JP2007522814A - ウイルスの精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はこのような方法を提供する。
本発明は、宿主細胞からウイルスを精製する方法を提供するものであって、前記方法は、a)ウイルスを感染させた宿主細胞を培養するステップと、b)細胞培養物にヌクレアーゼを添加するステップと、c)ウイルスを含む溶解物を提供するために前記宿主細胞を溶解するステップと、によって構成される。好適な実施形態では、本方法はさらに、d) 溶解物を洗浄するステップ、から構成される。さらにより好適な実施形態では、本方法はさらに、e) 好適には少なくとも1回のクロマトグラフィー・ステップによってさらにアデノウイルスを精製するステップ、から構成される。これまでに開示された方法との最も重要な違いは、従来の方法では、細胞を溶解して初めて、または精製プロセスの後期段階において、ヌクレアーゼを添加していたことである。本発明によれば、細胞を溶解する前にヌクレアーゼを添加する。本明細書で開示するように、本発明の方法は、細胞を溶解した後に初めてヌクレアーゼを添加するプロセスを改良する結果をもたらすことが、予想外にも発見された。本発明による方法では、本プロセスに起因する精製されたウイルスバッチが含有する宿主細胞のDNA量は、細胞の溶解をヌクレアーゼの添加に先行させる方法に比べて少ない。好適な実施形態では、ウイルスを組み換えアデノウイルスとする。ある実施形態では、ステップb)で用いるヌクレアーゼをベンゾナーゼ(benzonase:商標登録)とする。ある実施形態では、宿主細胞を溶解するステップ(ステップc)を界面活性剤により行うが、そのうちの1つの実施形態では、界面活性剤をTriton-X 100とする。ある実施形態では、溶解物の洗浄(ステップd)は深層濾過(depth filtration)および膜濾過からなる。そのうちの好適な実施形態では、0.8μmおよび0.45μmの孔径を有するフィルターを組み合わせて用いることによって前記膜濾過を行うが、例えばSartopore(登録商標)2コンビネーションフィルターのような、0.8μmおよび0.45μmの孔径を有する2つの非対称ポリエーテルスルホン膜からなるコンビネーションフィルターを用いる。ある実施形態では、洗浄された溶解物(ステップdにより生じる)を限外濾過および/またはダイアフィルトレーションにかける。そのうちの好適な実施形態では、ダイアフィルトレーションを行う結果として、0.8〜2MのNaClまたは同等なイオン強度を供する他の塩を含む溶液に対してバッファー交換がなされる。ある好適な実施形態では、ウイルスのさらなる精製(ステップe)は陰イオン交換クロマトグラフィーから構成される。他の実施形態では、前記のウイルスのさらなる精製(ステップe)は粒径排除クロマトグラフィー・ステップから構成され、好適には群分離モードが適用される。他の好適な実施形態では、ステップe)は陰イオン交換クロマトグラフィーおよび粒径排除クロマトグラフィーの両者から構成される。本発明によるある実施形態では、洗浄された溶解物およびさらに精製されたウイルス(ステップd以降)は、界面活性剤、塩化マグネシウムおよびスクロースを含まないバッファー中に存在する。
宿主細胞
本発明による宿主細胞は、所望のウイルスが増殖できるならばどのような宿主細胞としてもよい。例えば、組み換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス中の欠失部分を補完するような宿主細胞の中で増殖する。このような宿主細胞は、ゲノム中に少なくともアデノウイルスのE1配列を有することが望ましく、それゆえ、E1領域を欠失する組み換えアデノウイルスを補完することが可能である。さらに、アデノウイルスはE3領域を欠損している可能性があるが、Adゲノムになくても構わない領域であるため、この欠損部を補完する必要はない。例えば911細胞のようなE1不死化ヒト網膜細胞(米国特許第5,994,128号参照)、E1形質転換羊水細胞(欧州特許第1230354号参照)、E1形質転換A549細胞(例えばWO 98/39411、米国特許第5,891,690号参照)、GH329:HeLa細胞(Gao et al, 2000, Human Gene Therapy 11 : 213-219)、293細胞などの、任意のE1補完宿主細胞を用いることが可能である。好適には、PER.C6(登録商標)細胞(米国特許第5,994,128号)またはPER. C6細胞に由来する細胞を宿主細胞として用いるのが好ましい。なぜなら、これらの細胞は、組み換えアデノウイルスを含むがこれに限定されない、複数の異なるウイルスの増殖に適するためであり(例えばWO 01/38362参照)。
本発明の方法は、広範囲のウイルスに適用可能であって、アデノウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス(インフルエンザなど)、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、 ワクシニアウイルス、ロタウイルスなどを含むがこれらに限定されず、特にアデノウイルスが好適である。ウイルスは組み換えウイルスであることが望ましいが、臨床分離株、弱毒化ワクチン株なども含みうる。ある実施形態では、組み換えウイルス、好適にはアデノウイルスを濃縮するために本発明を用いるが、該ウイルスは遺伝子治療での使用およびワクチン接種の目的のための非相同的トランス遺伝子(heterologous transgene)を有する。実例を挙げて説明する目的のためだけに、本発明を組み換えアデノウイルスに関してより詳細に説明するが、決してそれに限定されない。
アデノウイルスベクターは、E1領域の少なくとも1つの必須遺伝子、たとえば、ウイルス複製に必要とされる、アデノウイルスゲノムのE1a領域および/またはE1b領域を欠損していることが好ましい。ある実施形態では、ベクターは、E1領域の少なくとも1つの必須遺伝子および少なくとも1部の非必須E3領域を欠損している(例えば、E3領域のXba I欠失)。アデノウイルスベクターを「多欠失」とすることも可能であって、アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの2つ以上の領域の各々において1つ以上の必須遺伝子の機能を欠損していることを意味する。例えば、前述したE1欠損またはE1, E3欠損アデノウイルスベクターは、E4領域の少なくとも1つの必須遺伝子および/またはE2領域の少なくとも1つの必須遺伝子(例えばE2A領域および/またはE2B領域)をさらに欠損していてもよい。全E4領域を欠損したアデノウイルスベクターは、宿主免疫応答を誘発しにくい。適切なアデノウイルスベクターの具体例として、(a)E1領域の全部または一部、およびE2領域の全部または一部、(b)E1領域の全部または一部、E2領域の全部または一部、およびE3領域の全部または一部、(c)E1領域の全部または一部、E2領域の全部または一部、E3領域の全部または一部、およびE4領域の全部または一部、(d)E1a領域の少なくとも一部、E1b領域の少なくとも一部、E2a領域の少なくとも一部、およびE3領域の少なくとも一部、(e)E1領域の少なくとも一部、E3領域の少なくとも一部、およびE4領域の少なくとも一部、を欠損するアデノウイルスベクター、および、(f)必須アデノウイルス遺伝子の全生成物を欠損するアデノウイルスベクター(例えばITRsおよびパッケージングシグナルのみを含むアデノウイルス・アンプリコン)、が挙げられる。アデノウイルスゲノムから必須領域が欠失している場合には、これらの領域にコードされる機能は、好適には宿主細胞によって相補的に(in transに)供給される必要がある。すなわち、例えばアデノウイルスからE1、E2および/またはE4領域の一部または全体が欠失している場合には、例えばゲノムに組み込まれるか、またはいわゆるヘルパーアデノウイルスやヘルパープラスミドという形で、宿主細胞にこれらの領域が存在する必要がある。複製欠損性アデノウイルスベクターは、ベクターDNAのソースとして、アデノウイルスまたはキメラアデノウイルスの、任意の種、株、亜型、または種、株、亜型の組合せを用いることにより生成可能であって(例えばWO 96/26281、WO 00/03029を参照されたい)、このことにより、例えば、アデノウイルスベクターに、ある種の所望の細胞型に感染する能力を供することができる。アデノウイルスベクターを、細胞内で増殖可能な任意のアデノウイルスベクターとすることが可能であり、かなりの部分は(必ずしも十分ではないが)アデノウイルスゲノムに由来するか、または基づいている。アデノウイルスベクターは、C群野生型アデノウイルスのアデノウイルスゲノム、特に血清型5(すなわちAd5)またはAd2のゲノムを含みうる。アデノウイルスベクターは、例えばAd11, Ad35, Ad51などのB群アデノウイルスに由来するアデノウイルスゲノム、または少なくとも線維タンパク質をも含む可能性があり(例えばWO 00/70071参照)、この実施形態には、これらのアデノウイルスベクターの親和性はAd5の親和性と異なるために、これらの血清型に対する中和抗体は集団内に見出されにくく、他の細胞型を標的とする可能性を与えるという利点がある。もちろん、当業者は他の血清型も利用可能であることを知っているだろう。当業者ならば、例えば米国特許第6,492,169号およびWO 03/104467に開示されている方法およびそこに記載の参考文献を用いれば、特定の宿主細胞の中で様々な血清型のアデノウイルスベクターが増殖する可能性があることに気がつくであろう。アデノウイルスベクター、その作製方法、およびそれを増殖させる方法は当業者にはよく知られており、例えば、米国特許第5,559,099号、第5,837,511号、第5,846,782号、第5,851,806号、第5,994,106号、第5,994,128号、第5,965,541号、第5,981,225号、第6,040,174号、第6,020,191号および第6,113,913号、およびThomas Shenk氏による"Adenoviridae and their Replication"、M.S.Horwitz氏による"Adenoviruses"のそれぞれ67章および68章、Virology誌B. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996)、および本明細書で言及した他の参考文献に記載されている。アデノウイルスベクターの作製法は当業者によく理解されており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)、Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992)、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995)、および本明細書で言及した他の参考文献に記載されているような、標準的な分子生物学の技術を用いることを伴う。
ある実施形態では、本発明によるウイルスは野生型ウイルスであるか、または本発明による宿主細胞の中で感染性を保つ変異体あるいはその一部分である。他の実施形態では、ウイルスは非相同的な情報を含む組み換えウイルスであり、遺伝子治療を目的とした治療設定に用いたり、ワクチン接種を目的とした抗原として用いたりすることができる。これは、例えばアデノウイルスベクターを用いた好適な実施形態である。非相同的な情報を「トランス遺伝子」と呼ぶ。本発明による方法は、任意のトランス遺伝子を含むウイルス、好適には任意のトランス遺伝子を含むアデノウイルスに適用可能であり、ゆえにトランス遺伝子の性質自体は本発明において重要ではない。
アデノウイルスを感染させた後、ウイルスは細胞内で複製し、その結果増幅される。アデノウイルスの感染は、最終的には感染した細胞の溶解を招く。アデノウイルスには細胞を溶解する特徴があることにより、ウイルス産生には2つの異なるモードが可能となる。第一のモードでは、細胞が溶解する前にウイルスを回収し、細胞を溶解するために外部因子を使用する。第二のモードでは、産生されたウイルスによって(ほぼ)完全に細胞が溶解した後にウイルス上清を回収する(外部因子によって宿主細胞を溶解することなくアデノウイルスを回収する方法について記載した、米国特許第6,485,958号を参照されたい)。後者のモードでは、完全に細胞が溶解し、それ故高収率でウイルスを回収できるようになるためには、より長いインキュベーション時間が必要とされる。さらに、宿主細胞の内容物が培地中へと徐々に流出することは、調達するウイルスの質および量にとって有害となりうる。それゆえ、本発明によれば、細胞を高い活性で溶解するためには外部因子を用いることが好ましい。
本発明により使用可能な界面活性剤、およびそれらを使用する方法は、当業者には広く知られている。いくつかの具体例については、例えばWO 98/22588の29〜33ページで議論されている。本明細書において使用される界面活性剤は、陰イオン性、陽イオン性、両性イオン性、および非イオン性の界面活性剤を含みうる。典型的な界面活性剤としては、これらに限定されないが、タウロコール酸塩、デオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、セチルピリジウム、ベンザルコニウム塩化物、ZWITTERGENT 3-14界面活性剤(商標登録)、CHAPS(3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸塩;Aldrich社)、Big CHAP、Deoxy Big CHAP、Triton X-100(商標登録)、Triton X-114(商標登録)、C12E8、オクチル-B-D-グルコピラノシド、PLURONIC-F68(商標登録)、TWEEN-20(商標登録)、TWEEN-80(商標登録)(CALBIOCHEM(商標登録)Biochemicals社)、Thesit(商標登録)、NP-40(商標登録)、Brij-58(商標登録)、オクチルグルコシドなどが挙げられる。当業者には、界面活性剤の濃度を例えば約0.1%〜5% (w/w)の範囲内で変化させてよいことは明らかであろう。ある実施形態では、界面活性剤は約1%(w/w)の濃度で溶菌溶液中に存在する。発明者によるいくつかのパイロット実験では、Tritonを用いると、テストしたいくつかの他の界面活性剤(Tween 20, Tween 80, デオキシコール酸塩)よりも粘性の低い溶液が生じた。本発明の1つの実施形態では、使用する界面活性剤はTriton X-100である。
本発明は、汚染物質(すなわち大抵は宿主細胞や核酸)を除去するためにヌクレアーゼを利用する。本発明における使用に適切な典型的なヌクレアーゼとして、ベンゾナーゼ(Benzonase:商標登録)、パルモザイム(Pulmozyme:商標登録)、または当技術分野において一般的に使用されるその他のDNaseおよび/またはRNaseが挙げられる。本発明の好適な実施形態では、ヌクレアーゼはベンゾナーゼ(Benzonase:商標登録)であり、特定のヌクレオチドの間の内部リン酸ジエステル結合を加水分解することによって核酸を速やかに加水分解し、結果として細胞溶解物の粘度を減少させる。ベンゾナーゼ(Benzonase:商標登録)はMerck KGaA(コード W214950)から市販されている。
存在下でも、ウイルスの影響により早くも溶解してしまう細胞もある。ゆえに、好適な実施形態では、ヌクレアーゼ処理を開始する時点において、外部因子非存在下におけるこのような溶解は宿主細胞のうちの50%未満しか起こらず、好適には40%未満、より好適には30%未満、さらに好適には20%未満であることが望ましい。すなわち、細胞がそれぞれ少なくとも50%、60%、70%、80%生存している段階でヌクレアーゼを添加することが望ましい。
本発明による好適な実施形態では、ウイルスを含む宿主細胞溶解物を洗浄する。洗浄は、細胞残屑およびその他の不純物を除去する濾過ステップによって行われうる。適切なフィルターとして、セルロース・フィルター、再生セルロース・フィルター、無機フィルター(珪藻土、真珠岩、ヒュームド・シリカ など)の補助と組み合わせたセルロース・フィルター、無機フィルターによる補助および有機樹脂と組み合わせたセルロース・フィルター、またはその任意の組合せ、およびポリマー・フィルター(これらに限定されないが、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホンが例として挙げられる)を利用することが可能である。一般的には、複数の段階により処理するのが望ましいが、必須ではない。典型的な2〜3段階のプロセスは、大きな沈殿物および細胞残屑を除去するコースフィルターを利用し、その後、0.2μ以上1μ未満の公称孔径を有する第二段階のフィルターによって仕上げることからなる。最適な組合せは、沈殿物の粒度分布およびその他の変数の関数となる可能性がある。さらに、洗浄の目的で、比較的タイトなフィルターまたは遠心分離を利用する単一段階からなる操作を利用することも可能である。より一般的には、全量濾過、微量濾過、遠心分離、または、全量濾過または深層濾過と組み合わせたボディフィード濾過(例;珪藻土)の補助を含む任意の洗浄方法であって、次のステップで膜および/または樹脂を汚さないような適切な清澄度の濾液を供給する該洗浄方法を、本発明の洗浄ステップにおいて用いることが許容可能である。
本発明のある実施形態では、例えばウイルスの濃縮および/またはバッファー交換のために、および/または洗浄された回収物の濃縮およびダイアフィルトレーションのために、プロセスの間に少なくとも1回は、ウイルスの懸濁液を限外濾過/ダイアフィルトレーションにかける。本発明による方法によってウイルスを濃縮するために用いるプロセスは、任意の濾過プロセス(例えば限外濾過;UF)を含む可能性があり、ウイルスはフィルターを通過できずにウイルス調製物中に高濃度で残存する一方で希釈剤はウイルス調製物から除去されるような方法によって、希釈剤を濾過にかけることによって、ウイルス濃度を上昇させる。UFについては、例えば、Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman and A.Zydney (Marcel Dekker,Inc., New York, NY, 1996)に詳細に記載されている。好適な濾過プロセスは、例えば、"Pharmaceutical Process Filtration Catalogue"という題のMILLIPORE社カタログの177〜202ページ(Bedford, Massachusetts, 1995/96)に記載されているような、タンジェンシャルフローフィルトレーション(Tangential Flow Filtration:TFF)である。TFFは、細胞の回収、洗浄、およびウイルスを含む生成物の濃縮のために、バイオプロセス産業では広く用いられている。システムは3つの異なるプロセスの流れ、すなわち供給液、透過液および保持液から構成される。用途により、異なる孔径のフィルターを用いることが可能である。本発明による1つの実施形態では、保持液は生成物であり、必要に応じてさらなる精製ステップのために用いることが可能である。この実施形態では、選択した個々の限外濾過膜は、不純物を効率的に除去するには十分大きいが、ウイルスを保持するのには十分に小さな孔径を有するであろう。製造業者および膜のタイプに依存して、アデノウイルスの場合は公称分子量カットオフ値(nominal molecular weight cutoffs:NMWC)が100〜1000kDaであることが適当であり、例えばNMWCが300kDaまたは500kDaの膜を用いる。膜組成は、これらに限定されないが、再生セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリスルホンまたはそれらの誘導体とする可能性がある。膜はフラット・シートまたは中空糸とする可能性がある。限外濾過とは一般に0.1μm未満の孔径を有するフィルターを用いた濾過をさす。生成物は通常保持されるが、一方で透過により体積は減少する。バイオ医薬品産業においてTFFのために最も広く利用される2つの形状は、平板型モジュ−ルおよび中空糸モジュ−ルである。今ではSpectrum社およびA/G Technology社を含む複数の業者が存在するものの、限外濾過および微量濾過に用いる中空糸ユニットは1970年代初期にAmicon社とRamicon社により開発された(Cheryan, M. Ultrafiltration Handbook)。中空糸モジュールは緻密な表面層を有する自己支持型ファイバーのアレイから構成され、膜に選択透過性をもたらす。ファイバーの直径は0.5mm〜3mmの範囲である。中空糸モジュールの利点は、小さな膜面積(約16cm2)から非常に大きな膜面積(約28cm2)のフィルターを利用できることであって、直線的で単純なスケールアップが可能となる。本発明によるある好適な実施形態では、TFFのために中空糸を用いる。これらはほとんどずれを生み出さず、平面型の膜に比べてウイルス粒子/感染単位(VP/IU)比が優れる。ある実施形態では、本発明によれば、0.05μmの中空糸を用いる。
本発明の好適な実施形態によると、本発明による方法によって、好適には溶解物の洗浄後に得られたウイルス懸濁液を、例えば当業者に一般に知られる方法によりさらに精製する。これは、例えばWO 98/22588の59〜61ページにて議論されるように、例えば密度勾配遠心法により達成されうる。
本発明によるウイルス精製の過程で、多くのバッファーを使用することが可能である。本発明の複数の実施形態では、UF/DFおよび陰イオン交換クロマトグラフィーで使用するバッファーは、一般には0.4〜1.0M NaClおよび50mM TRIS (pH7.5)を含み、NaCl濃度は生産工程に依存していた。ある好適な実施形態では、洗浄の後に用いるバッファーは界面活性剤、塩化マグネシウムおよびスクロースを含まない。これらの添加物が存在しない点が、これらのバッファーと既存の確立されたプロトコールで使用されるバッファーが異なる点である。それにもかかわらず、本発明による方法を使用すれば、精製された、実質的に凝集していないアデノウイルスが得られる。これらの添加物を含まないバッファーを使用することの利点は、このバッファーは調製するのがより容易で、より安価ですみ、そして添加物が除去されているかどうかを試験する必要がない点である。
当技術分野では、トランス遺伝子自体は一般に精製プロセスには無関係であると見なされる。しかしながら、本明細書で示されるように、特定の場合には、トランス遺伝子は、発現に際して宿主細胞またはウイルスの中でウイルスの特性に影響を与えたり、ウイルスを精製するプロセスに影響を与えたりする可能性がある。
1つの態様では、本発明は組み換えアデノウイルスのバッチを提供するが、該ウイルスバッチは、エボラウイルス核タンパク質、エボラウイルス糖タンパク質、熱帯マラリア原虫スポロゾイト周囲遺伝子、麻疹ウイルスヘムアグルチニン、からなるグループから選択したトランス遺伝子を含み、前記バッチは1E11ウイルス粒子あたり0.1ng未満の宿主細胞DNAしか含まないことを特徴とする。もちろん、本発明の本態様の範囲から逸脱しない範囲で、これらのトランス遺伝子は、自然界でみられる野生型(全ての分離株および亜型を含む)の配列と比較して、欠失、付加、および/または変異を任意に含んでいても良い。明らかに、汚染宿主細胞DNAを非常に少ない量しか含まないバッチを利用できることは、規制の目的で既に必要とされているわけではないとしても、被験者に投与する目的には有益である。好適な態様では、バッチは1011ウイルス粒子あたり、0.08ng未満、より好適には0.06ng未満、さらに好適には0.04ng未満の宿主細胞DNAしか含まないことを特徴とする。
本実施例では、細胞を溶解する前にヌクレアーゼを細胞培養物へ添加することによって、最終的に精製されたバルク中の残留宿主細胞DNA量が減少することを示す。
1. ベンゾナーゼ(Benzonase:商標登録)を添加すると、ウイルスを生成したために溶解した細胞から放出されたDNAを、早くも消化することが可能である。Tritonによって溶解した細胞からDNAが放出されるや否や、DNAを消化するべくベンゾナーゼ(Benzonase:商標登録)が存在しているので、大きなDNA凝集物の形成が妨げられる。おそらく、非凝集DNAを消化することの方が、大きなDNA凝集物を消化するよりも効率的であろう。
2. ベンゾナーゼ(Benzonase:商標登録)存在下の全インキュベーション時間は30分増加するので、より効率的な消化が可能になる(ベンゾナーゼ(Benzonase:商標登録)の小冊子;Merck KGaA, コード W214950を参照されたい)。
3. おそらく、DNAが放出されるやいなや消化されると、より大きなヒストン複合体が形成され、洗浄フィルターによってこれらの大きな粒子が保持される。洗浄している間にヒストン―DNA複合体が保持されると、残留宿主細胞DNAが減少する一因となる可能性がある。
PER.C6細胞を10リットルのバイオリアクター中で培養し、Ad5.Adapt.MV-H(麻疹ウイルスヘムアグルチニンをトランス遺伝子として有する;WO 2004/037294に記載されている)を感染させた。感染後2.5日の時点で、1% TritonX-100(商標登録)を用いて細胞を溶解し、30分後にベンゾナーゼ(Benzonase :商標登録)(50 units/ml) およびMgCl2 を添加し、さらに30分間培養した。回収物を0.5μmのClarigardフィルターによって洗浄し、その後Millistak DE 30/60 フィルター(Millipore社)によって洗浄した。洗浄した回収物を、等量の0.6M NaCl /50mM HEPES (pH7.5)溶液にて希釈し、NaClの最終濃度を0.3Mとした。希釈した洗浄した回収物を、500kDの平面カセット(Biomax500, Pellicon 2 モジュール Millipore社)を用いて4倍に濃縮し、その後、2ダイアフィルトレーション容積(DFV)の0.3M NaCl/50mM HEPES(pH7.5)、2DFVの0.6M NaCl/50mM HEPES(pH7.5)、2DFVの1.0M NaCl/50mM HEPES (pH7.5)、および3DFVの0.3M NaCl/50mM HEPES (pH7.5)によってダイアフィルトレーションした。生成した透過液の伝導度を測定し、サンプルをSDS-PAGEによって分析した(図3)。データは、透過液の塩濃度(故に保持液の塩濃度)が0.55〜0.85M NaClの範囲にあるかそれ以上のとき、ヒストン(ゲル上で約10〜20kDの分子量であり、質量分析法により同定する)は膜の細孔を通過してしまうことを示している。
エボラ核タンパク質をトランス遺伝子として有する組み換えアデノウイルスの生成については、実施例5に記載する。本実施例では、そのようなウイルスの精製について記載する。
Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NPを、記載したプロトコールによって精製した(実施例1および図4参照)。この方法を行った結果、発現したエボラ核タンパク質(NP)トランス遺伝子がウイルスと共精製された。充填され完成した生成物を、5MのNaCl(最終濃度2.5M)または2%のTween 20(最終濃度1%)のうちいずれか一方を含むバッファーを用いて1対2に希釈し、Sepharose 4 FF カラムに流入する前に、室温で1時間インキュベーションした。ボイド分画(void fraction)および遅延分画(retarded fraction)をSDS-PAGEによって分析した。結果(図5)は、ボイド分画は、インタクトなNPを汚染することなく、アデノウイルス5型を含むことを示している。ここまでのところ、高い塩濃度を用いた結果には再現性があるように見えたが、界面活性剤を用いた結果には再現性がなかったため、高い塩濃度を用いることが好適である。しかし、使用する界面活性剤やその濃度を変化させることによって、界面活性剤の最適な条件を試験することができる。
Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NPを、記載したプロトコールによって精製した(実施例1および図4参照)。充填され完成した生成物を、10kDの膜を用いて、1, 2, 3または5MのNaClを含む、50mMのTRISバッファー(pH7.5)に対して透析した。Ad5.Ebo.NPを、Sepharose 4 FFカラムに流入する前に、これらのバッファー中で2時間または一晩培養した。ボイド分画および遅延分画をSDS-PAGEによって分析した。結果は、ボイド分画はアデノウイルス5型を含み、NPの量は有意に少ないことを示している。表2に示すように、NPの除去量は塩濃度およびインキュベーション時間と相関する。
本実験を図6に図式的に示した。PER.C6細胞を10リットルのバイオリアクター中で培養し、Ad5.dE3x.Adapt.Ebo.NP.を感染させた2.5日後に、ベンゾナーゼ(Benzonase :商標登録)(50 units/ml) およびMgCl2 を細胞培養液に添加し、10分後に細胞を1% Triton(商標登録)X-100で溶解し、さらに50分間培養した。回収物を0.5μmのClarigardフィルターにより洗浄し、その後Sartopore 2 フィルター(0.8/0.45μm,Sartorius社)によって洗浄した。
1. 洗浄した回収物を5MのNaClへとダイアフィルトレーションすることは、おそらく宿主細胞タンパク質の沈殿が生じるせいで、実行不可能である。
2. よく精製したAd5dE3x.Adapt.Ebo.NPを5MのNaCl中でインキュベーションし、その後にSepharose 4 FF上で分離するか、または親水性フィルターを通して濾過することによって、エボラ核タンパク質からAd5dE3x.Adapt.Ebo.NPが精製される結果となる。
3. 2時間から一晩の間でインキュベーションステップを延長することによって、残留核タンパク質は、5%未満から1%未満へとさらに減少する結果となる。親水性フィルターを通して濾過することによって、同じ結果を得るために必要とされるインキュベーション時間が減少する可能性がある。
PER.C6細胞を10リットルのバイオリアクター中で培養し、別個の実験において異なる組み換えアデノウイルスを感染させた。感染させた2.5日後に、1% TritonX-100(商標登録)を用いて細胞を溶解し、30分後に、ベンゾナーゼ(Benzonase :商標登録)(50 units/ml) およびMgCl2を添加して、さらに30分間培養した。回収物を洗浄実験のために用いた。
本発明による方法により、様々な組み換えアデノウイルスを精製した。このようなウイルスを生成することは、例えばEP 0955373, WO 03/104467およびWO 2004/001032に記載されている、当技術分野では周知の方法によって、例えば、パッケージング細胞内でゲノムの左端部分(時々「アダプタープラスミド」と呼ばれ、トランス遺伝子を簡単にクローニングするのに有用である)および右端部分を相同組み換えすることによって可能である。ウイルスは、例えば、293細胞、PER.C6(登録商標)細胞(ECACCにNo.96022940の名前で登録されている細胞が例として挙げられる;米国特許第5,994,128号参照)またはAd35からE1B 55Kタンパク質を発現するPER.E1B55K細胞(米国特許第6,492,169号参照)のような、当技術分野では周知のパッケージング細胞内で増殖することが可能である。本発明の方法によって精製されたか精製される、複数の組み換えアデノウイルスのコンストラクションを本実施例に記載する。
pAdapt. Ebola NPの生成
エボラウイルスザイール株の核タンパク質をコードする遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅したが、ここで、pAdApt(登録商標)ベクター内でダイレクショナル・クローニング(directional cloning)を行うため(EP 0955373参照)、制限酵素認識部位および最適な翻訳開始に必要なコンセンサス配列を導入するために(Kozak M, 1987, At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J Mol Biol. 20: 947-950)、プライマーとして、forward配列;6401 5' GCA CCG GTG CCG CCA TGG ATT CTC GTC CTC A 3' (配列番号1)および reverse配列;6401 5'GCG CTA GCT CAC TGA TGA TGT TGC AG 3' (配列番号2)を用いた。PCR反応は、プライマー各々10μM,VRC6401(WO 03/028632参照)のminiprep DNA 0.75μl,Pwo DNA polymerase 1.5単位,10×PCRバッファー5μl,および20mM dNTP 0.5μl を用いて、Biometra社のT1またはT3サーマルサイクラーを用いて行った。PCRの条件は、94℃ 5分,50℃ 1分,72℃ 4分を1サイクル、94℃ 1分,50℃ 1分,72℃ 4分を5サイクル、94℃ 1分,62℃ 1分,72℃ 4分を20サイクル、94℃ 1分,62℃ 1分,72℃ 10分を1サイクルとした。次に、正しい大きさのPCR産物をPinA I (Age Iのイソ制限酵素)を用いて切断し、PinA IおよびHpa Iを用いて切断したpAdApt(登録商標)ベクターにライゲーションした。断片を室温にて2時間ライゲーションした後、ヒートショック形質転換法により、50%の混合物を大腸菌DH5α T1R細胞へ形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを追加したLBアガープレート上へ平板培養した。20個のコロニーを選び、アンピシリンを付加したLB培地で、37℃で一晩培養した。Qiagen社のminiprep Spin kitを用いて、メーカーの記載の通りに、Miniprep DNAを抽出した。Hind IIIおよびXba Iを用いた制限酵素分析によって正しいクローンを選択した後、さらにDNAシークエンス分析によって確認した。
エボラウイルスザイール株の糖タンパク質全長をコードする遺伝子を、プライマーとして、forward配列;6001(5' CCC AAG CTT GCC GCC ATG GGC GTT ACA GG 3') (配列番号3)および reverse配列;6001(5' GGC TCT AGA TTA CTA AAA GAC AAA TTT GC 3') (配列番号4)を用いて、PCR法によって増幅した。PCR反応は、プライマー各々10μM,VRC6001(WO 03/028632参照)のDNA100ngおよび25ng,Pwo DNA polymerase 1.5単位,10×PCRバッファー5μl,および20mM dNTP 0.5μlを用いて、Biometra社のT1またはT3サーマルサイクラーを用いて行った。PCRの条件は、94℃ 5分,55℃ 1分,72℃ 4分を1サイクル、94℃ 1分、55℃ 1分、72℃ 4分を5サイクル、94℃ 1分,64℃ 1分,72℃ 4分を20サイクル、94℃ 1分、64℃ 1分、72℃ 10分を1サイクルとした。次に、正しい大きさのPCR産物をHind IIIおよびXba Iを用いて切断し、同様に切断したpAdApt(登録商標)ベクターにライゲーションした。断片を室温にて2時間ライゲーションした後、ヒートショック形質転換法により、50%の混合物を大腸菌DH5α T1R細胞へ形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを追加したLBアガープレート上へ平板培養した。コロニーを選択し、アンピシリンを付加したLB培地で、37℃で一晩培養した。Qiagen社のminiprep Spin kitを用いて、メーカーが記載の通りに、Miniprep DNAを抽出した。Hind IIIおよびXba Iによる制限酵素分析によって正しいクローンを選択した後、さらにDNAシークエンス分析によって確認した。
上述の方法と同様にして、C末端の29個のアミノ酸の長さの膜貫通領域を欠失した、エボラウイルスのザイール株およびスーダン/グール株の糖タンパク質の1つをコードするコドン最適化配列(それぞれ、GPdTM (Z)およびGPdTM (S)、WO 03/028632をも参照されたい)をpAdaptベクターへクローニングした。
例えば、EP 0955373に記載されている周知の方法により、異なるインサートを有するpAdaptプラスミド(pAdapt.Ebola NP, pAdapt.Ebola GP (Z), pAdapt.Ebola GPdTM (S), pAdapt.Ebola GPdTM (Z))を、アデノウイルス5型ゲノムの残余部分から構成されるプラスミド(pWE/Ad.AflII-rITRsp(EP 0955373参照)のE3領域(XbaI領域)から1878塩基が欠失した、pWE/Ad.AflII-rITRsp△E3プラスミドをアデノウイルスゲノムの右端に使用したもの)との相同組み換えにより、組み換えアデノウイルスを作製するために使用したところ、結果として、それぞれ、Ad5dE3x.Adapt.Ebo.NP, Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GP (Z), Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM (S) および Ad5dE3x.Adapt.Ebo.GPdTM (Z)という名前のウイルスが生じた。もちろん、トランス遺伝子を、Ad35のような、異なる血清型のアデノウイルスベクターに同様にクローニングして、これらの血清型に由来する組み換えアデノウイルスを生成することも可能である(例えば、WO 00/70071参照)。
pAdapt.CS.pFalcおよびpAdapt535.CS.Pfalcの生成
コドン最適化した、熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲(CS)遺伝子を合成し、pCR-script(Stratagene社)へとクローニングすることによって、WO 2004/055187に記載のような、クローン02-659を提供する。CS遺伝子を、pAdaptおよびpAdapt535(WO2004/001032参照)へとクローニングして、それぞれ組み換えAd5および組み換えAd35ベクターを生成した。クローン02-659および両pAdaptベクターをHind IIIおよびBam HIによって切断し、ライゲーションにより結合した。断片を室温にて2時間ライゲーションした後、ヒートショック形質転換法により、50%の混合物を大腸菌DH5α T1R細胞へ形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを追加したLBアガープレート上へ平板培養した。
PER.C6細胞を、約100万細胞/mlの細胞濃度となるまで、撹拌槽の中で培養した。この細胞にMOI40のAd35.CSベクターを感染させた。ウイルスが生成された4日後に、感染させた細胞培養液を、実施例1に記載のように、ベンゾナーゼ(Benzonase)およびTriton X-100(B/T法)によって処理した。実施例1に記載の通りに、B/T回収物を洗浄した。洗浄した回収物をTFFによって5倍に濃縮して(0.05μmの中空糸を使用する)、その後10ダイアフィルトレーション容積の0.1M NaCl, 0.05% PS80 および 50mM Tris pH7.5によってダイアフィルトレーションした。濃縮し、ダイアフィルトレーションした保持液を0.45μmのフィルター上で濾過して、捕獲用のカラムまたはフィルター上へ流入した。捕獲ステップとして、Q-XLカラム(3mlカラム,ベッド高15cm)またはSartobind 75 filter(陰イオン基を含む荷電フィルター;Sartorius社)を試験した。結合成分を、TRISを基本とするバッファー中に0〜1Mの勾配でNaClを含む溶液によって溶出した。荷電フィルターの溶出プロファイルは、勾配の初めに付加的なピークを示すが、このピークはAd35のピークとは区別される。Ad35ウイルスのピークは、荷電フィルターの場合には、塩濃度が高いほどより急なピークとして溶出し、ピークは0.44M NaCl(溶出開始−0.41M, 終了−0.49M NaCl)であったが、Q-XL樹脂の場合は0.39M NaCl(溶出開始−0.19M, 終了−0.53M NaCl)であった。溶出された分画を、SDS-PAGE、HPLC-AEX、ディスク遠心分離法およびTCID50によって分析した。
Claims (32)
- 宿主細胞からウイルスを精製する方法であって、
a) ウイルスに感染させた宿主細胞を培養するステップと、
b) 細胞培養物にヌクレアーゼを添加するステップと、および、
c) ウイルスを含む溶解物を提供するために前記宿主細胞を溶解するステップと、
を所定の順序で含む前記方法。 - さらに、d) 溶解物を洗浄するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- さらに、e) 少なくとも1回のクロマトグラフィー・ステップによりウイルスをさらに精製するステップを含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記ウイルスが組み換えアデノウイルスであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- ステップb)のヌクレアーゼがベンゾナーゼ(Benzonase)であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 宿主細胞を溶解するステップc)を、界面活性剤により行うことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 界面活性剤をTriton-X 100とすることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- ステップd)は深層濾過および膜濾過からなることを特徴とする、請求項2〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 膜濾過を0.8μmおよび0.45μmのフィルターを組み合わせて用いることによって行うことを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- ステップe)に先立って、洗浄した溶解物を、限界濾過および/またはダイアフィルトレーションにかけることを特徴とする、請求項3〜9のいずれか1項に記載の方法。
- ダイアフィルトレーションにかけた洗浄した溶解物を、0.8〜2.0MのNaClを含む溶液、好適には約1MのNaClまたは同等なイオン強度を供する他の塩を含む溶液に対して交換することを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- ステップe)は陰イオン交換クロマトグラフィーを含むことを特徴とする、請求項4〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーを、陰イオン交換基を含む荷電フィルターを用いて行うことを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- ステップe)は粒径排除クロマトグラフィーを含むことを特徴とする、請求項4〜13のいずれか1項に記載の方法。
- ステップe)は、
ステップe,i) 陰イオン交換クロマトグラフィー、および
ステップe,ii) 粒径排除クロマトグラフィー
によって構成されることを特徴とする、請求項4〜14のいずれか1項に記載の方法。 - 組み換えアデノウイルスを含む混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび粒径排除クロマトグラフィーからなる前記ステップの間に、少なくとも2MのNaClまたは同等なイオン強度を供する他の塩を含む溶液によってバッファー交換することを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- ステップd)およびその後のステップで用いるバッファーには、界面活性剤、塩化マグネシウムおよびスクロースを含まないことを特徴とする、請求項4〜16のいずれか1項に記載のプロセス。
- 宿主細胞を溶解することが可能なウイルスを精製するための方法であって、
a) 宿主細胞を溶解することが可能な前記ウイルスを含む宿主細胞を培養するステップと、
b) 外部溶解因子を添加することなく、ウイルスが培養液中に放出された後にウイルスを回収するステップであって、95%の宿主細胞が溶解してしまう前にヌクレアーゼを培養物へと添加することを特徴とする該ステップと、
によって構成される前記方法。 - 出血熱ウイルスの核タンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスを生成するための方法であって、
a) 前記ウイルスを感染させた宿主細胞を培養するステップと、
b) 前記ウイルスを含む宿主細胞の前記培養物を、宿主細胞を溶解することによって処理し、前記ウイルスを含む溶解物を提供するステップと、
c) ウイルスを陰イオン交換クロマトグラフィーにかけるステップであって、陰イオン交換クロマトグラフィーによる処理後に、混合物を含むウイルスを、少なくとも1MのNaClまたは同等なイオン強度を供する他の塩を含む溶液、および/または少なくとも1%の界面活性剤を含む溶液によってバッファー交換することを特徴とするステップ、
とによって構成される方法。 - 混合物を含むウイルスを、少なくとも1MのNaClまたは同等なイオン強度を供する他の塩を含む溶液によって、少なくとも1回バッファー交換することを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 前記ウイルスが組み換えアデノウイルスであることを特徴とする、請求項19または請求項20に記載の方法。
- 前記出血熱ウイルスがエボラウイルスである特徴とする、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶液は、少なくとも1.5MのNaClまたは同等なイオン強度を供する他の塩を含むことを特徴とする、請求項20〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶液は、少なくとも2MのNaClまたは同等なイオン強度を供する他の塩を含むことを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- 前記溶液は、少なくとも3MのNaClまたは同等なイオン強度を供する他の塩を含むことを特徴とする、請求項24に記載の方法。
- 前記溶液は、約5MのNaClまたは同等なイオン強度を供する他の塩を含むことを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- 1.2μm又はそれ以下の孔径を有する親水性フィルターを通してバッファー交換した、混合物を含むウイルスを、さらに濾過することを特徴とする、請求項19〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記孔径は約0.45μmまたは約0.22μmであることを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- バッファー交換した混合物を含むウイルスを、粒径排除クロマトグラフィーにかけるステップをさらに備えることを特徴とする、請求項19〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 組み換えアデノウイルス調製物から遊離アデノウイルスタンパク質を除去するための方法であって、遊離アデノウイルスタンパク質を含む組み換えアデノウイルス調製物を、陰イオン交換基を含む荷電フィルターにかけるステップを備えることを特徴とする方法。
- 前記組み換えアデノウイルス調製物は、サブグループBの組み換えアデノウイルスを含むことを特徴とする、請求項30に記載の方法。
- 前記組み換えアデノウイルスがAd35組み換えアデノウイルスである、請求項30または請求項31に記載の方法。
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