WO2018194438A1 - 비복제 아데노 바이러스 생산 세포주 및 이의 제조방법 - Google Patents

비복제 아데노 바이러스 생산 세포주 및 이의 제조방법 Download PDF

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    • C12N2740/13044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector

Definitions

  • the present invention provides novel cell lines producing non-replicating adenoviruses; A method of preparing the same; And the use of said cell line.
  • Vectors are most commonly used as a means of delivery for delivery of genes into cells and in vivo for application in gene therapy clinical trials.
  • Vectors are largely non-viral vectors, such as DNA and RNA, which use the nucleic acid itself, and viral types include adeno, retro, pox, vaccinia, and herpes. Of these, adeno is most commonly used in gene therapy clinical trials.
  • Adenovirus in the form of double-stranded DNA, shows high expression rates in both dividing and non-dividing cells. In addition, there is an advantage that there is little restriction in inserting an external gene.
  • adenovirus as a gene transfer vector
  • RCA replication replication adenovirus
  • RCA can be generated by host sequence and recombination or contamination at various stages of the manufacturing process. If a small number of RCAs are present, they can replicate themselves in human tissue and spread to other sites, which can cause serious side effects in patients with immunodeficiency.
  • An object of the present invention is to provide a recombinant adenovirus producing cell line having a non-replicating ability that does not generate RCA. It is another object of the present invention to provide a method for producing the non-replicating adenovirus producing cell line and the use of the cell line.
  • the present invention provides a non-replicating adenovirus producing cell line; A method of making a non-replicating adenovirus producing cell line; And non-replicating adenovirus producing cell lines.
  • a non-replicating adenovirus producing cell line comprising one or more substances of an E1A protein, a nucleic acid sequence encoding E1A, an E1B protein, and a nucleic acid sequence encoding E1B.
  • the E1 protein may be characterized in that the adenovirus type 5 E1 protein.
  • nucleic acid sequence encoding the E1A protein may be represented by SEQ ID NO: 1.
  • nucleic acid sequence encoding the E1B protein may be represented by SEQ ID NO: 2.
  • the cell line may be characterized in that the human-derived cells.
  • the cell line may be characterized as L132 cells.
  • the adenovirus-producing cell line according to the present invention has a lack of replication ability of the adenovirus itself, there is a feature that can be used safely for therapeutic purposes because RCA does not occur.
  • the present invention also provides a non-replicating adenovirus producing cell line; And it provides a packaging system for recombinant adenovirus production comprising adenovirus vectors.
  • a method of producing a non-replicating adenovirus producing cell line comprising the following steps;
  • step (c) infecting a retrovirus comprising a nucleic acid sequence of the E1 gene produced from step (b) into a cell line for adenovirus production;
  • step (d) additionally infecting any one or more of the retroviruses comprising the nucleic acid sequence of the E1A or E1B gene produced from step (b) to the adenovirus-producing cell line of step (C) to produce a non-replicating adenovirus producing cell line. It can provide a method for producing a non-replicating adenovirus producing cell line comprising the step of obtaining.
  • the E1A gene may be represented by SEQ ID NO: 1.
  • the E1B gene may be represented by SEQ ID NO: 2.
  • the adenovirus producing cell line may be a human-derived cell line, a preferred example may be characterized as L132 cells.
  • the present invention can provide various uses of adenoviruses obtained from cell lines produced by the above methods.
  • Adenovirus obtained from the cell line produced by the above method A cell line comprising a nucleic acid sequence of the rep gene of AAV (adeno-associated virus) and a nucleic acid sequence of the cap gene of AAV; And it can provide a packaging system for AAV production comprising the AAV vector.
  • a gene therapy agent comprising adenovirus obtained from the cell line produced by the above method can be provided.
  • the present invention can provide various uses of the above cell lines.
  • the nucleic acid sequence of the E1 gene In one embodiment of the invention, the nucleic acid sequence of the E1 gene; And
  • An antibody producing cell line further comprising any one or more nucleic acid sequences selected from nucleic acid sequences of E1A and E1B genes can be provided.
  • the nucleic acid sequence of the E1 gene In one embodiment of the invention, the nucleic acid sequence of the E1 gene; And
  • a vaccine-producing cell line further comprising any one or more nucleic acid sequences selected from the nucleic acid sequences of the E1A and E1B genes can be provided.
  • the cell line of the present invention can be used for antibody production or vaccine production.
  • the present invention relates to a non-replicating adenovirus-producing cell line, using the cell line of the present invention can provide a recombinant adenovirus-producing cell line having a non-replicating ability in which RCA is not generated, as well as a non-replicating adenovirus-producing cell line It is possible to provide a cell line with excellent ability to produce adenoviruses having replication ability.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the adenovirus E1 gene used in the present invention.
  • 3 is a sequence of the adenovirus E1B gene used in the present invention.
  • FIG. 5 shows the expression of E1 gene in HT1080 cells (HT), HEK293 cells (293), HT1080 cells (HT-E1) transfected with a retroviral vector comprising the E1 gene and plasmid (gE1) in genomic DNA form. The result is.
  • Figure 7 shows the results of measuring the production titers of adenoviruses when L132 cells were transfected with a retrovirus containing the E1 gene.
  • FIG. 8 shows the results of measuring the production titers of adenoviruses when L132 cells were transfected with a retrovirus containing an E1 gene and further transfected with a retrovirus containing an E1A gene.
  • 9 is a result of comparing the production titers of adenoviruses when L132 cells were transfected with an E1 retrovirus and transfected with a retrovirus containing an E1 gene, and further transfected with a retrovirus containing an E1A gene. to be.
  • 11 is a result of confirming the RCA test of the adenovirus producing cell line transfected with E1 retrovirus after transfection of L132 cells with E1 retrovirus.
  • E1 protein refers to some of the envelope proteins (epidermal proteins) of the virus.
  • the adenovirus E1 protein has the ability to replicate adenovirus.
  • non-replicating and “nonreplicating” refer to the lack of propagation capacity of a virus.
  • adenovirus lacks the replication ability of the adenovirus through the deletion of part or all of the E1 gene.
  • cell line refers to a series of cell lines whose genetic traits are maintained even when passaged into clones of cultured cells that can continue to divide and proliferate through cell culture.
  • promoter is a regulatory sequence that is a nucleic acid sequence region in which transcription initiation and rate are regulated. These promoters may contain genetic elements that can bind regulatory proteins and molecules such as RNA polymerase and other transcription factors to initiate specific transcription of the nucleic acid sequence.
  • the terms 'effectively placed', 'effectively bound', 'under control' and 'under transcription control' refer to the correct position of action and / or with respect to the nucleic acid sequence in which the promoter controls transcription initiation and expression of the sequence. It is meant to be arranged in an orientation.
  • operably linked refers to the binding of one nucleic acid fragment to another nucleic acid fragment so that its function or expression is affected by another nucleic acid fragment.
  • Expression control sequences also refer to DNA sequences that control the expression of nucleic acid sequences operably linked in a particular host cell. Such regulatory sequences include any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • vector refers to DNA that transfers genetic material to another cell.
  • desired DNA In order to make a vector, the desired DNA must be combined with other DNA, and the resulting DNA is called recombinant DNA (recombinant DNA).
  • recombinant refers to the process of binding a DNA fragment of any organism to other DNA molecules and may be used as a recombinant vector or recombinant virus in the present invention.
  • homologous recombination means that a linkage exchange occurs between two homologous DNA chains.
  • introduction refers to the introduction of foreign DNA into cells by transfection or transduction.
  • Transfections include sugars such as calcium phosphate-DNA co-precipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroshock, microinjection, liposome fusion, lipofectamine and protoplast fusion. It can be carried out by various methods known in the art. Transduction also refers to the transfer of genes into cells using viral or viral vector particles by means of infection.
  • nucleic acid refers to a polymer organic material consisting of a purine base and pyrimidine base sugar phosphoric acid, and a nucleotide means a polymer organic material to which a unit material is connected.
  • Five-sugar is a kind of carbohydrate with five carbon atoms, which is called sugar. This sugar is divided into ribose and deoxyribose.
  • bases There are five kinds of bases: adenine A, guanine G, thymine T, cytosine C, and uracil U.
  • packaging system for virus production used in the present invention is a system for producing a virus, and in the present invention, adenovirus or retrovirus can be produced.
  • Packaging systems for virus production include nucleic acid molecules and proteins necessary for virus production.
  • beneficial or desirable clinical outcomes include, but are not limited to, alleviation of symptoms, reduction of disease range, stabilization of disease state (ie, not worsening), delay or slowing of disease progression, disease state Improvement or temporary mitigation and alleviation (partially or wholly), detectable or not detected.
  • Treatment refers to both therapeutic treatment and preventive or preventive measures. Such treatments include not only the disorders to be prevented but also the treatments required for already occurring disorders. 'Palliating' a disease may reduce the extent of disease status and / or undesirable clinical signs and / or slow or lengthen the time course of progression as compared to untreated treatment. It means losing.
  • 'About' means 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 for reference quantities, levels, values, numbers, frequencies, percentages, dimensions, sizes, quantities, weights, or lengths. , Amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length, varying by about 3, 2 or 1%.
  • the present invention provides adenovirus E1 protein; And a non-replicating adenovirus producing cell line additionally expressing any one or more proteins selected from E1A or E1B.
  • the present invention also provides a method for preparing a non-replicating adenovirus producing cell line; And the use of said cell line.
  • One aspect of the invention is a cell line with viral production capacity.
  • a “viral production capacity” refers to a specific function (e.g., replication, transcription) by artificially manipulating (e.g., deleting) a specific factor (e.g., a gene, a protein, etc.) for the purpose of treating or preventing a disease. It means that the production capacity of the virus is increased, improved, or improved by preventing the occurrence of translation, etc.).
  • a specific function e.g., replication, transcription
  • a specific factor e.g., a gene, a protein, etc.
  • the particular factor may be a gene associated with the autologous replication of the virus.
  • the specific function may be a virus self-replicating function.
  • the virus has a characteristic of carrying and replicating and propagating its gene to another host. By using the characteristics of these viruses can remove the pathogenicity and can serve as a vector (transport) to carry a treatable gene.
  • the cell line may be one or more selected from retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus (AAV), lentivirus, herpes simplex virus (HSV), and the like. Cell lines having a combination virus production capacity, but are not limited thereto.
  • the cell line may include, but is not limited to, normal cells, cancer cells, stem cells, immune cells, and the like. Preferably the cell line may be normal cells.
  • Derivation of the cell line may include, but is not limited to, human origin, mouse origin, pig origin, monkey origin, sheep origin, plant origin, and the like.
  • the cell line is derived from a human derived cell line.
  • first cell line comprising one or more envelope genes
  • second cell line transfected with the result obtained from the first cell line.
  • the second cell line contains two or more envelope genes. Preferably it includes both the envelope gene and the envelope gene subtype.
  • the result obtained from the first cell line may be a virus expressing one or more envelope genes.
  • the envelope gene may include one or more selected from E1, E2, E3, and E4 genes, but is not limited thereto. More specifically, the envelope gene may be an E1 gene. Preferably, the envelope gene may be the E1 gene of adenovirus.
  • E1, E2 and E4 genes of the adenovirus are essential for this virus propagation and the E3 gene contains protein information that avoids the host cell's immune system, which is not essential for the virus propagation.
  • the envelope gene may also include an envelope gene subtype.
  • the envelope gene subtype may include one or more selected from E1A, E1B, E2A, E2B, E3A, E3B, E4A, E4B, but is not limited thereto. More specifically, the envelope gene subtypes may be E1A and E1B. Preferably, the envelope gene subtype may be E1A and E1B of adenovirus.
  • the E1B gene comprises a nucleotide sequence encoding E1B 19K (E1B19K) and a nucleotide sequence encoding E1B 55K (E1B55K) and inhibits apoptosis signaling mechanisms.
  • envelope genes described below are to be interpreted as meanings that include the envelope gene subtype.
  • the first cell line may include one or more selected from the envelope genes E1, E2, E3, E4, E1A, E1B, E2A, E2B, E3A, E3B, E4A, E4B, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the first cell line may include one or more genes selected from the envelope genes E1, E1A, and E1B.
  • the first cell line may be a cell line including E1, E1A, E1B independently.
  • the first cell line E1 and; It may comprise E1A or E1B.
  • the first cell line may include E1, E1A, and E1B.
  • the result obtained in the first cell line may be a result obtained in the form of a virus by inserting the envelope gene into a vector.
  • the vector may be a non-viral vector or a viral vector. More specifically, the vector is a viral vector, preferably a retroviral vector.
  • the first cell line inserts the E1, E1A and E1B genes into the retrovirus vectors, respectively, to obtain retroviruses including the E1, E1A and E1B genes, respectively, as a result obtained from the first cell line. have.
  • the first cell line can be inserted into the retroviral vector E1 and E1A or / and E1B gene to obtain a retrovirus containing E1 and E1A or / and E1B gene as a result obtained in the first cell line.
  • the retroviral vector may be a non-replicating recombinant retroviral vector having no replication capability.
  • the retroviral vector may include a foreign gene as a gene transfer vector.
  • the foreign gene is not particularly limited, but any gene that is desired to be expressed in a target cell, for example, a polypeptide (enzyme, growth factor, cytokine, receptor, structural protein, etc.), antisense RNA, ribozyme, decoy, RNA interference Nucleic acids encoding the resulting RNA and the like are exemplified.
  • a promoter, enhancer, terminator or other transcriptional regulatory element may be inserted into the nucleic acid to control the expression of the foreign gene.
  • suitable marker genes e.g., drug resistance genes, genes encoding fluorescent proteins, enzymes capable of functioning as reporters such as ⁇ -galactosidase or luciferase
  • suitable marker genes that allow selection of transduced cells Genes encoding the same).
  • the drug resistance gene it may be an antibiotic resistance gene.
  • One example of the present invention may be genes resistant to ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and tetracycline, but is not limited thereto.
  • the promoter is a Murine Leukemia Virus (LLV) Long terminal repeat (LTR) promoter, a Cytomegalovirus (CMV) promoter, an early adenovirus promoter, an adenovirus late promoter, a vaccinia virus 7.5K Promoter, SV40 promoter, tk promoter of HSV, Rous sarcoma virus (RSV) promoter, EF1 alpha promoter (Elongation factor-1 alpha), metallothionine promoter, beta-actin promoter, promoter of human IL-2 gene, human interferon Promoter of gene, promoter of human interleukin-4 gene, promoter of human lymphotoxin gene, promoter of human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) gene, human phosphoglycerate kinase (PGK) promoter or mouse phosphoglycer May be, but is not limited to, a late kinase (PGK) promoter.
  • LUV Long
  • the promoter may be an Elongation factor-1 alpha (EF1 ⁇ ) promoter.
  • EF1 ⁇ Elongation factor-1 alpha
  • the recombinant retroviral vector (recombinant retroviral vector, sometimes referred to herein as a recombinant retrovirus) used in the present invention may be a known retroviral vector.
  • MFG vectors or ⁇ -SGC vectors (Patent No. 92/07943 pamphlet), pBabe [Nucleic Acids Research, Vol. 18, pp. 3587-3596 (1990)], pLXIN (manufactured by Clontech, Inc.), retroviral vectors such as pDON-AI (manufactured by Takara Bio Co., Ltd.), lentiviral vectors (vectors derived from human immunodeficiency virus (HIV), vectors derived from monkey immunodeficiency virus (SIV), etc.), pBApo-EF1 ⁇ Neo DNA (TaKaRa Code 3243) or A pBApo-EF1 ⁇ Pur DNA (TaKaRa Code 3244) vector or a vector modified from these can be used.
  • pDON-AI manufactured by Takara Bio Co., Ltd.
  • lentiviral vectors vectors derived from human immunodeficiency virus (HIV), vectors derived from
  • the retroviral vector may be in a form in which gag, pol, and env genes are removed as MLV-derived vectors.
  • a retroviral vector comprising each of the nucleic acid sequences encoding the E1, E1A, E1B proteins of the adenovirus can be prepared.
  • the retroviral vector may further comprise an Elongation factor-1 alpha (EF1 ⁇ ) promoter.
  • EF1 ⁇ Elongation factor-1 alpha
  • the retroviral vector may further comprise an LTR sequence.
  • the retroviral vector may further comprise an IRES neo sequence.
  • the gene of the vector when the vector is transfected into a packaging plasmid and a virus producing cell line, the gene of the vector may be packaged to obtain a virus.
  • Transfection of the vector into a virus producing cell line can be carried out by various methods known in the art.
  • microinjection method comprising: Calcium phosphate precipitation method; Electroporation method; Liposome-mediated transfection; DEAE-dextran treatment; And the vector can be introduced into the cell by the gene bombardment method, but is not limited thereto.
  • the packaging plasmid lacks the cis-acting sequence required for most reverse transcription and integration and is intended to express only viral proteins of gag, pol, and env.
  • retroviral packaging cell lines transformed with retroviral vectors include various cells.
  • Such retroviral packaging cell lines are known packaging cell lines such as PG13 (ATCC CRL-10686), PA317 (ATCC CRL-9078), GP + E-86 or GP + envAm-12 (US Pat. No. 5,278, US). 056), Psi-Crip [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 85, pp. 6460-6464 (1988)], and the like.
  • retroviral producing cells by introducing a packaging plasmid (retrovirus packaging kit: TAKARA BIO INC., Etc.) loaded with a gene required for retroviral particle production in 293 cells or 293T cells. You can also make.
  • a packaging plasmid retrovirus packaging kit: TAKARA BIO INC., Etc.
  • the retroviral packaging cell line may be a human derived cell.
  • the retroviral packaging cell line may be L132 cells.
  • the first cell line may produce a virus that expresses the envelope gene.
  • a virus that expresses the envelope gene Preferably it may be a retrovirus.
  • the retroviruses can stably insert the E1 gene of adenoviruses, and have excellent titers, which are advantageous for transfecting adenovirus-producing cell lines.
  • the present invention transforms a cell line using the recombinant retrovirus prepared above to obtain a cell line expressing the adenovirus E1 gene.
  • the second cell line may also be a cell line infected with the virus produced by the first cell line. More specifically, the second cell line may be a cell line transfected with an adenovirus vector after transfecting the first cell line with an adenovirus producing cell line. In this case, the second cell line may include two or more envelope genes.
  • the form of the envelope gene that may be included in the second cell line is described as an example, but is not limited thereto.
  • the second cell line when the first cell line independently includes E1, E1A, and E1B, the second cell line may be transfected simultaneously or sequentially with two or more of viruses obtained from the first cell line to the adenovirus producing cell line, respectively. May be a cell line.
  • it may be a second cell line infected with the E1 first cell line product and the E1A first cell line product. It may also be a second cell line infected with the E1 first cell line product and the E1B first cell line product. In addition, the cell line may be transfected with the E1 first cell line product, the E1A first cell line product, and the E1B first cell line product.
  • the E1 first cell line product may be transfected first, followed by a second cell line infected with the E1A first cell line product.
  • the E1 first cell line product may be first transfected, and then the second cell line infected with the E1B first cell line product.
  • the cell line may be transfected with the E1 first cell line first, followed by transfection of the E1A first cell line and the E1B first cell line.
  • the second cell line may be a cell line transfected with the product of the first cell line in a desired order or combination.
  • the second cell line may be transfected with the E1 first cell line product first and then infected with the E1A or E1B first cell line product.
  • the second cell line is a cell line transfected with E1 retrovirus to an adenovirus producing cell line.
  • the second cell line is a cell line further transfected with E1A retrovirus after transfecting the E1 retrovirus into an adenovirus producing cell line.
  • the transfection is as described above.
  • the second cell line further comprises an adenovirus vector.
  • the adenovirus vector may further include an enhancer, terminator or other transcriptional regulator for controlling the expression of the foreign gene.
  • the adenovirus vector may further comprise a marker gene.
  • the marker gene may be, but is not limited to, a drug resistance gene, a gene encoding a fluorescent protein, a gene encoding an enzyme capable of functioning as a reporter, such as ⁇ -galactosidase or luciferase.
  • the adenovirus vector of the present invention can transfect cell lines expressing the E1 protein of adenovirus. Introduction of the adenovirus vector can be carried out through various methods known in the art.
  • Calcium phosphate precipitation method In one embodiment of the present invention, Calcium phosphate precipitation method; Electroporation method; Liposome-mediated transfection; DEAE-dextran treatment; And the vector can be introduced into the cell by the gene bombardment method, but is not limited thereto.
  • the adenovirus vectors of the invention enable the production of RNA transcripts of adenovirus vectors, which are packaged into viruses, and the adenovirus can be released into the medium.
  • the non-replicating adenovirus of the present invention can be obtained through the process of collecting and concentrating the medium.
  • the adenovirus obtained by collecting and concentrating the medium may be further subjected to purification for clinical application and may be by a known method.
  • purification of adenovirus may be performed using fractional centrifugation, density gradient centrifugation, column chromatography, expanded chromatography, virus precipitation, contaminant denaturation, and cell destruction using enzymes. But it is not limited thereto.
  • the first cell line and the second cell line is a cell line having different virus producing ability, specifically, the first cell line may be a retrovirus producing cell line, and the second cell line may be an adenovirus producing cell line. .
  • the retrovirus is considered the most useful vector for stably inserting a therapeutic gene into an RNA virus. Retroviruses, however, are only inserted into dividing cells, and transgenes cannot be introduced into cells that do not divide. In addition, there is a problem in that replication competent retrovirus (RCR), which remains replicable, and a serum complement may inactivate the retrovirus.
  • RCR replication competent retrovirus
  • the adenovirus has a high expression rate in both dividing and non-dividing cells in the form of double stranded DNA. It is also possible to produce recombinant viruses with high stability and high titer. Adenoviruses, however, can be isolated from a variety of organisms, from birds to humans, and are divided into six subgenes depending on their structural, biochemical and immunological properties. To date, adenovirus vectors used in gene therapy are widely used in Ad2 and Ad5. However, if there is a replication competent adenovirus (RCA) capable of self-replicating, it can cause serious side effects in patients with immunodeficiency. Therefore, it should be used as a gene transfer vector to minimize RCA production.
  • RCA replication competent adenovirus
  • the adenovirus type 5 has a replication origin essential for virus replication and has genes encoding E1, E2, E3, E4 genes and the viral capsid proteins.
  • the envelope gene and envelope gene subtypes are genes associated with adenovirus (RCA; replication competent adenovirus).
  • the RCA refers to a phenomenon in which the viral vector contained in the first cell line and the second cell line is self-replicated when the first cell line and the second cell line are applied as a gene therapy delivery tool. RCA can cause side effects in patients with a deficient immune response.
  • the cell line may be a cell line having a low possibility of producing a replication competent adenovirus (RCA) and having an increased ability to produce adenovirus.
  • RCA replication competent adenovirus
  • the formation of RCA can confirm whether the adenovirus cell line is reactive.
  • Adenovirus produced by the non-replicating adenovirus-producing cell line of the present invention may not have the E1 region, and thus does not have a replication ability, thereby reducing the immune response due to the replication ability of the adenovirus when used as a gene therapy agent. Can be.
  • the non-replicating adenovirus-producing cell line according to the present invention does not have the same sequence as the adenovirus production vector and thus has no characteristic of generating RCA (replication competent adenovirus), thereby producing adenovirus that can be used for gene therapy. .
  • the cell line according to the present invention is a non-replicating adenovirus producing cell line with increased productivity of adenovirus.
  • the cell line may be a cell line producing adenovirus. Preferably it may be a cell line producing the adenovirus E1 gene.
  • the cell line producing the E1 gene can be selected by measuring cell viability.
  • the cell expressing the adenovirus E1 gene can be a variety of cells.
  • A549 Carcinomic Human Alveolar Basal Epithelial Cell
  • HER Human Embryonic Retinoblast
  • HeLa Human Cervical Cancer Cell
  • CHO Choinese Hamster Ovary Cell
  • BHK Baby Hamster Kidney Cell
  • 3T3 Mouse Embryonic Fibroblast Cell
  • Myeloma Rat Pheochromocytoma Cell (PC12), Human Amniocyte, WS1 (Human Dermal Fibroblast), Human Lung Fibroblast (MRC5) or Human Lung Fibroblast Cell (WI38), L132 (human lung) cells
  • PC12 Human Amniocyte
  • WS1 Human Dermal Fibroblast
  • Human Lung Fibroblast MRC5
  • WI38 Human Lung Fibroblast Cell
  • it may be a cell line having the adenovirus production ability introduced E1 gene into the L132 cell line.
  • the stability may be increased by introducing the E1 gene into the L132 cell line, and then may be a cell line having the adenovirus production capacity into which the E1A or / and E1B genes are introduced.
  • the cell line of the present invention can provide adenovirus E1 gene with high stability to cross complement the adenovirus deleted with E1, thereby providing a cell line capable of producing highly efficient adenovirus.
  • Another aspect of the invention is a method of producing a cell line.
  • the method for producing the cell line may include a first step of obtaining a first cell line and a second step of preparing a second cell line.
  • the cell line production method is a method of transfecting the resultant obtained in the first cell line to the second cell line.
  • the first step is to obtain a first cell line.
  • the first step includes inserting the envelope gene; Producing an intermediate for the production of a second cell line.
  • Inserting the envelope gene is a step of inserting a gene sequence into an expression construct (vector) to allow the expression of the envelope gene.
  • the expression construct may use one or more selected from lentiviral vectors, adenovirus vectors, retroviral vectors, and the like, but is not limited thereto.
  • the expression construct may be a retroviral vector.
  • the envelope gene is inserted into the expression construct described in the following examples, but is not limited thereto.
  • retroviral vector comprising E1 and E1A
  • retroviral vector comprising E1 and E1B
  • retrovirus comprising E1A and E1B
  • E1, E1A And retroviral vectors comprising E1B.
  • E1, E1A, E1B by inserting three genes of the E1, E1A, E1B can be made retroviral vector comprising E1, E1A and E1B.
  • the insertion order when inserting the two or three genes may be changed depending on the purpose.
  • each of the E1, E1A, and E1B genes may be inserted to make an E1 retrovirus vector, an E1A retrovirus vector, and an E1B retrovirus vector, respectively.
  • insertion of the E1 gene into the retroviral vector can be confirmed whether the gene is inserted into the vector by PCR as shown in FIG. 10.
  • whether the E1A or E1B gene is inserted into the retroviral vector can be confirmed by inserting the gene into the vector through PCR as shown in FIGS. 6 and 10.
  • Production of the intermediate is a step of introducing the vector into which the envelope gene is inserted into an appropriate cell to obtain a viral form. More specifically, the retroviral vector into which the envelope gene is inserted is transfected into the retrovirus producing packaging cell line together with the packaging plasmid to harvest the retrovirus.
  • the retroviral vector When the retroviral vector is transfected into the packaging plasmid and the retrovirus producing cell line, the retroviral vector may be packaged to produce a retrovirus.
  • the transfection method is the same as described above.
  • the retroviral vector is transfected into the packaging plasmid and retrovirus producing cell line and cultured under conditions that allow retroviral production to occur.
  • Cell line clones are selected by incubating for a period of time until the transfected cells form colonies.
  • the selection of clones is carried out by culturing a cell line into which a retrovirus has been introduced, adding a selection material (for example, an antibiotic) in a medium, and then collecting resistant cells, selecting them, or selecting clones. Can be used.
  • a selection material for example, an antibiotic
  • the retrovirus may be transduced with a retroviral vector, a gag-pol, and an envelope expression plasmid at a time to produce a retrovirus by concentrating and purifying only the supernatant of the cells after a certain time.
  • the retroviruses are able to stably insert the E1 gene of adenovirus and have excellent titer, which is advantageous for transfecting adenovirus producing cell lines.
  • the retrovirus comprises a nucleic acid sequence encoding the E1 protein of the adenovirus to produce a production cell line expressing the E1 protein for producing a non-replicating adenovirus used for gene therapy To make a retrovirus.
  • retroviral vector When the produced retrovirus is infected with an adenovirus producing cell line, only the structure of the retroviral vector may be inserted into the chromosome of the cell line to induce the expression of the foreign gene, adenovirus E1 protein.
  • the second step is to obtain a second cell line.
  • the second step may be obtained by transfecting the resultant cell of the first step into appropriate cells.
  • the second cell line is a cell line including two or more envelope genes.
  • the second cell line is an adenovirus producing cell line comprising one envelope gene and one or more envelope subtype genes.
  • the second step includes transfecting the retrovirus produced by the first cell line into an adenovirus producing cell and then transfecting with an adenovirus vector.
  • the transfection method is the same as described above.
  • the second cell line comprising the steps of making a retrovirus comprising a nucleic acid sequence of one gene selected from E1, E1A, E1B; Obtaining each of the prepared retroviral vectors as a retrovirus; Transfecting the retrovirus into the cell line for adenovirus production.
  • the second cell line comprises the steps of making a retroviral vector comprising nucleic acid sequences of E1, E1A and E1B genes, respectively; Obtaining each prepared retroviral vector as each retrovirus; Transfecting the E1 retrovirus, the E1A retrovirus and the E1B retrovirus into a cell line for adenovirus production.
  • the second cell line comprises the steps of making a retroviral vector comprising nucleic acid sequences of E1, E1A and E1B genes, respectively; Obtaining each prepared retroviral vector as each retrovirus; Transfecting the E1 retrovirus, the E1A retrovirus and the E1B retrovirus into a cell line for adenovirus production.
  • the second cell line comprising the steps of creating a retroviral vector comprising two nucleic acid sequences of the E1, E1A, E1B gene; Obtaining each of the prepared retroviral vectors as a retrovirus; Transfecting the retrovirus into a cell line for adenovirus production; And additionally infecting the retrovirus comprising the remaining one nucleic acid sequence in the cell line transfected with the adenovirus-producing cell line, the retrovirus comprising the two nucleic acid sequences.
  • the second cell line comprises the steps of making a retroviral vector comprising nucleic acid sequences of E1, E1A and E1B genes, respectively; Obtaining each prepared retroviral vector as each retrovirus; Transfecting the E1 retrovirus into a cell line for adenovirus production; And further infecting the E1A and / or E1B retrovirus to the cell line transfected with the E1 retrovirus to the cell line for adenovirus production.
  • the adenovirus producing cell line measures the titer of the cell line producing adenovirus E1 gene to show the efficiency of how much the cell line can produce adenoviruses in FIGS.
  • real-time PCR can confirm adenovirus production efficiency of the cell line.
  • the adenovirus producing cell line transfected with the E1 retrovirus and then transfected with the E1A or / and E1B retrovirus is higher than the adenovirus producing cell line transfected with the E1 retrovirus. This higher can be seen in FIGS. 7, 8 and 9.
  • the adenovirus producing cell line transfected with the E1 retrovirus and then transfected with E1A or / and E1B retroviruses can be seen in Figure 11 that there is no RCA response.
  • the cell line capable of producing the adenovirus having the non-replicating ability may be a cell line derived from human cells, but is not limited thereto.
  • the cell line derived from a human cell may be an L132 cell line.
  • non-replicating adenovirus of the present invention can be obtained through the process of collecting and concentrating the medium.
  • the adenovirus obtained by collecting and concentrating the medium may be further subjected to purification for clinical application and may be by a known method.
  • purification of adenovirus may be performed using fractional centrifugation, density gradient centrifugation, column chromatography, expanded chromatography, virus precipitation, contaminant denaturation, and cell destruction using enzymes. But it is not limited thereto.
  • Adenovirus produced by the production cell line of the present invention has a non-replicating ability.
  • the non-replicating ability of the adenovirus obtained by the cell line of the present invention can be confirmed by analysis of the presence of the E1 region by amplifying the genome of adenovirus present in the culture supernatant of the cell line of the present invention by PCR (polymerase chain reaction). have.
  • Adenovirus produced by the non-replicating adenovirus-producing cell line of the present invention may not have the E1 region, and thus does not have a replication ability, thereby reducing the immune response due to the replication ability of the adenovirus when used as a gene therapy agent. Can be.
  • the non-replicating adenovirus-producing cell line according to the present invention does not have the same sequence as the adenovirus production vector and thus has no characteristic of generating RCA (replication competent adenovirus), thereby producing adenovirus that can be used for gene therapy. .
  • the cell line by the method of the present invention is a non-replicating adenovirus producing cell line with increased productivity of adenovirus.
  • Adenoviruses produced from the adenovirus producing cell lines of the invention can be used to produce adeno-associated viruses.
  • Adenovirus-associated virus (AAV) of the present invention is a therapeutic protein by inserting into various cells (muscle, brain, lung, retina, liver, ear, gland, blood vessels, etc.) and infecting the target cell into the chromosome of the target cell. It is expressed stably for a long time.
  • the non-replicating adenovirus producing cell line Adenovirus obtained;
  • a cell line comprising a nucleic acid sequence encoding a rep protein of AAV (adeno-associated virus) and a nucleic acid sequence encoding a cap protein of AAV;
  • AAV adeno-associated virus
  • a packaging system for AAV production comprising the AAV vector.
  • the nucleic acid sequence encoding the rep protein of the AAV (adeno-associated virus) and the nucleic acid sequence encoding the cap protein of AAV can be introduced into the cell line by a known method.
  • the nucleic acid sequence may be introduced into adenovirus-related virus-producing cell lines, but there may be human calcium method, lipofection method, DEAE dextran method, polyethyleneimine method, electroporation method and the like.
  • the nucleic acid may be introduced into an adenovirus-related virus producing cell line using a vector or a plasmid, and the vector may be a retroviral vector, a lentiviral vector, an adenovirus vector, or the like, but is not limited thereto.
  • the AAV vector may be by a method known in the art.
  • Calcium phosphate precipitation method In one embodiment of the present invention, Calcium phosphate precipitation method; Electroporation method; Liposome-mediated transfection; DEAE-dextran treatment; And the vector can be introduced into the cell by the gene bombardment method, but is not limited thereto.
  • the AAV obtained through the packaging system for producing AAV can be used for gene therapy because it is efficiently inserted into the cell and the target of efficient infectivity.
  • Gene therapy can be prepared using the non-replicated adenovirus-producing cell line prepared above and the adenovirus produced through the packaging system for non-replicating adenovirus production.
  • Gene therapy of the present invention refers to a method for treating a congenital or acquired gene abnormality that is difficult to treat by conventional methods by genetic engineering method.
  • the gene therapy for the treatment and prevention of chronic diseases such as congenital or acquired genetic defects, viral diseases, cancer or cardiovascular diseases, by administering a genetic material such as DNA and RNA in the human body
  • a genetic material such as DNA and RNA
  • a therapeutic method may be provided that allows for expression of a protein or inhibition of expression of a particular protein.
  • the adenovirus may deliver the target gene in vivo, including the target gene required for gene therapy.
  • the adenovirus may deliver the target gene into cells taken from the patient.
  • the adenovirus may include a target gene instead of the E1 gene.
  • the adenovirus may include a target gene instead of the E1 gene.
  • adenovirus obtained from the non-replicating adenovirus producing cell line of the present invention is used for gene therapy, the immune response can be reduced due to the non-replicating ability and there is no risk of RCA.
  • the non-replicating adenovirus producing cell line of the invention can be used to produce antibodies.
  • the selection of highly productive cell lines is an important step in the production of therapeutic antibodies using cell lines.
  • the adenovirus E1 gene of the present invention can be endowed with high productivity through immortalization, ie, continuous cell division.
  • the adenovirus E1A gene of the present invention is associated with permanent cell division and the E1B gene has the ability to inhibit apoptosis, and after transformation to express the E1 gene as in the present invention, additionally E1A or By producing a recombinant cell line through transformation to express the E1B gene it is possible to obtain a cell line with high productivity.
  • an antibody means a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • Antibodies for the purposes of the present invention refer to antibodies produced by the cell lines of the present invention that specifically bind to an antigen and include all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies.
  • the polyclonal antibody using the cell line can be produced by methods well known in the art.
  • the polyclonal antibody may be prepared from any animal species host such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog, but is not limited thereto.
  • the monoclonal antibody using the cell line is a hybridoma method well known in the art (see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6: 511-519), or phage Antibody libraries (Clackson et al, Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991).
  • the antibody produced by the cell line can be isolated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography.
  • the antibodies produced include functional forms of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • the cell line may use human cells as an antibody producing cell line, but is not limited thereto.
  • CHO cells may be used as antibody and protein producing cell lines.
  • the antibody-producing cell line of the present invention is characterized by very low immunogenicity because there is no morphological difference in glycosylation, so the antibody produced by the cell line may be usefully used as a therapeutic agent.
  • the adenovirus producing cell line of the present invention can be used as a vaccine producing cell line.
  • Vaccine producing cell lines like the antibody producing cell lines, are also highly productive.
  • influenza vaccine production may use eggs or canine cells.
  • the vaccine produced by the present invention may be suitably formulated with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be used in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition and can be formulated into a solution for parenteral administration or lyophilized powder.
  • the powder may be reconstituted by adding a suitable diluent or other pharmaceutically acceptable carrier prior to use.
  • Liquid formulations may be buffers, isotonic solutions, aqueous solutions.
  • the powder may be sprayed in anhydrous form. Examples of suitable diluents are usually isotonic saline solutions, standard 5% dextrose solutions in water, or buffered sodium or ammonium acetate solutions.
  • the formulations are particularly suitable for parenteral administration but may be used for oral administration or contained in metered dose inhalers or spray nebulizers. It may be desirable to add excipients such as polyvinylpyrrolidone, gelatin, hydroxy cellulose, acacia, polyethylene glycol, mannitol, sodium chloride, sodium citrate and the like.
  • Vaccines produced by the cell lines of the invention can be prepared for oral administration.
  • Pharmaceutically acceptable solid or liquid carriers may be added to improve or stabilize the composition.
  • Solid carriers include starch, lactose, calcium sulfate dihydrate, clay, magnesium stearate or stearic acid, talc, pectin, acacia, agar or gelatin.
  • Liquid carriers include syrup, peanut oil, olive oil, saline and water.
  • the carrier may comprise a delayed release material such as glyceryl monostearate or glyceryl distearate alone or in combination with a wax.
  • the amount of solid carrier will vary but will preferably be from about 20 mg to about 1 g per dosage unit.
  • the preparation may be in the form of a syrup, elixir, emulsion, or an aqueous or non-aqueous suspension.
  • Vaccines produced by the cell lines of the present invention may be formulated with medicamentally useful drugs or biologics.
  • vaccines produced by the cell lines of the invention can be administered in parallel with the administration of other drugs or biological agents useful for the desired disease or condition.
  • the cell line according to the present invention When the cell line according to the present invention is used for vaccine production, it is possible to produce a safe vaccine since it has low immunogenicity.
  • Adenovirus type 5 E1 gene 2962bp was used as a template, and PCR was performed using E1A 998bp and E1B 1808bp using specific primers to obtain E1A bands of about 1 Kb and E1B bands of about 1.8 Kb.
  • E1A obtained through PCR can be identified using specific primers.
  • the genes were identified and cloned into the retroviral vector (enzyme digestion) in the clones of the E1, E1A, E1B, pro-E1, pro-E1A, pro-E1B gene.
  • the superviral vector into which the gene was inserted was co-transfected into a packaging cell line expressing the gag-pol protein together with the plasmid expressing the surface protein, and the supernatant 3 days later. (supernatant) was obtained. The supernatant was concentrated and purified via centrifuge to produce the retrovirus produced.
  • the standard was used by serial dilution from 10 9 to 10 5 considering the concentration and size of vector plasmid DNA.
  • the control virus expressing GFP was transformed with 1, 10, 100, etc., and the expression level was evaluated by fluorescence microscopy. This confirmed the production of retroviruses.
  • Example 1-1 In order to evaluate the expression of the E1 gene of Example 1-1, mRNA expression was confirmed using RT-PCR. The introduction of the E1 gene was confirmed by measuring the E1A gene, which includes introns among the E1 genes, which can distinguish between mRNA and gDNA form by PCR.
  • HT1080 cells were used as a negative control group
  • HEK293 (293) was used as a positive control group
  • PCR was performed using plasmid gE1, which is a genomic DNA form, as a control group to exclude plasmid contamination.
  • the retroviral vector obtained by cloning the E1A gene and the E1B gene of Example 1-1 was transformed into a retrovirus-producing packaging cell line, and the cells were cultured to obtain a gene.
  • DNA was extracted from the colonies of cultured cells by mini-prep method, cut through restriction enzymes, and subjected to electrophoresis. By measuring the size, it was confirmed whether the E1A gene and the E1B gene were introduced. ( Figure 6)
  • E1A gene or E1B gene was introduced into the retrovirus producing cells by the retroviral vector.
  • MRNAs of the selected cells were isolated and the expression levels of E1A, E1B19K and E1B55K were compared with those of HEK293 cells.
  • the method of transforming and selecting retroviruses expressing E1, E1A, E1B based on the expression amount of each cell line was repeated.
  • Retroviruses obtained through the method of Example 1 were infected with L132 cells and then transfected with adenovirus vectors to prepare non-replicating adenovirus producing cell lines. The titer of the produced adenovirus was measured to confirm the production of adenovirus in the cell line.
  • L132 cells were infected with E1 retrovirus only; And the experimental results were compared to the case of infection with the E1 retrovirus and additional E1A retrovirus to the cells such as the method of the present invention and the results are shown in Figures 7-9.
  • adenovirus production in cell line 6 was 2.9 times higher in the cell line further infected with E1A retrovirus.
  • cell line 11 (# 11) showed 3.8-fold higher adenovirus production.
  • FIG. 9 is a table comparing adenovirus production in these two cases, again showing high efficiency adenovirus titers in cell lines further infected with E1A retrovirus.
  • the adenovirus productivity can be increased by inserting the E1A gene additionally by the retrovirus according to the present invention.
  • adenovirus-producing cell line with the adenovirus vector as in Examples 1 to 3 After infection with the adenovirus-producing cell line with the adenovirus vector as in Examples 1 to 3, when CPE (cytopathic effect) was seen, the cells were harvested and degraded to obtain a supernatant. Then, adenovirus produced by concentration and purification using a centrifuge (ultracentrifuge) using CsCl.
  • Whether the virus produced had an E1 gene was measured by PCR using a specific primer, and HEK293 cells were used as a positive control group. The test result confirmed that the adenovirus produced in the adenovirus producing cell line of the present invention does not have the E1 gene.
  • Example 5 Stable, nonreplicating adenovirus producing cell line
  • E1 and E1A genes were cloned into retroviral vectors as in Example 1-1.
  • the gene (E1) inserted into the retroviral vector is inserted onto the genome DNA of the host cell.
  • cell gDNA was extracted (Qiagene Tissue kit) and confirmed by PCR using the following primers. (See Table 1 and Table 2)
  • E1 Primer Sequence (2962 bp) E1 (Forward) (0-33 bp) GGA TCC ATG AGA CAT ATT ATC TGC CAC GGA GGT (33mer) (SEQ ID NO: 3) E1 (Reverse) (2930-2962bp) GAA TTC TCA ATC TGT ATC TTC ATC GCT AGA GCC (33mer) (SEQ ID NO: 4)
  • E1A Primer Sequence (421 bp) E1A (Forward) (78-101 bp) CGA AGA GGT ACT GGC TGA TAA TCT (24mer) (SEQ ID NO: 5) E1A (Reverse) (480-499bp) CCG TAT TCC TCC GGT GAT AA (20mer) (SEQ ID NO: 6)
  • L132 cells (L132) were used as a negative control group, HEK293A cells (293A) were used as a positive control group, and the results of PCR using the cell lines (named L132-2E1-3E1A # 6) in which E1 and E1A were inserted into L132 cells were used as experimental groups. 10 is shown.
  • FIG. 10 is a result of confirming the E1 and E1A genes by electrophoresis of the result of the PCR.
  • (A) and (b) of FIG. 10 showed that the bands corresponding to E1 (2962bp) and E1A (421bp) were observed in the GT541 clone L132-2E1-3E1A # 6.
  • the virus was harvested after infection with Ad-GFP in the cell line, gDNA was extracted, and confirmed by PCR using a primer corresponding to E1. .
  • E1 RCA identified Primer sequence (241 bp)
  • E1 (RCA) Forward ATG AGA CAT ATT ATC TGC CAC (21mer) (SEQ ID NO: 7)
  • E1 (RCA) Reverse GTA AGT CAA TCC CTT CCT GCA C (22mer) (SEQ ID NO: 8)
  • Viral gDNA was extracted by infecting 293A cells (named 293A), DNA of 293A cells was extracted as positive control (named 293A cell) and PCR was used as GT541 cell line (named L132-2E1-3E1A # 6) as experimental group. And the results are shown in FIG.
  • RCA response that is, E1 (241 bp) band was found only in 293A cells and not in the rest.
  • the GT541 cell line was found to have no RCA reaction.
  • the titer of the produced adenovirus was measured.
  • FIG. 12 shows the results of comparing HEK 293A cells (named 293A) and L132-2E1-3E1A # 6 used as adenovirus host cells.
  • adenovirus-producing cell lines when the cells are infected with E1 retroviruses and then additionally infected with E1A retroviruses can not only increase adenovirus productivity, but can also be used as highly stable adenovirus cell lines because there is no RCA response. Able to know.
  • SEQ ID NO: 1 nucleic acid sequence encoding the E1A protein
  • SEQ ID NO: 2 nucleic acid sequence encoding the E1B protein
  • cagagctcta acagtacctc ttggttttgg aggtttctgt ggggctcatc ccaggcaaag
  • agggtaactc cagggtgcgc cacaatgtgg cctccgactg tggttgcttc atgctagtga
  • SEQ ID NO: 6 E1 reverse primer (20mer)
  • SEQ ID NO: 7 E1 RCA forward primer (21mer)

Abstract

본 발명은 비복제 아데노바이러스 생산 세포주; 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 아데노바이러스의 E1 단백질; 및 E1A 단백질 또는 E1B 단백질 중 선택되는 어느 하나 이상을 발현함으로서 복제능이 결여된 아데노바이러스를 생산하는 세포주 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 세포주는 아데노바이러스의 E1 단백질; 및 E1A 단백질 또는 E1B 단백질 중 선택되는 어느 하나 이상을 발현하는 세포주의 용도에 관한 것이다.

Description

비복제 아데노 바이러스 생산 세포주 및 이의 제조방법
본 발명은 비복제 아데노바이러스를 생산하는 신규한 세포주; 이를 제조하는 방법; 및 상기 세포주의 용도에 관한 것이다.
유전자를 세포 및 생체 내로 전달하여 유전자 치료 임상 시험에서 적용하기 위한 전달 수단으로 가장 많이 사용 되는 것이 벡터(vector)이다.
벡터는 크게 비바이러스형 벡터로 DNA와 RNA와 같이 핵산 그 자체를 이용하는 것이 있고, 바이러스형 벡터로 아데노(adeno), 레트로(retro), pox, vaccinia, herpes 등이 있다. 이들 중 유전자 치료 임상 시험에서는 아데노가 가장 많이 이용되고 있다.
이중가닥 DNA 형태인 아데노바이러스는 분열세포와 비분열세포 모두에서 높은 발현율을 나타낸다. 또한, 외부 유전자를 삽입하는데 제한이 적은 장점이 있다.
하지만 유전자 전달 벡터로서 아데노바이러스를 사용할 때 가장 문제가 되는 것은 RCA(replication comptent adenovirus)이다. RCA는 제조 과정 중 여러 단계에서 숙주 염기서열과 재조합 또는 오염에 의해서 생성될 수 있다. 만약 적은 수라도 RCA가 존재한다면 RCA는 인체 조직에서 스스로 복제되어 다른 부위로 퍼져 면역 결핍 환자의 경우 심각한 부작용을 일으킬 수 있다.
따라서 이러한 단점을 극복한 RCA가 발생되지 않는 비복제능을 가진 재조합 아데노바이러스의 세포주 생산이 필요하다.
본 발명의 목적은 RCA가 발생되지 않는 비복제능을 가진 재조합 아데노바이러스 생산하는 세포주를 제공하는 데에 있다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 비복제 아데노바이러스 생산 세포주를 제조하는 방법 및 상기 세포주의 용도를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 비복제 아데노바이러스 생산 세포주; 비복제아데노바이러스 생산 세포주를 제조하는 방법; 및 비복제 아데노바이러스 생산 세포주의 다양한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구체예로,
E1 단백질 및 이를 코딩하는 핵산서열 중 1 이상의 물질; 및
E1A 단백질, E1A를 코딩하는 핵산서열, E1B 단백질, 및 E1B를 코딩하는 핵산서열중 1 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주를 제공한다.
본 발명은 일 구체예로, 상기 E1 단백질은 아데노바이러스 타입 5의 E1 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 E1A 단백질을 코딩하는 핵산서열은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 E1B 단백질을 코딩하는 핵산서열은 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 세포주는 인간 유래 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 세포주는 L132 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 의한 상기 아데노바이러스 생산 세포주는 아데노바이러스 자체의 복제능이 결실되어 있으며, RCA가 발생 되지 않아 치료용도로 안전하게 사용될 수 있다는 특징이 있다.
또한, 본 발명은 상기 비복제 아데노바이러스 생산 세포주; 및 아데노바이러스 벡터를 포함하는 재조합 아데노바이러스 생산용 패키징 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 비복제 아데노바이러스 생산 세포주를 제조하기 위하여,
다음 단계를 포함하는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주의 제조방법;
(a) 아데노바이러스 E1, E1A 및 E1B 유전자의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 각각 제작하는 단계;
(b) 상기 제작된 레트로바이러스 벡터를 레트로바이러스 생산세포주에 각각 형질도입시켜 레트로바이러스를 생산하는 단계;
(c) 상기(b) 단계로부터 생산된 E1 유전자의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스를 아데노바이러스 생산용 세포주에 감염시키는 단계; 및
(d) 상기 (b) 단계로부터 생산된 E1A 또는 E1B 유전자의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스 중 어느 하나 이상을 상기 (C) 단계의 아데노바이러스 생산용 세포주에 추가적으로 감염시켜 비복제 아데노 바이러스 생산 세포주를 수득하는 단계를 포함하는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 구체예로, 상기 E1A 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 E1B 유전자는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 아데노 바이러스 생산세포주는 인간유래 세포주일 수 있고, 바람직한 일 예로는 L132 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 세포주로부터 수득된 아데노바이러스의 다양한 용도를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로,
상기의 방법에 의해 생산된 세포주로부터 수득된 아데노바이러스 ; AAV(adeno-associated virus)의 rep 유전자의 핵산서열 및 AAV의 cap 유전자의 핵산서열을 포함하는 세포주; 및 AAV 벡터를 포함하는 AAV 생산용 패키징 시스템을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기의 방법에 의해 생산된 세포주로부터 수득된 아데노바이러스를 포함하는 유전자치료제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 세포주의 다양한 용도를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, E1 유전자의 핵산서열; 및
E1A 및 E1B 유전자의 핵산서열 중 선택된 어느 하나 이상의 핵산서열을 더 포함하는 항체 생산 세포주를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, E1 유전자의 핵산서열; 및
E1A 및 E1B 유전자의 핵산서열 중 선택된 어느 하나 이상의 핵산서열을 더 포함하는 백신 생산 세포주를 제공할 수 있다.
즉, 본 발명의 세포주를 항체생산 또는 백신생산에 이용할 수 있다.
본 발명은 비복제 아데노바이러스 생산 세포주에 관한 것으로, 본 발명의 세포주를 이용하여 RCA가 발생되지 않는 비복제능을 가진 재조합 아데노바이러스 생산하는 세포주를 제공할 수 있을 뿐 아니라, 기존 생산 세포주에 비해 비복제능을 가진 아데노바이러스의 생성능이 뛰어난 세포주를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 이용되는 아데노바이러스 E1 유전자의 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 이용되는 아데노바이러스 E1A 유전자의 서열이다.
도 3은 본 발명에서 이용되는 아데노바이러스 E1B 유전자의 서열이다.
도 4는 본 발명에서 이용되는 E1A 유전자의 PCR 결과이다.
도 5는 HT1080 세포(HT), HEK293 세포(293), E1유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터로 형질감염시킨 HT1080 세포(HT-E1) 및 genomic DNA형태인 플라스미드(gE1)에서 E1 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 6은 레트로 바이러스 벡터에 의해 형질전환된 세포주에서 E1A 및 E1B 유전자가 도입되었음을 확인한 결과이다.
도 7은 L132 세포에 E1 유전자를 포함하는 레트로바이러스로 형질감염 시킨경우 아데노바이러스의 생산역가를 측정한 결과이다.
도 8은 L132 세포에 E1 유전자를 포함하는 레트로바이러스로 형질감염 시킨 후, 추가적으로 E1A 유전자를 포함하는 레트로바이러스로 형질감염 시킨 경우 아데노바이러스의 생산 역가를 측정한 결과이다.
도 9는 L132 세포에 E1 레트로바이러스로 형질감염 시킨 경우 및 E1 유전자를 포함하는 레트로바이러스로 형질감염 시킨 후, 추가적으로 E1A 유전자를 포함하는 레트로바이러스로 형질감염 시킨 경우 아데노바이러스의 생산 역가를 비교한 결과이다.
도 10은 L132 세포에 E1 레트로바이러스로 형질감염 시킨 후, 추가적으로 E1A 레트로바이러스를 형질감염 시킨 아데노바이러스 생산 세포주의 E1 유전자 및 E1A 유전자의 도입 여부를 확인한 결과이다.
도 11은 L132 세포에 E1 레트로바이러스로 형질감염 시킨 후, 추가적으로 E1A 레트로바이러스를 형질감염 시킨 아데노바이러스 생산 세포주의 RCA 테스트를 확인한 결과이다.
도 12는 L132 세포에 E1 레트로바이러스로 형질감염 시킨 후, 추가적으로 E1A 레트로바이러스를 형질감염 시킨 아데노바이러스 생산 세포주의 아데노바이러스 생산 역가를 확인한 결과이다.
본 발명에서 대표적으로 사용되는 용어에 대한 정의는 다음과 같다.
본 발명에 사용된 용어 "E1 단백질"이란 바이러스의 엔벨로프 단백질(표피단백질)중 일부를 말하는 것으로 본 발명에서 아데노바이러스 E1 단백질은 아데노바이러스의 복제능을 가진다.
본 발명에 사용된 용어 "비복제능" 및 "비복제"란 바이러스의 증식 능력이 결여된 것을 의미한다. 본 발명에서는 아데노바이러스의 경우 E1유전자의 일부 또는 전부의 결실을 통해 아데노바이러스의 복제능력을 결여시킨다.
본 발명에 사용된 용어 "세포주"란 세포배양을 통해 계속 분열, 증식하여 대를 이을 수 있는 배양세포의 클론으로 계대배양을 하여도 그 유전적 형질이 유지되는 일련의 세포계통을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "프로모터" 전사 개시 및 속도가 조절되는 핵산 서열 영역인 조절 서열이다. 이들 프로모터는, RNA 폴리머라제 및 기타 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합하여 핵산 서열의 특이적인 전사를 개시할 수 있는 유전자 요소를 함유할 수 있다. '유효하게 배치된', '유효하게 결합된', '조절 하에' 및 '전사 조절 하에'란 용어는, 프로모터가 서열의 전사 개시 및 발현을 조절하는 핵산 서열과 관련하여 올바른 작용 위치 및/또는 배향으로 배치됨을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된다(operably linked)"는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 또한, 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "벡터"란 유전 물질을 다른 세포로 이동시키는 DNA을 말한다. 벡터를 만들기 위해서는 원하는 DNA를 다른 DNA와 결합하는 과정을 거쳐야 하며 그 결과 형성된 DNA를 재조합 DNA(recombinant DNA)라고 한다.
본 발명에 사용된 용어 "재조합"이란 임의의 생물의 DNA 조각을 다른 DNA 분자에 결합시키는 과정을 의미하는 것으로 본 발명에서 재조합 벡터 또는 재조합 바이러스로 사용될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "상동 재조합"이란 상동인 2개의 DNA사슬 사이에 연결교환이 이루어지는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "도입"이란 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 "핵산"이란 퓨린염기 및 피리미딘 염기 당 인산으로 이루어진 고분자물질로 뉴클레오티드란 단위 물질이 연결된 고분자 유기물을 의미한다. 5탄당은 탄소원자가 5개 있는 탄수화물의 일종으로 줄여서 당이라고 이야기한다. 이 당은 리보오스와 디옥시리 보오스로 구별된다. 염기는 5 종류가 있는데 아데닌(adenine A), 구아닌(guanine G), 티민(thymine T), 시토신(cytosine C), 우라실(uracil U)이 있다.
본 발명에 사용된 용어 "바이러스 생산용 패키징 시스템"이란 바이러스를 생산하기 위한 시스템으로 본 발명에서는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스를 생산할 수 있다. 바이러스 생산용 패키징 시스템은 바이러스 생산에 필요한 핵산 분자 및 단백질을 포함한다.
'치료'는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. '치료'는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 '완화(Palliating)'하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
'약'이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "함유하다" 및 "포함하다"란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 아데노바이러스 E1 단백질; 및 E1A 또는 E1B 중 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 추가적으로 발현하는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 비복제 아데노바이러스 생산 세포주를 제조하는 방법; 및 상기 세포주의 용도를 제공한다.
I. 세포주(cell line)
본 발명의 일 태양은 바이러스 생산능을 가진 세포주이다.
"바이러스 생산능"은 질환의 치료, 예방 등의 목적 하에 인위적으로 특정 인자(예를 들면, 유전자, 단백질 등)를 조작(예를 들면, 결실)하여, 특정 기능(예를 들면, 복제, 전사, 번역 등)이 발생되지 않도록 하여 바이러스의 생산능력이 증가, 향상, 개선된 상태를 의미한다.
상기 특정 인자는 바이러스의 자가 복제와 관련된 유전자일 수 있다.
상기 특정 기능은 바이러스의 자가 복제기능일 수 있다.
상기 바이러스는 자신이 가지고 있는 유전자를 다른 숙주로 운반하여 복제 및 증식이 가능한 특성을 가지고 있다. 이러한 바이러스의 특성을 이용하여 병원성을 제거하고 치료 가능한 유전자를 운반 해주는 벡터(vector)의 역할을 할 수 있다.
상기 세포주는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노바이러스 관련 바이러스(AAV; adeno-associated virus), 렌티바이러스(lentivirus), 헤르페스 바이러스(HSV; herpes simplex virus) 등에서 선택되는 하나 이상 또는 그들 조합의 바이러스 생산능을 가진 세포주이나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 세포주는 정상세포, 암세포, 줄기세포, 면역세포 등을 포함할 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 바람직하게는 상기 세포주는 정상세포일 수 있다.
상기 세포주의 유래는 인간 유래, 마우스 유래, 돼지 유래, 원숭이 유래, 양 유래, 식물 유래 등을 포함할 수 있으나 이제 한정하지는 않는다. 바람직하게는 상기 세포주의 유래는 인간 유래 세포주일 수 있다.
상기 세포주는 i) 엔벨롭(envelope) 유전자 1 이상을 포함한 제1세포주(first cell line); 및 ii) 상기 제1세포주로부터 수득한 결과물로 형질감염된 제2세포주(second cell line)일 수 있다. 상기 제2세포주는 엔벨롭 유전자를 2 이상 포함한다. 바람직하게는 엔벨롭 유전자 및 엔벨롭 유전자 아형을 모두 포함한다.
상기 제1세포주로부터 수득한 결과물은 엔벨롭(envelope) 유전자 1개 이상 발현하는 바이러스일 수 있다.
상기 엔벨롭 유전자는 E1, E2, E3, E4 유전자 등에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 보다 구체적으로, 상기 엔벨롭 유전자는 E1 유전자일 수 있다. 바람직하게는 상기 엔벨롭 유전자는 아데노 바이러스의 E1 유전자일 수 있다.
상기 아데노바이러스의 E1, E2 및 E4 유전자 일부는 이 바이러스 증식에 필수적이고 E3유전자는 이 바이러스 증식에 필수적이 아닌 숙주세포의 면역 체계를 피하는 단백질 정보를 갖고 있다.
상기 엔벨롭 유전자는 엔벨롭 유전자 아형도 포함할 수 있다.
상기 엔벨롭 유전자 아형은 E1A, E1B, E2A, E2B, E3A, E3B, E4A, E4B 등에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 엔벨롭 유전자 아형은 E1A 및 E1B 일 수 있다. 바람직하게는 상기 엔벨롭 유전자 아형은 아데노바이러스의 E1A 및 E1B 일 수 있다.
상기 E1B 유전자는 E1B 19K를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(E1B19K)과 E1B 55K를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(E1B55K)을 포함하며, 세포고사(apoptosis) 신호 기전을 억제한다.
이하에서는 기재하는 엔벨롭 유전자는 엔벨롭 유전자 아형도 포함하는 의미로 해석하는 것으로 한다.
상기 제1세포주는 상기 엔벨롭 유전자 E1, E2, E3, E4, E1A, E1B, E2A, E2B, E3A, E3B, E4A, E4B 등에서 선택되는 하나 이상 또는 그들의 조합을 포함할 수 있으나 이에 한정하지는 않는다.
일 실시예로 예를 들어, 상기 제1세포주는 상기 엔벨롭 유전자 E1, E1A, 및 E1B에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함할 수 있다.
일 실시예로 상기 제1세포주는 E1, E1A, E1B 을 각각 독립적으로 포함한 세포주일 수 있다.
일 실시예로 상기 제1세포주는 E1 및; E1A 또는 E1B를 포함할 수 있다.
일 실시예로 상기 제1세포주는 E1, E1A 및 E1B를 포함할 수 있다.
상기 제1세포주에서 수득한 결과물은 상기 엔벨롭 유전자를 벡터에 삽입하여 바이러스 형태로 수득한 결과물일 수 있다. 이 때, 상기 벡터는 비바이러스형 벡터 또는 바이러스형 벡터를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 벡터는 바이러스형 벡터이며, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
일 실시예로, 상기 제1세포주는 E1, E1A 및 E1B 유전자를 각각 레트로바이러스 벡터에 삽입하여 상기 제1세포주에서 수득한 결과물로 E1, E1A 및 E1B 유전자를 각각을 포함한 레트로바이러스를 각각 수득할 수 있다.
일 실시예로, 상기 제1세포주는 E1 및 E1A 또는/및 E1B 유전자를 레트로바이러스 벡터에 삽입하여 상기 제1세포주에서 수득한 결과물로 E1 및 E1A 또는/및 E1B 유전자를 포함한 레트로바이러스를 수득할 수 있다.
상기 레트로바이러스 벡터는 복제능이 없는 비복제 재조합 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
일 실시예로, 상기 레트로바이러스 벡터는 유전자 전달 벡터로 외래 유전자를 포함할 수 있다.
상기 외래 유전자는 특별하게 한정은 없으나 목적 세포에서 발현을 원하는 임의의 유전자, 예를 들면 폴리펩티드(효소, 성장인자, 사이토카인, 리셉터, 구조 단백질 등), 안티센스 RNA, 리보자임, 디코이, RNA간섭을 일으키는 RNA 등을 코딩하는 핵산이 예시된다.
또한, 상기의 외래 유전자의 발현의 제어를 위해서 프로모터, 인핸서, 터미네이터나 기타의 전사 조절요소가 상기의 핵산에 삽입될 수도 있다. 또한, 유전자 도입된 세포의 선택을 가능하게 하는 적당한 마커 유전자(예를 들면 약제 내성 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자, β-갈락토시다아제나 르시페라제와 같은 리포터로서 기능할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자 등)을 가질 수도 있다.
상기 약제 내성 유전자의 경우, 항생제 내성 유전자일 수 있다. 본 발명의 일 예로 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자일 수 있으며 이에 한정하지 않는다.
일 구체예로 상기 프로모터는 MLV(Murine Leukemia Virus) LTR(Long terminal repeat) 프로모터, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, 아데노바이러스 초기 프로모터(early promoter), 아데노바이러스 후기 프로모터 (late promoter), 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV (Rous sarcoma virus) 프로모터, EF1 알파 프로모터(Elongation factor-1 alpha), 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 인터페론 유전자의 프로모터, 인간 인터루킨-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터,인간 과립구대식세포 집락자극인자 (GM-CSF) 유전자의 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK) 프로모터 또는 마우스 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK) 프로모터일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일 구체예로 상기 프로모터는 EF1α(Elongation factor-1 alpha)프로모터일 수 있다.
본 발명에 사용되는 재조합 레트로바이러스 벡터(재조합 레트로바이러스 벡터, 본 명세서에서는 재조합 레트로바이러스라고 기재하는 경우가 있다)는 공지된 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
예를 들면, MFG 벡터나 α-SGC 벡터(국제공개 제92/07943호 팸플릿), pBabe[Nucleic Acids Research, 제18권, 제3587～3596쪽 (1990)], pLXIN(클론테크사 제), pDON-AI(다카라바이오사 제)등 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터[인간 면역부전바이러스(HIV) 유래 벡터, 원숭이 면역부전 바이러스(SIV) 유래 벡터 등], pBApo-EF1αNeo DNA (TaKaRa Code 3243) 또는 pBApo-EF1αPur DNA (TaKaRa Code 3244)벡터 혹은 이것들을 변형한 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 레트로바이러스 벡터는 MLV-유래 벡터로서 gag, pol 및 env 유전자가 제거된 형태일 수 있다.
일 실시예에서, 아데노바이러스의 E1, E1A, E1B 단백질을 암호화하는 핵산서열 각각을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제작할 수 있다.
일 실시예에서, 레트로바이러스 벡터는 EF1α(Elongation factor-1 alpha)프로모터를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 레트로바이러스 벡터는 LTR 서열을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 레트로바이러스 벡터는 IRES neo 서열을 더 포함할 수 있다.
상기 바이러스 형태로의 수득은 상기 벡터를 패키징 플라스미드(packaging plasmid)와 바이러스 생산 세포주에 형질감염되면 벡터의 유전자를 포장화(packaging)하여 바이러스를 수득할 수 있다.
상기 벡터를 바이러스 생산 세포주로의 형질감염은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있다.
일 구체예로, 미세주입법; 칼슘포스페이트 침전법; 전기천공법; 리포좀-매개 형질감염법; DEAE-덱스트란 처리법; 및 유전자 밤바드먼트 방법에 의해 벡터를 세포 내로 이입시킬 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
상기 패키징 플라스미드(packaging plasmid)는 대부분의 역전사와 통합에 필요한 시스-작용 서열(cis-acting sequence)이 결여되고 gag, pol, env의 바이러스 단백질만을 발현하도록 되어 있다.
본 발명의 일 구체예로, 레트로바이러스 벡터에 의해 형질전환 되는 레트로바이러스 패키징 세포주는 다양한 세포를 포함한다.
상기의 레트로바이러스 패키징 세포주는 공지의 패키징 세포주, 예를 들면 PG13(ATCC CRL-10686), PA317(ATCC CRL-9078), GP+E-86이나 GP+envAm-12(미국특허 제5, 278, 056호), Psi-Crip[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.85, pp.6460-6464 (1988)] 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예로, 293세포나 293T 세포에 레트로바이러스 입자생산에 필요한 유전자가 탑재된 패키징 플라스미드(레트로바이러스 패키징 키트:등록특허 10-1362111 TAKARA BIO INC. 등)를 도입해서 레트로바이러스 생산세포를 제작할 수도 있다.
본 발명의 일 구체예로, 레트로바이러스 패키징 세포주는 인간유래 세포일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예로서 L132 세포일 수 있다.
상기 제1세포주는 상기 엔벨롭 유전자를 발현하는 바이러스를 생산할 수 있다. 바람직하게는 레트로바이러스일 수 있다.
상기 레트로바이러스는 아데노바이러스의 E1 유전자를 안정하게 삽입할 수 있으며, 역가도 뛰어나기 때문에 아데노바이러스 생산 세포주를 형질 감염시키는데 유리한 특징이 있다.
본 발명은 상기 제조된 재조합 레트로바이러스를 이용하여 세포주를 형질전환시켜 아데노바이러스 E1유전자를 발현하는 세포주를 수득한다.
상기 제2세포주는 상기 제1세포주에 의해 생산된 바이러스도 감염된 세포주일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 제2세포주는 상기 제1세포주를 아데노바이러스 생산 세포주에 형질감염 시킨 후 아데노바이러스 벡터로 형질감염시킨 세포주일 수 있다. 이 때, 상기 제2세포주는 엔벨롭 유전자를 2 이상 포함할 수 있다.
이하에서 상기 제2세포주가 포함할 수 있는 엔벨롭 유전자의 형태를 예시로 설명하나, 이에 한정하지는 않는다.
일 실시예로 상기 제1세포주가 E1, E1A, E1B 을 각각 독립적으로 포함한 경우, 상기 제2세포주는 아데노바이러스 생산세포주에 제1세포주에서 수득한 바이러스 중 2 이상을 각각 동시에 또는 순차적으로 형질감염시킨 세포주일 수 있다.
일 실시예로, 상기 E1 제1세포주 생성물 및 E1A 제1세포주 생성물로 감염시킨 제2세포주일 수 있다. 또한, 상기 E1 제1세포주 생성물 및 E1B 제1세포주 생성물로 감염시킨 제2세포주일 수 있다. 또한, E1 제1세포주 생성물, E1A 제1세포주 생성물 및 E1B 제1세포주 생성물로 형질감염 시킨 세포주일 수 있다.
일 실시예로, 상기 E1 제1세포주 생성물을 먼저 형질감염한 뒤, E1A 제1세포주 생성물로 감염시킨 제2세포주일 수 있다. 또한, 상기 E1 제1세포주 생성물을 먼저 형질감염한 뒤, E1B 제1세포주 생성물로 감염시킨 제2세포주일 수 있다. 또한, E1 제1세포주를 먼저 형질감염한 뒤, E1A 제1세포주 및 E1B 제1세포주를 형질감염 시킨 세포주일 수 있다.
즉, 상기 제2세포주는 제1세포주의 생성물을 목적하는 순서 또는 조합으로 형질감염 시킨 세포주일 수 있다. 바람직하게는 상기 E1 제1세포주 생성물을 먼저 형질감염한 뒤, E1A 또는 E1B 제1세포주 생성물로 감염시킨 제2세포주일 수 있다
본 발명의 일 실시예로, 상기 제2세포주는 E1 레트로바이러스를 아데노바이러스 생산 세포주에 형질감염시킨 세포주이다.
본 발명의 또 다른 실시예로, 상기 제2세포주는 E1 레트로바이러스를 아데노바이러스 생산 세포주에 형질감염시킨 뒤, E1A 레트로바이러스를 추가적으로 형질감염시킨 세포주이다.
상기 형질감염은 앞서 설명한 바와 동일하다.
상기 제2세포주는 아데노바이러스 벡터를 더 포함한다.
상기 아데노바이러스 벡터는 외래 유전자의 발현의 제어를 위한 인핸서, 터미네이터나 기타의 전사 조절요소를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예로, 상기 아데노바이러스 벡터는 마커 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 마커 유전자는 약제 내성 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자, β-갈락토시다아제나 르시페라제와 같은 리포터로서 기능할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자 등일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스의 E1 단백질을 발현하는 세포주를 형질감염 할 수 있다. 아데노바이러스 벡터의 도입 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 미세주입법; 칼슘포스페이트 침전법; 전기천공법; 리포좀-매개 형질감염법; DEAE-덱스트란 처리법; 및 유전자 밤바드먼트 방법에 의해 벡터를 세포 내로 이입시킬 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 아데노 바이러스는 배지로 배출될 수 있다.
따라서, 본 발명의 비복제 아데노바이러스는 상기의 배지를 수집하고 농축하는 과정을 통하여 수득할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 배지의 수집 및 농축을 통해 수득한 아데노바이러스는 임상적용을 위해 정제과정을 추가적으로 거칠 수 있고 공지의 방법에 의할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 아데노 바이러스의 정제는 분별 원심분리법, 밀도구배 원심분리법, 컬럼크로마토그래피, 익스팬디드 크로마토그래피, 바이러스 침전법, 오염물 변성법 및 효소를 이용한 세포성분 파괴법 등을 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 제1세포주와 상기 제2세포주는 서로 다른 바이러스 생산능을 가진 세포주이며, 구체적으로는 상기 제1세포주는 레트로바이러스 생산능 세포주일 수 있고, 상기 제2세포주는 아데노바이러스 생산능 세포주일 수 있다.
상기 레트로바이러스는 RNA 바이러스로 치료유전자를 안정하게 삽입하기에 가장 유용한 벡터로 여겨지고 있다. 그러나 레트로바이러스는 분열하는 세포에만 삽입되고 분열이 이루어지지 않는 세포에는 치료유전자 이입이 불가능하다. 또한, 복제가능성이 잔존하는 RCR(repilication competent retrovirus)이 나타나는 문제점과 혈청 보체(serum complement)가 레트로바이러스를 불활성화 시킬 수 있다는 단점이 있다.
상기 아데노바이러스는 이중가닥 DNA 형태로 분열세포와 비분열세포 모두에서 높은 발현율을 나타낸다. 또한 안정성이 높고 역가(titer)가 높은 재조합 바이러스를 생산할 수 있다. 하지만 아데노바이러스는 조류부터 사람에 이르기까지 다양한 생물로부터 분리될 수 있고, 이들의 구조적, 생화학적, 면역학적 특성에 따라 6종류의 아속(subgene)으로 구분된다. 현재까지 유전자 치료에 사용되는 아데노바이러스 벡터는 Ad2와 Ad5가 광범위하게 사용된다. 하지만 자가 복제가 가능한 RCA(replication competent adenovirus)가 존재한다면 면역 결핍 환자의 경우 심각한 부작용을 초래할 수 있기 때문에 RCA 생성을 최소화 할 수 있도록 하여 유전자 전달 벡터로 사용해야만 한다.
상기 아데노바이러스는 타입 5는 바이러스 복제에 필수적인 복제기점(replication origin)이 있으며 E1, E2, E3, E4유전자와 바이러스의 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자들을 가지고 있다.
상기 엔벨롭 유전자 및 엔벨롭 유전자 아형은 아데노바이러스(RCA; replication competent adenovirus)와 관련된 유전자들이다.
상기 RCA는 상기 제1세포주 및 상기 제2세포주가 유전자 치료의 전달도구로서 적용이 될 때, 상기 제1세포주 및 상기 제2세포주에 포함되어 있는 바이러스 벡터가 자가복제 되는 현상을 의미하는 것으로, 상기 RCA가 발생하면 면역반응이 결핍된 환자에게서는 부작용을 초래할 수 있다.
상기 세포주는 복제 가능 아데노바이러스(RCA; replication competent adenovirus)의 생산 가능성은 낮고, 아데노바이러스 생산능이 증가한 세포주일 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시예에 있어서, 상기 E1 및 E1A 또는/및 E1B 레트로바이러스를 아데노바이러스 세포주에 형질감염시킨, 아데노바이러스 생산능을 가진 세포주의 RCA 반응성 실험결과는 도 11에서 볼 수 있듯이 E1 밴드의 형성 여부로 통해 아데노바이러스 세포주의 RCA 반응성 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 비복제 아데노바이러스 생산세포주에 의해 생산된 아데노바이러스는 E1 영역이 존재하지 않을 수 있으며, 이로 인해 복제능을 가지고 있지 않아 유전자 치료제 등으로 이용시 아데노바이러스의 복제능으로 인한 면역반응을 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 비복제 아데노바이러스 생산 세포주는 아데노 바이러스 생산벡터와 동일한 시퀀스를 가지고 있지 않으므로 RCA(replication competent adenovirus)가 생성되지 않는 특징을 가지고 있어 유전자치료 등에 사용할 수 있는 아데노바이러스를 생산할 수 있다.
본 발명에 의한 세포주는 아데노바이러스의 생산성이 증대된 비복제아데노바이러스 생산 세포주이다.
상기 세포주는 아데노바이러스를 생산하는 세포주일 수 있다. 바람직하게는 아데노바이러스 E1 유전자를 생산하는 세포주일 수 있다.
상기 E1유전자를 생산하는 세포주는 세포 생존도(cell viability)를 측정하여 선별할 수 있다.
아데노바이러스 E1유전자를 발현하는 세포는 다양한 세포일 수 있다. 본 발명의 일 구체예로 A549 (Carcinomic Human Alveolar Basal Epithelial Cell), HER (Human Embryonic Retinoblast), HeLa (Human Cervical Cancer Cell), CHO (Chinese Hamster Ovary Cell), BHK (Baby Hamster Kidney Cell), 3T3 (Mouse Embryonic Fibroblast Cell), 미엘로마, PC12 (Rat Pheochromocytoma Cell), 인간 양막 세포 (Human Amniocyte), WS1 (Human Dermal Fibroblast), MRC5 (Human Lung Fibroblast) 또는 WI38 (Human Lung Fibroblast Cell), L132(human lung cells)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 있어서, 상기 L132 세포주에 E1 유전자를 도입한 아데노바이러스 생산능을 가진 세포주일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체적인 일 실시예에 있어서, 상기 L132 세포주에 E1 유전자를 도입하여 안정성을 높인 뒤, E1A 또는/및 E1B 유전자를 도입한 아데노바이러스 생산능을 가진 세포주일 수 있다.
따라서, 본 발명의 세포주는 아데노바이러스 E1 유전자를 안정성 높게 제공하여 E1이 결실된 아데노바이러스를 교차보완할 수 있어, 효율성 높은 아데노바이러스를 생산할 수 있는 세포주를 제공할 수 있다.
II. 세포주 생산 방법
본 발명의 또 다른 태양은 세포주를 생산하는 방법이다.
상기 세포주를 생산하는 방법의 일 구체예로서, 제1세포주를 수득하는 제1단계 및 제2세포주를 제조하는 제2단계를 포함할 수 있다.
상기 세포주를 생산하는 방법은 상기 제1세포주에서 수득한 결과물을 형질감염 시켜 상기 제2세포주로 만드는 방법이다.
이하 각 단계에 대하여 설명한다.
제1단계는 제1세포주를 수득하는 단계이다.
엔벨롭 유전자 1 이상을 포함한 제1세포주를 수득하기 위해, 상기 제1단계는 상기 엔벨롭 유전자를 삽입하는 단계; 제2세포주 생성을 위한 중간물질을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 엔벨롭 유전자를 삽입하는 단계는 상기 엔벨롭 유전자를 발현하게 하는 발현 구조체(벡터)에 유전자 서열을 삽입하는 단계이다. 상기 발현 구조체는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 바람직하게 상기 발현 구조체는 레트로바이러스 벡터일 수 있다.
상기 레트로바이러스 벡터에 대한 설명은 앞서 설명한 바와 동일하다.
상기 엔벨롭 유전자가 발현 구조체에 삽입된 형태는 하기의 예시로 설명하나, 이에 한정하지 않는다.
일 구체예로, 상기 E1, E1A, E1B 중 2개 유전자들을 삽입하여 E1 및 E1A을 포함하는 레트로바이러스 벡터, E1 및 E1B을 포함하는 레트로바이러스 벡터, E1A 및 E1B을 포함하는 레트로바이러스, E1, E1A 및 E1B을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 만들 수 있다.
일 구체예로, 상기 E1, E1A, E1B 중 3개 유전자들을 삽입하여 E1, E1A 및 E1B을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 만들 수 있다.
상기 2개 또는 3개 유전자들을 삽입할 때의 삽입순서는 목적에 따라 바뀔 수 있다.
바람직하게는 상기 E1, E1A, E1B 유전자 각각을 삽입하여 E1 레트로바이러스 벡터, E1A 레트로바이러스 벡터, E1B 레트로바이러스 벡터를 각각 만들 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시예에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터에 E1 유전자의 삽입여부는 도 10에서 볼 수 있듯이 PCR을 통해 벡터 내로의 유전자 삽입여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시예에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터에 E1A 또는 E1B 유전자의 삽입여부는 도 6 및 도 10에서 볼 수 있듯이 PCR을 통해 벡터 내로 유전자의 삽입여부를 확인할 수 있다.
중간물질을 생산하는 단계는 엔벨롭 유전자가 삽입된 상기 벡터를 적절한 세포에 도입하여 바이러스 형태로 수득하는 단계이다. 보다 구체적으로, 엔벨롭 유전자가 삽입된 상기 레트로바이러스 벡터를 패키징 플라스미드와 함께 레트로바이러스 생산 패키징 세포주에 형질감염시켜 레트로바이러스를 수확한다.
상기 레트로바이러스 벡터가 패키징 플라스미드와 레트로바이러스 생산 세포주에 형질감염되면 레트로바이러스 벡터의 유전자를 패키징하여 레트로바이러스를 생산할 수 있다. 상기 형질감염 방법은 앞서 설명한 바와 동일하다.
상기 레트로바이러스 벡터를 패키징 플라스미드와 레트로바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 레트로바이러스 생산이 발생하도록 허용되는 조건하에서 배양을 한다. 형질감염된 세포가 군락을 형성할 때까지 일정시간 배양을 하여 세포주 클론을 선별한다. 클론의 선별은 레트로바이러스가 도입된 세포주를 배양하여 배지 내 선별물질(예를 들어, 항생제)를 첨가한 후 저항성이 있는 세포들을 모아 선별하거나 각각의 클론으로 선별하는 방법 등 당업계에 알려진 방법 모두를 이용할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 레트로바이러스는 레트로바이러스 벡터와 gag-pol, 그리고 엔벨로프(envelope)발현 플라스미드를 한꺼번에 세포에 형질도입하여 일정 시간 이후 세포의 상층액만을 농축 및 정제하여 레트로바이러스를 생산할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시예에 있어서, 상기 레트로바이러스는 아데노바이러스의 E1 유전자를 안정하게 삽입할 수 있으며, 역가도 뛰어나기 때문에 아데노바이러스 생산 세포주를 형질 감염시키는데 유리한 특징이 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 레트로바이러스는 유전자치료에 사용되는 비복제 아데노바이러스를 생산하기 위한 E1 단백질을 발현하는 생산 세포주를 제조하기 위해 상기 아데노바이러스의 E1 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스를 제조한다.
상기 생산된 레트로바이러스는 아데노바이러스 생산 세포주에 감염 시키면 레트로바이러스 벡터의 구조만이 세포주의 염색체 내로 삽입되어 외래 유전자인 아데노바이러스 E1 단백질의 발현을 유도할 수 있다.
제2단계는 제2세포주를 수득하는 단계이다.
엔벨롭 유전자 2 이상을 포함한 제2세포주를 수득하기 위해, 상기 제2단계는 상기 제1단계의 결과물을 적절한 세포에 형질감염시켜 수득할 수 있다.
상기 제2세포주는 앞서 설명한 바와 같이, 엔벨롭 유전자 2 이상을 포함한 세포주이다. 일 구체예에서는 엔벨롭 유전자 1개 및 엔벨롭 아형 유전자 1개 이상을 포함한 아데노바이러스 생산 세포주이다.
상기 제2단계는 상기 제1세포주에서 생산한 레트로바이러스를 아데노바이러스 생산 세포에 형질감염 시킨 후 아데노바이러스 벡터로 형질감염시키는 단계를 포함한다.
상기 형질감염 방법은 앞서 설명한 바와 동일하다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2세포주는 E1, E1A, E1B 중 선택되는 1개의 유전자의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스를 만드는 단계; 상기 제작된 각각의 레트로바이러스 벡터를 레트로바이러스로 수득하는 단계; 레트로바이러스를 아데노바이러스 생산용 세포주에 형질감염시키는 단계;로 만들어질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2세포주는 E1, E1A 및 E1B 유전자의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 각각 만드는 단계; 상기 제작된 각각의 레트로바이러스 벡터를 각각의 레트로바이러스로 수득하는 단계; E1 레트로바이러스, E1A 레트로바이러스 및 E1B 레트로바이러스를 아데노바이러스 생산용 세포주에 형질감염시키는 단계;로 만들어질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2세포주는 E1, E1A 및 E1B 유전자의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 각각 만드는 단계; 상기 제작된 각각의 레트로바이러스 벡터를 각각의 레트로바이러스로 수득하는 단계; E1 레트로바이러스, E1A 레트로바이러스 및 E1B 레트로바이러스를 아데노바이러스 생산용 세포주에 형질감염시키는 단계;로 만들어질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2세포주는 E1, E1A, E1B 유전자 중 2개의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 만드는 단계; 상기 제작된 각각의 레트로바이러스 벡터를 레트로바이러스로 수득하는 단계; 레트로바이러스를 아데노바이러스 생산용 세포주에 형질감염시키는 단계; 및 상기 2개의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스를 아데노바이러스 생산용 세포주에 형질감염시킨 세포주에 나머지 1개의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스를 추가적으로 감염시키는 단계;로 만들어질 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2세포주는 E1, E1A 및 E1B 유전자의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 각각 만드는 단계; 상기 제작된 각각의 레트로바이러스 벡터를 각각의 레트로바이러스로 수득하는 단계; E1 레트로바이러스를 아데노바이러스 생산용 세포주에 형질감염시키는 단계; 및 상기 E1 레트로바이러스를 아데노바이러스 생산용 세포주에 형질감염시킨 세포주에 E1A 및/또는 E1B 레트로바이러스를 추가적으로 감염시키는 단계;로 만들어질 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 아데노바이러스 생산 세포주는 아데노바이러스 E1 유전자를 생산하는 세포주의 역가(titer)를 측정하여 상기 세포주가 아데노바이러스를 얼마나 생산할 수 있는지의 효율을 도 7, 도 8, 도 9 및 도 12에서 볼 수 있듯이 Real-time PCR을 통해 상기 세포주의 아데노바이러스 생산 효율을 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 E1 레트로바이러스로 형질감염 시킨 뒤 E1A 또는/및 E1B 레트로바이러스로 형질감염시킨 아데노바이러스 생산 세포주는 E1 레트로바이러스로 형질감염시킨 아데노바이러스 생산 세포주보다 아데노바이러스 생산량이 더 높은 것을 도 7, 도 8 및 도 9를 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 E1 레트로바이러스로 형질감염 시킨 뒤 E1A 또는/및 E1B 레트로바이러스로 형질감염시킨 아데노바이러스 생산 세포주는 RCA 반응이 없는 것을 도 11을 통해 확인할 수 있다.
상기에서 서술한 세포주 생산 방법을 이용하면, 비복제능을 가진 아데노바이러스를 생산할 수 있는 세포주를 만들 수 있다. 이 때, 상기 비복제능을 가진 아데노바이러스를 생산할 수 있는 세포주는 인간세포 유래의 세포주일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 바람직하게는, 인간세포 유래의 세포주는 L132 세포주일 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 비복제 아데노바이러스는 상기의 배지를 수집하고 농축하는 과정을 통하여 수득할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 배지의 수집 및 농축을 통해 수득한 아데노바이러스는 임상적용을 위해 정제과정을 추가적으로 거칠 수 있고 공지의 방법에 의할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 아데노 바이러스의 정제는 분별 원심분리법, 밀도구배 원심분리법, 컬럼크로마토그래피, 익스팬디드 크로마토그래피, 바이러스 침전법, 오염물 변성법 및 효소를 이용한 세포성분 파괴법 등을 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 생산세포주에 의해 생산되는 아데노바이러스는 비복제능을 가지고 있다. 본 발명의 세포주에 의해 수득된 아데노바이러스의 비복제능은 본 발명의 세포주의 배양 상등액에 존재하는 아데노바이러스의 지놈을 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭하여 E1 영역이 있는지 여부의 분석에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 비복제 아데노바이러스 생산세포주에 의해 생산된 아데노바이러스는 E1 영역이 존재하지 않을 수 있으며, 이로 인해 복제능을 가지고 있지 않아 유전자 치료제 등으로 이용시 아데노바이러스의 복제능으로 인한 면역반응을 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 비복제 아데노바이러스 생산 세포주는 아데노 바이러스 생산벡터와 동일한 시퀀스를 가지고 있지 않으므로 RCA(replication competent adenovirus)가 생성되지 않는 특징을 가지고 있어 유전자치료 등에 사용할 수 있는 아데노바이러스를 생산할 수 있다.
본 발명의 방법에 의한 세포주는 아데노바이러스의 생산성이 증가된 비복제아데노바이러스 생산 세포주이다.
III. 세포주의 용도
AAV 생산용 패키징 시스템
본 발명의 아데노바이러스 생산 세포주로부터 생산된 아데노바이러스는 아데노관련 바이러스를 생산하는 데에 이용할 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 관련 바이러스(AAV:adeno-associated virus)는 다양한 세포(근육, 뇌, 폐, 망막, 간, 귀, 샘장, 혈관 등)에 효율적 감염능력 및 대상세포의 염색체 내로 삽입됨으로써 치료 단백질이 장기간 안정적으로 발현된다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 비복제 아데노바이러스 생산 세포주에 의해 수득된 아데노바이러스; AAV(adeno-associated virus)의 rep 단백질을 암호화하는 핵산서열 및 AAV의 cap 단백질을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 세포주; 및 AAV 벡터를 포함하는 AAV 생산용 패키징 시스템을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 AAV(adeno-associated virus)의 rep 단백질을 암호화하는 핵산서열 및 AAV의 cap 단백질을 암호화하는 핵산서열은 공지의 방법에 의해 세포주로 도입될 수 있다.
이때, 상기 핵산서열을 아데노바이러스 관련 바이러스 생산 세포주에 도입하는 방법으로는 인간칼슘법, 리포펙션법, DEAE 덱스트란법, 폴리에틸렌이민법, 일렉트로포레이션법 등이 있을 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 핵산을 아데노바이러스 관련 바이러스 생산 세포주에 도입은 벡터 또는 플라스미드를 사용할 수 있으며, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스벡터, 아데노바이러스 벡터 등일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 AAV 벡터는 당업계의 공지의 방법에 의할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 미세주입법; 칼슘포스페이트 침전법; 전기천공법; 리포좀-매개 형질감염법; DEAE-덱스트란 처리법; 및 유전자 밤바드먼트 방법에 의해 벡터를 세포 내로 이입시킬 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
상기의 AAV 생산용 패키징 시스템을 통해 수득된 AAV는 효율적 감염능력 및 대상 세포내로 안정적으로 삽입되므로 유전자치료에 사용될 수 있다.
유전자치료제
상기 제조된 비복제 아데노바이러스 생산 세포주 및 비복제 아데노바이러스 생산용 패키징 시스템을 통해 제조된 아데노바이러스를 이용하여 유전자치료제를 제조할 수 있다.
본 발명의 유전자 치료(gene therapy)란 통상적인 방법으로는 치료가 곤란한 선천적 또는 후천적 유전자 이상을 유전공학적 방법으로 치료하는 방법을 의미한다.
본 발명의 일 구체예로, 유전자 치료로 선천적 또는 후천적 유전자 결함, 바이러스성 질병, 암 또는 심혈관계 질환 등과 같은 만성 질환의 치료와 예방을 위하여, DNA 및 RNA 등의 유전 물질을 인체 내에 투여하여 치료 단백질을 발현시키거나 특정 단백질의 발현을 억제하도록 하는 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 아데노바이러스는 유전자 치료에 필요한 타깃 유전자를 포함하여 타깃 유전자를 생체 내로 전달할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 아데노바이러스는 타깃 유전자를 환자에서 채취한 세포 내로 전달할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 아데노바이러스는 E1유전자 대신에 타깃 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 아데노바이러스는 E1유전자 대신에 타깃 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 비복제 아데노바이러스 생산세포주로부터 수득한 아데노바이러스를 유전자치료에 이용할 경우, 비복제능으로 인해 면역반응을 감소시킬 수 있으며 RCA의 위험이 없다는 장점이 있다.
항체 생산세포주
본 발명의 상기 비복제 아데노바이러스 생산 세포주는 항체를 생산하는 데에 이용할 수 있다.
세포주를 이용한 치료용 항체 생산에 있어 고생산성을 지닌 세포주의 선별은 중요한 단계 중 하나이다.
본 발명의 아데노바이러스 E1유전자는 불멸화 즉, 지속적 세포분열을 통해 고생산성이 부여될 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 E1A 유전자의 경우 영구적인 세포분열과 관련 있고 E1B 유전자는 세포사멸(apoptosis)를 억제하는 능력을 가지고 있어, 본 발명과 같이 E1 유전자를 발현시키도록 형질전환 한 후, 추가적으로 E1A 또는 E1B 유전자를 발현시키도록 형질전환을 통해 재조합 세포주를 제작함으로 인해 고생산성을 지닌 세포주를 얻을 수 있다.
본 발명에서 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 항체는 본 발명의 세포주에 의해 생산된 것으로 항원에 대해 특이적 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 세포주를 이용한 다클론 항체는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이때, 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 세포주를 이용한 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976)European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature,352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 세포주에 의해 생산된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
상기 생산된 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 의한 일 구체예로, 세포주는 항체 생산 세포주로 인간세포(human cell)를 이용할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일 구체예로, 항체 및 단백질 생산세포주로 CHO세포를 이용할 수 있다.
본 발명의 항체생산 세포주는 글리코실화의 형태적 차이가 없어 면역원성이 매우 낮은 특징이 있어 상기 세포주에 의해 생산된 항체는 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
백신생산
본 발명의 상기 아데노바이러스 생산 세포주는 백신 생산 세포주로 이용할 수 있다.
백신 생산 세포주 역시 상기 항체 생산 세포주와 같이 고생산성이 중요하다.
따라서, 본 발명과 같이 E1 유전자를 발현시키도록 형질전환 한 후, 추가적으로 E1A 또는 E1B 유전자를 발현시키도록 형질전환을 통해 재조합 세포주를 제작함으로 인해 고생산성을 지닌 세포주를 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 인플루엔자 백신생산의 경우 계란을 이용하거나 개과동물의(canine) 세포를 이용할 수 있다.
본 발명에 의해 생산된 백신은 제약상 허용되는 담체와 함께 적절하게 제제화될 수 있다. 따라서, 의약 또는 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있고, 비경구 투여용 용액 또는 동결건조된 분말로 제제화될 수 있다. 분말은 사용 전에 적합한 희석제 또는 다른 제약상 허용되는 담체를 첨가함으로써 재구성될 수 있다. 액체 제제는 완충액, 등장액, 수용액일 수 있다. 분말은 무수 형태로 분무될 수도 있다. 적합한 희석제의 예로는 보통 등장성 염수 용액, 물 중 표준 5％ 덱스트로스 용액, 또는 완충된 나트륨 또는 암모늄 아세테이트 용액이 있다. 상기 제제는 특히 비경구 투여에 적합하지만, 경구 투여용으로 사용될 수도, 또는 계량된 투여량 흡입기 또는 살포용 분무기에 함유될 수도 있다. 부형제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 히드록시 셀룰로스, 아카시아, 폴리에틸렌 글리콜, 만니톨, 나트륨클로라이드, 나트륨 시트레이트 등을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 세포주에 의해 생산된 백신은 경구 투여용으로 제조될 수 있다. 제약상 허용되는 고체 또는 액체 담체를 첨가하여 조성물을 개선 또는 안정화 할 수 있다. 고체 담체로는 전분, 락토스, 칼슘 술페이트 이수화물, 백토, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테아르산, 활석, 펙틴, 아카시아, 아가또는 젤라틴이 있다. 액체 담체로는 시럽, 땅콩기름, 올리브유, 염수 및 물이 있다. 또한, 담체는 지연 방출 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로, 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 고체 담체의 양은 달라지지만, 바람직하게는 투여량 단위 당 약 20 mg 내지 약 1 g일 것이다. 액체 담체를 사용하는 경우, 제제는 시럽, 엘릭서제, 에멀젼, 또는 수성 또는 비-수성 현탁액 형태일 수 있다.
본 발명의 세포주에 의해 생산된 백신은 의약상 유용한 약물 또는 생물 제제를 포함한 상태로 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명의 세포주에 의해 생산된 백신은 목적하는 질환 또는 증상에 유용한 다른 약물 또는 생물 제제의 투여와 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에 의한 세포주를 백신생산에 이용할 경우 낮은 면역원성을 가지므로 안전한 백신을 생산이 가능하다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1.E1, E1A, E1B 클로닝 및 레트로바이러스(retrovirus)제조
1-1. 레트로바이러스 벡터에 E1, E1A, E1B 유전자의 클로닝
아데노바이러스 타입 5(adenovirus type 5) E1 유전자 2962bp를 주형(template)으로 하여 E1A 998bp 와 E1B 1808bp를 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 약 1Kb의 E1A와 약1.8Kb의 E1B 밴드를 얻었다.
유전자를 pGEM-T easy vector에 클로닝 한 후 시퀸싱(sequencing)하여 E1A와 E1B의 염기서열을 확인하였다. (도 2, 서열번호 1 및 도 3, 서열번호 2)
도 4를 보면, 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 얻은 E1A를 확인할 수 있다.
여러 클론 중 염기서열이 확인된 클론에서 효소절단(enzyme digestion)을 통해 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)에 E1, E1A, E1B, pro-E1, pro-E1A, pro-E1B 각 유전자를 클로닝하였다.
1-2. 레트로바이러스 생산
유전자가 삽입된 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)를 표면단백질(envelop)을 발현하는 플라스미드와 함께 gag-pol 단백질을 발현하는 패키징세포주(puackaging cell)에 공형질전환(co-transfection)하고 3일 후에 상청액(supernatant)을 얻었다. 상청액을 원심분리기(centrifuge)를 통해 농축 및 정제하여 생산된 레트로바이러스 생산하였다.
1-3. 레트로바이러스 생산 확인
real-time PCR를 이용하여 역가(titer)를 측정하기 위해 기준(standard)은 벡터 플라스미드 DNA의 농도 및 크기를 고려하여 109에서 105까지 연속 희석(serial dilution)하여 사용하였다. 적정 MOI 평가를 위해 GFP를 발현하는 대조군바이러스(control virus)를 1, 10, 100 등으로 형질전환(transduction)하여 발현 정도를 형광현미경으로 평가하였다. 이를 통해 레트로바이러스의 생산을 확인할 수 있었다.
1-4. E1, E1A 및 E1B 유전자의 도입 확인
상기 실시예 1-1의 E1유전자의 발현여부를 평가하기 위해 RT-PCR을 이용하여 mRNA 발현을 확인하였다. E1 유전자 중 인트론을 포함하고 있어 PCR을 통해 mRNA와 gDNA형태의 구별이 가능한 E1A 유전자를 측정함으로써 E1유전자의 도입을 확인하였다.
E1 유전자를 레트로바이러스 벡터에 삽입하고 JetPEI (Polyplus, France)를 이용하여 HT1080 세포에 형질감염시킨 후 mRNA발현을 측정하기 위해 E1A에 특이적인 두 가지 다른 프라이머세트(E1A-1 및 E1A-2)를 이용하였다.
음성대조군으로 HT1080 세포(HT)를, 양성대조군으로 HEK293(293)를 사용하였고, 플라스미드 오염(contamination)을 배제하기 위해 genomic DNA형태인 플라스미드 gE1을 대조군으로 사용하여 PCR을 수행하였고 그 결과는 도 5에 도시하였다.
도 5를 보면, 음성대조군인 HT1080에 레트로바이러스 벡터를 형질감염시킨 경우(HT-E1) 293세포와 동일한 크기에서 밴드가 관찰된 것을 볼 수 있었다. 이로써 클로닝한 유전자에 의해 E1의 도입 및 발현됨을 알 수 있었다.
상기 실시예 1-1의 E1A 유전자와 E1B 유전자를 각각 클로닝 시킨 레트로바이러스 벡터를 레트로바이러스 생산 패키징 세포주에 형질전환 시킨 후, 세포를 배양하여 유전자를 얻었다. 배양시킨 세포의 콜로니에서 mini-prep 방법을 통해 DNA를 추출한 다음 제한효소를 통해 자른 후 전기영동을 하였다. 해당 사이즈를 측정하여 E1A 유전자와 E1B 유전자의 도입 여부를 확인할 수 있었다. (도 6)
도 6을 볼 때, E1A 유전자 또는 E1B 유전자가 레트로바이러스 벡터에 의해 레트로바이러스 생산세포 내로 도입되었음을 확인할 수 있었다.
실시예2. 아데노바이러스 생산 세포주 선정
10종 이상의 정상세포주를 ATCC (USA)에서 구매한 후 MTT assay 등을 통해 정상세포와의 증식능력을 평가하여 증식능력이 우수한 6종의 정상세포주를 선정하였다. 선정된 6종의 세포주에서 상기 실시예 1에서 제조한 E1 발현 레트로바이러스 2종을 각각 1차 형질전환 후 G418 (Sigma, USA)을 처리하여 E1 유전자가 삽입된 세포를 선별하였다.
선별된 세포의 mRNA를 분리하여 E1A, E1B19K, E1B55K 발현량을 HEK293 세포와 비교하였다. 각 세포주별로 발현량을 기준으로 E1, E1A, E1B를 발현하는 레트로바이러스를 각각 형질전환 및 선별하는 방법을 반복하였다.
이때 real-time PCR과 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 통해 E1A, E1B19K, E1B55K발현량을 비교하여 80%이상의 값을 나타내는 세포주를 선별하였다.
실시예3. 비복제 아데노바이러스 생산 세포주로부터 아데노바이러스 생산
상기 실시예 1의 방법을 통해 얻은 레트로바이러스를 L132 세포에 감염시킨 후 아데노바이러스 벡터로 형질감염시켜 비복제 아데노바이러스 생산세포주를 제조하였다. 상기 제작된 세포주에서 아데노바이러스의 생산을 확인하기 위해 생산한 아데노바이러스의 역가를 측정해 보았다.
L132 세포에 E1 레트로바이러스로만 감염시킨 경우; 및 본 발명의 방법과 같은 상기 세포에 E1 레트로바이러스 및 추가적으로 E1A 레트로바이러스로 감염시킨 경우로 나누어 실험결과를 비교하였고 그 결과는 도 7 내지 9에 도시하였다.
도 7 및 8을 보면, 6번 세포주(#6)에서 아데노바이러스 생산량이 추가적으로 E1A 레트로바이러스로 감염시킨 세포주에서 2.9배 더 높은 것을 볼 수 있었다.
또한, 11번 세포주(#11)에서는 3.8배 더 높은 아데노바이러스 생산량을 볼 수 있었다.
도 9는 상기 두 경우에서 아데노바이러스 생산량을 비교한 표로 역시, 추가적으로 E1A 레트로바이러스로 감염시킨 세포주에서 높은 효율의 아데노바이러스 역가를 보여 주었다.
따라서, 이 결과로 본 발명에 의해 레트로바이러스에 의해 추가적으로 E1A 유전자를 삽입함으로써 아데노바이러스 생산성을 높일 수 있음을 알 수 있다.
실시예4. 생산된 아데노바이러스의 RCA검사
RCA검사를 위해 세포주 당 1개씩 총 6개의 클론을 선별하여 5 계대(passage)이상의 아데노바이러스(adenovirus)를 계대수(passage)별로 생산하였다.
상기 실시예 1 내지 3과 같이 아데노바이러스 생산 세포주에 아데노바이러스 벡터로 감염 후, CPE(cytopathic effect)가 보이면 세포를 배양(harvest) 및 분해(sonication)하여 상층액(supernatant)을 얻었다. 이후 CsCl를 이용하여 원심분리기(ultracentrifuge)로 농축 및 정제하여 생산된 아데노 바이러스를 얻었다.
생산된 바이러스가 E1 유전자를 갖고 있는지 유무를 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 측정하였고, 이때, 양성대조군으로 HEK293 세포를 사용하였다. 상기 검사결과 본 발명의 아데노바이러스 생산세포주에서 생산된 아데노바이러스는 E1 유전자를 가지고 있지 않음을 확인하였다.
실시예5. 안정성 있는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주
5-1. GT541 세포주의 E1 및 E1A 유전자 분석
상기 실시예 1-1과 같이 레트로바이러스 벡터에 E1 및 E1A 유전자를 클로닝하였다. 레트로바이러스 벡터를 통해 유전자를 전달할 경우 레트로바이러스 벡터에 삽입된 유전자(E1)는 숙주 세포의 지놈 DNA 상에 삽입된다. 그래서 GT541(L132 세포에 E1을 도입한 세포를 명명)클론에 E1 및 E1A 유전자가 삽입되었는지 확인하기 위하여 cell gDNA를 추출(Qiagene Tissue kit)하여 해당하는 하기 프라이머들을 사용하여 PCR로 확인하였다. (표 1 및 표 2 참조)
E1 Primer 서열 (2962bp)
E1 (Forward) (0-33bp) GGA TCC ATG AGA CAT ATT ATC TGC CAC GGA GGT (33mer) (서열번호 3)
E1 (Reverse) (2930-2962bp) GAA TTC TCA ATC TGT ATC TTC ATC GCT AGA GCC (33mer) (서열번호 4)
E1A Primer 서열 (421bp)
E1A (Forward) (78-101bp) CGA AGA GGT ACT GGC TGA TAA TCT (24mer)(서열번호 5)
E1A (Reverse) (480-499bp) CCG TAT TCC TCC GGT GAT AA (20mer)(서열번호 6)
음성대조군으로 L132 세포(L132), 양성대조군으로 HEK293A 세포(293A)를 사용하였고, L132 세포에 E1 및 E1A가 삽입된 세포주(L132-2E1-3E1A#6로 명명)들을 실험군으로 한 PCR의 결과를 도 10에 도시하였다.
도 10은 상기 PCR의 결과물을 전기영동으로 E1 및 E1A 유전자를 확인한 결과이다. 도 10의 (a) 및 (b)는 GT541 클론인 L132-2E1-3E1A#6에서 E1(2962bp) 및 E1A(421bp)에 해당하는 밴드가 관찰된 것을 볼 수 있었다.
이로써 L132 세포에 E1 및 E1A의 도입 및 발현됨을 알 수 있었다.
5-2. RCA TEST
상기 5-1의 세포주에서 RCA 반응이 일어났는지 확인하기 위해서 세포주에 Ad-GFP를 감염 후 바이러스를 수확(harvest)한 다음, gDNA를 추출하여 E1에 해당하는 프라이머를 이용하여 PCR 방법을 통해 확인하였다.
해당 실험에서는 E1 RCA 확인 primer 서열(241bp)을 사용하여 RCA 반응이 일어났는지 확인하였다. (표 3 참조)
E1 RCA 확인 Primer 서열 (241bp)
E1(RCA) Forward ATG AGA CAT ATT ATC TGC CAC (21mer)(서열번호 7)
E1(RCA)Reverse GTA AGT CAA TCC CTT CCT GCA C (22mer)(서열번호 8)
293A 세포에 바이러스를 감염시켜 바이러스 gDNA를 추출(293A로 명명), 양성대조군으로 293A 세포의 DNA를 추출(293A cell로 명명) 및 실험군으로 GT541 세포주(L132-2E1-3E1A#6로 명명)로 PCR을 수행하였고 그 결과는 도 11에 도시하였다.
도 11를 보면, 293A cell에서만 RCA 반응 즉, E1(241bp) 밴드가 발견되고 나머지에서는 발견되지 않았다. 이로써, GT541 세포주가 RCA 반응이 없는 것을 알 수 있었다.
5-3. 아데노바이러스 역가 측정
상기 5-1의 세포주에서 아데노바이러스의 생산을 확인하기 위해, 생산한 아데노바이러스의 역가를 측정해 보았다.
상기 세포주들을 배양하여 Ad-GFP를 감염시킨 뒤 세포를 수확(harvest)하여 -70℃에 보관한 뒤, 다음날 sonicator로 세포를 깨고 원심분리하여 상등액만 얻어서 gDNA를 추출하여 Real-time PCR로 정량하였다.
도 12는 아데노바이러스 숙주세포로 많이 이용되는 HEK 293A 세포(293A로 명명)와 L132-2E1-3E1A#6을 비교한 결과들이다.
도 12를 보면 아데노바이러스 생산량이 293A는 8.53x109 GC/ml이고 L132-2E1-3E1A#6은 2.53x109 GC/ml의 생산량을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기 결과들은 세포에 E1 레트로바이러스를 감염시킨 뒤 추가적으로 E1A 레트로바이러스를 감염시켰을 때의 아데노바이러스 생산 세포주가 아데노바이러스 생산성을 높일 수 있을 뿐만 아니라, RCA 반응도 없으므로 안정성 높은 아데노바이러스 세포주로 이용가능함을 알 수 있다.
서열번호 1 : E1A 단백질을 코딩하는 핵산서열
ggatccatga gacatattat ctgccacgga ggtgttatta ccgaagaaat ggccgccagt
cttttggacc agctgatcga agaggtactg gctgataatc ttccacctcc tagccatttt
gaaccaccta cccttcacga actgtatgat ttagacgtga cggcccccga agatcccaac
gaggaggcgg tttcgcagat ttttcccgac tctgtaatgt tggcggtgca ggaagggatt
gacttactca cttttccgcc ggcgcccggt tctccggagc cgcctcacct ttcccggcag
cccgagcagc cggagcagag agccttgggt ccggtttcta tgccaaacct tgtaccggag
gtgatcgatc ttacctgcca cgaggctggc tttccaccca gtgacgacga ggatgaagag
ggtgaggagt ttgtgttaga ttatgtggag caccccgggc acggttgcag gtcttgtcat
tatcaccgga ggaatacggg ggacccagat attatgtgtt cgctttgcta tatgaggacc
tgtggcatgt ttgtctacag taagtgaaaa ttatgggcag tgggtgatag agtggtgggt
ttggtgtggt aatttttttt ttaattttta cagttttgtg gtttaaagaa ttttgtattg
tgattttttt aaaaggtcct gtgtctgaac ctgagcctga gcccgagcca gaaccggagc
ctgcaagacc tacccgccgt cctaaaatgg cgcctgctat cctgagacgc ccgacatcac
ctgtgtctag agaatgcaat agtagtacgg atagctgtga ctccggtcct tctaacacac
ctcctgagat acacccggtg gtcccgctgt gccccattaa accagttgcc gtgagagttg
gtgggcgtcg ccaggctgtg gaatgtatcg aggacttgct taacgagcct gggcaacctt
tggacttgag ctgtaaacgc cccaggccat aagaattc
서열번호 2 : E1B 단백질을 코딩하는 핵산서열
ggatccatgg aggcttggga gtgtttggaa gatttttctg ctgtgcgtaa cttgctggaa
cagagctcta acagtacctc ttggttttgg aggtttctgt ggggctcatc ccaggcaaag
ttagtctgca gaattaagga ggattacaag tgggaatttg aagagctttt gaaatcctgt
ggtgagctgt ttgattcttt gaatctgggt caccaggcgc ttttccaaga gaaggtcatc
aagactttgg atttttccac accggggcgc gctgcggctg ctgttgcttt tttgagtttt
ataaaggata aatggagcga agaaacccat ctgagcgggg ggtacctgct ggattttctg
gccatgcatc tgtggagagc ggttgtgaga cacaagaatc gcctgctact gttgtcttcc
gtccgcccgg cgataatacc gacggaggag cagcagcagc agcaggagga agccaggcgg
cggcggcagg agcagagccc atggaacccg agagccggcc tggaccctcg ggaatgaatg
ttgtacaggt ggctgaactg tatccagaac tgagacgcat tttgacaatt acagaggatg
ggcaggggct aaagggggta aagagggagc ggggggcttg tgaggctaca gaggaggcta
ggaatctagc ttttagctta atgaccagac accgtcctga gtgtattact tttcaacaga
tcaaggataa ttgcgctaat gagcttgatc tgctggcgca gaagtattcc atagagcagc
tgaccactta ctggctgcag ccaggggatg attttgagga ggctattagg gtatatgcaa
aggtggcact taggccagat tgcaagtaca agatcagcaa acttgtaaat atcaggaatt
gttgctacat ttctgggaac ggggccgagg tggagataga tacggaggat agggtggcct
ttagatgtag catgataaat atgtggccgg gggtgcttgg catggacggg gtggttatta
tgaatgtaag gtttactggc cccaatttta gcggtacggt tttcctggcc aataccaacc
ttatcctaca cggtgtaagc ttctatgggt ttaacaatac ctgtgtggaa gcctggaccg
atgtaagggt tcggggctgt gccttttact gctgctggaa gggggtggtg tgtcgcccca
aaagcagggc ttcaattaag aaatgcctct ttgaaaggtg taccttgggt atcctgtctg
agggtaactc cagggtgcgc cacaatgtgg cctccgactg tggttgcttc atgctagtga
aaagcgtggc tgtgattaag cataacatgg tatgtggcaa ctgcgaggac agggcctctc
agatgctgac ctgctcggac ggcaactgtc acctgctgaa gaccattcac gtagccagcc
actctcgcaa ggcctggcca gtgtttgagc ataacatact gacccgctgt tccttgcatt
tgggtaacag gaggggggtg ttcctacctt accaatgcaa tttgagtcac actaagatat
tgcttgagcc cgagagcatg tccaaggtga acctgaacgg ggtgtttgac atgaccatga
agatctggaa ggtgctgagg tacgatgaga cccgcaccag gtgcagaccc tgcgagtgtg
gcggtaaaca tattaggaac cagcctgtga tgctggatgt gaccgaggag ctgaggcccg
atcacttggt gctggcctgc acccgcgctg agtttggctc tagcgatgaa gatacagatt
gagaattc
서열번호 3 : E1 forward primer (33mer)
GGA TCC ATG AGA CAT ATT ATC TGC CAC GGA GGT
서열번호 4 : E1 reverse primer (33mer)
GAA TTC TCA ATC TGT ATC TTC ATC GCT AGA GCC
서열번호 5 : E1A forward primer (24mer)
CGA AGA GGT ACT GGC TGA TAA TCT
서열번호 6 : E1 reverse primer (20mer)
CCG TAT TCC TCC GGT GAT AA
서열번호 7 : E1 RCA forward primer (21mer)
ATG AGA CAT ATT ATC TGC CAC
서열번호 8 : E1 RCA reverse primer (22mer)
GTA AGT CAA TCC CTT CCT GCA C

Claims (13)

  1. E1 단백질 및 이를 코딩하는 핵산서열 중 1 이상의 물질; 및
    E1A 단백질, E1A를 코딩하는 핵산서열, E1B 단백질, 및 E1B를 코딩하는 핵산서열중 1 이상의 물질
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 E1 단백질은 아데노바이러스 타입 5의 E1 단백질인 것을 특징으로 하는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 E1A 단백질을 코딩하는 핵산서열은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 E1B 단백질을 코딩하는 핵산서열은 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 인간 유래 세포인 것을 특징으로 하는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 세포주는 L132 세포인 것을 특징으로 하는 비복제 아데노 바이러스 생산세포주.
  7. 제 1항 내지 6항 중 어느 한 항의 세포주; 및 아데노바이러스 벡터를 포함하는 재조합 아데노바이러스 생산용 패키징 시스템.
  8. 다음 단계를 포함하는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주의 제조방법;
    (a) 아데노바이러스 E1, E1A 및 E1B 유전자의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 각각 제작하는 단계;
    (b) 상기 제작된 레트로바이러스 벡터를 레트로바이러스 생산세포주에 각각 형질도입시켜 레트로바이러스를 생산하는 단계;
    (c) 상기(b) 단계로부터 생산된 E1 유전자의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스를 아데노바이러스 생산용 세포주에 감염시키는 단계; 및
    (d) 상기(b) 단계로부터 생산된 E1A 또는 E1B 유전자의 핵산서열을 포함하는 레트로바이러스 중 어느 하나 이상을 상기 (C) 단계의 아데노바이러스 생산용 세포주에 추가적으로 감염시켜 비복제 아데노 바이러스 생산 세포주를 수득하는 단계.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 E1A 유전자의 핵산서열은 서열번호 1로 표시되고, 상기 E1B 유전자의 핵산서열은 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 비복제 아데노 바이러스 생산세포주의 제조방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 아데노 바이러스 생산세포주는 인간세포 유래인 것을 특징으로하는 비복제 아데노 바이러스 생산세포주의 제조방법.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 아데노 바이러스 생산세포주는 L132 세포인 것을 특징으로하는 비복제 아데노 바이러스 생산세포주의 제조방법.
  12. E1 단백질 및 이를 코딩하는 핵산서열 중 1 이상의 물질; 및
    E1A 단백질, E1A를 코딩하는 핵산서열, E1B 단백질, 및 E1B를 코딩하는 핵산서열중 1 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주로부터 수득된 아데노바이러스; AAV(adeno-associated virus)의 rep 유전자의 핵산서열 및 AAV의 cap 유전자의 핵산서열을 포함하는 세포주; 및 AAV 벡터를 포함하는 AAV 생산용 패키징 시스템.
  13. E1 단백질 및 이를 코딩하는 핵산서열 중 1 이상의 물질; 및
    E1A 단백질, E1A를 코딩하는 핵산서열, E1B 단백질, 및 E1B를 코딩하는 핵산서열중 1 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 비복제 아데노바이러스 생산 세포주로부터 수득된 아데노바이러스를 포함하는 유전자치료용 조성물.
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