JP2001520041A - 新規な改変核酸配列並びに細胞システムにおいてｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させる方法 - Google Patents
新規な改変核酸配列並びに細胞システムにおいてｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させる方法Info
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、改変された組換え核酸(好ましくは、ＤＮＡ)配列並びに細胞培養システム、哺乳動物細胞培養システム又はトランスジェニック動物において発現させることが困難であることが知られている(又は困難であることがありそうな)マラリア表面蛋白質ＭＳＰ−１のｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させる方法を提供する。この発明の組換え技術を用いる発現のための好適な「困難な」蛋白質の候補は、用いるべき組換え発現システムと比べて全体的に高いＡＴ含量若しくはＡＴリッチな領域及び／又はｍＲＮＡ不安定性モチーフ及び／又は希なコドンを含むＤＮＡコード配列を有する異種細胞(好ましくは、寄生虫、細菌及びウイルス等の下等生物)から導かれる蛋白質である。
Description
【０００１】発明の背景 発明の分野 この発明は、異種遺伝子発現に関するものである。一層特に、この発明は、微
生物又は寄生性生物の遺伝子の一層高等な真核生物細胞システムにおける発現に
関係する。
生物又は寄生性生物の遺伝子の一層高等な真核生物細胞システムにおける発現に
関係する。
【０００２】 関連技術の要約 ある種の異種遺伝子産物の組換え生成は、イン・ビトロ細胞培養システム又は
イン・ビボ組換え生成システムにおいて、しばしば、困難である。例えば、多く
の研究者が、細菌、寄生虫及びウイルスに由来する蛋白質を、その蛋白質が最初
に得られた細胞と異なる細胞培養システム特に哺乳動物細胞培養システムにおい
て発現させることが困難であることを見出した。哺乳動物細胞により生成するこ
とが困難であった治療上重要な蛋白質の一例は、マラリア娘虫表面蛋白質(ＭＳ Ｐ−１)である。
イン・ビボ組換え生成システムにおいて、しばしば、困難である。例えば、多く
の研究者が、細菌、寄生虫及びウイルスに由来する蛋白質を、その蛋白質が最初
に得られた細胞と異なる細胞培養システム特に哺乳動物細胞培養システムにおい
て発現させることが困難であることを見出した。哺乳動物細胞により生成するこ
とが困難であった治療上重要な蛋白質の一例は、マラリア娘虫表面蛋白質(ＭＳ Ｐ−１)である。
【０００３】 マラリアは、熱帯の国々における重大な健康上の問題である。現存薬物に対す
る耐性は、急速に広がりつつあり、ワクチンが緊急に必要とされている。P.falc
iparumの生活環において発現される多数の抗原の内で、ＭＳＰ−１が、最も広範
囲に研究されており、予防接種のための最も上首尾の候補である見込みがある。
P.falciparumにさらされた個人は、ＭＳＰ−１に対する抗体を発生し、研究は、
ＭＳＰ−１に対する自然に得られた免疫応答と減じたマラリア罹患率との間に相
関があることを示した。多数の研究の内で、精製した天然のＭＳＰ−１又はこの
蛋白質の組換え断片での免疫化は、少なくともこの寄生虫に対する部分的防護を
誘導した(Diggs等(1993)Parasitol.Today9:300-302)。従って、ＭＳＰ−１は、P
.falciparumに対するワクチンの開発に関して重要な標的である。
る耐性は、急速に広がりつつあり、ワクチンが緊急に必要とされている。P.falc
iparumの生活環において発現される多数の抗原の内で、ＭＳＰ−１が、最も広範
囲に研究されており、予防接種のための最も上首尾の候補である見込みがある。
P.falciparumにさらされた個人は、ＭＳＰ−１に対する抗体を発生し、研究は、
ＭＳＰ−１に対する自然に得られた免疫応答と減じたマラリア罹患率との間に相
関があることを示した。多数の研究の内で、精製した天然のＭＳＰ−１又はこの
蛋白質の組換え断片での免疫化は、少なくともこの寄生虫に対する部分的防護を
誘導した(Diggs等(1993)Parasitol.Today9:300-302)。従って、ＭＳＰ−１は、P
.falciparumに対するワクチンの開発に関して重要な標的である。
【０００４】 ＭＳＰ−１は、１９０〜２２０ｋＤＡの糖蛋白質である。そのＣ末端領域は、
ワクチンとしての利用のための組換え生成の焦点であった。しかしながら、ワク
チンとしてのＭＳＰ−１の開発における主要な問題は、細菌又は酵母発現システ
ムにおいて、免疫学的効力においてアフィニティー精製した天然の蛋白質と同等
である組換え蛋白質を得ること(Chang等(1992)J.Immunol.148:548-555)及びワク
チン生産を可能にするのに十分な量で該組換え蛋白質を得ることの困難さである
。
ワクチンとしての利用のための組換え生成の焦点であった。しかしながら、ワク
チンとしてのＭＳＰ−１の開発における主要な問題は、細菌又は酵母発現システ
ムにおいて、免疫学的効力においてアフィニティー精製した天然の蛋白質と同等
である組換え蛋白質を得ること(Chang等(1992)J.Immunol.148:548-555)及びワク
チン生産を可能にするのに十分な量で該組換え蛋白質を得ることの困難さである
。
【０００５】 以前には組換えにより生成することが困難であった寄生虫、細菌及びウイルス
性生物体に由来する蛋白質の十分な量の発現を促進する改良された手順は、好都
合であろう。特に、十分な量でＭＳＰ−１を発現することのできる組換えシステ
ムは、特に好都合であろう。
性生物体に由来する蛋白質の十分な量の発現を促進する改良された手順は、好都
合であろう。特に、十分な量でＭＳＰ−１を発現することのできる組換えシステ
ムは、特に好都合であろう。
【０００６】発明の要約 本発明は、改良された組換えＤＮＡ組成物並びに以前は細胞培養システム、哺
乳動物細胞培養システム又はトランスジェニック哺乳動物において発現させるの
が困難であった異種細胞(好ましくは、細菌、ウイルス及び寄生虫等の下等生物)
由来のｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させる手順を提供する。この発明に
よる発現システムにおける発現のための好適な蛋白質の候補は、この組換え発現
システムと比べて全体的に高いＡＴ含量若しくはＡＴリッチな領域及び／又はｍ
ＲＮＡ不安定性モチーフ及び／又は希なコドンを含むＤＮＡコード配列を有する
蛋白質である。
乳動物細胞培養システム又はトランスジェニック哺乳動物において発現させるの
が困難であった異種細胞(好ましくは、細菌、ウイルス及び寄生虫等の下等生物)
由来のｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させる手順を提供する。この発明に
よる発現システムにおける発現のための好適な蛋白質の候補は、この組換え発現
システムと比べて全体的に高いＡＴ含量若しくはＡＴリッチな領域及び／又はｍ
ＲＮＡ不安定性モチーフ及び／又は希なコドンを含むＤＮＡコード配列を有する
蛋白質である。
【０００７】 第一の面において、この発明は、システムにおいて発現され得る改変された公
知の核酸(好ましくは、細菌、ウイルス又は寄生虫に由来する遺伝子)を特徴とし
、ここに、改変は、未改変配列と比べて減じたＡＴ含量を含み、随意、天然の遺
伝子中に存在する少なくとも一つのｍＲＮＡ不安定性モチーフの除去を更に含む
。ある好適具体例において、この改変は、更に、天然の遺伝子の少なくとも一つ
のコドンのこの細胞システムの好適コドンでの置換を含む。
知の核酸(好ましくは、細菌、ウイルス又は寄生虫に由来する遺伝子)を特徴とし
、ここに、改変は、未改変配列と比べて減じたＡＴ含量を含み、随意、天然の遺
伝子中に存在する少なくとも一つのｍＲＮＡ不安定性モチーフの除去を更に含む
。ある好適具体例において、この改変は、更に、天然の遺伝子の少なくとも一つ
のコドンのこの細胞システムの好適コドンでの置換を含む。
【０００８】 第二の面において、この発明は、蛋白質をコードする天然の遺伝子の全体的Ａ
Ｔ含量を低下させるステップ及び／又は少なくとも一つのｍＲＮＡ不安定性モチ
ーフを除去するステップ及び／又は少なくとも一つのコドンを選択した細胞シス
テムの好適コドンで置換するステップ{すべて、天然の遺伝子中の少なくとも一 つのコドンを、選択した細胞システムに認識可能な(好ましくは、選択した細胞 システムに好まれる)コドンで置換し且つ置換されたコドンと同じアミノ酸をコ ードするコドンで置換することによる}を含むこの発明の改変された核酸を調製 する方法を提供する。この発明のこの面は、更に、この発明の方法により調製さ
れた改変された核酸を含む。
Ｔ含量を低下させるステップ及び／又は少なくとも一つのｍＲＮＡ不安定性モチ
ーフを除去するステップ及び／又は少なくとも一つのコドンを選択した細胞シス
テムの好適コドンで置換するステップ{すべて、天然の遺伝子中の少なくとも一 つのコドンを、選択した細胞システムに認識可能な(好ましくは、選択した細胞 システムに好まれる)コドンで置換し且つ置換されたコドンと同じアミノ酸をコ ードするコドンで置換することによる}を含むこの発明の改変された核酸を調製 する方法を提供する。この発明のこの面は、更に、この発明の方法により調製さ
れた改変された核酸を含む。
【０００９】 第三の面において、この発明は又、この発明の核酸及び選択した細胞株又は生
物中で活性なプロモーターを含むベクター、並びにこの発明の核酸でトランスフ
ォームされた宿主細胞をも提供する。
物中で活性なプロモーターを含むベクター、並びにこの発明の核酸でトランスフ
ォームされた宿主細胞をも提供する。
【００１０】 第四の面において、この発明は、この発明の核酸を含むトランスジェニック泌
乳動物の作成ためのトランスジェニック発現ベクター及び生殖細胞系がこの発明
の核酸を含むトランスジェニック非ヒト泌乳動物を提供する。
乳動物の作成ためのトランスジェニック発現ベクター及び生殖細胞系がこの発明
の核酸を含むトランスジェニック非ヒト泌乳動物を提供する。
【００１１】 第五の面において、この発明は、この発明の核酸、その核酸に機能的に結合さ
れたその核酸によりコードされる蛋白質の乳腺でのトランスジェニック動物の乳
汁中への発現を指示するプロモーターを含むトランスジェニック泌乳動物種の作
成のためのトランスジェニック発現ベクターを提供する。
れたその核酸によりコードされる蛋白質の乳腺でのトランスジェニック動物の乳
汁中への発現を指示するプロモーターを含むトランスジェニック泌乳動物種の作
成のためのトランスジェニック発現ベクターを提供する。
【００１２】 第六の面において、この発明は、この発明による改変された核酸を含むＤＮＡ
ワクチンを提供する。この発明のこの面の好適具体例には、この発明による改変
されたＭＳＰ−１遺伝子の断片が含まれる。
ワクチンを提供する。この発明のこの面の好適具体例には、この発明による改変
されたＭＳＰ−１遺伝子の断片が含まれる。
【００１３】好適具体例の詳細な説明 本明細書中で言及する特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立す
る。本明細書中で引用されている発行された米国特許、許可された出願、公開さ
れた外国出願及び参考文献は、本明細書中に参考として援用する。これらの参考
文献と本願の開示との間の如何なる矛盾も、本願の開示に賛成して解決されよう
。
る。本明細書中で引用されている発行された米国特許、許可された出願、公開さ
れた外国出願及び参考文献は、本明細書中に参考として援用する。これらの参考
文献と本願の開示との間の如何なる矛盾も、本願の開示に賛成して解決されよう
。
【００１４】 この発明は、改変された組換え核酸配列(好ましくは、ＤＮＡ)並びにｍＲＮＡ
レベルを及び細胞培養システム、哺乳動物細胞培養システムにおいて又はトラン
スジェニック動物において発現させることが困難であることが知られている(又 は、ありそうな)蛋白質の発現を増大させる方法を提供する。この発明の組換え 技術を用いる発現のための好適な「困難な」蛋白質の候補は、異種細胞好ましく
は寄生虫、細菌及びウイルス等の下等生物から導かれた、用いられるべき組換え
発現システムと比較して全体的に高いＡＴ含量即ちＡＴリッチの領域及び／又は
ｍＲＮＡ不安定性モチーフ及び／又は希なコドンを含む配列をコードするＤＮＡ
を有する蛋白質である。
レベルを及び細胞培養システム、哺乳動物細胞培養システムにおいて又はトラン
スジェニック動物において発現させることが困難であることが知られている(又 は、ありそうな)蛋白質の発現を増大させる方法を提供する。この発明の組換え 技術を用いる発現のための好適な「困難な」蛋白質の候補は、異種細胞好ましく
は寄生虫、細菌及びウイルス等の下等生物から導かれた、用いられるべき組換え
発現システムと比較して全体的に高いＡＴ含量即ちＡＴリッチの領域及び／又は
ｍＲＮＡ不安定性モチーフ及び／又は希なコドンを含む配列をコードするＤＮＡ
を有する蛋白質である。
【００１５】 第一の面において、この発明は、細胞システムにおいて発現させることのでき
る改変された公知の核酸好ましくは細菌、ウイルス又は寄生虫に由来する遺伝子
を特徴とし、ここに、この改変は、減じたＡＴ含量(未改変配列と比べて)を含み
、適宜、天然の遺伝子中に存在する少なくとも一つのｍＲＮＡ不安定性モチーフ
の除去を更に含む。「細胞システム」は、細胞培養システム、組織培養システム
、器官培養システム及び生きている動物の組織を包含する。ある好適具体例にお
いては、この改変は、更に、天然遺伝子の少なくとも一つのコドンのこの細胞シ
ステムの好適コドンでの置換を含む。これらの特徴の各々は、天然遺伝子の少な
くとも一つのコドンを、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードするこの細胞
システムに認識可能な(好ましくは、好まれる)コドンで置換することにより達成
される。この発明により、かかる「サイレント」ヌクレオチド及びコドン置換は
、ｍＲＮＡを生成して所望の蛋白質を発現する細胞システムの能力を維持しつつ
(好ましくは、改良しつつ)、ゴールのＡＴ含量の低下及び／又はｍＲＮＡ不安定
性モチーフの除去及び／又は希なコドンの数を減らすことを達せするのに十分で
あるべきである。
る改変された公知の核酸好ましくは細菌、ウイルス又は寄生虫に由来する遺伝子
を特徴とし、ここに、この改変は、減じたＡＴ含量(未改変配列と比べて)を含み
、適宜、天然の遺伝子中に存在する少なくとも一つのｍＲＮＡ不安定性モチーフ
の除去を更に含む。「細胞システム」は、細胞培養システム、組織培養システム
、器官培養システム及び生きている動物の組織を包含する。ある好適具体例にお
いては、この改変は、更に、天然遺伝子の少なくとも一つのコドンのこの細胞シ
ステムの好適コドンでの置換を含む。これらの特徴の各々は、天然遺伝子の少な
くとも一つのコドンを、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードするこの細胞
システムに認識可能な(好ましくは、好まれる)コドンで置換することにより達成
される。この発明により、かかる「サイレント」ヌクレオチド及びコドン置換は
、ｍＲＮＡを生成して所望の蛋白質を発現する細胞システムの能力を維持しつつ
(好ましくは、改良しつつ)、ゴールのＡＴ含量の低下及び／又はｍＲＮＡ不安定
性モチーフの除去及び／又は希なコドンの数を減らすことを達せするのに十分で
あるべきである。
【００１６】 適当な緊縮条件下でこの発明の改変された核酸と特異的に相同である配列も又
、この発明に含まれる(これらの改変された核酸が由来した公知の核酸は、特異 的に排除する)。一の配列は、その配列の正確な相補鎖と特異的にハイブリダイ ズするのに十分に相同であるならば、他の配列と「特異的に相同」である。一の
配列は、もしそれが、体内で、又はイオン強度に関して生理的条件に近い条件下
(例えば、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2)でハイブリダイズしてワ トソン−クリック又はフーグスティーン塩基対を形成するならば、他の配列と「
特異的にハイブリダイズする」。好ましくは、かかる特異的ハイブリダイゼーシ
ョンは、緊縮条件下(例えば、６８℃で、０．２×ＳＳＣ)に維持する。
、この発明に含まれる(これらの改変された核酸が由来した公知の核酸は、特異 的に排除する)。一の配列は、その配列の正確な相補鎖と特異的にハイブリダイ ズするのに十分に相同であるならば、他の配列と「特異的に相同」である。一の
配列は、もしそれが、体内で、又はイオン強度に関して生理的条件に近い条件下
(例えば、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2)でハイブリダイズしてワ トソン−クリック又はフーグスティーン塩基対を形成するならば、他の配列と「
特異的にハイブリダイズする」。好ましくは、かかる特異的ハイブリダイゼーシ
ョンは、緊縮条件下(例えば、６８℃で、０．２×ＳＳＣ)に維持する。
【００１７】 好適具体例において、この発明の核酸は、哺乳動物細胞培養において、又はト
ランスジェニック動物において、天然遺伝子によりイン・ビトロ細胞培養システ
ム又はトランスジェニック動物において同じ条件下(即ち、同じ細胞型、同じ培 養条件、同じ発現ベクター)で発現される蛋白質の少なくとも２５％(好ましくは
５０％)の、更に一層好ましくは少なくとも１００％以上のレベルで蛋白質を発 現することができる。
ランスジェニック動物において、天然遺伝子によりイン・ビトロ細胞培養システ
ム又はトランスジェニック動物において同じ条件下(即ち、同じ細胞型、同じ培 養条件、同じ発現ベクター)で発現される蛋白質の少なくとも２５％(好ましくは
５０％)の、更に一層好ましくは少なくとも１００％以上のレベルで蛋白質を発 現することができる。
【００１８】 ここで用いる場合、用語「発現」は、蛋白質発現を生じるｍＲＮＡ転写を意味
する。発現は、関心ある蛋白質に特異的な抗体の利用を含む当分野で公知の多く
の技術によって測定することができる。「天然の遺伝子」又は「自然のままの遺
伝子」とは、野生型の蛋白質をコードし且つ改変された核酸が由来する遺伝子配
列又はその断片(天然の対立遺伝子変異体を含む)を意味する。「好適なコドン」
は、選択した細胞システムにより一層優勢に用いられるコドンを意味する。コド
ン置換が、少なくとも細胞システムにより認識されるコドンでありさえすれば、
ここに記載のすべてのコドンの変化が、好適コドンへの変化ではない。用語「減
じたＡＴ含量」は、ここで用いる場合、Ａ(アデニン)又はＴ(チミン)を含むヌク
レオチド位置の置換のために或はＡ及び／又はＴ含有コドンの選択した細胞シス
テムにより認識されるヌクレオチド又はコドンでの置換(該置換は、標的蛋白質 のアミノ酸配列を変化させない)のために、Ａ又はＴ塩基を有するヌクレオチド の全体的に一層低いパーセンテージ(天然の遺伝子と比べて)を有することを意味
する。「異種」は、ここでは、遺伝物質を導入した種と異なる種に起源を発する
その遺伝物質又はかかる遺伝物質から生成された蛋白質を示すために用いられて
いる。
する。発現は、関心ある蛋白質に特異的な抗体の利用を含む当分野で公知の多く
の技術によって測定することができる。「天然の遺伝子」又は「自然のままの遺
伝子」とは、野生型の蛋白質をコードし且つ改変された核酸が由来する遺伝子配
列又はその断片(天然の対立遺伝子変異体を含む)を意味する。「好適なコドン」
は、選択した細胞システムにより一層優勢に用いられるコドンを意味する。コド
ン置換が、少なくとも細胞システムにより認識されるコドンでありさえすれば、
ここに記載のすべてのコドンの変化が、好適コドンへの変化ではない。用語「減
じたＡＴ含量」は、ここで用いる場合、Ａ(アデニン)又はＴ(チミン)を含むヌク
レオチド位置の置換のために或はＡ及び／又はＴ含有コドンの選択した細胞シス
テムにより認識されるヌクレオチド又はコドンでの置換(該置換は、標的蛋白質 のアミノ酸配列を変化させない)のために、Ａ又はＴ塩基を有するヌクレオチド の全体的に一層低いパーセンテージ(天然の遺伝子と比べて)を有することを意味
する。「異種」は、ここでは、遺伝物質を導入した種と異なる種に起源を発する
その遺伝物質又はかかる遺伝物質から生成された蛋白質を示すために用いられて
いる。
【００１９】 この発明の特に好適な細胞システムには、哺乳動物細胞培養システム例えばＣ
ＯＳ細胞及びＣＨＯ細胞並びにトランスジェニック動物特にトランスジェニック
動物の乳組織が含まれる。しかしながら、この発明は又、細菌、酵母、大腸菌及
びバキュロウイルス等のウイルス性発現システム及び植物のシステムさえも企図
している。
ＯＳ細胞及びＣＨＯ細胞並びにトランスジェニック動物特にトランスジェニック
動物の乳組織が含まれる。しかしながら、この発明は又、細菌、酵母、大腸菌及
びバキュロウイルス等のウイルス性発現システム及び植物のシステムさえも企図
している。
【００２０】 第２の面において、この発明は、蛋白質をコードする天然の遺伝子の全体的Ａ
Ｔ含量を減じ、及び／又は少なくとも一つのｍＲＮＡ不安定性モチーフを除去し
、及び／又は少なくとも一つのコドンを選択した細胞システムの好適コドンで置
換するステップ(すべて、天然の遺伝子中の少なくとも一つのコドンを選択した 細胞システムにより好まれるコドンで置換することにより、且つ該置換後のコド
ンは、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする)を含むこの発明の改変さ れた核酸の製造方法を提供する。組換えＤＮＡ技術の原理を記載している標準的
な参考文献には、Watson,J.D.等、Molecular Biology of the Gene,第Ｉ及びＩ Ｉ巻 the Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.publisher,Menlo Park,カ
リフォルニア (1987)Darnell,J.E.等、Molecular Cell Biology,Scientific American Books,Inc.,Publisher,New York,ニューヨーク(1986); Old,R.W.,等、Principles of G ene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering,第二版、Univers
ity of California Press,publisher,Berkeleyカリフォルニア(1981); Maniatis,T.,等 、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版、Cold Spring Harbor Labo
ratory,publisher,Cold Spring Harbor,ニューヨーク(1989)及びCurrent Protocols in Molecular Biology,Ausubel等、Wiley Press,New York,ニューヨーク(1992)が含まれ る。この発明のこの面は、この発明の方法により調製された改変された核酸をも
包含する。
Ｔ含量を減じ、及び／又は少なくとも一つのｍＲＮＡ不安定性モチーフを除去し
、及び／又は少なくとも一つのコドンを選択した細胞システムの好適コドンで置
換するステップ(すべて、天然の遺伝子中の少なくとも一つのコドンを選択した 細胞システムにより好まれるコドンで置換することにより、且つ該置換後のコド
ンは、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする)を含むこの発明の改変さ れた核酸の製造方法を提供する。組換えＤＮＡ技術の原理を記載している標準的
な参考文献には、Watson,J.D.等、Molecular Biology of the Gene,第Ｉ及びＩ Ｉ巻 the Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.publisher,Menlo Park,カ
リフォルニア (1987)Darnell,J.E.等、Molecular Cell Biology,Scientific American Books,Inc.,Publisher,New York,ニューヨーク(1986); Old,R.W.,等、Principles of G ene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering,第二版、Univers
ity of California Press,publisher,Berkeleyカリフォルニア(1981); Maniatis,T.,等 、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版、Cold Spring Harbor Labo
ratory,publisher,Cold Spring Harbor,ニューヨーク(1989)及びCurrent Protocols in Molecular Biology,Ausubel等、Wiley Press,New York,ニューヨーク(1992)が含まれ る。この発明のこの面は、この発明の方法により調製された改変された核酸をも
包含する。
【００２１】 如何なる理論に限定されるものでもないが、以前の研究は、ＧＭ−ＣＳＦｍＲ
ＮＡの３’非翻訳領域からの保存されたＡＵ配列(ＡＵＵＵＡ)が選択的ｍＲＮＡ
分解を媒介することを示した(Shaw,G.及びKamen,R.Cell46:659-667)。この過去 における焦点は、遺伝子の非翻訳領域内のこれらの不安定性モチーフの存在の上
にあった。本発明は、遺伝子のコード領域内の不安定性配列の除去の利点を認識
する最初のものである。
ＮＡの３’非翻訳領域からの保存されたＡＵ配列(ＡＵＵＵＡ)が選択的ｍＲＮＡ
分解を媒介することを示した(Shaw,G.及びKamen,R.Cell46:659-667)。この過去 における焦点は、遺伝子の非翻訳領域内のこれらの不安定性モチーフの存在の上
にあった。本発明は、遺伝子のコード領域内の不安定性配列の除去の利点を認識
する最初のものである。
【００２２】 第３の面において、この発明は又、この発明の核酸及び選択した細胞株又は生
物中で活性なプロモーターを含むベクター、及びこの発明の核酸でトランスフォ
ームされた宿主細胞をも提供する。好適なベクターは、複製起点を含み、従って
、少なくとも一の細胞型において複製可能である。ある好適なベクターは、発現
ベクターであり、少なくとも一つのプロモーター及び受動的ターミネーターを更
に含み、それにより、組換え発現エレメントの細菌、カビ、植物、昆虫又は哺乳
動物細胞における転写を可能にしている。
物中で活性なプロモーターを含むベクター、及びこの発明の核酸でトランスフォ
ームされた宿主細胞をも提供する。好適なベクターは、複製起点を含み、従って
、少なくとも一の細胞型において複製可能である。ある好適なベクターは、発現
ベクターであり、少なくとも一つのプロモーター及び受動的ターミネーターを更
に含み、それにより、組換え発現エレメントの細菌、カビ、植物、昆虫又は哺乳
動物細胞における転写を可能にしている。
【００２３】 第４の面において、この発明は、この発明の核酸を含むトランスジェニック泌
乳動物の作成のためのトランスジェニック発現ベクター並びに、生殖細胞系列が
この発明の核酸を含むトランスジェニック非ヒト泌乳動物を提供する。かかるト
ランスジェニック発現ベクターは、宿主トランスジェニック動物のゲノムの部分
として発現することのできるプロモーターを含む。トランスジェニック動物作成
のための一般的原理は、当分野で公知である。例えば、Hogan等,Manipulating t
he Mouse Embryo: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1986
)；Simons等,Bio/Technology6:179-183,(1988)；Wall等,Biol.Reprod.32:645-65
1,(1985)；Buhler等,Bio/Technology,8:140-143(1990)；Ebert等,Bio/Technolog
y9:835-838(1991)；Krimenfort等,Bio/Technology9:844-847(1991)；Wall等,J.C
ell.Biochem.49:113-120(1992)を参照されたい。外来ＤＮＡ配列を哺乳動物及び
それらの生殖細胞に導入する技術は、最初、マウスにおいて開発された。例えば
、Gordon等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:7380-7384,(1980)；Gordon及びRuddle,S
cience214:1244-1246(1981)；Palmiter及びBrinster,Cell41:343-345,1985；Bri
nster等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:4438-4442(1985)及びHogan等(前出)を参照 されたい。これらの技術は、その後、ウシ及びヤギを含むもっと大きい動物用に
改変された。ごく最近まで、トランスジェニックマウス又は家畜の作成のための
最も広く用いられた手順においては、トランスジェニック発現構築物の形態の関
心あるＤＮＡの数百の線状分子が、受精卵の前核の一つに注入される。接合体の
細胞質中へのＤＮＡの注入も又、広く用いられている。最も最近において、未受
精卵に注入することのできる完全なトランスジェニック細胞系統のクローン化が
、達成された(KHS Campbell等,Nature380 64-66(1996))。
乳動物の作成のためのトランスジェニック発現ベクター並びに、生殖細胞系列が
この発明の核酸を含むトランスジェニック非ヒト泌乳動物を提供する。かかるト
ランスジェニック発現ベクターは、宿主トランスジェニック動物のゲノムの部分
として発現することのできるプロモーターを含む。トランスジェニック動物作成
のための一般的原理は、当分野で公知である。例えば、Hogan等,Manipulating t
he Mouse Embryo: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1986
)；Simons等,Bio/Technology6:179-183,(1988)；Wall等,Biol.Reprod.32:645-65
1,(1985)；Buhler等,Bio/Technology,8:140-143(1990)；Ebert等,Bio/Technolog
y9:835-838(1991)；Krimenfort等,Bio/Technology9:844-847(1991)；Wall等,J.C
ell.Biochem.49:113-120(1992)を参照されたい。外来ＤＮＡ配列を哺乳動物及び
それらの生殖細胞に導入する技術は、最初、マウスにおいて開発された。例えば
、Gordon等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:7380-7384,(1980)；Gordon及びRuddle,S
cience214:1244-1246(1981)；Palmiter及びBrinster,Cell41:343-345,1985；Bri
nster等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:4438-4442(1985)及びHogan等(前出)を参照 されたい。これらの技術は、その後、ウシ及びヤギを含むもっと大きい動物用に
改変された。ごく最近まで、トランスジェニックマウス又は家畜の作成のための
最も広く用いられた手順においては、トランスジェニック発現構築物の形態の関
心あるＤＮＡの数百の線状分子が、受精卵の前核の一つに注入される。接合体の
細胞質中へのＤＮＡの注入も又、広く用いられている。最も最近において、未受
精卵に注入することのできる完全なトランスジェニック細胞系統のクローン化が
、達成された(KHS Campbell等,Nature380 64-66(1996))。
【００２４】 第五の面において、この発明は、この発明の核酸、その核酸に機能的に結合さ
れ、その核酸によりコードされる蛋白質の乳腺での発現(トランスジェニック動 物の乳汁中への)を指示するプロモーターを含むトランスジェニック泌乳動物種 の作成のためのトランスジェニック発現ベクターを提供する。この乳腺発現シス
テムは、高発現レベル、低コスト、正確なプロセッシング及び利用しやすさの利
点を有している。公知の蛋白質例えばウシ及びヒトのアルファ−ラクトアルブミ
ンが、何人かの研究者により、泌乳トランスジェニック動物において生成されて
おり、(Wright等,Bio/Technology9:830-834(1991)；Vilotte等,Eur.J.Biochem.,
186:43-48(1989)；Hochi等,Mol Reprod.And Devel.33:160-164(1992)；Soulier 等,FEBS Letters297(1,2):13-18(1992))且つこのシステムは、高レベルの蛋白質
を生成することが示されている。
れ、その核酸によりコードされる蛋白質の乳腺での発現(トランスジェニック動 物の乳汁中への)を指示するプロモーターを含むトランスジェニック泌乳動物種 の作成のためのトランスジェニック発現ベクターを提供する。この乳腺発現シス
テムは、高発現レベル、低コスト、正確なプロセッシング及び利用しやすさの利
点を有している。公知の蛋白質例えばウシ及びヒトのアルファ−ラクトアルブミ
ンが、何人かの研究者により、泌乳トランスジェニック動物において生成されて
おり、(Wright等,Bio/Technology9:830-834(1991)；Vilotte等,Eur.J.Biochem.,
186:43-48(1989)；Hochi等,Mol Reprod.And Devel.33:160-164(1992)；Soulier 等,FEBS Letters297(1,2):13-18(1992))且つこのシステムは、高レベルの蛋白質
を生成することが示されている。
【００２５】 好適なプロモーターは、乳組織で活性である。乳汁特異的な蛋白質をコードす
る遺伝子例えば乳組織において見出される遺伝子において特異的に活性な即ち乳
汁が合成される生理的条件下で乳組織において他の組織におけるよりも一層活性
であるプロモーターは、特に有用である。最も好適なのは、乳組織に特異的で且
つ該組織で効率的であるプロモーターである。かかるプロモーターの内で、カゼ
イン、ラクトアルブミン及びラクトグロブリンのプロモーターが好適である(ア ルファ、べータ及びガンマカゼインプロモーター及びアルファラクトアルブミン
及びべータ−ラクトグロブリンプロモーターが含まれるが、これらに限られない
)。これらのプロモーターの内で、ゲッ歯類、ヤギ及びウシ由来のものが好適で ある。他のプロモーターには、乳清酸性蛋白質(ＷＡＰ)遺伝子を調節するものが
含まれる。
る遺伝子例えば乳組織において見出される遺伝子において特異的に活性な即ち乳
汁が合成される生理的条件下で乳組織において他の組織におけるよりも一層活性
であるプロモーターは、特に有用である。最も好適なのは、乳組織に特異的で且
つ該組織で効率的であるプロモーターである。かかるプロモーターの内で、カゼ
イン、ラクトアルブミン及びラクトグロブリンのプロモーターが好適である(ア ルファ、べータ及びガンマカゼインプロモーター及びアルファラクトアルブミン
及びべータ−ラクトグロブリンプロモーターが含まれるが、これらに限られない
)。これらのプロモーターの内で、ゲッ歯類、ヤギ及びウシ由来のものが好適で ある。他のプロモーターには、乳清酸性蛋白質(ＷＡＰ)遺伝子を調節するものが
含まれる。
【００２６】 この発明の好適具体例において、ＭＳＰ−１をコードする改変された核酸又は
細胞培養システム、哺乳動物細胞培養システムにおいて又はトランスジェニック
動物の乳汁中で発現し得るその断片を提供する。天然のＭＳＰ−１遺伝子をコー
ドする核酸配列を、この発明により改変する。第一に、全体的ＡＴ含量を、天然
遺伝子のコドンを選択した細胞システムに認識可能なコドン(好ましくは、該細 胞システムに好まれるコドン)で置換することにより減じる(該置換後のコドンは
、同じアミノ酸をコードするが、改変された核酸のＡＴ含量を天然のままのＭＳ
Ｐ−１遺伝子又は遺伝子断片と比べて低下させるのに十分である)。第２に、天 然の遺伝子又は遺伝子断片中のｍＲＮＡ不安定性モチーフ(ＡＵＵＵＡ、Shaw及 びKamen,前出)を、天然遺伝子のコドンを、選択した細胞システムにより認識さ れ得る(好ましくは、好まれる)コドンで置換することにより、この遺伝子のコー
ド配列から除去する(該置換後のコドンは、同じアミノ酸をコードするが、ｍＲ ＮＡ不安定性モチーフを除去するには十分なものである)。適宜、天然遺伝子の 任意の他のコドンを、記載したように、選択した発現システムの優先的コドンで
置換することができる。
細胞培養システム、哺乳動物細胞培養システムにおいて又はトランスジェニック
動物の乳汁中で発現し得るその断片を提供する。天然のＭＳＰ−１遺伝子をコー
ドする核酸配列を、この発明により改変する。第一に、全体的ＡＴ含量を、天然
遺伝子のコドンを選択した細胞システムに認識可能なコドン(好ましくは、該細 胞システムに好まれるコドン)で置換することにより減じる(該置換後のコドンは
、同じアミノ酸をコードするが、改変された核酸のＡＴ含量を天然のままのＭＳ
Ｐ−１遺伝子又は遺伝子断片と比べて低下させるのに十分である)。第２に、天 然の遺伝子又は遺伝子断片中のｍＲＮＡ不安定性モチーフ(ＡＵＵＵＡ、Shaw及 びKamen,前出)を、天然遺伝子のコドンを、選択した細胞システムにより認識さ れ得る(好ましくは、好まれる)コドンで置換することにより、この遺伝子のコー
ド配列から除去する(該置換後のコドンは、同じアミノ酸をコードするが、ｍＲ ＮＡ不安定性モチーフを除去するには十分なものである)。適宜、天然遺伝子の 任意の他のコドンを、記載したように、選択した発現システムの優先的コドンで
置換することができる。
【００２７】 第六の面において、この発明は、この発明により改変された核酸を含むＤＮＡ
ワクチンを提供する。ある好適な具体例において、このＤＮＡワクチンは、この
発明によるベクターを含む。この発明によるＤＮＡワクチンは、「裸の」形態で
あってもこの発明による精製された改変された核酸の形態であってもよい(プロ モーターと機能的に結合していてもいなくてもよい)。核酸は、その核酸配列が 発現可能となるような仕方でプロモーターと結合されているならば、プロモータ
ーと機能的に結合されている。かかるＤＮＡワクチンは、カプセル封入しないで
送達することができ、又はリポソーム若しくはウイルスゲノムの部分として送達
することができる。一般に、かかるワクチンは、この核酸の発現を可能にして、
このワクチンを受けたヒトを含む動物中に抗体応答を誘出するのに十分な量で送
達される。最初の送達から少なくとも一週間後の第二次の送達を用いて、抗体応
答を増大させることができる。好適な送達経路には、粘膜経由の導入並びに非経
口投与が含まれる。
ワクチンを提供する。ある好適な具体例において、このＤＮＡワクチンは、この
発明によるベクターを含む。この発明によるＤＮＡワクチンは、「裸の」形態で
あってもこの発明による精製された改変された核酸の形態であってもよい(プロ モーターと機能的に結合していてもいなくてもよい)。核酸は、その核酸配列が 発現可能となるような仕方でプロモーターと結合されているならば、プロモータ
ーと機能的に結合されている。かかるＤＮＡワクチンは、カプセル封入しないで
送達することができ、又はリポソーム若しくはウイルスゲノムの部分として送達
することができる。一般に、かかるワクチンは、この核酸の発現を可能にして、
このワクチンを受けたヒトを含む動物中に抗体応答を誘出するのに十分な量で送
達される。最初の送達から少なくとも一週間後の第二次の送達を用いて、抗体応
答を増大させることができる。好適な送達経路には、粘膜経由の導入並びに非経
口投与が含まれる。
【００２８】 この発明のこの面の好適具体例には、この発明による改変されたＭＳＰ−１遺
伝子の断片が含まれる。かかる断片は、好ましくは、遺伝子配列全体の約５〜１
００％を含み且つ少なくとも一のこの発明による改変を含む。
伝子の断片が含まれる。かかる断片は、好ましくは、遺伝子配列全体の約５〜１
００％を含み且つ少なくとも一のこの発明による改変を含む。
【００２９】 大腸菌及びヒトからのコドン利用例は、図３ｂに示してある。図３ｂは、ＭＳ
Ｐ−１の自然のままの遺伝子並びにこの発明の改変されたＭＳＰ−１遺伝子につ
いてのコドン利用頻度を示しており、又、大腸菌の該遺伝子におけるコドン利用
頻度とヒトのそれとの比較もしている。コドン利用頻度表は、容易に利用するこ
とができ、多くの他の発現システム(例えば、酵母、バキュロウイルス及び哺乳 動物のシステム)について当業者に公知である。
Ｐ−１の自然のままの遺伝子並びにこの発明の改変されたＭＳＰ−１遺伝子につ
いてのコドン利用頻度を示しており、又、大腸菌の該遺伝子におけるコドン利用
頻度とヒトのそれとの比較もしている。コドン利用頻度表は、容易に利用するこ
とができ、多くの他の発現システム(例えば、酵母、バキュロウイルス及び哺乳 動物のシステム)について当業者に公知である。
【００３０】 下記の実施例は、本発明の実施のある好適な態様を説明するが、別の方法を用
いて同様の結果を得ることができるので、この発明の範囲を制限することを意味
するものではない。
いて同様の結果を得ることができるので、この発明の範囲を制限することを意味
するものではない。
【００３１】実施例 新規な改変されたＭＳＰ−１42遺伝子の作成 一具体例において、ＭＳＰ−１のＣ末端断片をコードする新規な改変された核
酸を提供する。この発明の哺乳動物細胞中で発現することのできるＭＳＰ−１の
４２ｋＤのＣ末端部分(ＭＳＰ−１42)をコードするのこの発明の新規な改変され
た核酸を図１に示す。天然のＭＳＰ−１42遺伝子(図２)は、哺乳動物細胞培養中
で又はトランスジェニックマウスにおいて発現することができなかった。天然の
ＭＳＰ−１42遺伝子の分析は、それを哺乳動物の遺伝子と区別する幾つかの特徴
を示唆した。第一に、それは、全体的に非常に高い７６％のＡＴ含量を有してい
る。第二に、ｍＲＮＡ不安定性モチーフＡＵＵＵＡが、この１１００ｂｐのＤＮ
Ａセグメント中に１０回現れた(図２)。これらの差異を扱うために、新たなＭＳ
Ｐ−１42遺伝子をデザインした。サイレントヌクレオチド置換を天然のＭＳＰ−
１42遺伝子の３０６の位置に導入して全体的ＡＴ含量を４９．７％に減少させた
。その上、天然遺伝子中の１０のＡＵＵＵＡｍＲＮＡ不安定性モチーフの各々を
、コドン使用量の変更により除去した。コドン使用量を変えるために、乳組織特
異的コドン使用表(図３ａ)を、幾つかのマウス及びヤギの乳特異的蛋白質を用い
て作成した。この表を用いて、上記のように改変したＭＳＰ−１42遺伝子につい
てのコドン使用量の選択を導いた。例えば、表(図３ａ中)に示したように、天然
遺伝子において、Ｌｅｕの６５％(２５／３８)が、ＴＴＡ(乳腺においては希な コドン)によりコードされていた。改変されたＭＳＰ−１42遺伝子においては、 １００％のＬｅｕがＣＴＧ(乳腺におけるＬｅｕの好適なコドン)によりコードさ
れた。
酸を提供する。この発明の哺乳動物細胞中で発現することのできるＭＳＰ−１の
４２ｋＤのＣ末端部分(ＭＳＰ−１42)をコードするのこの発明の新規な改変され
た核酸を図１に示す。天然のＭＳＰ−１42遺伝子(図２)は、哺乳動物細胞培養中
で又はトランスジェニックマウスにおいて発現することができなかった。天然の
ＭＳＰ−１42遺伝子の分析は、それを哺乳動物の遺伝子と区別する幾つかの特徴
を示唆した。第一に、それは、全体的に非常に高い７６％のＡＴ含量を有してい
る。第二に、ｍＲＮＡ不安定性モチーフＡＵＵＵＡが、この１１００ｂｐのＤＮ
Ａセグメント中に１０回現れた(図２)。これらの差異を扱うために、新たなＭＳ
Ｐ−１42遺伝子をデザインした。サイレントヌクレオチド置換を天然のＭＳＰ−
１42遺伝子の３０６の位置に導入して全体的ＡＴ含量を４９．７％に減少させた
。その上、天然遺伝子中の１０のＡＵＵＵＡｍＲＮＡ不安定性モチーフの各々を
、コドン使用量の変更により除去した。コドン使用量を変えるために、乳組織特
異的コドン使用表(図３ａ)を、幾つかのマウス及びヤギの乳特異的蛋白質を用い
て作成した。この表を用いて、上記のように改変したＭＳＰ−１42遺伝子につい
てのコドン使用量の選択を導いた。例えば、表(図３ａ中)に示したように、天然
遺伝子において、Ｌｅｕの６５％(２５／３８)が、ＴＴＡ(乳腺においては希な コドン)によりコードされていた。改変されたＭＳＰ−１42遺伝子においては、 １００％のＬｅｕがＣＴＧ(乳腺におけるＬｅｕの好適なコドン)によりコードさ
れた。
【００３２】 発現ベクターを、この改変されたＭＳＰ−１42遺伝子を用いて、ヤギのベータ
カゼインの最初の２６アミノ酸をこの改変されたＭＳＰ−１42遺伝子のＮ末端に
融合することにより作成し、この融合遺伝子を有するＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を
発現ベクターｐＣＤＮＡ３のＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。この遺伝子産
物をアフィニティー精製可能にするためにこのＭＳＰ−１42遺伝子の３’末端に
Ｈｉｓ６タグを融合させた。これは、プラスミドＧＴＣ６２７(図４ｃ)を生じた
。
カゼインの最初の２６アミノ酸をこの改変されたＭＳＰ−１42遺伝子のＮ末端に
融合することにより作成し、この融合遺伝子を有するＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を
発現ベクターｐＣＤＮＡ３のＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。この遺伝子産
物をアフィニティー精製可能にするためにこのＭＳＰ−１42遺伝子の３’末端に
Ｈｉｓ６タグを融合させた。これは、プラスミドＧＴＣ６２７(図４ｃ)を生じた
。
【００３３】 天然のＭＳＰ−１42遺伝子構築物をこの発明の改変されたＭＳＰ−１42核酸と
比較するために、天然のＭＳＰ−１42遺伝子についても発現ベクターを作成して
、その遺伝子を哺乳動物細胞培養に加え、下記のようにマウスに注入してトラン
スジェニックマウスを生成した：
比較するために、天然のＭＳＰ−１42遺伝子についても発現ベクターを作成して
、その遺伝子を哺乳動物細胞培養に加え、下記のようにマウスに注入してトラン
スジェニックマウスを生成した：
【００３４】 天然ＭＳＰ−１42発現ベクターの構築 切り詰められた熱帯熱マラリア原虫の娘虫表面蛋白質−１(ＭＳＰ−１)を分泌
するために、ＭＳＰ−１の４２ＫＤのＣ末端部分(ＭＳＰ−１42)をコードする野
生型遺伝子をヤギのべータ−カゼインの最初の１５又は２５アミノ酸をコードす
るＤＮＡに融合した。これは、第一に、ＭＳＰ−１プラスミド(ＮＩＨのDavid K
aslow博士から得た)をプライマーＭＳＰ１及びＭＳＰ２(図６)を用いて増幅する
ＰＣＲにより達成され、次いで、そのＰＣＲ生成物をＴＡベクター(Invitrogen)
中にクローン化する。ＰＣＲ生成物のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片を、オリゴＯＴ
１及びＯＴ２(図６)を用いて発現ベクターｐＣＤＮＡ３中に連結した。この生成
されたプラスミドＧＴＣ５６４(図４ｂ)は、１５アミノ酸のべータ−カゼインシ
グナルペプチド及び成熟ヤギべータ−カゼインの最初の１１アミノ酸をコードし
、その次に天然のＭＳＰ−１42遺伝子が続く。オリゴＭＳＰ−８及びＭＳＰ−２
(図６)を用いて、ＭＳＰ−１プラスミドをＰＣＲにより増幅し、次いで、その生
成物をＴＡベクター中にクローン化した。ＸｈｏＩ断片を切り出して、発現ベク
ターｐＣＤＮＡ３のＸｈｏＩ部位にクローン化して、プラスミドＧＴＣ４７９( 図４ａ)を生成した(これは、野生型ＭＳＰ−１42遺伝子に融合された１５アミノ
酸のヤギべータ−カゼインシグナルペプチドをコードした)。Ｈｉｓ６タグを、 ＧＴＣ５６４及びＧＴＣ４７９中のＭＳＰ−１42遺伝子の３’末端に加えた。
するために、ＭＳＰ−１の４２ＫＤのＣ末端部分(ＭＳＰ−１42)をコードする野
生型遺伝子をヤギのべータ−カゼインの最初の１５又は２５アミノ酸をコードす
るＤＮＡに融合した。これは、第一に、ＭＳＰ−１プラスミド(ＮＩＨのDavid K
aslow博士から得た)をプライマーＭＳＰ１及びＭＳＰ２(図６)を用いて増幅する
ＰＣＲにより達成され、次いで、そのＰＣＲ生成物をＴＡベクター(Invitrogen)
中にクローン化する。ＰＣＲ生成物のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片を、オリゴＯＴ
１及びＯＴ２(図６)を用いて発現ベクターｐＣＤＮＡ３中に連結した。この生成
されたプラスミドＧＴＣ５６４(図４ｂ)は、１５アミノ酸のべータ−カゼインシ
グナルペプチド及び成熟ヤギべータ−カゼインの最初の１１アミノ酸をコードし
、その次に天然のＭＳＰ−１42遺伝子が続く。オリゴＭＳＰ−８及びＭＳＰ−２
(図６)を用いて、ＭＳＰ−１プラスミドをＰＣＲにより増幅し、次いで、その生
成物をＴＡベクター中にクローン化した。ＸｈｏＩ断片を切り出して、発現ベク
ターｐＣＤＮＡ３のＸｈｏＩ部位にクローン化して、プラスミドＧＴＣ４７９( 図４ａ)を生成した(これは、野生型ＭＳＰ−１42遺伝子に融合された１５アミノ
酸のヤギべータ−カゼインシグナルペプチドをコードした)。Ｈｉｓ６タグを、 ＧＴＣ５６４及びＧＴＣ４７９中のＭＳＰ−１42遺伝子の３’末端に加えた。
【００３５】 天然のＭＳＰ−１42遺伝子は、ＣＯＳ−７細胞中で発現されない 培養ＣＯＳ−７細胞中での天然のＭＳＰ遺伝子の発現を、一過性トランスフェ
クションアッセイによりアッセイした。ＧＴＣ４７９及びＧＴＣ５６４プラスミ
ドＤＮＡを、リポフェクタミン(Gibco-BRL)により、製造業者のプロトコールに 従ってＣＯＳ−７細胞に導入した。全細胞ＲＮＡを、ＣＯＳ細胞から、トランス
フェクションの二日後に単離した。これらの新たに合成された蛋白質を、35Ｓメ
チオニンを加える(トランスフェクションの二日後に培養培地に加える)ことによ
り１０時間にわたって代謝的に標識した。
クションアッセイによりアッセイした。ＧＴＣ４７９及びＧＴＣ５６４プラスミ
ドＤＮＡを、リポフェクタミン(Gibco-BRL)により、製造業者のプロトコールに 従ってＣＯＳ−７細胞に導入した。全細胞ＲＮＡを、ＣＯＳ細胞から、トランス
フェクションの二日後に単離した。これらの新たに合成された蛋白質を、35Ｓメ
チオニンを加える(トランスフェクションの二日後に培養培地に加える)ことによ
り１０時間にわたって代謝的に標識した。
【００３６】 ＣＯＳ細胞におけるＭＳＰｍＲＮＡ発現を測定するために、ノーザンブロット
を、ＧＴＣ４７９に由来する32Ｐ標識したＤＮＡ断片をプローブとして調べた。
ＭＳＰＲＮＡは、ＧＴＣ４７９又はＧＴＣ５６４トランスフェクタントにおいて
検出されなかった(データは、示してない)。もっと長い露出は、分解されたＭＳ
ＰｍＲＮＡの残留レベルを示した。35Ｓ標識した培養上清及び細胞溶解物は、Ｍ
ＳＰに対して高められたポリクローナル抗体で免疫沈降された。免疫沈降実験は
、これらのＧＴＣ４７９又はＧＴＣ５６４でトランスフェクトされた細胞の溶解
物又は上清の何れからも、発現を示さなかった(データは、示してない)。これら
の結果は、天然のＭＳＰ−１遺伝子がＣＯＳ細胞において発現されないことを示
した。
を、ＧＴＣ４７９に由来する32Ｐ標識したＤＮＡ断片をプローブとして調べた。
ＭＳＰＲＮＡは、ＧＴＣ４７９又はＧＴＣ５６４トランスフェクタントにおいて
検出されなかった(データは、示してない)。もっと長い露出は、分解されたＭＳ
ＰｍＲＮＡの残留レベルを示した。35Ｓ標識した培養上清及び細胞溶解物は、Ｍ
ＳＰに対して高められたポリクローナル抗体で免疫沈降された。免疫沈降実験は
、これらのＧＴＣ４７９又はＧＴＣ５６４でトランスフェクトされた細胞の溶解
物又は上清の何れからも、発現を示さなかった(データは、示してない)。これら
の結果は、天然のＭＳＰ−１遺伝子がＣＯＳ細胞において発現されないことを示
した。
【００３７】 天然のＭＳＰ−１42遺伝子は、トランスジェニックマウスの乳腺において発現さ
れない ＧＴＣ４７９のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片(１５アミノ酸のヤギべータ−カゼイ ンシグナルペプチド、ヤギべータ−カゼインの最初の１１アミノ酸及び天然のＭ
ＳＰ−１42遺伝子をコードする)を、ベクターＢＣ３５０中で発現されるべータ −カゼインのＸｈｏＩ部位にクローン化した。これは、プラスミドＢＣ５７４( 図７)を生成した。ＢＣ５７４のＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を、マウス胚中に注入 して、トランスジェニックマウスを生成した。１５系統のトランスジェニックマ
ウスを樹立した。雌の創出マウスからの乳汁を集めて、ＭＳＰに対するポリクロ
ーナル抗体を用いるウエスタンブロット分析にかけた。分析した７匹のマウスの
何れも、それらの乳汁中にＭＳＰ−１42蛋白質を発現することが見出されなかっ
た。ＭＳＰ−１42のｍＲＮＡが乳腺で発現されるかどうかを更に測定するために
、全ＲＮＡを、１１日間泌乳しているトランスジェニックマウスから抽出して、
ノーザンブロッティングにより分析した。ＭＳＰ−１42ｍＲＮＡは、分析したＢ
Ｃ５７４系統の何れによっても検出されなかった。それ故、ＭＳＰ−１42トラン
スジーンは、トランスジェニックマウスの乳腺において発現されなかった。まと
めると、これらの実験は、天然の寄生虫のＭＳＰ−１42遺伝子が哺乳動物細胞に
おいて発現され得なかったこと及びこのブロックがｍＲＮＡの豊富さのレベルに
あることを示唆している。
れない ＧＴＣ４７９のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片(１５アミノ酸のヤギべータ−カゼイ ンシグナルペプチド、ヤギべータ−カゼインの最初の１１アミノ酸及び天然のＭ
ＳＰ−１42遺伝子をコードする)を、ベクターＢＣ３５０中で発現されるべータ −カゼインのＸｈｏＩ部位にクローン化した。これは、プラスミドＢＣ５７４( 図７)を生成した。ＢＣ５７４のＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を、マウス胚中に注入 して、トランスジェニックマウスを生成した。１５系統のトランスジェニックマ
ウスを樹立した。雌の創出マウスからの乳汁を集めて、ＭＳＰに対するポリクロ
ーナル抗体を用いるウエスタンブロット分析にかけた。分析した７匹のマウスの
何れも、それらの乳汁中にＭＳＰ−１42蛋白質を発現することが見出されなかっ
た。ＭＳＰ−１42のｍＲＮＡが乳腺で発現されるかどうかを更に測定するために
、全ＲＮＡを、１１日間泌乳しているトランスジェニックマウスから抽出して、
ノーザンブロッティングにより分析した。ＭＳＰ−１42ｍＲＮＡは、分析したＢ
Ｃ５７４系統の何れによっても検出されなかった。それ故、ＭＳＰ−１42トラン
スジーンは、トランスジェニックマウスの乳腺において発現されなかった。まと
めると、これらの実験は、天然の寄生虫のＭＳＰ−１42遺伝子が哺乳動物細胞に
おいて発現され得なかったこと及びこのブロックがｍＲＮＡの豊富さのレベルに
あることを示唆している。
【００３８】 哺乳動物細胞におけるＭＳＰの発現 一過性トランスフェクションの実験を行って、ＣＯＳ細胞におけるこの発明の
改変されたＭＳＰ−１42遺伝子の発現を評価した。ＧＴＣ６２７及びＧＴＣ４７
９ＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に導入した。全ＲＮＡを、トランスフェクションの４
８時間後にノーザン分析用に単離した。固定化したＲＮＡをＧＴＣ６２７の32Ｐ
標識したＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片をプローブとして調べた。劇的な差異が、ＧＴ
Ｃ４７９とＧＴＣ６２７の間で認められた。ＧＴＣ４７９でトランスフェクトさ
れた細胞においては前に示したようにＭＳＰ−１42ｍＲＮＡが検出されなかった
が、豊富なＭＳＰ−１42ｍＲＮＡがＧＴＣ６２７により発現された(図５、パネ ルＡ)。ＧＴＣ４６９を負の対照として用いたが、これは、市販のクローニング ベクターのＰＵ１９中にクローン化したＧＴＣ５６４のインサートを含む。35Ｓ
メチオニンを用いる代謝的標識実験とそれに続くＭＳＰに対するポリクローナル
抗体(ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨのD.Kaslow提供)を用いる免疫沈降は、ＭＳＰ−１42蛋
白質がトランスフェクトされたＣＯＳ細胞により合成されるを示した(図５、パ ネルＢ)。更に、ＭＳＰ−１42は、トランスフェクトされたＣＯＳの上清中で検 出されたが、これは、ＭＳＰ−１42蛋白質が分泌もされることを示している。更
に、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いて、ＭＳＰ−１42を、ＧＴＣ６２７トランスフェ
クトされたＣＯＳ上清からアフィニティー精製した。
改変されたＭＳＰ−１42遺伝子の発現を評価した。ＧＴＣ６２７及びＧＴＣ４７
９ＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に導入した。全ＲＮＡを、トランスフェクションの４
８時間後にノーザン分析用に単離した。固定化したＲＮＡをＧＴＣ６２７の32Ｐ
標識したＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片をプローブとして調べた。劇的な差異が、ＧＴ
Ｃ４７９とＧＴＣ６２７の間で認められた。ＧＴＣ４７９でトランスフェクトさ
れた細胞においては前に示したようにＭＳＰ−１42ｍＲＮＡが検出されなかった
が、豊富なＭＳＰ−１42ｍＲＮＡがＧＴＣ６２７により発現された(図５、パネ ルＡ)。ＧＴＣ４６９を負の対照として用いたが、これは、市販のクローニング ベクターのＰＵ１９中にクローン化したＧＴＣ５６４のインサートを含む。35Ｓ
メチオニンを用いる代謝的標識実験とそれに続くＭＳＰに対するポリクローナル
抗体(ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨのD.Kaslow提供)を用いる免疫沈降は、ＭＳＰ−１42蛋
白質がトランスフェクトされたＣＯＳ細胞により合成されるを示した(図５、パ ネルＢ)。更に、ＭＳＰ−１42は、トランスフェクトされたＣＯＳの上清中で検 出されたが、これは、ＭＳＰ−１42蛋白質が分泌もされることを示している。更
に、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いて、ＭＳＰ−１42を、ＧＴＣ６２７トランスフェ
クトされたＣＯＳ上清からアフィニティー精製した。
【００３９】 これらの結果は、寄生虫のＭＳＰ−１42遺伝子の改変がＣＯＳ細胞におけるＭ
ＳＰｍＲＮＡの発現へと導くことを示した。従って、ＭＳＰ−１42産物は、哺乳
動物細胞により合成されて分泌された。
ＳＰｍＲＮＡの発現へと導くことを示した。従って、ＭＳＰ−１42産物は、哺乳
動物細胞により合成されて分泌された。
【００４０】 この実験で用いたポリクローナル抗体は又、当分野で周知の手段によっても調
製することができる(Antibodies: A Laboratory Manual,Ed Harlow及びDavid La
ne編、Cold Spring Harbor Laboratory,publishers(1988))。ＭＳＰ血清抗体の 生成も又、Chang等,Infection and Immunity(1996)64:253-261及びChang等,(199
2)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6343-6347に記載されている。
製することができる(Antibodies: A Laboratory Manual,Ed Harlow及びDavid La
ne編、Cold Spring Harbor Laboratory,publishers(1988))。ＭＳＰ血清抗体の 生成も又、Chang等,Infection and Immunity(1996)64:253-261及びChang等,(199
2)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6343-6347に記載されている。
【００４１】 この分析の結果は、この発明の改変されたＭＳＰ−１42核酸が、天然の蛋白質
(全く発現されなかった)と比べて非常に高レベルで発現されることを示している
。これらの結果は、遺伝子中のＡＴ％を減じることが異種システムにおけるＭＳ
Ｐ遺伝子の発現に導くという第一の実験的証拠を示しており、ＭＳＰコード領域
からのＡＵＵＵＡｍＲＮＡ不安定性モチーフの除去がＣＯＳ細胞におけるＭＳＰ
蛋白質の発現を導くという第一の証拠もを示している。
(全く発現されなかった)と比べて非常に高レベルで発現されることを示している
。これらの結果は、遺伝子中のＡＴ％を減じることが異種システムにおけるＭＳ
Ｐ遺伝子の発現に導くという第一の実験的証拠を示しており、ＭＳＰコード領域
からのＡＵＵＵＡｍＲＮＡ不安定性モチーフの除去がＣＯＳ細胞におけるＭＳＰ
蛋白質の発現を導くという第一の証拠もを示している。
【００４２】 従って、ここに提供したデータは、高ＡＴ含量及び／又は不安定性モチーフの
存在及び又は選択した細胞システムに認識不能な希なコドンの使用の故に細胞培
養又はトランスジェニックシステムにおいて発現させるのが困難であろうある種
の異種蛋白質を、任意所定のシステムにおいて発現できるように、そのシステム
についてのコドン利用表の助けによって、作り直すことができることを示唆して
いる。本発明は、低ＲＮＡレベル又はＲＮＡが全くないということを生じる分解
の原因となると思われる配列を除去する目的をもってＤＮＡ配列が改変された第
一のものに相当する。図５、パネルＡのノーザンに示した結果(即ち、天然の遺 伝子ではＲＮＡは検出されず、この発明による改変されたＤＮＡ配列では、妥当
なレベルのＲＮＡが検出された)は、蛋白質生成の増加をもっともらしく説明す る。
存在及び又は選択した細胞システムに認識不能な希なコドンの使用の故に細胞培
養又はトランスジェニックシステムにおいて発現させるのが困難であろうある種
の異種蛋白質を、任意所定のシステムにおいて発現できるように、そのシステム
についてのコドン利用表の助けによって、作り直すことができることを示唆して
いる。本発明は、低ＲＮＡレベル又はＲＮＡが全くないということを生じる分解
の原因となると思われる配列を除去する目的をもってＤＮＡ配列が改変された第
一のものに相当する。図５、パネルＡのノーザンに示した結果(即ち、天然の遺 伝子ではＲＮＡは検出されず、この発明による改変されたＤＮＡ配列では、妥当
なレベルのＲＮＡが検出された)は、蛋白質生成の増加をもっともらしく説明す る。
【００４３】 下記の実施例は、トランスジェニックマウスの乳汁中の自然のままの非融合蛋
白質としての(且つグリコシル化されてない)ＭＳＰ１−４２の発現を説明する。
白質としての(且つグリコシル化されてない)ＭＳＰ１−４２の発現を説明する。
【００４４】 ＭＳＰトランスジーンの構築 ＭＳＰ１−４２を１５アミノ酸のβ−カゼインシグナルペプチドに融合させる
ために、１５アミノ酸のカゼインシグナル及びＣｌａＩ部位で終わるＭＳＰ１−
４２の最初の５アミノ酸をコードするオリゴＭＳＰ２０３及びＭＳＰ２０４の対
(ＭＳＰ２０３：ggccgctcgacgccaccatgaaggtcctcataattgcctgtctggtggctctggcca
ttgcagccgtcactccctccgtcat、ＭＳＰ２０４：cgatgacggagggagtgacggctgcaatggc
cagagccaccagacaggcaattatgaggaccttcatggtggcgtcgagc)を、ＭＳＰ１−４２遺伝
子の残りをコードするＢＣ６２０(図８)のＣｌａＩ−ＸｈｏＩ断片と共に、発現
ベクターｐＣＤＮＡ３のＸｈｏＩ部位に連結した。このプラスミド(ＧＴＣ６６ ９)のＸｈｏＩ断片を、次いで、乳特異的発現ベクターＢＣ３５０のＸｈｏＩ部 位にクローン化して、Ｂ６７０(図９)を生成した。
ために、１５アミノ酸のカゼインシグナル及びＣｌａＩ部位で終わるＭＳＰ１−
４２の最初の５アミノ酸をコードするオリゴＭＳＰ２０３及びＭＳＰ２０４の対
(ＭＳＰ２０３：ggccgctcgacgccaccatgaaggtcctcataattgcctgtctggtggctctggcca
ttgcagccgtcactccctccgtcat、ＭＳＰ２０４：cgatgacggagggagtgacggctgcaatggc
cagagccaccagacaggcaattatgaggaccttcatggtggcgtcgagc)を、ＭＳＰ１−４２遺伝
子の残りをコードするＢＣ６２０(図８)のＣｌａＩ−ＸｈｏＩ断片と共に、発現
ベクターｐＣＤＮＡ３のＸｈｏＩ部位に連結した。このプラスミド(ＧＴＣ６６ ９)のＸｈｏＩ断片を、次いで、乳特異的発現ベクターＢＣ３５０のＸｈｏＩ部 位にクローン化して、Ｂ６７０(図９)を生成した。
【００４５】 トランスジェニックマウスの乳汁中でのＭＳＰ１−４２の発現 ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片をプラスミドＢＣ６７０から調製し、マウス胚にマイ
クロインジェクションしてトランスジェニックマウスを生成した。トランスジェ
ニックマウスを、マウスのＤＮＡを尾のバイオプシーから抽出した後にオリゴＧ
ＴＣ１７及びＭＳＰ１０１を用いるＰＣＲ分析により同定した(オリゴＧＴＣ１ ７の配列：GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC、オリゴＭＳＰ１０１、GGATTCAATAGAT
ACGG)。雌の創出トランスジェニックマウスの乳汁を、泌乳の７日目及び９日目 に集め、ポリクローナル抗ＭＳＰ抗体及びモノクローナル抗ＭＳＰ抗体５．２( ＮＩＨ、David Kaslow博士)を用いるウエスタン分析にかけて、ＭＳＰ−１−４ ２の発現レベルを測定した。結果は、トランスジェニックマウスの乳汁中のＭＳ
Ｐ−１−４２の発現レベルが１〜２ｍｇ／ｍｌであることを示した(図１０)。
クロインジェクションしてトランスジェニックマウスを生成した。トランスジェ
ニックマウスを、マウスのＤＮＡを尾のバイオプシーから抽出した後にオリゴＧ
ＴＣ１７及びＭＳＰ１０１を用いるＰＣＲ分析により同定した(オリゴＧＴＣ１ ７の配列：GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC、オリゴＭＳＰ１０１、GGATTCAATAGAT
ACGG)。雌の創出トランスジェニックマウスの乳汁を、泌乳の７日目及び９日目 に集め、ポリクローナル抗ＭＳＰ抗体及びモノクローナル抗ＭＳＰ抗体５．２( ＮＩＨ、David Kaslow博士)を用いるウエスタン分析にかけて、ＭＳＰ−１−４ ２の発現レベルを測定した。結果は、トランスジェニックマウスの乳汁中のＭＳ
Ｐ−１−４２の発現レベルが１〜２ｍｇ／ｍｌであることを示した(図１０)。
【００４６】 ＭＳＰ１−４２グリコシル化部位欠如変異体の構築 乳汁中に産生されたＭＳＰの我々の分析は、このトランスジェニックＭＳＰ蛋
白質がＮグリコシル化されることを示した。ＭＳＰ１−４２遺伝子中のＮグリコ
シル化部位を除去するために、１８１位及び２６２位のＡｓｎ(Ｎ)をＧｌｎ(Ｑ)
で置換した。これらの置換を、ＭＳＰ１の対応領域にアニールし且つＡＡＣから
ＣＡＧへの突然変異を担うＤＮＡオリゴをデザインすることにより導入した。こ
れらのオリゴを、次いで、ＰＣＲプライマーとして用いて、ＮからＱへの置換を
コードするＤＮＡ断片を生成した。
白質がＮグリコシル化されることを示した。ＭＳＰ１−４２遺伝子中のＮグリコ
シル化部位を除去するために、１８１位及び２６２位のＡｓｎ(Ｎ)をＧｌｎ(Ｑ)
で置換した。これらの置換を、ＭＳＰ１の対応領域にアニールし且つＡＡＣから
ＣＡＧへの突然変異を担うＤＮＡオリゴをデザインすることにより導入した。こ
れらのオリゴを、次いで、ＰＣＲプライマーとして用いて、ＮからＱへの置換を
コードするＤＮＡ断片を生成した。
【００４７】 Ｎ２６２−Ｑ突然変異を導入するために、オリゴＭＳＰＧＹＬＹＣＯ−３(CAG
GGAATGCTGCAGATCAGC)及びＭＳＰ４２−２(AATTCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATC
GCAGAAAATACCATG、図１１)の対を用いて、合成のＭＳＰ１−４２遺伝子を含むプ
ラスミドＧＴＣ６２７をＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ２．１ベ
クター(Invitrogen)中にクローン化した。これは、プラスミドＧＴＣ７１６を生
成した。
GGAATGCTGCAGATCAGC)及びＭＳＰ４２−２(AATTCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATC
GCAGAAAATACCATG、図１１)の対を用いて、合成のＭＳＰ１−４２遺伝子を含むプ
ラスミドＧＴＣ６２７をＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ２．１ベ
クター(Invitrogen)中にクローン化した。これは、プラスミドＧＴＣ７１６を生
成した。
【００４８】 Ｎ１８１−Ｑ突然変異を導入するために、オリゴＭＳＰＧＬＹＣＯ−１(CTCCT
TGTTCAGGAACTTGTAGGG)及びＭＳＰＧＬＣＯ−２(GTCCTGCAGTACACATATGAG、図４) を用いて、プラスミドＧＴＣ６２７を増幅した。このＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ２
．１中にクローン化した。これは、プラスミドＧＴＣ７００を生成した。
TGTTCAGGAACTTGTAGGG)及びＭＳＰＧＬＣＯ−２(GTCCTGCAGTACACATATGAG、図４) を用いて、プラスミドＧＴＣ６２７を増幅した。このＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ２
．１中にクローン化した。これは、プラスミドＧＴＣ７００を生成した。
【００４９】 ＭＳＰ二重グリコシル化変異体を、次の３ステップにより構築した：第一に、
ＢＣ６７０のＸｈｏＩ−ＢｓｍＩ断片とＧＴＣ７１６のＢｓｍＩ−ＸｈｏＩ断片
をベクターｐＣＲ２．１のＸｈｏＩ部位に連結する。これは、Ｎ２６２−Ｑ突然
変異を有するＭＳＰ−１−４２遺伝子を含むプラスミドを生じた。次いで、この
プラスミドのＥｃｏＮＩ−ＮｄｅＩ断片をプラスミドＧＴＣ７１６からのＥｃｏ
ＮＩ−ＮｄｅＩ断片により置換して第二の突然変異Ｎ１８１−Ｑを導入した。こ
のプラスミドのＸｈｏＩ断片を、最後に、ＢＣ３５０中にクローン化してＢＣ７
１８(図１２)を生成した。
ＢＣ６７０のＸｈｏＩ−ＢｓｍＩ断片とＧＴＣ７１６のＢｓｍＩ−ＸｈｏＩ断片
をベクターｐＣＲ２．１のＸｈｏＩ部位に連結する。これは、Ｎ２６２−Ｑ突然
変異を有するＭＳＰ−１−４２遺伝子を含むプラスミドを生じた。次いで、この
プラスミドのＥｃｏＮＩ−ＮｄｅＩ断片をプラスミドＧＴＣ７１６からのＥｃｏ
ＮＩ−ＮｄｅＩ断片により置換して第二の突然変異Ｎ１８１−Ｑを導入した。こ
のプラスミドのＸｈｏＩ断片を、最後に、ＢＣ３５０中にクローン化してＢＣ７
１８(図１２)を生成した。
【００５０】 非グリコシル化ＭＳＰ１のトランスジェニック動物における発現 ＢＣ７１８は、次の特徴を有している：それは、ＭＳＰ１−４２遺伝子をβ−
カゼインプロモーターの制御下に、それがトランスジェニック動物の乳腺におい
て泌乳中発現され得るように有している。更に、それは、Ｎ末端に何らの更なる
アミノ酸も有しないＭＳＰ１−４２が乳汁中に分泌され得るように、ＭＳＰ１−
４２に直接融合された１５アミノ酸のβ−カゼインリーダー配列をコードする。
最後に、Ｎ−Ｑ置換のために、この構築物によりトランスジェニック動物の乳汁
中に生成されたＭＳＰは、Ｎ末端グリコシル化されない。まとめると、ＢＣ７１
８により乳汁中に生成されたトランスジェニックＭＳＰは、寄生虫のＭＳＰと同
じである。
カゼインプロモーターの制御下に、それがトランスジェニック動物の乳腺におい
て泌乳中発現され得るように有している。更に、それは、Ｎ末端に何らの更なる
アミノ酸も有しないＭＳＰ１−４２が乳汁中に分泌され得るように、ＭＳＰ１−
４２に直接融合された１５アミノ酸のβ−カゼインリーダー配列をコードする。
最後に、Ｎ−Ｑ置換のために、この構築物によりトランスジェニック動物の乳汁
中に生成されたＭＳＰは、Ｎ末端グリコシル化されない。まとめると、ＢＣ７１
８により乳汁中に生成されたトランスジェニックＭＳＰは、寄生虫のＭＳＰと同
じである。
【００５１】 ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ断片をプラスミドＢＣ７１８から調製し、マウス胚にマイ
クロインジェクションしてトランスジェニックマウスを生成した。トランスジェ
ニック動物を、前に記載されたように同定した。雌の創出動物の乳汁を集めて、
抗体５．２を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。図１３に示した
結果は、非グリコシル化ＭＳＰ１の濃度０．５〜１ｍｇ／ｍｌでの発現を示して
いる。
クロインジェクションしてトランスジェニックマウスを生成した。トランスジェ
ニック動物を、前に記載されたように同定した。雌の創出動物の乳汁を集めて、
抗体５．２を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。図１３に示した
結果は、非グリコシル化ＭＳＰ１の濃度０．５〜１ｍｇ／ｍｌでの発現を示して
いる。
【００５２】同等物 当業者は、日常的実験を用いて、多数の同等物がこの発明の範囲内にあると考
えられること及びそれらが請求の範囲によりカバーされることを認識し、又は確
認することができるであろう。
えられること及びそれらが請求の範囲によりカバーされることを認識し、又は確
認することができるであろう。
【図１】 この発明により改変したＭＳＰ−１42のｃＤＮＡ配列[SEQ ID NO:１](３０６ のヌクレオチド位置が置換されてＡＴ含量が低下されており、ＭＳＰ−１42の同
じ蛋白質アミノ酸配列を維持しつつｍＲＮＡ不安定性モチーフが排除されている
)を描いた図である。大文字は、ヌクレオチド置換を示している。
じ蛋白質アミノ酸配列を維持しつつｍＲＮＡ不安定性モチーフが排除されている
)を描いた図である。大文字は、ヌクレオチド置換を示している。
【図２】 「野生型」又は自然のままのＭＳＰ−１42[SEQ ID NO:２]の配列をコードする
ヌクレオチド配列を描いた図である。
ヌクレオチド配列を描いた図である。
【図３ａ】 野生型ＭＳＰ−１42(表中で「ＭＳＰｗｔ」で示した)及び新たな改変したＭＳ
Ｐ−１42遺伝子(表中で「編集されたＭＳＰ」で示した)及び幾つかの乳蛋白質遺
伝子(ヤギ及びマウス由来のカゼイン遺伝子)についてのコドン利用表である。各
欄内の数値は、特定のコドンが列記した各遺伝子において現れる実際の回数を示
している。この新たなＭＳＰ−１42合成遺伝子は、乳特異的なコドン利用量から
、所定のアミノ酸のＧＣリッチなコドンを第一に選択する(乳蛋白質において最 も頻繁に利用されているアミノ酸を選択することと組み合わせる)ことにより導 かれた。
Ｐ−１42遺伝子(表中で「編集されたＭＳＰ」で示した)及び幾つかの乳蛋白質遺
伝子(ヤギ及びマウス由来のカゼイン遺伝子)についてのコドン利用表である。各
欄内の数値は、特定のコドンが列記した各遺伝子において現れる実際の回数を示
している。この新たなＭＳＰ−１42合成遺伝子は、乳特異的なコドン利用量から
、所定のアミノ酸のＧＣリッチなコドンを第一に選択する(乳蛋白質において最 も頻繁に利用されているアミノ酸を選択することと組み合わせる)ことにより導 かれた。
【図３ｂ】 各コドンが野生型ＭＳＰ−１42(表中で「ＭＳＰｗｔ」で示した)及び新たな改
変したＭＳＰ−１42遺伝子(表中で「編集されたＭＳＰ」で示した)の両者におい
て現れる回数を含むコドン利用表である(図３ａにも示してある)。図３ｂの表は
、各コドンが、野生型ＭＳＰ−１42及び新たな改変したＭＳＰ−１42遺伝子にお
いて現れる頻度を、各コドンの大腸菌遺伝子及びヒトの遺伝子の両者における出
現頻度と比較している。従って、もしこの発現システムが大腸菌細胞であったな
らば、この表を用いてどのコドンが大腸菌により認識され又は好まれるかを決定
することができる。
変したＭＳＰ−１42遺伝子(表中で「編集されたＭＳＰ」で示した)の両者におい
て現れる回数を含むコドン利用表である(図３ａにも示してある)。図３ｂの表は
、各コドンが、野生型ＭＳＰ−１42及び新たな改変したＭＳＰ−１42遺伝子にお
いて現れる頻度を、各コドンの大腸菌遺伝子及びヒトの遺伝子の両者における出
現頻度と比較している。従って、もしこの発現システムが大腸菌細胞であったな
らば、この表を用いてどのコドンが大腸菌により認識され又は好まれるかを決定
することができる。
【図４】 図４ａ−ｃ ＭＳＰ−１42構築物ＧＴＣ４７９、ＧＴＣ５６４及びＧＴＣ６２７(それぞれ 、実施例に記載されている)を描いた図である。
【図５】 パネルＡ 構築物ＧＴＣ６２７がこの発明により改変された新たなＭＳＰ−１42遺伝子を
含み、ＧＴＣ４７９が自然のままのＭＳＰ−１42遺伝子を含む構築物であり且つ
構築物ＧＴＣ４６９が負の対照用ＤＮＡであるノーザン分析である。 パネルＢ アフィニティー精製後の溶出画分のウエスタン分析である。数字は、採取した
画分である。これらの結果は、ＧＴＣ６７９(改変されたＭＳＰ−１42合成遺伝 子構築物)からの画分がＭＳＰ−１に対するポリクローナル抗体と反応したが、 負の対照のＧＴＣ４７９は反応しなかったことを示している。
含み、ＧＴＣ４７９が自然のままのＭＳＰ−１42遺伝子を含む構築物であり且つ
構築物ＧＴＣ４６９が負の対照用ＤＮＡであるノーザン分析である。 パネルＢ アフィニティー精製後の溶出画分のウエスタン分析である。数字は、採取した
画分である。これらの結果は、ＧＴＣ６７９(改変されたＭＳＰ−１42合成遺伝 子構築物)からの画分がＭＳＰ−１に対するポリクローナル抗体と反応したが、 負の対照のＧＴＣ４７９は反応しなかったことを示している。
【図６】 実施例に記載したＯＴ１[SEQ ID NO:３]、ＯＴ２[SEQ ID NO:４]、ＭＳＰ−８
[SEQ ID NO:５]ＭＳＰ−２[SEQ ID NO:６]及びＭＳＰ１[SEQ ID NO:７]の核酸配
列を描いた図である。
[SEQ ID NO:５]ＭＳＰ−２[SEQ ID NO:６]及びＭＳＰ１[SEQ ID NO:７]の核酸配
列を描いた図である。
【図７】 プラスミドＢＣ５７４の略図である。
【図８】 ＢＣ６２０の略図である。
【図９】 ＢＣ６７０の略図である。
【図１０】 トランスジェニック乳汁中のＭＳＰのウエスタンブロットの表示である。
【図１１】 ＭＳＰ４２−２のヌクレオチド配列[SEQ ID NO:８]の略図である。
【図１２】 ＢＣ−７１８の略図である。
【図１３】 トランスジェニック乳汁におけるＢＣ−７１８の発現のウエスタンブロットの
表示である。
表示である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 19/34 Ａ ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 19/34 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハリー ミード アメリカ合衆国 02158 マサチューセッ ツ、ニュートン、グラースメア ストリー ト 62 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA31 CA02 CA12 DA02 DA06 FA17 GA18 GA19 HA01 4B064 AG31 CA09 CA19 DA03 4B065 AA26X AA90X AA90Y AA91X AC14 BA01 BA16 CA45 4C084 AA13 NA14 ZB372 ZB382 4C085 AA02 AA03 BA06 BB11 CC40 DD62 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA51 DA86 EA31 FA74
Claims (26)
- 【請求項１】 哺乳動物細胞中で発現することのできる寄生虫の改変された
公知の核酸であって、改変が、遺伝子中の少なくとも一のＡＴ含有コドンの、置
換されたコドンと同じアミノ酸をコードする好適コドンでの置換による遺伝子の
ＡＴ含量の減少を含む当該改変された核酸。 - 【請求項２】 哺乳動物細胞中で発現することのできる寄生虫蛋白質の改変
された公知の核酸であって、遺伝子のコード鎖中に存在する少なくとも一のｍＲ
ＮＡ不安定性モチーフが、該ｍＲＮＡ不安定性モチーフを置換されたコドンと同
じアミノ酸をコードする好適コドンで置換することによって除去されている当該
改変された核酸。 - 【請求項３】 公知の遺伝子の少なくとも一のコドンが、置換されたコドン
と同じアミノ酸をコードする好適な乳蛋白質特異的なコドンで置換されている、
請求項１又は２に記載の改変された核酸。 - 【請求項４】 哺乳動物細胞で発現することのできる寄生虫の改変された公
知の核酸であって、この公知の遺伝子コーディングの全体的ＡＴ含量が乳蛋白質
特異的コドンでの置換により低下されており且つこの遺伝子中に存在する少なく
とも一のｍＲＮＡ不安定性モチーフが乳蛋白質特異コドンでの置換により除去さ
れ且つ天然遺伝子の少なくとも一のコドンが好適な乳蛋白質特異的コドンにより
置換されている当該改変された核酸。 - 【請求項５】 前記の改変された核酸が前記の蛋白質を、イン・ビトロ又は
イン・ビボ哺乳動物細胞システム中で前記の天然遺伝子により発現されるレベル
の少なくとも１００％のレベルで発現することのできる、請求項４に記載の改変
された核酸。 - 【請求項６】 哺乳動物細胞中での発現のための寄生虫の改変された公知の
核酸の製造方法であって、天然遺伝子のＡＴ含量を、その天然遺伝子の少なくと
も一のＡＴ含有コドンを、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする好適な
乳特異的コドンで置換することにより低下させることを含む当該製造方法。 - 【請求項７】 哺乳動物細胞中での発現のための寄生虫蛋白質の改変された
公知の核酸の製造方法であって、遺伝子コード配列中に存在する少なくとも一の
ｍＲＮＡ不安定性モチーフをその遺伝子中の少なくとも一のｍＲＮＡ不安定性モ
チーフを、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする乳特異的コドンで置換
することにより除去することを含む当該製造方法。 - 【請求項８】 前記の蛋白質をコードする天然遺伝子中の少なくとも一のコ
ドンを、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする好適な乳特異的コドンで
置換することを更に含む、請求項５又は６に記載の方法。 - 【請求項９】 請求項５又は６に記載の方法により製造された改変された核
酸配列。 - 【請求項１０】 哺乳動物細胞における発現のための寄生虫の改変された公
知の核酸の製造方法であって、下記のステップを含む当該方法： ａ）前記の蛋白質をコードする天然遺伝子中に存在する少なくとも一のｍＲＮＡ
不安定性モチーフを、その遺伝子中の少なくとも一のｍＲＮＡ不安定性モチーフ
を、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする好適な乳蛋白質特異的コドン
で置換することにより除去し； ｂ）前記の蛋白質をコードする天然遺伝子のＡＴリッチな含量を、その遺伝子の
少なくとも一のＡＴ含有コドンを、置換されたコドンと同じアミノ酸をコードす
る乳蛋白質特異的コドンで置換することにより低下させ；そして ｃ）前記の蛋白質をコードする天然遺伝子中の少なくとも一のコドンを、置換さ
れたコドンと同じアミノ酸をコードする好適な乳特異的コドンで置換する。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法により製造された改変された核酸
。 - 【請求項１２】 前記の寄生虫がマラリアであり、且つ前記の核酸が、SEQ
ID NO:１若しくはSEQ ID NO:９の断片又はそれらと特異的に相同な配列である、
請求項１に記載の改変された核酸。 - 【請求項１３】 前記の寄生虫がマラリアであり、且つ前記の核酸が、SEQ
ID NO:９若しくはその断片又はそれらと特異的に相同な配列である、請求項１に
記載の改変された核酸。 - 【請求項１４】 細胞システムで発現することのできるSEQ ID NO:１の断片
又はそれに特異的に相同な配列である改変された核酸であって、その天然遺伝子
のＡＴ含量が、少なくとも一のコドンの前記の細胞培養システムにより認識し得
るコドンでの置換により低下されており、置換後のコドンは置換されたコドンと
同じアミノ酸をコードするが該置換はこの天然遺伝子の全体的ＡＴ含量を効果的
に低下させる、当該改変された核酸。 - 【請求項１５】 細胞システムで発現することのできるSEQ ID NO:１の断片
又はそれに特異的に相同な配列である改変された核酸であって、その天然遺伝子
のコード配列中に存在する少なくとも一のｍＲＮＡ不安定性モチーフが、該不安
定性モチーフを含む少なくとも一のコドンを該細胞システムにより認識し得るコ
ドンで置換することにより除去されており、該置換は該不安定性モチーフを効果
的に除去し且つ置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする、当該改変された
核酸。 - 【請求項１６】 天然遺伝子の少なくとも一のコドンが前記の細胞システム
の好適コドンで置換されている、請求項１４又は１５に記載の改変された核酸。 - 【請求項１７】 請求項１２に記載の改変された核酸を含むベクター。
- 【請求項１８】 請求項１７のベクターでトランスフェクトされ又はトラン
スフォームされた宿主細胞。 - 【請求項１９】 請求項１２に記載の改変された核酸を含むトランスジェニ
ック発現構築物。 - 【請求項２０】 生殖細胞系統が請求項１２に記載の改変された核酸を含む
トランスジェニック非ヒト動物。 - 【請求項２１】 トランスジェニック動物の作成のためのトランスジェニッ
ク発現ベクターであって、請求項１２に記載の改変された核酸と機能的に結合さ
れたプロモーターを含み、該プロモーターが該改変された核酸によりコードされ
る蛋白質の乳腺でのその動物の乳汁中への発現を指示する、当該トランスジェニ
ック発現ベクター。 - 【請求項２２】 細胞システムにおいて発現することのできる細菌、ウイル
ス又は寄生虫の改変された公知の核酸であって、その遺伝子のＡＴ含量が少なく
とも一のコドンの該細胞システムにより認識し得るコドンでの置換により低下さ
れており、該置換後のコドンが置換されたコドンと同じアミノ酸をコードするが
該置換が天然遺伝子の全体的ＡＴリッチな含量を効果的に低下させる、当該改変
された公知の核酸。 - 【請求項２３】 細胞システムにおいて発現することのできる細菌、ウイル
ス又は寄生虫の改変された核酸であって、その遺伝子コード配列中に存在する少
なくとも一のｍＲＮＡ不安定性モチーフが、該不安定性モチーフを含む少なくと
も一のコドンを該細胞システムにより認識され得るコドンで置換することにより
除去されており、該置換が該不安定性モチーフを効果的に排除し且つ置換された
コドンと同じアミノ酸をコードする、当該改変された核酸。 - 【請求項２４】 天然遺伝子の少なくとも一のコドンが前記の細胞システム
の好適コドンで置換されている、請求項２２又は２３に記載の改変された核酸。 - 【請求項２５】 請求項２４に記載の改変された核酸を含むＤＮＡワクチン
。 - 【請求項２６】 請求項１７に記載のベクターを含むＤＮＡワクチン。
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