CN103534355A - 条件性表达蛋白质的载体 - Google Patents

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CN103534355A CN201280021577.XA CN201280021577A CN103534355A CN 103534355 A CN103534355 A CN 103534355A CN 201280021577 A CN201280021577 A CN 201280021577A CN 103534355 A CN103534355 A CN 103534355A
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B·库斯博特森
S·查达
W·E·佛格勒
F·哈兹
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Abstract

本发明涉及治疗领域。最特别地，本发明提供活化配体存在时在基因表达调节***控制下生成条件性表达一种或多种蛋白质的方法和用于动物体内治疗目的的用途。所述载体可提供用于治疗或预防疾病。

Description

条件性表达蛋白质的载体
对通过EFS-WEB电子提交的序列表的参照
与本申请一同提交的序列表电子版的全部内容(名称：SequenceListing.ascii.txt；大小：153,629字节；创建日期：2012年3月2日)通过引用纳入本文。
发明背景
技术领域
白介素-12(IL-12)是I型细胞因子家族的成员，其涉及作用于多种生物学过程，所述生物学过程包括但不限于保护性免疫反应和抑制肿瘤发生(Abdi等，2006；Adorini，1999；Adorini，2001；Adorini等，2002；Adorini等，1996；Akhtar等，2004；Akiyama等，2000；Al-Mohanna等，2002；Aliberti等，1996；Allavena等，1994；Alli和Khar，2004；Alzona等，1996；Amemiya等，2006；Araujo等，2001；Arulanandam等，1999；Athie等，2000；Athie-Morales等，2004；Bertagnolli等，1992；Bhardwaj等，1996；Biedermann等，2006；Brunda和Gately，1994；Buchanan等，1995；Romani等，1997；Rothe等，1996；Satoskar等，2000；Schopf等，1999；Thomas等，2000；Tsung等，1997；Wolf等，1994；Yuminamochi等，2007)。越来越多的证据提示IL-12可能是控制人类疾病(如癌症)的有希望的靶标。
虽然IL-12是有希望的癌症治疗剂(基于其对1型抗肿瘤NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞具有强效的支持活性(Trinchieri，2003))，但是已报道重组人IL-12(rhIL-12)在患者内具毒性(Atkins等，1997)，连同供临床应用的GMP级rhIL-12的有限来源使得基于IL-12的成功治疗方案受到阻碍。因此，基因治疗方案代表更安全、更可行的治疗选择似乎是合理的。事实上，在肿瘤内或肿瘤周围递送基于重组病毒(Sangro等，2004；Triozzi等，2005)或质粒的IL-12cDNA(Heinzerling等，2005)，或经IL-12基因改性的自体成纤维细胞(Kang等，2001)的第一期临床试验已被认为是安全且良好耐受的。
然而，目标临床反应在接受这些基因疗法的黑色素瘤患者或不同癌症患者中很少出现、不一致、短暂，并且大多数临床反应局限在治疗部位(Heinzerling等，2005；Kang等，2001；Sangro等，2004；Triozzi等，2005)。在疾病部分或完全缓解的情况中，注意到肿瘤浸润性淋巴细胞的频率增加(Heinzerling等，2005；Sangro等，2004)及循环肿瘤特异性CD8+T细胞的水平升高(Heinzerling等，2005)，所述发现与这些患者体内的抗原特异性T细胞的交叉激活增加相一致。
因为作为IL-12的天然但经调节来源的树突细胞(DC)能最佳交叉激活特异性T细胞(Berard等，2000)，所以最近有关基于DC的IL-12基因治疗在临床前优良功效的报道引起了高度关注(Satoh等，2002；Tatsumi等，2003；Yamanaka等，2002)。例如，研究显示在鼠模型中，肿瘤内(i.t.)注射经工程改造成产生IL-12p70的DC(通过重组腺病毒感染)引起显著改善的广泛反应性、肿瘤特异性CD8+T细胞库的交叉激活和肿瘤排斥(Tatsumi等，2003)。鉴于先前使用在基于CMV的启动子控制下编码mIL-12的重组腺病毒(rAd.cIL12，(Tatsumi等，2003))，经工程改造的DC生成IL-12是组成型的，因此就治疗结果而言，该细胞因子在肿瘤病灶内的早期免疫影响和在肿瘤引流***内的晚期免疫影响问题无法解决。因此，需要条件性表达IL-12的经工程改造DC，以达调节转基因表达水平和适时活化转基因的目的。本发明提供用于这些细胞的有希望的治疗结果。
考虑到与通过包含感兴趣核酸序列所编码蛋白质的载体组合物进行基因表达相关的问题，仍然需要用于直接注射或用于基于细胞治疗的经改善转移载体组合物。
***(EPO)通过控制骨髓中红系祖细胞的增生、分化和存活，在调节红细胞生成上具有关键作用。缺乏EPO蛋白导致贫血。采用重组人EPO(huEPO)的治疗对改善与慢性疾病相关贫血的处理有效且安全。尽管蛋白质治疗是成功的，但报道了多种不良反应。例如，患者可能变成EPO耐药性，还可能对该生物制剂有低反应性。此外，因化学治疗导致贫血的患者的临床实验观察表明rHuEPO蛋白增加致死性。因此，在该领域中仍需要避免当前现有递送方案缺点的治疗贫血的EPO递送方案。
多发性硬化症是一种炎性疾病，其中，脑和脊髓的轴突周围的脂肪髓鞘受损，导致脱髓鞘、形成疤痕以及广泛征候和症状。尽管已知许多该疾病过程涉及的机制，但其原因仍然未知。多发性硬化症仍然没有已知治愈法。治疗意图在发作后恢复功能，防止新发作和预防残疾(prevent disability)。多发性硬化症药物可能有不良反应或耐受性差，因此许多患者寻求替代性治疗，尽管缺乏科学实验的支持。
血管性水肿是真皮、皮下组织、黏膜和黏膜下组织的快速肿胀(水肿)。血管性水肿分为后天性或遗传性。后天性血管性水肿通常由过敏造成，且与其它过敏性症状和荨麻疹一起发生。这也可能是某些药物(特别是ACE抑制剂)的副作用。遗传性血管性水肿(HAE)以三种形式存在，所有形式皆由以常染色体显性形式遗传的基因突变造成。这些形式由潜在遗传异常区分。所有形式的HAE导致补体***的异常活化，且所有形式皆可造成身体其它部位(例如，消化道)的肿胀。如果HAE涉及咽部，则可造成威胁生命的窒息。
肺高血压是一种肺动脉(从心至肺的血管)的压力超过正常值的肺疾病。肺动脉性高血压(PAH)是一种表征为肺动脉压力和肺血管阻力增加的疾病。参见Harrison's Principles of Internal Medicine(《哈里森内科学原理》)，第15版，第1506-1507页(麦格劳-希尔公司(McGraw-Hill)，2001)。若不治疗，PAH“通常具有不良预后，最后导致右心室衰竭和死亡。”Ulrich,S.等，Swiss Med.Wkly137:73-82,73(2007)。
克罗恩(Crohn)氏病是一种胃肠道(GI)慢性炎性疾病，其由症状复发和缓解段定义，且随时间发展成狭窄、瘘管或脓肿并发症。在美国，克罗恩氏病影响大约一百万人，估计每年因IBD(炎性肠疾病)造成的直接花费有约$63亿美元，其中估计克罗恩氏病引起该数字中的$36亿花费。硫唑嘌呤(azathioprine)和6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)经常处方用于第一线治疗失败的，特别是依赖***性皮质类固醇或对其无反应的患者。大约40%接受硫唑嘌呤治疗的患者维持缓解1年。英利昔单抗(infliximab)和其它靶向肿瘤坏死因子(TNF)的单克隆抗体已显示诱导和维持克罗恩氏病患者缓解的功效，然而在大多数指导性和共识性文章中，认为英利昔单抗是将内腔疾病(luminal disease)患者移交给外科医师之前的最后药物手段。因此，仍然需要用于治疗IBD和克罗恩氏病的经改善治疗方法。
IL-10是由活化的Th2细胞、B细胞、角化细胞、单核细胞和巨噬细胞生成的细胞因子。IL-10抑制多种细胞因子的合成，包括由活化的巨噬细胞和辅助T细胞生成的IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF和GM-CSF。IL-10用于促进活化的人B细胞的生长和分化、抑制Th1反应以防止移植排斥和T细胞介导的自体免疫疾病。
IL-10(白介素-10)是一种强下调促炎细胞因子生成的免疫调节细胞因子，其参与调节肠道炎症。rhIL-10(重组人IL-10)的临床发展显示狭窄的治疗窗口和导致GI组织有限生物利用度的药物动力学特性。然而，若IL-10可通过体内细胞表达而局部增加，则全身不良反应可能不会发生。CF(囊肿性纤维化)是一种由CFTR(囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白)的基因缺陷造成的常染色体隐性疾病，该疾病会造成跨黏膜表面的上皮细胞的氯化物转运异常，因为CFTR蛋白的功能是作为跨越产生黏液、汗液、唾液、泪液和消化酶的细胞的膜的氯离子通道。氯离子的转运有助于控制水在组织中的移动，这是产生稀薄、自由流动的黏膜所必需的(正常量的黏膜是保护气道、消化***、生殖***和其它器官及组织内衬所必需的)。所述CFTR蛋白还调节其它通道的功能，例如将称作钠离子的正电粒子转运通过细胞膜的那些通道。这些通道是器官(例如肺和胰)维持正常功能所必需的。因此，CF影响外分泌腺体功能，导致黏膜聚集于肺、胰和其它器官。该黏膜阻塞除了造成胰酶不足和消化问题以外还会导致肺部感染和炎症。
大约30,000个美国人患有CF，此疾病是美国最常见的致寿命缩短遗传性疾病之一，每位CF患者的平均寿命为37岁。CF治疗中最一致的方面是维持生命质量和治疗由浓稠黏液和感染造成的肺部损伤。在囊肿性纤维化患者的CFTR基因中已经识别超过1,000个突变。大部分这些突变改变CFTR蛋白中的单一氨基酸或从所述CFTR基因中删除少量DNA。最常见的突变称为ΔF508，删除了CFTR蛋白中508位的一个氨基酸。所得的异常通道在形成之后快速分解，因此从未到达细胞膜以运输氯离子。CFTR基因中的致病性突变改变氯通道的产生、结构或稳定性。所有这些变化使通道无法正常行使功能，因而损害氯离子转运及水从细胞移入和移出。因此，在肺、胰和其它器官的通道内衬的细胞产生异常黏稠的黏液。该异常黏液阻塞气道和腺体，导致囊肿性纤维化的特征性征候和症状。最近，KalydecoTM已被美国食品药物管理局(FDA)核准作为靶向CF潜在病因(在所述CFTR基因中的G551D突变)的第一治疗。但是，KalydecoTM对治疗具有最常见CFTR突变的患者并不有效。因此，仍然需要经改善的CF治疗。
糖尿病(Diabetes mellitus，通常简称为diabetes)是代谢性疾病群，其中患者具有高血糖，因为其身体无法产生足够的胰岛素或因为细胞无法响应所生成的胰岛素。所述高血糖产生多尿(频繁排尿)、烦渴(渴感增加)和多食(饿感增加)的典型症状。代谢性综合症是多种医学疾病的组合，当这些医学疾病一同发生时增加发生心血管疾病和糖尿病的风险。在美国，每五个人中即有一人受该疾病影响，且流行率随年龄增加。一些研究显示，预计在美国的流行率为总人口的25%。因此，仍然需要改善的糖尿病治疗。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是有效的抗高血糖激素，其诱导胰岛素分泌的葡萄糖依赖性刺激，同时抑制胰高血糖素分泌。GEP-1似乎能恢复胰β细胞的葡萄糖敏感性，其机制可能涉及GLUT2和葡萄糖激酶的表达增加。还已知GLP-1抑制胰β细胞凋亡和刺激胰岛素分泌性β细胞的增殖和分化。此外，GLP-1抑制胃分泌和运动。这延缓和延长碳水化合物的吸收，并造成饱腹作用。
胰高血糖素样肽-2(GLP-2)由肠道内分泌L细胞和中枢神经***中的多种神经元产生。肠GLP-2在营养摄入后与GLP-1共分泌。若经外部给予，GLP-1产生多种作用，包括肠道生长、增进肠功能、减少骨降解和神经保护作用。
脂连蛋白(adiponectin)是调节多种代谢过程(包括葡萄糖调节和脂肪酸分解代谢)的蛋白质激素。脂连蛋白仅由脂肪组织(和怀孕时的胎盘)分泌至血流，其相较于许多激素在血浆中非常丰富。该激素水平和成人的体脂百分比成反比。
人瘦体素主要由白色脂肪组织中的脂肪细胞制造，循环瘦体素的水平与身体脂肪总量成正比。瘦体素作用于脑下视丘受体，其通过以下机制抑制食欲：(1)抵消神经肽Y(由肠和下视丘细胞分泌的强力摄食刺激剂)效应；(2)抵消***素(结合受体与THC相同的另一种强力摄食刺激剂)效应，和(3)促进食欲抑制剂α-MSH的合成。
发明内容
本发明提供一种重组载体，该载体在一个或多个启动子控制下编码具有一种或多种治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质。在一个实施方式中，所述一个或多个启动子是条件型启动子。在另一个实施方式中，所述一个或多个启动子是组成型启动子。在另一个实施方式中，所述载体是编码关闭启动子的蛋白质的腺病毒载体，所述启动子可通过提供可溶性小分子配体如二酰基肼(例如，RG-115819、RG-115830或RG-115932)得以条件性活化。
本发明还以供一种诱导、调节或增强哺乳动物的***(EPO)表达的方法，其中，所述方法包括：
(a)肌肉内给予所述哺乳动物腺相关病毒，
其中所述病毒包含编码EPO的多核苷酸；和
(b)给予活化剂配体，
其中所述腺相关病毒还包含基因开关，其中该基因开关包含与启动子操作性连接的至少一个转录因子序列，其中由所述至少一个转录因子序列编码的至少一个转录因子是配体依赖性转录因子，其中所述腺相关病毒还包含与该编码EPO的多核苷酸操作性连接的第二启动子，并且其中该第二启动子在给予活化剂配体之后由所述至少一种配体依赖性转录因子活化。
本发明还提供一种包含编码基因开关的多核苷酸的载体，其中，所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中，所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸操作性连接由所述配体依赖性转录因子活化的启动子，其中，所述一种或多种蛋白质选自C1酯酶抑制剂、激肽释放酶(kallikrein)抑制剂、舒缓激肽(bradykinin)B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素(leptin)和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
本发明还提供一种产生表达一种或多种蛋白质的细胞群的方法，其中，所述方法包括使用条件性表达一种或多种蛋白质的重组载体改造所述细胞，其中，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸连接由所述配体依赖性转录因子活化的启动子，其中所述一种或多种蛋白质选自C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
本发明还提供一种条件性表达一种或多种蛋白质的重组载体改造的细胞群，其中，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种选自C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的蛋白质的多核苷酸。
本发明还提供一种体外工程改造细胞，所述细胞包含编码基因开关的重组多核苷酸，其中，所述编码基因开关的多核苷酸包含：(1)至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码与启动子操作性连接的配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸连接由所述配体依赖性转录因子活化的启动子，其中所述一种或多种蛋白质选自C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
本发明还提供治疗哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括：
(a)给予体外工程改造以条件性表达一种或多种蛋白质的细胞群；和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；由此诱导所述一种或多种蛋白质的表达，其中所述一种或多种蛋白质选自C1酯酶抑制剂、激肽释放酶(kallikrein)抑制剂、舒缓激肽(bradykinin)B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素(leptin)和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
本发明还提供治疗哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括：
(a)给予所述哺乳动物条件性表达一种或多种蛋白质的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸操作性连接通过该配体依赖性转录因子活化的启动子，
其中，所述载体不包含在细胞内；和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；由此诱导所述一种或多种蛋白质的表达并治疗该疾病，
其中所述一种或多种蛋白质选自C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
本发明还提供治疗哺乳动物的多发性硬化症的方法，所述方法包括：
(a)给予所述哺乳动物条件性表达一种或多种蛋白质的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸操作性连接通过该配体依赖性转录因子活化的启动子，
其中，所述载体不包含在细胞内；和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；由此诱导所述一种或多种蛋白质的表达并治疗该疾病，
其中所述一种或多种蛋白质选自髓磷脂碱性蛋白(MBP)和干扰素-β(IFN-B)。
一种治疗哺乳动物炎性肠病或克罗恩氏病的方法，所述方法包括：
(a)给予所述哺乳动物条件性表达一种或多种蛋白质的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸操作性连接由所述配体依赖性转录因子活化的启动子，
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；由此诱导所述一种或多种蛋白质的表达并治疗该疾病，
其中所述一种或多种蛋白质之一是白介素-10(IL-10)。
附图详细说明
图1A和1B的折线图描述伴随活化剂配体的Ad-RTS-mIL12在C57B16小鼠中对侧黑素瘤(B16F0)肿瘤的效力。图1A描述在动物右侧经治疗的肿瘤体积。图1B描述在动物左侧经治疗的肿瘤体积。肿瘤尺寸以平均值±SE显示。
图2的折线图描述双侧带有黑素瘤肿瘤的小鼠响应Ad-RTS-mIL12和活化剂配体的体重变化。
图3的柱状图描述LLC和4T1细胞系中mIL12和mIFN的体外调节表达。
图4A和4B的折线图描述LLC和4T1细胞系中mIL12和mIFN的作用。
图5的柱状图描述IL12和IFNα在小鼠中的全身作用和瘤内作用。
图6的复合折线和柱状图描述IL12和IFNα的共表达增强4T1和LLC癌细胞中MHC I类的表达。
图7A、7B、7C和7D分别描述载体0034A、0034B、0034CB和0034D的载体图。0034A携带标准开关***元件。0034B携带经修饰的调控型启动子。
图8的折线图描述C3H/H小鼠在肌肉内(IM)给予AAV-HuEPO之后的生理学反应。
图9的复合折线图和柱状图显示经调节的HuEPO表达对C3H/H小鼠内血细胞比容的影响。
图10的复合折线图和柱状图显示经调节的HuEPO表达对Balb/c小鼠内血细胞比容的影响。
图11的复合折线图和柱状图显示经调节的HuEPO表达对单一IM注射AAV-HuEPO后血细胞比容的影响。
图12A和12B的折线图显示IM递送AAV-HuEPO之后血细胞比容的绝对变化。
图13的复合折线图和柱状图显示经调节的HuEPO表达随着活化剂配体剂量变化对血细胞比容的影响。
图14的复合折线图和柱状图显示3/4肾切除C3H/H小鼠中HuEPO表达对血细胞比容造成的影响。
图15的柱状图显示IM递送至Balb/c小鼠的RTS-HuEPO表达对血细胞比容的影响。
序列表描述
SEQ ID NO:1是在果蝇(Drosophila)中发现的蜕皮激素响应元件的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中发现的蜕皮激素响应元件的核酸序列。
SEQ ID NO:3是在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中发现的蜕皮激素响应元件的核酸序列。
SEQ ID NO:4是包含人IL-12编码序列:Ad-RTS-hIL-12(SP1-RheoIL-12)的腺病毒载体DNA序列。
SEQ ID NO:5是载体(Ad-RTS-mIL-12)的核酸序列。
SEQ ID NO:6是人***的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)蜕皮激素受体配体结合域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是信号肽序列、人***序列和终止密码子的核酸序列。SEQ ID NO:9是人髓磷脂碱性蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO:10是人C1酯酶抑制剂的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是艾卡拉肽(ecallantide)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是人***素合成酶2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是人***素合成酶1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是人***素合成酶2的核酸序列。
SEQ ID NO:15是人***素合成酶1的核酸序列。
SEQ ID NO:16是人干扰素β的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是人GLP-1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是人GLP-2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是人脂连蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是人瘦体素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是人CFTR的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是人IL-10的氨基酸序列。
发明详述
定义
除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它科学术语或专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用和理解目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解有显著差异。分子生物学术语和/或方法和/或方案的一般理解定义参见Rieger等，Glossary of Genetics:Classicaland Molecular(遗传学词汇：经典和分子)，第5版,纽约施普林格出版公司(Springer-Verlag),1991;Lewin,Genes V(基因V)，纽约的牛津大学出版社(OxfordUniversity Press),1994;Sambrook等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)(第3版，2001)和Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(新编分子生物学实验指南)(1994)。除非另有说明，涉及使用市售可得试剂盒和/或试剂的过程通常按生产商的指南和/或方案和/或参数适当进行。
本发明提供在一个或多个启动子控制下编码蛋白质的重组载体。在一个实施方式中，所述一个或多个启动子是条件型启动子。在另一个实施方式中，所述一个或多个启动子是组成型启动子。在另一个实施方式中，所述载体是编码关闭启动子的蛋白质的腺病毒载体，所述启动子可通过提供可溶性小分子配体如二酰基肼(例如，RG-115819、RG-115830或RG-115932)得以条件性活化。所述载体允许控制所述一种或多种蛋白质在细胞中的表达。
在一个实施方式中，所述一种或多种有免疫调节剂功能的蛋白质编码多核苷酸受所述基因开关启动子的控制，和所述有IL-12功能的蛋白质编码多核苷酸受组成型启动子的控制。在另一个实施方式中，有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质编码多核苷酸和有IL-12功能的蛋白质编码多核苷酸都受所述基因开关的多顺反子启动子控制。在另一个实施方式中，所述有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质编码多核苷酸受所述基因开关的启动子控制，且所述有IL-12功能的蛋白质编码多核苷酸受与所述基因开关启动子不同的条件型启动子控制。在另一个实施方式中，所述有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质编码多核苷酸的基因调节***和有IL-12功能的多核苷酸的基因调节***是正交的。在另一个实施方式中，编码各蛋白质的各多核苷酸的基因调节***是正交的。
在一个实施方式中，本发明也提供癌症治疗，例如但不限于黑色素瘤、胶质瘤、肾癌和***癌以及本文表1中列举的癌症。已在动物模型研究中证实IL-12基因治疗以重组cDNA载体施予时的抗肿瘤功效(Faure等，1998；Sangro等，2005)，以经基因改造的DC施予时的抗肿瘤功效甚至更高(Satoh等，2002；Svane等，1999；Tatsumi等，2003；Yamanaka等，2002)。然而，到目前为止，使用质粒或病毒载体的IL-12基因治疗的I期人临床试验无法在癌环境中实现持久、目标临床反应(Heinzerling等，2005；Kang等，2001；Sangro等，2004；Triozzi等，2005)，本文所述的基因治疗提供有希望的治疗方式。
在一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物中肿瘤的方法，该方法包括以下步骤：
(a)向肿瘤微环境(在肿瘤周边的区域)瘤内给予或***给予免疫细胞群、TSC群或本发明的载体(或其组合)，所述细胞群或载体经体外工程改造以条件性表达一种或多种有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质；和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的活化配体；
从而诱导有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质表达并治疗所述肿瘤。
在另一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的疾病或紊乱的方法，该方法包括以下步骤：
(a)给予所述哺乳动物经改造的细胞群，所述细胞群改造成条件性表达一种或多种有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质；和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的活化配体；
从而诱导有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质的表达从而治疗所述疾病或紊乱。
在另一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的疾病或紊乱的方法，该方法包括以下步骤：
(a)给予所述哺乳动物两个或多个经改造的细胞群，所述细胞群改造成条件性表达一种或多种有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质，其中每个经改造细胞群表达不同组的一种或多种治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)；和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；
从而诱导有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质表达并治疗所述疾病或紊乱。
在另一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的疾病或紊乱的方法，该方法包括以下步骤：
(a)给予所述哺乳动物经改造的细胞群，所述细胞群改造成条件性表达一种或多种有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质和有IL-12功能的蛋白质，其中至少一种有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)或IL-12功能的所述蛋白质受经配体活化的条件型启动子控制；和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的活化配体；
从而诱导有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质和/或有IL-12功能的蛋白质表达并治疗所述疾病或紊乱。
在另一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的疾病或紊乱的方法，该方法包括以下步骤：
(a)给予所述哺乳动物两个或多个经改造的细胞群，所述细胞群改造成条件性表达一种或多种有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质和有IL-12功能的蛋白质，其中每个经改造细胞群表达不同组的一种或多种有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质，其中至少一种有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)或IL-12功能的所述蛋白质受经配体活化的条件型启动子控制；和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；
从而诱导有治疗性蛋白质(例如免疫调节剂)功能的蛋白质和/或有IL-12功能的蛋白质表达并治疗所述疾病或紊乱。
在一个实施方式中，本发明提供一种条件性表达蛋白质的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述编码基因开关的多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸连接通过所述配体依赖性转录因子活化的启动子。
在一个实施方式中，本发明的载体条件性表达所述蛋白质。在另一个实施方式中，所述条件性表达一种或多种蛋白质的载体(例如，腺病毒载体)还包含编码信号肽的核酸序列。所述信号肽可经密码子优化。在其他实施方式中，所述载体还包含5’非翻译区(UTR)、3’调节区或所述两者，并且提高蛋白质表达和/或总体产量。
本发明还提供一种产生表达蛋白质的细胞群的方法，所述方法通过使用条件性表达蛋白质的重组载体改造(例如转染、电穿孔等)所述细胞，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸连接通过所述配体依赖性转录因子活化的启动子。
在一些实施方式中，本发明提供一种增加蛋白质表达的方法，所述方法包括生成条件性表达一种或多种蛋白质和一个或多个调节序列的载体，其中所述一个或多个调节序列提高所述蛋白质的表达。
本发明还提供表达蛋白质的细胞群，所述细胞群采用条件性表达所述蛋白质的重组载体改造(例如转染、电穿孔等)，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸连接通过所述配体依赖性转录因子活化的启动子。
在另一个实施方式中，本发明提供一种包含本发明的两种或多种细胞群的组合物，其中所述组合物中各细胞群表达的一种或多种蛋白质不同于所述组合物中其它细胞群所表达的一种或多种蛋白质。在一个实施方式中，所述组合物包含两种细胞群。在另一个实施方式中，所述组合物包含多于两种细胞群。在另一个实施方式中，所述组合物包含三种细胞群。在另一个实施方式中，所述组合物包含四种细胞群。
在另一个实施方式中，本发明提供一种包含载体的体外工程改造细胞，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸连接通过所述配体依赖性转录因子活化的启动子。
在另一个实施方式中，本发明提供一种包含两种或多种体外工程改造细胞群的组合物，其中所述组合物中的各体外工程改造细胞群包含载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸连接通过所述配体依赖性转录因子活化的启动子，且其中所述组合物中各体外工程改造细胞群表达的一种或多种蛋白质不同于所述组合物中其它体外工程改造细胞群所表达的一种或多种蛋白质。
在另一个实施方式中，本发明的载体和方法用于治疗糖尿病、代谢疾病、代谢紊乱和代谢综合症。在一个实施方式中，所述载体包含编码GLP-1、GLP-2、脂连蛋白或瘦体素或者GLP-1、GLP-2、脂连蛋白或瘦体素片段的多核苷酸序列。在另一个实施方式中，所述载体包含编码人GLP-1、GLP-2、脂连蛋白或瘦体素或者人GLP-1、GLP-2、脂连蛋白或瘦体素片段的多核苷酸序列。
在另一个实施方式中，本发明的载体和方法用于治疗炎性肠疾病(IBD)和/或克罗恩氏病。在一个实施方式中，所述载体包含编码IL-10或其片段的多核苷酸序列。在另一个实施方式中，所述载体包含编码人IL-10或其片段的多核苷酸序列。
在一个实施方式中，本发明包括含组成型、诱导型或组织特异性启动子的载体，所述启动子允许体内产生囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)以取代或补充所述缺陷型或突变型CFTR蛋白。因此，在一个实施方式中，本发明的载体和方法用于治疗CF(囊肿性纤维化)。在一个实施方式中，所述载体包含编码正常(非突变)CFTR或其功能性(生物活性/可离子转运)片段的多核苷酸序列。在另一个实施方式中，所述载体包含编码正常人CFTR(非突变型CFTR)或其功能性(生物活性/可离子转运)片段的多核苷酸序列。
本发明还提供一种包含本文所述细胞群的药物组合物，或一种适合直接注射无表达载体细胞群即直接注射的组合物。
本发明还提供用于条件性表达***合成酶的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码***素合成酶的多核苷酸。本发明还提供治疗肺高血压的方法，所述方法包括给予所述载体。
IL-12是细胞因子，能作为活化T和NK细胞的生长因子，增强NK/淋巴因子活化杀伤细胞的裂解活性，并且通过使外周血单核细胞(PBMC)休止来刺激IFN-γ生成。IL-12的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号NM_000882(人IL12A)；NM_002187(人IL12B)；NM_008351(小鼠IL12a)；NM_008352(小鼠IL12b)；NM_213588(鸡IL12A)；NM_213571(鸡IL12B)；NM_053390(大鼠IL12a)和NM_022611(大鼠IL12b)，这些序列通过引用纳入本文。
白介素12(IL-12)的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_000873(人IL12A)；NP_002178(人IL12B)；NP_032377(小鼠IL12a)；NP_032378(小鼠IL12b)；NP_998753(鸡IL12A)；NP_998736(鸡IL12B)；NP_445842(大鼠IL12a)；和NP_072133(大鼠IL12b)，这些序列通过引用纳入本文。
在一个实施方式中，所述IL-12基因是野生型小鼠IL-12序列。在另一个实施方式中，所述序列与野生型小鼠IL-12至少85%相同，例如与野生型小鼠IL-12至少90%、95%或99%相同。在另一个实施方式中，所述IL-12基因序列编码小鼠IL-12多肽。在另一个实施方式中，所述基因编码与野生型小鼠IL-12具有至少85%相同性的多肽，例如与野生型小鼠IL-12具有至少90%、95%或99%的相同性。
髓磷脂碱性蛋白(MBP)被视为一种对中枢神经***的神经髓鞘形成过程重要的蛋白质。由典型MBP基因编码的蛋白质是神经***中少突细胞和施旺(Schwann)细胞的髓鞘的主要成分。MBP相关转录物还存在于骨髓和免疫***中。MBP的氨基酸和多核苷酸序列已可获得，登录号NM_001025081和NP_001020252(人)和NM_001025245和NP_001020416(小鼠)。
在一个实施方式中，所述MBP是野生型人MBP序列。在另一个实施方式中，所述序列与野生型人MBP具有至少85%的相同性，例如与野生型人MBP具有至少90%、95%或99%的相同性。
C1酯酶抑制剂(C1-抑制剂，C1-inh)是属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)超家族的蛋白酶抑制剂。其主要功能是抑制补体***以防止自发性活化。C1酯酶抑制剂是急性期蛋白质，其在血液循环中的水平约为0.25g/L，在发炎期间该水平升高约两倍。C1酯酶抑制剂不可逆地结合且灭活补体经典途径的C1复合物中的C1r和C1s蛋白酶。凝集素途径的MBL复合物中的MASP-1和MASP-2蛋白酶也被灭活。C1酯酶抑制剂防止之后的补体成分C4和C2被C1和MBL蛋白水解切割。C1酯酶抑制剂还抑制纤维蛋白溶解、凝结和激肽途径的蛋白酶。C1酯酶抑制剂是血浆激肽释放素的抑制剂。人C1酯酶抑制剂的氨基酸序列参见GenBankADU87625.1，登录号GU727623.1。
在一个实施方式中，所述C1酯酶抑制剂是野生型人C1酯酶抑制剂序列。在另一个实施方式中，所述序列与野生型人C1酯酶抑制剂具有至少85%的相同性，例如与野生型人MBP具有至少90%、95%或99%的相同性。
艾卡拉肽(商品名Kalbitor，研究药物名称DX-88)是蛋白质激肽释放素的抑制剂，可用于治疗遗传性血管性水肿(HAE)和预防心胸手术中的失血。艾卡拉肽的氨基酸序列参见美国专利公开号2007/0213275，其通过引用全文纳入本文。
在一个实施方式中，所述艾卡拉肽是野生型人艾卡拉肽序列。在另一个实施方式中，所述序列与野生型人MBP具有至少85%的相同性，例如与野生型人艾卡拉肽具有至少90%、95%或99%的相同性。
在一个实施方式中，所述GLP-1是野生型人GLP-1序列。在另一个实施方式中，所述序列与野生型人GLP-1具有至少85%的相同性，例如与野生型人GLP-1具有至少90%、95%或99%的相同性。
在一个实施方式中，所述GLP-2是野生型人GLP-2序列。在另一个实施方式中，所述序列与野生型人GLP-2具有至少85%的相同性，例如与野生型人GLP-2具有至少90%、95%或99%的相同性。
在一个实施方式中，所述脂连蛋白是野生型人脂连蛋白序列。在另一个实施方式中，所述序列与野生型人脂连蛋白具有至少85%的相同性，例如与野生型人脂连蛋白具有至少90%、95%或99%的相同性。
在一个实施方式中，所述瘦体素是野生型人瘦体素序列。在另一个实施方式中，所述序列与野生型人瘦体素具有至少85%的相同性，例如与野生型人瘦体素具有至少90%、95%或99%的相同性。
在一个实施方式中，所述IL-10是野生型人IL-10序列。在另一个实施方式中，所述序列与野生型人IL-10具有至少85%的相同性，例如与野生型人IL-10具有至少90%、95%或99%的相同性。
用于本发明目的的术语“经分离”定义从其原始环境(天然存在的环境)移出的生物材料(细胞、核酸或蛋白)。例如，植物或动物中以天然状态存在的多核苷酸未经分离，然而与其天然存在的相邻核酸分开的相同多核苷酸视作“经分离”。
当用于生物材料时，术语“经纯化”不要求所述材料以显示绝对纯度、排除其它化合物存在的形式存在。这其实是相对性的定义。
“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”互换使用，并且指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或其采用单链形式或双链螺旋的任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯和硫酯。可以是双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。术语核酸分子且特别是DNA或RNA分子，仅仅指分子的一级和二级结构，不限于任何特定三级形式。因此，该术语包含特别是在线状或环状DNA分子(如限制性片段)、质粒、超螺旋DNA和染色体等中发现的双链DNA。当讨论特定双链DNA分子的结构时，本文可以按常规惯例描述序列，仅沿非转录的DNA链(即具有mRNA同源序列的链)以5'到3'方向给出序列。重组“DNA分子”是经过分子生物学操作的DNA分子。DNA包含但不限于cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成DNA和半合成DNA。
用于多核苷酸序列的术语“片段”指相对于参照核酸长度减少的核苷酸序列，在所述共有部分包含与参照核酸相同的核苷酸序列。就本发明而言，这种核酸片段可合适地包含在其作为组分的更大多核苷酸中。这种片段包含寡核苷酸或另外由其组成，所述寡核苷酸长度范围为至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000或更多个本发明所述核酸的连续核苷酸。
本文使用的“经分离的核酸片段”指单链或双链的RNA或DNA聚合物，可选包含合成、非天然或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的经分离核酸片段可包含一个或多个区段的cDNA、基因组DNA或合成DNA。
“基因”指包含编码功能分子的核苷酸的多核苷酸，所述功能分子包含只由转录生成的功能分子(例如生物活性RNA种类)或由转录和翻译生成的功能分子(例如多肽)。术语“基因”包含cDNA和基因组DNA核酸。“基因”也指表达特定RNA、蛋白或多肽的核酸片段，包含所述编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调节序列。“天然基因”指自然存在且具有自身调控序列的基因。“嵌合基因”指作为非天然基因的任何基因，包含未天然一起发现的调节和/或编码序列。因此，嵌合基因可能包含获自不同来源的调节序列和编码序列，或获自相同来源但是与天然发现方式不同排列的调节序列和编码序列。嵌合基因可能包含获自不同来源的编码序列和/或获自不同来源的调节序列。“内源基因”指在生物体基因组中天然定位的天然基因。“外源”基因或“异源”基因指在宿主生物体内未正常发现，但是通过基因转移引入宿主生物体的基因。外源基因能包含***到非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化过程引入到基因组的基因。例如，白介素12(IL-12)基因编码IL-12蛋白。IL-12是35-kD亚基(p35)和40-kD亚基(p40)通过二硫键连接产生全功能IL-12p70的异二聚体。所述IL-12基因编码p35和p40亚基。
“异源性DNA”指不是天然定位到所述细胞或细胞染色***点的DNA。异源性DNA可以包含对细胞外源的基因。
术语“基因组”包含染色体以及线粒体、叶绿体和病毒DNA或RNA。
当单链形式的核酸分子可在合适的温度和溶液离子强度条件下与其它核酸分子(如cDNA、基因组DNA或RNA)退火时，该核酸分子与所述其它核酸分子是“可杂交的”。杂交和洗涤条件熟知且示例于Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版，冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor,1989)，特别是其中的第11章和表11.1)。温度和离子强度条件确定了杂交的“严谨性”。
可调整严谨性条件以筛选中等相似的片段如来自亲缘关系较远生物体的同源序列，到高度相似的片段如使来自亲缘关系较近生物体的功能酶加倍的基因。对同源核酸的初级筛选而言，能使用对应Tm55°的低严谨性杂交条件，例如5XSSC、0.1%SDS、0.25%牛奶且没有甲酰胺；或30%甲酰胺、5X SSC、0.5%SDS。中等严谨性杂交条件对应更高Tm，例如40%甲酰胺，有5X或6X SSC。高严谨性杂交条件对应最高Tm，例如50%甲酰胺，有5X或6X SSC。
杂交需要包含互补序列的两个核酸，尽管根据所述杂交的严谨性，可以有碱基之间的错配。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基间的关系。例如，当涉及DNA时，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明也包含分离的核酸片段，所述片段与本文公开或使用的全部序列以及那些基本相似的核酸序列互补。
在本发明的一个实施方式中，多核苷酸通过采用包含Tm55℃杂交步骤的杂交条件和使用上述条件来检测。在其他实施方式中，Tm是60℃、63℃或65℃。
杂交后的洗涤也决定了严谨条件。一组条件使用一系列的洗涤，开始用6XSSC、0.5%SDS在室温洗涤15分钟(min)，然后用2X SSC、0.5%SDS于45℃重复洗涤30min，再用0.2X SSC、0.5%SDS于50℃重复洗涤两次，各30min。一组严谨条件使用更高的温度，其中洗涤同上，除了最后两次用0.2X SSC、0.5%SDS洗涤30min的温度升高到60℃。另一组高严谨条件在0.1X SSC，0.1%SDS中65℃进行最后两次洗涤。
另外，技术人员应认识到，本发明包含的基本相似序列也由其在严谨条件(0.1X SSC、0.1%SDS,65℃，并用2X SSC、0.1%SDS然后0.1X SSC、0.1%SDS洗涤)下与本文所示例序列杂交的能力定义。本发明的基本相似核酸片段是其DNA序列与本文所报道核酸片段的DNA序列至少约70%、80%、90%或95%相同的那些核酸片段。
杂交核酸的合适严谨性取决于核酸的长度和互补的程度，这是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间相似性或同源性的程度越高，有这些序列的核酸杂交体的Tm值越高。核酸杂交的相对稳定性(对应更高Tm)按下列顺序降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度多于100个核苷酸的杂交体，已经推导出计算Tm的方程(见Sambrook等，同上，9.50-0.51)。对更短核酸(如寡核苷酸)的杂交而言，错配的位置变得更加重要，且寡核苷酸的长度决定其特异性(见Sambrook等，同上，11.7-11.8)。
在本发明的一个实施方式中，通过使用杂交条件测定多核苷酸，所述条件包含在少于500mM盐和至少37℃的杂交步骤，以及在温度至少63℃的2X SSPE中的洗涤步骤。在另一个实施方式中，杂交条件包含用于杂交步骤的小于200mM盐和至少37℃。在另一个实施方式中，杂交条件包含用于杂交和洗涤步骤的2×SSPE和63℃。
在另一个实施方式中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选可杂交核酸的最短长度是至少约15个核苷酸；例如，至少约20个核苷酸；例如，至少约30个核苷酸。另外，技术人员会认识到，根据诸如探针长度等因素，必要时可以调整温度和洗液盐浓度。
术语“探针”指单链核酸分子，所述分子能与互补单链靶标核酸碱基配对以形成双链分子。
本文使用的术语“寡核苷酸”指与基因组DNA分子、cDNA分子、质粒DNA或mRNA分子可杂交的短核酸。寡核苷酸能用例如32P核苷酸或共价偶联标记如生物素的核苷酸来标记。标记的寡核苷酸能用作检测核酸出现的探针。寡核苷酸(二者之一或都可以被标记)能用作PCR引物以克隆全长或核酸片段，用于DNA测序，或检测核酸的出现。寡核苷酸也能用于与DNA分子形成三螺旋。通常，寡核苷酸优选在核酸合成器上合成制备。因此，寡核苷酸能用非天然产生的磷酸酯类似物键例如硫酯键等制备。
“引物”指寡核苷酸，所述寡核苷酸与靶标核酸序列杂交以生成能用作合适条件下DNA合成起始点的双链核酸区。这种引物可用于聚合酶链反应或DNA测序。
“聚合酶链反应”缩写为PCR，指酶促扩增特异核酸序列的体外方法。PCR涉及重复系列的温度循环，每个循环包含三个阶段：变性模板核酸以分离靶标分子的链，退火单链PCR寡核苷酸引物到模板核酸，和通过DNA聚合酶延伸退火引物。PCR提供检测靶标分子出现的方法，并且在定量或半定量条件下，测定核酸的起始库中靶标分子的相对量。
“逆转录聚合酶链反应”缩写为RT-PCR且指一种体外方法，所述方法用于酶促生成靶标cDNA分子或来自一个或多个RNA分子的分子，然后如上述酶促扩增一个或多个靶标cDNA分子内的一种或多种特异核酸序列。RT-PCR还提供检测靶标分子出现的方法，并且在定量或半定量条件下，测定核酸的起始库中靶标分子的相对量。
DNA“编码序列”或“编码区”指某一双链DNA序列，所述序列当置于合适调节序列控制下时在细胞中、离体、体外或体内编码多肽并且能被转录和翻译成多肽。“合适的调控序列”指位于编码序列上游(5’非编码序列)、之内或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可包含启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎环结构。编码序列的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于，原核序列、来自mRNA的cDNA、基因组DNA序列和甚至合成DNA序列。如果所述编码序列意在用于真核细胞中的表达，聚腺苷酸化信号和转录终止序列常位于该编码序列的3’。
“开放阅读框”缩写为ORF，指包含翻译起始信号或起始密码子如ATG或AUG和终止密码子并且能潜在翻译成多肽序列的某一核酸序列(DNA、cDNA或RNA)长度。
本文使用术语“头对头”描述彼此相关的两个多核苷酸序列的方向。当一个多核苷酸的编码链的5’末端毗邻另一多核苷酸的编码链的5’末端时，两个多核苷酸以头对头方向放置，其中每个多核苷酸的转录方向以远离另一多核苷酸的5’末端进行。术语“头对头”可以缩写为(5’)-(5’)，并且也可以由符号(←→)或(3’←5’5’→3’)表示。
本文使用术语“尾对尾”描述彼此相关的两个多核苷酸序列的方向。当一个多核苷酸的编码链的3’末端毗邻另一多核苷酸的编码链的3’末端时，两个多核苷酸以尾对尾方向放置，其中每个多核苷酸的转录方向朝着另一多核苷酸进行。术语“尾对尾”可以缩写为(3’)-(3’)，并且也可以由符号(→←)或(3’→3’5’←3’)表示。
本文使用术语“头对尾”描述彼此相关的两个多核苷酸序列的方向。当一个多核苷酸的编码链的5’末端毗邻另一多核苷酸的编码链的3’末端时，两个多核苷酸以头对尾方向放置，其中每个多核苷酸的转录方向以与另一多核苷酸相同的方向进行。术语“头对尾”可以缩写为(5’)-(3’)，并且也可以由符号(→→)或(5’→3’5’←3’)指示。
术语“下游”指位于参照核苷酸序列3’的核苷酸序列。特别地，下游核苷酸序列通常指转录起始点后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始点的下游。
术语“上游”指位于参照核苷酸序列5’的核苷酸序列。特别地，上游核苷酸序列通常涉及位于编码序列或转录起始点的5’侧的序列。例如，大部分启动子位于转录起始点的上游。
术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”可互换使用，指在双链DNA内结合和剪切特异核苷酸序列的酶。
“同源重组”指将外源DNA序列***另一个DNA分子中，例如将载体***染色体中。优选地，所述载体靶向用于同源重组的特定染色***点。对特异性同源重组而言，所述载体会包含足够长的与染色体序列同源区域以使载体与染色体互补结合并纳入其中。更长的同源区域和更高的序列相似性程度可以增加同源重组的效率。
本领域已知的数个方法可以用于根据本发明扩增多核苷酸。一旦建立合适宿主***和生长条件，重组表达载体能大量扩增和制备。本文所述能使用的表达载体包括但不限于下列载体或其衍生物：人或动物病毒例如疫苗病毒或腺病毒；昆虫病毒例如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如λ)，和质粒及粘粒DNA载体等等。
“载体”指用于克隆和/或转移核酸到宿主细胞的任何载剂。载体可以是连接另一DNA区段的复制子，以实现所连接区段的复制。“复制子”指用作体内DNA自主复制单位的任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)，即能够在其自身控制下进行复制。术语“载体”包含体外、离体或体内引入核酸到细胞的病毒和非病毒载剂。可使用本领域已知的大量载体来操纵核酸，将响应元件和启动子纳入基因等。可能的载体包括例如：质粒和修饰的病毒，包括例如噬菌体如λ衍生物，或质粒如pBR322或pUC质粒衍生物，或Bluescript载体。本发明所用载体的另一个示例是如WO2007/038276和US2004/185556所述的UltraVectorTM生成***(弗吉尼亚州布莱克斯堡(Blacksburg)的英创松公司(Intrexon))。例如，将对应响应元件和启动子的DNA片段***到合适载体能通过连接合适DNA片段到有互补粘性末端的选定载体来完成。或者，DNA分子的末端可经酶学修饰或可以是通过连接核苷酸序列(接头)到该DNA末端而产生的任何位点。这种载体可以工程改造成包含选择标记基因，能选择已整合标记到细胞基因组内的细胞。这种标记能鉴定和/或选择整合并表达标记所编码蛋白的宿主细胞。
病毒载体(特别是逆转录病毒载体)已被用于多种细胞和活体动物对象中的各种基因递送应用。能使用的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、腺相关病毒、痘病毒、杆状病毒、疫苗病毒、单纯疱疹病毒、EB(Epstein-Barr)病毒、腺病毒、双生病毒(geminivirus)和花椰菜花叶病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电脂质(细胞转染素)、DNA-蛋白质复合物和生物聚合物。除了核酸之外，载体还可包含一个或多个调控区和/或用于选择、测量和监测核酸转移结果(转移到哪个组织、表达持续时间等)的选择标记物。
术语“质粒”指通常载有不是细胞中心代谢部分的基因的染色体外元件，且通常呈环状双链DNA分子的形式。这些元件可以是自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性、环状或超螺旋的单链或双链DNA或RNA，源自任何来源，其中大量核苷酸序列已连接或重组入能够将选定基因产物的启动子片段和DNA序列与合适的3’未翻译序列引入细胞的独特结构。
“克隆载体”指“复制子”，是顺序复制和包含复制起点的单位长度的核酸(优选DNA)例如质粒、噬菌体或粘粒，其可以连接另一个核酸区段，从而产生所述连接区段的复制。克隆载体能在一种细胞类型中复制并且在另一种中表达(“穿梭载体”)。克隆载体可以包含能用于细胞选择的一个或多个序列，所述细胞包含所述载体和/或一个或多个***感兴趣序列的多克隆位点。
术语“表达载体”指设计成能表达所***核酸序列的载体、质粒或载剂。克隆基因如***的核酸序列，通常置于对照元件(如启动子、最小启动子、增强子等)的控制下。用于驱动所需宿主细胞中核酸表达的起始控制区或启动子众多，并且为本领域技术人员熟悉。能驱动这些基因表达的几乎任何启动子可用于表达载体，包括但不限于病毒启动子、细菌启动子、动物启动子、哺乳动物启动子、合成启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、发病或疾病相关启动子、发育特异性启动子、诱导型启动子、光调节启动子；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、碱性磷酸酶启动子(用于酵母(Saccharomyces)中的表达)；AOX1启动子(用于毕赤酵母(Pichia)中的表达)；β-内酰胺酶、lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc启动子(用于大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达)；光调节、种子特异性、花粉特异性、卵巢特异性、花椰菜花叶病毒35S、CMV35S最小、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)、叶绿素a/b结合蛋白、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶、苗特异性、根特异性、壳多糖酶、应激诱导型、水稻东格鲁杆状病毒、植物超启动子、马铃薯亮氨酸氨基肽酶、硝酸还原酶、甘露碱合酶、胆脂碱合酶、泛素、玉米醇溶蛋白和花色苷启动子(用于植物细胞中的表达)；本领域已知的动物和哺乳动物启动子，包括但不限于SV40早期(SV40e)启动子区、劳斯肉瘤病毒(RSV)的3’长末端重复序列(LTR)所包含的启动子、E1A的启动子或腺病毒(Ad)的主要晚期启动子(MLP)基因、巨细胞病毒(CMV)早期启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)启动子、杆状病毒IE1启动子、延伸因子1α(EF1)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、泛素(Ubc)启动子、白蛋白启动子、小鼠金属硫蛋白-L启动子调节序列和转录控制区、遍在启动子(HPRT、波形蛋白、α-肌动蛋白、微管蛋白等)、中间纤维启动子(肌间线蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP等)、治疗基因启动子(MDR、CFTR或因子VIII型等)、发病或疾病相关启动子、和显示组织特异性并用于转基因动物的启动子例如胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区；胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区,淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区,睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区；白蛋白基因、肝中有活性的Apo AI和Apo AII控制区、肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区、肝中有活性的α1抗胰蛋白酶基因控制区、骨髓细胞中有活性的β珠蛋白基因控制区、脑内少突细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区、骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2基因控制区和下丘脑中有活性的***释放激素基因控制区、丙酮酸激酶启动子、绒毛蛋白启动子、脂肪酸结合肠蛋白启动子、平滑肌细胞α-肌动蛋白启动子等。另外，这些表达序列可以通过加入增强子或调节序列等进行修饰。
载体可以通过本领域已知的方法引入所需的宿主细胞，所述方法例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质转染(溶酶体融合)、利用基因枪、或DNA载体转运子(参见例如，Wu等，J.Biol.Chem.267:963(1992)；Wu等，J.Biol.Chem.263:1462114624(1988);和Hartmut等，加拿大专利申请号2,012,311)。
本发明的载体还可经任何给予途径给予对象，包括但不限于肌肉内给予。
根据本发明的多核苷酸也能通过脂质转染体内引入。在过去的十年中，越来越多使用脂质体以体外包封和转染核酸。设计成限制脂质体介导转染所遭遇困难和危险的合成阳离子脂质，能用于制备脂质体以体内转染编码标记的基因(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84:7413(1987);Mackey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8027(1988)；和Ulmer等，Science259:1745(1993))。使用阳离子脂质促进带负电核酸的包封，也促进与带负电细胞膜的融合(Feigner等，Science337:387(1989))。用于转移核酸的尤其有用的脂质化合物和组合物如WO95/18863、WO96/17823和US5,459,127所述。使用脂质转染体内引入异源基因到特定器官具有某些实用优点。分子靶向脂质体到特定细胞代表一个优势方面。显然，指向特定细胞类型的转染会在有细胞异质性的组织例如胰腺、肝、肾和脑中特别优选。脂质可以化学偶联到其他分子以用于靶向目的(Mackey等，1988，同上)。靶定的肽(例如激素或神经递质)和蛋白质(例如抗体)或非肽分子可以化学偶联到脂质体。
其它分子也可用于促进体内核酸转染，例如阳离子寡肽(例如WO95/21931)，源自DNA结合蛋白的肽(例如WO96/25508)或阳离子聚合物(例如WO95/21931)。
也可将载体作为裸露DNA质粒体内引入(参见美国专利号5,693,622、5,589,466和5,580,859)。还可使用受体介导的DNA递送方法(Curiel等，Hum.GeneTher.3:147(1992)；和Wu等，J.Biol.Chem.262:4429(1987))。
术语“转染”指细胞摄入外源或异源RNA或DNA。当这种RNA或DNA引入到细胞内时，细胞被外源或异源RNA或DNA“转染”。当转染的RNA或DNA影响表型改变时，细胞被外源或异源RNA或DNA“转化”。转化RNA或DNA能整合(共价连接)到构成所述细胞基因组的染色体DNA中。
“转化”指将核酸片段转移到宿主生物的基因组中，产生遗传上稳定的遗传。包含转化核酸片段的宿主生物称为“转基因”或“重组”或“转化”生物。
另外，包含本发明所述多核苷酸的重组载体可以包含细胞宿主中的一个或多个复制起点，在所述细胞宿主中试图扩增或表达标记或选择标记。
术语“选择标记”指能基于标记基因效果来选择的鉴定因子，通常是抗生素或化学抗性基因，所述效果即耐受抗生素、耐受除草剂、比色标记物、酶、荧光标记物等，其中所述效果用于追踪感兴趣核酸的遗传和/或鉴定遗传所述感兴趣核酸的细胞或生物。本领域已知并使用的选择标记基因的例子包括：提供耐受氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨磷除草剂、磺酰胺等的基因；和可用作表型标记物的基因，即花色素苷调节基因、异戊烯转移酶基因等。
术语“报道基因”指编码能基于报道基因效果分辨的鉴定因子的核酸，其中所述效果用于追踪感兴趣核酸的遗传，鉴定遗传有感兴趣核酸的细胞或生物，和/或测量基因表达诱导或转录。本领域已知并使用的报道基因的例子包含：萤光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸酶(Gus)等。选择标记基因也可视作报道基因。
“启动子”和“启动子序列”可互换使用，并且指能控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可整体来自于天然基因，或由来自天然发现的不同启动子的不同元件所组成，或甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员应了解，不同的启动子可指导不同组织或细胞类型中的基因表达，或在不同发育阶段，或响应不同的环境或生理条件。在多数时候引起大部分细胞类型中基因表达的启动子通常称作“组成型启动子”。引起基因在特定细胞类型中表达的启动子通常称为“细胞特异启动子”或“组织特异启动子”。引起基因在特定发育或细胞分化的阶段中表达的启动子通常称为“发育特异启动子”或“细胞分化特异启动子”。用诱导启动子的试剂、生物分子、化学物、配体、光等接触或处理细胞后，诱导并引起基因表达的启动子通常称为“诱导型启动子”或“调节启动子”。还应认识到，由于多数情况下调控序列的精确界限未完全确定，不同长度的DNA片段可有相同的启动子活性。
本发明的任何载体中，载体可选包含本文公开的启动子。在一个实施方式中，所述启动子是列于本文表1的启动子。
本发明的任何载体中，载体可选包含组织特异启动子。在一个实施方式中，所述组织特异启动子是本文公开的组织特异启动子。在另一个实施方式中，所述组织特异启动子是列于本文表2的组织特异启动子。
通常启动子序列的3'末端界限为转录起始位点且向上游(5’方向)延伸，以包括起始高于背景的可检测转录水平所需的最小数目碱基或元件。启动子序列内部可找到转录起始位点(易通过例如核酸酶S1作图确定)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域(共有序列)。
“治疗性开关启动子”(“TSP”)指控制基因开关组分表达的启动子。参见例如US2009/0098055，其通过引用全文纳入本文。基因开关和其各种组分在本文其它地方详细描述。在某些实施方式中，TSP是组成型的，即持续活性。组成型TSP可以是组成型-遍在(即通常在任何组织或细胞中有功能，而不需要额外因子或调节物)或者组成型-组织或细胞特异(即通常在特定组织类型或细胞类型中有功能，而不需要额外因子或调节物)。在某些实施方式中，本发明的TSP在与疾病、紊乱或病症相关的条件下活化。在涉及两个或多个TSP的某些本发明实施方式中，所述启动子可以是组成型和活化型启动子的组合。本文使用的“在与疾病、紊乱或病症相关的条件下活化的启动子”包括但不限于疾病特异启动子，响应特定生理、发育、分化或病理条件的启动子、响应特定生物分子的启动子、和对所述疾病、紊乱或病症相关特定组织或细胞类型(如肿瘤组织或恶性细胞)特异的启动子。TSP能包含天然产生的启动子序列、衍生自天然产生启动子的修饰序列、或合成序列(例如将响应元件***最小启动子序列以改变所述启动子的反应)。
当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后反式RNA剪接(如果编码序列包含内含子)和翻译成由编码序列编码的蛋白质时，编码序列是在细胞中转录和翻译控制序列“控制下”。
“转录和翻译控制序列”指提供宿主细胞中编码序列表达的DNA调节序列，例如启动子、增强子、终止子等。在真核细胞中，聚腺苷酸化信号是控制序列。
术语“响应元件”是一种或多种顺式作用的DNA元件，它能够赋予通过与转录因子的DNA-结合域相互作用介导的启动子反应性。这种DNA元件可以是回文序列(完美或不完美)或者由序列基序或被不等数量的核苷酸分隔的半位点组成。所述半位点可以类似或者相同，并排列成正向或反向重复序列或者形成单个半位点或相邻半位点串联形成的多聚体。所述响应元件可以根据要整合响应元件的细胞或生物的性质，包含从不同生物分离的最小启动子。有或没有配体时，转录因子DNA结合域结合响应元件的DNA序列以启动或抑制受该响应元件调控的下游基因的转录。天然蜕皮激素受体的响应元件的DNA序列示例包含：RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO:1)(见Cherbas等，Genes Dev.5:120(1991))；AGGTCAN(n)AGGTCA,其中N(n)是一个或多个间隔子核苷酸(SEQ IDNO:2)(见D'Avino等，Mol.Cell.Endocrinol.113:1(1995))；和GGGTTGAATGAATTT(SEQ ID NO:3)(见Antoniewski等，Mol.Cell Biol.14:4465(1994))。
术语“操作性连接”指单一核酸片段上核酸序列的结合，从而彼此影响功能。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子操作性连接于编码序列。编码序列以有义或反义方向操作性连接于调控序列。
本文所用的术语“表达”指源自核酸或多核苷酸的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达也可以指mRNA翻译形成蛋白质或多肽。
术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”指能够在特定限制位点或者通过同源重组***核酸或多核苷酸的DNA区段。该DNA区段包括编码感兴趣多肽的多核苷酸，盒和限制位点设计成能够确保所述盒***适当阅读框进行转录和翻译。“转化盒”指包含编码感兴趣多肽的多核苷酸并具有除有利于特定宿主细胞转化的多核苷酸之外元件的特定载体。本发明的盒、表达盒、基因表达盒和转化盒也可以包含使宿主细胞中编码感兴趣多肽的多核苷酸表达增强的元件。这些元件包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、响应元件、终止子序列、聚腺苷酸化序列等。
就本发明的目的而言，术语“基因开关”指启动子相关的响应元件和基于配体依赖性转录因子***的组合，所述***在一个或多个配体出现时，调节整合响应元件和启动子的基因表达。术语“编码基因开关的多核苷酸”指启动子相关的响应元件和编码基于配体依赖性转录因子***的多核苷酸的组合，所述***在一个或多个配体出现时，调节整合响应元件和启动子的基因表达。
本发明的治疗开关启动子可以是任何用于治疗、改善或预防特定疾病、紊乱或病症的启动子。示例包括但不限于，只在特定疾病、紊乱或病症中显示表达增加的基因的启动子和特定细胞条件(例如增殖、凋亡、pH改变、氧化状态、氧含量)下显示表达增加的基因的启动子。在基因开关包含多于一个转录因子序列的一些实施方式中，通过联合疾病或病症特异性启动子和组织或细胞类型特异性启动子以限定表达治疗产物的组织，能提高治疗方法的特异性。因此，组织或细胞类型特异性启动子包含在治疗开关启动子定义中。
以疾病特异性启动子为例，可用于治疗癌症的启动子包括致癌基因的启动子，包括用于治疗贫血的启动子。癌基因种类的示例包括但不限于，生长因子、生长因子受体、蛋白激酶、程序性细胞死亡调节物和转录因子。癌基因的特定示例包括但不限于sis、erb B、erb B-2、ras、abl、myc和bcl-2和TERT。其他癌症相关基因的示例包含在肿瘤细胞中过量表达的肿瘤相关抗原基因和其他基因(例如MAGE-1、癌胚抗原、酪蛋白酶、***特异抗原、***特异膜抗原、p53、MUC-1、MUC-2、MUC-4、HER-2/neu、T/Tn、MART-1、gp100、GM2、Tn、sTn和Thompson-Friedenreich抗原(TF))。
本领域已知并且用作本发明治疗开关启动子的启动子序列和其他调节元件(例如增强子)的示例，以及与每个启动子相关的疾病/紊乱(表1)或组织特异性(表2)，在表1和2所列参考文献中公开。表中所引述的美国专利和已公开美国申请所述启动子序列和其中公开的序列通过引用全文纳入本文。
编码表1所列任何蛋白的多核苷酸也可以使用本发明载体和非治疗启动子的启动子来表达。
表1
Figure BDA0000407120760000291
Figure BDA0000407120760000301
表2
Figure BDA0000407120760000311
Figure BDA0000407120760000321
在特定疾病或紊乱中显示表达水平改变并且因此可以提供本发明所用启动子的其他基因包括但不限于表3列举的基因(以及所述相关疾病/紊乱)。
表3
Figure BDA0000407120760000322
Figure BDA0000407120760000331
Figure BDA0000407120760000341
Figure BDA0000407120760000351
Figure BDA0000407120760000361
Figure BDA0000407120760000371
Figure BDA0000407120760000381
Figure BDA0000407120760000391
Figure BDA0000407120760000401
Figure BDA0000407120760000411
Figure BDA0000407120760000431
一旦鉴定了具有在疾病、紊乱或病症中受调节表达模式的基因，该基因的启动子可以用于本发明的基因开关。很多基因的序列(包含启动子区)为本领域已知并且可获自公共数据库(例如GenBank)。因此，一旦鉴定了合适的基因，易于鉴定和获得启动子序列。本发明的另一方面针对鉴定其启动子能被分离并置于基因开关的合适基因。因此，由于所述启动子能分离并用于后续设置或环境中，所述基因性质对本发明的特定实施方式不重要。因此本发明包含使用仍需鉴定的基因的启动子。一旦鉴定了合适基因，测定启动子功能所需的基因序列是一项常规技术或实验。确实，存在数个市售方案以帮助测定感兴趣基因的启动子区。举例来说，Ding等通过累进删除人Sprouty4基因的5′侧翼序列，近期阐明了新型Sprouty4基因的启动子序列(Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.287:L52(2004)，通过引用纳入)。简言之，一旦确定转录起始位点，使用通用PCR引物以单向方式克隆5′侧翼区段来生成PCR片段。将所生成的片段克隆到荧光素酶报道载体并且测量荧光素酶活性以测定人Sprouty4基因的启动子区。
获得和证实基因启动子的方案的另一个示例包含下列步骤：(1)获得相似/相同组织类型的疾病和非疾病细胞/组织样品；(2)从样品中分离总RNA或mRNA；(3)进行疾病和非疾病RNA的差异微阵列分析；(4)鉴定候选疾病特异性转录物；(5)鉴定与疾病特异性转录物相关的基因组序列；(6)获得或合成所述疾病特异性转录物的预测转录起始位点上游和下游的DNA序列；(7)使用步骤6的不同长度DNA设计和生成启动子报道载体；和(8)在疾病和非疾病细胞/组织以及不相关的细胞/组织中检测启动子报道载体。
***到基因开关的启动子来源可以是天然的或合成的，并且启动子来源不应限定本文所述发明的范围。换言之，所述启动子可以直接从细胞中克隆，或所述启动子可以从不同来源事先克隆，或所述启动子可以合成。
在另一个实施方式中，编码表1-3中所述任何基因产物的多核苷酸可用于本发明的载体和方法以用于治疗应用和诊断目的。
基因开关***
所述基因开关可以是通过加入或移除特定配体来调节基因表达的任何基因开关。在一个实施方式中，所述基因开关是其中基因表达水平取决于所出现配体水平的基因开关。可以用于本发明基因开关的配体依赖性转录因子复合物的示例包括但不限于由其各自配体(例如糖皮质激素、***、孕激素、类视黄醇、蜕皮激素和其类似物及模拟物)活化的核受体超家族成员和四环素活化的rTTA。本发明的一个方面中，所述基因开关是基于EcR的基因开关。这些***的示例包括但不限于，美国专利号6,258,603、7,045,315，美国公开专利申请号2006/0014711、2007/0161086和国际公开申请号WO01/70816中所述的***。嵌合蜕皮激素受体***的示例描述于美国专利号7,091,038，美国公开专利申请号2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457和2006/0100416以及国际公开申请号WO01/70816、WO02/066612、WO02/066613、WO02/066614、WO02/066615、WO02/29075和WO2005/108617，各专利通过引用全文纳入本文。非甾体蜕皮激素激动剂调节***的一个示例是
Figure BDA0000407120760000441
哺乳动物诱导型表达***(马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich MA)的新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs))。本发明的另一个方面中，所述基因开关基于FK506结合蛋白(FKBP)与FKBP雷帕霉素相关蛋白(FRAP)的异二聚化，并且通过雷帕霉素或其非免疫抑制类似物调节。这种***的示例包括但不限于ARGENTTM转录技术(马萨诸塞州剑桥的ARIAD药物公司(ARIAD Pharmaceuticals))以及美国专利号6,015,709、6,117,680、6,479,653、6,187,757和6,649,595所述的***。
在一个实施方式中，所述基因开关包含编码在治疗开关启动子控制下配体依赖性转录因子复合物的单个转录因子序列。所述转录因子序列可以编码天然产生的配体依赖性转录因子复合物或人工配体依赖性转录因子复合物。人工转录因子是转录因子的天然序列已经改变的那些，所述改变是例如通过序列突变或不同转录因子结构域的组合。在一个实施方式中，所述转录因子包含H组核受体配体结合域。在一个实施方式中，所述H组核受体配体结合域来自蜕皮激素受体、遍在受体(ubiquitous receptor)(UR)、孤儿受体1(OR-1)、甾体激素核受体1(NER-1)、类视黄醇X受体相互作用蛋白15(RIP-15)、肝X受体β(LXRβ)、类固醇激素受体样蛋白(RLD-1)、肝X受体(LXR)、肝X受体α(LXRα)、法尼酯X受体(FXR)、受体相互作用蛋白14(RIP-14)或法尼醇受体(HRR-1)。在另一个实施方式中，H组核受体LBD来自蜕皮激素受体。
A.基于蜕皮激素的基因开关
EcR和其他H组核受体是核受体超家族的成员，其中所有成员的特征通常是出现氨基末端反式活化结构域(AD，也可互换称为“TA”或“TD”)、DNA结合域(DBD)和LBD，所述AD可选融合异二聚体伙伴(HP)以形成共活化蛋白(CAP)，所述LBD通过铰链区与DBD融合以形成配体依赖性转录因子(LTF)。本文所用的术语“DNA结合域”包括DNA结合蛋白的最小多肽序列，最长至整个DNA结合蛋白长度，只要该DNA结合域能够与特定响应元件相关联。核受体超家族的成员的特征也是出现四个或五个结构域：A/B、C、D、E和一些成员中的F(见US4,981,784和Evans,Science240:889(1988))。“A/B”结构域对应反式活化结构域，“C”对应DNA结合域，“D”对应铰链区和“E”对应配体结合域。该家族的一些成员在LBD羧基末端也有另一个反式活化结构域，对应“F”。
据报道下列多肽序列是蜕皮激素受体的多肽序列(蜕皮类固醇(ecdysteroid)受体)(20-羟基蜕皮激素受体)(20E受体)(EcRH)(核受体亚家族1,H组,成员1)，其Genbank登录号是P34021。
黑腹果蝇(果蝇)的蜕皮激素受体(878aa)(SEQ ID NO:5)
  1mkrrwsnngg fmrlpeesss evtsssnglv lpsgvnmsps sldshdycdq dlwlcgnesg
 61sfggsnghgl sqqqqsvitl amhgcsstlp aqttiiping nangnggstn gqyvpgatnl
121galangmlng gfngmqqqiq nghglinstt pstpttplhl qqnlggaggg giggmgilhh
181angtpnglig vvgggggvgl gvggggvggl gmqhtprsds vnsissgrdd lspssslngy
241sanescdakk skkgpaprvq eelclvcgdr asgyhynalt cegckgffrr svtksavycc
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661shlqitqeen erleraermr asvggaitag idcdsastsa aaaaaqhqpq pqpqpqpssl
721tqndsqhqtq pqlqpqlppq lqgqlqpqlq pqlqtqlqpq iqpqpqllpv sapvpasvta
781pgslsavsts seymggsaai gpitpattss itaavtasst tsavpmgngv gvgvgvggnv
841smyanaqtam almgvalhsh qeqliggvav ksehstta
在一个实施方式中，所述蜕皮激素受体配体结合域选自无脊椎动物蜕皮激素受体配体结合域、节肢动物门蜕皮激素受体配体结合结构域、鳞翅类昆虫(Lepidopteran)蜕皮激素受体配体结合域、双翅类昆虫(Dipteran)蜕皮激素受体配体结合域、直翅类昆虫(Orthopteran)蜕皮激素受体配体结合域、同翅类昆虫(Homopteran)蜕皮激素受体配体结合域、半翅类昆虫(Hemipteran)蜕皮激素受体配体结合域、云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)EcR蜕皮激素受体配体结合域、黄粉虫(Tenebrio molitor)蜕皮激素受体配体结合域、天蛾(Manduca sexta)蜕皮激素受体配体结合域、绿棉夜蛾(Heliothies virescens)蜕皮激素受体配体结合域、摇蚊(Chironomus tentans)蜕皮激素受体配体结合域、家蚕蛾(Bombyx mori)蜕皮激素受体配体结合域、丛林斜眼褐蝶(Bicyclus anynana)蜕皮激素受体配体结合域、鹿眼蝶(Junonia coenia)蜕皮激素受体配体结合域、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)蜕皮激素受体配体结合域、埃及斑蚊(Aedes aegypti)蜕皮激素受体配体结合域、绿头苍蝇(Lucilia capitata)蜕皮激素受体配体结合域、铜绿蝇(Lucilia cuprina)蜕皮激素受体配体结合域、红头丽蝇(Calliphora vicinia)蜕皮激素受体配体结合域、地中海果实蝇(Ceratitis capitata)蜕皮激素受体配体结合域、飞蝗(Locusta migratoria)蜕皮激素受体配体结合域、桃蚜(Myzus persicae)蜕皮激素受体配体结合域、大西洋砂招潮蟹(Celuca pugilator)蜕皮激素受体配体结合域、美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum)蜕皮激素受体配体结合域、银液粉虱(Bamecia argentifoli)蜕皮激素受体配体结合域和黑尾叶蝉(Nephotetix cincticeps)蜕皮激素受体配体结合域。
在另一个实施方式中，所述蜕皮激素受体配体结合域是云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)蜕皮激素受体配体结合域，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
在另一个实施方式中，所示蜕皮激素受体配体结合域是云山卷叶蛾(Christoneura fumiferana)蜕皮激素受体配体结合域的类似物，其保留云山卷叶蛾蜕皮激素受体配体结合域的体外云山卷叶蛾蜕皮激素受体配体结合活性的至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。体外蜕皮激素受体配体结合实验为本领域普通技术人员熟知。例如，参见WO02/066612。
在另一个实施方式中，所示蜕皮激素受体配体结合域类似物是在WO02/066612、US2006/0100416、WO05/108617和2005/0266457中公开的蜕皮激素受体配体结合域。在另一个实施方式中，所述蜕皮激素受体配体结合域类似物是SEQ ID NO:7的V107I/Y127E取代突变体。
DBD的特征是在两个氨基酸基序(P盒和D盒)之间出现两个半胱氨酸锌指，这赋予对响应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或嵌合的异源受体蛋白不同结构域。EcR类似核受体家族的子集，也有负责异二聚化性质的未充分明确区域。因为核受体结构域自然模块化，所述LBD、DBD和AD可以互换。
在另一个实施方式中，所述转录因子包含AD、识别与表达待调控的治疗蛋白或治疗多肽相关的响应元件的DBD；和H组核受体LBD。在某些实施方式中，H组核受体LBD包含取代突变。
DNA结合域可以是具有已知响应元件的任何DNA结合域(DBD)，包括合成和嵌合的DNA结合域，或其类似物、组合或修饰。在一个实施方式中，所述DNA结合域选自GAL4DBD、LexA DBD、转录因子DBD、H组核受体成员DBD、类固醇/甲状腺素核受体超家族成员DBD、细菌性LacZ DBD、EcR DBD、GAL4DBD和LexA DBD。
所述反式活化结构域(缩写为“AD”或“TA”)可以是任何H组核受体成员AD、类固醇/甲状腺素核受体AD、合成性或嵌合性AD、多谷氨酰胺AD、碱性或酸性氨基酸AD、VP16AD、GAL4AD、NF-κB AD、BP64AD、B42酸性活化结构域(B42AD)、p65反式活化结构域(p65AD)或其类似物、组合或修饰。在另一个实施方式中，所述基因开关包含在第一治疗性开关启动子(TSP-1)控制下的第一转录因子序列例如CAP，和在第二治疗性开关启动子(TSP-2)控制下的第二转录因子序列例如LTF，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形成蛋白复合物(LDTFC)，即基于“双开关”或“双杂交”的基因开关。所述第一和第二TSP可以相同或不同。在此实施方式中，基因开关中出现治疗性分子表达所需的两个不同TSP增强了治疗方法的特异性(见WO2011/119773的图2)。WO2011/119773的图2还显示了仅通过***合适的TSP修饰治疗性基因开关以治疗任何疾病、紊乱或病症的能力。
在另一个实施方式中，第一和第二转录因子序列例如CAP或LTF受单个治疗性开关启动子控制(例如WO2011/119773的图1中的TSP-1)。这种启动子的活化会产生有单个开放阅读框的CAP和LTF。这能使用转录接头如IRES(内部核糖体进入位点)来实现。在这个实施方式中，配体依赖性转录因子复合物的两个部分都在TSP-1活化后合成。TSP-1能是组成型启动子或只在与所述疾病、紊乱或病症相关的条件下活化。
在另一个实施方式中，一个转录因子序列如LTF受仅在所述疾病、紊乱或病症相关条件下活化的治疗性开关启动子控制(例如WO2011/119773的图4中的TSP-2或TSP-3)，且另一个转录因子如CAP受组成型治疗性开关启动子控制(例如WO2011/119773的图4中的TSP-1)。在这个实施方式中，配体依赖性转录因子复合物的一部分组成型存在，而第二部分只在与所述疾病、紊乱或病症相关的条件下合成。
在另一个实施方式中，一个转录因子序列如CAP受第一TSP控制(例如WO2011/119773的图3中的TSP-1)且两个或更多不同的第二转录因子序列如LTF-1和LTF-2受不同TSP控制(例如WO2011/119773的图3中的TSP-2和TSP-3)。在此实施方式中，每个LTF可以有识别不同因子调节启动子序列的不同DBD(例如DBD-A结合与因子调节启动子1(FRP-1)有关的响应元件且DBD-B结合与因子调节启动子2(FRP-2)有关的响应元件。每个因子调节启动子可以操作性连接不同的治疗基因。在这种方式下，可以同时提供多个治疗。
在一个实施方式中，所述第一转录因子序列编码包含AD的多肽，识别与表达受到调控的治疗产物序列相关的响应元件的DBD；和H组核受体LBD，第二转录因子序列编码包含核受体LBD的转录因子，所述核受体LBD选自脊椎动物类视黄醇X受体(RXR)、无脊椎动物RXR、超气门蛋白(ultraspiracle protein)(USP)，或包含至少两个不同核受体配体结合域多肽片段的嵌合核受体，所述多肽片段选自脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR和USP(见WO01/70816A2和US2004/0096942A1)。“伙伴”核受体配体结合域还可以包含截短突变、缺失突变、取代突变或其它修饰。
在另一个实施方式中，所述基因开关包含第一转录因子序列和第二转录因子序列，所述第一转录因子序列编码包含核受体LBD和DBD的第一多肽，所述DBD识别与表达受到调节的治疗产物序列有关的响应元件，所述第二转录因子序列编码包含AD和核受体LBD的第二多肽，其中核受体LBD之一是H组核受体LBD。在一个实施方式中，第一多肽基本没有AD且第二多肽基本没有DBD。就本发明的目的而言，“基本没有”指研究的蛋白不含有所研究结构域的充足序列以提供活化或结合活性。
本发明的另一个方面中，所述第一转录因子序列编码含有异二聚化伙伴和AD(“CAP”)的蛋白质，和第二转录因子序列编码含有DBD和LBD(“LTF”)的蛋白质。
当只有一个核受体LBD是H组LBD时，所述另一个核受体LBD可以来自与H组LBD形成二聚体的任何其他核受体。例如，当H组核受体LBD是EcR LBD时，所述另一个核受体LBD"伙伴"可以来自EcR、脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR、超气门蛋白(USP)或包含至少两个不同核受体LBD多肽片段的嵌合核受体，所述多肽片段选自脊椎动物RXR、非脊椎动物RXR或USP(见WO01/70816A2、国际专利申请号PCT/US02/05235、US2004/0096942A1和美国专利号7,531,326，所述专利通过引用全文纳入本文)。所述“伙伴”核受体配体结合域还可以包含截短突变、缺失突变、取代突变或其它修饰。
在一个实施方式中，所述脊椎动物RXR LBD来自人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、原鸡(Gallus gallus)、猪(Sus scrofadomestica)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)、被囊动物(Polyandrocarpa misakiensis)或水母(Tripedalia cysophora)RXR。
在一个实施方式中，所述无脊椎动物RXR配体结合域来自飞蝗(Locustamigratoria)超气门多肽(“LmUSP”)、美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum)RXR同源物1(“AmaRXR1”)、美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum)RXR同源物2(“AmaRXR2”)、招潮蟹(Celuca pugilator)RXR同源物(“CpRXR”)、甲虫黄粉虫(Tenebrio molitor)RXR同源物(“TmRXR”)、蜜蜂(Apis mellifera)RXR同源物(“AmRXR”)、桃蚜(Myzus persicae)RXR同源物(“MpRXR”)或非双翅类/非鳞翅类昆虫RXR同源物。
在一个实施方式中，所述嵌合RXR LBD包含至少两个多肽片段，所述多肽片段选自脊椎动物种RXR多肽片段、无脊椎动物种RXR多肽片段、或非双翅类/非鳞翅类无脊椎动物种RXR同源物多肽片段。本发明使用的嵌合RXR配体结合域可以包含至少两个不同物种RXR多肽片段，或当所述物种相同时，所述两个或多个多肽片段可以来自物种RXR多肽片段的两个或多个不同同种型。这种嵌合RXR LBD公开在例如WO2002/066614中。
在一个实施方式中，所述嵌合RXR配体结合域包含至少一个脊椎动物种RXR多肽片段和一个无脊椎动物种RXR多肽片段。
在另一个实施方式中，所述嵌合RXR配体结合域包含至少一个脊椎动物种RXR多肽片段和一个非双翅类/非鳞翅类无脊椎动物种RXR同源物多肽片段。
所述配体与核受体的LBD组合并进而与治疗产物序列相关FRP的响应元件结合时，提供治疗产物序列表达的外部时序调节。本发明的各种组分互相结合的结合机理或顺序(例如配体-LBD、DBD-响应元件、AD-启动子等)并不重要。
在一个特定示例中，配体与H组核受体的LBD和其核受体LBD伙伴的结合能表达治疗产物序列。这个机理不排除配体结合H组核受体(GHNR)或其伙伴和形成活性同源二聚体复合物(例如GHNR+GHNR或伙伴+伙伴)的可能性。一个或多个受体结构域优选可变，从而生成杂交基因开关。通常，三个结构域(DBD、LBD和AD)中的一个或多个选自与其他结构域来源不同的来源，从而所述杂交基因和所得的杂交蛋白在选定宿主细胞或生物中就反式活化活性、配体的互补结合和特异响应元件的识别优化。另外，响应元件本身可以修饰或取代有用于其他DNA结合蛋白结构域的响应元件例如酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等，Nature335:563(1988))或大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent等，Cell43:729(1985))，或对就特定相互作用设计、修饰和选择的蛋白靶向相互作用特异的合成响应元件(参见例如Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，94:3616(1997))以适合杂交受体。双杂交***的另一个优势是能根据所需最终结果选择用于驱动基因表达的启动子。因为可以控制表达的时间和表达发生的细胞，这种双控制可能对基因治疗领域特别重要，尤其是当生成细胞毒性蛋白时。将操作性连接到合适启动子的基因引入对象细胞时，外源基因的表达受本发明***的控制。启动子可以是组成型或诱导型调控，或是组织特异性(即只在特定细胞类型中表达)或对生物的某些发育阶段特异。
在有或没有配体的情况下，第一杂交蛋白的DNA结合域结合响应元件的DNA序列以启动或抑制受该响应元件调控的下游基因的转录。
功能LDTFC例如EcR复合物也可以包含其它蛋白质例如亲免素。蛋白质的其它核受体家族成员称为转录因子(例如DHR38或βFTZ-1)，也可以是EcR、USP和/或RXR的配体依赖性或非依赖***。另外，可以需要其他辅助因子，如一般称为辅激活物(也称为衔接子或调节子)的蛋白质。这些蛋白质不与DNA序列特异性结合，并且不参与基础转录。其可以通过多种机理影响转录活化，所述机理包含通过影响染色质结构或通过介导激活物-起始复合物相互作用来刺激激活物的DNA结合。这些辅激活物的示例包含RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及混杂辅激活物C响应元件B结合蛋白、CBP/p300(综述参见Glass等，Curr.Opin.CellBiol.9:222(1997))。另外，可能需要通常称为辅阻遏物(也称为阻遏物、沉默子或沉默调节子)的蛋白辅助因子以在没有配体情况下有效抑制转录活化。这些辅阻遏物可以与无配体的EcR相互作用以使响应元件处的活性沉默。当前证据显示配体的结合改变所述受体的构象，引起辅阻遏物的释放和上述辅激活物的募集，从而消除其沉默活性。辅阻遏物的示例包含N-CoR和SMRT(综述参见Horwitz等，Mol Endocrinol.10:1167(1996))。这些辅助因子在细胞或生物中可以是内源性的，或可作为以受调节或未调节方式表达的转基因外源性添加。B.基于雷帕霉素的基因开关
本发明还提供基因开关***，所述***利用FK506结合蛋白作为配体依赖性转录因子复合物和雷帕霉素作为配体。在一个实施方式中，所述编码基因开关的构建物包含
(a)编码第一嵌合蛋白的第一多核苷酸，所述第一嵌合蛋白结合雷帕霉素或其类似物，并且包含至少一个FK506-结合蛋白(FKBP)结构域和至少一个异源蛋白结构域，其中所述FKBP结构域包含选自以下的肽序列：
(1)天然产生的FKBP
(2)天然产生的FKBP的变体，其中多至10个氨基酸残基被删除、***或用取代的氨基酸置换，和
(3)DNA序列编码的FKBP，其与编码(1)或(2)的FKBP的DNA序列选择性杂交。
(b)编码第二嵌合蛋白的第二多核苷酸，所述第二嵌合蛋白与(a)雷帕霉素或雷帕霉素类似物和(b)第一嵌合蛋白都形成复合物，并且包含至少一个FKBP：雷帕霉素结合(FRB)结构域和至少一个异源蛋白结构域，其中FRB结构域包含选自以下的肽序列：
(4)天然产生的FRB结构域，
(5)天然产生的FRB结构域的变体，其中多至10个氨基酸残基被删除、***或用取代的氨基酸置换，和
(6)DNA序列编码的FRB结构域，其与编码(4)或(5)的FKB的DNA序列选择性杂交。
在这个基因开关***中，第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受本文它处所述的一种或多种治疗性开关启动子控制。另外，在某些实施方式中，第一和第二嵌合蛋白中与FKBP和/或FRB结构域异源的至少一个蛋白质结构域可以是一个或多个“作用”或“效应”结构域。效应结构域可以选自多种蛋白质结构域，包括DNA结合域、转录活化结构域、细胞定位结构域和信号转导结构域(即在聚类或多聚化后能激发细胞生长、增殖、分化、凋亡、基因转录等的结构域)。
在某些实施方式中，一种融合蛋白包含至少一个DNA结合域(例如GAL4或ZFHD1DNA-结合域)和另一个融合蛋白包含至少一个转录活化结构域(例如VP16或p65转录活化结构域)。融合蛋白的配体介导结合代表转录因子复合物的形成并引起与DNA序列连接的靶标基因起始转录，所述DNA序列由融合蛋白之一的DNA-结合域识别(即能与其结合)。关于基因表达***和配体的信息公开于美国专利号6,187,757B1、6,649,595B1、6,509,152B1、6,479,653B1和6,117,680B1。
在其它实施方式中，本发明提供基因开关***，所述基因开关***包含编码没有配体时自我聚集的两个融合蛋白的多核苷酸，其中(a)第一融合蛋白包含结合选定配体的条件聚合结构域和转录活化结构域，和(b)第二融合蛋白包含结合选定配体的条件聚合结构域和DNA结合域，和(c)没有配体时，所述细胞表达操作性连接调节DNA的基因，所述调节DNA结合所述DNA结合域。存在足够量配体抑制基因时，包含所述基因开关***的修饰细胞扩增。配体移除会诱导造成细胞死亡的编码蛋白表达。编码两个融合蛋白的核酸受至少一个条件型启动子控制。利用条件性聚合结构域的基因表达***公开于美国公开号2002/0048792。
C.基于原核抑制子/操纵子的基因开关***
在一个实施方式中，本发明提供基因开关***，所述***包含(a)编码包含原核四环素("tet")抑制子和真核转录激活蛋白结构域的反式激活融合蛋白的第一多核苷酸；和(b)编码治疗蛋白或治疗多肽的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸操作性连接到最小启动子和至少一个tet操纵子序列。编码反式激活融合蛋白的第一多核苷酸可以包含本文他处所述的治疗开关启动子。致死蛋白的表达在没有四环素时上调。(见例如Gossen等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89:5547-5551;Gossen等，(1993)TIBS18:471-475;Furth等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:9302-9306;和Shockett等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92:6522-6526)。TetO表达***公开于美国专利号5,464,758B1。
在另一个实施方式中，所述基因开关***包含来自细菌大肠杆菌的乳糖(“Lac”)抑制子-操纵子***。本发明的基因开关***也可以包含(a)编码包含原核lac I抑制子和真核转录活化蛋白结构域的反式活化融合蛋白的第一多核苷酸；和(b)编码治疗蛋白或治疗多肽的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸操作性连接到治疗性开关启动子。在Lac***中，没有乳糖或合成类似物如异丙基-硫代半乳糖苷时，lac操纵子失活。
其他基因开关***包含下列所述的那些：US7,091,038；WO2004078924；EP1266015；US20010044151；US20020110861；US20020119521；US20040033600；US20040197861；US20040235097；US20060020146；US20040049437；US20040096942；US20050228016；US20050266457；US20060100416；WO2001/70816；WO2002/29075；WO2002/066612；WO2002/066613；WO2002/066614；WO2002/066615；WO2005/108617；US6,258,603；US20050209283；US20050228016；US20060020146；EP0965644；US7,304,162；US7,304,161；MX234742；KR10-0563143；AU765306；AU2002-248500和AU2002-306550。
D.基因开关***的组合
本发明提供包括含不同配体依赖性转录因子复合物的两个或多个基因开关***的核酸组合物、修饰细胞和生物反应器，所述复合物由有效量的一种或多种配体活化，其中，所述两个或多个基因开关***包含第一基因开关和第二基因开关，两者在结合一种或多种配体后，都选择性诱导一种或多种治疗多肽或治疗多核苷酸的表达。本发明的范围包括任何数目和/或组合的基因开关***。
在一个实施方式中，本发明提供核酸组合物，所述组合物包含：
a.第一基因开关***，所述***包含：
i.第一基因表达盒，包含编码第一杂交多肽的多核苷酸，其包含：
1.反式活化结构域，其活化与编码治疗性多肽或治疗性多核苷酸的多核苷酸操作性连接的因子调节性启动子；和
2.异二聚体伙伴结构域，
ii.第二基因表达盒，包含编码第二杂交多肽的多核苷酸，其包含：
1.DNA结合域，其识别与编码治疗性多肽或治疗性多核苷酸的多核苷酸操作性连接的因子调节性启动子；和
2.配体结合域；和
iii.第三基因表达盒，包含编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸，其包含：
1.因子调节性启动子，其通过第二杂交多肽的反式活化结构域活化；和
2.编码治疗性多肽或治疗性多核苷酸的多核苷酸，和
b.第二基因表达***，包含：
i.第一基因表达盒，包含编码第一杂交多肽的多核苷酸，其包含：
1.反式活化结构域，其活化与编码治疗性多肽或治疗性多核苷酸的多核苷酸操作性连接的因子调节性启动子；和
2.异二聚体伙伴结构域，
ii.第二基因表达盒，包含编码第二杂交多肽的多核苷酸，其包含：
1.DNA结合域，其识别与编码治疗性多肽或治疗性多核苷酸的多核苷酸操作性连接的因子调节性启动子；和
2.配体结合域；和
iii.第三基因表达盒，包含编码治疗多肽或治疗多核苷酸的多核苷酸，其包含：
1.因子调节性启动子，其通过第二杂交多肽的反式活化结构域活化；和
2.编码治疗性多肽或治疗性多核苷酸的多核苷酸。
多重诱导型基因表达***提供给定治疗性多核苷酸或治疗性多肽在与不同疾病、紊乱或病症相关条件下的表达，或者多种治疗性多肽或治疗性多核苷酸在与相同疾病、紊乱或病症相关的相同条件下，或在与不同疾病、紊乱或病症相关的不同条件下的表达。
在某些实施方式中，两个或多个基因开关相同***的组合可以是(1)基于双开关蜕皮激素受体的基因表达***和(2)基于单开关蜕皮激素受体的基因开关。在另一些实施方式中，所述组合可以是(1)基于单或双开关蜕皮激素受体的基因开关和(2)基于雷帕霉素的基因开关。或者，基因开关***的组合可以是上述两个相同的基于雷帕霉素的基因开关***。任何基因开关***的可能组合在本发明范围内。双开关蜕皮激素受体的示例能参见例如WO2002/29075和US2002/0110861。
配体
本文使用的术语“配体”用于基于LDTFC的基因开关(如基于EcD复合物的基因开关)时，描述能活化基因开关以刺激其中所编码多肽表达的可溶性小分子。本发明的配体依赖性转录因子复合物的配体结合蛋白复合物，所述蛋白复合物包含一个或多个配体结合域、异二聚体伙伴结构域、DNA结合域和反式活化结构域。活化配体依赖性转录因子复合物的配体选择取决于使用的基因开关类型。
配体的示例包括但不限于，蜕皮甾醇激素例如蜕皮激素、20-羟基蜕皮激素、松甾酮A、莫瑞甾A等，9-顺-视黄酸、视黄酸合成类似物，N,N'-二酰肼例如美国专利号6,013,836；5,117,057；5,530,028和5,378,726以及美国公开申请号2005/0209283和2006/0020146公开的那些；噁二唑啉(oxadiazoline)，如美国公开申请号2004/0171651所述；二苯甲酰烷基氰基肼(dibenzoylalkyl cyanohydrazine)，如欧洲申请号461,809所公开；N-烷基-N,N'-二芳酰基肼(diaroylhydrazine)，如美国专利号5,225,443所公开；N-酰基-N-烷基羰基肼(alkylcarbonylhydrazine)，如欧洲申请号234,994所公开；N-芳酰基-N-烷基-N'-芳酰基肼(aroylhydrazine)，如美国专利号4,985,461所公开；酰胺酮(amidoketone)，如美国公开专利号2004/0049037所公开；各专利通过引用纳入本文以及其他类似材料，包含3,5-二-叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰哈巴苷、羟甾醇、22(R)羟基胆固醇、24(S)羟基胆固醇、25-环氧胆固醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆固醇-3-硫酸盐(ECHS)、7-酮胆固醇-3-硫酸盐、金合欢醇(famesol)、胆酸、1,1-二膦酸酯(biphosphonate ester)、保幼激素III等。本发明使用的二酰肼配体的示例包含RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N'-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼)、RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼)和RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼)。参见例如，美国专利申请序列号12/155,111(公开为US2009/0163592)和PCT申请号PCT/US2008/006757，两者都通过引用全文纳入本文。
例如，用于蜕皮激素受体基因开关的配体可以选自任何合适的配体。天然产生的蜕皮激素或蜕皮激素类似物(例如20-羟基蜕皮激素、莫瑞甾酮A、松甾酮A、松甾酮B、松甾酮C、26-碘松甾酮A、牛膝甾酮或26-甲基磺酰牛膝甾酮)和非类固醇诱导物可以用作本发明基因开关的配体。美国专利号6,379,945B1描述了分离自烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的昆虫类固醇受体(“HEcR”)，所述受体能用作响应类固醇和某些非类固醇诱导物的基因开关。在响应类固醇和非类固醇诱导物的这个和许多其他***中，出于很多原因，非类固醇诱导物有与类固醇不同的优势，所述原因包含例如：更低的生产成本，代谢稳定性，昆虫、植物或哺乳动物中缺失，和环境可接受性。美国专利号6,379,945B1描述了使用2个二苯甲酰肼、1,2-二苯甲酰-1-叔丁基-肼和虫酰肼(tebufenozide)(N-(4-乙基苯甲酰)-N'-(3,5-二甲基苯甲酰)-N'-叔丁基-肼)作为基于蜕皮激素基因开关的配体。本发明的配体还包括其他二苯甲酰肼，例如美国专利号5,117,057B1公开的那些。使用虫酰肼作为来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的蜕皮激素受体的化学配体也公开于美国专利号6,147,282。另外，蜕皮激素配体的非限定性示例是3,5-二叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰哈巴苷、1,2-二酰基肼、N'-取代-N,N'-双取代肼、二苯甲酰烷基氰基肼、N-取代-N-烷基-N,N-二芳酰基肼、N-取代-N-酰基-N-烷基、碳酰肼或N-芳酰基-N'-烷基-N'-芳酰基肼。(参见美国专利号6,723,531)。
在一个实施方式中，基于蜕皮激素配体的基因开关***是二酰肼配体或手性二酰肼配体。用于基因开关***的配体可以是式I所示的化合物
Figure BDA0000407120760000561
其中，
A是烷氧基、芳基烷氧基或芳氧基；
B是可任选取代的芳基或可任选取代的杂芳基；且
R1和R2独立地是可选取代的烷基、芳基烷基、羟基烷基、卤代烷基、可选取代的环烷基、可选取代的烯基、可选取代的炔基、可选取代的杂环基、可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；
或其药学上可接受的盐、水合物、晶体形式或无定形形式。
在另一个实施方式中，所述配体可以是对映体富集的式II化合物
Figure BDA0000407120760000562
其中，
A是烷氧基、芳基烷氧基、芳氧基、芳基烷基、可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；
B是可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；且
R1和R2独立地是可选取代的烷基、芳基烷基、羟基烷基、卤代烷基、可选取代的环烷基、可选取代的烯基、可选取代的炔基、可选取代的杂环基、可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；
前提是R1不等于R2；
其中有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要是S；
或其药学上可接受的盐、水合物、晶体形式或无定形形式。
在某些实施方式中，配体可以是对映体富集的式III化合物
Figure BDA0000407120760000571
其中，
A是烷氧基、芳基烷氧基、芳氧基、芳基烷基、可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；
B是可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；且
R1和R2独立地是可选取代的烷基、芳基烷基、羟基烷基、卤代烷基、可选取代的环烷基、可选取代的烯基、可选取代的炔基、可选取代的杂环基、可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；
前提是R1不等于R2；
其中有R1和R2的不对称碳原子处的绝对构型主要是R；
或其药学上可接受的盐、水合物、晶体形式或无定形形式。
在一个实施方式中，配体可以是具有至少95%的对映体过量的(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼，或其药学上可接受的盐、水合物、晶体形式或无定形形式。式I的二酰肼配体和式II或III的手性二酰肼配体与基于蜕皮激素的基因开关***一起使用时，提供本发明治疗多肽或治疗多核苷酸表达的外部时序调节方式。参见2008年5月29日提交的美国申请号12/155,111(公开为US2009/0163592)，所述申请通过引用全文纳入本文。
本发明使用的配体可以形成盐。本文使用的术语“盐”表示与无机和/或有机酸和碱形成的酸性和/或碱性盐。另外，当式I、II或III的化合物包含碱性部分和酸性部分时，两性离子(“内盐”)可以形成，并且包含在本文所用术语“盐”中。例如在制备中可以使用的分离或纯化步骤中使用药学上可接受的盐(例如非毒性、生理上可接受)，尽管也使用其它盐。例如通过化合物与一定量(例如等量)的酸或碱在某一介质如盐在其中沉淀的介质或冻干后的水介质中反应，可以形成式I、II或III的化合物的盐。
包含碱性部分的配体可以与多种有机和无机酸形成盐。示例性的酸加成盐包含乙酸盐(例如与乙酸或三卤代乙酸如三氟乙酸形成的那些)、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、安息香酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐(用盐酸形成)、氢溴酸盐(用氢溴酸形成)、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐(用马来酸形成)、甲磺酸盐(用甲磺酸形成)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(例如用硫酸形成的那些)、磺酸盐(例如本文提到的那些)、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐例如甲苯磺酸盐(tosylate)、十一酸盐等。
包含酸性部分的配体可以与多种有机和无机碱形成盐。示例性的碱性盐包含铵盐，碱金属盐如钠、锂和钾盐，碱土金属盐例如钙和镁盐，带有机碱(例如有机胺)的盐如苄星盐，二环己胺、哈胺(用N,N-二(脱氢松香基)乙二胺形成)、N-甲基-D-葡糖胺、N-甲基-D-葡糖胺、正丁基胺和具有氨基酸(如精氨酸、赖氨酸等)的盐。
使用FK506结合域的诱导型基因表达***的配体的非限定性示例是FK506、环孢菌素A或雷帕霉素。FK506、雷帕霉素及其类似物公开于美国专利号6,649,595B2和6,187,757。还参见美国专利号7,276,498和7,273,874。
本文描述的配体能单独给予或作为包含药学上可接受运载体的药物组合物的一部分给予。在一个实施方式中，药物组合物采用溶液、悬浮液、片剂、胶囊、软膏、酏剂或可注射的组合物形式。
在一个实施方式中，编码抗体的多核苷酸编码单克隆抗体。
在另一个实施方式中，本发明的载体和方法能用于表达作为疫苗的核酸。本发明也提供包含本发明载体或表达***的疫苗组合物。在另一实施方式中，所述疫苗组合物包含佐剂。
“***或其激动剂”是***多肽、与***具有至少约85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列相同性的多肽、或保留***至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%体外***受体结合活性的***片段。任何***多核苷酸序列可用于本发明的方法。在一个实施方式中，所述***多核苷酸序列编码人***，其氨基酸序列如登录号AAF23134(SEQ ID NO:6)所示。编码***的氨基酸序列还可获自公共资料库，登录号AAH93628(人)、AA119266(小鼠)和BAA01593(大鼠)，其序列通过引用纳入本文。编码***的多核苷酸序列可获自公共资料库，登录号BC093628(人)、BC119265(小鼠)和D10763(大鼠)，其序列通过引用纳入本文。在另一个实施方式中，所述***多核苷酸序列编码人***的类似物，所述类似物保留人***的至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%体外***受体结合活性。体外***受体结合实验为本领域普通技术人员熟知。例如，参见Harris,K.W.等，J.Biol.Chem.25:15205-9(1992)；Wrighton,N.C等，Science273:458-463(1996)；和Jarsch,M.等，Pharmacology81:63-69(2008)。
***的非限制性示例包括阿法达贝泊汀(darbepoietin alfa)、阿法依泊汀(epoetin alfa)、阿法依泊汀(epoetin alfa)、贝塔依泊汀(epoetin beta)和卡帕依泊汀(epoetin kappa)。
***激动剂的非限制性示例包括美国专利号7,767,643、7,786,163、7,674,913、7,553,861、7,410,941、7,345,019、7,309,687、6,531,121、5,858,670、5,650,489和5,510,240中公开的那些激动剂。其它***激动剂的非限制性示例包括美国专利公开号2011/0027890、2010/0305002、2010/297117、2010/0297106、2010/0190692、2010/0145006、2010/136015、2010/0120661、2010/093608、2010/0028331、2010/016218、2010/0009961、2009/0233844、2009/0022734、2009/0004202、2008/0213277、2008/0014193、2007/0298031、2007/0293421、2007/0060547、2006/027071、2006/0009518、2003/0134798、2003/0104988和2002/008616中公开的那些激动剂。其它***激动剂的非限制性示例包括MacDougal,I.C.等，N.Engl.J.Med.361:1848-55(2009)；Pankratova,S.等，Brain133(Pt.8):2281-94(2010)；和Zarychanski,R.等，Canadian Medical Association Journal177:725-34(2007)中公开的那些激动剂。
关于基因开关方面的术语“基于蜕皮激素受体”指某一基因开关，所述基因开关包含至少天然产生或合成的蜕皮激素受体配体结合域的功能部分，其响应结合蜕皮激素受体配体结合域的配体而调节基因表达。蜕皮激素响应***的示例于美国专利号7,091,038和6,258,603。在一个实施方式中，所述***是
Figure BDA0000407120760000601
治疗***(RTS)，所述***包含两个融合蛋白即与Gal4DNA结合域融合的突变蜕皮激素受体(EcR)DEF结构域和与VP16转录活化结构域融合的嵌合RXR的EF结构域，如图1所示在组成型启动子控制下表达。
术语“调节”和“调控”指诱导、降低或抑制核酸或基因表达，分别引起蛋白或多肽生成的诱导、降低或抑制。
本发明所述的多核苷酸或载体还可以包含适于驱动宿主细胞中基因表达的至少一个启动子。
可用于本发明实施方式的增强子包括但不限于：SV40增强子、巨细胞病毒(CMV)增强子、延伸因子1(EF1)增强子、酵母增强子、病毒基因增强子等。
终止控制区即终止子或聚腺苷酸化序列也可以衍生自优选宿主的多种天然基因。可选地，终止位点不是必需的，然而，最优选包含终止位点。在本发明的一个实施方式中，终止控制区可以包含在或衍生自合成序列、合成聚腺苷酸化信号、SV40晚期聚腺苷酸化信号、SV40聚腺苷酸化信号、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号、病毒终止子序列等。
术语“3’非编码序列”或“3’非翻译区(UTR)”指位于编码序列下游(3’)的DNA序列，并且可以包含聚腺苷酸化[聚(A)]识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。聚腺苷酸化信号的特征通常是影响聚腺苷酸束添加至mRNA前体的3'末端。
“调节区”指调节第二核酸序列表达的核酸序列。调节区可以包含天然负责特定核酸表达的序列(同源区域)，或可以包含负责表达不同蛋白质或甚至合成蛋白质的不同起源序列(异源区域)。特别地，所述序列能是原核、真核或病毒基因序列，或以特定或非特定方式和诱导或非诱导方式刺激或抑制基因转录的衍生序列。调节区包含复制起点、RNA剪接位点、启动子、增强子、转录终止序列和指导多肽到靶标细胞中分泌通路的信号序列。
来自“异源来源”的调节区指与所表达核酸不是天然相关的调节区。异源调节区中包含来自不同物种的调节区、来自不同基因的调节区、杂交调节序列，和天然不产生但是由本领域普通技术人员设计的调节序列。
“RNA转录物”指RNA聚合酶催化的DNA序列转录所得的产物。当RNA转录物是DNA序列的完美互补拷贝时，称为初级转录物，或可以是来自初级转录物转录后加工的RNA序列，并称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指没有内含子、并能被细胞翻译成蛋白的RNA。“cDNA”指与mRNA互补并且从mRNA衍生的双链DNA。“正义”RNA指包含mRNA并因此能被细胞翻译成蛋白的RNA转录物。“反义RNA”指与全部或部分靶标初级转录物或mRNA互补并阻断靶标基因表达的RNA转录物。反义RNA的互补可以是与特异基因转录物的任何部分，即5'非编码序列、3'非编码序列或编码序列。“功能RNA”指反义RNA、核酶RNA或尚未翻译但是对细胞过程有影响的其他RNA。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且指由共价连接的氨基酸残基构成的聚合化合物。
“经分离的多肽”、“经分离的肽”或“经分离的蛋白质”指基本不含与其天然状态正常相关的那些化合物(例如其它蛋白质或多肽、核酸、糖、脂质)的多肽或蛋白质。“分离的”并不意味着排除有其它化合物的人工或合成混合物或者出现杂质，所述杂质不干扰生物功能并且可以是例如归因于不完全纯化、加入稳定剂或复合入药学上可接受制剂。
“取代突变多肽”或“取代突变体”将被理解成表示包含用相对于野生型或天然产生多肽不同的氨基酸取代至少一个野生型或天然产生氨基酸被一个与的突变多肽。取代突变多肽可以仅包含一个野生型或天然产生氨基酸的取代，并且可以称作“点突变”或“单点突变”多肽。或者，取代突变多肽可以包含用相对于野生型或天然产生多肽用两个或多个氨基酸取代两个或多个野生型或天然产生的氨基酸。根据本发明，包含取代突变的H组核受体配体结合域多肽包含用相对于野生型或天然产生H组核受体配体结合域多肽不同的氨基酸取代至少一个野生型或天然产生的氨基酸。取代突变H组核受体配体结合域多肽的非限制性示例可见于WO2002/066612和US2006/0100416。
当取代突变多肽包含两个或多个野生型或天然产生氨基酸的取代时，这种取代可以包含就取代删除的等数目野生型或天然产生氨基酸，例如用2个非野生型或天然产生的氨基酸替代2个野生型或天然产生的氨基酸，或者就取代删除的不等数目野生型氨基酸，例如用1个非野生型氨基酸替代2个野生型氨基酸(取代+删除突变)或用3个非野生型氨基酸替代2个野生型氨基酸(取代+***突变)。
取代突变体可以使用缩写术语***描述以指示在参照多肽序列内取代的氨基酸残基和数目和新取代的氨基酸残基。例如，多肽的第20个(20th)氨基酸残基被取代的取代突变体可以缩写成“x20z”，其中“x”是被取代的氨基酸，“20”是多肽内的氨基酸残基位置或数目和“z”是新取代的氨基酸。因此，互换缩写成“E20A”或“Glu20Ala”的取代突变体指示包含多肽位置20处丙氨酸残基(本领域通常缩写成“A”或“Ala”)取代谷氨酸(本领域通常缩写成“E”或“Glu”)的突变体。
取代突变可以通过本领域任何已知的突变技术生产，包括但不限于体外定点诱变(Hutchinson等，J.Biol.Chem.253:6551(1978);Zoller等，DNA3:479(1984);Oliphant等，Gene44:177(1986);Hutchinson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:710(1986))，使用接头(法玛西亚公司(Pharmacia))、限制性内切核酸酶消化/片段删除和取代、PCR介导/寡核苷酸定向突变等。就定点诱变而言优选基于PCR的技术(参见Higuchi，1989，“Using PCR to Engineer DNA(使用PCR工程改造DNA)”，收录于PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification(《PCR技术：DNA扩增的原理和应用》)，H.Erlich编，斯托克顿出版社(Stockton Press)，第6章第61-70页)。
用于多肽的术语“片段”指某一多肽，所述多肽的氨基酸序列短于参照多肽的氨基酸序列并且在完整部分上包含与所述参照多肽相同的氨基酸序列。合适时，这些片段可以包含在其作为一部分的更大多肽中。根据本发明的这种多肽片段的长度可以是至少2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240或300或更多氨基酸。
多肽或蛋白的“变体”指衍生自多肽或蛋白的任何类似物、片段、衍生物或突变体，并且保持所述多肽或蛋白的至少一种生物特性。多肽或蛋白质的不同变体可以天然存在。这些变体可以是由编码蛋白的结构基因的核苷酸序列差异来确定特征的等位基因变异，或者可以涉及差异剪接或翻译后修饰。技术人员能生成有单个或多个氨基酸取代、删除、加入或替换的变体。这些变体可以包括：(a)一个或多个氨基酸残基用保守或非保守氨基酸取代的变体，(b)一个或多个氨基酸加入到所述多肽或蛋白质的变体，(c)其中一个或多个氨基酸包含取代基的变体，和(d)所述多肽或蛋白质与另一个多肽如血清白蛋白质融合的变体。获得这些变体的技术包括遗传学(抑制、删除、突变等)、化学和酶学技术，所述技术为本领域普通技术人员已知。在一个实施方式中，变体多肽包含至少约14个氨基酸。
术语“同源性”指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的相同性百分比。一个部分和另一部分序列之间的对应性能通过本领域已知的技术测定。例如，通过比对序列信息和使用易于获得的计算机程序，在两个多肽分子之间直接比较序列信息来测定同源性。或者，测定同源性可以通过多核苷酸在允许同源区域间形成稳定双链体的条件下杂交，然后用单链特异性核酸酶消化并确定已消化片段的大小。
本文使用的术语“同源”(其所有语法形式和拼写变异)指有“共同进化起源”的蛋白质之间的关系，包含来自超家族的蛋白质(例如，免疫球蛋白超家族)和来自不同种的同源蛋白(例如，肌球蛋白轻链等)。(Reeck等，Cell50:667(1987))。这种蛋白质(和其编码基因)有序列同源性，如其高序列相似性程度所反映。然而，在通常使用和应用中，当用副词如“高度”修饰时，术语“同源”可以指序列相似性而不是共同进化起源。
因此，术语“序列相似性”(其所有语法形式)指可以有或没有共同进化起源的蛋白的核酸或氨基酸序列之间的相同性或对应性程度(见Reeck等，Cell50:667(1987))。在一个实施方式中，当至少约50%(如至少约75%、90%、95%)核苷酸在确定长度的DNA序列上匹配时，两个DNA序列“基本同源”或“基本相似”。基本同源的序列能通过比较所述序列来鉴定，所述比较使用序列数据库可用的标准软件或例如就特定***定义的严谨条件下的Southern杂交实验。定义合适杂交条件在本领域技术范围内(见例如Sambrook等，1989，同上)。
本文使用的“基本相似”指某些核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的改变造成一个或多个氨基酸的取代，但是不影响DNA序列编码的蛋白的功能属性。“基本相似”也指某些核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的改变不影响核酸片段通过反义或共抑制技术调节基因表达改变的能力。“基本相似”也指本发明核酸片段的修饰，例如基本不影响所得转录物功能特性的一个或多个核苷酸碱基的删除或***。因此应理解本发明包含的超出特定示例性序列。每个提出的修饰都在本领域常规技术内，如测定编码产物的生物活性保留。
当超过约40%的氨基酸相同或超过60%相似(功能相同)时，两个氨基酸序列“基本同源”或“基本相似”。优选地，所述相似或同源序列通过比对鉴定，例如使用GCG(威斯康星州麦迪逊的遗传计算机组(Genetics Computer Group)，GCG包的程序手册，第7版)堆积程序。
本文使用的术语“对应”指相似或同源序列，所述准确位置是否与要测量相似性或同源性的分子相同或不同。核酸或氨基酸序列的比对可以包含空白。因此，术语“相对应”指序列相似性，而不是氨基酸残基或核苷酸碱基的数目。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”包含足够的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列以推定鉴定多肽或基因，通过本领域技术人员对序列进行人工评价或通过计算机自动化序列比较和鉴定，使用算法例如BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)；Altschul等，J.Mol.Biol.215:403(1993))；可获自ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。通常，需要10个或更多毗连氨基酸或者30个或更多核苷酸序列以推定鉴定多肽或核酸序列与已知蛋白质或基因的同源性。此外，对核苷酸序列而言，包含20-30个毗连核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可以用于基因鉴定(例如Southern杂交)和分离(例如细菌菌落或噬菌体噬斑的原位杂交)的序列依赖性方法。另外，12-15个碱基的短寡核苷酸可以用作PCR扩增引物以获得包含引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含足够序列以特异性鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。
本领域所知的术语“相同性百分数”指，通过序列比较确定两个或多个多肽序列或者两个或多个核苷酸序列之间的关系。本领域中“相同性”也指多肽或多核苷酸序列之间序列相关的程度，视情况通过此类序列字串之间的匹配进行确定。“相同性”和“相似性”能通过已知方法容易计算，所述方法包括但不限于以下所述：Computational Molecular Biology(计算分子生物学)(Lesk,A.M.编)纽约的牛津大学出版(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(生物计算：信息学和基因组工程)(Smith,D.W.编)纽约学术出版社(Academic Press,1993)；Computer Analysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，第I部分(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编)新泽西州休曼出版公司(Humana Press)(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology(分子生物学的序列分析)(von Heinje,G.编)学术出版社(1987)；和Sequence Analysis Primer(序列分析引物)(Gribskov,M.和Devereux,J.编)纽约斯托克顿出版社(Stockton Press)(1991)。设计测定相同性的优选方法以给出测试序列之间的最好匹配。测定相同性和相似性的方法在公共可用计算机程序中编码。序列比对和百分比相同性的计算可以使用序列分析软件完成，所述软件例如LASERGENE生物信息学计算套件的Megalign程序(威斯康星州麦迪逊的DNASTAR公司(DNASTAR Inc.,))。序列的多个比对可使用比对的Clustal方法(Higgins等，CABIOS.5:151(1989))以默认参数(缺口罚分=10、缺口长度罚分=10)完成。使用Clustal方法的配对比对的默认参数可以选自:KTUPLE1、缺口罚分=3、窗口=5和DIAGONALS SAVED=5。
术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可以是市售可得的或独立开发的。常用序列分析软件包括但不限于，程序的GCG套件(威斯康星包(Wisconsin Package)第9.0版，威斯康星州麦迪逊的遗传计算机组(GCG))、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215:403(1990))和DNASTAR(美国威斯康星州麦迪逊S.Park大街1228的DNASTAR公司，53715)。本申请内容中应理解，除非特别说明，当序列分析软件用于分析时，分析结果是基于参照程序的“默认值”。本文使用的“默认值”指当最初开始时，软件原始载入的任何组的值或参数。
关于DNA序列的“化学合成”指体外组装的组分核苷酸。DNA的人工化学合成可以使用完善的工艺完成，或自动化学合成能使用很多市售可得的机器之一完成。因此，能根据反映宿主细胞中密码子偏好的核苷酸序列优化就最佳基因表达调整基因。技术人员应了解如果密码子使用偏向宿主喜好的那些密码子，成功基因表达是可能的。优选密码子的测定能基于源自序列信息可用的所述宿主细胞的基因调查。
本文使用的两个或多个单独可操作基因调控***称为“正交”，条件是a)通过各自配体以选定浓度调节每个给定***，使得该***的基因表达幅度发生可检测的改变，和b)不论实际调节的同时性和顺序性如何，所述改变与细胞、组织或生物中可同时操作的所有其他***表达变化在统计学上显著不同。优选地，每个单独可操作基因调节***的调节影响基因表达的改变，所述改变比细胞、组织或生物中所有其他可操作***高至少2倍，例如至少5倍、10倍、100倍、或500倍更多。理想地，通过其各自配体以选定浓度调节每个给定***，使得该***基因表达幅度发生可检测的改变，且细胞、组织或生物中可操作的所有其他***没有可检测的改变。在这种示例中，多个诱导型基因调节***被称为“全部正交”。可用的正交配体和基于正交受体的基因表达***描述于US2002/0110861A1。
术语“外源基因”指就对象而言外来的基因，即通过转化过程引入到对象的基因，内源突变基因的未突变形式或内源未突变基因的突变形式。转化方法对本发明不重要，可以是任何适于本领域那些已知对象的方法。外源基因能是天然或合成的基因，以DNA或RNA(通过诸如逆转录酶的DNA中间物起作用)形式引入对象。所述基因能引入到靶标细胞、直接引入到对象或通过转化细胞的转移而间接引入到对象。
术语“治疗产物”指对表达这种产物的宿主细胞施加有益功能的治疗多肽或治疗多核苷酸。治疗多肽可以包括但不限于小至3个氨基酸长度的肽、单链或多链蛋白和融合蛋白。治疗多核苷酸可以包括但不限于反义寡核苷酸、小干扰RNA、核酶和RNA外部引导序列。治疗产物可以包含天然产生的序列、合成序列或天然和合成序列的组合。
术语“配体依赖性转录因子复合物”或“LDTFC”指包含一个或多个蛋白亚基的转录因子，其复合物能调节由本文所定义“因子调节启动子”驱动的基因表达。模型LDTFC是“蜕皮激素受体复合物”，通常指异二聚体蛋白复合物，所述复合物有核受体家族、蜕皮激素受体(“EcR”)和超气门(“USP”)蛋白中至少两个成员(见Yao等，Nature366:476(1993));Yao等，Cell71:63(1992))。功能性LDTFC例如EcR复合物，也可以包含其它蛋白质例如亲免素。蛋白质的其它核受体家族成员称为转录因子(例如DHR38或βFTZ-1或其他昆虫同源物)，也可以是EcR和/或USP的配体依赖性或非依赖***。LDTFC如EcR复合物也能是EcR蛋白和超气门蛋白的脊椎动物同源物、视黄酸X受体(“RXR”)蛋白或USP和RXR嵌合体的异二聚体。术语"LDTFC"和"EcR复合物"也包含EcR蛋白或USP的同二聚体复合物以及单个多肽或三聚体、四聚体和其他功能相同的多聚体。
LDTFC如EcR复合物能通过结合到复合物蛋白之一的活性蜕皮甾醇激素或非甾体配体来活化，所述蛋白质包含EcR但不排除复合物的其它蛋白质。LDTFC如EcR复合物包含作为核受体超家族成员的蛋白，其中所有成员的特征是出现包含氨基末端反式活化结构域("AD"、"TD"或"TA"，本文中可互换使用)、DNA结合域(“DBD”)和配体结合域(“LBD”)的一个或多个多肽亚基。AD可以与“异二聚化伙伴”或“HP”融合的形式出现。包含本发明AD和HP的融合蛋白在本文中称为“共活化蛋白”或“CAP”。DBD和LBD可作为融合蛋白表达，本文中称为"配体诱导型转录因子("LTF")。所述融合伙伴可以由接头分开，例如铰链区。LTF家族的一些成员在LBD羧基末端也有另一个反式活化结构域。DBD的特征是在两个氨基酸基序(P盒和D盒)之间出现两个半胱氨酸锌指，这赋予对蜕皮激素响应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或嵌合的异源受体蛋白不同结构域。
生成外源基因、响应元件和LDTFC如EcR复合物的DNA序列可以纳入到古细菌、原核细胞如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其它肠细菌或真核细胞如植物或动物细胞。然而，因为由基因表达的很多蛋白质在细菌中不正确加工，优选真核细胞。所述细胞可以是单细胞或多细胞生物的形式。外源基因、响应元件和受体复合物的核苷酸序列也能作为RNA分子纳入，优选功能性病毒RNA如烟草花叶病毒形式。对真核细胞而言，优选脊椎动物细胞，因为其天然缺乏某些分子，所述分子就EcR而言赋予对本发明配体的响应。因此，其对本发明的配体“基本不敏感”。因此，本发明使用的配体对转化细胞或完整生物体的生理或其他影响可以忽略。因此，细胞能生长和表达所需产物，基本不受配体本身存在的影响。
术语“蜕皮激素受体复合物”通常指异二聚体蛋白复合物，所述复合物有核受体家族、蜕皮激素受体(“EcR”)和超气门(“USP”)蛋白中至少两个成员(见Yao等，Nature366:476(1993));Yao等，Cell71:63(1992))。功能性EcR复合物也可以包含其它蛋白质例如亲免素。蛋白质的其它核受体家族成员称为转录因子(例如DHR38或βFTZ-1或其他昆虫同源物)，也可以是EcR和/或USP的配体依赖性或非依赖***。所述EcR复合物也能是EcR蛋白和超气门蛋白的脊椎动物同源物、视黄酸X受体(“RXR”)蛋白或USP和RXR嵌合体的异二聚体。术语EcR复合物也包含EcR蛋白或USP的同源二聚体复合物。
EcR复合物能通过活性蜕皮甾醇激素或非甾体配体结合到复合物的蛋白质之一来活化，所述蛋白质包含EcR但不排除复合物的其它蛋白质。本文使用的术语“配体”用于基于EcD的基因开关时描述了小且可溶性分子，所述分子有活化基因开关的能力以刺激其中编码多肽的表达。配体的示例包括但不限于，蜕皮甾醇激素例如蜕皮激素、20-羟基蜕皮激素、松甾酮A、莫瑞甾A等，9-顺-视黄酸、视黄酸合成类似物，N,N'-二酰肼例如美国专利号6,013,836、5,117,057、5,530,028和5,378,726以及美国公开申请号2005/0209283和2006/0020146所述的那些；噁二唑啉，如美国公开申请号2004/0171651所述；二苯甲酰基烷基氰基肼，如欧洲申请号461,809所公开；N-烷基-N,N'-二芳酰基肼，如美国专利号5,225,443所公开；N-酰基-N-烷基羰基肼，如欧洲申请号234,994所公开；N-芳酰基-N-烷基-N'-芳酰基肼，如美国专利号4,985,461所公开；酰胺酮，如美国公开专利号2004/0049037所公开；以及其它类似物质，包括3,5-二叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰哈巴苷、羟甾醇、22(R)羟基胆固醇、24(S)羟基胆固醇、25-环氧胆固醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆固醇-3-硫酸盐(ECHS)、7-酮胆固醇-3-硫酸盐、金合欢醇、胆酸、1,1-二膦酸酯、保幼激素III等。本发明使用的二酰肼配体的示例包含RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N'-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼)、RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼)和RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼)。用于实施本发明的其他二酰肼参见2008年5月29日提交的美国申请12/155,111，和2008年5月29日提交的PCT/US2008/006757。
EcR复合物包含作为核受体超家族成员的蛋白质，其中所有成员的特征是出现氨基末端反式活化结构域("TA")、DNA结合域(“DBD”)和由铰链区分开的配体结合域(“LBD”)。所述家族的一些成员在LBD羧基末端也有另一个反式活化结构域。DBD的特征是在两个氨基酸基序(P盒和D盒)之间出现两个半胱氨酸锌指，这赋予对蜕皮激素响应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或嵌合的异源受体蛋白质不同结构域。
构成外源基因、响应元件和EcR复合物的DNA序列可以纳入古细菌、原核细胞如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其他肠细菌或真核细胞如植物或动物细胞。然而，因为由基因表达的很多蛋白质在细菌中不正确加工，优选真核细胞。所述细胞可以是单细胞或多细胞生物的形式。外源基因、响应元件和受体复合物的核苷酸序列也能作为RNA分子纳入，优选功能性病毒RNA如烟草花叶病毒形式。对真核细胞而言，优选脊椎动物细胞，因为其天然缺乏某些分子，所述分子就EcR而言赋予对本发明配体的响应。因此，其对本发明的配体“基本不敏感”。因此，本发明使用的配体对转化细胞或完整生物体的生理或其他影响可以忽略。因此，细胞能生长和表达所需产物，基本不受配体本身存在的影响。
EcR配体与EcR复合物一起使用并进而与连接外源基因的响应元件结合时，提供外源基因表达的外部时序调节方式。多个成分互相结合(即配体-受体复合物和受体复合物-响应元件)的顺序并不重要。通常，外源基因表达的调控响应EcR复合物与特异对照或调节DNA元件的结合。所述EcR蛋白如同其他核受体家族成员，有至少三个结构域即一个反式活化结构域、一个DNA结合域和一个配体结合域。这种受体如同核受体家族的子集，也有负责异二聚化性质的未充分明确区域。与USP或RXR蛋白的异二聚化后，配体与EcR蛋白的配体结合域的结合能使异二聚体蛋白的DNA结合域与活化形式的响应元件结合，因此引起外源基因的表达或抑制。这个机理不排除配体与EcR或USP结合和形成活性同源二聚体复合物(例如EcR+EcR或USP+USP)的可能性。在一个实施方式中，一个或多个受体结构域是可变的，从而生成嵌合基因开关。通常，三个结构域中的一个或多个可选自与其他结构域来源不同的来源，从而所述嵌合受体在所选宿主细胞和生物中就反式活化活性、配体的互补结合和特异响应元件的识别优化。另外，响应元件本身能修饰或取代有用于其他DNA结合蛋白结构域的响应元件，如来自酵母的GAL-4蛋白(见Sadowski等，Nature335:563(1988))或来自大肠杆菌的LexA蛋白(见Brent等，Cell43:729(1985))以适合嵌合EcR复合物。嵌合***的另一个优势是可以根据所需最终结果选择用于驱动外源基因的启动子。因为可以控制表达的时间和发生表达的细胞，这种双控制可能对基因治疗领域特别重要，尤其是当生成细胞毒性蛋白时。将操作性连接到合适启动子的外源基因引入对象细胞时，外源基因的表达受本发明配体存在的控制。启动子可以是组成型或诱导型调控，或是组织特异性(即只在特定细胞类型中表达)或对生物的某些发育阶段特异。
在某些实施方式中，本方法描述的治疗开关启动子是组成型的。在某些实施方式中，所述治疗开关启动子是在与疾病、紊乱或病症相关的条件下活化，例如响应疾病，响应特定生理、发育、分化或病理条件，和/或响应一个或多个特异生物分子，所述启动子被活化；和/或所述启动子在特定组织或细胞类型中活化。在某些实施方式中，所述疾病、紊乱或病症响应治疗多肽或多核苷酸。例如，在某些非限定性实施方式中，所述治疗多核苷酸或多肽用于治疗、预防、改善、减少症状、预防发展或治愈所述疾病、紊乱或病症，但是不需要实现这些事情的任何一个或全部。在某些实施方式中，引入第一和第二多核苷酸，从而使配体依赖性转录因子复合物在与疾病、紊乱或病症相关的条件下表达。在一个实施方式中，完成治疗方法，从而所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达并且以足以治疗、改善或预防所述疾病、紊乱或病症的水平在对象中散布。本文使用的“散布”指多肽表达并从修饰细胞中充分释放以在对象中有效果或活性。散布可以是***的、局部的或两者间的任何情况。例如，治疗多肽或治疗多核苷酸可以通过血液或淋巴******散布。或者，治疗多肽或治疗多核苷酸可以在待治疗的组织或器官中局部散布。
编码各种多肽(如转录因子和受体蛋白)的多个基因组和cDNA核酸序列为本领域熟知。本领域技术人员可以利用几乎所有已知基因的核酸序列信息和能从公共库、发表序列的研究所中直接获得核酸分子，或者使用常规方法制备分子。例如，参见下文序列登录号的描述。
所述基因开关可以是通过加入或移除特定配体来调节基因表达的任何基因开关***。在一个实施方式中，所述基因开关是其中基因表达水平取决于所出现配体水平的基因开关。可以用于本发明基因开关的配体依赖性转录因子的示例包括但不限于由其各自配体(例如糖皮质激素、***、孕激素、类视黄醇、蜕皮激素和其类似物及模拟物)活化的核受体超家族成员和四环素活化的rTTA。本发明的一个方面中，所述基因开关是基于EcR的基因开关。这些***的示例包括但不限于，美国专利号6,258,603、7,045,315，美国公开专利申请号2006/0014711、2007/0161086和国际公开申请号WO01/70816中所述的***。嵌合的蜕皮激素受体的示例描述于美国专利号7,091,038，美国公开专利申请号2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457和2006/0100416以及国际公开申请号WO01/70816、WO02/066612、WO02/066613、WO02/066614、WO02/066615、WO02/29075和WO2005/108617。非甾体蜕皮激素激动剂调节***的示例是哺乳动物诱导型表达***(马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich MA)的新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))。
在一个实施方式中，编码所述基因开关的多核苷酸包含编码启动子控制下配体依赖性转录因子的单个转录因子序列。所述转录因子序列可以编码天然产生的配体依赖性转录因子或人工转录因子。人工转录因子是转录因子的天然序列已经改变的那些，所述改变是例如通过序列突变或不同转录因子结构域的组合。在一个实施方式中，所述转录因子包含H组核受体配体结合域(LBD)。在一个实施方式中，H组核受体LBD来自EcR、遍在受体、孤儿受体1、NER-1、甾体激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白–15、肝X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝X受体α、法尼酯X-受体、受体相互作用蛋白14或法尼醇受体。在另一个实施方式中，H组核受体LBD来自蜕皮激素受体。
在一个实施方式中，编码所述基因开关的多核苷酸包含编码启动子控制下配体依赖性转录因子的单个转录因子序列。所述转录因子序列可以编码天然产生的配体依赖性转录因子或人工转录因子。人工转录因子是转录因子的天然序列已经改变的那些，所述改变是例如通过序列突变或不同转录因子结构域的组合。在一个实施方式中，所述转录因子包含H组核受体配体结合域(LBD)。在一个实施方式中，H组核受体LBD来自EcR、遍在受体、孤儿受体1、NER-1、甾体激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白–15、肝X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝X受体α、法尼酯X-受体、受体相互作用蛋白14或法尼醇受体。在另一个实施方式中，H组核受体LBD来自蜕皮激素受体。
EcR和其他H组核受体是核受体超家族成员，其中所有成员的特征通常是出现氨基末端反式活化结构域(TD)、DNA结合域(DBD)和通过铰链区与DBD分开的LBD。本文所用的术语“DNA结合域”包括DNA结合蛋白的最小多肽序列，最长至整个DNA结合蛋白的长度，只要该DNA结合域能够与特定响应元件相关联。核受体超家族成员的特征也是出现四个或五个结构域：A/B、C、D、E和一些成员中的F(参见US4,981,784和Evans,Science240:889(1988))。“A/B”结构域对应反式活化结构域，“C”对应DNA结合域，“D”对应铰链区和“E”对应配体结合域。该家族的一些成员在LBD羧基末端也有另一个反式活化结构域，对应“F”。
DBD的特征是在两个氨基酸基序(P盒和D盒)之间出现两个半胱氨酸锌指，这赋予对响应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或嵌合的异源受体蛋白质不同结构域。EcR类似核受体家族的子集，也有负责异二聚化性质的未充分明确区域。因为核受体结构域天然模块化，所述LBD、DBD和TD可以互换。
在另一个实施方式中，所述转录因子包含TD、识别与表达被调控的外源基因相关的响应元件的DBD；和H组核受体LBD。在某些实施方式中，H组核受体LBD包含取代突变。
在另一个实施方式中，所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列，和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形成用作配体依赖性转录因子的蛋白复合物，即基于“双开关”或"双杂交”的基因开关。所述第一和第二启动子可以相同或不同。
在某些实施方式中，所述编码基因开关的多核苷酸包含启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用形成用作配体依赖性转录因子的蛋白复合物，即“单基因开关”。所述第一转录因子序列和第二转录因子序列可以通过内部核糖体进入位点(IRES)连接。所述IRES可以是EMCV IRES。
在一个实施方式中，第一转录因子序列编码某一多肽，所述多肽包含TD、识别与表达受到调节的外源基因相关响应元件的DBD；和H组核受体LBD，和第二转录因子序列编码包含核受体LBD的转录因子，所述LBD选自脊椎动物RXR LBD、无脊椎动物RXR LBD、超气门蛋白LBD和包含两个多肽片段的嵌合LBD，其中所述第一多肽片段来自脊椎动物RXR LBD、无脊椎动物RXR LBD或超气门蛋白LBD，和所述第二多肽片段来自不同的脊椎动物RXR LBD、无脊椎动物RXR LBD或超气门蛋白LBD。
在另一个实施方式中，所述基因开关包含编码第一多肽的第一转录因子序列和编码第二多肽的第二转录因子序列，所述第一多肽包含核受体LBD和识别与表达受到调节的外源基因相关的响应元件的DBD，所述第二多肽包含TD和核受体LBD，其中核受体LBD之一是H组核受体LBD。在一个实施方式中，第一多肽基本没有TD且第二多肽基本没有DBD。就本发明的目的而言，“基本没有”指研究的蛋白不含有所研究结构域的充足序列以提供活化或结合活性。
本发明的另一个方面中，所述第一转录因子序列编码含有异二聚体伙伴和TD的蛋白质，和第二转录因子序列编码含有DBD和LBD的蛋白质。
当只有一个核受体LBD是H组LBD时，所述另一个核受体LBD可以来自与H组LBD形成二聚体的任何其它核受体。例如，当H组核受体LBD是EcR LBD时，所述另一个核受体LBD"伙伴"可以来自EcR、脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR、超气门蛋白(USP)或包含至少两个不同核受体LBD多肽片段的嵌合核受体，所述多肽片段选自脊椎动物RXR、非脊椎动物RXR和USP(参见WO01/70816A2、国际专利申请号PCT/US02/05235和US2004/0096942A1)。所述“伙伴”核受体配体结合域还可以包含截短突变、缺失突变、取代突变或其它修饰。
在一个实施方式中，所述脊椎动物RXR LBD来自人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、原鸡(Gallus gallus)、猪(Sus scrofadomestica)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)、被囊动物(Polyandrocarpa misakiensis)或水母(Tripedalia cysophora)RXR。
在一个实施方式中，所述无脊椎动物RXR配体结合域来自飞蝗(Locustamigratoria)超气门多肽(“LmUSP”)、美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum)RXR同源物1(“AmaRXR1”)、美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum)RXR同源物2(“AmaRXR2”)、招潮蟹(Celuca pugilator)RXR同源物(“CpRXR”)、甲虫黄粉虫(Tenebrio molitor)RXR同源物(“TmRXR”)、蜜蜂(Apis mellifera)RXR同源物(“AmRXR”)、桃蚜(Myzus persicae)RXR同源物(“MpRXR”)或非双翅类/非鳞翅类昆虫RXR同源物。
在一个实施方式中，所述嵌合RXR LBD包含至少两个多肽片段，所述多肽片段选自脊椎动物种RXR多肽片段、无脊椎动物种RXR多肽片段、和非双翅类/非鳞翅类无脊椎动物种RXR同源物多肽片段。本发明使用的嵌合RXR配体结合域可以包含至少两个不同物种RXR多肽片段，或当所述物种相同时，所述两个或多个多肽片段可以来自该物种RXR多肽片段的两个或多个不同同种型。
在一个实施方式中，所述嵌合RXR配体结合域包含至少一个脊椎动物种RXR多肽片段和一个无脊椎动物种RXR多肽片段。
在另一个实施方式中，所述嵌合RXR配体结合域包含至少一个脊椎动物种RXR多肽片段和一个非双翅类/非鳞翅类无脊椎动物种RXR同源物多肽片段。
所述配体与核受体的LBD结合并进而与外源基因相连的响应元件结合时，提供外源基因表达的外部时序调节。本发明的各种组分互相结合的结合机理或顺序(例如配体-LBD、DBD-响应元件、TD-启动子等)并不重要。
在一个特定示例中，配体与H组核受体的LBD和其核受体LBD伙伴的结合能表达外源基因。这个机理不能排除配体结合H组核受体(GHNR)或其伙伴并形成活性同源二聚体复合物(例如GHNR+GHNR或伙伴+伙伴)的可能性。一个或多个受体结构域优选可变，从而生成杂交基因开关。通常，三个结构域(DBD、LBD和TD)中的一个或多个可选自与其他结构域来源不同的来源，从而所述杂交基因和所得的杂交蛋白在选定宿主细胞或生物中就反式活化活性、配体的互补结合和特异响应元件的识别优化。另外，响应元件本身可以修饰或取代有用于其他DNA结合蛋白结构域的响应元件例如酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等，Nature335:563(1988))或大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent等，Cell43:729(1985))，或对就特定相互作用设计、修饰和选择的蛋白靶向相互作用特异的合成响应元件(参见例如Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，94:3616(1997))以适合杂交受体。
功能性EcR复合物也可以包含其它蛋白质例如亲免素。蛋白质的其它核受体家族成员称为转录因子(例如DHR38或βFTZ-1)，也可以是EcR、USP和/或RXR的配体依赖性或非依赖***。另外，可以需要其他辅助因子，如通常称为辅活化子(也称为衔接子或调节子)的蛋白质。这些蛋白质不与DNA序列特异性结合，并且不参与基础转录。其可以通过多种机理影响转录活化，所述机理包含通过影响染色质结构或通过介导激活物-起始复合物相互作用来刺激激活物的DNA结合。这些辅激活物的示例包含RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及混杂辅激活物C响应元件B结合蛋白、CBP/p300(综述参见Glass等，Curr.Opin.Cell Biol.9:222(1997))。另外，可能需要通常被称为辅阻遏物(也称为阻遏物、沉默子或沉默调节子)的蛋白辅助因子以在没有配体情况下有效抑制转录活化。这些辅阻遏物可以与无配体的EcR相互作用以使响应元件处的活性沉默。目前证据显示配体的结合改变所述受体的构象，造成辅阻遏物的释放和上述辅激活物的募集，从而消除其沉默活性。辅阻遏物的示例包含N-CoR和SMRT(综述参见Horwitz等，Mol Endocrinol.10:1167(1996))。这些辅助因子在细胞或生物中可以是内源性的，或可作为以受调节或未调节方式表达的转基因外源性添加。
外源基因操作性连接到启动子上，所述启动子包含由所述基因开关所编码配体依赖性转录因子的DBD识别的至少一个响应元件。在一个实施方式中，所述启动子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多拷贝的所述响应元件。包含所需响应元件的启动子可以是天然产生的启动子或使用本领域熟知技术生成的人工启动子，例如操作性连接到最小启动子的一个或多个响应元件。
编码蛋白质的基因还可经密码子优化。在一个实施方式中，蛋白质的编码区经密码子优化以在人内表达。本领域普通技术人员应理解，由于遗传密码的冗余性，各种核酸编码区域会编码相同的多肽。包括编码任何多肽链氨基酸的密码子的核苷酸序列偏差允许编码该基因的序列不同。由于各密码子由三个核苷酸组成，且含DNA的核苷酸局限于四种特异碱基，所以有64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸(剩余三种密码子编码信号终止翻译)。显示哪种密码子编码哪种氨基酸的“遗传密码”在本文中以表4再现。因此，许多氨基酸被多于一种密码子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由4种三联体编码,丝氨酸和精氨酸由6种编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性能使DNA碱基组成在较广的范围内变化，而不用改变DNA所编码多肽的氨基酸序列。
表4：标准遗传密码
应理解任何编码本发明所述多肽的多核苷酸都落入本发明范围内，不论所用的密码子如何。
许多生物体对具体密码子的使用显示出偏好，用于编码生长的多肽链中具体氨基酸的***。密码子优选或密码子偏好、生物体之间密码子使用的差异，由遗传密码的简并性提供，且在许多生物体中详细记载。密码子偏好常和信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，继而认为其依赖被翻译的密码子性质和具体转移RNA(tRNA)分子的有效性等。所选tRNA在细胞中优势通常反映了肽合成中使用最频繁的密码子。因此，可基于密码子优化就给定生物体中最佳的基因表达来调整基因。
通过将优选用于给定物种基因的密码子纳入DNA序列来制备多核苷酸。
鉴于就各种动物、植物和微生物物种可获得的大量基因序列，可计算密码子使用的相对频率。密码子使用表可获自例如http://www.kazusa.or.jp/codon/(2006年5月30日访问)的“密码子使用数据库”，这些表可适用于许多方面。参见Nakamura,Y.等,“Codon usage tabulated from theinternational DNA sequence databases:status for the year2000(由国际DNA序列数据库制得的密码子使用：2000年状况)”Nucl.Acids Res.28:292(2000)。从GenBank Release151.0计算的人密码子使用表在下表5中再现(来自www.kazusa.or.jp/codon/同上)。这些表使用mRNA命名法，因此该表使用RNA中发现的尿嘧啶(U)，而不是DNA中发现的胸腺嘧啶(T)。所述表经过调整，从而频率针对各氨基酸计算，而不是所有64个密码子。
表5：人基因(智人(Homo sapiens))的密码子使用表
Figure BDA0000407120760000761
Figure BDA0000407120760000771
Figure BDA0000407120760000781
通过使用这些或相似的表，本领域普通技术人员可将所述频率应用于任何给定的多肽序列，并产生密码子优化的编码区域的核酸片段，所述编码区域编码多肽但使用对给定物种最优的密码子。
合成上述任何方法所设计的密码子优化的编码区域有很多选择，使用本领域普通技术人员熟知的标准和常规分子生物操作。
在一个实施方式中，本发明的载体中编码所述蛋白质的编码区是经密码子优化的。在另一个实施方式中，所述编码区对于人中的表达是密码子优化的。在一个特定实施方式中，所述序列是经密码子优化的核酸序列。
为了向细胞体内或离体引入多核苷酸，能使用载体。例如，所述载体可以是质粒载体或者单链或双链RNA或DNA病毒载体。所述载体可以通过将DNA和RNA引入细胞的熟知技术，引入到需要对象(例如哺乳动物)的细胞中。病毒载体可以是复制型或复制缺陷型。后一种情况中，病毒增殖通常只在互补宿主细胞中发生。本文使用的术语“宿主细胞”或“宿主”用于指有一个或多个本发明多核苷酸的本发明细胞。
因此，在最低限度，载体必需包含本发明的多核苷酸。载体的其他组分可以包括但不限于，选择标记、染色质修饰结构域、驱动载体上还存在的其他多肽(例如致死多肽)表达的额外启动子、基因组整合位点、重组位点和分子***支点。所述载体可以包含在或不在多核苷酸内的任何数目的这些附加元件，从而能根据所需治疗方法的特定目标调整所述载体。
在本发明的一个实施方式中，引入细胞的所述载体还包含“选择标记基因”，其表达时指示本发明的基因开关构建物已经整合到宿主细胞的基因组中。在这个方式中，所述选择基因能是基因组整合的阳性标记。尽管对本发明方法不重要，存在选择标记基因使操作者能选择所述细胞的基因组中已经整合载体构建物的活细胞群。因此，本发明的某些实施方式包含选择载体成功整合的细胞。当与细胞联用时，本文使用的术语“选择”或其变化意在指选择有特定遗传组成或表型的细胞的标准且熟知方法。一般方法包括但不限于在抗生素如G418、新霉素和氨苄青霉素存在时培养细胞。选择标记基因的其它示例包括但不限于赋予对二氢叶酸还原酶、潮霉素或霉酚酸抗性的基因。其它选择方法包括但不限于能使用胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶或腺嘌呤磷酸核糖基转移酶作为选择试剂的选择标记基因。包括含一个或多个抗生素抗性基因的载体构建物的细胞然后能耐受培养中的抗生素。类似地，不包括含一个或多个抗生素抗性基因的载体构建物的细胞不能耐受培养中的抗生素。
本文使用的“染色质修饰结构域”(CMD)指某些核苷酸序列，所述核苷酸序列与维持和/或改变染色质结构有关的多种蛋白质(例如但不限于DNA隔离子(insulator))相互作用。参见Ciavatta等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:9958(2006)。CMD示例包括但不限于鸡β-球蛋白隔离子和鸡超敏感位点4(cHS4)。例如，一种或多种基因程序(即启动子、编码序列和3'调节区)之间应用不同CMD序列能促进联用差异CMD DNA序列作为“最小同源臂”与多种微生物或体外重组技术，以在现有多基因和单基因穿梭载体之间“交换”基因程序。染色质修饰结构域的其它示例为本领域已知或易于鉴定。
本发明的载体中的多核苷酸和核酸编码区可与其它编码区相连，所述其它编码区编码指导蛋白分泌的分泌或信号肽。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白质链跨粗面内质网的输出启动，所述序列从成熟蛋白质上切除。脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合于所述多肽N末端的信号肽，它们从完整或“全长”多肽上切除以产生分泌或“成熟”形式的多肽。
在一个实施方式中，本发明的载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，其与通过所述配体依赖性转录因子活化的启动子操作性连接，其中所述编码一种或多种蛋白质的多核苷酸还包含编码信号肽的核酸序列。在另一个实施方式中，所述信号肽相较于包含所述蛋白质天然信号肽基因的载体增加由所述载体编码的蛋白质分泌。具体而言，本发明所用的信号肽可经密码子优化。
本发明的载体能包含多个调节区，例如5’非翻译区(5’UTR)、3’UTR或两者都有。本发明也针对使用多个调节区来诱导改善的分泌、蛋白质翻译、翻译后、mRNA转录或转录后加工。本文使用的基因的“5’非翻译区”或“5’UTR”应理解为，转录成初级RNA转录物(前体mRNA)的基因部分，并且所述部分位于编码区的上游。所述初级转录物是DNA转录生成的起始RNA产物，包含内含子和外显子。很多初级转录物必需经过RNA加工以形成生理活性的RNA种类。所述加工成成熟mRNA可以包含修剪末端、去除内含子，加帽和/或从其前体RNA上切除单个rRNA分子。因此mRNA的5'UTR是mRNA不翻译成蛋白质并且位于编码序列上游的一部分。在基因组序列中，所述5'UTR通常定义为转录起始位点和起始密码子之间的区域。脊椎动物mRNA的5'非翻译区(5'UTR)的长度可以是几十个碱基到几百个碱基(Crowe等，2006BMC Genomics7:16)。本文使用的5'UTR可以天然产生或修饰成包含天然不毗连的一个或多个核酸序列(嵌合序列)和/或可以包含取代、***和缺失及其组合。在一个实施方式中，所述5’UTR序列来自野生型TNFα序列或5U2序列。在另一个实施方式中，所述5'UTR序列是5U2的5'UTR。在一些实施方式中，所述5'UTR诱导改善的蛋白质表达，例如mRNA转录、转录前或转录后。
本发明使用的3’非编码区(UTR)指位于编码序列下游(3’)的DNA序列，并且可以包含聚腺苷酸化[聚(A)]识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。聚腺苷酸化信号的特征通常是影响聚腺苷酸束添加至mRNA前体的3'末端。能使用任何合适的聚腺苷酸化序列，包含合成的优化序列，以及BGH(牛生长激素)、多瘤病毒、TK(胸苷激酶)、EBV(爱波斯坦-巴尔病毒)和包含人***瘤病毒及BPV(牛***瘤病毒)在内的***瘤病毒的聚腺苷酸化序列。在特定实施方式中，3’调节区是SV40e(人肉瘤病毒-40)聚腺苷酸化序列。在另一个特定实施方式中，3'调节区是人生长激素的聚腺苷酸化序列。
在某些实施方式中，与不含所述信号肽和/或调节区的对照相比，所述单独或联合的信号肽和/或调节区能使蛋白质分泌、转录或翻译提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍或500倍。蛋白质(例如TNF-α)的分泌水平能根据有野生型基因的载体所编码蛋白质表达标准化。在本发明的另一个特定实施方式中，所述单独或联合的信号肽和/或调节区能使所述蛋白质的产率增加约5%-约10%、约11%-约20%、约21%-约30%、约31%-约40%、约41%-约50%、约51%-约60%、约61%-约70%、约71%-约80%、约81%-约90%,约91%-约100%、约101%-约149%、约150%-约199%、约200%-约299%、约300%-约499%或约500%-约1000%。在特定实施方式中，本发明包含条件性表达蛋白质的载体，其中所述载体包含5U2的5'UTR、编码IL-2信号肽的密码子优化的核酸序列、编码蛋白质的密码子优化的编码区和SV40e或人生长激素的聚腺苷酸化信号。
本发明使用的特定载体是编码蛋白质或多核苷酸的表达载体。通常，所述载体包含对宿主中表达有效的顺式作用控制区域，所述区域操作性连接要表达的多核苷酸。合适的反式作用因子可以由宿主提供，由互补载体提供或引入宿主后由载体本身提供。
很多表达载体能用于表达蛋白质或多核苷酸。这种载体包含染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒如腺相关病毒、慢病毒、杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒的载体，和衍生自其结合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件如粘粒和噬菌粒的那些。所有都可以用于本发明此方面所述的表达。通常，任何适于在宿主中维持、增殖或表达多核苷酸或蛋白质的载体可以用于这方面的表达。
用于本发明的合适病毒载体包括但不限于基于腺病毒的载体、逆转录病毒病毒、基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体、基于细小病毒的载体如基于腺相关病毒(AAV)的载体和AAV腺病毒嵌合载体。这些病毒载体能使用标准重组DNA技术制备，所述技术描述于例如Sambrook等，Molecular Cloning,a Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第2版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(1989)，和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，纽约州纽约的格林出版联合公司(Greene Publishing Associates)和约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons)(1994)。
在一个实施方式中，本发明的病毒载体是腺病毒载体。腺病毒(Ad)是在体内有效转移DNA到多种不同靶标细胞类型的36kb双链DNA病毒。腺病毒载体能以高效价生成，并能有效转移DNA到复制和非复制细胞中。腺病毒载体基因组能使用任何种，株，亚型，种、株、亚型的混合物或嵌合腺病毒作为载体DNA的来源生成。能用作腺病毒来源的腺病毒储液能从腺病毒血清型1-51(目前可得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC，弗吉尼亚州玛纳萨斯))或从来自任何其他来源的任何其他腺病毒血清型中扩增。例如，腺病毒能是亚群A(例如血清型12、18和31)、亚群B(例如血清型3、7、11、14、16、21、34和35)、亚群C(例如血清型1、2、5和6)、亚群D(例如血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39和42-47)、亚群E(血清型4)、亚组F(血清型40和41)或任何其他腺病毒血清型。鉴于所述人腺病毒血清型5(Ad5)基因组已经完整测序，本发明的腺病毒载体在本文中就Ad5血清型方面进行描述。所述腺病毒载体可以是能在细胞中生长的任何腺病毒载体，其一些重要部分(尽管基本上不必需)衍生自或基于腺病毒的基因组。所述腺病毒载体能基于任何合适的野生型腺病毒基因组。在某些实施方式中，所述腺病毒载体衍生自C群的野生型腺病毒基因组，特别是血清型2或5。腺病毒载体为本领域熟知，描述于例如美国专利号5,559,099、5,712,136、5,731,190、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,962,311、5,965,541、5,981,225、5,994,106、6,020,191和6,113,913，国际专利申请WO95/34671、WO97/21826、和WO00/00628，以及Thomas Shenk,"Adenoviridae and theirReplication(腺病毒科和其复制)"和M.S.Horwitz,"Adenoviruses(腺病毒)"分别收录于Virology(《病毒学》)第67和68章，B.N.Fields等编，第3版，纽约的雷文出版社有限公司(Raven Press,Ltd.)(1996)。
在其它实施方式中，所述腺病毒载体是复制缺陷型。本文使用的术语“复制缺陷型”指所述腺病毒载体包含缺乏至少一个复制必需基因功能的基因组。本文使用的基因、基因功能、或者基因或基因组区域的缺陷定义为缺失病毒基因组的充分遗传材料从而损坏或消除基因的功能，所述基因的核酸序列全部或部分被删除。复制必需基因功能是对复制缺陷型腺病毒载体的复制(即增殖)而言必需的那些基因功能。复制必需基因功能由例如腺病毒早期区(例如E1、E2和E4区)、晚期区(例如L1-L5区)、涉及病毒包装的基因(例如IVa2基因)和病毒相关RNA(例如VA-RNA I和/或VA-RNA II)来编码。在其它实施方式中，所述复制缺陷型腺病毒载体包含一个或多个腺病毒基因组区域的至少一个复制必需基因功能缺陷的腺病毒基因组(例如，腺病毒基因组的两个或多个区从而产生多重复制缺陷型腺病毒载体)。腺病毒基因组的一个或多个区域选自E1、E2和E4区。所述复制缺陷型腺病毒载体能包含E1区的至少一个复制必需基因功能的缺失(标注为E1缺陷型腺病毒载体)，特别是每个腺病毒E1A区和腺病毒E1B区的复制必需基因功能的缺失。除了所述E1区的缺陷，重组腺病毒也能有主要晚期启动子(MLP)的突变，如国际专利申请WO00/00628中所讨论。在一个特定的实施方式中，所述载体在E1区的至少一个复制必需基因功能和至少部分非必需E3区(例如E3区的Xba I删除)(标注为E1/E3缺陷型腺病毒载体)上缺陷。
在某些实施方式中，所述腺病毒载体是“多重缺陷”，指所述腺病毒载体在腺病毒基因组的两个或多个区域各自病毒复制所需的一个或多个基因功能上缺陷。例如，前述E1缺陷型或E1/E3缺陷型腺病毒载体还能在E4区的至少一个复制必需基因功能上缺陷(标注为E1/E4缺陷型腺病毒载体)。删除整个E4区的腺病毒载体能引起更低的宿主免疫反应。
或者，所述腺病毒载体缺乏全部或部分E1区和全部或部分E2区中的复制必需基因功能(标注为E1/E2缺陷型腺病毒载体)。本文也考虑缺乏全部或部分E1区、全部或部分E2区和全部或部分E3区中复制必需基因功能的腺病毒载体。如果本发明的腺病毒载体缺乏E2A区的复制必需基因功能，所述载体不包含长度小于约230碱基对的E2A区完全删除。通常，腺病毒的E2A区编码DBP(DNA结合蛋白)，DBP是DNA复制所需的多肽。DBP根据病毒血清型由473-529个氨基酸组成。认为DBP是以由带延伸Nt结构域的球形Ct组成的长椭球形式存在的不对称蛋白质。研究显示Ct结构域负责DBP结合核酸、结合锌的能力和在DNA链延长水平的DNA合成中的功能。然而，认为所述Nt结构域在晚期基因表达的转录和转录后水平中有功能，负责蛋白质的有效的核定位，并且也可以涉及其自身表达的提高。Nt结构域在氨基酸2-38间的缺失显示这个区对DBP功能重要(Brough等，Virology,196,269-281(1993))。而编码DBP中Ct区的E2A区删除对病毒复制没有影响，编码DBP中Nt结构域氨基酸2–38的E2A区删除削弱病毒复制。在一个实施方式中，多重复制缺陷型腺病毒载体包含腺病毒基因组E2A区的所述部分。特别是例如，要保持的所需E2A区部分是腺病毒基因组E2A区的部分，其由E2A区的5'末端定义，特别是血清型Ad5的腺病毒基因组E2A区的位置Ad5(23816)-Ad5(24032)。
所述腺病毒载体能仅缺乏腺病毒基因组早期区的复制必需基因功能、仅缺乏腺病毒基因组晚期区的复制必需基因功能、和同时缺乏腺病毒基因组早期区和晚期区的复制必需基因功能。所述腺病毒载体也能基本移除全部腺病毒基因组，其中至少病毒的反向末端重复(ITR)和一个或多个启动子或病毒ITR和包装信号完好保留(例如腺病毒扩增子)。移除的腺病毒基因组区域越大，能***基因组的外源核酸序列段越大。例如，鉴于病毒ITR和一个或多个启动子保持完整时所述腺病毒基因组是36kb，所述腺病毒的外源***容量是约35kb。或者，只包含ITR和包装信号的多重缺陷型腺病毒载体能有效地***约37-38kb的外源核酸序列。当然，在任何或全部缺陷型腺病毒区中纳入间隔子元件会降低腺病毒载体就大***物而言的容量。包含多重缺陷型腺病毒载体的合适复制缺陷型腺病毒载体公开于美国专利号5,851,806和5,994,106以及国际专利申请WO95/34671和WO97/21826。在一个实施方式中，用于本发明方法的载体描述于国际专利申请PCT/US01/20536中。
应理解腺病毒载体的不同区域删除能改变哺乳动物的免疫反应。特别地，不同区域的删除会降低由腺病毒载体引起的炎症反应。另外，所述腺病毒载体外壳蛋白能经修饰以降低腺病毒载体被针对野生型外壳蛋白的中和抗体识别的能力或无力，如国际专利申请WO98/4050所述。
当腺病毒载体是多重复制缺陷型(特别是E1和E4区的复制必需基因功能)时，能包含间隔子元件以提供在互补细胞系中的病毒生长，这类似于单个复制缺陷型腺病毒载体(特别是包含E1区缺陷的腺病毒载体)所实现的。所述间隔子元件能包含具有所需长度的任何一个或多个序列。所述间隔子元件序列相对腺病毒基因组能是编码或非编码和天然或非天然的，但不恢复缺陷区的复制必需功能。没有间隔子时，多重复制缺陷型腺病毒载体的纤维蛋白生成和/或病毒生长通过与单个复制缺陷型腺病毒载体的比较而降低。然而，在至少一个缺陷型腺病毒区(优选E4区)中包含间隔子能抵消纤维蛋白生成和病毒生长中的这种降低。间隔子在腺病毒载体中的应用描述于美国专利号5,851,806。
腺病毒载体的构建为本领域熟知。腺病毒载体能使用例如美国专利号5,965,358和国际专利申请WO98/56937、WO99/15686和WO99/54441所述的方法构建和/或纯化。腺病毒基因转移载体的生成为本领域熟知，并且涉及使用标准分子生物学技术，例如Sambrook等，同上，Watson等，同上，Ausubel等，同上，和本文所提及其他几篇参考文献中所述的那些。
复制缺陷型腺病毒载体通常在互补细胞系中生成，所述互补细胞系以合适水平提供复制缺陷型腺病毒载体中没有但病毒增殖需要的基因功能，从而生成高效价的病毒载体储液。在一个实施方式中，细胞系对复制缺陷型腺病毒中没有的至少一个和/或所有复制必需基因功能互补。所述互补细胞系能对至少一个复制必需基因功能缺陷互补，所述复制必需基因功能由早期区、晚期区、病毒包装区、病毒相关RNA区或其组合编码，包括所有的腺病毒功能(例如能增殖包含最小腺病毒序列的腺病毒扩增子，例如仅是反向末端重复(ITR)和包装信号或者仅ITR和腺病毒启动子)。在另一个实施方式中，所述互补细胞系对腺病毒基因组E1区的至少一个复制必需基因功能(例如，两个或多个复制必需基因功能)缺陷互补，特别是对每个E1A和E1B区的复制必需基因功能缺陷互补。另外，所述互补细胞系能对腺病毒基因组E2(特别是考虑腺病毒DNA聚合酶和末端蛋白)和/或E4区的至少一个复制必需基因功能缺陷互补。理想地，对E4区缺陷互补的细胞包含E4-ORF6基因序列且生成E4-ORF6蛋白。这种细胞需要包含腺病毒基因组E4区的至少ORF6且没有其它ORF。优选细胞系的特征还在于其包含以不重叠方式与腺病毒载体互补的基因，所述腺病毒载体最小化和实际上消除载体基因组与细胞DNA重组的可能性。因此，即使不能在载体储液中避免，尽可能减少复制型腺病毒(RCA)的出现，从而适合某些治疗目的，特别是基因治疗目的。载体储液中RCA的缺乏避免了非互补细胞中腺病毒载体的复制。构建互补细胞系涉及到标准的分子生物学和细胞培养技术，例如Sambrook等，同上和Ausubel等，同上所述的那些。生产基因转移载体的互补细胞系(例如腺病毒载体)包括但不限于293细胞(描述于例如Graham等，J.Gen.Virol.,36,59-72(1977))、PER.C6细胞(描述于例如国际专利申请WO97/00326以及美国专利号5,994,128和6,033,908)和293-ORF6细胞(描述于例如国际专利申请WO95/34671和Brough等，J.Virol.,71,9206-9213(1997))。通过已知方法如在给定腺病毒基因组位置引入独特限制性位点，能帮助***核酸序列到腺病毒基因组(例如腺病毒基因组的E1区)中。
逆转录病毒是能感染广泛宿主细胞的RNA病毒。转染后，所述逆转录病毒基因组整合到宿主细胞的基因组中，并且与宿主细胞DNA一起复制，因此持续生成病毒RNA和任何整合到逆转录病毒基因组中的核酸序列。如此，使用逆转录病毒时可实现治疗因子的长期表达。考虑用于基因治疗的逆转录病毒为相对非致病性，尽管存在致病性逆转录病毒。当使用致病性逆转录病毒例如人免疫缺陷病毒(HIV)或人T细胞淋巴营养性病毒(HTLV)时，必需注意改变病毒基因组以消除对宿主的毒性。还能操作逆转录病毒载体以产生病毒复制缺陷型。如此，认为逆转录病毒载体对体内稳定基因转移尤其有用。慢病毒载体例如基于HIV的载体，是用于基因递送的逆转录病毒载体的示例。不同于其他逆转录病毒，已知基于HIV的载体将其乘客基因整合到非***细胞，并且因此能用于治疗持久型疾病。
基于HSV的病毒载体适用作基因转移载体以引入核酸到多种细胞类型。成熟HSV病毒颗粒由封装的二十四面衣壳和病毒基因组组成，所述病毒基因组由152kb的线性双链DNA分子组成。大部分复制缺陷型HSV载体包含缺失以去除一个或多个中间-早期基因从而防止复制。HSV载体的优势是能进入可产生长期DNA表达的潜伏阶段和其能适应多至25kb外源DNA***的大病毒DNA基因组。当然，HSV促进长期外源蛋白生成的能力在短期治疗方案中可能是劣势。然而，一种本领域普通技术具有必要的了解以决定用于特定情况的合适载体。基于HSV的载体描述于例如美国专利号5,837,532、5,846,782、5,849,572和5,804,413，以及国际专利申请WO91/02788、WO96/04394、WO98/15637和WO99/06583。
AAV载体是基因治疗方案中使用的特别感兴趣的病毒载体。AAV是DNA病毒，在造成人疾病方面未知。所述AAV基因组由两个基因即侧接有反向末端重复(ITR)的rep和cap组成，其包含用于DNA复制和病毒包装的识别信号。为了有效复制，AAV需要与辅助病毒(例如腺病毒或单纯疱疹病毒)共感染或辅助基因表达。根据使用的辅助病毒，AAV能在广泛的宿主细胞中增殖，所述细胞包含人、猿和啮齿动物细胞。用于给予核酸序列的AAV载体通常删除约96%的亲本基因组，从而只保留ITR。这消除了由于表达病毒基因造成的免疫学或毒性副作用。如果需要，所述AAV rep蛋白能与AAV载体共同给予以使AAV载体整合到宿主细胞基因组中。包含有已整合AAV基因组的宿主细胞在细胞生长或形态方面没有显示改变(参见例如美国专利号4,797,368)。如此，来自AAV载体的治疗因子的延长表达能用于治疗持续性和慢性疾病。
表达载体中的多核苷酸序列操作性连接合适的表达控制序列，所述表达控制序列包含例如指导mRNA转录的启动子。其他启动子的代表包括但不限于组成型启动子和组织特异性或诱导型启动子。组成型真核启动子的示例包括但不限于，小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等，J.Mol.Appl.Gen.1:273(1982))；疱疹病毒的TK启动子(McKnight,Cell31:355(1982))；SV40早期启动子(Benoist等，Nature290:304(1981))和痘苗病毒启动子。能用于驱动蛋白或多核苷酸表达的启动子的其他示例包括但不限于，用于特定蛋白的组织特异性启动子和其他内源启动子如白蛋白启动子(肝实质细胞)、胰岛素原启动子(胰腺β细胞)等。通常，表达构建物会包含转录、起始和终止位点，以及转录区域中的核糖体翻译结合位点。构建物所表达成熟转录物的编码部分可以包含开始处的翻译起始AUG和待翻译多肽末端合适位置处的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
另外，所述构建物可以包含调节和产生表达的控制区。通常，这类区域会通过控制转录操作，例如阻遏物结合位点和增强子等。
真核载体的示例包括但不限于可获自司查塔基公司(Stratagene)的pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；可获自安法马西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech)的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；和可获自克隆泰克公司(Clontech)的pCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito和pCMV-EGFP。很多其他载体是熟知的，并且市售可得。
包含分子***支点以快速***和移除基因程序元件的特别有用载体描述于美国公开专利申请号2004/0185556、美国专利申请号11/233,246和国际公开申请号WO2005/040336及WO2005/116231。这种载体的示例是UltraVectorTM生成***(Production System)(弗吉尼亚州布莱克斯堡的英创松公司(Intrexon))，如WO2007/038276所述。本文使用的“基因程序”是基因元件的组合，所述元件包含启动子(P)、表达序列(E)和3′调节序列(3)，从而“PE3”是基因程序。基因程序内的元件能在所述基因程序每个元件侧翼的分子支点之间容易地交换。本文使用的分子支点定义为包含以线性方式排列的至少两个非可变、罕见或不常见限制位点的多核苷酸。在一个实施方式中，所述分子支点包含以线性方式排列的至少三个非可变的罕见或不常见限制位点。通常任何一个分子支点可以不包含相同基因程序中任何其他分子支点的罕见或不常见限制位点。限制性酶作用的大于6个核苷酸的关联序列称为“罕见”限制位点。然而，6bp限制性位点的出现频率高于统计学预测，这些位点和切割它们的核酸内切酶称作“不常见”限制位点。罕见或不常见限制位点的示例包括但不限于AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、FlpI、Pme I、Sda I、Sgf I、Srf I、Nru I、Acl I、Cla I、Csp45I、Age I、Bst1107I、BstB I、Hpa I、Aat II、EcoR V、Nhe I、Spe I、Avi II、Avr II、Mfe I、Afe I、Fsp I、Kpn I、Sca I、BspE I、Nde I、Bfr I、Xho I、Pml I、ApaL I、Kas I、Xma I、BsrB I、Nsi I、Sac II、Sac I、Blp I、PspoM I、Pci I、Stu I、Sph I、BamH I、Bsu36I、XbaI、BbvC I、Bgl II、Nco I、Hind III、EcoR I、BsrG I和Sse8781I。
载体也可以包含称为归巢内核酸内切酶(HE)的第二类限制性酶的限制位点。HE酶有大的、不对称的限制位点(12-40碱基对)并且其限制位点天然稀少。例如，称为I-SceI的HE具有18bp限制性位点(5′TAGGGATAACAGGGTAAT3′)，预计在每7×1010个碱基对的随机序列中仅出现一次。这个发生率等于哺乳动物基因组20倍大小的基因组中只有一个位点。如果克隆载体质粒的合适位置中含有HE位点，HE位点的罕见特性将大大提高遗传工程技术人员切割基因程序而不破坏基因程序完整性的可能性。
选择合适的载体和启动子以在宿主细胞中表达是熟知的过程，并且用于载体构建和引入宿主以及宿主中表达的必需技术是本领域的常规技术。
引入多核苷酸到细胞中能是短暂转染、稳定转染或能是载体的基因座特异性***。向宿主细胞中短暂和稳定转染载体能通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法实现。这种方法描述于很多标准实验室手册，例如Davis等，Basic Methods in MolecularBiology(分子生物学基本方法)(1986);Keown等，1990,Methods Enzymol.185:527-37;Sambrook等，2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第三版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社。这些稳定转染方法造成载体随机***细胞基因组中。另外，载体的拷贝数和方向通常来说也是随机的。
在本发明的一个实施方式中，将载体***到基因组的生物中性位点。生物中性位点是基因组中多核苷酸***对细胞的正常功能干扰(若有)非常小的位点。生物中性位点能用可用的生物信息学分析。很多生物中性位点为本领域已知，如ROSA等价基因座。其他生物中性位点可以使用本领域熟知的常规技术确定。使用本领域已知方法进行基因组***位点的鉴定。为了在引入载体到细胞中时控制多核苷酸的位置、拷贝数和/或方向，可以使用基因座特异性***方法。基因座特异性***方法为本领域熟知，并且包括但不限于同源重组和重组酶介导的基因组***。当然，如果基因座特异性***方法用于本发明的方法，载体可以包含辅助此基因座特异性***(例如但不限于同源重组)的元件。例如，载体可以包含一个、两个、三个、四个或更多的基因组整合位点(GIS)。本文使用的“基因组整合位点”定义为载体序列的部分，其核苷酸序列与细胞中能使载体***基因组的基因组部分相同或基本相同。特别地，载体可以包含在至少多核苷酸侧翼的两个基因组***位点。当然，所述GIS可以在其他元件或甚至载体上出现的所有元件的侧翼。
在另一个实施方式中，基因座特异性***可以通过重组酶位点特异性基因***完成。简单说，细菌重组酶(例如但不限于PhiC31整合酶)能作用于人基因组内的“假”重组位点。这些假重组位点能是使用重组酶的基因座特异性***靶标。重组酶位点特异性基因***描述于Thyagarajan等，Mol.Cell Biol.21:3926(2001)。重组酶和其可用于重组酶位点特异性基因***的各自位点的其他示例包括但不限于丝氨酸重组酶如R4和TP901-1及WO2006/083253所述的重组酶。
在另一个实施方式中，所述载体可以包含化疗抗性基因，如多药耐药基因mdr1、二氢叶酸还原酶或O6-甲基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶。所述化疗抗性基因可以受组成型(例如CMV)或诱导型(例如
Figure BDA0000407120760000891
)启动子控制。在这个实施方式中，如果需要治疗对象的疾病而维持对象中修饰的细胞，临床医生可以应用化疗试剂来破坏患病细胞，而所述修饰细胞会由于表达合适的化疗抗性基因而受到保护抵御所述试剂，并且可以持续用于疾病或紊乱的治疗、改善或预防。通过将化疗抗性基因置于诱导型启动子下，能避免化疗抗性基因的不必要表达，但是在需要持续治疗的情况中其仍然可用。如果所述修饰细胞本身患病，其仍然会通过诱导下述致死多肽的表达而被破坏。
本发明的方法通过把编码基因开关的多核苷酸和外源基因引入到对象细胞中完成。能使用本领域已知的引入多核苷酸到细胞的任何已知方法，如上面描述的那些方法。
当所述多核苷酸离体引入细胞中时，所述细胞可以使用任何本领域已知的技术从所述对象获得，所述技术包括但不限于活检、刮擦和手术组织去除。所述分离细胞可培养足够时间以使多核苷酸能引入到所述细胞中，所述时间如2、4、6、8、10、12、18、24、36、48小时或更多。短时间段培养原代细胞的方法为本领域熟知。例如，细胞能在平板(如微孔板)中贴壁或悬浮培养。
对离体治疗方法而言，从对象分离细胞并在适于引入多核苷酸到所述细胞的条件下培养。一旦多核苷酸引入到细胞中，培养所述细胞足够的时间段以表达配体依赖性转录因子，所述时间如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18或24小时或更多。在所述多核苷酸引入到所述细胞后的一些点(表达显著水平的配体依赖性转录因子之前或之后)，引入所述细胞回到所述对象。重新引入可以通过本领域已知的任何方法完成，如静脉内输注或直接注射到组织或空腔。在一个实施方式中，在引入细胞回到对象前测定细胞中多核苷酸的存在。在另一个实施方式中，选择包含多核苷酸的细胞(例如基于多核苷酸中选择标记的出现)并且仅将那些包含多核苷酸的细胞重新引入到对象中。所述细胞重新引入所述对象后，给予所述对象配体以诱导治疗多肽或治疗多核苷酸的表达。在另一个实施方式中，甚至在所述细胞重新引入到所述对象前，向细胞加入所述配体，从而在重新引入所述细胞前表达治疗多肽或治疗多核苷酸。可以通过任何合适的方法给予配体，或***地给予(例如口服、静脉)或局部给予(例如腹膜内、鞘内、心室内、直接注射到重新引入细胞的所述组织或器官中)。对于每种类型的细胞和疾病或紊乱，仅使用常规技术能测定配体给予的最佳时间。
本发明的体内治疗方法涉及体内向对象细胞直接引入多核苷酸，例如腺病毒载体。所述多核苷酸可以***地或局部地(例如在所述局部或紊乱的位点)引入到对象中。一旦多核苷酸引入到所述对象中，给予所述配体以诱导治疗多肽或治疗多核苷酸的表达。可以通过任何合适的方法给予配体，或***地给予(例如口服、静脉)或局部给予(例如腹膜内、鞘内、心室内、直接注射到所述疾病或紊乱发生的组织或器官中)。对于每种类型的细胞和疾病或紊乱，仅使用常规技术能测定配体给予的最佳时间。
对体内使用而言，本文所述配体可在药学上可接受运载体中吸收，例如溶液、悬浮液、片剂、胶囊、软膏、酏剂和可注射组合物。药物组合物可以包含0.01%-99%重量的配体。组合物可以是单个或多个剂量形式。任何特定药物组合物中的配体量取决于所述有效剂量，即引起所需基因表达或抑制需要的剂量。
本文使用的术语"rAD.RheoIL12"指有基因开关
Figure BDA0000407120760000901
治疗***(RTS)控制下IL-12基因的腺病毒多核苷酸载体，在活化配体出现时能生成IL-12蛋白。本文使用的术语"rAd.cIL12"指包含组成型启动子控制下IL-12基因的腺病毒多核苷酸控制载体。
本文使用的术语"IL-12p70"指天然有两个亚基(通常称为p40和p35)的IL-12蛋白。术语IL-12p70包括含有两个IL-12亚基(p40和p35)的融合蛋白，其中所述融合蛋白可以包含亚基之间的接头氨基酸。
给予药物制剂的合适途径包含口腔、直肠、局部(包含皮肤、口颊和舌下)、***、胃肠外(包含皮下、肌肉内、静脉内、肿瘤内、皮内、鞘内和硬膜外)和通过鼻胃管。本领域技术人员应理解给予途径取决于要治疗的病症，并且根据诸如受体情况等因素而变化。
本文所用的术语“活化”或“激活”指基因开关的细胞活性的任何可测量增加，引起感兴趣基因的表达。
本文使用的术语"治疗"或"处理"疾病指操作某一方案，所述方案可以包含给予哺乳动物(人或非人)一种或多种药物或体外工程改造的细胞，以缓解疾病的征兆或症状。因此，"治疗"或"处理"不应该解释为需要完全改善征兆或症状，不需要治愈，且特定包含仅对对象产生边际效果的方案。
本文所用的术语“体外经工程改造的细胞”或“体外经工程改造的细胞群”或“经工程改造的细胞群”或“表达蛋白质的细胞”指在基因开关的控制下条件性表达蛋白质的细胞，所述基因开关可由活化配体激活。
本文使用的术语"修饰的细胞"指通过某一过程改变的细胞，所述过程包括但不限于转染、电穿孔、微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀和脂质转染(溶酶体融合)。
本文使用的术语"MOI"或"感染复数"指特定实验中感染单个细胞的腺病毒颗粒的平均数目(例如重组腺病毒或对照腺病毒)。
在另一个实施方式中，本发明的所述载体和方法能用于治疗疾病。
在另一个实施方式中，本发明的所述载体和方法能用于治疗肾病。在一个实施方式中，所述肾病是肾衰竭。在另一个实施方式中，所述肾病是慢性肾衰竭。
在另一个实施方式中，本发明的载体和方法可用于治疗贫血。在一个实施方式中，所述贫血是肾病相关性贫血，例如肾衰竭或慢性肾衰竭相关性贫血。在另一个实施方式中，所述贫血与癌治疗有关，例如用一种或多种化学治疗剂治疗。在另一个实施方式中，所述贫血与高龄有关。在另一个实施方式中，所述贫血与肺功能受损有关。在另一个实施方式中，所述贫血与骨髓异常增生有关。在另一个实施方式中，所述贫血与放射治疗有关。在另一个实施方式中，所述贫血与重大疾病有关。
在一个实施方式中，所述贫血与心脏病无关。在另一个实施方式中，所述响应***治疗的疾病、紊乱或病症不是心脏病。“心脏病”的非限制性类型有充血性心衰竭、缺氧、缺血性心脏病、高血压性心脏病、冠状动脉疾病、周边血管性疾病和缺血性心脏事件，例如心肌梗塞、心脏病发作、心衰竭、心律不齐、心肌破裂、心包炎、心因性休克、血栓形成、栓塞、动脉粥样硬化和动脉狭窄。
在另一个实施方式中，所述包含***或其激动剂编码多核苷酸的多核苷酸不同时编码依那西普(etanercept)，依那西普是TNF受体-Fc融合体。在另一个实施方式中，所述包含***或其激动剂编码多核苷酸的多核苷酸不给予如下对象：所述对象也给予包含依那西普编码多核苷酸的多核苷酸。
在一个实施方式中，本发明的载体和方法可用于治疗多发性硬化症。在一个实施方式中，所述载体包含编码干扰素的多核苷酸序列或其片段。在另一个实施方式中，所述载体包含编码干扰素-β的多核苷酸序列或其片段。在另一个实施方式中，所述载体包含编码髓磷脂碱性蛋白(MBP)的多核苷酸序列或其片段。在一个实施方式中，所述载体包含编码干扰素(例如干扰素-β)的多核苷酸序列或其片段和编码髓磷脂碱性蛋白的多核苷酸序列或其片段。
在另一个实施方式中，本发明的载体和方法可用于治疗血管性水肿。在另一个实施方式中，所述血管性水肿是遗传性血管性水肿。在一个实施方式中，所述载体包含的多核苷酸序列编码选自C1酯酶抑制剂(例如人C1酯酶抑制剂)、激肽释放素)抑制剂或舒缓激肽B2受体拮抗剂的分子。
在另一个实施方式中，本发明的载体和方法用于治疗疾病、病症或紊乱，其中C1酯酶的抑制提供治疗有益效果。在该实施方式中，所述载体包含编码C1酯酶抑制剂的多核苷酸序列，以治疗例如选自败血症、血凝过快、肺功能障碍、低血氧症、出血性胰炎、心肌梗塞、肺移植、外伤、烧损伤和血管渗漏的疾病、病症或紊乱。
在另一个实施方式中，本发明的载体和方法用于治疗疾病、病症或紊乱，其中激肽释放素的抑制提供治疗有益效果。所述疾病、病症或紊乱的示例包括但不限于接触***的疾病、病症或紊乱。参见例如Shariat-Madar等，InnateImmunity,10卷1号3-13(2004)和Frick等，EMBO J.,(2006)25,5569–5578(2006)。在该实施方式中，所述载体包含编码激肽释放素抑制剂的多核苷酸序列，以治疗例如选自动脉粥状栓塞症、冠状动脉疾病、阿兹海默(Alzheimer)氏症、炎性肠病(例如克罗恩氏病)、血管渗漏、急性呼吸窘迫综合症或舒缓激肽介导的炎症的疾病、病症或紊乱。在一个实施方式中，所述载体包含编码激肽释放素抑制剂的多核苷酸序列。激肽释放素抑制剂的示例包括但不限于艾卡拉肽(ecallantide)和美国专利公开号2010/0034805、2009/0264350、2009/0234009、2008/0221031、2007/0213275、2006/0264603和2005/0089515中所述的激肽释放素抑制剂，所述专利各通过引用全文纳入本文。在另一个实施方式中，本发明的载体和方法可用于治疗肺高血压。在一个实施方式中，所述肺高血压是肺动脉性高血压。在另一个实施方式中，所述肺动脉性高血压是自发性肺动脉性高血压。在另一个实施方式中，所述肺动脉性高血压是家族性肺动脉性高血压。在另一个实施方式中，所述肺动脉性高血压是与其它疾病或病症有关的肺动脉性高血压。在另一个实施方式中，所述肺动脉性高血压是继发于其它病症的肺动脉性高血压。在另一个实施方式中，所述肺动脉性高血压是继发性肺动脉性高血压。在另一个实施方式中，所述肺动脉性高血压与显著静脉或毛细血管受累相关，例如肺静脉闭塞症和肺毛细血管瘤。在另一个实施方式中，所述肺动脉性高血压是新生儿的持续性肺高血压。在一个实施方式中，所述载体经肌肉内给予。
在一个实施方式中，术语"***素合酶"是选自***素合酶、***素合成酶、***素合成酶1、***素合成酶2、***素内过氧化物合成酶、***素E合成酶、***素H2合成酶、***素G/H合成酶1、***素G/H合成酶2、PG合成酶、环氧合酶(COX)、COX-1、COX-2和COX-3的多肽。
人***素G/H合酶1核苷酸序列的登录号是NC_000009，人***素G/H合酶1氨基酸序列的登录号是：NP_000953。参见例如，Lander等，Nature429:369-374(2004)。
人***素G/H合酶2核苷酸序列的登录号是NC_000001，人***素G/H合酶2氨基酸序列的登录号是：NP_000954.1。参见例如，Lander等，Nature431:931-945(2004)。
人干扰素β的登录号是NP_002167.1。
人GLP-1的登录号是RP_12738。
人GLP-2的登录号是RP_10769。
人脂连蛋白的登录号是ABZ10942.1。
人瘦体素的登录号是AAH69323.1。
人CFTR的登录号是ABD72213.1。
人IL-10的登录号是NP_000563。
在另一个实施方式中，本发明的载体和方法用于治疗疾病、病症或紊乱，其中舒缓激肽B2受体的抑制提供治疗有益效果。在这个实施方式中，所述载体包含编码舒缓激肽B2受体抑制剂的多核苷酸序列，以治疗例如选自肾小球硬化、阿兹海默病、脑水肿、血管渗漏、急性呼吸窘迫综合症、疼痛、发炎、创伤、烧伤、休克、过敏和心血管疾病的疾病、病症或紊乱。舒缓激肽B2受体抑制剂的示例包括但不限于哈罗基那他汀(helokinestatin)和抗舒缓激肽B2受体抗体。哈罗基那他汀的氨基酸序列是Gly-Pro-Pro-Tyr-Gln-Pro-Leu-Val-Pro-Arg(Kwok,H.F.等，Peptides29I65-72(2008)，通过引用全文纳入本文)。抗舒缓激肽B2受体抗体的非限制性示例如Alla,S.A.等，J.Biol.Chem.271:1748-1755(1996)所示。
在一个实施方式中，向患有一种或多种所公开疾病的哺乳动物给予的载体是腺病毒载体。在一个实施方式中，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸。一方面，所述基因开关是基于EcR的基因开关。在另一些实施方式中，所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列，和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形成用作配体依赖性转录因子的蛋白复合物。一方面，所述配体是二酰肼。另一方面，所述配体选自RG-115819、RG-115932和RG-115830。另一方面，所述配体是酰胺酮和噁二唑啉。
在一个实施方式中，提供包含基因开关的核酸腺病毒载体，其中VP16-RXR和Gal4-EcR的编码序列由EMCV内部核糖体进入位点(IRES)序列分开，***到受人泛素C启动子控制的腺病毒穿梭载体中。例如，将由IRES序列分开并置于合成诱导型启动子控制下的IL12的p40和p35亚基编码序列***到泛素C启动子的上游。在另一个实施方式中，将置于合成诱导型启动子控制下的TNF-α编码序列***到泛素C启动子的上游。
纯化载体以增加浓度能通过任何合适的方法完成，所述方法例如密度梯度纯化(例如氯化铯(CsCl))或色谱技术(例如柱或分批色谱)。例如，本发明的载体能进行两个或三个CsCl密度梯度纯化步骤。载体(例如复制缺陷型腺病毒载体)需要从感染有复制缺陷型腺病毒载体的细胞中纯化，所用方法包含裂解感染有腺病毒的细胞、将裂解液用于色谱树脂、从色谱树脂洗脱所述腺病毒和收集含有腺病毒的组分。
在一个特定的实施方式中，所得的初级病毒储液通过重新感染HEK293细胞或CHO细胞来扩增并且通过CsCl密度梯度离心纯化。
基于蛋白的标记降低或消除对用于有效靶定的高特异性翻译后修饰的需求。基于蛋白的有用标记包括但不限于，IGF2R靶定(IGF2(GILT)/IGF2工程改造)、转铁蛋白受体靶定(转铁蛋白、TfR靶向肽)和Tat蛋白(其中细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)调节Tat内化)。
除了能用作标记以外的其他靶向溶酶体的蛋白包括但不限于维生素D结合蛋白、叶酸结合蛋白、乳酸转铁蛋白、性激素结合球蛋白、转甲状腺素、鞘脂激活蛋白原、视黄醇结合蛋白、Apo脂蛋白B、Apo脂蛋白E、促乳激素、受体相关蛋白(在一个实施方式中，没有HNEL序列)、天然转铁蛋白和突变转铁蛋白(例如K225E/R651A突变体或K225E/K553A突变体)。
一方面，本发明提供一种适用于给予人或非人的药物组合物，所示药物组合物包含经体外工程改造以表达蛋白质的细胞群或载体(例如腺病毒载体)，其中所述制剂适合肿瘤内给予。在另一个实施方式中，组合物(例如药物组合物)包含条件性表达蛋白质的载体。在一些实施方式中，所述组合物包含约1×105或更多颗粒单位(pu)的基因转移载体。“颗粒单位”是单一载体颗粒。在某些实施方式中，所述组合物包含约1×106颗粒单位(例如约1×107或更多颗粒单位、约1×108或更多颗粒单位、或约1×109或更多颗粒单位)的基因转移载体。在其它实施方式中，所述组合物包含约1×1010或更多pu、1×1011或更多pu、1×1012或更多pu、1×1013或更多pu、1×1014或更多pu或1×1015或更多pu的基因转移载体，特别是病毒载体，例如复制缺陷型腺病毒载体。所述组合物中基因转移载体的颗粒单位数目能使用任何已知的合适方法测定，所述方法例如通过比较所述组合物的吸光度和基因转移载体标准溶液的吸光度(即已知基因转移载体浓度的溶液)，如本文进一步所述。
在一个实施方式中，所述活化配体选自RG-115819、RG-115830和RG-115932。
本发明还提供包含活化配体如RG-115819、RG-115830或RG-115932的药物组合物，其中所述组合物适于通过腹膜内、口服或皮下给予来施用。
在一个实施方式中，口服给予所述活化配体。在另一个实施方式中，胃肠外给予所述活化配体。在另一个实施方式中，经腹膜内、皮下或肌肉内给予所述活化配体。
本发明的组合物还可包含药学上可接受的运载体。所述运载体能是用于经工程改造树突细胞、基因转移载体或活化配体的任何合适运载体。所述组合物的合适运载体描述于美国专利号6,225,289。所述运载体通常是液体，但也能是固体或者是液体和固体成分的组合。所述运载体需要是药学上可接受(如生理学或药理学上可接受)运载体(如赋形剂或稀释液)。药学上可接受运载体是熟知且易于获得的。运载体的选择至少部分通过组合物中的特定成分和用于给予组合物的特定方法来确定。所述组合物还能包含任何其他合适的成分，特别用于增强组合物的稳定性和/或其最终用途。因此，有各种合适的本发明组合物制剂。
适于口服给予的制剂包含(a)液体溶液，如有效量的溶于稀释液(如水、盐水或橙汁)的活性成分，(b)胶囊、囊袋或片剂，各包含预定量的活性成分，如固体或颗粒，(c)溶于合适液体的悬浮液，和(d)合适的乳液。片剂形式能包含一种或多种乳糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、***胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药学相容性赋形剂。锭剂形式能包含调味料中的活性成分，通常是含有惰性基料中活性成分的蔗糖和***胶或黄芪胶以及软锭剂(例如明胶和甘油或蔗糖和***胶)，和在活性成分以外含有如本领域已知赋形剂的乳剂、凝胶等。
适于通过吸入给予的制剂包含气雾制剂。可将气雾制剂置于加压可接受推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。其也能制成非加压的制剂以从喷雾器或雾化器中递送。
适于胃肠道外给予的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射溶液，能包含使该制剂与预期接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，以及含有助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌混悬剂。可以用单位剂量或多剂量密封容器例如安瓿和药瓶提供该制剂，也可通过冷冻干燥(冻干)条件保存该制剂，临用前只需要加入无菌液体赋形剂如注射用水即可。临时注射溶液和混悬液可以由前述无菌粉末、颗粒和片剂进行制备。
适于***给予的制剂能通过混合活性成分与各种基料如乳化基料或水溶性基料来制成栓剂。适于***给药的制剂可制成***栓剂、棉塞剂，乳膏剂、凝胶剂、贴剂、泡沫剂或喷雾制剂，所述制剂除了所述活性成分以外还包含所述本领域已知的合适运载体。
另外，所述组合物能包含其他治疗或生物活性试剂。例如，能存在用于治疗特定适应症的治疗因子。控制炎症的因子(如布洛芬或类固醇)能是组合物的一部分以降低与体内给予基因转移载体和生理压力有关的溶胀和炎症。免疫***抑制剂能与所述组合物方法一起给予以降低对所述基因转移载体本身或与疾病相关的任何免疫反应。或者，所述组合物中能包含免疫增强剂以上调身体针对疾病的天然防御。另外，细胞因子能与所述组合物一起给予以吸引免疫效应细胞到肿瘤位点。
在本文所述的特定实施方式中，本发明提供***的方法，所述方法包含以下顺序的步骤：
a.哺乳动物中瘤内给予经体外工程改造的免疫细胞群或TSC群；和
b.给予所述哺乳动物治疗有效量的活化配体；
在一个实施方式中，所述活化配体在与包含体外工程改造细胞或载体(例如腺病毒载体)的组合物基本相同的时间给予，例如在给予所述细胞或载体组合物之前或之后的1小时内。在另一个实施方式中，所述活化配体在给予所述体外细胞或载体之后大约24小时或不到约24小时给予。在另一个实施方式中，所述活化配体在给予所述经体外工程改造的细胞或载体之后大约48小时或不到约48小时给予。在另一实施方式中，所述配体是RG-115932。在另一个实施方式中，以约1-50mg/kg/天的剂量给予所述配体。在另一个实施方式中，以约30mg/kg/天的剂量给予所述配体。在另一个实施方式中，每天给予所述配体，持续7–28天。在另一个实施方式中，每天给予所述配体，持续14天。在另一个实施方式中，给予约1×106–1×108细胞。在另一个实施方式中，给予约1×107细胞。
术语“对象”指哺乳动物。哺乳动物包括人、啮齿动物、猴和其它动物，其中更优选人和小鼠。其它哺乳动物包括兽医学动物，如狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、猪等。
本文使用的术语“蛋白质表达”包括但不限于转录、转录后、翻译和/或翻译后。
本发明还包括一种增加蛋白质的mRNA或蛋白质表达的方法，所述方法包括产生条件性表达所述蛋白质的载体，及添加活化配体，由此诱导所述蛋白质的表达，其中所述载体还包含一个或多个调节序列与编码所述蛋白质的多核苷酸序列连接，其中所述一个或多个调节序列和/或信号肽增进所述蛋白质的表达。本发明的各种调节区包括但不限于已经描述的5’非翻译区(5’UTR)、3’UTR或两者。在一个实施方式中，所述5'UTR是5U2。5U2是融合的犬SERCA2内含子2，有突变的推定共有序列聚A位点，有5’末端侧接的外显子2剪接供体和3’末端侧接的外显子3剪接受体，随后是牛酪蛋白5’UTR部分的一部分。在另一个实施方式中，所述3'调节区是SV40或hGH的聚腺苷酸化信号。
本发明还支持条件表达感兴趣基因的体外工程改造细胞作为有效和高效治疗人类疾病的创新方案的治疗应用。
在这个实施方式中，所述载体以未包装于细胞内的形式给予对象。
在一个实施方式中，细胞不与所述载体经肿瘤内给予。
在另一个实施方式中，不包含于细胞内的本发明载体在细胞给予的同时、之前或之后给予。
在一个实施方式中，所述剂量是至少约1.0×109病毒颗粒/载体给予周期。在另一个实施方式中，所述剂剂量是至少约1.0×1010病毒颗粒/载体给予周期。在另一个实施方式中，所述剂量是约1.0×109-约1.0×1013病毒颗粒/载体给予周期。在另一个实施方式中，所述剂量是约1.0×1010-约1.0×1013病毒颗粒/载体给予周期。在另一个实施方式中，所述剂量是约1.0×1010、约1.0×1011、约1.0×1012或约1.0×1013病毒粒子/载体给予周期。
活化配体剂量是约5-100mg/天，如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg/天。在一个实施方式中，所述活化配体一天至少给予一次。在另一个实施方式中，每天给予所述活化配体一次，持续约14天。
在一个实施方式中，至少两个剂量的所述载体(例如约1x1011和1x1012)与至少三个不同剂量水平的活化配体联用(例如约5mg/天-约100mg/天)。
本领域的普通技术之一能优化剂量以对不同程度的活化配体激活提供一定范围的有效载体血浆水平。
在一个实施方式中，给予所述对象的活化配体剂量随着瘤内载体给予周期内的活化配体给予阶段而改变。在另一个实施方式中，给予所述对象的活化配体剂量随着瘤内载体给予周期内的活化配体给予阶段而降低。在另一个实施方式中，给予所述对象的活化配体剂量随着瘤内载体给予周期内的活化配体给予阶段而增加(逐步升高)。
在一个实施方式中，用2、3、4、5、6、7、8、9或10个载体给予周期治疗所述对象。在另一个实施方式中，用3-7个载体给予周期治疗所述对象。在另一个实施方式中，用4-6个载体给予周期治疗所述对象。在另一个实施方式中，用5或6个载体给予周期治疗所述对象。在另一个实施方式中，用6个载体给予周期治疗所述对象。
在一个实施方式中，每个载体给予周期间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周完成。在另一个实施方式中，每个载体给予周期间隔4周完成。
在一个实施方式中，在每个后续载体给予周期中改变载体的剂量。在另一个实施方式中，在每个后续载体给予周期中减少载体的剂量。在另一个实施方式中，在每个后续载体给予周期中增加载体的剂量。
在一个实施方式中，本发明也提供药物组合物，所述组合物包含药学上可接受的运载体和细胞不含有的本发明载体。合适的运载体包括但不限于盐水，蒸馏水，氯化钠溶液，氯化钠和无机盐的混合物或其相似混合物，诸如甘露醇、乳糖、葡聚糖和葡萄糖等物质的溶液，氨基酸溶液如甘氨酸和精氨酸，有机酸溶液或盐溶液和葡萄糖溶液的混合物，含有抗氧化剂、螯合剂、缓冲液、抑菌剂和溶质以使该制剂等渗的水性和非水性、等渗无菌注射溶液，以及含有助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。可以用单位剂量或多剂量密封容器例如安瓿和药瓶提供该制剂，也可通过冷冻干燥(冻干)条件保存该制剂，临用前只需要加入无菌液体运载体如注射用水。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸包含在宿主细胞内。在一个实施方式中，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、原核细胞、细菌细胞、真菌细胞、线虫细胞、昆虫细胞、鱼细胞、植物细胞、禽细胞、真核细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、无脊椎动物宿主细胞、脊椎动物宿主细胞、酵母菌细胞、斑马鱼细胞、鸡细胞、仓鼠细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞、猫细胞、犬细胞、牛细胞、山羊细胞、乳牛细胞、猪细胞、马细胞、绵羊细胞、类人猿细胞、猴细胞、黑猩猩细胞或人细胞。
在一个实施方式中，所述宿主细胞不是心肌细胞或肌细胞。
宿主细胞的转化为本领域熟知，并可利用多种方法实现，所述方法包括但不限于电穿孔、病毒感染、质粒/载体转染、非病毒载体介导转染、农杆菌(Agrobacterium)介导转化、粒子轰击等。所需基因产物的表达涉及在适当条件下培养所述经转化的宿主细胞并诱导所述转化基因的表达。原核和真核细胞的培养条件和基因表达操作方案是本领域熟知的。收集细胞、根据基因产物特定方案分离所述基因产物。
在本文所引用任何参考文献的任何内容或建议与本说明书之间发生抵触的情况中，应以后者为准以用于本发明目的。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物均通过充分引用全文纳入。
应理解上面描述的实施方式和实施例并不意在限定本发明范围的任何方面，并且本文所述的权利要求旨在包含所有实施方式和实施例，不论本文是否明确讲述。
2008年10月8日提交的题为"Engineered Dendritic Cells And Uses ForTreatment Of Cancer(工程改造的树突细胞和用于肿瘤治疗的应用)"的美国申请号12/247,738通过引用全文纳入本文。2008年9月29日提交的题为"TherapeuticGene-Switch Constructs And Bioreactors For The Expression Of BiotherapeuticMolecules,And Uses Thereof(生物治疗分子表达的治疗基因开关构建物和生物反应器及其应用)"的美国申请号12/241,018也通过引用全文纳入本文。
本发明的实施方式还包括以下(其中“E”代表“实施方式”)：
E1.一种诱导、调节或增强哺乳动物的***(EPO)表达的方法，其中所述方法包括
(a)给予所述哺乳动物腺相关病毒，其中所述病毒包含编码EPO的多核苷酸；和
(b)给予活化剂配体，所述活化剂配体诱导所述编码EPO的病毒多核苷酸表达EPO，
其中，所述腺相关病毒经肌肉内给予，
其中，所述腺相关病毒还包含基因开关，其中所述基因开关包含与启动子操作性连接的至少一个转录因子序列，其中由所述至少一个转录因子序列编码的至少一个转录因子是配体依赖性转录因子，
其中，所述腺相关病毒还包含与所述EPO编码多核苷酸操作性连接的第二启动子，其中所述第二启动子在给予活化剂配体之后由所述至少一个配体依赖性转录因子活化。
E2.如实施方式E1所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
E3.如实施方式E1或E2所述的方法，其中EPO的表达通过控制所述给予的一个或多个活化剂配体剂量来诱导、调节或增强。
E4.如实施方式E1-E3中任一项所述的方法，其中活化剂配体以足以诱导或维持正常生理范围内的EPO表达水平的一个或多个剂量给予。
E5.如实施方式E1-E4中任一项所述的方法，其中编码EPO的多核苷酸包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8(人EPO)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
E6.如实施方式E1-E5中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物的血细胞比容或血中红细胞的体积百分比增加。
E7.一种包含基因开关编码多核苷酸的载体，其中，所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中，所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸与由所述配体依赖性转录因子活化的启动子操作性连接，其中，所述一种或多种蛋白质选自C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
E8.如实施方式E7所述的载体，其中所述一种或多种蛋白质是人蛋白质。
E9.如实施方式E7或E8所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
E10.如实施方式E9所述的载体，其中所述病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、双生病毒、伪狂犬病病毒、细小病毒和花椰菜花叶病毒载体。E11.如实施方式E7-E10中任一项所述的病毒，其中所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。
E12.如实施方式E7-E11中任一项所述的载体，其中所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子和由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。E13.如实施方式E7-E11中任一项所述的载体，其中所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子与由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。E14.如实施方式E7-E13中任一项所述的载体，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列由EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。E15.如实施方式E7-E14中任一项所述的载体，其中所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:9(人髓磷脂碱性蛋白)编码的氨基酸具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
E16.如实施方式E7-E15中任一项所述的载体，其中所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:10(人C1酯酶抑制剂)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
E17.如实施方式E7-E16中任一项所述的载体，其中所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:11(艾卡拉肽)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
E18.如实施方式E7-E17中任一项所述的载体，其中所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15(***素合成酶)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
E19.如实施方式E7-E17中任一项所述的载体，其中所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:17(GLP-1)或SEQ ID NO:18(GLP-2)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
E20.如实施方式E7-E17中任一项所述的载体，其中所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:19(脂连蛋白)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
E21.如实施方式E7-E17中任一项所述的载体，其中所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:20(瘦体素)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
E22.如实施方式E7-E17中任一项所述的载体，其中所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:21(CFTR)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
E23.一种产生表达一种或多种蛋白质的细胞群的方法，其中，所述方法包括使用条件性表达一种或多种蛋白质的重组载体改造所述细胞，其中，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸连接由所述配体依赖性转录因子活化的启动子，其中所述一种或多种蛋白质选自C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
E24.如实施方式E23所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是人蛋白质。
E25.如实施方式E23或E24所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
E26.如实施方式E25所述的方法，其中所述病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、双生病毒、伪狂犬病病毒、细小病毒和花椰菜花叶病毒载体。
E27.如实施方式E23-E26中任一项所述的方法，其中所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。
E28.如实施方式E23-E27中任一项所述的方法，其中所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子和由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
E29.如实施方式E23-E27中任一项所述的方法，其中所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子与由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
E30.如实施方式E29所述的方法，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列由EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。
E31.一种用条件性表达一种或多种蛋白质的重组载体改造的细胞群，其中，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种选自C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的蛋白质的多核苷酸。
E32.如实施方式E31所述的细胞群，其中所述一种或多种蛋白质是人蛋白质。
E33.如实施方式E31或E32所述的细胞群，其中所述载体是病毒载体。
E34.如实施方式E33所述的细胞群，其中所述病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、双生病毒、伪狂犬病病毒、细小病毒和花椰菜花叶病毒载体。
E35.如实施方式E31-E34中任一项所述的细胞群，其中所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。
E36.如实施方式E31-E35中任一项所述的细胞群，其中所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子和由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
E37.如实施方式E31-E35中任一项所述的细胞群，其中所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子与由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
E38.如实施方式E37所述的群，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列由EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。
E39.一种治疗哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括：
(a)给予条件性表达一种或多种蛋白质的细胞群；和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；
由此诱导所述一种或多种蛋白质的表达，其中所述一种或多种蛋白质选自C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
E40.一种治疗哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括：
(a)给予所述哺乳动物条件性表达一种或多种蛋白质的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸与通过该配体依赖性转录因子活化的启动子操作性连，和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；由此诱导所述一种或多种蛋白质的表达并治疗该疾病，
其中所述一种或多种蛋白质选自C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
E41.如实施方式E39或E40所述的方法，其中至少一种所述蛋白质是C1酯酶抑制剂且所述疾病选自血管性水肿、遗传性血管性水肿、败毒症、血凝过快、肺功能障碍、低血氧症、出血性胰炎、心肌梗塞、肺移植、创伤、热损伤或血管渗漏。
E42.如实施方式E39或E40所述的方法，其中至少一种所述蛋白质是激肽释放素抑制剂且所述疾病选自血管性水肿、遗传性血管性水肿、动脉粥状栓塞症、冠状动脉疾病、阿兹海默病、炎性肠病、克罗恩氏病、血管渗漏、急性呼吸窘迫综合症、舒缓激肽介导的炎症和所述接触***的疾病、病症或紊乱。
E43.如实施方式E39或E40所述的方法，其中至少一种所述蛋白质是舒缓激肽B2受体抑制剂且所述疾病选自血管性水肿、遗传性血管性水肿、舒缓激肽介导的炎症、肾小球硬化、阿兹海默病、脑水肿、血管渗漏、急性呼吸窘迫综合症、疼痛、发炎、创伤、烧伤、休克、过敏和心血管疾病。
E44.如实施方式E39或E40所述的方法，其中至少一种所述蛋白质是***素合成酶且所述疾病选自肺高血压、肺动脉高血压(PAH)、自发性肺动脉高血压、家族性肺动脉高血压、继发性肺动脉高血压、肺静脉闭塞症、肺毛细血管瘤、新生儿持续性肺高血压。
E45.如实施方式E39或E40所述的方法，其中至少一种所述蛋白质是胰高血糖素样肽1(GLP-1)且所述疾病是糖尿病或其它代谢性疾病或紊乱。
E46.如实施方式E39或E40所述的方法，其中至少一种所述蛋白质是胰高血糖素样肽2(GLP-2)且所述疾病是糖尿病或其它代谢性疾病或紊乱。
E47.如实施方式E39或E40所述的方法，其中至少一种所述蛋白质是脂连蛋白且所述疾病是糖尿病或其它代谢性疾病或紊乱。
E48.如实施方式E39或E40所述的方法，其中至少一种所述蛋白质是瘦体素且所述疾病是糖尿病或其它代谢性疾病或紊乱。
E49.如实施方式E39或E40所述的方法，其中至少一种所述蛋白质是囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)且所述疾病是囊肿性纤维化。
E50.一种治疗哺乳动物的多发性硬化症的方法，所述方法包括：
(a)给予所述哺乳动物条件性表达一种或多种蛋白质的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸与通过该配体依赖性转录因子活化的启动子操作性连接，和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；由此诱导所述一种或多种蛋白质的表达并治疗该疾病，
其中所述一种或多种蛋白质选自髓磷脂碱性蛋白(MBP)和干扰素-β(IFN-B)。
E51.如实施方式E50所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:9(人髓磷脂碱性蛋白)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
E52.如实施方式E50所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:17(干扰素-β)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
E53.如实施方式E50所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质同时包含髓磷脂碱性蛋白(MBP)和干扰素-β(INF-β)。
E54.如实施方式E50-E53中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是人蛋白质。
E55.如实施方式E50-E54中任一项所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
E56.如实施方式E55所述的方法，其中所述病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、双生病毒、伪狂犬病病毒、细小病毒和花椰菜花叶病毒载体。
E57.如实施方式E50-E56中任一项所述的方法，其中所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。
E58.如实施方式E50-E57中任一项所述的方法，其中所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子和由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
E59.如实施方式E50-E57中任一项所述的方法，其中所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子与由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
E60.如实施方式E59所述的方法，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列由EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。
E61.一种治疗哺乳动物炎性肠病或克罗恩氏病的方法，所述方法包括：
(a)给予所述哺乳动物条件性表达一种或多种蛋白质的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸与由所述配体依赖性转录因子活化的启动子操作性连接，和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；由此诱导所述一种或多种蛋白质的表达并治疗该疾病，
其中所述一种或多种蛋白质之一是白介素-10(IL-10)。
E62.如实施方式E61所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:22(白介素-10)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
E63.如实施方式E61或E62所述的方法，其中所述白介素-10是人IL-10蛋白质。
E64.如实施方式E61-E63中任一项所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
E65.如实施方式E64所述的方法，其中所述病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、双生病毒、伪狂犬病病毒、细小病毒和花椰菜花叶病毒载体。
E66.如实施方式E61-E65中任一项所述的方法，其中所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。
E67.如实施方式E61-E66中任一项所述的方法，其中所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子和由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
E68.如实施方式E61-E66中任一项所述的方法，其中所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子与由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
E69.如实施方式E68所述的方法，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列由EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。
E70.一种组合物，所述组合物包含如实施方式E7-E22中任一项所述的载体或如实施方式E31-E38中任一项所述的细胞群和药学上可接受的运载体。
E71.如实施方式E70所述的组合物，所述组合物经全身性、静脉内、肿瘤内、口服、腹腔内、肌肉内、脊柱内、脑内、鞘内、皮内或皮下给予。
E72.一种药物，所述药物包含如实施方式E7-E22中任一项所述的载体或如实施方式E31-E38中任一项所述的细胞群和药学上可接受的运载体。
E73.如实施方式E72所述的药物，所述药物经全身性、静脉内、肿瘤内、口服、腹腔内、肌肉内、脊柱内、脑内、鞘内、皮内或皮下给予。
E74.一种试剂盒，所述试剂盒包含如实施方式E7-E22中任一项所述的载体或如实施方式E31-E38中任一项所述的细胞群。
E75.如实施方式E7-E22中任一项所述的载体或如实施方式E31-E38中任一项所述的细胞群和活化所述基因开关的配体。
E76.如实施方式E75所述的载体或细胞群及配体，其中所述配体是二酰基肼。
E77.如实施方式E76所述的载体或细胞群及二酰基肼配体，其中所述二酰基肼是RG-115819、RG-115830或RG-115932。
E78.如实施方式E75所述的载体或细胞群及配体，其中所述配体是酰胺酮或噁二唑啉。
E79.如实施方式E7-E22中任一项所述的载体、如实施方式E23-E30和E39-E69中任一项所述的方法、如实施方式E31-E38中任一项所述的细胞群，其中活化配体依赖性转录的配体是二酰基肼。
E80.如实施方式E79所述的载体、方法或细胞群，其中所述二酰基肼是RG-115819、RG-115830或RG-115932。
E81.如实施方式E7-E22中任一项所述的载体、如实施方式E23-E30和E39-E69中任一项所述的方法、如实施方式E31-E38中任一项所述的细胞群，其中活化配体依赖性转录的配体是酰胺酮或噁二唑啉。
E82.一种试剂盒，所述试剂盒包含如实施方式E7-E22中任一项所述的载体或如实施方式E31-E38中任一项所述的细胞群和配体。
E83.如实施方式E82所述的试剂盒，其中所述配体是二酰基肼。
E84.如实施方式E83所述的试剂盒，其中所述二酰基肼是RG-115819、RG-115830或RG-115932。
E85.如实施方式E82所述的试剂盒和配体，其中所述配体是酰胺酮或噁二唑啉。
实施例1
局部注射Ad-RTS-mIL12对于B16F0黑素瘤模型中的局部和对侧肿瘤的效果
我们探讨用Ad-RTS-mIL12治疗局部肿瘤(引起局部肿瘤生长消退)是否还能在远端肿瘤中产生抗肿瘤活性。出于该目的，我们在具有免疫活性小鼠(C57BL/6)的双侧腹部区域发展黑素瘤，并在活化剂配体存在下用Ad-RTS-mIL12治疗右侧腹部肿瘤。
6-8周龄的雌性C57Bl/6小鼠购自美国哈伦实验室(Harlan)。根据英创松(Intrexon)实验动物照料和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)指南进行动物护理和实验过程。
小鼠黑素瘤(B16F0)细胞购自ATCC(维吉尼亚州马纳萨斯市)。B16F0细胞生长于达氏改良伊氏培养基(维吉尼亚州马纳萨斯市的ATCC)。用热灭活胎牛血清(FCS)10%v/v、2-mM L-谷氨酰胺(佐治亚劳伦斯维尔的亚特兰大生物公司(Atlanta Biologicals,Inc))、100IU/ml青霉素G和100μg/ml链霉素补充DMEM。细胞在37℃5%CO2中生长。常规检测所有细胞系并且发现没有支原体。
总共45只C57BL/6动物在右侧和左侧后腹经皮下接种鼠黑色素瘤B16F0(ATCC)，1e5细胞/50ul。12天后，当巨大肿瘤可见时，将这些动物随机分成四组各10只动物，如下表所示无治疗(第1组)、仅活化剂配体(第2组)、仅Ad-RTS-mIL12(1×1010vp剂量，第3组)和Ad-RTS-mIL12(1×1010vp剂量)与存在于饲料中的活化剂配体(1000mg/kg饲料，第4组)。
接受活化剂配体的组可自由采食与所述活化剂配体RG-115932混合的小鼠饲料直至实验结束。向未接受活化剂配体的组持续喂饲常规饲料。
载体在肿瘤细胞接种后第12天和第9天经肿瘤内给予。每只小鼠的肿瘤大小和体重每周测量三次直至实验结束。当动物的累积肿瘤大小超过1000mm3或显示体重减轻>15%超过3天时，处死该动物。在完成实验后，所有剩余动物被处以安乐死。
肿瘤体积利用公式L×W2/2计算。肿瘤尺寸以平均值±SE显示。统计学分析利用双尾t检验实施。当p<0.05时，认为不同组别之间的差异显著。
Figure BDA0000407120760001101
当右侧腹部肿瘤达到平均体积44mm3时，开始进行治疗。对局部递送而言，给予右侧肿瘤两次相隔7天的1e10vp Ad-RTS-mIL12肿瘤内注射。这些动物接受活化剂配体饲料(1000mg/kg)。对照动物接受无任何处理或仅活化剂配体(100mg/kg)或仅Ad-RTS-mIL12不加活化配体。在给予载体之前的24小时，所示组接受活化剂配体(1000mg/kg)。每周评估三次这些动物的肿瘤进展或消退的任何迹象。如图1A所示，仅接受活化剂配体处理或无处理的对照动物在细胞接种后21天的平均肿瘤体积分别是924±80mm3和884±142mm3。
相反，经Ad-RTS-mIL12+活化剂配体治疗的肿瘤的肿瘤体积为86±138mm3，显示相较于无治疗的动物具有统计上显著(p<0.0001)的约91%肿瘤生长抑制。仅Ad-RTS-mIL12不加活化剂配体的肿瘤体积为565±305mm3，相较对照动物并无显著差异(p<0.07)。这些数据显示Ad-RTS-mIL12不加活化剂配体对肿瘤生长的影响很小，而Ad-RTS-mIL12加上活化剂配体则具有显著的抗肿瘤活性。
重要的是，相较于无治疗对照组中未经注射的对侧肿瘤(1019±233mm3)，右侧腹部肿瘤接受Ad-RTS-mIL12加上活化剂配体的动物显示统计上显著(p<0.005)的肿瘤生长抑制，抑制81%的未经注射的左侧腹部肿瘤(189±231mm3)(图1B)。然而，就Ad-RTS-mIL12不加配体治疗的肿瘤而言，对侧未经治疗的肿瘤体积并无显著减少。仅接受Ad-RTS-mIL12或仅活化剂配体治疗的对照组中的肿瘤和对侧未经注射的肿瘤在肿瘤植入后21天持续加快生长。这些数据表明，在用Ad-RTS-mIL12加配体治疗原发性肿瘤后所发展出对抗肿瘤细胞的全身性免疫反应可能引起远端未经***中观察到的抗肿瘤效应。
体重作为本实验中毒性的函数进行测量。每周测量三次动物的体重直至实验结束。经常观测小鼠有无任何不良反应和治疗相关副作用的明显迹象。可接受的毒性定义为在研究期间的平均体重减轻小于15%。该研究中所有的治疗皆耐受良好。最大平均体重减轻在允许界限内(<15%)(图2)，没有发现治疗相关的死亡。然而，我们发现在所有组中均有偶发性死亡。
已明确免疫***能识别肿瘤特异性抗原并清除恶性细胞(Brunda,M.J.等，J.Exp.Med.178:1223–1230(1993)；Brunda,M.J.等，Cancer Chemother.Pharmacol.38(Suppl):S16–S21(1996)；和Golab J.等，Int.J.Mol.Med.3(5):537-44(1999))。然而，仍然难以驾驭免疫***以用于癌治疗的治疗性目的。该策略涉及使用肿瘤内注射IL-12表达受调节的复制缺陷病毒载体(即Ad-RTS-mIL12)，以在不诱导全身毒性的情况下减少肿瘤生长(Komita,H.等，Cancer Gene Ther.16:883-91(2009))并活化免疫***以杀死远端和转移的癌。
在该研究中，向已建立的肿瘤内注射Ad-RTS-mIL12在活化配体存在下抑制B16F0模型中的肿瘤生长。在此处，使用C57BL/6小鼠的双侧建立皮下B16F0肿瘤模型显示，单侧肿瘤内注射Ad-RTS-mIL12造成所述经注射的肿瘤和对侧未经注射的肿瘤皆生长显著减少。该抗肿瘤效应显著高于仅以活化剂配体治疗或Ad-RTS-mIL12不加活化剂配体治疗的动物。这些结果表明直接递送Ad-RTS-mIL12至肿瘤微环境提供治疗性益处，且产生针对转移性癌细胞的保护性抗肿瘤免疫作用。
实施例2
IL-12和IFNα联合治疗
目前的癌症免疫治疗在临床上提供的成功有限，因此需要创新策略以进一步增进抗肿瘤免疫反应的有效性。该研究评估用新型Rheoswitch治疗***
Figure BDA0000407120760001121
就调节表达鼠IL-12或IFNα肿瘤内(i.t.)给予腺病毒(Ad)的抗肿瘤活性，所述RTS***是诱导型启动子***。口服给予小分子活化剂配体(AL)INXN-1001调节IL-12在Ad-RTS-mIL12中的表达和IFNα在Ad-RTS-mIL12中的表达。肿瘤内给予的Ad-RTS-mIL12和Ad-RTS-mIFNα的单独或组合的IL-12和IFNα调节性表达和治疗益处在同源Lewis肺癌(LLC)和同源乳腺癌(4T1)模型中评估。在LLC模型中，相较于对照即未经治疗的肿瘤，每天仅给予口服AL治疗(于饲料中给予1000ppm，代表每日剂量约225mg/kg/天)或肿瘤内给予无AL的细胞因子基因治疗不导致显著抑制肿瘤生长。相反，肿瘤内注射1010vpAd-RTS-mIL-12或Ad-RTS-mIFNa和每天口服AL到第25天引起显著的肿瘤生长抑制(分别为72%和71%，p<0.05)。值得注意的是，用Ad-RTS-mIL-12和Ad-RTS-mIFNa与口服AL联合治疗LLC肿瘤相较于各单独治疗引起显著的抗肿瘤效应(97%生长抑制，p<0.05)，但没有明显毒性，这是通过体重没有变化来评价。在4T1模型中，用1010vp的Ad-RTS-mIL-12加AL或Ad-RTS-mIFNa加AL肿瘤内治疗相较于对照未治疗的肿瘤到第34天引起58%和53%的肿瘤生长抑制(p<0.05)。值得注意的是，用Ad-RTS-mIL-12加AL和Ad-RTS-mIFNa加AL的联合治疗产生增强的抗肿瘤活性，有80%的生长抑制。这些数据显示，利用Ad载体中经RTS调节的IL-12和IFNα联合AL的组合治疗策略诱导针对侵袭性小鼠肿瘤的有效治疗活性。未来的研究将探讨IL-12和IFNα两者在上述肿瘤模型中施加其抗肿瘤效应的机制。
白介素-12(IL-12)是一种用于治疗多种感染性和恶性疾病的强力多效性细胞因子。IL-12抗肿瘤活性通过直接肿瘤细胞细胞毒性、抗血管生成特性和免疫调节活性提高(包括活化自然杀伤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞)来调节。虽然具有这些抗肿瘤效应，在人内全身性输注重组IL-12导致严重的全身毒性，从而大幅限制了其临床应用。
干扰素α(IFNa)是一种具有强抗病毒和抗肿瘤效应的细胞因子。给予IFNa刺激T细胞和自然杀伤细胞增生，导致肿瘤细胞细胞毒性、抗血管生成以及主要组织相容性复合体(MHC)、肿瘤抗原和黏附分子的表达增加。与IL-12相似，高水平的IFNa也显示严重的副作用，包括类流感综合症、严重恶心、疲倦和沮丧。
因此，明显需要控制这些细胞因子的表达水平。RTSTM(Rheoswitch治疗***)是一种新型调节***，其利用活化剂配体INXN-1001来控制基因表达，所述活化剂配体是口服生物可利用的小分子药物。在利用RTS技术以控制细胞因子表达方面，我们先前已在许多临床前动物模型中利用任一Ad-RTS-IL-12转导的树突细胞证实肿瘤生长减少，最近用直接肿瘤内(IT)注射Ad-RTS-IL-12。这导致开始进行直接注射Ad-RTS-IL-12至第III/IV期恶性黑素瘤患者的肿瘤病灶的第一期临床试验。
联合治疗在临床前模型和临床上显示颇有潜力。因此，在本研究中，我们探讨Ad-RTS-IL-12和Ad-RTS-IFNa在两种不同的同源肿瘤模型(Lewis肺癌(LLC)和4T1乳腺癌)中肿瘤内共给予的协同效应。
所述RheoSwitch治疗***(RTS)包括三种基本成分：(1)诱导型启动子；(2)配体诱导型转录因子和共活化伙伴；(3)RheoSwitch活化剂配体(AL)。
没有配体时，所述开关蛋白复合物提供“关闭”信号。相反地，当配体存在时，所述复合物改变构型并提供就靶标基因表达而言的剂量依赖性“开启”信号。在体内，所述口服给予的AL在24小时内启动基因表达，停止给予AL后，基因表达在约24小时内回复至基准水平。
LLC和4T1细胞用Ad-RTS-鼠IL12或Ad-RTS-鼠IFNa瞬时转导，MOI为100。为了诱导基因表达，活化剂配体INXN-1001以75nM的浓度添加于培养基或用0.1%DMSO处理作为对照。在48小时收集上清液，细胞因子的水平通过ELISA检测。n=3，平均值±标准差(s.d.)。结果见图3。
LLC和4T1细胞用Ad-RTS-鼠IL12或Ad-RTS-鼠IFNa瞬时转导，MOI为100。为了诱导基因表达，活化剂配体INXN-1001以75nM的浓度添加于培养基或用0.1%DMSO处理作为对照。在48小时收集上清液，细胞因子的水平通过ELISA检测。n=3，平均值±标准差(s.d.)。结果见图。在图4箭头所示的特定天数肿瘤内给予腺病毒。对照包括经活化剂配体(INXN-1001)处理或未处理的PBS和Ad-RTS-Luc注射小鼠，由于对肿瘤大小无影响，将所述小鼠分组。肿瘤抑制的百分比如图所示，其显著低于对照组和单一细胞因子治疗组(p<0.01)。n=5，平均值±标准误(s.e.m.)。
在单独研究中，我们经皮下途径注射1×1054T1癌细胞至小鼠。当肿瘤达到可触知的大小时，小鼠经随机分组至单独或联合肿瘤内给予Ad-RTS-IL-12和/或Ad-RTS-IFNa(1010vp/小鼠/载体)的治疗组。在肿瘤内注射后48小时收集血清和肿瘤。对照包括有或没有INXN-1001活化剂配体的PBS和Ad-RTS-Luc注射小鼠，由于对肿瘤大小无影响,将所述小鼠分组。INXN-1001在辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)中配制并经口管饲每天递送。在循环和肿瘤内的细胞因子水平利用血清和肿瘤均质液评价并通过ELISA检测。n=4，平均值±标准误(s.e.m.)。结果见图5。
LLC和4T1(这周稍晚的结果)细胞用Ad-RTS-IL-12和Ad-RTS-IFNa单独或组合转导，就各载体而言浓度为500MOI。经转导的细胞在75nm INXN-1001或0.1%DMSO存在时培养48小时。收集细胞培养上清液用于细胞因子分析。还收集细胞用于流式细胞分析MHC I型表达。n=2至3，平均值±标准差(s.d.)。结果见图6。
数据显示IL12和IFNa细胞因子抑制肿瘤生长的协同效应。虽然IL-12先前已经显示可减少肿瘤生长，但其与Ad-RTS-IFNa的组合显著增进疗效，如LLC和4T1模型中肿瘤生长减缓所测。值得注意的是，在细胞因子表达后并未观察到毒性，显示IL12和IFNa通过Rheoswitch***的受调节表达。在机制方面，IFNa引发MHC-1在肿瘤细胞上表达，因此导致加剧的细胞死亡。额外的MOA研究目前正在进行。
总体而言，以安全、受控制和可诱导的方式递送细胞因子组合代表治疗通常影响人群的侵袭性肿瘤的新策略。
实施例3
方法
下列实施例4至8中的实验如下述实施。
动物
6-8周龄的雌性C3H/H和Balb/c小鼠购自哈伦实验室(Harlan Laboratories)。动物根据英创松的实验动物照料和使用委员会的规定照料与处理。动物经喂饲水和购自哈伦实验室的不含紫花苜蓿的18%蛋白质饲料。
所有程序对麻醉动物进行。在注射DNA前1小时，于股四头肌周围的区域预先注射50U(终体积50μl)的Hylanex(rHuPH20，海罗撒爱姆公司(Halozyme))。切开一小切口以暴露股四头肌，利用装有29号针头的结核菌素针筒注射溶于终体积100ul的250ug临床前级RTS-hEPO质粒。尽快将切口缝合。DNA在***肌肉中的2针头电极(5mm)协助下进行电穿孔，各针头***DNA注射位置的任一侧。递送8次50V/cm(20ms，1Hz)的脉冲以增强基因转移。
配体
将RG-115932配体配制在动物饮食中，并以1000mg/kg的浓度给予。对于OG配体则以10mg/mL配制于辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯。
肌肉内给予AAV-HuEPO(0034A、0034B)
动物经麻醉，使其股四头肌可见并无菌处理注射部位。用0.5mL的胰岛素针筒和29.5号针头注射小鼠。每只动物注射共含1011病毒基因组的100ul体积。在该步骤后，将动物置于笼中，并观察其是否正常行走。
蛋白质分析
利用酶联免疫吸附测定(ELISA)(干细胞技术公司(StemCell Technologies)，#01630)测试血浆样本中的人***存在。
血细胞比容测量
小鼠经眼窝采血，样本经Heska CBC血液分析仪测量。
实施例4
单次肌肉内给予AAV-RTS0HuEpo后评估人***在小鼠中的功效
“AAV-RTS-HuEPO”指腺相关病毒载体-
Figure BDA0000407120760001151
治疗***-人EPO。该信号肽序列、人***序列和终止密码子的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。
该研究的目的在于测定由AAV介导的肌肉内(IM)递送HuEPO转基因至小鼠是否会引起可测量的huEPO表达和血细胞比容(HCT)同时增加。两个AAV-huEPO载体0034A和0034B(图7A和7B)利用两个小鼠品系C3H/H和BALB/c测试。两个AAV载体中的huEPO表达盒都在诱导型启动子的控制下。每周测量血浆的HuEpo水平和HCT。
在研究开始时，小鼠就基准血细胞比容水平进行放血，然后每只动物经肌肉内给予1011AAV-HuEPO病毒基因组。从给予AAV当天开始，动物接受含活化剂配体的饲料(18-1000)。对照动物接受载体给予和正常饲料(无活化剂配体)，或接受有或没有活化剂配体的单独载剂IM给予(盐水。全部组每7天测量一次HCT。两个接受HuEPO载体和有活化剂配体存在的组皆显示上升的血细胞比容。
如图8所示，相较于对照，0034A显示40%HCT增加而0034B显示25%HCT增加。在实验第29天时，移除配体诱导剂，全部组都接受正常饲料。重要的是，在移出该活化剂配体之后两个星期，血细胞比容的水平下降至正常范围。在第50天重新引入含配体的饲料再次引起HCT增加，在第64天再度移除导致HCT下降。
这些数据显示，在单次IM给予AAV-huEPO载体后经调节的HuEPO表达介导生理变化。在活化剂配体存在下，表达高水平的HuEPO而引起HCT增加。当移除活化剂配体时，HCT下降至正常范围之内。HuEPO表达和后续的HCT增加可通过引入该活化剂配体来诱导至少两次。
实施例5
HuEPO在C3H/H和Balb/c小鼠内的调节表达
经治疗C3H/H小鼠的血浆中有无HuEPO存在通过ELISA检测。检测两种AAV-huEPO载体的HuEPO表达。如图9所示，HuEPO表达水平高于正常人生理水平的四倍(正常人EPO水平为4-24mU/mL)。经0034A处理的动物的血浆HuEPO水平比接受0034B载体的动物高出十倍。对照动物中未检测到HuEPO的表达。HuEPO表达水平在第7天和第14天之间达到峰值，并从第14天至第28天维持稳定。
重要的是，HuEPO表达与HCT增加平行，并在诱导huEPO表达和可测量的HCT改变之间显示预期的延迟时间(即红细胞响应EPO而增殖所需的时间)。在第29天移除配体。第35、42和50天皆未检测到血浆中的HuEPO(经载体处理和对照)。第50天时，相关动物回复含有活化剂配体的饲料。HuEPO表达再次被检测到类似第一次诱导周期中观察到的水平。在第64天移除配体。HuEPO表达在第71天无法检测到，在第85天的0034A载体处理中无法检测到。在第85天用0034B载体检测到低水平的HuEPO表达。
如图9所示的相同实验在正常Balb/c小鼠平行实施(图10)。
实施例6
单次IM注射AAV-HuEPO后受调节的HuEPO表达
动物在第0天经IM注射给予1011vp的AAV-HuEPO(0034B)。在该研究的头21天，以口管饲法(OG)每天递送配体。经治疗小鼠的血浆中有无HuEPO存在通过ELISA检测。如图11所示，HCT水平和HuEPO表达在第21天达到峰值。第21天停止递送配体，huEPO表达和HCT在无配体存在时显示急剧下降。第35天样本的HuEPO ELISA数据在制作图11时尚未取得。
就每个时间点进行平均的各动物和组的HCT与基准值(时间0，出血前)作比较。如图48A和48B所示，用0034A的C3H/H小鼠在第14天和Balb/c小鼠在第28天的HCT增加多至1.7倍。在给予0034B后，C3H/H小鼠的HCT增加多至1.4倍，Balb/c小鼠增加多至1.6倍。在配体诱导剂移除后，HCT下降至正常范围之内。
实施例7
通过活化剂配体剂量的受调节HuEPO表达
动物就基准HCT水平进行放血，然后每只动物经IM给予1011AAV-HuEPO病毒基因组(0034A)。动物从给予AAV当天开始接受含活化剂配体的饲料，其中活化剂配体的浓度为1000mg/kg(18-1000)、250mg/kg(18-250)、100mg/kg(18-100)、50mg/kg(18-50)或0mg/kg(18-0)。对照动物接受载体给予和正常饲料(不含活化剂配体，18-0)，或接受有(18-1000)或没有(18-0)活化配体的单独载剂IM给予(盐水)。每7天测量一次所有组的HCT和HuEPO表达水平。
如图13所示，在基准的放血前样本中未检测到HuEPO。在第7-21天检测HuEPO的表达。在最低浓度的活化剂配体(18-50)中，HuEPO表达在第7天无法被检测到(该测试的敏感性限值为8mU/mL)，但在第14和21天检测到，虽然其水平低于接受较高活化剂配体剂量的动物。在接受两个最高浓度活化剂配体(18-1000和18-250)的组中，HuEPO达到类似的峰值表达水平。接受中等浓度活化配体(18-100)的动物血浆中的HuEPO水平在第7天显示较低的HuEPO表达，但在第14和21天达到和18-1000和18-250动物类似的水平。HCT的变化与HuEPO表达水平平行。在第21天移除配体后，HCT水平下降至正常范围之内。
这些数据显示在单次肌肉内给予AAV载体后受调节的HuEPO表达。重要的是，HuEPO的表达水平由活化剂配体剂量调节。这些数据显示HuEPO的表达可通过滴定活化剂配体的浓度而维持在正常生理范围之内，并具有临床应用性。
实施例8
单次IM注射AAV-HuEPO后受调节的HuEPO表达
共25只3/4肾切除的C3H/H小鼠购自塔可尼克公司(Taconic)。动物就基准HuEPO水平和HCT进行放血。所示组在研究期间接受含RG-115932活化剂配体的饲料(18-1000，1000mg/kg饲料)。在第0天，RTS-HuEPO质粒DNA(0034D)通过透明质酸酶(Hyase)(购自海罗撒爱姆(Halozyme)公司的50U rHUPH20)预处理1小时后的开放肌肉IM注射加电穿孔(EP)给予。动物组包括1)HuEPO DNA+EP+透明质酸酶+配体，2)HuEPO DNA+EP+透明质酸酶，无配体，3)HuEPODNA+EP，无透明质酸酶，+配体，4)盐水+EP+透明质酸酶+配体，和5)每周用IP注射两次重组人EPO蛋白质治疗的动物。
如图14所示，高HuEPO表达在第8天的血浆中检测到，并在第22天下降至较低的正常范围。HCT的变化与血浆中的HuEPO水平平行。在第30天再次给予所述载体后，并未在血浆中检测到HCT的变化。
将HuEPO质粒DNA(0034C，RTS-hEpo-IRES-fLuc)递送至Balb/c小鼠(股四头肌，每只动物200ug的DNA)，之后实施电穿孔。在DNA递送和电穿孔之前一小时，动物还用透明质酸酶(购自海罗撒爱姆(Halozyme)公司的50U rHUPH20)或仅盐水处理。所有动物在此实验期间通过饲料接受活化剂配体。
在DNA递送前和递送后第4天和第7天测量小鼠的HCT。如图15所示，接受huEPO质粒加透明质酸酶预处理的动物在第7天检测到HCT增加40%，然而接受huEPO但无透明质酸酶预处理的动物在第7天显示HCT增加25%。
应理解上面描述的实施方式和实施例并不意在限定本发明范围的任何方面，并且本文所述的权利要求旨在包含所有实施方式和实施例，不论本文是否明确讲述。
参考文献
Abdalla,2007.
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Claims (85)

1.一种诱导、调节或增强哺乳动物中***(EPO)表达的方法，其特征在于，所述方法包括
(a)给予所述哺乳动物腺相关病毒，其中所述病毒包含编码EPO的多核苷酸；和
(b)给予活化剂配体，所述活化剂配体诱导所述编码EPO的病毒多核苷酸表达EPO，
其中，所述腺相关病毒经肌肉内给予，
其中，所述腺相关病毒还包含基因开关，其中所述基因开关包含与启动子操作性连接的至少一个转录因子序列，其中由所述至少一个转录因子序列编码的至少一个转录因子是配体依赖性转录因子，
其中，所述腺相关病毒还包含与所述编码EPO的多核苷酸操作性连接的第二启动子，其中所述第二启动子在给予活化剂配体之后由所述至少一个配体依赖性转录因子活化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，EPO的表达通过控制所给予的一个或多个活化剂配体剂量来诱导、调节或增强。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述活化剂配体以足以诱导或维持正常生理范围内EPO表达水平的剂量给予。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述编码EPO的多核苷酸包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物的血细胞比容或血中红细胞的体积百分比增加。
7.一种包含编码基因开关的多核苷酸的载体，其特征在于，所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中，所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸与由所述配体依赖性转录因子活化的启动子操作性连接，其中，所述一种或多种蛋白质选自下组：C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
8.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述一种或多种蛋白质是人蛋白质。
9.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述载体是病毒载体。
10.如权利要求9所述的载体，其特征在于，所述病毒载体选自下组：腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、双生病毒、伪狂犬病病毒、细小病毒和花椰菜花叶病毒载体。
11.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。
12.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子和由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
13.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子与由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
14.如权利要求13所述的载体，其特征在于，所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列通过EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。
15.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:9所编码氨基酸具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
16.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:10具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
17.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:11具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
18.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列、SEQ ID NO:13的氨基酸序列、由SEQ IDNO:14的核酸序列所编码氨基酸序列或由SEQ ID NO:15的核酸序列所编码氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
19.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
20.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:19具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
21.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:20具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
22.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:21具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
23.一种产生表达一种或多种蛋白质的细胞群的方法，其特征在于，所述方法包括使用条件性表达一种或多种蛋白质的重组载体改造所述细胞，其中，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸与由所述配体依赖性转录因子活化的启动子连接，其中所述一种或多种蛋白质选自下组：C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述一种或多种蛋白质是人蛋白质。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述载体是病毒载体。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述病毒载体选自下组：腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、双生病毒、伪狂犬病病毒、细小病毒和花椰菜花叶病毒载体。
27.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。
28.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子和由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
29.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子与由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列通过EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。
31.一种用条件性表达一种或多种蛋白质的重组载体改造的细胞群，其特征在于，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种选自下组的蛋白质的多核苷酸：C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
32.如权利要求31所述的细胞群，其特征在于，所述一种或多种蛋白质是人蛋白质。
33.如权利要求31所述的细胞群，其特征在于，所述载体是病毒载体。
34.如权利要求33所述的细胞群，其特征在于，所述病毒载体选自下组：腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、双生病毒、伪狂犬病病毒、细小病毒和花椰菜花叶病毒载体。
35.如权利要求31所述的细胞群，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。
36.如权利要求31所述的细胞群，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子和由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
37.如权利要求31所述的细胞群，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子与由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
38.如权利要求37所述的群，其特征在于，所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列通过EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。
39.一种治疗哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括：
(a)给予条件性表达一种或多种蛋白质的细胞群；和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；
由此诱导所述一种或多种蛋白质的表达，其中所述一种或多种蛋白质选自下组：C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
40.一种治疗哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括：
(a)给予所述哺乳动物条件性表达一种或多种蛋白质的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸与通过该配体依赖性转录因子活化的启动子操作性连接，和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；由此诱导所述一种或多种蛋白质的表达并治疗该疾病，
其中所述一种或多种蛋白质选自下组：C1酯酶抑制剂、激肽释放酶抑制剂、舒缓激肽B2受体抑制剂、***素合成酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、脂连蛋白、瘦体素和囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
41.如权利要求39或40所述的方法，其特征在于，至少一种所述蛋白质是C1酯酶抑制剂，且所述疾病选自下组：血管性水肿、遗传性血管性水肿、败毒症、血凝过快、肺功能障碍、低血氧症、出血性胰炎、心肌梗塞、肺移植、创伤、热损伤或血管渗漏。
42.如权利要求39或40所述的方法，其特征在于，至少一种所述蛋白质是激肽释放素抑制剂，且所述疾病选自下组：血管性水肿、遗传性血管性水肿、动脉粥状栓塞症、冠状动脉疾病、阿兹海默病、炎性肠病、克罗恩氏病、血管渗漏、急性呼吸窘迫综合症、舒缓激肽介导的炎症和接触***的疾病、病症或紊乱。
43.如权利要求39或40所述的方法，其特征在于，至少一种所述蛋白质是舒缓激肽B2受体抑制剂，且所述疾病选自下组：血管性水肿、遗传性血管性水肿、舒缓激肽介导的炎症、肾小球硬化、阿兹海默病、脑水肿、血管渗漏、急性呼吸窘迫综合症、疼痛、炎症、创伤、烧伤、休克、过敏和心血管疾病。
44.如权利要求39或40所述的方法，其特征在于，至少一种所述蛋白质是***素合成酶，且所述疾病选自下组：肺高血压、肺动脉高血压(PAH)、自发性肺动脉高血压、家族性肺动脉高血压、继发性肺动脉高血压、肺静脉闭塞症、肺毛细血管瘤、新生儿持续性肺高血压。
45.如权利要求39或40所述的方法，其特征在于，至少一种所述蛋白质是胰高血糖素样肽1(GLP-1)，且所述疾病是糖尿病或其它代谢性疾病或紊乱。
46.如权利要求39或40所述的方法，其特征在于，至少一种所述蛋白质是胰高血糖素样肽2(GLP-2)，且所述疾病是糖尿病或其它代谢性疾病或紊乱。
47.如权利要求39或40所述的方法，其特征在于，至少一种所述蛋白质是脂连蛋白，且所述疾病是糖尿病或其它代谢性疾病或紊乱。
48.如权利要求39或40所述的方法，其特征在于，至少一种所述蛋白质是瘦体素，且所述疾病是糖尿病或其它代谢性疾病或紊乱。
49.如权利要求39或40所述的方法，其特征在于，至少一种所述蛋白质是囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，且所述疾病是囊肿性纤维化。
50.一种治疗哺乳动物的多发性硬化症的方法，所述方法包括：
(a)给予所述哺乳动物条件性表达一种或多种蛋白质的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸与通过该配体依赖性转录因子活化的启动子操作性连接，和
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；由此诱导所述一种或多种蛋白质的表达并治疗该疾病，
其中所述一种或多种蛋白质选自下组：髓磷脂碱性蛋白(MBP)和干扰素-β(IFN-B)。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:9具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:16具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
53.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述一种或多种蛋白质同时包含髓磷脂碱性蛋白(MBP)和干扰素-β(INF-B)。
54.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述一种或多种蛋白质是人蛋白质。
55.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述载体是病毒载体。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述病毒载体选自下组：腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、双生病毒、伪狂犬病病毒、细小病毒和花椰菜花叶病毒载体。
57.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。
58.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子和由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
59.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子与由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列通过EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。
61.一种治疗哺乳动物炎性肠病或克罗恩氏病的方法，所述方法包括：
(a)给予所述哺乳动物条件性表达一种或多种蛋白质的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
(1)至少一个与启动子操作性连接的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸与由所述配体依赖性转录因子活化的启动子操作性连接，
(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；由此诱导所述一种或多种蛋白质的表达并治疗该疾病，
其中所述一种或多种蛋白质之一是白介素-10(IL-10)。
62.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述一种或多种蛋白质之一包含与SEQ ID NO:22具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
63.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述白介素-10是人IL-10蛋白质。
64.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述载体是病毒载体。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述病毒载体选自下组：腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、双生病毒、伪狂犬病病毒、细小病毒和花椰菜花叶病毒载体。
66.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。
67.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子和由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
68.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列编码的第一转录因子与由所述第二转录因子序列编码的第二转录因子相互作用以形成用作配体依赖性转录因子的复合物。
69.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列通过EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。
70.一种组合物，所述组合物包含如权利要求7-22中任一项所述的载体或如权利要求31-38中任一项所述的细胞群和药学上可接受的运载体。
71.如权利要求70所述的组合物，其特征在于，所述组合物经全身性、静脉内、肿瘤内、口服、腹腔内、肌肉内、脊内、脑内、鞘内、皮内或皮下给予。
72.一种药物，所述药物包含如权利要求7-22中任一项所述的载体或如权利要求31-38中任一项所述的细胞群和药学上可接受的运载体。
73.如权利要求72所述的药物，其特征在于，所述药物经全身性、静脉内、肿瘤内、口服、腹腔内、肌肉内、脊内、脑内、鞘内、皮内或皮下给予。
74.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求7-22中任一项所述的载体或如权利要求31-38中任一项所述的细胞群。
75.如权利要求7-22中任一项所述的载体或如权利要求31-38中任一项所述的细胞群，以及活化所述基因开关的配体。
76.如权利要求75所述的载体或细胞群及配体，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
77.如权利要求76所述的载体或细胞群及二酰基肼配体，其特征在于，所述二酰基肼是RG-115819、RG-115830或RG-115932。
78.如权利要求75所述的载体或细胞群及配体，其特征在于，所述配体是酰胺基酮或噁二唑啉。
79.如权利要求7-22中任一项所述的载体，如权利要求23-30和39-69中任一项所述的方法，如权利要求31-38中任一项所述的细胞群，其特征在于，所述活化配体依赖性转录的配体是二酰基肼。
80.如权利要求79所述的载体、方法或细胞群，其特征在于，所述二酰基肼是RG-115819、RG-115830或RG-115932。
81.如权利要求7-22中任一项所述的载体，如权利要求23-30和39-69中任一项所述的方法，如权利要求31-38中任一项所述的细胞群，其特征在于，所述活化配体依赖性转录的配体是酰胺基酮或噁二唑啉。
82.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求7-22中任一项所述的载体或如权利要求31-38中任一项所述的细胞群及配体。
83.如权利要求82所述的试剂盒，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
84.如权利要求83所述的试剂盒，其特征在于，所述二酰基肼是RG-115819、RG-115830或RG-115932。
85.如权利要求82所述的试剂盒和配体，其特征在于，所述配体是酰胺基酮或噁二唑啉。
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