TWI624461B

TWI624461B - 喹唑啉化合物，其製備方法及用途

Info

Publication number: TWI624461B
Application number: TW102147152A
Authority: TW
Inventors: 林南宏; 郭曼娫; 廖助彬; 彭劭政; 嚴士傑
Original assignee: 財團法人生物技術開發中心
Priority date: 2013-12-19
Filing date: 2013-12-19
Publication date: 2018-05-21
Also published as: TW201524962A

Abstract

一種用於治療蛋白激酶相關疾病之化合物，其具有式(I)之結構：其中G為雜芳基、雜環基或炔基；X為N或CH；L¹為-N(R⁷)-、-O-、-C(S)-、-C(O)-或-S-；L²為-N(R⁸)-或-O-；R¹與R²各別為氫、鹵素、羥基、胺基、氰基、硝基、羧基、C_1-C₄烷氧基、C₁-C₄烷氧基C₁-C₄烷氧基、N,N-(C₁-C₄二烷基)胺基C_1-C₄烷氧基、N-(C₁-C₄烷基)胺基C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷醯基、C₁-C₄烷醯氧基、N-(C₁-C₄烷基)胺基、N,N-(C₁-C₄二烷基)胺基、C₁-C₄烷醯基或雜環基；其中，C₁-C₄烷基可視需要由一或多個選自氟和氯之取代基取代；R³、R⁴和R⁵各別為氫、氟或氯；R⁶為C₁-C₄烷基或芳香基，其可視需要經一個或多個選自鹵素、羥基、胺基、氰基與硝基之取代基取代；或R⁶與R⁸為選自於5-6員環基或雜環基。

Description

喹唑啉化合物，其製備方法及用途

本發明係關於一種新穎的化學化合物和及其用於治療和製劑的方法。特別是本發明係關於某些經取代的喹唑啉化合物，及其於抑制、調節及/或調制特定蛋白激酶和其相關訊息傳遞之用途。

蛋白激酶(PKs)在細胞訊息傳遞途徑中扮演著重要的角色，其調控了多種細胞功能，例如：細胞分化、增殖、遷移、存活和凋亡等。這類酵素催化ATP的磷酸根轉移到受質蛋白上的酪氨酸、絲氨酸或酥氨酸的殘基。激酶的磷酸化和去磷酸酶的去磷酸化反應，參與無數細胞過程，反應不同的細胞內訊號、細胞功能的調節和細胞作用的活化或去活化。

如同代謝、免疫和神經系統疾病，異常PK活性已被證實與癌症有關。因此，蛋白激酶已成為治療人類疾病具有吸引力的目標。PK抑制劑，係一種阻斷PK活性的化合物，已開發並廣泛應用於臨床治療。而超過30種PK抑制劑已被批准用於疾病的治療上，例如癌症治療，但仍然需要一種新的PK抑制劑來治療各種疾病或克服抗藥性。因此，鑑別出可特異性抑制訊息傳遞及細胞增殖之有效的小分子化合物，將有益於以調節PK活性來調節和調控導致癌症的不適當細胞增殖、分化或代謝。

本發明具體實施方式係基於意外的發現某些喹唑啉化合物可以抑制蛋白激酶(例如B-RAF、B-RAF(V600E)、C-RAF)的活性。這些性質使喹唑啉化合物可用於治療蛋白激酶有關的疾病，包括癌症。

本發明之一具體實施例係為式(I)之喹唑啉化合物：其中G為雜芳基、雜環基或炔基；X為N或CH；L¹選自含有-N(R⁷)-、-O-、-C(S)-、-C(O)-與-S-之基團；L²選自含有-N(R⁸)-與-O-之基團；R¹和R²獨立選自由氫、鹵素、羥基、胺基、氰基、硝基、羧基、烷氧基、烷氧基烷氧基、N,N-(二烷基)胺基烷氧基、N-烷基胺基烷氧基、烷醯胺、烷醯氧基、N-(烷基)胺基、N,N-(二烷基)胺基、烷醯基胺基、雜環基和雜烯基之基團，其中烷基部分係視需要由一或多個氟和氯之取代基取代；R³、R⁴和R⁵為獨立地選自氫、氟和氯；R⁶選自烷基、烯基、炔基和芳基，其中烷基、烯基、炔基和芳香基係視需要經一或多個選自鹵素、羥基、胺基、氰基和硝基之取代基取代；較佳地，當L²為-N(R⁸)-時，R⁶和R⁸與其所連接的原子，共同形成一5-6員環烷基、環烯基或雜環烷基；R⁷與R⁸獨立地選自氫、烷基和烯基。

本發明一較佳具體實施例為選自含有以下基團之化合物：N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺； N-(2,4-二氟-3-(6-(6-嗎啉吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(1H-吡唑-4-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(4-氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(7-氟-6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2-氯-4-氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)甲烷磺醯胺；N-(2,4-二氟-5-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(吡啶-4-基)喹啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(7-氟-6-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,6-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,6-二氟-3-(6-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)乙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-2-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)苯磺醯胺；N-(3-(7-(2-(二甲胺基)乙胺基)-6-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-甲氧吡啶-3-基)喹啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-4-基)喹啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺； N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-甲氧吡啶-3-)喹啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)-7-甲氧喹唑啉-4-基胺)苯基)苯磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)-7-(2-甲氧乙氧基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(7-甲氧基-6-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-甲氧吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-氧代-1,6-二氫吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-(2-甲氧乙氧基)吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基氧)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(6-(2-(二甲胺基)乙氧基)吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-氟吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-甲氧吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-(2-甲氧乙氧基)吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(6-(2(二甲胺基)乙氧基)吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-嗎啉吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-嗎啉喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(1H-咪唑-1-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)-3-氟丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(2-(2-二甲胺基)乙氧基)吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(5-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(1H-苯並[d]咪唑-1-基)喹唑啉-4- 基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-羰基)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-乙炔喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(2-胺嘧啶-5-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(2-(二甲胺基)嘧啶-5-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(1H-1,2,3-***-4-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基)(甲基)胺基)苯基)-N-甲基丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(6-(二甲胺基)吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷磺內醯醯胺；N-(2,4-二氟-3-(5-氟-6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(2-氯吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-甲氧基-5-硝基吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(3-胺苯基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(5-胺基-6-甲氧吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(6-胺基吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-三氟甲基)吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(6-氰基吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(2-氰基吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(5-三氟甲基)吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(4-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(6-胺基-5-甲基吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺。

根據本發明的具體實施例中，所述化合物具有下列式(I) 結構：其中G選自下列其中之一：其中表示一吡啶基，可任選地被一個或多個R⁹取代，表示一嘧啶基，可任選地被一個或多個R¹⁰取代，表示一呋喃基，可任選地被一個或多個R¹¹取代，表示一吡唑基，可任選獨立地被R¹²和一個或多個R¹³取代，表示一***基，可任選獨立地被R¹⁴和一個或多個R¹⁵取代，表示一咪唑基，可任選地被一個或多個R¹⁶取代，其中R⁹為獨立地選自由氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、氰基、鹵烷基、烷氧基、甲氧烷氧基、二烷基胺基烷氧基、二烷基胺基和雜環基組成之基團，其中R¹⁰為氫、羥基、胺基或二烷基胺基，其中R¹¹、R¹³、R¹⁵與R¹⁶為獨立地氫、鹵素或烷基，和其中R¹²、R¹⁴為獨立地氫、烷基或烷醯基。

根據本發明的具體實施例中，所述化合物具有式(I)的結構：其中G選自於：其中表示一嗎啉基，可任選地被一個或多個R¹⁷取代，表示一吡酮基，可任選獨立地被R¹⁸和一個或多個R¹⁹取代，代表一炔基，可被一個R²⁰取代；其中R¹⁷獨立地選自：氫、鹵素、羥基、胺基、氰基、烷基和烷氧基；其中R¹⁸選自含有氫和烷基之基團；其中R¹⁹獨立地選自由氫、鹵素、羥基、胺基、氰基、烷基和烷氧基組成之基團；和其中R²⁰是選自由氫、烷基、芳基、甲氧基和烷氧基組成之基團。

從下面的描述及從屬之申請專利範圍，將可更加瞭解本發明的其它特徵及優點。

定義

術語“烷基”，除另有註明外，係指含有1-20個碳原子的直鏈或支鏈的單價飽和烴基。在本說明書中的數值範圍是指包括在本定義範圍內的任何數值。例如：1至20個碳的烷基，包括C₁、C₂...C₂₀，以及C₁-C₂₀、C₁-C₁₅、C₁-C₁₀、C₁-C₆、C₁-C₄等。烷基的實例包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基。術語“烯基”是指含有2至20個碳原子(例如C₂-C₁₀)和一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈的單價烴基。烯基的實例包括但不限於乙烯基、丙烯基、烯丙基和1,4-丁二烯。術語“炔基”是指含有2-20個碳原子(例如C₂-C₁₀)和一個或多個三鍵的直鏈或支鏈的單價烴基。炔基的實例包括但不限於乙炔基、1-丙炔基、1-和2-丁炔基、和1-甲基-2-丁炔基。術語“烷氧基”是指-O-烷基基團，其中該烷基係如上所定義。烷氧基的實例包括但不限於甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。術語“醯氧基”是指-OC(O)-R基團，其中R可以是氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基。術語“胺基”是指NH₂。術語“烷基胺基”是指-N(R)-烷基基團，其中R可以是H、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基。

術語“環烷基”是指具有3至30個碳原子(例如C₃-C₆或C₃-C₁₂)的單價飽和烴環系統。環烷基的實例包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基，以及金剛烷基。術語“環烯基”是指具有3至30個碳原子(例如C₃-C₆或C₃-C₁₂)和一個或多個雙鍵的單價非芳香族的烴環系統。實例包括環戊烯基、環己烯基和環庚烯基。術語“雜環烷基”是指具有一個或多個雜原子(如氧、氮、硫或硒)之單價非芳基5-8員單環、8-12員雙環、或11-14員三環的環系統。雜環烷基的實例包括但不限於哌嗪基(piperazinyl)、咯啶基、哌啶基、二氧六環基(dioxanyl)、嗎啉基，和四氫呋喃基。術語“雜環烯基”是指具有一個或多個雜原子(如氧、氮、硫或硒)和一個或更多雙鍵的單價非芳基5-8員單環、8-12員雙環、或11-14員三環的環系統。

術語“芳基”是指單價的6-碳單環，10-碳雙環或14-碳三環芳族環系。芳基的實例包括但不限於，苯基、萘基和蒽基。術語“芳氧基”係指-O-芳基。術語“芳基胺基”是指-N(R)-芳基，其中R可為氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基或雜芳基。術語“雜芳基”是指具有一個或多個雜原子(如氧、氮、硫或硒)單價芳基5-8員單環、8-12員雙環，或11-14員三環的環系統。雜芳基的實例包括吡啶基、呋喃基、咪唑基、苯並咪唑基、嘧啶基、噻吩基、喹啉基、吲哚基、噻唑基、吡咯基、異喹啉基、嘌呤基、噁唑基、吡唑基和咔唑基。

前述之烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、胺基、烷胺基、芳胺基、烷氧基、芳氧基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳基和雜芳基可以是經取代或未經取代的。合適的取代基，包含但不限於，C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₃-C₂₀環烷基、C₃-C₂₀環烯基、C₁-C₂₀雜環烷基、C₁-C₂₀雜環烯基、C₁-C₁₀烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳氧基、胺基、C₁-C₁₀烷胺基、芳香胺基、羥基、鹵素、氧代基(O=)、硫代基(S=)、硫基、C₁-C₁₀烷硫基、芳硫基、C₁-C₁₀烷基磺醯基、芳基磺醯基、醯胺基、胺醯基、胺硫醯基、甲脒基、巰基、醯胺基、硫脲基、氰硫基、磺醯胺基、胍基、脲基、氰基、硝基、醯基、硫代醯基、醯氧基、脲基、胺甲醯基(-C(O)NH₂)、羧基和羧酸酯。另一方面，烷基、烯基或炔基的取代基可以包括上述所列舉的取代基，除了C₁-C₁₀烷基。環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基和雜芳基亦可互相彼此融合。

下列反應式(反應式1至反應式14)中，提供了用於製備式(I)化合物的代表性的流程。然而，熟習本領域的技術人員可理解這些僅用於說明，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可進行修改或變化。根據本發明的具體實施例所合成的喹唑啉化合物，可以藉由快速管柱層析法、高效液相層析法、結晶化，或任何其它適當的方法進行純化。

中間產物I

於0℃下，將濃硝酸(1.1當量)逐滴加入至含有苯甲酸乙酯(1)(1.0當量)之發煙硫酸(1.25M)中。然後，將混合物置於室溫下攪拌一小時；接著，將反應混合物倒入冰中，並以乙酸乙酯萃取水相。分離有機層，以飽和的碳酸氫鈉沖洗並濃縮，得到產物2。

在氮氣下，將含有10%(wt.)鈀的活性炭(0.05當量)加入到有乙基-3-硝基苯甲酸甲酯(2)(1.0當量)的燒瓶中。於燒瓶中加入甲醇(0.25M)，並在2個氫氣氣球下攪拌過夜。待反應完成後，以氮氣沖洗燒瓶，並將反應混合物經由矽藻土過濾。除去揮發物，得到粗製的3-胺基苯甲酸乙酯(3)。

將烷基-1-磺醯氯(1.2當量)緩慢加入到被維持在冷水浴的3-胺基苯甲酸乙酯(3)(1.1當量)吡啶溶液中(0.5M)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，然後倒入冷水中。以乙酸乙酯萃取水層。將有機層分離，並用飽和的氯化銨和鹽水洗滌，然後以硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮，得到3-(N-(烷基磺醯基)亞磺醯胺基)苯甲酸乙酯(4)。

將1N氫氧化鈉水溶液(3.0當量)加入到溶於4：1 THF/MeOH(0.2M)之3-(N-(烷基磺醯基)磺醯胺)苯甲酸乙酯(4)溶液中(1.0當量)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜，接著在真空中將大部分的有機溶劑除去。將1N的鹽酸溶液緩慢加入到該混合物中，過濾所得到的固體，並用水沖洗。用***洗滌該物質，得到3-烷磺醯胺苯甲酸(5)。

中間產物II

反應式2.

在0℃、氮氣下，將N,N-二異丙基乙胺(2.0當量)和氯甲基甲基醚(2.0當量)加入到溶於乾燥二氯甲烷之苯酚(6)(1.0當量)溶液中。所得黃色混合物在0℃下攪拌30分鐘，並於室溫下放置過夜。以10%氫氧化鈉水溶液稀釋有機混合物，並以二氯甲烷進行萃取。將有機層合併，經硫酸鎂乾燥，過濾，並真空濃縮。以矽膠管柱純化粗產物，並用含乙酸乙酯的己烷溶液沖提，得到所要產物7。

於-70℃、氮氣下，在含甲氧基甲氧基苯(7)(1.0當量)的四氫呋喃(0.35M)溶液中加入1.4M的正丁基鋰的己烷溶液(0.99當量)，滴加時間為10分鐘。混合物在-70℃下攪拌1.5小時，然後倒入粉碎的乾冰。一旦冒泡消失後，即可將混合物溫熱至室溫，並加入水。將該水溶液用***萃取兩次，然後藉由加入濃鹽酸酸化至pH 1。將所得懸浮液用超音波振盪處理5分鐘，然後用二氯甲烷萃取兩次。將合併的二氯甲烷萃取液用硫酸鎂乾燥，並進行減壓濃縮，得到產物9。

將烷磺醯氯(1.2當量)緩慢加入至被維持在冷水浴中含有3-羥基苯甲酸(9)(1.0當量)的吡啶溶液(0.5M)。反應混合物在室溫下攪拌1小時。加入水，將有機層分離，並用水和鹽水洗滌，然後用硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮，得到產物10。

中間產物III

於含苯甲酸(11)(1當量)的四氫呋喃溶液(0.25M)中加入三乙胺(2.3當量)和二苯基磷疊氮化物(1.15當量)。將反應混合物在室溫下攪拌3小時，然後溫熱至80℃達2小時。加入水，並在80℃下攪拌混合物15小時。用乙酸乙酯稀釋反應混合物，並以飽和碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌有機層。在減壓環境下除去溶劑，並以矽膠管柱層析法純化殘餘物，得到化合物12。

中間產物IV

在-20℃下，將氫化鋁鋰(3.85當量)小量加至含3-烷磺醯胺基苯甲酸(5)(1當量)的無水四氫呋喃溶液(1.1M)，並在-20℃下攪拌4小時，然後在室溫下攪拌1小時，以進行反應。然後，將反應物以飽和氯化銨溶液進行淬滅處理(quench)。常規處理後得到粗產物，將其在真空下乾燥，並溶解在0℃的無水二氯甲烷中，然後加入氯鉻酸吡啶(2.0當量)。將反應混合物於冰浴中攪拌40分鐘，然後用飽和碳酸氫鈉水溶液稀釋，並用乙酸乙酯萃取。將合併的有機層用水和鹽水洗滌，以無水硫酸鎂乾燥，和減壓濃縮。使用含乙酸乙酯的己烷流洗液進行矽膠管柱色層分析，得到產物13。

中間產物V

在0℃下，於含苯酚(14)(1.0當量)的二氯甲烷(0.5M)攪拌溶液中加入吡啶(1.05當量)，並攪拌10分鐘。在15分鐘內逐滴加入以二氯甲烷稀釋之甲基氯甲酸酯(1.05當量)，並將反應混合物溫熱至室溫並持續攪拌17小時。以二氯甲烷稀釋反應混合物並依序用0.5N氫氧化鈉水溶液、及鹽水洗滌。有機層經由無水硫酸鎂床過濾，濃縮至乾燥，得到產物15。

在氮氣下，將苯基甲基碳酸酯(15)(1.0當量)溶解於濃硫酸中，並冷卻至0℃。然後小心地加入硝酸(2.0當量)，同時將溫度保持在0℃。然後將混合物攪拌2小時，同時升溫至室溫。然後小心地將其倒入冰中，並用***萃取兩次。合併有機相，用硫酸鎂乾燥並經減壓濃縮，得到產物16。

於含3-硝苯甲基碳酸酯(16)(1.0當量)的甲醇溶液(0.2M)中加入20%鈀碳(10% wt)。將反應混合物在室溫、氫氣下攪拌過夜。以氮氣置換後，將催化劑濾除。在減壓條件下將溶劑從濾液中蒸除，殘留物以***進行再結晶，得到標題化合物17。

將烷基-1-磺醯基氯(1.2當量)緩慢加入到被維持在冷卻水浴中含有乙基-3-胺基苯甲酸甲酯(17)(1.0當量)的吡啶溶液(0.5M)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時。加入水並將有機層分離，有機層用水和鹽水洗滌，然後用硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮以得到產物18。

將含苯甲基碳酸鹽(18)(1.0當量)的甲醇溶液(0.2M)以1N氫氧化鈉(5.0當量)溶液在75℃下加熱處理14小時。冷卻至室溫後，將甲醇在真空中蒸除。所得含水混合物以1N的鹽酸溶液酸化後，用鹽水稀釋，並用二氯甲烷萃取。將合併的有機相以無水硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮。所得固體經由短的矽膠管柱過濾純化，接著用乙酸乙酯回收，得到標題化合物19。

中間產物VI

將含化合物20(1.0當量)的甲醯胺(15.0當量)的懸浮液加熱到165℃，持續6小時。冷卻至室溫後，將水加入到反應混合物中。沉澱物經由過濾收集，以水沖洗，並在120℃的烘箱中乾燥，得到標題化合物21。

將含化合物21(1.0當量)的三氯氧磷(1.0M)懸浮液加熱回流6小時。接著將所得澄清溶液冷卻至室溫，並在真空下濃縮，得到4-氯-6-溴喹唑啉(22)，產物不經進一步純化即用於下一步驟。

中間產物VII

將含化合物23(1.0當量)的乙醇溶液(0.5M)中加入化合物12(1.1當量)和催化量的鹽酸。回流2小時後，將反應混合物冷卻至室溫並進行真空濃縮。將所得殘餘物用100ml乙酸乙酯稀釋，用飽和的碳酸氫鈉(水溶液)和鹽水洗滌後，以硫酸鎂乾燥，並進行真空濃縮，得到標題產物。藉由管柱層析法進一步純化，得到化合物24。

中間產物VIII

於0℃下，在含3-烷基磺胺酚(18)(1.1當量)和4-氯喹唑啉(25)(1.0當量)的DMF(0.3M)之攪拌溶液中，加入60%氫化鈉(1.25當量)之油懸浮液，然後將反應混合物溫熱至室溫並攪拌5小時。緩慢加入水以終止反應，並用乙酸乙酯稀釋。接著以水、鹽水沖洗，用無水硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮。再藉由管柱層析法進一步純化，得到化合物26。

中間產物IX

將氫化鈉(50%含油，1.3當量)加入到含4-氯喹唑啉的溶液(25)(1.0當量)、苯甲醛(8)(1.3當量)和1,3-二甲基咪唑碘化物(0.33當量)之四氫呋喃溶液中。並使混合物在油浴中回流攪拌適當的時間。冷卻後，將混合物倒入冰-水混合物中，並用乙酸乙酯萃取。將萃取液經硫酸鎂乾燥並濃縮至乾燥。藉由管柱層析法進一步純化，得到化合物27。

最終產物I

化合物24(1.0當量)、雜芳基硼酸(1.5當量)和碳酸鈉(3.0當量)於二氧陸圜/水(4：1，0.2M)中，以Pd(Ph₃P)₄(0.05當量)催化反應，並在80℃下攪拌2小時。過濾粗製反應混合物，並經硫酸鎂乾燥，及減壓濃縮。再藉由管柱層析法進一步純化，得到化合物28。

最終產物II

將化合物29(1.0當量)、乙酸鉀(3.0當量)、Pd(dppf)Cl₂(0.03當量)和雙戊醯二硼(1.2當量)加入到二氧陸圜(0.3M)中，並加熱5小時至80℃。以乙酸乙酯和水萃取該溶液，並再次用水洗滌有機相，以硫酸鎂乾燥，並蒸發至小體積。藉由管柱層析法進一步純化，得到化合物30。

將二氧雜環戊硼喹唑啉(30)(1.0當量)、芳基鹵或雜芳基鹵(1.2當量)、四(三苯基磷)鈀(0)(0.05當量)和2.0M的碳酸鈉水溶液(2.5當量)加入到二氧陸圜(0.3M)中，並加熱5小時至80℃。以乙酸乙酯和水萃取該溶液，並再次用水洗滌有機相，以硫酸鎂乾燥，並蒸發至小體積。藉由管柱層析法進一步純化，得到化合物31。

最終產物III

於燒瓶中加入碘化亞銅(0.1當量)、L-脯氨酸(0.2當量)、K₂CO₃(2當量)、化合物29(1.0當量)和咪唑(1.5當量)，將燒瓶抽真空並用氮氣回充。在室溫、氮氣下，以注射器將DMSO(0.2M)加入混合物溶液中。在混合物分佈於水和乙酸乙酯之間前，將混合物加熱至100℃。將有機層分離，並以乙酸乙酯萃取水層。合併有機層，並用鹽水洗滌，硫酸鎂乾燥，以及真空濃縮。再藉由管柱層析法進一步純化，得到化合物32。

最終產物IV

將四(三苯基磷)鈀(0.02當量)加入到含化合物29(1.0當量)、炔丙醇(1.5當量)和三乙胺(1.5當量)之四氫呋喃(0.2M)溶液中，並加熱回流16小時。將混合物冷卻，然後通過矽藻土過濾，用甲醇流洗。再藉由管柱層析法進一步純化，得到化合物33。

最終產物V

反應式14.

將嗎啉(0.5M)加入到5-氟-2-硝基苯甲酸(1.0當量)溶液中，並將反應溶液加熱至90℃達5小時。然後將反應物冷卻並加入水。攪拌10分鐘後，過濾混合物，並以水沖洗濾餅。於濾液中加入檸檬酸，使更多的產物沉澱出。以水沖洗濾餅，然後在40℃下真空乾燥過夜，以得到產物35。

在氮氣環境下，將含10%(wt)鈀的活性碳(0.05當量)加入到裝有2-硝基苯甲酸(35)(1.0當量)的燒瓶中。接著在燒瓶中加入甲醇(0.25M)，並在2個氫氣球下攪拌過夜。待反應完成後，以氮氣沖洗燒瓶，並以矽藻土過濾反應混合物。除去揮發物後，得到粗製的2-胺基苯甲酸(36)。

將含有化合物36(1.0當量)之甲醯胺(7.0當量)的懸浮液於165℃下持續加熱6小時。冷卻至室溫後，將乙酸乙酯加入到反應混合物中，並劇烈攪拌。將沉澱物過濾收集，用乙酸乙酯洗滌，並在120℃烘箱中乾燥，得到標題化合物37。

將含有化合物37(1.0當量)的三氯氧磷(1.0M)懸浮液加熱回流6小時，然後將所得澄清溶液冷卻至室溫，並在真空下濃縮，得到粗糙的產物37，該產物無需進一步純化即可用於下一步驟。

在含有化合物38(1.0當量)的乙醇(0.5M)溶液中加入化合物12(1.1當量)和催化量的鹽酸。回流4小時後，將反應混合物冷卻至室溫並真空濃縮。所得剩餘物以100ml乙酸乙酯稀釋後，用飽和的碳酸氫鈉(水溶液)和鹽水洗滌，再用硫酸鎂乾燥，並真空濃縮以得到產物。藉由管柱層析法進一步純化，得到化合物39。

於本發明說明書中提到的喹唑啉化合物可以含有非芳香族雙鍵和一個或多個不對稱中心，例如：位在連接於中心芳香環的取代基。因此，這些化合物可作為消旋混和物和外消旋混合物、單一對掌異構物、單個非對映立體異構物、非對映體混合物，以及順式或反式異構體形式。所有這些異構體形式都含括在本發明範圍之內。本發明的喹唑啉化合物可具有酸性或鹼性官能基(例如：在取代基上)以形成鹽類，特別是藥學上可接受的鹽類，這種鹽類的形成為製藥工業中的常規做法，此種喹唑啉鹽類亦在本發明的範疇之內。同樣地，其酸性或鹼性基團可以被官能基化，例如形成酯。這樣的官能化衍生物會在體內水解，因此，於本發明中所述的此類喹唑啉化合物衍生物可以作為前驅藥。而前驅藥的形成只涉及常規技能，本領域技術人員無需過多的實驗即可理解如何製備及使用此類前驅藥。

本發明的範圍亦包含：(1)一種醫藥組合物，其包含有效劑量之至少一種本發明之喹唑啉化合物和其藥學上可接受的載體；(2)一種用於治療蛋白激酶相關疾病的方法(例如癌症)，其係透過投予一個體所需有效劑量的此類喹唑啉化合物的方式來達成；以及(3)一種減低至少一種蛋白激酶活性的方法，其係經由本發明之至少一種喹唑啉化合物與至少一種蛋白激酶接觸。

在此術語“蛋白激酶相關的疾病”係指一種有PK活性異常特性之疾病或病症，或是可透過改變至少一PK活性的方式來治療之疾病或病症。異常的PK活性為PK基因表現量提高所引起或是在正常不會發生之情況下表現PK。在此所描述的PK相關疾病，包括但不限於，癌症、糖尿病、過度增殖疾病、腎臟過度增殖性的疾病、腎臟疾病、希佩爾-林道病(von Hippel-Lindau disease)、再生狹窄、纖維變性、牛皮癬、骨關節炎、類風濕性關節炎、發炎性疾病、免疫疾病如自體免疫性疾病(如愛滋病、紅斑狼瘡等)、心血管疾病(如動脈粥狀硬化)和血管增生性疾病如異常血管新生。

術語“治療”意指對於患有蛋白激酶相關疾病或出現病徵的個體，投予喹唑啉化合物，其目的是治愈、恢復、減輕、緩解、改變、矯正、改善、改進、影響或降低疾病的風險、症狀或易罹病的素質。例如，癌症治療，係指治療導致腫瘤生長或腫瘤細胞生長的抑制、腫瘤生長的退化(即，其減低一可檢測腫瘤的大小)，或癌症的消失。

術語“有效劑量”係指於個體中達到預期治療效果所需的活性劑劑量。有效劑量可根據本領域已知技術、給藥途徑、賦形劑的使用，以及可能同時使用其它藥物而有所差異。有效劑量的測定，對於本領域的技術人員來說，無需過度實驗僅需要常規技能，即可確定預定用途的有效劑量。需要治療的個體可為哺乳動物。術語“哺乳動物”是指人類或非人類之哺乳動物，例如：狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠、或小鼠。

可藉由本發明方法所治療的癌症，包括任何異常的細胞或組織的生長，例如：腫瘤，無論是惡性的、前惡性或非惡性的。癌症的特徵在於細胞不受控制的增殖，而該細胞可能侵入或不侵入周圍組織，因此，可能轉移或不轉移至新的身體部位。癌症包括上皮細胞癌，而上皮細胞癌包括鱗狀細胞癌、腺癌、黑色素瘤和肝癌。癌症還包括肉瘤，這是種間質細胞起源的腫瘤；肉瘤包括成骨肉瘤、白血病和淋巴瘤。癌症可以包括一個或多個腫瘤細胞類型。術語“癌症”舉例但不限於，肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳腺癌、***癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、胃癌、腎癌、唾液腺癌、卵巢癌、子宮體癌、子宮頸癌、口腔癌、皮膚癌、腦癌、淋巴瘤和白血病。其亦指抗藥性癌症(包括但不限於多藥耐藥性的癌症)。

本發明所述之化合物可以與放射線療法、免疫療法、單克隆抗體療法、激素療法使用其它藥物的化療及/或手術合併施予哺乳動物。合併治療不需發生在同一時間，可以是連續，或是相互及/或與休息和恢復期交替進行。

於本發明一具體實施例中，治療如癌症等與蛋白激酶有關疾病的方法，包括將一有效劑量之本發明至少一種喹唑啉化合物和至少一種化療藥物施予一哺乳動物。化療藥物的實例包括但不限於在此所述之PK抑制劑，(例如：伊馬替尼甲磺酸鹽(imatinib mesylate)、吉非替尼(gefitinib)、達沙替尼(dasatinib)、埃羅替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、尼羅替尼(nilotinib)、索拉非尼(sorafenib)等；抗體，包括如：賀癌平(trastuzumab)、美羅華(rituximab)、西妥昔單抗(cetuximab)；以及貝伐單抗(bevacizumab)；雙羥蒽醌(mitoxantrone)；糖皮質固醇(dexamethasone)；強的松(prednisone)以及替莫唑胺(temozolomide))，烷化劑(例如：美法崙(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、二甲磺酸丁酯(busulfan)、沙奧特帕(thiotepa)、依弗醯胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、鏈球黴素(streptozocin)、達卡巴仁(decarbazine)、環磷醯胺(cyclophosphamide))，有絲***抑制劑，抗代謝藥(例如：截瘤達(capecitibine)、吉西他濱(gemcitabine)、5-氟尿嘧啶或5-氟尿嘧啶/白葉酸(leucovorin)、福達樂(fludarabine)、***糖基胞嘧啶(cytarabine)、硫醇嘌呤(mercaptopurine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、噴司他丁(pentostatin)、和胺甲基葉酸(methotrexate))，細胞週期抑制劑，酶，激素，抗激素，生長因子抑制劑，植物生物鹼和萜類，拓撲異構酶抑制劑(如：依伊妥普賽(etoposide)、坦尼坡賽(teniposide)、喜樹鹼(camptothecin)、拓撲替康(topotecan)、抗癌妥(irinotecan)、阿黴素(doxorubicin)、道紅鏈絲菌素(daunorubicin))，抗腫瘤抗生素(例如：放線菌素D(actinomycin D)、博來黴素(bleomycin)、絲裂黴素C、阿黴素(adriamycin)、道諾黴素(daunorubicin)、艾達魯比辛(idarubicin)、阿黴素(doxorubicin)和聚乙二醇化脂質體阿黴素)，長春花生物鹼(vinca alkaloids)(例如：長春新鹼(vincristine)和長春鹼(vinblastin)，紫杉烷類(例如：紫杉醇和多烯紫杉醇)，鉑試劑(例如：順氯氨鉑(cisplatin)、卡鉑普來錠(carboplatin)和益樂鉑(oxaliplatin))，沙利度胺(thalidomide)和相關類似物(例如：CC-5013和CC-4047)，單株抗體和抗血管生成劑。

術語“接觸”在此係指利用一方法將本發明之化合物與至少一PK帶引在一起，該化合物可藉由與PK本身作用而直接降低PK的活性，或藉由與另一種和PK活性有關之分子作用而間接降低PK的活性。“接觸”可以發生在體外或體內，例如：將本發明之化合物投予至含至少一PK的試管、具有生長的全細胞的培養皿、或一哺乳動物。以PK為標靶的實例包括但不限於EGFR、CDK1、Aurora A & B激酶、MAP、CDK2、Raf、NEK(包括NEK 4a、NEK 4b、NEK 5與NEK 6)、BUB1、VEGFR、C-MET、HER2、HER3、HER4、IR、IGF-IR、IRR、PDGFRct、PDGFRO、CSFIR、C-Kit、C-fms、Flk-1 R、Flk4、KDRlFlk-1、FLT-1、FLT3、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR4、Src、Frk、Btk、Csk、Abl、ZAP70、Fes、Fps、Fak、Jak、Ack、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr、Aur2和Yrk。

為了實施本發明的方法，上述藥物組合物可以經由口服、腸胃外(parenterally)噴霧吸入、局部表面塗用、直腸、鼻腔、臉頰、***或植入式儲藥槽(implanted reservoir)的方式給藥。術語“腸胃外”包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、脊髓內、患處內和顱內注射或注入技術。於一具體實施例中，本發明之一喹唑啉化合物係經由靜脈注射方式給藥，合適的載體可包括但不限於生理鹽水或磷酸緩衝鹽水(PBS)，以及含有增稠劑和增溶劑之溶液，例如葡萄糖，聚乙二醇溶液和聚丙二醇及其混合物。

無菌可注射組合物，如無菌注射水性或油性懸浮液，可根據本領域中已知技術使用合適的分散劑或潤濕劑(如Tween 80)和懸浮劑來配製。無菌注射製劑亦可以是無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸浮液，例如1,3-丁二醇的溶液形式。於可接受的賦形劑和溶劑之間可採用甘露醇、水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌且無揮發性油常用作為溶劑或懸浮介質(例如：合成的單或雙甘油酯)。脂肪酸(如油酸及其甘油酯衍生物)可用於製備注射劑，天然藥用油，如橄欖油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙烯化型態，同樣可用於注射劑的製備中。這些油溶液或懸浮液也可以含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，或羧甲基纖維素或類似的分散劑。其它常用的界面活性劑(如Tweens、或Spans)或其他類似的乳化劑或常用於製備藥學上可接受的固體、液體或其它劑型的生物利用度增強劑也可以用於製備目的。

用於口服給藥的組合物可以是任何口服可接受的劑型，包括但不限於膠囊、錠劑、乳液和水性懸浮液、分散液和溶液。在用於口服用錠劑的情況下，常用的載體包括乳糖和玉米澱粉。通常還可加入潤滑劑，比如硬脂酸鎂。對於以膠囊形式的口服給藥而言，可用的稀釋劑包括乳糖和乾燥玉米澱粉。當口服施予水性懸浮液或乳劑時，活性成分可懸浮或溶解在與乳化劑或懸浮劑結合之油相中。如果需要，可加入某些甜味劑，調味劑或著色劑。鼻用氣霧劑或吸入組合物可根據藥物製劑領域中眾所熟知的技術來製備。含有喹唑啉化合物之組合物也可以用於直腸給藥的栓塞劑形式投與。

藥物組合物中的載體必須是“可接受的”，即能夠與組合物中的活性成分相容(若能夠使其穩定化更加)且對待治療之個體無害。一種或多種增溶劑(例如環糊精)，其可與有活性的喹唑啉化合物形成更易溶解的複合物可作為遞送活性化合物的藥物載體。其它載體的實例包括膠體二氧化矽、硬脂酸鎂和十二烷基硫酸鈉。

適合的體外測定可用於初步評估本發明之喹唑啉化合物在諸如抑制腫瘤細胞生長的抗癌活性方面的功效。可進一步檢查該等化合物在治療癌症方面的療效。例如：化合物可以施用於具有癌症之動物(例如，小鼠模型)，接著評估其治療效果。亦可基於這些結果來確定適當的劑量範圍和給藥途徑。

無需進一步詳盡說明，以上之描述已經充分地實現本發明。因此，以下的實施例應被解釋為僅是說明性的，而非用以限制本發明之範圍。

實例

示例性之喹唑啉化合物列於表1，其計算出的質量與ESI-MS數據係列於表2中。

生物活性

各種不同式(I)之化合物被用來測試其抑制多種蛋白激酶的能力，不同測定法係簡述如下。

1.B-Raf激酶活性分析

經由定量於欲測試化合物存在下受質納入[³³P]之含量，即可估算出本測試化合物對於激酶活性的抑制能力。標準分析條件分別為5ng之重組B-Raf激酶(Upstate Biotechnology)與500ng MEK1(K97R)溶於測定緩衝液(8μM ATP，0.5μCi[³³P]ATP(比活度3000Ci/mmol，PerkinElmer)中，50mM Tris/HCl(pH 7.5)和1mM EGTA，1mM Na₃VO₄，1% 2-巰基乙醇，0.1% Brij35，和0.2mg/ml BSA)，使其最終體積為25μL。反應液於30℃下作用30分鐘，並藉由加入3%磷酸終止反應，以細胞收集器(ulifilter harvester,PerkinElmer)將產物收集到96孔GF/B微量多孔盤(UniFilter,PerkinElmer)中，並用微板閃爍計數器(TopCount microplate scintillation counter,PerkinElmer)計數。抑制劑的IC₅₀值係經由測試各化合物之3倍連續稀釋濃度而得，並做二重複測試。所得之結果以線性回歸軟體(GraphPad Prism 4；GraphPad Software Inc.)進行分析。

表1所列化合物的抑制活性數據係整理於表3中。IC₅₀值被定義為激酶最大活性被抑制一半時測試化合物的濃度。+表示該濃度為10,000~1,000nM；++表示該濃度為1,000-300nM；和+++表示該濃度小於300nM。

2.B-Raf(V600E)激酶活性分析

經由定量在欲測試化合物存在下其受質納入[³³P]之含量，即可計算此處所揭露之化合物對於激酶的活性抑制。標準分析條件為5ng的重組B-Raf(V600E)激酶(Upstate Biotechnology)與500ng MEK1(K97R)溶於緩衝溶液中(8μM ATP,0.5μCi[³³P]ATP(活度3000Ci/mmol,PerkinElmer),50mM Tris/HCl(pH7.5)，與1mM EGTA,1mM Na₃VO₄,1% 2-mercaptoethanol,0.1% Brij 35，及0.2mg/ml BSA)，和測試化合物(以4% DMSO稀釋)或單獨的DMSO(作為對照組)，其最終反應體積為25μL。在攝氏30℃下反應30分鐘，加入3%磷酸以終止反應。利用細胞收集器(PerkinElmer)將產物收集在96孔GF/B UniFilter(PerkinElmer)，並以TopCount微板閃爍計數器(PerkinElmer)計數放射性強度。抑制劑的IC₅₀值係經由測試各化合物之3倍系列稀釋濃度而得，並重複進行，所得結果以線性回歸軟體(GraphPad Prism 4；GraphPad Software Inc.)分析。

在表1中列出所選化合物的抑制活性數據整理於表4中。IC₅₀值被定義為抑制激酶最大活性的一半時，其測試化合物的濃度。+表示該濃度為10,000~1,000nM；++表示該濃度為1,000-300nM；和+++表示該濃度小於300nM。

3.C-Raf激酶活性分析

經由定量在欲測試化合物存在下其受質納入[³³P]之含量，即可計算此處所揭露之化合物對於激酶的活性抑制。標準分析條件為2ng的重組C-Raf激酶(Upstate Biotechnology)與500ng MEK1(K97R)溶於緩衝液中(8μM ATP,0.5μCi[³³P]ATP(活度3000Ci/mmol,PerkinElmer),50mM Tris/HCl(pH7.5)，與1mM EGTA,1mM Na₃VO₄,1% 2-mercaptoethanol,0.1% Brij 35,and 0.2mg/ml BSA)，和測試化合物(以4% DMSO稀釋)或單獨的DMSO(作為對照組)，使其最終反應體積為25μL。反應在攝氏30℃作用30分鐘，藉由加入3%磷酸以終止反應，利用細胞收集器(PerkinElmer)將產物收集在96孔GF/B UniFilter(PerkinElmer)。並以TopCount微板閃爍計數器(PerkinElmer)計數放射性強度。抑制劑的IC₅₀值係經由各化合物之3倍系列稀釋濃度而得，並重複進行，所得結果使用線性回歸軟體(GraphPad Prism 4；GraphPad Software Inc.)分析。

所選化合物對於抑制C-Raf激酶活性之IC₅₀數據係整理於表5中。IC₅₀值被定義為抑制激酶最大活性的一半時，其測試化合物的濃度。+表示該濃度為10,000~1,000nM；++表示該濃度為1,000~300nM；和+++表示該濃度小於300nM。

4.VEGFR2和EGFR激酶活性分析

喹唑啉是一個眾所周知可用於開發ATP競爭性激酶抑制劑的骨架結構，特別是針對EGFR和VEGFR2激酶。然而，本發明的新穎喹唑啉衍生物意外顯示對Raf激酶具有選擇性地抑制活性，而不會抑制VEGFR2或EGFR激酶，如下所示。

後續顯示VEGFR2、EGFR或Raf激酶抑制的結果。針對VEGFR2或EGFR的抑制活性是通過輻射激酶分析法測定。VEGFR2激酶分析之實驗條件為6.25ng的重組VEGFR2激酶(僅含VEGFR2激酶結構域，Millipore)、5μg之聚(谷氨酸-酪氨酸)受質(4：1，Sigma)、激酶反應緩衝液(20mM MOPS pH7.0，1mM EDTA，5%甘油，0.01% Brij-35，0.1-巰基乙醇，1mg/mL BSA，100μM ATP和0.1μCi/孔之[³³P]ATP(比活性3000Ci/mmol，PerkinElmer公司))，以及試驗化合物(用4%DMSO稀釋)或單獨的DMSO(作為對照)，其最終體積為25μL。於30℃下反應30分鐘，並加入3%磷酸以終止反應，用細胞收集器(PerkinElmer)中收集到96孔GF/B UniFilter(PerkinElmer)中，並用TopCount微板閃爍計數器(PerkinElmer) 計數。

EGFR激酶活性分析的實驗條件為25ng的EGFR激酶(僅含EGFR激酶結構域，Millipore)、3μg的受質poly(Glu-Tyr)(Sigma)、激酶反應緩衝液(10mM MOPS pH7.0，0.3mMEDTA，0.5甘油，0.001% Brij-35，10mM氯化錳，0.1mg/mL BSA，100μM ATP和0.1μCi/孔之[³³P]ATP(比活性3000Ci/mmol，PerkinElmer)和試驗化合物(用4%DMSO稀釋)或DMSO(作為對照)，其最終體積為25μL。於30℃下反應30分鐘，並加入3%磷酸終止反應，用細胞收集器(PerkinElmer)收集到96孔GF/B UniFilter(PerkinElmer)中，並以TopCount微板閃爍計數器(PerkinElmer)計數放射性強度。

所選化合物對於VEGFR2和EGFR激酶的抑制活性結果係整理於表6，其中，該所選化合物對B-Raf激酶的半抑制濃度(IC₅₀)係小於300nM。IC₅₀值被定義為抑制激酶最大活性值的一半時，其測試化合物的濃度。+表示該濃度為3000~1000nM；++表示該濃度為1,000~300nM；+++表示該濃度小於300nM。

如表6所示，相較於VEGFR2或EGFR激酶，新穎的喹唑啉衍生物顯示選擇性地對於Raf激酶具抑制活性。這些化合物對Raf激酶的IC₅₀值皆小於300nM，然而，對於VEGFR2或EGFR激酶的抑制能力較弱，IC₅₀值較高(例如通常大於3μM)。這些新穎喹唑啉化合物意料外的選擇性，顯示可將其應用在需要選擇性控制Raf激酶活性的治療方法中。

5.細胞增殖活性分析(Cell proliferation assay)

如上所述，本發明的化合物可用於治療蛋白激酶有關的疾病或病症。蛋白激酶有關的疾病可以是癌症、糖尿病、腎病、希佩爾-林道綜合症(von Hip-pel-Lindau disease)、纖維化、骨關節炎自體免疫性疾病、或血管增殖性病症。所述癌症可以是肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳腺癌、***癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、胃癌、腎癌、唾腺癌、卵巢癌、子宮體癌、子宮頸癌、口腔癌、皮膚癌、腦腫瘤、淋巴瘤、或白血病。

依照操作手冊使用CellTiter^TM-96分析套組(Promega)，即可測得式(I)化合物對於B-Raf突變的人類癌細胞株(V600E)、A375黑色素瘤細胞和COLO205結腸癌細胞之抑制增殖的活性。簡言之，細胞在37℃、5% CO₂環境下培養於含有10% FCS之DMEM培養基中，細胞以一孔含有2000個細胞之密度鋪灑於96孔盤中，培養24小時。然後將這些細胞用不同濃度的化合物處理，並再培養72小時。於時間終了時，加入CellTiter^TM-96 Aqueous One Solution Reagent(Promega)再培養4小時。使用微量盤樣品測讀機(EMax^® microplate reader,Molecular Devices)測定490nm處的吸光度來測定細胞之存活率，並以GraphPad Prism進行數據處理及分析。受測化合物具有IC₅₀<2μM的抗增殖活性，相關分析結果整理於表7中。

在表7中的數據清楚地顯示，本發明的化合物可以抑制癌細胞生長。因此，這些化合物可用於治療癌症。

雖然本發明已描述有限數量之實施例，本領域之技術人士基於本發明揭示之幫助，可了解在不偏離本說明書所述反為之下能衍生出其他實施例。因此，本發明之範圍應僅受限於本案之申請專利範圍。

Claims

一種式(I)之化合物，或其立體異構物、互變異構物或其藥理上可接受之鹽類，其中：G係選自由下列所組成之群的取代基：其中代表吡啶基，可任選地被一個或多個R⁹取代，其中代表嘧啶基，可任選地被一個或多個R¹⁰取代，其中代表吡唑基，可任選獨立地被R¹²和一個或多個R¹³取代，其中代表***基，可任選獨立地被R¹⁴和一個或多個R¹⁵取代，其中代表示咪唑基，可任選地被一個或多個R¹⁶取代；其中代表嗎啉基，可任選地被一個或多個R¹⁷取代，其中代表吡酮基，可任選地獨立地被R¹⁸和一個或多個R¹⁹取代，其中代表炔基，可任選地被R²⁰取代，其中R⁹為獨立地選自含有氫、鹵素、羥基、胺基、C₁-C₄烷氧基、甲氧基C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄二烷胺基與雜環基之基團；R¹⁰獨立地為氫、羥基或C₁-C₄二烷胺基；R¹¹、R¹³、R¹⁵和R¹⁶獨立地為氫、鹵素或C₁-C₄烷基；R¹²和R¹⁴獨立地為氫、C₁-C₄烷基或C₁-C₄烷醯基；R¹⁷為獨立地選自由氫、鹵素、羥基、胺基、硝基、氫基、C₁-C₄胺基與C₁-C₄烷氧基組成的基團；R¹⁸為選自含有氫與C₁-C₄烷基的基團；R¹⁹為獨立地選自氫、鹵素、羥基、氨基、氰基、C₁-C₄烷基和C₁-C₄烷氧基組成的基團；且R²⁰為選自由氫、C₁-C₄烷基、甲氧基C₁-C₄烷氧基和芳基組成的基團；X為N或CH；L¹係選自由-N(R⁷)-、-O-、-C(S)-、-C(O)-和-S-所組成的基團，其中R⁷為氫或C_1-C₄烷基；L²係選自-N(R⁸)-和-O-，其中R⁸為氫或C₁-C₄烷基；R¹與R²係獨立地選自由氫、鹵素、羥基、胺基、氰基、硝基、羧基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷氧基C₁-C₄烷氧基、N,N-(C_1-C₄二烷基)胺基C₁-C₄烷氧基、N-(C_1-C₄烷基)胺基C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷醯氧基、N-(C₁-C₄烷基)胺基、N,N-(C₁-C₄二烷基)胺基、C₁-C₄烷醯胺基與雜環基所組成之基團，其中C₁-C₄烷基可任選地由一個或多個選自含有氟或氯之基團之取代基取代；R³、R⁴和R⁵為獨立地選自含有氫、氟和氯之基團；並且R⁶係選自含有C₁-C₄烷基與芳基之基團，其中C₁-C₄烷基與芳基可為任選獨立地被一個或多個選自含有鹵素、羥基、胺基、氰基與硝基之基團之取代基取代；當L²為-N(R⁸)-時，R⁶及R⁸與其共同連接的原子，形成一5至6員環基或雜環基。
如申請專利範圍第1項之化合物，其中L²為NH。
如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中L¹為NH。
如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中R⁵為氫。
如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中R³和R⁴為氟。
一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項所述之化合物、其鹽類或其立體異構體；以及藥學上可接受之載體。
如申請專利範圍第1項所述之化合物，其中該化合物是：N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-嗎啉吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(1H-吡唑-4-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(4-氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(7-氟-6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)丙烷-1-磺醯胺；N-(2-氯-4-氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-胺磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)甲烷磺醯胺；N-(2,4-二氟-5-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(吡啶-4-基)喹啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-醯磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(7-氟-6-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,6-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,6-二氟-3-(6-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丁烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)乙烷磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-2-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)苯磺醯胺；N-(3-(7-(2-(二甲胺基)乙胺)-6-(吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)-2,6-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-甲氧吡啶-3-基)喹啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-4-基)喹啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氧代-1,2-二氫吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-甲氧吡啶-3-基)喹啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)-7-甲氧喹唑啉-4-基胺)苯基)苯磺醯胺； N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)-7-(2-甲氧乙氧基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(7-甲氧-6-吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2甲氧吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-氧代-1,6-二氫吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-(2-甲氧乙氧基)吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基氧)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(6-(2-(二甲胺基)乙氧)吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-氟吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-甲氧吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-(2-甲氧乙氧基)吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(6-(2-(二甲胺基)乙氧)吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-(氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-嗎啉吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-嗎啉喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(1H-咪唑-1-基)喹唑啉-4基胺)-2,4-二氟苯)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯)-3-氟丙烷-1-磺醯胺； N-(3-(6-(2-(2-(二甲胺基)乙氧)吡啶-4-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(5-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(1H-苯並[d]咪唑-1-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-羰基)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-乙炔基喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(2-胺嘧啶-5-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(2-(二甲胺基)嘧啶-5-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(1H-1,2,3-***-4-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-((6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基)(甲基)胺)苯基)-N-甲基丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(6-(二甲胺基)吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷磺內醯胺；N-(2,4-二氟-3-(5-氟-6-(2-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(2-氯吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-甲氧-5-硝基吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺； N-(3-(6-(3-胺苯基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(5-胺基-6-甲氧吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(6-胺基吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(6-氰基吡啶-2-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(3-(6-(2-氰基吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(5-(三氟甲基)吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；N-(2,4-二氟-3-(6-(4-氟吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)苯基)丙烷-1-磺醯胺；或N-(3-(6-(6-胺基-5-甲基吡啶-3-基)喹唑啉-4-基胺)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺醯胺。
如申請專利範圍第6項所述之醫藥組合物，其係用於治療蛋白激酶相關疾病。
如申請專利範圍第8項所述之醫藥組合物，其中該蛋白激酶相關疾病為癌症、糖尿病、腎病、希佩爾-林道綜合症(von Hip-pel-Lindau disease)、纖維化、骨關節炎、自體免疫性疾病，或血管增殖性病症。
如申請專利範圍第8項所述之醫藥組合物，其中該蛋白激酶相關疾病為癌症。
如申請專利範圍第10項所述之醫藥組合物，其中該癌症為肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳腺癌、***癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、胃癌、腎癌、唾液腺癌、卵巢癌、子宮體癌、子宮頸癌、口腔癌、皮膚癌、腦癌、淋巴瘤，或白血病。