KR102548229B1

KR102548229B1 - 결정질 fgfr4 억제제 화합물 및 그의 용도

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Publication number: KR102548229B1
Application number: KR1020177032911A
Authority: KR
Inventors: 조지 모니츠; 크리스틴 샌더스; 아라니 찬다; 켄시 요시다; 밍홍 하오; 도미닉 레이놀즈; 수딥 프라자파티; 아난드 셀바라즈; 다카시 사토; 존 왕
Original assignee: 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤
Priority date: 2015-04-14
Filing date: 2016-04-13
Publication date: 2023-06-27
Also published as: SG11201708472WA; EP3283465A1; EP3283465B1; IL254974B; BR112017022243A2; CA2982562C; US20180093972A1; AU2020257131A1; AU2016248056B2; KR20180003559A; US11498916B2; IL254974A0; RU2763328C2; US20200317645A1; RU2017139246A; AU2016248056A1; JP2021050231A; CN107660200A; US10562888B2; WO2016168331A1

Abstract

N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드의 다수의 결정질 형태가 제공된다. 이들은 결정질 유리 염기 형태, 결정질 모노히드로클로라이드 염 형태, 결정질 디히드로클로라이드 염 형태, 및 결정질 에탄술포네이트 염 형태를 포함한다. 결정질 화합물의 제조 및 사용 방법이 또한 제공된다.

Description

결정질 FGFR4 억제제 화합물 및 그의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2015년 4월 14일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/147,313에 대해 우선권을 주장한다. 이 출원은 본원에 참조로 포함된다.

배경 기술

섬유모세포 성장 인자 (FGF)는 다양한 생물학적 활성을 갖는 20종 초과의 구조적으로 관련된 단백질의 패밀리이다. 이들의 주요 수용체인 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGFR1, FGFR2, FGFR3 및 FGFR4)는, FGF에 결합하고 세포 증식 및 분화의 과정에 관여하는 수용체 티로신 키나제의 패밀리이다. FGFR 신호전달 네트워크의 탈조절은 많은 유형의 인간 암을 비롯한 다수의 병리생리학적 상태에 관련이 있다.

"섬유모세포 성장 인자 수용체 4" 또는 "FGFR4"는 증식 및 항아폽토시스를 조절하는 것으로 공지되어 있고, 많은 암에서 발현되거나 또는 고도로 발현된다. 예를 들어, 문헌 [Dieci et al. 2013, Cancer Discovery, 0F1-0F16]을 참고한다. 연구는 FGFR4의 발현이 암의 보다 공격성 표현형을 예측하는 것이고, FGFR4 발현의 녹다운 또는 감소가 증식을 감소시키고 아폽토시스를 촉진하는 작용을 한다는 것을 제시한다. 예를 들어, 문헌 [Wesche et al. 2011, Biochem J 437:199-213]을 참고한다.

예를 들어, FGFR4 발현 또는 과다발현은 위암 (Ye et al. 2011, Cancer, 5304-5313), 전립선암 (Xu et al. 2011, BMC Cancer, 11;84), 육종, 예컨대 횡문근육종 (Taylor VI et al. 2009, J Clin Invest, 119(11):3395-3407), 피부암, 예컨대 흑색종 (Streit et al. 2006, British J Cancer, 94:1879-1886), 간암, 예컨대 담관암종 (Sia et al. 2013, Gastroenterology 144:829-840), 및 간세포성 암종 (French et al. 2012, PLoS ONE 7(5): e367313; Miura et al. 2012, BMC Cancer 12:56; Chiang et al. 2008, Cancer Res 68(16):6779-6788; Sawey et al. 2011, Cancer Cell 19:347-358), 췌장암, 예컨대 췌장 상피내 신생물 및 췌장관 선암종 (Motoda et al. 2011, Int'l J Oncol 38:133-143), 폐암, 예컨대 비소세포 폐암 (Fawdar et al. 2013, PNAS 110(30):12426-12431), 결장직장암 (Pelaez-Garcia et al. 2013, PLoS ONE 8(5): e63695; Barderas et al. 2012, J Proteomics 75:4647-4655), 및 난소암 (Zaid et al. 2013, Clin Cancer Res 19:809-820)에서의 암 공격성과 연관된다.

여러 FGFR 억제제의 임상 개발은 항종양제로서의 그의 유용성을 확인하였다. 문헌 [Dieci et al. 2013, Cancer Discovery, 0F1-0F16]. 그러나, FGFR, 특히 FGFR4를 표적화하는데 유용한 새로운 작용제가 필요하다.

게다가, 제약 제품의 제조에서, 화합물은 편리하게 조작 및 가공될 수 있는 형태로 있어야 한다. 이와 관련하여, 활성 화합물의 화학적 안정성 및 물리적 안정성은 중요한 고려사항이다. 바람직하게는, 화합물 및 이를 함유하는 제약 조성물은 물리-화학적 특징에서 유의한 변화를 나타내지 않으면서 장기간에 걸쳐 효과적으로 저장될 수 있다.

본 발명의 실시양태는 하기 화합물의 결정질 형태를 제공할 수 있다:

일부 실시양태에서, 예를 들어, 결정질 형태는 유리 염기 형태, 히드로클로라이드 염 형태, 모노히드로클로라이드 염 형태, 디히드로클로라이드 염 형태 또는 에탄술포네이트 염 형태일 수 있다.

실시양태는 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 (화합물 108)의 결정질 유리 염기 형태를 제공할 수 있다:

일부 실시양태에서, 결정질 유리 염기 형태 화합물은 분말 X선 회절 (PXRD) 스펙트럼에서 2θ°의 하기 값 범위의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 피크를 제공한다: 7.8-8.2; 10.1-10.5; 14.6-15.0; 16.3-16.7; 16.9-17.3; 및 21.6-22.0. 예를 들어, 화합물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 2θ° (± 0.2 °)의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 값을 나타낼 수 있다: 8.0, 10.3, 14.8, 16.5 17.1 및 21.8. 일부 실시양태에서, 결정질 유리 염기 화합물은 실질적으로 도 5에 나타난 바와 같은 PXRD 패턴을 특징으로 한다 (도 5). 일부 실시양태에서 화합물의 결정질 유리 염기 형태는 분말 X선 회절 스펙트럼에서 2θ° (±0.2)의 하기 범위에서의 피크를 제공한다: 적어도 10.3, 8.0 및 9.5; 적어도 10.3, 8.0, 9.5, 14.8, 16.5 및 17.1; 또는 적어도 10.3, 8.0, 9.5, 14.8, 16.5, 17.1, 19.3, 21.8, 23.7 및 24.5.

일부 실시양태에서, 결정질 유리 염기 형태는 실질적으로 도 7에 나타난 바와 동일한 시차 주사 열량측정 (DSC) 곡선을 특징으로 한다 (도 7).

일부 실시양태에서, 결정질 유리 염기 형태 화합물은 실질적으로 도 10에 나타난 바와 같은 ¹³C NMR을 특징으로 한다 (도 10).

일부 실시양태는 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 염인 화합물을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 염은 분말 X선 회절 스펙트럼에서 2θ° (±0.2)의 하기 범위에서의 피크를 제공한다: 적어도 26.6, 19.9 및 11.3; 적어도 26.6, 19.9, 11.3, 9.0, 23.5 및 25.4; 또는 적어도 26.6, 19.9, 11.3, 9.0, 23.5, 25.4, 27.6, 23.0, 18.1 및 29.0. 일부 실시양태에서, 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 염은 실질적으로 도 13에 나타난 바와 같은 PXRD 스펙트럼을 특징으로 한다 (도 13).

일부 실시양태에서, 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 염은 실질적으로 도 11에 나타난 바와 같은 ¹³C NMR을 특징으로 한다 (도 11).

일부 실시양태는 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드 염의 결정질 형태인 화합물을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드 염은 분말 X선 회절 스펙트럼에서 2θ° (±0.2)의 하기 범위에서의 피크를 제공한다: 적어도 26.6, 22.8 및 21.3; 적어도 26.6, 22.8, 21.3, 8.0, 26.2 및 13.5; 또는 적어도 26.6, 22.8, 21.3, 8.0, 26.2, 13.5, 12.4, 16.1, 28.0 및 18.7. 일부 실시양태에서, 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드 염은 실질적으로 도 16에 나타난 바와 같은 PXRD 스펙트럼을 특징으로 한다 (도 16).

일부 실시양태에서, 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드 염은 실질적으로 도 14에 나타난 바와 같은 ¹³C NMR을 특징으로 한다 (도 14).

실시양태는 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트 염의 결정질 형태인 화합물을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트 염은 분말 X선 회절 스펙트럼에서 2θ° (±0.2)의 하기 범위에서의 피크를 제공한다: 적어도 19.2, 15.1 및 23.3; 적어도 19.2, 15.1, 23.3, 20.3, 11.2 및 21.8; 또는 적어도 19.2, 15.1, 23.3, 20.3, 11.2, 21.8, 9.4, 22.4, 23.6 및 24.0. 일부 실시양태에서, 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트 염은 실질적으로 도 19에 나타난 바와 같은 PXRD 스펙트럼을 특징으로 한다 (도 19).

일부 실시양태에서, 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트 염은 실질적으로 도 17에 나타난 바와 같은 ¹³C NMR을 특징으로 한다 (도 17).

추가적 목적은 본원에 기재된 바와 같은 결정질 형태 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 경구 또는 비경구 투여를 위해 제제화된다.

추가적 목적은 하기 화합물의 결정질 유리 염기 형태의 제조 방법이다.

이러한 방법은 하기 단계의 하나 이상을 포함할 수 있다: a) 용매 중 하기 화합물을 포함하는 조성물을 제공하는 단계:

, 여기서 X는 (2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸이다;

b) 조성물의 온도를 ≤ 50℃ (예를 들어, ≤ 30, 20, 또는 15℃)에서 유지하는 정도의 비율로 상기 조성물에 산을 첨가하는 단계;

c) 단계 b)에서 형성된 조성물을 가온 (예를 들어, 실온으로)하는 것을 허용하는 단계; 및 이어서

d) 조성물을 포화 수산화암모늄 용액 (예를 들어, 차가운, 예컨대 0-5℃)에, 조성물의 온도를 ≤ 25℃에서 유지하는 정도의 비율로 첨가하는 단계; 및 이어서

e) 조성물을 불혼화성 용매 (예를 들어, 디클로로메탄/메탄올)의 혼합물로 추출하여 유기 상을 형성하는 단계; 및

f) 적합한 용매를 유기 상에 첨가하여, 이로써 상기 화합물의 결정질 유리 염기 형태를 형성하는 단계.

추가적 목적은 간세포성 암종의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 결정질 형태 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 간세포성 암종을 치료하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 간세포성 암종은 변경된 FGFR4 및/또는 FGF19 상태 (예를 들어, FGFR4 및/또는 FGF19의 증가된 발현)를 갖는다.

추가적 목적은 간세포성 암종의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간세포성 암종을 치료하는 방법이며, 하기를 포함한다: 상기 간세포성 암종의 세포를 함유하는 생물학적 샘플에서 변경된 FGFR4 및/또는 FGF19 상태 (예를 들어, FGFR4 및/또는 FGF19의 증가된 발현)를 검출하고, 상기 간세포성 암종이 상기 변경된 FGFR4 및/또는 FGF19 상태를 갖는 경우, 본원에 기재된 바와 같은 결정질 형태 화합물을 상기 대상체에게 치료-유효량으로 투여한다.

추가적 목적은 간세포성 암종의 치료 방법에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 결정질 형태 화합물의 용도이다.

추가적 목적은 간세포성 암종의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 결정질 형태 화합물의 용도이다.

도 1은 HUH7 세포를 사용하는 간세포성 암종 모델에서의 생체내 효능 시험의 결과를 나타낸다. 화합물 108 (25 mg/kg 또는 37.5 mg/kg) 또는 비히클 대조군은 복강내 주사를 통해 투여되었고, 종양 부피는 15일의 과정에 걸쳐 매주 2회 측정되었다.
도 2는 HEP3B 세포를 사용하는 간세포성 암종 모델에서의 생체내 효능 시험의 결과를 나타낸다. 화합물 108 (12.5 mg/kg, 25 mg/kg 또는 37.5 mg/kg) 또는 비히클 대조군은 복강내 주사를 통해 투여되었고, 종양 부피는 15일의 과정에 걸쳐 매주 2회 측정되었다.
도 3은 JHH7 세포를 사용하는 간세포성 암종 모델에서의 생체내 효능 시험의 결과를 나타낸다. 화합물 108 (12.5 mg/kg, 25 mg/kg 또는 37.5 mg/kg) 또는 비히클 대조군은 복강내 주사를 통해 투여되었고, 종양 부피는 15일의 과정에 걸쳐 매주 2회 측정되었다.
도 4는 HEP3B 세포를 사용하는 간세포성 암종 모델에서의 비교 생체내 효능 시험의 결과를 나타낸다. 화합물 108 (25 mg/kg, 37.5 mg/kg 또는 50 mg/kg)은 복강내 주사를 통해 1일 2회 투여되거나, 또는 BGJ398 (30 mg/kg 또는 60 mg/kg)은 경구로 1일 2회 투여되었다.
도 5는 화합물 108의 결정질 유리 염기 형태로부터 수득된 PXRD 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 3개의 로트로부터의 화합물 108의 결정질 유리 염기 형태의 PXRD 스펙트럼 오버레이를 나타낸다.
도 7은 화합물 108의 결정질 유리 염기 형태에 대한 DSC 곡선을 나타낸다.
도 8은 화합물 108의 결정질 유리 염기 형태의 3개의 로트에 대한 DSC 곡선의 오버레이를 나타낸다.
도 9a-9d는 화합물 108의 구조와 일치하는 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 화합물 108의 결정질 유리 염기 형태의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 11은 본원의 실시예 10에서 수득된 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 (즉, 화합물 108의 결정질 모노히드로클로라이드 염 형태)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 본원의 실시예 10에서 수득된 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은 본원의 실시예 10에서 수득된 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드로부터 수득된 PXRD 스펙트럼을 나타낸다.
도 14는 본원의 실시예 13에서 수득된 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드 (즉, 화합물 108의 결정질 디히드로클로라이드 염 형태)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 15는 본원의 실시예 13에서 수득된 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 16은 본원의 실시예 13에서 수득된 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드로부터 수득된 PXRD 스펙트럼을 나타낸다.
도 17은 본원의 실시예 16에서 수득된 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트 (즉, 화합물 108의 결정질 에탄술포네이트 염 형태)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 18은 본원의 실시예 16에서 수득된 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 19는 본원의 실시예 16에서 수득된 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트로부터 수득된 PXRD 스펙트럼을 나타낸다.

하기 화합물의 결정질 형태가 본원에 제공된다:

, 이는 선택적 FGFR4 억제제로서 유용하다.

일부 실시양태에서, 결정질 화합물은 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드의 유리 염기 형태이다. 결정질 유리 염기 형태의 한 실시양태는 분말 X선 회절 (PXRD) 스펙트럼에서 2θ°의 하기 값 범위에서의 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 피크를 제공한다: 7.8-8.2; 10.1-10.5; 14.6-15.0; 16.3-16.7; 16.9-17.3; 및 21.6-22.0. 예를 들어 결정질 유리 염기 형태 화합물은 2θ° (± 0.2 °)의 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 값을 나타낼 수 있다: 8.0, 10.3, 14.8, 16.5 17.1 및 21.8. 일부 실시양태에서, 결정질 유리 염기 화합물은 실질적으로 도 5에 나타난 바와 같은 PXRD 패턴을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서 화합물의 결정질 유리 염기 형태는 분말 X선 회절 스펙트럼에서 2θ° (±0.2)의 하기 범위에서의 피크를 제공한다: 적어도 10.3, 8.0 및 9.5; 적어도 10.3, 8.0, 9.5, 14.8, 16.5 및 17.1; 또는 적어도 10.3, 8.0, 9.5, 14.8, 16.5, 17.1, 19.3, 21.8, 23.7 및 24.5.

일부 실시양태에서, 결정질 유리 염기 형태는 실질적으로 도 7에 나타난 바와 동일한 시차 주사 열량측정 (DSC)을 특징으로 한다.

일부 실시양태는 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 염인 화합물을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 염은 분말 X선 회절 스펙트럼에서 2θ° (±0.2)의 하기 범위에서의 피크를 제공한다: 적어도 26.6, 19.9 및 11.3; 적어도 26.6, 19.9, 11.3, 9.0, 23.5 및 25.4; 또는 적어도 26.6, 19.9, 11.3, 9.0, 23.5, 25.4, 27.6, 23.0, 18.1 및 29.0. 이러한 한 실시양태는 도 13에 나타난 바와 같은 PXRD 스펙트럼을 가질 수 있다.

일부 실시양태는 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드 염의 결정질 형태인 화합물을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드 염은 분말 X선 회절 스펙트럼에서 2θ° (±0.2)의 하기 범위에서의 피크를 제공한다: 적어도 26.6, 22.8 및 21.3; 적어도 26.6, 22.8, 21.3, 8.0, 26.2 및 13.5; 또는 적어도 26.6, 22.8, 21.3, 8.0, 26.2, 13.5, 12.4, 16.1, 28.0 및 18.7. 이러한 한 실시양태는 도 16에 나타난 바와 같은 PXRD 스펙트럼을 가질 수 있다.

실시양태는 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트 염의 결정질 형태인 화합물을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트 염은 분말 X선 회절 스펙트럼에서 2θ° (±0.2)의 하기 범위에서의 피크를 제공한다: 적어도 19.2, 15.1 및 23.3; 적어도 19.2, 15.1, 23.3, 20.3, 11.2 및 21.8; 또는 적어도 19.2, 15.1, 23.3, 20.3, 11.2, 21.8, 9.4, 22.4, 23.6 및 24.0. 이러한 한 실시양태는 도 19에 나타난 바와 같은 PXRD 스펙트럼을 가질 수 있다.

본원에 사용된, 데이터, 예컨대 스펙트럼과 관련하여 "실질적으로 나타낸 바와 같음.", "실질적으로 동일한", 또는 "실질적으로 나타낸 바와 같은"은, 통상의 기술자가 데이터의 동일한 수집 방법을 사용하여 수득한 이러한 스펙트럼과 비교했을 때 (예를 들어, 예컨대 도 6에 나타난 바와 같은), 스펙트럼이 본원에 교시된 바와 같은 화합물의 결정질 유리 염기 형태를 나타내기에 충분히 유사하다고 결론지을 수 있는 것을 의미한다.

화합물의 합성 및 결정화 방법이 본원에 교시된 바와 같이 제공된다. 결정질 유리 염기 형태에 대하여, 방법은 하기 단계의 하나 이상을 포함할 수 있다: a) 용매 중 하기 화합물을 포함하는 조성물을 제공하는 단계:

, 여기서 X는 (2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸이다;

f) 적합한 용매를 유기 상에 첨가하여 이로써 상기 화합물의 결정질 유리 염기 형태를 형성하는 단계.

본원에 보고된 바와 같은 결정질 화합물은 제약상 허용되는 담체와 조합하여 그의 제약 제제를 제공할 수 있다. 담체 및 제제의 특정 선택은 조성물이 의도되는 특정한 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 일부 실시양태에서, 담체는 투여 전에 화합물의 결정질 형태를 유지하도록 선택된다.

본원에서 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는 담체"는 함께 제제화되는 화합물의 약리학적 활성을 파괴하지 않는 무독성 담체, 아주반트 또는 비히클을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 화합물의 결정질 유리 염기 형태를 유지하도록 선택된다. 제약상 허용되는 담체, 아주반트 또는 비히클은 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물은 비경구, 경구, 흡입 스프레이, 국소, 직장, 비강, 협측, 질 또는 이식 저장소 투여 등에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 천연 또는 비-천연 공급원으로부터의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제 또는 담체는 멸균 형태로 제공될 수 있다. 멸균 담체의 비제한적인 예에는 무-내독소수 또는 무-발열원수가 포함된다.

본원에 사용된 용어 "비경구적"은 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 수막강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 특정의 실시양태에서, 화합물은 정맥내로, 경구로, 피하로, 또는 근육내 투여에 의해 투여된다. 본 발명의 조성물의 멸균 주사가능한 형태는 수성 또는 유질 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 관련 기술분야에 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 또한 비독성의 비경구로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다.

이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 포함한 임의의 무자극 고정 오일이 이용될 수 있다. 지방산 및 그의 글리세리드 유도체가 주사제의 제조에 유용하고, 특히 그의 폴리옥시에틸화 버전에서 천연 제약상 허용되는 오일, 예컨대 올리브 오일 또는 피마자 오일도 유용하다. 이러한 오일 용액 또는 현탁액은 또한, 장쇄 알콜의 희석제 또는 분산제, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로스 또는 제약상 허용되는 투여 형태 (에멀젼 및 현탁액제 포함)의 제제에 통상적으로 사용되는 유사한 분산제를 함유할 수 있다. 다른 통상적으로 사용되는 계면활성제, 예컨대 제약상 허용되는 고체, 액체, 또는 다른 투여 형태의 제조시에 통상적으로 사용되는 트윈(Tween), 스판(Span) 및 다른 유화제는 또한 제제화 목적을 위해 사용될 수도 있다.

경구 투여를 위해, 화합물 또는 염은 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하나 이에 제한되지는 않는 허용되는 경구 투여 형태로 제공될 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우, 통상적으로 사용되는 담체에는 락토스 및 옥수수 전분이 포함된다. 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트가 또한 첨가될 수 있다. 캡슐 형태로의 경구 투여의 경우에, 유용한 희석제는 락토스 및 건조된 옥수수 전분을 포함한다. 경구 사용을 위해 수성 현탁액이 필요한 경우에, 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 목적하는 경우에, 특정 감미제, 향미제 또는 착색제가 또한 첨가될 수 있다. 또한 보존제가 또한 첨가될 수 있다. 제약상 허용되는 보존제의 적합한 예는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대 용매, 예를 들어 에탄올, 프로필렌 글리콜, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 4급 암모늄 염 및 파라벤 (예컨대 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤 등)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

대상 및 사용 방법

본원에 교시된 바와 같은 화합물의 결정질 형태는 간세포성 암종을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

"치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애를 역전시키거나, 완화시키거나, 그의 개시를 지연시키거나, 그의 진행을 억제하거나 또는 개선시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료는 1종 이상의 증상이 발생된 후에 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료는 증상의 부재 하에 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 (예를 들어, 증상의 병력에 비추어 및/또는 유전적 또는 다른 감수성 요인에 비추어) 증상의 발병 이전에 감수성 개체에게 투여될 수 있다. 치료는, 증상이 해소된 후에, 예를 들어 그의 재발을 예방 또는 지연시키기 위해 또한 계속될 수 있다.

본원에 사용된 "환자" 또는 "대상체"는 동물 대상체, 바람직하게는 포유동물 대상체, 및 특히 인간 대상체 (남성 및 여성 대상체 둘 다 포함, 및 신생아, 유아, 소아, 청소년, 성인 및 노인 대상체 포함)를 의미한다. 대상체는 또한 실험실 또는 수의학적 목적을 위해, 다른 포유동물 대상체 (예를 들어, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 원숭이, 조류 등)를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 치료는 변경된 FGFR4 및/또는 FGF19 (섬유모세포 성장 인자 19) 상태를 갖는 간세포성 암종을 갖는 대상체에게 제공된다.

일부 실시양태에서, 치료는 FGFR4 및/또는 FGF19 상태를 상기 간세포성 암종의 세포를 함유하는 생물학적 샘플에서 분석하고, 상기 간세포성 암종이 FGFR4 및/또는 FGF19 변경을 나타내는 경우에, 대상체를 치료 유효량의 본원에 기재된 활성제로 치료하는 것을 함께 포함하거나 또는 함께 수행될 수 있다.

FGFR4 및/또는 FGF19와 관련하여 본원에 사용된 "변경된 상태"는, 상응하는 비-암성 조직과 비교하여, 돌연변이의 결과로서 그의 증가된 발현 (예를 들어 증가된 수준의 mRNA 또는 증가된 수준의 단백질), 게놈의 증가된 카피 수, 및/또는 코딩된 단백질의 증가된 활성 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, FGFR4 및/또는 FGF19의 변경된 상태는, 활성 증가를 유발하거나 또는 다르게는 간세포성 암종의 보다 공격성 형태와 연관된 유전자 및/또는 코딩 단백질 돌연변이를 포함한다.

FGFR4 및/또는 FGF19의 "발현"은 이를 코딩하는 유전자를 전사, 바람직하게는 번역하는 것을 의미한다. 전형적으로, 코딩 영역의 발현은 코딩된 폴리펩티드의 생산을 결과로 할 것이다.

FGFR4 및 FGF19 단백질은 공지되어 있고, 이들의 변경된 상태 및/또는 발현은 관련 기술분야에서의 기술, 예를 들어 돌연변이 또는 카피수 이상, 예컨대 핵산 증폭의 게놈 분석, 서열 분석, 및/또는 혼성화-기반 기술, RNA 발현 분석, 예컨대 노던 블롯 또는 qRT-PCR, 웨스턴 블롯 또는 다른 이뮤노블롯 또는 면역검정, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 등을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에 기재된 발명이 보다 완전하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 실시예를 제시한다. 이들 실시예는 단지 예시적 목적을 위한 것이고 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예

실시예 1: 하기의 합성을 위한 절차:

일반사항:

마이크로파 가열은 바이오티지 엠리스 리버레이터(Biotage Emrys Liberator) 또는 이니시에이터(Initiator) 마이크로파를 사용하여 행하였다. 칼럼 크로마토그래피는 이스코(Isco) Rf200d를 사용하여 수행하였다. 용매 제거는 부치(Buechi) 회전식 증발기 또는 제네박(Genevac) 원심 증발기를 사용하여 수행하였다. 제조용 LC/MS는 산성 이동상 상태 하에 워터스(Waters) 자동정제기 및 19 x 100 mm 엑스테라(XTerra) 5 마이크로미터 MS C18 칼럼을 사용하여 수행하였다. NMR 스펙트럼은 배리안(Varian) 400MHz 분광계를 사용하여 기록하였다. 분석 질량 스펙트럼 (MS) 결과는 단일 사중극자 MS 검출기 (워터스 SQD)가 구비된 워터스 액퀴티(Waters Acquity) UPLC를 사용하여 수득하였다.

정제를 위한 정제용 HPLC 조건

크로마토그래피 조건:

기기: 워터스 2767-SQD 매스 트리거 정제용 시스템

칼럼: 워터스 엑스브리지(Waters Xbridge) C18 150mm*19mm*5μm

검출기: VWD SQD

유량: 15 mL/분

구배 시간:

대표적인 이동상:

1)

이동상: A: 물 중 0.1%TFA

이동상: B: ACN

2)

이동상: A: 물 중 0.1%NH₄HCO₃

이동상: B: ACN

3)

이동상: A: 물 중 0.1%NH₄OAc

이동상: B: ACN

4)

이동상: A: 물 중 0.1%NH₄OH

이동상: B: ACN

정의: 하기 약어는 하기 나타낸 의미를 갖는다:

ACN: 아세토니트릴

Boc₂O: 디-tert-부틸 디카르보네이트

Brettphos: 2-(디시클로헥실포스피노)-3,6-디메톡시-2',4',6'-트리이소프로필-1,1'-비페닐

tBuONa: 소듐 tert-부톡시드

CH₃I: 아이오도메탄

Cs₂CO₃: 탄산세슘

DCC: N,N'-디시클로헥실카르보디이미드

DCM: 디클로로메탄

DIEA: N,N-디이소프로필에틸아민

DIPEA: N,N-디이소프로필에틸아민

DMAP: 4-(디메틸아미노)피리딘

DME: 디메틸 에테르

DMF: 디메틸포름아미드

DMSO: 디메틸 술폭시드

EGTA: 에틸렌 글리콜 테트라아세트산

ESI-MS: 전기분무 이온화 - 질량 분광측정법

EtOH: 에탄올

HATU: 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트

H₂SO₄: 황산

iPrOH: 이소프로판올

K₂CO₃: 탄산칼륨

KHMDS: 포타슘 비스(트리메틸실릴)아미드

KOH: 수산화칼륨

LCMS: 액체 크로마토그래피 - 질량 분광측정법

MeOH: 메탄올

MsCl: 메탄술포닐 클로라이드

NaBH₃CN: 소듐 시아노보로히드라이드

NaBH(OAc)₃: 소듐 트리아세톡시보로히드라이드

NH₄Cl: 염화암모늄

NH₄HCO₃: 중탄산암모늄

NaI: 아이오딘화나트륨

NaNO₃: 질산나트륨

NaOAc: 아세트산나트륨

MTBE: 메틸 tert-부틸 에테르

nBuOH: n-부탄올

정제용 HPLC: 정제용 고성능 액체 크로마토그래피

정제용 TLC: 정제용 박층 크로마토그래피

TBAF: 테트라부틸암모늄 플루오라이드

TBDMS-CL: tert-부틸디메틸실릴 클로라이드

TBSCl: tert-부틸디메틸실릴 클로라이드

TBSOTf: tert-부틸디메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트

TEA: 트리에틸아민

TESCl: 클로로트리에틸실란

TFA: 트리플루오로아세트산

THF: 테트라히드로푸란

Ti(OⁱPr)₄: 티타늄 이소프로폭시드

TLC: 박층 크로마토그래피

PPTS: 피리디늄 p-톨루엔술포네이트

PE: 석유 에테르

PEG: 폴리(에틸렌 글리콜)

PtO₂: 이산화백금

EtOAc: 에틸 아세테이트

Pd/C: 탄소 상의 팔라듐 (0)

Pd₂(dba)₃: 트리스(디벤질리덴아세톤) 디팔라듐(0)

Pd(dppf)₂Cl₂: [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)

Ruphos: 2-디시클로헥실포스피노-2',6'-디이소프로폭시비페닐

Xantphos: 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸크산텐

명세서 및 청구항에서 사용된 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥적으로 달리 지시되지 않는 한 복수에 대한 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "HCl 염"에 대한 언급은 모노히드로클로라이드 염, 디히드로클로라이드 염, 1.5 히드로클로라이드 염 및 다른 화학량론적 및 비화학량론적 히드로클로라이드 염을 참조한다.

N-[2-{6-[3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시-페닐)-1-메틸-우레이도]-피리미딘-4-일아미노}-5-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐]-아크릴아미드메탄

a. tert-부틸 4-브로모-2-니트로페닐카르바메이트

THF (50 mL) 중 4-브로모-2-니트로아닐린 (4 g, 18.4 mmol), (Boc)₂O (4.4 g, 20.24 mmol)의 혼합물을 밤새 환류 하에 가열하였다. 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 PE:EtOAc = 20:1로 용리시키면서 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (5.4 g, 수율: 93%)을 수득하였다. MS (ESI): 317, 319 [M+H]⁺.

b. tert-부틸 4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로페닐카르바메이트

톨루엔 (85 mL) 중 tert-부틸 4-브로모-2-니트로페닐카르바메이트 (5.4 g, 17 mmol), 1-에틸피페라진 (2.91 g, 25.5 mmol), Pd₂(dba)₃ (2.1 g, 3.4 mmol), xantphos (3.92 g, 6.8 mmol) 및 Cs₂CO₃ (11.1 g, 34 mmol)의 탈기된 혼합물을 4시간 동안 100℃에서 가열하였다. 반응물을 농축시키고, 잔류물을 MeOH: DCM = 1:50~1:20으로 용리시키면서 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (3.3 g, 수율: 55%)을 수득하였다. MS (ESI): 351 [M+H]⁺.

c. 4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로아닐린

DCM (50 mL) 중 tert-부틸 4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로페닐카르바메이트 (3.3 g, 9.43 mmol)의 용액에 0℃에서 TFA (20 mL)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 모든 휘발물을 진공 하에 제거한 후에, 잔류물을 DCM 중에 재용해시키고, 포화 수성 K₂CO₃으로 중화시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 추출물을 농축시켜 표제 화합물 (2.1 g, 수율: 90%)을 수득하였으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.02 (t, 3H), 2.36 (q, 2H), 2.47-2.49 (m, 4H) 2.97-3.00 (m, 4H), 6.97 (d, 1H), 7.20 (s, 2H), 7.25 (s, 1H), 7.34 (dd, 1H); MS (ESI): 251 [M+H]⁺.

d. N⁴-(4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로페닐)-N⁶-메틸피리미딘-4,6-디아민

톨루엔 (45 mL) 중 4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로아닐린 (2.1 g, 8.4 mmol), 6-클로로-N-메틸피리미딘-4-아민 (절차 2A, 단계 e; 1.2 g, 8.4 mmol), Pd₂(dba)₃ (1.54 g, 1.68 mmol), xantphos (1.94 g, 3.36 mmol) 및 Cs₂CO₃ (5.48 g, 16.8 mmol)의 탈기된 혼합물을 1시간 동안 100℃에서 가열하였다. 반응물을 농축시키고, 잔류물을 MeOH: DCM = 1:40~1:20으로 용리시키면서 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (870 mg, 수율: 29%)을 수득하였다. MS (ESI): 358 [M+H]⁺.

e. 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-(6-(4-(4-에틸피페라진-1-일)-2- 니트로페닐아미노)피리미딘-4-일)-1-메틸우레아

THF (15 mL) 중 N⁴-(4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로페닐)-N⁶-메틸피리미딘-4,6-디아민 (870 mg, 2.44 mmol)의 용액에 0℃에서 NaH (60%, 200 mg, 5 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. THF 중 2,4-디클로로-3-이소시아네이토-1,5-디메톡시-벤젠 (절차 2A, 단계 a-d; 908 mg, 3.66 mmol)의 용액을 0℃에서 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 포화 수성 NH₄Cl 용액 (2 mL)을 첨가하여 반응물을 켄칭하였다. 혼합물을 농축시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 추출물을 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 조 생성물을 수득하였으며, 이를 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (330 mg, 수율: 21%)을 적색 오일로서 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.44 (t, 3H), 3.01 (t, 2H), 3.21 (q, 2H), 3.41-3.49 (m, 5H), 3.73-3.80 (m, 4H), 3.92 (s, 6H), 6.27 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 7.25 (d, 1H), 7.69 (s, 1H), 8.32 (d, 1H), 8.52 (s, 1H), 10.28 (br s, 1H), 12.05 (br s, 1H); MS (ESI): 605 [M+H]⁺.

f. 1-(6-(2-아미노-4-(4-에틸피페라진-1-일)페닐아미노)피리미딘-4-일)-3-(2,6-디클로로-3,5- 디메톡시페닐)-1-메틸우레아

THF (20 mL) 및 MeOH (20 mL) 중 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-(6-(4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로페닐아미노)피리미딘-4-일)-1-메틸우레아 (330 mg, 0.546 mmol)의 용액에 실온에서 라니-Ni (물 중 현탁액)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 3시간 동안 수소 분위기 (1 atm) 하에 교반하였다. 반응물을 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 MeOH로 2회 세척하여 표제 화합물 (280 mg, 순도: 90%)을 수득하였으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다. MS (ESI): 575 [M+H]⁺.

g. N-(2-(6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일아미노)-5-(4- 에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드

THF (30 mL) 중 1-(6-(2-아미노-4-(4-에틸피페라진-1-일)페닐아미노)피리미딘-4-일)-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레아 (280 mg, 순도: 90%, 0.44 mmol)의 용액에 THF 중 아크릴로일 클로라이드의 용액 (20 mg/mL, 2 mL, 0.44 mmol)을 -10℃에서 첨가하고, 생성된 혼합물을 이 온도에서 1시간 동안 교반하였다. MeOH (1 mL)를 첨가하여 반응물을 켄칭하였다. 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 정제용 HPLC 및 정제용 TLC에 의해 정제하여 표제 화합물 108 (20 mg, 수율: 7%)을 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.31 (t, 3H), 2.65 (q, 2H), 2.62-2.68 (m, 4H), 3.27 (s, 3H), 3.36-3.38 (m, 4H), 3.91 (s, 6H), 5.76 (d, 1H), 5.90 (s, 1H), 6.24 (dd, 1H), 6.41 (d, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.74 (dd, 1H), 7.07 (br s, 1H), 7.23 (d, 1H), 7.72 (br s, 1H), 7.98 (br s, 1H), 8.37 (s, 1H), 12.52 (s, 1H); MS (ESI): 629 [M+H]⁺.

실시예 2: 생물학적 활성의 검정

FGFR4에 대한 결합의 검정. 정제된, 재조합 FGFR4를 밤새 4℃에서 또는 1시간 동안 실온에서 10 μM 화합물과 함께 예비-인큐베이션하였다. 예비-인큐베이션 후에, 옵티-트랩(OPTI-TRAP) 단백질 농축 및 탈염 C4 칼럼 (옵티마이즈 테크놀로지스(Optimize Technologies)) 상에서 FGFR4를 농축시키고, 완충제를 교체하였다. 단백질을 0.1% 포름산을 함유하는 아세토니트릴 중에 용리시키고, 써모 사이언티픽 Q 엑스액티브 (Thermo Scientific Q Exactive)^TM LCMS 상에서 직접 주입에 의해 진행시켜 변형된, 무손상 FGFR4를 확인하였다.

하기 표 1에 제공된 결과는 펩티드-리간드 부가물의 예상 질량과 관측 질량과의 상응성에 따라 시험된 화합물과 펩티드와의 공유 부가물 형성을 확인하였다.

표 1

키나제 활성 억제의 IC₅₀ 프로파일링. 화합물을 그의 키나제 핫스팟(HotSpot)^SM 검정을 사용하여 리액션 바이올로지 코포레이션(Reaction Biology Corporation) (말번, 펜실베니아주)에서 FGFR 억제 활성에 대해 프로파일링하였다. 문헌 [Anastassiadis et al., 2011, Comprehensive assay of kinase catalytic activity reveals features of kinase inhibitor selectivity. Nat Biotechnol 29, 1039-1045]을 참조한다.

재조합 FGFR1 (2.5 nM), FGFR2 (1 nM), FGFR3 (5 nM), 또는 FGFR4 (12 nM) (인비트로젠(Invitrogen™))를 키나제 반응 완충제 (20 mM HEPES-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 2 mM MnCl₂, 1 mM EGTA, 0.02% Brij35, 0.1 mM Na₃VO₄, 0.02 mg/ml BSA, 2 mM DTT, 및 1% DMSO) 중 기질 KKKSPGEYVNIEFG (서열식별번호: 1) (20 μM, FGFR1 기질); 및 폴리 [E,Y] 4:1 (0.2 mg/ml, FGFR2,3,4 기질)]과의 혼합물로서 제조하였다. 화합물을 음향 기술 (랩사이트(Labcyte)® 에코(Echo) 550, 서니베일, 캘리포니아주)을 사용하여 효소/기질 혼합물에 첨가하고 (문헌 [Olechno et al., 2006, Improving IC₅₀ results with acoustic droplet ejection. JALA 11, 240-246] 참조), 실온에서 0, 15, 또는 60분 동안 예비-인큐베이션하였다. 화합물 예비-인큐베이션 후에, ATP (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)®) 및 ³³P-γ-ATP (퍼킨엘머(PerkinElmer))의 혼합물을 최종 농도 10 μM로 첨가하여 키나제 반응을 개시하였다. 반응물을 120분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 이어서 와트만(Whatman)™ P81 이온 교환 필터지 상에 스폿팅하였다. 필터를 0.75% 인산 중에 광범위하게 세척함으로써 미결합 포스페이트를 제거하였다. 문헌 [Anastassiadis et al., 2011, Comprehensive assay of kinase catalytic activity reveals features of kinase inhibitor selectivity. Nat Biotechnol 29, 1039-1045]을 참조한다.

FGFR4 및 FGFR1에 대한 결과를 표 2에 나타내었다. 화합물 108은 FGFR1에 대한 보다 높은 IC₅₀과 함께, FGFR4의 선택적 억제를 나타내었다.

표 2

이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, FGFR1에 대한 IC₅₀ 활성은 일반적으로 FGFR1, FGFR2 및 FGFR3에 대한 활성을 대표한다. 또한 문헌 [Dieci et al., 2013, Fibroblast Growth Factor Receptor Inhibitors as a Cancer Treatment: From a Biologic Rationale to Medical Perspectives. Cancer Discovery, F1-F16]을 참조한다.

확인하기 위해, 화합물을 또한 FGFR2 및 FGFR3 억제에 대하여 시험하였다. 하기 표 3에 나타낸 이들 결과는 FGFR1, FGFR2 및 FGFR3의 활성을 일반적으로 대표하는 FGFR1의 IC₅₀ 활성과 일치하고, 이는 추가로 이 FGFR4 억제제의 선택성을 증명한다.

표 3

종양 모델에서의 생체내 효능. 화합물 108을 3가지 상이한 인간 간세포성 암종 종양 세포주로부터의 종양 이종이식편을 보유하는 누드 마우스의 종양 성장을 억제하는 그의 능력에 대해 평가하였다. 이들 세포주는 변경된 FGFR4 및/또는 FGF19 상태를 갖는 암을 대표한다. 문헌 [Sawey et al., Cancer Cell 19(3): 347-358 (2011)]을 참조한다.

동물: 6-8 주령이고 체중이 대략 19-25 g인 누드 마우스를 타코닉(Taconic) (타코닉, 허드슨, 뉴욕주)으로부터 구입하였다. 모든 동물 실험은 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인받은 프로토콜에 따라 수행하였다.

종양 이종이식편 및 치료: 총 부피 100 μl, 1:1 매트리겔(Matrigel) (코닝 인크(Corning Inc)., 코닝, 뉴욕주) 중 각각 7.5 x 10⁶개 HUH7 세포 (HSRRB 카탈로그 번호 JCRB0403), 5 x 10⁶개 Hep3B (ATCC 카탈로그 번호 HB8064), 또는 2.5 x 10⁶개 JHH7 세포 (HSRRB 카탈로그 번호 JCRB1031)를 우측 측복부 내로 피하 (s.c) 주사하였다. 종양이 150-200 mm³에 도달하면, 마우스를 5-10마리 동물의 치료군으로 무작위화하였다. 5% DMSO (알파 에이사(Alfa Aesar), 워드 힐, 매사추세츠주), 10% PEG300 (시그마(Sigma), 세인트 루이스, 미주리주), 8% 트윈(TWEEN)® 80 (시그마, 세인트 루이스, 미주리주), 77% USP 염수의 비히클 중에 목적하는 농도로 제제화된 화합물 108을 사용하여, 명시된 투여량으로 15일 동안 복강내 주사에 의해 1일 2회 투약을 수행하였다. 종양 부피를 매주 2회 식: 부피 = (길이*너비²)/2를 사용하여 수집하였다. 체중을 또한 매주 2회 수집하였다. 모든 동물을 관찰하였고, 문헌 [The Guide for Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition (National Academies Press, Washington D.C.)]에 따라 관리하였다.

통계적 방법: 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5를 사용하여, 치료군의 비교를 위해 본페로니(Bonferroni) 사후-시험으로 반복 측정 분산분석 (Repeated Measures Anova)을 사용하여 실험의 종료시에 통계적 비교를 진행하였다. 하기 기준은 진행성 질환, 안정 질환, 부분 퇴행 및 완전 퇴행을 결정하는데 사용하였다. 진행성 질환은 3회 연속 측정값이 최선의 반응으로부터의 증가 또는 >120% 초기 종양 부피인 것으로 규정된다. 안정 질환은 3회 연속 측정값 <120% 및 >50%의 초기 종양 부피인 반면에, 3회 연속 측정값 <50% 초기 종양 부피는 부분 퇴행으로서 검증되었다. 완전 퇴행은 3회 연속 측정값 <30 mm³이다. 카이-제곱 시험은 치료군 사이의 반응을 비교하는데 사용하였다 (마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)).

HUH7, HEP3B 및 JHH7 암 세포로부터의 종양을 보유하는 동물로부터의 결과는 도 1-3에 각각 나타내었고, 또한 표 4에 반영된다.

표 4 - FGF19 증폭된 HCC 이종이식편에서의 종양 성장의 억제

HUH7 (군 당 n=10)

HEP3B (군 당 n=5)

JHH7 (군 당 n=10)

이들 데이터는 화합물 108이 모든 모델에서 효능이 있음을 증명한다. 3가지 모델 중에, HEP3B는 화합물 108에 대해 가장 감수성이고, JHH7은 가장 적게 감수성이고, HUH7은 중간 감수성을 나타낸다. JHH7에 대한 용량 반응을 도 3에서 볼 수 있지만, 시험된 모든 용량 수준에서는 진행성 질환이었다.

화합물 108의 BGJ398과의 비교 연구. 비교 연구는 화합물 108 및 공지된 FGFR 억제제 BJG398을 사용하여 수행하였다.

IC₅₀을 수득하기 위한 생화학적 키나제 검정 프로토콜: 재조합 FGFR1 (2.5 nM) 또는 FGFR4 (12 nM)를 키나제 반응 완충제 (20 mM HEPES-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 2 mM MnCl₂, 1 mM EGTA, 0.02% Brij35, 0.1 mM Na₃VO₄, 0.02 mg/ml BSA, 2 mM DTT, 및 1% DMSO) 중 기질 KKKSPGEYVNIEFG (서열식별번호: 1) (20 μM, FGFR1 기질); 폴리 [E,Y] 4:1 (0.2 mg/ml, FGFR2,3,4 기질)]과의 혼합물로서 제조하였다. 화합물을 음향 기술을 사용하여 효소/기질 혼합물에 첨가하고, 실온에서 0, 15, 또는 60분 동안 예비-인큐베이션하였다. 화합물 예비-인큐베이션 후에, ³³P-γ-ATP를 최종 농도 10 μM로 첨가하여 키나제 반응을 개시하였다. 반응물을 120분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 기질 인산화를 상기와 같은 필터 검정에 의해 모니터링하였다. 결과를 표 5에 나타내었다. 보고된 결과는 화합물 108이 보다 강력한 FGFR4 억제제인 한편, BGJ398이 보다 강력한 FGFR1 억제제임을 나타낸다.

표 5 - 생화학적 키나제 검정을 사용한 화합물 108 및 BGJ398의 비교 시험

GI₅₀을 수득하기 위한 세포 생존율 검정 프로토콜: 세포주를 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 배양하였다. 배양 배지는 깁코(GIBCO, USA)®로부터 구입하였다. 생존율 검정을 위해, 2000개 세포/웰을 96웰 플레이트에 시딩하고, 24시간 동안 인큐베이션한 후에, 화합물 처리하였다. 화합물 첨가 후에, 플레이트를 5% CO₂와 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 CTG 검정 (셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 세포 생존율 검정, 카탈로그 번호 G7572, 프로메가(Promega))에 의해 측정하였다. 결과를 표 6에 나타내었다. 표는 화합물 108이 FGF19 증폭된 세포주인 Hep3B 세포에서 BGJ398보다 더 강력하다는 것을 보여준다. 다른 2종의 FGF19 증폭된 세포주인 HUH7 및 JHH7에서의 효력은 화합물 108 및 BGJ398 간에 비슷하였다. HepG2 (ATCC 카탈로그 번호 HB-8065), SNU398 (ATCC 카탈로그 번호 CRL-2233) 및 SNU449 (ATCC 카탈로그 번호 CRL-2234)는 대조군으로서 사용된 FGF19 비-증폭 세포주이다.

GI₅₀은 100 x (T - T0)/(C - T0) = 50인 시험 약물의 농도이다. 예를 들어 문헌 [Monks et al., Feasibility of a High-Flux Anticancer Drug Screen Using a Diverse Panel of Cultured Human Tumor Cell Lines, J Natl Cancer Inst (1991) 83(11):757-766; Boyd et al., Data Display and Analysis Strategies for the NCI Disease-oriented In Vitro Antitumor Drug Screen, in Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development, Valeriote et al., eds. (1990), pp. 11-34]을 참조한다. 시험 약물에 대한 72시간 노출 후 시험 웰의 발광은 T이고, 시점 0에서의 발광은 T0이고, 대조군 발광은 C이다. GI₅₀은 시험 작용제의 성장 억제력을 측정한다.

표 6 - 세포 생존율 검정에서 화합물 108 및 BGJ398의 비교 시험

생체내 효능 비교: 누드 마우스를 상기와 같이 이들 실험에 사용하였다. 총 부피 100 μl, 1:1 매트리겔 (코닝 인크., 코닝, 뉴욕주) 중 5.0 x 10⁶개 Hep3B 세포를 우측 측복부 내로 s.c 주사하였다. 종양이 150-200 mm³에 도달하면, 마우스를 5-10마리 동물의 치료군으로 무작위화하였다. 5% DMSO (알파 에이사, 워드 힐, 매사추세츠주), 10% PEG300 (시그마, 세인트, 루이스 미주리주), 8% 트윈® 80 (시그마, 미주리주 세인트 루이스), 77% USP 염수의 비히클 중에 목적하는 농도로 제제화된 화합물 108을 사용하여 치료를 시작하였다. 0.5% 메틸셀룰로스 (시그마)/0.2% 트윈® 80 중 현탁액으로서 제제화된 BGJ398을 목적 농도로 현탁시켰다. 두 약물 모두를 18일 동안 투여하되, 한 치료군은 제외하였다 (하기 참조). 종양 부피를 매주 2회 식: 부피 = (길이*너비²)/2를 사용하여 수집하였다. 체중을 또한 매주 2회 수집하였다. 모든 동물을 관찰하였고, 문헌 [The Guide for Care 및 Use of Laboratory Animals, 8th edition (National Academies Press, Washington D.C.)]에 따라 관리하였다. 이 비교 생체내 연구의 결과를 도 4에 나타내었다.

데이터는 화합물 108이 허용되는 투여량 수준에서 BGJ398보다 더 효능이 있다는 것을 나타낸다. 60mg/kg의 BGJ398이 화합물 108에 필적하는 효능을 나타내었지만, 이 BGJ398 60mg/kg 군의 투약은 동물의 불량한 건강 때문에 제11일에 종결되어야만 하였다. 독성에서의 이러한 차이는 30mg/kg의 BGJ398을 경구로 투여한 동물 군이 불량한 건강을 나타내지 않았기 때문에 투여 경로로 인한 것이 아니다.

실시예 3: 대안적 합성 방법 및 화합물 108의 결정화

비스(Boc)-4-브로모-2-니트로아닐린의 합성

3구 5 L 둥근 바닥 플라스크에 4-브로모-3-니트로아닐린 (200g, 922 mmol), Boc 무수물 (412g, 1889 mmol, 2.05 당량), 및 THF (3L)를 채웠다. 교반한 혼합물에 DMAP (11.26g, 92.2 mmol, 0.10 당량)를 채웠다. 혼합물을 65℃로 가열하고, 반응이 HPLC에 의해 완료된 것 (≤ 2% 4-브로모-3-니트로아닐린 잔류, 대략 3.5시간)으로 여겨질 때까지 이 온도에서 교반하고, 이어서 실온으로 냉각시켰다. 혼합물을 12 L 후처리 용기로 옮기고, 에틸 아세테이트를 첨가 (3 L)하고 혼합물을 순차적으로 1N HCl (1 L), 포화 수성 NaHCO₃ 용액 (1 L), 및 10% 수성 NaCl 용액 (1 L)으로 세척하였다. 유기 층을 최소 교반가능한 부피로 농축시키고 에틸 아세테이트 (1 L)를 첨가하였다. 용액을 헵탄 (1.5 L)으로 2회 체이싱하고 제2 체이싱 후에 1.5 L의 총 부피로 혼합물을 농축시켰다. 생성된 슬러리를 여과하고, 헵탄 (3 x 200 mL)으로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (345.5g, 90% 수율)을 회백색 고체로서 수득하였다.

tert-부틸 (4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로페닐)카르바메이트

5 L 3구 둥근 바닥 플라스크에 비스(Boc)-4-브로모-2-니트로아닐린 (250 g, 599 mmol), 탄산세슘 (234g, 719 mmol, 1.2 당량), 및 부흐발트(Buchwald) Ru-Phos 전촉매 (CAS# 1375325-68-00, 20g, 27.4 mmol, 0.046 당량)를 채웠다. 고체에 이전에 탈기된 톨루엔 (1 L) 및 N-에틸피페라진 (156 mL, 1228 mmol, 2.05 당량)을 채웠다. 생성된 혼합물을 30분 동안 질소 기체로 폭기하였고, 이어서 혼합물을 95-105℃로 가열하고 HPLC 분석이 완전한 반응을 나타낼 때까지 이 온도에서 교반하였다 (대략 6시간). 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트® 545 (125g) 상에서 여과하고, 케이크를 톨루엔 (3 x 60 mL)으로 세척하였다. 생성된 용액을 농축시켜 표제 화합물 (210g, 100% 수율)을 수득하였고, 이를 추가 정제 없이 계속 사용하였다.

4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로아닐린

최소량의 톨루엔 중 tert-부틸 4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로페닐카르바메이트 (210g, 599 mmol)의 현탁액에, 내부 온도를 ≤ 40℃에서 유지하며, 기계적 교반하면서 4N 수성 HCl (2.1 L, 14 당량)을 채웠다. 생성된 슬러리를 HPLC 분석이 완료된 반응을 나타낼 때까지 실온에서 질소 스위프와 함께 교반하여 임의의 잔류 유기 용매를 제거하였다. 현탁액에 MTBE (1 L)를 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고 층을 분리하였다. 하부 수성 층을 0-5℃로 냉각시키고 12N 수성 NaOH 용액을 pH 9-10로 첨가하였다 (대략 480 mL이 요구됨). 생성된 고체를 여과하고 냉각 (0-5℃) 물 (3 x 400 mL)로 세척하였다. 습윤 케이크를 진공 및/또는 질소 스위프 하에 30℃에서 여과하여 표제 화합물 (136.3g, 91% 수율)을 적색 고체로서 수득하였다.

tert-부틸 4-브로모-2-니트로페닐카르바메이트 - 대안적 절차

THF (50 mL) 중 4-브로모-2-니트로아닐린 (4 g, 18.4 mmol) 및 (Boc)₂O (4.4 g, 20.24 mmol)의 혼합물을 밤새 환류 하에 가열하였다. 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 PE:EtOAc = 20:1로 용리시키면서 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (5.4 g, 수율: 93%)을 수득하였다. MS (ESI): 317, 319 [M+H]⁺.

tert-부틸 4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로페닐카르바메이트 - 대안적 절차

a. 1-(6-클로로피리미딘-4-일)-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레아

3 L 3구 둥근 바닥 플라스크에 2,6-디클로로-3,5-디메톡시아닐린 (199.65g, 899 mmol), 트리포스겐 (93g, 315 mmol, 0.35 당량), 및 1,4-디옥산 (1.9 L)을 채웠다. 혼합물을 100℃로 가열하고, 3.5시간 동안 이 온도에서 교반하였다. 이어서, 혼합물을 20-25℃로 냉각시키고, 여과하였다. 고체 잔류물을 1,4-디옥산 (200 mL)으로 세척하였다. 여과물을 최소 교반가능한 부피로 농축시키고 디옥산 (700 mL 각 체이싱)으로 3x 체이싱하였다. 용액을 마지막 체이싱 후에 최소 교반가능한 부피로 농축시킨 다음, 1,4-디옥산 (730 mL) 중에 재용해시켰다. 이 슬러리에 6-클로로-N-메틸피리미딘-4-아민 (129g, 899 mmol, 1 당량)을 채웠다. 생성된 혼합물을 80℃로 가열하고, 60시간 동안 이 온도에서 교반하였으며, 이 시간 동안 침전물의 실질적인 양이 형성되었다. 혼합물을 20-22℃로 냉각시키고 여과하였다. 고체 케이크를 디옥산 (2 x 90 mL)으로 세척하고 실온에서 질소 스위프와 함께 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (191g, 54% 수율)을 고체로서 수득하였다.

b. 1-(6-클로로피리미딘-4-일)-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)우레아

5 L 3구 둥근 바닥 플라스크에 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-(6-(4-(4-에틸피페라진-1-일)-2- 니트로페닐아미노)피리미딘-4-일)-1-메틸우레아 (135g, 345 mmol), 아이오딘화칼륨 (6.87g, 41.4 mmol. 0.12 당량) 및 DMF (400 mL)를 채웠다. 혼합물을 0-5℃로 냉각시키고 내부 온도를 ≤ 5℃로 유지하도록 NaH (미네랄 오일 중 60% 분산액, 17.9g, 448 mmol, 1.3 당량)를 조금씩 채웠다. 혼합물을 0-5℃에서 1시간 동안 교반하도록 허용한 후, 내부 온도를 ≤ 5℃로 유지하도록 SEM-Cl (73.2 mL, 414 mmol, 1.2 당량)을 적가하였다. 반응 혼합물을 HPLC 분석이 완전한 반응을 나타낼 때까지 0-5℃에서 교반하였다 (대략 1시간). 배치를 냉각 (0-5℃) 물 (4 L)을 함유하는 제2 5 L 3구 둥근 바닥 플라스크로 옮겼다. 생성된 슬러리를 15분 동안 교반한 다음, 여과하였다. 케이크를 물 (3 x 300 mL)로 세척하고 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (184g, 102%)을 고체로서 수득하였다.

c. 1-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-3-(6-((4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로 페닐) 아미노)피리미딘-4-일)-3-메틸-1-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)우레아

3 L 3구 둥근 바닥 플라스크에 1-(6-클로로피리미딘-4-일)-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)우레아 (182g, 349 mmol), 4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로아닐린 (87g, 349 mmol, 1 당량), BrettPhos 전촉매 (CAS# 1470372-59-8, 15.6 g, 17.2 mmol, 0.05 당량) 및 탄산세슘 (136g, 418 mmol, 1.2 당량)을 채웠다. 시스템을 질소로 플러싱하고, 이전에 탈기된 DMF (910 mL)를 첨가하였다. 용액을 30분 동안 질소 기체로 폭기한 다음, HPLC 분석이 완전한 반응을 나타낼 때까지 22-25℃에서 교반하도록 허용하였다 (3-4시간). 혼합물을 내부 온도를 ≤ 35℃로 유지하는 비율로 물 (2.7 L)을 함유하는 5 L 3구 둥근 바닥 플라스크 내에 채웠다. 생성된 슬러리를 22-25℃로 냉각시킨 다음 여과하였다. 케이크를 물 (4 x 150 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (257g, 100% 수율)을 고체로서 수득하였다.

d. 1-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-3-(6-((4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로 페닐) 아미노)피리미딘-4-일)-3-메틸-1-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)우레아의 합성 - 대안적 절차

환류 응축기, 자기 교반기 및 질소 퍼징 설정이 구비된 3 L 4구 둥근 바닥 플라스크에, 4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로아닐린 (50g, 0.199 mol), 1-(6-클로로피리미딘-4-일)-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)우레아 (125.1g, 0.239 mol, 1.2 당량), DMF (500 mL) 및 탄산세슘 (130.17g, 0.399 mol, 2.0 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 5-10분 동안 혼합물을 통해 질소를 버블링함으로써 퍼징하였다. 혼합물에 Pd₂(dba)₃ (18.29g, 0.0199 mol, 0.10 당량), Xantphos (11.55g, 0.0199 mol, 0.10 당량)를 첨가하고, 추가로 10분 동안 질소 퍼징을 계속하였다. 이어서 반응 혼합물을 TLC 분석이 완전한 반응을 나타낼 때까지 100℃로 가열하였다 (대략 2시간). 혼합물을 셀라이트 층을 통해 여과하고 수성 후처리를 수행하고, 목적 생성물을 EtOAc (3 x 500 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수 용액 (2 x 500 mL)으로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 표제 화합물을 적색빛 고체 (142 g)로서 수득하였고, 이를 그대로 이월하였다.

e. 1-(6-(2-아미노-4-(4-에틸피페라진-1-일)페닐아미노)피리미딘-4-일)-3-(2,6-디클로로-3,5- 디메톡시페닐)-1-메틸우레아

THF (20 mL) 및 MeOH (20 mL) 중 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-(6-(4-(4-에틸피페라진-1-일)-2-니트로페닐아미노)피리미딘-4-일)-1-메틸우레아 (330 mg, 0.546 mmol)의 용액에 라니-Ni (물 중 현탁액)를 실온에서 첨가하고, 생성된 혼합물을 3시간 동안 수소 분위기 (1 atm) 하에 교반하였다. 반응물을 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 MeOH로 2회 세척하여 표제 화합물 (280 mg, 순도: 90%)을 수득하였으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다. MS (ESI): 575 [M+H]⁺.

f. N-(2-(6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일아미노)-5-(4- 에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드의 제조

5 L 3구 둥근 바닥 플라스크에 디클로로메탄 (1 L), 아크릴산 (14.6 mL, 213 mmol, 1.5 당량), 및 휘니그 염기 (39.5 mL, 227 mmol, 1.6 당량)를 채웠다. 용액을 0-5℃로 냉각시키고 내부 온도를 ≤ 7℃로 유지하는 비율로 메틸 클로로포르메이트 (15.4 mL, 198 mmol, 1.4 당량)로 처리하였다. 혼합물을 20-25℃로 가온하고, 1시간 동안 이 온도에서 교반한 다음, 0-5℃로 냉각시켰다. 개별 500 mL 둥근 바닥 플라스크에서 디클로로메탄 (150 mL) 중 1-(6-((2-아미노-4-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아미노)피리미딘-4-일)-3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)우레아 (100 g, 142 mmol, 1 당량)를 용해시켰다. 기질 용액을 혼합 무수물 용액으로 옮기고, 디클로로메탄 (200 mL)으로 헹구고 이 헹군 액을 또한 무수물 용액으로 옮겼다. 생성된 혼합물에 피리딘 (27.5 mL, 340 mmol, 2.4 당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 20-25℃로 가온하였다. 반응 혼합물을 HPLC 분석이 완전한 반응을 나타낼 때까지 이 온도에서 교반하였다 (대략 1시간). 이어서, 혼합물을 0-5℃로 냉각시키고 포화 수성 NaHCO₃ 용액 (1 L)을 첨가하였다. 배치를 20분 동안 교반한 다음, 상이 침강 및 분할 침강되었다. 보다 낮은 유기 상을 NaHCO₃ 용액 (600 mL)으로 2회 세척하였다. 이어서 보다 낮은 유기 상을 10% 수성 NaCl 용액 (600 mL)으로 세척하였다. 보다 낮은 유기 상을 고체 Na₂SO₄ (250g) 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 표제 화합물 (108g, 100%)을 수득하였고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.

g. 화합물 108의 유리 염기 형태의 합성 및 결정화

디클로로메탄 (102 mL) 중 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸-3-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 (1, 51g, 67.12 mol)의 교반 용액을 0-5℃로 냉각시켰다. 이 용액에 내부 온도 ≤ 15℃를 유지하는 비율로 트리플루오로아세트산 (102 mL, 1585 mol, 23.6 당량)을 첨가하였다. 첨가가 완료되면, HPLC 분석이 완전한 반응을 나타내는 시점에 혼합물을 실온으로 가온되도록 허용하고, 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 내부 온도 ≤ 25℃를 유지하는 비율로 냉각 (0-5℃) 포화 수산화암모늄 용액 (550 mL)을 함유하는 제2 플라스크로 옮겼다. HPLC 분석이 완전한 반응을 나타내는 시점에 혼합물을 5-10분 동안 교반하도록 허용하였다. 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 디클로로메탄/메탄올 (5:1, 600 mL)로 2회 및 디클로로메탄/메탄올 (5:1, 300 mL)로 1회 추출하였다. 합한 유기 상을 최소 교반가능한 부피로 농축시키고 아세토니트릴 (150 mL)을 첨가하였다. 생성된 고체를 15분 동안 슬러리화한 다음, 여과하였다. 고체 케이크를 아세토니트릴 (4 x 30 mL)로 세척하고 질소 스위프와 함께 진공 하에 필터 상에서 건조시켜 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 (108, 29.56g, 70% 수율)를 고체로서 수득하였다. ¹H-NMR (d₆-DMSO): δ 1.04 (t, J=7.15 Hz, 3H); 2.37 (m, 2H); 3.13 (m, 4H); 3.22 (m, 4H); 3.31 (s, 3H); 3.93 (s, 6H); 5.72 (dd, 1H, J=10.27, 1.83 Hz); 6.23 (dd, 1H, J=17.06, 1.83 Hz; br s, 1H); 6.48 (dd, 1H, J=16.87, 10.27 Hz); 6.81 (dd, 1H, J=8.99, 2.75 Hz); 6.89 (s, 1H); 7.29 (br d, J=9.17 Hz, 2H); 8.32 (s, 1H); 8.71 (s, 1H); 9.58 (s, 1H) (도 9a-9c). 질량 스펙트럼: [M+H]⁺ = 629.2. 이는 500 MHz에서 배리안 이노바(Varian Inova) 상에서 측정하였다.

화합물 108의 유리 염기 형태의 재결정화:

N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 (108, 42g)를 디클로로메탄/메탄올 (4:1, 500 mL) 중에 용해시켰다. 이 용액에 아세토니트릴 (150 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 150 mL의 총 부피로 감압 하에 농축시켰다. 생성된 혼합물에 추가의 아세토니트릴 (150 mL)을 첨가하고 혼합물을 다시 150 mL의 총 부피로 감압 하에 농축시켰다. 생성된 슬러리를 여과하였다. 고체 케이크를 아세토니트릴 (4 x 30 mL)로 세척하고 질소 스위프와 함께 진공 하에 필터 상에서 건조시켜 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 (108, 36g, 재결정화로부터 86% 회수)의 재결정화된 유리 염기 형태를 고체로서 수득하였다.

실시예 4: 분말 X-선 회절 (PXRD)에 의한 화합물 108의 결정질 유리 염기 형태의 특징화

본 실시예에서 샘플에 대한 PXRD 데이터는 리가쿠 멀티플렉스(Rigaku MultiFlex) 기기 (표적: Cu; 튜브 전압: 40 kV; 튜브 전류: 30 mA, 범위 3.0-45. 0=42.0°) 상에서 취득하였다. 표준 원형 알루미늄 시편 홀더 내에 분말을 첨가함으로써 샘플을 제조하고 유리 슬라이드로 평탄하게 하였다.

화합물 108의 결정질 유리 염기 형태는 3.0-35.0=32.0°의 범위를 나타내기 위해 말단절단된 도 5에 나타난 PXRD 패턴을 특징으로 한다. 화합물 108의 결정질 유리 염기 형태의 3개 로트로부터의 PXRD 스펙트럼의 오버레이 (도 6)는 재현성을 증명한다.

표 7에 요약된 바와 같이, 화합물 108의 결정질 유리 염기 형태는 6개의 특징적인 피크를 갖는 PXRD 패턴을 나타낸다.

표 7: 특징적 결정질 유리 염기 형태 화합물 108 PXRD 피크

실시예 5: 시차 주사 열량측정 (DSC)에 의한 결정질 유리 염기 형태 화합물 108의 특징화

본 실시예에서 샘플에 대한 DSC는 메틀러-톨레도(Mettler-Toledo) DSC 1/700 (수행 조건: 초기 온도 35℃, 최종 온도 325℃, 가열 속도 10℃/분) 상에서 취득하였다.

화합물 108의 결정질 유리 염기 형태의 대략 4 내지 8 mg을 70 μL 알루미늄 팬에 첨가하고, 덮고, 크림핑하고 단일 구멍으로 천공하였다. 동일한 방식으로 제조된 샘플 및 블랭크 용기를 열전쌍 표면에 첨가하고 기기를 초기 온도에서 평형화하였다. 챔버를 10℃/분에서 325℃로 가열하였고 시차 온도기록도를 수집하였다.

화합물 108의 결정질 유리 염기 형태의 시차 온도기록도를 시차 주사 열량측정 (DSC) 기기를 사용하여 수득하였다 (도 7 참조, 약 254℃ 이후에 말단절단됨). 화합물 108의 결정질 유리 염기 형태는 213.6℃ (±1℃)의 개시 온도에서 단일 흡열 피크를 갖는 것을 특징으로 한다. 화합물 108의 결정질 유리 염기 형태의 3개의 상이한 배치로부터의 개시 온도의 비교를 표 8 및 도 8에 나타내었다 (약 246℃ 이후에 말단절단됨).

표 8. 3개 로트로부터의 개시 온도의 비교

실시예 6: 결정질 유리 염기 형태 화합물 108의 용해도

0.1 N HCl 중 결정질 유리 염기 형태 화합물 108의 용해도는 5.2 mg/mL이었다.

실시예 7:

이 실시예는 상기 보고된 데이터를 제공한 자료 이외에, 화합물 108의 결정질 유리 염기 형태의 개별 배치로부터 제조된 추가적 데이터를 보고한다.

¹³C-NMR (100 MHz, 고체 상태) δ(ppm): 11.9, 31.1, 52.2, 54.8, 56.5, 88.6, 95.7, 106.2, 110.8, 112.3, 114.5, 123.0, 129.0, 130.3, 132.3, 132.9, 133.8, 149.9, 153.2, 154.8, 155.4, 160.0, 162.1, 164.4. 이를 도 10에 나타내었다.

¹H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d ₆) δ(ppm): 1.03 (3H, t, J=7.2 Hz), 2.37 (2H, q, J=7.2 Hz), 2.46-2.51 (4H, m), 3.12 (4H, t, J= 5.0 Hz), 3.21 (3H, s), 3.92 (6H, s), 5.71 (1H, dd, J= 10.3, 1.7 Hz), 6.13-6.26 (1H, m), 6.22 (1H, dd, J=17.1, 1.8 Hz), 6.48 (1H, dd, J=17.0, 10.3 Hz), 6.80 (1H, dd, J= 8.9, 2.6 Hz), 6.88 (1H, s), 7.23-7.33 (1H, m), 7.28 (1H, d, J=8.9 Hz), 8.30 (1H, s), 8.69 (1H, brs), 9.57 (1H, brs), 12.05 (1H, s). 이는 아반스(Avance) 600 MHz (브루커(Bruker))를 사용하여 측정하였다. 이를 도 9d에 나타내었다.

실시예 8: N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 결정의 제조

10% (v/v) DMSO를 함유하는 아세톤 용액 (4 mL)을 염산 용액 (2.76 μL, 1 당량)과 혼합하고, N-(2((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 (20.25 mg)에 첨가하고, 초음파 조사하고, 7일 동안 실온에서 교반하였다. 생성된 결정을 여과하고 아세톤으로 세척하여 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 결정을 수득하였다.

실시예 9: N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 결정의 제조

10% (v/v) DMSO를 함유하는 아세톤 용액 (2.5 mL)을 염산 용액 (7.25 μL, 1당량)과 혼합하고, N-(2((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 (53.12 mg)에 첨가하고, 초음파 조사하고, 1일 동안 실온에서 교반하였다. 실시예 8에서 수득한 결정질 형태를 반응 혼합물에 첨가하고 추가로 5일 동안 교반하였다. 생성된 결정을 여과하고 에탄올 (1mL)로 세척하여 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 결정 (50.60 mg)을 수득하였다.

실시예 10: N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 결정의 제조

10% (v/v) DMSO를 함유하는 아세톤 용액 (25 mL)을 염산 용액 (68.51 μL, 1당량)과 혼합하고, N-(2((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 (502.1 mg)에 첨가하고, 초음파 조사하였다. 실시예 9에서 수득한 결정질 형태를 반응 혼합물에 첨가하고, 7일 동안 실온에서 교반하였다. 생성된 결정을 여과하고, 에틸 아세테이트 (1.5mL)로 세척하고, 3일 동안 감압 하에 건조시켜 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 결정 (543.0mg)을 수득하였다.

¹³C-NMR (100 MHz, 고체 상태) δ(ppm): 10.9, 32.1, 34.1, 45.4, 49.2, 51.9, 53.7, 56.0, 91.3, 95.7, 112.5, 121.2, 124.1, 128.2, 130.7, 134.3, 144.7, 153.6, 154.8, 160.3, 166.9. 이를 도 11에 나타내었다.

¹H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d₆) δ(ppm): 1.26 (3H, m), 2.98-3.21 (6H, m), 3.23 (3H, s), 3.55 (2H, brs), 3.77 (2H, brs), 3.92 (6H, s), 5.72 (1H, dd, J= 10.3, 1.3 Hz), 6.23 (1H, dd, J=17.0, 1.6 Hz), 6.26 (1H, brs), 6.52 (1H, dd, J=17.0, 10.2), 6.87 (1H, dd, J= 9.0, 2.0 Hz), 6.89 (1H, s), 7.37 (1H, d, J=8.8 Hz), 7.41 (1H, brs), 8.32 (1H, s), 8.88 (1H, s), 9.67 (1H, s), 10.17 (1H, brs), 12.02 (1H, s). 이를 도 12에 나타내었다.

실시예 11:

본 실시예에서 샘플에 대한 PXRD 데이터를 리가쿠 RINT TTR-III 기기 (표적: Cu; 튜브 전압: 50 kV; 튜브 전류: 300 mA, 범위 5.0-35.0=30°) 상에서 취득하였다.

실시예 10에서 제조된 바와 같은 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드는 도 13에 나타난 PXRD 패턴을 특징으로 한다.

표 8에 요약된 바와 같이, N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드의 결정질 형태는 적어도 10개의 특징적인 피크를 갖는 PXRD 패턴을 나타낸다.

표 8: 특징적 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 모노히드로클로라이드 PXRD 피크.

실시예 12: N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드 결정의 제조

아세톤 (3 mL)을 염산 용액 (12.36 μL, 3 당량)과 혼합하고, N-(2((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 (30.19 mg)에 첨가하고, 초음파 조사하고, 실온에서 4일 동안 교반하였다. 생성된 결정을 여과하여 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드 결정을 수득하였다.

실시예 13: N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드 결정의 제조

10% (v/v) DMSO를 함유하는 아세톤 용액 (10 mL)을 염산 용액 (137.7 μL, 2당량)과 혼합하고, N-(2((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 (504.4 mg)에 첨가하고, 초음파 조사하였다. 실시예 12에서 수득한 결정질 형태를 반응 혼합물에 첨가하고, 7일 동안 실온에서 교반하였다. 생성된 결정을 여과하고, 에틸 아세테이트 (1.5mL)로 세척하고, 3일 동안 감압 하에 건조시켜 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드 결정 (565.4mg)을 수득하였다.

¹³C-NMR (100 MHz, 고체 상태) δ(ppm): 9.9, 30.4, 35.0, 39.8, 41.5, 45.5, 46.7, 51.3, 53.8, 56.1, 57.6, 93.2, 96.1, 109.9, 111.5, 112.5, 115.6, 119.0, 128.2, 130.0, 131.6, 134.0, 148.6, 154.6, 161.4, 163.7. 이를 도 14에 나타내었다.

¹H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d₆) δ(ppm): 1.27 (3H, t, J=7.3 Hz), 3.03-3.21 (6H, m), 3.25 (3H, s), 3.52-3.59 (2H, m), 3.72-3.83 (2H, m), 3.92 (6H, s), 5.72 (1H, dd, J= 10.3, 1.5 Hz), 6.23 (1H, dd, J=17.1, 1.6 Hz), 6.32 (1H, brs), 6.53 (1H, dd, J=17.0, 10.4), 6.88 (1H, dd, J= 8.9, 2.5 Hz), 6.89 (1H, s), 7.37 (1H, d, J=8.8 Hz), 7.42 (1H, brs), 8.34 (1H, s), 9.03 (1H, brs), 9.73 (1H, s), 10.43 (1H, brs), 11.88 (1H, brs). 이를 도 15에 나타내었다.

실시예 14:

본 실시예에서 샘플에 대한 PXRD 데이터는 리가쿠 RINT TTR-III 기기 (표적: Cu; 튜브 전압: 50 kV; 튜브 전류: 300 mA, 범위 5.0-35.0=30°) 상에서 취득하였다.

실시예 13에서 제조된 바와 같은 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드는 도 16에 나타난 PXRD 패턴을 특징으로 한다.

표 9에 요약된 바와 같이, N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드의 결정질 형태는 적어도 10개의 특징적인 피크를 갖는 PXRD 패턴을 나타낸다.

표 9: 특징적 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 디히드로클로라이드 PXRD 피크.

실시예 15: N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트의 제조

아세톤 (5 mL)을 에탄술폰산 용액 (13.51 μL, 1당량)과 혼합하고, N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 (100.6 mg)에 첨가하고, 초음파 조사하고, 7일 동안 실온에서 교반하였다. 생성된 결정을 여과하여 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트 결정 (103.7 mg)을 수득하였다.

실시예 16: N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트의 제조

아세톤 (20 mL)을 에탄술폰산 용액 (67.22 μL, 1당량)과 혼합하고, N-(2((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 (500.6 mg)에 첨가하고, 초음파 조사하였다. 실시예 15에서 수득한 결정질 형태를 반응 혼합물에 첨가하고, 3일 동안 실온에서 교반하였다. 생성된 결정을 여과하고, 에틸 아세테이트 (1.5mL)로 세척하고, 3일 동안 감압 하에 건조시켜 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트 결정 (562.0mg)을 수득하였다.

¹³C-NMR (100 MHz, 고체 상태) δ(ppm): 10.3, 33.4, 44.0, 44.3, 45.0, 45.9, 47.0, 50.0, 53.0, 55.9, 87.6, 95.5, 107.4, 111.0, 124.8, 129.5, 131.5, 134.5, 144.2, 154.6, 159.2, 159.9, 164.1. 이를 도 17에 나타내었다.

¹H-NMR 스펙트럼 (DMSO-d₆) δ(ppm): 1.05 (3H, t, J=7.5 Hz), 1.25 (3H, t, J=7.3 Hz), 2.37 (2H, q, J=7.4 Hz), 2.98 (2H, t, J=11.7 Hz), 3.13 (2H, m), 3.21 (2H, m), 3.24 (3H, s), 3.58 (2H, brd, J=11.6 Hz), 3.80 (2H, brd, J=12.9 Hz), 3.92 (6H, s), 5.72 (1H, dd, J= 10.3, 1.5 Hz), 6.22 (1H, dd, J=17.0, 1.7 Hz), 6.25 (1H, brs), 6.50 (1H, dd, J=17.0, 10.3), 6.84-6.92 (2H, m), 7.36 (1H, d, J=8.9 Hz), 7.41 (1H, brs), 8.32 (1H, s), 8.81 (1H, s), 9.34 (1H, brs), 9.58 (1H, brs), 11.99 (1H, s). 이를 도 18에 나타내었다.

실시예 17:

실시예 16에서 제조된 바와 같은 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트는 도 19에 나타난 PXRD 패턴을 특징으로 한다.

표 10에 요약된 바와 같이, N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트의 결정질 형태는 적어도 10개의 특징적인 피크를 갖는 PXRD 패턴을 나타낸다.

표 10: 특징적 결정질 N-(2-((6-(3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-메틸우레이도)피리미딘-4-일)아미노)-5-(4-에틸피페라진-1-일)페닐)아크릴아미드 에탄술포네이트 PXRD 피크.

상기는 본 발명의 예시이며, 그를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명은 하기 청구범위에 의해 정의되며, 청구범위의 등가물은 그에 포함되어야 한다.

Claims

결정질 유리 염기 형태 화합물이 적어도 하기 X선 분말 회절 피크, 2θ° (± 0.2): 10.3, 8.0 및 9.5를 나타내는 것인 하기 화합물의 결정질 유리 염기 형태 화합물.
제1항에 있어서, 결정질 유리 염기 형태 화합물이 적어도 하기 X선 분말 회절 피크, 2θ° (± 0.2°): 10.3, 8.0, 9.5, 14.8, 16.5 및 17.1을 나타내는 것인 결정질 유리 염기 형태 화합물.
제2항에 있어서, 결정질 유리 염기 형태 화합물이 적어도 하기 X선 분말 회절 피크, 2θ° (± 0.2°): 10.3, 8.0, 9.5, 14.8, 16.5, 17.1, 19.3, 21.8, 23.7 및 24.5를 나타내는 것인 결정질 유리 염기 형태 화합물.
결정질 유리 염기 형태가 하기에 나타난 바와 같은 분말 X선 회절 (PXRD) 패턴을 특징으로 하는 것인 하기 화합물의 결정질 유리 염기 형태 화합물.

[도 5]
결정질 화합물이 적어도 하기 X선 분말 회절 피크, 2θ°(± 0.2°): 26.6, 19.9 및 11.3을 나타내는 것인 하기 화합물의 결정질 모노히드로클로라이드 염 형태 화합물.
제5항에 있어서, 결정질 화합물이 적어도 하기 X선 분말 회절 피크, 2θ°(± 0.2°): 26.6, 19.9, 11.3, 9.0, 23.5 및 25.4를 나타내는 것인 결정질 화합물.
제6항에 있어서, 결정질 화합물이 적어도 하기 X선 분말 회절 피크, 2θ°(± 0.2°): 26.6, 19.9, 11.3, 9.0, 23.5, 25.4, 27.6, 23.0, 18.1 및 29.0을 나타내는 것인 결정질 화합물.
결정질 화합물이 하기에 나타난 바와 같은 분말 X선 회절 (PXRD) 패턴을 특징으로 하는 것인 하기 화합물의 결정질 모노히드로클로라이드 염 형태 화합물.

[도 13]
결정질 화합물이 적어도 하기 X선 분말 회절 피크, 2θ°(± 0.2°): 26.6, 22.8 및 21.3을 나타내는 것인 하기 화합물의 결정질 디히드로클로라이드 염 형태 화합물.
제9항에 있어서, 결정질 화합물이 하기 X선 분말 회절 피크, 2θ°(± 0.2°): 26.6, 22.8, 21.3, 8.0, 26.2 및 13.5를 나타내는 것인 결정질 화합물.
제10항에 있어서, 결정질 화합물이 하기 X선 분말 회절 피크, 2θ°(± 0.2°): 26.6, 22.8, 21.3, 8.0, 26.2, 13.5, 12.4, 16.1, 28.0 및 18.7을 나타내는 것인 결정질 화합물.
결정질 화합물이 하기에 나타난 바와 같은 분말 X선 회절 (PXRD) 패턴을 특징으로 하는 것인 하기 화합물의 결정질 디히드로클로라이드 염 형태 화합물.

[도 16]
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 결정질 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 간세포성 암종의 치료를 위한 제약 조성물.
제13항에 있어서, 경구, 정맥내 또는 피하 투여를 위해 제제화된 제약 조성물.
a) 용매 중 하기 화합물을 포함하는 조성물을 제공하는 단계:

, 여기서 X는 (2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸이다;
b) 조성물의 온도를 ≤ 50℃에서 유지하면서 상기 조성물에 산을 첨가하는 단계; 이어서
c) 조성물에 포화 수산화암모늄 용액을 첨가하는 단계; 및 이어서
e) 조성물을 불혼화성 용매의 혼합물로 추출하여 유기 상을 형성하는 단계; 및
f) 적합한 용매를 유기 상에 첨가하여, 이로써 제1항의 상기 결정질 유리 염기 형태 화합물을 형성하는 단계
를 포함하는, 제1항의 결정질 유리 염기 형태 화합물의 제조 방법.
제15항에 있어서, 단계 b)의 상기 산이 트리플루오로아세트산, 염산, 브로민화수소산, 황산 또는 메탄술폰산인 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 단계 f)의 적합한 용매가 디클로로메탄, 아세토니트릴, 1,2-디클로로에탄, 또는 수성 디메틸 포름아미드인 방법.
치료 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 간세포성 암종을 치료하기 위한 제약 조성물.
제18항에 있어서, 상기 간세포성 암종이 변경된 FGFR4 및/또는 FGF19 상태를 갖는 것인 제약 조성물.
제19항에 있어서, 상기 변경된 FGFR4 및/또는 FGF19 상태가 FGFR4 및/또는 FGF19의 증가된 발현을 포함하는 것인 제약 조성물.
치료-유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물의 결정질 형태를 포함하고 대상체에서 간세포성 암종을 치료하기 위한 제약 조성물로서, 여기서 치료는 간세포성 암종의 세포를 함유하는 생물학적 샘플에서 변경된 FGFR4 및/또는 FGF19 상태를 검출하고, 상기 간세포성 암종이 상기 변경된 FGFR4 및/또는 FGF19 상태를 갖는 경우인 제약 조성물.
제21항에 있어서, 상기 변경된 FGFR4 및/또는 FGF19 상태가 FGFR4 및/또는 FGF19의 증가된 발현을 포함하는 것인 제약 조성물.
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