JP2001520048A - 新規な改変されたＭＳＰ−１核酸配列並びに細胞システムにおいてｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させる方法 - Google Patents
新規な改変されたＭＳＰ−１核酸配列並びに細胞システムにおいてｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させる方法Info
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、改変された組換え核酸(好ましくは、ＤＮＡ)配列並びに細胞培養システム、哺乳動物細胞培養システム又はトランスジェニック動物において発現させることが困難であることが知られているマラリア表面蛋白質ＭＳＰ−１のｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させる方法を提供する。この発明の組換え技術を用いる発現のための好適な蛋白質の候補は、自然のままのＭＳＰ−１遺伝子と比べて減じた全体的ＡＴ含量又はＡＴリッチな領域及び／又はｍＲＮＡ不安定性モチーフ及び／又は希なコドンを含むＤＮＡコード配列から発現されるＭＳＰ−１蛋白質である。
Description
【０００１】発明の背景 発明の分野 この発明は、異種遺伝子発現に関するものである。一層特に、この発明は、マ
ラリア遺伝子の一層高等な真核生物細胞システムにおける発現に関係する。
ラリア遺伝子の一層高等な真核生物細胞システムにおける発現に関係する。
【０００２】 関連技術の要約 ある種の異種遺伝子産物の組換え生成は、イン・ビトロ細胞培養システム又は
イン・ビボ組換え生成システムにおいて、しばしば、困難である。例えば、多く
の研究者が、細菌、寄生虫及びウイルスに由来する蛋白質を、その蛋白質が最初
に得られた細胞と異なる細胞培養システム特に哺乳動物細胞培養システムにおい
て発現させることが困難であることを見出した。哺乳動物細胞により生成するこ
とが困難であった治療上重要な蛋白質の一例は、マラリア娘虫表面蛋白質(ＭＳ Ｐ−１)である。
イン・ビボ組換え生成システムにおいて、しばしば、困難である。例えば、多く
の研究者が、細菌、寄生虫及びウイルスに由来する蛋白質を、その蛋白質が最初
に得られた細胞と異なる細胞培養システム特に哺乳動物細胞培養システムにおい
て発現させることが困難であることを見出した。哺乳動物細胞により生成するこ
とが困難であった治療上重要な蛋白質の一例は、マラリア娘虫表面蛋白質(ＭＳ Ｐ−１)である。
【０００３】 マラリアは、熱帯の国々における重大な健康上の問題である。現存薬物に対す
る耐性は、急速に広がりつつあり、ワクチンが緊急に必要とされている。P.falc
iparumの生活環において発現される多数の抗原の内で、ＭＳＰ−１が、最も広範
囲に研究されており、予防接種のための最も上首尾の候補である見込みがある。
P.falciparumにさらされた個人は、ＭＳＰ−１に対する抗体を発生し、研究は、
ＭＳＰ−１に対する自然に得られた免疫応答と減じたマラリア罹患率との間に相
関があることを示した。多数の研究の内で、精製した天然のＭＳＰ−１又はこの
蛋白質の組換え断片での免疫化は、少なくともこの寄生虫に対する部分的防護を
誘導した(Diggs等(1993)Parasitol.Today9:300-302)。従って、ＭＳＰ−１は、P
.falciparumに対するワクチンの開発に関して重要な標的である。
る耐性は、急速に広がりつつあり、ワクチンが緊急に必要とされている。P.falc
iparumの生活環において発現される多数の抗原の内で、ＭＳＰ−１が、最も広範
囲に研究されており、予防接種のための最も上首尾の候補である見込みがある。
P.falciparumにさらされた個人は、ＭＳＰ−１に対する抗体を発生し、研究は、
ＭＳＰ−１に対する自然に得られた免疫応答と減じたマラリア罹患率との間に相
関があることを示した。多数の研究の内で、精製した天然のＭＳＰ−１又はこの
蛋白質の組換え断片での免疫化は、少なくともこの寄生虫に対する部分的防護を
誘導した(Diggs等(1993)Parasitol.Today9:300-302)。従って、ＭＳＰ−１は、P
.falciparumに対するワクチンの開発に関して重要な標的である。
【０００４】 ＭＳＰ−１は、１９０〜２２０ｋＤＡの糖蛋白質である。そのＣ末端領域は、
ワクチンとしての利用のための組換え生成の焦点であった。しかしながら、ワク
チンとしてのＭＳＰ−１の開発における主要な問題は、細菌又は酵母発現システ
ムにおいて、免疫学的効力においてアフィニティー精製した天然の蛋白質と同等
である組換え蛋白質を得ること(Chang等(1992)J.Immunol.148:548-555)及びワク
チン生産を可能にするのに十分な量で該組換え蛋白質を得ることの困難さである
。
ワクチンとしての利用のための組換え生成の焦点であった。しかしながら、ワク
チンとしてのＭＳＰ−１の開発における主要な問題は、細菌又は酵母発現システ
ムにおいて、免疫学的効力においてアフィニティー精製した天然の蛋白質と同等
である組換え蛋白質を得ること(Chang等(1992)J.Immunol.148:548-555)及びワク
チン生産を可能にするのに十分な量で該組換え蛋白質を得ることの困難さである
。
【０００５】 ＭＳＰ−１の十分な量の発現を促進する改良された手順は、好都合であろう。
【０００６】発明の要約 本発明は、改良された組換えＤＮＡ組成物並びに細胞培養システム、哺乳動物
細胞培養システム又はトランスジェニック哺乳動物におけるマラリア表面抗原Ｍ
ＳＰ−１のｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させる手順を提供する。この発
明による発現システムにおける発現のための好適な蛋白質の候補は、この組換え
発現システムと比べて減じたＡＴ含量及び除去されたｍＲＮＡ不安定性モチーフ
及び希なコドンを有するＤＮＡコード配列を有するＭＳＰ−１のＣ末端誘導体で
ある。従って、第一の面において、この発明は、SEQ ID NO:２に示した配列に由
来するＤＮＡ配列を提供する。この誘導体配列は、SEQ ID NO:１に示してある。
細胞培養システム又はトランスジェニック哺乳動物におけるマラリア表面抗原Ｍ
ＳＰ−１のｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させる手順を提供する。この発
明による発現システムにおける発現のための好適な蛋白質の候補は、この組換え
発現システムと比べて減じたＡＴ含量及び除去されたｍＲＮＡ不安定性モチーフ
及び希なコドンを有するＤＮＡコード配列を有するＭＳＰ−１のＣ末端誘導体で
ある。従って、第一の面において、この発明は、SEQ ID NO:２に示した配列に由
来するＤＮＡ配列を提供する。この誘導体配列は、SEQ ID NO:１に示してある。
【０００７】 第二の面において、この発明は、ＭＳＰ−１をコードする天然の遺伝子の全体
的ＡＴ含量を低下させるステップ、すべてのｍＲＮＡ不安定性モチーフを除去す
るステップ及びすべての希なコドンを乳腺組織の好適コドンで置換するステップ
{すべて、天然の遺伝子中の特異的コドンを、乳腺組織により認識可能な好まし くは好まれるコドンで置換し且つ置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする
コドンで置換することによる}を含むこの発明の改変された核酸を調製する方法 を提供する。この発明のこの面は、更に、この発明の方法により調製された改変
された核酸を含む。
的ＡＴ含量を低下させるステップ、すべてのｍＲＮＡ不安定性モチーフを除去す
るステップ及びすべての希なコドンを乳腺組織の好適コドンで置換するステップ
{すべて、天然の遺伝子中の特異的コドンを、乳腺組織により認識可能な好まし くは好まれるコドンで置換し且つ置換されたコドンと同じアミノ酸をコードする
コドンで置換することによる}を含むこの発明の改変された核酸を調製する方法 を提供する。この発明のこの面は、更に、この発明の方法により調製された改変
された核酸を含む。
【０００８】 第三の面において、この発明は又、この発明の改変されたＭＳＰ−１核酸及び
ヤギベータカゼインプロモーター及びシグナル配列を含むベクター、並びにこの
発明の核酸でトランスフォームされた宿主細胞をも提供する。
ヤギベータカゼインプロモーター及びシグナル配列を含むベクター、並びにこの
発明の核酸でトランスフォームされた宿主細胞をも提供する。
【０００９】 第四の面において、この発明は、生殖細胞系がこの発明の核酸を含むトランス
ジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
ジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【００１０】 第五の面において、この発明は、この発明による改変されたＭＳＰ−１遺伝子
を含むＤＮＡワクチンを提供する。
を含むＤＮＡワクチンを提供する。
【００１１】好適具体例の詳細な説明 本明細書中で言及する特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立す
る。本明細書中で引用されている発行された米国特許、許可された出願、公開さ
れた外国出願及び参考文献は、本明細書中に参考として援用する。これらの参考
文献と本願の開示との間の如何なる矛盾も、本願の開示に賛成して解決されよう
。
る。本明細書中で引用されている発行された米国特許、許可された出願、公開さ
れた外国出願及び参考文献は、本明細書中に参考として援用する。これらの参考
文献と本願の開示との間の如何なる矛盾も、本願の開示に賛成して解決されよう
。
【００１２】 本発明は、改良された組換えＤＮＡ組成物並びに細胞培養システム、哺乳動物
細胞培養システム又はトランスジェニック哺乳動物においてマラリア表面抗原Ｍ
ＳＰ−１のｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させるための手順を提供する。
この発明による発現システムにおける発現のための好適な蛋白質の候補は、を有
するこの組換え発現システムと比べて減じたＡＴ含量、及び除去したｍＲＮＡ不
安定性モチーフ及び希なコドンＤＮＡコード配列を有するＭＳＰ−１のＣ末端誘
導体である。従って、第一の面において、この発明は、SEQ ID NO:２に示した配
列に由来するＤＮＡ配列を提供する。この誘導体配列は、SEQ ID NO:１に示して
ある。
細胞培養システム又はトランスジェニック哺乳動物においてマラリア表面抗原Ｍ
ＳＰ−１のｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させるための手順を提供する。
この発明による発現システムにおける発現のための好適な蛋白質の候補は、を有
するこの組換え発現システムと比べて減じたＡＴ含量、及び除去したｍＲＮＡ不
安定性モチーフ及び希なコドンＤＮＡコード配列を有するＭＳＰ−１のＣ末端誘
導体である。従って、第一の面において、この発明は、SEQ ID NO:２に示した配
列に由来するＤＮＡ配列を提供する。この誘導体配列は、SEQ ID NO:１に示して
ある。
【００１３】 好適具体例において、この発明の核酸は、哺乳動物細胞培養システムにおいて
、又はトランスジェニック哺乳動物において、天然遺伝子により哺乳動物細胞培
養システム又はトランスジェニック哺乳動物において同じ条件下で発現されるＭ
ＳＰ−１の少なくとも２５％(好ましくは５０％)の、更に一層好ましくは少なく
とも１００％以上のレベルでＭＳＰ−１を発現することができる。
、又はトランスジェニック哺乳動物において、天然遺伝子により哺乳動物細胞培
養システム又はトランスジェニック哺乳動物において同じ条件下で発現されるＭ
ＳＰ−１の少なくとも２５％(好ましくは５０％)の、更に一層好ましくは少なく
とも１００％以上のレベルでＭＳＰ−１を発現することができる。
【００１４】 ここで用いる場合、用語「発現」は、蛋白質発現を生じるｍＲＮＡ転写を意味
する。発現は、関心ある蛋白質に特異的な抗体の利用を含む当分野で公知の多く
の技術によって測定することができる。「天然の遺伝子」又は「自然のままの遺
伝子」とは、野生型のＭＳＰ−１をコードし且つ改変された核酸が由来する遺伝
子配列又はその断片(天然の対立遺伝子変異体を含む)を意味する。「好適なコド
ン」は、改変されたＭＳＰ−１遺伝子が発現されるべき細胞又は組織型(例えば 、乳組織)により一層優勢に用いられるコドンを意味する。コドン置換が、少な くともマウスの乳組織により認識されるコドンでありさえすれば、ここに記載の
すべてのコドンの変化が、好適コドンへの変化ではない。用語「減じたＡＴ含量
」は、ここで用いる場合、Ａ(アデニン)又はＴ(チミン)を含むヌクレオチド位置
の或はＡ及び／又はＴ含有コドンのマウスの乳組織により認識されるヌクレオチ
ド又はコドンでの置換(該置換は、標的蛋白質のアミノ酸配列を変化させない)の
ために、Ａ又はＴ塩基を有するヌクレオチドの全体的に一層低いパーセンテージ
(天然のＭＳＰ−１遺伝子と比べて)を有することを意味する。
する。発現は、関心ある蛋白質に特異的な抗体の利用を含む当分野で公知の多く
の技術によって測定することができる。「天然の遺伝子」又は「自然のままの遺
伝子」とは、野生型のＭＳＰ−１をコードし且つ改変された核酸が由来する遺伝
子配列又はその断片(天然の対立遺伝子変異体を含む)を意味する。「好適なコド
ン」は、改変されたＭＳＰ−１遺伝子が発現されるべき細胞又は組織型(例えば 、乳組織)により一層優勢に用いられるコドンを意味する。コドン置換が、少な くともマウスの乳組織により認識されるコドンでありさえすれば、ここに記載の
すべてのコドンの変化が、好適コドンへの変化ではない。用語「減じたＡＴ含量
」は、ここで用いる場合、Ａ(アデニン)又はＴ(チミン)を含むヌクレオチド位置
の或はＡ及び／又はＴ含有コドンのマウスの乳組織により認識されるヌクレオチ
ド又はコドンでの置換(該置換は、標的蛋白質のアミノ酸配列を変化させない)の
ために、Ａ又はＴ塩基を有するヌクレオチドの全体的に一層低いパーセンテージ
(天然のＭＳＰ−１遺伝子と比べて)を有することを意味する。
【００１５】 第２の面において、この発明は、ＭＳＰ−１をコードする天然の遺伝子の全体
的ＡＴ含量を減じ、すべてのｍＲＮＡ不安定性モチーフを除去しそしてすべての
希なコドンを乳腺組織の好適コドンで置換するステップ(すべて、天然の遺伝子 中の特異的コドンを乳腺組織により認識され得て好ましくは好まれるコドンで置
換することにより、且つ該置換後のコドンは、置換されたコドンと同じアミノ酸
をコードする)を含むこの発明の改変された核酸の製造方法を提供する。組換え ＤＮＡ技術の原理を記載している標準的な参考文献には、Watson,J.D.等、Molec
ular Biology of the Gene,第Ｉ及びＩＩ巻 the Benjamin/Cummings Publishing
Company,Inc.publisher,Menlo Park,カリフォルニア (1987)Darnell,J.E.等、Molecula r Cell Biology,Scientific American Books,Inc.,Publisher,New York,ニューヨーク( 1986); Old,R.W.,等、Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering,第二版、University of California Press,publisher,Ber
keleyカリフォルニア(1981); Maniatis,T.,等、Molecular Cloning: A Laboratory Manu al,第二版、Cold Spring Harbor Laboratory,publisher,Cold Spring Harbor,ニューヨーク (1989)及びCurrent Protocols in Molecular Biology,Ausubel等、Wiley Pr ess,New York,ニューヨーク(1992)が含まれる。この発明のこの面は、この発明の方法 により調製された改変された核酸をも包含する。
的ＡＴ含量を減じ、すべてのｍＲＮＡ不安定性モチーフを除去しそしてすべての
希なコドンを乳腺組織の好適コドンで置換するステップ(すべて、天然の遺伝子 中の特異的コドンを乳腺組織により認識され得て好ましくは好まれるコドンで置
換することにより、且つ該置換後のコドンは、置換されたコドンと同じアミノ酸
をコードする)を含むこの発明の改変された核酸の製造方法を提供する。組換え ＤＮＡ技術の原理を記載している標準的な参考文献には、Watson,J.D.等、Molec
ular Biology of the Gene,第Ｉ及びＩＩ巻 the Benjamin/Cummings Publishing
Company,Inc.publisher,Menlo Park,カリフォルニア (1987)Darnell,J.E.等、Molecula r Cell Biology,Scientific American Books,Inc.,Publisher,New York,ニューヨーク( 1986); Old,R.W.,等、Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering,第二版、University of California Press,publisher,Ber
keleyカリフォルニア(1981); Maniatis,T.,等、Molecular Cloning: A Laboratory Manu al,第二版、Cold Spring Harbor Laboratory,publisher,Cold Spring Harbor,ニューヨーク (1989)及びCurrent Protocols in Molecular Biology,Ausubel等、Wiley Pr ess,New York,ニューヨーク(1992)が含まれる。この発明のこの面は、この発明の方法 により調製された改変された核酸をも包含する。
【００１６】 如何なる理論に限定されるものでもないが、以前の研究は、ＧＭ−ＣＳＦｍＲ
ＮＡの３’非翻訳領域からの保存されたＡＵ配列(ＡＵＵＵＡ)が選択的ｍＲＮＡ
分解を媒介することを示した(Shaw,G.及びKamen,R.Cell46:659-667)。この過去 における焦点は、遺伝子の非翻訳領域内のこれらの不安定性モチーフの存在の上
にあった。本発明は、ＭＳＰ−１遺伝子のコード領域内の不安定性配列の除去の
利点を認識する最初のものである。
ＮＡの３’非翻訳領域からの保存されたＡＵ配列(ＡＵＵＵＡ)が選択的ｍＲＮＡ
分解を媒介することを示した(Shaw,G.及びKamen,R.Cell46:659-667)。この過去 における焦点は、遺伝子の非翻訳領域内のこれらの不安定性モチーフの存在の上
にあった。本発明は、ＭＳＰ−１遺伝子のコード領域内の不安定性配列の除去の
利点を認識する最初のものである。
【００１７】 第３の面において、この発明は又、この発明の改変されたＭＳＰ−１核酸及び
ヤギベータカゼインプロモーター及びシグナル配列を含むベクター、並びにこの
発明の核酸でトランスフォームされた宿主細胞をも提供する。
ヤギベータカゼインプロモーター及びシグナル配列を含むベクター、並びにこの
発明の核酸でトランスフォームされた宿主細胞をも提供する。
【００１８】 第４の面において、この発明は、生殖細胞系列がこの発明の核酸を含むトラン
スジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。トランスジェニック動物作成のための
一般的原理は、当分野で公知である。例えば、Hogan等,Manipulating the Mouse
Embryo: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1986)；Simon
s等,Bio/Technology6:179-183,(1988)；Wall等,Biol.Reprod.32:645-651,(1985)
；Buhler等,Bio/Technology,8:140-143(1990)；Ebert等,Bio/Technology9:835-8
38(1991)；Krimenfort等,Bio/Technology9:844-847(1991)；Wall等,J.Cell.Bioc
hem.49:113-120(1992)を参照されたい。外来ＤＮＡ配列を哺乳動物及びそれらの
生殖細胞に導入する技術は、最初、マウスにおいて開発された。例えば、Gordon
等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:7380-7384,(1980)；Gordon及びRuddle,Science21
4:1244-1246(1981)；Palmiter及びBrinster,Cell41:343-345,1985；Brinster等,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:4438-4442(1985)及びHogan等(前出)を参照されたい 。これらの技術は、その後、ウシ及びヤギを含むもっと大きい動物用に改変され
た。ごく最近まで、トランスジェニックマウス又は家畜の作成のための最も広く
用いられた手順においては、トランスジェニック発現構築物の形態の関心あるＤ
ＮＡの数百の線状分子が、受精卵の前核の一つに注入される。接合体の細胞質中
へのＤＮＡの注入も又、広く用いられている。最も最近において、未受精卵に注
入することのできる完全なトランスジェニック細胞系統のクローン化が、達成さ
れた(KHS Campbell等,Nature380 64-66(1996))。
スジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。トランスジェニック動物作成のための
一般的原理は、当分野で公知である。例えば、Hogan等,Manipulating the Mouse
Embryo: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1986)；Simon
s等,Bio/Technology6:179-183,(1988)；Wall等,Biol.Reprod.32:645-651,(1985)
；Buhler等,Bio/Technology,8:140-143(1990)；Ebert等,Bio/Technology9:835-8
38(1991)；Krimenfort等,Bio/Technology9:844-847(1991)；Wall等,J.Cell.Bioc
hem.49:113-120(1992)を参照されたい。外来ＤＮＡ配列を哺乳動物及びそれらの
生殖細胞に導入する技術は、最初、マウスにおいて開発された。例えば、Gordon
等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:7380-7384,(1980)；Gordon及びRuddle,Science21
4:1244-1246(1981)；Palmiter及びBrinster,Cell41:343-345,1985；Brinster等,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:4438-4442(1985)及びHogan等(前出)を参照されたい 。これらの技術は、その後、ウシ及びヤギを含むもっと大きい動物用に改変され
た。ごく最近まで、トランスジェニックマウス又は家畜の作成のための最も広く
用いられた手順においては、トランスジェニック発現構築物の形態の関心あるＤ
ＮＡの数百の線状分子が、受精卵の前核の一つに注入される。接合体の細胞質中
へのＤＮＡの注入も又、広く用いられている。最も最近において、未受精卵に注
入することのできる完全なトランスジェニック細胞系統のクローン化が、達成さ
れた(KHS Campbell等,Nature380 64-66(1996))。
【００１９】 この乳腺発現システムは、高発現レベル、低コスト、正確なプロセッシング及
び利用しやすさの利点を有している。公知の蛋白質例えばウシ及びヒトのアルフ
ァ−ラクトアルブミンが、何人かの研究者により、泌乳トランスジェニック動物
において生成されており、(Wright等,Bio/Technology9:830-834(1991)；Vilotte
等,Eur.J.Biochem.,186:43-48(1989)；Hochi等,Mol Reprod.And Devel.33:160-1
64(1992)；Soulier等,FEBS Letters297(1,2):13-18(1992))且つこのシステムは 、高レベルの蛋白質を生成することが示されている。
び利用しやすさの利点を有している。公知の蛋白質例えばウシ及びヒトのアルフ
ァ−ラクトアルブミンが、何人かの研究者により、泌乳トランスジェニック動物
において生成されており、(Wright等,Bio/Technology9:830-834(1991)；Vilotte
等,Eur.J.Biochem.,186:43-48(1989)；Hochi等,Mol Reprod.And Devel.33:160-1
64(1992)；Soulier等,FEBS Letters297(1,2):13-18(1992))且つこのシステムは 、高レベルの蛋白質を生成することが示されている。
【００２０】 第五の面において、この発明は、この発明による改変されたＭＳＰ−１遺伝子
を含むＤＮＡワクチンを提供する。かかるＤＮＡワクチンは、カプセル封入しな
いで送達することができ、又はリポソーム若しくはウイルスゲノムの部分として
送達することができる。一般に、かかるワクチンは、改変されたＭＳＰ−１遺伝
子の発現を可能にして、このワクチンを受けたヒトを含む動物中に抗体応答を誘
出するのに十分な量で送達される。最初の送達から少なくとも一週間後の第二次
の送達を用いて、抗体応答を増大させることができる。好適な送達経路には、粘
膜経由の導入並びに非経口投与が含まれる。
を含むＤＮＡワクチンを提供する。かかるＤＮＡワクチンは、カプセル封入しな
いで送達することができ、又はリポソーム若しくはウイルスゲノムの部分として
送達することができる。一般に、かかるワクチンは、改変されたＭＳＰ−１遺伝
子の発現を可能にして、このワクチンを受けたヒトを含む動物中に抗体応答を誘
出するのに十分な量で送達される。最初の送達から少なくとも一週間後の第二次
の送達を用いて、抗体応答を増大させることができる。好適な送達経路には、粘
膜経由の導入並びに非経口投与が含まれる。
【００２１】実施例 新規な改変されたＭＳＰ−１42遺伝子の作成 ＭＳＰ−１のＣ末端断片をコードする新規な改変された核酸を提供する。この
発明の哺乳動物細胞中で発現することのできるＭＳＰ−１の４２ｋＤのＣ末端部
分(ＭＳＰ−１42)をコードするのこの発明の新規な改変された核酸を図１に示す
。天然のＭＳＰ−１42遺伝子(図２)は、哺乳動物細胞培養中で又はトランスジェ
ニックマウスにおいて発現することができなかった。天然のＭＳＰ−１42遺伝子
の分析は、それを哺乳動物の遺伝子と区別する幾つかの特徴を示唆した。第一に
、それは、全体的に非常に高い７６％のＡＴ含量を有している。第二に、ｍＲＮ
Ａ不安定性モチーフＡＵＵＵＡが、この１１００ｂｐのＤＮＡセグメント中に１
０回現れた(図２)。これらの差異を扱うために、新たなＭＳＰ−１42遺伝子をデ
ザインした。サイレントヌクレオチド置換を天然のＭＳＰ−１42遺伝子の３０６
の位置に導入して全体的ＡＴ含量を４９．７％に減少させた。その上、天然遺伝
子中の１０のＡＵＵＵＡｍＲＮＡ不安定性モチーフの各々を、コドン使用量の変
更により除去した。コドン使用量を変えるために、乳組織特異的コドン使用表( 図３ａ)を、幾つかのマウス及びヤギの乳特異的蛋白質を用いて作成した。この 表を用いて、上記のように改変したＭＳＰ−１42遺伝子についてのコドン使用量
の選択を導いた。例えば、表(図３ａ中)に示したように、天然遺伝子において、
Ｌｅｕの６５％(２５／３８)が、ＴＴＡ(乳腺においては希なコドン)によりコー
ドされていた。改変されたＭＳＰ−１42遺伝子においては、１００％のＬｅｕが
ＣＴＧ(乳腺におけるＬｅｕの好適なコドン)によりコードされた。
発明の哺乳動物細胞中で発現することのできるＭＳＰ−１の４２ｋＤのＣ末端部
分(ＭＳＰ−１42)をコードするのこの発明の新規な改変された核酸を図１に示す
。天然のＭＳＰ−１42遺伝子(図２)は、哺乳動物細胞培養中で又はトランスジェ
ニックマウスにおいて発現することができなかった。天然のＭＳＰ−１42遺伝子
の分析は、それを哺乳動物の遺伝子と区別する幾つかの特徴を示唆した。第一に
、それは、全体的に非常に高い７６％のＡＴ含量を有している。第二に、ｍＲＮ
Ａ不安定性モチーフＡＵＵＵＡが、この１１００ｂｐのＤＮＡセグメント中に１
０回現れた(図２)。これらの差異を扱うために、新たなＭＳＰ−１42遺伝子をデ
ザインした。サイレントヌクレオチド置換を天然のＭＳＰ−１42遺伝子の３０６
の位置に導入して全体的ＡＴ含量を４９．７％に減少させた。その上、天然遺伝
子中の１０のＡＵＵＵＡｍＲＮＡ不安定性モチーフの各々を、コドン使用量の変
更により除去した。コドン使用量を変えるために、乳組織特異的コドン使用表( 図３ａ)を、幾つかのマウス及びヤギの乳特異的蛋白質を用いて作成した。この 表を用いて、上記のように改変したＭＳＰ−１42遺伝子についてのコドン使用量
の選択を導いた。例えば、表(図３ａ中)に示したように、天然遺伝子において、
Ｌｅｕの６５％(２５／３８)が、ＴＴＡ(乳腺においては希なコドン)によりコー
ドされていた。改変されたＭＳＰ−１42遺伝子においては、１００％のＬｅｕが
ＣＴＧ(乳腺におけるＬｅｕの好適なコドン)によりコードされた。
【００２２】 発現ベクターを、この改変されたＭＳＰ−１42遺伝子を用いて、ヤギのベータ
カゼインの最初の２６アミノ酸をこの改変されたＭＳＰ−１42遺伝子のＮ末端に
融合することにより作成し、この融合遺伝子を有するＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を
発現ベクターｐＣＤＮＡ３のＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。この遺伝子産
物をアフィニティー精製可能にするためにこのＭＳＰ−１42遺伝子の３’末端に
Ｈｉｓ６タグを融合させた。これは、プラスミドＧＴＣ６２７(図４ｃ)を生じた
。
カゼインの最初の２６アミノ酸をこの改変されたＭＳＰ−１42遺伝子のＮ末端に
融合することにより作成し、この融合遺伝子を有するＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を
発現ベクターｐＣＤＮＡ３のＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。この遺伝子産
物をアフィニティー精製可能にするためにこのＭＳＰ−１42遺伝子の３’末端に
Ｈｉｓ６タグを融合させた。これは、プラスミドＧＴＣ６２７(図４ｃ)を生じた
。
【００２３】 天然のＭＳＰ−１42遺伝子構築物をこの発明の改変されたＭＳＰ−１42核酸と
比較するために、天然のＭＳＰ−１42遺伝子についても発現ベクターを作成して
、その遺伝子を哺乳動物細胞培養に加え、下記のようにマウスに注入してトラン
スジェニックマウスを生成した：
比較するために、天然のＭＳＰ−１42遺伝子についても発現ベクターを作成して
、その遺伝子を哺乳動物細胞培養に加え、下記のようにマウスに注入してトラン
スジェニックマウスを生成した：
【００２４】 天然ＭＳＰ−１42発現ベクターの構築 切り詰められた熱帯熱マラリア原虫の娘虫表面蛋白質−１(ＭＳＰ−１)を分泌
するために、ＭＳＰ−１の４２ＫＤのＣ末端部分(ＭＳＰ−１42)をコードする野
生型遺伝子をヤギのべータ−カゼインの最初の１５又は２６アミノ酸をコードす
るＤＮＡに融合した。これは、第一に、ＭＳＰ−１プラスミド(ＮＩＨのDavid K
aslow博士から得た)をプライマーＭＳＰ１及びＭＳＰ２(図６)を用いて増幅する
ＰＣＲにより達成され、次いで、そのＰＣＲ生成物をＴＡベクター(Invitrogen)
中にクローン化する。ＰＣＲ生成物のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片を、オリゴＯＴ
１及びＯＴ２(図６)を用いて発現ベクターｐＣＤＮＡ３中に連結した。この生成
されたプラスミドＧＴＣ５６４(図４ｂ)は、１５アミノ酸のべータ−カゼインシ
グナルペプチド及び成熟ヤギべータ−カゼインの最初の１１アミノ酸をコードし
、その次に天然のＭＳＰ−１42遺伝子が続く。オリゴＭＳＰ−８及びＭＳＰ−２
(図６)を用いて、ＭＳＰ−１プラスミドをＰＣＲにより増幅し、次いで、その生
成物をＴＡベクター中にクローン化した。ＸｈｏＩ断片を切り出して、発現ベク
ターｐＣＤＮＡ３のＸｈｏＩ部位にクローン化して、プラスミドＧＴＣ４７９( 図４ａ)を生成した(これは、野生型ＭＳＰ−１42遺伝子に融合された１５アミノ
酸のヤギべータ−カゼインシグナルペプチドをコードした)。Ｈｉｓ６タグを、 ＧＴＣ５６４及びＧＴＣ４７９中のＭＳＰ−１42遺伝子の３’末端に加えた。
するために、ＭＳＰ−１の４２ＫＤのＣ末端部分(ＭＳＰ−１42)をコードする野
生型遺伝子をヤギのべータ−カゼインの最初の１５又は２６アミノ酸をコードす
るＤＮＡに融合した。これは、第一に、ＭＳＰ−１プラスミド(ＮＩＨのDavid K
aslow博士から得た)をプライマーＭＳＰ１及びＭＳＰ２(図６)を用いて増幅する
ＰＣＲにより達成され、次いで、そのＰＣＲ生成物をＴＡベクター(Invitrogen)
中にクローン化する。ＰＣＲ生成物のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片を、オリゴＯＴ
１及びＯＴ２(図６)を用いて発現ベクターｐＣＤＮＡ３中に連結した。この生成
されたプラスミドＧＴＣ５６４(図４ｂ)は、１５アミノ酸のべータ−カゼインシ
グナルペプチド及び成熟ヤギべータ−カゼインの最初の１１アミノ酸をコードし
、その次に天然のＭＳＰ−１42遺伝子が続く。オリゴＭＳＰ−８及びＭＳＰ−２
(図６)を用いて、ＭＳＰ−１プラスミドをＰＣＲにより増幅し、次いで、その生
成物をＴＡベクター中にクローン化した。ＸｈｏＩ断片を切り出して、発現ベク
ターｐＣＤＮＡ３のＸｈｏＩ部位にクローン化して、プラスミドＧＴＣ４７９( 図４ａ)を生成した(これは、野生型ＭＳＰ−１42遺伝子に融合された１５アミノ
酸のヤギべータ−カゼインシグナルペプチドをコードした)。Ｈｉｓ６タグを、 ＧＴＣ５６４及びＧＴＣ４７９中のＭＳＰ−１42遺伝子の３’末端に加えた。
【００２５】 天然のＭＳＰ−１42遺伝子は、ＣＯＳ−７細胞中で発現されない 培養ＣＯＳ−７細胞中での天然のＭＳＰ遺伝子の発現を、一過性トランスフェ
クションアッセイによりアッセイした。ＧＴＣ４７９及びＧＴＣ５６４プラスミ
ドＤＮＡを、リポフェクタミン(Gibco-BRL)により、製造業者のプロトコールに 従ってＣＯＳ−７細胞に導入した。全細胞ＲＮＡを、ＣＯＳ細胞から、トランス
フェクションの二日後に単離した。これらの新たに合成された蛋白質を、35Ｓメ
チオニンを加える(トランスフェクションの二日後に培養培地に加える)ことによ
り１０時間にわたって代謝的に標識した。
クションアッセイによりアッセイした。ＧＴＣ４７９及びＧＴＣ５６４プラスミ
ドＤＮＡを、リポフェクタミン(Gibco-BRL)により、製造業者のプロトコールに 従ってＣＯＳ−７細胞に導入した。全細胞ＲＮＡを、ＣＯＳ細胞から、トランス
フェクションの二日後に単離した。これらの新たに合成された蛋白質を、35Ｓメ
チオニンを加える(トランスフェクションの二日後に培養培地に加える)ことによ
り１０時間にわたって代謝的に標識した。
【００２６】 ＣＯＳ細胞におけるＭＳＰｍＲＮＡ発現を測定するために、ノーザンブロット
を、ＧＴＣ４７９に由来する32Ｐ標識したＤＮＡ断片をプローブとして調べた。
ＭＳＰＲＮＡは、ＧＴＣ４７９又はＧＴＣ５６４トランスフェクタントにおいて
検出されなかった(データは、示してない)。もっと長い露出は、分解されたＭＳ
ＰｍＲＮＡの残留レベルを示した。35Ｓ標識した培養上清及び細胞溶解物は、Ｍ
ＳＰに対して高められたポリクローナル抗体で免疫沈降された。免疫沈降実験は
、これらのＧＴＣ４７９又はＧＴＣ５６４でトランスフェクトされた細胞の溶解
物又は上清の何れからも、発現を示さなかった(データは、示してない)。これら
の結果は、天然のＭＳＰ−１遺伝子がＣＯＳ細胞において発現されないことを示
した。
を、ＧＴＣ４７９に由来する32Ｐ標識したＤＮＡ断片をプローブとして調べた。
ＭＳＰＲＮＡは、ＧＴＣ４７９又はＧＴＣ５６４トランスフェクタントにおいて
検出されなかった(データは、示してない)。もっと長い露出は、分解されたＭＳ
ＰｍＲＮＡの残留レベルを示した。35Ｓ標識した培養上清及び細胞溶解物は、Ｍ
ＳＰに対して高められたポリクローナル抗体で免疫沈降された。免疫沈降実験は
、これらのＧＴＣ４７９又はＧＴＣ５６４でトランスフェクトされた細胞の溶解
物又は上清の何れからも、発現を示さなかった(データは、示してない)。これら
の結果は、天然のＭＳＰ−１遺伝子がＣＯＳ細胞において発現されないことを示
した。
【００２７】 天然のＭＳＰ−１42遺伝子は、トランスジェニックマウスの乳腺において発現さ
れない ＧＴＣ４７９のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片(１５アミノ酸のヤギべータ−カゼイ ンシグナルペプチド、ヤギべータ−カゼインの最初の１１アミノ酸及び天然のＭ
ＳＰ−１42遺伝子をコードする)を、ベクターＢＣ３５０中で発現されるべータ −カゼインのＸｈｏＩ部位にクローン化した。これは、プラスミドＢＣ５７４( 図７)を生成した。ＢＣ５７４のＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を、マウス胚中に注入 して、トランスジェニックマウスを生成した。１５系統のトランスジェニックマ
ウスを樹立した。雌の創出マウスからの乳汁を集めて、ＭＳＰに対するポリクロ
ーナル抗体を用いるウエスタンブロット分析にかけた。分析した７匹のマウスの
何れも、それらの乳汁中にＭＳＰ−１42蛋白質を発現することが見出されなかっ
た。ＭＳＰ−１42のｍＲＮＡが乳腺で発現されるかどうかを更に測定するために
、全ＲＮＡを、１１日間泌乳しているトランスジェニックマウスから抽出して、
ノーザンブロッティングにより分析した。ＭＳＰ−１42ｍＲＮＡは、分析したＢ
Ｃ５７４系統の何れによっても検出されなかった。それ故、ＭＳＰ−１42トラン
スジーンは、トランスジェニックマウスの乳腺において発現されなかった。まと
めると、これらの実験は、天然の寄生虫のＭＳＰ−１42遺伝子が哺乳動物細胞に
おいて発現され得なかったこと及びこのブロックがｍＲＮＡの豊富さのレベルに
あることを示唆している。
れない ＧＴＣ４７９のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片(１５アミノ酸のヤギべータ−カゼイ ンシグナルペプチド、ヤギべータ−カゼインの最初の１１アミノ酸及び天然のＭ
ＳＰ−１42遺伝子をコードする)を、ベクターＢＣ３５０中で発現されるべータ −カゼインのＸｈｏＩ部位にクローン化した。これは、プラスミドＢＣ５７４( 図７)を生成した。ＢＣ５７４のＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を、マウス胚中に注入 して、トランスジェニックマウスを生成した。１５系統のトランスジェニックマ
ウスを樹立した。雌の創出マウスからの乳汁を集めて、ＭＳＰに対するポリクロ
ーナル抗体を用いるウエスタンブロット分析にかけた。分析した７匹のマウスの
何れも、それらの乳汁中にＭＳＰ−１42蛋白質を発現することが見出されなかっ
た。ＭＳＰ−１42のｍＲＮＡが乳腺で発現されるかどうかを更に測定するために
、全ＲＮＡを、１１日間泌乳しているトランスジェニックマウスから抽出して、
ノーザンブロッティングにより分析した。ＭＳＰ−１42ｍＲＮＡは、分析したＢ
Ｃ５７４系統の何れによっても検出されなかった。それ故、ＭＳＰ−１42トラン
スジーンは、トランスジェニックマウスの乳腺において発現されなかった。まと
めると、これらの実験は、天然の寄生虫のＭＳＰ−１42遺伝子が哺乳動物細胞に
おいて発現され得なかったこと及びこのブロックがｍＲＮＡの豊富さのレベルに
あることを示唆している。
【００２８】 哺乳動物細胞におけるＭＳＰの発現 一過性トランスフェクションの実験を行って、ＣＯＳ細胞におけるこの発明の
改変されたＭＳＰ−１42遺伝子の発現を評価した。ＧＴＣ６２７及びＧＴＣ４７
９ＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に導入した。全ＲＮＡを、トランスフェクションの４
８時間後にノーザン分析用に単離した。固定化したＲＮＡをＧＴＣ６２７の32Ｐ
標識したＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片をプローブとして調べた。劇的な差異が、ＧＴ
Ｃ４７９とＧＴＣ６２７の間で認められた。ＧＴＣ４７９でトランスフェクトさ
れた細胞においては前に示したようにＭＳＰ−１42ｍＲＮＡが検出されなかった
が、豊富なＭＳＰ−１42ｍＲＮＡがＧＴＣ６２７により発現された(図５、パネ ルＡ)。ＧＴＣ４６９を負の対照として用いたが、これは、市販のクローニング ベクターのＰＵ１９中にクローン化したＧＴＣ５６４のインサートを含む。35Ｓ
メチオニンを用いる代謝的標識実験とそれに続くＭＳＰに対するポリクローナル
抗体(ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨのD.Kaslow提供)を用いる免疫沈降は、ＭＳＰ−１42蛋
白質がトランスフェクトされたＣＯＳ細胞により合成されるを示した(図５、パ ネルＢ)。更に、ＭＳＰ−１42は、トランスフェクトされたＣＯＳの上清中で検 出されたが、これは、ＭＳＰ−１42蛋白質が分泌もされることを示している。更
に、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いて、ＭＳＰ−１42を、ＧＴＣ６２７トランスフェ
クトされたＣＯＳ上清からアフィニティー精製した。
改変されたＭＳＰ−１42遺伝子の発現を評価した。ＧＴＣ６２７及びＧＴＣ４７
９ＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に導入した。全ＲＮＡを、トランスフェクションの４
８時間後にノーザン分析用に単離した。固定化したＲＮＡをＧＴＣ６２７の32Ｐ
標識したＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片をプローブとして調べた。劇的な差異が、ＧＴ
Ｃ４７９とＧＴＣ６２７の間で認められた。ＧＴＣ４７９でトランスフェクトさ
れた細胞においては前に示したようにＭＳＰ−１42ｍＲＮＡが検出されなかった
が、豊富なＭＳＰ−１42ｍＲＮＡがＧＴＣ６２７により発現された(図５、パネ ルＡ)。ＧＴＣ４６９を負の対照として用いたが、これは、市販のクローニング ベクターのＰＵ１９中にクローン化したＧＴＣ５６４のインサートを含む。35Ｓ
メチオニンを用いる代謝的標識実験とそれに続くＭＳＰに対するポリクローナル
抗体(ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨのD.Kaslow提供)を用いる免疫沈降は、ＭＳＰ−１42蛋
白質がトランスフェクトされたＣＯＳ細胞により合成されるを示した(図５、パ ネルＢ)。更に、ＭＳＰ−１42は、トランスフェクトされたＣＯＳの上清中で検 出されたが、これは、ＭＳＰ−１42蛋白質が分泌もされることを示している。更
に、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いて、ＭＳＰ−１42を、ＧＴＣ６２７トランスフェ
クトされたＣＯＳ上清からアフィニティー精製した。
【００２９】 これらの結果は、寄生虫のＭＳＰ−１42遺伝子の改変がＣＯＳ細胞におけるＭ
ＳＰｍＲＮＡの発現へと導くことを示した。従って、ＭＳＰ−１42産物は、哺乳
動物細胞により合成されて分泌された。
ＳＰｍＲＮＡの発現へと導くことを示した。従って、ＭＳＰ−１42産物は、哺乳
動物細胞により合成されて分泌された。
【００３０】 この実験で用いたポリクローナル抗体は又、当分野で周知の手段によっても調
製することができる(Antibodies: A Laboratory Manual,Ed Harlow及びDavid La
ne編、Cold Spring Harbor Laboratory,publishers(1988))。ＭＳＰ血清抗体の 生成も又、Chang等,Infection and Immunity(1996)64:253-261及びChang等,(199
2)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6343-6347に記載されている。
製することができる(Antibodies: A Laboratory Manual,Ed Harlow及びDavid La
ne編、Cold Spring Harbor Laboratory,publishers(1988))。ＭＳＰ血清抗体の 生成も又、Chang等,Infection and Immunity(1996)64:253-261及びChang等,(199
2)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6343-6347に記載されている。
【００３１】 この分析の結果は、この発明の改変されたＭＳＰ−１42核酸が、天然の蛋白質
(全く発現されなかった)と比べて非常に高レベルで発現されることを示している
。これらの結果は、遺伝子中のＡＴ％を減じることが異種システムにおけるＭＳ
Ｐ遺伝子の発現に導くという第一の実験的証拠を示しており、ＭＳＰコード領域
からのＡＵＵＵＡｍＲＮＡ不安定性モチーフの除去がＣＯＳ細胞におけるＭＳＰ
蛋白質の発現を導くという第一の証拠もを示している。図５、パネルＡのノーザ
ンに示した結果(即ち、天然の遺伝子ではＲＮＡは検出されず、この発明による 改変されたＤＮＡ配列では、妥当なレベルのＲＮＡが検出された)は、蛋白質生 成の増加をもっともらしく説明する。
(全く発現されなかった)と比べて非常に高レベルで発現されることを示している
。これらの結果は、遺伝子中のＡＴ％を減じることが異種システムにおけるＭＳ
Ｐ遺伝子の発現に導くという第一の実験的証拠を示しており、ＭＳＰコード領域
からのＡＵＵＵＡｍＲＮＡ不安定性モチーフの除去がＣＯＳ細胞におけるＭＳＰ
蛋白質の発現を導くという第一の証拠もを示している。図５、パネルＡのノーザ
ンに示した結果(即ち、天然の遺伝子ではＲＮＡは検出されず、この発明による 改変されたＤＮＡ配列では、妥当なレベルのＲＮＡが検出された)は、蛋白質生 成の増加をもっともらしく説明する。
【００３２】 下記の実施例は、トランスジェニックマウスの乳汁中の自然のままの非融合蛋
白質としての(且つグリコシル化されてない)ＭＳＰ１−４２の発現を説明する。
白質としての(且つグリコシル化されてない)ＭＳＰ１−４２の発現を説明する。
【００３３】 ＭＳＰトランスジーンの構築 ＭＳＰ１−４２を１５アミノ酸のβ−カゼインシグナルペプチドに融合させる
ために、１５アミノ酸のカゼインシグナル及びＣｌａＩ部位で終わるＭＳＰ１−
４２の最初の５アミノ酸をコードするオリゴＭＳＰ２０３及びＭＳＰ２０４の対
(ＭＳＰ２０３：ggccgctcgacgccaccatgaaggtcctcataattgcctgtctggtggctctggcca
ttgcagccgtcactccctccgtcat、ＭＳＰ２０４：cgatgacggagggagtgacggctgcaatggc
cagagccaccagacaggcaattatgaggaccttcatggtggcgtcgagc)を、ＭＳＰ１−４２遺伝
子の残りをコードするＢＣ６２０(図８)のＣｌａＩ−ＸｈｏＩ断片と共に、発現
ベクターｐＣＤＮＡ３のＸｈｏＩ部位に連結した。このプラスミド(ＧＴＣ６６ ９)のＸｈｏＩ断片を、次いで、乳特異的発現ベクターＢＣ３５０のＸｈｏＩ部 位にクローン化して、Ｂ６７０(図９)を生成した。
ために、１５アミノ酸のカゼインシグナル及びＣｌａＩ部位で終わるＭＳＰ１−
４２の最初の５アミノ酸をコードするオリゴＭＳＰ２０３及びＭＳＰ２０４の対
(ＭＳＰ２０３：ggccgctcgacgccaccatgaaggtcctcataattgcctgtctggtggctctggcca
ttgcagccgtcactccctccgtcat、ＭＳＰ２０４：cgatgacggagggagtgacggctgcaatggc
cagagccaccagacaggcaattatgaggaccttcatggtggcgtcgagc)を、ＭＳＰ１−４２遺伝
子の残りをコードするＢＣ６２０(図８)のＣｌａＩ−ＸｈｏＩ断片と共に、発現
ベクターｐＣＤＮＡ３のＸｈｏＩ部位に連結した。このプラスミド(ＧＴＣ６６ ９)のＸｈｏＩ断片を、次いで、乳特異的発現ベクターＢＣ３５０のＸｈｏＩ部 位にクローン化して、Ｂ６７０(図９)を生成した。
【００３４】 トランスジェニックマウスの乳汁中でのＭＳＰ１−４２の発現 ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片をプラスミドＢＣ６７０から調製し、マウス胚にマイ
クロインジェクションしてトランスジェニックマウスを生成した。トランスジェ
ニックマウスを、マウスのＤＮＡを尾のバイオプシーから抽出した後にオリゴＧ
ＴＣ１７及びＭＳＰ１０１を用いるＰＣＲ分析により同定した(オリゴＧＴＣ１ ７の配列：GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC、オリゴＭＳＰ１０１、GGATTCAATAGAT
ACGG)。雌の創出トランスジェニックマウスの乳汁を、泌乳の７日目及び９日目 に集め、ポリクローナル抗ＭＳＰ抗体及びモノクローナル抗ＭＳＰ抗体５．２( ＮＩＨ、David Kaslow博士)を用いるウエスタン分析にかけて、ＭＳＰ−１−４ ２の発現レベルを測定した。結果は、トランスジェニックマウスの乳汁中のＭＳ
Ｐ−１−４２の発現レベルが１〜２ｍｇ／ｍｌであることを示した(図１０)。
クロインジェクションしてトランスジェニックマウスを生成した。トランスジェ
ニックマウスを、マウスのＤＮＡを尾のバイオプシーから抽出した後にオリゴＧ
ＴＣ１７及びＭＳＰ１０１を用いるＰＣＲ分析により同定した(オリゴＧＴＣ１ ７の配列：GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC、オリゴＭＳＰ１０１、GGATTCAATAGAT
ACGG)。雌の創出トランスジェニックマウスの乳汁を、泌乳の７日目及び９日目 に集め、ポリクローナル抗ＭＳＰ抗体及びモノクローナル抗ＭＳＰ抗体５．２( ＮＩＨ、David Kaslow博士)を用いるウエスタン分析にかけて、ＭＳＰ−１−４ ２の発現レベルを測定した。結果は、トランスジェニックマウスの乳汁中のＭＳ
Ｐ−１−４２の発現レベルが１〜２ｍｇ／ｍｌであることを示した(図１０)。
【００３５】 ＭＳＰ１−４２グリコシル化部位欠如変異体の構築 乳汁中に産生されたＭＳＰの我々の分析は、このトランスジェニックＭＳＰ蛋
白質がＮグリコシル化されることを示した。ＭＳＰ１−４２遺伝子中のＮグリコ
シル化部位を除去するために、１８１位及び２６２位のＡｓｎ(Ｎ)をＧｌｎ(Ｑ)
で置換した。これらの置換を、ＭＳＰ１の対応領域にアニールし且つＡＡＣから
ＣＡＧへの突然変異を担うＤＮＡオリゴをデザインすることにより導入した。こ
れらのオリゴを、次いで、ＰＣＲプライマーとして用いて、ＮからＱへの置換を
コードするＤＮＡ断片を生成した。
白質がＮグリコシル化されることを示した。ＭＳＰ１−４２遺伝子中のＮグリコ
シル化部位を除去するために、１８１位及び２６２位のＡｓｎ(Ｎ)をＧｌｎ(Ｑ)
で置換した。これらの置換を、ＭＳＰ１の対応領域にアニールし且つＡＡＣから
ＣＡＧへの突然変異を担うＤＮＡオリゴをデザインすることにより導入した。こ
れらのオリゴを、次いで、ＰＣＲプライマーとして用いて、ＮからＱへの置換を
コードするＤＮＡ断片を生成した。
【００３６】 Ｎ２６２−Ｑ突然変異を導入するために、オリゴＭＳＰＧＹＬＹＣＯ−３(CAG
GGAATGCTGCAGATCAGC)及びＭＳＰ４２−２(AATTCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATC
GCAGAAAATACCATG、図１１)の対を用いて、合成のＭＳＰ１−４２遺伝子を含むプ
ラスミドＧＴＣ６２７をＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ２．１ベ
クター(Invitrogen)中にクローン化した。これは、プラスミドＧＴＣ７１６を生
成した。
GGAATGCTGCAGATCAGC)及びＭＳＰ４２−２(AATTCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATC
GCAGAAAATACCATG、図１１)の対を用いて、合成のＭＳＰ１−４２遺伝子を含むプ
ラスミドＧＴＣ６２７をＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ２．１ベ
クター(Invitrogen)中にクローン化した。これは、プラスミドＧＴＣ７１６を生
成した。
【００３７】 Ｎ１８１−Ｑ突然変異を導入するために、オリゴＭＳＰＧＬＹＣＯ−１(CTCCT
TGTTCAGGAACTTGTAGGG)及びＭＳＰＧＬＣＯ−２(GTCCTGCAGTACACATATGAG、図４) を用いて、プラスミドＧＴＣ６２７を増幅した。このＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ２
．１中にクローン化した。これは、プラスミドＧＴＣ７００を生成した。
TGTTCAGGAACTTGTAGGG)及びＭＳＰＧＬＣＯ−２(GTCCTGCAGTACACATATGAG、図４) を用いて、プラスミドＧＴＣ６２７を増幅した。このＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ２
．１中にクローン化した。これは、プラスミドＧＴＣ７００を生成した。
【００３８】 ＭＳＰ二重グリコシル化変異体を、次の３ステップにより構築した：第一に、
ＢＣ６７０のＸｈｏＩ−ＢｓｍＩ断片とＧＴＣ７１６のＢｓｍＩ−ＸｈｏＩ断片
をベクターｐＣＲ２．１のＸｈｏＩ部位に連結する。これは、Ｎ２６２−Ｑ突然
変異を有するＭＳＰ−１−４２遺伝子を含むプラスミドを生じた。次いで、この
プラスミドのＥｃｏＮＩ−ＮｄｅＩ断片をプラスミドＧＴＣ７１６からのＥｃｏ
ＮＩ−ＮｄｅＩ断片により置換して第二の突然変異Ｎ１８１−Ｑを導入した。こ
のプラスミドのＸｈｏＩ断片を、最後に、ＢＣ３５０中にクローン化してＢＣ７
１８(図１２)を生成した。
ＢＣ６７０のＸｈｏＩ−ＢｓｍＩ断片とＧＴＣ７１６のＢｓｍＩ−ＸｈｏＩ断片
をベクターｐＣＲ２．１のＸｈｏＩ部位に連結する。これは、Ｎ２６２−Ｑ突然
変異を有するＭＳＰ−１−４２遺伝子を含むプラスミドを生じた。次いで、この
プラスミドのＥｃｏＮＩ−ＮｄｅＩ断片をプラスミドＧＴＣ７１６からのＥｃｏ
ＮＩ−ＮｄｅＩ断片により置換して第二の突然変異Ｎ１８１−Ｑを導入した。こ
のプラスミドのＸｈｏＩ断片を、最後に、ＢＣ３５０中にクローン化してＢＣ７
１８(図１２)を生成した。
【００３９】 非グリコシル化ＭＳＰ−１のトランスジェニック発現 ＢＣ７１８は、次の特徴を有している：それは、ＭＳＰ１−４２遺伝子をβ−
カゼインプロモーターの制御下に、それがトランスジェニック動物の乳腺におい
て泌乳中発現され得るように有している。更に、それは、Ｎ末端に何らの更なる
アミノ酸も有しないＭＳＰ１−４２が乳汁中に分泌され得るように、ＭＳＰ１−
４２に直接融合された１５アミノ酸のβ−カゼインリーダー配列をコードする。
最後に、Ｎ−Ｑ置換のために、この構築物によりトランスジェニック動物の乳汁
中に生成されたＭＳＰは、Ｎ末端グリコシル化されない。まとめると、ＢＣ７１
８により乳汁中に生成されたトランスジェニックＭＳＰは、寄生虫のＭＳＰと同
じである。
カゼインプロモーターの制御下に、それがトランスジェニック動物の乳腺におい
て泌乳中発現され得るように有している。更に、それは、Ｎ末端に何らの更なる
アミノ酸も有しないＭＳＰ１−４２が乳汁中に分泌され得るように、ＭＳＰ１−
４２に直接融合された１５アミノ酸のβ−カゼインリーダー配列をコードする。
最後に、Ｎ−Ｑ置換のために、この構築物によりトランスジェニック動物の乳汁
中に生成されたＭＳＰは、Ｎ末端グリコシル化されない。まとめると、ＢＣ７１
８により乳汁中に生成されたトランスジェニックＭＳＰは、寄生虫のＭＳＰと同
じである。
【００４０】 ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ断片をプラスミドＢＣ７１８から調製し、マウス胚にマイ
クロインジェクションしてトランスジェニックマウスを生成した。トランスジェ
ニック動物を、前に記載されたように同定した。雌の創出動物の乳汁を集めて、
抗体５．２を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。図１３に示した
結果は、非グリコシル化ＭＳＰ１の濃度０．５〜１ｍｇ／ｍｌでの発現を示して
いる。
クロインジェクションしてトランスジェニックマウスを生成した。トランスジェ
ニック動物を、前に記載されたように同定した。雌の創出動物の乳汁を集めて、
抗体５．２を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。図１３に示した
結果は、非グリコシル化ＭＳＰ１の濃度０．５〜１ｍｇ／ｍｌでの発現を示して
いる。
【図１】 この発明により改変したＭＳＰ−１42のｃＤＮＡ配列[SEQ ID NO:１](３０６ のヌクレオチド位置が置換されてＡＴ含量が低下されており、ＭＳＰ−１42の同
じ蛋白質アミノ酸配列を維持しつつｍＲＮＡ不安定性モチーフが排除されている
)を描いた図である。大文字は、ヌクレオチド置換を示している。
じ蛋白質アミノ酸配列を維持しつつｍＲＮＡ不安定性モチーフが排除されている
)を描いた図である。大文字は、ヌクレオチド置換を示している。
【図２】 「野生型」又は自然のままのＭＳＰ−１42[SEQ ID NO:２]の配列をコードする
ヌクレオチド配列を描いた図である。
ヌクレオチド配列を描いた図である。
【図３】 野生型ＭＳＰ−１42(表中で「ＭＳＰｗｔ」で示した)及び新たな改変したＭＳ
Ｐ−１42遺伝子(表中で「編集されたＭＳＰ」で示した)及び幾つかの乳蛋白質遺
伝子(ヤギ及びマウス由来のカゼイン遺伝子)についてのコドン利用表である。各
欄内の数値は、特定のコドンが列記した各遺伝子において現れる実際の回数を示
している。この新たなＭＳＰ−１42合成遺伝子は、乳特異的なコドン利用量から
、所定のアミノ酸のＧＣリッチなコドンを第一に選択する(乳蛋白質において最 も頻繁に利用されているアミノ酸を選択することと組み合わせる)ことにより導 かれた。
Ｐ−１42遺伝子(表中で「編集されたＭＳＰ」で示した)及び幾つかの乳蛋白質遺
伝子(ヤギ及びマウス由来のカゼイン遺伝子)についてのコドン利用表である。各
欄内の数値は、特定のコドンが列記した各遺伝子において現れる実際の回数を示
している。この新たなＭＳＰ−１42合成遺伝子は、乳特異的なコドン利用量から
、所定のアミノ酸のＧＣリッチなコドンを第一に選択する(乳蛋白質において最 も頻繁に利用されているアミノ酸を選択することと組み合わせる)ことにより導 かれた。
【図４】 図４ａ−ｃ ＭＳＰ−１42構築物ＧＴＣ４７９、ＧＴＣ５６４及びＧＴＣ６２７(それぞれ 、実施例に記載されている)を描いた図である。
【図５】 パネルＡ 構築物ＧＴＣ６２７がこの発明により改変された新たなＭＳＰ−１42遺伝子を
含み、ＧＴＣ４７９が自然のままのＭＳＰ−１42遺伝子を含む構築物であり且つ
構築物ＧＴＣ４６９が負の対照用ＤＮＡであるノーザン分析である。 パネルＢ アフィニティー精製後の溶出画分のウエスタン分析である。数字は、採取した
画分である。これらの結果は、ＧＴＣ６７９(改変されたＭＳＰ−１42合成遺伝 子構築物)からの画分がＭＳＰ−１に対するポリクローナル抗体と反応したが、 負の対照のＧＴＣ４７９は反応しなかったことを示している。
含み、ＧＴＣ４７９が自然のままのＭＳＰ−１42遺伝子を含む構築物であり且つ
構築物ＧＴＣ４６９が負の対照用ＤＮＡであるノーザン分析である。 パネルＢ アフィニティー精製後の溶出画分のウエスタン分析である。数字は、採取した
画分である。これらの結果は、ＧＴＣ６７９(改変されたＭＳＰ−１42合成遺伝 子構築物)からの画分がＭＳＰ−１に対するポリクローナル抗体と反応したが、 負の対照のＧＴＣ４７９は反応しなかったことを示している。
【図６】 実施例に記載したＯＴ１[SEQ ID NO:３]、ＯＴ２[SEQ ID NO:４]、ＭＳＰ−８
[SEQ ID NO:５]ＭＳＰ−２[SEQ ID NO:６]及びＭＳＰ１[SEQ ID NO:７]の核酸配
列を描いた図である。
[SEQ ID NO:５]ＭＳＰ−２[SEQ ID NO:６]及びＭＳＰ１[SEQ ID NO:７]の核酸配
列を描いた図である。
【図７】 プラスミドＢＣ５７４の略図である。
【図８】 ＢＣ６２０の略図である。
【図９】 ＢＣ６７０の略図である。
【図１０】 トランスジェニック乳汁中のＭＳＰのウエスタンブロットの表示である。
【図１１】 ＭＳＰ４２−２のヌクレオチド配列[SEQ ID NO:８]の略図である。
【図１２】 ＢＣ−７１８の略図である。
【図１３】 トランスジェニック乳汁におけるＢＣ−７１８の発現のウエスタンブロットの
表示である。
表示である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/445 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハリー ミード アメリカ合衆国 01720 マサチューセッ ツ、ニュートン、グラースメア ストリー ト 62
Claims (8)
- 【請求項１】 SEQ ID NO:１に示した改変されたＭＳＰ−１核酸配列。
- 【請求項２】 ＭＳＰ−１をコードする天然遺伝子の全体的ＡＴ含量を低下
させるステップ、すべてのｍＲＮＡ不安定性モチーフを除去するステップ及びす
べての希なコドンをマウスの乳腺の好適コドンで置換するステップを含む改変さ
れたＭＳＰ−１核酸の製造方法。 - 【請求項３】 請求項２に記載の方法により製造された改変されたＭＳＰ−
１核酸。 - 【請求項４】 請求項１に記載の改変されたＭＳＰ−１核酸及びヤギベータ
カゼインプロモーター及びシグナル配列を含むベクター。 - 【請求項５】 請求項４に記載のベクターでトランスフォームされた宿主細
胞。 - 【請求項６】 請求項４に記載のベクターを含むトランスジェニック非ヒト
哺乳動物。 - 【請求項７】 請求項１に記載の改変されたＭＳＰ−１核酸を含むトランス
ジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項８】 請求項１に記載の改変された核酸を含むＤＮＡワクチン。
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| JP2000517086A Pending JP2001520041A (ja) | 1997-10-20 | 1998-10-20 | 新規な改変核酸配列並びに細胞システムにおいてｍＲＮＡレベル及び蛋白質発現を増大させる方法 |
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