CN1325646C - 修饰的核酸序列以及增加细胞***中mRNA水平和蛋白质表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了修饰的重组核酸序列(优选的是DNA)以及增加蛋白质的mRNA水平和蛋白质表达的方法，这里的蛋白质是已知或很可能在细胞培养***、哺乳动物细胞培养***或转基因动物中难以表达的蛋白质。使用本发明重组技术表达的优选的“困难”蛋白质候选物是从优选是诸如寄生生物、细菌和病毒等低等生物的异源细胞衍生的蛋白质。它们的DNA编码序列相对使用的重组表达***而言含有高的总AT含量或富AT区和/或mRNA不稳定基序和/或稀有密码子。
Description
本发明的背景
发明领域
本发明涉及异源基因表达。更具体地，本发明涉及在较高等的真核细胞***中表达微生物或寄生生物的基因。
相关的现有技术综述
在体外细胞培养***或体内重组生产***中进行某种异源基因产物的重组生产通常是困难的。例如，许多研究人员发现，在与蛋白质原始来源的细胞不同的细胞培养***，特别是哺乳动物细胞培养***中难以表达来自细菌、寄生生物和病毒的蛋白质。难以由哺乳动物细胞产生的医疗上重要蛋白质的一个例子是疟原虫裂殖子表面蛋白(malaria merozoite surface protein)(MSP-1)。
疟疾在热带国家是严重的健康问题。对现存药物的抗性迅速发展，因而急需疫苗。在恶性疟原虫(P.falciparum)生长周期中表达的多种抗原中，MSP-1是研究最深入的并且看来是最成功的接种候选物。暴露于恶性疟原虫的个体产生抗MSP-1抗体，研究表明在对MSP-1的天然获得性免疫反应和减低的疟疾发病率之间有相关性。在一系列研究中，用纯化的天然MSP-1或该蛋白的重组片段免疫可以诱导至少部分对该寄生生物的防护(Diggs等，(1993)Parasitol Today 9：300-302)。因此MSP-1是开发抗恶性疟原虫疫苗的重要靶。
MSP-1是一种190-220kDA的糖蛋白。C-末端区域已经是可用作疫苗的重组产物的焦点。然而，开发MSP-1用作疫苗的一个主要问题是在细菌或酵母表达***难以获得与亲和纯化的天然蛋白质具有同等免疫学能力的重组蛋白(Chang等，(1992)免疫学杂志(J.Immunol.)148：548-555)以及使疫苗生产可行的足够量的重组蛋白。
改进的方法是有利的，它能够增强以前难以重组表达的来自寄生生物、细菌和病毒的蛋白质的足够量的表达。特别是，一种能够表达足够量MSP-1的重组***是特别有利的。
本发明的概述
本发明提供了改进的重组DNA成分和增加蛋白质的mRNA水平和蛋白质表达的方法，这里的蛋白质是来自异源细胞的，优选是诸如细菌、病毒和寄生生物等低等生物的，且以前在细胞培养***、哺乳动物细胞培养***或转基因动物中难以表达的蛋白质。适于依据本发明的表达***表达的优选蛋白候选物是那些具有相对重组表达***而言含高总AT量或富AT区域和/或mRNA不稳定基序和/或稀有密码子的DNA编码序列的蛋白质。
第一个方面，本发明特征是一种修饰的已知核酸，优选的是能在一种***中表达的来自细菌、病毒或寄生生物的一个基因，其中的修饰包括相对未修饰序列有降低的AT含量，并且可任选的进一步包括消除至少一种或全部在天然基因中存在的mRNA不稳定基序。在特定优选实施方案中，修饰进一步包括用细胞***的优选密码子置换天然基因的一个或多个密码子。
第二个方面，本发明提供了制备本发明的修饰的核酸的方法，包括降低编码蛋白质的天然基因的总AT含量和/或消除mRNA不稳定基序中的至少一个或全部和/或使用选择的细胞***的优选密码子置换一个或多个密码子(均采用选择的细胞***识别的、优选地为选择的细胞系优选的并且编码与所置换的密码子相同的氨基酸的密码子来置换天然基因中的一个或多个密码子)。本发明的这一方面进一步包括依据本发明方法制备的修饰的核酸。
第三个方面，本发明亦提供了含有本发明核酸和在选择的细胞系或生物体中有活性的启动子的载体，以及用本发明核酸转化的宿主细胞。
第四个方面，本发明提供了，用于生产转基因泌乳动物(lactatinganimal)的含有本发明核酸的转基因表达载体以及其种系含有本发明核酸的转基因非人泌乳动物。
第五个方面，本发明提供了用于生产转基因的泌乳动物物种的转基因表达载体，包括本发明核酸和操作地偶联到该核酸上的指导乳腺将该核酸编码的蛋白质表达到转基因动物乳汁中的启动子。
第六个方面，本发明提供了含有依据本发明的修饰的核酸的DNA疫苗。本发明这一方面的一个优选实施方案包括依据本发明的修饰的MSP-1基因的片段。
附图的说明
图1描绘了依据本发明修饰的MSP-142的cDNA序列[序列1]，其中置换了306个核苷酸以降低AT含量并消除了mRNA不稳定基序同时保持MSP-142的相同蛋白质氨基酸序列。大写字母表示核苷酸置换。
图2描绘了编码“野生型”或天然MSP-142序列的核苷酸序列[序列2]。
图3a是野生型MSP-142(在表中命名为“MSP-1wt”)和新修饰的MSP-142基因(在表中命名为“编辑的MSP”)以及几种乳蛋白质基因(来自山羊和小鼠的酪蛋白基因)的密码子使用表。每一栏中的数目表示在列出的各基因中特定密码子出现的实际次数。新的MSP-142合成基因是通过首先选择给定氨基酸的富GC密码子结合选择在乳蛋白中最常使用的氨基酸从***特异密码子用法中产生的。
图3b是比较亦如图3a所示的每一密码子在野生型MSP-142(在表中命名为“MSP-1wt”)和新修饰的MSP-142基因(在表中命名为“编辑的MSP”)中的出现次数的密码子用法表。图3b中的表亦将每一密码子在野生型MSP-142和新修饰的MSP-142基因中的出现频率与每一密码子在大肠杆菌基因和人基因中的出现频率进行了比较。从而，如果表达***是大肠杆菌细胞，此表可用于确定大肠杆菌识别或优选的密码子。
图4a-c分别描绘了如实施例中所述的MSP-142构建体GTC479，GTC564和GTC627。
图5A栏是Northern检测，其中构建体GTC627含有依据本发明修饰的新MSP-142基因，GTC479是含有天然MSP-142基因的构建体，而构建体GTC469是阴性对照DNA。
图5B栏是亲和纯化后洗脱组分的Western检测。数字是收获的级分。结果表明来自修饰的MSP-142合成基因构建体GTC679的级分与MSP-1多克隆抗体反应而阴性对照GTC479则不反应。
图6描绘了实施例中所述的OT1[序列3]、OT2[序列4]、MSP-8[序列5]、MSP2[序列6]、MSP-1[序列7]的核酸序列。
图7图示质粒BC574。
图8图示BC620。
图9图示BC670。
图10图示转基因乳汁中的MSP的Westen印迹。
图11图示MSP42-2的核苷酸序列[序列8]。
图12图示BC-718。
图13图示在转基因乳汁中BC718表达的Westen印迹。
优选实施方案的详细描述
本专利和此处引用的科学文献建立了本技术领域熟练技术人员可利用的知识。颁布的美国专利、允许的申请、公开的国外申请以及此处引用的文献，通过参考文献形式并于本发明。解决这些文献和本公开之间的任何冲突均以本发明为准。
本发明提供了修饰的重组核酸序列(优选的是DNA)以及增加蛋白质的mRNA水平和蛋白质表达的方法，这里的蛋白质是已知或很可能在细胞培养***、哺乳动物细胞培养***或转基因动物中难以表达的蛋白质。使用本发明重组技术表达的优选的“困难”蛋白质候选物是从优选地诸如寄生生物、细菌和病毒等低等生物的异源细胞衍生的蛋白质。它们的DNA编码序列相对使用的重组表达***而言含有高的总AT含量或富AT区和/或mRNA不稳定基序和/或稀有密码子。
第一个方面，本发明的特征是一种修饰的已知核酸，优选的是能在一种细胞***中表达的来自细菌、病毒或寄生生物的一个基因，其中的修饰包括相对未修饰序列有降低的AT含量，并且可任选的进一步包括消除至少一种或全部在天然基因中存在的mRNA不稳定基序。“细胞***”包括细胞培养***、组织培养***、器官培养***和活体动物的组织。在特定的优选实施方案中，修饰进一步包括用细胞***的优选密码子置换天然基因的一个或多个密码子。这些特征中的每一个均是通过用细胞***可识别的并优选地是其偏爱的且与被置换的天然基因中密码子编码相同氨基酸的密码子来替代天然基因中的一个或多个密码子实现的。依据本发明，这种“沉默”核苷酸和密码子置换将足以达到降低AT含量和/或消除mRNA不稳定基序和/或减少稀有密码子数目同时保持并优选的改善细胞***产生mRNA和表达所需蛋白能力的目的。
本发明亦包括那些在适当的严紧条件下与本发明修饰核酸序列特异性同源的序列，特别排除改进的核酸从其衍生的已知核酸。如果同源性足以使一个序列与另一个序列的准确互补序列杂交，则这个序列与另一个序列“特异性”同源。如果在体内或离子强度接近生理条件的条件下，例如140mM NaCl、5mM MgCl2的条件下能够杂交形成Waston-Crick或Hoogsteen碱基对，则一个序列与另一个序列“特异性杂交”。优选的，在严紧条件下，例如在68℃ 0.2X SSC条件下保持这种特异性杂交。
在优选实施方案中，本发明核酸在哺乳动物细胞培养或转基因动物中能够以天然基因在相同条件下(即相同的细胞类型，相同的培养条件，相同的表达载体)于体外细胞培养***或转基因动物中表达量的至少25％，优选的是50％，更优选的至少为100％或更高的水平表达蛋白质。
此处使用的术语“表达”是指导致蛋白质表达的mRNA转录。可通过本技术领域已知的一系列技术测定表达，包括使用对目的蛋白特异的抗体。“天然基因”或“自然基因”是指编码野生型蛋白质的和作为修饰的核酸来源的基因序列或其片段(包括天然出现的等位基因变异)。“偏爱(优选)密码子”是指选择的细胞***更普遍使用的密码子。并非所有在此描述的密码子改变都是变成偏爱密码子，只需置换的密码子至少能被细胞***识别。此处使用的术语“减少的AT含量”是指由于在不改变靶蛋白的氨基酸序列的前提下使用选择的细胞***识别的核苷酸或密码子置换含A或T的核苷酸位点或含A和/或T的密码子而比天然基因具有较低的含A(腺嘌呤)或T(胸腺嘧啶)碱基的核苷酸的总百分数。此处使用的“异源的”是指来自与其导入的种不同种的遗传物质，或者从这种遗传物质产生的蛋白质。
本发明的特别优选的细胞***包括诸如COS细胞和CHO细胞的哺乳动物细胞***，以及转基因动物，特别是转基因动物的***组织。然而，本发明亦考虑了细菌、酵母、大肠杆菌和诸如杆状病毒的病毒表达***甚至植物***。
第二个方面，本发明提供了制备修饰的核酸的方法，包括降低编码蛋白质的天然基因的总AT含量和/或消除至少一个或所有mRNA不稳定基序和/或使用选择的细胞***的偏爱密码子置换一个或多个密码子(均采用选择的细胞***识别的、优选地为偏爱的并且编码与所置换的密码子同样的氨基酸的密码子来置换天然基因中的一个或多个密码子)。描述重组DNA技术的一般原理的标准参考书包括Watson，J.D.等，基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene)卷I和卷II，the Benjamin/Cummings Publishing Company，Inc.publisher，Menlo Park，CA(1987)Darnell，J.E.等，分子细胞生物学(MolecularCell Biology)，Scientific American Books，Inc.，Publisher，NewYork，NY(1986)；Old，R.W.等，基因操作原理：基因工程入门(Principle of Gene Manipula tion：An Introduction to GeneticEngineering)，第二版，university of California Press，publisher，Berkeley CA(1981)；Maniatis，T.等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，publisher，冷泉港(Cold SpringHarbor)，NY(1989)和分子生物学通用流程(Current Protocols inMolecular Biology)，Ausubel等，Wiley Press，New York，NY(1992)。本发明的这一方面进一步包括依据本发明方法制备的修饰的核酸。
不局限于任何原理，以前的研究表明GM-CSF mRNA的3’非翻泽区的一段保守AU序列(AUUUA)介导选择性mRNA降解(Shaw，G.和Kamen，R.细胞(Cell)46：659-667)。过去的焦点在于基因非翻译区的这些不稳定基序的存在。本发明是第一个意识到消除基因编码区的不稳定序列的益处。
第三个方面，本发明亦提供了含有本发明核酸和在选择的细胞系或生物体中有活性的启动子的载体，以及用本发明核酸转化的宿主细胞。优选的载体含有一个复制起点，因而在一个或多个细胞类型中可复制。某些优选的载体是表达载体，进一步具有至少一个启动子和被动终止子，从而使重组表达元件可以在细菌、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞中转录。
第四个方面，本发明提供了用于产生转基因泌乳动物的含有本发明核酸的转基因表达载体以及其种系含有本发明核酸的转基因非人泌乳动物。这种转基因表达载体含有能够使其作为宿主转基因动物基因组一部分来表达的启动子。本技术领域已知产生转基因动物的一般原理。参看例如Hogan et al.，小鼠胚胎操作：实验室手册(Manipulatingthe Mouse Embryo：ALaboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory)，(1986)；Simons et al，Bio/Technology 6：179-183，(1988)；Wall et al.，Biol.Reprod.32：645-651，(1985)；Buhler et al.，Bio/Technology 8∶140-143(1990)；Ebert et al.，Bio/Technology 9：835-838(1991)；Krimenfort et al.，Bio/Technology 9：844-847(1991)；Wall et al.，细胞生物化学杂志(J。Cell.Biochem.)49：113-120(1992)。将外源DNA序列导入哺乳动物及其生殖细胞的技术最初是在小鼠中开发的。参看例如，Gordon et al.，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77：7380-7384，(1980)；Gordon and Ruddle科学(Science)214：1244-1246(1981)；Palmiter and Brinster，细胞(Cell)41：343-345，1985；Brinster et al.，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82：4438-4442(1985)and Hogan et al.(出处如上)。随后将这些技术改进为用于大型动物包括牛和羊。直至最近，产生转基因小鼠或家畜的最广泛应用的方法是将感兴趣的上百个线性DNA分子以转基因表达构建体的形式注射到受精卵的一个前核。将DNA注射到受精卵的细胞质亦有广泛应用。最近，能够注射到未受精卵的完整转基因细胞系的克隆已获得成功(KHS Campbell et al.，自然(Nature)380 64-66，(1996))。
第五个方面，本发明提供了含有本发明核酸和可操作偶联到核酸上的指导乳腺将核酸编码的蛋白质表达到转基因动物乳汁中的启动子的转基因表达载体，用于产生转基因泌乳期动物物种。乳腺表达***具有高表达水平、低成本、正确加工和可及性的优点。多名研究人员已经在泌乳转基因动物中产生了已知蛋白质，诸如牛和人α-乳清蛋白。(Wright et al.，Bio/technology 9：830；834(1991)；Vilotte et al，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)，186：43-48(1989)；Kochiet al.，Mol Reprod.And Devel.33：160-164(1992)；Soulier et al.，FEBS Letters 297(1，2)：13-18(1992))，并且该***显示可以产生高水平的蛋白质。
优选的启动子在***组织中是有活性的。特别有用的是在编码乳汁特异性蛋白质的基因诸如***组织中发现的基因中有特异活性的，即在合成乳汁的生理条件下在乳腺组织中的活性强于其它组织中的启动子。最优选的是既对***组织特异又高效的启动子。这类启动子中优选的是酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白(lactalglobulin)启动子，包括但不限于α-、β-和γ-酪蛋白启动子和α-乳清蛋白以及β-乳球蛋白启动子。优选的启动子来自啮齿动物，山羊和牛。其它的启动子包括调节乳清酸性蛋白质(WAP)基因的启动子等。
本发明的一个优选实施方案提供了能够在细胞培养***、哺乳动物细胞培养***或在转基因动物乳汁中表达的编码MSP-1或其片段的修饰核酸。依据本发明修饰了编码天然MSP-1基因的核酸序列。首先通过使用编码相同氨基酸的但与天然MSP-1基因或基因片段相比足以降低修饰的核酸中AT含量的选择的细胞***识别的并优选是其偏爱的密码子置换天然基因中的密码子来降低总AT含量。其次通过使用编码相同氨基酸的但足以消除mRNA不稳定基序的选择的细胞***识别的并优选是其偏爱的密码子置换天然基因中的密码子消除了天然基因或基因片段中的mRNA不稳定基序(AUUUA，Shaw and Kamen，在前面)。任选地，天然基因中的任何其它密码子均可用所说的选择的表达***的优选的密码子置换。
第六个方面，本发明提供了含有依据本发明的修饰核酸的DNA疫苗。在特定优选实施方案中，DNA疫苗含有依据本发明的载体。本发明的DNA疫苗可能是依据本发明的“裸”的或纯化的修饰核酸，可能或可能不与启动子可操作地连接。如果核酸与启动子连接的方式使核酸序列表达，即为核酸与启动子可操作连接。这种DNA疫苗可以不进行胶囊化给药，或可作为脂质体的部分给药，或作为病毒基因组的部分给药。通常以足够使核酸表达并在接受DNA疫苗的动物体包括人体诱发抗体反应的量使用这种疫苗。随后至少在第一次给药后一星期之后可再次给药增强抗体反应。优选的给药途径包括经粘膜以及肠胃外给药。
本发明这一方面的一个优选实施方案包括依据本发明的修饰的MSP-1基因的片段。这种片段优选的包括大约5％至大约100％的全基因序列并含有依据本发明的一个或多个修饰。
图3b图示了大肠杆菌和人的密码子使用的例子。图3b显示了MSP-1天然基因和依据本发明的修饰的基因的密码子使用频率并将其密码子使用频率与大肠杆菌和人基因的进行了比较。本技术领域熟练技术人员很容易得到和知道诸如酵母、杆状病毒和哺乳动物***等多种其他表达***的密码子使用频率表。
下面的实施例说明了实施本发明的某些优选方式，但并非为了限制本发明的范围，因为可以使用替代的方法获得类似的结果。
实施例
制造新的修饰的MSP-142基因
在一种实施方案中，提供了编码MSP-1 C-末端片段的新的修饰的核酸。图1显示了能够在本发明哺乳动物细胞中表达的编码MSP-142kD C-末端部分(MSP-142)的本发明新的修饰的核酸。天然MSP-142基因(图2)不能够在哺乳动物细胞培养或转基因小鼠中表达。对天然MSP-142基因的分析表明其多种特征与哺乳动物有区别。首先，它有高达76％的总AT含量。其次，在此1100bp的DNA片段(图2)中，mRNA不稳定基序AUUUA出现10次。为了针对这些区别，设计了新的MSP-142基因。向天然MSP-142基因的306个位点引入了沉默核苷酸置换将总AT含量降至49.7％。同样经过密码子用法的改变消除了天然基因中的10个AUUUA mRNA不稳定基序。为了改变密码子用法，使用多种小鼠和山羊***特异蛋白质制出了***组织特异性密码子使用表图3a。将该表用于指导如上所述修饰的MSP-142基因的密码子用法选择。例如图3a中的表中所示，在天然基因中，65％(25/38)的亮氨酸由TTA编码，它在乳腺中是稀有密码子。在修饰的MSP-142基因中，100％的亮氨酸由CTG编码，它是乳腺中亮氨酸的优选密码子。
使用修饰的MSP-142基因构建表达载体，其通过将山羊β-酪蛋白的前端26个氨基酸融合到修饰的MSP-142基因的N-末端和将携带融合基因的SalI-Xho I片段亚克隆到表达载体pCDNA3的XhoI位点而进行的。将His6标记融合到MSP-142基因的3’末端使基因产物能够亲和纯化。这样制备了质粒GTC627(图4c)。
为了比较天然MSP-142基因构建体和本发明修饰的MSP-142核酸，亦构建了天然MSP-142基因的表达载体并将该基因加到哺乳动物细胞培养物和注射到小鼠中形成转基因小鼠，如下所述：
构建天然MSP-142表达载体
为了分泌截短的恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)，将编码MSP-142kD C-末端部分(MSP-142)的野生型基因融合到编码山羊β-酪蛋白的前15或前25个氨基酸的DNA序列中。这是通过首先用引物MSPl和MSP2(图6)PCR扩增MSP-1质粒(来自Dr.David Kaslow，NIH)，然后将PCR产物克隆到TA载体(Invitrogen)获得的。将PCR产物的BglII-XhoI片段与寡聚物OT1和OT2(图6)连接进入表达载体pCDNA3。这样产生了质粒GTC564(图4b)，它编码15个氨基酸的β-酪蛋白信号肽和成熟山羊β-酪蛋白的前11个氨基酸，随后是天然MSP-142基因。使用寡聚物MSP-8和MSP-2(图6)通过PCR扩增MSP-1质粒，然后将产物克隆到TA载体。切下XhoI片段并克隆到表达载体pCDNA3的XhoI位点产生质粒GTC479(图4a)，它编码融合到野生型MSP-142基因的15个氨基酸的山羊β-酪蛋白信号肽。在GTC564和GTC479中的MSP-142基因3’末端加上了组氨酸6(His6)标记。
在COS-7细胞中未表达天然MSP-142基因
通过瞬时转染检测测定了培养的COS-7细胞中天然MSP基因的表达。按照厂商手册使用脂质转染胺试剂(Gibco-BRL)将GTC479和GTC564质粒DNA导入COS-7细胞。转染两天后从COS细胞分离总细胞RNA。转染两天后通过将35S甲硫氨酸加入培养物中代谢标记新合成的蛋白质10个小时。
为了测定COS细胞中的MSP mRNA表达，用来自GTC479的32P标记DNA片段探测Northern印迹。在GTC479或GTC564转染体中未测到MSP RNA(未发表资料)。延长的曝光揭示有残余水平的降解的MSPmRNA。用抗MSP的多克隆抗体免疫沉淀35S标记的培养物上清和裂解物。免疫沉淀实验显示GTC479或GTC564转染细胞的裂解物或上清中没有表达(未发表资料)。这些结果显示天然MSP-1未在COS细胞中表达。
在转基因小鼠乳腺中没有天然MSP-142基因的表达
将编码15个氨基酸的山羊B-酪蛋白信号肽，山羊β-酪蛋白的前11个氨基酸以及天然MSP-142基因的GTC479 SalI-XhoI片段克隆到载体BC350中表达的β-酪蛋白XhoI位点。这样产生质粒BC574(图7)。将BC574的SalI-NotI片段注射到小鼠胚胎产生转基因小鼠。建立了15个株系的转基因小鼠。收集雌性建立者小鼠的乳汁并使用抗MSP多克隆抗体进行Western检测。检测的7个小鼠乳汁中均未发现表达MSP-142蛋白质。为了进一步确定在乳腺是否有MSP-142的mRNA表达，从第11天的泌乳转基因小鼠提取总RNA并进行Northern印迹检测。检测的任何一个BC574株系均未测到MSP-142mRNA。因而，MSP-142转基因未在转基因小鼠的乳腺中表达。总的来说，这些实验提示天然寄生生物的MSP-142基因不能在哺乳动物细胞中表达，其阻断是mRNA丰度的水平的。
哺乳动物细胞中MSP的表达
进行了瞬时转染实验以评价本发明修饰的MSP-142基因在COS细胞中的表达。将GTC627和GTC479的DNA导入COS-7细胞。转染后48小时分离总RNA进行Northern检测。用32P标记GTC627的SalI-XhoI片段探测固定化RNA。观察到GTC479和GTC627的显著不同。如前面显示，GTC479转染细胞中未检测到MSP-142mRNA，而在GTC627中表达了丰富的MSP-142mRNA(图5，A栏)。GTC469用作阴性对照并且含有克隆到商品化克隆载体PU19的GTC564的***片段。使用35S甲硫氨酸的代谢标记实验以及随后的使用抗MSP的多克隆抗体(由NIH的D.Kaslow NIAID提供)的免疫沉淀显示转染的COS细胞合成了MSP-142蛋白质(图5，B栏)。而且，在转染的COS细胞上清中检测到MSP-142，表明MSP-142蛋白质亦分泌出来。此外，使用Ni-NTA柱，从GTC627转染的COS上清中亲和纯化了MSP-142。
这些结果证明寄生性MSP-142基因的修饰导致MSP mRNA在COS细胞中表达。随后，哺乳动物细胞合成和分泌MSP-142产物。
亦可使用本技术领域熟知的方法制备本实验中使用的多克隆抗体(抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，Ed Harlowand David Lane，eds.冷泉港实验室(CoId Spring HarborLaboratory)，publishers(1988))。MSP血清抗体的产生亦描述于Chang et al.，感染和免疫(Infectionand Immunity)(1996)64∶253-261 and Chang et al.，(1992)美国国家科学院院报(ProcNatl./Acad.Sci.USA)86∶6343-6347。
这些检测表明与根本不表达的天然蛋白质相比，本发明的修饰的MSP-142核酸可以高水平表达。这些结果代表了降低基因中的AT％导致MSP基因在异源***中表达的第一个实验证据，同时代表了从MSP编码区消除AUUUA mRNA不稳定基序导致MSP蛋白质在COS细胞中表达的第一个证据。
这样，此处给出的资料提示某些因为其高A/T含量和/或存在不稳定基序，和/或使用了选择的细胞***不识别的稀有密码子而难以在细胞培养物或转基因***中表达的异源蛋白质可以借助该***的密码子用法表进行工程改造使它们能在任何给定的***中表达。本发明第一次表明为了消除造成导致低RNA水平或无RNA的降解的怀疑序列的目的进行DNA序列的修饰。图5A栏Northern的结果(即天然基因无RNA而本发明的修饰的DNA序列有合理的水平的RNA)很可能解释了蛋白质产生的增加。
下面的实施例描述了MSP1-42作为天然未融合(并且未糖基化)蛋白质在转基因小鼠乳汁中的表达。
MSP转基因的构建
为了将MSP1-42与15个氨基酸的β-酪蛋白信号肽融合，将编码15个氨基酸酪蛋白信号和结束于Cla I位点的MSP1-42的前5个氨基酸的寡聚物对MSP203和MSP204(MSP203：ggccgctcgacgccaccatgaaggtcctcataattgcctgtctggtggctctggccattgcagccgtcactccctccgtcat.MSP204：cgatgacggagggagtgacggctgcaatggccagagccaccagacaggcaattatgaggaccttcatggtggcgtcgagc)与编码其余的MSP1-42基因的BC620的CLA I-Xho I片段(图8)连接进入表达载体pCDNA3的Xho I位点。然后将这个质粒(GTC669)的Xho I片段克隆到乳汁特异性表达载体BC350的Xho I位点产生B670(图9)。
MSP1-42在转基因小鼠乳汁中的表达
从质粒BC670制备Sal I-Not I片段并微注射到小鼠胚胎产生转基因小鼠。通过从尾巴活组织检查提取小鼠DNA随后使用寡聚物GTC17和MSP101(寡聚物的序列：GTC17，GATTG ACAAG TAATA CGCTGTTTCC TC寡聚物MSP101，GGATTCAATAGATACGG)进行PCR检测确认转基因小鼠。在哺乳第7和9天收集雌性建立者转基因小鼠的乳汁，并使用多克隆抗-MSP抗体和单克隆抗MSP抗体5.2(Dr.David Kaslow，NIH)通过western检测确定MSP-1-42的表达水平。结果表明转基因小鼠乳汁中MSP1-42的表达水平是1-2毫克/毫升(图10)。
构建MSP1-42糖基化位点负突变体
我们对乳汁产生的MSP检测揭示转基因MSP蛋白质是N-糖基化的。为了消除MSP1-42基因中的N-糖基化位点，用谷氨酰胺(Q)取代了181和262位点的天冬酰胺(N)。通过设计与MSP1相应区域退火的携带AAC到CAG突变的DNA寡聚物导入了置换。然后将这些寡聚物用作PCR引物产生编码N到Q置换的DNA片段。
为了导入N262-Q突变，使用一对寡聚物MSPGYLYCO-3(CAGGGAATGCTGCAGATC AGC)和MSP42-2(AATTCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCGCAGAAAATAC CATG图11)PCR扩增含有合成的MSP1-42基因的质粒GTC627。将PCR产物克隆到pCR2.1载体。这样产生了质粒GTC716。
为了导入N181-Q突变，使用寡聚物MSPGLYCO-1(CTCCTTGTTCAGGAACTTGTAG GG)和MSPGLCO-2(GTCCTGCAGTACACATATGAG图4)PCR扩增质粒GTC627。将PCR产物克隆到pCR2.1载体(Invitrogen)。这样产生了质粒GTC700。
通过下面三个步骤构建了MSP双糖基化突变体：首先将BC670的Xho I-Bsm I片段和GTC716的BSm I-Xho I片段连接导入pCR2.1载体的Xho I位点。这样产生了含有具N262-Q突变的MSP1-42基因的质粒。然后将这个质粒中的EcoN I-Nde I片段用GTC716质粒的EcoNI-Nde I片段取代，引入第二个突变N181-Q。最后将这个质粒的Xho I片段克隆到BC350产生BC718(图12)。
转基因动物中非糖基化MSP1的表达
BC718具有下列特征：它携带处于β-酪蛋白启动子控制下的MSP1-42基因因而可在转基因动物哺乳期乳腺中表达。此外，它编码直接与MSP1-42融合的15个氨基酸的β-酪蛋白前导序列，这样在N-末端没有任何多余氨基酸的MSP1-42可以分泌到乳汁中。最后，由于N-Q置换，转基因动物乳汁中此构建体产生的MSP不会被糖基化。总而言之，在乳汁中由BC718产生的转基因MSP与寄生生物MSP1是相同的。
从质粒BC718制备了SalI/XhoI片段并微注射到小鼠胚胎产生了转基因小鼠。如前面所述鉴定转基因动物。收集雌性建立者的乳汁，并使用抗体5.2进行Western印迹检测。结果示于图13，表明非糖基化MSP1以0.5至1毫克/毫升的浓度表达。
等价物
本技术领域熟术人员仅使用常规实验会认识到或能够确定多种等价物均被认为在本发明的范围内，并由下面的权利要求所覆盖。
Claims (22)
1.在非人转基因哺乳动物的乳汁中产生寄生物蛋白或其片段的方法，其包含：
提供非人转基因哺乳动物，其基因组包含与定向乳腺表达的启动子有效连接的编码所述寄生物蛋白或其片段的修饰的核酸序列，其中的修饰的核酸序列经下述方式被修饰：
a)将所述的寄生物蛋白或其片段的编码序列在寄生物中天然存在的至少一部分AUUUA mRNA不稳定性基序置换为用于表达的哺乳动物细胞优选的密码子，以去除所述的AUUUA mRNA不稳定性基序或防止所述的AUUUA mRNA不稳定性基序使编码所述寄生物蛋白或其片段的mRNA不稳定，同时与被置换的所述的AUUUA mRNA不稳定性基序部分编码相同的氨基酸；
b)将所述的被修饰核酸序列在寄生物中天然存在的一个或多个含AT的密码子置换为用于表达的哺乳动物细胞优选的并且与所述被置换的密码子编码相同的氨基酸的密码子；
c)使所述非人转基因哺乳动物在其乳汁中表达所述的寄生物蛋白或其片段，从而产生所述的寄生物蛋白或其片段，并且其中编码所述的寄生物蛋白或其片段的天然存在的核酸序列包含至少一个AUUUA不稳定性基序。
2.权利要求1的方法，其中所述的修饰的核酸序列使所述寄生物的天然存在的核酸序列中的至少一个密码子被用于表达的哺乳动物细胞的优选密码子所置换，从而所述寄生物蛋白或其片段的所述核酸序列的AT含量相对于所述寄生物蛋白或其片段的所述天然存在的核酸序列降低，并且所述寄生物蛋白或其片段的所述天然存在的核酸序列的mRNA不稳定性基序通过使用另外的用于表达的哺乳动物细胞优选的密码子而消除。
3.权利要求1的方法，其中所述的存在于天然存在的核酸中的每一个AUUUA mRNA不稳定性基序都被用于表达的哺乳动物细胞优选的密码子所置换，以去除所述的AUUUA mRNA不稳定性基序或防止所述的AUUUA mRNA不稳定性基序使编码所述寄生物蛋白或其片段的mRNA不稳定。
4.权利要求1的方法，其中所述的修饰的核酸序列进一步包含至少一个非第一密码子的另外的密码子被置换以降低AT含量，或包含核酸序列修饰以消除所述的AUUUA mRNA不稳定性基序，其被用于表达的哺乳动物细胞优选的密码子所置换，并与天然存在的核酸序列编码相同的寄生物蛋白或其片段。
5.权利要求1的方法，其中天然存在的核酸序列的所有密码子都被用于表达的哺乳动物细胞优选的并且编码与该天然存在的核酸序列相同的寄生物蛋白或其片段的密码子所置换。
6.权利要求1的方法，其中所述的寄生物蛋白或其片段以至少0.5mg/ml的水平表达于所述的非人转基因哺乳动物的乳汁中。
7.权利要求1的方法，其中所述的寄生物蛋白或其片段以1.0mg/ml-2.0mg/ml的水平表达于所述的非人转基因哺乳动物的乳汁中。
8.权利要求1的方法，其中所述的非人转基因哺乳动物中表达的所述的寄生物蛋白或其片段可检测地表达于所述的非人转基因哺乳动物的乳汁中。
9.权利要求1的方法，其中所有的非优选密码子被用于表达的哺乳动物细胞的优选的密码子所置换。
10.权利要求1的方法，其中所述的寄生物蛋白或其片段是来自恶性疟原虫的蛋白片段。
11.权利要求10的方法，其中所述的寄生物蛋白或其片段是来自恶性疟原虫蛋白MSP-1的蛋白、多肽或肽。
12.权利要求1的方法，其中所述的用于表达的哺乳动物细胞是乳腺上皮细胞。
13.权利要求1的方法，其中所述的启动子选自下列启动子：
a)β-酪蛋白；
b)牛乳球蛋白；
c)乳清酸启动子；
d)α-卵清蛋白；以及
e)山羊酪蛋白。
14.权利要求1的方法，其中所述的非人转基因哺乳动物选自：
a)山羊；
b)牛；
c)猪；
d)啮齿动物；以及
e)绵羊。
15.权利要求1的方法，其中所述的修饰的核酸序列被修饰来表达修饰的氨基酸序列，产生至少一个天冬酰胺到谷氨酰胺的变化以消除所述非人转基因哺乳动物产生的所述寄生物蛋白或其蛋白片段上的至少一个糖基化位点。
16.转基因非人哺乳动物细胞系，其包含与定向乳腺表达的启动子有效连接的编码寄生物蛋白或其片段的修饰的核酸序列，其中所述的修饰的核酸序列经下述方式被修饰：通过用于表达的哺乳动物细胞优选的密码子置换编码序列在寄生物中天然存在的至少一部分AUUUAmRNA不稳定性基序，以去除所述的AUUUA mRNA不稳定性基序或防止所述的AUUUA mRNA不稳定性基序使编码所述寄生物蛋白或其片段的mRNA不稳定，同时与被置换的所述的AUUUA mRNA不稳定性基序部分编码相同的氨基酸，并且通过用于表达的哺乳动物细胞优选的并且与被置换的密码子编码相同的氨基酸的密码子置换所述的寄生物蛋白或其片段在寄生物中天然存在的核酸序列一个或多个含AT的密码子，其中所述非人转基因哺乳动物细胞系表达所述的寄生物蛋白或其片段，并且其中编码所述的寄生物蛋白或其片段的天然存在的核酸序列包含至少一个AUUUA不稳定性基序。
17.权利要求16的转基因非人哺乳动物细胞系，其中所述的寄生物蛋白或其片段是来自恶性疟原虫的蛋白片段。
18.权利要求17的转基因非人哺乳动物细胞系，其中所述的寄生物蛋白或其片段是来自恶性疟原虫蛋白MSP-1的蛋白、多肽或肽。
19.权利要求16的转基因非人哺乳动物细胞系，其中所述的用于表达的哺乳动物细胞是乳腺上皮细胞。
20.权利要求16的转基因非人哺乳动物细胞系，其中所述的启动子选自下列启动子：
a)β-酪蛋白；
b)牛乳球蛋白；
c)乳清酸启动子；
d)α-卵清蛋白；以及
e)山羊酪蛋白。
21.权利要求16的转基因非人哺乳动物细胞系，其中所述的非人转基因哺乳动物选自：
a)山羊；
b)牛；
c)猪；
d)啮齿动物；以及
e)绵羊。
22.权利要求16的转基因非人哺乳动物细胞系，其中所述的修饰的核酸序列被修饰来表达修饰的氨基酸序列，产生至少一个天冬酰胺到谷氨酰胺的变化以消除所述非人转基因哺乳动物产生的所述寄生物蛋白或其蛋白片段上的至少一个糖基化位点。
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