JP2002518018A - エリスロポエチン類似体−ヒト血清アルブミン融合物 - Google Patents
エリスロポエチン類似体−ヒト血清アルブミン融合物Info
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Abstract
Description
A)融合蛋白質、EPOa−hSA融合蛋白質をコードする核酸及びEPOa−
hSA融合蛋白質及び核酸の製造方法及び利用方法に関係する。
のEPOa部分の少なくとも1つのアミノ酸残基が、エリスロポエチン(EPO)
におけるグリコシル化部位として働く部位がEPOにおけるグリコシル化部位と
して働かないように変化している当該EPOa−hSA融合蛋白質、例えばエリ
スロポエチンにおけるグリコシル化部位として働き得る少なくとも1つのアミノ
酸残基が例えば置換又は欠失により変化してそれによりそれがグリコシル化部位
として働かなくなっているEPOa−hSA融合蛋白質を特徴とする。
;R2−L−R1;又はR1−L−R2−L−R1(式中、R1は、EPOaア
ミノ酸配列であり、Lは、ペプチドリンカーであり、そしてR2は、ヒト血清ア
ルブミンアミノ酸配列である)を有する。好ましくは、R1及びR2は、ペプチ
ドリンカーを介して共有結合により結合されている。
酸残基は欠失しており;グリコシル化部位として働くEPOのアミノ酸残基はグ
リコシル化部位として働かないアミノ酸残基で置換されており;変化させるアミ
ノ酸残基を、アミノ酸残基Asn24、Asn38、Asn83及びSer12
6よりなる群から選択し;アミノ酸残基Ser126のグリコシル化部位と、A
sn24、Asn38及びAsn83よりなる群から選択する少なくとも1つの
更なるN結合グリコシル化部位を変化させ;N結合グリコシル化に供するグリコ
シル化部位は、Asn残基をそれ以外のアミノ酸残基例えばGlnで置換するこ
とにより変化させ;O結合グリコシル化に供するグリコシル化部位は、Ser残
基をそれ以外のアミノ酸残基例えばAlaで置換することにより変化させる。
乳動物例えば反芻動物例えばヤギの乳腺において作られる。
乳動物例えば反芻動物例えばヤギの乳汁中に分泌される。
物において、乳腺特異的プロモーター例えば乳汁特異的プロモーター例えば乳清
又はカゼインプロモーターの制御下で作られる。この乳汁特異的プロモーターは
、カゼインプロモーター、べータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質
プロモーター又はラクトアルブミンプロモーターであってよい。好ましくは、こ
のプロモーターは、ヤギのβカゼインプロモーターである。
は、トランスジェニック動物の乳汁中に、少なくとも約0.2mg/ml、0.
5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/m
l以上の濃度で分泌される。
換され又は欠失している)。好ましくは、このアミノ酸残基Asn24は、Gl
nで置換されている。
され又は欠失している。好ましくは、アミノ酸残基Asn38は、Glnで置換
されている。
され又は欠失している。好ましくは、このアミノ酸残基Asn83は、Glnで
置換されている。
ば置換され又は欠失している。好ましくは、このアミノ酸残基Ser126は、
Alaにより置換されている。
Ser126の各々は、変化しており(例えば、置換され又は欠失している)、そ
れにより、それは、グリコシル化部位として働かず、アミノ酸残基Asn24、
Asn28、Asn83及びSer126は、それぞれ、Gln、Gln、Gl
n及びAlaにより置換されている。
チドリンカーは、次の特徴の少なくとも1つを有する:a)それは、エリスロポ
エチン類似体のアミノ酸配列とヒト血清アルブミンのアミノ酸配列の相互の回転
を可能にし;b)それは、プロテアーゼによる消化に耐性であり、そしてc)そ
れは、エリスロポエチン類似体又はヒト血清アルブミンと相互作用しない。
チドリンカーは、5〜60アミノ酸長、一層好ましくは10〜30アミノ酸長で
あり;このペプチドリンカーは、20アミノ酸長であり;このペプチドリンカー
は、17アミノ酸長であり;このペプチドリンカー中の各アミノ酸は、Gly、
Ser、Asn、Thr及びAlaよりなる群から選択し;このペプチドリンカ
ーは、Gly−Serエレメントを含む。
チドリンカーは、式(Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)y(式中、yは、
1、2、3、4、5、6、7又は8である)を有する配列を含む。好ましくは、
このペプチドリンカーは、式(Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3を有
する配列を含む。好ましくは、このペプチドリンカーは、式((Ser−Gly−
Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有する配列を含む。
チドリンカーは、式(Ser−Ser−Ser−Ser−Gly)y(式中、yは、
1、2、3、4、5、6、7又は8である)を有する配列を含む。好ましくは、
このペプチドリンカーは、式((Ser−Ser−Ser−Ser−Gly)3−S
er−Pro)を有する配列を含む。
POaがアミノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を
含む当該融合蛋白質を特徴とする。
、Ala126EPOである(即ち、アミノ酸24、38、83及び126のみ
が野生型と異なっている)。
38、Gln83及びAla126を含むEPOa、ペプチドリンカー例えば式
((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプ
チドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含むEPOa−hSA融合蛋白質を特
徴とする。
、Ala126EPOである。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
カー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)
を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Gln24、Gln38、Gln
83及びAla126を含むEPOaを含むEPOa−hSA融合蛋白質を特徴
とする。
、Ala126EPOである。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
えば少なくとも1つのアミノ酸残基が変化していてそれによりEPOにおけるグ
リコシル化部位として働く部位がそのEPOにおけるグリコシル化部位として働
かないEPOa−hSA融合蛋白質、例えばエリスロポエチンにおけるグリコシ
ル化部位として働くことのできるコードされたEPOa−hSAの少なくとも1
つのアミノ酸残基が例えば置換又は欠失により変化してそれによりグリコシル化
部位として働かなくなっているEPOa−hSA融合蛋白質をコードするヌクレ
オチド配列を有する単離された核酸を特徴とする。
8、Gln83及びAla126を含むEPOa−hSA融合蛋白質をコードす
る核酸を特徴とする。
、Ala126EPOである。
38、Gln83及びAla126を含むEPOa、ペプチドリンカー例えば式
((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプ
チドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含むEPOa−hSA融合蛋白質をコ
ードする核酸を特徴とする。
、Ala126EPOである。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
ンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro
)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Gln24、Gln38、Gl
n83及びAla126を含むEPOaを含むEPOa−hSA融合蛋白質をコ
ードする核酸を特徴とする。
、Ala126EPOである。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
を特徴とする。
マーカー;複製起点;又はヒト以外の種に相同なDNA例えばヤギDNAを含む
。
清蛋白質又はカゼインプロモーターである。この乳汁特異的プロモーターは、カ
ゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質プロ
モーター又はラクトアルブミンプロモーターである。好ましくは、このプロモー
ターは、ヤギβカゼインプロモーターである。
とする。
融合物の調製方法を特徴とする。この方法は、エリスロポエチン類似体をコード
する核酸がヒト血清アルブミンをコードする核酸とイン・フレームで結合された
配列をこの構築物又はベクター中に形成することを含む。
から調製する方法を特徴とする。この方法は、EPOa−hSA融合蛋白質をコ
ードする核酸を含む細胞を準備し、そのEPOa−hSA融合蛋白質をこの核酸
から発現させ、それにより、このEPOa−hSA融合蛋白質を作成することを
含む。
胞である。適当な哺乳動物細胞には、CHO細胞又は他の類似の発現系が含まれ
る。
細胞である。
される。
方法は、更に、そのEPOa−hSA融合蛋白質を培養培地から精製することを
含む。
、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
ノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa
、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−S
er−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly
−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基G
ln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
SA融合蛋白質をコードする核酸を含む培養細胞をも包含する。この発明は又、
かかる細胞を例えばEPOa−hSA融合蛋白質例えばここに記載のEPOa−
hSA融合蛋白質をコードする核酸をこの細胞に導入し又はこの細胞中で形成す
ることにより調製する方法をも包含する。
のEPOa−hSAの製造方法を特徴とする。この方法は、EPOa−hSA融
合蛋白質の発現を指示するトランスジーンを含むトランスジェニック生物を用意
し;そのトランスジーンを発現させ;そして好ましくは、トランスジーンにより
生成されたEPOa−hSA融合蛋白質を例えばその生物から又はその生物によ
り生成された生成物から回収することを含む。
物例えばトランスジェニック哺乳動物例えばトランスジェニック乳用動物例えば
トランスジェニックヤギ又はトランスジェニックウシである。
の方法は、更に、そのEPOa−hSA融合蛋白質をその体液から精製すること
を含む。
蛋白質は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において好ましくは乳汁特異的プ
ロモーター例えば乳清蛋白質又はカゼインプロモーターの制御下で作られる。こ
の乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、ベータラクトグロブリン
プロモーター、乳漿酸蛋白質プロモーター、又はラクトアルブミンプロモーター
であってよい。好ましくは、このプロモーターは、ヤギのβカゼインプロモータ
ーである。
ク哺乳動物例えば反芻動物例えば乳用動物例えばヤギ又はウシの乳腺において作
られる。
ク哺乳動物の乳汁中に少なくとも約0.2mg/ml、0.5mg/ml、0.
75mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml以上の濃度で分泌
される。
から又はその生物により生成された生成物例えば乳汁、種子、毛、血液、卵又は
尿から回収することを含む。
ェニック植物において生成される。
4、Gln38、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
ノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa
、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−S
er−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
n38、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gl
y−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アル
ブミンである。
血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly
−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基G
ln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
質例えばここに記載のEPOa−hSA融合物の製造方法を特徴とする。この方
法は、EPOa−hSA融合蛋白質の発現を与えるトランスジェニック動物例え
ばヤギ又はウシを準備し;そのトランスジーンを発現させ;そして好ましくはE
POa−hSA融合蛋白質をこのトランスジェニック動物の乳汁から回収するこ
とを含む。
ク哺乳動物例えば反芻動物例えばヤギ又はウシの乳腺において生成される。
ク哺乳動物例えば反芻動物例えば乳用動物例えばヤギ又はウシの乳汁中に分泌さ
れる。
ーター例えば乳汁特異的プロモーター例えば乳清蛋白質又はカゼインプロモータ
ーの制御下で生成される。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモータ
ー、ベータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質プロモーター又はラク
トアルブミンプロモーターであってよい。好ましくは、このプロモーターは、ヤ
ギのβカゼインプロモーターである。
ク哺乳動物の乳汁中に少なくとも約0.2mg/ml、0.5mg/ml、0.
75mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml以上の濃度で分泌
される。
、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
ノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa
、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−S
er−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly
−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基G
ln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
a−hSA融合蛋白質例えばここに記載のEPOa−hSA融合蛋白質を含むト
ランスジェニック調製物を準備する方法を特徴とする。この方法は、乳腺上皮細
胞中で蛋白質をコードする配列の発現を生じるプロモーター配列と機能的に結合
されたEPOa−hSA融合蛋白質をコードする配列を有するトランスジェニッ
ク哺乳動物を準備し、この融合蛋白質を発現させ、そしてこの哺乳動物から乳汁
を得、それにより、トランスジェニック調製物を与えることを含む。
hSA融合蛋白質をコードする配列を、トランスジェニック哺乳動物の生殖細胞
系統に導入する。
4、Gln38、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
ノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa
、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−S
er−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly
−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、アミノ酸残基Gln
24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
POa−hSA融合蛋白質例えばここに記載のEPOa−hSA融合蛋白質を含
むトランスジェニック調製物を準備する方法を特徴とする。この方法は、乳腺上
皮細胞における蛋白質をコードする配列の発現を生じるプロモーター配列に機能
的に結合されたEPOa−hSA融合蛋白質をコードする配列を有するトランス
ジェニックヤギ又はウシを準備し、その融合蛋白質を発現させ、そして、ヤギ又
はウシに由来する乳汁を得、それにより、トランスジェニック調製物を与えるこ
とを含む。
4、Gln38、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
ノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa
、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−S
er−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly
−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基G
ln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
のEPOa−hSA融合蛋白質をコードするトランスジーンを含むトランスジェ
ニック生物を特徴とする。
物又は動物である。好適なトランスジェニック動物には、哺乳動物;鳥類;爬虫
類;有袋類;及び両生類が含まれる。適当な哺乳動物には、反芻動物;有蹄動物
;家畜化哺乳動物;及び乳用動物が含まれる。特に好適な動物には、マウス、ヤ
ギ、ヒツジ、ラクダ、ウサギ、雌ウシ、ブタ、ウマ、雄ウシ及びラマが含まれる
。適当な鳥類には、ニワトリ、ガチョウ及び七面鳥が含まれる。このトランスジ
ェニック蛋白質がトランスジェニック動物の乳汁中に分泌される場合には、この
動物は、1年間に少なくとも1、一層好ましくは少なくとも10又は100リッ
トルの乳汁を生成することができるであろう。
ーター例えば乳汁特異的プロモーター例えば乳清蛋白質又はカゼインプロモータ
ーの制御下にある。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、ベ
ータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質プロモーター、またはラクト
アルブミンプロモーターであってよい。好ましくは、このプロモーターは、ヤギ
のβカゼインプロモーターである。
とも役0.2mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/m
l、2mg/ml、3mg/ml以上の濃度で分泌される。
、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
ノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa
、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−S
er−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly
−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基G
ln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
のEPOa−hSA融合蛋白質をコードするトランスジーンを含むトランスジェ
ニックウシ、ヤギ又はヒツジを特徴とする。
ーター例えば乳汁特異的プロモーター例えば乳性蛋白質又はカゼインプロモータ
ーの制御下にある。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、ベ
ータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質プロモーター又はラクトアル
ブミンプロモーターであってよい。好ましくは、このプロモーターは、ヤギのβ
カゼインプロモーターである。
2mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml、2mg
/ml、3mg/ml以上の濃度で乳汁中に分泌される。
、Gln83及びAla126を含む。
la126EPOである。
残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa、ペ
プチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser
−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−G
ly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Gln
24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
ク動物を有する一群のトランスジェニック動物であって、各動物がEPOa−h
SA融合蛋白質トランスジーン例えばここに記載のEPOa−hSA融合蛋白質
をコードするトランスジーンをふくむ、一群のトランスジェニック動物を特徴と
する。
爬虫類、有袋類又は両生類である。適当な哺乳動物には、有蹄類;家畜化哺乳動
物;及び乳用動物が含まれる。特に好適な動物には、マウス、ヤギ、ヒツジ、ラ
クダ、ウサギ、雌ウシ、ブタ、ウマ、雄ウシ及びラマが含まれる。適当な鳥類に
は、ニワトリ、ガチョウ及び七面鳥が含まれる。このトランスジェニック蛋白質
がトランスジェニック動物の乳汁中に分泌される場合には、その動物は、年間に
少なくとも1リットルの、一層好ましくは少なくとも10又は100リットルの
乳汁を生成することができるであろう。
ーター例えば乳汁特異的プロモーター例えば乳清蛋白質又はカゼインプロモータ
ーの制御下にある。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、ベ
ータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質プロモーター又はラクトアル
ブミンプロモーターであってよい。
2mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml、2mg
/ml、3mg/ml以上の濃度で乳汁中に分泌される。
、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
、Ala126EPOである。
ノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa
、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−S
er−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly
−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基G
ln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
例えばここに記載のEPOa−hSA融合蛋白質及び製薬上許容し得るキャリア
ーを有する製薬組成物を特徴とする。
、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
ノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa
、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−S
er−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly
−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基G
ln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
ための指示と一緒にパッケージにされたEPOa−hSA融合蛋白質例えばここ
に記載のEPOa−hSA融合蛋白質を有するキットを特徴とする。
癌に関係して貧血症を患った患者である。
4、Gln38、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
ノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa
、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−S
er−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly
−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基G
ln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
のEPOa−hSA融合蛋白質の精製した調製物を特徴とする。
0マイクログラムのEPOa−hSA融合蛋白質を含む。好適具体例において、
この調製物は、少なくとも1、10、100又は1000ミリグラムのEPOa
−hSA融合蛋白質を含む。
調製物を特徴とし、ここに、このエリスロポエチン類似体は、アミノ酸残基Gl
n24、Gln38、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
0マイクログラムのEPOa−hSA融合蛋白質を含む。好適具体例において、
この調製物は、少なくとも1、10、100又は1000ミリグラムのEPOa
−hSA融合蛋白質を含む。
38、Gln83及びAla126を含むEPOa、ペプチドリンカー例えば式
((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプ
チドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含むEPOa−hSA融合蛋白質又は
その精製した調製物を特徴とする。
、Ala126EPOである。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
0マイクログラムのEPOa−hSA融合蛋白質を含む。好適具体例において、
この調製物は、少なくとも1、10、100又は1000ミリグラムのEPOa
−hSA融合蛋白質を含む。
ンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro
)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Gln24、Gln38、Gl
n83及びAla126を含むEPOaを含むEPOa−hSA融合蛋白質又は
その精製した調製物を特徴とする。
、Ala126EPOである。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
ムのEPOa−hSA融合蛋白質を含む。好適具体例において、この調製物は、
少なくとも1、10又は100グラムのEPOa−hSA融合蛋白質を含む。
を治療する方法を特徴とする。この方法は、治療上有効な量のEPOa−hSA
融合蛋白質例えばここに記載のEPOa−hSA融合蛋白質をその患者に投与す
ることを含む。
癌に関係する貧血症を患っている患者である。
又は10回反復投与する。
ln24、Gln38、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
ノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa
、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−S
er−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly
−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基G
ln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
方法を特徴とする。この方法は、EPOa−hSA融合蛋白質例えばここに記載
の融合蛋白質をコードする核酸をその患者に送達し又は供給することを含む。
クターで送達し又は供給する。
種細胞にて送達し又は供給する。
、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
ノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa
、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−S
er−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly
−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基G
ln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
ンスジェニック動物の作製方法を特徴とする。この方法は、生物の細胞中にEP
Oa−hSAトランスジーン例えばここに記載のEPOa−hSA融合蛋白質を
コードするトランスジーンを供給し又は形成し;その細胞又はその細胞の子孫に
トランスジェニック動物を生じさせることを含む。
物又は動物である。好適なトランスジェニック動物には、哺乳動物;鳥類;爬虫
類;有袋類;及び両生類が含まれる。適当な哺乳動物には、反芻動物;が有蹄類
;家畜化哺乳動物;及び乳用動物含まれる。特に好適な動物には、マウス、ヤギ
、ヒツジ、ラクダ、ウサギ、雌ウシ、ブタ、ウマ、雄ウシ及びラマが含まれる。
適当な鳥類には、ニワトリ、ガチョウ及び七面鳥が含まれる。このトランスジェ
ニック蛋白質がトランスジェニック動物の乳汁中に分泌される場合には、この動
物は、年間少なくとも1リットルの、一層好ましくは少なくとも10又は100
リットルの乳汁を生成することができよう。
ーター例えば乳汁特異的プロモーター例えば乳清蛋白質又はカゼインプロモータ
ーの制御下にある。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、べ
ータラクトグロブリン、乳漿酸蛋白質プロモーター又はラクトアルブミンプロモ
ーターであってよい。好ましくは、このプロモーターは、ヤギのβカゼインプロ
モーターである。
合蛋白質は、そのトランスジェニック動物の乳汁中に、少なくとも約0.2mg
/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml、2mg/ml
、3mg/ml以上の濃度で分泌される。
、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
ノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOa
、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−S
er−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
8、Gln83、Ala126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−
Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミ
ンである。
血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ser−Gly−Gly−Gly
−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基G
ln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEPOaを含む。
式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペ
プチドリンカー、及びGln24、Gln38、Gln83、Ala126EP
Oである。
その精製した調製物例えばここに記載のEPOa−hSA融合蛋白質のEPOa
部分を特徴とし、該類似体蛋白質においては、少なくとも1つのアミノ酸残基が
変化しており、それにより、EPOにおいてグリコシル化部位として働く部位が
EPOa(例えば、エリスロポエチンにおけるグリコシル化部位として働くこと
のできる少なくとも1つのアミノ酸残基が例えば置換又は欠失により変化し、そ
れにより、それがグリコシル化部位として働かなくなったEPOa)においては
グリコシル化部位として働かない。
4、Gln38、Gln83及びAla126を含む。
、Ala126EPOである。
ド配列を有する単離された核酸を特徴とする。
又は構築物を特徴とする。
マーカー;複製起点;又はヒト以外の種に相同なDNA例えばヤギのDNAを含
む。
構築物を含む細胞を特徴とする。
プチドは、ここで用いる場合、それがそれを発現する細胞又は生物中で共存して
いる少なくとも一の他の蛋白質、脂質又は核酸から(例えば、トランスジェニッ
ク動物中の又はトランスジェニック動物により生成される液体(例えば、乳汁)若
しくは他の物質(例えば、卵)中の蛋白質、脂質又は核酸から)分離されたポリペ
プチドを意味する。このポリペプチドは、好ましくは、それを精製するのに用い
た物質例えば抗体又はゲルマトリクス例えばポリアクリルアミドから分離される
。このポリペプチドは、好ましくは、精製された調製物の少なくとも10、20
、50、70、80又は95%(乾燥重量)を構成する。好ましくは、この調製物
は、蛋白質配列決定を可能にするのに十分なポリペプチド;少なくとも1、10
又は100μgのポリペプチド;少なくとも1、10又は100mgのポリペプ
チドを含む。
J.Biol.Chem.261:6747-6757,1986;Lawn等 Nucl.Acids Res.9:6103,1981に記載
されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。好適具体例においては、1つ
又は最大で2、5、10若しくは20のアミノ酸残基が置換され、挿入され又は
欠失した配列変異体が含まれる。変異体は、例えばマウス、ラット、ウサギ、霊
長類、ヒヒ又はヒトにおいて、実質的に、hSAと同じ免役原性を有するであろ
う。変異体は、EPOaを含む融合蛋白質に取り込まれた場合に、例えばマウス
、ウサギ又はヒトにおいて、EPOaとhSAとを含む融合蛋白質と同様のクリ
アランス時間と活性とを有するEPOa−hSA融合物を生じるであろう。
の赤血球への成熟に関与する糖蛋白質ホルモンをいう。EPOの配列は、Powell
等、Proc.Natl.Acad.Sci. USA,83:6465-6469(1986)に見出すことができる。
した生物の天然のゲノムにおいて直接隣接している配列例えばコード配列の一方
又は両方(即ち、5’側のものと3’側のもの)と直接隣接していない;又はそれ
が由来した生物において共存している核酸配列を実質的に含まない。この用語は
、例えば、ベクター (例えば、自律的に複製するプラスミド若しくはウイルス)
中に又は原核若しくは真核生物のゲノムDNA中に取り込まれた組換えDNA、
又は他のDNA配列と独立の別個の分子として存在するDNA(例えば、PCR
又は制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されるcDNA又はゲノムDNA断
片)を包含する。実質的に純粋なDNAは又、更なるEPOa−hSA融合蛋白
質配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えDNAをも包含する
。
は2つの核酸分子間の配列類似性をいう。第1の配列のある位置が第2の配列中
の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められているなら
ば、これらの分子は、その位置で相同である(即ち、ここで用いる場合、アミノ
酸又は核酸の「相同性」は、アミノ酸又は核酸の「同一性」に等しい)。2つの
配列間の相同性パーセントは、それらの配列により共有される同じ位置の数の関
数である(即ち、相同性%=同じ位置の数/位置の総数×100)。例えば、もし
2つの配列の位置10の内の6が一致し又は相同であるならば、これらの2つの
配列は、60%相同であり又は60%の配列同一性を有する。例として、DNA
配列ATTGCCとTATGGCは、50%の相同性又は配列同一性を共有する
。一般に、比較は、2つの配列を最大の相同性又は配列同一性を与えるように整
列させて行う。
ムを利用して達成することができる。配列の比較に利用される数学的アルゴリズ
ムの好適な非制限的な例は、Karlin及びAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
87:2264-68(Karlin及びAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77にお
いて改変)のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Altschul(1990)J.Mol
.Biol.215:403-10のNBLAST及びXBLASTプログラム(バージョン2.
0)に組み込まれている。BLASTヌクレオチドサーチは、NBLASTプロ
グラム、スコア=100、ワード長=12を用いて行って、この発明のITAL
Y核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLAST蛋白質サ
ーチは、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて行って
、この発明のITALY蛋白質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。
比較目的のためにギャップを入れたアラインメントを得るためには、ギャップト
BLASTを、Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402に記載さ
れたように利用することができる。BLAST及びギャップトBLASTプログ
ラムを利用する場合には、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びN
BLAST)のデフォルトパラメーターを利用することができる。http://www.nc
bi.nlm.nih.gov.を参照されたい。配列の比較に利用される数学的アルゴリズム
の他の好適な非制限的な例は、Myers及びMiller, CABIOS(1989)のアルゴリズム
である。かかるアルゴリズムは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組
み込まれており、これは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの
部分である。ALIGNプログラムをアミノ酸配列の比較に利用する場合には、
PAM120ウェイトレジデューテーブル、ギャップ長ペナルティ12及びギャ
ップペナルティ4を用いることができる。
中に導入された核酸配列(少なくとも1つのEPOa−hSA融合蛋白質ポリペ
プチドをコードするもの)を意味する。トランスジーンは、この融合蛋白質をコ
ードする核酸の最適の発現及び分泌に必要であり得る少なくとも1つの転写調節
配列及び他の核酸例えばイントロンを含んでよい。トランスジーンは、エンハン
サー配列を含むことができる。EPOa−hSA融合蛋白質配列は、組織特異的
プロモーター例えば乳腺特異的プロモーター配列(この蛋白質のトランスジェニ
ック哺乳動物の乳汁中への分泌を生じる)、尿特異的プロモーター、又は卵特異
的プロモーターに機能的に結合することができる。
む細胞をいう。
植物をいう。
の動物の細胞の少なくとも1つ好ましくは本質的にすべてが人間の介入により例
えば当業者に公知のトランスジェニック技術によって導入されたトランスジーン
を含んでいる当該非ヒト動物である。このトランスジーンは、細胞の前駆細胞に
意図的遺伝子操作例えばマイクロインジェクション又は組換えウイルス感染によ
り導入することによって直接又は間接に細胞に導入することができる。
とも1つ好ましくはすべてが 植物好ましくは多細胞の又は高等植物である。
となろう。
。それは、循環における赤血球細胞のレベルの調節において重要な役割を演じて
いる。天然のEPOは、胎児期の肝臓及び成体の腎臓で産生され、血中を循環し
て骨髄における赤血球細胞の産生を刺激する。
のオリゴ糖基の付着により修飾される。この修飾は、グリコシル化と呼ばれ、蛋
白質の物理的特性に劇的に影響し得て、蛋白質の安定性、分泌及び局在性におい
て重要であり得る。グリコシル化は、ポリペプチド主鎖の特定の位置に起きる。
通常次の2つの主要なタイプのグリコシル化がある:セリン又はスレオニン残基
に結合するO結合されるオリゴ糖により特徴付けられるグリコシル化;及びAs
n−X−Ser/Thr配列中のアスパラギン残基に結合するN結合されるオリ
ゴ糖により特徴付けられるグリコシル化(ここに、Xは、プロリン以外の何れの
アミノ酸であってもよい)。N−アセチルノイラミン酸(以後、シアル酸と呼ぶ)
が、通常、N結合したオリゴ糖及びO結合したオリゴ糖の両者の末端残基である
。
ゴ糖鎖を含んでいる。N結合するグリコシル化は、24、38及び83位に局在
するアスパラギン残基で起きるが、他方、O結合するグリコシル化は、126位
に局在するセリン残基に起きる(Lai等、J.Biol.Chem.261,3116(1986);Broudy等
、Arch.Biochem.Biophys.265,329(1988))。
、3つ又はすべてにおけるグリコシル化が完全に破壊されるように例えばアミノ
酸残基の置換又は欠失により修飾されている。
38、Asn83又はSer126の少なくとも1つにおいて異なってよい。E
POaにおいては、その一次配列は、これらの残基の少なくとも1つがグリコシ
ル化を支持できないように変化させることができる。
ないアミノ酸例えばGln又はAlaである
てのみEPOと異なっており、以下で検討するように更なるアミノ酸置換及び/
又は欠失を有することができる。
aを有するが、他の構成もこの発明の範囲内にある。例えば、EPOa−hSA
融合蛋白質は、次の式の何れでも有することができる:R1−L−R2;R2−L
−R1;R1−L−R2−L−R1;又はR2−L−R1−L−R2;R1−R2;R2−
R1;R1−R2−R1;又はR2−R1−R2(式中、R1は、EPO類似体であり、
R2は、hSAであり、Lは、ペプチドリンカー配列である)。
列により結合されている。このリンカー配列は、EPOaドメインとhSAドメ
インを、各ドメインが適当にその二次及び三次構造へと折り畳まることを確実に
するのに十分な距離で離すべきである。好適なリンカー配列は、(1)フレキシブ
ルな伸長した構成を採るべきであり、(2)機能的EPOa及びhSAドメインと
相互作用することのできる規則正しい二次構造を発達させる傾向を示すべきであ
り、そして(3)これらの機能的な蛋白質ドメインとの相互作用を促進することの
できるであろう最少の疎水性又は帯電した特性を有するべきである。フレキシブ
ル蛋白質領域内の典型的な表面アミノ酸には、Gly、Asn及びSerが含ま
れる。Gly、Asn及びSerを含むアミノ酸配列の順列は、リンカー配列に
ついての上記の基準を満たすことが期待されよう。他のほぼ中性のアミノ酸例え
ばThr及びAlaも又、このリンカー配列において用いることができる。
を与えることができる(もっとも、一層長いか又は一層短いリンカー配列も又、
用いることはできる)。このEPOa及びhSAを分離するリンカー配列の長さ
は、5〜500アミノ酸長であってよく、一層好ましくは5〜100アミノ酸長
であってよい。好ましくは、このリンカー配列は、約5〜30アミノ酸長である
。好適具体例において、このリンカー配列は、約5〜20アミノ酸であり、有利
には、約10〜20アミノ酸である。EPOaとhSAのリンカーとして有用な
アミノ酸配列には、(SerGly4)y(式中、yは8以上である)又はGly4S
erGly5が含まれる(但し、これらに限定はしない)。好適なリンカー配列は
、式(SerGly4)4を有する。他の好適なリンカーは、式((Ser−Ser−
Ser−Ser−Gly)3−Ser−Pro)配列を有する。
ことができる。リンカー配列は、これらの融合される蛋白質が、それらの機能的
ドメインを分離して立体障害を防止するのに利用することのできる必須でないN
又はC末端アミノ酸領域を有する場合には不必要である。好適具体例において、
EPOaのC末端は、hSAのN末端に直接融合させることができ、又はhSA
のC末端は、EPOaのN末端に直接融合させることができる。
蛋白質をコードする核酸分子を用いて調製することができる。融合蛋白質をコー
ドするヌクレオチド配列は、標準的DNA合成法により合成することができる。
の細胞に導入することができる。それらの組換え細胞を用いて、この融合蛋白質
を生成することができる。融合蛋白質をコードする核酸は、例えば相同組換えに
よって宿主細胞に導入することができる。殆どの場合において、このEPOa−
hSA融合蛋白質をコードする核酸を組換え発現ベクターに組み込む。
づいて選択される少なくとも1つの調節配列に機能的に結合することができる。
用語「操作可能に結合する」は、この融合蛋白質化合物をコードする配列を、こ
の融合蛋白質の発現を可能にする仕方で調節配列に結合することを意味する。用
語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント(
例えば、ポリアデニル化シグナル)をいう。かかる調節配列は、例えば、Goeddel
; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press,
San Diego,カリフォルニア(1990)に記載されている(その内容を本明細書中に参
考として援用する)。調節配列には、ヌクレオチド配列の構成的発現を多くの型
の宿主細胞において指示するもの、ある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチ
ド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)及び調節可能な仕方
で(例えば、誘導因子の存在下でのみ)発現を指示するものが含まれる。発現ベク
ターのデザインは、トランスフォームすべき宿主細胞の選択、所望の融合蛋白質
の発現レベル等の要因に依存するということは、当業者に認められよう。これら
の融合蛋白質発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより、核酸にコードさ
れる融合蛋白質を生成することができる。
デザインすることができる。例えば、融合蛋白質を細菌細胞例えば大腸菌、昆虫
細胞(例えば、バキュロウイルス発現系)、酵母細胞又は哺乳動物細胞において発
現させることができる。幾つかの適当な宿主細胞は、Goeddel; Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego,カリフ
ォルニア(1990)において更に検討されている。酵母S.セレビシエにおける発現
のためのベクターの例には、pYepSec1(Baldari等(1987)EMBO J.6:229-2
34)、pMFa(Kurjan及びHerskowitz(1982)Cell 30:933-943)、pJRY88(S
chultz等(1987)Gene 54:113-123)及びpYES2(Invitrogen Corporation, San
Diego,カリフォルニア)が含まれる。培養昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)におけ
る融合蛋白質の発現に利用することのできるバキュロウイルスベクターには、p
Acシリーズ(Smith等(1983)Mol.Cell.Biol.3:2156-2165)及びpVLシリーズ(L
ucklow,V.A.及びSummers,M.D.(1989)Virology 170:31-39)が含まれる。
)及びpMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J.6:187-195)が含まれる。哺乳動物細
胞中で用いる場合には、これらの発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイル
スの調節エレメントにより与えられる。例えば、一般に用いられているプロモー
ターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス及びサルウイル
ス40に由来するものである。
ド配列を含むことができる。例えば、この組換え発現ベクターは、このベクター
を取り込んだ宿主細胞を同定するための選択マーカー遺伝子をコードすることが
できる。その上、この融合蛋白質の宿主細胞(特に、哺乳動物宿主細胞)からの分
泌を容易にするために、この組換え発現ベクターは、発現に際してこの融合蛋白
質がそのアミノ末端に融合されたシグナル配列を伴って合成されるように、この
融合蛋白質のアミノ末端をコードする配列に機能的に結合されたシグナル配列を
コードすることができる。このシグナル配列は、この融合蛋白質がこの細胞の分
泌経路に入ることを指示してから開裂され、成熟融合蛋白質(即ち、シグナル配
列を伴わない融合蛋白質)を宿主細胞から放出させる。蛋白質又はペプチドの哺
乳動物宿主細胞からの分泌を容易にするためのシグナル配列の利用は、当分野で
公知である。
ン技術によって原核又は真核細胞に導入することができる。ここで用いる場合、
用語「トランスフォーメーション」及び「トランスフェクション」は、外来核酸
(例えば、DNA)を宿主細胞に導入するための分野で認められた様々な技術をい
い、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈法、DEAE−デキストラン媒介
のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイク
ロインジェクション及びウイルス媒介のトランスフェクションを包含する。宿主
細胞をトランスフォームし又はトランスフェクトするための適当な方法は、Samb
rook等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版、Cold Spring Harbor
Laboratory press(1989))及び他のラボラトリーマニュアル中に見出すことがで
きる。
み込まない。これらのインテグラントを同定して選択するために、選択マーカー
(例えば、抗生物質耐性)をコードする遺伝子を、融合蛋白質をコードする遺伝子
と共にこれらの宿主細胞に導入することができる。好適な選択マーカーには、薬
物例えばG418、ヒグロマイシン及びメトトレキセートに対する耐性を与える
ものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、融合蛋白質をコードするベ
クターと同じベクターで宿主細胞に導入することができ、又は別々のベクターで
導入することもできる。導入された核酸により安定にトランスフェクトされた細
胞は、薬物選択により同定することができる(例えば、選択マーカー遺伝子を取
り込んだ細胞は生き残るが、その他の細胞は死滅する)。
ーゼを用いて、イン・ビトロで転写されて翻訳され得る。
築物を哺乳動物の生殖細胞系統に導入して、トランスジェニック哺乳動物を作製
することができる。例えば、この構築物の少なくとも1コピーを、標準的トラン
スジェニック技術により、哺乳動物胚のゲノム中に組み込むことができる。
ることは、しばしば、望ましい。多量の乳汁を生成する及び長い泌乳期間を有す
る哺乳動物は、好適である。好適な哺乳動物は、反芻動物例えばウシ、ヒツジ、
ラクダ又はヤギ(例えば、スイス起源のヤギ、例えばAlpine、Saanen及びToggenb
urg産のヤギ)である。他の好適な動物には、雄ウシ、ウサギ及びブタが含まれる
。
、非ヒト動物の生殖細胞系統へ導入することにより生成される。トランスジーン
は、胚性標的細胞に様々な発生ステージにおいて導入することができる。胚性標
的細胞の発生のステージに依って異なる方法が用いられる。用いる任意の動物の
特定の系統は、可能であれば、一般的に良好な健康、良好な胚の収率、胚の前核
がよく見えること、及び良好な再現性により選択されるべきである。
で公知の様々な手段の何れか例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレ
ーション又はリポフェクションにより達成することができる。例えば、EPOa
−hSA融合蛋白質のトランスジーンは、その構築物を受精した哺乳動物卵の前
核にマイクロインジェクションすることにより哺乳動物に導入することができ、
この構築物の少なくとも1コピーを発生中の哺乳動物の細胞中に維持させること
ができる。このトランスジーン構築物の受精卵への導入後に、その卵をイン・ビ
トロで様々な時間にわたってインキュベートすることができ、又は代用宿主中に
再移植することができ、又はこれらの両方が可能である。1つの一般的方法は、
これらの胚をイン・ビトロで種に応じて約1〜7日間インキュベートしてから、
代用宿主に再移植することである。
在について、組織切片のサザーンブロット分析により試験することができる。こ
のゲノム中に安定に組み込まれた外因性のクローン化構築物の少なくとも1コピ
ーを有する胚を用いて、トランスジェニック技術により加えられた構築物を有す
る永久的トランスジェニック哺乳動物系統を樹立することができる。
の構築物の子孫のゲノムへの組込みについてアッセイすることができる。これは
、この融合蛋白質又はその断片をコードするDNA配列に対応するプローブをこ
の子孫に由来する染色体物質にハイブリダイズさせることにより行うことができ
る。この構築物の少なくとも1コピーをゲノム中に含むことが見出された哺乳動
物の子孫を成熟するまで育てる。これらの子孫の雌は、所望の蛋白質をそれらの
乳汁中に又は乳汁と共に生成するであろう。これらのトランスジェニック哺乳動
物を交配させて、所望の蛋白質の乳汁中への生産に有用な他のトランスジェニッ
ク子孫を生成することができる。
ッセイ技術例えばウエスタンブロット又は酵素的アッセイを用いて試験すること
ができる。
ーであり、乳汁蛋白質例えばカゼイン、ベータラクトグロブリン(Clark等(1989)
Bio/Technology 7:487-492)、乳漿酸蛋白質(Gorton等(1987)Bio/Technology 5:1
183-1187)、及びラクトアルブミン(Soulier等(1992)FEBS Letts.297:13)をコー
ドする遺伝子を制御するプロモーターを含む。任意の哺乳動物種のアルファ、ベ
ータ、ガンマ又はカッパカゼイン遺伝子プロモーターを用いて、***での発現を
与えることができ;好適プロモーターは、ヤギのベータカゼイン遺伝子プロモー
ターである(DiTullio(1992)Bio/Technology 10:74-77)。乳汁特異的蛋白質プロ
モーター又は***組織で特異的に活性化されるプロモーターを、cDNA又はゲ
ノム配列から単離することができる。好ましくは、それらは、ゲノム起源のもの
である。
いて)、上記の乳腺特異的遺伝子が利用することができる。例えば、Richards等
J.Biol.Chem.256,526-532(1981)(α−ラクトアルブミン);Campbell等Nucleic A
cids Res.12,8685-8697(1984)(ラットWAP);Jones等 J.Biol.Chem.260,7042-
7050(1985)(ラットβ−カゼイン);Yu-Lee及びRosen,J.Biol.Chem.258,10794-10
804(1983)(ラットγ−カゼイン);Hall,Biochem.J.242,735-742(1987)(ヒトα−
ラクトアルブミン);Stewart,Nucleic Acids Res.12,389(1984)(ウシαs1及び
κカゼインcDNA);Gorodetsky等Gene 66,87-96(1988)(ウシβカゼイン);Al
exander等 Eur.J.Biochem.178,395-401(1988)(ウシκカゼイン);Brignon等 FEB
S Lett.188,48-55(1977)(ウシαS2カゼイン);Jamieson等Gene 61,85-90(1987
),Ivanov等 Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369,425-429(1988) Alexander等 Nucleic
Acids Res.17,6739(1989)(ウシβラクトグロブリン);Vilotte等 Biochimie 69,
609-620(1987)(ウシα−ラクトアルブミン)。様々な乳汁蛋白質遺伝子の構造と
機能が、Mercier及びVilotte,J.Dairy Sci.76,3079-3098(1993)(そのまますべて
の目的のために参考として援用する)により総説されている。更なる隣接配列が
発現の最適化に有用であるならば、存在する配列をプローブとして用いて、かか
る配列をクローン化することができる。種々の生物に由来する乳腺特異的な調節
配列を、かかる生物に由来するライブラリーを、公知の同起源のヌクレオチド配
列又は同起源の蛋白質に対する抗体をプローブとして用いてスクリーニングする
ことにより得ることができる。
質の分泌を生じる他のシグナル配列である。好ましくは、このシグナル配列は、
乳汁特異的シグナル配列から選択する(即ち、それは、乳汁中に分泌される生成
物をコードする遺伝子に由来する)。最も好ましくは、この乳汁特異的シグナル
配列は、この発明の発現系で用いられる乳汁特異的プロモーターに関連する。こ
のシグナル配列の大きさは、この発明にとって重要ではない。必要とされるすべ
てのことは、この配列が、例えば***組織において、所望の組換え蛋白質の分泌
をもたらすのに十分な大きさのものであるということである。例えば、カゼイン
(例えば、アルファ、べータ、ガンマ又はカッパカゼイン)、べータラクトグロブ
リン、乳漿酸蛋白質及びラクトアルブミンをコードする遺伝子に由来するシグナ
ル配列は、本発明において有用である。好適なシグナル配列は、ヤギのβ−カゼ
インシグナル配列である。
れる蛋白質)に由来するシグナル配列も又、用いることができる。
カゼインプロモーター例えばヤギのべータカゼインプロモーター、乳汁特異的シ
グナル配列例えばカゼインシグナル配列例えばβ−カゼインシグナル配列、及び
EPOa−hSA融合蛋白質をコードするDNAを含む構築物から発現させるこ
とができる。
も含んでよい。かかる領域は、この発現系のRNA転写物を安定化させることが
でき、それ故、この発現系からの所望の蛋白質の収率を増大させる。この発明の
構築物において有用な3’非翻訳領域の内には、ポリAシグナルを与える配列が
ある。かかる配列は、例えば当分野で周知のSV40小型t抗原、カゼイン3’
非翻訳領域又は他の3’非翻訳配列から導くことができる。好ましくは、3’非
翻訳領域は、乳汁特異的蛋白質に由来する。この3’非翻訳領域の長さは重要で
ないが、そのポリA転写物の安定化効果は、この発現配列のRNAの安定化にお
いて重要であるようである。
非翻訳領域を含むことができる。かかる非翻訳領域は、プロモーターが得られた
のと同じ制御領域に由来してよいし、又は異なる遺伝子に由来してもよい(例え
ば、それらは、他の合成の、半合成の又は天然の起源に由来するものであってよ
い)。
領域の約10%、20%、30%以上を含んでもよい。例えば、このN末端コー
ド領域は、用いられるプロモーターに対応することができる(例えば、ヤギのβ
−カゼインのN末端コード領域)。
する能力について試験してから、その構築物をトランスジェニック動物中に配置
することを含むことができる。驚くべきことに、本願発明者は、かかるプロトコ
ールが、例えばトランスジェニック動物の乳汁中に通常分泌されない蛋白質が分
泌されるかどうかの測定における予測値ではあり得ないということを見出した。
それ故、構築物を直接トランスジェニック動物例えばトランスジェニックマウス
において試験することは望ましいことであろう(CHO細胞において分泌され得
ない幾つかの構築物がトランスジェニック動物の乳汁中に分泌されるので)。
れ得て、再生可能な起源から容易に収穫することのできる正常に処理を受けたペ
プチドの連続的な高レベルのアウトプットを与える。乳汁からの蛋白質の単離の
ための当分野で公知の幾つかの異なる方法がある。
スキミング、遠心分離、沈降(H.E. Swaisgood, Developments in Dairy Chemist
ry, I: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY,1982)、
酸沈殿(米国特許第4,644,056号)又はレンニン若しくはキモトリプシン
による酵素的凝固(Swaisgood,同書)により分画されて脂肪を除去される。次に、
主要な乳汁蛋白質を、透明な溶液と沈殿の塊とに分画することができ、後者から
関心ある特定の蛋白質を容易に精製することができる。
を、その生物学的に活性な形態で、全乳汁又は乳汁画分から、接線流濾過により
単離する方法を開示している。以前の単離方法と異なり、これは、脂肪及びカゼ
インミセルを除去するための全乳汁の最初の分画の必要性を排除し、それにより
この工程を単純化して回収率と生物活性の損失を回避する。この方法を更なる精
製ステップと組み合わせて用いて、更に夾雑物を除去して関心ある成分を精製す
ることができる。
他の生成物例えば卵において生成され得る。EPOa−hSAは、トランスジェ
ニック動物好ましくは七面鳥、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、ホロホロチョウ、
クジャク、コリンウズラ、キジ、ハトの卵、一層好ましくはトランスジェニック
ニワトリの卵において、当分野で公知の方法を用いて生成され得る(Sang等、Tre
nds Biotechnology,12:415-20,1994)。この卵中で特異的に発現される蛋白質を
コードする遺伝子例えば卵黄蛋白質遺伝子及びアルブミン蛋白質遺伝子は、EP
Oa−hSAの発現を指示するように改変することができる。
あり、卵蛋白質例えばオバルブミン、リゾチーム及びアビジンをコードする遺伝
子を制御するプロモーターを含む。ニワトリのオバルブミン、リゾチーム又はア
ビジン遺伝子由来のプロモーターは、好適である。卵特異的蛋白質のプロモータ
ー又は卵組織で特異的に活性化されるプロモーターは、cDNA又はゲノム配列
に由来し得る。好ましくは、これらの卵特異的プロモーターは、ゲノム起源のも
のである。
、「The Avian Egg」、John Wiley and Sons, p.472,1989(この内容を参考とし
て本明細書中に援用する)を参照されたい)。もし更なる隣接配列が発現の最適化
に有用であるならば、かかる配列を、存在する配列をプローブとして用いてクロ
ーン化することができる。種々の生物に由来する卵特異的な調節配列を、かかる
生物に由来するライブラリーを公知の同起源のヌクレオチド配列又は同起源の蛋
白質に対する抗体をプローブとして用いてスクリーニングすることにより得るこ
とができる。
ニック植物例えばDNAトランスジーンが核又は色素体ゲノム中に挿入されたト
ランスジェニック植物において発現させることができる。植物のトランスフォー
メーションは、当分野で公知である。一般的には、Methods in Enzymology Vol.
153(「Recombinant DNA Part D」)及び編、及び欧州特許出願EP693554
号を参照されたい。
ができる。例えば、核酸は、マイクロピペッターの使用により、植物細胞に直接
マイクロインジェクションすることにより、機械的にトランスファーすることが
できる。外来核酸は、遺伝物質と沈殿複合体(これは、細胞により取り込まれる)
を形成するポリエチレングリコールを用いて植物細胞にトランスファーすること
もできる(Paszkowski等(1984)EMBO J.3:2712-22)。外来核酸は、植物細胞に、エ
レクトロポレーションにより導入することができる(Fromm等(1985)Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 82:5824)。この技術において、植物プロトプラストは、適当な遺伝
子構築物を含むプラスミド又は核酸の存在下で電気穿孔される。高電界強度の電
気的インパルスは、可逆的に生体膜を透過性にしてこれらのプラスミドの導入を
可能にする。電気穿孔された植物プロトプラストは、細胞壁を再建し、***して
植物カルスを形成する。これらのトランスフォームされた遺伝子有するトランス
フォームされた植物細胞の分泌を、表現型マーカーを用いて達成することができ
る。
ためのベクターとして利用することができる(Hohn等(1982)「Molecular Biology
of Plant Tumors」Academic Press, New York, p.549-560;Howell,米国特許第
4,407,956号)。CaMVのウイルスDNAゲノムは、親細菌プラスミ
ドに挿入されて組み換えDNA分子を造り、これは、細菌中で増殖することがで
きる。この組換えプラスミドを更に所望のDNA配列の導入により改変すること
ができる。この組換えプラスミドの改変されたウイルス部分を、次いで、親細菌
プラスミドから切り出して植物細胞又は植物への接種に用いる。
とができる。核酸は、小さいビーズ若しくは粒子のマトリクス内で又はその表面
で処理される(Klein等(1987)Nature 327:70-73)。典型的には新しい核酸セグメ
ントの単一の導入しか必要とされなくても、この方法は、多数の導入をも与える
。
でトランスフォームされたアグロバクテリウム・ツメファシエンスの感染により
導入することができる。適当な条件下で、これらのトランスフォームされた植物
細胞を生育させて、苗条、根を形成し、更には、植物へ発生させる。これらの核
酸は、植物細胞へ、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのTiプラ
スミドによって導入することができる。Tiプラスミドは、アグロバクテリウム
・ツメファシエンスの感染の際に植物細胞に伝えられて、その植物ゲノム中に安
定に組み込まれる(Horsch等(1984)「Inheritance of Functional Foreign Genes
in Plants」Science 233:496-498;Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80
:4803)。
きる植物は、トランスファーされた外来遺伝子を含む全植物体が回復されるよう
にトランスフォームすることができる。幾つかの適当な植物には、Fragaria、Lo
tus、Medicago、Onobrychis、Trifolium、Trigonella、Vigna、Citrus、Linum、
Geranium、Manihot、Daucus、Arabidopsis、Brassica、Raphanus、Sinapis、Atr
opa、Capsicum、Hyoscyamus、Lycopersicon、Nicotiana、Solanum、Petunia、Di
gitalis、Majorana、Ciohorium、Helianthus、Lactuca、Bromus、Asparagus、An
tirrhinum、Hererocallis、Nemesia、Pelargonium、Panicum、Pennisetum、Ranu
nculus、Senecio、Salpiglossis、Cucumis、Browaalia、Glycine、Lolium、Zea
、Triticum、Sorghum及びDatura属の種が含まれる。
nd Culture」Handbook of Plant Cell Cultures 1:124-176(MacMillan Publishi
ng Co.New York 1983);M.R.Davey「Recent Development in the Culture and R
egeneration of Plant Protoplast」Protoplasts(1983)-Lecture Proceedings,
p.12-29(Birkhauser, Basal 1983);P.J.Dale「Protoplast Culture and Plant
Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops」Protoplasts(1983)-
Lecture Proceedings, p.31-41(Birkhauser, Basel 1983);及びH.Binding「Reg
eneration of Plants」Plant Protoplasts, p.21-73(CRC Press, Boca Raton 19
85)に記載されている。
外因性配列のコピーを含むトランスフォームされたプロトプラストの懸濁液を生
成する。ある種においては、胚芽形成を、次いで、プロトプラスト懸濁液から成
熟及び発芽のステージ(天然の胚芽としての)まで誘導することができる。培養培
地は、様々なアミノ酸及びホルモン例えばオーキシン及びサイトカイニンを含む
ことができる。グルタミン酸及びプロリンを培地に加えることも又、特にコーン
及びアルファルファ等の種には有利であり得る。苗条と根は、通常、同時に発育
する。効率的な再生は、培地、遺伝子型及び培養履歴に依るであろう。これらの
3つの変数を制御することができるならば、再生は、十分に、再現可能であり且
つ反復可能である。
より又は組織培養技術により繁殖させて多数の同じ植物を試験例えば生産特性の
試験のために生成することができる。望ましいトランスジェニック植物の選択を
行って、それにより新しい品種を得、商業的販売のために栄養的に繁殖させる。
種子で繁殖する作物においては、成熟トランスジェニック植物を、自家受粉させ
てホモ接合の同系交配植物を生成する。この同系交配植物は、新たに導入された
外来遺伝子活性レベルについての遺伝子を含む種子を生成する。これらの種子は
、生長して、選択された表現型を有する植物を生成することができる。この発明
による同系交配植物を用いて、新たな雑種を開発することができる。この方法に
おいては、選択した同系交配系統を他の同系交配系統と交配させて雑種を生成す
る。
、この発明によりカバーされる(但し、これらの部分は、上記のようにトランス
フォームされた細胞を含む)。再生された植物の子孫及び変種並びに変異体も又
、この発明の範囲内に含まれる(但し、それらの部分は、導入されたDNA配列
を含む)。再生された植物の子孫及び変種並びに変異体も又、この発明の範囲内
に含まれる。
化の観察(例えば、白い花、変化しやすい色素の生成及び花における均一な色彩
パターン又は不規則なパターン)に基づくものであってよいが、酵素活性又は生
成定量の生化学的アッセイをも包含することができる。トランスジェニック植物
又は植物細胞は、関心ある植物部分を有する植物へと生長し、遺伝子活性は、視
覚的外観(フラボノイド遺伝子)により又は生化学的アッセイ(ノーザンブロット)
;ウエスタンブロット;酵素アッセイ及びフラボノイド化合物アッセイ(分光学
をふくむ。Harborne等(編)(1975)The Flavonoids,第1及び2巻[Acad.Press]参照)
等によってモニターされる。適当な植物を選択して、更に評価する。遺伝子工学
処理した植物の生成方法は、更に、米国特許第5,283,184号、米国特許
第5,482,852号及び欧州特許出願EP693,554号(すべてを参考
として本明細書に援用する)に記載されている。
Asn38、Asn83又はSer126に有する。EPO類似体は又、下記の
ような更なるアミノ酸変化をも有する。
5又は10残基天然のEPO蛋白質の配列と異なっている。これらの変化は、A
sn24、Asn38、Asn83又はSer126の変化に追加されるもので
あってよい。他の好適具体例において、このEPOaは、アミノ酸配列が、最大
でこれらの残基の1、2、3、5又は10%天然のEPO蛋白質の配列と異なっ
ている。これらの変化は、Asn24、Asn38、Asn83又はSer12
6の変化に追加されるものであってよい。好適具体例において、これらの変化は
、エリスロポエチン類似体がhSAに融合されたときにエリスロポエチン生物学
的活性を示すようなものである。好適具体例において、これらの差異の少なくと
も1つ又はすべては、保存的アミノ酸変化である。他の好適具体例において、こ
れらの変化の少なくとも1つ又はすべては、保存的アミノ酸変化以外である。
中間配列が削除された配列の末端断片である。
150アミノ酸長であり;この断片は、天然のエリスロポエチンの生物学的活性
を有し;この断片は、天然のエリスロポエチンの生物学的活性のアゴニスト又は
アンタゴニストであり;この断片は、エリスロポエチンのレセプターへの結合を
競争的に又は非競争的に阻害することができる。
酸配列との少なくとも60%の、一層好ましくは少なくとも70、80、90、
95、99又は100%の配列同一性を有する。
ばヒトのエリスロポエチンの断片である。
は10残基天然のエリスロポエチンの対応する残基と異なっている。これらの変
化は、Asn24、Asn38、Asn83及びSer126の変化に追加され
るものであってよい。他の好適具体例において、この断片は、アミノ酸配列が、
最大で1、2、3、5又は10%天然のエリスロポエチンの対応する残基と異な
っている。これらの変化は、Asn24、Asn38、Asn83及びSer1
26の変化に追加されるものであってよい。好適具体例において、これらの差異
は、この断片がhSAと融合されたときにエリスロポエチンの生物学的活性を示
すようなものである。好適具体例において、これらの差異の少なくとも1つ又は
すべては、保存的アミノ酸変化である。他の好適具体例において、これらの差異
の少なくとも1つ又はすべては、保存的アミノ酸変化以外である。
るものを包含する。
活性は、EPOaへの追加の変化(グリコシル化を改変する変化に追加される変
化)の導入のための手引きとして役立つ。活性を減じるか又はグリコシル化部位
を造る変化は、回避すべきである。
きる。このましくは、グリコシル化を支持しないポリペプチドがある。句「グリ
コシル化を支持しない」は、ここで用いる場合、天然においてグリコシル化を支
持しないポリペプチド及びグリコシル化を支持しないように改変されたポリペプ
チドをいう。例えば、この融合パートナーは、Igの可溶性断片好ましくはグリ
コシル化を支持しないように改変されたIgの可溶性断片であってよい。
しくはEPO又はEPOaの循環半減期を改善することのできる蛋白質例えば血
漿蛋白質又はその断片で置き換えることができる。例えば、この融合蛋白質は、
EPOa配列が免疫グロブリンスーパーファミリーに由来する配列に融合された
EPOa−免疫グロブリン(Ig)融合蛋白質であってよい。細胞表面糖蛋白質の
細胞外ドメインが免疫グロブリンの定常F(c)領域と融合している幾つかの可溶
性融合蛋白質構築物が開示されている。例えば、Capon等(1989)Nature 337(9):5
25-531は、CD4を免疫グロブリン(IgG1)に融合させることにより一層長く
続くCD4類似体を生成することについての手引きを提供している。Capon等の
米国特許第5,116,964号及び5,428,130号(CD4−IgG融
合構築物);Linsley等米国特許第5,434,131号(CTLA4−IgG1
及びB7−IgG1融合構築物);Linsley等(1991)J.Exp.Med.174:561-569(CT
LA4−IgG1融合構築物);及びLinsley等(1991)J.Exp.Med.173:721-730(C
D28−IgG1及びB7−IgG1融合構築物)も参照されたい。かかる融合
蛋白質は、レセプター−リガンド相互作用を調節するのに及びイン・ビボで炎症
を低減させるのに有用であることが判明している。例えば、細胞表面腫瘍壊死因
子レセプター(TNFR)蛋白質の細胞外ドメインが免疫グロブリン定常(Fc)領
域に融合した融合蛋白質は、イン・ビボで利用されてきた。例えば、Moreland等
(1997)N.Engl.J.Med.337(3):141-147;及びvan der Poll等(1997)Blood 89(10):
3727-3734を参照されたい。
性を特徴とする病状(EPO活性のレベルが正常である(が、不十分である)症状
及びそれが正常を下回るものを含む)を治療する(例えば、阻止し、減じ、予防し
、又は改善する)のに有用な製薬組成物に組み込むことができる。
くは癌を患っている患者又は手術前の患者に投与する。これらの組成物は、治療
用の又は予防用の量の組換えにより生成したEPOa−hSA融合蛋白質を製薬
上許容し得るキャリアー又はトランスジェニック動物の乳汁中に含む。
のに適した任意の適合性の無毒性の物質であってよい。滅菌した水、アルコール
、脂肪、ワックス及び不活性固形物をキャリアーとして用いることができる。製
薬上許容し得るアジュバント、緩衝剤、分散剤等も、これらの製薬組成物中に取
り込むことができる。このキャリアーは、EPO−hSA融合蛋白質と、注射(
通常、静脈注射又は皮下注射)による又はその他の投与に適した如何なる形態で
結合してもよい。静脈投与のためには、適当なキャリアーには、例えば、生理食
塩水、静菌水、CremophorEL(商標)(BASF,ニュージャージー、Parsip
pany)又はリン酸緩衝塩溶液(PBS)が含まれる。トランスジェニック技術によ
り生成されたペプチド又は他の活性剤の製薬組成物中の濃度は、広範囲で変わり
得る(即ち、約0.1重量%未満から、通常、少なくとも約1重量%であり、最
大で20重量%以上まで)。
ければならず且つ容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは、製
造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、微生物例えば細菌及びカビの汚染作
用から防護されていなければならない。微生物の作用からの防護は、種々の抗菌
剤及び抗カビ剤例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン
酸、チメロサール等により達成することができる。多くの場合に、等張剤例えば
糖類、ポリアルコール例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組
成物中に含有することは、好ましいことであろう。これらの注射用組成物の延長
された吸収を、この組成物に、吸収を遅延させる薬剤例えばモノステアリン酸ア
ルミニウム及びゼラチンを含有させることによってもたらすことができる。
末で、又は液体投薬形態例えばエリキシル、シロップ及び懸濁液で投与すること
ができる。活性成分は、ゼラチンカプセルに不活性成分及び粉末キャリアー例え
ばグルコース、ラクトース、シュークロース、マンニトール、澱粉、セルロース
又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ナトリウム
サッカリン、タルク、炭酸マグネシウム等と共にカプセル封入することができる
。所望の色、味、安定性、緩衝能力、分散又は他の公知の望ましい特徴を与える
ために加えることのできる付加的な不活性成分の例は、赤酸化鉄、シリカゲル、
ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食べられる白色インク等である。類似
の希釈剤を用いて圧縮錠剤を作ることができる。錠剤とカプセルの両方とも、薬
物の数時間にわたる連続的放出を与える持続放出性製品として製造することがで
きる。圧縮錠剤は、糖衣錠にし又はフィルムでコートして不快な味をマスクし、
その錠剤を環境から保護し又は胃腸管における選択的消化のために腸溶性コート
をすることができる。経口投与のための液体投薬形態は、患者の許容度を増すた
めに着色及び香料を含有することができる。
できる。用語「エアゾール」は、細気管支又は鼻気道に吸入することのできる本
発明の化合物の任意の気体担持された相を包含する。特に、エアゾールは、投与
量を計量する吸入器若しくは噴霧器、又はミスト機により調製できる本発明の化
合物の液滴の気体担持懸濁物を包含する。エアゾールは又、例えば吸入器からの
吸入治療により送達することのできる空気その他のキャリアーガスに浮遊してい
る本発明の化合物の乾燥粉末組成物をも包含する。Ganderton及びJones,Drug De
livery to the Respiratory Tract, Ellis Horwood(1987);Gonda(1990)Critica
l Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313;及びRaeburn等(1
992)J.Pharmacol.Toxical.Methods 27:143-159を参照されたい。
異的イン・ビボ活性、投与経路、医学的条件、患者の年齢、体重又は性別、患者
のEPO−hSA融合蛋白質又はビヒクル成分に対する感受性、主治医が容易に
考慮することのできる他の要因に応じて、個体間で幾分か変わり得る。
、代用血液若しくは他の患者に送達すべき成分を有する無菌の容器例えばバッグ
で供給することができる。
ができる。好ましくは、それは、融合蛋白質を発現するトランスジェニック哺乳
動物から得られる乳汁又は乳製品を含む。それは、この融合蛋白質を発現するト
ランスジェニック植物から得られる植物又は植物産物を含むことができる。この
融合蛋白質は、粉末又は錠剤形態で、他の公知の添加剤、キャリアー、充填剤及
び希釈剤を伴って又は伴わないで供給することができる。栄養療法剤は、Scott
Hegenhart, Food Product Design(1993年、12月)に記載されている。この栄養療
法剤は、乳幼児用調合乳であってよい。それは、EPOa−hSA融合蛋白質を
生成するトランスジェニック植物の成分を含有することができる。
送達する遺伝子治療プロトコールの一部分として利用することができる。
合蛋白質をコードする核酸を含むウイルスベクターの利用によるものである。細
胞へのウイルスベクターの感染は、標的細胞の大きな集団がその核酸を受けるこ
とができるという利点を有している。更には、ウイルスベクター内に例えばその
ウイルスベクターに含まれるcDNAによってコードされる分子は、ウイルスベ
クター核酸を取り込んだ細胞において効率的に発現される。
融合蛋白質をコードする外因性核酸分子のトランスファーのための組換え遺伝子
送達システムとしてイン・ビボで用いることができる。これらのベクターは、核
酸の細胞への効率的な送達を与え、トランスファーされた核酸は、宿主の染色体
DNA中に安定に組み込まれる。複製欠損レトロウイルスだけを生成する特殊化
された細胞株(「パッケージング細胞」と呼ばれる)の開発は、遺伝子治療のため
のレトロウイルスの有用性を増したが、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的
のための遺伝子トランスファーにおける利用について特性表示される(総説とし
ては、Miller,A.D.(1990)Blood 76:271を参照されたい)。複製欠損レトロウイル
スは、標的細胞への感染に用いることのできるビリオン中に、ヘルパーウイルス
の利用により、標準的技術によってパッケージされ得る。組換えレトロウイルス
を生成するプロトコール及びイン・ビトロ又はイン・ビボで細胞にかかるウイル
スを感染させるプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Au
subel,F.M.等(編)Greene Publishing Associates,(1989),9.10-9.14節及び他の
標準的実験室マニュアル中に見出すことができる。
ベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、それが関心ある遺伝子産物を
コードして発現するが、正常の溶菌性ウイルス生活環で複製する能力に関して不
活性化されるように操作することができる。例えば、Berkner等(1988)BioTechni
ques 6:616;Rosenfeld等(1991)Science 252:431-434;及びRosenfeld等(1992)C
ell 68:143-155を参照されたい。アデノウイルス株Ad5d1324型又は他の
アデノウイルス株(例えば、Ad2、Ad3、Ad7等)に由来する適当なアデノ
ウイルスベクターが、当業者には公知である。組換えアデノウイルスは、それら
が非***細胞に感染できず、上皮細胞を含む多種類の細胞型に対する感染に利用
することのできるある種の状況において有利であり得る(Rosenfeld等(1992)、前
出)。その上、このウイルス粒子は、上記のように、比較的安定であり且つ精製
及び濃縮しやすく、感染スペクトルに影響するように改変することができる。更
に、導入されたアデノウイルスDNA(及びそれに含まれる外来DNA)は、宿主
細胞のゲノム中に組み込まれずにエピソームのままであり、それにより、導入さ
れたDNAが宿主ゲノムに組み込まれる状況(例えば、レトロウイルスDNA)で
の挿入による突然変異誘発の結果として生じ得る潜在的問題が回避される。その
上、アデノウイルスゲノムの外来DNAの運搬能力は、他の遺伝子送達ベクター
と比べて大きい(最大8キロベース)(Berkner等、前出;Haj-Ahmand及びGraham(1
986)J.Virol.57:267)。
な他のウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス(AAV)である。アデ
ノ随伴ウイルスは、効率的な複製及び生産的生活環に他のウイルス(例えば、ア
デノウイルス又はヘルペスウイルス)をヘルパーウイルスとして必要とする天然
の欠損ウイルスである。(総説としては、Muzyczka等 Curr.Topics in Micro. an
d Immunol.(1992)158:97-129を参照されたい)。それは、そのDNAを非***細
胞に組み込むことのできる少数のウイルスの1つでもあり、高頻度の安定な組込
みを示す(例えば、Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356;Samu
lski等(1989)J.Virol.63:3822-3828;及びMcLaughlin等(1989)J.Virol.62:1963-
1973を参照されたい)。300塩基対程の少数を含むAAVのベクターは、パッ
ケージされて組み込まれることができる。外因性DNAのためのスペースは、約
4.5kbに限られる。Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.5:3251-3260に記載さ
れたようなAAVベクターを用いて、DNAを細胞に導入することができる。様
々な核酸が、種々の細胞型に、AAVベクターを用いて導入されてきた(例えば
、Hermonat等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470;Tratschin等(1985)
Mol.Cell.Biol.4:2072-2081;Wondisford等(1988)Mol.Endocrinol.2:32-39;Tra
tschin等(1984)J.Virol.51:611-619;及びFlotte等(1993)J.Biol.Chem.268:3781
-3790を参照されたい)。
法も又、動物の組織においてEPO−hSA融合蛋白質の発現を引き起こすため
に用いることができる。殆どの遺伝子トランスファーの非ウイルス的方法は、哺
乳動物細胞が巨大分子を取り込んで細胞内を輸送するために用いる正常の機構に
依存する。好適具体例において、本発明の非ウイルス性遺伝子送達システムは、
主題のヌクレオチド分子の標的細胞による取り込みのためのエンドサイトーシス
経路に依存している。この型の典型的な遺伝子送達システムには、リポソーム送
達システム、ポリリジン結合体及び人工的ウイルスエンベロープが含まれる。
表面に正電荷を有して(適宜)標的組織の細胞表面抗原に対する抗体で標識した(M
izuno等(1992)No Shinkei Geka 20:547-551;PCT公開WO91/06309
;日本国特許出願1047381;及び欧州特許公開EP−A−43075)リ
ポソーム(例えば、リポフェクチン)に閉じ込めることができる。
、幾つもの方法の内の何れかによって患者に導入することができる。例えば、こ
の遺伝子送達システムの製薬調製物を、例えば静脈注射によって全身に導入する
ことができ、標的細胞における蛋白質の特異的形質導入が、主として、遺伝子送
達ビヒクルにより与えられるトランスフェクションの特異性、レセプター遺伝子
の発現を制御する転写調節配列による細胞型若しくは組織型発現、又はこれらの
組合せから生じる。他の具体例において、組換え遺伝子の初期の送達は、動物へ
の導入(全く局所的である)に一層限られている。例えば、遺伝子送達ビヒクルを
、カテーテル(米国特許第5,328,470号参照)又は定位的注射(例えば、C
hen等(1994)PNAS 91:3054-3057)により導入することができる。
伝子送達システムよりなってよく、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれたゆっ
くり放出するマトリクスよりなってよい。この融合蛋白質が組換え細胞(例えば
、レトロウイルスベクター)から無傷で生成され得るならば、この製薬調製物は
、この融合蛋白質を生成する少なくとも1つの細胞を含むことができる。
ることができる。トランスジェニックブタの作製のためのプロトコールは、Whit
e及びYannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Im
munology, 88-94頁;米国特許第5,523,226号;米国特許第5,573
,933号PCT出願WO93/25071;及びPCT出願WO95/047
44に見出すことができる。トランスジェニックマウスの生成のためのプロトコ
ールは、米国特許第5,530,177号に見出すことができる。トランスジェ
ニックラットの生成のためのプロトコールは、Bader及びGanten, Clinical and
Experimental Pharmacology and Physiology,前出、3:S81-S87,1996中に見出す
ことができる。トランスジェニックウシの生成のためのプロトコールは、Transg
enic Animal Technology, A Handbook,1994,Carl A.Pinkert編,Academic Press,
Inc.中に見出すことができる。トランスジェニックヒツジの生成のためのプロト
コールは、Transgenic Animal Technology, A Handbook,1994,Carl A.Pinkert編
,Academic Press,Inc.中に見出すことができる。トランスジェニックウサギの生
成のためのプロトコールは、Hammer等 Nature 315:680-683,1985及びTaylor及び
Fan, Frontiers in Bioscience 2:d298-308,1987中に見出すことができる。
るものと解釈すべきではない。この出願中で引用されたすべての引用文献(参考
文献、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む
)の内容を、はっきりと、本明細書中に参考として援用する。
ードするcDNAをデザインし、遺伝子工学処理してグリコシル化の3つのN結
合及び1つのO結合部位(それぞれ、残基24、38、83及び126)を変化さ
せた。その上、残りのアミノ酸残基を変えることなく、コドン使用量を乳腺蛋白
質コドン使用量テーブルを用いて変化させてトランスジェニック動物の乳汁にお
ける蛋白質発現を最大化した。これらの融合構築物の図式表示は、図1に略記し
てある。hSAが融合蛋白質のN末端側半分である場合には、hSAシグナルペ
プチドを無傷で残し、ヒトエリスロポエチン類似体のシグナルを削除した。ヒト
エリスロポエチン類似体が融合物のN末端側半分である場合には、そのシグナル
配列を無傷で残し、hSA蛋白質のそれを削除した。最初の場合には、野生型h
SA停止コドンも除去し、第2の構築物中のヒトエリスロポエチン類似体cDN
Aのそれも除去した。加えて、リンカー蛋白質(Ser−Gly4)4即ちヒンジを
これらの2つの融合パートナーの間に置いて、hSAがこの分子のEPO部分に
及びその後の活性に対して有し得る如何なる抑制性の拘束をも最小化した。
乳腺における発現のための適当なベクター中に置いた。これらの構築物を、組織
培養物(COS7細胞)中で一時的に発現させることにより、これらのcDNA融
合物の生成物の重要な特徴の幾つかを試験することができる。例えば(1)これら
の蛋白質が生成されて分泌されるか?(2)これらの蛋白質は、忠実に作られてい
て、EPOa及びhSAに対する抗血清により認識可能であるか?(3)これらの
蛋白質は、イン・ビトロ及びイン・ビボで生物活性を有するか?
三連のプレートで又はベクター(pcDNA3)のみを有する単一プレートで)。
トランスフェクションの24時間後に、培地を低血清培地(Optimem)で置き換え
た。5日後に、すべての培地を収穫して夾雑細胞を遠心分離により除去した。調
整培地の試料を、次いで、SDS−PAGE及び免疫ブロッティングにより分析
した(図2参照)。
たCOS細胞の上清を、ヒト血清アルブミンに対するポリクローナル抗体(α−
hSA)を用いる免疫ブロッティングにより分析した。このhSA抗体を用いる
分析の後に、そのブロットを条片化してヒトエリスロポエチンに対するモノクロ
ーナル抗体(α−hEpo)を用いて再分析した。このゲルに次のようにロードし
た:レーン1、10nghSA標準;レーン2、10μl擬似CM;レーン3−
5、10μlhSA−hEpoCM;レーン6−8、10μlhEpo−hSA
CM。
れることを明らかに示している。両融合蛋白質は、適当な予想される大きさ(約
89kDa)である。hSA抗体ブロットにおける調整培地のレーンに見られる
バンドは、hSA(約66kDa)ではなくbSAである(この抗体が、用いた組
織培養培地中に見出されたbSAと幾らか交差反応性を有するので)。しかしな
がら、最も重要なことには、これら2つの抗体の両融合蛋白質を認識する能力が
ある。これは、完全な融合物mRNAの適当な翻訳が達成されて、完全で且つ抗
体に受け入れられる適当なエピトープが残ったことを示唆している。
ELISAを行って、これら2つの融合蛋白質の組織培養上清中の濃度を測定し
た。ウエスタンブロットの結果と一致して、このEPOa−リンカー−hSA融
合蛋白質は、hSA−リンカー−EPOa融合蛋白質より約4倍高レベルで作ら
れることが示された(それぞれ、232ng/ml対59ng/ml)。これらの
レベルは、イン・ビトロ及び多分イン・ビボの生物活性を評価するのに十分な生
成物を与えるであろう。もしこの融合蛋白質のEPOa画分がこの分子の全体の
大きさの20%であるならば、232ng/mlは、約10U/mlのhEpo
−hSA融合蛋白質を表す[(2.1×105U/mg)2.32×10-4mg/m
l)(0.2)=9.7U/ml]。イン・ビトロのEPOa活性は、Epo応答性
細胞株を用いて評価されよう。簡単にいえば、細胞を22〜27時間にわたって
、増大する量の組換えEPOa−hSA融合蛋白質とインキュベートして、細胞
の生長を[3H]チミジンの取り込みにより又は比色MTTアッセイ(Sigma)により
測定する。
利用するカチオン交換クロマトグラフィーを用いて、迅速に殆ど均質にまで精製
することができる。融合蛋白質は、必要ならば濃縮してマウスで試験することが
できる。マウスに融合蛋白質を皮下注射して(できるだけ少量の3×50ng/
マウス、全EPOa)、網状赤血球数又は赤血球容積レベルの変化を測定するこ
とにより応答を検出することができる。pcDNA3ベースのプラスミドDNA
の高濃度(>100μg)での直接的筋肉注射とその後の網状赤血球及び赤血球容
積レベルの変化のモニターは、イン・ビボアッセイとして利用できる。プラスミ
ドの注射は、サイトメガロウイルスプロモーター(CMV)から発現される野生型
hEpocDNAを用いた場合には、マウスにおける赤血球容積レベルを有意に
上げることが示されている。
合蛋白質構築物の生成 EPOa−hSA融合蛋白質をコードするcDNAを、ヤギベータ−カゼイン
遺伝子の調節エレメントを含むBC355ベクターに導入して、EPOa−hS
A融合蛋白質配列を乳汁特異的プロモーターの制御下に有するトランスジーンを
造った。この構築物を用いて、トランスジェニック哺乳動物の泌乳乳腺に対して
EPOa−hSA融合蛋白質発現を狙った。
トランスジーン構築物を、一般に、マウスモデル系で試験して、それらの高レ
ベルの発現を指示する能力及び組織特異的様式で発現させる能力を評価する。ト
ランスジェニックマウスを、乳腺に対してEPOa−hSA融合物の発現を狙っ
て生成した。
物をマイクロインジェクションすることにより生成した。EPOa−hSA融合
蛋白質トランスジェニックマウスの乳汁のウエスタン分析を、モノクローナル抗
EPO又は抗hSA抗体を用いて行って、どの動物がEPOa−hSA融合蛋白
質を乳汁中に発現するかを測定した。検出されたEPOa−hSA融合蛋白質の
レベルは、約0.2〜4mg/mlに及んだ。
現するトランスジェニックマウスの赤血球容積レベルの変化を測定することによ
り分析した。表1参照。これらのトランスジェニックマウスの赤血球容積レベル
(655−1−8、655−1−16、655−1−43)を、対照用マウス(C
D1マウス)のレベルと比較した。正常の赤血球容積レベルは、約50である。
スにおける発現は、それらのマウスにおいて赤血球容積を有意に増した。
球容積レベル及び創出雄についての赤血球容積レベル(678−1−11及び6
78−1−23)を与え、これらのマウスにおけるEPOa−hSAの発現及び
EPOa−hSAの生物活性を示している。
hSAの発現の基底レベルを与える。表IIに示したように、たとえ低いEPO
a−hSA融合蛋白質の発現レベルであっても、有意のイン・ビボ効果を有して
いる。
に記載している。
ジェニックヤギの作製に好適である。
ンプラント(Syncromate-B, CEVA Laboratories, Inc., Overland Park, KS)によ
り同期させる。プロスタグランジンを、最初の7〜9日後に投与して、内因性プ
ロゲステロンの合成を止める。インプラントの挿入後13日目に開始して、全部
で18mgの濾胞刺激ホルモン(FSH Schering Corp.,Kenilworth,NJ)を、1
日2回の注射で3日間にわたって筋肉内に与える。インプラントを14日目に取
り出す。インプラントを取り出してから24時間後に、これらのドナー動物を2
日間にわたって繁殖力のある雄と数回交配させる(Selgrath等、Theriogenology,
1990.p.1195-1205)。
時間)に起きる。過剰***させたヤギには、手術前36時間は、餌と水を与えな
い。ヤギに、0.8mg/kgのジアゼパム(Valium(登録商標))IVを投与して
から、直ちに5.0mg/kgのケタミン(Keteset)IVを投与する。ハロタン(
2.5%)を、手術中、2L/分酸素で気管内チューブにより投与する。生殖管
を、腹壁切開により体外に出す。黄体、直径が6mmより大きい未破裂濾胞及び
卵巣嚢胞を計数して、過剰***の結果を評価し且つ卵管のフラッシュにより収集
されるべき胚の数を予想する。カニューレを卵管の口に置き、3.0プロレンの
単一の一時的結紮により保持する。20ゲージの針を子宮内に、子宮卵管接合部
から約0.5cmの位置に置く。10〜12mlの無菌リン酸緩衝塩溶液(PB
S)を、カニューレを通して卵管中にフラッシュさせてペトリ皿中に集める。こ
の手順を、反対側について反復してから、生殖管を胴体内に戻す。閉じる前に、
10〜20mlの無菌食塩水グリセロール溶液を腹腔内に注入して癒着を防止す
る。白線を、2.0ポリジオキサノン又はスプラミドの単一中断縫合により閉じ
て皮膚を無菌の傷クリップで閉じる。
、10%ウシ胎児血清(FBS)(Sigma社より購入)を含有するハムのF12培地(
Sigma、ミズーリ、St.Louis)中で洗う。前核が見える場合には、これらの胚に直
接マイクロインジェクションを行う。もし前核が見えないならば、これらの胚を
、5%CO2を空気中に含む加湿ガスチャンバー中で、10%FBSを含有する
ハムのF12中に37℃で短い培養期間にわたって、前核が見えるようになるま
で置くことができる(Selgrath等、Theriogenology,1990.p.1195-1205)。
つの可視的前核を有する受精卵を、Normarskiオプティクスを用いる固定ステー
ジを有するZeiss直立顕微鏡上のフレームポリッシュトホールディングマイクロ
ピペット上に固定する。前核に、関心あるDNA構築物例えばヤギベータカゼイ
ン遺伝子の調節エレメントに操作可能に結合されたヒトエリスロポエチン類似体
−ヒト血清アルブミン(EPOa−hSA)融合蛋白質遺伝子を含むBC355ベ
クター(インジェクション用緩衝液(トリス−EDTA)中)を、細いガラス極微針
を用いてマイクロにジェクションする(Selgrath等、Theriogenology,1990.p.119
5-1205)。
2培養物中に置き、次いで、37℃の空気中に5%CO2を含む加湿ガスチャン
バー中でレシピエント動物が胚トランスファーのために調製されるまでインキュ
ベートする(Selgrath等、Theriogenology,1990.p.1195-1205)。
プラント(Syncromate-B)により誘導する。インプラントの挿入後13日目に、こ
れらの動物に、Sigma社から購入した妊娠雌ウマ血清ゴナドトロピン(PMSG)
の単一の非過剰***注射(400I.U.)をする。レシピエント雌を精管切除し
た雄と交配させて発情同期性を確実にする(Selgrath等、Theriogenology,1990.p
.1195-1205)。
ントにトランスファーする。この外科手術手順は、上記の胚の収集のために概説
したものと同じである(但し、卵管にカニューレを入れず、胚を、ガラスマイク
ロピペットを使って、ふさ状へりから卵管の内腔に10%FBSを含有する最少
容量のハムF12にてトランスファーする)。卵巣に6〜8より多くの***点を
有する動物は、レシピエントとして不適当であると認められる。切開を閉じて術
後のケアを行うのは、ドナー動物についてと同じである(Selgrath等、Theriogen
ology,1990.p.1195-1205)。
。110日目に、第2の超音波検査を行って妊娠を確認し、胎児の重みを評価す
る。130日目に、妊娠レシピエントヤギに、破傷風毒素及びクロストリジウム
C&Dのワクチン接種をする。セレン及びビタミンE(Bo−Se)を与え(IM)
、及びイベルメクチンを与えた(SC)。これらの雌ヤギを145日目に清潔な畜
舎に移し、約147日目に分娩を誘導する前にこの環境に順応させる。147日
目に、分娩を、40mgのPGF2a(Lutalyse(登録商標)、ミシガン、
Kalamazoo、Upjohn社)を用いて誘導する。この注射を2回行い(IM)、1回目
は、20mgの投与量で、その4時間後に、20mgを投与する。この雌ヤギを
、147日目の最初のLutalyse(登録商標)注射の後に、昼夜定期的な監
視下に置く。監視を2日目の朝から30毎に増やす。分娩は、最初の注射から3
0〜40時間後に起きた。分娩後、この雌ヤギから搾乳して初乳を集め、胎盤の
排出を確認する。
トランスジェニックをも見逃さないように2つの異なる細胞株からゲノムDNA
を単離する。モザイク動物を、各細胞にトランスジーンの少なくとも1コピーを
有しない任意のヤギと定義する。それ故、耳組織試料(中胚葉)及び血液試料を、
2日齢のF0動物からゲノムDNAの単離のために採取する(Lacy等、A Laborato
ry Manual, 1986, Cold Spring Harbor, NY;及びHerrmann及びFrischauf, Meth
ods Enzymology, 1987.152:p.180-183)。これらのDNA試料を、ヒトEPOa
−hSA融合蛋白質遺伝子に特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応
(Gould等、Proc.Natl.Acad.Sci.,1989.86:p.1934-1938)により、及びランダムプ
ライムされたEPO又はhSAcDNA(Feinberg及びVogelstein, Anal.Bioc.,
1983.132:p.6-13)を用いるサザーンブロット分析(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.,
1980.77:5201-5205)によって分析する。アッセイの感度は、体細胞の10%中の
トランスジーンの1コピーの検出が可能と見積もられている。
ックヤギの生成のために利用することができる。トランスジェニックF0創出ヤ
ギは、例えば、雌であれば、乳汁生産用に繁殖され、雄の創出動物であれば、雌
のトランスジェニック子孫を生成するために繁殖される。このトランスジェニッ
ク創出雄動物を非トランスジェニック雌と交配させて雌のトランスジェニック子
孫を生成することができる。
いて、PCR及びサザーンブロット分析により分析する。例えば、この創出雄及
びその3匹のトランスジェニック子孫のサザーンブロット分析は、世代間で再配
列又はコピー数の変化のないことを示している。これらのサザーンブロットは、
ヒトEPOa−hSA融合蛋白質cDNAプローブを用いて調べる。これらのブ
ロットを、Betascope603で分析し、コピー数はこのトランスジーン
のヤギベータカゼイン内因性遺伝子との比較により測定する。
ベルは、酵素的アッセイ又はウエスタンブロットにより測定する。
エリスロポエチンのグリコシル化部位を示している。
S7細胞のウエスタンブロット分析を描写した写真である。
Claims (52)
- 【請求項1】 EPOa−hSA融合蛋白質であって、この融合蛋白質のE
POa部分の少なくとも1つのアミノ酸残基を変化させて、EPOにおけるグリ
コシル化部位として働く部位がこのEPOaにおいてはグリコシル化部位として
働かないようにした上記のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項2】 下記式を有する、請求項1に記載のEPOa−hSA融合蛋
白質: R1−L−R2;R2−L−R1;又はR1−L−R2−L−R1 (式中、R1は、エリスロポエチン類似体アミノ酸配列であり;Lは、ペプチド
リンカーであり、そしてR2は、ヒト血清アルブミンアミノ酸配列である)。 - 【請求項3】 R1及びR2が、前記のペプチドリンカーにより共有結合で
結合された、請求項2に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項4】 グリコシル化のための付着点として働くアミノ酸残基を欠失
させた、請求項1に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項5】 グリコシル化部位として働くヒトEPOのアミノ酸残基がグ
リコシル化部位として働かないアミノ酸残基で置換されている、請求項1に記載
のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項6】 アミノ酸残基を、アミノ酸残基Asn24、Asn38、A
sn83及びSer126よりなる群から選択する、請求項1に記載のEPOa
−hSA融合蛋白質。 - 【請求項7】 前記のグリコシル化部位を、アミノ酸残基Ser126及び
、Asn24、Asn38及びAsn83よりなる群から選択する少なくとも1
つの更なるN結合グリコシル化部位で変化させた、請求項1に記載のEPOa−
hSA融合蛋白質。 - 【請求項8】 前記のグリコシル化部位がN結合グリコシル化を与え、アミ
ノ酸残基AsnをGlnで置き換えることにより変化させた、請求項1に記載の
EPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項9】 前記のグリコシル化部位がO結合グリコシル化を与え、アミ
ノ酸残基SerをGlnで置き換えることにより変化させた、請求項1に記載の
EPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項10】 アミノ酸残基24、38又は83の少なくとも1つを変化
させた、請求項1に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項11】 アミノ酸残基24、38又は83の少なくとも1つをGl
nで置き換えた、請求項10に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項12】 アミノ酸残基126を変化させた、請求項1に記載のEP
Oa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項13】 前記のアミノ酸残基126をAlaで置き換えた、請求項
12に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項14】 アミノ酸残基Asn24、Asn38、Asn83及びS
er126の各々が、それがグリコシル化部位として働かないように変化してい
る、請求項1に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項15】 アミノ酸残基Asn24、Asn38、Asn83及びS
er126の各々を、それぞれ、Gln、Gln、Gln及びAlaで置き換え
た、請求項14に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項16】 前記のペプチドリンカーが、10〜30アミノ酸長である
、請求項3に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項17】 前記のペプチドリンカー中の前記のアミノ酸の各々を、G
ly、Ser、Asn、Thr及びAlaよりなる群から選択する、請求項16
に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項18】 前記のペプチドリンカーが、式(Ser−Ser−Ser
−Ser−Gly)y(式中、yは8以下である)を有する配列を含む、請求項3に
記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項19】 前記のペプチドリンカーが、式(Ser−Ser−Ser
−Ser−Gly)3−Ser−Proを有する配列を含む、請求項3に記載のE
POa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項20】 EPOaが、Gln24、Gln38、Gln83、Al
a126EPOである、請求項1に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項21】 左から右へ、アミノ酸残基Gln24、Gln38、Gl
n83及びAla126を含むEPOa、ペプチドリンカー及びヒト血清アルブ
ミンを含む、請求項1に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項22】 EPOaが、Gln24、Gln38、Gln83、Al
a126EPOである、請求項21に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項23】 左から右へ、Gln24、Gln38、Gln83、Al
a126EPO、式((Ser−Gly−Gly−Gly−Gly)3−Ser−P
ro)を有するペプチドリンカー及びヒト血清アルブミンである、請求項1に記
載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項24】 左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー及び
アミノ酸残基Gln24、Gln38、Gln83及びAla126を含むEP
Oaを含む、請求項1に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項25】 EPOaが、Gln24、Gln38、Gln83、Al
a126EPOである、請求項24に記載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項26】 左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ser−Gly−
Gly−Gly−Gly)3−Ser−Pro)を有するペプチドリンカー及びG
ln24、Gln38、Gln83、Ala126EPOである、請求項1に記
載のEPOa−hSA融合蛋白質。 - 【請求項27】 EPOa−hSA融合蛋白質をコードするヌクレオチド配
列を含む単離された核酸であって、EPOにおけるグリコシル化部位として働く
ことのできるコードされたEPOa−hSAの少なくとも1つのアミノ酸残基が
変化していて、それがEPOaにおいてはグリコシル化部位として働かない、上
記の単離された核酸。 - 【請求項28】 請求項27に記載の核酸を含む発現ベクター又は構築物。
- 【請求項29】 請求項28に記載のベクター又は構築物を含む細胞。
- 【請求項30】 構築物又はベクター中のEPOa−hSA融合物の製造方
法であって、EPOaをコードするヌクレオチド配列を含む核酸がヒト血清アル
ブミンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸にイン・フレームで結合された
配列を構築物又はベクター中に形成することを含む、上記の製造方法。 - 【請求項31】 EPOa−hSA融合蛋白質の製造方法であって、下記を
含む当該製造方法: EPOa−hSA融合蛋白質をコードする核酸を含む細胞を準備し、そして 該EPOa−hSA融合蛋白質を該核酸から発現させ、それにより、該EPO
a−hSA融合蛋白質を生成する。 - 【請求項32】 前記の細胞を、哺乳動物、酵母、植物、昆虫又は細菌細胞
よりなる群から選択する、請求項31に記載の方法。 - 【請求項33】 EPOa−hSA融合蛋白質の製造方法であって、下記を
含む当該製造方法: EPOa−hSA融合蛋白質の発現を指示するトランスジーンを含むトランス
ジェニック生物を準備し; そのトランスジーンを発現させ;そして EPOa−hSA融合蛋白質を回収する。 - 【請求項34】 トランスジェニック生物が、トランスジェニック動物であ
る、請求項33に記載の方法。 - 【請求項35】 トランスジェニック生物が、トランスジェニック乳用動物
である、請求項33に記載の方法。 - 【請求項36】 EPOa−hSA融合蛋白質が、トランスジェニック哺乳
動物の乳腺において、乳汁特異的プロモーターの制御下で作られる、請求項33
に記載の方法。 - 【請求項37】 前記のプロモーターが、乳清蛋白質又はカゼインプロモー
ターである、請求項36に記載の方法。 - 【請求項38】 トランスジェニック哺乳動物が、ヤギである、請求項37
に記載の方法。 - 【請求項39】 EPOa−hSA融合蛋白質をトランスジェニック哺乳動
物の乳汁中に含むトランスジェニック調製物を提供する方法であって、下記を含
む当該方法: 蛋白質コード配列の乳腺上皮細胞における発現を生じるプロモーター配列に機
能的に結合されたEPOa−hSA融合蛋白質をコードする配列を有するトラン
スジェニック哺乳動物を準備し、 この融合蛋白質を発現させ、そしてこの哺乳動物から乳汁を得、それにより、
トランスジェニック調製物を供給する。 - 【請求項40】 EPOa−hSA融合蛋白質をコードするトランスジーン
を含むトランスジェニック生物。 - 【請求項41】 トランスジェニック生物が、トランスジェニック動物であ
る、請求項40に記載の方法。 - 【請求項42】 トランスジェニック生物が、トランスジェニック乳用動物
である、請求項40に記載の方法。 - 【請求項43】 EPOa−hSA融合蛋白質が、トランスジェニック哺乳
動物の乳腺において、乳汁特異的プロモーターの制御下で作られる、請求項40
に記載の方法。 - 【請求項44】 前記のプロモーターが、乳清蛋白質又はカゼインプロモー
ターである、請求項43に記載の方法。 - 【請求項45】 トランスジェニック哺乳動物が、ヤギ又はウシである、請
求項44に記載の方法。 - 【請求項46】 治療上有効な量のEPOa−hSA融合蛋白質を有する製
薬組成物。 - 【請求項47】 エリスロポエチンを必要とする患者の治療方法であって、
治療上有効な量のEPOa−hSA融合蛋白質をその患者に投与することを含む
当該治療方法。 - 【請求項48】 エリスロポエチンにおいてグリコシル化部位として働く4
つの部位が変化していて、それらがグリコシル化部位として働かないエリスロポ
エチン類似体。 - 【請求項49】 EPOaが、Gln24、Gln38、Gln83、Al
a126EPOである、請求項48に記載のエリスロポエチン類似体。 - 【請求項50】 EPOa−hSA融合蛋白質をコードするトランスジーン
を含むトランスジェニックウサギ。 - 【請求項51】 EPOa−hSA融合蛋白質をコードするトランスジーン
を含むトリ。 - 【請求項52】 EPOa−hSA融合蛋白質の培養細胞における製造方法
であって、EPOa−hSA融合蛋白質をコードする核酸を含む細胞を準備し、
そのEPOa−hSA融合蛋白質をその核酸から発現させ、それにより、EPO
a−hSA融合蛋白質を生成することを含む、上記の製造方法。
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