HUT60523A - Improved process for expressing polypeptides - Google Patents

Abstract

This invention relates to processes and intermediates for improving the level of production of a desired polypeptide in a recombinant host whose genome has integrated into it an island of expression comprising in the 5' to 3' direction, a 5' flanking region, the heterologous polypeptide encoding sequence and a 3' flanking region. The island of expression of this invention permits the expression of the integrated heterologous DNA sequence to be substantially dependent on its copy number and to be substantially independent of its position of integration in the host genome.

Description

A jelen találmány eljárásokkal és intermedierekkel foglalkozik egy kívánt polipeptid termelési szintjének javítására valamely rekombináns gazdaszervezetben. Pontosabban a jelen találmány a kifejezési sziget-tel foglalkozik - ez olyan DNS szegmens, amely egy heterológ polipeptidet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz -, valamint foglalkozik a kifejezési szigetnek alkalmazásával egy gazdaszervezet átfertőzésére. A kifejezésnek ezt a szigetét magában foglaló gazdaszervezetek meglepően magas szinten termelik a kívánt heterológ polipeptidet. A kifejezési szigetnek beépülése egy gazdaszervezetbe lehetővé teszi, hogy a kifejezendő kívánt polipeptid lényegében független legyen integrálódási helyétől a gazdaszervezet genomban, viszont lényegében függő legyen a kifejezési sziget kópiáinak számától, amelyek integrálódnak a gazdaszervezet genomban.The present invention relates to methods and intermediates for improving the level of production of a desired polypeptide in a recombinant host. More particularly, the present invention relates to an expression island, a DNA segment comprising a DNA sequence encoding a heterologous polypeptide, and to the use of an expression island to infect a host organism. Host organisms comprising this island of the term produce surprisingly high levels of the desired heterologous polypeptide. Incorporation of the expression island into a host allows the desired polypeptide to be expressed to be substantially independent of its site of integration in the host genome, but substantially dependent on the number of copies of the expression island that integrate in the host genome.

A szakterületen jól ismert, hogy a polipeptideket ki lehet fejezni és ki lehet választani olyan gazdaszervezetek révén, amelyek a nevezett polipeptidet kódoló DNS szekvenciával vannak átfertőzve vagy transzformálva. Ezzel kapcsolatban pl. az alábbi irodalmi helyek: Gilbert és munkatársai: 4,565,785 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1986); VillaKomaroff L. és munkatársai: A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7 5 , 3727-31 ( 1978), bemutatják, hogy egy kiválasztott polipeptidet szintetizálhatunk egy bakteriális gazdaszervezeten belül és kiválaszthatjuk a sejtmembránon át. Hasonló munkafolyamatot lehet elvégezni állati sejtekben is £Doehmer J. és munkatársai: Introduction of Rat Growth Hormoné Gene Intő Mouse Fibroblasts Via A Retroviral DNA Vector: Expression And Regulation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2268-72 (1982)7. Rekombináns fehérjéket kifejeztek még em ősökben is egy kifejező rendszer transzgenikus beépítésével egy megtermékenyített embrió pronukleuszába ^Bucchini 0. és munkatársai: Pancreatic Expression Of Humán Insulin Gene In Transgeni_c Mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8J5, 2511-15 ( 1986); Gordon K. és munkatársai: Production Of Hdman Tissue Plasminogen Activator In Transgenic Mousg Milk, Bio/Technology 5/11), 118387 (1987)].It is well known in the art that polypeptides can be expressed and selected by host organisms that are transfected or transformed with the DNA sequence encoding said polypeptide. For example, Gilbert et al., U.S. Patent 4,565,785 (1986); VillaKomaroff L. et al., Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3727-31 (1978), disclose that a selected polypeptide can be synthesized within a bacterial host and can be secreted through the cell membrane. A similar workflow can be performed in animal cells. £ Doehmer, J., et al., Introduction to Rat Growth, Hormone Gene, Ind. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2268-72 (1982). Recombinant proteins expressed at even em stem orchards a transgenic expression systems incorporating a fertilized embryo pronuclei ^ 0. Bucchini et Pancreatic Expression Of Human Insulin Gene In Transgene _c Mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8J5, 2511-15 (1986); Gordon, K., et al., 1987, Production of Hdman Tissue Plasminogen Activator In Transgenic Mousg Milk, Bio / Technology 5/11).

Jelenleg azonban meg ezen technikák egyike sem sikeres következetesen olyan értelemben, hogy lehetővé tenné valamely kívánt heterológ polipeptid nagy mennyiségű kifejezését olyan gazdaszervezet révén, amely valamely heterológ polipeptidet kódoló szekvenciát integrált a genomjába. Ez különösen meglepő, ha tekintetbe vesszük a teljesen azonos kifejező kontroll szekvenciákból eredő magas szintű natív fehérje termelést natív környezetben. így pl. a tej-specifikus kifejező kontroll szekvenciák lehetővé teszik, hogy nagy mennyiségű fehérje, pl. kazein képződjék az emlős mirigyekben és választódjék ki onnan. A teljesen azonos tej-specifikus kifejező kontroll szekvenciákról azonban nem mutatták még ki, hogy nagy mennyiségű heterológ polipeptidet indukálnának, amikor operatívan össze vannak kapcsolva heterológ polipeptidet kódoló szekvenciákkal ^lásd pl. Pittins C.W. és munkatársai: A Milk Protein Gene Promoter Directs The Expression of Humán Tissue Plasminogen Activator cDNA To The Mammary Gland In Transgenic Mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5874-78 (1988)] . A kifejezés szintje ez utóbbi konstrukciókban függ a gazdaszervezet genomba integrálódott, a heterológ polipeptidet kódoló szekvencia kópiaszámától is. Ezen kívül a kifejeződés szintje a helyi hatásoknak is alá van vetve, vagyis ez a kifejeződési szint függ attól, hogy a heterológ polipeptidet • · · · ·· ·« ·· · • · · · «· ····· • ·· · · *···· kódoló szekvencia hol integrálódott a genomba ^Lee K.F. és munkatársai: Tissue-Specific Expression Of The Rat Béta Casein Géné In Transgenic Mice , Nucleic AcidsHowever, at present none of these techniques is consistently successful in the sense that it allows large amounts of a desired heterologous polypeptide to be expressed by a host integrating a heterologous polypeptide coding sequence into its genome. This is particularly surprising when one considers the high level of native protein production resulting from identical expression control sequences in the native environment. so e.g. milk-specific expression control sequences allow large amounts of protein, e.g. casein is formed in and secreted from mammalian glands. However, identical milk-specific expression control sequences have not yet been shown to induce large amounts of heterologous polypeptide when operatively linked to sequences encoding heterologous polypeptide. Pittins C.W. et al., The Milk Protein Gene Promoter Directs The Expression of Human Tissue Plasminogen Activator cDNA To The Mammary Gland In Transgenic Mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5874-78 (1988)]. The level of expression in the latter constructs also depends on the copy number of the sequence encoding the heterologous polypeptide integrated into the host genome. In addition, the level of expression is also subject to local effects, that is, the level of expression depends on the heterologous polypeptide. · · * ···· where the coding sequence is integrated into the genome ^ Lee KF et al: Tissue-Specific Expression Of The Rat Beta Casein Gene In Transgenic Mice, Nucleic Acids

Rés. 16/3), 1027-41(1988)].Gap. 16/3), 1027-41 (1988)].

Következésképpen fennáll az igény egy olyan eljárásra, amely növeli egy heterológ fehérjét vagy polipeptidet kódoló DNS szekvencia kifejeződését a gazdaszervezet genomban történő integrálódás helyétől függetlenül. Ezen kívül az ilyen eljárá soknak olyan kifejezést kell nyújtaniok, amely függ a gazdaszer vezet genomba integrálódott kópiaszámtól, úgy, hogy a kifejező dési szint szabályozható legyen.Consequently, there is a need for a method that increases expression of a DNA sequence encoding a heterologous protein or polypeptide, regardless of the site of integration into the host genome. In addition, such methods should provide an expression that depends on the copy number integrated into the host genome, so that the level of expression can be controlled.

A jelen találmány megoldja ezeket a problémákat olyan módon, hogy a kifejezési sziget-et szolgáltatja, amely egy kívánt heterológ polipeptidet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz. A jelen találmány szerinti kifejezési sziget első ízben nyújtja egy heterológ polipeptidet kódoló DNS szekvencia magas szintű, helytől független, de a kópiaszámtól függő kifejeződését.The present invention solves these problems by providing an expression island comprising a DNA sequence encoding a desired heterologous polypeptide. The expression island of the present invention provides, for the first time, high-level, site-independent but copy-dependent expression of a DNA sequence encoding a heterologous polypeptide.

Amint az 1. ábrában bemutatjuk, a jelen találmány szerinti kifejezési sziget 5’ —>3’ irányban az alábbiakat tartalmazza: egy 5’ szegélyező terület, egy heterológ polipeptidet kódoló szekvencia (amely a kívánt heterológ fehérjét vagy polipeptidet kódolja), és egy 3’ szegélyező terület. Az 5’ szegélyező terület 5’ —5’ irányban az alábbiakat tartalmazza: 5’ kifejező kontroll szekvenciák, és egy 5’ nem transzlatált terület. A kifejező kontroll szekvenciák működőképesen kapcsolódnak a heterológ polipeptidet kódoló szekvenciához. Az 5’ nem transzlatált terület egy transzlációs iniciációs helynél kezdődik és a heterológ polipeptidet kódoló szekvencia transzlációs rajthelyével végződik. A 3’ szegélyező terület az 5’ --> 3’ irányban az alábbiakat tartalmazza: egy 3’ nem transzlatált terület, és 3’ kifejezőAs shown in Figure 1, the expression island of the present invention comprises in the 5 'to 3' direction: a 5 'flanking region, a coding sequence for a heterologous polypeptide (encoding the desired heterologous protein or polypeptide), and a 3' border area. The 5 'flanking region in the 5' to 5 'direction comprises 5' expressing control sequences and a 5 'untranslated region. Expression control sequences are operably linked to the heterologous polypeptide coding sequence. The 5 'untranslated region begins at a translation initiation site and ends at the translation start site of the sequence encoding the heterologous polypeptide. The 3 'flanking region in the 5' to> 3 'direction includes a 3' untranslated region and a 3 'expressing region

- 5 kontroll szekvenciák, ahol a kontroll szekvenciák működőképesen össze vannak kapcsolva a heterológ polipeptidet kódoló szekvenciával. Végül a találmány szerinti kifejezési sziget 5’ és 3’ szegélyező területeit megfelelő méret és szerkezet jellemzi, amely hatásosan változtatja meg a kívánt fehérje vagy polipeptid termelési szintjét lényegében függően a gazdaszervezet genomjába integrálódott kifejezési sziget kópiaszámától és lényegében függetlenül ezek integrálódási helyétől.5 control sequences, wherein the control sequences are operably linked to a coding sequence for a heterologous polypeptide. Finally, the 5 'and 3' flanking regions of the expression island of the invention are characterized by an appropriate size and structure that effectively alter the level of production of the desired protein or polypeptide substantially depending on the copy number integrated into the host genome and substantially independent of their site of integration.

A találmány foglalkozik a kifejezési sziget alkalmazásával valamely gazdaszervezet átfertőzésére, és foglalkozik ezekkel az átfertőzött gazdaszervezetekkel. Azok a gazdaszervezetek, amelyek genomjukba integrálták a kifejezési szigetet, magas szinten termelik azt a heterológ polipeptidet, amelyet egy, ezen a kifejezési szigeten belül levő DNS szekvencia kódol. Ez a szignál szekvencia kódoló terület fuzionálva van a heterológ polipeptidet kódoló szekvencia 5’ végéhez, és azonos leolvasó keretüen van azzal. A szignál szekvenciát kódoló terület működőképesen össze van kapcsolva a kifejezés kontroll szekvenciákkal is úgy, hogy a gazdaszervezet, amelynek genomja ezt a kifejezési szigetet hordozza, képes legyen termelni, kiválasztani, és előnyösen fel is dolgozni a kívánt fehérjét vagy polipeptidet a kombinált szignál-heterológ polipeptid kódoló szekvencia által kódolt elő-fehérjéból vagy elő-polipeptidből.The present invention relates to the use of an expression island for the transfection of a host organism and relates to these transfected host organisms. Hosts that have integrated the expression island into their genome produce high levels of the heterologous polypeptide encoded by a DNA sequence within this expression island. This signal sequence coding region is fused to the 5 'end of the heterologous polypeptide coding sequence and has the same reading frame. The coding region of the signal sequence is also operably linked to expression control sequences such that the host whose genome bears this expression island is capable of producing, selecting for and preferably processing the desired protein or polypeptide of the combined signal heterologous polypeptide. a pre-protein or a pre-polypeptide encoded by a coding sequence.

Az alábbiakban röviden ismertetjük, az ábrákat.The following is a brief description of the figures.

Az 1. ábra egy jelen találmány szerinti tipikus kifejezési sziget (A) és egy előnyös kifejezési sziget (B) vázlatos bemutatása.Figure 1 is a schematic representation of a typical expression island (A) and a preferred expression island (B) of the present invention.

A 2. ábra szarvasmarha alfa S-l kazein 5’ és 3’ szegélyező területeit tartalmazó plazmid (CAS 1288) megalkotását ábrázolja.Figure 2 depicts the construction of a plasmid (CAS 1288) containing the 5 'and 3' flanking regions of bovine alpha S-1 casein.

• ··· ··· · · • · · · · · · • · · · ·• ··· ··· · · · · · · · · · · · · ·

- 6 A 3. ábra az urokináz strukturgén bevezetését ábrázolja CAS 1288-bahogy kialakuljon a CAS 1295, a kifejezési sziget.Figure 6 depicts the introduction of the urokinase structural gene CAS 1288 to form CAS 1295, the expression island.

Abból a célból, hogy az itt bemutatott találmány könnyebben legyen megérthető, az alábbi részletes leírást adjuk.In order that the invention disclosed herein may be more readily understood, the following detailed description is set forth.

A leírásban az alábbi fogalmakat alkalmazzuk:The following terms are used in this description:

Kifejezés kontroll szekvenciák --- olyan szekvenciák, amelyek ellenőrzik és szabályozzák géntermékek kifejezését mind transzkripciós (átírási), mind transzlációs szinten, amikor operatívan (működőképesen) kapcsolódnak valamely strukturgénhez (egy polipeptidet kódoló DNS-hez). Ezek magukban foglalják a promotor és fokozó (enhancer) területeket, riboszóma kötőhelyekéi· , poliadenilező szignálokat és más olyan szekvenciákat, amelyek gének kifejezéséhez hasznosan.Expression control sequences --- sequences that control and regulate the expression of gene products both at the transcription (transcription) and translation levels when operatively linked to a structural gene (DNA encoding a polypeptide). These include promoter and enhancer regions, ribosome binding sites, polyadenylation signals, and other sequences useful for the expression of genes.

Működőképesen (operatívan) kapcsolt --- 5’ és 3’ kifejezés kontroll szekvenciák összekapcsolása valamilyen heterológ polipeptidet kódoló szekvenciával úgy, hogy a kifejezés kontroll szekvenciák képesek legyenek szabályozni és ellenőrizni a heterológ polipeptid kifejezését és termelését.Coupling operably linked --- 5 'and 3' expression control sequences to a coding sequence for a heterologous polypeptide such that the expression control sequences are capable of controlling and controlling the expression and production of the heterologous polypeptide.

Heterológ polipeptidet kódoló szekvencia --- egy kívánt fehérjét vagy polipeptidet kódoló szekvencia, amely egy gazdaszervezet genomjába van iktatva. Ez a DNS szekvencia olyan polipeptidet kódol, amely heterológ a gazdaszervezetre, a szegélyező szekvenciákra vagy mindkettőre nézve. A heterológ polipeptidet kódoló szekvencia adott esetben saját transzlációs stop kodont tartalmaz 3’ végén. A heterológ polipeptidet kódoló szekvencia tartalmazhat saját szignál szekvencia kódoló területet is.Heterologous polypeptide coding sequence - a coding sequence for a desired protein or polypeptide inserted into the genome of a host. This DNA sequence encodes a polypeptide that is heterologous to the host organism, flanking sequences, or both. The heterologous polypeptide coding sequence optionally contains its own translation stop codon at the 3 'end. The heterologous polypeptide coding sequence may also comprise its own signal sequence coding region.

Szignál szekvencia kódoló terület --- olyan DNS szekvencia, amely egy szignál peptidnek nevezett, tipikusan hidrofób aminosavakból álló szekvenciát kódol. A szignál peptid lehetővé teszi, hogy egy polipeptid, amely hozzá kötődik, át tudjon jutni egy biológiai membránon.Signal sequence coding region --- a DNA sequence that encodes a sequence typically called a hydrophobic amino acid called a signal peptide. The signal peptide allows a polypeptide that binds to it to pass through a biological membrane.

Kifejezési sziget---DNS konstrukció, amely 5’ —> 3’ irányban az alábbiakat tartalmazza: egy 5’ szegélyező terület, egy heterológ polipeptidet kódoló szekvencia, és egy 3’ szegélyező terület. Az 5’ és 3’ szegélyező területek megfelelő méretűek és szerkezetűek ahhoz, hogy a kívánt fehérje vagy polipeptid termelési szintje lényegében függő legyen a gazdaszervezet genomjába beépült kifejezési sziget konstrukció kópiaszámától, viszont lényegében független legyen a kifejezési sziget integrálódásának helyétől a gazdaszervezet genomján belül.An expression island --- DNA construct comprising a 5 'flanking region, a sequence encoding a heterologous polypeptide, and a 3' flanking region in the 5 'to 3' direction. The 5 'and 3' flanking regions are sized and structured such that the level of production of the desired protein or polypeptide is substantially dependent on the copy number of the expression island construct incorporated into the host genome, but substantially independent of the site of integration of the expression island within the host genome.

5’ szegélyező terület ---a kifejezési sziget azon része, amely a heterológ polipeptidet kódoló szekvenciától 5’ irányban van. Ez - 5’ —> 3’ irányban - az alábbiakat foglalja magában: 5’ kifejezés kontroll szekvenciák és egy 5’ nem transzlatált terület; a kifejezés kontroll szekvenciák működőképesen össze vannak kapcsolva a heterológ polipeptidet kódoló szekvenciával. Az 5’ nem transzlatált terület tipikusan egy transzkripciós iniciációs helytől a heterológ polipeptidet kódoló szekvencia transzlációs rajthelyéig terjed.5 'flanking region --- that portion of the expression island 5' to the heterologous polypeptide coding sequence. This includes, in the 5 'to> 3' direction, the following: 5 'expression control sequences and a 5' untranslated region; the expression control sequences are operably linked to a sequence encoding the heterologous polypeptide. The 5 'untranslated region typically ranges from a transcription initiation site to a translation start site of a sequence encoding a heterologous polypeptide.

3’ szegélyező terület --- a kifejezési sziget azon része, amely a heterológ polipeptidet kódoló szekvenciától 5’ irányban van. Ez - 5’ —> 3’ irányban - az alábbiakat foglalja magában: egy 3’ nem transzlatált terület, és 3’ kifejezés kontroll szekvenciák. A 3’ szegélyező terület magában foglalhatja a strukturgénből a 3’ szegélyező területtel eredetileg is társult kódoló szekvencia egészét vagy egy részét.3 'flanking region --- that portion of the expression island 5' to the heterologous polypeptide coding sequence. This includes, in the 5 '-> 3' direction, a 3 'untranslated region and a 3' expression control sequence. The 3 'flanking region may comprise all or part of the coding sequence originally associated with the structural gene to the 3' flanking region.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.The present invention is described in detail below.

Bár nem szándékozunk semmiféle elmélethez kötődni, úgy véljük, hogy a kifejezési sziget lehetővé teszi az 5’ és 3’ • · · · • * . ····«·····« t Τ ·········· • · ·· ·« ·· ·While not intended to be bound by any theory, we believe that the expression island allows 5 'and 3' • · · · • *. · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·Bar - eng

- 8 szegélyező területeken belül levő, még meg nem határozott faktorok számára, hogy működtessék a kifejezés kontroll szekvenciákat és lehetővé tegyék, hogy a heterológ polipeptidet kódoló szekvencia magasabb termeléssel fejeződjék ki. A kifejezés függ a gazdaszervezet genomjába beépült kifejezési sziget konstrukció kópiaszámától, így lehetővé válik, hogy a polipeptid termelés szintjét változtathassuk.- 8 undefined factors within the flanking regions to operate the expression control sequences and allow the heterologous polypeptide coding sequence to be expressed in higher production. The expression depends on the copy number of the expression island construct incorporated into the host genome, thus allowing the level of polypeptide production to be varied.

A jelen találmány szerinti kifejezési sziget nagy 5’ és 3’ szegélyező területet egy puffer zónát is szolgáltatnak úgy, hogy a kifejezés kontroll szekvenciákat izoláljuk a gazdaszervezet kifejezés kontroll szekvenciáiból, amelyeket azután az a környező DNS alkalmazhat, amelybe a kifejezési sziget integrálódott. Ennél fogva mindegy, hogy a kifejezési sziget a gazdaszervezet genomjában hol integrálódik; a heterológ polipeptidet kódoló szekvencia ettől függetlenül magas szinten fejeződik ki. Ez magával hordozza saját genomikus szerkezetét, így lesz belőle kifejezési sziget .The expression island of the present invention also provides a large 5 'and 3' flanking region with a buffer zone such that expression control sequences are isolated from host expression control sequences which can then be used by the surrounding DNA to which the expression island is integrated. Therefore, it does not matter where the expression island is integrated into the host genome; the sequence encoding the heterologous polypeptide is nonetheless expressed at high levels. It carries its own genomic structure, making it an expression island.

Bár nem kívánunk egyetlen elmélethez sem kötődni, úgy véljük, hogy a DNS azon területeinek többsége, amelyek fokozhatják a kifejeződést a kifejezés kontroll szekvenciákból, egy adott strukturgén 5’ és 3’ szegélyező szekvenciáiban található. Ennél fogva egy strukturgén izolálása után 5’ és 3’ szegélyező területeikkel együtt a strukturgén részben vagy egészben kimetszhető és helyettesíthető bármely heterológ polipeptidet kódoló szekvenciával olyan módon, hogy lehetővé váljék a kifejezés olyan szinten, amely az eredeti strukturgén kifejezésének felel meg. Egy másik eljárás szerint a heterológ polipeptidet kódoló szekvenciát beiktathatjuk a strukturgén 5’ végénél a gén egyidejű eltávolítása nélkül. Ebben a kiviteli módban a heterológ polipeptidet kódoló szekvencia szintén kifejezhető olyan szinten, * ·.· * * « • ···«······« • ·· · · ····« •β ·· ·« ·· ·While not wishing to be bound by any theory, it is believed that most of the DNA regions that may enhance expression from expression control sequences are located in the 5 'and 3' flanking sequences of a particular structural gene. Therefore, after isolation of a structural gene, together with their 5 'and 3' flanking regions, the structural gene may be partially or completely excised and replaced with a coding sequence for any heterologous polypeptide so as to allow expression at a level corresponding to that of the original structural gene. Alternatively, the sequence encoding the heterologous polypeptide may be inserted at the 5 'end of the structural gene without simultaneous deletion of the gene. In this embodiment, the sequence encoding the heterologous polypeptide can also be expressed at a level such as β ························································ · · · ·

- 9 amely az eredeti strukturgén kifejeződési szintjének felel meg.- 9 corresponding to the level of expression of the original structural gene.

A kifejezés kontroll szekvenciák közül a jelen találmány különböző kiviteli módjaiban azok használhatók, amelyek magas szinten irányítják a kifejezést sejtek bizonyos típusaiban, illetve a sejtnövekedés vagy differenciálódás adott stádiumaiban, vagy speciális tenyésztési körülméryek között. A jelen találmány szerinti transzgenikus gazdaszervezetben előnyösek a szövet-fajlagos kifejezés kontroll szekvenciák.Among the expression control sequences used in the various embodiments of the present invention are those that direct expression at a high level in certain types of cells or at particular stages of cell growth or differentiation or in specific culturing conditions. Tissue specific expression control sequences are preferred in the transgenic host of the present invention.

Ha emlős gazdasejteket alkalmazunk, a hasznos kifejezés szabályozó szekvenciák a gazdasejtből magából származhatnak, mégpedig olyan natív szekvenciákból, amelyek egy magas szinten kifejezett terméket kódolnak. Származhatnak azonban más magas szinten kifejeződő eukarióta génekből is, pl. p-aktint, kollagént, miozint, albumint, metallotioneint vagy humán növekedési hormont kódoló génekből.When mammalian host cells are used, useful expression control sequences may be derived from the host cell itself, namely native sequences encoding a highly expressed product. However, they may also be derived from other high-level eukaryotic genes, e.g. genes encoding p-actin, collagen, myosin, albumin, metallothionein or human growth hormone.

A jelen találmány egy előnyös kiviteli módja fehérjék termelését idézi elő transzgenikus emlősökben. Ez a kiviteli mód előnyösen olyan kifejezés kontroll szekvenciákat alkalmaz, amely szabályozza és ellenőrzi a géntermékek kifejeződését emlős szövetekben( ilyen kifejezés kontroll szekvenciák pl. a kazein promotorok és a béta laktoglobulin promotor. A kazein promotorok pl. az alábbiak lehetnek: alfa kazein promotor, béta kazein promotor, vagy kappa kazein promotor. A kazein promotor és az ezzel társult kifejezés kontroll szekvenciák előnyösen szarvasmarha eredetűek, és legelőnyösebben ezek az alfa S-l kazein promotor és az ezzel társult kifejezés kontroll szekvenciák.A preferred embodiment of the present invention provides for the production of proteins in transgenic mammals. Preferably, this embodiment utilizes expression control sequences that regulate and control expression of gene products in mammalian tissues (such as control sequences, e.g., casein promoters and beta-lactoglobulin promoter. Casein promoters include, for example: alpha casein promoter, beta casein promoter or kappa casein promoter The casein promoter and associated expression control sequences are preferably of bovine origin and most preferably these are the alpha S1 casein promoter and associated expression control sequences.

A kifejezés kontroll szekvenciák származhatnak akár közvetlenül azokból a sejtekből is, amelyeket gazdaszervezetként szándékozunk használni a kifejezési sziget konstrukcióhoz. Először is azonosítani kell a gazdaszervezetben az aktivitás kívánt • · · szintjével bíró promotort és az ezzel társult kifejezés kontroll szekvenciákat. A kifejezési szigetet úgy kell tervezni, hogy a kifejezési sziget konstrukció, amely a gazdaszervezet genomjában integrálódik, kópiaszám-függően, de helytől függetlenül fejeződjék ki .Expression control sequences may also be derived directly from cells intended to be used as host for the expression island construct. First, the promoter with the desired level of activity in the host and the associated expression control sequences must be identified. The expression island should be designed such that the expression island construct, which is integrated into the host genome, is expressed in a copy-dependent but independent manner.

Az alábbiakban eljárásokat írunk le kifejezés kontroll szekvenciák azonosítására, az ezeket a szekvenciákat tartalmazó szükséges szegélyező területek klónozására,a heterológ polipeptidet kódoló szekvencia hozzáadására, és annak vizsgálatára, vajon az így létrejött konstrukció találmányunk szerinti kifejezési sziget-e?The following describes methods for identifying expression control sequences, cloning the required flanking regions containing these sequences, adding a sequence encoding the heterologous polypeptide, and testing whether the resulting construct is an expression island of the invention.

Az első lépés az, hogy meghatározzuk azt a gazdaszervezetet és azokat a követelményeket, amelyel lehetővé teszik, hogy a gazdaszervezet magas szinten vagy speciális időpontokban legyen képes kifejezni. Szövettenyészet esetében előnyösen alkalmazhatók a VERAX rendszerben található kollagén gyöngyökön növekedő CHO sejtek .The first step is to determine the host and the requirements to allow the host to express at a high level or at specific times. For tissue culture, CHO cells growing on collagen beads in the VERAX system are preferred.

Abból a célból, hogy egy homológ génre kifejezés kontroll szekvenciákat izoláljunk, amelyek a gazdasejtekben jól megválasztott körülmények között magas szinten fejeződnek ki, egy dúsan kifejezett RNS fajtát kell azonosítanunk. Ezt úgy érhetjük el, hogy egy kiválasztott indukciós és növekedési körülmények között kiválasztott gazdasejtekből izolált poliA RNS-ből cDNS könyvtárat készítünk. A cDNS könyvtárat azután átvizsgáljuk olyan RNS jelzett alikvotját alkalmazva, amelyből a cDNS könyvtárat kialakítottuk. A leginkább pozitív szignálok jelzik azokat a cDNS-eket, amelyek RNS-ei a legdúsabbak a gazdasejtekben a kiválasztott indukciós és növekedési körülmények között. A kiválasztott cDNS-eket azután felhasználhatjuk a kiválasztott gazdasejtekből készített genomikus DNS könyvtárak átvizsgálására • * · ··· ···«· • ·· · « »·«·« abból a célból, hogy megtaláljuk azokat a genomikus DNS szekvenciákat, amelyek a legdúsabb RNS-eknek felelnek meg. Ezeket a genomikus szekvenciákat, tipikusan kozmidokban ΓManiatis T. és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1982)J , azután elemezhetjük, hogy meghatározzuk a kozmidban a restrikciós helyeket, a szegélyező szekvenciák mennyiségét és a polipeptidet kódoló területeket.In order to isolate expression sequences for a homologous gene that are expressed at high levels in well-selected host cells, a highly expressed RNA species must be identified. This can be achieved by constructing a cDNA library of polyA RNA isolated from selected host cells under selected induction and growth conditions. The cDNA library is then screened using a labeled aliquot of RNA from which the cDNA library was constructed. The most positive signals indicate the cDNAs whose RNA is most abundant in the host cells under the selected induction and growth conditions. Selected cDNAs can then be used to screen for genomic DNA libraries prepared from selected host cells to find the genomic DNA sequences that correspond to the richest RNAs. These genomic sequences, typically in cosmids ΓManiatis T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) J, can then be analyzed to determine restriction sites, amount of flanking sequences and regions encoding the polypeptide in the cosmid.

Egy másik, de kevésbbé előnyös eljárás szerint a kifejezés kontroll szekvenciákat izolálhatjuk olyan módon is, hogy egy kiválasztott körülmények közt nőtt és indukált gazdasejteket átvizsgálunk dúsan termelt fehérjére vagy polipeptidre. Ezt úgy érhetjük el, hogy a gazdaszervezetben termelt összes polipeptidet elemezzük vagy SDS (nátrium-dodecil-szulfát)-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE), vagy kétdimenziós gélelektroforézissel. A legdúsabb polipeptidet a legerősebb csíkként azonosítjuk az SDS-PAGE elemzésben, vagy a legnagyobb foltként a kétdimenziós gélen. Miután azonosítottuk, a csíkot vagy foltot kimetszszűk a gélről, eluáljuk, és automatizált fehérje szekvenciaelemzésnek vetjük alá. A fehérje szekvenciaelemzésből kapott aminosav-szekvenciára alapozva azután szintetizáljuk a megfelelő oligonukleotidokat. Ezeket az oligonukleotidokat azután jelezhetjük és felhasználhatjuk vizsgáló mintaként (próbaként) megfelelő genomikus szekvenciák azonosítására a gazdasgjt DNS-ből alkotott kozmid könyvtárból.In another but less preferred method, expression control sequences may also be isolated by screening host cells grown and induced under selected conditions on a richly produced protein or polypeptide. This can be achieved by analyzing all polypeptides produced in the host either by SDS (sodium dodecyl sulfate) polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) or by two-dimensional gel electrophoresis. The most abundant polypeptide was identified as the strongest band in SDS-PAGE or as the largest spot on the two-dimensional gel. Once identified, the band or spot is excised from the gel, eluted and subjected to automated protein sequence analysis. Based on the amino acid sequence obtained from the protein sequence analysis, the corresponding oligonucleotides are then synthesized. These oligonucleotides can then be labeled and used as probes to identify appropriate genomic sequences from the cosmid library of the host cell DNA.

Amikor ennek a dúsan kifejezett génnek a kielégítően részletes térképét meghatároztuk, a strukturgén kódoló szekvenciáit és közbenső szekvenciáit a kozmidokból eltávolíthatjuk pl. megfelelő restrikciós enzimek segítségével, és a heterológ polipeptidet kódoló szekvenciával helyettesíthetjük. Egy másik módszer • · · · 4 «· • · *4 * •f· ··· ·Once a sufficiently detailed map of this richly expressed gene has been determined, the coding sequences and intermediate sequences of the structural gene can be removed from the cosmids, e.g. with appropriate restriction enzymes and may be replaced by a coding sequence for the heterologous polypeptide. Another Method • · · · 4 «· • · * 4 * • f · ··· ·

- 12 szerint a heterológ polipeptidet kódoló szekvenciát a strukturgéntől 5’ felé iktathatjuk be. Ebben az eljárásban a strukturgént nem kell kimetszeni. Egy előnyös kiviteli mód szerint a heterológ polipeptid urokináz, amelynek DNS szekvenciáját genomikus könyvtárból izoláljuk és klónozzuk, próbaként már publikált szekvenciákat alkalmazva [^Riccio A. és munkatársai: The Humán UrokinasePlasminogen Activator Gene And Its Promoter, Nucleic Acid Rés. 13(8) , 2759-71(1985)] .- 12, the sequence encoding the heterologous polypeptide may be inserted 5 'to the structural gene. In this procedure, the structural gene does not have to be excised. In a preferred embodiment, the heterologous polypeptide is a urokinase whose DNA sequence is isolated and cloned from a genomic library using probe published sequences [Riccio A. et al., The Human UrokinasePlasminogen Activator Gene And Its Promoter, Nucleic Acid Slit. 13 (8): 2759-71 (1985)].

Az így létrejövő konstrukció a heterológ polipeptidet kódoló DNS szekvenciával bír, amelyet mindkét oldalán annak a dúsan kifejeződő génnek a genomikus szekvenciái szegélyeznek, amelyet eredetileg a gazdasejtekből izoláltunk. A különböző hoszszúságú 5’ és 3’ szegélyező szekvenciákat át kell vizsgálnunk, hogy meghatározzuk: milyen méretű szegélyező területek szükségesek a heterológ polipeptidet kódoló szekvencia kifejezésének irányításához kópiaszám-függő, de helytől független módon.The resulting construct has the DNA sequence encoding the heterologous polypeptide flanked on both sides by the genomic sequences of the abundantly expressed gene originally isolated from the host cells. 5 'and 3' flanking sequences of different lengths should be screened to determine what size flanking regions are required to direct expression of the heterologous polypeptide coding sequence in a copy-dependent but location-independent manner.

Abból a célból, hogy meghatározzuk: tartalmaz-e az izolált kozmád annak megfelelő 5 és 3’ szegélyező területeket, hogy egy beiktatott heterológ polipeptidet kódoló szekvencia lényegében ugyanolyan szinten fejeződjék ki, mint a magas szinten kifejezett homológ DNS szekvencia, a szelektált DNS szekvenciát szövettenyészet sejtjeibe fertőzzük át, vagy valamely embrió genomjába vezetjük be, hogy transzgenikus állatokat állítsunk elő. Előnyösen azokat a sejteket vagy embriókat alkalmazzuk ebben a lépésben, amelyeket a végső termelésben is alkalmazunk. A transzformált gazdaszervezeteket azután megvizsgáljuk a heterológ fehérje kifejeződésére a jól ismert vizsgálati eljárások bármelyikével. Ezek között találjuk (de eljárásunk nemcsak ezekre korlátozódik) a radioimmunassayt, az ELISA-t, az immunfoltképzést, és azokat a vizsgálatokat, amelyek a kívánt polipeptid ·»·· 4« *· *1««* • 4 · · f 4 ·* • · · ml ·*1 ·· • ·· ♦ · ·♦··· aktivitását mérik. Egy másik előnyös eljárás szerint a többféle növekedési körülmények közt mért mRNS szinteket alkalmazzuk. Ezt elvégezhetjük Northern folt technikával, próbaként a korábban leírt (és a polipeptid szekvenciáknak megfelelő) oligonukleotidokat vagy a korábban azonosított cDNS-eket alkalmazva.In order to determine whether the isolated cosmos contains the corresponding 5 and 3 'flanking regions, the sequence encoding an inserted heterologous polypeptide is expressed at substantially the same level as the highly expressed homologous DNA sequence in the cells of tissue culture. or transfected into the genome of an embryo to produce transgenic animals. Preferably, cells or embryos that are used in the final production are used in this step. The transformed hosts are then assayed for expression of the heterologous protein by any of the well known assays. These include, but are not limited to, radioimmunoassay, ELISA, immuno-staining, and assays that provide the desired polypeptide · 4 · · 4 · * • · · ml · * 1 ·· • ···································································································. Another preferred method is to use mRNA levels measured under a variety of growth conditions. This can be accomplished by the Northern blot technique using probes as previously described (and corresponding to the polypeptide sequences) or previously identified cDNAs.

Mivel a gazdasejtekből kiválasztott kifejezés kontroll szekvenciák mutatják azt a képességet, hogy ismert körülmények között (pl. kollagén gyöngyökön, a VERAX rendszerben növekvő CHO sejtekben) irányítsák a homológ gén magas szintű kifejeződését, várható, hogy a heterológ polipeptid kifejeződése lényegében azonos szinten történjék azonos körülmények eredetű DNS szekvencia nem nyújt kor más, eltérő hosszúságú 5’ és talmazó kozmidokat kell elemezni csak megfelelő DNS szekvenciákat között. Amennyiben a kozmidilyen szintű kifejeződést, ak 3’ szegélyező területeket tar lényegében azonos módon, amíg nem lokalizálunk.Because the expression control sequences selected from host cells show the ability to direct high levels of expression of the homologous gene under known conditions (e.g., collagen beads, growing CHO cells in the VERAX system), expression of the heterologous polypeptide is expected to occur at substantially the same level. DNA sequence does not provide any other 5 'cosmids of different lengths and should only be analyzed between appropriate DNA sequences. If the cosmid has any level of expression, the 3 'flanking regions will be held in substantially the same manner until localized.

Az ezen szekvencia által létrehozott heterológ fehérje termelési szintjét azután összevetjük az integrált kifejezési sziget kópiaszámával. A kópiaszámot megfelelő restrikciós enzimes elemzéssel határozzuk meg. Azok a kifejezési konstrukciók, amelyek helytől független, de kópiaszámtól függő kifejezést mutatnak, az optimális kifejezési szigetek a jelen találmány szerint.The level of production of the heterologous protein produced by this sequence is then compared to the copy number of the integrated expression island. The copy number was determined by appropriate restriction enzyme analysis. Expression constructs that show a location-independent but copy-dependent expression are the optimal expression islands according to the present invention.

Egy előnyös kiviteli mód szerint egy gazdaszervezet, amely magában foglal egy találmányunk szerinti kifejezési szigetet, kiválasztja a kívánt polipeptidet. A polipeptidek kiválasztását úgy érjük el, hogy egy szignál peptidet kódoló DNS szekvenciát a megfelelő leolvasó keretben fuzionálunk a heterológ polipeptidet kódoló DNS-sel. A szignál peptid mérete nem kritikus ebben a találmányban. Minden, ami szükséges, csak az, hogy a szignál *·«« «« *4 4 • ’ ·····« 4··· • 4 ·· ·· 99 *In a preferred embodiment, a host comprising an expression island of the invention selects the desired polypeptide. Selection of polypeptides is achieved by fusing a DNA sequence encoding a signal peptide with DNA encoding the heterologous polypeptide in the appropriate reading frame. The size of the signal peptide is not critical in this invention. All it takes is just that the signal * · «« «« * 4 4 • '······ 4 ··· • 4 ···· 99 *

- 14 pepiid legyen megfelelő méretű és szekvenciájú ahhoz, hogy hatékonyan elősegítse a heterológ polipeptid kiválasztását. A szignál peptidet kódoló szignál szekvenciákra példák lehetnek a természetben a kifejezés kontroll szekvenciákkal társult szignál szekvenciák, a természetben a kívánt heterológ fehérjével vagy polipeptiddel társult szignál szekvenciák, a heterológ polipeptid forrására nézve natív szignál szekvenciák, a kifejezés kontroll szekvenciák forrására nézve natív szignál szekvenciák és bármely más szekvencia, amely működőképes szignál peptideket kódol.- 14 peptides of sufficient size and sequence to efficiently promote the selection of the heterologous polypeptide. Examples of signal sequences encoding a signal peptide may include, in nature, signal sequences associated with expression control sequences, in nature, signal sequences associated with a desired heterologous protein or polypeptide, native signal sequences for the source of the heterologous polypeptide, and expression sequences for any of the expression sequences. another sequence encoding functional signal peptides.

A kifejezendő fehérjék közül sok normálisan kiválasztódik és saját szignál peptiddel bír, amelynek megfelelőnek kell lennie a kiválasztás irányításához. Ebben az esetben az ezt a szignált kódoló DNS-t bele lehet érteni a heterológ polipeptidet kódoló szekvenciába, amely a kifejezési szigetbe beiktatódik. Amikor olyan polipeptidet állítunk elő, amely normálisan nem választódik ki, olyan szignál szekvencia alkalmazása lehetséges, amely a gazdasejtekből normálisan kiválasztódó polipeptidekből vagy más kiválasztódó polipeptidekből származik.Many of the proteins to be expressed are normally secreted and have their own signal peptide, which should be appropriate for directing the selection. In this case, the DNA encoding this signal may be included in the coding sequence for the heterologous polypeptide, which is inserted into the expression island. When producing a polypeptide that is not normally secreted, it is possible to use a signal sequence derived from polypeptides normally secreted from host cells or other secreted polypeptides.

A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módja tej-specifikus szignál peptideket kódoló szekvenciákat vagy olyan más szignál peptidek szekvenciáit alkalmazza, amely szignál peptidek használhatók fehérjék érésében és kiválasztásában emlős szövetekben. Ha a kiválasztandó heterológ polipeptid a természetben saját szignál szekvenciájával társul, a természetben a heterológ polipeptidet kódoló szekvenciával társult szignál szekvencia a legelőnyösebb szignál szekvencia.A preferred embodiment of the present invention utilizes sequences encoding milk-specific signal peptides or sequences of other signal peptides useful for maturation and selection of proteins in mammalian tissues. If the heterologous polypeptide to be selected is naturally associated with its own signal sequence, in nature, the signal sequence associated with the heterologous polypeptide coding sequence is the most preferred signal sequence.

A szükséges 5’ és 3’ szegélyező területeket az jellemzi, hogy képesek kifejeződést előidézni a kifejezési sziget konstrukcióból helytől független, de kópiaszámtól függő módon. Á ·· · · ···♦· • · · · ·· ·· · szegélyező szekvenciák hossza nem kritikus mindaddig, amíg a kívánt tulajdonságokat megadják a kifejezési konstrukciónak. A felső mérethatárt a DNS manipulálhatóságának könnyűsége határozza meg. A kifejező kontroll szekvenciák eredeti forrásában (az állatban vagy a sejtvonalban) a kifejezés kontroll szekvenciákat elméletileg a teljes kromoszóma szegélyezi. A jelenlegi technikák mintegy 40-50 kb-s DNS szegmens könnyű manipulálhatóságát teszik lehetővé. Ez a jól ismert kozmid technika alkalmazását igényli. A DNS méretében határt jelenthet, hogy ez injektálható legyen az embrió manipulációkhoz alkalmazott tűkön keresztül. Az előnyös technika az, ha olyan nagy 5’ és 3’ szegélyező területeket alkalmazunk, amilyen nagyokat csak lehet, hogy elegendő elszigetelő területet biztosítsunk a kópiaszám-függőség és a helytől való függetlenség átadásához.The required 5 'and 3' flanking regions are characterized by their ability to induce expression in a site-independent but copy-dependent manner. The length of the flanking sequences is not critical as long as the desired properties are given to the expression construct. The upper limit is determined by the ease with which the DNA can be manipulated. In the original source of expression control sequences (animal or cell line), expression control sequences are theoretically flanked by the entire chromosome. Current techniques allow for easy manipulation of a 40-50 kb DNA segment. This requires the use of well known cosmid techniques. There may be a limit on the size of DNA to be injected through needles used for embryo manipulation. A preferred technique is to use as large 5 'and 3' flanking areas as large as possible to provide sufficient isolation space to transmit copy number dependency and site independence.

A kívánt heterológ polipeptid kódoló szekvenciája származhat cDNS-ből, genomikus szekvenciákból, szintetikus DNS-ből vagy félszintetikus DNS-ből. Azok között a polipeptid termékek között, amelyeket a jelen találmány szerinti eljárással előállíthatunk, találjuk pl. a VIII. és IX. alvadási faktorokat, a humán vagy állati szérum albumínt, szöveti plazminogén aktivátort (tPA), urokinázt, alfa-1-antitripszint, állati növekedési hormonokat, Müller-féle gátló anyagot j^Mullerian Inhibiting Substance (MIS)], sejtfelületi fehérjéket, inzulint, interferonokat, interleukinokat, tej —1ípázokat, vírusellenes fehérjéket, peptid hormonokat, immunglobulinokat, 1ipokortinókat, és más heterológ fehérje termékeket.The coding sequence of the desired heterologous polypeptide may be derived from cDNA, genomic sequences, synthetic DNA or semi-synthetic DNA. Among the polypeptide products obtainable by the process of the present invention are, for example, VIII. and IX. clotting factors, human or animal serum albumin, tissue plasminogen activator (tPA), urokinase, alpha-1 antitrypsin, animal growth hormones, Mullerian Inhibiting Substance (MIS)], cell surface proteins, insulins, , interleukins, milk-lipases, antiviral proteins, peptide hormones, immunoglobulins, lipocortinins, and other heterologous protein products.

A kívánt heterológ polipeptidet fúziós fehérjeként is előállíthatjuk, amely a kívánt vagy natív polipeptidben levő aminosavakon túl további aminosavakat is tartalmaz. így pl. a találmányunk szerinti kívánt heterológ polipeptid előállítható egy nagyobb heterológ fehérje vagy polipeptid részeként abból a célból, hogy stabilizálja a kívánt polipeptidet, vagy annak tisztítását könnyebbé és/vagy gyorsabbá tegye. Ezt úgy lehet elérni, hogy a heterológ polipeptidet kódoló szekvenciát a kifejezési szigetbe attól a strukturgéntől vagy részétől 5’ hely felé iktatjuk be, amely eredetileg társult a kifejezés kontroll szekvenciához; a beiktatás megfelelő leolvasó keretben történik. Nyilvánvaló, hogy az ilyen konstrukció a heterológ polipeptid terminációs kodon eltávolítását igényli a kifejezési szigetbe való beiktatás előtt.The desired heterologous polypeptide may also be prepared as a fusion protein that contains additional amino acids in addition to the amino acids present in the desired or native polypeptide. so e.g. the desired heterologous polypeptide of the invention may be prepared as part of a larger heterologous protein or polypeptide in order to stabilize the desired polypeptide or to make purification easier and / or faster. This can be accomplished by inserting the heterologous polypeptide coding sequence into the expression island from the 5 'or 5' site of the structural gene that was originally associated with the expression control sequence; it is installed in a suitable reading frame. Obviously, such a construct requires removal of the termination codon of the heterologous polypeptide before insertion into the expression island.

Egy másik eljárás szerint a fúziós fehérjét kódoló területet megalkothatjuk a kifejezési szigetbe való beiktatás előtt. A fúziós fehérje konstrukció két vagy több heterológ fehérjét kódoló szekvenciát vagy részeit tartalmazhatja, amíg csak a szekvenciák azonos leolvasó keretben vannak. Ilyen konstrukciókat a szakterületen ismert eljárásokkal készíthetünk. A fúziós fehérjét ezután elhasíthatjuk, ha szükséges, és a kívánt fehérjét izolálhatjuk. A kívánt heterológ polipeptidet annak a polipeptidnek a fragmentumaként vagy származékaként állíthatjuk elő, amely eredetileg társult a kifejezés kontroll szekvenciákkal. Ezeknek a fenti változatoknak bármelyike könnyen elvégezhető, csupán a korrekt DNS szekvenciákat kell kiválasztani és/vagy manipulálni. Az ilyen manipulációk a szakterületen jól ismertek .Alternatively, the fusion protein coding region may be constructed prior to insertion into the expression island. The fusion protein construct may contain sequences or portions encoding two or more heterologous proteins as long as only the sequences are in the same reading frame. Such constructs can be made by methods known in the art. The fusion protein can then be cleaved, if necessary, and the desired protein isolated. The desired heterologous polypeptide may be prepared as a fragment or derivative of the polypeptide that is originally associated with the expression control sequences. Any of these variants can be easily accomplished by selecting and / or manipulating the correct DNA sequences. Such manipulations are well known in the art.

A fentebb leírt kifejezési sziget konstrukciókat a szakterületen jól ismert eljárásokat alkalmazva készíthetjük el. így pl. hagyományos kapcsolókat, restrikciós helyeket, stb. alkalmazó különböző ligálási technikákat alkalmazhatunk jó hatásfokkal. A találmányunk szerinti kifejezési szigeteket nagyobb • ·· • · · · • ·· · · ····· ·» ·· ·· ·· ·The expression island constructs described above may be prepared using techniques well known in the art. so e.g. conventional switches, restriction sites, etc. employing various ligation techniques with good efficiency. The expression islands of the invention are larger.

- 17 plazmidok részeként állítjuk elő. Az ilyen készítmények lehetővé teszik a korrekt konstrukciók klónozását és szelektálását hatékony módon, ahogyan ez a szakterületen jól ismert, és lehetővé teszik nagy mennyiségű kifejezési sziget konstrukció kényelmes előállítását.It is prepared as part of plasmids. Such compositions allow cloning and selection of correct constructs in an efficient manner, as is well known in the art, and allow convenient production of large amounts of expression island constructs.

A plazmid mibenléte nem kritikus a jelen találmány gyakorlatában. Bármely plazmid, amelyről a szakterületen ismert, hogy replikálódni, szelektálódni és nagyobb DNS darabokat hordozni képes, megfelelő hordozó lehet, amelybe be lehet iktatni a találmányunk szerinti kifejezési szigeteket. A találmányunk szerinti kifejezési szigetek legelőnyösebben kényelmes restrikciós helyek közt helyezkednek el a plazmidban úgy, hogy könnyen izolálhatól legyenek a plazmid szekvenciák további részeitől a kívánt gazdaszervezetbe való beépítéshez.The nature of the plasmid is not critical to the practice of the present invention. Any plasmid known in the art to be capable of replication, selection and carrying larger pieces of DNA may be a suitable carrier into which the expression islands of the invention can be inserted. Most preferably, the expression islands of the present invention are located between convenient restriction sites in the plasmid so that they can be readily isolated from other parts of the plasmid sequences for insertion into the desired host.

Egy, a kifejezési szigethez megfelelő gazdaszervezet kiválasztását sokféle, a szakterületen ismert tényezővel ellenőrizhetjük. Ezek között találjuk pl. az összeférhetőséget a kiválasztott vektorral, a polipeptid termékek toxicitását, a kívánt heterológ polipeptid kinyerésének könnyűségét, a kifejezési jellemzőket, a heterológ polipeptid speciális feldolgozási igényeit, a biológiai biztonságot és a költségeket.The selection of a suitable host for the expression island can be controlled by a variety of factors known in the art. These include eg. compatibility with the vector of choice, toxicity of the polypeptide products, ease of obtaining the desired heterologous polypeptide, expression characteristics, specific processing needs of the heterologous polypeptide, biosafety and cost.

A gazdaszervezet abszolút biztos kiválasztása nem lehetséges egy adott, kívánt fehérje vagy polipeptid részére a fenti faktorok közül egynek a segítségével, bármelyik is legyen az. Ezeknek a tényezőknek az egyensúlya alapján az a reális kép alakul ki, hogy nem minden gazdaszervezet egyformán alkalmas egy adott heterológ polipeptid hatékony kifejezéséhez.Absolute certainty in the selection of the host for a particular desired protein or polypeptide is not possible by any of the above factors. The balance of these factors leads to the realization that not all hosts are equally capable of effectively expressing a particular heterologous polypeptide.

Az alkalmas emlős gazdasejtek között találjuk a B és T limfocitákat, leukocitákat, fibroblasztokat, hepatocitákat, hasnyálmirigy sejteket, és nem differenciált sejteket. Előnyö« sen immortalizált (halhatatlanná tett) emlős sejtvonalakat hasznosíthatunk. Az alkalmas emlős sejtvonalak között találjukSuitable mammalian host cells include B and T lymphocytes, leukocytes, fibroblasts, hepatocytes, pancreatic cells, and non-differentiated cells. Preferably, immortalized (immortalized) mammalian cell lines may be utilized. It is found among suitable mammalian cell lines

V pl. az alábbiakat: 3T3, 3T6, STO, CHO, Ltk , FTO2B, Hep2B, AR42J és MPC1L. A legelőnyösebb emlős sejtvonalak a CHO, 3T3 és Ltk .E.g. 3T3, 3T6, STO, CHO, Ltk, FTO2B, Hep2B, AR42J and MPC1L. The most preferred mammalian cell lines are CHO, 3T3 and Ltk.

Abból a célból, hogy transzgenikus állatokat állítsunk elő, különböző emlősök embrióit alkalmazhatjuk. A gazda embrió kiválasztása olyan tényezőktől függ, mint a heterológ polipeptid kívánt végső sorsa az állatban. így pl. a heterológ polipeptidek kifejezésénél az egyik előnyös kiviteli mód az emlős tejben levő polipeptidek kifejezése, ahol az előnyös gazda embriók olyan állatokból származnak, amelyek már nagy térfogatú tejtermelésre vannak tenyésztve; ilyenek pl. a tehenek, birkák, kecskék és sertések.Embryos from various mammals may be used to produce transgenic animals. The choice of the host embryo will depend on factors such as the desired final fate of the heterologous polypeptide in the animal. so e.g. one preferred embodiment of the expression of heterologous polypeptides is the expression of polypeptides in mammalian milk, wherein the preferred host embryos are derived from animals that have already been bred for high volume milk production; such as cows, sheep, goats and pigs.

Számos standard munkamenet áll rendelkezésre a kifejezési konstrukció DNS-ének bevezetésére állati sejtekbe. Az általánosan használt átfertőzési eljárások között található az elektroporáció ^Potter H. és munkatársai: Enhancer-Dependent Expression of Humán Kappa Immunoglobulin Genes In troduce Intő Mouse Pre-B Lymphocytes By Electroporation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(7) , 4216-4200(1980)^, a protoplaszt fúzió ^Sandri-Goldin R. M. és munkatársai. Mól. Cell. Bioi, 743-52(1981 )J, a kalcium-foszfátos együtt-kicsapás jAraham F.L. és van dér Eb A.J.: A New Technique Fór The Assay Of Infectivity Of Humán Adenovirus 5 DNA , Virology 52(2) , 456-67(1973); Miller A.O. és munkatársai: c-fos Protein Can Induce Cellular Transformation: A Növel Mechanism Of Activation Of A Cellular Oncogene Cell 36(1) , 51-60(1981)2, továbbá a DEAE-dextrán-szulfáttal közvetített munkamenetek. Ezen kívül számos változat létezik a DEAEdextrán-szulf átos és kalcium-szulfátos eljárásokra Toueen C. és • 4 · · · * ····· • · · · · · · · · ·There are several standard protocols available for introducing the expression construct DNA into animal cells. Commonly used transfection methods include electroporation. H. Potter et al., Enhancer-Dependent Expression of Human Kappa Immunoglobulin Genes Introduce Mouse Pre-B Lymphocytes By Electroporation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (7), 4216-4200 (1980), protoplast fusion, Sandri-Goldin, R.M., et al. Mole. Cell. Biol., 743-52 (1981) J, Calcium phosphate co-precipitation by J.H. and van Aér Eb Eb: The New Technique For Assay Of Infectivity Of Human Adenovirus 5 DNA, Virology 52 (2), 456-67 (1973); Miller A.O. et al., c-fos Protein Can Induce Cellular Transformation: The Increased Mechanism Of Activation Of Cellular Oncogene Cell 36 (1), 51-60 (1981) 2, and DEAE-dextran sulfate-mediated sessions. In addition, there are many variants of DEAEdextran sulfate and calcium sulfate processes in Toueen C. and · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

Baltimore D.: Immunglobulin Gene Transcription Is Activated By Downstream Sequence Elements, Cell 33(3) , 741-48(1983); Gorman C.M. és munkatársai: Recombinant Genomes Which Express Chloramphenicol Acetyl-transferase In Mammalian Cells, Mól. Cell. Bioi. 2/9), 1044-41( 1982); Mclvor R.S. és munkatársai: Expression Of A cDNA Sequence Encoding Humán Purine Nucleoside Phosphorylase In Rodent And Humán Cells, Mól. Cell. Bioi. _5(6), 1349-57( 1985)J, amelyek számos előnyt nyújtanak. így pl. a kalcium-foszfátos együtt-kicsapásos munkamenetek különösen hatékonyak emlős sejteknél, ezeken belül is a CHO sejteknél.Baltimore D .: Immunglobulin Gene Transcription Is Activated By Downstream Sequence Elements, Cell 33 (3), 741-48 (1983); Gorman C.M. et al., Recombinant Genomes Which Express Chloramphenicol Acetyl-Transferase In Mammalian Cells, Mol. Cell. Biol. 2/9), 1044-41 (1982); Mclvor R.S. et al., Expression Of A cDNA Sequence Encoding Human Purine Nucleoside Phosphorylase In Rodent And Human Cells, Mol. Cell. Biol. 5 (6), 1349-57 (1985) J, which provide numerous advantages. so e.g. calcium phosphate co-precipitation sessions are particularly effective for mammalian cells, including CHO cells.

A kifejezési sziget konstrukcióval együtt általában bevezetünk egy szelektálható markért is az emlős sejtekbe, mint elkülönült DNS darabot, azért, hogy azokat a sejteket, amelyek beépítették a kifejező konstrukciót, könnyen kimutathassuk. Az alkalmas szelektálható markerek között találjuk többek között a dihidrofolát reduktázt, a metallotioeneint, a neo -t,a gpt-t és a hisD-t. A kiválasztott sejteket azután átvizsgáljuk a heterológ fehérje kifejezésére.Together with the expression island construct, a selectable marker is also generally introduced into mammalian cells as a distinct piece of DNA so that cells that have incorporated the expression construct can be readily detected. Suitable selectable markers include dihydrofolate reductase, metallothioenein, neo, gpt and hisD. The selected cells are then screened for expression of the heterologous protein.

Standard technikák állnak rendelkezésre a kifejező konstrukció bevezetésére egy emlős embrió genomjába. Az emlősök transzgenikus megváltoztatásának egyik technikája a kifejezési sziget konstrukció mikroinjektálása a megtermékenyített emlős petesejt pronukleuszába; ez azt eredményezi, hogy a konstrukció egy vagy több kópiája integrálódik a genomba és megőrződik a kifejlődő emlősök sejtjeiben. Röviden ismertetve a mikroinjektálási munkamenet abból áll, hogy izolálják a megtermékenyített petesejtet, a pronukleuszt láthatóvá teszik, majd a DNS-t olyan módon vezetik be a pronukleuszba, hogy a petesejteket egy tompa megtámasztó pipettával ( mintegy 50^4m átmérőjű) rögzítik, és egy élesre kihegyezett pipetta (mintegy 1,5/q m átmérőjű) alkalmazd• · β · • · · ·«· ····· • · · · · ·····Standard techniques are available for introducing an expressive construct into the genome of a mammalian embryo. One technique for transgenic alteration of mammals is microinjection of the expression island construct into the pronucleus of a fertilized mammalian ovum; this results in one or more copies of the construct being integrated into the genome and retained in the developing mammalian cells. Briefly, a microinjection session consists of isolating the fertilized ovum, visualizing the pronucleus, and then introducing the DNA into the pronucleus by attaching the ova to a blunt support pipette (about 50 ^ 4m in diameter) and apply a sharpened pipette (about 1.5 / qm in diameter) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

- 20 savai a DNS-t tartalmazó pufferoldatot a pronukleuszba injektálják j^lásd pl. Kraemer D. és munkatársai: Gene Transfer Intő Pronuclei Of Cattle And Sheep Zygotes, a Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo című szakkönyvben, 221-27. oldal, Cold Spring Harbor Laboratory (kiadó)(1985); Hammer R. G. és munkatársai: Production Of Transgenic Rabbits, Sheep and Pigs By Mi erőinjection , Natúré 315, 680-83(1985); és Gordon J.W. és Ruddle F.H.: Gene Transfer Intő Mouse Embryos: Production Of Transgenic Mice By Pronuclear Injection Methods in Embryology 101, 411-33(1983)] .20 acids are injected into the pronucleus in the DNA containing buffer. Kraemer, D., et al., Gene Transfer Inton Pronuclei Of Cattle And Sheep Zygotes, 221-27 in Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo. pages, Cold Spring Harbor Laboratory (Publisher) (1985); R. G. Hammer et al., Production Of Transgenic Rabbits, Sheep and Pigs By Mi Force Injection, Natur 315, 680-83 (1985); and Gordon J.W. and Ruddle, F.H., Gene Transfer Intro Mouse Embryos (1983), Production of Transgenic Mice By Pronuclear Injection Methods 101, 411-33.

A mikroinjektál ást előnyösen az egy-sejt állapotban levő embrión hajtják végre, hogy maximális legyen az esély arra: az injektált DNS beépül az állat minden sejtjébe, és a DNS beépül a csírasejtekbe is úgy, hogy az állat utódai ugyanúgy transzgenikusak lesznek. Általában az injektált petesejtekből kifejlődött emlősök legalább 40%-a tartalmazza a klónozott konstrukció legalább egy kópiáját a szomatikus szövetekben, és ezek a transzgenikus emlős-ök általában átviszik a gént a csíravonalon keresztül a következő nemzedékbe is. Az így létrejövő transzgenikus emlősök szöveteiből izolált DNS-t a kifejezési sziget jelenlétére Southern folt elemzéssel vizsgálhatjuk. Ha a kifejezési sziget egy vagy több kópiája stabilan integrálódva megmarad az ilyen transzgenikus emlősök genomjában, lehetséges permanens transzgenikus emlős vonalat létesíteni, amely hordozza a kifejezési sziget konstrukciót.Microinjection is preferably performed on a single-cell embryo to maximize the chance that the injected DNA is incorporated into all cells of the animal and the DNA is incorporated into the germ cells so that the offspring of the animal will be equally transgenic. Generally, at least 40% of mammals that have developed from injected egg cells contain at least one copy of the cloned construct in somatic tissues, and these transgenic mammals generally carry the gene through the germ line to the next generation. DNA isolated from the tissues of the resulting transgenic mammals may be analyzed by Southern blot analysis for the presence of the expression island. If one or more copies of the expression island remain stably integrated into the genome of such transgenic mammals, it is possible to establish a permanent transgenic mammalian line carrying the expression island construct.

A transzgenikusan megváltoztatott emlősök utódait a születés után megvizsgálhatjuk a kifejezési sziget konstrukciónak a genomba való beépülésére. Ezt a vizsgálatot előnyösen az utód kromoszomális anyagának Southern hibridizálásával lehet végre* 4 * 4 · 4 » · · 4 · 4The offspring of transgenically altered mammals may be examined after birth to incorporate the expression island construct into the genome. This assay is preferably performed by Southern hybridization of the chromosomal material of the offspring * 4 * 4 · 4 »· · 4 · 4

- 21 hajtani, a heterológ polipeptidet kódoló szekvencia egy részletének megfelelő próbát alkalmazva. Azokat az emlős utódokat, amelyekről úgy találjuk, hogy genomjukban tartalmazzák a konstrukciónak legalább egy kópiáját, érettségig neveljük. A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjában ezen utódok nőstényei a kívánt heterológ polipeptidet tejükben vagy tejükkel együtt termelik. Egy másik eljárás szerint a transzgenikus emlősöket tovább tenyésztjük, hogy további transzgenikus utódokat hozzunk létre, amelyek szintén alkalmasak a kívánt heterológ polipeptidek termelésére .- 21, using a probe corresponding to a portion of the heterologous polypeptide coding sequence. Mammalian offspring that are found to contain at least one copy of the construct in their genome are raised to maturity. In a preferred embodiment of the present invention, the females of these offspring produce the desired heterologous polypeptide in or together with milk. Alternatively, the transgenic mammals are further cultured to generate additional transgenic progeny that are also capable of producing the desired heterologous polypeptides.

KIVITELI PÉLDÁKEXPORTING EXAMPLES

1, PÉLDA - A SZARVASMARHA ALFA S-l KAZEIN KIFEJEZÉSI SZIGET MEGALKOTÁSAEXAMPLE 1 - CREATING THE BEEF ALFA S-l CASEIN EXPRESSION ISLAND

Erre a technológiára az egyik példa az, hogy a kifejezési sziget konstrukciót ép állat speciális szöveteiben vagy szervrendszerében egy heterológ fehérje termelésére alkalmazzuk. Ebben az esetben a heterológ fehérje magas szintű kifejezését egy emlős emlőmirigyeibe irányítjuk.One example of this technology is the use of the expression island construct in the production of a heterologous protein in specific tissues or organs of an intact animal. In this case, the high level expression of the heterologous protein is directed to a mammalian mammary gland.

Az itt leírt génkonstrukció olyan kifejezési sziget-et tartalmaz, amelyben a szarvasmarha alfa kazein génből származó nagy 5’ és 3’ szegélyező területek humán urokináz genomikus kiónjának kifejezését irányítják. Az 5’ szegélyező terület egy 21 kb-s, felfelé levő (upstream) alfa kazein szekvenciából áll, amelyben benne foglaltatik az első nem-kódoló exon és a második exon nem-kódoló része. A 9 kb-s 3’ szegélyező terület tartalmazza az alfa kazein COOH-terminális felét kódoló exonokat, a poliadenilező szignált, és 2 kb-t a további lefelé levő (downstream) szegélyező szekvenciákból.The gene construct described herein contains an expression island in which the large 5 'and 3' flanking regions derived from the bovine alpha casein gene direct the expression of the human urokinase genomic clone. The flanking region 5 'consists of a 21 kb upstream alpha-casein sequence including the first non-coding exon and the non-coding portion of the second exon. The 9 kb 3 'flanking region contains exons encoding the COOH-terminal half of alpha casein, the polyadenylation signal, and 2 kb of further downstream flanking sequences.

A borjú timusz DNS kozmid könyvtárából a szarvasmarha alfa ·· · ·From the calf thyme DNA cosmid library, bovine alpha ·· · ·

5-1 kazein gént klónozzuk HC79 kozmid vektorban (Boehringer Mannheim) , amint ezt Hohn B. és Collins 3. leírták LA Small Cosmid Fór Efficient Cloning Of Large ONA Fragments, Gene 11(3-4) ,The 5-1 casein gene was cloned in the cosmid vector HC79 (Boehringer Mannheim) as described by Hohn B. and Collins 3. LA Small Cosmid Forage Cloning Of Large ONA Fragments, Gene 11 (3-4),

291-98291-98

A timuszt vágóhídról szerezzük be és a DNS-t a szakterületen jól ismert eljárásokkal izoláljuk Maniatis T. és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 271. oldal,The thyme is obtained from a slaughterhouse and the DNA is isolated by methods well known in the art. Maniatis T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p.

Cold Spring Harbor Laboratory (kiadó)(1982) . A kozmid könyvtá rat standard technikák alkalmazásával alkotjuk meg ^Grosveld F. és munkatársai: Isolation Of Beta-Globin-Related Genes From A Humán Cosmid Library, Gene 13(3), 227-31 (1981 )^ . A borjú timusz DNS-t részlegesen emésztjük Sau3A-val (New England BioLabs), és NaCl gradiensen (1 mól/1 —5 mól/1) futtatjuk, hogy feldúsítsuk a 30 és 40 kb közötti fragmentumokat. A részlegesen emésztett DNS fragmentumokat azután BamHl -gyei emésztett HC79 kozmid vektorba ligáljuk, amelyet in vitro csomagolás követ lambda extraktumok segítségével (Amersham Corporation, Arlington Heights, Illinois) a gyártó cég útmutatásai szerint. Az in vitro csomagolt anyagot azután felhasználjuk az E. coli K-12 HB101 törzs átfertőzésére. Az ezt a vektort beépített kiónokat olyan módon szelektáljuk, hogy 50^( g/ml ampicillint (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) tartalmazó LB lemezeken növesztjük.Cold Spring Harbor Laboratory (Publisher) (1982). The cosmid library is constructed using standard techniques. F. Grosveld, F., et al., Isolation Of Beta-Globin-Related Genes From The Human Cosmid Library, Gene 13 (3), 227-31 (1981). Calf thyme DNA was partially digested with Sau3A (New England BioLabs) and run on a NaCl gradient (1 mol / l to 5 mol / l) to enrich the 30 to 40 kb fragments. The partially digested DNA fragments are then ligated into Bam HI digested cosmid vector HC79 followed by in vitro packaging with lambda extracts (Amersham Corporation, Arlington Heights, Illinois) according to the manufacturer's instructions. The in vitro packaged material is then used to infect E. coli strain K-12 HB101. Integrated clones of this vector were selected by growing on LB plates containing 50 µg / ml ampicillin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri).

Az így létrejövő könyvtárat egy 45 bázispáros oligonukleotid próba, a CAS-1 alkalmazásával vizsgáljuk át. Ezt a CAS-1 szekvenciát (5’-ATGGCTTGATCTTCAGTTGATTCACTCCCAATATCCTTGCTCAG3’) az alfa S-l kazein Willis I.M. és munkatársai által leírt részleges cDNS szekvenciájára alapozva szintetizáljuk Construction And Identification By Partial Nucleotide Sequence Analysis Of Bovine Casein And Beta-Lactoglobulin cDNA Clones ONA /(4), 375-86(1982) . Ez a szekvencia az érett szarvasmarha kazein 20.-35. aminosavainak felel meg. Ennek az átvizsgá» » • · lásnak az eredményeképpen három kiónt izolálunk (C9, D4 és El), amelyek tartalmaznak kozmidokat.The resulting library was screened using a 45 base pair oligonucleotide probe, CAS-1. This CAS-1 sequence (5'-ATGGCTTGATCTTCAGTTGATTCACTCCCAATATCCTTGCTCAG3 ') is provided by alpha S-1 casein Willis I.M. et al. (1982), 375-86, based on the sequence of the partial cDNA described in Part et al., et al. (4), 375-86. This sequence is shown on pages 20-35 of mature bovine casein. corresponding to its amino acids. As a result of this screening, three clones (C9, D4 and E1) containing cosmids were isolated.

Az 5’ és 3’ szegélyező szekvenciákat az El és C9 kozmid kiónokból kapjuk. A restrikciós térképezés és a Southern folt elemzés j^Southern E.: Detection Of Specific Sequences Among DNA Fragments Separated By Gél Electrophoresis, 0. Mól. Bioi. 98(3), 503-517 (1975)]j, amelyhez a kazein cDNS ismert szekvenciájú területeinek megfelelő oligonukleotid próbákat alkalmazunk ^Stewart A.F. és munkatársai: Nucleotide Sequences Of Bovine Alpha Sl-And Kappa-Casein cDNAs, Nucleic Acids Rés. 12(9) , 3895-3907 (1984); Nagao M. és munkatársai: Isolation and Sequence Analysis Of Bovine Alpha Sl-Casein cDNA Clone , Agric. Bioi. Chem. 48(6) , 1663-67( 1984)3, megállapítja, hogy a D4 és El kozmidok tartalmazzák a kazein strukturgén (vagyis a kazein fehérjét kódoló DNS szekvencia) egy részét, továbbá tartalmaznak 21 kb-ΐ a fölfelé levő vagy 5’ szegélyező szekvenciákból. A C9 kozmid tartalmazza a kazein strukturgén egy részét és kiterjed mintegy 7 kb-re a poliadenilező helytől lefelé. Elvégezzük az El és D4 kozmidok szekvenciaelemzését a kazein strukturszekvencia transzkripciós rajtjának megfelelő területben és meghatározzuk, hogy a szekvencia megfelel az azonos területtel kapcsolatban publikált szekvenciának |^Yu-Lee L ,Y. és munkatársai: Evolution Of The Casein Multigene Family.· Conserved Sequences In The 5’ Flanking And Exon Regions, Nucleic Acid Rés. 14 (4) , 1883-1902 (1986)] .The 5 'and 3' flanking sequences were obtained from cosmid clones E1 and C9. Restriction mapping and Southern blot analysis: Southern E. Detection Of Specific Sequences Among DNA Fragments Separated By Gel Electrophoresis, 0. Mole. Biol. 98 (3), 503-517 (1975)] using oligonucleotide probes corresponding to known sequence regions of the casein cDNA. Stewart A.F. et al., Nucleotide Sequences Of Bovine Alpha Sl-And Kappa-Casein cDNAs, Nucleic Acids Slit. 12 (9): 3895-3907 (1984); Nagao, M., et al., Isolation and Sequence Analysis of Bovine Alpha Sl-Casein cDNA Clone, Agric. Biol. Chem. 48 (6), 1663-67 (1984) 3, states that the cosmids D4 and E1 contain a portion of the casein structural gene (i.e., the DNA sequence encoding the casein protein), and contain 21 kb of upstream or 5 'flanking sequences. Cosmid C9 contains a portion of the casein structural gene and extends approximately 7 kb downstream of the polyadenylation site. Sequence analysis of the cosmids E1 and D4 is carried out in the region corresponding to the transcription start of the casein structural sequence and determined that the sequence corresponds to the published sequence for the same region. Yu-Lee L, Y. et al .: Evolution Of The Casein Multigene Family · Conserved Sequences In The 5 'Flanking And Exon Regions, Nucleic Acid Slit. 14 (4): 1883-1902 (1986)].

A találmányunk szerinti kifejezési sziget megalkotását a 2. ábrában mutatjuk be. A C9 kozmidból a 9 kb-s BamHI fragmentumot al-klónozzuk, amely az alfa kazein 98. aminosavát követő intronon belül levő BamHI helynél kezdődik és az alfa kazein poliade• · • ·♦<The construction of the expression island of the present invention is shown in Figure 2. From cosmid C9, the 9 kb BamHI fragment is subcloned which starts at the BamHI site within the intron following the 98th amino acid residue of alpha casein and the alpha casein polyadd.

* » ·········· ·· ·· ·· · · ·* »················· · · ·

- 24 nilező szignáljától 2 kb-re lefelé elhelyezkedő másik BamHI helyig folytatódik. Ezt a fragmentumot a 2. ábrán c-term jelöléssel jelöljük. Ezt a 9 kb-s fragmentumot BamHI-gyel hasított pUC19-be klónozzuk, így kapjuk meg a pCAS 947-et. A lefelé levő BamHI helyet Sáli hellyé alakítjuk olyan módon, hogy a pCAS 947et részlegesen emésztjük BamHI-gyel, majd ligálunk egy Sáli kapcsolóval, a CAS 10-zel, amelynek szekvenciája 5'-GATCGTCGAC-3’. Az így létrejövő plazmidot pCAS 1238-nak nevezzük. Ezt a 9 kb-s BamHI-Sall fragmentumot használjuk a sziget 3’ szegélyező szekvenciájaként. Ez tartalmazza a 3’-nem transzlatált területet és a 3’ kifejezés kontroll szekvenciákat, valamint az alfa S-l kazeinből származó strukturgén egy részletét.- Continues from 24 nil signal to 2 kb downstream to another BamHI site. This fragment is designated c-term in Figure 2. This 9 kb fragment was cloned into BamHI-cleaved pUC19 to give pCAS 947. The downstream BamHI site was converted to SalI site by partial digestion of pCAS 947 with BamHI and ligated with a SalI linker, CAS 10, having the sequence 5'-GATCGTCGAC-3 '. The resulting plasmid is called pCAS 1238. This 9 kb BamHI-SalI fragment is used as the 3 'flanking sequence of the island. It contains the 3'-untranslated region and the 3 'expression control sequences, as well as a portion of the structural gene derived from alpha S-1 casein.

A következő lépés az 5’ szegélyező terület megtervezése. Ezt a területet, amely tartalmazza a transzkripciós rajthelyet, továbbá tartalmaz egy nem-kódoló exont és egy második exont, amelynek egy része szintén nem kódoló, al-klónozzuk. Az El kozmidból izolálunk egy 4 kb-s Smal/BamHI fragmentumot és alklónozzuk BamHI-gyel és Smal-gyel hasított pUC19-be; így kapjuk meg a pCAS 2276-ot. Ezt a plazmidot BglII-vel hasítjuk, hogy eltávolítsuk a második exon kódoló részét, majd a BglII helyet BamHI hellyé alakítjuk át olyan módon, hogy egy CAS 12 kapcsolóhoz ligáljuk, amelynek szekvenciája 5 ’-GATCTTGGATCCAA-3 ’ . Az így létrejövő plazmidot, a pCAS 1181-et azután Smal-gyel és BamHI-gyel emésztjük, hogy eltávolítsuk az El kozmid DNS 3 kb-s darabját. A fragmentumot izoláljuk, ligáljuk a pCAS 1238-ból származó 9 kb-s BamHI-Sall fragmentumhoz, majd beiktatjuk az Smal-gyel és Sallgyel emésztett pUC19-be, így kapjuk meg a pCAS 1276-ot.The next step is to design the 5 'flanking area. This region, which contains the transcription start site, also contains a non-coding exon and a second exon, some of which is also non-coding. A 4 kb SmaI / BamHI fragment was isolated from cosmid E1 and subcloned into BamHI and SmaI cleaved pUC19; This gives pCAS 2276. This plasmid was cleaved with BglII to remove the coding portion of the second exon, and the BglII site was converted to a BamHI site by ligation to a CAS 12 linker having the sequence 5 '-GATCTTGGATCCAA-3'. The resulting plasmid, pCAS 1181, was then digested with SmaI and BamHI to remove a 3 kb fragment of cosmid E1. The fragment was isolated, ligated to the 9 kb BamHI-SalI fragment from pCAS 1238 and inserted into SmaI and SalI digested pUC19 to give pCAS 1276.

Az így létrejövő konstrukció összekapcsolja a transzkripciós rajthelyet a lefelé levő genomikus szekvenciával; köztük van egy egyedi BamHI klónozó hely, amelybe a heterológ polipeptidet kó • « · · ♦ · • « dőlő szekvenciát be lehet iktatni. Mivel a végső konstrukciók számos más BamHI helyet is tartalmaznak a genomikus szekvenciákban, a heterológ polipeptidet kódoló szekvencia klónozó helyet ki kell cserélni mind Xhol helyre, mind NotI helyre a CAS 30 kapcsoló hozzáadásával, amelynek szekvenciája 5’-GATCTCGAGCGCGGC CGCGCT-3’. Az így létrejövő vektor, a pCAS 1277 klónozó helyekként Xhol és NotI helyeket tartalmaz, ezek között van az alfa kazein transzkripciós rajtja és az alfa kazein C-terminális genomikus része.The resulting construct links the transcription start site to the downstream genomic sequence; among them is a unique BamHI cloning site into which the tilting sequence encoding the heterologous polypeptide can be inserted. Because the final constructs contain several other BamHI sites in the genomic sequences, the sequence cloning site encoding the heterologous polypeptide must be changed to both the XhoI site and the NotI site by the addition of the CAS 30 linker sequence 5'-GATCTCGAGCGCGGC CGCGCT-3 '. The resulting vector, pCAS 1277, contains XhoI and NotI sites as cloning sites, including the transcription starter of alpha casein and the C-terminal genomic portion of alpha casein.

A pCAS 1277-ből való transzkripciós rajtot és c-term-et azután az El kozmidban található alfa kazein genomikus szekvencia megfelelő részeinek helyettesítésére alkalmazzuk. Mivel a konstrukció 39 kb hosszúságú, a kozmid technikát alkalmazzuk a plazmidok manipulálására. Az eredeti El kozmidot részlegesen emésztjük Xmal-gyel, majd teljességig emésztjük Sall-gyel, hogy eltávolítsuk a kozmidban található alfa kazein gén 3’ részének legtöbbjét. Az Smal és Xmal enzimek azonos felismerő hellyel bírnak, azzal a kivétellel, hogy az Xmal meghagy egy 5’ túlnyúlást, míg az Smal tompa véget hagy hátra. A pCAS 1277-ből származó 12 kb-s Xmal-Sall fragmentumot azután beiktatjuk az Xmalgyel és Sall-gyel hasított kozmidba, hogy helyettesítsük az eltávolított részt.The transcription start and c-term from pCAS 1277 are then used to replace appropriate portions of the alpha casein genomic sequence in cosmid E1. Because the construct is 39 kb in length, the cosmid technique is used to manipulate plasmids. The original cosmid E1 was partially digested with Xmal and then completely digested with SalI to remove most of the 3 'portion of the alpha casein gene in the cosmid. The Smal and Xmal enzymes share the same recognition site, except that Xmal leaves a 5 'overhang while Smal leaves a blunt end. The 12 kb Xmal-SalI fragment from pCAS 1277 is then inserted into the XmaI and SalI-cleaved cosmids to replace the deleted portion.

A ligáit termékeket azután in vitro csomagolásnak vetjük alá egy in vitro csomagoló készletet (Amersham Corporation) alkalmazva, és a csomagolt DNS-t E. coli DH5 sejtek átfertőzésére használjuk fel; ezt 50/^g/ml ampicillint (Sigma Chemical Co.) is tartalmazó LB lemezeken végzett szelekció követi. Az ampicillinre rezisztens telepekből plazmidokat vizsgálunk át, a kazein 3’-végére fajlagos próbákat alkalmazva. Azonosítunk és • · · · « ♦ • · · i ····«·«···The ligated products are then subjected to in vitro packaging using an in vitro packaging kit (Amersham Corporation), and the packaged DNA is used to infect E. coli DH5 cells; followed by selection on LB plates containing 50 µg / ml ampicillin (Sigma Chemical Co.). Plasmids from ampicillin-resistant colonies were screened using specific probes for the 3 'end of casein. We identify and • · · · «♦ • · · i ····« · «···

- 26 jellemzőnk olyan plazmidokat, amelyek tartalmaznak 21 kb-t a transzkripciós rajttól fölfelé, és tartalmazzák az XhoI/NotI klónozó helyet a kazein gén genomikus 3’ végével együtt. Ezen plazmidok egyikét, a CAS 1288-at azután felhasználjuk a heterológ DNS szekvencia kifejezésére.- 26 features plasmids containing 21 kb upstream of the transcription start and containing the XhoI / NotI cloning site along with the genomic 3 'end of the casein gene. One of these plasmids, CAS 1288, is then used to express the heterologous DNA sequence.

A humán urokináz genomikus kiónját egy genomikus könyvtárból izoláljuk, próbaként közölt szekvenciákat alkalmazva (lásd Riccio A. korábban idézett munkáját). A közölt szekvenciából látható, hogy a gén transzlációs rajthelyétől felfelé van egy Apai hely, és a poliA transzkripciós szignáltól lefelé is van egy. Oligonukleotid adaptereket (URO 8, amelynek szekvenciája 5’-CGT CGACG-3’, és ÚRI 9, amelynek szekvenciája 5’-GTACCGTCGACCGGCC-3 ’) alkalmazunk, hogy Sáli helyeket adjunk ehhez a két szegélyező Apai helyhez. Ez lehetővé teszi, hogy a genomikus kiónt az SV40 korai promotortól lefelé behelyezzük egy állati sejt kifejező vektorba úgy, hogy meg is tudjuk vizsgálni a kifejeződést, mielőtt beiktatnánk az alfa kazein kifejezési szigetbe. Az így létrejövő plazmid, a pUK0409, irányítja az autentikus humán urokináz kifejeződését átfertózött szövettenyészet sejtekben. Mi ennél fogva tudjuk, hogy a genomikus klón működőképes. A következő lépés az urokináz genomikus klón behelyezése a CAS 1288 Xhol klónozó helyébe. Ezeket a lépéseket a 3. ábra ábrázolja.The genomic clone of human urokinase is isolated from a genomic library using probe sequences (see Riccio A., cited above). From the disclosed sequence, it can be seen that there is an Apai site upstream of the translation start site of the gene and downstream of the polyA transcriptional signal. Oligonucleotide adapters (URO 8 having 5'-CGT CGACG-3 'and URI 9 having 5'-GTACCGTCGACCGGCC-3') were used to add SalI sites to these two flanking Apa sites. This allows the genomic clone to be inserted downstream of the SV40 early promoter into an animal cell expression vector so that expression can be examined before insertion into the alpha casein expression island. The resulting plasmid, pUK0409, directs the expression of authentic human urokinase in transfected tissue culture cells. We therefore know that the genomic clone is functional. The next step is to insert the urokinase genomic clone into the CAS 1288 Xhol cloning site. These steps are illustrated in Figure 3.

Az urokináz genomikus kiónt egy 8 kb-s Sáli fragmentumként izoláljuk pUK0409-ból. A Sáli túlnyúló végek képesek ligálódni a CAS 1288-ban talált Xhol klónozó helybe. Van azonban egy másik Xhol hely is az alfa kazein 21 kb-vel feljebb levő területeiben. Mj ennél fogva részleges Xhol emésztést végzünk, ezt ligálás követi az izolált Sáli urokináz fragmentummal (lásd a 3. ábrát). A telepekből plazmidokat izolálunk és átvizsgáljuk az ···· ·· ·· «4· • · · · 9 ο ·· • « · Β«· ·«· ·» • ·· * · ··· · urokináz DNS szekvencia jelenlétére és orientációjára. Ezeknek a plazmidoknak az egyike, a CAS 1295 korrekt orientációban tartalmazza az urokináz gént, amint ezt restrikciós elemzéssel meghatároztuk. Ez a plazmid 5’ —> 3’ orientációban az alábbiakat tartalmazza: a 21 kb-s lefelé levő terület, az a kazein első nem kódoló exon és intron szekvenciái, az urokinázt kódoló genomikus szekvencia, és a 9 kb-s 3’ genomikus alfa kazein terület .The urokinase genomic clone was isolated as an 8 kb Sal I fragment from pUK0409. The protruding ends can ligate to the Xhol cloning site found in CAS 1288. However, there is another Xhol site in the 21 kb upstream areas of alpha casein. Mj is therefore subjected to partial Xhol digestion followed by ligation with the isolated SalI urokinase fragment (see Figure 3). Plasmids were isolated from the colonies and screened for the presence of the urokinase DNA sequence ························································ · and orientation. One of these plasmids, CAS 1295, contains the urokinase gene in the correct orientation, as determined by restriction analysis. This plasmid contains, in the 5 'to 3' orientation: the 21 kb downstream region, the first non-coding exon and intron sequences of the casein, the genomic sequence encoding the urokinase, and the 9 kb 3 'genomic alpha. casein area.

2. PÉLDA A KIFEJEZÉSI SZIGET KONSTRUKCIÓ TRANSZGENIKUS BEÉPÍTÉSE EGEREKBEEXAMPLE 2 TRANSGENIC INSTALLATION OF EXPRESSION ISLAND CONSTRUCTIONS IN MICE

Abból a célból, hogy transzgenikus kísérleteket hajtsunk végre, a CAS 1295-ben jelen levő prokarióta vektor szekvenciákat eltávolítjuk, mielőtt embriókba injektálnánk. Ezt úgy valósítjuk meg, hogy a CAS 1295-öt Clal-gyel és Sall-gyel emésztjük, majd gélelektroforézisnek vetjük alá 1¾ agaróz TBE-n (lásd Maniatis fentebb idézett munkáját). A kifejezési sziget konstrukció eukarióta szekvenciáinak megfelelő 41 kb-s fragmentumot a gélről kihasítjuk és a DNS-t elektroelucióval tisztítjuk. A DNS-t azután egy éjszakán át centrifugáljuk kiegyensúlyozott CsCl gradiensen. A gradiensből eltávolítjuk a DNS csíkot és erőteljesen dializáljuk TNE pufferral szemben 5 mmól/1 trisz(pH 7,4) , 5 mmól/1 NaCl és 0,1 mmól/1 EDTA (pH 8,0) .For the purpose of performing transgenic experiments, the prokaryotic vector sequences present in CAS 1295 are removed prior to injection into embryos. This is accomplished by digesting CAS 1295 with Clal and SalI and then gel electrophoresis on 1¾ agarose TBE (see Maniatis, supra). The 41 kb fragment corresponding to the eukaryotic sequences of the expression island construct was excised from the gel and the DNA was purified by electroelution. The DNA was then centrifuged overnight on a balanced CsCl gradient. The DNA was removed from the gradient and vigorously dialyzed against TNE buffer at 5 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl and 0.1 mM EDTA pH 8.0.

A kívánt genetikai információ fejlődő egér embrióba való transzgenikus beépítésének munkamenete a szakterületen már rögzítve van. Hogan B. és munkatársai eljárását követjük [j'Manipulating The Mouse Embryo: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (kiadó) ( 1986)J . A C57B1 és CB6 egerek (Jackson Laboratories) közti keresztezés FI generációját (Sloan Kettering) alkalmazzuk. Hat hetes nőstényeket szuperovulálunk Gestile (terhes kanca szérum) injekcióval, amelyet 2 nappal ··«<· · · 9«4 · • » V · · · ♦ · « · · *·· ··· · · később humán korion ganadotropin injekció követ. A kezelt nőstényeket pároztatjuk C57B1 tenyészhímekkel 24 órával később. A már megtermékenyített embrókat a párzást követő 12 órán belül kivesszük a DNS-sel végzendő mikroinjektáláshoz és az álterhes nőstényekbe való beültetéshez.The process of transgenic incorporation of the desired genetic information into a developing mouse embryo is already well established in the art. The procedure of B. Hogan et al., J. Manipulating The Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Manual (1986) J. The FI generation (Sloan Kettering) of the cross between C57B1 and CB6 mice (Jackson Laboratories) was used. Six-week-old females were superovulated by injection of Gestile (pregnant mare serum), which was injected with human chorionic ganadotropin 2 days later, ························• follow. Treated females were mated with C57B1 breeding males 24 hours later. Already fertilized embryos are removed within 12 hours of mating for microinjection with DNA and for implantation in pregnant females.

Az embrió izolálása után először hialuronidázzal leemésztjük a petesejtet körülvevő kumulusz sejteket. Ezután a kifejezési sziget konstrukciót az embrió pronukleuszába injektáljuk, amíg az méretének 30-50%-ával felduzzad. Az injektált embriókat azután álterhes FI nőstények petevezetékébe ültetjük be. Az így létrejött élő utódok farkából származó ONS-t átvizsgáljuk, próbaként nick-transzlatált CAS 1295 DNS-t alkalmazva, hogy azonosítsuk azokat az állatokat, amelyek hordozzák a kifejezési sziget konstrukciót. Három transzgenikus állatot azonosítunk. Ezeket az állatokat pároztatjuk és az utódokat megvizsgáljuk a kifejezési sziget konstrukció jelenlétére a fentiek szerint.After embryo isolation, the cumulus cells surrounding the ovum are first digested with hyaluronidase. The expression island construct is then injected into the pronucleus of the embryo until it is swollen by 30-50% of its size. The injected embryos are then implanted into the fallopian tube of pregnant F1 female. The ONS from the tail of the resulting live offspring was screened using probe nick-translated CAS 1295 DNA to identify the animals carrying the expression island construct. Three transgenic animals were identified. These animals are mated and the offspring examined for the presence of the expression island construct as described above.

A transzgenikus vonalak egyike, amely a kifejezési sziget konstrukció 2-3 kópiáját hordozza, a Mendel-féle szabályok szerint viszi tovább a genetikai anyagot. Ennek a transzgenikus vonalnak a nőstényei, amelyek a CAS 1295 beiktatást hordozzák, tejükben mind termelnek humán urokinázt mintegy 1 mg/ml mennyiségben, amint ezt enzimes vizsgálattal meghatározzuk. Az urokinázt gátoja a 394. monoklonális antitest, amely a humán urokinázra fajlagos (Americana Diagnostica, Inc., New York, New York).One of the transgenic lines carrying 2-3 copies of the expression island construct carries the genetic material according to Mendelian rules. The females of this transgenic line carrying the CAS 1295 insert all produce human urokinase in their milk at approximately 1 mg / ml as determined by enzymatic assay. Urokinase is inhibited by monoclonal antibody 394 which is specific for human urokinase (Americana Diagnostica, Inc., New York, New York).

A két másik transzgenikus vonal a konstrukció 20-50 kópiáját hordozza, de nem adja tovább a ONS-t az egerek további generációjának. Úgy véljük, hogy a nagy kópiaszámú vonalak azért képtelenek átadni ezeket a géneket, mert az embriogenezis során ··«· 99 r· ·49 • · 9 9 · 9 ··The other two transgenic lines carry 20-50 copies of the construct but do not pass ONS to the next generation of mice. We believe that high copy number lines are unable to transmit these genes because of the fact that during embryogenesis, ··· · 99 r · · 49 • · 9 9 · 9 ··

9 9 ··· 999 ·99 9 ··· 999 · 9

9 9 9 9 9 ·999 az urokináznak nagy az alapszintje. Az urokináz normálisan embrioszövetekben (embrionális őssejtekben) fejeződik ki, és a kifejlődés során működik. Az urokináz kifejeződés alacsony alapszintje a kazein kifejezés kontroll szekvenciákból nem zavarja a fejlődést a gén két kópiáját öröklő embriókban. Ha azonban a kifejezés függ a kópiaszámtól, azok a vonalak, amelyek 20-50 kópiával bírnak, 20-50-szer magasabb alapszinttel rendelkeznek, ezért elég urokinázt fejeznek ki ahhoz, hogy zavarják a megfelelő kifejlődést. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy/kifejezett urokináz szintje függ a kópia-számtól.9 9 9 9 9 · 999 High baseline urokinase. Urokinase is normally expressed in embryonic tissues (embryonic stem cells) and functions during development. Low baseline urokinase expression from casein expression control sequences does not interfere with development in embryos that inherit two copies of the gene. However, if the expression is dependent on copy number, lines with 20-50 copies have a baseline of 20-50 times higher and therefore express enough urokinase to interfere with proper development. These results indicate that / expressed urokinase levels are dependent on copy number.

3. PÉLDA A KIFEJEZÉSI SZIGET KONSTRUKCIÓ ÁTFERTŰZÉSE ÁLLATI SEJTEKBEEXAMPLE 3 REFLECTING THE EXPRESSION ISLAND CONSTRUCTION IN ANIMAL CELLS

A kifejezési sziget konstrukciót és a pSV2-DHFR szelektálható markert j/amely az American Type CultureCollection-nál rendelkezésre áll (ATCC 37146)J , amely a dihidrofolát reduktáz termelését kódolja emlős sejtekben, együtt vezetjük be DHFR CHO sejtekbe elektroporációval. Ezt a technikát ezért választottuk, mert olyan gazdasejtek előállítására képes, amelyeket a stabilan integrálódott idegen DNS jellemez nagy kópiaszámmal. A 0 343 783 számú európai szabadalmi bejelentés részletesen leírja ezt a technikát; ez a bejelentés referenciaként beépül ebbe a bejelentésbe.The expression island construct and the pSV2-DHFR selectable marker available at American Type CultureCollection (ATCC 37146) J, which codes for the production of dihydrofolate reductase in mammalian cells, are co-introduced into DHFR CHO cells by electroporation. This technique was chosen because it is capable of producing host cells characterized by high copy number of stably integrated foreign DNA. EP 0 343 783 describes this technique in detail; this application is incorporated herein by reference.

Az elektroporáció előtt a pSV2-DHFR plazmidot 1inearizáljuk AatlI-vel egy éjszakán át végzett emésztéssel. A kifejezési sziget szekvenciákat a vektor szekvenciákból olyan módon izoláljuk, hogy a 2. példában leírt módon restrikciós enzimekkel hasítjuk, ezt azután gélelektroforézis követi, hogy lehetővé váljék az elkülönítés és izolálás (lásd Maniatis korábban idézett munkáját). Lazac sperma DNS-t (200^/tg), amelyet előzőleg ultra• · hangos kezeléssel 300-1000 bp-s fragmentumokká tördeltünk, adunk ahhoz a keverékhez, amely 200(/v\g linearizált pSV2-DHFR-t ésPrior to electroporation, plasmid pSV2-DHFR was linearized by digestion with AatlI overnight. The expression island sequences were isolated from the vector sequences by restriction digestion as described in Example 2, followed by gel electrophoresis to allow isolation and isolation (see Maniatis, cited above). Salmon sperm DNA (200 µg / tg) previously digested into 300-1000 bp fragments by sonication is added to the mixture of 200 µg / g of linearized pSV2-DHFR and

0,5 mg/ml kifejezési sziget konstrukciót tartalmaz. Abból a célból, hogy a DNS-t kicsapjuk, NaCl-t adunk a keverékhez 0,1 mól/1 végső koncentrációig. Ezután 2,5 térfogat etanolt adunk hozzá és a keveréket 10 percig szárazjégen inkubáljuk. 10 percig centrifugáljuk 4°C hőmérsékleten, majd az etanolt leszívjuk és a DNS üledéket 15 percen át levegőn szárítjuk egy szövettenyésztő tartályban. A DNS üledéket azután újra szuszpendáljuk 800 ^/11 HeBS pufferban E_20 mmól/1 Hepes/Na0H(pH 7,05); 137 mmól/1 NaCl; 5 mmól/1 KC1; 0,7 mmól/1 Ν3 2ΗΡ0^ ; 6 mmól/1 glükóz) legalább 2 órával az elektroporáció előtt.Contains 0.5 mg / ml expression island construct. In order to precipitate the DNA, NaCl was added to the mixture to a final concentration of 0.1 M. Subsequently, 2.5 volumes of ethanol were added and the mixture was incubated on dry ice for 10 minutes. After centrifugation at 4 ° C for 10 minutes, ethanol is aspirated and the DNA pellet is air-dried for 15 minutes in a tissue culture vessel. The DNA pellet was then resuspended in 800 µl HeBS buffer E20 mM Hepes / NaOH pH 7.05; 137 mM NaCl; 5 mM KCl; 0.7 mmol / lΝΝΗΡΗΡ ^ ^; 6 mM glucose) at least 2 hours before electroporation.

Mintegy 2.10⁷ DHFR^- CHO sejtet Qa CH0-DUKX-B1 nevű kiónból szubklónozzuk, amelyet Urlaub és Charis írnak le az alábbi közleményben: Isolation Of Chinese Hamster Cell Mutants Deficient In Dihídrofolate Reductase Activity, Proc. Natl. Acad. Sci.USAAbout 2.10 ⁷ DHFR ^- CHO cells are subcloned from Qa clone CH0-DUKX-B1 described by Urlaub and Charis in Isolation of Chinese Hamster Cell Mutants Deficient In Dihydrofolate Reductase Activity, Proc. Natl. Acad. Sci.USA

77, 4216 alkalmazun k mindegyik elektroporációnál. A77, 4216 are applicable to each electroporation. THE

DHFR^- CHO sejteket három nappal az elektroporáció előtt passzáljuk, és az elektroporációhoz való kinyerés időpontjában a 10 cm-es lemezeken a tenyészet mintegy 50%-ban összefolyó. A DHFR CHO sejteket tripszines kezeléssel távolítjuk el a lemezekről, majd a tripszint lemezenként 8,0 ml <Z. ’ tápközeg j^MEM alfa, ribonukleotidokkal és dezoxiribonukleotidokkal kiegészítve (10-10 ng/1 adenozin, citidin, guanozin, uridin, 2’-dezoxi-adenozin, 2’dezoxi-guanozin és 2’-dezoxi-timidin ; 11 ng/1 2’-dezoxi-citidin hidroklorid)(Gibco Laboratories, Grand Island, New York)] _; 10¾ borjú embrió szérum (Házelton, Lenexa, KS) és 4 mmól/1 glutamin (M.A. Bioproducts, Walkersville, Maryland) hozzáadásával inaktiváljuk. A lemezekről leválasztott sejteket azután összegyűjt31 : ’··: *··:DHFR ^- CHO cells were passaged three days prior to electroporation and at the time of harvest for electroporation, the culture was confluent at about 50% on 10 cm plates. DHFR CHO cells were removed from the plates by trypsin treatment and then 8.0 ml <Z of trypsin per plate. medium supplemented with 1 M MEM alpha supplemented with ribonucleotides and deoxyribonucleotides (10-10 ng / L adenosine, cytidine, guanosine, uridine, 2'-deoxyadenosine, 2'-deoxyguanosine and 2'-deoxythymidine; 11 ng / L 2'-deoxycytidine hydrochloride (Gibco Laboratories, Grand Island, New York)] _; It is inactivated by the addition of 10¾ calf embryo serum (Házelton, Lenexa, KS) and 4 mM glutamine (MA Bioproducts, Walkersville, Maryland). The cells isolated from the plates are then harvested31: '··: * ···

♦ · .. ·· · jük és 1000 fordulat/percnél 4 percen át centrifugáljuk. A tápközeg legnagyobb részét leszívjuk a sejtüledékről, és újra szuszpendáljuk a megmaradt tápközeg-maradékban a tatásával.♦ · .. ·· · and centrifuged at 1000 rpm for 4 minutes. Most of the medium is aspirated from the cell pellet and resuspended in the remaining medium by plating.

A kifejezési szigetet, a pSV2-DHFR-t, valamint a a sejteket cső kocoglazac sperma DNS-t - 800^1 lxHeBS-ben szuszpendálva - azután hozzáadjuk a DHFR CHO sejtszuszpenzióhoz. Az így létrejövő keveréket azonnal átvisszük egy elektroporációs küvettába. Az elektroporációs berendezés ra állítjuk be.The expression island, pSV2-DHFR, as well as the tubular coccoglazers' sperm DNA, suspended in 800 µl x HeBS, are then added to the DHFR CHO cell suspension. The resulting mixture is immediately transferred to an electroporation cuvette. Set it on the electroporation device.

sodpercig tart, kondenzátorát 960^F-ra, és feszültségét 300 VEgy egyedi löketet, amely mintegy 10 milli-má adunk a küvetta tartalmának szobahőmérsékleten.rpm, its capacitor is 960 µF, and its voltage is 300 µg individual stroke, which is added to about 10 milliliters of the contents of the cuvette at room temperature.

A sejteket azután 8-10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd átvisszük egy 14 ml cL⁺ tápközeget tartalmazó csőbe. A sejteket a fentiek szerint centrifugáljuk. A tápközeg leszivatása után a nedves sejtüledéket újra szuszpendáljuk a cső kocogtatásával, majd friss *Á⁺ tápközeget adunk hozzá. A szuszpendált sejteket azután tenyésztő lemezekre oltjuk át nem szelektív tápközegre 2 napra, hogy lehetővé váljék az elektroporáció utáni sejtek kinyerése és a szelektív gén kifejezése. Az életképes CHO teljes sejtek mintegy 20-30'^-áról úgy véljük, hogy beépítette a kifejezési sziget/pSV2-DHFR-t, és így túlélte a szelekciós munkafolyamatot. Ennél fogva 10 cm-es lemezenként mintegy 1.10^ sejtet oltunk át és tenyésztünk 37°C hőmérsékleten, 5,5¾ co₂-t tartalmazó inkubáto'rban.The cells are then incubated for 8-10 minutes at room temperature and transferred to a tube containing 14 ml of cL ⁺ medium. The cells are centrifuged as above. After the medium was aspirated, the wet cell pellet was resuspended by jogging the tube and then fresh * Á ⁺ medium was added. The suspended cells are then seeded on culture plates for 2 days in non-selective medium to allow for the recovery of cells after electroporation and expression of the selective gene. About 20-30 'of viable CHO whole cells are believed to have incorporated the expression island / pSV2-DHFR and thus survived the selection workflow. Therefore, a 10 cm plate of about 1.10 ^ cells were seeded into and cultured at 37 ° C, containing ₂ per inkubáto'rban 5,5¾ co.

Két napos helyreállítási periódus után a sejteket a tő lemezről tripszines kezeléssel eltávolítjuk a fentebb tényészleírtak szerint , megszámoljuk és 6 db 10 cm-es lemezre oltjuk mintegyAfter a two-day recovery period, cells are removed from the stem plate by trypsin treatment as described above, counted and inoculated into 6 x 10 cm plates.

1.10^ sejt/lemez sűrűséggel, << tápközegben (Sigma Chemical Co.).1.10 cells / plate in << medium (Sigma Chemical Co.).

A kifejezési szigetet és a pSV2-DHFR-t tartalmazó sejteket 4 napos,oC” tápközegen végzett inkubálás után szelektáljuk. A szelek• · »Cells containing the expression island and pSV2-DHFR are selected after incubation for 4 days in oC medium. The Winds • · »

• · • · · · • · · · · • · tált sejteket azután urokináz kifejezésére megvizsgáljuk standard technikákkal, pl. kereskedelmi forgalomban kapható Spectrozyme kolorimetriás vizsgáló készlettel (Americana Diagnostica, Inc.)Tested cells are then assayed for urokinase expression by standard techniques, e.g. with a commercially available Spectrozyme Colorimetric Assay Kit (Americana Diagnostica, Inc.)

Számos kiónt izolálunk, amelyek különböző szinten fejeznek ki urokinázt. Ezekből a kiónokból DNS-t és RNS-t izolálunk, és Northern, illetve Southern elemzést végzünk, hogy meghatározzuk a kifejezési sziget kontstrukció transzkripciós szintjét és kópiaszámát. Ez az elemzés feltárja, vajon az urokináz üzenet kifejezése függvénye-e a kópiaszámnak, és független-e az integrált konstrukció integrálódási helyétől.Numerous clones have been isolated which express urokinase at different levels. DNA and RNA were isolated from these clones and Northern and Southern analysis was performed to determine the transcriptional level and copy number of the expression island construct. This analysis reveals whether the expression of the urokinase message is dependent on copy number and independent of the site of integration of the integrated construct.

Egy jelen találmány szerinti konstrukciót, amely tartalmazza a CAS 1288 plazmidot, példaként egy olyan tenyészet testesít meg, amely az In Vitro International, Inc.-nél (Linthicum, Maryland) lett deponálva 1990. február 1-én; ebben a CAS 1288 azonosítható, és ez a CAS 1288 plazmid E. coli DH5-ben van. Ennek deponálási száma IVI 10232 . It: <x törzset kc/'tl a L hi^ez-tü k ,.vz í\^cΙ'ΐί-Λπ CliILmi'c í c? ílect lu í'i - ₍ 4/ho¹ az Alii Ölj £·An embodiment of the present invention comprising plasmid CAS 1288 is exemplified by a culture deposited with In Vitro International, Inc. (Linthicum, Maryland) on February 1, 1990; this identifies CAS 1288 and contains plasmid CAS 1288 in E. coli DH5. It is deposited under IVI 10232. It: <x strain kc / 'tl a L hi ^ ez-tık, .vz í \ ^ cΙ'ΐί-Λπ CliILmi'c í c? ílect lu í'i - ₍ 4 / ho ¹ of Alii Kill £ ·

Egy második, jelen találmány szerinti konstrukciót, amely a CAS 1295 plazmidot tartalmazza, példaként egy olyan tenyészet testesít meg, amely az In Vitro International, Inc.-nél (Linthicum, Maryland) lett deponálva 1990. február 1-én; ebben a CAS 1295 plazmid E. coli DH5-ben van. Ennek deponálási száma IVI 10231 >/7i ; <λ tó>.>/ lyfí: ίζΙτζίΎ ( _v; i j ' Ili:, t ά ' A h ó’ l ű ' '\ j í * - O í í t' s Z . - ^Ί ? t k iA j· íA second construct of the present invention comprising the plasmid CAS 1295 is exemplified by a culture deposited with In Vitro International, Inc. (Linthicum, Maryland) on February 1, 1990; this plasmid CAS 1295 is in E. coli DH5. Its deposit number is IVI 10231> / 7i; <λ lake>.> / lyfí: ίζΙτζίΎ ( _v ; ij 'Ili :, t ά' A h ó 'l û''\ j í * - O í í t' s Z. - ^Ί ? tk iA j · í

Bár itt egy sor kiviteli módját ismertettük találmányunknak, nyilvánvaló, hogy alapvető konstrukciónk változtatható . így más olyan kiviteli módokat hozhatunk létre, amelyek a jelen találmány munkameneteit és kompozícióit alkalmazzák. így tehát a találmány oltalmi körét nem a példákban megadott speciális kiviteli módok, hanem a mellékelt igénypontok szabják meg.Although a number of embodiments of the present invention have been described herein, it is obvious that our basic construction is variable. Thus, other embodiments may be provided that employ the procedures and compositions of the present invention. Thus, the scope of the invention is not limited to the specific embodiments shown in the examples, but to the appended claims.

Claims (13)

SZABADALMI IGÉNYPONTOKPATENT CLAIMS 1. ) Eljárás egy kívánt polipeptid magas szintű termelésére valamely gazdaszervezetben azzal jellemezve, hogy1.) A method of producing high levels of a desired polypeptide in a host comprising: i. ) legalább egy kifejezési szigetet integrálunk az említett gazdaszervezet genomjába, ahol az említett kifejezési szigeti. ) integrating at least one expression island into said host genome, wherein said expression island 5’ —> 3’ irányban tartalmaz egy 5’ szegélyező területet, egy heterológ polipeptidet kódoló szekvenciát és egy 3’ szegélyező területet; az említett 5’ szegélyező terület tartalmaz 5’ kifejezés kontroll szekvenciákat működőképesen összekapcsolva egy említett heterológ polipeptidet kódoló szekvenciával, és egy 5’ nemtranszlatált területet; az említett 3’ szegélyező terület tartalmaz egy 3’ nem transzlatált területet és 3’ kifejezés kontroll szekvenciákat működőképesen összekapcsolva az említett heterológ polipeptidet kódoló szekvenciával; és az említett kifejezési sziget 5’ és 3’ szegélyező területei megfelelő méretűek és szerkezetűek ahhoz, hogy hatásosan függővé tegyék a kívánt heterológ polipeptid termelését a gazdaszervezet genomjába integrált kifejezési sziget kópiaszámától, és lényegében függetlenné tegyék a kifejezési sziget integrálódási helyétől a gazdaszervezet genomban; és ii. ) az említett gazdaszervezetet tenyésztjük olyan körülmények között, amely lehetővé teszi a kívánt heterológ polipeptid kifejeződését.5 'to 3' comprises a 5 'flanking region, a heterologous polypeptide coding sequence and a 3' flanking region; said 5 'flanking region comprising a 5' expression control sequence operably linked to a coding sequence for said heterologous polypeptide and a 5 'untranslated region; said 3 'flanking region comprising a 3' untranslated region and a 3 'expression control sequence operably linked to said heterologous polypeptide coding sequence; and the flanking regions 5 'and 3' of said expression island are sized and structured to efficiently depend on the production of the desired heterologous polypeptide for copy number integrated into the host genome and substantially independent of the expression site integration site in the host genome; and ii. ) culturing said host under conditions that allow expression of the desired heterologous polypeptide. 2. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett heterológ polipeptidet kódoló szekvencia tartalmaz működőképes szignál szekvenciát kódoló területet is.2. The method of claim 1, wherein said heterologous polypeptide coding sequence further comprises a coding region for a functional signal sequence. 3. ) A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett szignál szekvenciát kódoló terület egy tejspecifikus fehérje génből származik.3. The method of claim 2, wherein said region encoding said signal sequence is derived from a milk-specific protein gene. • 4 « · • *• 4 «· • * 4 4 · • 4 ·· • 4 444 4 · • 4 ·· • 4 44 4. ) A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a tejspecifikus fehérje gén kazein gén.4. The method of claim 3, wherein the milk-specific protein gene is a casein gene. 5. ) A 2.-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet valamely tejelő emlős, az alábbiak közül: egér, szarvasmarha, juh, kecske és sertés; és az 5’ és 3’ szegélyező szekvenciák egy tejspecifikus fehérje génből származnak.5.) In steps 2-4. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the host is a dairy mammal, selected from the group consisting of mice, cattle, sheep, goats and pigs; and the 5 'and 3' flanking sequences are derived from a milk-specific protein gene. 6. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a heterológ polipeptidet kódoló szekvencia az alábbi polipeptidek valamelyikét kódoló szekvencia: tPA, urokináz, Müllerféle gátló anyag (Mullerian Inhibiting Substance), valamely interferon, VIII. és IX. alvadási faktor, valamely állati növekedési faktor, inzulin, valamely interleukin, valamely immunglobulin és valamely lipokortin.6. The method of claim 1, wherein the heterologous polypeptide coding sequence is one of the following polypeptides: tPA, urokinase, Mullerian Inhibiting Substance, interferon, VIII. and IX. clotting factor, animal growth factor, insulin, an interleukin, an immunoglobulin and a lipocortin. 7. ) Kifejezési sziget azzal jellemezve, hogy 5’ —> 3’ irányban tartalmaz egy 5’ szegélyező területet, egy heterológ polipeptidet kódoló szekvenciát és egy 3’ szegélyező területet; az említett 5’ szegélyező terület tartalmaz 5’ kifejezés kontroll szekvenciákat működőképesen összekapcsolva egy említett heterológ polipeptidet kódoló szekvenciával, és egy 5’ nem-transzlatált területet; az említett 3’ szegélyező terület tartalmaz egy 3’ nem transzlatált területet és 3’ kifejezés kontroll szekvenciákat működőképesen összekapcsolva az említett heterológ polipeptidet; kódoló szekvenciával; és az említett kifejezési sziget 5’ és 3’ szegélyező területei megfelelő méretűek és szerkezetűek ahhoz, hogy hatásosan függővé tegyék a kívánt heterológ polipeptid termelését a gazdaszervezet genomjába integrált kifejezési sziget kópiaszámától, és lényegében függetlenné tegyék a kifejezési sziget integrálódási helyétől a gazdaszervezet genomban.7.) An expression island comprising a 5 'flanking region, a coding sequence for a heterologous polypeptide and a 3' flanking region in the 5 'to 3' direction; said 5 'flanking region comprising a 5' expression control sequence operably linked to a coding sequence for said heterologous polypeptide and a 5 'untranslated region; said 3 'flanking region comprising a 3' untranslated region and a 3 'expression control sequence operably linked to said heterologous polypeptide; a coding sequence; and the 5 'and 3' flanking regions of said expression island are sized and structured to efficiently depend on the production of the desired heterologous polypeptide for copy number integrated into the host genome and substantially independent of the expression site integration site in the host genome. ···« ·· ····· «·· ·· 8. ) A 7. igénypont szerinti kifejezési sziget azzal jellemezve, hogy az említett heterológ polipeptidet kódoló szekvencia tartalmaz működőképes szignál szekvenciát kódoló területet is.8. The expression island of claim 7, wherein said heterologous polypeptide coding sequence further comprises a coding region for a functional signal sequence. 9. ) A 7. igénypont szerinti kifejezési sziget azzal jellemezve, hogy az 5’ és 3’ szegélyező szekvenciák egy tejspecifikus fehérje génből származnak.Expression island according to claim 7, characterized in that the 5 'and 3' flanking sequences are derived from a milk-specific protein gene. 10. ) A 8. .igénypont szerinti kifejezési sziget azzal jellemezve, hogy az említett szignál szekvenciát kódoló terület egy tejspecifikus fehérje génből származik.10. The expression island of claim 8, wherein the coding region for said signal sequence is derived from a milk-specific protein gene. 11. ) A 9. igénypont szerinti kifejezési sziget azzal jellemezve, hogy a tejspecifikus fehérje gén kazein gén.11. The expression island of claim 9, wherein the milk-specific protein gene is a casein gene. 12. ) A 7. igénypont szerinti kifejezési sziget azzal jellemezve, hogy a heterológ polipeptidet .kódoló szekvencia az alábbi polipeptidek valamelyikét kódoló szekvencia: tPA, urokináz, Müller-féle gátló anyag (Mullerian Inhibiting Substance), valamely interferon, VIII. és IX. alvadási faktor, valamely állati növekedési faktor, inzulin, valamely interleukin, valamely immunglobulin és valamely lipokortin.12. The expression island of claim 7, wherein the heterologous polypeptide encoding sequence is one of the following polypeptides: tPA, urokinase, Mullerian Inhibiting Substance, interferon, VIII. and IX. clotting factor, animal growth factor, insulin, an interleukin, an immunoglobulin and a lipocortin. 13. ) Transzformált gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy genomja egy 7.-12. igénypontok bármelyike szerinti integrált kifejezési szigetet tartalmaz.13.) A transformed host, characterized in that its genome has a sequence from 7 to 12. An integrated expression island according to any one of claims 1 to 6.