내었다. CombiFlash 정제(4g, DCM to 15% MeOH/DCM)로 반고체인 32 mg의 화합물 1-15를 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 7.98(d, J=6.15Hz, 1H), 7.94(m, 1H), 7.72(d, J=8.54, 2H), 7.36(dd, J1=2.0Hz, J2=6.8Hz, 2H), 7.19(dd, J1=2.0Hz, J2=8.8Hz, 2H), 6.21 (d, J=6.1 Hz, 1H), 3.65(br-s, 4H), 2.48(br-s, 4H), 2.34(s, 3H) ESI/MS m/z 441.2 (M+H).
2-(3-(2-(4-(4-시클로헥실피페라진-1-카보닐)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노) 페닐)아세토니트릴 (화합물 1-16)
Figure 112009057886861-PCT00044
2-프로판올 (5 mL) 및 촉매 TFA 중, 화합물 (12) (50 mg, 0.204 mmol), (4-아미노페닐)(4-시클로헥실)피페라지노메탄온 (29) (58.7 mg, 0.204 mmol)의 혼합물을 24시간 동안 환류시켰다. NaOH를 첨가하고, TLC (10% MeOH/DCM)로 약간의 출발 물질 및 추가적 새로운 스폿을 확인하였다. 농축 및 CombiFlash 정제(4g, DCM to 15% MeOH/DCM)로 갈색 고체인 화합물 1-16 (95 mg)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) 7.99(d, J=5.8Hz, 1H), 7.73(m, 3H), 7.55(d, J=8.2Hz, 1H), 7.35(m, 3H), 7.05(d, J=7.9Hz, 1H), 6.24(d, J=6.2Hz, 1H), 3.80(s, 2H), 3.699br-s, 4H), 2.75(br-s, 4H), 2.48(br-s, 1H), 1.95(br-s, 2H), 1.83(br-s, 2H), 1.65(d, J=13.0Hz, 1H), 1.29(br-s, 4H) ESI/MS m/z 496.1 (M+H).
2-(3-(2-(4-(4-메틸피페라진-1-카보닐)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐)아세토니트릴 (화합물 1-17)
Figure 112009057886861-PCT00045
2-프로판올 (5 mL) 및 촉매 TFA 중, 화합물 (12) (50 mg, 0.204 mmol) 및 화합물 (28) (44.8 mg, 0.204 mmol)의 혼합물을 24시간 동안 환류시켰다. NaOH를 첨가하고, TLC (10% MeOH/DCM)로 약간의 출발 물질 및 새로운 화합물 스폿을 확인하였다. 농축 및 CombiFlash 정제 (4g, DCM to 15% MeOH/DCM)로 노란색 고체인 화합물 1-17 (52 mg)을 수득하였다. 1NMR (400MHz, DMSO-d6) 9.53(s, 1H), 9.40(s, 1H), 8.06(d, J=5.8Hz, 1H), 7.78(m, 3H), 7.58(s, 1H), 7.31 (m, 3H), 6.98(d, J=7.1 Hz, 1H), 6.27(d, J=5.5Hz, 1H), 4.02(s, 2H), 3.48(br-m, 4H), 2.42(br-m, 4H), 2.28(br-s, 3H) ESI/MS m/z 428.2 (M+H).
2-(3-(2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐)아세토니트릴 (화합물 1-18)
Figure 112009057886861-PCT00046
2-프로판올 (5 mL) 및 촉매 TFA 중, 화합물 (12) (50 mg, 0.204 mmol) 및 4-(4-메틸피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)아닐린 (29) (46.6 mg, 0.409 mmol)의 혼합물을 2.5시간 동안 130℃에서 마이크로웨이브 조건에 위치시켰다. TLC로 새로운 스폿의 존재를 확인하였다. 반응 혼합물을 NaOH를 첨가함으로써 퀀칭시키고, 농축하고, CombiFlash로 정제(4g C-18, 5% 내지 100% 물/CH3CN)하고, 분획물을 HPLC로 확인하였다. 순수한 분획물을 통합하고, 농축시켜 연백색 고체인 4.5 mg의 화합물 1-18을 수득하였다. 1H-NMR-(300MHz, CDCl3-CD3OD) 7.62(d, J=6.0Hz, 1H), 7.50(s, 1H), 7.46(d, J=9Hz, 1H), 7.24(s, 2H), 7.02(m, 2H), 6.70(d, J=7.2Hz, 1H), 5.89(d, J=5.8Hz, 1H), 3.45(s, 1H), 3.35(s, 1H), 3.03(s, 2H), 2.61 (s, 4H), 2.29(s, 4H), 2.05(s, 3H). ESI/MS m/z 468.36 (M+H).
실시예 4
대표적 화합물의 염 형성
화합물 1-11 및 1-18의 대표적 염 형성(즉, HCl, 황산염, 메실레이트 및 베실레이트 형태)을 아래 과정에 따라 제조하고 아래 표 2에 나타내었다.
2-(3-(2-(3-플루오로-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐) 아세토니트릴 디하이드로클로라이드 (화합물 1-11 2HCl)
화합물 1-11 (2.06g)을 125 mL의 2-프로판올에 현탁시켰다. 농축된 HCl (2.47mL, 6 eq)을 첨가하였다. 혼합물을 맑은 용액이 수득될 때까지 가열하였다. 용액을 실온에서 냉각시키고 -20℃ 냉동고로 이동시켰다. 3일 후, 아르곤 하 여과 및 에테르로 세척하여 노란색 분말의 화합물 1-11의 비스-HCl 염(1.823g)을 수득하였다. 수득률: 70%.
2-(3-(2-(3-플루오로-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐) 아세토니트릴 설페이트 (화합물 1-11 설페이트)
350 mg의 화합물 1-11을 35 mL의 아세톤에 용해시키고, 0.122 mL (2.5 eq)의 H2SO4를 첨가하였다. 침전물이 빠르게 형성되었다. 혼합물을 실온에서 밤새 저장하였다. 여과로 노란색의 검습성(hygroscopic) 분말 394mg을 수득하였다. 고체를 1시간 동안 에탄올에 현탁시키고 여과하여 350mg의 백색 분말을 수득하였다. 수득률: 68% (비-검습성). 1H NMR (300 MHz, CD3OD) 7.94 (d, J=7.33Hz, 1H), 7.76 (s, 1H)1 7.65 (d, J=8.3Hz, 1H), 7.49 (m, 2H), 7.29 (m, 3H), 6.57 (d, J=7.33Hz, 1H), 3.96 (s, 2H), 3.74(t, J=12.45Hz, 4H), 3.42(m, 4H), 3.12(s, 3H), 19F-NMR (300Mhz, CD3OD)-186.99Hz. 원소 분석, CaI: C, 45.02; H, 4.60; N, 15.98; S, 10.45, Found: C, 45.68; H, 4.30; N, 15.96; S, 9.39.
2-(3-(2-(3-플루오로-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐) 아세토니트릴 메탄설포네이트 (화합물 1-11 메실레이트)
40 mL의 IPA 중, 가온된 화합물 1-11 (400 mg) 용액에 메탄설폰산(0.186 mL, 3 eq)을 첨가하였다. 맑은 용액이 점차 흐리게 변하였고, 혼합물을 밤새 -20℃에서 저장하였다. 잔류물을 N2 하에서 여과하고, 진공 하 건조시켜 400mg의 백색 분말을 수득하였다. 수득률: 68%. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) 7.83(d, J=7.08Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.55 (d, J=8.55Hz, 1H), 7.42 (m, 2H), 7.19 (m, 3H), 6.43 (d, J =7.33Hz, 1H), 3.85 (s, 2H), 3.62 (d, J =11.23Hz, 4H), 3.37 (m, 4H), 3.18 (d, J =11.OHz, 2H), 3.04 (s, 3H), 2.71 (s, 6H). 원소 분석. CaI: C 49.25, H 5.29, N 16.08, S 10.52, Found: C 48.75, H 5.50, N 15.13, S 10.51.
2-(3-(2-(3-플루오로-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐) 아세토니트릴 벤젠설포네이트 (화합물 1-11 베실레이트)
30 mL의 에탄올 중 화합물 1-11 (400 mg)의 용액에 벤젠설폰산(455 mg, 3eq)을 첨가하였다. 맑은 용액이 형성된 후 백색 침전물이 빠르게 생겼다. 잔류물을 밤새 N2 하에서 여과하고, 진공 건조시켜 520mg의 백색 고체를 수득하였다. 수득률: 74%. 1H-NMR-(300MHz, CD3OD-CDCl3) 7.93 (m, 3H), 7.82 (d, J=7.08Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.49M, 5H), 7.27 (d, J=7.33Hz, 1H), 7.21 (d, J=9.04Hz, 1H), 7.04 (t, J=7.3Hz, 1H), 6.49 (d, J=7.32Hz, 1H), 3.85 (s, 2H), 3.67 (d, J=10.2Hz, 2H), 3.63 (d, J=11.7Hz, 2H), 3.39 (s, 4H), 3.03(s, 3H). 원소 분석, CaI: C 57.28, H 4.94, N 13.36, S 8.74, Found: C 57.06, H 4.86, N 13.20, S 8.66.
2-(3-(2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐)아세토니트릴 하이드로클로라이드 (화합물 1-18 HCl)
화합물 1-18 (500 mg)을 40 mL의 IPA에 완전히 용해시키는 것은 어려웠다. 그러나, HCl (0.446 mL, 5 eq)을 첨가하고 가열한 후, 맑은 노란색 용액이 수득되었다. 용액을 실온으로 냉각시키고 2일 동안 -20℃ 냉동고로 이동시켰다. 여과 및 진공 건조하여 570mg의 분말을 수득하였다. 수득률: 84%. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) 7.87 (d, J=7.32Hz, 1H), 7.81 (s, 2H), 7.60 (m, 3H), 7.36 (m, 1H), 7.22 (d, J=7.82Hz, 1H), 6.48 (d, J=7.33Hz, 1H), 3.89 (m, 3H), 3.60 (d, J=7.57Hz, 2H), 3.25 (m, 4H), 2.99 (s, 3H),1.14 (d, J=6.35Hz, 6H, IPA). 원소 분석, CaI: C, 53.17; H, 6.06; N, 15.50; Cl, 11.21 , Found: C, 53.27; H, 6.37; N, 14.84; Cl, 10.81.
2-(3-(2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐)아세토니트릴 설페이트 (화합물 1-18 설페이트)
50 mL의 IPA 중 화합물 1-18 (400 mL)의 용액에 H2SO4 (0.137 mL, 3 eq)를 첨가하였다. 침전물이 빠르게 형성되었다. 주말 동안 N2 하에서 여과하여 407mg의 노란색 분말을 수득하였다. 수득률: 68%. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) 7.89 (d, J=7.32Hz, 1H), 7.78 (m, 2H), 7.60 (m, 3H), 7.36 (t, J=7.32Hz, 1H), 7.22 (d, J=7.08Hz, 1H), 6.48 (d, J=7.33Hz, 1H), 3.87 (s, 2H), 3.60 (d, J=7.1 Hz, 2H), 3.27 (m, 4H), 3,21 (s, 3H). 원소 분석, CaI: C, 44.15; H, 4.65; N, 14.13; S, 9.24, Found: C, 44.20; H, 4.65; N, 13.98; S, 9.16.
2-(3-(2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐)아세토니트릴 메탄설포네이트 (화합물 1-18 메실레이트)
20 mL의 아세톤 중 화합물 1-18 (400mg)의 용액(거의 맑은)에 메틸설폰산(0.139 mL, 2.5eq)을 첨가하였다. 용액이 흐려졌다. 혼합물을 주말 동안 -20℃에서 저장하였다. 아세톤을 따라 내었다. 고체를 세척하고 진공 건조하여 429mg의 노란색 고체를 수득하였다. 수득률: 74%. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) 7.88 (d, J=7.33Hz, 1H), 7.78 (m, 2H), 7.59 (m, 3H), 7.35 (t, J=7.32Hz, 1H), 7.22(d, J=7.08Hz, 1H), 6.48 (d, J=7.33Hz, 1H), 3.86 (s, 2H), 3.60 (d, J=7.57Hz, 2H), 3.27 (m, 4H), 2.99 (s, 3H), 2.72 (s, 6H). 원소 분석 CaI: C, 46.08; H, 5.06; N, 14.47; S, 9.46, Found: C, 46.08; H, 4.93; N, 14.16; S.10.25.
2-(3-(2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐아미노)피리미딘-4-일아미노)페닐)아세토니트릴 벤젠 설포네이트 (화합물 1-18 베실레이트)
IPA (30 mL) 중 뜨거운 화합물 1-18 (400mg)의 현탁액에 벤젠설폰산(406 mg, 3 eq)을 첨가하였다. 이를 실온에서 냉각시키고 밤새 -20℃에서 저장하였다. N2 하 여과하여 516 mg의 노란색 분말을 수득하였다. 수득률: 72%. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) 7.81 (m, 7H), 7.58(m, 3H), 7.43(m, 7H), 7.19 (d, J=7.57Hz, 1H), 6.47 (d, J=7.33Hz, 1H), 3.84 (s, 2H), 3.58 (d, 2H), 3.23 (m, 5H), 2.97 (s, 3H), 19F-NMR (300Mz, CD3OD) -126.58. 원소 분석 CaI: C, 51.60; H, 5.05; N, 11.70; S, 7.65, Found: C, 51.57; H, 4.96; N, 10.98; S, 7.61.
Figure 112009057886861-PCT00047
Figure 112009057886861-PCT00048
실시예 5
대표적 화합물의 활성
A. JAK2 키나제 억제 검사
JAK2 키나제 활성을 측정할 수 있는 한 예시적 방법은 키나제-Glo 검사 키트(제조원: Promega, Inc., 매디슨, 위스콘신주, 미국)와 같은 in vitro JAK2 키나제 반응 후 용액에 남아있는 ATP 양을 정량하는 것이다. 키나제 반응 후 용액에 남아있는 ATP의 양은 루시페라제의 기질로 제공되어, 빛의 광자 하나를 더하여 루시페린이 옥시루시페린이 되는 것을 촉매한다. 따라서, 키나제 반응 후 Luminoskan Ascent Instrument(제조원: Thermo Electron Corp., Milford, MA)에 의해 판독된 발광 시그널은 존재하는 ATP의 양과 관련이 있으며, 역으로 키나제 활성의 양과 관련이 있다. 이 검사는 JAK2 키나제에 대한 키나제 억제제의 IC50 값을 측정하는 데 효과적이다. 이 검사는 중복된 백색의 평평 바닥 96 웰 플레이트에 50㎕ 용적으로 개시한다. 억제제가 1X 키나제 버퍼, 6uM ATP, 62.5uM JAK2-특이적 기질, 30ng of 활성 JAK2 효소 및 물의 용액에 마이크로몰에서 나노몰 농도 범위의 단계적 희석으로 첨가된다. 이 용액을 2시간 동안 360rpm에서 30℃에서 배양한다. 배양 후, 양성 및 음성 대조군 웰을 포함한 각 웰에 5Oul의 키나제-Glo 시약을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 배양하였다. 이후, 플레이트를 Luminoskan Ascent instrument로 판독하고, 결과를 Ascent Software version 2.6으로 나타내었다. 이후 각 시험 억제제의 IC50 값이 계산될 수 있다.
또한, 화합물은 방사분석, 즉, KinaseProfilerTM 및 IC50ProfilerTM 검사 서비스(Millipore- Upstate, Dundee, UK)을 사용하여 테스트될 수 있다. 요약하면 방사선 라벨링된 ATP의 존재 하에서 재조합 JAK2 효소에 대해 단일 농도(단일-포인트 스크리닝) 또는 다중 농도(IC50 측정을 위해)에서 화합물을 테스트한다.
JAK2 V617F 변이 이소폼은 종양 변형에서의 이의 역할이 최근 주목받고 있다. 따라서, 화합물은 또한 JAK2의 야생형 및 V617F 변이 이소폼 모두를 포함하는 SelectScreenTM assay service (제조원: Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)를 사용하여 테스트될 수 있다. 이 효소는 단백질의 JH1 및 JH2 상동 부위 모두를 포함하며, 아미노산 617에서만 상이하다.
B. 세포계 JAK2 키나제 억제제 검사
세포 배양계 검사는 본 발명의 화합물의 하나 이상의 세포 활성, 예를 들어 암 세포 성장 및/또는 생존을 억제하는 능력을 평가하는 데 사용될 수 있다. 다수의 암 세포주가 American Type Culture Collection(ATCC) 및 기타 공급원으로부터 획득될 수 있다. 요약하면, 세포를 100ul의 적합한 성장 배지(ATCC에 의해 결정된) 중, 세포 증식의 속도에 따라 웰 당 세포수 600 내지 14000로, 96-웰, 조직-배양 처리된, 불투명 백색 플레이트(제조원: Thermo Electron, Vantaa, 핀란드)에 씨딩한다. 이후, 세포를 적합한 농도의 약물에 노축시키고, 96시간 동안 이의 존재 하에 성장시킨다. 다음으로, 각 웰에 100ul의 Cell-Titer-Glo 시약 (제조원: Promega, Inc., Madison, Wl)을 첨가한다. 플레이트를 이후 실온에서 2분 동안 진탕하여 세포를 용해시키고 실온에서 10분 동안 배양하여 발광 시그널을 안정화시킨다. Promega의 키나제-Glo 검사 시약과 유사하게 이 시약은 루시페라제 효소 및 이의 기질 루시페린을 모두 함유한다. 세포 용해물 내 ATP에 의해 활성화된 루시페라제는 루시페린이 옥시루시페린으로 전환되는 것을 촉매하며, 이 반응에서 빛이 생성된다. 생성된 빛의 양은 세포 용해물 내 ATP의 양에 비례하며, ATP의 양 자체는 세포 개수에 비례하므로 세포 증식의 지표를 제공한다.
세포 배양 내 JAK2 효소의 특이적 억제를 검출하기 위해서, Western blot assays가 또한 시행될 수 있다. 이를 위해, 후보(potential) JAK2 억제제로 처리된 세포들은 단백질의 분리 및 보존에 특이적인 버퍼로 용해된다(1 % Nonidet P-40, 12OmM NaCl, 3OmM Tris pH 7.4, 1:100 프로테아제 억제제 칵테일 III [Calbiochem/EMD Biosciences], 1:100 포스파타제 억제제 칵테일 1 [Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO], 1:100 포스파타제 억제제 칵테일 2 [Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO]). 이 용해물 중 단백질 농도는 이후 BCA 단백질 검사 키트 (Pierce)를 사용하여 정량된다. 알려진 양의 단백질, 예를 들어, 50ug을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고, 환원, 변성시키는 SDS-PAGE에 위치시킨다. 전기 영동 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 이동시키고, 이후 STAT5, pSTAT5(Tyr 694), STAT3 및 pSTAT3 (Tyr 705)에 대한 항체로 프로빙(probe)한다. 티로신 694 및 티로신 705에서 STAT5 및 STAT3이 각각 JAK2에 대해 기질이기 때문에 처리된 세포의 이 부위에서 인산화 양을 측정함으로써 JAK2 억제제의 효능을 평가하는 수단을 제공한다.
C. JAK2 키나제 특이적 활성 데이터
화합물 1-4, 1-7, 1-11 및 1-17은 JAK2 억제제로서 300 nM 내지 10 nM의 희석 범위로 스크리닝되었으며, 생존률이 Cell-Titer-Glo 검사를 사용하여 함께 측정되었다. 이들 화합물 각각은 IC50 값이 계산되는 억제 농도에 비례하는 생존값(%)에 이른다. 이들 화합물은 다양한 암 세포주에서 10 nM 미만의 IC50 값을 나타내었다.
JAK2 키나제에 대한 IC50 값(Promega Kinase-Glo 검사를 사용한)이 화합물 1-4, 1-7, 1-11 및 1-17에 대해 측정되었다. 화합물 각각은 1 uM 미만의 IC50 값을 갖는 것으로 밝혀졌다.
IC50 ProfileTM 데이터는 화합물 1-4, 1-7, 1-11 및 1-17에 대해 1uM 미만의 IC50 값을 나타낸 반면, 야생형(JAK2 WT) 및 변이 JAK2 키나제(JAK2 V617F)에 대한 Invitrogen SelectScreenTM 프로파일링을 사용해 스크리닝된 화합물로부터의 데이타는 이들 4개의 화합물의 IC50 값이 1 μM 미만이었다.
실시예 6
대표적 화합물들이 STAT3 및 STAT5를 변화시키다.
A. 화합물 1-4는 STAT3 및 STAT5 인산화를 억제한다.
이 실시예에서, 화합물 1-4는 AGS 위암 세포주에서 STAT3 및 STAT5의 JAK2-의존적 인산화를 감소시키는 것으로 보여진다. 간략히, AGS 세포를 25cm2 조직 배양 플라스크에 심고, 다양한 농도의 화합물 1-4의 존재 하에 24시간 동안 배양시켰다. 배양 후, 세포를 용해시키고, 총 단백질을 분리하고 정량하였다. 총 단백질의 50㎍이 전기 영동되어 니트로셀룰로스 막으로 이동하였으며, 이 시점에서 STAT3-포스포-Y705 및 STAT5-포스포-Y694에 대한 항체를 사용하여 Western Blot 분석을 실시하였다. 총 STAT3 및 STAT5를 비교하였다. 농도계 분석으로 테스트 세포에서 STAT3 및 STAT5의 인산화 양을 정량하였다. 포스포-STAT3 및 포스포-STAT5를 총 STAT3 및 STAT5과 비교하고, 비처리된 대조군에 대한 STAT 인산화 비율을 측정하였다. 화합물 1로 처리된 세포는 낮은 마이크로몰 농도(5-1OuM)에서 STAT3 및 STAT5 인산화 수준이 감소되었다.
B. 화합물 1-4는 STAT3 활성화를 감소시킨다.
STAT3가 JAK2에 의해 인산화될 때, 호모다이머(homodimer)를 형성하고, 핵으로 전위하여 세포 증식에 관여하는 다수의 표적 유전자의 전사에 영향을 끼진다. AGS 유전자 암 세포를 96 웰 플레이트에 접종하고 5 μM 화합물 1-4의 존재 하에서1, 5 또는 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 STAT3 HitKit(Thermo-Fisher)를 사용하여 염색하고, ArrayScan VTi 고함량 스크리닝 장치(Thermo-Fisher) 상에서 분자 전위 바이오적용(Molecular Translocation BioApplication)을 사용하여 검출하였다. 핵을 청색(Hoechst)으로 가염색(pseudostain)하고, STAT3을 녹색(FITC)으로 가염색하였다.
비처리된 세포에서, STAT3이 핵내 상당한 정도로 발견되었으며, 이는 STAT3이 인산화되어, 활성으로 전사를 유도함을 나타낸다. 그러나, 화합물 1-4로 처리된 세포에서, STAT3 염색은 핵 바깥에 제한되어, 이것이 인산화되지 않아 불활성으로, JAK2 억제제에서 기대되는 효과를 나타냄을 보여주었다. 핵의 STAT3은 화합물 1-4로 처리 후 24시간에 비처리된 샘플에서 핵의 STAT3 수준과 비교시 50% 이상 감소되었다.
C. 화합물 1-4 및 1-7은 세포 발현 JAK2(V617F)에서 STAT5 인산화를 감소시킨다.
이 실시예에서, 화합물 1-4, 1-7, 1-11 및 1-17은 JAK2의 V617F를 발현하는 세포에서 STAT5의 JAK2-의존적 인산화를 감소시키는 것을 입증되었다. 요약하면, HEL 세포를 25cm2 조직 배양 플라스크에 심고, 다양한 농도의 화합물 1 또는 2의 존재 하에 24시간 동안 배양시켰다. 배양 후, 세포를 용해시키고, 총 단백질을 분리하고 정량하였다. 총 단백질의 50㎍이 전기 영동되어 니트로셀룰로스 막으로 이동하였으며, 이 시점에서 STAT5-포스포-Y694에 대한 항체를 사용하여 Western Blot 분석을 실시하였다. 총 STAT5를 비교하였다. 농도계 분석으로 테스트 세포에서 STAT5의 인산화 양을 정량하였다. 이 검사에서, 화합물 1-4의 EC50 값은 299 nM, 화합물 1-7은 4 nM, 화합물 1-11은 65.8 nM 및 화합물 1-17은 266 nM으로 측정되었다.
본원에서 언급되고/언급되거나 출원 데이터 쉬트 상에 기재된, 상기한 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공보는 참조에 의해 이의 전체가 본원에 혼입된다.
전술한 것으로부터, 본 발명의 특정 양태가 예시를 위해 본원에 기술되었으나, 다양한 변형이 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않으면서 가해질 수 있음이 고려되어야 할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구범위를 제외하고는 한정되지 않는다.

Claims (19)

  1. 화학식 I의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    [화학식 I]
    Figure 112009057886861-PCT00049
    상기 식에서, Z는 CH 또는 N이고;
    W1 및 W2는 독립적으로 직접 결합, -C(=O)- 또는 -O(CH2)n- 이고;
    X1 및 X2는 독립적으로 -H, -CF3, -OCF3, -OCHF2, -OCH3, -CH3, -OH, -NO2, -NH2, 할로겐 또는
    Figure 112009057886861-PCT00050
    (여기서, X1 또는 X2 중 어느 하나가
    Figure 112009057886861-PCT00051
    인 경우, Q는 O 또는 N이고 R은 존재하지 않거나 R은 -C1-6 알킬이다);
    Y1 및 Y2는, Y1 및 Y2 둘 다 -H가 아니면, 독립적으로 -H, -CN, 할로겐, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬기이고;
    n 은 1, 2 또는 3이다.
  2. 제1항에 있어서, Z가 CH인, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  3. 제2항에 있어서, X2가 할로겐인, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  4. 제3항에 있어서, Y2가 -CN, 할로겐, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬기인, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  5. 제3항에 있어서, Y1이 -CN, 할로겐, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬기인, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  6. 제2항에 있어서, X2가 -H인, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  7. 제6항에 있어서, Y1이 -CN, 할로겐, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬기인, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  8. 제6항에 있어서, Y2가 -CN, 할로겐, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬기인, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  9. 제2항에 있어서,
    Figure 112009057886861-PCT00052
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  10. 제2항에 있어서,
    Figure 112009057886861-PCT00053
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  11. 제1항에 있어서, Z가 N인, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  12. 제11항에 있어서, X2가 -H인, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  13. 제12항에 있어서, Y2가 -CN, 할로겐, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬기인, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  14. 제12항에 있어서, Y1이 -CN, 할로겐, 또는 -CN으로 치환된 C1-4 알킬기인, 화 합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  15. 제11항에 있어서,
    Figure 112009057886861-PCT00054
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  16. 제1항에 따른 화합물과 약제학적으로 허용되는 부형제를 배합하여 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 따른 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, JAK2 단백질 키나제-매개된 질환을 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 JAK2 단백질 키나제-매개된 질환이 암인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 암은 결장암, 전립선암, 고환암, 폐암, 자궁암, 난소암, 위암, 유방암, 췌장암, 백혈병 또는 림프종인, 방법.
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