KR20010031210A - 세포계내의 ｍＲＮＡ량 및 단백질 발현을 증가시키는 방법및 변형 핵산 서열 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 배양물 계, 포유동물 세포 배양물 계 또는 돌연변이 동물에서는 발현되기 어려운 것으로 공지되거나 어려울 가능성이 있는 단백질의 mRNA 농도 및 단백질 발현을 증가시키는 방법 및 변형된 재조합 핵산 서열(바람직하게는 DNA)을 제공한다. 본 발명의 재조합 기법에 사용되는 발현하기 ″어려운″ 바람직한 단백질 후보는, 사용되는 재조합 발현계에 비해 총 AT 함량이 높거나 AT 고밀도 영역을 포함하는 DNA 암호 서열 및/또는 mRNA 불안정성 모티프를 포함하는 DNA 암호 서열 및/또는 희귀 코돈을 포함하는 DNA 암호 서열을 보유한 이종 세포 유래의 단백질, 바람직하게는 기생체, 박테리아 및 바이러스 등의 하등 유기체 유래의 단백질이다.
Description
시험관내 세포 배양계 또는 생체내 재조합체 생성계에서는 일부 이종 유전자 생성물의 재조합체를 생성하는 것이 어려울 때가 종종 있다. 예를 들어, 여러 연구진들은 원래 단백질이 유래한 세포와 상이한 세포 배양계, 특히 포유 동물 세포 배양계에서 박테리아, 기생체 및 바이러스에서 유래한 단백질을 발현하는 것이 어렵다는 것을 발견하였다. 포유 동물 세포가 생성하기 어려운 치료학적으로 중요한 단백질의 일례로는 말라리아 유충체 표면 단백질(MSP-1)이 있다.
말라리아는 열대 지방에서는 심각한 건강 문제이다. 특히, 기존 약물에 대한 내성이 급속하게 확산되고 있어, 백신의 필요성이 절박하다. 피.팔시파럼(P. falciparum)의 생활환 과정에서 발현되는 다수의 항원 중, MSP-1이 가장 집중적으로 연구되어 왔으며 예방 접종용으로 가장 성공적인 후보인 것으로 보인다. 피.팔시파럼에 노출된 개체는 MSP-1에 대한 항체를 형성하고, 연구 결과 MSP-1에 대해 자연적으로 획득된 면역 반응과 말라리아 이병률 감소 사이에 상관 관계가 있다는 것을 밝혀냈다. 여러 연구에서, 정제된 천연 MSP-1 또는 이 단백질의 재조합 단편을 이용하여 면역화시키면 최소한 부분적으로 기생체로부터의 보호를 유발함을 확인하였다[Diggs et al., (1993) Parasitol. Today 9:300-302). 따라서, MSP-1은 피.팔시파럼에 대한 백신 개발에 가장 중요한 표적이다.
MSP-1은 190∼220 kDa 당단백질이다. 이의 C 말단 영역은 백신으로서 사용하기 위한 재조합체 생성에 있어서 중심이 되었다. 그러나, 백신으로서 MSP-1을 개발하는데 있어서 주요 문제는 친화성 정제된 천연 단백질과 면역학적 효능이 동등한 재조합 단백질을, 백신을 제조할 수 있을 만큼 충분한 양으로 박테리아 또는 효모 발현계[Chang et al., (1992) J. Immunol. 148:548-555]에서 얻기가 어렵다는 것이다.
따라서, 종래 재조합법으로 생성하기가 어려웠던 기생체, 박테리아 및 바이러스 유기체 유래의 단백질을 충분량 발현시킬 수 있는 개선된 절차가 유용할 것이다. 구체적으로, MSP-1을 충분량으로 발현시킬 수 있는 재조합체 계가 특히 유용할 것이다.
본 발명은 이종 유전자 발현에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 고등 진핵 세포계에서의 미생물 유전자 또는 기생체 유전자의 발현에 관한 것이다.
도 1은 MSP-142의 동일한 단백질 아미노산 서열을 유지하면서 AT 함량을 낮추고 mRNA 불안정성 모티프가 제거되도록 306개 뉴클레오티드 위치를 치환시킨 본 발명에 따라 변형된 MSP-142의 cDNA 서열(서열 번호 1)을 도시한다. 대문자는 뉴클레오티드 치환체를 나타낸다.
도 2는 ″야생형″ 또는 천연 MSP-142의 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열[서열 번호 2]을 도시한다.
도 3a는 야생형 MSP-142(표에서는 ″MSP wt″로 표기됨) 및 신규 변형된 MSP-142유전자(표에서는 ″변형 MSP″로 표기됨)와 일부 유단백질 유전자(염소 및 마우스에서 유래한 카제인 유전자)에 대한 코돈 사용량 표이다. 각 칼럼에서의 숫자는 제시된 유전자 각각에서 나타나는 특정 코돈의 실제 횟수를 제시한 것이다. 신규 MSP-142합성 유전자는 소정의 아미노산에 대해 GC 고밀도 코돈을 먼저 선택하고, 이와 겸하여 유단백질에서 가장 빈번하게 사용되는 아미노산을 선택함으로써 유방 동물 특이적 코돈 사용량으로부터 유도하였다.
도 3b는 도 3a의 표에 제시한 바와 같은 신규 변형된 MSP-142유전자(표에서는 ″변형 MSP″로 표기됨)와 야생형 MSP-142(표에서는 ″MSP wt″로 표기됨)에서 나타나는 각 코돈의 횟수를 비교한 코돈 사용량 표이다. 이 도 3b에서는 또한 야생형 MSP-142유전자와 신규 변형된 MSP-142유전자에서 나타나는 각 코돈의 횟수와, 이.콜리(E.coli) 유전자 및 인간 유전자에서 나타나는 각 코돈의 횟수를 비교하였다. 따라서, 발현계가 이.콜리 세포인 경우에는, 이 표를 사용하여 이.콜리에 의해 어떤 코돈이 인식 또는 선호되는지를 측정할 수 있다.
도 4a 내지 도 4c는 실시예에 개시된 바와 같이 제조된 MSP-142작제물 GTC 479, GTC 564 및 GTC 627을 각각 도시한 것이다.
도 5의 패널 A는 노던 분석으로서, 작제물 GTC 627은 본 발명에 따라 변형된 신규 MSP-142유전자를 포함하고, GTC 479는 천연 MSP-142유전자를 포함하는 작제물이며, 작제물 GTC 469는 음성 대조군 DNA이다.
도 5의 패널 B는 친화성 정제 후에 용출된 분획물의 웨스턴 분석이다. 번호는 수거된 분획물의 번호이다. 이 결과로부터 GTC 627의 변형된 MSP-142합성 유전자 작제물에서 유래한 분획물은 MSP-1에 대한 폴리클로널 항체와 반응하고 음성 대조군 GTC 479는 이와 반응하지 않는다는 것을 알 수 있다.
도 6은 실시예에 기재된 OT1[서열 번호 3], OT2[서열 번호 4], MSP-8[서열 번호 5], MSP-2[서열 번호 6] 및 MSP1[서열 번호 7]의 핵산 서열을 도시한다.
도 7은 플라스미드 BC574의 개략도이다.
도 8은 BC620의 개략도이다.
도 9는 BC670의 개략도이다.
도 10은 돌연변이 유액 중에 존재하는 MSP의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 11은 MSP42-2의 뉴클레오티드 서열의 개략도이다[서열 번호 8].
도 12는 BC-718의 개략도이다.
도 13은 돌연변이 유액 중에 있어서의 BC-718 발현의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
바람직한 양태들의 상세한 설명
본원에서 언급한 특허 및 과학 문헌은 당업자들이 이용가능한 지식을 수록하고 있다. 본원에서 인용한 간행된 미국 특허, 허여된 특허 출원, 공개된 외국 출원과 참조 문헌은 참고로 인용하였다. 이들 참조 문헌과 본원에 개시된 내용간에 상충되는 것이 있으면 본원에 개시된 내용으로 해석해야 한다.
본 발명은 세포 배양계, 포유 동물 세포 배양계 또는 돌연변이 동물에서 발현시키기 어려운 것으로 알려지거나 발현이 어려울 가능성이 있는 단백질의 mRNA 농도 및 단백질 발현을 증가시키기 위한 변형된 재조합 핵산 서열(바람직하게는 DNA) 및 방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 기법을 사용하여 발현시키기에 바람직한 ″어려운″ 단백질 후보로는 사용될 재조합 발현계에 비해 높은 총 AT 함량이나 AT 고밀도 영역 및/또는 mRNA 불안정성 모티프 및/또는 희귀 코돈을 포함하는 DNA 암호 서열을 보유한 이종 세포 유래의 단백질, 바람직하게는 기생체, 박테리아 및 바이러스와 같은 하등 유기체 유래의 단백질이다.
제1 양태로, 본 발명은 미변형 서열과 비교하여 AT 함량의 감소, 경우에 따라 천연 유전자 중에 존재하는 1 이상 또는 모든 mRNA 불안정성 모티프의 제거를 포함하는 변형이 있는 것이 특징인, 세포계에서 발현될 수 있는 공지 핵산의 변형체, 바람직하게는 박테리아, 바이러스 또는 기생체 유래의 유전자를 제공한다. ″세포계″란 세포 배양계, 조직 배양계, 기관 배양계 및 살아있는 동물의 조직을 포함한다. 바람직한 특정 구체예에 있어서, 변형은 천연 유전자의 1 이상의 코돈을 세포계의 바람직한 코돈으로 치환시키는 것을 포함한다. 이러한 양태는, 천연 유전자에서 치환된 코돈과 동일한 아미노산을 암호하지만, 세포계가 인식할 수 있는 코돈, 바람직하게는 세포계에 바람직한 코돈으로 천연 유전자의 1 이상의 코돈을 치환시켜 달성한다. 본 발명에 있어서, 이러한 ″침묵″ 뉴클레오티드 및 코돈 치환은 AT 함량의 저하 및/또는 mRNA 불안정성 모티프의 제거 및/또는 희귀 코돈 수의 감소와 같은 목표를 달성하면서, mRNA를 생성하고 목적 단백질을 발현하는 세포계의 성질을 유지하기 위한, 바람직하게는 개량하기 위한 목표 달성에 충분해야 한다.
또한, 본 발명에는, 구체적으로 변형 핵산이 유래되는 공지 핵산은 제외하고, 적합한 엄중 조건하에서 본 발명의 변형 핵산과 특이적으로 상동성인 서열도 포함된다. 서열의 정확한 보체에 특이적으로 하이브리드하기에 충분히 상동성이라면, 서열이 다른 서열에 ″특이적 상동성″인 것이다. 또한, 체내에서 또는 이온 강도와 관련하여 생리적 조건, 예컨대 140 mM NaCl, 5 mM MgCl2과 근사한 조건하에서 하이브리드하여 왓슨-크릭 염기쌍 또는 후그스틴 염기쌍을 형성한다면, 그 서열은 다른 서열에 ″특이적으로 하이브리드″하는 것이다. 이와 같은 특이적 하이브리드화는 엄중 조건, 예컨대 0.2 x SSC에서 68 ℃하에 유지되는 것이 바람직하다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산은 동일한 조건(즉, 동일한 세포 종류, 동일한 배양 조건, 동일한 발현 벡터)하에 시험관내 세포 배양계 또는 돌연변이 동물에서 천연 유전자에 의해 발현되는 발현량의 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 더 바람직하게는 100% 이상의 양으로 포유 동물 세포 배양계 또는 돌연변이 동물에서 상기 단백질을 발현할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 ″발현″은 단백질을 발현시키는 mRNA 전사를 의미한다. 이러한 발현의 측정은 해당 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 방법을 비롯하여 당업계에 공지된 다수의 기법을 사용하여 실시할 수 있다. ″천연 유전자″는 상기 단백질의 야생형 형태를 암호화하고 변형 핵산이 유래되는 유전자 서열, 또는 이의 단편(자연 발생적 대립 유전자 변형체 포함)을 의미한다. ″바람직한 코돈″은 소정 세포계가 보다 우선적으로 사용하는 코돈을 의미한다. 코돈의 치환이 적어도 세포계에 의해 인식되는 한, 본 명세서에 기재된 모든 코돈 변화가 바람직한 코돈으로의 변화만을 의미하는 것이다. ″AT 함량 감소″는 A(아데닌) 또는 T(티민) 함유 뉴클레오티드 위치나 A 및/또는 T 함유 코돈을 표적 단백질의 아미노산 서열은 변경시키지 않으면서 소정 세포계가 인식하는 뉴클레오티드 또는 코돈으로 치환시켜 천연 유전자에 비하여 A 또는 T 염기를 보유한 뉴클레오티드의 전체 백분율이 더 낮아지는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 ″이종″이란 유전자가 도입되는 종과 다른 종 유래의 유전자 물질 또는 이 유전자 물질로부터 생성되는 단백질을 의미한다.
본 발명의 특히 바람직한 세포계로는 COS 세포 및 CHO 세포와 같은 포유 동물 세포 배양물계, 뿐만 아니라 돌연변이 동물, 특히 돌연변이 동물의 유방 조직을 포함한다. 하지만, 본 발명에는 박테리아, 효모, 이.콜리 및 바큘로바이러스 등의 바이러스 발현계 및 심지어 식물계도 포함된다.
본 발명의 제2 양태는 천연 유전자 중의 1 이상의 코돈이 소정 세포계에서 인식할 수 있는 코돈, 바람직하게는 소정 세포계에 바람직한 코돈으로 치환되지만, 이 치환된 코돈과 동일한 아미노산을 암호하는 코돈으로 치환시켜, 단백질을 암호하는 천연 유전자의 총 AT 함량을 저하시키는 단계 및/또는 1 이상 또는 모든 mRNA 불안정성 모티프를 제거하는 단계 및/또는 1 이상의 코돈을 소정 세포계의 바람직한 코돈으로 치환시키는 단계를 포함하는 본 발명의 핵산 변형체를 제조하는 방법을 제공한다. 재조합 DNA 기법의 일반적인 원리를 개시한 표준 참고 문헌으로는 Watson J.D. 등의 문헌[Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. publisher, 미국 캘리포니아주 먼로 파크(1987)], Darnell J.E. 등의 문헌[Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Publisher, 미국 뉴욕주 뉴욕(1986)], Old, R.W. 등의 문헌[Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2d edition, Uinversity of California Press, publisher, 미국 캘리포니아주 버클리(1981)], Maniatis, T 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, 뉴욕(1989)] 및 Ausubel 등의 문헌[Current Protocols in Molecurlar Biology, Wiley Press, 미국 뉴욕주 뉴욕(1992)] 등이 있다. 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 변형 핵산을 추가로 포함한다.
특정 이론에 귀속시키려는 것은 아니지만, 앞서의 연구는 GM-CSF mRNA의 3' 비해독 영역에서 유래한 보존된 AU 서열(AUUUA)이 선택적 mRNA 분해를 매개한다는 것을 시사하였다[Shaw, G. and Kamen, R. Cell 46:659-667]. 과거에는 유전자의 비해독 영역내 불안성성 모티프의 존재에 주목하였다. 본 발명은 유전자의 암호 영역에서 불안정성 서열을 제거하는 것이 유리하다는 장점을 인식한 최초의 발명이다.
제3 양태로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 핵산과 소정의 세포주 또는 유기체에서 활성인 프로모터를 포함하는 벡터, 및 본 발명의 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 바람직한 벡터로는 복제 오리진을 포함하여 1 이상의 세포 종류에서 복제할 수 있다. 바람직한 특정 벡터는 발현 벡터로서, 최소한 프로모터와 수동 종결인자를 포함하여, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 또는 포유 동물 세포에서 재조합 발현 인자를 전사시킬 수 있는 것이다.
제4 양태로, 본 발명은 본 발명에 기재된 핵산을 포함하는 배선을 보유하는 인간을 제외한 돌연변이 유액분비 동물 뿐만 아니라 본 발명에 기재된 핵산을 포함하는 돌연변이 유액분비 동물 제조용 돌연변이 발현 벡터를 제공한다. 이러한 돌연변이 발현 벡터는 숙주 돌연변이 동물의 게놈 일부로서 발현될 수 있는 프로모터를 포함한다. 돌연변이 동물을 제조하는 일반적인 원리는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Hogan 등의 문헌[Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1986)], Simons 등의 문헌[Bio/Technology, 6:179-183, (1988)], Wall 등의 문헌[Biol. Reprod. 32:645-651, (1985)], Buhler 등의 문헌[Bio/Technology, 8:140-143(1990)], Ebert 등의 문헌[Bio/Technology, 9:835-838(1991)], Krimenfort 등의 문헌[Bio/Technology, 9:844-847(1991), Wall 등의 문헌[J.Cell. Biochem. 49:113-120(1992)] 참조. 포유 동물 및 그 배세포내로 외래 DNA 서열을 도입하는 기법은 본래 마우스에서 개발되었다. 예컨대 Gordon 등의 문헌[Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77:7380-7384, (1980)], Gordon and Ruddle, Science 214:1244-1246 (1981)], Palmiter 및 Brinster 등의 문헌[Cell 41:343-345, 1985], Brinster 등의 문헌[Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:4438-4442(1985)] 및 Hogan 등의 문헌[동일 문헌] 참조. 이어서, 이들 기법은 젖소 및 염소를 비롯한 거대 동물에 사용하기 위해 개조되었다. 매우 최근까지, 돌연변이 마우스 또는 돌연변이 가축 형성에 가장 널리 사용되는 절차는 돌연변이 발현 작제물의 형태로 수 백개의 해당 DNA 선형 분자를 수정된 난의 전핵 중 하나로 주사하는 것이다. 접합체의 세포질내로 DNA를 주사하는 방법도 널리 사용된다. 가장 최근에는 수정되지 않은 난에 주사할 수 있는 전체 돌연변이 세포주를 클로닝하는 기법도 개발되었다[KHS Campbell et al., Nature 380 64-66(1996)].
제5 양태로, 본 발명은 본 발명의 핵산, 이 핵산에 작동가능하게 커플링되어 이 핵산이 암호하는 단백질을 돌연변이 동물의 유액으로 유선 발현 유도하는 프로모터를 포함하는 돌연변이 유액분비 동물종을 생성하는 돌연변이 발현 벡터를 제공한다. 유선 발현계는 높은 발현율, 저비용, 정확한 프로세싱 및 접근용이성의 잇점이 있다. 소 및 인간의 α-락트알부민과 같은 공지 단백질은 여러 연구자들에 의해 유액분비성 돌연변이 동물에서 생산된 바 있고[Wright et al., Bio/Technology 9:830-834(1991); Vilotte et al., Eur. J. Biochem., 186:43-48(1989); Hochi et al., Mol Reprod. And Devel. 33:160-164(1992); Soulier et al., FEBS Letter 297(1,2):13-18(1992)], 상기 발현계는 단백질을 고밀도로 생성한다고 밝히고 있다.
바람직한 프로모터는 유방 조직에서 활성적인 것이다. 특히 유용한 것은, 유방 조직에서 발견되는 유전자와 같이 유액 특이적 단백질을 암호하는 유전자에서 특히 활성적인, 즉 유액이 합성되는 생리적 조건하에서 다른 조직에서보다 유방 조직에서 보다 활성적인 프로모터이다. 가장 바람직한 것은, 유방 조직에 특이적이고, 유방 조직에서 효과적인 프로모터이다. 이러한 프로모터 중에서, 카제인, 락트알부민 및 락트글로불린 프로모터가 바람직하며, 그 예로는 알파, 베타 및 감마 카제인 프로모터와 알파 락트알부민 및 베타 락트글로불린 프로모터가 있지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. 이 프로모터 중에서 바람직한 것은 설치류, 염소 및 소 유래의 프로모터이다. 다른 프로모터로는 유장 산성 단백질(WAP) 유전자를 조절하는 프로모터를 포함한다.
본 발명은 바람직한 구체예로서, 세포 배양계, 포유 동물 세포 배양계 또는 돌연변이 동물의 유액에서 발현될 수 있는 MSP-1 또는 이의 단편을 암호하는 변형 핵산을 제공한다. 즉, 천연 MSP-1 유전자를 암호하는 핵산 서열을 본 발명에 따라 변형시킨다. 첫째, 동일 아미노산을 암호하지만, 천연 MSP-1 유전자 또는 유전자 단편에 비해 변형 핵산의 AT 함량을 낮추기에 충분한, 소정의 세포계에서 인식할 수 있는 코돈, 바람직하게는 소정 세포계에 바람직한 코돈으로 천연 유전자의 코돈을 치환시켜 총 AT 함량을 감소시킨다. 둘째, 동일 아미노산을 암호하지만, mRNA 불안정성 모티프를 제거하기에 충분한, 소정의 세포계에서 인식할 수 있는 코돈, 바람직하게는 소정 세포계에 바람직한 코돈으로 천연 유전자의 코돈을 치환시켜 유전자의 암호 서열로부터 천연 유전자 또는 유전자 단편 중의 mRNA 불안정성 모티프(AUUUA, 상기 문헌 Shaw and Kamen 참조)를 제거한다. 경우에 따라, 천연 유전자의 기타 다른 코돈을 전술한 바와 같이 소정의 발현계에 바람직한 코돈으로 치환시킬 수 있다.
제6 양태로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 변형 핵산을 포함하는 DNA 백신을 제공한다. 바람직한 특정 구체예로서, DNA 백신은 본 명세서에 기재된 벡터를 포함한다. 본 발명에 기재된 DNA 백신은, 프로모터에 작동가능하게 결합되거나 결합되지 않은 본 발명에 기재된 ″나출″ 또는 정제된 변형 핵산의 형태일 수 있다. 핵산은 프로모터에 그 핵산 서열이 발현될 수 있게 결합한 경우 프로모터에 작동가능하게 결합된 것이다. 이러한 DNA 백신은 캡슐화됨이 없이 전달하거나, 리포좀의 일부로서 전달하거나 또는 바이러스 게놈의 일부로서 전달할 수 있다. 일반적으로, 이러한 백신은 핵산을 발현시켜 DNA 백신을 투여받은 인간을 비롯한 동물 중에서 항체 반응을 유도하기에 충분한 양으로 전달한다. 또한, 1차 전달 후 최소한 1주 후에 후속 전달을 실시하여 항체 반응을 증가시킬 수도 있다. 바람직한 전달 경로로는 비경구 투여 뿐만 아니라 점막을 통한 투여를 포함한다.
이러한 본 발명의 양태는 바람직한 구체예로서 본 발명에 기재된 변형 MSP-1 유전자의 단편을 포함한다. 이러한 단편은 본 발명에 기재된 1 이상의 변형을 포함하고 총 유전자 서열의 약 5% 내지 약 100% 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
이.콜리 및 인간에서 사용되는 코돈 사용량에 대해서 도 3b에 기재하였다. 도 3b에서는 본 발명의 변형 MSP-1 유전자 뿐만 아니라 MSP-1 천연 유전자의 코돈 사용량의 빈도를 나타내고, 이.콜리 및 인간 유전자의 코돈 사용량의 빈도와 비교하였다. 코돈 사용량의 빈도 표는 효모, 바큘로바이러스 및 포유 동물 계와 같은 기타 다른 다수의 발현계에 대해 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 용이하게 입수할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명을 제조하고 실시하는 특히 바람직한 양태에 대해 예시한 것으로, 유사 결과를 얻을 수 있는 대안 방법이 있기 때문에 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
발명의 개요
본 발명은 종래 세포 배양계, 포유 동물 세포 배양계 또는 돌연변이 포유 동물에서 발현시키기 어려웠던, 이종 세포 유래의 단백질, 바람직하게는 박테리아, 바이러스 및 기생체와 같은 하등 유기체 유래의 단백질의 mRNA 농도 및 단백질 발현을 증가시키기 위한 재조합 DNA 조성물 및 절차를 제공한다. 본 발명에 기재된 발현계에서 발현시키기에 바람직한 단백질 후보는 재조합 발현계에 비해 높은 총 AT 함량 또는 AT 고밀도 영역 및/또는 mRNA 불안정성 모티프 및/또는 희귀 코돈을 포함하는 DNA 암호 서열을 가진 단백질이다.
제1 양태로, 본 발명은 미변형 서열과 비교하여 AT 함량의 감소, 경우에 따라 천연 유전자 중에 존재하는 1 이상 또는 모든 mRNA 불안정성 모티프의 제거를 포함하는 변형이 있는 것이 특징인, 일정 계에서 발현될 수 있는 공지 핵산의 변형체, 바람직하게는 박테리아, 바이러스 또는 기생체 유래의 유전자를 제공한다. 바람직한 특정 구체예로서, 변형은 천연 유전자의 1 이상의 코돈을 세포계의 바람직한 코돈으로 치환시키는 것을 포함한다.
제2 양태로, 본 발명은 천연 유전자 중의 1 이상의 코돈이 소정 세포계에서 인식할 수 있는 코돈, 바람직하게는 소정 세포계에 바람직한 코돈으로 치환되지만, 이 치환된 코돈과 동일한 아미노산을 암호하는 코돈으로 치환시켜, 단백질을 암호하는 천연 유전자의 총 AT 함량을 저하시키는 단계 및/또는 1 이상 또는 모든 mRNA 불안정성 모티프를 제거하는 단계 및/또는 1 이상의 코돈을 소정 세포계의 바람직한 코돈으로 치환시키는 단계를 포함하여 본 발명의 핵산 변형체를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 본 발명의 양태는 본 발명의 방법에 따라 제조된 핵산 변형체도 포함한다.
제3 양태로, 본 발명은 본 발명의 핵산과, 소정의 세포주 또는 유기체에서 활성인 프로모터를 포함하는 벡터, 및 본 발명의 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
제4 양태로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 핵산을 포함하는 배선을 보유한 인간을 제외한 돌연변이 유액분비 동물 뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 핵산을 포함하는 돌연변이 유액분비 동물의 제조용 돌연변이 발현 벡터를 제공한다.
제5 양태로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 핵산, 이 핵산에 작동가능하게 커플링되어 돌연변이 동물의 유액내로 상기 핵산에 의해 암호된 단백질의 유선 발현을 유도하는 프로모터를 포함하는, 돌연변이 유액분비 동물종의 제조용 돌연변이 발현 벡터를 제공한다.
제6 양태로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 핵산 변형체를 포함하는 DNA 백신을 제공한다. 이러한 양태의 바람직한 구체예로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 변형된 MSP-1 유전자의 단편을 포함한다.
신규 변형 MSP-142유전자의 작제
일 구체예로서, MSP-1의 C 말단 단편을 암호하는 신규 변형 핵산을 제공한다. 본 발명의 포유 동물 세포에서 발현할 수 있는 MSP-1의 42 kD C-말단 부분(MSP-142)을 암호하는 본 발명의 신규 변형 핵산은 도 1에 도시하였다. 천연 MSP-142유전자(도 2)는 포유 동물 세포 배양물 또는 돌연변이 마우스에서 발현될 수 없다. 천연 MSP-142유전자를 분석해 본 결과 포유 동물 유전자와 다른 여러 특징이 있음이 암시되었다. 첫째, 총 AT 함량이 76%로 매우 높았다. 둘째, mRNA 불안정성 모티프, AUUUA가 이 1100 bp DNA 분절에서 10 배 높게 나타났다(도 2). 이와 같은 차이를 해명하기 위하여 새로운 MSP-142유전자를 디자인하였다. 천연 MSP-142유전자의 306 위치에 침묵 뉴클레오티드 치환을 도입하여 총 AT 함량을 49.7%로 감소시켰다. 또한, 코돈 사용량을 변화시켜 천연 유전자 중의 10 AUUUA mRNA 불안정성 모티프를 각각 제거하였다. 코돈 사용량을 변화시키기 위하여, 여러 마우스 및 염소의 유방 특이적 단백질을 사용하여 도 3a에 기재한 유방 조직 특이적 코돈 사용량의 표를 만들었다. 이 표를 사용하여 전술한 변형 MSP-142유전자의 코돈 사용량을 선택하였다. 예컨대, 도 3a의 표에 나타낸 바와 같이 천연 유전자에서는 Leu의 65%(25/38)가 TTA에 의해 암호되고 있는데, 이 코돈은 유선에서는 희귀한 코돈이다. 따라서, 변형 MSP-142유전자에서는 유선에 존재하는 Leu의 바람직한 코돈인 CTG에 의해 Leu이 100% 암호화되었다.
발현 벡터는 변형 MSP-142유전자를 사용하여, 염소 베타 카제인의 처음 26개 아미노산을 변형 MSP-142유전자의 N-말단에 융합시키고, 이 융합 유전자를 운반하는 SalI-XhoI 단편을 발현 벡터 pCDNA3의 XhoI 부위에 서브클로닝하여 작제하였다. 이 유전자 생성물을 친화성 정제할 수 있도록 MSP-142유전자의 3' 말단에 His6 태그를 융합시켰다. 그 결과 플라스미드 GTC627이 얻어졌다(도 4c).
천연 MSP-142유전자 작제물과 본 발명의 변형 MSP-142핵산을 비교하기 위하여, 다음과 같이 천연 MSP-142유전자의 발현 벡터를 작제하고, 이 유전자를 포유동물 세포 배양물에 첨가한 뒤 마우스에게 주사하여 돌연변이 마우스를 제조하였다.
천연 MSP-142발현 벡터의 작제
플라스모듐 팔시파럼(Plasmodium falciparum)의 절두형 유충체 표면 단백질-1(MSP-1)을 분비형으로 만들기 위하여, MSP-1의 42 kD C 말단 부분(MSP-142)을 암호하는 야생형 유전자를 염소 베타 카제인의 처음 15개 아미노산을 암호하는 DNA 서열이나 처음 25개 아미노산을 암호하는 DNA 서열에 융합시켰다. 이것은, 먼저 프라이머 MSP1 및 MSP2를 사용하여 MSP-1 플라스미드(데이비드 카슬로우(NIH) 박사로부터 입수함)를 PCR 증폭시키고, 그 다음 PCR 생성물을 TA 벡터(Invitrogen)에 클로닝하여 제조하였다. PCR 생성물의 BglII-XhoI 단편을 발현 벡터 pCDNA3 내의 올리고 OT1 및 OT2와 결찰시켰다. 그 결과 플라스미드 GTC564(도 4b)를 얻었다. 이 플라스미드는 15개 아미노산 베타 카제인 시그널 펩티드, 성숙 염소 베타 카제인의 처음 11개 아미노산 및 후속되는 천연 MSP-142유전자를 암호한다. 올리고 MSP-8 및 MSP-2(도 6)를 사용하여 PCR로 MSP-1 플라스미드를 증폭시키고, 이 생성물을 그 다음 TA 벡터내로 클로닝하였다. XhoI 단편을 절단하여 발현 벡터 pCDNA3의 XhoI 부위에 클로닝하여 플라스미드 GTC479(도 4a)를 얻었다. 이 플라스미드는 야생형 MSP-142유전자에 융합된 15개 아미노산 염소 베타 카제인 시그널 펩티드를 암호한다. GTC 564 및 GTC 479내에 존재하는 MSP-142유전자의 3'-말단에는 His6 태그를 첨가하였다.
COS-7 세포내에서 발현되지 않는 천연 MSP-142유전자
배양된 COS-7 세포 중에서의 천연 MSP 유전자의 발현은 순간 형질감염 분석법으로 분석하였다. GTC479 및 GTC564 플라스미드 DNA를 제조자의 프로토콜에 따라 리포펙트아민(Gibco-BRL)을 사용하여 COS-7 세포로 도입시켰다. 형질감염 2일 후 이 COS 세포로부터 총 세포 RNA를 분리하였다. 형질감염 2일 후 배양 배지에35S-메티오닌을 첨가하여 10 시간 동안 새로 합성된 단백질을 대사적 표지시켰다.
COS 세포에서의 MSP mRNA 발현률을 측정하기 위하여, 노던 블롯을 GTC479 유래의32P 표시된 DNA 단편으로 탐침하였다. GTC479 또는 GTC564 형질감염체에서는 MSP RNA가 전혀 검출되지 않았다(데이터는 도시 안함). 계속 노출시킨 결과, 분해된 MSP mRNA의 잔류 농도가 관찰되었다.35S 표지된 배양물 상청액과 용균물을 MSP에 대하여 유발된 폴리클로널 항체로 면역침전시켰다. 면역침전 실험 결과, GTC479 또는 GTC564 형질감염 세포의 상청액이나 용균물에서는 발현이 전혀 일어나지 않는 것으로 나타났다(데이터는 제시 안함). 이와 같은 결과를 통해, COS 세포 중에서는 천연 MSP-1 유전자가 발현되지 않음을 알 수 있었다.
돌연변이 마우스의 유선에서 발현되지 않는 천연 MSP-142유전자
염소 베타-카제인 시그널 펩티드의 15개 아미노산과, 염소 베타-카제인의 처음 11개 아미노산 및 천연 MSP-142유전자를 암호하는 GTC479의 SalI-XhoI 단편을, 벡터 BC350 중에서 발현되는 베타-카제인의 XhoI 부위에 클로닝하였다. 그 결과 플라스미드 BC574를 얻었다(도 7). BC574의 SalI-NotI 단편을 마우스 배에 주사하여 돌연변이 마우스를 제조하였다. 돌연변이 마우스 15 주를 제조하였다. 초기 마우스 암컷으로부터 유액을 수집하고, MSP에 대한 폴리클로널 항체를 사용하여 웨스턴 분석하였다. 분석된 7마리 마우스 중 어떤 마우스도 유액 중에 MSP-142단백질을 발현시키지 않았다. MSP-142의 mRNA가 유선 중에서 발현되는지를 추가 조사하기 위하여 11일째 유액분비 돌연변이 마우스로부터 총 RNA를 추출하고 노던 블롯으로 분석하였다. 분석된 BC 574계 중 어느 것에서도 MSP-142mRNA가 검출되지 않았다. 즉, MSP-142변이유전자는 돌연변이 마우스의 유선에서는 발현되지 않았다. 이를 종합해보면, 본 실험은 천연 기생 MSP-142유전자가 포유동물 세포에서는 발현될 수 없으며, 방해 요인은 mRNA 다량의 농도임을 암시한다.
포유동물 세포에서의 MSP 발현
순간 형질감염 실험을 실시하여 COS 세포에서의 본 발명의 변형 MSP-142유전자의 발현에 대해 평가하였다. COS-7 세포내로 GTC627 및 GTC479 DNA를 도입시켰다. 노던 분석을 위하여 형질감염후 48 시간 후에 총 RNA를 분리하였다. RNA를 고정화시킨 후 GTC627의32P 표지된 SalI-XhoI 단편으로 프로브하였다. GTC479와 GTC627 간에는 큰 차이가 관찰되었다. 전술한 바와 같이 GTC479 형질감염 세포에서는 어떤 MSP-142mRNA도 검출되지 않은 반면, GTC627에서는 다량의 MSP-142mRNA가 발현되었다(도 5, 패널 A). 음성 대조군으로 사용한 GTC469는 시판되는 클로닝 벡터인 PU19 중에 클로닝된 GTC564의 삽입체를 포함한다.35S 메티오닌으로 대사적 표지화한 후 MSP에 대한 폴리클로널 항체(캐슬로우 박사에게서 입수함, NIAID, NIH)로 면역침전시킨 결과, 형질감염된 COS 세포에 의해 MSP-142단백질이 합성된 것을 관찰하였다(도 5, 패널 B). 또한, 형질감염된 COS 상청액에서 MSP-142이 검출되었는데, 이것은 MSP-142단백질이 분비형임을 시사하는 것이다. 또, Ni-NTA 컬럼을 사용하여 GTC627 형질감염된 COS 상청액으로부터 MSP-142를 친화성 정제하였다.
이 결과는 기생체의 MSP-142유전자를 변형시키면 COS 세포 중에서 MSP mRNA가 발현된다는 것을 입증한다. 결과적으로, 포유동물 세포에 의해 MSP-142생성물이 합성되고 분비되었다.
또한, 본 실험에서 사용한 폴리클로널 항체는 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있다[Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, eds. Cold Spring Harbor Laboratory, publishers(1988)]. 또, 문헌[Chang et al., Infection and Immunity(1996) 64:253-261 and Chang et al.,(1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:6343-6347]에도 MSP 혈청 항체의 생산에 대해 기술되어 있다.
이 분석의 결과는 본 발명의 변형된 MSP-142핵산이 전혀 발현되지 않는 천연 단백질에 비해 상당히 고밀도로 발현된다는 것을 보여주고 있다. 이와 같은 결과는 유전자 중의 AT%를 감소시키면 이종계에서 MSP 유전자의 발현이 유도된다는 최초의 실험 결과이며, 또한 MSP 암호 영역으로부터 AUUUA mRNA 불안정성 모티프를 제거하면 COS 세포에서 MSP 단백질이 발현된다는 것을 최초로 입증한 것이다.
따라서, 본 명세서에 제시된 데이터는, 높은 AT 함량 및/또는 불안정성 모티프의 존재, 및/또는 소정의 세포계에 의해 인식불가능한 희귀 코돈의 사용량으로 인하여 세포 배양물이나 돌연변이계에서 발현되기 어려운 특정 이종 단백질이, 임의의 소정 계에서 그 계에 적합한 코돈 사용량 표를 보조적으로 사용하여 발현할 수 있도록 재조작될 수 있음을 시사하고 있다. 본 발명은 낮은 RNA 농도를 생성하거나 RNA를 전혀 생성하지 않아 퇴화의 원인이 되는 추정 서열을 제거하는 것을 목표로 하여 DNA 서열을 변형시킨 최초의 발명이다. 도 5, 패널 A에 나타낸 노던 분석 결과(즉, 천연 유전자에 의해서는 RNA가 전혀 관찰되지 않고, 본 발명에 따른 변형된 DNA 서열에 의해서는 적당한 농도가 관찰됨), 역시 단백질 생성이 증가됨이 나타나고 있다.
다음 실시예는 돌연변이 마우스의 유액에서 발현되는 천연 비융합(및 비글리코실화) 단백질로서의 MSP1-42에 대한 것이다.
MSP 돌연변이유전자의 작제
15개 아미노산 β-카제인 시그널 펩티드에 MSP1-42를 융합시키기 위하여, 15개 아미노산-카제인 시그널 및 말단이 ClaI 부위인 MSP1-42의 처음 5개 아미노산을 암호하는 올리고쌍 MSP203과 MSP204(MSP203 : ggccgctcgacgccaccatgaaggtcctcataa ttgcctgtctggtggctctggccattgcagccgtcactccctccgtcat, MSP204 :cgatgacggagggagt gacggctgcaatggccagagccaccagacaggcaattatgaggaccttcatggtggcgtcgagc)를 BC620의 ClaI-XhoI 단편(MSP1-42 유전자의 나머지를 암호함)에 결찰시켜 발현 벡터 pCDNA3의 XhoI 부위에 삽입하였다. 이 플라스미드(GTC669)의 XhoI 단편을 유액 특이적 발현 벡터 BC350의 XhoI 부위에 클로닝하여 BC670을 생성하였다(도 9).
돌연변이 마우스의 유액내에서의 MSP1-42의 발현
플라스미드 BC670으로부터 SalI-NotI 단편을 제조하여 마우스 배(胚)에 미량주입하여 돌연변이 마우스를 제조하였다. 돌연변이 마우스는, 꼬리 생검으로부터 마우스 DNA를 추출한 뒤, 올리고 GTC17과 MSP101(GTC17 : GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC, MSP101 : GGATTCAATAGATACGG)을 사용하여 PCR 분석하여 동정하였다. 기초 돌연변이 마우스 암컷 유래의 유액을 유액분비 7일과 9일째 수집하고 웨스턴 분석하여, 폴리클로널 항MSP 항체와 모노클로널 항MSP 항체 5.2(데이비드 카슬로우 박사, NIH)로 MSP-1-42의 발현률을 측정하였다. 그 결과, 돌연변이 마우스의 유액에 발현된 MSP-1-42의 발현 농도가 1 내지 2 ㎎/㎖인 것으로 나타났다(도 10).
MSP1-42 글리코실화 부위 결실 돌연변이체의 작제
MSP를 생성하는 유액의 분석 결과, 돌연변이 MSP 단백질은 N-글리코실화되었다. MSP1-42 유전자 중의 N-글리코실화 부위를 제거하기 위하여, 181번과 262번의 Asn(N)을 Gln(Q)으로 치환시켰다. 이 치환은, MSP1의 대응 영역에 어닐링하고 AAC 대신 CAG 돌연변이를 보유하는 DNA 올리고를 디자인하여 도입시켰다. 이 올리고를 그 다음 PCR 프라이머로서 사용하여 N 대신 Q 치환체를 암호하는 DNA 단편을 생성하였다.
N262-Q 돌연변이를 도입하기 위하여, 올리고 쌍, MSPGYLYCO-3 (CAGGGAATGCTGCAGATCAGC) 및 MSP42-2 (AATTCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCGCAGAAA ATACCATG, 도 11)를 사용하여 플라스미드 GTC627(합성 MSP1-42 유전자 함유)을 PCR 증폭시켰다. 이 PCR 생성물을 pCR2.1 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다. 그 결과 플라스미드 GTC716을 얻었다.
N181-Q 돌연변이를 도입하기 위하여, 올리고 MSPGLYCO-1 (CTCCTTGTTCAGGAACTTGTAGGG) 및 MSPGLCO-2 (GTCCTGCAGTACACATATGAG, 도 4)를 사용하여 플라스미드 GTC627을 증폭시켰다. 이 PCR 생성물을 pCR2.1내로 클로닝하였다. 그 결과, 플라스미드 GTC700을 얻었다.
MSP 이중 글리코실화 돌연변이체는 다음과 같은 3 단계로 작제하였다. 먼저, BC670의 XhoI-BsmI 단편 및 GTC716의 BsmI-XhoI 단편을 벡터 pCR2.1의 XhoI 부위에 결찰시켰다. 그 결과, N262-Q 돌연변이를 보유한 MSP-1-42 유전자를 포함하는 플라스미드를 얻었다. 그 다음, 이 플라스미드의 EcoNI-NdeI 단편을 플라스미드 GTC716의 EcoNI-NdeI 단편으로 치환시켜 제2 돌연변이인 N181-Q를 도입시켰다. 마지막으로, 이 플라스미드의 XhoI 단편을 BC350내로 클로닝하여 BC718을 생성하였다(도 12).
돌연변이 동물에서의 비글리코실화 MSP1의 발현
BC718은 다음과 같은 특성이 있다. 즉, 유액분비 동안 돌연변이 동물의 유선에서 발현될 수 있도록 β-카제인 프로모터의 제어하에 MSP1-42 유전자를 보유한다. 또한, N-말단에 어떤 부가 아미노산이 없는 MSP1-42가 유액으로 분비될 수 있도록 MSP1-42에 직접 융합된 15개 아미노산 β-카제인 리더 서열을 암호한다. 마지막으로, N-Q 치환으로 인하여, 이 작제물에 의해 돌연변이 동물의 유액에 생성되는 MSP는 N-글리코실화되지 않을 것이다. 이를 종합해 보면, BC718에 의해 유액에 생성되는 돌연변이 MSP는 기생체 MSP와 동일한 것이다.
플라스미드 BC718로부터 SalI/XhoI 단편을 제조한 뒤, 마우스 배로 미량주입하여 돌연변이 마우스를 제조하였다. 돌연변이 동물은 전술한 바와 같이 동정하였다. 기초 마우스 암컷 유래의 유액을 수집하고 항체 5.2를 사용하여 웨스턴 블롯 분석하였다. 그 결과는 도 13에 도시하였는데, 비글리코실화 MSP1 발현량이 0.5 내지 1 ㎎/㎖ 농도인 것으로 나타났다.
균등물
당업자라면 통상의 실험만을 사용하여 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주되고 다음 청구의 범위에 포함되는 다양한 균등물을 제조할 수 있다는 것은 자명한 것이다.
Claims (26)
- 유전자내의 1 이상의 AT 함유 코돈을, 치환되는 코돈과 동일한 아미노산을 암호하는 바람직한 코돈으로 치환시켜 유전자의 AT 함량을 감소시키는 변형을 포함하는 것이 특징인, 포유 동물 세포에서 발현될 수 있는 기생체의 공지된 핵산의 변형체.
- 유전자 암호 서열내 존재하는 1 이상의 mRNA 불안정성 모티프를, 치환되는 코돈과 동일한 아미노산을 암호하는 바람직한 코돈으로 치환시켜 상기 불안정성 모티프를 제거한 것이 특징인, 포유 동물 세포내에서 발현될 수 있는 기생체 단백질의 공지된 핵산의 변형체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 공지 유전자의 1 이상의 코돈이, 치환되는 코돈과 동일한 아미노산을 암호하는 바람직한 유단백질 특이적 코돈으로 치환된 것이 특징인 핵산의 변형체.
- 유단백질 특이적 코돈으로 치환시켜 암호성 공지 유전자의 총 AT 함량이 저하시키고, 유단백질 특이적 코돈으로 치환시켜 상기 유전자 중에 존재하는 1 이상의 mRNA 불안정성 모티프를 제거하고, 천연 유전자의 1 이상의 코돈을 바람직한 유단백질 특이적 코돈으로 치환시킨 것이 특징인, 포유 동물 세포에서 발현될 수 있는 기생체의 공지된 핵산의 변형체.
- 제4항에 있어서, 변형된 핵산이 시험관내 또는 생체내 포유 동물 세포계에서 천연 유전자에 의해 발현되는 농도의 최소 100%에 해당하는 농도로 단백질을 발현시킬 수 있는 것이 특징인 핵산의 변형체.
- 천연 유전자의 1 이상의 AT 함유 코돈을, 이 치환되는 코돈과 동일 아미노산을 암호하는 바람직한 유방 특이적 코돈으로 치환시켜 천연 유전자의 AT 함량을 저하시키는 것을 포함하여, 포유 동물 세포내에서 발현시키기 위한 기생체의 공지 핵산의 변형체를 제조하는 방법.
- 유전자 암호 서열 중에 존재하는 1 이상의 mRNA 불안정성 모티프를, 이 치환되는 코돈과 동일한 아미노산을 암호하는 유방 특이적 코돈으로 치환시켜 상기 유전자 중의 1 이상의 mRNA 불안정성 모티프를 제거하는 것을 포함하여, 포유 동물 세포내에서 발현시키기 위한 기생체 단백질의 공지 핵산의 변형체를 제조하는 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 단백질을 암호하는 천연 유전자 중의 1 이상의 코돈을, 이 치환되는 코돈과 동일한 아미노산을 암호하는 바람직한 유방 특이적 코돈으로 치환시키는 것을 더 포함하는 것이 특징인 방법.
- 제5항 또는 제6항에 기재된 방법에 의해 제조되는 변형된 핵산 서열.
- a) 단백질을 암호하는 천연 유전자 중에 존재하는 1 이상의 mRNA 불안정성 모티프를, 이 치환되는 코돈과 동일한 아미노산을 암호하는 바람직한 유단백질 특이적 코돈으로 치환시켜 상기 유전자 중의 1 이상의 mRNA 불안정성 모티프를 제거하는 단계,b) 상기 단백질을 암호하는 천연 유전자의 1 이상의 AT 함유 코돈을, 이 치환되는 코돈과 동일한 아미노산을 암호하는 유단백질 특이적 코돈으로 치환시켜 상기 유전자의 AT 고밀도 함량을 저하시키는 단계, 및c) 상기 단백질을 암호하는 천연 유전자 중의 1 이상의 코돈을, 이 치환되는 코돈과 동일한 아미노산을 암호하는 바람직한 유방 특이적 코돈으로 치환시키는 단계를 포함하여, 포유 동물 세포 중에서 발현시키기 위한 기생체의 공지된 핵산 변형체를 제조하는 방법.
- 제10항에 기재된 방법으로 제조되는 변형된 핵산.
- 제1항에 있어서, 기생체가 말라리아이고, 핵산이 서열 번호 1 또는 서열 번호 9의 단편 또는 이것과 특이적 상동성인 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 변형체.
- 제1항에 있어서, 기생체가 말라리아이고, 핵산이 서열 번호 9의 서열 또는 이의 단편 또는 이 서열에 특이적 상동성인 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 변형체.
- 1 이상의 코돈을, 이 치환되는 코돈과 동일한 아미노산을 암호하지만 천연 유전자의 총 AT 함량을 효과적으로 저하시켜 세포 배양계가 인식할 수 있는 코돈으로 치환시켜 천연 유전자의 AT 함량을 저하시킨 것이 특징인, 세포계에서 발현될 수 있는 서열 번호 1의 단편 또는 이 서열에 특이적 상동성이 있는 서열인 핵산 변형체.
- 천연 유전자 암호 서열 중에 존재하는 1 이상의 mRNA 불안정성 모티프를 포함하는 1 이상의 코돈을, 이 불안정성 모티프는 효과적으로 제거하고, 치환되는 코돈과 동일한 아미노산을 암호하여 상기 세포계가 인식할 수 있는 코돈으로 치환시켜 상기 1 이상의 불안정성 모티프를 제거한 것이 특징인, 세포계에서 발현될 수 있는 서열 번호 1의 단편 또는 이 서열에 특이적 상동성이 있는 서열인 핵산 변형체.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 천연 유전자의 1 이상 코돈 또는 모든 코돈이 상기 세포계의 바람직한 코돈으로 치환된 것이 특징인 핵산 변형체.
- 제12항에 기재된 핵산 변형체를 포함하는 벡터.
- 제17항에 기재된 벡터로 형질감염되거나 형질전환된 숙주 세포.
- 제12항에 기재된 핵산 변형체를 포함하는 돌연변이 발현 작제물.
- 제12항에 기재된 핵산 변형체를 포함하는 배선을 보유한 인간을 제외한 돌연변이 동물.
- 제12항에 기재된 핵산 변형체에 작동가능하게 결합되고, 그 핵산 변형체에 의해 암호되는 단백질의 유선 발현을 동물의 유액으로 유도하는 프로모터를 포함하는 것이 특징인, 돌연변이 동물 제조용 돌연변이 발현 벡터.
- 치환된 코돈과 동일한 아미노산을 암호하지만, 천연 유전자의 총 AT 고밀도 함량을 유효하게 저하시켜 세포계가 인식할 수 있는 코돈으로 1 이상의 코돈을 치환시켜 유전자의 AT 함량을 저하시킨 것이 특징인, 세포계에서 발현될 수 있는 박테리아, 바이러스 또는 기생체 유래의 공지 핵산의 변형체.
- 유전자 암호 서열내 존재하는 1 이상의 mRNA 불안정성 모티프를 포함하는 1 이상의 코돈을, 이 불안정성 모티프를 유효하게 제거하고 치환되는 코돈과 동일한 아미노산을 암호하여 세포계가 인식할 수 있는 코돈으로 치환시켜 상기 1 이상의 불안정성 모티프를 제거한 것이 특징인, 세포계에서 발현될 수 있는 박테리아, 바이러스 또는 기생체의 핵산 변형체.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 천연 유전자의 1 이상의 코돈 또는 모든 코돈이 세포계의 바람직한 코돈으로 치환된 것이 특징인 핵산 변형체.
- 제24항에 기재된 핵산 변형체를 포함하는 DNA 백신.
- 제17항에 기재된 벡터를 포함하는 DNA 백신.
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