NL9101680A - Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren. - Google Patents

Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren. Download PDF

Info

Publication number
NL9101680A
NL9101680A NL9101680A NL9101680A NL9101680A NL 9101680 A NL9101680 A NL 9101680A NL 9101680 A NL9101680 A NL 9101680A NL 9101680 A NL9101680 A NL 9101680A NL 9101680 A NL9101680 A NL 9101680A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
cells
bone marrow
mulv
recombinant
gene
Prior art date
Application number
NL9101680A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Tno
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tno filed Critical Tno
Priority to NL9101680A priority Critical patent/NL9101680A/nl
Priority to DE69225489T priority patent/DE69225489T2/de
Priority to EP92921536A priority patent/EP0606376B1/en
Priority to US08/211,342 priority patent/US5612206A/en
Priority to ES92921536T priority patent/ES2118140T3/es
Priority to PCT/NL1992/000177 priority patent/WO1993007281A1/en
Priority to JP5506806A priority patent/JPH07501690A/ja
Priority to AU27689/92A priority patent/AU2768992A/en
Priority to CA002120370A priority patent/CA2120370A1/en
Priority to AT92921536T priority patent/ATE166109T1/de
Publication of NL9101680A publication Critical patent/NL9101680A/nl
Priority to US08/820,479 priority patent/US6472212B1/en
Priority to US10/164,076 priority patent/US20030166285A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13045—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6045—RNA rev transcr viruses
    • C12N2810/6054—Retroviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
    • C12N2810/855—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from receptors; from cell surface antigens; from cell surface determinants

Description

BESCHRIJVING
Titel: werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren
Gebied van de uitvinding
De uitvinding ligt op het gebied van de gentherapie en heeft meer in het bijzonder betrekking op een werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede op cellen welke recombinante retrovirale vectoren produceren die in een dergelijke werkwijze kunnen worden toegepast.
Stand van de techniek Introductie
Ontwikkelingen op het gebied van de moleculaire biologie hebben geleid tot een beter begrip van de genetische basis die ten grondslag ligt aan het ontstaan van een groot aantal aandoeningen. Naar verwachting zullen de genen welke geassocieerd zijn met de meest frequent voorkomende ziekten voor het einde van deze eeuw geïdentificeerd, gedoneerd en gekarakteriseerd zijn.
Tot nu toe heeft de moleculaire genetica aan de geneeskunde bijgedragen door de ontwikkeling van diagnostische middelen en methoden en de biotechnologische productie van pharmaceutica.
Het mag echter worden verwacht dat de toenemende kennis van de genetica eveneens zal kunnen worden aangewend voor een wezenlijk nieuwe therapeutische behandelwijze, de zogenaamde gentherapie. Gentherapie heeft tot doel aandoeningen te behandelen door somatische cellen van patiënten genetisch te modificeren. De toepassingen hiervan blijven niet beperkt tot erfelijke aandoeningen, de behandeling van verkregen ziekten wordt eveneens tot de mogelijkheden gerekend. Hoewel dit vakgebied zich nog in een beginstadium bevindt en ontwikkeling behoeft, liggen therapeutische mogelijkheden in het verschiet die de geneeskunde in de toekomst drastisch kunnen verbeteren (1-3).
Een belangrijk celtype voor gentherapie doeleinden is de zogenaamde hemopoëtische stamcel welke zich bevindt in het beenmerg en de voorlopercel is van alle circulerende bloedcellen. Deze stamcel kan zich eveneens zelf vermenigvuldigen zonder zijn differentiërend vermogen te verliezen. De achterliggende gedachte voor een, op deze cellen gerichte, gentherapie is dat gentransfer naar (een beperkt aantal) stamcellen reeds voldoende kan zijn om het hele bloedvormende weefsel levenslang te vervangen door genetisch gemodificeerde cellen (4). Daarmee zouden niet alleen ziekten kunnen worden aangepakt die hun oorzaak vinden in een (erfelijk) defect van bloedcellen, maar ook ziekten die berusten op het onvermogen om een bepaald eiwit te maken: het gemodificeerde bloed(vormende) systeem zou een constante bron voor het eiwit kunnen zijn, dat op de plaatsen waar het nodig is zijn werk zou kunnen doen. Tevens is het mogelijk om met de introductie van genetisch materiaal in het bloedsysteem, resistentie tegen infectieuze agentia te verkrijgen of zelfs een predispositie voor chronische aandoeningen zoals bijvoorbeeld reuma of diabetes te overwinnen.
Retrovirale vectoren
Een van de voorwaarden voor de realisatie van een dergelijk beenmerg gentherapie protocol is een techniek waarmee genen in de chromosomen van doelcellen geïncorporeerd kunnen worden, zodanig dat die genen ook aan de dochtercellen worden doorgegeven en dat in die cellen het gewenste eiwitproduct geproduceerd wordt.
Bij de hier beschreven uitvinding wordt voor dit doel gebruik gemaakt van recombinante retrovirussen die de te introduceren genen bij zich dragen en deze in zoogdiercellen kunnen afgeven. Ze maken gebruik van de natuurlijke eigenschap van retrovirussen om efficiënt en stabiel te integreren in het genoom van de geïnfecteerde cel, maar kunnen zelf niet meer een productieve infectie veroorzaken doordat ze replicatie-defectief zijn en niet zijn gecontamineerd met wild-type virussen (5, 6).
De recombinante retrovirussen waarvan in het kader van de onderhavige uitvinding gebruik wordt gemaakt, zijn alle gebaseerd op muize leukemie virussen (MuLV; 7). Voor gentherapie bij mensen zal gebruik gemaakt worden van zogenaamde amphotrope retrovirussen welke een brede gastheer-specificiteit bezitten en naast muizecellen tevens primatecellen kunnen infecteren.
Voor de productie van recombinante retrovirussen zijn twee elementen nodig: a) de zogenaamde retrovirale vector, die naast het gen (of de genen) dat dient te worden geïntroduceerd alle DNA elementen van een retrovirus bevat welke noodzakelijk zijn voor de verpakking van het virale genoom en de integratie in het gastheer genoom, en b) de zogenaamde packaging cellijn welke de virale eiwitten produceert die noodzakelijk zijn voor het opbouwen van een infectieus recombinant retrovirus (8).
Aangezien de aanwezigheid van replicatie-competente virussen in een gentherapie protocol zeer ongewenst wordt geacht, zijn de meeste moderne packaging cellijnen zodanig geconstrueerd dat de kans op recombinatie gebeurtenissen, waardoor een replicatie-competent virus ontstaat, geminimaliseerd is. Dit wordt bewerkstelligd door de delen van het virusgenoom welke coderen voor virale eiwitten, fysiek in twee delen te scheiden en apart in de cellijn te introduceren (9-11) .
Aangezien de aanwezigheid van beide constructen essentieel is voor het functioneren van de packaging cellijn en chromosomale instabiliteit regelmatig optreedt, is het voor het routinematig gebruik van dergelijke cellen in gentherapie procedures van groot belang dat middels een selectiemedium voor de aanwezigheid van de constructen geselecteerd kan worden. Daarom worden deze constructen vaak door middel van een zogenaamde co-transfectie geïntroduceerd waarbij beide virale constructen tezamen met een dominante selectiemarker getransfecteerd worden. De hierdoor geboden mogelijkheid tot selectie is zeker geen triviale eis, gezien bijvoorbeeld de waarneming die wij en diverse andere onderzoeksgroepen deden, dat virus-producerende cellen gebaseerd op de packaging cellijn \|iCRIP (9) niet stabiel zijn. Dat wil zeggen dat ze niet resistent meer zijn tegen de relevante selectie-media en gedurende de kweek hun vermogen tot het produceren van retrovirussen verliezen. Een voorbeeld hiervan, van belang voor de onderhavige uitvinding, is de zogenaamde POC-1 cellijn welke door ons op basis van \|/CRIP cellen is geproduceerd (12) en vanwege zijn instabiliteit niet op routinematige basis gebruikt kan worden voor gentherapie. In de hier beschreven uitvinding wordt derhalve gebruik gemaakt van packaging cellen welke, middels een dominante selectie kweek, stabiel virus zullen blijven produceren.
fonetische modificatie van het hemopoëtische systeem
Studies in muizen hebben aangetoond dat met behulp van amphotrope retrovirale vectoren beenmergstamcellen van een nieuw gen voorzien kunnen worden. Na transplantatie van deze gemodificeerde cellen in lethaal bestraalde muizen kon tevens het nieuwe gen gedurende lange perioden worden aangetoond in vele verschillende bloedceltypen van de getransplanteerde dieren (12).
Eerdere problemen met betrekking tot het niet tot expressie komen van de nieuw geïntroduceerde genen zijn door ons opgelost door gebruik te maken van een retrovirale vector waarin de expressie van het gen van keuze gestuurd wordt door een retrovirale promoter waarvan de expressie-specificiteit veranderd is middels een vervanging van de zogenaamde enhancer (12, 13). Deze vectoren worden in de voorliggende uitvinding LgXL (ΔΜο+PyFlOl) genoemd, waarbij X de code van een nader in te vullen gen voorstelt.
Preklinische studies in non-humane primaten
Voordat de resultaten, verkregen uit onderzoek naar genoverdracht in het bloedvormende orgaan van muizen, vertaald kunnen worden naar een uiteindelijke toepassing van gentherapie in de kliniek, dient een aantal essentiële vragen te worden beantwoord door bestudering van een relevant preklinisch model. Allereerst zal moeten worden aangetoond dat efficiënte genoverdracht eveneens mogelijk is naar bloedvormende stamcellen van hogere zoogdieren, met name primaten. Bovendien vergt genetische modificatie gekoppeld aan autologe beenmergtransplantatie bij primaten een complexe logistiek die niet in de muis bestudeerd kan worden. De organisatie van de bloedvormende organen van muis en mens is slechts tot op zekere hoogte vergelijkbaar en het mag duidelijk zijn dat de groottes van beide soorten en daardoor de bij transplantatie betrokken celaantallen aanzienlijk verschillen.
Het bij uitstek geschikte proefdiermodel voor preklinische gentherapie studies is de non-humane primaat, met name de rhesusaap, mede doordat de huidige beenmergtransplantatie protocollen in de kliniek voornamelijk gebaseerd zijn op gegevens verkregen uit experimenten met beenmerg van de rhesusaap. Gentherapie procedures met behulp van beenmergcellen kunnen in dit diermodel getest worden door beenmerg af te nemen, dit m.b.v. recombinante retrovirussen genetisch te modificeren en vervolgens autoloog (d.w.z. in dezelfde aap) terug te transplanteren nadat de endogene beenmergcellen geëradiceerd zijn d.m.v. bestraling.
Tot nu toe zijn dergelijke experimenten weinig succesvol gebleken met betrekking tot: a) de hemopoëtische regeneratie welke met het geïnfecteerde beenmerg bewerkstelligd kon worden, en b) de in vivo stabiliteit van de genetische modificatie.
ad a): Voor een efficiënte gen-overdracht door middel van retrovirale vectoren is een directe blootstelling van de te infecteren beenmergcellen aan de virus-producerende cellen vereist. Dit geschiedt middels een zogenaamde co-cultivatie waarbij de virus-producerende cellen gehecht zitten aan de bodem van een kweekfles en de beenmergcellen hierboven worden uitgezaaid. Na afloop van de co-cultivatie worden vervolgens de niet gehechte beenmergcellen geoogst en als transplantaat gebruikt.
In de tot op heden gepubliceerde gegevens is deze zogenaamde co-cultivatie van beide celtypen altijd geassocieerd geweest met een drastisch verlies aan in vivo regenererend vermogen van de beenmergcellen (14—16), waardoor een klinische toepassing uitgesloten is.
De huidige uitvinding laat in een voorbeeld zien dat, onder gecontroleerde condities, met de hier beschreven virus-producerende cellen een co-cultivatie kan plaatsvinden zonder een dergelijk regeneratie verlies.
ad b): Geen van de tot nu toe gepubliceerde studies is voor wat betreft de genetische modificatie voldoende interpretabel aangezien er steeds gewerkt is met virus-preparaten waarin replicatie-competent virus aanwezig was. Dit kan via een zogenaamde "rescue" leiden tot een verspreiding van het recombinante 'virusgenoom nadat de cellen getransplanteerd zijn waardoor onduidelijk blijft of de gemodificeerde cellen nakomelingen zijn van geïnfecteerde beenmergcellen.
In de eerste gerapporteerde studie (14, 15) werd bij 19 apen een autologe transplantatie uitgevoerd met beenmergcellen geïnfecteerd met verschillende retrovirale vectoren met daarin het gen voor neomycine resistentie (neor) of dihydrofolaat reductase (DHFR), of met een virus waarin zich neor en het gen voor adenosine deaminase (ADA) samen bevinden, geproduceerd door cellen die tevens replicatie-competent virus produceren.
Er werden twee gentransfer-procedures toegepast, de onder ad a) beschreven co-cultivatie procedure of een infectie met virus supernatant dat van de virus-producerende cellen geoogst kan worden. De co-cultivatie was geassocieerd met het onvermogen om tot een hemopoëtische regeneratie te komen na autologe transplantatie. Dientengevolge overleefden slechts drie van de dertien apen deze procedure. Geen enkele overlevende aap vertoonde enige tekenen van genetische modificatie in vivo. Volledige hemopoëtische reconstitutie kon verkregen worden in de zes apen welke supernatant geïnfecteerd beenmerg kregen en in vier van deze dieren kon het gen worden aangetoond. Echter, genetische modificatie bleef laag en tijdelijk. Ook kon niet uitgesloten worden dat de geobserveerde modificatie was opgetreden in langlevende T-cellen welke niet uit het in vitro gekweekte beenmerg ontstaan zijn, maar reeds als verontreiniging in het geïnfecteerde beenmerg aanwezig waren.
In de tweede studie (16) werd beenmerg van rhesus apen geco-cultiveerd met cellijnen welke neor-bevattende virussen produceerden. Ook in deze studie kon alleen het provirus in vivo aangetoond worden na infectie met behulp van een virus-producerende cellijn welke contaminerende helper virussen produceerde. In deze setting konden geen lange termijn studies verricht worden doordat opnieuw het beenmerg niet in staat bleek het hemopoëtische systeem te reconstitueren.
Onze uitvinding laat in een voorbeeld zien dat beenmergcellen geco-cultiveerd met de hier beschreven virus-producerende cellen in staat zijn om na autologe transplantatie het hemopoëtische systeem van primaten genetisch te modificeren.
Deze modificatie werd langdurig waargenomen in verscheidene bloedceltypen waaronder de zeer kort (ongeveer 8 uur) levende granulocyten. Deze gegevens demonstreren onze capaciteit om zeer primitieve cellen te infecteren en tonen aan dat het met behulp van dergelijke gemodificeerde beenmergcellen mogelijk is om gentherapie uit te voeren.
Korte beschrijving van de essentie van de uitvinding
De uitvinding verschaft een werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, omvattende het isoleren van beenmergcellen uit een primaat en het door middel van een co-cultivatie blootstellen van de geïsoleerde beenmergcellen aan cellen die een recombinant amphotroop retrovirus produceren met een genoom gebaseerd op een retrovirale vector die de in de beenmergcellen in te brengen genetische informatie bevat. Het heeft hierbij de voorkeur dat het genoom van het recombinante amphotrope retrovirus op een retrovirale vector is gebaseerd die afgeleid is van een virale MuLV vector.
Met primaten worden alle primaten bedoeld, inclusief de mens. Bij voorkeur gaat het om gentherapie bij de mens.
Het heeft volgens de uitvinding de voorkeur dat de retrovirale vector twee van een virale MuLV vector afgeleide LTRs en het 5’ gedeelte van het gag gen van een MuLV omvat. De MuLV sequenties zijn daarbij bij voorkeur afgeleid van de virale Mo-MuLV vector, waarbij ten minste de 3'-LTR een hybride LTR is die in plaats van de Mo-MuLV enhancer de PyFlOl enhancer bevat. Liefst past men hiervoor de retrovirale vector pLgXL(ΔΜο+PyFlOl) toe, waarin X de in de beenmergcellen in te brengen genetische informatie voorstelt.
De cellen, die het recombinante amphotrope retrovirus produceren, zijn volgens de uitvinding bij voorkeur recombinante zoogdiercellen die de gag, pol en env genen van MuLV bevatten en tot expressie brengen. Het env gen is liefst van een amphotrope MuLV afgeleid. De gag, pol en env genen van MuLV zijn in de recombinante zoogdiercellen bij voorkeur verdeeld over ten minste twee verschillende eukaryote expressievectoren. Voorts heeft het de voorkeur dat elk packaging construct geassocieerd is aan een selecteerbaar merker gen. Liefst worden als recombinante zoogdiercellen GP+envAM12 cellen gebruikt, terwijl het voorts voorkeur verdient dat de cellen, die een recombinant amphotroop retrovirus produceren, meerdere kopieën van de retrovirale vector bevatten.
Volgens de uitvinding heeft het verder de voorkeur dat de co-cultivatie van beenmergcellen met cellen, die amphotroop retrovirus produceren, geschiedt in aanwezigheid van serum en ten minste een hemopoëtische groeifactor. Na de co-cultivatie worden de niet-hechtende beenmergcellen bij voorkeur samen met wel-hechtende beenmergcellen geoogst.
De uitvinding verschaft verder cellen die een recombinant amphotroop retrovirus produceren met een genoom gebaseerd op een retrovirale vector, bij voorkeur een die afgeleid is van een virale MuLV vector, en genetische informatie bevat die geschikt is om volgens de hierin beschreven werkwijze in beenmergcellen van een primaat te worden gebracht.
Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding
De uitvinding heft de genoemde nadelen met betrekking tot de vereiste stabiliteit van de virus-producerende cellen op door cellen ter beschikking te stellen die te selecteren zijn voor de aanwezigheid van de virale constructen en een recombinant amphotroop retrovirus produceren waarvan het genoom is samengesteld uit de recombinante retrovirale vector pLgXL(ΔΜο+PyFlOl) waarin X een geïnserteerd gen voorstelt coderend voor een eiwit dat van belang is voor gentherapie.
Voorts verschaft de uitvinding een werkwijze voor het in beenmergcellen inbrengen van een gen X waarbij beenmergcellen van een primaat in een co-cultivatie worden samengebracht met voornoemde selecteerbare virus-producerende cellen die een recombinant amphotroop retrovirus produceren waarvan het genoom is samengesteld uit de recombinant retrovirale vector pLgXL(ΔΜο+PyFlOl) met daarin geïnserteerd gen X.
De uitvinding is opgebouwd uit een aantal essentiële bestanddelen: a) de recombinante retrovirale vector pLgXL(ΔΜο+PyFlOl), b) de virus-producerende cellijn, en c) de werkwijze waarmee beenmergcellen van een primaat van gen X kunnen worden voorzien.
ad aï Recombinante retrovirale vector pLgXL(AMo+PyF101)
De recombinante retrovirale vector is opgebouwd uit een aantal essentiële onderdelen, te weten: i) plasmide-sequenties noodzakelijk voor propagatie van de vector in E. coli bacteriën zoals bijvoorbeeld pBR322 (17) of een vector uit de pUC serie (18); hierop dienen zowel een origin van replicatie als een selecteerbaar gen (bijvoorbeeld voor ampicilline- of tetracycline-resistentie) aanwezig te zijn.
ii) DNA elementen afkomstig van een MuLV welke in cis benodigd zijn voor de verpakking, reverse transcriptie en integratie van het retrovirale genoom; hieronder vallen twee zogenaamde Long Terminal Repeats (LTR) en de zogenaamde packaging sequenties. In de LTR is een modificatie aangebracht door de enhancer afkomstig van MuLV te vervangen door de enhancer van de polyoma virus stam PyFlOl (19). In het plasmide construct is het niet noodzakelijk dat deze modificatie in beide LTRs aanwezig is, slechts de 3' LTR moet ervan voorzien zijn aangezien dat gedeelte van de LTR na een virale infectie in beide LTRs belandt (12, 13).
iii) het 5' gedeelte van de MuLV gag-coderende sequenties zoals aanwezig in de vector N2 (20), teneinde een hogere virale titer te bewerkstelligen. Hierin kan eventueel d.m.v. site-directed mutagenese het ATG initiatie-codon van gag zodanig gemuteerd worden dat er geen translatiestart meer op kan plaatsvinden, iv) de coderende sequenties van gen X. Hiermee worden genen 5 bedoeld welke coderen voor eiwitten die van belang kunnen zijn voor gentherapie, oftewel alle genen geassocieerd met erfelijke aandoeningen waarbij met behulp van introductie van een intacte versie van het gen in somatische cellen een therapeutisch effect kan worden bereikt. De meesten zijn gedocumenteerd in: 0 - McKusick, v.A. Mendelian inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes. Eighth edition. John Hopkins university press (1988).
- Stanbury, J.B.,Wyngaarden, J.B., Fredrickson, D.S., Goldstein, J.L. and Brown, M.S. The metabolic basis of inherited disease, j Fifth edition. McGraw-Hill (1983).
Voorbeelden ervan zijn: genen geassocieerd met ziekten van het koolhydraat metabolisme zoals voor: fructose 1 fosfaat aldolase - fructose-1,6-difosfatase - glucose-6-fosfatase - lysosomaal a-1,4-glucosidase - amylo-1,6-glucosidase amylo-(1,4:1,6)-transglucosidase - spier fosforylase - lever fosforylase - spier fosfofructokinase - fosforylase-b-kinase - galactose-l-fosfaat uridyl transferase - galactokinase alle enzymen van het pyruvaat dehydrogenase complex - pyruvaat carboxylase - 2-oxoglutaraatglyoxylaat carboligase - D-glyceraat dehydrogenase genen geassocieerd met ziekten van het aminozuur metabolisme zoals voor: - fenylalanine hydroxylase - dihydrobiopterine synthetase - tyrosine aminotransferase - tyrosinase - histidase - fumarylacetoacetase - glutathion synthetase - γ-glutamylcysteine synthetase - ornithine-5-aminotransferase - carbamoylfosfaat synthetase - ornithine carbamyltransferase - argininosuccinaat synthetase - argininosuccinaat lyase - arginase - L-lysine dehydrogenase - L-lysine ketoglutaraat reductase - valine transaminase - leucine isoleucine transaminase - "branched chain" 2-ketonzuur decarboxylase - isovaleryl CoA dehydrogenase - acyl-CoA dehydrogenase - 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA lyase - acetoacetyl CoA 3-ketothiolase - propionyl CoA carboxylase - methylmalonyl CoA mutase - ATP :cobalamine adenosyltransferase - dihydrofolaat reductase - methyleen tetrahydrofolaat reductase - cystathionine β-synthase - sarcosine dehydrogenase complex - eiwitten behorende bij het glycine klievingssysteem - β-alanine transaminase - serum carnosinase - hersen homocarnosinase genen geassocieerd met ziekten van vet en vetzuur metabolismen zoals voor: - lipoproteine lipase
- apolipoproteine C-II
- apolipoproteine E
- andere apolipoproteinen - lecithine cholesterol acyltransferase - LDL receptor - lever sterol hydroxylase - "Phytanic acid" α-hydroxylase genen geassocieerd met lysosomale afwijkingen zoals voor: - lysosomaal a—L—iduronidase - lysosomaal iduronaat sulfatase - lysosomaal heparan N-sulfatase - lysosomaal N-acetyl-a-D-glucosaminidase - lysosomaal acetyl CoA:a-glucosaminide N—acetyltransferase - lysosomaal N-acetyl-a-D-glucosaminide 6-sulfatase - lysosomaal galactosamine β-sulfaat sulfatase - lysosomaal β-galactosidase
- lysosomaal arylsulfatase B
- lysosomaal β-glucuronidase - N-acetylglucosaminylfosfotransferase - lysosomaal a-D-mannosidase - lysosomaal a-neuraminidase - lysosomaal aspartylglycosaminidase - lysosomaal a-L-fucosidase - lysosomaal zuur lipase - lysosomaal zuur ceramidase - lysosomaal sphingomyelinase - lysosomaal glucocerebrosidase - lysosomaal galactosylceramidase
- lysosomaal arylsulfatase A
- α-galactosidase A
- lysosomaal zuur β-galactosidase
- α-keten van het lysosomaal hexosaminidase A
genen geassocieerd met ziekten van het steroid metabolisme zoals voor: - 21-hydroxylase - Ιΐβ-hydroxylase - androgeen receptor - steroid 5oc-reductase - steroid sulfatase genen geassocieerd met ziekten van het purine en pyrimidine metabolisme zoals voor: - fosforibosylpyrofosfaat synthetase - hypoxanthine guanine fosforibosyltransferase - adenine fosforibosyltransferase - adenosine deaminase - purine nucleoside fosforylase - AMP deaminase - xanthine oxidase - orotaat fosforibosyltransferase - orotidine 5'-fosfaat decarboxylase - DNA repair enzymen genen geassocieerd met ziekten van het porphirine en heem metabolisme zoals voor: - uroporphyrinogeen III cosynthase - ferrochelatase - porphobilinogeen deaminase - coproporphyrinogeen oxidase - proporphyrinogeen oxidase - uroporphyrinogeen III synthase - uroporphyrinogeen decarboxylase - bilirubine UDP-glucuronyltransferase - catalase genen geassocieerd met ziekten van het bindweefsel, spieren en bot zoals voor: - lysyl hydroxylase - procollageen peptidase - al-antitrypsine - dystrophine - alkalisch fosfatase - guanosine nucleotide regulerend eiwit van het adenyl cyclase complex genen geassocieerd met ziekten van het bloed en bloedvormende organen zoals voor:
- bloedstollingsfactor V
- bloedstollingsfactor VII
- bloedstollingsfactor VIII
- bloedstollingsfactor IX
- bloedstollingsfactor X
- bloedstollingsfactor XII
- bloedstollingsfactor XIII
- alle andere stollingsfactoren - alle genen geassocieerd met osteopetrose zoals voor "carbonic anhydrase II" - thrombocyten membraan glycoproteine Ib - thrombocyten membraan glycoproteine Ilb-IIIa - spectrine - pyruvaat kinase - glucose-6-fosfaat dehydrogenase - NADH cytochroom bs reductase - β-globine - α-globine genen geassocieerd met ziekten van transport systemen zoals voor: - lactase - sucrase-a-dextrinase - 25-hydroxyvitamine Ü3-l-hydroxylase - cystic fibrosis transport regulator genen geassocieerd met aangeboren immunodeficiënties zoals voor:
- de eiwitten van het complement systeem waaronder B, Clq, Clr, C2, C3, C4, C5, C7, C8 en CIO
- de inhibitor van Cl, een component van het complement systeem - de inactivator van C3b, een component van het complement systeem de genen voor X-gebonden immunodeficiënties zoals voor: - een van de enzymen van het NADPH oxidase complex - myeloperoxidase - het syndroom van Wiscott Aldrich en Ataxia Telangiectasia genen coderend voor hormonen evenals de genen coderend voor hun receptor zoals bijvoorbeeld voor: - groeihormoon
Tot gen X moeten ook gerekend worden genen welke (tot dusverre) niet geassocieerd zijn met een erfelijke afwijking maar waarmee op enige wijze gentherapie bedreven kan worden. Hieronder vallen bijvoorbeeld: het gen voor tyrosine hydroxylase drug resistentie genen zoals bijvoorbeeld: - het P-glycoproteine P170 (het zogenaamde multi drug resistentie gen mdrl) - mdr 3 - dihydrofolaat reductase (DHFR) en methotrexaat resistente isotypen ervan - metallothioneine - aldehyde dehydrogenase (ALDH) - glutathion transferase genen coderend voor alle cytokinen waaronder bijvoorbeeld alle interleukines en alle interferonen genen coderend voor alle groeifactoren genen coderend voor alle groeifactor receptoren genen coderend voor alle transplantatieantigenen zoals bijvoorbeeld de major en minor histocompatibiliteits antigenen genen welke resistentie tegen infectieuze organismen kunnen geven, zoals bijvoorbeeld TAR decoys (21)
genen van infectieuze organismen welke gebruikt kunnen worden voor vaccinatie doeleinden zoals bijvoorbeeld het envelope gen van HIV
genen welke voor negatieve selectie gebruikt kunnen worden zoals bijvoorbeeld het Thymidine kinase gen van het Herpes simplex virus waartegen geselecteerd kan worden met substraten als bijvoorbeeld gancyclovir of acyclovir (22, 42).
ad de virus-producerende cellen
Teneinde een stabiele, selecteerbare virus-producerende cellijn te verkrijgen die het amphotrope recombinante retrovirus produceert, zal pLgXL(ΔΜο+PyFlOl) geïntroduceerd moeten worden in een amphotrope packaging cellijn welke geselecteerd kan worden voor de aanwezigheid van de DNA sequenties welke van belang zijn voor de productie van de virale eiwitten. Een voorbeeld van zo een cellijn is GP+envAml2 (11) . Van \yCRIP (9) is daarentegen gebleken dat zij niet is te selecteren en instabiel is m.b.t. de virus-productie.
De selecteerbare packaging cellijn is gebaseerd op zoogdiercellen en produceert alle virale eiwitten welke gecodeerd worden door de gag, pol en env genen van MuLV. Het .env gen dient afkomstig te zijn van een amphotrope MuLV. Teneinde expressie van voornoemde virale genen te verkrijgen dienen ze, gedoneerd in een eukaryote expressievector, onder controle van een RNA polymerase II promoter te staan en gevolgd te worden door een polyadenylerings-signaal. Op deze zogenaamde packaging constructen kunnen alle drie de virale genen tegelijk aanwezig zijn zoals bijvoorbeeld door Miller beschreven (23), maar de genen kunnen ook gesplitst voorkomen op twee expressie vectoren zoals beschreven door Markowitz (11). Dit laatste verdient de voorkeur omdat het de kans op recombinatie-gebeurtenissen, welke aanleiding geven tot helpervirus formatie, vermindert.
Zoals gesteld is een essentiële eigenschap van de voor deze uitvinding te gebruiken packaging cellijn de mogelijkheid te kunnen selecteren voor de aanwezigheid van voornoemde packaging constructen. Dit is te bereiken door een fysieke associatie van de packaging constructen met een selecteerbaar merker gen te bewerkstelligen. Deze associatie is te bereiken door ze in één vector te combineren (zoals gedaan met pGag-PolGPT in referentie (10)) of door middel van een zogenaamde co-transfectie (review in bijvoorbeeld (24)). De succesvol getransfecteerde cellen kunnen dan geïsoleerd worden door voor het merker gen te selecteren. Aangezien de ge-cotransfecteerde DNA fragmenten meestal geligeerd aan elkaar op één plek in het genoom van de getransfecteerde cel terechtkomen (24) zullen de aldus geselecteerde cellen meestal tevens het packaging construct bevatten. Gezien het feit dat \]/CRIP cellen op deze wijze gemaakt zijn en ze desalniettemin niet selecteerbaar zijn, is de laatste procedure niet altijd succesvol en verdient de constructie van vectoren met daarin het merkergen gedoneerd de voorkeur.
Als merkergen kunnen genen coderend voor een groot aantal verschillende eiwitten gebruikt worden. Veelgebruikte en geprefereerde merkergenen zijn: het neomycine resistentie gen (25), het hygromycine resistentie gen (26), het E. coli xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (gp_t.) gen (27), het histidinol gen (28) , het herpes simplex virus thymidine kinase gen (29) en het methotrexaat resistente isotype van dihydrofolaat reductase (30). Deze genen dienen eveneens onder controle van een RNA polymerase II promoter te staan en gevolgd te worden door een polyadenylerings-signaal.
De introductie van pLgXL(ΔΜο+PyFlOl) kan gebeuren m.b.v. diverse fysische technieken zoals via een calcium-fosfaat precipitatie, electroporatie of lipofectie (31-35) . Indien de packaging cellen niet geselecteerd kunnen worden voor de aanwezigheid van pLgXL(ΔΜο+PyFlOl) zal gebruik gemaakt worden van een selecteerbare merker zoals bijvoorbeeld een expressie-vector van het neomycine resistentie gen dat tezamen met pLgXL (ΔΜο+PyFlOl) getransfecteerd wordt. De succesvol getransfecteerde cellen kunnen dan geselecteerd worden door voor het merkergen te selecteren. Aangezien de DNA fragmenten meestal geligeerd aan elkaar op een plek in het genoom van de getransfecteerde cel terechtkomen, zullen de aldus geselecteerde cellen meestal tevens de retrovirale vector bevatten.
Een geprefereerde procedure is de introductie van pLgXL (ΔΜο+PyFlOl) via een infectie. Aangezien amphotrope virussen niet in staat zijn om amphotrope packaging cellen te infecteren, moet daarbij gebruik worden gemaakt van een ecotrope versie van het recombinante retrovirus welke verkregen wordt door het DNA in eerste instantie via een fysische techniek in ecotrope packaging cellen te introduceren. Ecotroop virus geproduceerd door dergelijke cellen kan gebruikt worden om amphotrope packaging cellen te infecteren waarna de geïnfecteerde cellen gedoneerd en vervolgens getest kunnen worden op hun vermogen om virus te produceren.
Voorts kunnen cellijnen verkregen worden die een hogere titer van het virus produceren, door meerdere copieën van de retrovirale vector in de packaging cellen te introduceren met behulp van de zogenaamde "ping-pong" methode (36, 37). Daarbij wordt een ecotroop-virus-producerende cellijn geco-cultiveerd met amphotrope packaging cellen hetgeen tot herhaalde infecties aanleiding kan geven. Om na deze co-cultivatie de amphotrope cellen terug te kunnen doneren, dienen ze selecteerbaar te zijn met selectieve media waarin de ecotrope packaging cellen niet overleven. Door de cellen uit te platen in dergelijk medium kunnen de juiste virus-producerende clones geïsoleerd en vervolgens geanalyseerd worden voor hun capaciteit om het recombinante virus te produceren.
ad a) werkwinze waarmee beenmergcellen van een primaat van gen X kunnen worden voorzien zodanig dat het regeneratie vermogen van hef beenmerg behouden bliift en autologe transplantatie van de beenmergcellen aanleiding geeft tot een genetisch gemodificeerd hemopoëtisch systeem
Bovengenoemde recombinante retrovirale vectoren kunnen gebruikt worden voor de efficiënte introductie van gen X in beenmergcellen van primaten door laatstgenoemde cellen via een co-cultivatie bloot te stellen aan de virus-producerende cellen. In de geprefereerde methode gebeurt dit gedurende drie tot vier dagen in aanwezigheid van serum en een of meer hemopoëtische groeifactoren zoals bijvoorbeeld interleukine 3. Na afloop van de co-cultivatie worden zowel de niet hechtende als de hechtende cellen uit de kweek geoogst (de laatstgenoemde cellen kunnen worden verkregen door middel van trypsinisatie) en als beenmerg transplantaat gebruikt.
Uitvoeringsvoorbeeld a) Productie van selecteerbare stabiele recombinant retrovirus-producerende cellen
In het uitvoeringsvoorbeeld is gebruik gemaakt van het retrovirale vector construct pLgAL(ΔΜο+PyFlOl) (12), waarin A staat voor het humane cDNA gen coderend voor adenosine deaminase (ADA). Twintig microgram van dit construct werd getransfecteerd naar de ecotrope packaging cellijn GP+E-86 (10), volgens de door Chen en Okayama (38) beschreven methode. Voorafgaand aan de transfectie waren de GP+E-86 cellen gekweekt in medium bevattende 15 μg/ml hypoxanthine, 250 μg/ml xanthine en 25 μg/ml mycophenolzuur, ter selectie voor het behoud van de DNA sequenties welke verantwoordelijk zijn voor de productie van de virale eiwitten. Transfectanten die een functioneel humaan ADA enzym produceerden, werden geïsoleerd middels een selectieve kweek in medium met een combinatie van 4 μΜ xylofuranosyl-adenine (Xyl-A) en 10 nM deoxycoformycine (dCF) (12).
Vervolgens werd met de aldus verkregen cellen een ping-pong kweek zoals beschreven door Kozak en Kabat (37) ingezet. Hiertoe werden 5 x 103 transfectanten gemengd met een gelijke hoeveelheid GP+envAml2 amphotrope packaging cellen (11) en gezamenlijk gekweekt in α-gemodificeerd DMEM met 10% FCS en 8 μg/ml polybreen. Ook de amphotrope packaging cellen waren voorafgaand aan het gebruik geselecteerd voor het behoud van de DNA sequenties coderend voor de virale eiwitten (in het medium als beschreven voor GP+E-86 cellen, met daaraan toegevoegd 200 μg/ml hygromycine B). De kweek werd gedurende twee weken geëxpandeerd, waarna de amphotrope virus-producerende cellen werden herverkregen gebruikmakend van de resistentie van deze cellen tegen hygromycine B. Individuele GP+envAml2 cloons die functioneel humaan ADA tot expressie brengen en de virale eiwitten produceren, werden verkregen door gelimiteerde celaantallen te kweken in medium dat alle hierboven genoemde componenten in de genoemde hoeveelheden bevatte. In totaal werden 12 van dergelijke cloons geïsoleerd en getest.
De titer van de door de 12 cloons geproduceerde virus-supernatanten werd gemeten door muize fibroblasten aan verdunningen van deze supernatanten bloot te stellen en vervolgens het aantal fibroblasten te bepalen dat ten gevolge hiervan resistentie tegen Xyl-A/dCF had verkregen. De verschillende cloons produceerden tussen 3 x 103 en 2 x 105 infectieve virusdeeltjes per milliliter supernatant. De beste cloons produceerden ongeveer lOOx meer virus dan de tot dan toe beste amphotrope LgAL(ΔΜο+PyFlOl)-virus-producerende cellijn, welke via een enkele infectie met ecotroop virus was verkregen.
Teneinde een indruk te verkrijgen over de meest veelbelovende cloon met betrekking tot de toepassing in beenmerg gentherapie procedures, werd rhesusaap beenmerg gedurende drie dagen met elk van de 12 virus-producerende cellijnen geco-cultiveerd. Vervolgens werden het behoud van de capaciteit van het beenmerg om in vitro hemopoëtische kolonies te vormen en de infectie-efficiëntie op de hemopoëtische voorlopercellen, die aan de oorsprong van deze kolonies liggen, bepaald. Met enkele van de cloons konden infectie-efficiënties worden behaald tot 40-45% Xyl-A/dCF resistente voorlopercellen, terwijl geen van de cloons een duidelijke toxiciteit op deze beenmergcellen vertoonde.
Op basis van alle voornoemde criteria werd een cellijn gekozen, die POAM-P1 werd genoemd. Deze cellijn is gebruikt om in het onder b) beschreven uitvoeringsvoorbeeld de bruikbaarheid van aldus verkregen virus-producers voor de genetische modificatie van het bloedvormende orgaan van primaten te demonstreren.
b) Preklinische test van een beenmerg gentherapie procedure_in rhesusapen mat de onder a) beschreven celliin_PQAM-Pl
Rhesusaap beenmerg werd afgenomen door het puncteren van de bovenbenen en gesuspendeerd in HBSS/Hepes met 100 units heparine en 100 μg/ml DNase I. Cellen met een dichtheid lager dan 1.064 g/ml werden verkregen door achtereenvolgens uit te voeren een Ficoll scheiding en een BSA-dichtheidsgradiënt centrifugatie (39). Deze handelingen resulteerden in een verrijking van de celpopulatie voor hemopoëtische stamcellen met een factor 10 tot 20. De aldus verkregen beenmergcellen werden in een concentratie van 106 cellen per ml opgenomen in hoog glucose (4.5 g/liter) a-gemodificeerd DMEM, met 5% hitte-geïnactiveerd apeserum, 15 mg/ml BSA, 1.25 x 10-5 M Na2SeC>3, 0.6 mg/ml ijzer-verzadigd humaan transferrine, 1 μg/ml van elk van de volgende nucleosides: adenosine, 2'-deoxyadenosine, guanosine, 2'-deoxyguanosine, cytidine, 2'-deoxycytidine, thymidine and uridine, 1.5 x 10-5 M linolzuur, 1.5 x 10-5 M cholesterol, 1 x 10-4 Μ β-mercaptoethanol, 0.4 μg/ml polybreen, 100 μg/ml streptomycine, 100 U/ml penicilline en 50 ng/ml van de recombinante rhesusaap hemopoëtische groeifactor IL-3 (40). De zo verkregen celsuspensie werd met een concentratie van 2 x 105 cellen per cm2 uitgezaaid op een 70-80% dichtgegroeide monocellulaire laag van POAM-Pl cellen, welke kort tevoren waren blootgesteld aan 20 Gray γ-straling. Het beenmerg werd gedurende 90 uur met de POAM-Pl cellen geco-cultiveerd bij 37°C in een vocht-verzadigde atmosfeer van 10% CO2 in lucht.
Tijdens de duur van de co-cultivatie werd de rhesusaap die het beenmerg had gedoneerd, geconditioneerd voor de autologe ontvangst van het geco-cultiveerde beenmerg middels totale lichaamsbestraling met 10 Gray Röntgen-straling, verdeeld over twee gelijke fracties met een tussentijd van 24 uur, uitgevoerd resp. 2 en 1 dag(en) voorafgaand aan de transplantatie. Op de dag van de transplantatie werd het geco-cultiveerde beenmerg uit de kweek geoogst, inclusief de beenmergcellen die zich gedurende de kweek aan de P0AM-P1 cellen of aan het kunststof van de kweekfles hadden gehecht. De laatstgenoemde cellen werden door middel van een trypsinisatie verkregen. Een monocellulaire celsuspensie werd bereid in een fysiologische zoutoplossing met 10 μg/ml DNase I, en geïnfundeerd in een perifere vene.
Teneinde het in vivo regenererend vermogen van het geco-cultiveerde beenmerg te bepalen, is gebruik gemaakt van de semi-quantitatieve assay beschreven door Gerritsen et al. (41). Deze methode is gebaseerd op de waarneming dat de snelheid waarmee circulerende rode en witte bloedcellen regenereren na transplantatie van autologe beenmergcellen in lethaal bestraalde rhesus apen afhankelijk is van de grootte van het transplantaat. Met name de kinetiek van het verschijnen van de voorlopers van rode bloedcellen (reticulocyten) is in dit verband een goede maatstaf. Door na de transplantatie met regelmatige tussenperioden hematologische waarden in het bloedsysteem van de apen te bepalen kon (gebruikmakend van de door Gerritsen beschreven relatie) worden vastgesteld dat het gemodificeerde beenmerg voldoende regenererend vermogen behouden had en de co-cultivatie derhalve geen toxische bijwerking had.
Analyse op DNA niveau maakte tevens duidelijk dat lange perioden na de transplantatie het geïntroduceerde provirus terug te vinden was in diverse bloedcel typen hetgeen een duidelijk bewijs is van het feit dat via de hier beschreven uitvinding stabiele genetische modificatie van het hemopoëtische systeem van primaten kan worden verkregen.
Referenties 1. Anderson, W.F., 1984, Prospects for human gene therapy, Science 226: 401.
2. Belmont, J.W. and C.T. Caskey, 1986, Developments leading to human gene therapy, In Gene transfer, R. Kucherlapati, eds. Plenum press, New York and London, 411.
3. Williamson, B., 1982, Gene therapy, Nature 298: 416.
4. Williams, D.A., 1990, Expression of introduced genetic sequences in hematopoietic cells following retroviral-mediated gene transfer, Hum. Gene Ther. 1: 229.
5. Temin, H.M., 1986, Retrovirus vectors for gene transfer: efficient integration into and expression of exogenous DNA in vertebrate cell genomes, In Gene Transfer, R. Kucherlapati, eds. Plenum Press, New York, 149.
6. Temin, H.M., 1990, Safety considerations in somatic gene therapy of human disease with retrovirus vectors, Hum. Gene Ther. 1: 111.
7. Weiss, R., N. Teich, H. Varmus and J. Coffin, 1984, RNA tumor viruses, New York.
8. Miller, A.D., 1990, Retrovirus packaging cells, Hum. Gene Ther. 1: 5.
9. Danos, 0. and R.C. Mulligan, 1988, Safe and efficient generation of recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 6460.
10. Markowitz, D., S. Goff and A. Bank, 1988, A safe packaging line for gene transfer: separating viral genes on two different plasmids, J. Virol. 62: 1120.
11. Markowitz, D., S. Goff and A. Bank, 1988, Construction and use of a safe and efficient amphotropic packaging cell line, Virology 167: 400.
12. Van Beusechem, V.W., A. Kukler, M.P.W. Einerhand, T.A.
Bakx, A.J. Van der Eb, D.W. Van Bekkum and D. Valerio, 1990, Expression of human adenosine deaminase in mice transplanted with hemopoietic stem cells infected with amphotropic retroviruses, J. Exp. Med. 172: 729.
13. Valerio, D., M.P.W. Einerhand, P.M. Wamsley, Τ.Ά. Bakx, o C.L. Li and I.M. Verma, 1989, Retrovirus-mediated gene transfer into embryonal carcinoma cells and hemopoietic stem cells: Expression from a hybrid long terminal repeat, Gene 84: 419.
14. Anderson, W.F., P. Kantoff, M. Eglitis, J. McLachlin, E. Karson, J. Zwiebel, A. Nienhuis, S. Karlsson, R.M. Blaese, D. Kohn, E. Gilboa, D. Armentano, E.D. Zanjani, A. Flake, M.R. Harrison, A. Gillio, C. Bordignon and R. O'Reilly, 1986, Gene transfer and expression in nonhuman primates using retroviral vectors, In Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Volume LI, eds. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1073.
15. Kantoff, P.W., A.P. Gillio, J.R. McLachlin, C. Bordignon, M.A. Eglitis, N.A. Kernan, R.C. Moen, D.B. Kohn, S. Yu, E. Karson, S. Karlsson, J.A. Zwiebel, E. Gilboa, R.M. Blaese, A. Nienhuis, R.J. O'Reilly and W.F. Anderson, 1987, Expression of human adenosine deaminase in nonhuman primates after retrovirus-mediated gene transfer, J. Exp. Med. 166: 219.
16. Bodine, D.M., K.T. McDonagh, S.J. Brandt, P.A. Ney, B. Agricola, E. Byrne and A.W. Nienhuis, 1990, Development of a high-titer retrovirus producer cell line capable of gene transfer into rhesus monkey hematopoietic stem cells, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 3738.
17. Bolivar, F., R.L. Rodrigues, P.J. Greene, M.C. Betlach, H.L. Heynecker, H.W. Boyer, J.H. Crosa and S. Falkow, 1977, Construction and characterization of of new cloning vehicles, II, A multipurpose cloning system, Gene 2: 95.
18. Vieira, J. and J. Messing, 1982, The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers, Gene 19: 259.
19. Linney, E., B. Davis, J. Overhauser, E. Chao and H. Fan, 1984, Non-function of a Moloney Murine Leukaemia Virus regulatory sequence in F9 embryonal carcinoma cells, Nature 308: 470.
20. Armentano, D., S.F. Yu, P.W. Kantoff, T. Von Ruden, W.F. Anderson and E. Gilboa, 1987, Effect of internal viral sequences on the utility of retroviral vectors, J. Virol. 61: 1647.
21. Sullenger, B.A., H.F. Gallardo, G.E. Ungers and E. Gilboa, 1990, Overexpression of TAR sequences renders cells resistant to human immunodeficiency virus replication, Cell 63: 601.
22. Borelli, E., R. Heyman, M. Hsi and R.M. Evans, 1988, Targeting of an inducible toxic phenotype in animal cells, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7572.
23. Miller, A.D. and C. Buttimore, 1986, Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production, Mol. Cell. Biol. 6: 2895.
24. Pellicer, A., D. Robins, B. Wold, R. Sweet, J. Jackson, I. Lowy, J.M. Roberts, G.K. Sim, S. Silverstein and R. Axel, 1980, Altering genotype and phenotype by DNA-mediated gene transfer, Science 209: 1414.
25. Southern, P.J. and P. Berg, 1982, Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327.
26. Blochlinger, K. and H. Diggelman, 1984, Hygromycin B phosphatransferase as a selectable marker for DNA transfer experiments with higher eucaryotic cells, Mol. Cell. Biol. 4: 2929.
27. Mulligan, R.C. and P. Berg, 1980, Expression of a bacterial gene in mammalian cells, Science 209: 1422.
28. Hartman, S.C. and R.C. Mulligan, 1988, Two dominant acting selectable markers for gene transfer studies in mammalian cells, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8047.
29. Colbère-Garapin, F., S. Chousterman, F. Horodniceanu, P. Kourilsky and A. Garapin, 1979, Cloning of the active thymidine kinase gene of herpes simplex virus type I in Escherichia coli K-12, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 3755.
30. Simonsen, C.C. and A.D. Levinson, 1983, Isolation and expression of an altered mouse dihydrofolate reductase cDNA,-Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2495.
31. Graham, F.L. and A.J. Van der Eb, 1973, A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA, Virology 52: 456.
32. Chu, G., H. Hayakawa and P. Berg, 1987, Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA, Nucl. Acids Res. 15: 1311.
33. Potter, H., L. Weir and P. Leder, 1984, Enhancer-dependent expression of human k immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 7161.
34. Feigner, P.L. and G.M. Ringold, 1989, Cationic liposome-mediated transfection, Nature 337: 387.
35. Feigner, P.L., T.R. Gadek, M. Holm, R. Roman, H.W. Chan, M. Wenz, J.P. Northrop, G.M. Ringold and M. Danielsen, 1987, Lipofection: A highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7413.
36. Bestwick, R.K., S.L. Kozak and D. Rabat, 1988, Overcoming interference to retroviral superinfection results in amplified expression and transmission of cloned genes, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5404.
37. Kozak, S.L. and D. Rabat, 1990, Ping-pong amplification of a retroviral vector achieves high-level gene expression: human growth hormone production, J. Virol. 64: 3500.
38. Chen, C. and H. Okayama, 1987, High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA, Mol. Cell. Biol. 7: 2745.
39. Dicke, K.A., G. Tridente and D.W. Van Bekkum, 1969, The selective elimination of immunologically competent cells from bone marrow and lymphocyte cell mixtures, III, In vitro test for the detection of immunocompetent cells in fractionated mouse spleen cell suspensions and primate bone marrow suspensions, Transplantation 8: 422.
40. Burger, H., R.W. Van Leen, L.C.J. Dorssers, N.L.M. Persoon, P.J. Lemson and G. Wagemaker, 1990, Species specificity of human interleukin-3 demonstrated by cloning and expression of the homologous rhesus monkey (Macaca mulatta) gene, Blood 76: 2229.
41. Gerritsen, W.R., G. Wagemaker, M. Jonker, M.J.H. Kenter, J.J. Wielenga, G. Hale, H. Waldmann and D.W. Van Bekkum, 1988, The repopulation capacity of bone marrow grafts following pretreatment with monoclonal antibodies against T lymphocytes in rhesus monkeys, Transplantation 45: 301.
42. Mansour, S.L., K.R. Thomas and M.R. Capecchi, 1988, Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes, Nature 336: 348.

Claims (24)

1. Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, omvattende het isoleren van beenmergcellen uit een primaat en het door middel van een co-cultivatie blootstellen van de geïsoleerde beenmergcellen aan cellen die een recombinant amphotroop retrovirus produceren met een genoom gebaseerd op een retrovirale vector die de in de beenmergcellen in te brengen genetische informatie bevat.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het genoom van het recombinante amphotrope retrovirus op een retrovirale vector is gebaseerd die afgeleid is van een virale MuLV vector.
3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij de retrovirale vector twee van een virale MuLV vector afgeleide LTRs en het 5' gedeelte van het gag gen van een MuLV omvat.
4. Werkwijze volgens conclusie 3, waarbij de MuLV sequenties zijn afgeleid van de virale Mo-MuLV vector en ten minste de 3'-LTR een hybride LTR is die in plaats van de Mo-MuLV enhancer de PyFlOl enhancer bevat.
5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij men de retrovirale vector pLgXL(ΔΜο+PyFlOl) gebruikt, waarin X de in de beenmergcellen in te brengen genetische informatie voorstelt.
6. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-5, waarbij de cellen, die het recombinante amphotrope retrovirus produceren, recombinante zoogdiercellen zijn die de gag, pol en .env genen van MuLV bevatten en tot expressie brengen.
7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij het env gen van een amphotrope MuLV is afgeleid.
8. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7, waarbij de gag., pol, en env genen van MuLV in de recombinante zoogdiercellen verdeeld zijn over ten minste twee verschillende eukaryote expressieve ct o ren .
9. Werkwijze volgens een van de conclusies 6-8, waarbij elk packaging construct geassocieerd is aan een selecteerbaar merker gen.
10. Werkwijze volgens een van de conclusies 6-9, waarbij als recombinante zoogdiercellen GP+envAM12 cellen worden gebruikt.
11. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-10, waarbij de cellen, die een recombinant amphotroop retrovirus produceren, meerdere kopieën van de retrovirale vector bevatten.
12. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-11, waarbij de co-cultivatie van beenmergcellen met cellen, die amphotroop retrovirus produceren, geschiedt in aanwezigheid van serum en ten minste een hemopoëtische groeifactor.
13. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-12, waarbij na de co-cultivatie de niet-hechtende beenmergcellen tesamen met wel-hechtende beenmergcellen worden geoogst.
14. Cellen die een recombinant amphotroop retrovirus produceren met een genoom gebaseerd op een retrovirale vector welke genetische informatie bevat die geschikt is om volgens de werkwijze van een van de conclusies 1-13 in beenmergcellen van een primaat te worden gebracht.
15. Cellen volgens conclusie 14, waarbij het genoom van het recombinante amphotrope retrovirus op een retrovirale vector is gebaseerd die afgeleid is van een virale MuLV vector.
16. Cellen volgens conclusie 15, waarbij de retrovirale vector twee van een virale MuLV vector afgeleide LTRs en het 5' gedeelte van het gag gen van een MuLV omvat.
17. Cellen volgens conclusie 16, waarbij de MuLV sequenties zijn afgeleid van de virale Mo-MuLV vector en ten minste de 3'-LTR een hybride LTR is die in plaats van de Mo-MuLV enhancer de PyFlOl enhancer bevat.
18. Cellen volgens conclusie 17, waarin de retrovirale vector pLgXL(ΔΜο+PyFlOl) is gebruikt, waarin X de in de beenmergcellen in te brengen genetische informatie voorstelt.
19. Cellen volgens een van de conclusies 14-18, waarbij de cellen, die het recombinante amphotrope retrovirus produceren, recombinante zoogdiercellen zijn die de gag., p.o_l en env genen van MuLV bevatten en tot expressie brengen.
20. Cellen volgens conclusie 19, waarbij het env gen van een amphotrope MuLV is afgeleid.
21. Cellen volgens conclusie 19 of 20, waarbij de gag, p_ol en env genen van MuLV in de recombinante zoogdiercellen verdeeld zijn over ten minste twee verschillende eukaryote expressie-vectoren.
22. Cellen volgens een van de conclusies 19-21, waarbij elk packaging construct geassocieerd is aan een selecteerbaar merker gen.
23. Cellen volgens een van de conclusies 19-22, waarbij als recombinante zoogdiercellen GP+envAM12 cellen worden gebruikt.
24. Cellen volgens een van de conclusies 14-23, waarbij de cellen, die een recombinant amphotroop retrovirus produceren, meerdere kopieën van de retrovirale vector bevatten.
NL9101680A 1991-10-04 1991-10-04 Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren. NL9101680A (nl)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9101680A NL9101680A (nl) 1991-10-04 1991-10-04 Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren.
PCT/NL1992/000177 WO1993007281A1 (en) 1991-10-04 1992-10-05 Method for genetically modifying bone marrow cells of primates, and useful cells therefor that produce recombinant retroviral vectors
EP92921536A EP0606376B1 (en) 1991-10-04 1992-10-05 Method for genetically modifying bone marrow cells of primates, and useful cells therefor that produce recombinant retroviral vectors
US08/211,342 US5612206A (en) 1991-10-04 1992-10-05 Retrovirus infecting primate bone marrow cells and harvesting both non-adherent and adherent cells
ES92921536T ES2118140T3 (es) 1991-10-04 1992-10-05 Procedimiento de modificacion genetica de las celulas de la medula osea de primates, y celulas utilizables y celulas que producen vectores retrovirales recombinados.
DE69225489T DE69225489T2 (de) 1991-10-04 1992-10-05 Methode zur genetischen veränderung von knochenmarkzellen von primaten und dafür brauchbare zellen, die rekombinante retrovirale vektoren produzieren
JP5506806A JPH07501690A (ja) 1991-10-04 1992-10-05 霊長類の骨髄細胞を遺伝的に修飾する方法、および該方法のために有用な、組換えレトロウイルスベクターを産生する細胞
AU27689/92A AU2768992A (en) 1991-10-04 1992-10-05 Method for genetically modifying bone marrow cells of primates, and useful cells therefor that produce recombinant retroviral vectors
CA002120370A CA2120370A1 (en) 1991-10-04 1992-10-05 Method for genetically modifying bone marrow cells of primates, and useful cells therefor that produce recombinant retroviral vectors
AT92921536T ATE166109T1 (de) 1991-10-04 1992-10-05 Methode zur genetischen veränderung von knochenmarkzellen von primaten und dafür brauchbare zellen, die rekombinante retrovirale vektoren produzieren
US08/820,479 US6472212B1 (en) 1991-10-04 1997-03-18 Methods and compositions for genetically modifying primate bone marrow cells
US10/164,076 US20030166285A1 (en) 1991-10-04 2002-06-04 Methods and compositions for genetically modifying primate bone marrow cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9101680A NL9101680A (nl) 1991-10-04 1991-10-04 Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren.
NL9101680 1991-10-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL9101680A true NL9101680A (nl) 1993-05-03

Family

ID=19859782

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL9101680A NL9101680A (nl) 1991-10-04 1991-10-04 Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren.

Country Status (10)

Country Link
US (3) US5612206A (nl)
EP (1) EP0606376B1 (nl)
JP (1) JPH07501690A (nl)
AT (1) ATE166109T1 (nl)
AU (1) AU2768992A (nl)
CA (1) CA2120370A1 (nl)
DE (1) DE69225489T2 (nl)
ES (1) ES2118140T3 (nl)
NL (1) NL9101680A (nl)
WO (1) WO1993007281A1 (nl)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5399493A (en) * 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
NL9101680A (nl) * 1991-10-04 1993-05-03 Tno Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren.
US6051427A (en) * 1993-06-11 2000-04-18 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
EP0711354A1 (en) * 1993-07-30 1996-05-15 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Efficient gene transfer into primary lymphocytes
AU5703796A (en) * 1995-05-10 1996-11-29 Introgene B.V. Improved retroviral vectors, especially suitable for gene th erapy
WO1998041644A1 (en) * 1997-03-18 1998-09-24 Introgene B.V. Methods and compositions for genetically modifying primate bone marrow cells
CA2297489A1 (en) 1997-07-30 1999-02-11 Emory University Novel bone mineralization proteins, dna, vectors, expression systems
US7923250B2 (en) 1997-07-30 2011-04-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells
ATE350482T1 (de) * 1998-07-01 2007-01-15 Takara Bio Inc Gentransfermethoden
JP2002528056A (ja) * 1998-08-28 2002-09-03 デューク・ユニバーシティー ＩＶａ２、１００Ｋ及び／又は末端前タンパク質配列における欠失型アデノウイルス
KR20020013538A (ko) 1999-05-10 2002-02-20 나가야마 오사무 세포의 배양방법
US6770468B1 (en) 1999-09-14 2004-08-03 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Phosphodiester-α-GlcNAcase of the lysosomal targeting pathway
US6534300B1 (en) * 1999-09-14 2003-03-18 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Methods for producing highly phosphorylated lysosomal hydrolases
US20030124652A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-03 Novazyme Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing high mannose glycoproteins in complex carbohydrate deficient cells
US6905856B2 (en) 2001-12-21 2005-06-14 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Soluble GlcNAc phosphotransferase
US6800472B2 (en) * 2001-12-21 2004-10-05 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Expression of lysosomal hydrolase in cells expressing pro-N-acetylglucosamine-1-phosphodiester α-N-acetyl glucosimanidase
ES2198216B1 (es) * 2002-07-02 2005-04-16 Juan Carlos Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A.(67%). Medio de cultivo de celulas madre-progenitoras autologas humanas y sus aplicaciones.
US20050048041A1 (en) * 2003-01-13 2005-03-03 Rao Mahendra S. Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products
US11584908B2 (en) * 2017-09-20 2023-02-21 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Apparatus for efficient genetic modification of cells

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198423A (en) 1989-05-26 1993-03-30 Takara Shuzo Co., Ltd. Functional polypeptide containing a cell binding domain and a heparin binding domain of fibronectin
US5399493A (en) * 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
US5061620A (en) * 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
NL9101680A (nl) * 1991-10-04 1993-05-03 Tno Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren.
US5834256A (en) 1993-06-11 1998-11-10 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
US5534423A (en) * 1993-10-08 1996-07-09 Regents Of The University Of Michigan Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors
US5686278A (en) 1994-03-25 1997-11-11 Indiana University Foundation Methods for enhanced retrovirus-mediated gene transfer
US5811274A (en) 1994-12-09 1998-09-22 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and apparatus for cell transfection
SI0833934T2 (sl) 1995-06-15 2013-04-30 Crucell Holland B.V. Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji

Also Published As

Publication number Publication date
ATE166109T1 (de) 1998-05-15
CA2120370A1 (en) 1993-04-15
US5612206A (en) 1997-03-18
US6472212B1 (en) 2002-10-29
AU2768992A (en) 1993-05-03
DE69225489T2 (de) 1999-01-07
ES2118140T3 (es) 1998-09-16
EP0606376B1 (en) 1998-05-13
WO1993007281A1 (en) 1993-04-15
DE69225489D1 (de) 1998-06-18
EP0606376A1 (en) 1994-07-20
JPH07501690A (ja) 1995-02-23
US20030166285A1 (en) 2003-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL9101680A (nl) Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren.
Kwok et al. Retroviral transfer of genes into canine hemopoietic progenitor cells in culture: a model for human gene therapy.
US5219740A (en) Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
Mosca et al. Mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery.
Dunbar et al. Gene transfer into hematopoietic progenitor and stem cells: progress and problems
US6027722A (en) Vectors for gene transfer
US6287863B1 (en) Method of transferring a DNA sequence to a cell in vitro
JP2000512150A (ja) 細胞を形質転換するための方法および組成物
Havenga et al. Retroviral stem cell gene therapy
Williams et al. Somatic gene therapy. Current status and future prospects.
Morgan et al. Retroviral gene therapy in Germany with a view on previous experience and future perspectives
Kaptein et al. Optimized conditions for the production of recombinant amphotropic retroviral vector preparations
US20030157070A1 (en) High efficiency ex vivo transduction of cells by high titer recombinant retroviral preparations
Larochelle et al. Genetic manipulation of hematopoietic stem cells
Chu et al. Retrovirus-mediated gene transfer into human hematopoietic stem cells
Kantoff et al. Prospects for gene therapy for immunodeficiency diseases
US5837536A (en) Expression of human multidrug resistance genes and improved selection of cells transduced with such genes
JPH11514209A (ja) 組換えレトロウイルス調製物による造血幹細胞の高効率エクスビボ形質導入
Bernstein et al. Gene transfer with retrovirus vectors
US6534314B1 (en) Methods and compositions for transforming cells
CA2244663A1 (en) 10a1 retroviral packaging cells and uses thereof
JPH11503916A (ja) 高力価組換えレトロウイルス調製物による細胞の高効率エクスビボ形質導入
Chang et al. Gene transfer into hemopoietic stem cells using retroviral vectors
Karlsson Gene therapy of haematopoietic cells
CA2283641A1 (en) Methods and compositions for genetically modifying primate bone marrow cells

Legal Events

Date Code Title Description
A1B A search report has been drawn up
BV The patent application has lapsed