KR20200128703A - B형 간염 백신 및 이의 용도 - Google Patents

B형 간염 백신 및 이의 용도 Download PDF

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KR20200128703A
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더글라스 이. 브로우
셰릴 지. 보링어
람야 얄라가다
비노드바부 쿠렐라
폰라즈 프라바카란
사이먼 메테노우
쿠안-푸 딩
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프레시전 인코포레이티드
피젠 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

가공된 B형 간염 바이러스(HBV) 분자 백신 작제물이 본원에 제공된다. 백신 작제물은 또한 숙주 세포 내에서 이종 유전자, 예를 들면, 사이토킨의 발현을 조절하기 위한 리간드-유도성의 가공된 유전자 스위치 시스템을 포함할 수 있다.

Description

B형 간염 백신 및 이의 용도
서열 목록에 대한 참고
본 출원과 함께 출원된, 전자적으로 제출된 서열 목록(명칭: 2584_161PC01_SeqListing_ST25; 크기: 372,514 바이트(byte); 생성일: 2019년 3월 5일)의 내용은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 생물정보학 및 단백질 가공(protein engineering)에서 진전된 원리를 사용하여 설계된 개선된, 광범위한 스펙트럼의 HBV 분자 백신에 관한 것이다.
만성 B형 간염은 다수의 바이러스(HepB 또는 HBV) 유전형을 포함하는 질환이다. HBV 유전형/서브유전형(subgenotype)은 임상 및 바이러스 특성, 예를 들면, 간 질환의 중증도 및 항바이러스 치료요법에 대한 반응에 있어서의 차이와 크게 관련되어 왔다. HBV에 의한 감염은 간경변, 간 부전 및 간세포 암종(HCC)을 야기할 수 있는 간염을 유발한다. HBV의 진단은 혈청학적 발견을 기준으로 한다. 만성 HBV 감염에 대한 치유법은 존재하지 않는다. 현재 이용가능한 치료 선택사항은 간경변 및 바이러스 복제의 진행을 늦추고, HCC 및 간부전의 발생을 감소시키는 것에 목표를 두고 있다.
본 개시내용은 생물정보학 및 단백질 가공에서 진전된 원리를 사용하여 설계된 개선된, 광범위한 스펙트럼의 HBV 분자 백신에 관한 것이다. 이러한 신규 HBV 백신은 HBV 관련 질환에 대한 치료학적 백신으로서 사용될 수 있다.
참고문헌의 포함
본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허원은 각각의 개개 공보, 특허, 또는 특허원이 참고에 의해 포함되도록 구체적으로 및 개별적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 참고에 의해 본원에 포함된다.
개시내용의 요약
적어도 하나 이상의 면역 반응-유도성(immune response inducing) B형 간염 바이러스(HBV) 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 비-천연적으로 발생하는(non-naturally occurring) 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 비-천연적으로 발생하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드는 HBV 코어 펩타이드(Core peptide)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 HBV 코어 펩타이드는 표 3에 나타낸 바와 같은 코어 펩타이드 서열 중 임의의 하나를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드는 HBV 표면 펩타이드(Surface peptide)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 HBV 표면 펩타이드는 표 3에 나타낸 바와 같은 표면 펩타이드 서열 중 임의의 하나를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드는 HBV Pol 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 HBV Pol 펩타이드는 표 3에 나타낸 바와 같은 Pol 펩타이드 서열 중 임의의 하나를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드는 HBV HBSP/HBx 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 HBV HBSP/HBx 펩타이드는 표 3에 나타낸 바와 같은 HBSP/HBx 펩타이드 서열 중 임의의 하나를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드는 KK 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 KK 링커는 표 3에 나타낸 바와 같은 펩타이드 서열 중 임의의 하나를 표 3에 나타낸 바와 같은 임의의 다른 펩타이드 서열에 연결시킨다.
이종 유전자 발현의 유도성 제어(inducible control)를 위한 유전자 스위치 시스템(gene switch system)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 본원에 제공된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공되며, 여기서 이종 유전자 발현은 상기 유전자 스위치 시스템에 의해 조절되며, 상기 이종 유전자는 본원에 기술된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 스위치 시스템은 엑다이손 수용체(ecdysone receptor)-기반(EcR-based) 유전자 스위치 시스템이다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드는 백신에서 사용하기 위한 것이다.
본원에 제공된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(vector)가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 고릴라(gorilla) 아데노바이러스 벡터이다.
세포 내에서 이종 유전자의 발현을 조절하는 방법이 본원에 제공되며, 이러한 방법은 (i) 억제성(repressible) 또는 유도성 유전자 스위치, 및 (ii) 이종 면역 반응-유도성 유전자를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내로 도입시키는 단계로서, 상기 이종 면역 반응-유도성 유전자의 발현은 상기 유전자 스위치에 의해 조절되고, 상기 이종 면역 반응-유도성 유전자는 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드 중 적어도 하나를 암호화하는 단계; 및 상기 세포를 상기 이종 면역 반응-유도성 유전자의 발현을 억제하거나 유도하기에 충분한 양의 화합물에 노출시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 표적 세포는 본원에 기술된 세포 내에서 이종 유전자의 발현을 조절하는 방법에서의 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 스위치는 엑다이손 수용체(EcR), 유비쿼터스 수용체(ubiquitous receptor), 오르판 수용체(orphan receptor) 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드(farnesoid) X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 및 파메솔 수용체 중 적어도 하나로부터 유래된 리간드 결합 도메인을 포함한다.
임의의 본원에 기술된 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다. 또한 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 고릴라(gorilla) 아데노바이러스 벡터이다.
벡터가 본원에 제공되며, 상기 벡터는 적어도 하나의 HBV 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
벡터가 본원에 제공되며, 상기 벡터는 적어도 하나의 HBV 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터이고, 상기 아데노바이러스 벡터는 고릴라 아데노바이러스 벡터이다.
폴리펩타이드 작제물이 본원에 제공되며, 상기 폴리펩타이드 작제물은 HBV HBx 도메인 및, HBV Pol 도메인, HBV 코어 도메인, HBV 프레-코어(pre-Core) 도메인 또는 HBV 표면 도메인 중 적어도 하나를 포함한다. 또한 폴리펩타이드 작제물이 본원에 제공되며, 상기 폴리펩타이드 작제물은 프레-코어 도메인 및, HBV Pol 도메인, HBV HBx 도메인 또는 HBV 표면 도메인 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 HBV HBx 도메인은 서열 번호: 98에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 HBV Pol 도메인은 야생형 HBV Pol 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 결실은 상기 야생형 HBV Pol 도메인의 결실된 부위를 포함하고, 상기 결실된 부위는 538 내지 544번 아미노산 또는 710 내지 742번 아미노산 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 결실된 부위는 538 내지 544번 아미노산 및 710 내지 742번 아미노산 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 HBV Pol 도메인은 서열 번호: 99에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 HBV 표면 도메인은 PreS1 도메인, PreS2 도메인 및 S 도메인 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 HBV 표면 도메인은 HBV S 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표면 도메인은 서열 번호: 100에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 작제물은 HBV 코어 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 작제물은 코어 부위를 포함하고, 상기 코어 부위는 상기 HBV 코어 도메인 및 상기 HBV 프레-코어 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 코어 부위는 서열 번호: 101에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 작제물은 각각의 SHB(Env), HBeAg, HBx, 및 Pol 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 작제물은 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 SHB(Env), HBeAg, HBx, 및 Pol 도메인의 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 SHB(Env) 도메인은 서열 번호: 102에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 HBeAg 도메인은 서열 번호: 103에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 HBx 도메인은 서열 번호: 104에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 Pol 도메인은 서열 번호: 105에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 작제물은 서열 번호: 106에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다.
폴리펩타이드 작제물이 본원에 제공되며, 상기 폴리펩타이드 작제물은 하나 이상의 HBV HBx 링커 및, 코어 도메인, 표면 도메인 및 Pol 도메인 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 코어 도메인, 상기 표면 도메인 및 상기 Pol 도메인 중 하나는 상기 코어 도메인, 상기 표면 도메인 및 상기 Pol 도메인 중 다른 것에 상기 하나 이상의 HBx 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 표면 도메인은 HBV PreS1 도메인, HBV PreS2 도메인 및 HBV S 도메인 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV HBx 링커는 다중 HBV HBx 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 다중 HBV HBx 링커 중 적어도 2개는 아미노산 서열에 있어서 상이하다. 일부 구현예에서, 상기 HBV HBx 링커는 표 3의 HBx-1, HBx-2, HBx-3, HBx-4, HBx-5 또는 HBx-6 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 코어 도메인은 상기 표면 도메인에 인접해 있다. 일부 구현예에서, 상기 표면 도메인은 PreS1 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표면 도메인은 상기 코어 도메인에 상기 하나 이상의 HBx 링커에 의해 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 Pol 도메인은 표면 도메인에 인접해 있다. 일부 구현예에서, 상기 표면 도메인은 PreS1 도메인, PreS2 도메인 및 S 도메인 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표면 도메인은 상기 PreS1 도메인을 포함하고, 상기 Pol 도메인의 N-말단 부위는 상기 PreS1 도메인에 인접해 있다. 일부 구현예에서, 상기 Pol 도메인의 상기 N-말단 부위는 상기 PreS1 도메인에 상기 하나 이상의 HBx 링커 중 하나에 의해 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 표면 도메인은 상기 PreS2 도메인을 포함하고, 상기 Pol 도메인의 N-말단 부위는 상기 PreS2 도메인에 인접해 있다. 일부 구현예에서, 상기 Pol 도메인의 N-말단 부위는 상기 PreS2 도메인에 상기 하나 이상의 HBx 링커 중 하나에 의해 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 표면 도메인은 상기 PreS2 도메인을 포함하고, 상기 Pol 도메인의 C-말단 부위는 상기 PreS2 도메인에 인접해 있다. 일부 구현예에서, 상기 Pol 도메인의 상기 C-말단 도메인은 상기 PreS2 도메인에 상기 하나 이상의 HBx 링커 중 하나에 의해 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 표면 도메인은 상기 S 도메인을 포함하고, 상기 Pol 도메인의 C-말단 부위는 상기 S 도메인에 인접되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 Pol 도메인의 상기 C-말단 부위는 상기 S 도메인에 상기 하나 이상의 HBx 링커 중 하나에 의해 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 작제물은 서열 번호: 107에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다.
안키린-유사 반복체 도메인(ankyrin-like repeat domain) 도메인 및 하나 이상의 HBV 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 작제물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 안키린-유사 반복체 단백질(ankyrin-like repeat protein)은 사람 안키린-유사 반복체 단백질이다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드는 표 3의 아미노산 서열 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드는 코어 펩타이드, 표면 펩타이드, Pol 펩타이드 및 HBSP/HBx 펩타이드 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드는 코어 펩타이드를 포함하고, 상기 코어 펩타이드는 표 3의 코어 아미노산 서열 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드는 표면 펩타이드를 포함하고, 상기 표면 펩타이드는 표 3의 표면 아미노산 서열 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드는 Pol 펩타이드를 포함하고, 상기 Pol 펩타이드는 표 3의 Pol 아미노산 서열 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드는 HBSP/HBx 펩타이드를 포함하고, 상기 HBSP/HBx 펩타이드는 표 3의 HBSP/HBx 아미노산 서열 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 작제물은 서열 번호: 108에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다.
폴리펩타이드 작제물이 본원에 제공되며, 상기 폴리펩타이드 작제물은 표 3에 나타낸 바와 같은 적어도 2개의 HBV 아미노산 서열을 포함하고, 상기 적어도 2개의 HBV 아미노산 서열은 펩타이드 링커에 의해 연결되며, 상기 펩타이드 링커는 KK 링커이다. 일부 구현예에서, 상기는 적어도 2개의 HBV 아미노산 서열을 포함하고, 표 3에 나타낸 바와 같은 코어 펩타이드, 표면 펩타이드, Pol 펩타이드 및 HBSP/HBx 펩타이드 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 2개의 HBV 아미노산 서열은 표 3에 나타낸 바와 같은 각각의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 각각의 아미노산 서열은 상기 각각의 아미노산 서열 중 다른 것에 상기 KK 링커에 의해 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 작제물은 서열 번호: 109에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 임의의 본원에 기술된 폴리펩타이드 작제물은 백신에서 사용하기 위한 것이다. 또한 임의의 본원에 기술된 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다. 또한 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 고릴라 아데노바이러스 벡터이다.
본 개시내용의 특징은 특히 첨부된 청구범위에 제공된다. 본 개시내용의 특징 및 이점의 보다 나은 이해는 예시적인 구현예를 제공하는 다음의 상세한 설명을 참고로 수득될 것이며, 여기서 본 개시내용의 원리가 활용되며, 이중 첨부되는 도면은 다음과 같다:
도 1은 만성 HBV 감염의 개략도이다.
도 2는 만성 HBV 감염의 병력(history)을 나타내는 개략도이다.
도 3a는 B형 간염 바이러스의 개략적인 개요이다. HBV DNA는 3.2kb의 환형의, 엔벨로프된(enveloped), 부분적으로 이중 가닥인 DNA 게놈이다. HBV는 4개의 유전자(S, C, P, 및 X)를 갖는다. S 유전자는 작은 표면 단백질(S), 중간 표면 단백질(S + PreS2), 및 큰 표면 단백질(S + PreS2 + PreS1)로 이루어진 엔벨로프(지질 이층) 표면 단백질(HBsAg)을 암호화한다. C 유전자는 캡시드 또는 코어 단백질을 암호화한다. C 유전자는 프레코어(precore) 및 코어 영역을 갖는다. 해독이 프레코어 영역에서 개시되는 경우, 단백질은 HBeAg이다. 해독이 코어 영역에서 개시되는 경우, 단백질은 HBcAg이다. P 유전자는 DNA 폴리머라제(Pol)를 암호화한다. X 유전자는 x 단백질(HBxAg)을 암호화한다. 도 3b는 B형 간염 바이러스 게놈의 개관이다. HBV 게놈은 TP, SP, RT 및 RH를 포함하는 Pol(832 아미노산); PreS1(108 아미노산); PreS2(55 아미노산); S(226 아미노산); PreC(29 아미노산); C(183 아미노산); 및 HBx(154 아미노산)를 포함한다. 도 3c는 수개의 오버랩핑 바이러스 단백질, 예를 들면, 폴리머라제 코어, 코어 엔벨로프(core envelop)(Pre-S1, S2, S), HBe, 및 HBx 단백질을 암호화하는 HBV 게놈의 개략도를 나타낸다. 도 3d는 수개의 오버래핑 바이러스 단백질, 예를 들면, 폴리머라제 코어, 코어 엔벨로프(Pre-S1, S2, S), HBe, 및 HBx 단백질을 암호화하는 HBV 게놈의 개략도를 나타낸다.
도 4는 HBV 감염 메카니즘의 개략적인 개요이다.
도 5는 HBV 백신 항원을 설계하기 위해 시행된 개략적인 전체 작업흐름도이다.
도 6은 HBV 설계 1 내지 5의 개략적인 구조적 도해를 나타낸다. HBV 설계 1 및 2는 클레드(clade) D 컨센수스(consensus)를 기반으로 설계되었다. HBV 설계 3의 경우, 사람 안키린-유사 반복체(ALR) 단백질 스캐폴드(scaffold)(PDB 코드 1QYM) 펩타이드는 나선 및 루프 영역에서 탄뎀(tandem) 방식으로 이식되었다. 절단가능한 링커(VSQTSKLTR)에 의해 연결된, 2개의 ALR 스캐폴드가 사용되었다. HBV 설계 4 에피토프(epitope)는 KK 링커에 의해 분리되었다. 상이한 링커를 HBV 설계 5에 사용하여 펩타이드를 연결시켰다.
도 7은 NK 세포 및 T 세포를 활성화시킴으로써 면역 반응을 촉진하는 IL-12의 개관을 나타낸다.
도 8은 다양한 IL-12 리간드-유도성 유전자 스위치 벡터 시스템의 다양한 구조적 구성성분을 나타낸다.
도 9a는 HBe에 대한 NetMHC4.0 항원성 예측을 나타낸다. 예측된 강한 및 약한 결합 펩타이드는 펩타이드 위치에 대해 플레이팅(plating)되었다. 도 9b는 HBe에 대한 NetMHC4.0 항원성 예측을 나타낸다. 제1 및 제2 차수 미분(differential)을 밀도 플롯 상에 사용하여 피크를 확인하였다. 도 9c는 HBV 서브형(subtype)에 걸쳐 포함도(coverage)를 측정하기 위하여 컨센수스 서열에 대해 정렬된 아미노산 서열을 나타낸다.
도 10은 상이한 HBV 단백질의 융합된 도메인을 강조하는 TG1050 및 HBV 설계 1의 개략적인 표시이다.
도 11은 HBx 펩타이드로 연결된 모든 3개의 주요 단백질(코어, 표면 스플라이스 변이체, 및 폴리머라제)로 이루어진 HBV 설계 2의 개략적인 표시이다.
도 12a는 코어 HBV 단백질 도메인의 구조를 나타낸다. 도 12b는 HBV preS1 및 S2 펩타이드의 구조를 나타낸다. 도 12c는 HBV HBx의 구조를 나타낸다. 도 12d는 4개의 코어 펩타이드-MHC 복합체의 구조를 나타낸다.
도 13은 멀티-에피토프(multi-epitope) 항원을 기반으로 한 HBV 설계 4의 상동성 모델을 나타낸다.
도 14는 RNA qPCR 상대적인 발현 검정에 대해 생성된 짧은 및 긴 프라이머 및 프로브 세트를 나타내는 개략적인 도해이다. 구체적인 프라이머가 각각의 HBV 항원 설계를 위해 설계되었다.
도 15a는 HBV 설계 1 및 TG1050 대조군의 코어 서열 비교를 나타낸다. 도 15b는 HBV 설계 1 및 TG1050 대조군의 서열 비교를 나타낸다. 도 15c는 HBV 설계 1 및 TG1050 대조군의 서열 비교를 나타낸다.
도 16은 HBV 설계 5의 개략적인 표시이다.
개시내용의 상세한 설명
다음의 설명 및 실시예는 본 개시내용의 구현예를 상세히 설명한다.
본 개시내용은 본원에 기술된 특수한 구현예에 한정되지 않으며 자체로서 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 당해 분야의 기술자는 본 개시내용의 변화 및 변형이 존재함을 인식할 것이며, 이는 이의 영역 내에 포함된다.
모든 용어는 이들이 당해 분야의 기술자에게 이해될 수 있으므로 이해되는 것으로 의도된다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속한 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 단락 제목은 단지 구조화 목적을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 개시내용의 다양한 특징은 단일 구현예의 맥락에서 기술될 수 있지만, 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 조합으로 제공될 수 있다. 역으로, 본 개시내용이 명확성을 위해 별도의 구현예의 맥락에서 본원에 기술될 수 있지만, 본 개시내용은 또한 단일 구현예로 시행될 수 있다.
다음의 정의는 당해 분야의 것을 보충하며 현재의 출원에 관한 것이며 임의의 관련되거나 관련되지 않은, 예컨대, 임의의 일반적으로 소유된 특허 또는 특허원에 귀속되지 않아야 한다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질을 본 개시내용의 시험을 위한 실시에 사용할 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기술되어 있다. 따라서, 본원에서 사용된 전문 용어는 특수한 구현예 만을 기술하는 목적을 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
정의
본 출원에서, 단수의 사용은 구체적으로 달리 기술하지 않는 한 복수를 포함한다. 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형 하나("a", "an") 및 그("the")는 문맥이 달리 명확하게 구술하지 않는 한 복수 참고를 포함한다.
본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 기술하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는" 및 "이의 임의의 조합" 및 이의 문법적 등가물은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어는 임의의 조합이 구체적으로 고려됨을 전달할 수 있다. 단지 설명적 목적을 위해, 다음의 어구 "A, B, 및/또는 C" 또는 "A, B, C, 또는 이의 임의의 조합"은 "개별적으로 A; 개별적으로 B; 개별적으로 C; A 및 B; B 및 C; A 및 C; 및 A, B, 및 C"를 의미한다. 용어 "또는"은 문맥이 구체적으로 분리성 용도를 지칭하지 않는 한, 결합하여 또는 분리하여 사용될 수 있다.
또한, "포함하는(including)" 뿐만 아니라 다른 형태, 예를 들어, "포함하다(include, includes, 및 included)"는 제한되지 않는다.
명세서에서 "일부 구현예", "구현예", "일 구현예" 또는 "다른 구현예"에 대한 참고는 구현예와 관련하여 기술된 특수한 특징, 구조, 또는 특성이 적어도 일부 구현예에 포함되지만 필수적으로 본 개시내용의 모든 구현예에 포함되지는 않는다는 것을 의미한다.
본 명세서 및 청구범위(들)에서 사용된 바와 같은, 단어 "포함하는(comprising)"(및 "포함하다(comprise 및 comprises)"와 같은 '포함하는'의 임의l 형태), "갖는(having)"(및 "갖다(have 및 has)"와 같은 '갖는'의 임의의 형태), "포함하는"(및 "포함하다(includes 및 include)"와 같은 '포함하는'의 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유하다(contains 및 contain)"와 같은 '함유하는'의 임의의 형태)는 포괄적이거나 비제한적(open-ended)이며 추가의, 인용되지 않은 성분 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 구현예는 본 개시내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 시행될 수 있고, 그 역으로도 가능함이 고려된다. 또한, 본 개시내용의 조성물을 사용하여 본 개시내용의 방법을 달성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 참고 수치 및 이의 문법적 등가물과 관련하여 용어 "약"은 수치 자체 및 이러한 수치로부터 플러스 또는 마이너스 10%의 범위를 포함할 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 측정된 특수한 값에 대해 허용되는 오차 범위 이내를 의미하며, 이는 이러한 값이 측정되거나 결정되는 방법의 일부, 즉, 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들면, "약"은 당해 분야에서 실시 당, 1 또는 1 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 다른 예에서, 양 "약 10"은 10 및 9 내지 11로부터의 임의의 양을 포함한다. 여전히 다른 실시예에서, 참고 수치와 관련하여 용어 "약"은 또한 이러한 값으로부터 플러스 또는 마이너스 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%의 범위를 포함할 수 있다. 대안적으로, 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 용어 "약"은 값의 자릿수 이내, 바람직하게는 값의 5배, 및 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특수한 값이 본 출원 및 청구범위에 기술되어 있지만, 달리 기술하지 않는 한, 특수한 값에 대해 허용되는 오차 범위 이내를 의미하는 용어 "약"이 추정되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단리된" 및 이의 문법적 등가물은 이의 천연 환경으로부터 핵산의 제거를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "정제된" 및 이의 문법적 등가물은 천연(게놈성 DNA 및 mRNA 포함)으로부터 제거되거나 합성(cDNA 포함)되고/되거나 실험실 조건 하에서 증폭된 것에 상관없이, 순도가 증가된 분자 또는 조성물을 지칭하며, 여기서 "순도"는 "절대 순도"가 아닌 상대적인 용어이다. 그러나, 핵산 및 단백질은 희석제 또는 보조제(adjuvant)와 함께 제형화될 수 있고 실질적인 목적을 위해 여전히 분리되어야 함이 이해되어야 한다. 예를 들면, 핵산은 전형적으로 세포 내로 도입하기 위해 사용된 경우 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 정제된" 및 이의 문법적 등가물은 필수적으로 유리된, 즉, 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산, 폴리펩타이드, 단백질 또는 다른 화합물이 천연적으로 관련되어 있는 다른 분자 중 약 50% 유리되고, 약 70% 이상 유리되며, 약 90% 이상 유리된 다른 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드 작제물", "유전자", "유전자 작제물", "이종 유전자" 및 이의 문법적 등가물은 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드인, 임의의 길이의 뉴클레오타이드 또는 핵산의 중합체 형태를 지칭한다. 이러한 용어는 분자의 1차 구조 만을 지칭한다. 따라서, 이러한 용어는 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA, 트리플렉스(triplex) DNA 뿐만 아니라 이중 및 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이는 또한 예를 들면, 메틸화에 의해 및/또는 캡핑(capping)에 의해 변형된, 및 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오타이드를 또한 포함한다. 용어는 또한 비-천연적으로 발생한 또는 합성 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 분자를 포함함을 의미한다. 본원에 개시되거나 고려된 핵산 서열 및 벡터는 예를 들면, 형질감염, 형질전환, 또는 형질도입에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 바와 같은 "형질감염", "형질전환" 또는 "형질도입"은 물리적 또는 화학적 방법을 사용한 숙주 세포 내로의 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 도입을 지칭한다. 많은 형질감염 기술이 당해 분야에 공지되어 있고 예를 들면, 인산칼슘 DNA 공-침전(참고: 예컨대, Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-덱스트란; 전기천공(electroporation); 양이온성 리포좀-매개된 형질감염; 텅스텐 입자-촉진된 미세입자 충격(cationic liposome-mediated transfection; tungsten particle-facilitated microparticle bombardment)(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 인산스트론튬 DNA 공-침전(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다. 파아지 또는 바이러스 벡터는 적합한 패키징 세포(packaging cell) 내에서 감염성 입자의 성장 후, 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있으며, 이들 중 많은 것이 상업적으로 이용가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 "폴리펩타이드", "펩타이드", "폴리펩타이드 작제물" 및 "펩타이드 작제물" 및 이들의 문법적 등가물은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. "성숙한 단백질"은 전체 길이의 단백질이고, 이는 임의로, 주어진 세포 환경에서 단백질에 대해 대표적인 글리코실화 또는 다른 변형을 포함한다. 본원에 개시된 폴리펩타이드 및 단백질(이의 기능성 부위 및 기능성 변이체 포함)은 하나 이상의 천연적으로 발생하는 아미노산 대신에 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 아미노사이클로헥산 카복실산, 노르루이신, α-아미노 n-데카노산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-하이드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카복시페닐알라닌, β-페닐세린 β-하이드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 사이클로헥실알라닌, 사이클로헥실글리신, 인돌린-2-카복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-라이신, N',N'-디벤질-라이신, 6-하이드록시라이신, 오르니틴, α-아미노사이클로펜탄 카복실산, α-아미노사이클로헥산 카복실산, α-아미노사이클로헵탄 카복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카복실산, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌, 및 α-3급-부틸글리신을 포함한다. 본 개시내용은 또한 가공된 세포 내에서 본원에 기술된 폴리펩타이드의 발현이 폴리펩타이드 작제물의 하나 이상의 아미노산의 해독 후 변형과 관련될 수 있음을 고려한다. 해독 후 변형의 비-제한적 예는 포스포릴화, 아실화, 에를 들면, 아세틸화 및 포르밀화, 글리코실화(N-연결된 및 O-연결된 것을 포함함), 아미드화, 하이드록실화, 알킬화, 예를 들면, 메틸화 및 에틸화, 유비퀴틸화, 피롤리돈 카복실산의 첨가, 이황화물 브릿지(disulfide bridge)의 형성, 황화(sulfation), 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화, 파르네실화, 게라닐화, 당화(glypiation), 리포일화(lipoylation) 및 요오드화를 포함한다.
핵산 및/또는 핵산 서열은 이들이 일반적인 조상 핵산(ancestral nucleic acid) 또는 핵산 서열로부터 천연적으로 또는 인공적으로 기원하는 경우 "상동성"이다. 단백질 및/또는 단백질 서열은 이의 암호화 DNA가 일반적인 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 천연적으로 또는 인공적으로 유래하는 경우 "상동성"이다. 상동성 분자는 동족체로 명명될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은, 임의의 천연적으로 발생하는 단백질은 임의의 이용가능한 돌연변이유발 방법으로 변형시킬 수 있다. 발현시키는 경우, 이러한 돌연변이유발된 핵산은 원래의 핵산에 의해 암호화된 단백질에 대해 상동성인 폴리펩타이드를 암호화한다. 상동성은 일반적으로 2개 이상의 핵산 또는 단백질(또는 이의 서열) 사이의 서열 동일성(sequence identity)으로부터 부여된다. 상동성을 확립하는데 유용한 서열 사이의 정밀한 동일성 퍼센트는 쟁점인 핵산 및 단백질과 함께 변하지만, 상동성을 확립하기 위해 25% 정도로 낮은 서열 동일성이 통상적으로 사용된다. 보다 높은 수준의 서열 동일성, 예컨대, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상을 또한 사용하여 상동성을 확립할 수 있다. 서열 동일성 퍼센트를 측정하는 방법(예컨대, 디폴트 매개변수(default parameter)를 사용한 BLASTP 및 BLASTN)가 본원에 기술되어 있으며 일반적으로 이용가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "동일한" 및 이의 문법적 등가물 또는 폴리펩타이드의 2개의 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 맥락에서 "서열 동일성"은 규정된 비교 윈도우(comparison window)에 걸쳐 최대 상응성에 대해 정렬한 경우 동일한 2개 서열 내 잔기를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "비교 윈도우"는 적어도 약 20개, 일반적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150개의 연속된 위치의 분절(segment)을 지칭하며, 여기서 서열은 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후 연속된 위치의 동일한 번호의 참고 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 문헌: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘(local homology algorithm)에 의해; 문헌: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)의 정렬 알고리즘에 의해; 문헌: Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A., 85:2444 (1988)의 유사성 방법에 대한 조사에 의해; 이러한 알고리즘의 컴퓨터처리된 시행(예를 들면, 캘리포니아주 마운틴 뷰(Mountain View) 소재의 Intelligentics에 의한 PC/Gene 프로그램에서 CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 미국 위스콘신주 매디슨(Madison) 사이언스 드라이브 575 소재의 Genetics Computer Group (GCG), Wisconsin Genetics Software Package에서의 TFASTA)에 의해 수행될 수 있으며; CLUSTAL 프로그램은 문헌: Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244 (1988) 및 Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988); Huang et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165 (1992); 및 Pearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994)에 잘 기술되어 있다. 정렬은 또한 검토 및 매뉴얼 정렬에 의해 흔히 수행된다. 구현예의 한 부류에서, 본원의 폴리펩타이드는 예컨대, 디폴트 매개변수를 사용하여 BLASTP(또는 CLUSTAL, 또는 임의의 다른 유용한 정렬 소프트웨어)에 의해 측정된 바와 같은, 참고 폴리펩타이드, 또는 이의 단편과 적어도 80%, 85%, 90%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 유사하게, 핵산은 또한 출발 핵산을 참고로 기술될 수 있는데, 이들은 예컨대, 유용한 디폴트 매개변수를 사용하여 BLASTN(또는 CLUSTAL, 또는 임의의 다른 이용가능한 정렬 소프트웨어)에 의해 측정된 바와 같이, 참고 핵산 또는 이의 단편에 대해 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 하나의 분자가 보다 큰 분자와 서열 동일성의 특정 퍼센트를 갖는 것으로 일컬어지는 경우, 이는 2개의 분자가 최적으로 정렬되는 경우, 보다 작은 분자 내 잔기의 상기 퍼센트가 2개 분자가 최적으로 정렬된 순서에 따라 보다 큰 분자내 매치 잔기(match residue)를 찾음을 의미한다.
핵산 또는 아미노산 서열에 적용된 바와 같은 용어 "실질적으로 동일한" 및 이의 문법적 등가물은 핵산 또는 아미노산 서열이 상술한 프로그램, 예컨대, 표준 매개변수를 사용하는, BLAST를 사용하여 참고 서열과 비교시 적어도 90% 이상의 서열 동일성, 적어도 95%, 적어도 98% 및 적어도 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함함을 의미한다. 예를 들면, BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 단어 길이(word length)(W), 10의 예측(E), M=5, N=-4, 및 가닥(strand) 둘 다의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어 길이(W), 10의 예측(E), 및 BLOSUM62 점수매김 매트릭스(scoring matrix)를 사용한다(참고: Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)). 서열 동일성의 퍼센트는 비교 윈도우에 걸쳐서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 측정되며, 여기서, 비교 윈도우내 폴리뉴클레오타이드 서열의 부위는 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 참고 서열(이는 첨가 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교하여 첨가 또는 결실(즉, 갭(gap))을 포함할 수 있다. 퍼센트는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 서열 둘 다에서 발생하여 매치된 위치의 수를 생성하는 위치의 수를 측정하고, 매치된 위치의 수를 비교 윈도우내 위치의 총 수로 나누고 이러한 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 퍼센트를 수득함으로써 계산한다. 구현예에서, 실질적인 동일성은 길이가 적어도 약 50개 잔기인 서열의 영역에 걸쳐, 적어도 약 100개의 잔기의 범위에 걸쳐 존재하고, 구현예에서, 서열은 적어도 약 150개 잔기에 걸쳐 실질적으로 동일하다. 구현예에서, 서열은 암호화 영역(coding region)의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
"발현 벡터" 또는 "벡터"는 세포 내 폴리뉴클레오타이드 복제의 자가 단위(즉, 이의 자체 제어 하에 복제할 수 있는)로서 거동하거나 숙주 세포 염색체 내로 삽입하여 복제할 수 있도록 하거나, 이에 다른 폴리뉴클레오타이드 분절을 부착시켜, 부착된 분절의 복제 및/또는 발현을 유발시키는 임의의 유전 성분, 예컨대, 플라스미드, 염색체, 바이러스, 트랜스포존(transposon)이다. 적합한 벡터는 플라스미드, 트랜스포존, 박테리오파아지 및 코스미드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 벡터는 목적한 숙주 세포 내로의 벡터의 연결 또는 삽입을 수행하고 부착된 분절의 발현을 수행하는데 필수적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열은 숙주 유기체에 따라 상이하고; 이들은 전사를 수행하는 프로모터 서열, 전사를 증가시키는 인핸서 서열, 리보소옴 결합 부위 서열 및 전사 및 해독 종결 서열을 포함한다. 대안적으로, 발현 벡터는 벡터를 숙주 세포 DNA 서열 내로 연결시키거나 통합시키지 않고 내부에 암호화된 핵산 서열 생성물을 직접 발현시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 "에피좀 발현 벡터(episome expression vector)" 또는 "에피좀(episome)"이며, 이는 숙주 세포 내에서 복제할 수 있고, 적절한 선택적 압력의 존재하에서 숙주 세포 내에서 DNA의 염색체외 분절로서 지속한다(참고: 예컨대, Conese et al., Gene Therapy, 11:1735-1742 (2004)). 대표적으로 상업적으로 이용가능한 에피솜 발현 벡터는 엡슈타인 바르 핵 항원(Epstein Barr Nuclear 항원) 1(EBNA1) 및 엡슈타인 바르 바이러스(EBV) 복제 오리진(oriP)을 이용하는 에피솜 플라스미드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. Invitrogen(캘리포니아주 칼스바드 소재)으로부터의 벡터 pREP4, pCEP4, pREP7, 및 pcDNA3.1 및 Stratagene(캘리포니아주 라 졸라 소재)로부터의 pBK-CMV는 EBNA1 및 oriP 대신에 T-항원 및 SV40 복제 오리진을 사용하는 에피솜 벡터의 비-제한적 예를 나타낸다. 벡터는 또한 선택가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아데노바이러스"는 아데노바이러스 생명 주기에 관여하는 능력을 보유하고 에를 들면, 파괴(예컨대, 초음파), 변성(예컨대,열 또는 용매의 사용), 또는 교차-연결(예컨대, 포르말린 교차-연결)에 의해 물리적으로 불활성화되지 않은 아데노바이러스를 지칭한다. "아데노바이러스 생명 주기"는 (1) 바이러스 결합 및 세포 내로의 도입, (2) 아데노바이러스 게놈의 전사 및 아데노바이러스 단백질의 해독, (3) 아데노바이러스 게놈의 복제, 및 (4) 바이러스 입자 조립을 포함한다(참고: 예컨대, Fields Virology, 5th ed., Knipe et al. (eds.), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2006)). 본원에 사용된 바와 같은 용어 "아데노바이러스 벡터"는 아데노바이러스 게놈이 아데노바이러스 게놈과 관련하여 비-천연인 핵산 서열을 수용하도록 조작된 아데노바이러스를 지칭한다. 전형적으로, 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 돌연변이(예컨대, 결실, 삽입, 또는 치환)를 아데노바이러스의 아데노바이러스 게놈 내로 도입하여 예를 들면, 유전자 전달을 위해 비-천연 핵산 서열의 아데노바이러스 내로의 삽입을 수용함으로써 생성된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "선택가능한 마커 유전자"는 세포가 상응하는 선택제의 존재하에서, 이에 대하여 또는 대항하여 특이적으로 선택될 핵산 서열을 발현하도록 하는 핵산 서열을 지칭한다. 적합한 선택가능한 마커 유전자는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, 국제 특허원 공보 제WO 1992/08796호 및 제WO 1994/28143호; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981); Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984); Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962); Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980); 및 미국 특허 제5,122,464호 및 제5,770,359호에 기술되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "암호화 서열"은 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 분절을 지칭한다. 영역 또는 서열은 출발 코돈에 의해 5' 말단의 더 근처에서 및 출발 코돈과 함께 3' 말단의 더 근처에서 결합된다. 암호화 서열은 또한 개방 판독 프레임(open reading frame)으로써 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동적으로 연결된"은 분절이 이들의 의도된 방식으로 작용하도록 하는 방식으로 다른 DNA 분절에 대한 DNA 분절의 물리적 및/또는 기능적 연결을 지칭하기 위해 지칭된다. 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 서열은 이것이 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서 및/또는 사일런서(silencer)에 DNA 서열의 전사를 직접 또는 간접적으로 조절하도록 하는 방식으로 연결된 경우 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 예를 들면, DNA 서열은, 이것이 프로모터의 전사 개시 부위와 관련하여 하부(downstream)로 프로모터에 연결된 경우, 전사 개시 부위와 관련하여 정확한 판독 프레임으로 프로모터에 작동적으로 연결되어 전사 신장(전사 elongation)이 DNA 서열을 통해 진행되도록 한다. 인핸서 또는 사일런서는 이것이 DNA 서열의 전사를 각각 증가시키거나 감소시키는 방식으로 DNA 서열에 연결되는 경우 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된다. 인핸서 및 사일런서는 DNA 서열의 암호화 영역 내에 상부(upstream)에, 하부에 위치하거나 포매(embedding)될 수 있다. 신호 서열에 대한 DNA는 신호 서열이 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 프레(pre)-단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결된다. 조절 서열에 대한 DNA 서열의 연결은 전형적으로 적합한 제한 부위에서 연결에 의해 또는 당해 분야의 기술자에게 공지된 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 서열 내 삽입된 어댑터(adaptet) 또는 링커를 통해 달성된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유도하다", "유도" 및 이의 문법적 등가물은 일부 기본 수준의 전사와 관련하여 전사 조절인자에 의해 유발된 핵산 서열 전사, 프로모터 활성 및/또는 발현에 있어서의 증가를 지칭한다.
용어 "전사 조절인자"는 특정의 환경 조건(예컨대, 리프레서(repressor) 또는 핵 억제 단백질) 하에서 프로모터-유래된 DNA 서열의 전사를 예방하거나 억제하거나, 특정의 환경 조건(예컨대, 유도인자 또는 인핸서) 하에서 프로모터-유래된 DNA 서열의 전사를 허용하거나 자극하는데 작용하는 생화학적 성분을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "인핸서"는 예를 들면, 이것이 작동적으로 연결된 핵산 서열의 전사를 증가시키는 DNA 서열을 지칭한다. 인핸서는 핵산 서열의 암호화 영역으로부터 많은 킬로염기(kilobase) 떨어져서 위치할 수 있으며 조절 인자의 결합, DNA 메틸화의 패턴, 또는 DNA 구조내 변화를 매개할 수 있다. 다양한 상이한 공급원으로부터의 다수의 인핸서가 당해 분야에 잘 공지되어 있고 클로닝된 폴리뉴클레오타이드(예컨대, ATCC와 같은 기탁 기관 뿐만 아니라 다른 상업적 또는 개인 공급원으로부터의)로서 또는 내에서 이용가능하다. 프로모터(예를 들면, 일반적으로 사용된 CMV 프로모터)를 포함하는 다수의 폴리뉴클레오타이드는 또한 인핸서 서열을 포함한다. 인핸서는 암호화 서열의 상부, 내부 또는 하부에 위치할 수 있다. 용어 "Ig 인핸서"는 면역글로불린(Ig) 유전자자리(locus)(예를 들면, 인핸서는 예를 들면, 중쇄(mu) 5' 인핸서, 경쇄(카파) 5' 인핸서, 카파 및 뮤(mu) 인트론성 인핸서, 및 3' 인핸서를 포함한다) 내에 맵핑된 인핸서 영역으로부터 유래된 인핸서 성분을 지칭한다(참고: 일반적으로 Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363; 및 미국 특허 제5,885,827호).
용어 "프로모터"는 암호화 서열의 전사를 개시하는 폴리뉴클레오타이드의 영역을 지칭한다. 프로모터는 유전자의 전사 개시 부위 근처에서, 동일한 가닥 상에 및 DNA 상의 상부(센스 가닥의 5' 영역을 향해)에서 위치한다. 일부 프로모터는 이들이 세포 내 모든 환경에서 활성이므로 구성적이지만, 다른 것은 특정 자극에 대한 반응시 활성이 되도록, 예컨대, 유도성 프로모터가 되도록 조절된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터 활성" 및 이의 문법적 등가물은 이의 활성이 측정되는 프로모터에 작동적으로 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 지칭한다. 프로모터 활성은 예를 들면, 노던 블롯 분석(Northern blot analysis)에 의해 생산된 RNA 전사체의 양을 측정함으로써 직접적으로 또는 연결된 핵산 서열, 예를 들면, 프로모터에 연결된 리포터 핵산 서열에 대해 암호화된 생성물의 양을 측정함으로써 간접적으로 측정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "유도성 프로모터"는 전사 조절인자, 예컨대, 바이오틱(biotic) 또는 아바이오틱(abiotic) 인자의 존재 또는 부재에 의해 활성으로 유도된 프로모터를 지칭한다. 유도성 프로모터는 이들에게 작동적으로 연결된 유전자의 발현이 유기체의 발달의 특정 단계에서 또는 특수한 조직에서 작동(turn on)되거나 작동되지 않을(turn off) 수 있으므로 유용하다. 유도성 프로모터의 비-제한적 예는 알코올-조절된 프로모터, 테트라사이클린-조절된 프로모터, 스테로이드-조절된 프로모터, 금속-조절된 프로모터, 발병-조절된 프로모터, 온도-조절된 프로모터 및 광-조절된 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 유전자 스위치 또는 유전 스위치의 부분일 수 있다. 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 소 분자 리간드-유도성의 2개의 폴리펩타이드 엑다이손 수용체-기반 유전자 스위치일 수 있다. 일부 경우에, 국제 특허원 제WO 2001/070816호; 제WO 2002/029075호; 제WO 2002/066613호; 제WO 2002/066614호; 제WO 2002/066612호; 제WO 2002/066615호; 제WO 2003/027266호; 제WO 2003/027289호; 제WO 2005/108617호; 제WO 2009/045370호; 제WO 2009/048560호; 제WO 2010/042189호; 제WO 2010/042189호; 제WO 2011/119773호; 및 제WO 2012/122025호; 및 미국 특허 제7,091,038호; 제7,776,587호; 제7,807,417호; 제8,202,718호; 제8,105,825호; 제8,168,426호; 제7,531,326호; 제8,236,556호; 제8,598,409호; 제8,715,959호; 제7,601,508호; 제7,829,676호; 제7,919,269호; 제8,030,067호; 제7,563,879호; 제8,021,878호; 제8,497,093호; 제7,935,510호; 제8,076,454호; 제9,402,919호; 제9,493,540호; 제9,249,207호; 및 제9,492,482호에 기술된 임의의 시스템에 기술되지만, 이에 한정되지 않는 엑다이손-기반 수용체 구성성분으로부터 선택될 수 있으며, 이들 각각은 이의 전문이 참고로 포함된다.
용어 "유전자 스위치" 또는 "유전성 스위치"는 프로모터와 관련된 반응 성분, 및 예를 들면, 하나 이상의 리간드의 존재하에서 반응 성분 및 프로모터가 도입된 유전자의 발현을 조절하는 EcR 기반 시스템의 조합을 지칭한다. 강력하게 조절된 유도성 유전자 발현 시스템 또는 유전자 스위치는 다양한 적용, 예를 들면, 유전자 치료요법, 세포 내에서 단백질의 대규모 생산, 세포 기반된 고 처리량 스크리닝 검정, 기능성 유전체학 및 형질전환 식물 및 동물에서 특징(trait)의 조절에 유용하다. 이러한 유도성 유전자 발현 시스템은 리간드 유도성 이종 유전자 발현 시스템을 포함할 수 있다.
"슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty: SB) 트랜스포존 시스템(트랜스포존 시스템)"은 DNA 서열을 척추동물의 염색체 내로 도입시키기 위한 합성 DNA 트랜스포존 시스템을 지칭한다. 이러한 시스템의 일부 예시적인 구현예는 예를 들면, 미국 특허 제6,489,458호, 제8,227,432호, 제9,228,180호 및 제WO/2016/145146호에 기술되어 있다. 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템은 슬리핑 뷰티(SB) 트랜스포사제 및 SB 트랜스포존으로 구성된다. 구현예에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템은 SB11 트랜스포존 시스템, SB100X 트랜스포존 시스템, 또는 SB110 트랜스포존 시스템을 포함할 수 있다.
"트랜스포존" 또는 "수송가능한 성분(transposable element)"(TE)은 때때로 돌연변이를 생성하거나 역전시키고 세포의 게놈 크기를 변경시키는 게놈 내 이의 위치를 변화시킬 수 있는 벡터 DNA 서열이다. 전위는 흔히 TE의 중복을 생성한다. 제I 부류 TE는 2개의 단계로 카피된다: 첫째로 이들은 DNA로부터 RNA로 전사되고, 생산된 RNA는 이후 DNA로 역 전사된다. 이러한 카피된 DNA는 이후 새로운 위치에서 게놈 내로 삽입된다. 역 전사 단계는 리버스 트랜스크립타제에 의해 촉매되며, 이는 TE 자체에 의해 암호화될 수 있다. 레트로트랜스포존의 특성은 레트로바이러스, 예를 들면, HIV와 유사하다. 제II 부류 TE의 절단-및-페이스트(cut-and-paste) 전위 메카니즘은 RNA 중간체를 포함하지 않는다. 전위는 수개의 트랜스포사제 효소에 의해 촉매된다. 일부 트랜스포사제는 DNA내 임의의 표적 부위에 비-특이적으로 결합하지만, 다른 것은 특정의 DNA 서열 표적에 결합한다. 트랜스포사제는 표적 부위에서 스태거된 절단(staggered cut)을 이루어 단일-가닥 5' 또는 3' DNA 오버행(overhang)(점성 말단(sticky end))을 생성한다. 이러한 단계는 DNA 트랜스포존을 절단하며, 이는 이후에 새로운 표적 부위 내에 결합(ligating)되고; 이러한 공정은 갭(gap)을 충전시키는 DNA 폴리머라제 및 당-포스페이트 골격을 폐쇄하는 DNA 리가제의 활성을 포함한다. 이는 표적 부위의 중복을 생성한다. DNA 트랜스포존의 삽입 부위는 표적 DNA 내 스태거된 절단에 의해 생성될 수 있는 짧은 직접적인 반복체에 의해서 및 DNA 폴리머라제에 의한 충전(filing in)에 이은, 트랜스포사제에 의한 TE 절개에 중요한 일련의 역위된 반복체에 의해 확인될 수 있다. 절단-및-페이스트 TE는 공여체 부위가 이미 복제되었지만, 표적 부위가 아직 복제되지 않았을 때 세포 주기의 S 기 동안에 일어나는 경우 중복될 수 있다. 전위는 제I 및 제II 부류 TE 둘 다에서 자주적이거나 비-자주적인 것으로 분류될 수 있다. 자주적인 TE는 자체적으로 이동할 수 있지만 비-자주적인 TE는 이동하기 위한 다른 TE의 존재를 필요로 한다. 이는 흔히 비-자주적인 TE가 트랜스포사제(제II 부류의 경우) 또는 리버스 트랜스퍼라제(제I 부류의 경우) 때문이다.
"트랜스포사제"는 트랜스포존의 말단에 결합하여 절단 및 페이스트 메카니즘 또는 복제성 전위 메카니즘에 의해 게놈의 다른 부분으로 트랜스포존의 이동을 촉매하는 효소를 지칭한다.
"본원에 사용된 바와 같은 "T 세포" 또는 "T 림프구"는 세포-매개된 면역성에서 중요한 역활을 하는 림프구의 유형이다. 이들은 세포 표면의 T-세포 수용체(TCR)의 존재에 의해, B 세포 및 천연 킬러 세포(NK 세포)와 같은 다른 림프구와는 구별될 수 있다.
"T 헬퍼 세포"(TH 세포)는 면역학적 공정, 예를 들면, B 세포의 혈장 세포 및 기억 B 세포로의 성숙, 및 세포독성 T 세포 및 대식구의 활성화시 다른 백혈구 세포를 보조한다. 이러한 세포는 이들의 표면에 CD4 당단백질을 발현하므로 CD4+ T 세포로서 또한 공지되어 있다. 헬퍼 T 세포는 이들이 MHC 제II 부류 분자에 의해 펩타이드 항원과 함께 나타나는 경우 활성화되며, 이러한 분자는 항원-표시 세포(antigen-presenting cell: APC)의 표면에서 발현된다. 일단 활성화되면, 이들은 신속하게 분할되어 활성 면역 반응에서 조절하거나 보조하는 사이토킨으로 불리는 소 단백질을 분비한다. 이러한 세포는 수개의 서브형, 예를 들면, TH1, TH2, TH3, TH9, TH17, TH22 또는 TFH(T 여포성 헬퍼 세포) 중 하나로 분화될 수 있으며, 이는 상이한 사이토킨을 분비하여 상이한 유형의 면역 반응을 촉진한다. APC로부터의 신호전달(signaling)은 T 세포를 특수한 서브형으로 지시한다.
"세포독성 T 세포"(TC 세포, 또는 CTL) 또는 "세포독성 T 림프구"는 바이러스-감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하며 이식 거부에 또한 연루되어 있다. 이러한 세포는 이의 표면에 CD8 당단백질을 발현하므로 CD8+ T 세포로 공지되어 있다. 이러한 세포는 MHC 제I 부류 분자와 관련된 항원에 결합함으로써 이의 표적을 인식하며, 이는 모은 핵화된 세포(nucleated cell)의 표면에 존재한다. IL-10, 아데노신, 및 조절성 T 세포에 의해 분비된 다른 분자를 통해, CD8+ 세포는 아네르기성 상태(anergic state)로 불활성화될 수 있으며, 이는 자가면역 질환을 예방한다.
"기억 T 세포"는 감염이 해결된 후 장기간 지속하는 항원-특이적인 T 세포의 서브세트(subset)이다. 이들은 이의 동족 항원에 재-노출시 다수의 효과기 T 세포로 신속하게 확장됨으로써 과거 감염(past infection)에 대한 기억을 지닌 면역계를 제공한다. 기억 T 세포는 3개의 서브형을 포함한다: 중심 기억(central memory) T 세포(TCM 세포) 및 2개 유형의 효과기 기억 T 세포(TEM 세포 및 TEMRA 세포). 기억 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있다. 기억 T 세포는 전형적으로 세포 표면 단백질 CD45RO, CD45RA 및/또는 CCR7을 발현한다.
억제인자(suppressor) T 세포로서 앞서 공지된, "조절성 T 세포"(Treg 세포)는 면역학적 내성의 유지에 있어 역활을 담당한다. 이의 주요 역활은 면역 반응의 말기를 향해 T 세포-매개된 면역성을 정지시키고 흉선에서 음성 선택(negative selection)의 과정을 피한 자가반응성 T 세포를 억제하는 것이다.
"천연 킬러 T 세포"(NKT 세포 - 선천적 면역계의 천연 킬러 세포로 혼동되지 않아야 함)는 선천성 면역계와 함께 후천성 면역계(adaptive immune system)를 브릿지한다. 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 나타난 펩타이드 항원을 인식하는 통상의 T 세포와는 달리, NKT 세포는 CD1d로 불리는 분자에 의해 나타난 당지질 항원을 인식한다. 일단 활성화되면, 이러한 세포는 T 헬퍼(TH) 및 세포독성 T(TC) 세포 둘 다에 대해 추정된 기능(즉, 사이토킨 생산 및 세포분해/세포사멸 분자의 방출)을 수행할 수 있다. 이들은 또한 일부 종양 세포 및 헤르페스 바이러스로 감염된 세포를 인식하여 이를 제거할 수 있다.
"후천성 T 세포 전달"은 예방접종 단독 또는 환자의 천연 종양 반응에 의해 수득될 수 있는 것보다 더 많은 수의 T 세포를 달성하기 위한 종양 특이적인 T 세포의 단리 및 생체외(ex vivo) 확장을 지칭한다. 이후에, 종양 특이적인 T 세포는 이의 면역 시스템에 암을 공격하여 이를 사멸시킬 수 있는 T 세포를 통해 남아있는 종양을 제압하는 능력을 제공하기 위한 시도에서 암을 지닌 환자 내로 주입된다. 종양 침윤 림프구 또는 TIL을 배양하고, 하나의 특수한 T 세포 또는 클론을 단리하고 확장하며, 심지어 종양을 강력하게 인식하고 이를 공격하도록 가공된 T 세포를 사용하는 암 치료에 사용되는 입양 T 세포 치료요법(adoptive T cell therapy)의 많은 형태가 존재한다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체"는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 B-세포의 단일 클론에 의해 생산되어 동일한 에피토프에 결합된 항체를 지칭한다. 대조적으로, "폴리클로날 항체"는 상이한 B-세포에 의해 생산되어 동일한 항원의 에피토프에 결합하는 항체의 집단을 지칭한다. 전체 항체는 전형적으로 4개의 폴리펩타이드로 이루어진다: 중(H) 쇄 폴리펩타이드의 2개의 동일한 카피 및 경(L) 쇄 폴리펩타이드의 2개의 동일한 카피. 각각의 중쇄는 하나의 N-말단 가변(VH) 영역 및 3개의 C-말단 불변(CH1, CH2 및 CH3) 영역을 함유하며, 각각의 경쇄는 하나의 N-말단 가변(VL) 영역 및 하나의 C-말단 불변(CL) 영역을 함유한다. 경쇄 및 중쇄의 각각의 쌍의 가변 영역은 항체의 항원 결합 부위를 형성한다. VH 및 VL 영역은 유사한 일반 구조를 가지며, 각각의 영역은 4개의 골격 영역을 포함하고, 이의 서열은 비교적 보존되어 있다. 골격 영역은 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결되어 있다. CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 공지된 3개의 CDR은 항체의 "초가변 영역"을 형성하며, 이는 항원 결합에 관여한다.
"항체 유사 분자"는 예를 들면, 파트너에 선택적으로 결합할 수 있는 Ig-상과(superfamily)의 구성원인 단백질일 수 있다. MHC 분자 및 T 세포 수용체가 이러한 분자이다. 일 구현예에서, 항체-유사 분자는 TCR이다. 일 구현예에서, TCR은 변형되어 이의 MHC 결합 친화성을 증가시켜 왔다.
용어 "항체의 단편", "항체 단편", "항체의 기능성 단편", "항원-결합 부위" 또는 이의 문법적 등가물은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편 또는 부위를 의미하기 위해 본원에서 사용교환적으로 사용된다(참고: 일반적으로, Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005)). 항체 단편은 바람직하게는 예를 들면, 하나 이상의 CDR, 가변 영역(또는 이의 부위), 불변 영역(또는 이의 부위), 또는 이의 조합을 포함한다. 항체 단편의 비-제한적 예는 (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 스택 영역(stalk 영역)에서 이황화물 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) 2개의 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄로서 합성되도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 결합된 Fv 단편(즉, VL 및 VH)의 2개의 도메인으로 이루어진 1가 분자인, 단일 쇄 Fv(scFv)(참고: 예컨대, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); 및 Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)) 및 (v) 폴리펩타이드 쇄의 이량체인, 디아보디(diabody)를 포함하며, 여기서 각각의 폴리펩타이드 쇄는 동일한 폴리펩타이드 쇄 상의 VH와 VL 사이에 쌍화(pairing)를 허용함으로써, 상이한 VH-VL 폴리펩타이드 쇄 상의 상보성 도메인 사이에 쌍화를 이끌어 2개의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 이량체성 분자를 생성하기에는 너무 짧아서 불가능한 펩타이드 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 항체 단편은 당해 분야에 공지되어 있으며 예컨대, 미국 특허 제8,603,950호에 보다 상세히 기술되어 있다.
"항원 인식 모이어티(antigen recognition moiety)" 또는 "항원 인식 도메인"은 항원에 특이적으로 결합하는 분자 또는 분자의 부위를 지칭한다. 일 구현예에서, 항원 인식 모이어티는 항체, 항체 유사 분자 또는 이의 단편이고 항원은 종양 항원이다.
용어 "보존적 아미노산 치환" 또는 "보존적 돌연변이"는 하나의 아미노산의 일반적인 특징을 지닌 다른 아미노산에 의한 대체(replacement)를 지칭한다. 개개의 아미노산 사이의 일반적인 특성을 정의하기 위한 기능적인 방법은 상동성 유기체의 상응하는 단백질 사이의 아미노산 변화의 표준화된 빈도를 분석하는 것이다(Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). 이러한 분석에 따라서, 아미노산의 그룹이 정의될 수 있으며 여기서 그룹내 아미노산은 서로 잠재적으로 교환되므로, 전체 단백질 구조에 대한 이들의 영향에 있어서 서로 가장 잘 유사하다(Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., 상기 참고). 보존적 돌연변이의 예는 상기 서브-그룹 내 아미노산의 아미노산 치환, 예를 들면, 양성 전하가 유지될 수 있도록 아르기닌에 대해 라이신의 치환 및 이의 역; 음성 전하가 유지될 수 있도록 아스파르트산에 대해 글루탐산의 치환 및 이의 역; 유리-OH가 유지될 수 있도록 트레오닌에 대해 세린의 치환; 및 유리 -NH2가 유지될 수 있도록 아스파라긴에 대해 글루탐산의 치환을 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 기능성 변이체는 적어도 하나의 비-보존적 아미노산 치환을 지닌 참고 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
용어 "비-보존적 돌연변이"는 상이한 그룹 사이의 아미노산 치환, 예를 들면, 트립토판에 대해 라이신의 치환, 또는 세린에 대해 페닐알라닌의 치환 등을 포함한다. 이러한 경우에, 비-보존적 아미노산이 기능성 변이체의 생물학적 활성을 방해하거나 억제하지 않도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 비-보존적 아미노산 치환은 기능성 변이체의 생물학적 활성을 향상시켜서 기능성 변이체의 생물학적 활성은 상동성 모 단백질과 비교하여 증가되도록 할 수 있다.
용어 "안키린"은 스펙트린-액틴계 막 세포골격에 대한 내재성 막 단백질(integral membrane protein)의 부착을 매개하는 어댑터 단백질(adaptor protein)의 계열(family)을 지칭한다. 안키린은 스펙트린의 베타 소단위에 대한 결합 부위 및 적어도 12 계열의 내재성 막 단백질을 갖는다. 이러한 연결은 혈장 막의 통합성을 유지하고 혈장 막에서 특수한 이온 채널, 이온 교환체(ion exchanger) 및 이온 수송인자(ion transporter)를 고정(anchor)시키는데 요구된다. 안키린은 4개의 기능성 도메인을 함유한다: 24개의 탄뎀(tandem) 안키린 반복체를 함유하는 N-말단 도메인, 스펙트린에 결합하는 중앙 도메인, 세포자멸사에 포함된 단백질에 결합하는 사멸 도메인, 및 상이한 안키린 단백질들 사이에서 고 가변성인 C-말단 조절성 도메인. 24개의 탄뎀 안키린 반복체는 광범위한 막 단백질의 인식에 관여한다. 이러한 24개의 반복체는 반복체 1 내지 14 범위의 3개의 구조적으로 명백한 결합 부위를 함유한다. 이러한 결합 부위는 서로 준-독립적(quasi-independent)이며 함께 사용될 수 있다. 부위가 막 단백질에 결합시키는데 사용하는 상호작용은 비-특이적이며 수소 결합, 소수성 상호작용 및 정전성 상호작용으로 이루어진다. 이러한 비-특이적인 상호작용은 서열이 아미노산의 특성을 바로 보존할 필요가 없으므로 거대 범위의 단백질을 인식하는 특성을 안키린에 제공한다. 준-독립성(quasi-independence)은 결합 부위가 사용되지 않는 경우, 전체 결합에서 큰 효과를 가지지 않을 수 있음을 의미한다. 조합시 이러한 2개의 특성은 안키린이 인식할 수 있는 단백질의 큰 레퍼토리를 생성한다. 안키린은 포유동물에서 3개의 유전자(ANK1, ANK2 및 ANK3)에 의해 암호화된다. 궁극적으로 각각의 유전자는 교호적인 스플라이싱(splicing)을 통해 다수의 단백질을 생산한다.
본원에 언급된 바와 같은 용어 "증식성 질환"은 세포의 과도한 증식 및/또는 세포 매트릭스의 턴오버(turnover)가 암을 포함하는 질환의 발병에 유의적으로 기여하는 통합 개념을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "환자" 또는 "대상체"는 암과 같은 증식성 장애를 가지거나 이로 발달하는 것으로 진단되거나 예측된 포유동물 대상체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "환자"는 암과 같은 증식성 장애로 발달하는 평균 가능성보다 더 높은 포유동물 환자를 지칭한다. 예시적인 환자는 사람, 유인원, 개, 돼지, 소, 고양이, 말, 염소, 양, 설치류 및 본원에 개시된 치료요법으로부터 유리할 수 있는 다른 포유동물을 지칭한다. 예시적인 사람 환자는 남성 및/또는 여성일 수 있다. "이를 필요로 하는 환자" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 본원에서 질환 또는 장애를 지니거나 갖는 것으로 의심되는 환자로서 지칭되지만, 예를 들면, 만성 B형 간염 감염에 한정되지 않는다.
"투여하는"은 본원에서 환자 또는 대상체에게 본원에 기술된 하나 이상의 조성물을 제공하는 것으로 지칭된다. 예로써 및 제한없이, 조성물 투여, 예컨대, 주사는 정맥내(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 피내(i.d.) 주사, 복강내(i.p.) 주사, 또는 근육내(i.m.) 주사에 의해 수행될 수 있다. 하나 이상의 이러한 경로가 사용될 수 있다. 비경구 투여는 예를 들면, 거환 주사(bolus injection)에 의해서 또는 시간에 걸쳐 점진적인 관류(perfusion)에 의할 수 있다. 대안적으로, 또는 동시에, 투여는 경구 경로에 의할 수 있다. 추가로, 투여는 세포의 거환 또는 펠렛(pellet)의 외과적 침착(surgical deposition), 또는 의료 장치의 위치조정(positioning)에 의할 수 있다. 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 본원에 기술된 핵산 서열, 또는 본원에 기술된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터를, 증식성 장애를 치료하거나 예방하는데 효과적인 양으로 발현하는 가공된 세포 또는 숙주 세포를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 본원에 기술된 바와 같은 표적 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예를 들면, 중성의 완충된 염수, 인산염 완충된 염수 등; 탄수화물, 예를 들면, 글루코즈, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예를 들면, 글리신; 항산화제; 킬레이팅제(chelating agent), 예를 들면, EDTA 또는 글루타티온; 보조제(예컨대, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료", "치료하는", 또는 이의 문법적 등가물은 목적한 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 지칭한다. 구현예에서, 효과는 치료학적인데, 즉, 효과는 질환 및/도는 질환에 기여할 수 있는 부작용 증상을 부분적으로 또는 완전히 치유한다. 이러한 목적으로, 본 발명의 방법은 본 발명의 핵산 서열, 또는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 발현하는 숙주 세포를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함한다.
용어 "치료학적 유효량", "치료량", "면역학적 유효량", "항-종양 유효량", "종양 억제 유효량" 또는 이의 문법적 등가물은 목적한 치료학적 결과를 달성하는데 효과적인 양, 투여량 및 필수적인 기간을 지칭한다. 치료학적 유효량은 개체의 질환 상태, 성별, 및 체중과 같은 인자, 및 하나 이상의 대상체에서 목적한 반응을 유발하는 본원에 기술된 조성물의 능력에 따라 변할 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 정확한 양은 환자(대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 상태에서의 개개의 차이를 고려하여 주치의에 의해 결정될 수 있다.
대안적으로, 환자 또는 대상체에 대한 본원에 기술된 하나 이상의 조성물의 투여의 약리학적 및/또는 생리학적 효과는 "예방적"일 수 있는데, 즉, 이러한 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다. "예방학적으로 유효한 양"은 목적한 예방학적 결과(예컨대, 질환 발병의 예방)을 달성하는데 효과적인 양, 투여량 및 이에 필수적인 기간을 지칭한다.
HBV 분자 백신
B형 간염(HepB)은 B형 간염 바이러스(HBV)에 의해 유발된 잠재적으로 생명을 위협하는 간 감염이다. HBV는 만성 감염을 유발하고 사람들을 간경변 및 간암으로부터의 높은 사망 위험에 빠뜨린다. HBV의 진화는 유전형의 지리학적 분포에 의해 현저하게 강조된다. HBV 유전형/서브유전형은 임상적 및 바이러스학적 특성, 예를 들면, 간 질환의 중증도 및 항바이러스 치료요법에 대한 반응에 있어서의 차이와 크게 관련되어 왔다. 서열을 비교하는 경우, HBV는 8개의 유전형(A 내지 H)으로 분류되며, 각각은 명백한 지리학적 분포를 지닌다. 연구자들은 상이한 HBV 유전형과 HBV 질환의 중증도 및 결과 사이의 관련성을 연관시켜왔다.
HBV는 높은 간 향성(tropism)을 지닌 이중 가닥 DNA 바이러스이다. HBV DNA는 3.2kb의 환형의, 엔벨로프되고, 부분적으로 이중 가닥인 DNA 게놈이다(도 3a 내지 도 3d). HBV는 4개의 유전자(S, C, P, 및 X)를 갖는다. S 유전자는 작은 표면 단백질(S), 중간 표면 단백질(S + PreS2), 및 큰 표면 단백질(S + PreS2 + PreS1)로 이루어진 엔벨로프(envelope)(지질 이층) 표면 단백질(HBsAg)을 암호화한다. C 유전자는 캡시드 또는 코어 단백질을 암호화한다. C 유전자는 프레코어(precore) 및 코어 영역을 갖는다. 해독이 프레코어 영역에서 개시되는 경우, 단백질은 HBeAg이다. 해독이 코어 영역에서 개시되는 경우, 단백질은 HBcAg이다. P 유전자는 DNA 폴리머라제(Pol)를 암호화한다. X 유전자는 x 단백질(HBxAg)을 암호화한다(도 3a 내지 도 3d). HBV 게놈은 TP, SP, RT 및 RH; PreS1(108개 아미노산); PreS2(55개 아미노산); S(226개 아미노산); PreC(29개 아미노산); C(183개 아미노산); 및 HBx(154개 아미노산)을 포함하는 Pol(832개 아미노산)을 포함한다(도 3a 내지 도 3d).
급성 HBV 감염은 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 및, 코어 항원, HBcAg에 대한 면역글로불린 M(IgM) 항체의 존재에 의해 특징화된다. 감염의 초기 상 동안에, 환자는 또한 B형 간염 항원(HBeAg)에 대해 혈청양성(seropositive)이다. HBeAg는 일반적으로 고 수준의 바이러스 복제의 마커이다. HBeAg의 존재는 감염된 개인의 혈액 및 체액이 고 감염성임을 나타낸다. 만성 감염은 적어도 6개월 동안(재발하는 HBeAg의 존재 또는 부재하에) HBsAg의 지속성에 의해 특징화된다. HBsAg의 지속성은 삶의 말기에 만성 간 질환 및 간암(간세포 암종)으로 진전될 위험의 기본 마커이다.
B형 간염 바이러스는 적어도 7일 동안 신체 밖에서 생존할 수 있다. 이러한 시간 동안, 바이러스는 백신에 의해 보호되지 않는 사람의 신체 내로 들어가는 경우 여전히 감염을 유발할 수 있다. B형 간염 바이러스의 항온처리 기간은 평균 75일이지만, 30 내지 180일로 변할 수 있다. 바이러스는 감염 후 30 내지 60일 내에 검출될 수 있고 지속하여 만성 B형 간염으로 진전될 수 있다. 매우 토착화된 지역에서, B형 간염은 출생시 어머니로부터 자녀로(분만기 전파(perinatal transmission)), 또는 수평적 전파(감염된 혈액에 대한 노출)를 통해, 특히 생애의 처음 5년 동안 감염된 아동으로부터 감염되지 않은 아동으로 가장 흔히 확산된다. B형 간염은 또한 감염된 혈액 및 다양한 체액에 대한 피하 또는 점막 노출에 의해서 뿐만 아니라 타액, 생리, 질액, 및 정액을 통해 확산된다. B형 간염의 성교 전파 또한 일반적으로 발생할 수 있다. 성인에서의 감염은 5% 미만의 사례에서 만성 간염을 초래한다. 바이러스의 전파는 또한 보건 시설(health-care settings) 또는 약물을 주사하는 개인 중에서 침(needle) 및 주사기의 재사용을 통해 발생할 수 있다. 또한, 감염은 의학적, 수술적 및 치과 수술 동안에, 문신새김(tattooing)을 통해, 또는 감염된 혈액으로 오염된 면도기 및 유사한 물체의 사용을 통해 발생할 수 있다.
대부분의 사람들은 급성 감염 상 동안 임의의 증상을 겪지 않는다. 그러나, 일부 사람들은 수 주 지속하는 증상, 예를 들면, 피부 및 눈의 황변(황달), 짙은 뇨(dark urine), 극심한 피로, 오심, 구토 및 복부 통증을 지닌 급성 질병을 갖는다. 급성 간염에 걸린 사람의 작은 서브세트(subset)는 급성 간 부전으로 진전될 수 있으며, 이는 사망을 야기할 수 있다. 일부 사람들에서, B형 간염 바이러스는 또한 후에 간경변(간의 반흔화(scarring)) 또는 간암으로 진전될 수 있는 만성 간 감염을 유발할 수 있다. 감염이 만성화되는 경향성은 개인이 감염되기 시작한 나이에 의존한다. B형 간염 바이러스로 감염되기 시작한 6세 미만의 어린이는 만성 감염으로 진전될 가능성이 가장 크다. 생애 첫해 동안 감염된 영아의 80 내지 90%는 만성 감염으로 진전되고; 6세 이전에 감염된 어린이의 30 내지 50%는 만성 감염으로 진전된다. 성인에서, 성인으로 감염된 달리 건강한 개인의 5% 미만이 만성 감염으로 진전될 것이며; 만성 감염된 성인의 20 내지 30%는 간경변 및/또는 간암으로 진전될 것이다(도 1 및 도 2).
급성 B형 간염에 대한 구체적인 치료는 존재하지 않는다. 따라서, 치유법은 편안함 및 적절한 영양적 균형의 유지, 예를 들면, 구토 및 설사로부터 손실된 유체의 보충에 목표를 둔다. 만성 B형 간염 감염은 의약, 예를 들면, 경구 항바이러스제로 치료될 수 있다. 치료(예컨대, 간 이식 또는 IFN-α 뉴클레오타이드 유사체)는 간경변의 진행을 늦추고, 간암의 발병률을 감소시키며 장기간 생존을 증진시킨다. 최근 보다 발달된 치료학적 백신(즉, GS-4777, Gilead; ABX203, 아비박스(Abivax))는 임상시험 2/3기에서 실패하였다. 그러나, 대부분의 사람들에서, 치료는 B형 간염 감염을 치유하지 않지만, 바이러스의 복제를 단지 억제한다. 따라서, B형 간염 치료를 시작한 대부분의 사람들은 생애 동안 이를 지속하여야만 한다. 많은 수단이 제한된 환경에서 B형 간염의 진단 및 치료에 대해 여전히 제한된 접근이 존재한다.
추정된 2억 5700만명의 사람들은 만성 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 지닌채 살고 있다(표면 항원 검출을 통한 양성 확인). 2015년에, B형 간염 감염은 사망의 주요 원인으로서 간 부전 또는 간암으로, 887,000명의 사망을 야기하였다. 현재, HBV 백신은 사례의 95%에서 감염을 방지함으로써 B형 간염으로 인한 감염, 간암, 및 만성 질환을 예방한다. 그러나, 다수의 HBV 서브형에 대한 광범위한 포함 및 간암에 대한 기능성을 지닌 HBV 백신을 개발하는 것에 대한 큰 필요성이 여전히 존재한다. 본 개시내용은 생물정보학 방법 및 단백질 가공 접근법을 기반으로 한 신규한 HBV 백신 항원에 관한 것이다. 이러한 신규한 HBV 백신 후보물은 HBV 및 HBV-관련된 질환에 대한 치료학적 백신으로서 사용될 수 있다.
치료 선택사항
만성 B형 간염 감염에 대한 표준 치료제(standard of care: SOC)는 PEG-IFN, 및/또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다. 그러나, cccDNA 및 면역 내성 및 고갈이 지속될 수 있다(도 4). HBV에 의한 감염은 간병변, 간 부전 및 간세포 암종(HCC)을 야기할 수 있는 간염을 유발한다. HBV의 진단은 혈청학적 발견을 기반으로 한다. 실제로, 바이러스 DNA, 항원 및 이의 각각의 항체는 혈청 속에서 발견할 수 있다. HBV는 일반적인 항원성 결정인자 (a) 및 HBsAg에서 발견된 2개의 상호 배타적인 결정인자 쌍(d/y 및 w/r)을 기반으로 하여 4개의 주요 혈청형(adr, adw, ayr, ayw)으로 세분된다. 게놈의 전체 뉴클레오타이드 서열 변이에 따라 10개의 공지된 유전형(A 내지 J) 및 40개의 공지된 서브유전형(subgenotype)이 존재한다. 유전형은 명백한 기하학적 분포를 가지며 상이한 유전형은 상이한 질환 중증도, 경과 및 합병증 가능성, 및 치료 및 가능하게는 예방접종에 대한 반응과 관련되어 있다. 혈청형 및 유전형은 필수적으로 상응하지 않는다(예컨대, 유전형 D는 10개의 서브유전형(subgenotype)을 갖는다).
현재, 만성 HBV 감염에 대한 치유법은 존재하지 않는다. 치료 선택사항은 간경변의 진행 및 바이러스 복제를 늦추고, HCC 및 간 부전의 발생을 감소시키는 것에 목표를 둔다. 현재의 치료는 2개의 주요 범주로 나뉜다: (1) 면역 매개인자 약물, 즉, 바이러스 감염된 세포와 싸우도록 면역계를 증강시키기 위해 설계된 주로 제I형 인터페론(인터페론 알파 및 페길화된(pegylated) 인터페론 알파); 및 (2) 뉴클레오사이드 유사체(라미부딘, 엔테카비르 및 텔비부딘) 및 뉴클레오타이드 유사체(아데포비르, 디피복실 및 테노포비르)를 포함하고, 바이러스 복제를 방해하는 것을 목표로 하는 항바이러스 약물. HBV 감염에 대한 사망자수(death toll)는 HIV 및 결핵을 기준으로 거의 70만명/년이다. 신규 HBV 감염율이 감소하고 있지만, 간염으로부터 전체적인 사망에 있어서의 증가는 신규 치료 선택사항의 개발의 절실한 필요성을 요구한다.
치료학적 접근법
표면(S), 코어(C), 및 폴리머라제(Pol) 단백질로부터의 HBV 에피토프는 HBV에 대한 세포 면역 반응을 매개하는 감염 동안 T 세포에 의해 표적화된다. MHC-I 및 MHC-II 에피토프를 포함하는 HBV X 단백질(HBx)은 바이러스 발병 및 발암에 관여된 다기능성 조절 단백질이다. 본원에 기술된 HBV 백신 설계는 잠재적인 T 세포 에피토프를 갖는 모든 주요 구성성분을 포함한다. 구체적으로, Pol, Core, Env 및 HBx 내에 유전적 변형(점 돌연변이의 형태) 및 트렁케이션(truncation)을 지닌 2개의 상이한 독특한 설계를 포함하는 HBV 백신이 본원에 제공된다. 또한 사람 단백질 스캐폴드 상에 이식되고 HBV 감염을 제어 및 제거(clearing)시키는데 요구되는 세포 면역 반응을 자극할 수 있는 하전된 디펩타이드에 의해 연결된 독특하에 설계된 다중-에피토프 작제물(즉, 세포독성 T 림프구)가 본원에 제공된다.
HBV 감염을 치료하기 위한 다양한 유전자 치료학적 접근법이 본원에 제공된다. 예를 들면, HBV의 면역계-매개된 제어를 증진시키는데 사용된 전략 중 일부가 표 1에 기술되어 있다. 또한 HBV 치료학적 백신, 프라이밍(priming)을 위한 HBV의 주요 구성성분의 면역원성 영역(HBsAg, HBcAg, HBxAg, HBeAg 및 HB PolAg)의 조합을 포함하는 프라임/부스트(prime/boost) DNA-기반 백신의 지능적인 설계 및 부스팅을 위한 효능제 CD8 T 세포 에피토프의 조합이 본원에 제공된다.
HBV 재조합 백신을 포함하는 조성물, 키트(kit), 및 시스템 및 이의 제조 방법이 본원에 제공된다. 본 개시내용에서 HBV 재조합 백신(예컨대, HBV 설계 1 내지 5)는 HBe, HBx, LHBs, Pol, 및 HBSP의 단백질 가공(protein engineering)을 통해 가공된다. 각각의 HBV 백신 항원 설계는 생물정보학 분석 및 인 실리코(in silico) 단백질 가공 방법(예컨대, 컨센수스 서열에 보다 근접하게 매치하는 항원성 서열의 선택, 항원성 예측, 및 T 세포 에피토프 맵핑, 이는 MHC-I 결합 및 사이토킨 생산에 이은 T 세포 활성화를 초래할 수 있다)을 사용하여 발명자가 선택한 조합적 안내를 통해 실시된다. 본원에 개시된 HBV 백신 설계의 전체적인 작업흐름도는 도 5에 나타나 있으며, 실시예 1에 추가로 설명되어 있다. 본 개시내용은 다중-결실된 고릴라 아데노벡터(GC46)에서 작제된 5개의 HBV 항원 설계(HBV 설계 1 내지 5)를 제공한다.
4개의 항원 설계(HBV 설계 1 내지 4) 및 대조군 항원을 합성하여 아데노벡터 작제를 위한 발현 플라스미드-pAd셔틀(pAdShuttle) 내로 클로닝하였다(도 6). HBV 설계를 분석하여 상이한 링커가 상이한 에피토프의 예측을 유발하는지를 평가하였다. 초기 항원 스크리닝을 일시적인 형질감염, 시험관내(in vitro) 항원 가공 및 단핵구-유래된 수지 세포의 일시적인 형질감염 연구에서의 표시에서 평가하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, HBV 설계 1 및 2는 클래이드(clade) D 컨센수스를 기반으로 설계하였다. 코어(8), 표면(8), 폴리머라제(8), HBx(6) 및 HBPS(2)로부터의 32개의 HBV 펩타이드를 실험 및 기능 데이타, 예를 들면, 면역원성 데이타, 질량-스펙트럼(Mass-spec.) 등을 갖는 문헌으로부터 준비하였다(표 4). HBV 설계 3의 경우, 사람 안키린-유사 반복체(ALR) 단백질 스캐폴드(PDB 코드 1QYM) 펩타이드를 나선 및 루프 영역에서 탄뎀(tandem) 방식으로 이식하였다. 절단가능한 링커 VSQTSKLTR(서열 번호: 111)에 의해 연결된, 2개의 ALR 스캐폴드를 사용하였다. ALR 단백질은 일반적으로 고 발현 및 고 안전성을 갖는다. 따라서, ALR 단백질을 HBV 펩타이드에 대한 스캐폴드로 사용하여 신규한 CTL을 생성하였다. HBV 설계 4 에피토프는 KK 링커로 분리하였다(도 6). RNA qPCR 상대적 발현 검정을 위해, 5'- TGCCAAGAGTGACGTGTCCA-3'(서열 번호: 110)를 스플라이스 프라이머로서 사용하고, 5'-CCCAGGTCCAACTGCAGCCGG-3'(서열 번호: 128)를 스플라이스 프로브로서 사용하였다. 각각의 항원에 대해 설계된 구체적인 프라이머는 역방향 프라이머(reverse primer)로서 사용하였다(도 14).
[표 1]
Figure pct00001

전달 시스템
고릴라 아데노바이러스 셔틀 벡터(Shuttle Vector)
본 개시내용의 특정의 양태는 하나 이상의 면역 반응-유도성 HBV 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 특정의 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특수한 구현예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 일반적으로 사람에서 양성 병리학과 관련되어 있으며, 사람을 포함하는, 다양한 종으로부터 단리된 아데노바이러스의 게놈이 집중적으로 연구되었다. 아데노바이러스는 대략 36 kb의 이중 가닥 DNA를 함유하는 중간-크기(90 내지 100 nm)의, 비-엔벨로프된 정이십면체 바이러스이다. 아데노바이러스 캡시드는 바이러스에 의한 세포의 감염의 초기 단계(early stage)의 주요 상호작용을 매개하고, 아데노바이러스 생명 주기의 말기에 아데노바이러스 게놈을 패키징하는데 요구된다. 캡시드는 252개 캡소머(capsomere)를 포함하며, 이는 240개의 헥손, 12개의 펜톤 염기 단백질, 및 12개의 섬유를 포함한다(Ginsberg et al., Virology, 28: 782-83 (1966)). 헥손은 3개의 동일한 단백질, 즉, 폴리펩타이드 II를 포함한다(Roberts et al., Science, 232: 1148-51 (1986)). 펜톤 염기는 5개의 동일한 단백질을 포함하고 섬유는 3개의 동일한 단백질을 포함한다. 단백질 IIIa, VI, 및 IX는 아데노바이러스 코트(coat) 속에 존재하며 바이러스 캡시드를 안정화시키는 것으로 여겨진다(Stewart et al., Cell, 67: 145-54 (1991), 및 Stewart et al., EMBO J., 12(7): 2589-99 (1993)). pIX를 제외한, 캡시드 단백질의 발현은 아데노바이러스 폴리머라제 단백질에 의존한다. 따라서, 아데노바이러스 입자의 주요 구성성분은 폴리머라제 단백질 유전자가 존재하여 발현되는 경우에만 게놈으로부터 발현된다.
아데노바이러스의 수개의 특징은 이들을 치료학적 적용(즉, "유전자 치료요법")을 위해 세포에 유전 물질을 전달하거나, 백신 적용을 위한 항원 전달 시스템으로서 사용하기 위한 이상적인 비히클(vehicle)이 되도록 한다. 예를 들면, 아데노바이러스는 고 역가(예컨대, 약 1013개 입자 단위(pu))로 생산될 수 있으며, 유전 물질을 비-복제하는 및 복제하는 세포로 이동시킬 수 있다. 아데노바이러스 게놈은 다량의 외인성 DNA(약 8 kb 이하)를 수반하도록 조작될 수 있으며, 아데노바이러스 캡시드는 심지어 보다 긴 서열의 전달을 강화시킬 수 있다(Curiel et al., Hum. Gene Ther., 3: 147-154 (1992)). 추가로, 아데노바이러스는 일반적으로 숙주 세포 염색체 내로 통합되지 않지만, 오히려 선형 에피좀(episome)으로서 유지됨으로써 재조합 아데노바이러스가 정상의 세포 기능을 방해할 가능성을 최소화시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 아데노바이러스는 고릴라로부터 단리된다. 이스턴 고릴라(Eastern Gorilla)(고릴라 베린게이(Gorilla beringei)) 및 웨스턴 고릴라(Western Gorilla)(고릴라 고릴라(Gorilla gorilla))의 2개 종 내에 4개의 광범위하게 인식된 고릴라 아종(subspecies)이 존재한다. 웨스턴 고릴라 종은 아종 웨스턴 로우랜드 고릴라(Western Lowland Gorilla)(고릴라 고릴라 고릴라(Gorilla gorilla gorilla)) 및 크로스 리버 고릴라(Cross River Gorilla)(고릴라 고릴라 디이흘리(Gorilla gorilla diehli))를 포함한다. 이스턴 고릴라 종은 아종인 마운틴 고릴라(Mountain Gorilla)(고릴라 베린게이 베린게이(Gorilla beringei beringei)) 및 이스턴 로우랜드 고릴라(Eastern Lowland Gorilla)(고릴라 베린게이 그라우어리(Gorilla beringei graueri))를 포함한다(참고: 예컨대, Wilson and Reeder, eds., Mammalian Species of the World, 3rd ed., Johns Hopkins University Press, Baltimore, Maryland (2005)). 일부 구현예에서, 본 개시내용의 아데노바이러스는 마운틴 고릴라(고릴라 베린게이 베린게이(Gorilla beringei beringei))로부터 단리된다.
다양한 고릴라 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 국제 특허원 공보 제WO 2013/052832호; 제WO 2013/052811호; 및 제WO 2013 052799호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 본원에 이의 전문이 참고로 포함된다.
이러한 수개의 아데노바이러스의 게놈은 분석되었으며, 아데노바이러스는 예를 들면, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 또는 서열 번호: 25의 핵산 서열을 가질 수 있으며, 이들 각각은 아데노바이러스를 유일하게 정의하기 위해 제공되는 다수의 서브-서열, 즉, 서열 번호: 1 내지 10의 핵산 서열, 및 서열 번호: 11 내지 20의 아미노산 서열을 포함한다. 서열 번호: 6 내지 서열 번호: 10은 서열 번호: 16 내지 20 각각의 아미노산 서열을 암호화한다. 서열 번호: 1 내지 5는 서열 번호: 6 내지 10 각각의 핵산 서열의 서브세트이다. 서열 번호: 11 내지 15는 서열 번호: 16 내지 20 각각의 아미노산 서열의 서브세트이다.
아데노바이러스는 아데노바이러스 벡터, 예컨대, 유전자 전달 비히클로서 사용될 이미 공지된 아데노바이러스와 동일한 방식으로 변형될 수 있다. 아데노바이러스 및 아데노바이러스 벡터는 복제-가능(replication-competent)하거나, 조건적으로 복제-가능하거나, 복제-결함성(replication-deficient)일 수 있다.
복제-가능한(replication-competent) 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 대표적인 숙주 세포, 즉, 아데노바이러스에 의해 전형적으로 감염될 수 있는 세포 내에서 복제할 수 있다. 복제-가능한 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 숙주 세포 내에서 바이러스 복제를 억제하지 않는 아데노바이러스 게놈 내에서 야생형 아데노바이러스와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(예컨대, 하나 이상의 결실, 삽입, 및/또는 치환)을 가질 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 E3 영역으로서 공지된 아데노바이러스 초기 영역(early region)의 부분적인 또는 전체의 결실을 가질 수 있으며, 이는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 게놈의 증식에 필수적이지는 않다.
조건적으로 복제하는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 예정된 조건 하에서 복제하도록 가공된 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터이다. 예를 들면, 복제-필수적인 유전자 기능, 예컨대, 아네노바이러스 초기 영역에 의해 암호화된 유전자 기능은 유도성의, 억제할 수 있거나(repressible), 조직-특이적인 전사 제어 서열, 예컨대, 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 구현예에서, 복제는 전사 제어 서열과 상호작용하는 특이적인 인자의 존재 또는 부재를 필요로 한다. 조건적으로-복제하는 아데노바이러스 벡터는 미국 특허 제5,998,205호에 추가로 기술되어 있다.
복제-결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 예를 들면, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 대표적인 숙주 세포, 특히 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에 의해 감염될 사람내의 대표적인 숙주 세포에서 복제하지 않도록, 하나 이상의 복제-필수 유전자 기능 또는 영역내 결함의 결과로서, 복제에 요구되는 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 유전자 기능 또는 영역의 보충을 필요로 하는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터이다.
본원에 기술된 바와 같은, 유전자 기능 또는 게놈 영역에서의 결함은 이의 핵산 서열이 전체적으로 또는 부분적으로 파열된(예컨대, 결실된) 유전자의 기능을 없애거나 손상시키기 위한(예컨대, 유전자 생성물의 기능을 적어도 약 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 또는 50배까지 감소시키기 위한) 아데노바이러스 게놈의 충분한 유전 물질의 파괴(예컨대, 결실)로서 정의된다. 전체 유전자 영역의 결실은 흔히 복제-필수적인 유전자 기능의 파괴에 요구되지 않는다. 그러나, 하나 이상의 이식유전자(transgene)에 대해 아데노바이러스 게놈 내에 충분한 공간을 제공할 목적으로, 하나 이상의 유전자 영역 대부분을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 유전 물질의 결실이 바람직하지만, 첨가 또는 치환에 의한 유전 물질의 돌연변이가 또한 유전자 기능을 파괴하기 위해 적절하다. 복제-필수 유전자 기능은 아데노바이러스 복제(예컨대, 증식)에 요구되는 유전자 기능이며 예를 들면, 아데노바이러스 초기 영역(예컨대, E1, E2, 및 E4 영역), 후기 영역(예컨대, L1, L2, L3, L4, 및 L5 영역), 바이러스 패키징에 관련된 유전자(예컨대, IVa2 유전자), 및 바이러스-관련된 RNA(예컨대, VA-RNA-1 및/또는 VA-RNA-2)에 의해 암호화된다.
아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 복제-가능하거나 복제-결함성인지 여부에 따라, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 적어도 일부를 보유한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 단백질 암호화 및 비-단백질 암호화 영역을 포함하는, 아데노바이러스 게놈의 임의의 부위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 예를 들면, 초기 영역 유전자(즉, E1A, E1B, E2A, E2B, E3, 및/또는 E4 영역) 중 어느 하나에 의해 암호화된 단백질, 또는 바이러스 구조 단백질을 암호화하는, 후기 영역 유전자(즉, L1, L2, L3, L4, 및 L5 영역) 중 어느 하나에 의해 암호화된 단백질과 같은, 임의의 적합한 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 바람직하게는 pIX 단백질, DNA 폴리머라제 단백질, 펜톤(penton) 단백질, 헥손(hexon) 단백질, 및/또는 섬유 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 단백질의 전장 아미노산 서열을 암호화하는 전장 핵산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 단백질의 전장 아미노산 서열 중 일부를 암호화하는 전장 핵산 서열 중 일부를 포함할 수 있다.
핵산 서열의 "일부"는 적어도 10개의 뉴클레오타이드(예컨대, 약 10 내지 약 5000개의 뉴클레오타이드)를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 서열의 "일부"는 10개 이상(예컨대, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상)의 뉴클레오타이드, 그러나 5,000개 미만(예컨대, 4900개 이하, 4000개 이하, 3000개 이하, 2000개 이하, 1000개 이하, 800개 이하, 500개 이하, 300개 이하, 또는 100개 이하)의 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 서열의 일부는 약 10 내지 약 3500개의 뉴클레오타이드(예컨대, 약 10, 20, 30, 50, 100, 300, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 2500, 또는 3000개의 뉴클레오타이드), 약 10 내지 약 1000개의 뉴클레오타이드(예컨대, 약 25, 55, 125, 325, 525, 725, 또는 925개의 뉴클레오타이드), 또는 약 10 내지 약 500개의 뉴클레오타이드(예컨대, 약 15, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 150, 175, 250, 275, 350, 375, 450, 475, 480, 490, 495, 또는 499개의 뉴클레오타이드), 또는 앞서의 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위이다. 보다 바람직하게는, 핵산 서열의 "일부"는 약 3200개 이하의 뉴클레오타이드(예컨대, 약 10 내지 약 3200개의 뉴클레오타이드, 약 10 내지 약 3000개의 뉴클레오타이드, 또는 약 30 내지 약 500개의 뉴클레오타이드, 또는 앞서의 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)를 포함한다.
아미노산 서열의 "일부"는 적어도 3개의 아미노산(예컨대, 약 3 내지 약 1,200개의 아미노산)을 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 서열의 "부위"는 3개 이상(예컨대, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 또는 50개 이상)의 아미노산, 그러나 1,200개 미만(예컨대, 1,000개 이하, 800개 이하, 700개 이하, 600개 이하, 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 또는 100개 이하)의 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 서열의 부위는 약 3 내지 약 500개의 아미노산(예컨대, 약 10, 100, 200, 300, 400, 또는 500개의 아미노산), 약 3 내지 약 300개의 아미노산(예컨대, 약 20, 50, 75, 95, 150, 175, 또는 200개의 아미노산), 또는 약 3 내지 약 100개의 아미노산(예컨대, 약 15, 25, 35, 40, 45, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 또는 99개의 아미노산), 또는 앞서의 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위이다. 보다 바람직하게는, 아미노산 서열의 "부위"는 약 500개 이하의 아미노산(예컨대, 약 3 내지 약 400개의 아미노산, 약 10 내지 약 250개의 아미노산, 또는 약 50 내지 약 100개의 아미노산, 또는 앞서의 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)를 포함한다.
아데노바이러스 pIX 단백질은 아데노바이러스 캡시드 속에 존재하며, 헥손 나노머 상호작용을 강화시키는 것으로 밝혀졌으며, 전장 게놈의 패키징에 필수적이다(참고: 예컨대, Boulanger et al., J. Gen. Virol., 44: 783-800 (1979); Horwitz M.S., "Adenoviridae and their replication" in Virology, 2 nd ed., B.N. Fields et al. (eds.), Raven Press, Ltd., New York, pp. 1679-1721 (1990), Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6: 1733-1739 (1987), 및 van Oostrum et al, J. Virol., 56: 439-448 (1985)). 아데노바이러스 구조에 대한 이의 기여 이외에, pIX는 또한 전사 특성, 예를 들면, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(MLP) 활성의 자극을 나타내는 것으로 밝혀졌다(참고: 예컨대, Lutz et al., J. Virol., 71(7): 5102-5109 (1997)). 아데노바이러스 pIX 단백질 중 모두 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들면, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 1을 포함한다. 전장 pIX 단백질 또는 이의 일부를 포함하는 아미노산 서열은 예를 들면, 서열 번호: 16 및 서열 번호: 11을 포함한다.
아데노바이러스 DNA 폴리머라제 단백질은 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 둘 다에서 바이러스 DNA 복제에 필수적이다. 폴리머라제는 말단 단백질의 전구체(pTP)와의 복합체로 동시-정제(co-purifying)하며, 이는 아데노바이러스 DNA의 5' 말단에 공유결합으로 부착된다(Field et al., J. Biol. Chem., 259: 9487-9495 (1984)). 아데노바이러스 DNA 폴리머라제 및 pTP는 E2 영역에 의해 암호화된다. 폴리머라제 단백질은 pIX를 제외한 모든 구조 단백질의 발현에 요구된다. 폴리머라제 단백질에 대한 유전자 서열없이는, 폴리머라제 단백질이 생산되지 않는다. 결과적으로, 바이러스 게놈은 복제되지 않으며, 주요 후기 프로모터는 활성화되지 않고, 캡시드 단백질은 발현되지 않는다. 아데노바이러스 DNA 폴리머라제 단백질 모두 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들면, 서열 번호: 7 및 서열 번호: 2를 포함한다. 전장 아데노바이러스 DNA 폴리머라제, 또는 이의 부위를 포함하는 아미노산 서열은 예를 들면, 서열 번호: 17 및 서열 번호: 12를 포함한다.
아데노바이러스 헥손 단백질은 아데노바이러스 캡시드에서 가장 크고 가장 풍부한 단백질이다. 헥손 단백질은 바이러스 캡시드 조립, 캡시드의 정이십면체 대칭의 측정(이는 결과적으로 캡시드 용적 및 DNA 패키징 크기에서 한계를 정의한다), 및 캡시드의 통합성에 필수적이다. 또한, 헥손은 아데노바이러스 벡터의 중화를 감소시키기 위한 변형을 위한 주요 표적이다(참고: 예컨대, Gall et al., J. Virol., 72: 10260-264 (1998), 및 Rux et al., J. Virol., 77(17): 9553-9566 (2003)). 헥손 단백질의 주요 구조적 특징은 혈청형에 걸쳐서 아데노바이러스에 의해 공유되지만, 헥손 단백질은 크기 및 혈청형 사이에서의 면역학적 특성이 상이하다(Jornvall et al., J. Biol. Chem., 256(12): 6181-6186 (1981)). 15개의 아데노바이러스 헥손 단백질의 비교는 헥손의 우세한 항원성 및 혈청형-특이적인 영역이 이의 내부에 길이가 다양한 7개의 별개의 초가변성 영역(HVR1 내지 HVR7) 및 아데노바이러스 혈청형 사이의 서열인 루프 1 및 2(즉, LI 또는 l1, 및 LII 또는 l2 각각) 내에 존재하는 것으로 여겨짐을 나타내었다(Crawford-Miksza et al., J. Virol., 70(3): 1836-1844 (1996)). 아데노바이러스 헥손 단백질 모두 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들면, 서열 번호: 9 및 서열 번호: 4를 포함한다. 전장 아데노바이러스 헥손 단백질, 또는 이의 일부를 포함하는 아미노산 서열은 예를 들면, 서열 번호: 19 및 서열 번호: 14를 포함한다.
아데노바이러스 섬유 단백질은 3개의 도메인: 테일(tail), 샤프트(shaft), 및 놉(knob)을 갖는 아데노바이러스 폴리펩타이드 IV의 동종삼량체(homotrimer)이다(Devaux et al., J. Molec. Biol., 215: 567-88 (1990), Yeh et al., Virus Res., 33: 179-98 (1991)). 섬유 단백질은 놉 및 샤프트 도메인을 통해 세포 표면 상의 수용체에 대한 주요 바이러스 결합을 매개한다(Henry et al., J. Virol., 68(8): 5239-46 (1994)). 삼량체화를 위한 아미노산 서열은 놉에 위치하며, 이는 펜톤 염기와 적절히 회합하기 위해 섬유의 아미노 말단(테일)에 필수적인 것으로 여겨진다(Novelli et al., Virology, 185: 365-76 (1991)). 세포 수용체를 인식하고 펜톤 염기에 결합하는 것 외에, 섬유는 혈청형 동일성(serotype identity)에 기여한다. 상이한 아데노바이러스 혈청형으로부터의 섬유 단백질은 현저히 상이하다(참고: 예컨대, Green et al., EMBO J., 2: 1357-65 (1983), Chroboczek et al., Virology, 186: 280-85 (1992), 및 Signas et al., J. Virol., 53: 672-78 (1985)). 따라서, 섬유 단백질은 아데노바이러스의 생명 주기에 대해 중요한 다수 기능을 갖는다. 아데노바이러스 섬유 단백질 중 모두 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들면, 서열 번호: 10 및 서열 번호: 5를 포함한다. 전장 아데노바이러스 섬유 단백질, 또는 이의 일부를 포함하는 아미노산 서열은 예를 들면, 서열 번호: 20 및 서열 번호: 15를 포함한다.
아데노바이러스 펜톤 염기 단백질은 정이십면체 캡시드의 꼭지점에 위치하며 5개의 동일한 단량체를 포함한다. 펜톤 염기 단백질은 정이십면체 캡시드의 다수 측면 상에 헥손 단백질을 브릿징하기 위한 구조를 제공하며, 섬유 단백질이 캡시드 내에 혼입되도록 할 필수 접점(interface)를 제공한다. 펜톤 염기의 각각의 단량체는 RGD 트리펩타이드 모티프(motif)를 함유한다(Neumann et al., Gene, 69: 153-157 (1988)). RGD 트리펩타이드는 αv 인테그린에 대한 결합을 매개하며, 펜톤 염기의 RGD 서열 내 점 돌연변이를 갖는 아데노바이러스는 세포를 감염시키는 이의 능력에 있어서 제한된다(Bai et al., J. Virol., 67: 5198-5205 (1993)). 따라서, 펜톤 염기 단백질은 캡시드의 구조 및 바이러스-세포 상호작용의 최대 효율에 필수적이다. 아데노바이러스 펜톤 염기 단백질 중 모두 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들면, 서열 번호: 8 및 서열 번호: 3을 포함한다. 전장 아데노바이러스 펜톤 염기 단백질, 또는 이의 일부를 포함하는 아미노산 서열은 예를 들면, 서열 번호: 18 및 서열 번호: 13을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 핵산 또는 아미노산 서열 "동일성"은 목적한 핵산 또는 아미노산 서열을 참고 핵산 또는 아미노산 서열과 비교함으로써 측정할 수 있다. 목적 서열에서 생성하기 위하여 참고 서열 내에서 변화되고/되거나 변형된(예컨대, 점 돌연변이, 삽입, 또는 결실과 같은) 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 수를 계수한다. 이러한 변화의 전체 수를 목적한 서열의 총 길이로부터 감하고, 차이를 목적한 서열의 길이로 나누고 퍼센트로서 나타낸다. 2개 이상의 서열 사이에 최적의 정렬을 수득하고 동일성을 계산하기 위한 다수의 수학적 알고리즘이 공지되어 있으며 다수의 이용가능한 소프트웨어 프로그램 내에 포함되어 있다. 이러한 프로그램의 예는 CLUSTAL-W, T-Coffee, 및 ALIGN(핵산 및 아미노산 서열의 정렬을 위해), BLAST 프로그램(예컨대, BLAST 2.1, BL2SEQ, 및 이의 이후의 버젼) 및 FASTA 프로그램(예컨대, FASTA3x, FASTM, 및 SSEARCH)(서열 정렬 및 서열 유사성 조사를 위해)을 포함한다. 서열 정렬 알고리즘은 예를 들면, 문헌: Altschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin et al., eds., Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005), Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997), 및 Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997))에 개시되어 있다.
아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 단독 또는 임의의 조합의 전술한 서열 중 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 모두를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 전술한 서열 중 임의의 2개의 조합, 전술한 서열 중 임의의 3개의 임의의 조합, 전술한 서열의 임의의 4개의 임의의 조합, 또는 전술한 서열의 5개 모두를 포함할 수 있다.
본원에 논의된 바와 같이, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제-가능하거나, 조건적으로-복제하거나, 복제-결함성일 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제-결함성이어서, 복제-결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 증식을 위한(예컨대, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성시키기 위한) 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 영역의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능의 보충을 필요로 한다.
복제-결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 증식을 위한 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 영역 내에서 하나 이상의 복제-필수 유전자 기능에서 결함을 유발하기 위한 임의의 적합한 방식으로 변형될 수 있다. 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 영역의 하나 이상의 복제-필수 유전자 기능에서의 결함의 보충은 결함성 복제-필수 유전자 기능을 제공하기 위한 외인성 수단의 사용을 지칭한다. 이러한 보충은 예를 들면, 파괴된 복제-필수 유전자 기능을 암호화하는 세포 및/또는 외인성 DNA(예컨대, 헬퍼 아데노바이러스)를 사용함으로써 임의의 적합한 방식으로 시행할 수 있다.
아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 초기 영역(즉, E1-E4 영역) 단독, 아데노바이러스 게놈의 후기 영역(즉, L1-L5 영역) 단독, 아데노바이러스 게놈의 초기 및 후기 영역 둘 다, 또는 모든 아데노바이러스 유전자(즉, 고 능력 아데노벡터(HC-Ad)의 하나 이상의 복제-필수 유전자 기능에서 결함성일 수 있다. 문헌: Morsy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 965-976 (1998); Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 1645-1650 (1997); 및 Kochanek et al., Hum. Gene Ther., 10: 2451-2459 (1999)를 참고한다. 복제-결함성 아데노바이러스 벡터의 예는 미국 특허 제5,837,511호; 제5,851,806호; 제5,994,106호; 제6,127,175호; 제6,482,616호; 및 제7,195,896호, 및 국제 특허원 공보 제WO 1994/028152호, 제WO 1995/002697호, 제WO 1995/016772호, 제WO 1995/034671호, 제WO 1996/022378호, 제WO 1997/012986호, 제WO 1997/021826호, 및 제WO 2003/022311호에 개시되어 있다.
아데노바이러스 게놈의 초기 영역은 E1, E2, E3, 및 E4 영역을 포함한다. E1 영역은 E1A 및 E1B 서브영역(subregion)을 포함하고, E1 영역내 복제-필수 유전자 기능에서 하나 이상의 결함은 E1A 및 E1B 서브 영역 중 어느 하나 또는 둘 다에서 복제-필수 유전자 기능에서의 하나 이상의 결함을 포함함으로써 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 증식하기 위한(예컨대, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성시키기 위한) 아데노바이러스 게놈의 E1A 서브 영역 및/또는 E1B 서브영역의 보충을 필요로 한다. E2 영역은 E2A 및 E2B 서브영역을 포함하고, E2 영역내 복제-필수 유전자 기능에서의 하나 이상의 결함은 E2A 서브영역 및/또는 E2B 서브 영역 중 어느 하나 또는 둘 다에서 복제-필수 유전자 기능에서의 하나 이상의 결함을 포함함으로써, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 증식하기 위한(예컨대, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위한) 아데노바이러스 게놈의 E2A 서브 영역 및/또는 E2B 서브 영역의 보충을 필요로 한다.
E3 영역은 어떠한 복제-필수 유전자 기능도 포함하지 않음으로써, 부분적으로 또는 전체적으로 E3 영역의 결실은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 증식하기 위한(예컨대, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위한) E3 영역내 임의의 유전자 기능을 필요로 하지 않는다. 본 개시내용의 맥락에서, E3 영역은 사람 아데노바이러스 5 (NCBI 참고 서열 AP_000218)의 E3 영역으로부터의 12.5K 단백질에 대해 높은 상동성을 지닌 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임(open reading frame)으로 개시하고 사람 아데노바이러스 5(NCBI 참고 서열 AP_000224.1)의 E3 영역으로부터 14.7K 단백질에 대해 높은 상동성을 지닌 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임에서 끝나는 영역으로 정의된다. E3 영역은 전체적으로 또는 부분적으로 결실될 수 있거나 전체적으로 또는 부분적으로 보유될 수 있다. 결실의 크기는 이의 게놈이 최적의 게놈 패키징 크기와 근접하게 매칭되는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 보유하도록 조절될 수 있다. 보다 큰 결실은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 게놈 내에 보다 큰 이종 핵산 서열의 삽입을 수용할 것이다. 본 개시내용의 일 구현예에서, E3 영역내 잔류하는, L4 폴리아데닐화 신호 서열이 보유된다.
E4 영역은 다수의 개방 판독 프레임(ORF)을 포함한다. ORF6, 및 일부 경우에 ORF3를 제외하고는 E4 영역의 모든 개방 판독 프레임이 결실된 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 증식하기 위한(예컨대, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위한) E4 영역내에 임의의 유전자 기능의 보충을 필요로 하지 않는다. 역으로, E4 영역의 ORF6, 및 일부 경우에 ORF3의 파괴 또는 결실을 지니고(예컨대, E4 영역의 ORF6 및/또는 ORF3를 기반으로 복제-필수 유전자 기능에서 결함성을 지닌) E4 영역의 임의의 다른 개방 판독 프레임 또는 천연의 E4 프로모터, 폴리아데닐화 서열, 및/또는 우측 역위된 말단 반복체(inverted terminal repeat: ITR)의 파괴 또는 결실이 존재하거나 부재하는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 증식하기 위한(예컨대, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위한) E4 영역(구체적으로, E4 영역의 ORF6 및/또는 ORF3)의 보충을 필요로 한다. 아데노바이러스 게놈의 후기 영역은 L1, L2, L3, L4, 및 L5 영역을 포함한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 또한 국제 특허원 공보 제WO 2000/000628호에 논의된 바와 같은, 주요 후기 프로모터(MLP) 내에 돌연변이를 가질 수 있으며, 이는 필요한 경우 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터 복제-결함성이 되도록 할 수 있다.
복제-필수 유전자 기능에서 하나 이상의 결함을 함유하는 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 영역은 바람직하게는 임의로 E3 영역 중 일부 또는 전체에 결실을 지닌, 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 초기 영역, 즉, E1, E2, 및/또는 E4 영역이다.
복제-결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 또한 숙주 세포 내에서 바이러스 복제를 억제하지 않는 아데노바이러스 게놈 내에 야생형 아데노바이러스와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(예컨대, 하나 이상의 결실, 삽입, 및/또는 치환)을 가질 수 있다. 따라서, 복제-필수 유전자 기능에서 하나 이상의 결함 외에, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제-필수적이 아닌 다른 관점에서 결함성일 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 E3 영역으로서 공지된 아데노바이러스 초기 영역의 부분적인 또는 전체적인 결실을 가질 수 있으며, 이는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 게놈의 증식에 필수적이지 않다.
일 구현예에서, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제-결함성이며, 증식을 위해(예컨대, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성시키기 위해) 아데노바이러스 게놈의 E1 영역 또는 E4 영역의 보충을 최대한 필요로 한다. 따라서, 복제-결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 증식을 위한(예컨대, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위한) 아데노바이러스 게놈의 E1A 서브영역 및/또는 E1B 영역(E1-결함성 아데노바이러스 벡터로 나타냄) 또는 E4 영역(E4-결함성 아데노바이러스 벡터로 나타냄)의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능의 보충을 필요로 한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능(바람직하게는 모든 복제-필수 유전자 기능) 및 아데노바이러스 게놈의 비필수 E3 영역의 적어도 하나의 유전자 기능에서 결함성일 수 있다(E1/E3-결함성 아데노바이러스 벡터로 나타냄). 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E4 영역의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능(바람직하게는 모든 복제-필수 유전자 기능) 및 아데노바이러스 게놈의 비필수 E3 영역의 적어도 하나의 유전자 기능에서 결함성일 수 있다(E3/E4-결함성 아데노바이러스 벡터로 나타냄).
일 구현예에서, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제-결함성이며 증식을 위해(예컨대, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성시키기 위해) 아데노바이러스 게놈의 E2 영역, 바람직하게는 E2A 서브 영역의 보충을 최대한 필요로 한다. 따라서, 복제-결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 증식을 위한(예컨대, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위한) 아데노바이러스 게놈의 E2A 서브영역(E2A-결함성 아데노바이러스 벡터)의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능의 보충을 필요로 한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E2A 영역의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능(바람직하게는 모든 복제-필수 유전자 기능) 및 아데노바이러스 게놈의 비필수 E3 영역의 적어도 하나의 유전자 기능에서 결함성일 수 있다(E2A/E3-결함성 아데노바이러스 벡터로 나타냄).
일 구현예에서, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제-결함성이며 증식을 위해(예컨대, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성시키기 위해) 아데노바이러스 게놈의 E1 및 E4 영역의 보충을 최대한 필요로 한다. 따라서, 복제-결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 증식을 위한(예컨대, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위한) 아데노바이러스 게놈의 E1 및 E4 영역(E1/E4-결함성 아데노바이러스 벡터로 나타냄) 둘 다의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능의 보충을 필요로 한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능(바람직하게는 모든 복제-필수 유전자 기능), 아데노바이러스 게놈의 E4 영역의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능, 및 아데노바이러스 게놈의 비필수 E3 영역의 적어도 하나의 유전자 기능에서 결함성일 수 있다(E1/E3/E4-결합성 아데노바이러스 벡터로 나타냄). 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 바람직하게는 증식을 위해 아데노바이러스 게놈의 E1 영역의 보충을 최대한 필요로 하며, 증식을 위해 아데노바이러스 게놈의 임의의 다른 결함의 보충을 필요로 하지 않는다. 보다 바람직하게는, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 증식을 위한 아데노바이러스 게놈의 E1 및 E4 영역의 보충을 최대한 필요로 하며, 증식을 위한 아데노바이러스 게놈의 임의의 다른 결함의 보충을 필요로 하지 않는다.
아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는, 아데노바이러스 게놈의 다수의 복제-필수 기능에서 결함성인 경우(예컨대, E1/E4-결함성 아데노바이러스 벡터), 단일의 복제-필수 유전자 기능에서 결함성인 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터(예컨대, E1-결함성 아데노바이러스 벡터)에 의해 달성된 것과 유사한 보충 세포주 내에서 바이러스 성장을 제공하기 위해 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 목적한 길이의 임의의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열들, 예를 들면, 길이가 적어도 약 15개 염기쌍인 서열(예컨대, 약 15개 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개 뉴클레오타이드), 바람직하게는 약 100개 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 약 500개 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개 뉴클레오타이드, 심지어 보다 바람직하게는 약 1,500개 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개 뉴클레오타이드, 및 가장 바람직하게는 약 2,000개 내지 약 3,000개 뉴클레오타이드, 또는 앞서의 값들 중 임의의 2개로 정의된 범위를 함유할 수 있다. 스페이서 서열은 암호화 또는 비-암호화일 수 있고 아데노바이러스 게놈과 관련하여 천연적이거나 비-천연적일 수 있지만, 결함성 영역에 대해 복제-필수 기능을 회복하지 않는다. 스페이서는 또한 발현 카세트(expression cassette)를 함유할 수 있다. 보다 바람직하게는, 스페이서는 폴리아데닐화 서열 및/또는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터와 관련하여 비-천연적인 유전자를 포함한다. 아데노바이러스 벡터 내에서 스페이서의 사용은 예를 들면, 미국 특허 제5,851,806호 및 국제 특허원 공보 제WO 1997/021826호에 추가로 기술되어 있다.
아데노바이러스 게놈 모두 또는 일부, 예를 들면, 아데노바이러스 게놈의 E1, E3, 및 E4 영역을 제거함으로써, 수득되는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 캡시드 내로 패키지되는 능력을 보유하면서 외인성 핵산 서열의 삽입을 허용할 수 있다. 외인성 핵산 서열은 위치내 삽입이 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터 입자의 형성을 허용하는 한 아데노바이러스 게놈 내 임의의 위치에 삽입될 수 있다. 외인성 핵산 서열은 바람직하게는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역, E3 영역, 또는 E4 영역 내에 위치한다.
본 개시내용의 복제-결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제-결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터 내에 존재하지 않는 유전자 기능을 제공하는 세포 주를 보충하는데 있어서 생산될 수 있지만, 고 역가의 바이러스 벡터 스톡(stock)을 생성하기 위하여 적절한 수준에서, 바이러스 증식에 필요할 수 있다. 이러한 보충 세포주는 공지되어 있으며 293개 세포(예컨대, Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59-72 (1977)에 기술됨), PER.C6 세포(예컨대, 국제 특허원 공보 제WO 1997/000326호, 및 미국 특허 제5,994,128호 및 제6,033,908호), 및 293-ORF6 세포(예컨대, 국제 특허원 공보 제WO 95/34671호 및 Brough et al., J. Virol., 71: 9206-9213 (1997)에 기술됨)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 개시내용의 복제-결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 생산하기 위한 다른 적합한 보충 세포주는 이의 발현이 숙주 세포 내에서 바이러스 성장을 억제하는 이식유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터를 증식시키기 위해 생성된 보충 세포를 포함한다(참고: 예컨대, 미국 특허원 공보 제2008/0233650호). 추가의 적합한 보충 세포는 예를 들면, 미국 특허 제6,677,156호 및 제6,682,929호, 및 국제 특허원 공보 제WO 2003/020879호에 기술되어 있다. 일부 예에서, 세포 게놈은 이의 유전 생성물이 복제-결함성 아데노바이러스 벡터의 결함 모두에 대해 보충하는, 핵산 서열을 포함할 필요는 없다. 복제-결함성 아데노바이러스 벡터 내에 결여하는 하나 이상의 복제-필수 유전자 기능은 헬퍼 바이러스, 예컨대, 복제-결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 복제에 필요한 하나 이상의 필수 유전자 기능을 인 트랜스(in trans)로 보충하는 아데노바이러스 벡터에 의해 공급될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 본 발명의 복제-결함성 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에서 결여하는 하나 이상의 복제-필수 유전자 기능을 보충하는 비-천연 복제-필수 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들면, E1/E4-결함성 아데노바이러스 벡터는 상이한 아데노바이러스(예컨대, 본 발명의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터보다는 상이한 혈청형의 아데노바이러스, 또는 본 발명의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터보다는 상이한 종의 아데노바이러스)로부터 수득되거나 유래된 E4 ORF 6을 암호화하는 핵산 서열을 함유하도록 가공될 수 있다.
아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 이식유전자를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "이식유전자"는 본원에서 적절한 조절 성분(예컨대, 프로모터)에 작동적으로 연결됨으로써, 비-천연 핵산 서열이 발현되어 단백질(예컨대, 펩타이드 또는 폴리펩타이드)를 생산하도록 하는 비-천연 핵산 서열로서 본원에 정의된다. 조절 성분(예컨대, 프로모터)은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에 대해 천연적이거나 비-천연적일 수 있다.
"비-천연" 핵산 서열은 천연적으로 발생하는 위치에서 아데노바이러스의 천연적으로 발생하는 핵산 서열이 아닌 임의의 핵산 서열(예컨대, DNA, RNA, 또는 cDNA 서열)이다. 따라서, 비-천연 핵산 서열은 아데노바이러스 내에서 천연적으로 발견될 수 있지만, 아데노바이러스 게놈 내 비-천연 위치에 위치하고/하거나 비-천연 프로모터에 작동적으로 연결된다. 용어 "비-천연 핵산 서열", "이종 핵산 서열", 및 "외인성 핵산 서열"은 본 개시내용의 맥락에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 비-천연 핵산 서열은 바람직하게는 DNA이고 바람직하게는 단백질(즉, 하나 이상의 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열)을 암호화한다.
비-천연 핵산 서열은 질환에 대해 포유동물을 예방학적으로 또는 치료학적으로 치료하는데 사용될 수 있는 치료학적 단백질을 암호화할 수 있다. 적합한 치료학적 단백질의 예는 사이토킨, 독소, 종양 억제인자 단백질, 성장 인자, 호르몬, 수용체, 미토겐(mitogen), 면역글로불린, 신경펩타이드, 신경전달인자, 및 효소를 포함한다. 대안적으로, 비-천연 핵산 서열은 병원체(예컨대, 세균 또는 바이러스)의 항원을 암호화할 수 있으며, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 백신으로서 사용될 수 있다.
바이러스 기반 전달 시스템
본 개시내용은 또한 전달 시스템, 예를 들면, 바이러스-기반 시스템을 제공하며, 여기서 본원에 기술된 핵산이 삽입된다. 대표적인 바이러스 발현 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터, 아데노바이러스-기반 벡터, 렌티바이러스-기반 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 헤르페스 바이러스-기반 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스, 예를 들면, 렌티바이러스로부터 기원한 벡터는 딸 세포(daughter cell) 내에서 이식유전자의 장기간, 안정한 통합 및 이의 증식을 허용하므로 장기간 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구(tool)이다. 렌티바이러스 벡터는 비-증식 세포, 예를 들면, 간 세포를 형질도입시킬 수 있다는 점에서 종양-레트로바이러스, 예를 들면, 쥐 백혈병 바이러스로부터 기원한 벡터보다 추가된 장점을 갖는다. 이들은 또한 낮은 면역원성의 추가된 장점을 갖는다. 추가의 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터이다. 추가의 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일반적으로, 및 구현예에서, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체 내에서 기능성인 복제의 오리진(origin), 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다.
추가의 적합한 벡터는 통합 발현 벡터를 포함하며, 이는 숙주 세포의 DNA 내로 무작위로 통합될 수 있거나, 발현 벡터와 숙주 세포의 염색체 사이에 특이적인 재조합을 가능하도록 하는 재조합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 통합 발현 벡터는 목적한 단백질의 발현을 시행하기 위한 숙주 세포의 염색체의 내인성 발현 제어 서열을 활용할 수 있다. 부위 특이적인 방식으로 통합하는 벡터의 예는 예를 들면, Invitrogen(캘리포니아주 칼스바드 소재)로부터의 flp-in 시스템(예컨대, pcDNATM5/FRT), 또는 Stratagene(캘리포니아주 라 졸라 소재)으로부터의 pExchange-6 Core 벡터에서 발견될 수 있는 것과 같은, cre-lox 시스템의 구성성분을 포함한다. 숙주 세포 염색체 내로 무작위적으로 통합되는 벡터의 예는 예를 들면, Invitrogen(캘리포니아주 칼스바드 소재)으로부터의 pcDNA3.1(T-항원의 부재하에 도입되는 경우), 및 Promega(위스콘신주 매디슨 소재)로부터의 pCI 또는 pFN10A (ACT) FLEXITM을 포함한다. 추가의 프로모터 성분, 예컨대, 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 다수의 프로모터가 출발 부위의 하부로 기능성 성분을 또한 함유하는 것으로 최근 밝혀졌지만, 이들은 출발 부위의 상부로 30 내지 110 bp 영역 내에 위치한다. 프로모터 성분들 사이의 간격은 흔히 가요성(flexible)이어서, 성분이 삽입되거나 서로에 대해 이동하는 경우 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 성분들 사이의 간격은 활성의 감소가 시작되기 전에 50 bp 떨어지게 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개개 성분은 협동적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화시키는 것으로 여겨진다.
적합한 프로모터의 하나의 예는 즉시 초기 사이토메갈로바이러스(immediate early cytomegalovirus: CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 이에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 고 수준의 발현을 구동시킬 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다.
그러나, 다른 구성적 프로모터 서열, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 시미안 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 사람 면역결핍성 바이러스(HIV) 긴 말단 반복체(long terminal repeat: LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus) 즉시 초기 프로모터, 로우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 프로모터 뿐만 아니라 사람 유전자 프로모터, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 본 개시내용은 구성적 프로모터의 사용에 한정되지 않아야 한다. 유도성 프로모터가 또한 본 개시내용의 부분으로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 이러한 발현이 요구되는 경우 이것이 작동적으로 연결되는 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 작동(turning on)시킬 수 있거나, 발현이 요구되지 않는 경우 작동시키지 않을(turning off) 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용체 유기체 또는 조직 내에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않고 이의 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예컨대, 효소 활성에 의해 나타나는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용체 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼린 포스파타제, 또는 녹색 형광성 단백질 유전자(예컨대, Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000))를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 적합한 발현 시스템을 잘 공지되어 있으며 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있거나 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 고 수준의 발현을 나타내는 최소의 5' 플랭킹 영역(flanking region)을 지닌 작제물이 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결시켜 프로모터-유래된 전사를 조절하는 능력에 대해 제제(agent)를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
유전자를 세포 내로 도입시키고 발현시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 숙주 세포, 예컨대, 포유동물, 세균, 효모, 또는 곤충 세포 내로 당해 분야의 임의의 방법에 의해 용이하게 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포내로 전달할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 도입시키는 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 지질감염, 입자 충격(particle bombardment), 미세주사, 전기천공(electroporation) 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문허: Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))을 참고한다. 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 도입시키는 방법은 인산칼슘 형질감염 또는 폴리에틸렌이민(PEI) 형질감염이다.
목적한 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포내로 도입시키기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예컨대, 사람 세포 내로 삽입시키기 위해 가장 광범위하게 사용된 방법이 되어 왔다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스 단성 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호를 참고한다.
비-바이러스 기반 전달 시스템
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 화학적 방법은 콜로이드성 분산 시스템, 예를 들면, 거대분자 복합체, 나노캅셀(nanocapsule), 미세구(microsphere), 비드(bead), 및 지질-기반 시스템, 예를 들면 수중유(oil-in-water) 에멀젼, 미셀(micelle), 혼합된 미셀, 및 리포좀을 포함한다. 시험관내 및 생체 내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포좀(예컨대, 인공 막 소낭)이다.
지질 제형의 사용은 핵산을 숙주 세포 내로 도입시키기 위해 고려된다(시험관내, 생체외(ex vivo) 또는 생체내). 다른 양태에서, 핵산은 지질과 관련될 수 있다. 지질과 관련된 핵산은 리포좀의 수성 내부 내에 캡슐화(encapsulating)되거나, 리포좀의 지질 이층 내에 배치되거나, 리포좀 및 올리고뉴클레오타이드 둘 다와 관련된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포좀 내에 인트랩(entrap)되거나, 리포좀과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액 속에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 속의 현탁액으로서 함유되거나 미셀과 함께 함유되거나 복합체화되거나, 또는 그렇지 않으면 지질과 회합된다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합된 조성물은 용액 속의 임의의 특수한 구조에 제한되지 않는다. 예를 들면, 이들은 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로, 이층 구조 내에 존재할 수 있다. 이들은 또한 용액 속에 단순히 산재되어, 가능하게는 크기 또는 형태가 균일하지 않은 응집물을 형성할 수 있다. 지질은 천연적으로 발생한 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들면, 지질은 세포질 속에 천연적으로 발생하는 지방 소적(droplet) 뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄수화물 및 이들의 유도체, 예를 들면, 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데하이드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 미주리주 세인트 루이스(St. Louis) 소재의 Sigma로부터 수득될 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories(뉴욕주 플레인뷰(Plainview) 소재)로부터 수득될 수 있으며; 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 수득될 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, Ala.)로부터 수득될 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 속의 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 저장할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 용이하게 증발되므로 유일한 용매로서 사용된다. "리포좀"은 봉입된(enclosed) 지질 이층 또는 응집물의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중라멜라 지질 소낭을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포좀은 인지질 이층 막 및 내부 수성 매질을 지닌 소낭 구조를 갖는 것으로 특징화될 수 있다. 다중라멜라 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다수의 지질 층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액 속에 현탁되는 경우에 자발적으로 형성된다. 지질 구성성분은 밀폐된 구조의 형성 전에 자가-재배열을 겪으며 지질 이층 사이에 물과 용해된 용질을 인트랩(entrap)시킨다(Ghosh et al., Glycobiology 5: 505-10 (1991)). 그러나 정상의 소낭 구조보다는 용액 속에 상이한 구조를 갖는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들면, 지질은 미셀 구조(micellar structure)로 추정될 수 있거나 단지 지질 분자의 비균일 응집물로서 존재할 수 있다. 리포펙타민-핵산 복합체가 또한 고려된다.
일부 예에서, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 비-바이러스 기반 전달 시스템, 예를 들면, DNA 서열을 척추동물의 염색체 내로 도입시키기 위한 합성 DNA 트랜스포존(transposon) 시스템을 지칭하는 "슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty: SB) 트랜스포존 시스템(Transposon System)"을 사용하여 세포 내로 도입시킬 수 있다. 시스템의 일부 예시적인 구현예는 예를 들면, 미국 특허 제6,489,458호 및 제8,227,432호에 기술되어 있다. 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템은 슬리핑 뷰티(SB) 트랜스포사제 및 SB 트랜스포존으로 구성된다. 구현예에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템은 SB11 트랜스포존 시스템, SB100X 트랜스포존 시스템, 또는 SB110 트랜스포존 시스템을 포함한다.
DNA 트랜스포존은 하나의 DNA 부위로부터 다른 것으로 단순한, 절단-및-페이스트 방식(cut-and-paste manner)으로 전좌된다(translocate). 전좌는 정의된 DNA 분절(segment)이 하나의 DNA 분자로부터 절개되어 동일한거나 상이한 DNA 분자 또는 게놈 내에서 다른 부위로 이동하는 정밀한 공정이다. 다른 Tc1/마리너-유형(mariner-type) 트랜스포사제에서와 같이, SB 트랜스포사제는 트랜스포존을 수용체 DNA 서열 내의 TA 디뉴클레오타이드 염기 쌍 내로 삽입시킨다. 삽입 부위는 동일한 DNA 분자 내, 또는 다른 DNA 분자(또는 염색체) 내의 어느 곳일 수 있다. 사람을 포함하는 포유동물 게놈에서, 대략 2억개의 TA 부위가 존재한다. TA 삽입 부위는 트랜스포존 통합 공정에서 중복되어 있다. TA 서열의 이러한 중복은 전좌의 특징이며 일부 실험에서 메카니즘을 확인하기 위해 사용된다. 트랜스포사제는 트랜스포존 내에서 암호화될 수 있거나 트랜스포사제는 다른 공급원, 예를 들면, DNA 또는 mRNA 공급원에 의해 공급될 수 있고, 이러한 경우에 트랜스포존은 비-자가 성분이 된다. 비-자가 트랜스포존은 삽입 후 독립적으로 절개 및 재-삽입을 지속할 수 없기 때문에 유전 도구로서 가장 유용하다. SB 트랜스포존은 유전자를 척추동물의 게놈 내로 도입하기 위한 및 유전자 치료요법을 위한 비-바이러스 벡터로서 사용되는 것으로 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 또는 그렇지 않으면 세포를 본 개시내용의 억제제에 노출시키는데 사용된 방법과 상관없이, 숙주 세포 내에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위하여, 다양한 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은 예를 들면, 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 분자 검정, 예를 들면, 서던 및 노던 블롯팅(Southern and Northern blotting), RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 검정, 예를 들면, 예컨대, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의하거나 본 개시내용의 영역 내에 속하는 제제를 확인하기 위해 본원에 기술된 검정에 의해, 특수한 펩타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다.
구현예에서, 본원에 기술된 변형된 효과기 세포 및 다른 유전 성분은 SB11 트랜스포존 시스템, SB100X 트랜스포존 시스템, SB110 트랜스포존 시스템, piggyBac 트랜스포존 시스템(참고: 예컨대, Wilson et al, "PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells," Molecular Therapy 15:139-145 (2007), 본원에 이의 전문이 참고로 포함됨) 및/또는 piggyBac 트랜스포존 시스템(참고: 예컨대, Mitra et al., "Functional characterization of piggyBac from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon", Proc. Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013)을 사용하여 세포로 전달된다. 추가의 트랜스포사제 및 트랜스포존 시스템은 미국 특허 제6,489,458호; 제6,613,752호, 제7,148,203호; 제7,985,739호; 제8,227,432호; 제9,228,180호; 미국 특허 공보 제2011/0117072호; Mates et al., Nat Genet, 41(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 2009 May 3, Gene Ther., 18(9):849-56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Mar 31 및 in Ivics et al., Cell, 91(4):501-10, (1997)에 제공되며, 이들 각각은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
추가의 적합한 비-바이러스 시스템은 발현 벡터를 통합시키는 단계를 포함할 수 있으며, 발현 벡터는 숙주 세포의 DNA 내로 무작위로 통합될 수 있거나, 발현 벡터와 숙주 세포의 염색체 사이에 특이적인 재조합을 가능하도록 하는 재조합 부위를 포함할 수 있다. 이식유전자의 예정된 유전성 유전자자리(genetic loci) 내로의 표적화된 통합은 많은 적용을 위해 바람직한 목표이다. 첫째로, 부위-특이적인 리콤비나제에 대한 제1의 재조합 부위는 무작위 또는 예정된 위치에서 게놈 부위에 삽입시킨다. 후속적으로, 세포는 목적한 유전자 또는 DNA 및 제2의 재조합 부위 및 리콤비나제에 대한 공급원(발현 플라스미드, RNA, 단백질, 또는 바이러스-발현 리콤비나제)을 수반하는 플라스미드로 형질감염시킨다. 제1 재조합 부위와 제2 재조합 부위 사이의 재조합은 플라스미드 DNA의 통합을 생성한다.
이러한 통합 발현 벡터는 숙주 세포의 염색체의 내인성 발현 제어 서열을 이용하여 목적한 단백질의 발현을 실시할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화된 통합은 통합 부위를 플랭킹(flanking)하는 서열에 대해 상동성인 공여체 폴리뉴클레오타이드 상의 서열의 존재에 의해 촉진된다. 예를 들면, 본원에 기술된 공여체 폴리뉴클레오타이드를 사용한 표적화된 통합은 통상의 형질감염 기술, 예컨대, 동종 재조합에 의한 유전자 녹아웃(gene knockout) 또는 녹인(knockin)을 생성하는데 사용된 기술에 따라 달성할 수 있다. 다른 구현예에서, 표적화된 통합은 통합 부위를 플랭킹하는 서열에 대해 상동성인 공여체 폴리뉴클레오타이드 상의 서열의 존재, 및 부위-특이적인 리콤비나제의 존재 하에 공여체 폴리뉴클레오타이드와 세포를 접촉시킴 둘 다에 의해 촉진된다. 부위-특이적인 리콤비나제에 의해, 또는 단순히 리콤비나제에 의해, 이는 이의 양립성 재조합 부위 사이에서 보존적인 부위-특이적인 재조합을 촉매하는 폴리펩타이드임을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 부위-특이적인 리콤비나제는 천연의 폴리펩타이드 뿐만 아니라 활성을 보유하는 유도체, 변이체 및/또는 단편, 및 활성을 보유하는 리콤비나제를 암호화하는 천연의 폴리뉴클레오타이드, 유도체, 변이체, 및/또는 단편을 포함한다.
또한 숙주 세포 내에서 이종 유전자를 통합시키기 위한 시스템이 본원에 제공되며, 상기 시스템은 하나 이상의 유전자 발현 카세트를 포함한다. 일부 예에서, 시스템은 제1의 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 제1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1의 유전자 발현 카세트를 포함한다. 다른 예에서, 시스템은 제2의 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 제2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2의 유전자 발현 카세트를 포함할 수 있다. 여전히 다른 예에서, 시스템은 제3의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 유전자 발현 카세트 중 하나는: (i) 전사활성화 도메인(transactivation domain); (ii) 핵 수용체 리간드 결합 도메인; (iii) DNA-결합 도메인; 및 (iv) 엑다이손 수용체 결합 도메인(ecdysone receptor binding domain) 중 하나 이상을 암호화하는 유전자 스위치 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 시스템은 재조합 부착 부위; 및 세린 리콤비나제를 포함함으로써; 상기 세포가 적어도 상기 제2의 유전자 발현 카세트와 접촉시, 상기 세린 리콤비나제의 존재하에서, 상기 이종 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 통합되도록 한다.
일부 예에서, 시스템은 리간드를 추가로 포함함으로써, 상기 숙주 세포와 접촉시, 상기 리간드의 존재하에서, 상기 이종 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되도록 한다. 하나의 예에서, 시스템은 또한 재조합 부착 부위를 포함한다. 일부 에에서, 하나의 재조합 부착 부위는 파아지 게놈성 재조합 부착 부위(attP) 또는 세균 게놈성 재조합 부착 부위(attB)이다. 하나의 예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 다른 예에서, 숙주 세포는 사람 세포이다. 추가의 예에서, 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.
프로모터
"프로모터"는 암호화 서열의 전사를 개시하는 폴리뉴클레오타이드의 영역을 지칭한다. 프로모터는 동일한 가닥 상에 및 DNA 상의 상부(센스 가닥(sense strand)의 5' 영역을 향해)에서 유전자의 전사 출발 부위 근처에 위치한다. 일부 프로모터는 세포 내 모든 환경에서 활성이므로 구성적인 반면, 다른 것은 조절되어 특이적인 자극, 예컨대, 유도성 프로모터에 대한 반응시 활성이 된다. 여전히 다른 프로모터는 조직 특이적이거나 활성화된 프로모터이며, T-세포 특이적인 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터 활성" 및 이의 문법적 등가물은 이의 활성이 측정되는 프로모터에 대해 작동적으로 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 지칭한다. 프로모터 활성은 예를 들면, 노던 블롯 분석에 의해 생산된 RNA 전사체의 양을 측정함으로써 직접적으로 또는 연결된 핵산 서열, 예를 들면, 프로모터에 연결된 리포터 핵산 서열에 의해 암호화된 생성물의 양을 측정함으로써 간접적으로 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "유도성 프로모터"는 전사 조절인자, 예컨대, 생물 인자(biotic factor) 또는 무생물 인자(abiotic factor)의 존재 또는 부재에 의해 활성으로 도입된 프로모터를 지칭한다. 유도성의 프로모터는 이들에 작동적으로 연결된 유전자의 발현이 유기체의 발달의 특정 단계에서 또는 특수한 조직 내에서 작동되거나 작동되지 않을 수 있으므로 유용하다. 유도성 프로모터의 예는 알코올-조절된 프로모터, 테트라사이클린-조절된 프로모터, 스테로이드-조절된 프로모터, 금속-조절된 프로모터, 발병-조절된 프로모터, 온도-조절된 프로모터 및 광-조절된 프로모터이다. 일 구현예에서, 유도성 프로모터는 유전성 스위치의 부분이다. 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 소 분자 리간드-유도성 2개의 폴리펩타이드 엑다이손 수용체-기반 유전자 스위치, 예를 들면, RHEOSWITCH® 유전자 스위치일 수 있다. 일부 경우에, 유전자 스위치는: 제PCT/US2001/009050호(제WO 2001/070816호); 미국 특허 제7,091,038호; 제7,776,587호; 제7,807,417호; 제8,202,718호; 제PCT/US2001/030608호(제WO 2002/029075호); 미국 특허 제8,105,825호; 제8,168,426호; 제PCT/1J52002/005235호(제WO 2002/066613호); 미국 특허원 제10/468,200호(미국 공보 제20120167239호); 제PCT/US2002/005706호(제WO 2002/066614호); 미국 특허 제7,531,326호; 제8,236,556호; 제8,598,409호; 제PCT/U52002/005090호(제WO 2002/066612호); 미국 특허 제8,715,959호(미국 공보 제20060100416호); 제PCT/US2002/005234호(제WO 2003/027266호); 미국 특허 제7,601,508호; 제7,829,676호; 제7,919,269호; 제8,030,067호; 제PCT/U52002/005708호(제WO 2002/066615호); 미국 특허원 제10/468,192호(미국 공보 제20110212528호); 제PCT/US2002/005026호(제WO 2003/027289호); 미국 특허 제7,563,879호; 제8,021,878호; 제8,497,093호; 제PCT/US2005/015089호(제WO 2005/108617호); 미국 특허 제7,935,510호; 제8,076,454호; 제PCT/U52008/011270호(제WO 2009/045370허); 미국 특허원 제12/241,018호(미국 공보 제20090136465호); 제PCT/US2008/011563호(제WO 2009/048560호); 미국 특허원 제12/247,738호(미국 공보 제20090123441호); 제PCT/US2009/005510호(제WO 2010/042189호); 미국 특허원 제13/123,129호(미국 공보 제20110268766호); 제PCT/US2011/029682호(제WO 2011/119773호); 미국 특허원 제13/636,473호(미국 공보 제20130195800호); 제PCT/US2012/027515호(제WO 2012/122025호); 및 미국 특허 제9,402,919호(이들 각각은 이의 전문이 참고로 포함된다)에 기술된 임의의 시스템에 기술되어 있지만 이에 한정되지 않는 엑다이손-기반 수용체 구성성분으로부터 선택될 수 있다.
대상체에게 적어도 2개의 기능성 단백질 또는 이의 일부; 적어도 하나의 프로모터; 및 적어도 하나의 가공된 재조합 부위를 포함하는 본원에 기술된 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 비-바이러스 벡터를 투여함을 포함하는 방법이 본원에 제공되며; 상기 적어도 하나의 프로모터는 상기 적어도 2개의 기능성 단백질의 발현을 유도(driving)시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 프로모터는 구성적일 수 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 프로모터는 조직-특이적일 수 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 프로모터는 유도성일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 소 분자 리간드(small molecular ligand)-유도성의 2개의 폴리펩타이드 엑다이손 수용체-기반 유전자 스위치이다. 다른 경우에, 프로모터의 조합(여기서 적어도 하나의 프로모터는 유도성일 수 있고 적어도 하나의 프로모터는 활성화 특이적일 수 있다)이 활용될 수 있다.
유도성 프로모터는 상기 적어도 2개의 유전자 발현의 용량-조절된 제어를 위해 리간드를 이용한다. 일부 경우에, 리간드는 엑다이스테로이드, 9-시스-레티노산, 레티노산의 합성 유사체, N,N'-디아실하이드라진, 옥사디아졸린, 디벤조일알킬 시아노하이드라진, N-알킬-N,N'-디아로일하이드라진, N-아실-N-알킬카보닐하이드라진, N-아로일-N-알킬-N'-아로일하이드라진, 아르니도케톤, 3,5-디-3급-부틸-4-하이드록시-N-이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸하르파기드, 옥시스테롤, 22(R) 하이드록시콜레스테롤, 24(S) 하이드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트(ECHS), 7-케토콜레스테롤-3-설페이트, 프라메솔, 담즙산, 1,1-비포스포네이트 에스테르, 청소년 호르몬(juvenile hormone) III, RG-115819 (3,5-디메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-메틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드-), RG-115932 ((R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드), 및 RG- 115830(3,5 -디메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비-유도성 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 조직-특이적인 프로모터일 수 있다. 여기서, "조직-특이적인"은 조직 또는 세포형의 서브세트(subset)에서 유전자의 조절된 발현을 지칭한다. 일부 경우에, 조직-특이적인 프로모터는 공간적으로 조절됨으로써 프로모터가 유기체의 특정 조직 또는 세포형에서만 발현을 유도하도록 할 수 있다. 다른 경우에, 조직-특이적인 프로모터는 일시적으로 조절됨으로써 프로모터가 유기체의 발달 동안을 포함하여, 시간에 걸쳐 차등적으로 세포형 또는 조직내에서 발현을 유도하도록 할 수 있다. 일부 경우에, 조직-특이적인 프로모터는 공간적으로 및 일시적으로 둘 다 조절된다. 특정의 구현예에서, 조직-특이적인 프로모터는 세포형의 특수한 시간 또는 단계에 구성적으로 또는 간헐적으로 특정의 세포형에서 활성화된다. 예를 들면, 조직-특이적인 프로모터는 특이적인 세포, 예를 들면, T 세포 또는 NK 세포가 활성화되는 경우 활성화되는 프로모터일 수 있다. T 세포는 예를 들면, MHC 제II 부류 분자에 의해 펩타이드 항원과 함께 나타나는 경우, 다양한 방법으로 활성화될 수 있다.
하나의 경우에, 적어도 하나의 프로모터는 가공된 프로모터 또는 이의 변이체이다. 본원에 기술된 바와 같이, 프로모터는 IL-2로부터의 최소의 프로모터 서열 및 다음 중 하나 이상을 혼입시킬 수 있다: 활성화된 T-세포의 핵 인자(NFAT) 반응 성분(들); NFIL2D 반응 성분, NFkB/TCF 반응 성분, NF_AT/NFIL2B 반응 성분 또는 NFIL2A/OCT 반응 성분. 반응 성분의 예는 이의 전문이 본원에 포함된, 문헌: Mattila et al., EMBO J. 9(13):4425-33 (1990)에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 IL-2 코어 프로모터(서열 번호: 26)를 포함한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 IL-2 최소 프로모터(서열 번호: 27)를 포함한다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 IL-2 인핸서 및 프로모터 변이체(서열 번호: 26 내지 서열 번호: 28)를 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 NF-κB 결합 부위(서열 번호: 30 내지 서열 번호: 32)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 (NF-κB)1-IL2 프로모터 변이체(서열 번호: 30)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 (NF-κB)3-IL2 프로모터 변이체(서열 번호: 31)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 (NF-κB)6-IL2 프로모터 변이체(서열 번호: 32)를 포함한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 활성화된 T-세포(NFAT) 반응 성분-IL2 프로모터 변이체의 1X 핵 인자(서열 번호: 33)를 포함한다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 3X NFAT 반응 성분(서열 번호: 34 내지 서열 번호: 35)을 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 6X NFAT 반응 성분-IL2 프로모터 변이체(서열 번호: 36 내지 서열 번호: 39)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 사람 EF1A1 프로모터 변이체(서열 번호: 40 및 서열 번호: 41)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 사람 EF1A1 프로모터 및 인핸서(서열 번호: 42)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 사람 UBC 프로모터(서열 번호: 43)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 6개 부위 GAL4-유도성의 인접 인자 결합 성분(proximal factor binding element)(PFB)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 합성의 최소 프로모터 1(유도성 프로모터)(서열 번호: 44)를 포함한다.
본원에 기술된 IL-12 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치의 사용은 예를 들면 조절된 발현을 허용하고 치료학적 지표를 증진시킴으로써 IL-12의 안전성 프로파일(safety profile)을 증진시킬 수 있다. 그러나, 유전자 스위치(들)을 사용하여 IL-12의 리간드 용량 의존성 발현을 위한 조건은 활성인자 리간드(예컨대, 벨레디멕스)의 존재 또는 부재이다. 특정의 구현예에서, IL-12 발현의 유도를 위한 추가의 조건적 제어가 고려된다. T 세포 활성화된 특이적인 프로모터의 제어 하에서 유전자 스위치 구성성분이 제공된다. 이는 유전자 스위치의 제어 하에서 이식유전자(들)의 벨레디멕스 조절된 발현에 필수적인 유전자 스위치 구성성분의 조건적 발현(예컨대, T 세포 활성화)을 야기한다. 일부 구현예에서, 이는 발레디멕스가 존재하고 T 세포가 활성화되는 경우 종양 특이적인 T 세포에 의해 IL-12 또는 IL-15와 같은 사이토킨의 우선적 발현을 야기한다. 이는 증가된 국재화된 수준의 유전자 스위치 제어된 이식유전자 발현을 이끌 수 있다.
예를 들면, 유전자 스위치 구성성분의 T 세포 활성화된 특이적인 발현은 활성화된 T-세포의 핵 인자(NFAT) 반응 구성성분(들)을 포함하는 프로모터에 의해 제어될 수 있다. NFAT 전사 인자는 효과기 T-세포 상태의 주요 조절인자이다. NFAT는 고갈(exhaustion)을 전진적으로 유도시키는 초기 전사 체크포인트(early transcriptional checkpoint)이다. NFAT는 TCR 자극 후 T 세포 내에서 신속하게 활성화되며 적절한 공-자극 신호전달에 의해 유도된 AP-1과 함께 단백질 복합체를 형성하며 효과기 유전자 및 T-세포 기능을 조절한다. NFAT 반응 성분(들)은 다른 최소의 프로모터 서열(예컨대, IL2 최소 프로모터)과 융합되어 T 세포 활성화에 대한 반응시 이식유전자의 발현을 유도시킬 수 있다.
활성화 특이적인 프로모터의 다른 예는 인터류킨-2 (IL2) 프로모터 및 프로그램화된 사멸(Programmed Death)(PD)-1(CD279) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유전자 스위치 구성성분은 또한 전염증성 신호전달 경로의 NF-κB와 같은 다른 핵 인자에 대한 결합 부위를 최소 프로모터 서열(예컨대, IL2)에 융합시킴으로써 면역 세포 활성화시 조건적으로 발현시킬 수 있다.
특정의 구현예에서, 프로모터는: IL-2 코어 프로모터, IL-2 최소의 프로모터, IL-2 인핸서 및 프로모터 변이체, (NF-κB)1-IL2 프로모터 변이체, (NF-κB)3-IL2 프로모터 변이체, (NF-κB)6-IL2 프로모터 변이체, 1X NFAT 반응 성분-IL2 프로모터 변이체, 3X NFAT 반응 성분-IL2 프로모터 변이체, 6X NFAT 반응 성분-IL2 프로모터 변이체, 사람 EEF1A1 프로모터 변이체, 사람 EEF1A1 프로모터 및 인핸서, 사람 UBC 프로모터 및 합성의 최소의 프로모터 1 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터 뉴클레오타이드는 서열 번호: 26 내지 서열 번호: 44를 포함할 수 있다.
유전자 스위치
유전자 스위치 폴리펩타이드, 리간드-유도성 유전자 스위치 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이러한 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 혼입시키는 방법 및 시스템이 본원에 제공된다. 특정의 양태에서, 본 개시내용은 이종 유전자 발현의 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 시스템을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이며, 여기서 이종 유전자 발현은 상기 유전자 스위치 시스템에 의해 조절되고, 상기 이종 유전자는 본원에 개시된 하나 이상의 면역 반응-유도성 B형 간염 바이러스(HBV) 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
용어 "유전자 스위치"는 프로모터와 관련된 반응 성분, 및 예를 들면, 하나 이상의 리간드의 존재 하에서, 이의 내부로 반응 성분 및 프로모터가 혼입된 유전자의 발현을 조절하는 EcR 기반 시스템의 조합을 지칭한다. 강력하게 조절된 유도성 유전자 발현 시스템 또는 유전자 스위치는 다양한 적용, 예를 들면, 유전자 치료요법, 세포 내에서 단백질의 대규모 생산, 세포 기반한 고 처리량(high throughput) 스크리닝 검정(cell based high throughput screening assay), 기능성 유전학 및 형질도입 식물 및 동물에서 특성의 조절에 유용하다. 이러한 유도성 유전자 발현 시스템은 리간드 유도성 이종 유전자 발현 시스템을 포함할 수 있다.
EcR-기반 유전자 스위치의 초기 버젼(early version)은 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) EcR(DmEcR) 및 무스 무스쿨루스(Mus musculus) RXR(MmRXR) 폴리펩타이드를 사용하였으며 이러한 수용체는 스테로이드, 포나스테론A의 존재하에서 포유동물 세포주 및 형질도입 마우스에서 이러한 리포터(reporter) 유전자를 전사활성화시킴(transactivate)이 밝혀졌다(Christopherson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(14):6314-18 (1992); No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(8):3346-51 (1996)). 이후에, 문헌: Suhr et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14):7999-8004 (1998))은 비-스테로이드성 엑다이손 효능제, 테부페노지드가 외인성 이종이량체 파트너의 부재하에서 봄빅스 모리(Bombyx mori) EcR(BmEcR)을 통해 포유동물 세포 내 리포터 유전자의 고수준의 전사활성화를 유도하였음을 나타내었다.
국제 특허원 제PCT/US97/05330호(제WO 97/38117호) 및 제PCT/US99/08381호(제WO99/58155호)는 외인성 유전자의 발현을 조절하는 방법을 개시하고 있으며, 여기서 외인성 유전자 및 엑다이손 반응 성분을 포함하는 DNA 작제물은 이에 대한 리간드의 존재하에서, 및 임의로 사일런트 파트너(silent partner)로서 작용할 수 있는 수용체의 존재하에서 엔다이손 반응 성분에 결합하여 유전자 발현을 유도하는 엑다이손 수용체를 포함하는 제2의 DNA 작제물에 의해 활성화된다. 이러한 예에서, 엑다이손 수용체는 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)로부터 단리되었다. 전형적으로, 이러한 시스템은 최적의 활성화를 제공하기 위하여, 사일런트 파트너, 바람직하게는 레티노이드 X 수용체(RXR)의 존재를 필요로 한다. 포유동물 세포에서, 곤충 엑다이손 수용체(EcR)는 포유동물 레티노이드 X 수용체(RXR)와 이종이량체화될 수 있으며, 이에 의해, 리간드 의존적 방식으로 표적 유전자 또는 이종 유전자의 발현을 조절하는데 사용된다. 국제 특허원 제PCT/US98/14215호(제WO 99/02683호)는 누에 나방(silk moth) 봄빅스 모리로부터 단리된 엑다이손 수용체가 외인성 이량체 파트너에 대한 필요성없이 포유동물 시스템에서 기능성임을 개시하고 있다.
미국 특허 제6,265,173호는 수용체의 스테로이드/갑상선 상과(superfamily)의 다양한 구성원이 유전자 발현 시스템에서 사용하기 위한 USP의 이량체화 도메인을 적어도 포함하는 드로소필라 멜라노가스터 울트라스피라클 수용체(ultraspiracle receptor)(USP) 또는 이의 단편과 조합될 수 있음을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,880,333호는 식물에서 사용된 드로소필라 멜라노가스터 EcR 및 울트라스피라클(USP) 이종이량체 시스템을 개시하고 있으며 여기서 전사활성화 도메인 및 DNA 결합 도메인은 2개의 상이한 하이브리드 단백질 상에 위치한다. 각각의 이러한 경우에서, 전사활성화 도메인 및 DNA 결합 도메인(국제 특허원 제PCT/US98/14215호에서와 같은 천연의 EcR로서 또는 국제 특허원 제PCT/US97/05330호에서와 같은 변형된 EcR로서)은 단일 분자 내로 혼입되었고 다른 이종이량체 파트너, USP 또는 RXR은 이의 천연 상태로 사용되었다.
국제 특허원 제PCT/US01/0905호는 엑다이손 수용체-기반 유도성 유전자 발현 시스템을 개시하고 있으며, 여기서 전사활성화 및 DNA 결합 도메인은 이들을 2개의 상이한 단백질 상에 위치시킴으로써 서로로부터 분리되어 리간드의 부재하에서 크게 감소된 배경 활성 및 리간드의 존재하에서 배경보다 유의적으로 증가된 활성을 야기한다. 이러한 2-하이브리드 시스템(two-hybrid system)은 특허원 제PCT/US97/05330호 및 제PCT/US98/14215호에 개시된 2개의 시스템과 비교하여 유도성 유전자 발현 조절 시스템을 유의적으로 개선시킨다. 2-하이브리드 시스템은 전사 활성화 도메인이 DNA 결합 도메인에 대해 보다 유리한 위치가 되도록 함으로써 DNA 결합 도메인이 유전자 상의 DNA 결합 부위에 결합하는 경우, 전사활성화 도메인이 프로모터를 보다 효과적으로 활성화시키도록 하는 상호작용 단백질의 쌍의 능력을 발휘하는 것으로 여겨진다(참고: 예를 들면, 미국 특허 제5,283,173호). 2-하이브리드 유전자 발현 시스템은 2개의 유전자 발현 카세트; 핵 수용체 폴리펩타이드에 융합된 DNA 결합 도메인을 암호화하는 제1의 유전자 발현 카세트, 및 상이한 핵 수용체 폴리펩타이드에 융합된 전사활성화 도메인을 암호화하는 제2의 유전자 발현 카세트를 포함한다. 리간드의 존재하에서, 제1의 폴리펩타이드와 제2의 폴리펩타이드의 상호작용을 촉진함으로써 이에 의해 DNA 결합 도메인 및 전사활성화 도메인의 이량체화를 생성하는 구조적 변화가 유도되는 것으로 여겨진다. DNA 결합 및 전사활성화 도메인은 2개의 상이한 분자 상에 잔류하므로, 리간드의 부재하에서 배경 활성은 크게 감소된다.
또 다른 놀라운 발견은 2-하이브리드 시스템의 특정 변형이 또한 스테로이드 리간드, 예를 들면, 포나스테론 A("PonA") 또는 무리스테론 A("MurA")과 비교하는 경우, 비-스테로이드성 리간드, 예를 들면, 디아실하이드라진에 대해 개선된 민감성을 제공할 수 있다는 것이었다. 즉, 스테로이드와 비교하는 경우, 비-스테로이드성 리간드는 보다 낮은 리간드 농도에서 더 높은 전사 활성을 제공하였다. 또한, 2-하이브리드 시스템은 변형되지 않은 RXR이 스위칭 파트너로서 사용되는 경우 발생할 수 있는 RXR의 과발현으로 인하여 일부 부작용을 피한다. 바람직한 2-하이브리드 시스템에서, EcR 또는 RXR의 천연의 DNA 결합 및 전사활성화 도메인은 제거되며 그 결과, 이러한 하이브리드 분자는 세포 내에 존재하는 다른 스테로이드 호르몬 수용체와 상호작용하는 기회가 거의 없으며, 따라서 감소된 부작용을 야기한다.
엑다이손 수용체(EcR)는 핵 수용체 상과의 구성원이며 아과(subfamily) 1, 그룹 H(본원에서 "그룹 H 핵 수용체"로 지칭됨)으로 분류된다. 각각의 그룹의 구성원은 E(리간드 결합) 도메인 내에서 40 내지 60% 아미노산 동일성을 공유한다(Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163). 엑다이손 수용체 외에도, 이러한 핵 수용체 아과 1, 그룹 H의 다른 구성원은: 편재된 수용체(ubiquitous receptor)(UR), 오르판 수용체(Orphan receptor) 1(OR-1), 스테로이드 호므론 핵 수용체 1(NER-1), RXR 상호작용 단백질-15(RIP-15), 간 x 수용체 β(LXRβ), 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질(RLD-1), 간 x 수용체(LXR), 간 x 수용체 α(LXRα), 파르네소이드 x 수용체(FXR), 수용체 상호작용 단백질 14(RIP-14), 및 파르네솔 수용체(HRR-1)를 포함한다.
일부 경우에, 유도성 프로모터는 소 분자 리간드-유도성의 2개의 폴리펩타이드 엑다이손 수용체-기반 유전자 스위치, 예를 들면, Intrexon Corporation의 RHEOSWITCH® 유전자 스위치일 수 있다. 일부 경우에, 유전자 스위치는 제PCT/US2001/009050호(제WO 2001/070816호); 미국 특허 제7,091,038호; 제7,776,587호; 제7,807,417호; 제8,202,718호; 제PCT/US2001/030608호(제WO 2002/029075호); 미국 특허 제8,105,825호; 제8,168,426호; 제PCT/1J52002/005235호(제WO 2002/066613호); 미국 특허원 제10/468,200호(미국 공보 제20120167239호); 제PCT/US2002/005706호(제WO 2002/066614호); 미국 특허 제7,531,326호; 제8,236,556호; 제8,598,409호; 제PCT/U52002/005090호(제WO 2002/066612호); 미국 특허 제8,715,959호(미국 공보 제20060100416호); 제PCT/US2002/005234호(제WO 2003/027266호); 미국 특허 제7,601,508호; 제7,829,676호; 제7,919,269호; 제8,030,067호; 제PCT/U52002/005708호(제WO 2002/066615호); 미국 특허원 제10/468,192호(미국 공보 제20110212528호); 제PCT/US2002/005026호(제WO 2003/027289호); 미국 특허 제7,563,879호; 제8,021,878호; 제8,497,093호; 제PCT/US2005/015089호(제WO 2005/108617호); 미국 특허 제7,935,510호; 제8,076,454호; 제PCT/U52008/011270호(제WO 2009/045370호); 미국 특허원 제12/241,018호(미국 공보 제20090136465호); 제PCT/US2008/011563호(제WO 2009/048560호); 미국 특허원 제12/247,738호(미국 공보 제20090123441호); 제PCT/US2009/005510호(제WO 2010/042189호); 미국 특허원 제13/123,129호(미국 공보 제20110268766호); 제PCT/US2011/029682호(제WO 2011/119773호); 미국 특허원 제13/636,473호(미국 공보 제20130195800호); 제PCT/US2012/027515호(제WO 2012/122025호); 및 미국 특허 제9,402,919호(이들 각각은 이의 전문이 참고로 포함된다)에 기술된 임의의 시스템에 기술되어 있지만, 이에 한정되지 않는 엑다이손-기반 수용체 구성성분으로부터 선택될 수 있다.
본원에 개시된 유전자-스위치 폴리펩타이드를 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 숙주 세포 내에서 이종 유전자 및 인터류킨의 발현을 조절하기 위한 시스템이 제공된다.
일부 구현예에서 제1의 폴리펩타이드를 암호화하는 제1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1의 유전자 발현 카세트; 제2의 폴리펩타이드를 암호화하는 제2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2의 유전자 발현 카세트; 및 리간드를 포함하는, 숙주 세포 내에서 이종 유전자 및 사이토킨의 발현을 조절하기 위한 시스템이 제공되며; 상기 제1 및 제2의 폴리펩타이드는: (i) 전사활성화 도메인; (ii) DNA-결합 도메인; 및 (iii) 리간드 결합 도메인; (iv) 상기 이종 유전자; 및 (vi) 상기 사이토킨 중 하나 이상을 포함함으로써 상기 숙주 세포가 상기 제1의 유전자 발현 카세트 및 상기 제2의 유전자 발현 카세트와 상기 리간드의 존재하에서 접촉하는 경우, 상기 이종 유전자 및 상기 사이토킨이 상기 숙주 세포 내에서 발현되도록 한다. 일부 경우에, 이종 유전자는 본원에 기술된 항원 결합 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 경우에, 사이토킨은 적어도 하나의 케모킨, 인터페론, 인터류킨, 림포킨, 종양 괴사 인자, 또는 이의 변이체 또는 조합을 포함한다. 일부 경우에, 사이토킨은 인터류킨이다. 일부 경우에 인터류킨은 IL12, IL2, IL15, IL21, 및 이의 기능성 변이체 및 단편 중 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 막 결합되거나 분비될 수 있다. 다른 구현예에서, 사이토킨은 세포내일 수 있다. 인터류킨은 막 결합된 IL-15(mbIL-15) 또는 IL-15 및 IL-15Rα의 융합체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mbIL-15은 본원에 기술된 변형된 효과기 세포와 공-발현될 수 있는 막-결합된 키메라 IL-15이다. 일부 구현예에서, mbIL-15는 전장 IL-15Rα, 이의 기능성 단편 또는 변이체와 프레임내(in frame)에 융합된 전장 IL-15(예컨대, 천연의 IL-15 폴리펩타이드) 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 경우에, IL-15는 링커를 통해 IL-15Rα에 간접적으로 연결된다. 일부 예에서, mbIL-15는 문헌: Hurton et al., "Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113(48):E7788-E7797 (2016)에 기술된 바와 같다. 다른 양태에서, 인터류킨은 IL-12를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-12은 단일 쇄 IL-12(scIL-12), 프로테아제 민감성 IL-12, 탈안정화된 IL-12, 막 결합된 IL-12, 삽입된(intercalated) IL-12이다. 일부 예에서, IL-12 변이체는 제WO2015/095249호, 제WO2016/048903호, 제WO2017/062953호에 기술된 바와 같으며, 이들 모두는 이의 전문이 참고로 포함된다.
유전자 스우치 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공되며, 상기 유전자 스위치 폴리펩타이드는: a) 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA-결합 도메인을 포함하는 제1의 유전자 스위치 폴리펩타이드, 및 b) 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사활성화 도메인을 포함하는 제2의 유전자 스위치 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 제1의 유전자 스위치 폴리펩타이드 및 제2의 유전자 스위치 폴리펩타이드는 링커에 의해 연결되어 있다. 일부 경우에, 링커는 본원에 기술된 링커, 예를 들면, GSG 링커, 푸린링크(furinlink), 2A 링커, 예를 들면, F/T2A, T2A, p2A, GSG-p2A, 이의 변이체 및 유도체일 수 있다. 다른 예에서, 링커는 IRES일 수 있다.
일부 경우에, DNA 결합 도메인(DBD)은 본원에 기술된 DBD, 예를 들면, GAL4(GAL4 DBD), LexA DBD, 전사 인자 DBD, 스테로이드/갑상선 호르몬 핵 수용체 상과(superfamily) 구성원 DBD, 세균성 LacZ DBD, 및 효모 DBD 중 적어도 하나를 포함한다. 전사활성화 도메인은 본원에 기술된 전사활성화 도메인, 예를 들면, VP16 전사활성화 도메인, p53 전사활성화 도메인 및 B42 산성 활성인자 전사활성화 도메인을 포함할 수 있다. 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 엑다이손 수용체(EcR), 편재하는 수용체, 오르판 수용체 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 및 파메솔 수용체 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 폴리펩타이드 링커 또는 리보소옴-스키핑 서열(ribosome-skipping sequence)에 의해 연결된 유전자 스위치 폴리펩타이드는 리간드-유도성 유전자 스위치와 비교하여 유전자 발현의 개선된 용량-의존성 리간드-유도성 제어를 나타내고 여기서 유전자 스위치 폴리펩타이드는 비-암호화 서열, 예를 들면, IRES에 의해 연결된다. 일부 경우에, 2A 링커에 의해 연결된 유전자 스위치 폴리펩타이드는 유전자 스위치와 비교하여 이종 유전자 발현의 개선된 용량-의존성 리간드-유도성 제어를 나타낼 수 있으며 상기 유전자 스위치 폴리펩타이드는 IRES에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, 유전자 스위치는 VP16 전사활성화 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 유전자 스위치는 엑다이손 수용체(EcR), 편재하는 수용체, 오르판 수용체 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 및 파메솔 수용체 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 스위치의 DNA-결합 도메인(DBD)은 GAL4(GAL4 DBD), LexA DBD, 전사 인자 DBD, 스테로이드/갑상선 호르몬 핵 수용체 상과 구성원 DBD, 세균성 LacZ DBD, 및 효모 DBD 중 적어도 하나를 포함한다. 여전히 다른 경우에, 유전자 스위치는 울트라스피라클(ultraspiracle) 단백질(USP), 레티노이드 수용체 X(RXR), 이의 기능성 단편 및 변이체 중 적어도 하나를 추가로 포함하며 상기 기능성 단편 및 변이체는 EcR에 결합할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 가공된 세포 내에서 발현될 수 있다. 본원에서 가공된 세포는 이의 천연 또는 내인성 상태로부터 변형된 세포이다. 가공된 세포의 예는 예를 들면, 본원에 기술된 유전자 스위치 폴리펩타이드, 목적한 유전자(GOI), 세포 태그(tag), 이종 유전자, 및 임의의 다른 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 암호화하도록 변형된(폴리뉴클레오타이드의 세포 내로의 형질감염에 의함) 본원에 기술된 세포이다.
리간드
일부 구현예에서, 유도성 유전자 스위치 조절에 사용된 리간드는 다음 중 어느 것으로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다: N-[(1R)-1-(1,1-디메틸에틸)부틸]-N'-(2-에틸-3-메톡시벤조일)-3,5-디메틸벤조하이드라지드(또한 벨레디멕스로 지칭됨), (2S,3R,5R,9R,10R,13R,14S,17R)-17-[(2S,3R)-3,6-디하이드록시-6-메틸헵탄-2-일]-2,3,14-트리하이드록시-10,13-디메틸- 2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-6-온; N'-(3,5-디메틸벤조일)-N'-[(3R)-2,2-디메틸-3-헥사닐]-2-에틸-3-메톡시벤조하이드라지드; 5-메틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(3,5-디메틸-벤조일)-N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-하이드라지드; 5-메틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-하이드라지드; 5-메틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-하이드라지드; 5-메틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-하이드라지드; 5-에틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(3,5-디메틸-벤조일)-N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-하이드라지드; 5-에틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-하이드라지드; 5-에틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-하이드라지드; 5-에틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드; 2-메톡시-니코틴산 N-(1-3급-부틸-펜틸)-N'-(4-에틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(2,2-디메틸-1-페닐-프로필)-N'-(4-에틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-펜틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-하이드라지드; 및 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-펜틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-하이드라지드.
일부 경우에, 엑다이손 수용체-기반 유도성 유전자 스위치의 용량-조절된 대조군에 대해 사용된 리간드는 엑다이스테로이드, 예를 들면, 엑다이손, 20-하이드록시엑다이손, 포나스테론 A, 무리스테론 A 등, 9-시스-레티노산, 레티노산의 합성 유사체, N,N'-디아실하이드라진, 예를 들면, 미국 특허 제6,013,836호; 제5,117,057호; 제5,530,028호; 및 제5,378,726호 및 미국 특허공개공보 제2005/0209283호 및 제2006/0020146호에 기술된 것; 미국 특허 공개공보, 제2004/0171651호에 기술된 바와 같은 옥사디아졸린; 디벤조일알킬 시아노하이드라진, 예를 들면, 유럽 특허원 제461,809호에 개시된 것; N-알킬-N,N'-디아로일하이드라진, 예를 들면, 미국 특허 제5,225,443호에 개시된 것; N-아실-N-알킬카보닐하이드라진, 예를 들면, 유럽 특허원 제234,994호에 기술된 것; N-아로일-N-알킬-N'-아로일하이드라진, 예를 들면, 미국 특허 제4,985,461호에 기술된 것; 아르니도케톤, 예를 들면, 미국 특허 공개공보 제2004/0049037호에 기술된 것(상기 문헌 각각은 본원에 참고로 포함된다) 및 다른 유사한 물질, 예를 들면, 3,5-디-3급-부틸-4-하이드록시-N-이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸하르파기드, 옥시스테롤, 22(R) 하이드록시콜레스테롤, 24(S) 하이드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트(ECHS), 7-케토콜레스테롤-3-설페이트, 프라메솔, 담즙산, 1,1-비포스포네이트 에스테르, 청소년 호르몬 III 등 중 어느 것으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 개시내용에 유용한 디아실하이드라진 리간드의 예는 RG-115819(3,5-디메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-메틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드-), RG-115932 ((R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드), 및 RG-115830(3,5-디메틸-벤조산 N-(1-3급-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드)를 포함한다. 예컨대, 미국 특허원 제12/155,111호, 및 PCT 특허원 제PCT/US2008/006757호를 참고하며, 이들 둘 다는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
사이토킨
특정의 구현예에서, 본원에 제공된 HBV 백신 항원은 다른 사이토킨과 함께 동시-전달되고/되거나 동시-발현(예컨대, 동일한 HBV 항원 전달 벡터의 부분으로서 또는 별도의 벡터를 통해)될 수 있다. 유전자-스위치 폴리펩타이드 및 사이토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 변이체 또는 유도체, 및 이를 혼입하는 방법 및 시스템이 본원에 제공된다. 사이토킨은 세포 신호전달에 관여된 약 5 내지 20 kDa 사이의 소 분자의 범주이다. 일부 예에서, 사이토킨은 케모킨, 인터페론, 인터류킨, 콜로니-자극 인자 또는 종양 괴사 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 케모킨은 세포의 이주를 안내하는 화학유인물질(chemoattractant)로서 역활을 하며, 4개의 아과로 분류된다: CXC, CC, CX3C, 및 XC. 예시적인 케모킨은 CC 아과: CCL1, CCL2(MCP-1), CCL3, CCL4, CCL5(RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9(또는 CCL10), CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, 및 CCL28; CXC 아과: CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, 및 CXCL17; XC 아과: XCL1 및 XCL2; 및 CX3C 아과 CX3CL1로부터의 케모킨을 포함한다.
특정의 구현예에서, 본원에 제공된 HBV 백신 항원은 다른 인터페론과 함께 동시-전달되고/되거나 동시-발현(예컨대, 동일한 HBV 항원 전달 벡터의 부분으로서 또는 별도의 벡터를 통해)될 수 있다. 인터페론(IFN)은 인터페론 제I형(예컨대, IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, 및 IFN-ω), 인터페론 제II형(예컨대, IFN-γ), 및 인터페론 제III형을 포함한다. 일부 구현예에서, IFN-α은 약 13개의 서브형, 예를 들면, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, 및 IFNA21로 추가로 분류된다.
특정의 구현예에서, 본원에 제공된 HBV 백신 항원은 다른 인터류킨과 함께 동시-전달되고/되거나 동시-발현(예컨대, 동일한 HBV 항원 전달 벡터의 부분으로서 또는 별도의 벡터를 통해)될 수 있다. 인터류킨은 백혈구 또는 백혈구 세포에 의해 발현되며 이들은 T 및 B 림프구 및 조혈 세포의 발달 및 분화를 촉진시킨다. 예시적인 인터류킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (CXCL8), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35, 및 IL-36을 포함한다. 일부 구현예에서, 인터류킨은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-21 또는 IL-15 및 IL-15α의 융합체이다.
일부 양태에서, 인터류킨은 IL-12를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-12은 단일 쇄 IL-12(scIL-12), 프로테아제 민감성 IL-12, 탈안정화된 IL-12, 막 결합된 IL-12, 삽입된(intercalated) IL-12이다. 일부 예에서, IL-12 변이체는 제WO2015/095249호, 제WO2016/048903호, 제WO2017/062953호에 기술된 바와 같고, 이들 모두는 이의 전문이 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 인터류킨은 mbIL-15를 포함한다. 일부 구현예에서, mbIL-15는 본원에 기술된 변형된 효과기 세포와 함께 동시-발현될 수 있는 막-결합된 키메라 IL-15이다. 일부 구현예에서, mbIL-15는 전장 IL-15Rα, 이의 기능성 단편 또는 변이체와 프레임 내에서 융합된, 전장 IL-15(예컨대, 천연의 IL-15 폴리펩타이드) 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 경우에, IL-15는 링커를 통해 IL-15Rα에 간접적으로 연결된다. 일부 예에서, mbIL-15는 문헌: Hurton et al., 2016에 기술된 바와 같다.
특정의 구현예에서, 본원에 제공된 HBV 백신 항원은 다른 종양 괴사 인자와 함께 동시-전달되고/되거나 동시-발현(예컨대, 동일한 HBV 항원 전달 벡터의 부분으로서 또는 별도의 벡터를 통해)될 수 있다. 종양 괴사 인자(TNF)는 세포자멸사를 조절하는 사이토킨의 그룹이다. 일부 예에서, TNF 과 내에 약 19개의 구성원, 예를 들면, TNFα, 림프독소-알파(LT-알파), 림프독소-베타(LT-베타), T 세포 항원 gp39(CD40L), CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L, 및 TNF-관련된 세포자멸사 유도성 리간드(TRAIL)가 존재하나, 이에 한정되지 않는다.
특정의 구현예에서, 본원에 제공된 HBV 백신 항원은 다른 콜로니 자극 인자와 함께 동시-전달되고/되거나 동시-발현(예컨대, 동일한 HBV 항원 전달 벡터의 부분으로서 또는 별도의 벡터를 통해)될 수 있다. 콜로니-자극 인자(CSF)는 조혈 줄기 세포의 표면에서 수용체 단백질과 상호작용하는 분비된 당단백질이며, 이는 후속적으로 세포 증식 및 특수한 유형의 혈액 세포로의 분화를 조절한다. 일부 예에서, CSF는 대식구 콜로니-자극 인자, 과립구 대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 또는 프로메가포이에틴을 포함한다.
일부 구현예에서, 사이토킨은 막-결합된 사이토킨은 막-결합된 사이토킨이며, 이는 본원에 기술된 키메라 항원 수용체와 함께 동시-발현된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 방법은 사이토킨의 투여를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 사이토킨은 케모킨, 인터페론, 인터류킨, 콜로니-자극 인자 또는 종양 괴사 인자를 포함한다. 일부 예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 방법은 케모킨, 인터페론, 인터류킨, 콜로니-자극 인자 또는 종양 괴사 인자로부터 선택된 사이토킨의 투여를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 방법은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL-15 및 IL-15Rα의 융합체, IL21, IFNγ 또는 TNF-α로부터 선택된 사이토킨의 투여를 추가로 포함한다.
인터류킨-12
특수한 구현예에서, 본원에 제공된 HBV 백신 항원은 인터류킨-12와 함께 동시-전달되고/되거나 동시-발현(예컨대, 동일한 HBV 항원 전달 벡터의 부분으로서 또는 별도의 벡터를 통해)될 수 있다. 인터류킨 12(IL-12)는 항원성 자극에 대한 반응시 수지 세포, 대식구, 호중구, 및 사람 B-림프아구성 세포(NC-37)에 의해 천연적으로 생산된 인터류킨이다. IL-12는 4개의 알파 나선의 다발로 구성된다. 이는 2개의 별도의 유전자, IL-12A(p35) 및 IL-12B(p40)에 의해 암호화된 이종이량체성 사이토킨이다. 활성 이종이량체(p70으로서 지칭됨), 및 p40의 동종이량체는 단백질 합성 후 형성된다. IL-12는 면역계의 주요 조절인자(master regulator)이다. IL-12는 NK 세포 및 T 세포를 활성화시킴으로써 면역 반응을 촉진한다(도 18).
HBV 재조합 백신을 포함하는 조성물, 키트, 및 시스템 및 이를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 본 개시내용은 다중-결실된 고릴라 아데노벡터(GC46)(서열 번호: 61 내지 63) 내에 작제된 HBV 항원 설계(HBV 설계 1 내지 5)를 제공한다. 또한 유전자 스위치 폴리펩타이드 및 IL-12를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변이체 또는 유도체, 및 이를 혼입시키는 방법 및 시스템이 본원에 제공된다(도 18).
링커
또한 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 발현 및 기능성을 촉진시키기 위한 링커를 포함하는 작제물이 개시된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 링커는 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 내에서 이용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 링커는 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터와 적합성인(compatible) 말단 구조를 생성하기 위해 첨가될 수 있는 목적한 제한 부위를 함유하는 DNA의 이중-가닥 분절일 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 링커는 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 변형시키는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드 링커를 포함하는 벡터 변형은 다중 클로닝 부위 내의 변화, 또는 폴리-히스티딘 테일(tail)의 첨가일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 링커를 또한 사용하여 응집성 끝 말단(cohesive end termini)을 지닌 제한 효소로 절단된 벡터내로 클로닝하기 위해 평활 삽입부 DNA의 말단을 조정할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 링커의 사용은 벡터 내로의 평활 연결보다 더 효율적일 수 있으며 벡터로부터의 삽입체를 하부 적용(downstream application)으로 방출시키는 방법을 제공할 수 있다. 일부 경우에 삽입체는 치료학적 적용에 유용한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 절단가능한 링커일 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 링커는 올리고머일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 링커는 DNA 이중 가닥, 단일 가닥, 또는 이의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 링커는 일부 경우에 T4 리가제에 의해 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 내로 연결시킬 수 있다. 연결을 촉진시키기 위해 과도한 폴리뉴클레오타이드 링커를 삽입체 및 벡터를 포함하는 조성물에 가할 수 있다. 일부 경우에, 삽입체 및 벡터는 링커가 도입되기 전에 예비-처리된다. 예를 들면, 메틸라제를 사용한 예비-처리는 삽입체 DNA의 원치않는 절단을 방지할 수 있다.
특정의 구현예에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 2개 이상의 폴리펩타이드는 개재되는(intervening) 링커 폴리펩타이드를 암호화하는 개재되는 서열에 의해 분리될 수 있다. 여기서 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 2개 이상의 폴리펩타이드를 분리하는 아미노산 서열을 지칭하는 용어 "개재되는 링커 폴리펩타이드"는 본원에 개시된 폴리펩타이드 작제물 내에 임의로 포함되어 막관통 도메인(transmembrane domain)을 세포 표면 폴리펩타이드(예컨대, 천연의 폴리펩타이드의 트렁케이트된(truncated) 변이체를 포함함)에 연결시키는 아미노산의 서열을 지칭하는 용어 "펩타이드 링커"와는 구별된다. 특정의 경우에, 개재되는 링커는 절단에 민감한 개재되는 링커 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 링커는 절단가능한 또는 리보소옴 스키핑(ribosome skipping) 링커이다. 일부 구현예에서, 절단가능한 링커 또는 리보소옴 스키핑 링커 서열은 2A, GSG-2A, GSG 링커, SGSG 링커, 푸린링크(furinlink) 변이체 및 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 2A 링커는 p2A 링커, T2A 링커, F2A 링커 또는 E2A 링커이다. 일부 구현예에서, 목적한 폴리펩타이드는 절단에 민감한 개재되는 링커 폴리펩타이드에 의해 연결된 융합 단백질로서 발현된다. 특정의 구현예에서, 절단에 민감한 개재되는 링커 폴리펩타이드(들)은 다음 중 임의의 하나 이상일 수 있다: F/T2A, T2A, p2A, 2A, GSG-p2A, GSG 링커, 및 푸린링크 변이체. 2017년 5월 18일자로 공개된 제PCT/US2016/061668호(제WO2017083750호)가 본원에 참고로 포함된다. 특정의 구현예에서, 링커 폴리펩타이드는 하기 표에 개시된 것을 포함한다:
[표 2]
Figure pct00002

Figure pct00003

일부 구현예에서, 개재되는 링커 폴리펩타이드는 Whitlow 링커(서열 번호: 64), GSG 링커(서열 번호: 66), SGSG 링커(서열 번호: 67), (G4S)3 링커(서열 번호: 68), 푸린 절단 부위/Furlink1(서열 번호: 69), Fmdv 링커(서열 번호: 70), 쏘세아 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus) 2A 영역(T2A)(서열 번호: 71), 푸린-GSG-T2A(서열 번호: 72), 푸린-SGSG-T2A(서열 번호: 73), 돼지 테스쵸바이러스(porcine teschovirus)-1 2A 영역(P2A)(서열 번호: 74), GSG-P2A(서열 번호: 75), 말 비염 A 바이러스 2A 영역(E2A)(서열 번호: 76), 또는 수족구 질환 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 2A 영역(F2A)(서열 번호: 78)의 아미노산과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다(표 2). 일부 경우에, 개재되는 링커 폴리펩타이드는 링커의 아미노산 서열(서열 번호: 65, 79, 80)과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 바이러스 2A 서열이 사용될 수 있다. 2A 성분은 5 내지 100개 염기 쌍을 갖는 IRES보다 더 짧을 수 있다. 일부 경우에, 2A 서열은 길이가 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 100개 뉴클레오타이드일 수 있다. 2A 연결된 유전자는 하나의 단일 개방 판독 프레임 내에서 발현될 수 있으며, "자가-절단"은 2A 폴리펩타이드의 C-말단에서, 마지막 2개의 아미노산, GP 사이에 동시-해독적으로 발생하여, 동일한 양의 동시-발현된 단백질을 생성할 수 있다.
바이러스 2A 서열은 약 20개 아미노산일 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 2A 서열은 컨센수스 모티프 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro를 함유할 수 있다. 컨센수스 모티프 서열은 동시-해독적으로 작용할 수 있다. 예를 들면, 글리신과 프롤린 잔기 사이의 정상적인 펩타이드 결합의 형성은 방지될 수 있으며, 이는 신생의(nascent) 폴리펩타이드의 리보소옴 스키핑(ribosomal skipping) 및 절단을 생성할 수 있다. 이러한 효과는 등몰 수준에서 다수의 유전자를 생산할 수 있다.
2A 펩타이드는 리보소옴-스키핑 메카니즘(ribosome-skipping mechanism)을 통해 다수의 단백질을 단일 개방 판독 프레임 내에서 개개의 폴리펩타이드 내로 후속적으로 절단될 수 있는 폴리펩타이드로 해독하도록 할 수 있다(Funston et al., J. Gen. Virol. 89(Pt 2):389-96 (2008)). 일부 구현예에서, 2A 서열은: F/T2A, T2A, p2A, 2A, T2A, E2A, F2A, 및 BmCPV2A, BmIFV2A, 및 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 벡터는 IRES 서열 및 2A 링커 서열을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 2A 펩타이드에 연결된 다수의 유전자의 발현은 2A 펩타이드의 앞쪽의 스페이서 서열(GSG)에 의해 촉진될 수 있다. 일부 경우에, 작제물은 스페이서, 링커, 어댑터(adaptor), 프로모터, 또는 이의 조합물을 조합시킬 수 있다. 예를 들면, 링커는 스페이서(SGSG 또는 GSG 또는 Whitlow 링커) 및 푸린 링커(R-A-K-R) 절단 부위를 상이한 2A 펩타이드와 함께 가질 수 있다. 스페이서는 I-Ceui일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 가공될 수 있다. 예를 들면, 링커는 소수성과 같은 화학적 특성을 포함하도록 설계할 수 있다. 일부 경우에, 적어도 2개의 링커 서열은 동일한 단백질을 생산할 수 있다. 다른 경우에, 다중 링커를 벡터 내에 사용할 수 있다. 예를 들면, 목적한 유전자는 적어도 2개의 링커로 분리될 수 있다.
특정의 구현예에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 2개 이상의 폴리펩타이드는 링커 폴리펩타이드를 암호화하는 개재되는 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정의 경우에, 링커는 절단에 민감한 링커이다. 일부 구현예에서, 목적한 폴리펩타이드는 절단에 민감한 링커 폴리펩타이드에 의해 연결된 융합 단백질로서 발현된다. 특정의 구현예에서, 절단에 민감한 링커 폴리펩타이드(들)는: Furinlink, fmdv, p2a, GSG-p2a, 및/또는 후술된 fp2a 중 임의의 1개 또는 2개일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 APVKQGSG(서열 번호: 96)이다.
특정의 경우에, 링커 폴리펩타이드는 아미노산 서열 "RAKR"(서열 번호: 86)을 포함할 수 있다. 특정의 경우에, 푸린 링커 폴리펩타이드는 "CGTGCAAAGCGT"(서열 번호: 69) 또는 "AGAGCTAAGAGG"(서열 번호: 130)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다.
일부 구현예에서, 링커는 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 내에서 이용될 수 있다. 링커는 가요성(flexible) 링커, 강직성(rigid) 링커, 생체내에서 절단가능한 링커, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 함께 기능성 도메인을 함께 연결시키거나(가요성 및 강직성 링커에서와 같이) 또는 생체내 절단가능한 링커에서와 같이 생체 내에서 유리된 기능성 도메인을 방출할 수 있다.
링커는 생물학적 활성을 증진시키고, 발현 수율을 증가시키며, 목적한 약력학적 프로파일을 달성할 수 있다. 링커는 또한 하이드라존, 펩타이드, 디설파이드, 또는 티오에스테르를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 링커 서열은 가요성 링커일 수 있다. 가요성 링커는 결합된 도메인이 특정 정도의 운동 또는 상호작용을 필요로 하는 경우 적용될 수 있다. 가요성 링커는 작거나, 비-극성(예컨대, Gly) 또는 극성(예컨대, Ser 또는 Thr) 아미노산으로 구성될 수 있다. 가요성 링커는 Gly 및 Ser 잔기의 스트레치(stretch)로 주로 이루어진 서열을 가질 수 있다("GS" 링커). 가요성 링커의 예는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(서열 번호: 85)의 서열을 가질 수 있다. 카피 수 "n"을 조절함으로써, 이러한 예시적인 GS 링커의 길이를 최적화하여 기능성 도메인의 적절한 분리를 달성하거나 필수적인 도메인간 상호작용을 유지시킬 수 있다. GS 링커 외에도, 다른 가요성 링커를 재조합 융합 단백질에 대해 이용할 수 있다. 일부 경우에, 가요성 링커는 또한 작거나 극성인 아미노산, 예를 들면, Gly 및 Ser 속에서 풍부할 수 있지만, 추가의 아미노산, 예를 들면, Thr 및 Ala를 함유함으로써 가요성(flexibility)을 유지할 수 있다. 다른 경우에, 극성 아미노산, 예를 들면, Lys 및 Glu를 사용하여 용해도를 증진시킬 수 있다.
본원에 기술된 링커 서열에 포함된 가요성 링커는 작거나 극성인 아미노산, 예를 들면, Gly 및 Ser 속에서 풍부하여 양호한 가요성 및 용해도를 제공할 수 있다. 가요성 링커는 특정의 운동 또는 상호작용이 융합체 단백질 도메인에 대해 요구되는 경우 적합한 선택이 될 수 있다. 또한, 가요성 링커가 강직성 구조를 가질 수 없지만, 이들은 수동적 링커로서 제공되어 기능성 도메인 사이의 거리를 유지할 수 있다. 가요성 링커의 길이는 적절한 폴딩(folding)을 허용하고 융합 단백질의 최적의 생물학적 활성을 달성하도록 조절될 수 있다.
본원에 기술된 링커는 일부 경우에 강직성 링커를 추가로 포함할 수 있다. 강직성 링커는 폴리펩타이드의 도메인들 사이에 고정된 거리를 유지하기 위해 이용될 수 있다. 강직성 링커의 예는: 몇가지 예를 들면, 알파 나선-형성 링커, Pro가 풍부한 서열, (XP)n, X-Pro 골격, A(EAAAK)nA(n = 2 내지 5)일 수 있다. 강직성 링커는 α-나선 구조를 채택하거나 일부 경우에 다중 Pro 잔기를 함유함으로써 비교적 강직성 구조를 나타낼 수 있다.
본원에 기술된 링커는 일부 경우에 절단가능할 수 있다. 다른 경우에, 링커는 절단가능하지 않다. 절단가능하지 않은 링커는 함께 기능성 도메인을 공유결합으로 결합시켜 생체내 공정 또는 생체외 공정 전체에서 하나의 분자로서 작용할 수 있다. 링커는 또한 생체 내에서 절단가능할 수 있다. 절단가능한 링커는 생체내에서 자유 기능성 도메인을 방출하도록 도입될 수 있다. 절단가능한 링커는 몇가지 예를 들면, 환원 시약, 프로테아제의 존재에 의해 절단될 수 있다. 예를 들면, 이황화물 결합의 환원을 이용하여 절단가능한 링커를 생산할 수 있다. 이황화물 링커의 경우에, 티올, 예를 들면, 글루타티온과의 이황화물 교환을 통한 절단 현상은 절단을 생산할 수 있다. 다른 경우에, 재조합 융합 단백질 내에서 링커의 생체내 절단은 또한 생리학적 상태(예컨대, 암 또는 염증) 하에서, 특수한 세포 또는 조직 내에서 생체내 발현될 수 있거나, 특정의 세포 구획 내에서 구속될 수 있는 프로테아제에 의해 수행될 수 있다. 일부 경우에, 절단가능한 링커는 표적화된 절단을 허용할 수 있다. 예를 들면, 많은 프로테아제의 특이성은 구속된 구획 내에서 링커의 보다 느린 절단을 제공할 수 있다. 절단가능한 링커는 또한 하이드라존, 펩타이드, 이황화물, 또는 티오에스테르를 포함할 수 있다. 예를 들면, 하이드라존은 혈청 안전성을 부여할 수 있다. 다른 경우에, 하이드라존은 산성 구획 내에서 절단을 허용할 수 있다. 산성 구획은 pH 7 이하를 가질 수 있다. 링커는 또한 티오에테르를 포함할 수 있다. 티오에테르는 비환원성일 수 있다. 티오에테르는 세포내 단백질분해성 분해를 위해 설계될 수 있다.
특정의 구현예에서, fmdv 링커 폴리펩타이드는 서열 번호: 87에 대해 적어도 약 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있는 서열을 포함한다. 특정의 구현예에서, fmdv 링커 폴리펩타이드는 2개 이상의 융합 단백질을 연결하는 단일 벡터 내에 암호화된 링커 중 하나 이상이다. 특정의 경우에, fmdv 링커 폴리펩타이드는 폴리뉴클레오타이드 개방 판독 프레임(ORF) 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 일부 경우에, ORF 암호화 fmdv는 서열 번호: 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정의 구현예에서, fmdv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호: 70에 대해 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
특정의 경우에, 링커 폴리펩타이드는 "p2a" 링커일 수 있다. 특정의 구현예에서, p2a 폴리펩타이드는 서열 번호: 91에 대해 약 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 특정의 구현예에서, p2a 링커 폴리펩타이드는 2개 이상의 융합 단백질을 연결하는 단일 벡터 내에 암호화된 링커 중 하나 이상일 수 있다. 일부 경우에, p2a 링커 폴리펩타이드는 폴리뉴클레오타이드 개방 판독 프레임(ORF) 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 특정의 구현예에서, ORF 암호화 p2a는 서열 번호: 74의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정의 경우에, p2a를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호: 74이거나 이와 약 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
일부 경우에, 링커 폴리펩타이드는 "GSG-p2a" 링커일 수 있다. 특정의 구현예에서, GSG-p2a 링커 폴리펩타이드는 서열 번호: 92에 대해 약 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 특정의 구현예에서, GSG-p2a 링커 폴리펩타이드는 2개 이상의 융합 단백질을 연결하는 단일 벡터 내에 암호화된 링커 중 하나 이상일 수 있다. 일부 경우에, GSG-p2a 링커 폴리펩타이드는 폴리뉴클레오타이드 개방-판독 프레임(ORF) 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. GSG p2a를 암호화하는 ORF는 서열 번호: 75의 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, GSG-p2a를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호: 75일 수 있거나 이와 적어도 약 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
링커 폴리펩타이드는 본원에서 제공한 바와 같은 "fp2a" 링커일 수 있다. 특정의 구현예에서, fp2a 링커 폴리펩타이드는 서열 번호: 95에 대해 적어도 약 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 특정의 경우에, fp2a 링커 폴리펩타이드는 2개 이상의 융합 단백질을 연결하는 단일 벡터 내에 암호화된 링커 중 하나 이상일 수 있다. 일부 경우에, fp2a 링커 폴리펩타이드는 폴리뉴클레오타이드 개방 판독 프레임(ORF) 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 특정의 구현예에서, fp2a 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호: 78일 수 있거나 이에 대해 적어도 약 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
일부 경우에, 링커는 가공될 수 있다. 예를 들면, 링커는 소수성과 같은 화학적 특성을 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 경우에, 적어도 2개의 링커 서열은 동일한 단백질을 생산할 수 있다. 서열은 서열 번호 82, 96 또는 97의 폴리펩타이드 서열일 수 있거나 이와 약 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% , 또는 100% 동일할 수 있다. 다른 경우에, 다중 링커를 벡터 내에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 목적한 유전자, 및 본원에 기술된 하나 이상의 유전자 스위치 폴리펩타이드 서열은 적어도 2개의 링커로 분리될 수 있다. 일부 경우에, 유전자는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 링커에 의해 분리될 수 있다.
링커는 가공된 링커일 수 있다. 링커를 설계하는 방법은 계산적일 수 있다. 일부 경우에, 계산 방법은 그래프 기술을 포함할 수 있다. 계산 방법을 사용하여 데이타베이스로부터 유도된 3차원 펩타이드 구조의 라이브러리로부터 적합한 펩타이드에 대해 조사할 수 있다. 예를 들면, 브룩해븐 단백질 데이타 뱅크(Brookhaven Protein Data Bank)(PDB)를 사용하여 링커의 선택된 아미노산들 사이의 공간에서 거리를 잴 수 있다.
일부 구현예는 푸린 폴리펩타이드 및 2A 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이며, 여기서 푸린 폴리펩타이드 및 2A 폴리펩타이드는 적어도 3개의 소수성 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 링커에 의해 연결되어 있다. 일부 경우에, 적어도 3개의 소수성 아미노산이 글리신(Gly)(G), 알라닌(Ala)(A), 발린(Val)(V), 루이신(Leu)(L), 이소루이신(Ile)(I), 프롤린(Pro)(P), 페닐알라닌(Phe)(F), 메티오닌(Met)(M), 트립토판(Trp)(W)으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 일부 경우에, 폴리펩타이드 링커는 또한 하나 이상의 GS 링커 서열, 예를 들면, (GS)n, (SG)n, (GSG)n, 및 (SGSG)n를 포함할 수 있으며, 여기서 n은 0 내지 15 중 임의의 수일 수 있다.
제1의 기능성 폴리펩타이드 및 제2의 기능성 폴리펩타이드를 포함하는 상기 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 상기 제1의 기능성 폴리펩타이드 및 제2의 기능성 폴리펩타이드가 서열 APVKQ에 대해 적어도 60% 상동성을 지닌 서열을 포함하는 링커 폴리펩타이드에 의해 연결되어 있는 단계; 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내에서 발현시키는 단계로서, 상기 발현시키는 것은 서열 APVKQ에 대해 적어도 60% 상동성을 지닌 서열을 포함하는 링커 폴리펩타이드를 가지지 않은 상응하는 폴리펩타이드 작제물과 비교하여 폴리펩타이드 작제물의 증진된 발현을 야기하는 단계를 포함하여, 폴리펩타이드 작제물의 증진된 발현을 수득하는 방법이 제공된다.
IRES 성분
본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 발현 및 기능성을 촉진시키기 위한 IRES 성분을 포함하는 작제물이 또한 본원에 개시되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "내부 리보소옴 도입 부위(internal ribosome entry site)(IRES)"는 내부 리보소옴 도입 부위를 의미하는 것으로 의도될 수 있다. IRES 서열을 포함하는 벡터에서, 제1의 유전자는 이의 자체의 5'-UTR을 사용한 메카니즘인, cap-의존성인, 리보소옴 스캐닝에 의해 해독될 수 있는 반면, 후속적인 유전자의 해독은 cap-독립된 방식으로 IRES에 리보소옴을 직접 보충(recruitment)시켜 달성할 수 있다. IRES 서열은 진핵세포 리보소옴이 5' 캡핑된 말단에 대한 결합없이 결합하여 해독되도록 할 수 있다. IRES 서열은 하나의 전사체로부터의 다중 유전자의 발현을 허용할 수 있다(Mountford and Smith 1995).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CAP" 또는 "cap"은 진핵세포 mRNA의 5' 말단에 대해 변형된 뉴클레오타이드, 일반적으로 3' 내지 5'로 연결된 7-메틸 구아노신(7meG-ppp-G)을 지칭하며, 이는 mRNA로부터 단백질의 발현 동안 정상적인 해독 개시 경로에서 필요 성분으로서 제공된다.
특정의 경우에, IRES 영역은 피코르나바이러스, 뇌척수 심근염 바이러스(encephalomyocarditis virus), C형 간염 바이러스 IRES 서열로부터 유래할 수 있다. 다른 경우에, IRES 서열은 뇌척수 심근염 바이러스로부터 유래할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "EMCV" 또는 "뇌척수 심근염 바이러스"는 피코르나비리다에(Picornaviridae) 과의 속의 뇌척수 심근염 바이러스 종의 임의의 구성원 단리체 또는 균주를 지칭한다. 예에는: EMCV-R(Rueckert) 균주 바이러스, Columbia-SK 바이러스가 있다. 일부 경우에, 세포 IRES 성분, 예를 들면, 진핵세포성 개시 인자 4G, 면역글로불린 중쇄 결합 단백질, c-myc 광-종양유전자, 혈관 내피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자-1 IRES, 또는 이의 임의의 조합 또는 변형을 사용할 수 있다. 일부 경우에, 세포 IRES는 바이러스 IRES와 비교하는 경우 증가된 유전자 발현을 가질 수 있다.
바이러스, 이의 세포 또는 조합의 IRES 서열을 벡터 내에서 이용할 수 있다. IRES는 뇌척수 심근염(EMCV) 또는 폴리오바이러스(poliovirus)(PV)로부터 유래할 수 있다. 일부 경우에, IRES 성분은 폴리오바이러스(PV), 뇌척수염 바이러스(EMCV), 수족구병 바이러스(FMDV), 돼지 테스쵸바이러스(Porcine teschovirus)-1(PTV-1), 아이키바이러스(Aichivirus)(AiV), 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus)(SVV), C형 간염 바이러스(HCV), 전통적인 돼지 열 바이러스(Classical swine fever virus)(CSFV), 사람 면역결핍성 바이러스-2(HIV-2), 사람 면역결핍성 바이러스-1(HIV-1), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus)(MoMLV), 고양이 면역결핍성 바이러스(Feline immunodeficiency virus)(FIV), 마우스 유방 종양 바이러스(Mouse mammary tumor virus)(MMTV), 잠복성 사람 사이토메갈로바이러스(Human cytomegalovirus latency)(pUL138), 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)(EBNA-1), 헤르페스 바이러스 마렉 질환(Herpes virus Marek's disease)(MDV RLORF9), SV40 폴리스스트론성(polycistronic) 19S(SV40 19S), 로팔로시퓸 파디 바이러스(Rhopalosiphum padi virus)(RhPV), 크릭켓 파랄라이시스 바이러스(Cricket paralysis virus)(CrPV), 엑트로피스 오블리쿠아 피코르나-유사 바이러스(Ectropis obliqua picorna-like virus)(EoPV), 플라우티아 스탈리 장 바이러스(Plautia stali intestine virus)(PSIV), 트리아토마 바이러스(Triatoma virus)(TrV), 벌 마비 디시스트로바이러스(Bee paralysis dicistrovirus)(IAPV, KBV), 블랙 커란트 리버젼 바이러스(Black currant reversion virus)(BRV), 펠라르고늄 플라워 브레이크 바이러스(Pelargonium flower break virus)(PFBV), 히비스커스 클로로틱 링스폿 바이러스(Hibiscus chlorotic ringspot virus)(HCRSV), 크루시퍼-감염 토바모바이러스(Crucifer-infecting tobamovirus)(CrTMV), 감자 잎 마름병 폴레로바이러스(Potato leaf roll polerovirus)(PLRV), 담배 에치 바이러스(Tobacco etch virus)(TEV), 기아르디아바이러스(Giardiavirus)(GLV), 레이슈마니아(Leishmania) RNA 바이러스-1(LRV-1), 및 이의 조합 또는 변형으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 경우에, IRES는 Apaf-1, XIAP, HIAP2/c-IAP1, DAP5, Bcl-2, c-myc, CAT-1, INR, 분화(Differentiation) LEF-1, PDGF2, HIF-1a, VEGF, FGF2, BiP, BAG-1, CIRP, p53, SHMT1, PITSLREp58, CDK1, Rpr, hid, hsp70, grim, skl, 안테나페디아(Antennapedia), dFoxO, dInR, Adh-Adhr, HSP101, ADH, URE-2,GPR1, NCE102, YMR181a, MSN1, BOI1, FLO8, GIC1, 및 이의 임의의 조합 또는 변형으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. IRES 성분이 2개의 개방 판독 프레임(ORF) 사이에 포함되는 경우, 해독의 개시는 처음 ORF 내에서 캐노니칼(canonical) 5'-m7GpppN 캡(cap)-의존성 메카니즘 및 IRES 성분의 하부의 제2의 ORF 내에서 cap-독립된 메카니즘에 의해 발생할 수 있다.
일부 경우에, 유전자는 내부 리보소옴 도입 부위(IRES)에 의해 연결될 수 있다. IRES는 다중 유전자의 동시 발현을 허용할 수 있다. 예를 들면, IRES 서열은 단일의 mRNA 전사체로부터 다중 단백질의 생산을 허용할 수 있다. 리보소옴은 IRES에 5'-cap 독립된 방식으로 결합하여 해독을 개시할 수 있다.
일부 경우에, IRES 서열은 약 500개의 염기쌍일 수 있다. IRES 서열은 300개 염기쌍 내지 1000개 염기쌍일 수 있다. 예를 들면, IRES는 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1000개 염기쌍일 수 있다.
일부 경우에, IRES 서열을 포함하는 벡터 내에서 하부 유전자의 발현은 감소될 수 있다. 예를 들면, IRES 서열 이후의 유전자는 IRES 서열 앞의 유전자보다 감소된 발현을 가질 수 있다. 감소된 발현은 선행 유전자보다 1% 내지 99% 감소일 수 있다.
발현을 조절하는 방법
일 구현예에서, 가공된 세포 내에서 이종 유전자의 발현을 조절하는 방법이 제공된다. 이종 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위해 유전자 스위치 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 항원 결합 폴리펩타이드 및 이종 유전자가 제공된다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 도 1 내지 16 중 임의의 하나에 나타낸 바와 같은 하나 이상의 유전자 발현 카세트에서와 같다. 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 통해 가공된 세포 내로 도입된다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 비-바이러스 벡터는 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 레콤비나제 또는 유전자 편집 기술을 통해 가공된 세포 내로 도입된다. 리콤비나제의 예는 본원에 기술된 바와 같은 세린 리콤비나제이다. 유전자 편집 기술의 예는 CRISPR 또는 아르고너트 시스템(Argonaute system)을 포함할 수 있다. 여기서 "CRISPR 시스템"의 "CRISPR 유전자 편집 시스템"은 게놈의 특수한 영역에 대해 DNA 서열내 변화를 표적화하기 위한 임의의 RNA-보조된 Cas 단백질-매개된 공정을 지칭한다. 여기서 "아르고너트 유전자 편집 시스템(Argonaute gene editing system)"은 게놈의 특이적 영역에 대해 DNA 서열내 변화를 표적화하기 위한 임의의 단일 가닥 DNA 인도된 아르고너트 엔도뉴클레아제-매개된 공정을 지칭한다.
약제학적 조성물 및 투여량
본 개시내용은 본원에 기술된 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터 및 이에 대한 담체(예컨대, 약제학적으로 허용되는 담체)를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 바람직하게는 생리학적으로 허용되는(예컨대, 약제학적으로 허용되는) 조성물이며, 이는 담체, 바람직하게는 생리학적으로(예컨대, 약제학적으로) 허용되는 담체, 및 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 임의의 적합한 담체가 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있으며, 이러한 담체는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 담체의 선택은 부분적으로는 조성물의 특수한 사용(예컨대, 동물에 대한 투여) 및 조성물을 투여하는데 사용된 특수한 방법에 의해 결정될 것이다. 이상적으로, 복제-결함성 아데노바이러스 벡터의 맥락에서, 약제학적 조성물은 바람직하게는 복제-가능한 아데노바이러스를 포함하지 않는다. 약제학적 조성물은 임의로 멸균성일 수 있다.
적합한 조성물은 수성 및 비-수성의 등장성 멸균 용액을 포함하며, 이는 항산화제, 완충제, 및 세균정지제, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 조성물은 단위-투여량 또는 다중-투여량 밀봉 용기, 예를 들면, 앰플(ampule) 및 바이알(vial) 속에 존재할 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들면, 물의 첨가 만을 필요로 하는 냉동-건조된(동결건조된) 상태로 저장될 수 있다. 일시적인 용액 및 현탁액을 멸균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조할 수 있다. 바람직하게는, 담체는 완충된 염수 용액이다. 보다 바람직하게는, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 투여 전에 손상으로부터 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 보호하도록 제형화된 조성물의 부분이다. 예를 들면, 조성물은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 제조하거나, 저장하거나,투여하기 위해 사용된 장치, 예를 들면, 유리제품, 주사기, 또는 침(needle)에서 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 손실을 감소시키기 위해 제형화될 수 있다. 조성물은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 광 민감성 및/또는 온도 민감성을 감소시키기 위해 제형화될 수 있다. 이러한 목적으로, 조성물은 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 액체 담체, 예를 들면, 위에서 기술한 것들, 및 폴리소르베이트 80, L-아르기닌, 폴리비닐피롤리돈, 트레할로즈, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 안정화제를 포함한다. 이러한 조성물의 사용은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 저장 수명을 연장시키고, 이의 투여를 촉진시킬 것이다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터-함유 조성물에 대한 제형은 예를 들면, 미국 특허 제6,225,289호, 미국 특허 제6,514,943호, 및 국제 특허원 공보 제WO 2000/034444호에 추가로 기술되어 있다.
조성물은 또한 형질도입 효율을 향상시키기 위해 제형화될 수 있다. 또한, 당해 분야의 통상의 기술자는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 다른 치료학적 또는 생물학적 활성제와의 조성물 속에 존재할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들면, 염증을 제어하는 인자, 예를 들면, 이부프로펜 또는 스테로이드는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 생체내 투여와 관련된 팽윤 및 염증을 감소시키는 조성물의 부분일 수 있다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 항원-암호화 핵산 서열을 숙주에게 전달하는 경우, 면역계 자극인자 또는 보조제, 예컨대, 인터류킨, 지질다당류, 또는 이중-가닥 RNA를 투여하여 항원에 대한 임의의 면역 반응을 향상시키거나 변형시킬 수 있다. 항생제, 즉, 살미생물제 및 살진균제가 기존의 감염을 치료하고/하거나 미래의 감염, 예를 들면, 유전자 전달 과정과 관련된 감염의 위험을 감소시키기 위해 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에서 투여하기 위한 본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 본원에 개시되어 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하고, 임의로 사이토킨 및/또는 추가의 치료제를 함유하는 변형된 효과기 세포 조성물이 개시되어 있다. 일부 예에서 또한 효과기 세포의 변형을 위해 키메라 항원 수용체의 발현을 조절하기 위한 유전자-스위치 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터가 본원에 포함된다.
일부 예에서, 변형된 효과기 세포 또는 유전자-스위치 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터 및 키메라 항원 수용체의 약제학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 에를 들면, 활성 화합물의 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 촉진시키는 부형제 및 보조제를 사용하는 통상의 방식으로 제형화된다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존적이다. 본원에 기술된 약제학적 조성물의 요약은 예를 들면, 문헌: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed.(Lippincott Williams & Wilkins1999)에서 찾을 수 있다.
약제학적 조성물은 통상의 방식, 예를 들면, 단지 예로서, 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 제분(levigating), 유화, 캡슐화, 인트랩핑(entrapping) 또는 압착 공정의 수단에 의해 임의로 제조된다.
특정의 구현예에서, 조성물은 또한 하나 이상의 pH 조절제 또는 완충제, 예를 들면, 산, 예를 들면, 아세트산, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산 및 염산; 염기, 예를 들면, 수산화나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 락트산나트륨 및 트리스-하이드록시메틸아미노메탄; 및 완충제, 예를 들면, 시트레이트/덱스트로즈, 중탄산나트륨 및 염화암모늄을 포함할 수 있다. 이러한 산, 염기 및 완충제는 허용되는 범위 내의 조성물의 pH를 유지하는데 필요한 양으로 포함된다.
다른 구현예에서, 조성물은 또한 조성물의 삼투압을 허용되는 범위로 가져오는데 필요한 양의 하나 이상의 염을 포함할 수 있다. 이러한 염은 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온 및 클로라이드, 시트레이트, 아스코르베이트, 보레이트, 포스페이트, 비카보네이트, 설페이트, 티오설페이트 또는 비설파이드 음이온을 갖는 것을 포함하며; 적합한 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 티오황산나트륨, 황산수소나트륨 및 황산암모늄을 포함한다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 임의의 적합한 투여 경로, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 경구, 비경구(예컨대, 정맥내, 피하, 근육내, 뇌내, 뇌실내, 관절내, 복강내, 또는 두개내), 비강내, 볼내, 설하, 또는 직장 투여 경로로 투여된다. 일부 예에서, 약제학적 조성물은 비경구(예컨대, 정맥내, 피하, 근육내, 뇌내, 뇌실내, 관절내, 복강내, 또는 두개내) 투여를 위해 제형화된다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 임의의 적합한 형태, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 수성의 경구 분산제, 액체, 겔제, 시럽제, 엘릭서르제(elixir), 슬러리제(slurry), 좌제 등, 치료될 개체(individual)에 의한 경구 소화를 위해, 고체 경구 용량형, 에어로졸제, 조절된 방출 제형, 신속한 용융 제형, 비등성 제형(effervescent formulation), 동결건조된 제형, 정제, 산제, 환제, 당의제, 캅셀제, 지연된 방출 제형, 연장된 방출 제형, 맥동 방출 제형(pulsatile release formulation), 다중입자화 제형(multiparticulate formulation), 및 혼합된 즉시 방출 및 제어된 방출 제형으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 캅셀제로 제형화된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 액제(예를 들면, IV 투여용)로 제형화된다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 주입제로 제형화된다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 주사제로 제형화된다.
본원에 기술된 약제학적 고체 투여형은 본원에 기술된 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들면, 적합성 담체, 결합제, 충전제, 현탁제, 풍미제, 감미제, 붕해제, 분산제, 계면활성제, 윤활제, 착색제, 희석제, 가용화제, 습윤제, 가소제, 안정화제, 침투 향상제, 습윤제, 소포제(anti-foaming agent), 항산화제, 보존제, 또는 하나 이상의 이의 조합을 포함한다.
여전히 다른 양태에서, 표준 코팅 과정, 예를 들면, 문헌: Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition (2000)에 기술된 과정을 사용하여, 필름 코팅을 조성물 주변에 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 입자(예를 들면, 캅셀제에 의한 투여용)으로 제형화되며 입자 중 일부 또는 모두는 코팅된다. 일부 구현예에서, 조성물은 입자(예를 들면, 캅셀제에 의한 투여용으로)로 제형화되며 입자 중 일부 또는 모두는 미세캡슐화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 입자(예를 들면 캅셀에 의한 투여용으로)로 제형화되며 입자 중 일부 또는 모두는 미세캡슐화되지 않고 코팅되지 않는다.
특정의 구현예에서, 본원에 제공된 조성물은 또한 미생물 활성을 억제는 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제는 수은 함유 물질, 예를 들면, 메르펜(merfen) 및 티오메르살(thiomersal); 안정화된 이산화염소; 및 4급 암모늄 화합물, 예를 들면, 벤즈알코늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 및 세틸피리디늄 클로라이드를 포함한다.
"소포제"는 수성 분산액의 응집, 최종 필름내 기포를 생성할 수 있는 공정 또는 일반적으로 손상 공정 동안 발포를 감소시킨다. 예시적인 소포제는 규소 에멀젼 또는 소르비탄 세스퀴올레이트를 포함한다.
"항산화제"는 예를 들면, 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 아스코르브산나트륨, 아스코르브산, 메타중황산나트륨 및 토코페롤을 포함한다. 특정의 구현예에서, 항산화제는 필요한 경우 화학적 안전성을 향상시킨다.
본원에 기술된 제형은 항산화제, 금속 킬레이팅제(metal chelating agent), 티올 함유 화합물 및 다른 일반적인 안정화제로부터 유리할 수 있다. 이러한 안정화제의 예는: (a) 약 0.5% 내지 약 2% w/v 글리세롤, (b) 약 0.1% 내지 약 1% w/v 메티오닌, (c) 약 0.1% 내지 약 2% w/v 모노티오글리세롤, (d) 약 1 mM 내지 약 10 mM EDTA, (e) 약 0.01% 내지 약 2% w/v 아스코르브산, (f) 0.003% 내지 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, (g) 0.001% 내지 약 0.05% w/v. 폴리소르베이트 20, (h) 아르기닌, (i) 헤파린, (j) 덱스트란 설페이트, (k) 사이클로덱스트린, (l) 펜토산 폴리설페이트 및 다른 헤파리노이드, (m) 2가 양이온, 예를 들면, 마그네슘 및 아연; 또는 (n) 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"결합제"는 점착 품질(cohesive quality)을 부여하며, 예컨대, 알긴산 및 이의 염; 셀룰로즈 유도체, 예를 들면, 카복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈(예컨대, Methocel®), 하이드록시프로필메틸셀룰로즈, 하이드록시에틸셀룰로즈, 하이드록시프로필셀룰로즈(예컨대, Klucel®), 에틸셀룰로즈(예컨대, Ethocel®), 및 미세결정성 셀룰로즈(예컨대, Avicel®); 미세결정성 덱스트로즈; 아밀로즈; 망간 알루미늄 실리케이트; 다당류 산; 벤토나이트; 젤라틴; 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체; 크로스포비돈; 포비돈; 전분; 예비젤라틴화된 전분; 트라가칸트, 덱스트린, 당, 예를 들면, 슈크로즈(예컨대, Dipac®), 글루코즈, 덱스트로즈, 몰라세스(molasses), 만니톨, 소르비톨, 크실리톨(예컨대, Xylitab®), 및 락토즈; 천연 또는 합성 검(gum), 예를 들면, 아카시아, 트라가칸트, 가티 검(ghatti gum), 이사폴 껍질의 점액(mucilage of isapol husks), 폴리비닐피롤리돈(예컨대, Polyvidone® CL, Kollidon® CL, Polyplasdone® XL-10), 라크 아라보갈락탄(larch arabogalactan), Veegum®, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스, 알긴산나트륨 등을 포함한다.
"담체" 또는 "담체 물질"은 약제학에서 임의의 일반적으로 사용된 부형제를 포함하며 본원에 개시된 화합물, 예를 들면, 이부루티닙 및 항암제의 화합물과의 적합성을, 및 목적한 투여량 형태의 방출 프로파일 특성을 기준으로 선택될 수 있다. 예시적인 담체 물질은 예컨대, 결합제, 현탁제, 붕해제, 충전제, 계면활성제, 가용화제, 안정화제, 윤활제, 습윤제, 희석제 등을 포함한다. "약제학적으로 허용되는 담체 물질"은 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 칼슘 글리세로포스페이트, 락트산칼슘, 말토덱스트린, 글리세린, 규산마그네슘, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 나트륨 카제이네이트, 대두 레시틴, 타우로콜산, 포스포티딜콜린, 염화나트륨, 인산삼칼슘, 인산이칼륨, 셀룰로즈 및 셀룰로즈 접합체(conjugate), 당 나트륨 스테아로일 락틸레이트, 카라기난(carrageenan), 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 예비젤라틴화된 전분 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 문헌: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)를 참고한다.
"분산제" 및/또는 "점도 조절제"는 액체 매질을 통하거나 과립화 방법 또는 배합 방법을 통해 약물의 확산 및 균질성을 제어하는 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 제제는 또한 코팅 또는 침식 매트릭스(eroding matrix)의 효능을 촉진시킨다. 예시적인 확산 촉진제/분산제는 예컨대, 친수성 중합체, 전해질, Tween® 60 또는 80, PEG, 폴리비닐피롤리돈(PVP; Plasdone®로서 상업적으로 공지됨), 및 탄수화물-기반 분산제, 예를 들면, 하이드록시프로필 셀룰로즈(예컨대, HPC, HPC-SL, 및 HPC-L), 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈(예컨대, HPMC K100, HPMC K4M, HPMC K15M, 및 HPMC K100M), 카복시메틸셀룰로즈 나트륨, 메틸셀룰로즈, 하이드록시에틸셀룰로즈, 하이드록시프로필셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 프탈레이트, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 아세테이트 스테아레이트(HPMCAS), 비결정성 셀룰로즈, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 트리에탄올아민, 폴리비닐 알코올(PVA), 비닐 피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S630), 에틸렌 옥사이드와 포름알데하이드와의 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페놀 중합체(또한 틸록사폴로 공지됨), 폴록사머(예컨대, Pluronics F68®, F88®, 및 F108®, 이는 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 블록 공중합체이다); 및 폴록사민(예컨대, Tetronic 908®, 또한 Poloxamine 908®로 공지되어 있으며, 이는 에틸렌디아민에 프로필렌 옥사이드와 에틸렌 옥사이드의 순차적인 첨가로부터 유도된 사기능성 블록 공중합체이다(뉴저지주 파시패니(Parsippany) 소재의 BASF Corporation)), 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S-630), 폴리에틸렌 글리콜(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜은 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400의 분자량을 가질 수 있다), 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 폴리소르베이트-80, 알긴산나트륨, 검, 예컨대, 검 트라가칸트 및 검 아카시아, 구아 검, 크산탄, 예를 들면, 크산탄 검, 당, 셀룰로직스(cellulosics), 예를 들면, 예컨대, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 폴리소르베이트-80, 알긴산나트륨, 폴리에톡실화된 소르비탄 모노라우레이트, 폴리에톡실화된 소르비탄 모노라우레이트, 포비돈, 카보머, 폴리비닐 알코올(PVA), 알기네이트, 키토산 및 이의 조합을 포함한다. 가소제, 예를 들면, 셀룰로즈 또는 트리에틸 셀룰로즈를 또한 분산제로서 사용할 수 있다. 분산제는 리포좀 분산액으로서 특히 유용하며 자가-유화되는 분산액은 디미리스토일 포스파티딜 콜린, 알(egg)로부터의 천연의 포스파티딜 글리세롤, 콜레스테롤 및 이소프로필 미리스테이트를 포함한다.
하나 이상의 부식 촉진제와 하나 이상의 확산 촉진제의 조합을 또한 본 조성물에서 사용할 수 있다.
용어 "희석제"는 전달 전에 목적한 화합물을 희석시키는데 사용된 화학적 화합물을 지칭한다. 희석제는 보다 안정한 환경을 제공할 수 있으므로 이는 또한 화합물을 안정화시키는데 사용될 수 있다. 완충된 용액 속에 용해된 염(이는 또한 pH 제어 또는 유지를 제공할 수 있다), 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 포스페이트 완충된 염수 용액을 당해 분야에서 희석제로서 이용한다. 특정의 구현예에서, 희석제는 캅셀 충전을 위해, 압착을 촉진시키거나 균질한 배합을 위한 충분한 부피를 생성시키기 위해 조성물의 부피를 증가시킨다. 이러한 화합물은 예컨대, 락토즈, 전분, 만니톨, 소르비톨, 덱스트로즈, 미세결정성 셀룰로즈, 예를 들면, Avicel®; 이염기성 인산칼슘, 인산이칼슘 이수화물; 인산삼칼슘, 인산칼슘; 무수 락토즈, 분무-건조된 락토즈; 예비젤라틴화된 전분, 압착가능한 당, 예를 들면, Di-Pac®(Amstar); 만니톨, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 아세테이트 스테아레이트, 당-기반 희석제, 제빵용 당(confectioner's sugar); 일염기성 황산칼슘 일수화물, 황산칼슘 이수화물; 락트산칼슘 삼수화물, 덱스트레이트; 가수분해된 곡물 고체, 아밀로즈; 분말화된 셀룰로즈, 탄산칼슘; 글리신; 카올린; 만니톨, 염화나트륨; 이노시톨, 벤토나이트 등을 포함한다.
"충전제"는 화합물, 예를 들면, 락토즈, 탄산칼슘, 인산칼슘, 이염기성 인산칼슘, 황산칼슘, 미세결정성 셀룰로즈, 셀룰로즈 분말, 덱스트로즈, 덱스트레이트, 전분, 예비젤라틴화된 전분, 슈크로즈, 크실리톨, 락티톨, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨, 폴리에틸렌 글리콜 등을 포함한다.
"윤활제" 및 "활주제(glidant)"는 물질의 부착 또는 마찰을 방지하거나, 감소시키거나 억제하는 화합물이다. 예시적인 윤활제는 예컨대, 스테아르산, 수산화칼슘, 활석, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 탄화수소, 예를 들면, 광 오일, 또는 수소화된 식물성 오일, 예를 들면, 수소화된 대두 오일(Sterotex®), 고급 지방산 및 이의 알칼리-금속 및 알칼리 토 금속 염, 예를 들면, 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 아연, 스테아르산, 스테아르산나트륨, 글리세롤, 활석, 왁스, Stearowet®, 붕산, 나트륨 벤조에이트, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 루이신, 폴리에틸렌 글리콜(예컨대, PEG-4000) 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 예를 들면, Carbowax™, 올레산나트륨, 나트륨 벤조에이트, 글리세릴 베헤네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 또는 나트륨 라우릴 설페이트, 콜로이드성 실리카, 예를 들면, Syloid™, Cab-O-Sil®, 전분, 예를 들면, 옥수수 전분, 실리콘 오일, 계면활성제 등을 포함한다.
"가소제"는 미세캡슐화 물질 또는 필름 코팅을 연화시켜 이들이 거의 취성이 되지 않도록 하는데 사용된 화합물이다. 적합한 가소제는 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들면, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350, 및 PEG 800, 스테아르산, 프로필렌 글리콜, 올레산, 트리에틸 셀룰로즈 및 트리아세틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 가소제는 또한 분산제 또는 습윤제로서 기능할 수 있다.
"가용화제"는 화합물, 예를 들면, 트리아세틴, 트리에틸시트레이트, 에틸 올레이트, 에틸 카프릴레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도쿠세이트, 비타민 E TPGS, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, N-하이드록시에틸피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필 사이클로덱스트린, 에탄올, n-부탄올, 이소프로필 알코올, 콜레스테롤, 담즙 염, 폴리에틸렌 글리콜 200 내지 600, 글리코푸롤, 트랜스쿠톨, 프로필렌 글리콜, 및 디메틸 이소소르바이드 등을 포함한다.
"안정화제"는 항산화제, 완충제, 산, 보존제 등과 같은 화합물을 포함한다.
"현탁제"는 화합물, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25, 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 비닐 피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S630), 폴리에틸렌 글리콜(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜은 약 300 내지 약 6000, 또는 약 3350 내지 약 4000, 또는 약 7000 내지 약 5400의 분자량을 가질 수 있다), 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈, 하이드록시메틸셀룰로즈 아세테이트 스테아레이트, 폴리소르베이트-80, 하이드록시에틸셀룰로즈, 나트륨 알기네이트, 검, 예를 들면, 예컨대, 검 트라가칸트 및 검 아카시아, 구아 검, 크산탄, 예를 들면, 크산탄 검, 당, 셀룰로직스, 예를 들면, 예컨대, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈, 하이드록시에틸셀룰로즈, 폴리소르베이트-80, 알긴산나트륨, 폴리에톡실화된 소르비탄 모노라우레이트, 폴리에톡실화된 소르비탄 모노라우레이트, 포비돈 등을 포함한다.
"계면활성제"는 화합물, 예를 들면, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도쿠세이트, Tween 60 또는 80, 트리아세틴, 비타민 E TPGS, 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리소르베이트, 폴락소머, 담즙염, 글리세릴 모노스테아레이트, 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 공중합체, 예컨대, Pluronic®(BASF) 등을 포함한다. 일부 다른 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세라이드 및 식물성 오일, 예컨대, 폴리옥시에틸렌(60) 수소화된 피마자 오일; 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 및 알킬페닐 에테르, 예컨대, 옥톡시놀 10, 옥톡시놀 40을 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는 물리적 안전성을 향상시키거나 다른 목적을 위해 포함될 수 있다.
"점도 향상제"는 예컨대, 메틸 셀룰로즈, 크산탄 검, 카복시메틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필 셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈 아세테이트 스테아레이트, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈 프탈레이트, 카보머, 폴리비닐 알코올, 알기네이트, 아카시아, 키토산 및 이의 조합을 포함한다.
"습윤제"는 화합물, 예를 들면, 올레산, 글리세릴 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 나트륨 도쿠세이트, 나트륨 올레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도쿠세이트, 트리아세틴, Tween 80, 비타민 E TPGS, 암모늄 염 등을 포함한다.
키트(KIT)/제조 제품
특정의 구현예에서, 본원에 기술된 하나 이상의 방법으로 사용하기 위한 키트 및 제조 제품이 본원에 개시되어 있다. 이러한 키트는 담체, 패기지, 또는 바이알(vial), 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 용기를 포함하고, 용기(들) 각각은 본원에 기술된 방법에 사용될 별도의 성분 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, 및 시험 튜브를 포함한다. 일 구현예에서, 용기는 다양한 물질, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성된다.
본원에 제공된 제조 제품은 패키징 물질(packaging material)을 함유한다. 약제학적 패키징 물질의 예는 블리스터 팩(blister pack), 병, 튜브, 백, 용기, 병, 및 선택된 제형에 적합하고 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 패키징 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
키트는 전형적으로 성분을 나열한 표지(label) 및/또는 사용 설명서, 및 사용 설명서가 들어있는 패키지 삽입물을 포함한다. 설명서 세트는 또한 전형적으로 포함될 것이다.
일부 구현예에서, 표지는 용기 위에 또는 이와 결합된다. 일 구현예에서, 표지는 표지를 형성하는 문자, 숫자 또는 다른 특징이 용기 자체로 부착되거나, 성형되거나 에칭(etching)되는 경우 용기 위에 존재하며; 표지가 용기를 또한 유지시키는 그롯(receptacle) 또는 담체 내에 존재하는 경우 이는 예를 들면, 패키지 삽입물로서 용기와 결합된다. 일 구현예에서, 표지는 내용물들이 특수한 치료학적 적용에 사용되도록 나타내는데 사용된다. 표지는 또한 본원에 기술된 방법에서와 같이, 내용물의 사용 지시사항을 나타낸다.
실시예
본 실시예는 설명 목적으로만 제공되며 본원에 제공된 청구범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
HBV 백신 설계를 위한 항원성 생물정보학 작업흐름도
본원에 제공된 HBV 백신 항원 설계를 생물정보학 분석 및 인 실리코 단백질 가공 방법의 사용을 통해 제공된 발명자가 선택한 조합 안내를 통해 고취된다. HBV 항원 서열을 유전형 D 단백질 서열, 항원성 예측 및 광범위한 포함(coverage)으로 맵핑(mapping)되는 T 세포 에피토프(epitope)를 기반으로 선택하였으며, 이는 MHC-I 결합 및 사이토킨 생산에 이은 T 세포 활성화를 초래할 수 있다. 본원에 제공된 HBV 백신 설계의 전체적인 작업흐름도는 도 5에 나타내며 하기에 추가로 설명한다.
컨센수스 서열의 수득
HBV 게놈은 수개의 오버래핑(overlapping) 바이러스 단백질, 예를 들면, 폴리머라제, 코어, 엔벨로프(envelope)(Pre-S1, S2, S), HBe, 및 HBx 단백질을 암호화한다(도 3a 내지 도 3d). 콘센수스 AA 서열을 A, C, 및 D 서브형에 대한 B형 간염 바이러스 데이타베이스(HBVdb)로부터 수득하였다.
결합 친화성의 예측
NetMHC 4.0을 각각의 컨센수스 서열에 적용하여 모든 주요 MHC-I 대립형질(HLA-A0101, HLA-A0201, HLA-A0301, HLA-A2402, HLA-A2601, HLA-B0702, HLA-B0801, HLA-B2705, HLA-B3901, HLA-B4001, HLA-B5801, 및 HLA-B1501)에 대한 결합 친화성을 예측하였다. NetMHC 4.0은 펩타이드 서열의 결합 친화성을 예측하기 위한 인공 신경 네트워크를 사용한다. 이러한 분석은 HBV 유전형 A, C, 및 D에 걸쳐 수행하였다. 역치(threshold)를 0.5%(강한 결합제) 및 2%(약한 결합제) 순위에서 임의로 확립하였다. 99.5%보다 더 큰 예측된 결합 친화성을 지닌 펩타이드는 강한 결합제로 분류하고 98%보다 더 큰 예측된 결합 친화성을을 지닌 펩타이드는 약한 결합제로 분류하였다. 펩타이드 서열 내에 각각의 AA의 위치를 추출하고 밀도 곡선을 생성하는데 사용하였다(도 9a). 이러한 밀도 곡선을 사용하여, 제1 및 제2 차수 미분(differential)을 계산하여 강한 및 약한 결합제에 대한 피크를 측정하였다(도 9b). 최종적으로, 이러한 위치의 통합을 사용하여 반응을 유발할 가능성이 있는 AA 서열을 추출하였다(도 9c).
실시예 2
HBV 분자 백신 설계
본원에 기술된 HBV 백신은 다음의 HBV 설계 1 내지 5 가공된 단백질(유전적 변형을 지닌 펩타이드)을 포함한다. 일단 설계가 끝나면, 각각의 설계에 대한 전체 서열을 NetMHC 예측에 적용하여 A, C, 및 D 유전형에 대한 항원성 및 포함을 평가하였다(실시예 1). 본원에 기술된 백신을 (a) 트렁케이트된 코어(truncated core), (b) 변형된 폴리머라제, 및 (c) 2개의 엔벨로프 도메인으로 구성된 독특한 거대 융합 단백질을 암호화하는, 현재 임상 시험에서 아데노바이러스-기반 면역치료학적 HBV 백신인, TG1050에 대해 비교하였다. TG1050의 코어 영역은 프레-코어(pre-core)를 결여하였으며 이의 폴리머라제는 4개의 점 돌연변이를 따라 3개의 분절로 분할되어 백신 작제물 안정성을 증진시켰다(Pol1, Plo2 및 Pol3; Δ AA 538-544 및 Δ AA 710-742 및 돌연변이 D689H, V769Y, T776Y, D777H). 2개의 선택된 엔벨로프 도메인을 도 5에 나타낸 바와 같이 폴리머라제 분절 사이 내로 삽입하였다. TG1050 폴리머라제, Env1 및 Env2 서열은 Genbank(Y07587.1)로부터 수득하였고, TG1050 코어 서열은 HBV DB(AB048701)로부터 수득하였다.
5개의 항원 설계(HBV 설계 1 내지 5) 및 대조군 항원을 합성하고 아데노벡터 작제를 위해 발현 플라스미드-pAdShuttles 내로 클로닝(cloning)하였다(도 6). 초기 항원 스크리닝은 일시적인 형질감염에서 시험관내 항원 발현, 시험관내 항원 가공 및 단핵구-기원한 수지 세포의 일시적인 형질감염 연구에서의 표시를 평가하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, HBV 설계 1 및 2를 클래이드(clade) D 컨센수스를 기반으로 설계하였다. 코어(8), 표면(8), 폴리머라제(8), HBx(6) 및 HBPS(2)로부터의 32개 HBV 펩타이드를 실험 및 기능 데이타, 예를 들면, 면역원성 데이타, 질량-스펙트럼(Mass-spec.) 등을 갖는 문헌으로부터 준비하였다(표 3). HBV 설계 3의 경우, 사람 안키린-유사 반복체(ALR) 단백질 스캐폴드(PDB 코드(code) 1QYM) 펩타이드를 나선 및 루프(loop) 영역에서 탄뎀(tandem) 방식으로 이식시켰다. 절단가능한 링커(VSQTSKLTR; 서열 번호:111)에 의해 연결된, 2개의 ALR 스캐폴드를 사용하였다. ALR 단백질은 일반적으로 고 발현 및 고 안정성을 갖는다. 따라서, ALR 단백질을 HBV 펩타이드에 대한 스캐폴드로서 사용하여 신규한 CTL을 생성하였다. HBV 설계 4 에피토프는 KK 링커에 의해 분리되었다(도 6).
HBV 설계 1
HBV D 유전형 단백질 서열(HBV DB: AB048701)을 당해 서열에서 사용하였다. 항원성 예측 분석(실시예 1) 및 HBV 단백질의 상동성 모델은 이러한 설계를 인도하였다. 단백질 항원의 상동성 모델과 함께 HBV 설계 1 및 TG1050의 비교는 도 10에 나타내며, 서열 비교는 도 15a 내지 도 15c에 나타낸다. 이러한 설계는 4개의 천연 HBV 항원: (1) 연장된 Env2/S 영역 165 내지 382번 AA; (2) 코어 영역 1 내지 151번 AA 및 프레-코어 영역; (3) HBx 영역 1 내지 154번 AA; 및 (4) 폴리머라제(339 내지 832번 AA), del 538 내지 544번, 710 내지 742번 AA을 함유하였다. TG1050 비교인자(comparator)는 폴리머라제에 융합된 제3의 엔벨로프 펩타이드를 지닌 2개의 HBV 항원을 가졌다.
이러한 설계는 폴리머라제의 엔벨로프, 코어, HBx 및 리버스 트랜스크립타제 도메인(reverse transcriptase domain)으로부터의 전체 단백질 도메인을 포함하였다. TG1050 비교인자는 트렁케이트된 코어 및 변형된 폴리머라제 도메인으로 융합된 엔벨로프 펩타이드를 가졌으나 임의의 HBx 서열에 의해 암호화되지 않았다.
상이한 HBV 도메인은 하나의 긴 개방 판독 프레임으로서 함께 균일하게 융합되었다. TG1050 비교인자는 트렁케이션(truncation) 뿐만 아니라 결실을 지닌 단지 2개의 도메인(코어 및 폴리머라제)를 가졌다. TG1050 비교인자는 폴리머라제 도메인 내에 엔벨로프 펩타이드의 무작위 삽입을 가졌다.
트렁케이션은 엔벨로프 단백질 및 폴리머라제 도메인 내에서 이루어졌다. 엔벨로프 단백질의 C 말단 영역만이 이러한 설계에 사용되었다. 리버스 트랜스크립타제의 C 말단 만이 포함되었다. 전체 RNaseH 도메인이 포함되었다. 트렁케이션은 ΔRT 활성 모티프(538 내지 544: 6개 aa) 및 ΔRNase H 모티프(710 내지 742번: 32개 aa) 내에서 리버스 트랜스크립타제 기능을 불활성화시키도록 이루어졌다.
HBV 설계 1 신규성: 전체적으로, HBV 설계 1은 TG1050과 비교하여 프레-코어 및 코어 영역 둘 다를 따라 연장된 Env2/S 영역을 가졌다. TG1050과는 달리, 이는 또한 HBx 도메인을 함유하였다. TG1050과 유사한 결실과 함께 N-말단 트렁케이트된 폴리머라제가 또한 사용되었다.
HBV 설계 2
본 설계는 모든 3개의 주요 단백질, 예를 들면, 코어, 표면 스플라이스 변이체, 및 도 11에 나타낸 바와 같은 HBx 펩타이드와 연결된 폴리머라제로 이루어졌다. 선택된 단백질 구성성분을 함께 융합시켜 하나의 긴 개방 판독 프레임을 제조하였다. 이러한 설계은 다음을 기반으로 하였다: (a) 기능성 유전학 데이타(HBVdb: AB048701); (b) T 세포 에피토프 예측(실시예 1); 및 (c) 도 12a 내지 도 12d에 나타낸 바와 같이 이용가능한 HBV 단백질 구조의 비교. TG1050 비교인자 및 HBV 설계 설계 1에 대해 비교하는 경우, 이러한 설계는 다음과 같은 추가의 및/또는 변형된 단백질 도메인을 갖는다: (a) 트렁케이트된 C 말단; (b) 표면 단백질의 스플라이스된 변이체(PreS1 및 PreS2, S); (c) 분할(split)된 Pol N- 및 C-말단 단편; 및 (d) 6개의 HBx 펩타이드. 단백질 도메인을 셔플링(shuffling)하여 임의의 HBV 감염성을 피하고, HBV 설계 2는 TG1050 비교인자 및 HBV 설계 1보다 상이한 차수 도해(ordering scheme)를 사용하였다.
HBV 설계 3
본 설계는 총 32개의 CTL 특이적인 에피토프를 기반으로 하였으며(표 3) 다음으로부터 선택하였다: (1) 다수의 면역학적 분석 및 면역단백질학을 기반으로 한 문헌 고찰; (2) IEDB; (3) NetMHC 4.0 에피토프 예측. 사람 안키린-유사 반복체 단백질(PDB 코드 1QYM)를 32개의 펩타이드가 이식된 스캐폴드로서 선택하여 반복체 영역을 대체하였다. 이러한 설계의 상동성 모델(도 13)을 생성하였으며, 이는 이식된 펩타이드를 지닌 안키린 스캐폴드는 전체적인 3차 구조를 보유할 수 있다는 것을 시사한다. 32개의 이식된 CTL 에피토프를 연결시키는 스캐폴드 골격 아미노산은 적절한 링커로서 제공될 수 있다.
HBV 설계 4
본 설계는 설계 3과 같이 코어, 표면, Pol, HBx 및 HBSP로부터의 동일한 32개의 CTL 에피토프로 구성되었다(표 3). 펩타이드를 스캐폴드 상에 이식하는 것 대신에 하전된(charged) 디펩타이드 KK 잔기 링커로 조립하였다.
[표 3]
Figure pct00004
HBV 설계 5
본 설계는 설계 1과 유사하며 융합 구성성분들 사이에 강직성(rigid) 링커 (EAAAK)2(서열 번호: 129)를 갖는다(서열 번호: 112 및 서열 번호: 113; 표 6; 도 16).
RNA qPCR 상대적인 발현 검정의 경우, 5'- TGCCAAGAGTGACGTGTCCA-3'(서열 번호: 110)를 스플라이스 프라이머로서 사용하였고 5'-CCCAGGTCCAACTGCAGCCGG-3'(서열 번호: 128)를 스플라이스 프로브로서 사용하였다. 각각의 항원에 대해 설계된 특이적인 프라이머를 역 프라이머로서 사용하였다(도 14). A549 세포를 지질형질감염(lipotransfection)시키고(표 4), HT1080 세포를 핵감염시켰다(표 5).
[표 4]
Figure pct00005
[표 5]
Figure pct00006
실시예 3
HBV 백신의 면역원성 시험
모든 항원을 다중-결실된 고릴라 아데노벡터 내에서 작제하고 실험용 연구 물질 뿐만 아니라 임상 연구용 GMP 제작으로 이동시킬 수 있는 프레-GMP 스톡(pre-GMP stock)을 생성하도록 생산하였다(도 6).
수지 세포 형질감염을 위한 최적의 플라스미드 농도를 측정한다. 만성 PHBV 환자로부터 T 세포를 활성화시키기 위한 상이한 항원 설계의 능력을 평가한다. HBV 감염된 환자에 대한 설계된 항원 설계의 면역원성을 평가한다. 생체내 시험 계획은 마우스 내에서 생체내 면역원성 연구(예컨대, 단일 투여 연구, 반복 투여 연구, 예를 들면, 실행가능성의 "집에서 증강(boost at home)", 투여 경로(IM 대 SC)), 및 만성 HBV 감염의 마우스 모델 및 궁극적으로 HCC를 수행하기 위한 것이다.
단핵구-기원한 수지 세포를 표준 프로토콜에 따라서 GM-CSF 및 IL-4를 사용하여 생성시켰다. 단핵구-기원한 수지 세포를 상이한 HBV 항원 작제물로 감염시키고 벡터와 함께 37℃에서 24시간 동안 항온처리하였다. 세포를 세척하고 10 ng/ml rhuTNF-α를 사용하여 밤새 성숙(maturing)시켰다. 세포 성숙은 유동 세포분석법(CD40, CD80, CD83, CD86, HLA-DR)으로 평가하였다. 사이토킨 생산은 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-12p40, 및 MCP1에 대해 평가하였다. 단핵구-유래된 수지 세포를 자가 T 세포와 함께 10일 동안 1:10의 비율로 동시-배양한다. 외인성 rhuIL-2(200U/ml), rhuIL-7 및 rHuIL-15(10 ng/ml)을 3일, 5일 및 7일째에 가한다. IFN-γ, TNF-α, CXCL-10, CXCL-9, IL-10, IL-6, IL-4, IL-5, IL-12p70, 및 MCP1에 대한 사이토킨 분비를 평가한다. T 세포에 대한 활성화 마커는 CD25, CD69, CD45RA, CD45RO, PD1, CTLA-4, TIGIT, 및 LAG3이다. 수지 세포 및 T 세포 활성화에 기반한 대부분의 면역원성을 사용한 항원 설계를 선택하고, HBV 감염된 환자 샘플에 대한 항원 설계의 면역원성을 평가한다.
구체적인 구현예의 앞서의 설명은 당해 분야의 기술 내에서의 지식을 적용함으로써 다른 것이 과도한 실험없이, 본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어나지 않고, 이러한 구체적인 구현예를 다양한 적용을 위해 용이하게 변형시키고/시키거나 조정할 수 있다는 본 발명의 일반적인 특성을 매우 충분히 나타낼 것이다. 따라서, 이러한 조정 및 변형은 본원에 나타낸 교시 및 안내를 기반으로 하여, 개시된 구현예의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원의 어법 또는 전문용어는 설명의 목적을 위한 것이며 한정할 목적이 아니므로, 본 명세서의 전문용어 또는 어법이 교시 및 안내의 측면에서 기술자에 의해 해석되어야 함이 이해되어야 한다.
본 발명의 다른 구현예는 본원에 개시된 본 발명의 명세서 및 실시의 고려로부터 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예로서 고려되며, 본 발명의 실제 영역 및 취지는 다음의 청구범위에 의해 나타내어지는 것으로 의도된다.
본 출원은 2018년 3월 6일자로 출원된 미국 가특허원 제62/639,354호에 대한 이익을 주장하며, 이는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
구현예
E1. 적어도 하나 이상의 면역 반응-유도성 B형 간염 바이러스(HBV) 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 비-천연적으로 발생하는 폴리뉴클레오타이드.
E2. E1의 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드가 HBV 코어 펩타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
E3. E2의 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 HBV 코어 펩타이드가 표 3에 나타낸 바와 같은 코어 펩타이드 서열 중 임의의 하나를 갖는 폴리뉴클레오타이드.
E4. E1 내지 E3 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드가 HBV 표면 펩타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
E5. E4의 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 HBV 표면 펩타이드가 표 3에 나타낸 바와 같은 표면 펩타이드 서열 중 어느 하나를 갖는 폴리뉴클레오타이드.
E6. E1 내지 E5 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드, 상기 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드가 HBV Pol 펩타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
E7. E6의 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 HBV Pol 펩타이드가 표 3에 나타낸 바와 같은 Pol 펩타이드 서열 중 임의의 하나를 갖는 폴리뉴클레오타이드.
E8. E1 내지 E7 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드가 HBV HBSP/HBx 펩타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
E9. E8의 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 HBV HBSP/HBx 펩타이드가 표 3에 나타낸 바와 같은 HBSP/HBx 펩타이드 서열 중 어느 하나를 갖는 폴리뉴클레오타이드.
E10. E1 내지 E9 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드가 KK 링커를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
E11. E10의 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 KK 링커가 표 3에 나타낸 바와 같은 임의의 다른 펩타이드 서열에 연결시키는 폴리뉴클레오타이드.
E12. E1 내지 E11 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 이종 유전자 발현의 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 시스템을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 츄가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 이종 유전자 발현은 상기 유전자 스위치 시스템에 의해 조절되고, 상기 이종 유전자는 E1 내지 E11 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
E13. E1 내지 E12 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 유전자 스위치 시스템이 엑다이손 수용체(ecdysone receptor)-기반(EcR-based) 유전자 스위치 시스템인 폴리뉴클레오타이드.
E14. E1 내지 E13 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드가 백신에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드.
E15. E1 내지 E14 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
E16. E15의 벡터로서, 상기 벡터가 아데노바이러스 벡터인 벡터(vector).
E17. E16의 벡터로서, 상기 아데노바이러스 벡터가 고릴라 아데노바이러스 벡터인 벡터.
E18. 세포 내에서 이종 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 이러한 방법이 상기 세포 내로 (i) 억제성(repressible) 또는 유도성 유전자 스위치(gene switch), 및 (ii) 이종 면역 반응-유도성 유전자를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 단계로서, 상기 이종 면역 반응-유도성 유전자의 발현이 상기 유전자 스위치에 의해 조절되고, 상기 이종 면역 반응-유도성 유전자가 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드 중 적어도 하나를 암호화하는 단계; 및 상기 세포를 상기 이종 면역 반응-유도성 유전자의 발현을 억제하거나 유도하기에 충분한 양의 화합물에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
E19. E18의 방법으로서, 상기 표적 세포가 포유동물 세포인 방법.
E20. E18 또는 E19의 방법으로서, 상기 유전자 스위치가 엑다이손 수용체(ecdysone receptor)(EcR), 편재된 수용체(ubiquitous receptor), 오르판 수용체(orphan receptor) 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 및 파메솔 수용체(famesol receptor) 중 적어도 하나로부터 유래된 리간드 결합 도메인을 포함하는 방법.
E21. 벡터로서, 상기 벡터가 적어도 하나의 HBV 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 벡터가 아데노바이러스 벡터인 벡터.
E22. 벡터로서, 상기 벡터가 적어도 하나의 HBV 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 벡터가 아데노바이러스 벡터이며, 상기 아데노바이러스 벡터가 고릴라 아데노바이러스 벡터인 벡터.
E23. 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 HBV HBx 도메인 및, HBV Pol 도메인, HBV 코어 도메인, HBV 프레-코어 도메인(pre-Core domain) 또는 HBV 표면 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E24. 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 프레-코어 도메인 및, HBV Pol 도메인, HBV HBx 도메인 또는 HBV 표면 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E25. E23 또는 E24의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 HBV HBx 도메인이 서열 번호: 98에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E26. E23 내지 E25 중 어느 하나의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 HBV Pol 도메인이 야생형 HBV Pol 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 결실을 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E27. E26의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 결실이 상기 야생형 HBV Pol 도메인의 결실된 부위를 포함하고, 상기 결실된 부위가 538 내지 544번 아미노산 또는 710번 내지 742번 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E28. E27의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 결실된 부위가 538 내지 544번 아미노산 및 710 내지 742번 아미노산 둘 다를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E29. E28의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 HBV Pol 도메인이 서열 번호: 99에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E30. E23 내지 E29 중 어느 하나의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 HBV 표면 도메인이 PreS1 도메인, PreS2 도메인 및 S 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E31. E30의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 HBV 표면 도메인이 HBV S 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E32. E30 또는 E31의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 HBV 표면 도메인이 서열 번호: 100에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E33. E24 내지 E32 중 어느 하나의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 HBV 코어 도메인을 추가로 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E34. E23 또는 E33의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 코어 부위를 포함하고, 상기 코어 부위가 상기 HBV 코어 도메인 및 상기 HBV 프레-코어 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E35. E34의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 코어 부위가 서열 번호: 101에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E36. E23 또는 E33의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 각각의 SHB(Env), HBeAg, HBx, 및 Pol 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E37. E36의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 SHB(Env), HBeAg, HBx, 및 Pol 도메인의 구조를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E38. E36 또는 E37의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 SHB(Env) 도메인이 서열 번호: 102에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E39. E36 또는 E37의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 HBeAg 도메인이 서열 번호: 103에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E40. E36 또는 E37의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 HBx 도메인이 서열 번호: 104에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E41. E36 또는 E37의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 Pol 도메인이 서열 번호: 105에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E42. E36 또는 E37의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 서열 번호: 106에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E43. 강직성(rigid) 링커를 추가로 포함하는, E36 또는 E37의 폴리펩타이드 작제물.
E44. E36 또는 E37의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호: 112에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E45. 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 하나 이상의 HBV HBx 링커 및, 코어 도메인, 표면 도메인 및 Pol 도메인 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 코어 도메인, 상기 표면 도메인 및 상기 Pol 도메인 중 하나는 상기 코어 도메인, 상기 표면 도메인 및 상기 Pol 도메인 중 다른 것에 상기 하나 이상의 HBx 링커에 의해 연결되어 있는 폴리펩타이드 작제물.
E46. E45의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 표면 도메인이 HBV PreS1 도메인, HBV PreS2 도메인 및 HBV S 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E47. E45 또는 E46의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 하나 이상의 HBV HBx 링커가 다중 HBV HBx 링커를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E48. E47의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 다중 HBV HBx 링커 중 적어도 2개가 아미노산 서열에 있어서 상이한 폴리펩타이드 작제물.
E49. E45 내지 E48 중 어느 하나의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 HBV HBx 링커가 표 3의 HBx-1, HBx-2, HBx-3, HBx-4, HBx-5 또는 HBx-6 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E50. E45 내지 E49 중 어느 하나의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 코어 도메인이 상기 표면 도메인에 인접한 폴리펩타이드 작제물.
E51. E50의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 표면 도메인이 PreS1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E52. E50 또는 E51의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 표면 도메인이 상기 코어 도메인에 상기 하나 이상의 HBx 링커 중 하나에 의해 연결되어 있는 폴리펩타이드 작제물.
E53. E45 내지 E52 중 어느 하나의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 Pol 도메인이 표면 도메인에 인접한 폴리펩타이드 작제물.
E54. E53의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 표면 도메인이 PreS1 도메인, PreS2 도메인 및 S 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E55. E54의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 표면 도메인이 상기 PreS1 도메인을 포함하고, 상기 Pol 도메인의 N-말단 부위가 상기 PreS1 도메인에 인접하고 있는 폴리펩타이드 작제물.
E56. E55의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 상기 Pol 도메인의 N-말단 부위가 상기 PreS1 도메인에 상기 하나 이상의 HBx 링커 중 하나에 의해 연결되어 있는 폴리펩타이드 작제물.
E57. E56의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 표면 도메인이 상기 PreS2 도메인을 포함하고, 상기 Pol 도메인의 N-말단 부위가 상기 PreS2 도메인에 인접하고 있는 폴리펩타이드 작제물.
E58. E57의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 상기 Pol 도메인의 N-말단 부위가 상기 PreS2 도메인에 상기 하나 이상의 HBx 링커 중 하나에 의해 연결되어 있는 폴리펩타이드 작제물.
E59. E58의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 표면 도메인이 상기 PreS2 도메인을 포함하고, 상기 Pol 도메인의 C-말단 부위가 상기 PreS2 도메인에 인접해 있는 폴리펩타이드 작제물.
E60. E59의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 Pol 도메인의 상기 C-말단 부위가 상기 PreS2 도메인에 상기 하나 이상의 HBx 링커 중 하나에 의해 연결되어 있는 폴리펩타이드 작제물.
E61. E60의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 표면 도메인이 상기 S 도메인을 포함하고, 상기 Pol 도메인의 C-말단 부위가 상기 S 도메인에 인접해 있는 폴리펩타이드 작제물.
E62. E61의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 Pol 도메인의 상기 C-말단 부위가 상기 S 도메인에 상기 하나 이상의 HBx 링커 중 어느 하나에 의해 연결되어 있는 폴리펩타이드 작제물.
E63. E45 내지 E62 중 어느 하나의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 서열 번호: 107에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E64. 안키린-유사 반복체 도메인 및 하나 이상의 HBV 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E65. E64의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 안키린-유사 반복체 단백질이 사람 안키린-유사 수용체 단백질인 폴리펩타이드 작제물.
E66. E64 또는 E65이 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드가 표 3의 아미노산 서열 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E67. E64 내지 E66 중 어느 하나의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드가 코어 펩타이드, 표면 펩타이드, Pol 펩타이드 및 HBSP/HBx 펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E68. E67의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드가 코어 펩타이드를 포함하고, 상기 코어 펩타이드가 표 3의 코어 아미노산 서열 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E69. E67의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드가 표면 펩타이드를 포함하고, 상기 표면 펩타이드가 표 3의 표면 아미노산 서열 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E70. E67의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드가 Pol 펩타이드를 포함하고, 상기 Pol 펩타이드가 표 3의 Pol 아미노산 서열 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E71. E67의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드가 HBSP/HBx 펩타이드를 포함하고, 상기 HBSP/HBx 펩타이드가 표 3의 HBSP/HBx 아미노산 서열 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E72. E65 내지 E71 중 어느 하나의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 서열 번호: 108에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E73. 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 표 3에 나타낸 바와 같은 적어도 2개의 HBV 아미노산 서열을 포함하고, 상기 적어도 2개의 HBV 아미노산 서열이 펩타이드 링커에 의해 연결되어 있으며, 상기 펩타이드 링커가 KK 링커인 폴리펩타이드 작제물.
E74. E73의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 적어도 2개의 HBV 아미노산 서열이 표 3에 나타낸 바와 같은 코어 펩타이드, 표면 펩타이드, Pol 펩타이드 및 HBSP/HBx 펩타이드 중 적어도 하나를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E75. E73 또는 E74의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 적어도 2개의 HBV 아미노산 서열이 표 3에 나타낸 바와 같은 각각의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
E76. E75의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 각각의 아미노산 서열이 상기 각각의 아미노산 서열의 다른 것에 상기 KK 링커에 의해 연결되어 있는 폴리펩타이드 작제물.
E77. E73 내지 E75 중 어느 하나의 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 서열 번호: 109에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
E78. 백신에서 사용하기 위한 E23 내지 E77 중 어느 하나의 폴리펩타이드 작제물.
E79. E25 내지 E78 중 어느 하나의 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
E80. E79의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
E81. E80의 벡터로서, 상기 벡터가 아데노바이러스 벡터인 벡터.
E82. E81의 벡터로서, 상기 아데노바이러스 벡터가 고릴라 아데노바이러스 벡터인 벡터.
서열
본원에 제공된 구현예에 포함된 특정 서열의 대표적인 목록이 본원에 제공된다(표 6).
[표 6]
Figure pct00007
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> INTREXON CORPORATION PRECIGEN, INC. BROUGH, DOUGLAS BOLINGER, CHERYL YARLAGADDA, RAMYA KURELLA, VINODHBABU PRABAKARAN, PONRAJ METENOU, SIMON DING, KUAN-FU <120> HEPATITIS B VACCINES AND USES OF THE SAME <130> 2584.161PC01 <150> US 62/639,354 <151> 2018-03-06 <160> 130 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adenovirus pIX fragment nucleotides <400> 1 agctctttgg tggcgagcgg cgcggcctct 30 <210> 2 <211> 439 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adenovirus DNA polymerase fragment nucleotides <400> 2 aacatcaata cctcaaagtc atggtcaggg acactttcgc cctcacccac acctccctcc 60 gcaaggcggc gcaggcctac gcgctgcccg tggagaaggg ctgttgcccc taccaggccg 120 tcaaccagtt ctacatgcta ggctcttacc gttcggacac ggacgggttt cccctccaag 180 agtactggaa agaccgcgaa gagttcgtcc tcaaccgcga gctgtggaaa aagaaggggg 240 aggataagta tgacatcatc cgcgagaccc tcgactactg cgcgctcgac gtccaggtca 300 ccgccgagct ggtgcacaag ctgcgcgagt cctacgcctc cttcgtcagg gactcggtgg 360 gcttgcaaga agcaagcttc aacgtcttcc agcggcccac catctcctcc aactcccatg 420 ccatcttcag gcagatcgc 439 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adenovirus penton base protein fragment nucleotides <400> 3 actgaggctg cggctaaggc tgaggtcgaa gcca 34 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adenovirus hexon protein fragment nucleotides <400> 4 ataggtgtgg atgccacaca ggcgggagat aaccctatat atgct 45 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adenovirus fiber protein fragment nucleotides <400> 5 gtagcaggcc ccctagctgt ggccaatggc 30 <210> 6 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adenovirus pIX nucleotides <400> 6 atgagcgaca ccggcaacag ctttgatgga agcatcttta gcccctatct gacagtgcgc 60 atgcctcact gggctggagt gcgtcagaat gtgatgggtt ccaacgtgga tggacgcccc 120 gttctgcctt caaattcgtc tacaatggcc tacgcgaccg tgggaggaac tccgctggac 180 gccgcgacct ccgccgccgc ctccgccgcc gccgcgaccg cgcgcagcat ggctacggac 240 ctttacagct ctttggtggc gagcggcgcg gcctctcgcg cgtctgctcg ggatgagaaa 300 ctgaccgctc tgctgcttaa actggaagac ttgacccggg agctgggtca actgacccag 360 caggtctcca gcttgcgtga gagcagcctt gcctccccc 399 <210> 7 <211> 3168 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adenovirus DNA polymerase nucleotides <400> 7 atggacagct ccaatgtgcg cgatgtcgtc atcaaactcc gcccgccgag cgccgagatc 60 tggacctgcg gctctcgcgg cgtggtggtc tgctccacca tcgccctcca ggagacagat 120 gctggcggcc agacaaccaa agtagaagac caccagccac acgggacccc aggcggggga 180 cttagattcc cgctgcgctt cctcgtcaga ggtcgccagg ttcacctcgt gcaagatata 240 caacccgtgc agcgctgcca gtactgcggt cgcttttaca aaagccagca cgagtgctcg 300 gcccgcagac gggacttcta ctttcaccac atcaacagcc aatcctccaa ctggtggcgg 360 gagatccagt tcttcccgat cggctctcat cctcgcacgg agcgcctctt tgtcacctac 420 gatgtagaga cctacacttg gatgggagcc tttggcaagc agctcgtgcc cttcatgctg 480 gtcatgaaac tggggggcga cgaggctctg gtcgccgccg cgcgcgacct cgcccgagag 540 ctcagatggg acccctggga gaaagacccc ctcaccttct actgcatcac ccccgaaaag 600 atggccgtgg ggcgacagtt cagaaccttc cgcgaccgcc tgcagaccct catggcccgc 660 gacctctggc gatccttcct ggcggccaac cctcacttgc aagactgggc cctggaggag 720 cacggcctgg aatcgcccga ggagctcacc tacgaggaac tcaaaaagct cccctccatc 780 aagggccagc cccgcttttt ggagctctac atcgtgggcc acaacataaa cggctttgac 840 gagatcgtcc tggccgccca ggtcatcaac aaccgctcct cggtcccagg gccctttcgc 900 atcaccagaa acttcatgcc tcgagcgggg aagatcctct tcaatgacct caccttctcc 960 ctgcccaacc cgcgctccaa aaagcgcacg gactacaccc tgtgggaaca gggcggctgc 1020 gatgacacag acttcaaaca tcaatacctc aaagtcatgg tcagggacac tttcgccctc 1080 acccacacct ccctccgcaa ggcggcgcag gcctacgcgc tgcccgtgga gaagggctgt 1140 tgcccctacc aggccgtcaa ccagttctac atgctaggct cttaccgttc ggacacggac 1200 gggtttcccc tccaagagta ctggaaagac cgcgaagagt tcgtcctcaa ccgcgagctg 1260 tggaaaaaga agggggagga taagtatgac atcatccgcg agaccctcga ctactgcgcg 1320 ctcgacgtcc aggtcaccgc cgagctggtg cacaagctgc gcgagtccta cgcctccttc 1380 gtcagggact cggtgggctt gcaagaagca agcttcaacg tcttccagcg gcccaccatc 1440 tcctccaact cccatgccat cttcaggcag atcgccttcc gcgccgagcg cccccagcgc 1500 accaacctcg ggcccaacat gctggccccc tcccacgagc tctatgacta cgtgcgcgcc 1560 agcatccgcg gggggcgctg ctaccccacc tacctcggca tcctcaggga acccctgtac 1620 gtgtatgaca tctgcggcat gtacgcctcc gcgctcaccc accccatgcc ctggggcccg 1680 cccctcaacc cctacgagcg cgcgctcgcc gcccgcgaat ggcagcgggc tctggacatg 1740 caagcttgca agatcgacta ctttgacccg cgcttgctcc ccggggtctt caccatcgac 1800 gcggaccccc caaacgagga ccagctggac cccctacccc ccttctgctc gcgcaagggc 1860 ggccgcctct gctggaccaa cgagcgcctg cgcggcgagg tcgccaccag cgtcgacatg 1920 gtcaccctgc acaaccgagg ctggagggtg cgcctaatcc cagacgagcg caccaccgtc 1980 ttccccgagt ggaagtgcgt ggcccgcgag tacgtgcaac tcaacatcgc ggccaaggag 2040 cgagccgacc gcgacaaaaa ccagaccctg cgctccatcg ccaagctgct ctccaacgcc 2100 ctctacgggt cgttcgccac caagcttgac aacaaaaaaa tagtgttttc tgaccagatg 2160 gacccaggta ccctcaaagg tatcacctcc ggacaggtga acatcaaatc ctcctcattt 2220 ttagaaactg acaacctgag cgctgaggtc atgcccgcct tcgagaggga atacttaccc 2280 cagcagctgg ccctcgcaga cagcgatgcg gaagagagtg aagatgaaag ggcgcccacc 2340 cccttttata cccccccgtc gggaaccccc ggtcacgtgt cctacaccta caagccaatc 2400 acttttctgg acgcggagga gggggacatg tgcctgcaca ccctggagaa ggtggacccg 2460 ctagtggaca acgaccgcta cccctcccac gtggcctcct tcgtcctggc ctggacgcgg 2520 gccttcgtct cagagtggtc agagtttctc tacgaggagg acagaggcac tccgctggaa 2580 gacaggcccc tgaagtcggt ctacggggac acggacagcc tcttcgtcac cgagaaggga 2640 caccgcctca tggagagccg aggtaagaaa cgcatcaaaa agcatggggg caacctggtt 2700 tttgaccctg accgcccgga gctcacttgg ctggtggaat gcgagacggt ctgcgcttcc 2760 tgcggcgcgg acgcctactc cccagagtcc gtgtttctcg ctcccaagct ctacgccctg 2820 aagagcctgc agtgcccctc gtgcggcgcc acctccaagg gaaagctccg cgccaagggg 2880 cacgccgccg agggtctcga ctacgagacc atggtcaaat gctacctggc cgacgcgcag 2940 ggcgaagagc ggcagcgatt cagcaccagc agaaccagcc tcaagcgcac cctggccagc 3000 gcccaacccg gagcgcaccc cttcaccgtg acccagacca ccctgacgag gaccctgcgc 3060 ccatggaagg acatgactct ggccccgctg gacgcccatc ggctggtgcc ctacagcgaa 3120 agccgcccca acccgcgaaa cgaggagatc tgctggatcg agatgccg 3168 <210> 8 <211> 1974 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adenovirus penton base protein nucleotides <400> 8 atgcggcgcg cggcgatgtt cgaggagggg cctcccccct cttacgagag cgcgatgggg 60 atttctcctg cggcgcccct gcagcctccc tacgtgcctc ctcggtacct gcaacctaca 120 ggggggagaa atagcatctg ttactctgag ctgcagcccc tgtacgatac caccagactg 180 tacctggtgg acaacaagtc cgcggacgtg gcctccctga actaccagaa cgaccacagc 240 gattttttga ccacggtgat ccaaaacaac gacttcaccc caaccgaggc cagcacccag 300 accataaacc tggataacag gtcgaactgg ggcggcgacc tgaagaccat cttgcacacc 360 aacatgccca acgtgaacga gttcatgttc accaactctt ttaaggcgcg ggtgatggtg 420 gcgcgcgagc agggggaggc gaagtacgag tgggtggact tcacgctgcc cgagggcaac 480 tactcagaga ccatgactct cgacctgatg aacaatgcga tcgtggaaca ctatctgaaa 540 gtgggcaggc agaacggggt gaaggaaagc gatatcgggg tcaagtttga caccagaaac 600 ttccgtctgg gctgggaccc cgtgaccggg ctggtcatgc cgggggtcta caccaacgag 660 gcctttcatc ccgacatagt gcttctgccc ggctgtgggg tggacttcac ccagagccgg 720 ctgagcaacc tgctgggcat tcgcaagcgg cagcctttcc aggagggttt caagatcacc 780 tatgaggatc tgaagggggg caacattccc gcgctccttg atctggacgc ctacgaggag 840 agcttgaaac ccgaggagag cgctggcgac agcggcgaga gtggcgagga gcaagccggc 900 ggcggtggcg gcgcgtcggt agaaaacgaa agtacgcccg cagtggcggc ggacgctgcg 960 gaggtcgagc cggaggccat gcagcaggac gcagaggagg gcgcacagga gggcgcgcag 1020 aaggacatga acgatgggga gatcagggga gacacattcg ccacccgggg cgaagaaaaa 1080 gaggcagagg cggcggcggc ggcgacggcg gaggccgaaa ccgaggttga ggcagaggca 1140 gagcccgaga ccgaagttat ggaagacatg aatgatggag aacgtagggg cgacacgttc 1200 gccacccggg gcgaagagaa ggcggcggag gcagaagccg cggctgagga ggcggctgcg 1260 gctgcggcca agactgaggc tgcggctaag gctgaggtcg aagccaatgt tgcggttgag 1320 gctcaggctg aggaggaggc ggcggctgaa gcagttaagg aaaaggccca ggcagagcag 1380 gaagagaaaa aacctgtcat tcaacctcta aaagaagata gcaaaaagcg cagttacaac 1440 gtcatcgagg gcagcacctt tacccagtac cgcagctggt acctggcgta caactacggc 1500 gacccggtca agggggtgcg ctcgtggacc ctgctctgca cgccggacgt cacctgcggc 1560 tccgagcaga tgtactggtc gctgccgaac atgatgcaag acccggtgac cttccgctcc 1620 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agtgggaaca agatgaacca 420 gctcaggcag caatagctga agatgaagaa gaacttgaag aagaacaagc tcaggacgaa 480 caggcgccca ctaagaaaac ccatgtatac gcccaggcac ctctttctgg tgaaaaaatt 540 actaaggatg gtttgcaaat aggtgtggat gccacacagg cgggagataa ccctatatat 600 gctgataaaa cattccaacc cgaacctcag ataggtgagt ctcagtggaa cgaggctgat 660 gccacagtag caggaggcag agtcttaaaa aagaccaccc ctatgagacc ttgctatgga 720 tcctatgcca aacctactaa tgccaatggc ggtcaaggga tcatggtggc caatgatcag 780 ggagcgcttg aatctaaagt tgagatgcaa tttttctcca ccacaacgtc tcttaatgta 840 agggaaggtg aaaacaatct tcagccaaaa gtagtgctat acagcgaaga tgttaacttg 900 gaatcccctg acactcattt gtcttacaaa cctaaaaagg atgacaccaa ctctaaaatc 960 atgttgggtc agcaagccat gcccaacaga cccaacctca ttgcttttag ggacaacttt 1020 attggactta tgtactacaa cagcacaggc aacatgggag tgctggcagg acaggcctcc 1080 cagctaaacg ctgtggtaga cttgcaagac agaaacacag agctgtcata ccaactgatg 1140 cttgattcca ttggagacag atcaagatac ttttccatgt ggaaccaggc agtggacagc 1200 tatgacccag atgtcagaat cattgaaaac catggggttg aagatgagct 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cctgggctcg 2100 ggttttgacc cctactttgt ctactcggga tccatcccct acctggatgg caccttctac 2160 ctcaaccaca cttttaagaa gatatccatc atgtatgact cctccgtcag ctggccgggc 2220 aatgaccgcc tgctcacccc caatgagttc gaggtcaagc gcgccgtgga cggcgagggc 2280 tacaacgtgg cccagtgcaa catgaccaag gactggttcc tggtgcagat gctggccaac 2340 tacaacatag gctaccaggg cttctacatc ccagagagct acaaggacag gatgtactcc 2400 ttcttcagaa atttccaacc catgagcagg caggtggtgg acgagaccaa atacaaggac 2460 tatcaggcca ttggcatcac tcaccagcac aacaactcgg gattcgtggg ctacctggct 2520 cccaccatgc gcgaggggca ggcctacccc gccaacttcc cctacccgtt gataggcaaa 2580 accgcggtcg acagcgtcac ccagaaaaag ttcctctgcg accgcaccct ctggcgcatc 2640 cccttctcta gcaacttcat gtccatgggt gcgctcacgg acctgggcca gaacctgctc 2700 tatgccaact ccgcccatgc gctggacatg acttttgagg tggaccccat ggacgagccc 2760 acccttctct atattgtgtt tgaagtgttc gacgtggtca gagtgcacca gccgcaccgc 2820 ggtgtcatcg agaccgtgta cctgcgcacg cccttctcgg ccggcaacgc caccacc 2877 <210> 10 <211> 1749 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adenovirus fiber protein nucleotides <400> 10 atgaaacgcg cgagatcgtc tgacgagacc ttcaaccccg tgtaccccta cgataccgag 60 atcgctccga cttctgtccc tttccttacc cctccctttg tgtcatccgc aggaatgcaa 120 gaaaatccag ctggggtgct gtccctgcac ttgtcagagc cccttaccac ccacaatggg 180 gccctgactc taaaaatggg gggcggcctg accctggaca aggaagggaa tctcacttcc 240 caaaacatca ccagtgtcga tccccctctc aaaaaaagca agaacaacat cagccttcag 300 accgccgcac ccctcgccgt cagctccggg gccctaacac tttttgccac tcccccccta 360 gcggtcagtg gtgacaacct tactgtgcag tctcaggccc ctctcacttt ggaagactca 420 aaactaactc tggccaccaa aggaccccta actgtgtccg aaggcaaact tgtcctagaa 480 acagaggctc ccctgcatgc aagtgacagc agcagcctgg gccttagcgt tacggcccca 540 cttagcatta acaatgacag cctaggacta gatctgcagg cacccattgt ctctcaaaat 600 ggaaaactgg ctctaaatgt agcaggcccc ctagctgtgg ccaatggcat taatgctttg 660 acagtaggca caggcaaagg tattggtcta aatgaaacca gcactcactt gcaagcaaag 720 ttggtcgccc ccctaggctt tgataccaat ggcaacatta agctaagcgt tgcaggaggc 780 atgagactaa ataatgacac acttatacta gatgtaaact acccatttga agctcaaggc 840 caactaagtc taagagtggg ccagggtccg ctgtatgtag attctagcag ccataacctg 900 accattagat gccttagagg attatacata acatcgtcta ataaccaaac cggtctagag 960 gccaacataa aactaacaaa aggccttgtc tatgatggaa atgccatagc agtcaatgtt 1020 ggtcaaggat tgcaatacag cactactgcc acatcggaag gtgtgtatcc tatacagtct 1080 aagataggtt tgggaatgga atatgatacc aacggagcca tgatgacaaa actaggctct 1140 ggactaagct ttgacaattc aggagccatt gtagtgggaa acaaaaatga tgacaggctt 1200 actctgtgga ctacaccaga cccatctcct aactgtagaa tttattctga aaaagatact 1260 aaactaacct tggtgctgac taagtgtggc agccaaatcc taggcacagt atctgccctt 1320 gctgtcagag gcagccttgc gcccatcact aatgcatcca gcatagtcca aatatttcta 1380 agatttgatg aaaatggact attgatgagc aactcatcgc tagacggtga ttactggaat 1440 tacagaaatg gggactccac taatagcaca ccatatacaa atgcagtagg ctttatgcct 1500 aatctagcag cctatcctaa aggtcaggct acagctgcaa aaagcagtat tgtaagccag 1560 gtatacatgg atggtgacac tactaaacct ataacactaa aaataaactt caatggcatt 1620 gatgaaacaa cagaaaatac ccctgttagt aaatattcca tgacattctc atggagctgg 1680 cccaccgcaa gctacatagg ccacactttt gcaacaaact cttttacttt ctcctacatc 1740 gcccaagaa 1749 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Adenovirus pIX protein fragment <400> 11 Ser Ser Leu Val Ala Ser Gly Ala Ala Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Adenovirus DNA polymerase fragment <400> 12 Lys His Gln Tyr Leu Lys Val Met Val Arg Asp Thr Phe Ala Leu Thr 1 5 10 15 His Thr Ser Leu Arg Lys Ala Ala Gln Ala Tyr Ala Leu Pro Val Glu 20 25 30 Lys Gly Cys Cys Pro Tyr Gln Ala Val Asn Gln Phe Tyr Met Leu Gly 35 40 45 Ser Tyr Arg Ser Asp Thr Asp Gly Phe Pro Leu Gln Glu Tyr Trp Lys 50 55 60 Asp Arg Glu Glu Phe Val Leu Asn Arg Glu Leu Trp Lys Lys Lys Gly 65 70 75 80 Glu Asp Lys Tyr Asp Ile Ile Arg Glu Thr Leu Asp Tyr Cys Ala Leu 85 90 95 Asp Val Gln Val Thr Ala Glu Leu Val His Lys Leu Arg Glu Ser Tyr 100 105 110 Ala Ser Phe Val Arg Asp Ser Val Gly Leu Gln Glu Ala Ser Phe Asn 115 120 125 Val Phe Gln Arg 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tcacacagga aacagctatg accatgatta 2100 cgccaagctg ggtcaagtct tccagtttaa gcagcagagc ggtcagtttc tcatcccgag 2160 cagacgcgcg agaggccgcg ccgctcgcca ccaaagagct gtaaaggtcc gtagccatgc 2220 tgcgcgcggt cgcggcggcg gcggaggcgg cggcggaggt cgcggcgtcc agcggagttc 2280 ctcccacggt cgcgtaggcc attgtagacg aatttgaagg cagaacgggg cgtccatcca 2340 cgttggaacc catcacattc tgacgcactc cagcccagtg aggcatgcgc actgtcagat 2400 aggggctaaa gatgcttcca tcaaagctgt tgccggtgtc gctcatggcg gcggctgttg 2460 caagacaaaa cagagagacc cttagacccc caatttatac acgccccacc cttctagcca 2520 cgcccacctt acccacctca atcggtatcc tcatcgctag acccaaactc ggccctggtg 2580 caggccagca ccagatggtc aggcctgcag gtacgtagcc gcaataaaat atctttattt 2640 tcattacatc tgtgtgttgg ttttttgtgt gaatccatag tactaacata cgctctccat 2700 caaaacaaaa cgaaacaaaa caaactagca aaataggctg tccccagtgc aagtccaggt 2760 gccagaacat ttctctatcc ataatgcagg ggtaccggaa ggaagagggg cggggtcgat 2820 cgaccccgcc cctcttcctt cgaaggaaga ggggcggggt ccaattgcgg agtactgtcc 2880 tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag 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aaagtcgccc ccccgaccga tgtcagcctg 5460 ggggacgagc tccacttaga cggcgaggac gtggcgatgg cgcatgccga cgcgctagac 5520 gatttcgatc tggacatgtt gggggacggg gattccccgg gtccgggatt taccccccac 5580 gactccgccc cctacggcgc tctggatatg gccgacttcg agtttgagca gatgtttacc 5640 gatgcccttg gaattgacga gtacggtggg gaattcgaga tgcctgtgga caggatcctg 5700 gaggcagagc ttgctgtgga acagaagagt gaccagggcg ttgagggtcc tgggggaacc 5760 gggggtagcg gcagcagccc aaatgaccct gtgactaaca tctgtcaggc agctgacaaa 5820 cagctattca cgcttgttga gtgggcgaag aggatcccac acttttcctc cttgcctctg 5880 gatgatcagg tcatattgct gcgggcaggc tggaatgaac tcctcattgc ctccttttca 5940 caccgatcca ttgatgttcg agatggcatc ctccttgcca caggtcttca cgtgcaccgc 6000 aactcagccc attcagcagg agtaggagcc atctttgatc gggtgctgac agagctagtg 6060 tccaaaatgc gtgacatgag gatggacaag acagagcttg gctgcctgag ggcaatcatt 6120 ctgtttaatc cagaggtgag gggtttgaaa tccgcccagg aagttgaact tctacgtgaa 6180 aaagtatatg ccgctttgga agaatatact agaacaacac atcccgatga accaggaaga 6240 tttgcaaaac ttttgcttcg tctgccttct 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Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg 275 280 285 Leu Ala Asp Glu Asp Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu 290 295 300 Gly Asn Leu Asn Val Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe 305 310 315 320 Thr Gly Leu Tyr Ser Ser Ser Val Pro Val Phe Asn Pro His Trp Lys 325 330 335 Thr Pro Ser Phe Pro Asn Ile His Leu His Gln Asp Ile Ile Lys Lys 340 345 350 Cys Glu Gln Phe Val Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu 355 360 365 Lys Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Phe Thr Lys Tyr Leu 370 375 380 Pro Leu Asp Lys Gly Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn 385 390 395 400 His Tyr Phe His Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly 405 410 415 Ile Leu Tyr Lys Arg Val Ser Thr His Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser 420 425 430 Pro Tyr Ser Trp Glu Gln Glu Leu Gln His Gly Ala Glu Ser Phe His 435 440 445 Gln Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ser Arg Pro Ser Val Gly Ser Ser Leu 450 455 460 Gln Ser Lys His Gln Gln Ser Arg Leu Gly Leu Gln Ser Gln Gln Gly 465 470 475 480 His Leu Ala Arg Arg Gln Gln Gly Arg 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Lys Phe Ala Val Pro Asn 690 695 700 Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Cys Trp Leu Ser 705 710 715 720 Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala 725 730 735 Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala 740 745 750 Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Ile Asn His Gln His Gly Thr Leu 755 760 765 Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu 770 775 780 Leu Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Trp Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro 785 790 795 800 Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro 805 810 815 Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Thr Val Asn Ala His Gln 820 825 830 Phe Leu Pro Lys Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro 835 840 845 Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Val Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg 850 855 860 Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu 865 870 875 880 Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile 885 890 895 Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr 900 905 910 Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro 915 920 925 Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe 930 935 940 Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser 945 950 955 960 Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val 965 970 975 Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr 980 985 990 Asn Thr Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Tyr Leu 995 1000 1005 Trp Val Tyr Ile Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu 1010 1015 1020 <210> 108 <211> 532 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV design 3 <400> 108 Met Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Ser Asp Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Ala 20 25 30 Asp Ala Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Asp Asn Met Glu Tyr 35 40 45 Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Pro Leu His Ala Ala Val Ser Ala Asp 50 55 60 Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Arg Asn Arg Ala Thr Asp Leu Gly 65 70 75 80 Gly Pro Asn Leu Asp Asn Ile Leu Met His Asp Ile Leu Arg Ser Phe 85 90 95 Ile Pro Leu Leu Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Ser Thr 100 105 110 Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Ser His Ala Asp Val Phe Leu 115 120 125 Gly Gly Pro Pro Val Cys Leu Asp Asp Leu Phe Leu Leu Thr Arg Ile 130 135 140 Leu Thr Ile Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Leu Thr 145 150 155 160 Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Gly Ala Asn Lys Trp Leu Ser 165 170 175 Leu Leu Val Pro Phe Val Asn Asn Arg Phe Leu Lys Gln Gln Tyr Met 180 185 190 Asn Leu Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Asp Leu 195 200 205 Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Ala Asn Arg Phe Leu Ser Lys Gln 210 215 220 Tyr Met Asp Leu Asp His Met Thr Val Ser Thr Lys Leu Cys Lys Ile 225 230 235 240 Pro Arg Asp Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Ile Val Arg 245 250 255 Leu Leu Asp Leu Glu Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Gln Thr 260 265 270 Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg 275 280 285 Ser Asp Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Ser Leu Leu Ala Ala Asp Ala 290 295 300 Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Asp Asn Met Lys Leu His Leu 305 310 315 320 Tyr Ser His Pro Ile Pro Leu His Ala Ala Val Ser Ala Asp Gly Leu 325 330 335 Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Arg Asn Arg Ala Thr Asp Leu Phe 340 345 350 Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Met His Asp Ser Leu Tyr Ala Asp 355 360 365 Ser Pro Ser Val Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val His Lys 370 375 380 Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser His Ala Asp Val Thr Leu Cys 385 390 395 400 Ile Pro His Val Ala Val Asp Asp Leu Leu Leu Leu Lys Ala Thr Leu 405 410 415 Cys Ile Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Gln Phe Leu 420 425 430 Pro Lys Val Leu His Lys Arg Gly Ala Asn Lys Ala Leu Met Pro Leu 435 440 445 Tyr Ala Cys Ile Asn Asn Arg Thr Val Asn Ala His Gln Phe Leu Pro 450 455 460 Lys Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Leu Pro Lys 465 470 475 480 Val Leu His Lys Arg Thr Leu Ala Asn Arg Val Leu His Lys Arg Thr 485 490 495 Leu Gly Leu Asp His Met Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Pro 500 505 510 Arg Asp Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Ile Val Arg Leu 515 520 525 Leu Asp Leu Glu 530 <210> 109 <211> 368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV design 4 <400> 109 Lys Lys Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Lys Lys Cys Trp 1 5 10 15 Gly Glu Leu Met Thr Leu Lys Lys Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 20 25 30 Ala Lys Lys Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Lys Lys 35 40 45 Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Lys Lys Asp Leu Leu 50 55 60 Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Trp Phe His Ile Ser Cys 65 70 75 80 Leu Thr Phe Lys Lys Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Lys Lys 85 90 95 Gly Gly Pro Asn Leu Asp Asn Ile Leu Lys Lys Leu Thr Thr Val Pro 100 105 110 Ala Ala Ser Leu Leu Ala Lys Lys Ile Leu Arg Ser Phe Ile Pro Leu 115 120 125 Leu Lys Lys Phe Leu Gly Gly Pro Pro Val Cys Leu Lys Lys Phe Leu 130 135 140 Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Lys Lys Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro 145 150 155 160 Phe Val Lys Lys Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Lys Lys 165 170 175 Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Lys Lys Phe Leu Lys Gln 180 185 190 Gln Tyr Met Asn Leu Lys Lys Phe Leu Ser Lys Gln Tyr Met Asp Leu 195 200 205 Lys Lys Thr Val Ser Thr Lys Leu Cys Lys Ile Lys Lys Gly Leu Ser 210 215 220 Arg Tyr Val Ala Arg Leu Lys Lys Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro 225 230 235 240 Ile Lys Lys Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Lys Lys Ser Leu 245 250 255 Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Lys Lys Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala 260 265 270 Cys Ile Lys Lys Leu Leu Leu Lys Ala Thr Leu Cys Ile Lys Lys Thr 275 280 285 Leu Cys Ile Pro His Val Ala Val Lys Lys Val Leu His Lys Arg Thr 290 295 300 Leu Gly Leu Lys Lys Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu Lys 305 310 315 320 Lys His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Lys Lys Gln Phe Leu 325 330 335 Pro Lys Val Leu His Lys Arg Lys Lys Thr Val Asn Ala His Gln Phe 340 345 350 Leu Pro Lys Lys Lys Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Lys Lys 355 360 365 <210> 110 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> splice primer <400> 110 Thr Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Cys Gly Thr Gly 1 5 10 15 Thr Cys Cys Ala 20 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleavable linker <400> 111 Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg 1 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV Peptides from Surface 1 <400> 112 Gly Gly Pro Asn Leu Asp Asn Ile Leu 1 5 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV Peptides from Surface 2 <400> 113 Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Ser Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV Peptides from Surface 3 <400> 114 Ile Leu Arg Ser Phe Ile Pro Leu Leu 1 5 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV Peptides from Surface 4 <400> 115 Phe Leu Gly Gly Pro Pro Val Cys Leu 1 5 <210> 116 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV Peptides from Surface 5 <400> 116 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV Peptides from Surface 6 <400> 117 Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val 1 5 <210> 118 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV Peptides from Surface 7 <400> 118 Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val 1 5 10 <210> 119 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV Peptides from Surface 8 <400> 119 Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val 1 5 10 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis B Spliced Protein 1 <400> 120 Leu Leu Leu Lys Ala Thr Leu Cys Ile 1 5 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis B Spliced Protein 2 <400> 121 Thr Leu Cys Ile Pro His Val Ala Val 1 5 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBx protein <400> 122 Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu 1 5 <210> 123 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBx protein <400> 123 Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu 1 5 10 <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBx protein <400> 124 His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met 1 5 10 <210> 125 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBx protein <400> 125 Gln Phe Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg 1 5 10 <210> 126 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBx protein <400> 126 Thr Val Asn Ala His Gln Phe Leu Pro Lys 1 5 10 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBx protein <400> 127 Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu 1 5 <210> 128 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> splice probe <400> 128 Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala 1 5 10 15 Gly Cys Cys Gly Gly 20 <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rigid Linker <400> 129 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 130 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin Linker <400> 130 agagctaaga gg 12

Claims (34)

  1. 하나 이상의 면역 반응-유도성(immune response-inducing) B형 간염 바이러스(HBV) 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 비-천연적으로 발생하는(non-naturally occurring) 폴리뉴클레오타이드(non-naturally occurring polynucleotide).
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드가 HBV 코어 펩타이드(Core peptide), HBV 표면 펩타이드(Surface peptide), HBV Pol 펩타이드, HBV HBSP/HBx 펩타이드, KK 링커, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제2항에 있어서,
    (i) 상기 HBV 코어 펩타이드가 표 3에 나타낸 바와 같은 코어 펩타이드 서열 중 임의의 하나를 가지거나,
    (ii) 상기 HBV 표면 펩타이드가 표 3에 나타낸 바와 같은 표면 펩타이드 서열 중 임의의 하나를 가지거나,
    (iii) 상기 HBV Pol 펩타이드가 표 3에 나타낸 바와 같은 the Pol 펩타이드 서열 중 임의의 하나를 가지거나,
    (iv) 상기 HBV HBSP/HBx 펩타이드가 표 3에 나타낸 바와 같은 HBSP/HBx 펩타이드 서열 중 임의의 하나를 가지거나,
    (v) 상기 KK 링커가 표 3에 나타낸 바와 같은 펩타이드 서열 중 임의의 하나를 표 3에 나타낸 바와 같은 임의의 다른 펩타이드 서열에 연결시키거나, 또는
    (vi) (i) 내지 (v)의 임의의 조합인 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 유전자 발현의 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 시스템을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 여기서 이종 유전자 발현이 상기 유전자 스위치 시스템에 의해 조절되며; 상기 이종 유전자가 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 유전자 스위치 시스템이 엑다이손 수용체(ecdysone receptor)-기반(EcR-based) 유전자 스위치 시스템인 폴리뉴클레오타이드.
  6. 세포 내에서 이종 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 이러한 방법이:
    (a) 상기 세포 내로
    (i) 억제성(repressible) 또는 유도성(inducible) 유전자 스위치(gene switch), 및
    (ii) 이종 면역 반응-유도성 유전자를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 단계로서, 상기 이종 면역 반응-유도성 유전자의 발현이 상기 유전자 스위치에 의해 조절되고, 상기 이종 면역 반응-유도성 유전자가 하나 이상의 HBV 폴리펩타이드 중 적어도 하나를 암호화하는 단계; 및
    (b) 상기 세포를 상기 이종 면역 반응-유도성 유전자의 발현을 억제하거나 유도하는데 충분한 양의 화합물에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유전자 스위치가 엑다이손 수용체(EcR), 편재하는 수용체(ubiquitous receptor), 오르판 수용체(orphan receptor) 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 및 파메솔 수용체(famesol receptor) 중 적어도 하나로부터 기원한 리간드 결합 도메인을 포함하는 방법.
  8. 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이:
    (a) HBV HBx 도메인 및, HBV Pol 도메인, HBV 코어 도메인, HBV 프레-코어 도메인(pre-Core domain) 또는 HBV 표면 도메인; 또는
    (b) 프레-코어 도메인 및, HBV Pol 도메인, HBV HBx 도메인 또는 HBV 표면 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
  9. 제8항에 있어서,
    (i) 상기 HBV HBx 도메인이 서열 번호: 98에 나타낸 바와 같은 서열을 갖거나;
    (ii) 상기 HBV Pol 도메인이 야생형 HBV Pol 도메인과 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 결실을 포함하거나;
    (iii) 상기 HBV 표면 도메인이 PreS1 도메인, PreS2 도메인 및 S 도메인 중 적어도 하나를 포함하거나; 또는
    (iv) 이의 임의의 조합인 폴리펩타이드 작제물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    (i) 상기 HBV Pol 도메인이 서열 번호: 99에 나타낸 바와 같은 서열을 갖거나,
    (ii) 상기 HBV 표면 도메인이 서열 번호: 100에 나타낸 바와 같은 서열을 갖거나,
    (ii) 상기 HBV 코어 도메인 및 상기 HBV 프레-코어 도메인("코어 부위")가 서열 번호: 101에 나타낸 바와 같은 서열을 갖거나, 또는
    (iv) 이의 임의의 조합인 폴리펩타이드 작제물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 각각의 SHB(Env), HBeAg, HBx, 및 Pol 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
  12. 제11항에 있어서,
    (i) 상기 SHB(Env) 도메인이 서열 번호: 102에 나타낸 바와 같은 서열을 갖거나,
    (ii) 상기 HBeAg 도메인이 서열 번호: 103에 나타낸 바와 같은 서열을 갖거나,
    (iii) 상기 HBx 도메인이 서열 번호: 104에 나타낸 바와 같은 서열을 갖거나, 또는
    (iv) 상기 Pol 도메인이 서열 번호: 105에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 서열 번호: 106에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 강직성 링커(rigd linker)를 추가로 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호: 112에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
  16. 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 하나 이상의 HBV HBx 링커 및, 코어 도메인, 표면 도메인 및 Pol 도메인 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 코어 도메인, 상기 표면 도메인 및 상기 Pol 도메인 중 하나는 상기 코어 도메인, 상기 표면 도메인 및 상기 Pol 도메인 중 다른 것에 상기 하나 이상의 HBx 링커에 의해 연결되어 있는 폴리펩타이드 작제물.
  17. 제16항에 있어서,
    (i) 상기 표면 도메인이 HBV PreS1 도메인, HBV PreS2 도메인 및 HBV S 도메인 중 적어도 하나를 포함하거나;
    (ii) 상기 하나 이상의 HBV HBx 링커가 표 3의 HBx-1, HBx-2, HBx-3, HBx-4, HBx-5 또는 HBx-6 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하거나; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii) 둘 다인 폴리펩타이드 작제물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 코어 도메인이 상기 표면 도메인에 인접해 있는 폴리펩타이드 작제물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면 도메인이 PreS1 도메인, PreS2 도메인, S 도메인, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 서열 번호: 107에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
  21. 안키린-유사 반복체 도메인(ankyrin-like repeat domain) 및 하나 이상의 HBV 펩타이드를 포함하는 펩타이드 작제물.
  22. 제21항에 있어서,
    (i) 상기 안키린-유사 반복체 단백질(ankyrin-like repeat protein)이 사람 안키린-유사 반복체 단백질이고,
    (ii) 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드가 표 3의 아미노산 서열 중 임의의 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 HBV 펩타이드가 코어 펩타이드, 표면 펩타이드, Pol 펩타이드 및 HBSP/HBx 펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
  24. 제23항에 있어서,
    (i) 상기 코어 펩타이드가 표 3의 코어 아미노산 서열 중 임의의 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖거나;
    (ii) 상기 표면 펩타이드가 표 3의 표면 아미노산 서열 중 임의의 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖거나;
    (iii) 상기 Pol 펩타이드가 표 3의 Pol 아미노산 서열 중 임의의 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖거나;
    (iv) 상기 HBSP/HBx 펩타이드가 표 3의 HBSP/HBx 아미노산 서열 중 임의의 하나에 나타낸 바와 같은 서열을 갖거나; 또는
    (v) 이의 임의의 조합인 폴리펩타이드 작제물.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 서열 번호: 108에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
  26. 폴리펩타이드 작제물로서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 표 3에 나타낸 바와 같은 적어도 2개의 HBV 아미노산 서열을 포함하고, 상기 적어도 2개의 HBV 아미노산 서열이 펩타이드 링커에 의해 연결되어 있으며, 상기 펩타이드 링커가 KK 링커인 폴리펩타이드 작제물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 적어도 2개의 HBV 아미노산 서열이 표 3에 나타낸 바와 같은 코어 펩타이드, 표면 펩타이드, Pol 펩타이드 및 HBSP/HBx 펩타이드 중 적어도 하나를 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 적어도 2개의 HBV 아미노산 서열이 표 3에 나타낸 바와 같은 각각의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 작제물.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 작제물이 서열 번호: 109에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩타이드 작제물.
  30. 제8항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  31. 제1항 내지 제5항 및 제30항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 벡터(vector).
  32. 제31항에 있어서, 상기 벡터가 아데노바이러스 벡터인 벡터.
  33. 제32항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터가 고릴라(gorilla) 아데노바이러스 벡터인 벡터.
  34. 백신에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 및 제30항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제8항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 작제물, 또는 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 벡터.
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