KR20040065317A - 유전자 요법에 사용할 수 있는 인간의 재조합아데노바이러스 패키징 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전자 요법 등에 유리하게 사용될 수 있는 아데노바이러스 물질에 기초한 개선된 방법 및 생성물을 제공한다. 본 발명의 한 관점에서 아데노바이러스 벡터는 본 발명의 다른 관점인 적합한 패키징 세포주와의 중복을 갖지 않는 것을 제공한다. 이 결합은 상동성 재조합 가능성을 배제하는 것에 의해, 복제능이 있는 아데노바이러스의 형성 가능성을 배제한다. 다른 개념에서 아데노바이러스 기저 헬퍼 구조물은 그것의 크기에 의해 인캡시데이트되는 것이 불가능하다. 이 헬퍼 바이러스는 이를 패키징 세포로 만드는 어떤 적합한 숙주세포 내로 전달될 수 있다. 추가로, 복제능이 있는 아데노바이러스의 제조를 방지하고 그리고/또는 면역 시스템에 의한 간섭을 피하는 방법 및 생성물의 일반적인 안전함을 모두 갖는 다수의 유용한 돌연변이 및 이러한 돌연변이의 결합이 기재되어 있다. 또한, 세포내 증식 방법이 제공된다.

Description

유전자 요법에 사용할 수 있는 인간의 재조합 아데노바이러스 패키징 시스템{Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy}
본 발명은 DNA 재조합 기술 분야에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유전자 요법 분야에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 아데노바이러스, 특히 인간의 재조합 아데노바이러스로부터 유도된 물질을 이용한 유전자 요법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 바이러스에서 유도된 신규한 벡터와 아데노바이러스에 기초한 벡터의 신규한 패키징 세포주(cell line)에 관한 것이다.
유전자 요법은 광역한 적용 범위가 있을 수 있고 그 적용 범위가 예견되어 온 최근에 개발된 개념이다.
유전자 요법에 있어서, 유전정보를 전달하는 분자는 숙주의 일부 또는 모든 세포에 삽입되어, 그 결과 유전정보가 기능적 형식 내에서 숙주에 추가된다.
추가된 유전정보는 유전자이거나 또는 단백질을 코드하는 cDNA 등의 유전자 유도체일 수 있다. 이 경우 기능적 형식이란 단백질이 숙주 세포의 구조에 의해 발현될 수 있는 것을 의미한다.
유전정보는 또한 숙주 세포 내에 존재하는 뉴클레오티드(DNA 또는 RNA인)의 서열에 상보적인 뉴클레오티드의 서열일 수 있다. 이 경우에서 기능적 형식이란 추가된 DNA(핵산) 분자나 또는 원위치에서 제조된 이들의 복제물이 숙주 세포 내에 존재하는 상보 서열과 염기쌍을 이룰 수 있는 것이다.
적용 범위에는 단백질이나 유전적 장애 전체에서 숙주 내에 존재하지 않거나 또는 적어도 불충분한 양으로 존재하는 기타 물질을 보충하는 것에 의한 유전적 장애의 치료와 종양 및 (자가)면역질환 또는 감염 등의 (기타) 후천적 질병의 치료가 포함된다.
상기한 바와 같이 유전자 요법에는 기본적으로 3가지의 접근 방법이 있는데;첫 번째는 (포유동물) 숙주 내에 존재하는 결손을 보충하는 방법이고, 두 번째는 원하지 않는 물질(유기체 또는 세포)을 이전하거나 삭제하는 방법이며, 세 번째는 재조합 백신(종양 또는 외래 미생물)을 사용하는 방법이다.
유전자 요법을 위해서 결실을 운반하는 아데노바이러스가 적당한 매체로서 제안되어 왔다. 아데노바이러스는 외막이 없는 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스에서 유도된 유전자 전이 벡터(아데노바이러스 벡터라 함)는 상기한 목적을 위한 유전자 전이에 특별히 유용한 많은 특징들을 가진다. 예를 들면, 아데노바이러스의 생물학은 상세하게 특성화되어 있고, 아데노바이러스는 인간의 심각한 병리학과 연관되어 있지 않으며, 이 바이러스는 그의 DNA가 숙주 세포 내에 매우 효율적으로 삽입되며, 다양한 종류의 세포를 감염시킬 수 있고 숙주의 범위가 광역하며, 이 바이러스는 비교적 용이하게 다량 제조될 수 있을 뿐만 아니라 바이러스 게놈의 초기 영역 1(E1) 내에서의 결실에 의해 복제가 결손될 수 있다.
아데노바이러스의 게놈은 약 36000 염기쌍으로 이루어진 직쇄상의 이중가닥 DNA 분자이며 55-kDa의 터미날 단백질이 각 가닥의 5-터미날에 공유결합되어 있다. Ad DNA는 약 100 염기쌍의 동일한 반전 말단 반복부(ITR)를 함유하는데 정확한 길이는 혈청형에 따라 다르다. 복제의 바이러스 기원은 정확하게 게놈 말단의 ITR 내에 위치한다. DNA 합성은 2단계로 일어난다. 먼저, 복제는 가닥 치환에 의해 진행되어 제 2세대 듀플렉스 분자와 제 1세대의 치환된 가닥을 생성한다. 치환된 가닥은 단일 가닥이 되며 복제를 개시하고 제 2세대 듀플렉스 분자를 생성할 수 있는 소위 "팬핸들(panhandle)" 중간체를 형성할 수 있다. 또는, 복제는 게놈의 양말단에서 동시에 진행될 수 있어서 팬핸들 구조를 생성하는 요건을 피할 수 있다. 복제는 (Lechner and Kelly, 1977)에서 각색된 도 14에 요약하였다.
생산 감염 사이클에서 바이러스 유전자는 2단계로 발현되는데, 제 1단계는 바이러스 DNA 복제까지의 기간이며, 제 2단계는 바이러스 DNA 복제의 개시와 일치한다. 초기 단계에서는 영역 E1, E2, E3, 및 E4에 의해 코드되는 초기 유전자 생성물 만이 발현되는데, 이들은 바이러스의 구조 단백질 합성을 위한 세포를 제조하는 다양한 기능을 수행한다(Berk, 1986). 제 2단계에서는 초기 바이러스 유전자 생성물 이외에도 후기의 바이러스 유전자 생성물이 발현되며, 숙주 세포 DNA와 단백질 합성이 중단된다. 결국, 세포는 바이러스 DNA와 바이러스의 구조 단백질의 생성에 제공된다(Tooze, 1981).
아데노바이러스의 E1 영역은 목적 세포의 감염 후에 발현된 아데노바이러스의 제 1 영역이다. 이 영역은 2개의 전사 단위, 즉 E1A와 E1B 유전자로 이루어지는데, 이들은 초생(태아) 설치류 배양물의 발암성 형질전환에 필요하다. E1A 유전자 생성물의 주요 작용은 1) 정지한 세포를 세포 사이클에 들어가도록 하여 세포의 DNA 합성을 재개하는 것이고, 2) E1B 유전자와 기타 초기 영역(E2, E3, E4)을 전사적으로 활성화하는 것이다. E1A 유전자 만으로 초생 세포를 형질감염시켜 비제한적인 증식(immortalization, 불멸화)을 유도할 수는 있으나 완전한 형질전환을 일으키지는 않는다. 그러나, 대부분의 경우에서 E1A의 발현은 프로그램화된 세포의 치사를 유발하고(apoptosis), 단지 때때로 비제한적인 증식이 얻어진다(Jochemsen et al., 1987). E1B 유전자의 동시 발현은 아폽토시스의 유발을 억제하는데 필요하며 발생한 형태학적 형질전환에 필요하다. 확립된 불멸화 세포주에 있어서, 고수준의 E1A 발현은 E1B가 없는 조건 하에서 완전한 형질전환을 일으킬 수 있다(Roberts et al., 1985).
E1B를 코드하는 단백질은 E1A가 세포 작용을 방향전환하는 것을 도와 바이러스를 복제하게 한다. 원래 핵 안에 위치한 복합체를 형성하는 E1B 55 kD와 E4 33 kD 단백질은 숙주 단백질의 합성을 억제하고 바이러스 유전자의 발현을 촉진하는 작용을 한다. 이들의 주 영향은 감염의 최종 단계의 개시와 함께 핵에서 세포질로의 바이러스 mRNA의 선택적 이동을 확립하는 것이다. E1B 21 kD 단백질은 생산성 감염 사이클의 정확한 일시적 조절에 중요하며, 그리하여 바이러스의 수명 사이클이 완료되기 전에 숙주 세포의 때이른 치사를 방지한다. E1B 21 kD 유전자 생성물을 발현할 수 없는 돌연변이 바이러스는 숙주 세포 염색체 DNA(deg-표현형)의 과도한 절단에 의해서 그리고 강화된 세포병리효과(cyt-표현형)에서 수반되는 단축된 감염 사이클을 나타낸다(Telling et al., 1994).deg와cyt표현형은 E1A 유전자가 돌연변이 되었을 때에도 억제되므로 이러한 표현형은 E1A의 작용인 것으로 나타났다(White et al., 1988). 또한, E1B 21 kD 단백질은 E1A가 다른 바이러스 유전자로 전환하는 속도를 저하시킨다. E1B 21 kD가 상기한 E1A에 의존적인 작용을 억제하는 메카니즘은 아직 알려져 있지 않다.
적어도 E1 영역이 삭제된 다음 주목되는 유전자에 의해 치환된 인간의 아데노바이러스로부터 유도된 벡터는 임상전과 임상 단계의 유전자 요법 실험에 많이 이용되어 왔다.
상기한 바와 같이 현재 유전자 요법에 사용되는 모든 아데노바이러스 벡터는 새로운 유전정보가 삽입될 수 있는 E1 영역에 결실(deletion)을 가진다. E1 결실은 재조합 바이러스의 복제를 불완전하게 한다(Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991). 본 발명자들은 재조합 아데노바이러스가 재조합 유전자를 래트의 간과 붉은털 원숭이의 기관 상피에 효과적으로 전달할 수 있음을 입증하였다(Bout et al., 1994b; Bout et al., 1994a). 또한, 본 발명자들(Vincent et al., 1996a; Vincent et al., 1996b)과 다른 인간들(Haddada et al., 1993 등 참조)은 시험관 내의 다양한 종양 세포와 생체 내에서의 동물 모델의 충실성 종양과 면역결핍성 마우스(폐) 내의 인간 이종이식편(Blaese et al., 1995에서 조사)에 생체 내 아데노바이러스 매개 유전자가 매우 효율적으로 전이되는 것을 관찰하였다.
예를 들면 레트로바이러스와는 대조적으로, 아데노바이러스는 1) 숙주 세포 게놈 내로 융합되지 않으며; 2) 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있고 3) 생체 내에서 재조합 유전자를 효과적으로 전이할 수 있다(Brody and Crystal, 1994). 이러한 특징은 아데노바이러스를, 예를들면 자멸 또는 사이토킨 유전자의 종양 세포 내로의 생체 내 유전자 전이를 위한 캔디데이트로서 관심을 모으게 한다.
그러나, 현재 재조합 아데노바이러스 기술과 연관된 문제는 재조합 아데노 바이러스를 생산하는 동안 원하지 않는 복제능이 있는 아데노바이러스(RCA)의 생성 가능성이다(Lochmuller et al., 1994; Imler et al., 1996). 이것은 293 세포와 같은 보완 세포주에 존재하는 아데노바이러스 구조물과 재조합 벡터와의 중복 서열 사이의 상동성 재조합에 의해 발생한다(Graham et al., 1977). 임상 시험에 사용될 배치 내의 RCA는 쓸모가 없는데, 왜냐하면 RCA는 1) 조절되지 않는 형태로 복제되고, 2) 복제 결함성 재조합 아데노바이러스를 보완하여 재조합 아데노바이러스의 비조절성 증식을 일으킬 수 있으며, 3) RCA를 함유하는 배치가 상당한 조직 손상을 유발하여 강력한 병리학적 부작용을 유발하기 때문이다(Lochmuller et al., 1994). 그러므로, 임상 시험에 사용될 배치는 RCA가 없는 것이 입증되어야만 한다(Ostrove, 1994).
본 발명의 목적은 바이러스 생산에서의 상기한 문제를 해결하고자 새로운 기본 벡터와 중복된 서열을 가지지 않음으로써 재조합 아데노바이러스의 안전한 대량 생산에 적당한 패키징 세포를 개발하기 위한 것이다.
도 1은 pBS.PGK.PCR1 구조물을 도시한 도면이다.
도 2는 pIG.E1a.E1b.X 구조물을 도시한 도면이다.
도 3(3a,3b)은 pIG.E1a.NEO 구조물을 도시한 도면이다.
도 4(4a,4b)는 pIG.E1a.E1b 구조물을 도시한 도면이다.
도 5는 pIG.NEO 구조물을 도시한 도면이다.
도 6은 유용한 아데노바이러스 패키징 구조물과 이의 일차 신장 세포를 형질 전환하는 능력의 측정 개요를 나타낸 도면이다.
도 7은 pIG.E1A.NEO으로 형질감염된 A549 클론 및 PER 클론(pIG.E1A.E1B로 형질감염된 HER 세포)의 웨스턴 블랏팅 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 8은 293, 911, PER 세포주의 서던 블랏 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 9는 PER.C3, PER.C5, PER.C6, 및 911 세포를 6-웰 플레이트에서 배양시키고, 칼슘 인산염 공동 침전에 의하여 5㎍ pRSV.lacZ로 형질감염(n=2)시키고, 48시간 후 상기 세포들을 X-GAL로 염색하여 블루 세포의 평균 퍼센트 함량을 나타낸 형질감염 효율 비교 시험 결과를 도시한 도면이다.
도 10은 pMLP.TK로부터 제조된 pMLPI.TK 구조물을 도시한 도면이다.
도 11a는 일차 세포에 기초한 패키징 시스템으로서, 서열 중복이 없는 새로운 재조합 아데노바이러스와 패키징 구조물을 도시하고 있습니다.
도 11b는 G418로 선택되고 E1a로 형질감염된 확립된 세포주에 기초한 패키징 시스템을 도시한 도면입니다.
도 12는 재조합 아데노바이러스의 생성 과정에 대한 도면입니다.
도 13은 아데노바이러스에서 유도되는 DNA 절편의 제조 과정을 도시한 도면이다.
도 14는 아데노바이러스의 복제 과정을 도시한 도면이다.
도 15는 본원발명에서 사용된 HP/asp 서열을 함유하는 단일 가닥 DNA 분자의 잠재적인 헤어핀 배열을 도시한 도면이다.
도 16은 pICLhac 벡터를 도시한 도면이다.
도 17은 pICLhaw 벡터를 도시한 도면이다.
도 18은 pICLI 벡터를 도시한 도면이다.
도 19는 pICL 벡터를 도시한 도면이다.
도 20a, 20b, 20c는 pICL 5620 BPS 원형 DNA의 서열(5/01/95 업데이트)이다.
본 발명의 한 관점에 있어서 바이러스 생산에서의 상기한 문제는 새로운 기본 벡터와 중복된 서열을 가지지 않음으로써 재조합 아데노바이러스의 안전한 대량 생산에 적당한 패키징 세포를 개발하여 해결되었다. 재조합 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것과 관련한 추가적인 문제점 중 하나는 아데노바이러스로의 처리에 대한 숙주 방어 반응이다.
요약하면, 재조합 아데노바이러스는 (상기한 바와 같이) E1 영역이 결실되어 있다. 아데노바이러스 E1 생성물은 다른 초기 유전자(E2, E3, E4)의 전사를 유발하여 결과적으로 후기 바이러스 유전자의 발현을 활성화한다. 그러므로, 일반적으로 E1이 결실된 벡터는 다른 어떠한 아데노바이러스 유전자도 발현하지 않는 것으로 생각되었다. 그러나, 최근 일부 세포종이 E1 서열 없이도 아데노바이러스 유전자를 발현할 수 있는 것으로 나타났다. 이것은 일부 세포종이 아데노바이러스 유전자의 전사를 유도하는 구조를 포함하는 것을 의미한다. 특히, 이러한 세포들이 E2A와 후기 아데노바이러스 단백질을 합성하는 것이 입증되었다.
유전자 요법 세팅에 있어서, 이것은 치료용 재조합 유전자가 체세포로 전이되는 것이 치료 단백질을 발현할 뿐만 아니라 바이러스 단백질을 발현할 수도 있음을 의미한다. 아데노바이러스 단백질을 발현하는 세포는 세포독성 T 림프구를 인식하여 박멸하므로 1) 형질도입된 세포를 박멸하고 2) 염증을 일으킨다(Bout et al., 1994a; Engelhardt et al., 1993; Simon et al., 1993). 이러한 역작용이 유전자 요법을 방해하므로 이 문제에 대한 여러 가지 해결방법이 제안되었는데, 예를들면 1) 치료 후에 면역억제제를 사용하거나; 2) 재조합 벡터 내에서 아데노바이러스 E3 영역을 존속시키거나(유럽 특허출원 제95202213호 참조); 3) E2A 영역 내에 포인트 돌연변이를 가지는 인간 아데노바이러스의 ts 돌연변이를 이용하는 방법(특허 WO/28938) 등이 있다.
그러나, 이러한 면역 반응을 회피하는 방법들은 한계가 있다.
ts 돌연변이 재조합 아데노바이러스를 이용하는 것은 면역 반응을 어느 정도 약화시키지만 폐에서 병리학적 반응을 억제하는 데는 효과가 적었다(Engelhardt et al., 1994a).
E2A 단백질은 그 자체가 면역 반응을 유도할 수 있고 최종 아데노바이러스 단백질 합성에 대한 스위치로 중요한 역할을 한다. 그러므로, 국제특허출원WO/28938에 기재된 바와 같이 E2 영역이 돌연변이되어 온도 민감성(ts)으로 된 재조합 아데노바이러스를 제조하는 것이 관심을 끌고 있다.
이 시스템의 주요 단점은 E2 단백질이 복제를 허용하지 않는 온도에서 불안정하지만 면역원성 단백질이 여전히 합성된다는 사실이다. 또한, 비록 낮은 정도이긴 하지만 상기 불안정한 단백질이 후기 유전자 발현을 활성화하는 것으로 예측된다. ts125 돌연변이성 재조합 아데노바이러스가 시험되었으며 지속적인 재조합 유전자 발현이 보고되었다(Yang et al., 1994b; Engelhardt et al., 1994a; Engelhardt et al., 1994b; Yang et al., 1995). 그러나, 코튼 래트의 폐에서의 병리학이 여전히 높아서(Engelhardt et al., 1994a) ts 돌연변이를 이용하는 것이 재조합 아데노바이러스 방법에서 부분적인 개선일 뿐인 것으로 나타났다. 다른 연구(Fang et al., 1996)에서는 ts125 재조합 아데노바이러스를 이용하여 마우스와 개에서 지속적인 유전자 발현을 관찰하지 못하였다. ts125 돌연변이 아데노바이러스를 이용하는 것과 관련한 다른 어려움은 리버젼(reversion)이 자주 관찰된다는 점이다. 이러한 귀선 돌연변이체는 실제 귀선 돌연변이체이거나 또는 제2 부위 돌연변이의 결과이다(Kruijer et al., 1983); Nicolas et al., 1981). 이들 2가지 형태의 귀선 돌연변이체는 정상적인 온도에서 작용하는 E2A 단백질을 가지므로 야생형 바이러스와 유사한 독성을 가진다.
그러므로, 본 발명의 다른 관점에 있어서, 본 발명자들은 재조합 아데노바이러스 게놈으로부터 E2A를 코드하는 서열을 삭제하고 이러한 E2A 서열을 E1 서열을 함유하는 (패키징) 세포주에 형질감염시켜 재조합 아데노바이러스 벡터를 보완하였다.
이러한 접근 방법에 있어서의 주요 장애물은 1) E2A가 매우 높은 수준으로 발현되어야 한다는 것과 2) E2A 단백질이 세포에 매우 유독하다는 것이다.
따라서, 또 다른 관점에서 본 발명은 복제를 허용하지 않는 온도에서 DNA 서열에 결합할 수 없는 단백질을 제조하는 ts125 돌연변이 E2A 유전자의 이용을 기재하였다. 복제가 허용되는 온도로 전환될 때까지 세포 내에서 상기 단백질이 높은 수준으로 유지될 수 있다(이 온도에서 유독하지 않으므로). 이것은 예를 들면, tet, 메탈로티오닌, 스테로이드 유도 프로모터, 레티노산 β-수용체 또는 기타 유도 시스템 등의 유도 프로모터 조절 하에 돌연변이 E2A 유전자를 두는 것과 결합될 수 있다. 그러나, 본 발명의 또 다른 관점에 있어서는 독성 야생형 E2A의 제조 시기를 조절하기 위한 유도 프로모터의 용도가 개시된다.
E2A-결실 재조합 아데노바이러스의 추가적인 현저한 이점 2가지는 이종 서열을 보유하는 용량의 증가와 돌연변이 E2A를 발현하는 세포에 대한 영구적인 선택성이다. 상기한 두 번째 이점은 ts125 돌연변이의 높은 빈도의 리버젼과 연관되어 있는데: ts125 E2A를 보유하는 세포주 내에서 리버젼이 발생할 때 이는 세포에 치명적이게 된다. 그러므로, ts125 돌연변이 E2A 단백질을 발현하는 세포들에 대한 영구적인 선택성이 있는 것이다. 또한, 본 발명자들은 본 발명의 한 관점에서 E2A-결실된 재조합 아데노바이러스를 생성하였으므로 본 발명에 따른 아데노바이러스에는 리버젼의 문제는 없다.
본 발명의 또 다른 관점에 있어서, 다른 개선방법으로 인간에서 유래하지 않은 세포주를 패키징 세포주로 이용하는 것을 개시하였다.
재조합 바이러스의 임상 배치의 GMP 제조에서는 다른 생명공학 생성물의 제조에 널리 사용되어 온 세포주를 이용하는 것이 바람직하다. 후자의 세포주 대부분은 백신 등을 제조하는데 사용되었던 원숭이에서 유래된다. 인간의 아데노바이러스는 원숭이에서 유래한 세포에서 복제되지 않거나 낮은 농도로만 복제되므로 상기한 세포는 재조합 인간 아데노바이러스의 제조에 직접 사용할 수 없다. 아데노바이러스 세포 용해 사이클의 초기에서 최종 단계로의 전환 장애는 결함이 있는 복제의 기초가 된다. 그러나, 인간 아데노바이러스 게놈 내의 숙주 영역 돌연변이는 원숭이 세포 내에서 인간 바이러스의 복제를 허용하는 것으로 기술되었다(hr400 - 404). 이러한 돌연변이는 E2A 단백질을 코드하는 유전자 내에 존재한다(Klessig and Grodzicker, 1979; Klessig et al., 1984; Rice and Klessig, 1985)(Klessig et al., 1984). 또한, 돌연변이 바이러스가 hr과 온도 감작성 ts125 표현형 모두를 갖는다고 기술되어 있다(Brough et al., 1985; Rice and Klessig, 1985).
그러므로, 본 발명자들은
1) E1/E2 결함 아데노바이러스의 복제를 허용하는 E1 서열, 및
2) E2A의 과도한 발현으로 인한 세포 치사를 방지하기 위한 ts400(Brough et al., 1985; Rice and Klessig, 1985)이라고 명명된, hr 돌연변이와 ts125 돌연변이를 함유하는 E2A 서열, 및/또는
3) 유도 프로모터의 조절 하에서 hr 돌연변이만을 함유하는 E2A 서열, 및/또는
4) 유도 프로모터의 조절 하에서 hr 돌연변이와 ts125 돌연변이(ts400)를 함유하는 E2A 서열:
을 갖는 원숭이 유래의 패키징 세포주(예를 들면, VERO, CV1 등)를 제조하였다.
또한, 본 발명에서는 (신규하고 개선된) 패키징 세포주와 (신규하고 개선된) 재조합 아데노바이러스 벡터의 신규하고 개선된 결합 구조체를 개시하였다. 본 발명에서는 다음과 같은 것들이 제공된다:
1. Ad5 게놈의 nt. 80 - 5788을 함유한 이배성 인간 태아 망막아세포(HER)에서 유도된 신규한 패키징 세포주. 911이라고 명명된 이 세포주는 ECACC에 제95062101호로 기탁되었으며, 일반적으로 이용되는 293 세포(Fallaux et al., 1996) 보다 우수한 많은 특징들이 있다.
2. E1B 유전자가 아니라 E1A 유전자만을 발현하는 신규한 패키징 세포주. E1B 없이 E1A를 발현하는 인간의 이배성 세포에서 일어나는 것과 같이, 확립된 세포주(293과 911 세포는 유도된 인간 이배성 세포가 아님)는 아폽토틱 세포 치사가 일어나지 않고 E1A를 높은 수준으로 발현할 수 있다. E1B 21 kD 단백질이 돌연변이된 바이러스는 야생형 아데노바이러스보다 훨씬 빨리 바이러스 복제를 완료할 수 있으므로(Telling., 1994) 상기한 세포주는 E1B가 결손된 재조합 아데노바이러스를 트란스-보완할 수 있다. 이 구조물은 이하에 상세히 기재하였으며 도 1-5에 그래프로 나타내었다. 이 구조물은 확립된 상이한 세포주 내로 형질감염(transfect)되어 E1A의 고발현을 위하여 선택된다. 이것은 E1B 프로모터에 직접 선택가능한 마커 유전자(예를들면 NEO 유전자)를 작용적으로 결합하여 실시된다. E1B 프로모터는 E1A 유전자 생성물에 의해 전사적으로 활성화되므로 선택제(예를들면 NEO가 선택 마커로서 사용되는 경우의 G418)에 대한 내성은 E1A 유전자의 바람직한 발현에 대하여 직접 선택을 유발한다.
3. E1B 21kD이 돌연변이되거나 제거되었지만 55kD 단백질을 발현하는 패키징 구조물.
4. 마커 유전자를 이용한 선택이 필요하지 않은 이배성 세포(인간에서 유래한 것을 포함하여)로부터 상보적 패키징 세포주를 생성하는데 사용될 수 있는 패키징 구조물. 이 세포들은 E1A의 발현에 의해 불멸화된다. 그러나, 특별한 경우에 있어서, E1B의 발현은 E1A 단백질에 의해 유도된 아폽토시스를 방지하는데 필수적이다. 각각 E1-형질전환된 인간의 태아 신장(HEK) 세포와 인간의 태아 망막아세포(HER)인 293 세포(Graham et al., 1977)와 911 세포(Fallaux et al., 1996)에 대하여 기재한 바와 같이 E1 발현 세포의 선택은 포커스 불멸화(immortalization)를 위한 선택에 의해 이루어진다.
5. HER 세포를 구조물 pIG.E1B로 형질감염시킨 후(도 4), 7개 각각의 세포주가 확립될 수 있다. 이러한 세포주를 PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8, 및 PER.C9로 표시하였다. PER은 PGK-E1-망막 아세포(Retinoblast)를 나타낸다. 이 세포주들은 E1A 및 E1B 단백질을 발현하고, 안정하며(예를 들면, 57 패키지 이상의 PER.C6) E1 결함이 있는 아데노바이러스 벡터를 보완한다. PER 세포에 대하여 얻어진 재조합 아데노바이러스의 수율은 293 세포에 대하여 얻어진 것보다 약간 더 높다. 상기한 세포주 중 하나(PER.C6)는 기탁번호 제96022940호로 ECACC에 기탁되었다.
6. 연장된 E1 결실(결실 nt. 459 - 3510)을 가지는 신규한 아데노바이러스 벡터. 이들 바이러스 벡터는 상기한 패키징 세포주 내에 E1 서열과 상동인 서열이 부족하다. pIX(그의 천연 프로모터 서열로부터 유래한)는 패키징 세포에 의해서가 아니라 벡터로부터만 발현될 수 있으므로(Matsui et al., 1986; Hoeben and Fallaux, pers. comm.; Imler et al., 1996), 상기한 아데노바이러스 벡터는 pIX 프로모터 서열과 pIX 유전자를 함유한다.
7. 바람직하게는 E1A 발현 확립된 세포주 또는 E1A - E1B 발현 이배성 세포에 기초한 E2A 발현 패키징 세포주(2 내지 4 항목 참조). E2A 발현은 유도 프로모터의 조절 하에 있거나 또는 유도 프로모터나 구성 프로모터에 의해 유도된 E2A ts125 돌연변이의 조절 하에 있다.
8. E2A 서열의 추가적 결실을 갖는 상기한 재조합 아데노바이러스 벡터(6 참조).
9. E1-결함 재조합 아데노바이러스를 트란스-보완할 수 있는 원숭이에서 유래한 아데노바이러스 패키징 세포. 바람직하기로는 이들은 pIG.E1AE1B와 pIG.NEO로 동시에 형질감염되어 NEO 내성으로 선택된다. E1A와 E1B를 발현하는 이러한 세포들은 E1 결함 재조합 인간 아데노바이러스를 트란스 보완할 수 있지만, 원숭이 유래의 세포에서 후기 아데노바이러스 단백질 합성에서의 장애로 인하여 그리 효율적이지는 않을 것이다(Klessig and Grodzicker, 1979). 이러한 문제를 해결하기위하여 본 발명자들은 E2A 유전자 내에서 숙주-영역 돌연변이를 갖는, 인간 아데노바이러스를 원숭이 세포에서 복제할 수 있는 재조합 아데노바이러스를 제조하였다. 이러한 바이러스들은 hr-돌연변이로부터의 DNA가 상동성 재조합에 사용되는 것을 제외하고 도 12에 기재된 바와 같이 제조된다.
10. 아데노바이러스 패키징 세포가 hr 돌연변이를 갖는 E2A 서열로 동시 형질감염된 것을 제외한, 항목 9에 기재된 바와 같은 원숭이에서 유래한 아데노바이러스 패키징 세포. 이것은 E1 및 E2A가 부족한 인간 아데노바이러스(항목 8 참조)를 복제할 수 있다. 상기한 세포주에서 E2A는 유도 프로모터의 조절 하에 있거나 tsE2A 돌연변이가 사용된다. 후자의 경우에 E2A 유전자는 ts 돌연변이와 hr 돌연변이(ts400에서 유도된)를 모두 운반하게 된다. 복제능이 있는 인간 아데노바이러스는 2가지 돌연변이 모두를 갖는 것으로 기술되어 있다(Brough et al., 1985; Rice and Klessig, 1985).
또한, 본 발명의 다른 관점에 따르면 다른 개선된 아데노바이러스 벡터뿐 만 아니라 상기한 벡터의 제조 및 사용을 위한 신규한 방법과 포유동물 내에서의 직쇄상 DNA 절편의 세포 내 증식방법이 제공된다.
본 발명에 따른 소위 "최소" 아데노바이러스 벡터는 바이러스 입자(인캡시데이션 시그널)에 게놈을 고정하는데 필요한 바이러스 게놈의 적어도 일부뿐 만 아니라, 선형 아데노바이러스 게놈의 말단에서 유도된 DNA 서열인 반전 말단 반복부(ITR)의 기능성 부분 또는 유도체의 1 이상의 복제물을 최소한 보유한다. 또한, 본 발명에 따른 벡터는 치료 유전자(transgene)의 발현을 지배하기 위하여 프로모터 서열에 결합된 치료 유전자도 포함할 수 있다. 소위 최소 아데노바이러스 벡터의 패키징은 헬퍼 바이러스 또는 임의로 다음에 기재한 패키징 결함 복제 헬퍼 시스템으로 동시감염하여 얻어질 수 있다.
적당한 세포주에서 복제할 수 있고 패키징 결함 복제 헬퍼 시스템으로서 작용할 수 있는 아데노바이러스에서 유도된 DNA 절편은 다음과 같이 제조되었다. 상기한 DNA 절편은 아데노바이러스 게놈의 "후기(late)" 전사 단위의 전사된 영역의 적어도 일부를 보유하며 E1 영역의 적어도 일부의 결실과 인캡시데이션 시그널의 적어도 일부의 결실을 운반한다. 또한, 상기한 DNA 절편은 반전 말단 복제물(ITR)의 1 이상의 복제물을 포함한다. 형질감염된 DNA 분자의 한쪽 말단에 ITR이 위치되어 있다. 다른 말단은 ITR, 또는 임의로 ITR 이외의 DNA 분자의 동일가닥의 일부에 상보적인 DNA 서열을 포함한다. 후자의 경우에 2개의 상보 서열이 어닐링하면, 헤어핀 구조의 3'-말단 뉴클레오티드의 유리 3'-히드록실기는 세포 및/또는 아데노바이러스를 코드하는 DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성 프라이머로서 작용하여 적어도 일부의 DNA 분자의 이중가닥 형태로 전환될 수 있다. 또한, ITR에서의 복제 개시는 2개의 ITR에 의하여 측면에 접해진 그리고 원래의 형질감염된 DNA 분자보다 큰 직쇄상 이중가닥 DNA 분자를 만들게 될 것이다(도 13 참조). 이 분자는 DNA 분자에 의해 코드되는 아데노바이러스 단백질과 숙주 세포 게놈 내의 유전자에 의해 코드되는 아데노바이러스 및 세포 단백질에 의해 형질감염된 세포 내에서 자체 복제될 수 있다. 이러한 DNA 분자는 그의 거대한 크기(39000 염기쌍 이상)와 기능성 인캡시데이션 시그널이 없어서 인캡시데이트될 수 없다. 이 DNA 분자는 적당한 세포주 내에서 결함이 있는 아데노바이러스 벡터를 제조하기 위한 헬퍼로서 작용하게 된다.
본 발명은 또한 적당한 포유동물 세포에서 다양한 크기의 직쇄상 DNA 단편을 증식하는 방법을 포함한다. 이러한 DNA 단편은 이 단편의 한쪽 말단에 적어도 하나 이상의 ITR 복제물을 포함한다. 다른 말단은 ITR이나 또는 임의로 ITR 이외의 DNA 분자의 동일가닥 일부분에 상보적인 DNA 서열을 함유할 수 있다. 후자의 경우, 2개의 상보적 서열이 어닐링하면, 헤어핀 구조의 3'-말단 뉴클레오티드의 유리 3'-히드록실기는 세포 및/또는 아데노바이러스를 코드하는 DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성 프라이머로서 작용하여 치환된 가닥 중 최소한 일부분 이상이 DNA 분자의 이중가닥 형태로 전환되게 할 수 있다. 또한, ITR에서의 복제 개시는 2개의 ITR에 의하여 측면에 접해진 원래의 형질감염된 DNA 분자 보다 큰 직쇄상 이중가닥 DNA 분자를 생기게 할 것이다(도 13 참조). 양 말단에 ITR 서열을 함유하는 DNA 분자는 적어도 아데노바이러스 E2 단백질, 즉 DNA-결합 단백질(DBP), 아데노바이러스 DNA 폴리머라제(Ad-pol), 및 프리터미날 단백질(pTP)의 존재로 인하여 형질감염된 세포에서 스스로 복제할 수 있다. 필요한 단백질은 상기한 DNA 분자 그 자체의 아데노바이러스 유전자, 숙주 세포 게놈에 결합된 아데노바이러스 E2 유전자, 또는 상기한 복제 헬퍼 단편으로부터 발현될 수 있다.
일부 연구에서는 복제에 필요한 아데노바이러스 단백질이 예를 들면 헬퍼바이러스로의 감염 등에 의하여 트랜스로 제공된다면, 복제할 수 있는 아데노바이러스 소염색체를 생산하기 위하여 DNA 분자 말단에 ITR 서열이 존재하는 것만으로도충분하다는 것을 입증하였다(Hu et al., 1992); (Wang and Pearson, 1985); (Hay et al., 1984). Hu 등(1992)은 단일 ITR을 함유하는 플라스미드의 형질감염 후에 대칭의 아데노바이러스 소염색체 다이머의 존재 및 복제를 관찰하였다. 상기 연구자들은 단일 ITR DNA 분자의 테일 대 테일 결찰 후에 상기한 다이머 소염색체가 발생하는 것을 관찰할 수 있었다. 결함이 있는 아데노바이러스 타입 2 입자로부터 추출된 DNA에서 전자현미경을 이용하여 여러 가지 크기의 다이머 분자가 관찰되었다(Daniell, 1976). 이것은 불완전한 게놈이 서로 다른 분자 간의 변칙적인 재조합에 의해 생성되고 변칙적인 염기쌍이 발생하는 서열 부위에서의 변이가 불완전한 게놈의 이종 성질에 기인한 것임을 의미한다. 이러한 메카니즘에 기초하여 이론적으로 전체 길이가 정상 게놈의 2배 정도인 결함이 있는 분자가 생성될 수 있다고 추측되었다. 상기한 분자들은 게놈의 어느 한 말단으로부터 복제된 서열을 함유할 수 있다. 그러나, 전장(full-length) 바이러스 보다 더 큰 DNA 분자가 결함이 있는 입자 내에서 패키지된 것을 발견하지 못하였다(Daniell, 1976). 이것은 패키징에 적용하는 크기 제한으로 설명될 수 있다. 또한, 바이러스 입자 내에서 복제된 왼쪽 단부를 갖는 DNA 분자가 오른쪽 단부 터미날을 함유하는 것보다 더 우세하다는 것이 관찰되었다(Kaniell, 1976). 이것은 게놈의 그 왼쪽 단부 근처의 인캡시데이션 시그널의 존재에 의해 충분히 설명될 수 있다(Grable and Hearing, 1990; Grable and Hearing, 1992; Hearing et al., 1987).
현재의 아데노바이러스에서 유도된 벡터와 관련된 주요 문제점들은 다음과 같다:
1) 바이러스 입자의 강력한 면역원성.
2) 아데노바이러스 벡터 내에 존재하는 아데노바이러스 유전자의 발현으로 인한 형질도입된 세포에 대한 세포독성 T-세포의 반응.
3) 현재의 벡터에 수용될 수 있는 소량의 이종 서열(최대한으로 약 8000 bp 이하의 이종 DNA)
Ad 1) 아데노바이러스 벡터의 단일 투여 이후에도 아데노바이러스 입자의 강력한 면역원성이 숙주의 면역학적 반응을 유발한다. 항체의 중화가 진행되는 결과로, 바이러스의 후속 투여는 효과가 거의 없거나 전혀 없을 것이다. 그러나, 전달된 유전자의 지속적이거나 안정된 발현은 요구되는 투여수를 감소시키며 이 문제를 피할 수 있다.
Ad 2) Wilson과 그의 협력자들에 의해 실시된 실험에서는 면역경합 동물에 아데노바이러스로 매개된 유전자를 전이시킨 후 치료 유전자의 발현이 점점 감소되어 감염 약 2 내지 4주 후에는 사라지는 것이 입증되었다(Yang et al., 1994a; Yang et al., 1994b). 이것은 형질도입된 세포에 대한 세포독성 T-세포(CTL)의 발달에 의해 유발된다. CTL은 바이러스 벡터에 의해 발현된 아데노바이러스 단백질에 대항한 것이었다. 형질도입된 세포에서, 아데노바이러스 DNA-결합 단백질(E2A-유전자 생성물), 펜톤과 섬유 단백질(후기-유전자 생성물)의 합성이 이루어질 수 있다. 바이러스 벡터에 의해 코드되는 상기한 아데노바이러스 단백질은 E1 영역이 결실되었음에도 불구하고 발현되었다. 이것은 E1 영역의 결실이 바이러스 유전자의 발현을 완전히 억제하는데 충분하지 못한 것임을 증명한다(Engelhardt et al.,1994a).
Ad 3) Graham과 그의 협력자들의 연구에서는 아데노바이러스가 정상 게놈 크기의 105% 이하의 DNA를 인캡시데이트할 수 있다는 것이 입증되었다(Bett et al., 1993). 더 큰 게놈은 불안정하여 바이러스의 전개 동안 DNA 서열이 손실되기 쉽다. 바이러스 게놈의 E1 및 E3 영역 내의 결실까지 결합되면 인캡시데이트될 수 있는 외부 유입물의 최대 크기를 약 8.3 kb까지 증가시킨다. 또한, E4 영역의 일부 서열은 바이러스 성장에 중요하지 않은 것으로 보인다(최대 인캡시데이션 용량에 1.8kb를 더 추가). E2A 유전자 생성물이 인캡시데이션 세포주에 트랜스로 제공되고 추가로 1.6kb를 첨가하면 E2A 영역은 상기 벡터로부터 결실될 수 있다. 그러나, 외래 DNA의 최대 용량은 12kb 이상으로 현저하게 증가할 것 같지는 않다.
본 발명자들은 외래 DNA 38kb까지를 수용할 수 있는 재조합 아데노바이러스 벡터의 헬퍼 프리-스톡을 생성 및 제조하는 새로운 방법을 개발하였다. 단지 2개의 기능성 ITR 서열과 인캡시데이션 시그널로서 작용할 수 있는 서열이 벡터 게놈의 일부여야 한다. 이러한 벡터를 최소 아데노벡터라 한다. 최소 아데노벡터를 위한 헬퍼 작용은 숙주세포 게놈 내에 존재하는 유전자들이나 또는 벡터 게놈 내에 존재하는 유전자를 제외한, 필요한 유전자 생성물을 코드하는 모든 바이러스 유전자를 함유하는 인캡시데이션 결함성 복제 경합 DNA 분자에 의해 트랜스로 제공된다.
본 발명의 적용방법을 이하에 요약하였으며 실험부분에서 예시될 것이다. 이것은 단지 예시의 목적으로써, 이 분야에 숙련된 인간들이 알고 있는 바와 같이본 발명의 범위를 축소하는데 사용될 수 없다.
IG 패키징 구조물 이배성 세포의 이용
구조물, 특히 pIG.E1A.E1B는 인간 태아 망막아세포(HER), 인간 태아 신장 세포(HEK), 인간 태아 폐 세포(HEL) 등의 이배성 인간 세포를 형질감염하는데 사용된다. 형질감염된 세포는 형질전환된 표현형(포커스 생성)에 대하여 선별되며 IG.Ad.MLPI.TK 등의 E1 결실된 재조합 아데노바이러스의 증식을 뒷받침하는 능력이 시험되었다. 이러한 세포주는 E1이 결실된 재조합 아데노바이러스의 생성 및 (대량) 제조에 사용될 것이다. 재조합 아데노바이러스로 감염된 상기 세포들은 또한 예를 들면 충실성 종양의 치료를 위한 재조합 아데노바이러스의 국소 생산자로서 생체 내에서 이용될 것이다.
911 세포는 재조합 아데노바이러스 벡터의 적정, 생성 및 제조에 사용된다(Fallaux et al., 1996).
pIG.E1A.E1B로 형질감염된 HER 세포는 7개의 개별적인 클론(PER 세포라 함)을 생성한다. 상기한 클론들은 E1이 결실된(중복되지 않은 아데노바이러스 벡터를 포함하여) 또는 E1 결함성 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조에 사용되며, E2A 또는 E4 내에 돌연변이가 있는 아데노바이러스 벡터를 증식시킬 수 있는 예를 들면, E2B 또는 E2A 구조물(ts125E2A 등, 이하 참조), E4 등의 삽입 기초를 제공한다.
또한, 코튼 래트(Sigmodon hispidus)(Pacini et al., 1984), 시리안 햄스터(Morin et al., 1987) 또는 침팬지(Levrero et al., 1991) 등의 인간 아데노바이러스의 복제를 허용하는 다른 종의 이배성 세포는 상기한 구조물로 불멸화될 것이다.재조합 아데노바이러스로 감염된 상기한 세포들은 또한 충실성 종양의 치료 등을 위한 재조합 아데노바이러스의 국소 생산을 위하여 생체 내에서 이용될 것이다.
확립된 세포(Established cell)
구조물, 특히 pIG.E1A.NEO는 A549(인간 기관지암), KB(경구암), MRC-5(인간 이배성 폐 세포주) 또는 GLC 세포주(소형 세포 폐암)(de Leij et al., 1985; Postmus et al., 1988) 등의 확립된 세포를 형질감염하는데 사용될 수 있으며 NEO 내성에 따라 선별될 수 있다. 내성 세포의 콜로니 각각을 단리하여 IG.Ad.MLPI.TK와 같은 E1이 결실된 재조합 아데노바이러스의 증식을 뒷받침하는 이들의 용량을 시험한다. E1A를 함유하는 세포 상에서 E1이 결실된 바이러스의 증식이 가능하다면 이러한 세포는 E1이 결실된 재조합 아데노바이러스의 생성 및 제조에 사용될 수 있다. 이들은 또한 E1A 결실/E1B 보유 재조합 아데노바이러스의 증식에 사용될 수 있다.
확립된 세포는 pIG.E1A.E1B 및 pIG.NEO (또는 다른 NEO를 함유하는 발현 벡터)로 동시 형질감염될 수 있다. G418에 대하여 내성이 있는 클론들은 IG.Ad.ML PI.TK와 같은 E1이 결실된 재조합 아데노바이러스의 증식을 뒷받침하는 이들의 능력을 시험하여 E1이 결실된 재조합 아데노바이러스의 생성 및 제조에 사용되고 (상기한) 이배성 세포에서 기재한 바와 같이 재조합 바이러스의 국소 생산을 위해 생체 내에서 이용될 것이다.
형질전환된 이배성 세포주 또는 NEO-내성인 확립된 세포주를 포함하는 모든 세포주는 E1 결함 재조합 아데노바이러스의 증식을 지지하며 E2A 및 E4 등의 다른유전자 내의 결실을 운반하는 "차세대" 패키징 세포주 생성의 기초로서 이용될 수 있다. 또한, 이들은 본 발명에 기재된 최소 아데노바이러스 벡터의 생성을 위한 기초를 제공한다.
E2 발현 세포주
E2A 서열을 발현하는 패키징 세포는 E2A 결실 재조합 아데노바이러스의 생성 및 (대량) 제조에 이용되고, 이용될 것이다.
새롭게 생성된 인간의 아데노바이러스 패키징 세포주 또는 인간 아데노바이러스의 복제를 허용하는 종으로부터 유도된 세포주(E2A 또는 ts125E2A; E1A - E2A; E1A - E1B - E2A; E1A - E2A/ts125; E1A - E1B - E2A/ts125) 또는 원숭이 세포 등과 같은 복제를 허용하지 않는 세포주(hrE2A 또는 hr - ts125E2A; E1A - hrE2A; E1A - E1B - hrE2A; E1A - hrE2A/ts125; E1A - E1B - hrE2A/ts125)는 E2A가 결실된 재조합 아데노바이러스 벡터의 생성 및 (대량) 제조에 이용될 수 있다. 또한, 이들은 상기한 이배성 세포에 대하여 기재한 바와 같이 재조합 바이러스의 국소 생산을 위하여 생체 내에서 적용될 수 있다.
신규한 아데노바이러스 벡터
nt. 459-3510의 E1 결실을 갖는 새롭게 개발된 아데노바이러스 벡터는 유전자 전이 목적으로 사용될 것이다. 이 벡터들은 E2A, E2B 또는 E4가 돌연변이된 추가 결실된 아데노바이러스 벡터의 개발을 위한 기초가 된다. 이 벡터들은, 예를들면 상기한 새로 개발된 패키징 세포주 상에 생성된다(1-3 참조).
최소 아데노바이러스 패키징 시스템
본 발명에서는 다음과 같은 특징을 가지는 아데노바이러스 패키징 구조물(최소 아데노바이러스 벡터의 패키징에 사용되는)을 기재하였다.
1. 패키징 구조물이 복제한다.
2. 패키징 시그널이 결실되었으므로 패키징 구조물이 패키지될 수 없다.
3. 패키징 구조물이 내부 헤어핀 생성 서열을 함유한다('실험예; 제안된 헤어핀' 참조; 도 15 참조).
4. 내부 헤어핀 구조로 인하여 패키징 구조물이 중복(duplicate)되는데, 즉 패키징 세포 내로의 형질감염 이전인 한 패키징 구조물의 DNA는 2배가 된다(본 발명의 샘플에서는 35kb 에서 70kb로 중복되었다). 또한, 이러한 중복은 패키징을 억제한다. 중복된 DNA 분자가 양쪽 터미날에 ITR을 가지는 것을 주목하여야 한다(도 13 참조).
5. 상기한 중복된 패키징 분자는 '정상적인 아데노바이러스' DNA 분자와 같이 복제할 수 있다.
6. 게놈의 중복은 최소 아데노바이러스 벡터를 패키지하는데 필요한 아데노바이러스 단백질의 충분한 농도를 제조하기 위한 선결조건이다.
7. 패키징 구조물은 최소 벡터 또는 상동성 재조합에 의해 RCA의 생성을 유발하는 세포 서열과 중복되는 서열이 없다.
이 패키징 시스템은 최소 아데노바이러스 벡터를 제조하기 위해 사용될 것이다. 예를 들면 백신 목적의 유전자 요법에 있어서 최소 아데노바이러스 벡터의 이점은 잘 알려져 있다(38kb까지 수용; 모든 잠재적으로 독성이고 면역원성인 아데노바이러스 유전자의 제거).
필수적 유전자(최소 아데노바이러스 벡터를 포함하여) 내에 돌연변이를 함유하는 아데노바이러스 벡터는 이 시스템을 이용하여 증식될 수 있다.
세포 내 E2 발현 벡터의 이용
최소 아데노바이러스 벡터는 패키징 결함 복제 헬퍼 분자에 의해 트랜스로 제공된 헬퍼 작용을 이용하여 생성되었다. 아데노바이러스에서 유도된 ITR 서열은 적어도 E2 유전자 생성물의 존재 하에서 DNA 복제의 기원으로 작용한다. E2 유전자 생성물이 벡터 게놈 내에서 유전자로부터 발현될 때(주: 유전자는 E1에 독립적인 프로모터에 의해 유도되어야 한다), 벡터 게놈은 표적 세포에서 복제될 수 있다. 이것이 표적 세포 내에서 주형 분자수를 상당히 증가시켜, 그 결과 상기 벡터에 의하여 코드된 목적 유전자의 증가된 발현이 가능해질 것이다. 이것은 암에 대한 유전자 요법의 접근 방법에 있어서 특히 주목된다.
직쇄상 DNA 절편의 세포내 증폭의 적용방법
직쇄상 DNA 절편의 증폭이 필요할 경우 유사한 접근방법이 선택될 수 있다. 1 이상의 ITR 서열이 그 말단 또는 그 근처에 위치한다면 알려진 또는 미지의 서열을 가지는 DNA 단편을 E2 유전자 생성물을 함유하는 세포 내에서 증폭시킬 수 있다. 단편의 크기에 대한 명백한 제한은 없다. 아데노바이러스 게놈(36 kb) 보다 훨씬 더 큰 단편조차도 이 방법을 이용하여 증폭되어야 한다. 따라서, (E. coli 등의) 박테리아에 단편을 셔틀링하거나 폴리머라제 체인 반응(P.C.R.)을 이용하지 않아도 포유동물 세포 내에서 거대 단편을 클로닝할 수 있다. 생산성 아데노바이러스 감염의 말기에서, 단일 세포는 100,000 카피 이상의 바이러스 게놈을 함유할 수 있다. 최적의 상황에서 직쇄상 DNA 단편은 비슷한 수준으로 증폭될 수 있다. 그러므로, 1천만 세포 당(35 kbp 단편에 대하여) DNA 단편 5㎍ 이상을 추출할 수 있어야 한다. 이 시스템은 조사 또는 치료 목적을 위한 이종 단백질(시미안 바이러스 40에 기초한 COS-세포 시스템과 동등한)을 발현하는데 사용될 수 있다. 또한, 이 시스템은 DNA의 거대 단편 내에서 유전자를 확인하는데 사용될 수 있다. 무작위 DNA 단편을 증폭시켜(ITR의 첨가 후에) 세포내 증식하는 동안에 발현시킬 수 있다. 원하는 표현형을 갖는 상기 세포들의 선별 및 선택은 목적하는 단편을 보강하고 그 유전자를 단리하는데 사용될 수 있다.
실시예
E1 결함성 재조합 아데노바이러스 벡터를 트란스 보완할 수 있는 세포주의 생성
1. 911 세포주
본 발명자들은 E1이 결실된 재조합 아데노바이러스(Fallaux et al., 1996)를 트란스 보완할 수 있는 아데노바이러스 타입 5의 E1 서열을 갖는 세포주를 생성하였다.
이 세포주는 Ad5의 nt. 80 - 5788을 함유하는 pAd5XhoIC로 인간 이배성 인간 태아 망막아세포(HER)의 형질감염에 의해 얻어졌으며; 생성된 형질전환체 중 하나를 911로 표시하였다. 이 세포주는 E1 결함성 재조합 아데노바이러스의 증식에 매우 유용한 것으로 나타났다. 293 세포 보다 훨씬 우수한 것이 확인되었다. 293세포와는 달리 911 세포는 완전히 형질전환된 표현형이 부족한데, 아마도 이것이 아데노바이러스 패키징 시스템으로서 더 잘 수행하는 이유일 것이다:
플라크 에세이가 더 빨리 수행될 수 있다(293의 8 내지 14일 대신에 4 내지 5일).
911 세포의 단일층이 플라크 에세이에 필요한 아가 오버레이(agar overlay) 하에서 생존율이 높다.
E1 결실 벡터의 증폭이 더 높다.
이외에도, 전단된 아데노바이러스 DNA로 형질감염된 293 세포와는 달리 911 세포는 규정된 구조물을 이용하여 형질감염되었다. 911 세포의 형질감염 효율은 293과 비슷하다.
신규한 패키징 구조물
아데노바이러스 서열의 공급원
아데노바이러스 서열은 인간 아데노바이러스 타입 5의 nt. 80 - 9460을 함유하는 pAd5.SalB 또는 야생형 Ad5 DNA로부터 유도된다(Bernards et al., 1983).
pAd5.SalB를 SalI과 XhoI으로 절단하고 거대 단편을 재결찰하여 이 새로운 클론을 pAd5.X/S로 명명하였다.
pTN 구조물(R. Vogels, IntroGene(NL)이 제조)은 인간의 PGK 프로모터와 NEO 유전자의 공급원으로 이용되었다.
인간 PGK 프로모터와 NEOR 유전자
새로운 패키징 구조물 내의 E1A 서열의 전사는 플라스미드 pTN(R. Vogels 제공)으로부터 유도된 인간 PGK 프로모터(Michelson et al., 1983; Singer-Sam et al., 1984)에 의해 유도되며 pUC119(Vieira and Messing, 1987)를 골격으로 이용한다. 이 플라스미드는 또한 B형 간염 바이러스(HBV) 폴리아데닐레이션 시그널에 융합된 NEO 유전자의 공급원으로도 사용되었다.
PGK 프로모터와 E1 유전자의 융합 (도 1)
Ad5의 E1 서열(ITR, 복제 및 패키징 시그널의 기원)을 이종 서열로 치환하기 위하여 본 발명에서는 Ea1 및 Ea2 프라이머(표 1 참조)를 이용하여 PCR 방법으로 Ad5의 E1 서열(nt.459 내지 nt.960)을 증폭시켰다. 얻어진 PCR 생성물을 ClaI으로 절단하고, ClaI과 EcoRV로 미리 절단된 Bluescript(Stratagene사 제품)에 결찰시켜 구조물 pBS.PCRI을 얻었다.
벡터 pTN을 제한효소 EcoRI(부분적으로) 및 ScaI으로 절단하고 PGK 프로모터 서열을 함유하는 DNA 단편을 ScaI과 EcoRI으로 절단된 PBS.PCRI에 결찰시켰다. 얻어진 구조물 PBS.PGK.PCRI은 nt.459에서 nt.916까지의 Ad5 E1 서열에 작용적으로 결합된 인간 PGK 프로모터를 함유한다.
pIG.E1A.E1B.X의 구성 (도 2)
pIG.E1A.E1B.X는 pAT-X/S의 ScaI-BspE1 단편을 PBS.PGK.PCRI(E1A 서열에 결합된 PGK 프로모터를 함유하는)으로부터 유래한 상응하는 단편으로 치환하여 제조되었다.
pIG.E1A.E1B.X는 PGK 프로모터의 조절 하에서 E1A 및 E1B를 코드하는 서열을 포함한다.
이 구조물 내에는 nt.459 내지 nt.5788의 Ad5 서열이 존재하므로 아데노바이러스의 pIX 단백질은 이 플라스미드에 의해 코드된다.
pIG.E1A.NEO의 구성 (도 3)
E1B 21 kD의 AUG 코돈이 NEOR의 AUG 코돈으로서 정확하게 작용하는 것과 같이 완전한 E1B 프로모터를 삽입하고 이 프로모터를 융합하기 위하여 본 발명에서는 프라이머 Ea3와 Ep2를 이용하여 E1B 프로모터를 증식시켰는데, 프라이머 Ep2는 PCR 단편의 NcoI 부위에 삽입된다. PCRII로 명명된 얻어진 PCR 단편을 HpaI과 NcoI으로 절단하여 HpaI과 NcoI으로 미리 절단된 pAT-X/S에 결찰시켰다. 얻어진 플라스미드는 pAT/X/S-PCR2로 표시되었다. NEO 유전자와 B형 간염 바이러스(HBV) 폴리아데닐화 시그널 일부를 함유하는 pTN의 NcoI-StuI 단편이 pAT-X/S-PCR2(NcoI 및 NruI으로 절단된)로 클로닝되었다. 얻어진 구조물은 pAT-PCR2-NEO이다. 폴리아데닐화 시그널은 pTN의 상응하는 단편으로 pAT-PCR2-NEO의 ScaI- SalI 단편을 치환(pAT.PCR2.NEO.p(A)를 얻고)하여 완성되었다. pAT.PCR2.NEO.p(A)의 ScaI-XbaI은 E1A 유전자에 결합된 PGK 프로모터를 함유하는 pIG.E1A.E1B-X의 상응하는 단편으로 치환되었다.
얻어진 구조물은 pIG.E1A.NEO로 명명되었고 이 구조물은 인간 PGK 프로모터의 조절 하에서 Ad5 E1 서열(nt.459 내지 nt.1713)을 함유한다.
pIG.E1A.E1B의 구성 (도 4)
pIG.E1A.E1B는 프라이머 Eb1과 Eb2(XhoI 부위에 삽입한다)를 이용하여 E1B 55kd의 N-터미날 아미노산을 코드하는 서열을 증폭하여 제조되었다. 얻어진 PCR단편을 BglII로 절단하여 pAT-X/S의 BglII/NruI에 클로닝하여 pAT-PCR3를 얻었다.
pIG.E1A.E1B는 pIG.E1A.NEO의 XbaI-SalI 단편과 pAT.PCR3의 XbaI-XhoI 단편을 교환하여 pAT-PCR3의 E1B 서열의 pIG.E1A.NEO 하향의 HBV 폴리(A) 서열을 삽입하여 구성되었다.
pIG.E1A.E1B는 E1A와 E1B 단백질을 코드하는 Ad5의 nt.459 내지 nt.3510을 함유한다. E1B 서열은 nt.3511의 스플라이스 수용체에서 종료된다. pIX 서열은 이 구조물 내에 없다.
pIG.NEO의 구조 (도 5)
pIG.NEO를 Ad.5 E1B 프로모터(promoter)의 조절하에서 NEO 유전자를 함유한 pIG.E1A.NEO의 HpaI-ScaI 단편을 EcoRV 및 ScaI으로 소화시킨 pBS로 클로닝(cloning)하여 얻었다.
이 구조는 확립된 세포가 E1A.E1B 구조로 형질감염되고 NEO 선택이 요구되는 경우에 유용하다. NEO 발현이 E1B 프로모터에 의해 지시되기 때문에 NEO 내성 세포는 E1A를 공동-발현(co-express)하도록 기대되어지고, 또한 상기 세포를 장기간 배양하는 동안 높은 수준으로 E1A를 유지하는데 유용하다.
구조물 테스트
구조물 pIG.E1A.NEO, pIG.E1A.E1B.X 및 pIG.E1A.E1B의 완전성을 제한효소맵핑에 의해 평가하였다: 또한, PCR 분석에 의해 얻어진 구조물의 일부분들을 서열분석에 의해 확인하였다. 뉴클레오티드 서열에 있어서 아무 변화도 발견되지 않았다.
상기 구조물은 일차 BRK(어린 래트의 신장) 세포로 형질감염되었고 이 세포들을 불멸화(pIG.E1A.NEO)시키거나 완전히 형질전환(pAd5.XhoIC, pIG.E1A.E1B.X 및 pIG.E1A.E1B)시키는 능력을 검사하였다.
생후 6일 지난 WAG-Rij 쥐의 신장을 분리하고, 균일화하여 트립신화하였다. BRK 세포 배양의 하부교회(交會) 접시(직경 5cm)는 SV40 초기 프로모터의 조절하에서 Ad5.E1B 유전자를 운반하면서 pIG.NEO, pIG.E1A.NEO, pIG.E1A.E1B, pIG.E1A.E1B.X, pAd5XhoIC 1 또는 5㎍, 또는 PDC26( Van der Elsen st al.,1983)과 함께 pIG.EIA.NEO로 형질감염되었다. 형질 감염 3주후, 포커스가 보이는 경우, 접시들은 고정되고, Giemsa가 염색되고 포커스가 계수되었다.
발생된 아데노바이러스 패키징 구조물 및 BRK를 형질전환하는 이들의 능력을 정리하여 도 6에 나타내었다. 상기 결과는 구조물 pIG.E1A.E1B 및 pIG.E1A.E1B.X 가 양(dose)-의존방식으로 BRK 세포를 형질전환할 수 있다는 것을 나타낸다. 형질전환 효율이 두 구조물에서 유사하고, 911 세포, 즉 pAd5.XhoIC를 만드는데 사용되는 구조물과 함께 발견된 것과 비교할 만 하다.
예상되는 바와 마찬가지로, pIG.E1A.NEO는 BRK를 거의 불멸화시킬 수 없었다. 그러나, E1B 발현 구조물(PDC26)의 공동 형질감염은 pIG.E1A.NEO에 의해 코드화된 E1A가 기능적이라는 것을 나타내면서 형질전환체의 수의 현저한 증가(18 대 1)를 일으켰다.
따라서, 본 발명자들은 새로 제조된 패키징 구조물은 새로운 아데노바이러스 패키징 라인의 제조에 적합하다고 판단한다.
새로운 패키징 구조물 세포주 및 세포 배양물로 세포주를 생성
인간의 A549 기관지 암 세포(Shapiro et al., 1978), 인간 태아의 망막 아세포(HER), Ad5-E1-형질전환된 인간 태아의 신장(HEK) 세포(293: Graham et al., 1977) 및 Ad5-형질전환된 HER 세포(911: Fallaux et al, 1996) 및 PER 세포는 37℃, 5% CO2 대기에서 10% 태아 송아지 혈청(FCS) 및 항생물질이 보충된 둘베코 모디파이드 이글 미디엄(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM)에서 배양되었다. 세포배양매질, 시약 및 혈청은 Gibco Labratories(Grand Island, NY)에서 구입하였다. 배양 플라스틱은 Greiner(Nurtingen, Germany) 및 Corning(Corning, NY)에서 구입하였다.
바이러스 및 바이러스 기술
아데노바이러스의 벡터 IG.Ad.MLP.nls.lacZ, IG.Ad.MLP.luc, IG.Ad.MLP.TK 및 IG.Ad.CMV.TK의 구조는 유럽특허 제 95202213 호에 상세히 기재되어 있다.
재조합 아데노바이러스 벡터 IG.Ad.MLP.nls.lacZ는 Ad2 메이저 후기 프로모터(MLP)의 조절 하에서 β-갈락토시다제를 코드하는 E.coli lacZ 유전자를 포함한다. IG.Ad.MLP.luc는 Ad2 MLP에 의해 유도된 개똥벌레 루시페라제 유전자를 함유한다. 아데노바이러스 벡터 IG.Ad.MLP.TK 및 IG.Ad.CMV.TK는 각각 Ad2 MLP 및 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서/프로모터의 조절 하에서 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(TK) 유전자를 함유한다.
형질감염
제조자 프로토콜에 따라 모든 형질감염을 GIBCO 인산 칼슘염 형질감염 시스템(GIBCO BRL Life Technologies Inc.,Gaithrsburg, USA)을 이용하여 칼슘-인산염 침전 DNA(Graham 과 van der Eb, 1973)에 의해 수행하였다.
웨스턴 블랏팅(Western blotting)
기하급수적으로 자란 293, 911, 및 Ad5-E1-형질전환된 A549의 하부교회배양 및 PER 세포를 PBS로 세척하고, Fos-RIPA 완충액(10mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.01% 소듐도데실설페이트(SDS), 1% NA-DOC, 0.5 mM 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF), 0.5mM 트립신 저해제, 50mM NaF 및 1 mM 나트륨 바나듐산염) 내에서 긁어내었다. 10분 후 실온에서 용질을 원심분리로 제거하였다. 단백질 농도를 바이오라드 단백질 분석 키트로 측정하고 25㎍의 전체 세포단백질을 12.5%의 SDS-PAA 겔에 로딩하였다. 전기영동후 단백질을 니트로셀룰로스(300mA에서 한시간)로 전이시켰다. 미리 염색된 표준품(Sigma, USA)을 평행하게 전개시켰다. 필터를 1시간 동안 TBST(10mM Tris, pH 8, 15mM NaCl 및 0.05% Tween-20)내에서 1% 보바인 혈청 알부민으로 고정시켰다. 첫 번째 항체는 A1C6 마우스의 단일클론 항-Ad5-E1B-55-kDa 항체 AlC6(Zantema et al., 미출판), 래트의 단일클론 항-Ad5-E1B-221-kDa 항체 ClGll(Zantema st al., 1985)였다. 두 번째 항체는 서양고추냉이 과산화효소-표지된 염소 항-마우스 항체(Promega)였다. 강화된 화학적 발광(Amersham Corp, UK)에 의하여 신호가 눈에 보였다.
써던 블랏(Souther blot) 분석
고분자량 DNA를 분리하여 10㎍을 절단하여 완료하고 0.7% 아가로즈 겔에서 분별하였다. 0.4M NaOH, 0.6M NaCl 전이용액으로 하이본드 N+(Amersham, UK)에 써던 블랏을 전이시켰다(Church and Gilbert, 1984). pAd5.SalB로부터 2463-nt SspI-HindIII 단편으로 혼성화가 실시되었다(Bernards et al., 1983). 상기 단편은 Ad5 bp. 342-2805로 이루어진다. 상기 단편이 랜덤 헥사뉴클레오티드 프라이머와 Klenow DNA 폴리머라제를 사용하여 α-32P-dCTP로 방사능 표지되었다. 써던 블랏을 -80℃에서 코닥 XAR-5 필름과 B&L 시스템 분자 동력 소프트웨어에 의해 분석된 Phospho-Imager 스크린에 노출시켰다.
A549
pIG.E1A.NEO로 형질전환하여 G418 내성을 선택함으로써 Ad5-E1-형질전환된 A549 인간의 기관지 암 세포주를 얻었다. 31개의 G418 저항 클론을 확립하였다. pIG.NEO에 의한 PIG.E1A.E1B의 공동-형질전환은 7개의 G418 내성 세포주를 생산하였다.
PER
일차 HER 세포를 플라스미드 pIG.E1A.E1B로 형질전환시켜 Ad5-E1-형질전환된인간 태아의 망막(HER) 세포를 얻었다. 형질전환된 세포주를 잘 분리된 포커스로부터 확립하였다. 본 발명자들은 7개의 클론 세포주를 확립하였고, 이들을 PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8 및 PER.C9으로 명명하였다.
상기 PER 클론중 하나인 PER.C6가 기탁번호 96022940으로 ECACC에 기탁되었다.
형질전환된 A549 및 PER 세포내의 Ad5 E1A 및 E1B 유전자의 발현
확립된 A549 및 PER 세포내의 Ad5 E1A 및 55 kDa과 21kDa E1B 단백질의 발현을 웨스턴 블랏팅의 방법에 의해 단일클론 항체(mAb)를 사용하여 연구하였다. Mab M73은 E1A 생성물을 인식하는 반면 Mabls AIC6 및 ClGll은 각각 55 kDa 및 21 kDa E1B 단백질을 지시한다.
항체는 모체 A549 또는 일차 HER 세포로부터 얻어진 추출물 내 단백질을 인식하지 못한다(데이타가 보이지 않음). pIG.NEO 및 pIG.E1A.E1B의 공동-형질전환에 의해 발생된 A549 클론 중 어느 것도 E1A 또는 E1B 단백질의 감지할 수 있는 수준으로 발현하지 않았다(보이지 않음). pIG.E1A.NEO로 형질전환되어 얻어진 A549 클론 일부는 A5d E1A 단백질을 발현하지만(도 7), 그 수준은 293 세포로부터 얻어진 단백질 용질 내에서 감지된 것보다 훨씬 낮았다. PER 세포의 단백질 추출물 내에서 감지된 정상 상태의 E1A 수준은 A549-유도된 세포의 추출물 내에서 감지된 수준보다 훨씬 높다. 모든 PER 세포주는 E1A 단백질을 비슷한 수준으로 발현하였다(도 7). E1B 단백질의 발현, 특히 E1B 55 kDa의 경우는 보다 다양하다. 911 및 293과 비교해 보면, PER 클론의 대다수는 E1B 55 kDa 및 21 kDa을 높은 수준으로 발현하였다. E1B 21 kDa의 정상상태 수준은 PER.C3 에서 가장 높았다. PER 클론의 어느 것도 세포의 연속 경로에서 Ad5 E1 유전자의 발현을 잃지 않았다. PER 세포내의 E1 발현의 수준이 적어도 100 개체군 배가기간 동안 안정하게 남아있다는 것이 밝혀졌다. 본 발명자들은 PER 클론을 더욱 상세하게 특성화시키기로 결정하였다.
PER 클론의 서던 분석(Southern analysis)
PER 클론 내의 Ad5-E1 코딩 서열 배열을 연구하기 위해, 본 발명자들은 서던 분석법을 실시하였다. 세포 DNA가 모든 PER 클론과 293 및 911 세포에서 추출되었다. HindIII으로 절단된 DNA는 Ad5 E1 영역에서 한 번 절단되었다. 방사성 표지된 Ad5-E1-특이성 프로브를 사용한 HindIII-절단 DNA의 서던 혼성화는 PER 클론의 게놈에서 pIG.E1A.E1B의 몇몇 통합된 복제형의 존재를 밝혀내었다. 도 8은 다른 PER 세포주의 고분자량 DNA에서 E1 서열의 분포 패턴을 보여준다. 단일 밴드 내에 집중된 복제형은 이들이 일렬 반복으로서 이루어진다는 것을 제시한다. PER.C3, C5, C6 및 C9의 경우, 본 발명자들은 pIG.E1A.E1B의 결절 복사형의 존재를 나타내는 저분자량의 추가적 혼성화 밴드를 발견하였다. 복제의 수는 포스포-이미저(Phospho-Imager)를 사용하여 결정하였다. 본 발명자들은 PER.C1, C3, C4, C5, C6, C8 및 C9가 Ad5 E1 코드 영역의 2, 88, 5, 4, 5, 5 및 3 복제형을 각각 포함하고, 911과 293 세포가 Ad5 E1 서열의 1과 4 복제형을 각각 포함한다고 추정하였다.
형질감염 효율
재조합 아데노벡터는 어댑터 플라스미드와 Ad5의 큰 ClaI 단편을 293 세포로 공동-형질감염시킴으로써 생성되었다(특허출원 EP 95202213 참조). 재조합 바이러스 DNA는 플라스미드 내에 존재하는 상동성 바이러스 서열과 아데노바이러스 DNA 간의 상동성 재조합에 의해 형성된다. 상기 방법과 다른 방법의 효용은 헬퍼 세포의 형질감염성에 의해 상당히 좌우된다. 따라서, 본 발명자들은 리포터로서 E.Coli β-갈락토시다제-코딩 lacZ 유전자를 사용하여, 911 세포와 몇몇 PER 클론의 형질감염 효율을 비교하였다(도 9).
재조합 아데노바이러스의 제조
서로 다른 아데노바이러스 벡터로 293, 911, PER.C3, PER.C5 및 PER.C6를 접종한 후에 얻어진 재조합 아데노바이러스 수득률을 표 2에 기재하였다.
얻어진 결과에 따르면 PER 세포 상에 얻어진 수득률이 적어도 기존의 세포주에서 얻어진 것 보다는 높은 것으로 나타났다.
또한, 신규한 아데노바이러스 벡터 IG.Ad.MLPI.TK의 수득률은 시험된 모든 세포주 상의 다른 바이러스 벡터에 대하여 얻어진 수득률과 동일하거나 더 높았다.
신규한 아데노바이러스 벡터의 생성 (도 10)
사용된 재조합 아데노바이러스 벡터(유럽 특허출원 제95202213호 참조)는 nt. 459 내지 nt. 3328까지의 E1 서열이 결실되었다.
구조물 pE1A.E1B는 nt. 459 내지 nt. 3510의 Ad5 서열을 함유하므로 패키징 구조물 pIG.E1A.E1B 내의 E1B 서열과, IG.Ad.MLP.TK 등의 재조합 아데노바이러스 사이에 183nt.의 서열 중복이 있다. 중복되는 서열은 새로운 아데노바이러스 벡터로부터 삭제되었다. 또한, 원래의 구조물 내에 존재하는, lacZ로부터 유도된 비코딩 서열도 삭제되었다. 이것은 프라이머 SV40-1(BamHI 부위 삽입)과 SV40-2(BglII 부위 삽입)를 이용하여 pMLP.TK로부터 SV40 폴리(A) 서열을 PCR 증폭시켜 얻었다(도 10). 또한, 이 구조물 내에 존재하는 Ad5 서열은 nt. 2496(Ad5. BglII 부위 삽입)에서 nt. 2779(Ad5-2)까지 증폭되었다. 양 PCR 단편을 BglII로 절단하여 결찰하였다. 결찰 생성물은 프라이머 SV40-1과 Ad5-2를 이용하여 PCR 증폭되었다. 얻어진 PCR 생성물은 BamHI과 AflII로 절단되어 동일한 효소로 미리 절단된 pMLP.TK에 결찰되었다. 얻어진 구조물은 pMLPI.TK로 명명되었으며, nt. 459에서 nt. 3510까지의 아데노바이러스 E1 서열이 결실되었다.
패키징 시스템
중복되는 어떠한 서열도 없는 신규한 패키징 구조물 pIG.E1A.E1B와 재조합 아데노바이러스 pMLPI.TK의 조합을 도 11a,b에 나타내었다. 이 도면에서는 서열 중복이 표시된 원래의 상태를 나타내었다.
pIG.E1A.E1B와 pMLPI.TK 사이에 중복 서열이 없는 것은(도 11a) 패키징 구조물과 재조합 바이러스 간의 상동성 재조합의 가능성을 배제하는 것이므로 원래의 상태와 비교하여 재조합 아데노바이러스의 제조에 있어서 상당히 개선된 것이다.
도 11b에는 pIG.E1A.NEO와 IG.Ad.MLPI.TK를 도시하였다. 확립된 세포 내로 형질감염되었을 때 pIG.E1A.NEO는 E1이 결실된 재조합 아데노바이러스의 증식을 뒷받침하는데 충분할 것으로 기대된다. 이 조합은 어떠한 서열 중복도 가지지 않으므로 상동성 재조합에 의한 RCA 생성을 방지한다. 또한, 이와 같은 간편한 패키징 시스템은 E1B 서열이 아니라 E1A 서열만이 결실된 재조합 아데노바이러스의 증식이 가능하게 한다. E1B 단백질, 특히 E1B 19kD은 종양괴사인자(TNF)에 의한 감염된 인간 세포의 용균현상을 억제할 수 있으므로(Gooding et al., 1991), E1A가 없는 조건 하에서 E1B를 발현하는 재조합 아데노바이러스는 매우 주목된다.
pMLPI.TK로부터 유도된 재조합 아데노바이러스의 생성
재조합 아데노바이러스는 SalI으로 선형화된 pMLPI.TK DNA와 ClaI으로 선형화된 Ad5 wt DNA로 293 세포를 동시-형질감염하여 생성되었다. 이 과정을 도 12에도해하였다.
최소 아데노바이러스 벡터의 패키징 시스템을 생성하는 방법의 개요
사용된 플라스미드의 명칭 약정:
P 플라스미드
I ITR(아데노바이러스 반전 말단 반복부)
C 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서/프로모터 조합
L 각각 정방향과 역방향에서 제한 엔도뉴클레아제 Asp718로 절단한 후 생성될 수 있는 개똥벌레 루시페라제 코딩 서열 hac, haw 포텐셜 헤어핀 (도 15)
어닐링된 올리고뉴클레오티드 쌍 HP/asp1 및 HP/asp2를 함유하는 플라스미드 pICLhac의 제한 엔도뉴클레아제 Asp718I로의 제한은 선형 이중 가닥 DNA 단편을 제공할 것이다. 원하는 아데노바이러스 유전자가 존재하는 세포 내에서, 복제는 ITR 서열을 함유하는 터미날에서 개시될 수 있다. 사슬 연장 동안, 상기 가닥 중 하나는 이동될 것이다. 단일 가닥, 치환된 가닥 분자의 터미날은 도 15에 개시된 배열을 채택할 수 있다. 이 배열에서, 유리된 3' 터미날은 세포 및/또는 아데노바이러스 DNA 폴리머라제를 위한 프라이머로 작용할 수 있어, 이중 가닥 형태에서 이동된 가닥의 전환을 일으킬 수 있다.
예: pICLhaw는 아데노바이러스 ITR 뒤에 CMV-유도 루시페라제 유전자와 역방향(비기능성)의 Asp718 헤어핀이 이어지는 플라스미드이다.
1.1 아데노바이러스 유전자를 함유하고 발현하는 세포 내에서 이중가닥 DNA 분자의 생성을 위한 역방향 가닥 합성의 프라이머로서 작용하는, 헤어핀 구조를 생성할 수 있는 합성 DNA 서열의 반응력 증명.
플라스미드 pICLhac, pICLhaw, pICLI, 및 pICL은 표준 방법에 의하여 생성되었다. 이들 플라스미드를 도 16 내지 19에 도해하였다.
플라스미드 pICL은 다음 플라스미드들로부터 유도되었다:
nt.1 - 457 pMLP10 (Levrerno et al., 1991)
nt.458 - 1218 pCMVβ (Clontech. EMBL Bank No. U02451)
nt.1219 - 3016 pMLP.luc (IntroGene, 미공개)
nt.3017 - 5620 pBLCAT5 (Stein and Whelan, 1989)
이 플라스미드는 다음과 같이 구성되었다:
플라스미드 pMLP10의 tet 유전자는 BamHI-SalI 단편의 삭제에 의해 불활성화되어 pMLP10ΔSB를 생성하였다. 프라이머 셋트 PCR/MLP1과 PCR/MLP3를 이용하여 합성 SalI 제한 부위가 옆에 있는 Ad5-ITR을 함유하는 210 bp 단편을 pMLP10 DNA를 주형으로 하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 효소 EcoRI과 SgrAI으로 절단하여 196 bp 단편을 생성하였다. ITR을 제거하기 위해 플라스미드 pMLP10ΔSB를 EcoRI과 SgrAI으로 절단하였다. 이 단편을 EcoRI-SgrAI으로 처리된 PCR 단편으로 치환하여 pMLP/SAL을 생성하였다. 완료를 위하여 플라스미드 pCMV-Luc를 PvuII로 절단하고 재순환시켜서 SV40에서 유도된 폴리아데닐레이션 시그널과 Ad5 왼쪽 터미날이 없는 Ad5 서열을 제거하였다. 얻어진 플라스미드 pCMV-lucΔAd에서, Ad5 ITR은 XmnI-SacII 단편을 교환하여 플라스미드 pMLP/SAL에서 유래한 Sal-부위의 옆에 있는 ITR로 치환되었다. 얻어진 플라스미드 pCMV-lucΔAd/SAL, Ad5 왼쪽 터미날 및 CMV에서 유도된 루시페라제 유전자를 SalI-SmaI 단편으로서 단리하고 SalI과 HpaI으로 분해된 플라스미드 pBLCATS에 삽입하여 플라스미드 pICL을 제조하였다. 플라스미드 pICL은 도 19에 나타내었으며 그의 서열은 도 20(a,b,c)에 기재하였다.
플라스미드 pICL은 다음과 같은 특징을 가진다:
nt.1-457 Ad5 왼쪽 터미널
(인간의 아데노바이러스 타입 5의 서열 1 내지 457)
nt.458-969 인간 사이토메갈로바이러스 인핸서 및 중간체
초기 프로모터 (Boshart et al., 1985)(플라스미드 pCMVβ(Clontech사
제품, Palo Alto, USA)에서 유래)
nt.970-1204 SV40 19S 엑손과 결절된 16/19S 인트론
(플라스미드 pCMVβ에서 유래)
nt.1218-2987 개똥벌레 루시페라제 유전자 (pMLP.luc에서 유래)
nt.3018-3131 최종 전사물(플라스미드 pBLCAT5에서 유도된)에서 유래한
SV40 일렬 폴리아데닐레이션 시그널
nt.3132-5620 pUC12 골격(플라스미드 pBLCAT5에서 유래)
nt.4337-5191 β-락타마제 유전자(Amp-내성 유전자, 역방향)
플라스미드 pICLhac 및 pICLhaw
플라스미드 pICLhac와 pICLhaw는 제한효소 Asp718로 후자 플라스미드 pICL을 절단하여 유도된다. 선형화된 플라스미드는 송아지의 장내 알칼리성 포스파타제로 처리되어 51개의 인산기가 제거된다. 부분 상보성 합성 단일가닥 올리고뉴클레오티드 Hp/asp1과 Hp/asp2를 어닐링하여 T4-폴리뉴클레오티드 키나제를 이용하여 이들의 5' 말단에 인산화하였다.
인산화된 이중가닥 올리고머를 탈인산화된 pICL 단편과 혼합하여 결찰하였다. 플라스미드에 삽입된 합성 올리고뉴클레오티드의 단일 카피를 함유하는 클론을 단리하여 제한효소 분해로 특성화하였다. 이 올리고뉴클레오티드를 Asp718 부위에 삽입하면 한 접합점에서는 Asp718 인지 부위를 재현하지만 다른 접합점에서는 인지 부위가 파괴된다. 삽입된 올리고뉴클레오티드의 배향 및 보전은 서열 분석에 의해 선택된 클론들에서 증명되었다. 정방향(3205 EcoRI 부위에 근접한 Asp718 부위)의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 클론을 pICLhac로 표시하였다. 역방향의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 클론(SV40에서 유도된 폴리 시그널에 근접한 Asp718 부위)을 pICLhaw로 표시하였다. 플라스미드 pICLhac와 pICLhaw를 도 16과 17에 나타내었다.
플라스미드 pICLI은 pICL의 Asp718 사이트에 Ad5-ITR을 포함하는, pICL에 SalI-SgrAI 단편을 삽입하는 것으로 플라스미드 pICL로부터 만들었다. 194 bp SalI-SgrAI 단편은 pICL로부터 분리되고, 접착(cohesive) 말단은 E.coli DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편)과 dNTP's를 사용하여 평활(blunt) 말단으로 전환하였다. Asp718 접착 말단은 녹두(mungbean) 뉴클레아제로의 처리에 의해 평활 말단으로 전환하였다. 결찰에 의해 플라스미드 pICL의 Asp718 사이트에 ITR을 포함한 클론을 발생시켰다. 정 배향에 ITR 단편이 포함된 클론은 pICLI로 지정되었다(도 18).
아데노바이러스 Ad-CMV-hcTK의 생성. 재조합 아데노바이러스는 유럽특허출원 95202213에 기재된 방법에 따라 구성하였다. 두 성분들이 재조합 아데노바이러스를 생성하는데 요구된다. 첫 번째, ITR과 패키징 신호를 포함하는 아데노바이러스 게놈의 왼쪽 터미날, 원하는 유전자를 갖는 발현 카세트, 및 상동성 재조합에 사용될 수 있는 아데노바이러스 게놈의 일부를 포함한 어댑터(adaptor)-플라스미드이다. 추가로, 아데노바이러스 DNA가 상기 언급된 어댑터-플라스미드와의 재조합에 필요하다. Ad-CMV-hcTK의 경우, 플라스미드 PCMV.TM이 기초로 사용된다. 이 플라스미드는 아데노바이러스 유형 5 게놈의 nt. 1-455, pCMVβ 유래 nt. 456-1204(클론테크, CMVV 인핸서 프로모터와 시미안 바이러스 40의 16S/19S 인트론을 함유하는 PstI-StuI 단편), 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 유전자(유럽특허출원 95202213호에 기재), SV40-유도된 폴리아데닐레이션 시그널(SV40 서열의 nt. 2533-2668), 이어서 Ad5의 BglII-ScaI 단편(Ad5 서열의 nt. 3328-6092)을 포함한다. 이들 단편들은 pMLP10-유래된(Levrero et al., 1991) 골격에 존재한다. 플라스미드 pAD-CMVhc-TK를 얻기 위하여, 플라스미드 pCMV.TK는 ClaI으로 절단되고(독특한 ClaI-부위가 TK 오픈 리딩프레임의 바로 상향에 위치된다), 송아지-장 알카리성 인산염으로 탈인산화되었다. 헤어핀-구조를 만들기 위해, 합성 올리고뉴클레오티드 HP/cla2 및 HP/cla2를 어닐링하고, T4-폴리뉴클레오티드 키나제와 ATP로 이들의 5'-OH기에 인산화하였다. 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 선형화된 벡터 단편으로 결찰되어, E.coli 스트레인 "Sure"을 형질전환하기 위해 사용되었다. ClaI 부위로의 올리고뉴클레오티드의 삽입은 ClaI 인지 부위를 붕괴시킬 것이다. 올리고뉴클레오티드에서 이들의 터미날 한 쪽 부근에 새로운 ClaI 부위가 포함된다. 선택된 클론에서, 삽입된 올리고뉴클레오티드의 배향과 완전성은 서열 분석에 의하여 확인되었다. 바른 배향(ITR 쪽에 ClaI 부위)에 올리고뉴클레오티드를 갖는 클론은 pAd-CMV-hcTK로 표시된다. 이 플라스미드는 야생형 아데노바이러스-5 DNA로 절단된 ClaI로 911 세포에 공동-형질감염되었다. CMV-hcTK 발현 카세트를 El 서열로 복원한 재조합 아데노바이러스를 분리하고, 표준 공정을 사용하여 증식시켰다.
복제가 ITR에서 시작된 후 교체된 가닥상에서 역 가닥 합성을 위한 프라이머로서 헤어핀이 사용될 수 있는지 여부를 연구하기 위하여, 플라스미드 pICLhac가 911 세포(아데노바이러스 E1 영역으로 형질전환된 인간 태아의 망막아세포)로 도입된다. 플라스미드 pICLhaw는 대조군으로서 제공되는데, 이것은 올리고뉴클레오티드 쌍 HP/asp 1 및 2를 역배향으로 포함하지만, 또한 플라스미드 pICLhac와 완전히 동일하다. 또한 이 연구에는 pICLI와 pICL도 포함된다. 플라스미드 pICLI에서 헤어핀은 아데노바이러스 ITR로 교체된다. 플라스미드 pICL은 헤어핀 또는 ITR 시퀀스 모두를 포함하지 않는다. 이들 플라스미드는 터미날-헤어핀 구조를 가지므로 복제 효율을 결정하는데 있어서 대조군으로서 제공된다. DNA 복제를 위해 요구되는 El 단백질(911 세포로부터 생성) 이외에 바이러스 생성물을 제공하기 위해, 형질감염후에 배양액이 바이러스 IG.Ad.MLPI.TK로 감염된다. 여러 가지 파라미터가 형질감염된 DNA 분자의 적절한 복제를 나타내기 위해 연구되고 있다. 첫 번째, 상기 언급된 플라스미드로 형질감염되고, IG.Ad.MLPI.TK 바이러스로 감염된 세포 배양액으로부터 추출된 DNA는 예상되는 복제 중간체의 존재에 대해서, 뿐만 아니라중복된 게놈의 존재에 대해서 서던 블라팅으로 분석한다. 또한, 형질감염되고 IG.Ad.MLPI.TK 감염된 세포군으로부터 바이러스가 분리되어, 이것이 루시페라제 표시 유전자를 루시페라제 네가티브 세포로 전달 및 발현할 수 있다.
플라스미드 pICLhac, pICLhaw, pICLI 및 pICL의 플라스미드 DNA는 제한 엔도뉴클레아제 SalI으로 절단되고 녹두 뉴클레아제로 처리되어, 얻어진 DNA 단편 중 4개의 뉴클레오티드 단일-가닥 연장부를 제거하였다. 이런 방식으로, DNA 단편상에 천연 아데노바이러스 5'-ITR 단부를 만든다. 이어서, pICLhac 및 pICLhaw 플라스미드 모두를 제한 엔도뉴클레아제 Asp718로 절단하여 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단부를 만든다. 각각의 플라스미드당 4개의 접시로 표준 인산칼슘 공동침전 방법을 이용하여 분해된 플라스미드가 911 세포로 도입된다. 형질감염동안, 각 플라스미드에서 상기 배양액 중 2개가 세포마다 5개의 감염성 IG.Ad.MLPI.TK 입자를 사용하여 IG.Ad.MLPI.TK 바이러스로 감염되었다. 20시간 후-형질감염과 4시간 후-형질감염에서 하나의 Ad.tk-바이러스-감염된 그리고 하나의 감염되지 않은 배양액을 Hirt에 의해 고안된 공정을 사용하여 저분자량 DNA를 분리하는데 사용한다. 분리된 DNA의 부분 표본을 서던 분석에 사용하였다. 탐침자로서 루시페라제 유전자를 사용하여 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI로 샘플을 절단한 후, 플라스미드 pICLhac로 형질감염된 아데노바이러스 감염된 세포로부터 얻어진 샘플에서만 약 2.6kb의 혼성 단편이 감지된다. 이 단편의 크기는 루시페라제 표시 유전자의 예견된 중복으로 균일하다. 이것은 삽입된 헤어핀이 역 가닥 합성을 위한 프라이머로서 제공될 수 있다는 결론을 지지한다. IG.Ad.MLPI.TK 바이러스가 생략되거나 또는 헤어핀 올리고뉴클레오티드가 역배향으로 삽입되는 경우는 혼성 단편이 존재하지 않는다.
제한 엔도뉴클레아제 DpnI은 테트라뉴클레오티드 서열 5'-GATC-3'을 인지하지만, 메틸화된 DNA만을 절단한다(즉, E.coli에서 증식되고 이로부터 유래된 (플라스미드) DNA 만이며, 포유류 세포에서 중복된 DNA는 아님). 제한 엔도뉴클레아제 MboI은 동일한 서열을 인식하지만, 메틸화된 DNA 만을 절단한다(즉, 포유류 세포에서 증식된 DNA). 형질감염된 세포들에서 분리된 DNA 샘플은 MboI와 DpnI으로 배양되어 서던 블라팅으로 분석된다. 이들 결과는 pICLhac 및 pICLI 플라스미드로 형질감염된 세포에서만 큰 DpnI-내성 단편이 존재하고, MboI 처리된 샘플에서는 존재하지 않는다는 것을 보여준다. 이들 데이터는 플라스미드 pICLI와 pICLhac의 형질감염 후에만 단편의 복제와 중복이 발생한다는 것을 보여주었다.
이들 데이터는 아데노바이러스-감염된 세포에서 한 쪽 터미널에는 아데노바이러스-유래 반전 말단 반복부(ITR)를 가지고, 다른 쪽 터미널에는 같은 가닥 상 서열로 어닐링할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 선형 DNA 단편은 단일 가닥 형태로 존재하는 경우 헤어핀 구조를 만들 수 있고, 양쪽 말단에 반전 말단 반복부 서열을 갖는 구조로 전환된다는 것을 나타낸다. 얻어진 DNA 분자는 야생형 아데노바이러스 게놈과 동일한 메카니즘에 의해 복제될 것이다.
1.2 루시페라제 표시 유전자, ITR의 단일 카피, 인캡시데이션 시그널 및 합성 DNA 서열을 포함하고, 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 DNA 분자가 비리온(virions)으로 인캡시데이트될 수 있는 DNA 분자를 생산하기에 충분하다는 증거.
2개의 복사본 CMV-luc 표시유전자를 포함한 상기 DNA 분자가 비리온으로 인캡시테이트될 수 있다는 것을 보이기 위해, 바이러스는 남아있는 2개의 배양액으로부터 3회의 냉동-해동 분쇄를 통해 얻어지고 무린 섬유아세포를 감염시키는데 사용된다. 감염 후 48시간에, 감염된 세포의 루시페라제 활성을 분석하였다. 루시페라제 활성이 바이러스 입자를 통해서 보다는, 유리 DNA의 전이에 의해 유도될 가능성을 배제하기 위해, 바이러스 스톡(stock)을 DNaseI으로 처리하여 DNA 불순물을 제거하였다. 또한, 추가 제어로서, 바이러스 스톡의 정제수(aliquot)를 56℃에서 60분 동안 배양하였다. 열처리는 오염 DNA에 영향을 주지 않지만, 바이러스를 불활성시킨다. 현저한 루시페라제 활성은 pICLhc와 pICLI 플라스미드로 형질감염된 IG.Ad.MLPI.TK-감염된 세포로부터 유도된 바이러스 스톡에 감염된 후 세포 내에서만 발견된다. 비감염 세포와 pICLhw와 pICL로 형질감염된 감염 세포에 어디에서도 현저한 루시페라제 활성이 나타날 수 없다. DNaseI 처리되지 않은, 열로 인한 불활성은, 완전히 루시페라제 발현을 제거하고, 아데노바이러스 입자와, 유리되지 않은 (불순) DNA 단편이 루시페라제 리포터 유전자를 전이시킨다는 것이 입증된다.
이들 결과는 이들 작은 바이러스 게놈이 아데노바이러스 입자로 인캡시데이트될 수 있다는 것을 나타내고, ITR과 인캡시데이션 시그널이 선형 DNA 단편을 아데노바이러스 입자로 인캡시데이션하는데 충분하다는 것을 제시한다. 이들 아데노바이러스 입자는 효율적인 유전자 전이에 사용될 수 있다. 아데노바이러스 유전자(즉, E1, E2, E4, 및 L, 및 VA)의 적어도 일부를 함유하고 발현하는 세포내로 도입될 때, 1 이상의 ITR로 이루어진 재조합 DNA 분자, 인캡시데이션 시그널의 적어도일부 및 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 합성 DNA 서열은 비리온으로 인캡시데이트될 수 있는 재조합 게놈을 자발적으로 발생시키는 고유한 능력을 갖는다. 이러한 게놈과 벡터 시스템은 유전자 전이에 사용될 수 있다.
1.3 아데노바이러스 타입 5 게놈의 뉴클레오티드 3510-35953(즉 9.7-100 맵 유니트)를 포함하는 DNA 분자(이로 인하여 E1 단백질-코딩 영역, 오른쪽 ITR과 인캡시데이션 서열 결핍)와 ITR과 다른 단일 가닥 형태로 존재할 때, 그 결과로 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 상기 DNA 분자의 동일 가닥의 일부에 상보적인 터미날 DNA 서열이 911 세포 내에서 복제할 수 있다는 증거.
상기 언급된 ICLhac 벡터 게놈과 유사 최소 아데노벡터가 헬퍼(helper) 세포에 의해 아데노바이러스 입자 내로 인캡시데이트되는 데 필요한 아데노바이러스 생성물을 제공할 수 있는 복제 DNA 분자를 개발하기 위해, Ad-CMV-hcTK 아데노바이러스 벡터가 개발되었다. CMV 인핸서/프로모터 영역과 티미딘 키나제 유전자 사이에 어닐링된 올리고뉴클레오티드 쌍 HP/cla 1과 2가 삽입되었다. 표준 방법을 사용하여 벡터 Ad-CMV-hcTK가 911 세포내에서 번식되고 생성될 수 있다. 이 벡터는 오직 형질감염에 사용되는 DNA의 공급원으로서 성장하고 배타적으로 증식된다. 아데노바이러스 Ad-CMV-hcTK의 DNA는 표준 기술에 의해 CsCl 밀도-구배 원심분리를 사용하여 정제된 바이러스 입자로부터 단리된다. 바이러스 DNA는 제한 엔도뉴클리아제 ClaI으로 절단되었다. 절단된 DNA는 0.7% 아가로스 겔 상에 크기-분별되어 큰 단편은 분리되어 그 다음 실험에 사용된다. 911 세포 배양액을 표준 칼슘 인산염 공동침전 기술을 사용하여 Ad-CMV-hcTK의 큰 ClaI-단편으로 형질감염시켰다. 플라스미드 pICLhac로 이전의 실험과 매우 유사하게, 오른쪽 ITR에서 출발하여 Ad-CMV-hc가 복제할 것이다. 일단 1-가닥이 전이되고, 헤어핀이 단편의 왼쪽 터미날에서 형성될 수 있다. 이것은 체인이 오른쪽을 향해 연장되도록 DNA 폴리머라제를 촉진한다. 이 과정은 전이된 가닥이 완전하게 이중가닥 형태로 변환될 때까지 진행될 것이다. 마지막으로, 오른쪽 ITR이 다시 만들어지고, 이 위치에서 정상 아데노바이러스 복제-개시 및 연장이 발생할 것이다. 폴리머라제는 헤어핀을 통해 해독할 것이고, 그로 인하여 분자를 중복시킨다는 것에 유의해야 한다. 한편에는 아데노바이러스 ITR 서열을 갖고 다른 편에는 헤어핀 구조를 형성하는 능력을 갖는 DNA 서열을 갖는 33250 bp의 입력 DNA 분자는, 양끝이 ITR 서열을 포함하는 방식으로 중복된다. 생성된 DNA 분자는 약 66500bp의 회문식(palindromic) 구조로 구성될 것이다.
이 구조는 서던(Southern) 분석을 사용하여 형질감염된 세포로부터 추출된 저분자량 DNA를 감지할 수 있다. DNA 단편의 회문성은 적당한 제한 엔도뉴클레아제와 프로브로서 HSV-TK 유전자를 사용한 서던 블라팅으로 저분자량 DNA를 절단시킴으로써 입증될 수 있다. 이 분자는 세포 내에 존재하는 아데노바이러스 유전자 생성물에 의해 형질감염된 세포 내에서 자체 복제할 수 있다. 부분적으로, 아데노바이러스 유전자는 표적 세포(즉, E1 유전자 생성물)의 게놈으로 통합되는 주형으로부터 발현되고, 다른 유전자는 복제하는 DNA 단편 그 자체 내에 존재한다. 그러나, 상기 직선형 DNA 단편은 비리온으로 인캡시데이트될 수 없다는 것에 주목하라. 이것이 인캡시데이션에 요구되는 모든 DNA 서열을 부족하게 할뿐만 아니라 그 크기가 인캡시데이트되기에는 너무 크다.
1.4 아데노바이러스 타입 5 게놈의 뉴클레오티드 3503-35953(즉, 9.7-100맵 유니트)를 포함하는 DNA 분자(E1 단백질-코딩 영역, 오른쪽 ITR과 인캡시데이션 서열 결핍)와 ITR과는 다른 상기 DNA 분자의 동일 가닥 일부에 상보적이어서 그 결과로 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 터미날 DNA 서열이 911 세포 내에서 복제할 수 있으며 pICLI와 pICLhac 유래 DNA 단편을 인캡시데이트하는데 요구되는 헬퍼 기능을 제공할 수 있다는 증거.
일련의 다음 실험은 파트 1.3에서 기재된 DNA 분자가 파트 1.1 및 1.2에 기재된 최소 아데노벡터를 인캡시데이트하는데 사용될 수 있는 것을 증명하기 위한 것이다.
이 실험에서, Ad-CMV-hcTK DNA의 엔도뉴클레아제 ClaI-절단 후 분리된 큰 단편이 엔도뉴클레아제 SalI, 녹두 뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 Asp718-처리된 플라스미드 pICLhac와 함께, 또는 대조군으로서 유사하게 처리된 플라스미드 pICLhaw와 함께 911 세포(파트 1.3에 기재된 실험에 따름)로 도입되었다. 48시간 후 바이러스는 형질감염된 세포군의 냉동-해동 분쇄에 의해 분리되었다. 바이러스-제제는 오염 유리 DNA를 제거하도록 DNaseI에 의해 처리되었다. 상기 바이러스는 Rat2 섬유아세포를 감염하도록 계속적으로 사용되었다. 감염 48시간 후 상기 세포의 루시페라제 활성도를 평가하였다. pICLhac 플라스미드로 형질감염되고, pICLhaw 플라스미드로는 형질감염되지 않은 세포로부터 분리된 바이러스에 의해 감염된 세포내에서만이, 현저한 루시페라제 활성이 나타날 수 있다. 감염 이전에 바이러스의 열불활성화는 루시페라제 활성을 완전하게 없애고, 이는 루시페라제 유전자가 바이러스 입자에 의해 전달된다는 것을 나타낸다. 바이러스 스톡에 의한 911 세포의 감염은 세포병리학적으로 어떠한 효과도 일으키지 않았는데, 이는 pICLhac이 911 세포에서 증식될 수 있는 어떤 감염성 헬퍼 바이러스 없이 생성된다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 제안된 방법이 최소-아데노바이러스의 벡터의 스톡을 생성하기 위해 사용될 수 있어, 아데노바이러스 형질 전환된 인간 세포 또는 비-아데노바이러스 형질전환된 인간 세포에 자동적으로 복제될 수 있는 감염성 헬퍼 바이러스가 전혀 없다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 기재된 시스템 이외에, 최소 아데노바이러스 벡터의 제조를 위한 다른 접근은 WO 94/12649호에 기재되었다. WO 94/12649호에 기재된 방법은 최소 아데노바이러스 벡터의 패키징을 위한 단백질 IX(WO 94/12649의 용어 중 유사(Pseudo) 아데노바이러스성 벡터(PAV))의 기능에 대한 것이다. PAVs는 왼쪽(인캡시데이션을 위해 요구되는 서열을 포함)과 오른쪽 아데노바이러스 ITRs 사이에 원하는 유전자에 의해 발현 플라스미드를 클로닝하여 제조된다. 상기 PAV는 헬퍼 바이러스의 존재하에서 증식된다. PAV의 인캡시데이션은 헬퍼 바이러스가 패키징을 위해 부분적으로 불완전하기 때문에 헬퍼 바이러스에 비하여 바람직하다. (패키징 시그날에서의 돌연변이 또는 그 크기(비능률적으로 37.5kb 팩키지 보다 큰 바이러스 게놈)때문). 추가로, 상기 저자는 단백질 Ⅸ 유전자의 부재시 상기 PAV가 우선적으로 패키지된다는 것을 제안한다. 그러나, 이들 메카니즘 중 어느 것도 PAVs/최소 벡터 만의 패키지를 허용하도록 충분히 제한적이지는 못 하다. 패키징 시그날 내에서 제안된 돌연변이가 패키징을 감소시키지만, 동일한 패키징 활성이 헬퍼 바이러스를 증식시키도록 요구하므로 완전히 차단하지는 못한다. 또한, 헬퍼 바이러스의 크기 증가나 단백질 IX 유전자의 돌연변이 중 어느 것도 PAV가 배타적으로 패키지 되는 것을 보장하지는 못한다. 따라서, WO94/12649에 기재된 방법은 최소 아데노바이러스 벡터/PAVs의 헬퍼-없는 스톡의 제조를 위해 유용하지 않다.
참조문헌
표 1
본 특허출원에서 기재된 구조를 얻기 위하여 사용되는 DNA 단편의 PCR 증식을 위해 사용되는 프라이머
PCR 프라이머가 ITR 서열에 병치된 SalI 및 Asp718 부위를 만들기 위하여 사용되도록 조정된다.
합성 헤어핀을 만들기 위하여 사용되는 합성 올리고뉴클레오티드 쌍이 Asp718 부위에 삽입되는 경우 터미널 중 한쪽에 Asp718을 재현한다.
합성 헤어핀을 만들기 위하여 사용되는 합성 올리고뉴클레오티드 쌍이 헤어핀 형성에 사용되기 위하여 ClaI 인지 부위를 함유한다.
표 2
아데노바이러스 E1 패키징 세포주 293, 911, PER.C3, PER.C5 및 PER.C6의 접종후 얻어진 다른 재조합 아데노바이러스의 수율
세포 통과수 IG.Ad.CMV.lacZ IG.Ad.CMV.TK IG.Ad.MLPI.TK dl313 발생평균
293 6.0 5.8 24 34 17.5
911 8 14 34 180 59.5
PER.C3 17 8 11 44 40 25.8
PER.C5 15 6 17 36 200 64.7
PER.C6 36 10 22 58 320 102
수율×10-8pfu/T175 플라스크.
상기 수율은 다른 두 실험의 평균이다. IG.Ad.CMV.LacZ 및 IG.Ad.CMV.TK는 EP 95 20 2213에 기재된다. IG.Ad.CMV.TK의 구조는 이 특허 출원에 기재된다. T80 플라스크당 바이러스의 수율은 [Fallaux,1996 #1493]에 기재된 바와 같이, 911 세포에 대한 플라그 평가에 의해 측정되었다.

Claims (5)

  1. 이종성 프로모터의 조절 하에서 아데노바이러스의 DNA 단편을 갖는 패키징 세포로서, 상기 단편은 인간 아데노바이러스 5의 E1 영역의 뉴클레오티드 459-3510으로 이루어지는 패키징 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포는 ECACC에 제96022940호로 기탁된 PER.C6 세포 또는 그의 유도체인 패키징 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아데노바이러스 E2A 유전자 생성물을 코드하는 핵산을 더 함유하는 패키징 세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 아데노바이러스 E2A 유전자 생성물은 E2A ts125 돌연변이체를 포함하는 패키징 세포.
  5. 인간 아데노바이러스 5 게놈의 뉴클레오티드 459-3510을 함유하는 재조합 핵산으로서, 상기 재조합 핵산은 제1항에 따른 패키징 세포를 제조하는 재조합 핵산.
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