KR19990022521A - L-리신의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 코리네형 세균내에서, L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제를 보존 유지하고, 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA, 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 DNA, 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 DNA 및 디아미노피멜산디하이드로게나제를 암호화하는 DNA를 순차 증강시킴에 의해, L-리신 생산 능력 및 생산 속도를 향상시키는 것에 관한 것이다.

Description

L-리신의 제조 방법
사료첨가물로서 사용되고 있는 L-리신은 통상, 코리네형 세균의 L-리신 생산 변이주를 이용하여 발효법에 의해 생산되고 있다. 현재 공지되어 있는 여러가지의 L-리신 생산균은 코리네형 세균의 야생주의 인공 변이에 의해 만들어지고 있다.
한편, 코리네형 세균에 있어서, 균체내에서 자율증식 가능하고 또한, 약제내성 표지 유전자를 가지는 벡터 플라스미드(미국특허 제4514502호 참조), 유전자의 균체로의 도입 방법(일본 특허공개 평2-207791호 등)이 개시되어 있고, 이들의 기술을 사용한 L-트레오닌 또는 L-이소로이신 생산균 육성의 가능성이 개시되어 있다(미국 특허 제4452890호 및 미국특허 제4442208호 참조). 또한, L-리신 생산균 육성에 관해서도, 벡터 플라스미드에 L-리신 생합성에 관여하는 유전자를 도입하고, 균체내에서 증폭시키는 기술(일본 특허공개 소56-160997호 등이 있다)이 공지되어 있다.
L-리신 생합성 유전자로서는, 예를들면, 디하이드로디피콜린산 리덕타제 유전자(일본 특허공개 평 7-75578)나 디아미노피멜산 디하이드로게나제 유전자(Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917(1987))와 같이, L-리신 생합성에 관여하는 유전자를 클로닝한 예나, 포스포에놀피루브산 카르복실라아제 유전자(일본 특허공개.소 60-87788), 디하이드로디피콜린산 신타제 유전자(일본 특허공고 평 6-55149), 디아미노피멜산 데카르복실라제 유전자(일본 특허공개 소 60-62994)와 같이, 유전자의 증폭이 L-리신 생산성에 영향을 주는 예가 공지되어 있다.
또한, L-리신 생합성에 관여하는 효소중, 야생형으로는 피이드 백 저해를 받는 효소에 대하여, 피이드 백 저해가 해제된 변이를 가지는 효소 유전자를 도입하여 L-리신 생산성을 향상시킨 예도 공지되어 있다. 이러한 유전자로서 구체적으로는, 아스파르토키나제 유전자(WO94/25605 국제공개 팜플렛) 등이 공지되어 있다.
상기한 바와 같이, L-리신 생합성 유전자의 증폭, 혹은 변이 유전자의 도입에 의해서, 일정한 성과가 얻어지고 있다. 예를들면, 리신 및 스레오닌에 의한 협력 저해가 해제된 변이형 아스파르토키나제 유전자를 보유하는 코리네형 세균은, L-리신의 현저한 량(약 25g/L)을 생산한다. 단, 해당 세균은, 변이형 아스파르토키나제 유전자를 보유하지 않는 세균과 비교하여 생육 속도가 저하된다. 또한, 변이형 아스파르토키나제 유전자에 추가하여, 또한 디하이드로디피콜린산 신타제 유전자를 도입함으로써 L-리신 생산성이 향상한다는 보고(Applied and Environmental Microbiology 57(6), 1746-1752(1991))도 있다. 그러나, 해당 세균은, 생육 속도가 한층 더 저하한다.
한편, 디하이드로디피콜린산 리덕타제 유전자에 관여하는, 이것을 도입한 코리네형 세균의 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성이 상승한 것은 나타나고 있지만, L-리신 생산성에의 영향에 관여하는 보고되어 있지 않다(일본 특허공개 평 7-75578).
또한, 코리네형 세균에 있어서는, L-리신 생합성 유전자를 여러개 조합하여, 생육을 억제하지 않고서 L-리신 수율의 대폭적인 개선에 성공한 예는 공지되어 있지 않은 것이 현 상황이다. 또한, L-리신 생합성 유전자의 증강에 의해 생육의 개선이 도모된 예도 보고되어 있지 않다.
본 발명은 아미노산 등의 발효 생산에 사용되고 있는 코리네형 세균에 유전자 조작 방법을 사용하여 개량 변이을 행하고, 해당 미생물을 배양함에 의한 L-리신의 제조 방법에 관한 것이다.
도 1은 변이형 lysC를 가지는 플러스미드 p399AK9B 및 p399AKYB 구축의 과정을 도시한 도면이다.
도 2는 dapB 및 Brevi.-ori를 가지는 플러스미드 pDPRB의 구축의 과정을 도시한 도면이다.
도 3은 dapA 및 Brevi.-ori를 가지는 플러스미드 pDPSB의 구축의 과정을 도시한 도면이다.
도 4는 lysA를 가지는 플러스미드 p299LYSA의 구축의 과정을 도시한 도면이다.
도 5는 lysA 및 Brevi.-ori를 가지는 플러스미드 pLYSAB의 구축의 과정을 도시한 도면이다.
도 6은 ddh 및 Brevi.-ori를 가지는 플러스미드 pPK4D의 구축의 과정을 도시한 도면이다.
도 7은 lysC, dapB 및 Brevi.-ori를 가지는 플러스미드 pCRCAB의 구축의 과정을 도시한 도면이다.
도 8은 변이형 lysC, dapB 및 Brevi.-ori를 가지는 플러스미드 pCB의 구축의 과정을 도시한 도면이다.
도 9는 dapA, dapB 및 Brevi.-ori를 가지는 플러스미드 pAB의 구축의 과정의 과정을 도시한 도면이다.
도 10은 ddh 및 lysA를 가지는 플러스미드 p399DL의 구축의 과정을 도시한 도면이다.
도 11은 ddh, lysA 및 Brevi.-ori를 가지는 플러스미드 pDL의 구축의 과정을 도시한 도면이다.
도 12는 변이형 lysC, dapA, dapB 및 Brevi.-ori를 가지는 플러스미드 pCAB의 구축의 과정을 도시한 도면이다.
도 13은 변이형 lysC, dapA, dapB, lysA 및 Brevi.-ori를 가지는 플러스미드 pCABL의 구축의 과정을 도시한 도면이다.
도 14는 변이형 lysC, dapA, dapB, ddh, lysA 및 Brevi.-ori를 가지는 플러스미드 pCABDL의 구축의 과정을 도시한 도면이다.
본 발명의 목적은, 코리네형 세균의 세포중의 L-리신 생합성의 중요한 효소인 아스파르토키나제(이하 「AK」라고도 하며, AK 단백질을 암호화하는 유전자를 이하 「lysC」라고도 한다), 디하이드로디피콜린산 리덕타제(이하-「DDPR」이라고도 하며 DDPR 단백질을 암호화하는 유전자를 이하 「dapB」라고도 한다), 디하이드로디피콜린산 신타제(이하, 「DDPS」로 약술하며, DDPS 단백질을 암호화하는 유전자를 이하 「dapA」라고도 한다), 디아미노피멜산 데카르복실라제(이하 「DDC」라고도 하며, DDC 단백질을 암호화하는 유전자를 이하 「lysA」라고도 한다), 및 디아모니피멜산 디하이드로게나제(이하, 「DDH」라고도 하며, DDH 단백질을 암호화하는 유전자를 이하 「ddh」라고도 한다)의 각각을 암호화하는 DNA 서열을 유전자 재료에 사용하고, 코리네형 세균의 L-리신 생산 능력 및 생육 속도를 개선하려고 하는 것이다.
미생물을 사용한 물질의 발효 생산을 하는 경우, 투입한 원료에 대한 목적물질의 수율과 더불어, 생산 속도는 극히 중요한 인자이고, 설비당 생산 속도를 올림에 의해 목적 물질을 대폭 염가로 제조하는 것이 가능하다. 그 때문에, 발효 수율과 생산 속도를 양립시키는 것은 공업적으로 극히 중요하다. 본 발명은 코리네형 세균을 사용한 L-리신의 발효 생산을 행하는데 있어서, 이상과 같은 문제점의 해결방법을 제시하는 것이다.
본 발명의 요지는, 코리네형 세균에 있어서, 리신 및 스레오닌에 의한 협력저해가 해제된 변이형 AK(이하, 단지 「변이형 AK」라고도 한다)를 암호화하는 변이형 lysC(이하, 단지 「변이형 lysC」라고도 한다.)에 dapB를 조합시켜 증강함에 의해, lysC를 단독으로 증강한 경우와 비교하여, 생육이 개선되고, L-리신 생산 속도를 향상시킬 수 있는 것, 또한 dapA, lysA, ddh를 순차 증강함에 의해, 단계적으로 L-리신 생산 속도를 향상할 수 있는 것에 있다.
즉, 본 발명은 L-리신 및 L-스레오닌에 의한 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제를 암호화하는 DNA 서열, 및 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA 서열을 포함하며, 코리네형 세균 세포속에서 자율증식 가능한 재조합 DNA에 관한 것이다. 또한, 상기 각 DNA 서열에 추가하여 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 DNA 서열을 또한 포함하는 재조합 DNA를 제공한다. 또한, 상기 3종의 DNA 서열에 덧붙여 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 DNA 서열을 또한 포함하는 재조합 DNA를 제공한다. 또한 다시, 상기 4종의 DNA 서열에 덧붙여 디아미노피멜산 디하이드로게나제를 암호화하는 DNA 서열을 또한 포함하는 재조합 DNA를 제공한다.
또한, 본 발명은, L-리신 및 L-스레오닌에 의한 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제를 보존 유지하고, 또한 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA가 증강된 코리네형 세균을 제공한다. 또한, 본 발명은 이 코리네형 세균에 있어서, 또한 본 발명은 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 DNA가 증강된 코리네형 세균을 제공한다. 그리고 또한, 이 코리네형 세균에 있어서, 상기의 3종의 DNA에 덧붙여 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 DNA가 증강된 코리네형 세균을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 코리네형 세균에 있어서, 상기의 4종의 DNA에 덧붙여, 디아미노피멜산 디하이드로게나제를 암호화하는 DNA가 증강된 코리네형 세균을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 코리네형 세균중 하나를 적합한 배지에서 배양하고, 해당 배양물중에 L-리신을 생산 축적시키도록 하여, 해당 배양물로부터 L-리신을 수집하는 것을 특징으로 하는 L-리신의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명에 있어서 코리네형 세균이란, 버지즈 매뉴얼 오브 디터미네이티브 박테리오로지(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology) 제8판 599페이지(1974)에 정의되어 있는 1군의 미생물이고, 호기성, 그람 양성, 비항산성, 포자 형성 능력을 가지지 않는 간균이고, 코리네박테리움속 세균, 및 종래 브레비박테리움속으로 분류되어 있지만, 현재 코리네박테리움속 세균으로서 통합된 브레비박테리움속 세균, 또한 코리네박테리움속 세균과 매우 근연인 브레비박테리움속 세균을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1 본 발명에 사용되는 L-리신 생합성 유전자의 제조
본 발명에 사용되는 L-리신 생합성 유전자는, DNA 공여체인 세균으로부터 염색체 DNA를 제조하고, 플러스미드 벡터 등을 사용하여 염색체 DNA 라이브러리를 작제하고, 이 라이브러리로부터 원하는 유전자를 보유하는 균주를 선택하고, 선택된 균주로부터 그 유전자를 삽입된 재조합 DNA를 회수함으로써 수득된다. 본 발명에 사용하는 L-리신 생합성 유전자의 DNA 공여체로서는, 원하는 L-리신 생합성 유전자가 코리네형 세균 세포속에서 기능하는 효소 단백질을 발현하는 것이면, 특히 제한되지 않지만, 코리네형 세균이 바람직하다.
코리네형 세균 유래의 lysC, dapA 및 dapB 유전자는, 어느것이나 서열이 공지되어 있기 때문에, 폴리머라제 쇄 반응법(PCR : polymerase chain reaction ; White, T.J. et al ; Trends Genet. 5, 185(1989) 참조)에 의해서 증폭함에 의해 취득할 수 있다.
이하에, 본 발명에 사용하는 각 L-리신 생합성 유전자를 수득하는 방법을 예시한다.
(1) 변이형 lysC의 수득
변이형 lysC를 포함하는 DNA 단편은 AK 활성에 대하는 L-리신 및 L-스레오닌에 의한 상승적인 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 변이주로부터 제조할 수 있다(WO94/25605 국제공개 팜플렛). 이러한 변이주는, 예를들면, 코리네형 세균 야생주에, 통상의 변이 처리법, 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘(NTG) 등의 변이제 처리를 시행하고, 변이 처리한 세포군중에서 수득할 수 있다. AK 활성의 측정은 문헌[참조 : Miyajima, R et al ; The Journal of Biochemistry(1968), 63(2), 139-148]에 기재되는 방법을 사용할 수 있다. 이러한 변이주로서, 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) 야생주 ATCC 13869주(현재의 명칭은, 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)으로 변경되어 있다)로부터 변이 처리에 의해 유도된 L-리신 생산균 AJ3445(FERM P-1944)가 가장 바람직한 것으로서 들 수 있다.
또한, 변이형 lysC는, 야생형 lysC를 포함하는 플러스미드 DNA를 실험관내에서 변이 처리함에 의하여도 수득된다. 또한, AK의 L-리신 및 L-스레오닌에 의한 상승적인 피이드 백 저해를 해제하는 변이가 구체적으로 공지되어 있기(WO94/25605 국제공개 팜플렛) 때문에, 이 정보에 기초하여 부위 특이적 돌연변이 유발 등에 의해, 야생형 lysC로부터 제조하는 것도 가능하다.
코리네형 세균으로부터 lysC를 분리하기에는, 예를들면, 사이토 및 미우라의 방법(H.Saito and K.Miura Biochem. Biophys. Acta, 72. 619(1963)) 등에 의해 염색체 DNA를 조제하고, 폴리머라제 쇄 반응법(PCR : polymerase chain reaction ; White.T.J.et al. Trends Genet. 5, 185(1989) 참조)에 의해, lysC를 증폭함으로써 행할 수 있다.
DNA 프라이머로서는, 예를들면, 코리네박테리움 글루타미컴에 있어서 이미공지되어 있는 서열(Molecular Microbiology(1991), 5(5), 1197-1204, Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324 참조)를 기초로 하여, lysC를 암호화하는 약 1643bp의 영역을 증폭하기 위하여, 서열목록 1 및 서열 2에 나타내는 염기서열을 가지는 23-머 및 21-머의 일본쇄 DNA를 들 수 있다. DNA의 합성은 Applied Biosystems사제 DNA 합성기 모델 380B를 사용하여, 포스포아미다이트법을 사용하여(Tetrahedron Letters(1981), 22, 1859 참조) 일상법에 따라서 합성할 수 있다. PCR 반응은, 다까라슈조(주)제 DNA 서멀 사이클러 모델(DNA Thermal Cycler Model) PJ2000 형을 사용하여, Taq DNA 폴리머라제를 사용하여, 공급자에 의해 지정된 방법에 따라서 행할 수 있다.
PCR 법에 의해 증폭된 lysC는, 이. 콜라이(E. Coli) 및/또는 코리네형 세균의 세포내에서 자율복제 가능한 벡터 DNA에 연결하여 재조합 DNA를 제조하고, 이것을 이. 콜라이 세포에 도입하여 두면, 이후의 조작이 쉽게 된다. 이. 콜라이 세포내에서 자율복제 가능한 벡터로서는, 플러스미드 벡터가 바람직하고, 숙주의 세포내에서 자립복제 가능한 것이 바람직하고, 예를 들면 pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010 등을 들 수 있다.
또한, 이것들의 벡터에 코리네형 세균속에서 플러스미드가 자율복제 가능하게 하는 능력을 가지는 DNA 단편을 삽입하면, 이. 콜라이 및 코리네형 세균의 양쪽에서 자율복제 가능한 이른바 셔틀 벡터로서 사용할 수 있다.
이러한 셔틀 벡터로서는 이하의 것을 들 수 있다. 또한, 각각의 벡터를 보유하는 미생물 및 국제 기탁 기관의 기탁 번호를 괄호내에 나타내었다.
pHC4에스케리키아 콜라이 AJ12617(FERM BP-3522)
pAJ655에스케리키아 콜라이 AJ11882(FERM BP-136)
.코리네박테리움 글루타미컴 SR8201(ATCC 39135)
pAJ1844에스케리키아 콜라이 AJ11883(FERM BP-137)
.코리네박테리움 글루타미컴 SR8202(ATCC 39136)
pAJ611에스케리키아 콜라이 AJ11884(FERM BP-138)
pAJ3148코리네박테리움 글루타미컴 SR8203(ATCC 39137)
pAJ440바실러스 섭틸리스 AJ11901(FERM BP-140)
이들의 벡터는, 기탁 미생물로부터 다음과 같이 수득된다. 대수증식기에 모아진 세포를 라이소자임 및 SDS를 사용하여 용균하고, 30000×g에서 원심분리하여 용해물로부터 수득된 상등액에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여, 세슘 클로라이드-에티듐 브로마이드 평형 밀도 구배 원심분리에 의해 분별 정제한다.
E. coli에 플러스미드를 도입하고 형질전환하기 위해서는 D. M. Morrison의 방법(Methods in Enzymology, 68, 326,1979) 혹은 수용균 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증가시키는 방법(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol, Biol., 53, 159(1970)) 등에 의해 행할 수 있다.
상기한 바와 같이 하여 AK 야생주로부터 lysC를 단리하면 야생형 lysC가 수득되고, AK 변이주로부터 lysC를 단리하면 변이형 lysC가 수득된다.
야생형 lysC를 포함하는 DNA 단편의 염기서열의 일례를, 서열목록 서열 3에 나타낸다. 이 염기서열에서 추정되는 야생형 AK 단백질의 α 아단위의 아미노산 서열을 DNA 서열과 동시에 서열목록의 서열 4에, 아미노산 서열만을 서열 5에 나타낸다. 또한, DNA 염기서열로부터 추정되는 야생형 AK 단백질의 β 아단위의 아미노산 서열을 DNA와 동시에 서열목록의 서열 6에, 아미노산 서열만을 서열 7에 나타낸다. 또한, 각 아단위 모두, 개시코든에 GTG가 사용되고 있고, 대응하는 아미노산을 메티오닌으로 표기하고 있지만, 이것은, 메티오닌, 발린, 또는 포르밀 메티오닌을 나타내는 것이다.
본 발명에 사용하는 변이형 lysC로서는, L-리신 및 L-스레오닌에 의한 상승적인 피이드 백 저해가 해제된 AK를 암호화하는 것이면 특히 제한되지 않지만, 야생형 AK의 아미노산 서열에 있어서, α 아단위으로서는 N 말단에서 279번째의 알라닌 잔기가 알라닌 이외 또한 산성 아미노산 이외의 아미노산 잔기로, β 아단위에서는 30번째의 알라닌 잔기가 알라닌 이외 또한 산성 아미노산 이외의 아미노산 잔기로 변화하는 변이를 들 수 있다. 여기에서, 야생형 AK의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 α 아단위에서는 서열목록 서열 5에 나타내는 아미노산 서열이, β 아단위에서는 서열목록 서열 7에 나타내는 아미노산 서열을 들 수 있다.
또한, 상기의 알라닌 이외 또한 산성 아미노산 이외의 아미노산 잔기로서 바람직한 것은, 스레오닌 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 페닐알라닌 잔기, 프롤린 잔기, 세린 잔기, 티로신 잔기 및 발린 잔기를 들 수 있다.
또한, 치환되는 아미노산 잔기에 대응하는 코돈은, 그 아미노산 잔기를 암호화하는 것이면 종류는 특히 개의치 않는다. 또한, 균종이나 균주의 차이에 의해 유지되는 야생형 AK의 아미노산 서열이 약간 상이한 것이 있다고 예상된다. 이러한 효소의 활성에 관여하지 않는 1 또는 2이상 위치에서의 1 또는 2이상 아미노산 잔기의 치환, 결실 혹은 삽입 등에 의한 변이를 가지는 AK도 본 발명에 사용할 수 있다. 또한, AK 활성, 및 L-리신 및 L-스레오닌에 의한 상승적인 피이드 백 저해의 해제에 실질적으로 영향이 없는 한, 다른 1 또는 2이상의 아미노산의 치환, 결실 혹은 삽입 등에 의한 변이를 가지는 AK도 사용할 수 있다.
브레비박테리움 락토퍼멘텀 야생형주인 AJ12036(FERM BP-734)에 변이형 lysC 플러스미드 p399AK93을 도입한 균주 AJ12691은, 1992년 4월 10일에 통상 산업성 공업기술원 생명공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본국 이바라기겐 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 수탁번호 FERM P-12918로서 기탁되고, 1995년 2월 10일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁에 이관되고, FERM BP-4999의 수탁번호로 기탁되어 있다.
(2) dapB의 취득
dapB를 포함하는 DNA 단편은, 코리네형 세균염색체로부터 PCR에 의해 조제할 수 있다. DNA 공여균으로서는 특히 제한되지 않지만, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869 주를 들 수 있다.
DDPR를 암호화하는 DNA 서열은, 브레비박테리움 락토퍼멘텀에 있어서 이미 공지이고(Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749(1993)), 이것을 기초로 하여 PCR용 DNA 프라이머를 조제할 수 있다. 이러한 DNA 프라이머로서 구체적으로는, 서열목록의 서열 8 및 9에 기재된 염기서열을 가지는 각각 23mer의 DNA를 들 수 있다. DNA의 합성, PCR 반응, 수득된 dapB를 포함하는 플러스미드의 제조 등은, 상기의 lysC인 경우와 같이 하여 행할 수 있다.
dapB를 포함하는 DNA 단편의 염기서열 및 이 서열로부터 예상되는 아미노산 서열을 서열 10에 나타낸다. 또한, 아미노산 서열만을 서열 11에 나타낸다. 본 발명에는, 이 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편의 것 이외에, 서열 11에 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 즉, DDPR 활성에 실질적으로 영향이 없는 한, 1 또는 2 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입 등에 의한 변이를 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편도 마찬가지로 사용할 수 있다.
E. coli JM109 주에 후기 실시예에서 수득된 dapB를 포함하는 플러스미드 pCRDAPB를 도입하여 수득된 형질전환주 AJ13107주는, 1995년 5월 26일로부터 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본국 이바라기겐 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 수탁번호 FERM BP-5114의 수탁번호로, 부다페스트조약에 근거하여 국제기탁되어 있다.
(3) dapA의 취득
dapA를 포함하는 DNA 단편은, 코리네형 세균염색체로부터 PCR에 의해 제조할 수 있다. DNA 공여균으로서는 특히 제한되지 않지만, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869주를 들 수 있다.
DDPS를 암호화하는 DNA 서열은, 코리네박테리움 글루타미캄에 있어서 이미 공지이고(Nucleic Acids Research 18(21), 6421(1990), EMBL accession No. X53993 참조), 이것을 기초로 하여 PCR용 DNA 프라이머를 제조할 수 있다. 이러한 DNA 프라이머로서 구체적으로는, 서열목록의 서열 12 및 13에 기재된 염기서열을 가지는 각각 23mer의 DNA를 들 수 있다. DNA의 합성, PCR 반응, 수득된 dapA를 포함하는 플러스미드의 제조 등은, 상기의 lysC인 경우와 같이 하여 행할 수 있다.
dapA를 포함하는 DNA 단편의 염기서열 및 이 서열로부터 예상되는 아미노산 서열의 일례를 서열 14에 나타낸다. 또한, 아미노산 서열만을 서열 15에 나타낸다. 본 발명에는, 이 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편의 것 이외에, 서열 15에 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 즉 DDPS 활성에 실절적으로 영향이 없는 한, 1 또는 2이상 아미노산의 치환, 결실, 삽입 등에 의한 변이를 가지는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 단편도 마찬가지로 사용할 수 있다.
E. coli JM109 주에 후기 실시예에서 수득된 dapA를 포함하는 플러스미드 pCRDAPA를 도입하여 수득된 형질전환주 JM106주는, 1995년 5월 26일부터 통상산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본국 이바라기겐 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 수탁번호 FERM BP-5113의 수탁번호로, 부다페스트조약에 근거하여 국제기탁되어 있다.
(4) lysA 취득
lysA를 포함하는 DNA 단편은, 코리네형 세균염색체로부터 PCR에 의해 제조할 수 있다. DNA 공여균으로서는 특히 제한되지 않지만, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869주를 들 수 있다.
코리네형 세균에 있어서는, lysA는 argS(아르기닐-tRNA 신타제 유전자)와 함께 오페론을 형성하고 있고, argS의 하류에 lysA가 존재하고 있다. lysA의 발현은, argS의 상류에 있는 프로모터에 의해서 조절을 받는다(Journal of Bacteriology Nov., 7356-7362(1993) 참조). 이들의 유전자의 염기서열은, 코리네박테리움 글루타미캄에서 이미 공지이고(Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830(1990), Molecular and General Genetics 212, 112-119(1988) 참조), 이것을 기초로 하여 PCR용 DNA 프라이머를 제조할 수 있다. 이러한 DNA 프라이머로서 구체적으로는, 서열목록의 서열 16(Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830(1990)에 기재되어 있는 염기서열에 있어서 염기번호 11 내지 33에 상당한다) 및 서열 17(Molecular and General Genetics 212, 112-119(1988)에 기재된 염기서열에 있어서 염기번호 1370 내지 1392에 상당한다)에 나타내는 염기서열을 가지는 각각 23mer의 DNA 들 수 있다. DNA의 합성, PCR 반응, 수득된 lysA를 포함하는 플러스미드의 제조 등은, 상기의 lysC인 경우와 같이 하여 행할 수 있다.
후기 실시예에서는, lysA를 증강하기 위해서, 프로모터, argS 및 lysA를 포함하는 DNA 단편을 사용하였지만, argS는 본 발명에 필수적인 것은 아니며, lysA가 프로모터의 바로 아래에 연결된 DNA 단편을 이용해도 좋다.
argS 및 lysA를 포함하는 DNA 단편의 염기서열 및 이 서열이 암호화한다고 예상되는 아미노산 서열의 일례를 서열 18에 나타낸다. 또한, argS가 암호화하는 아미노산 서열의 일례를 서열 19에, lysA가 암호화하는 아미노산 서열의 일례를 서열 20에 나타낸다. 본 발명에는, 이 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편 이외에, 서열 20에 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 즉, DDC 활성에 실질적으로 영향이 없는 한, 1 또는 2이상 아미노산의 치환, 결실 혹은 삽입 등에 의한 변이를 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편도 마찬가지로 사용할 수 있다.
(5) ddh의 취득
ddh를 포함하는 DNA 단편은, 코리네형 세균염색체로부터 PCR에 의해 제조할 수 있다. DNA 공여균으로서는 특히 제한되지 않지만, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869주를 들 수 있다.
DDH 유전자는, 코리네박테리움 글루타미캄에서 이미 공지이고(Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917(1987)), 이것을 기초로 하여 PCR용 프라이머를 제조할 수 있다. 이러한 DNA 프라이머로서 구체적으로는, 서열목록의 서열 21 및 22에 기재된 염기서열을 가지는 각각 20mer의 DNA를 들 수 있다. DNA의 합성, PCR 반응, 수득된 ddh를 포함하는 플러스미드의 제조 등은, 상기의 lysC인 경우와 같이 하여 행할 수 있다.
ddh를 포함하는 DNA 단편의 염기서열 및 이 서열로부터 예상되는 아미노산 서열을 서열 23에 나타낸다. 또한, 아미노산 서열만을 서열 24에 나타낸다. 본 발명에는, 이 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편의 것 이외에, 서열 24에 나타내는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 즉 DDH 활성에 실질적으로 영향이 없는 한, 1 또는 2이상 아미노산의 치환, 결실 혹은 삽입 등에 의한 변이를 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편도 마찬가지로 사용할 수 있다.
2 본 발명의 재조합 DNA 및 코리네형 세균
본 발명의 코리네형 세균은, L-리신 및 L-스레오닌에 의한 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제(변이형 AK)를 보존 유지하고, 또한 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA(dapB)가 증강된 것이다. 본 발명의 코리네형 세균으로서 바람직한 태양은, 또한, 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 DNA(dapA)가 증강된 코리네형 세균이다. 본 발명의 코리네형 세균으로서 더욱 바람직한 태양은, 또한, 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 DNA(lysA)가 증강된 코리네형 세균이다. 본 발명의 코리네형 세균으로서 보다 바람직한 태양은, 또한, 디아미노피멜산 디하이드로게나제를 암호화하는 DNA(ddh)가 증강된 코리네형 세균이다.
여기에서 DNA를 「증강」한다는 것은, 유전자의 카피수를 높게하는 방법, 프로모터를 강력한 것을 사용하는 방법, 비례 활성이 높은 효소를 암호화하는 유전자를 사용하는 방법, 또는 이들을 조합시키는 등의 방법으로, 그 DNA에 의해 코드되는 효소의 세포중의 활성을 높게 하는 것을 말한다.
변이형 AK을 유지하는 코리네형 세균으로서는, 돌연변이에 의해서 변이형 아스파르토키나제를 생산하도록 되어진 것도 좋고, 또한, 변이형 lysC를 도입함으로써 형질전환된 것이라도 좋다.
상기 DNA를 도입하는 코리네형 세균의 예로서는, 예를 들면 다음과 같은 L-리신 생산성 야생주를 들 수 있다.
코리네박테리움 아세트아시드필름ATCC 13870
코리네박테리움 아세트글루타미쿰ATCC 15806
코리네박테리움 카루나에ATCC 15991
코리네박테리움 글루타미쿰ATCC 13032
(브레비박테리움 디바리카탐)ATCC 14020
(브레비박테리움 락토퍼멘텀)ATCC 13869
(코리네박테리움 리륨)ATCC 15990
(브레비박테리움 프라밤)ATCC 14067
코리네박테리움 메라세코라ATCC 17965
브레비박테리움 사카로리티쿰ATCC 14066
브레비박테리움 인마리오필름ATCC 14068
브레비박테리움 로제움ATCC 13825
브레비박테리움 티오게니타리스ATCC 19240
미크로박테리움 암모니아필람ATCC 15354
코리네박테리움 서모아미노게네스AJ12340(FERM BP-1539)
또한, 상기 균주 이외에도, 이들의 균주로부터 유도된 L-리신 생산능력을 가지는 변이주 등도, 숙주로서 이용할 수 있다. 이러한 인공변이주로서는 다음과 같은 것이 있다. S-(2-아미노에틸)-시스테인(이하, 「AEC」라고 약기한다) 내성 변이주(예를들면, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ11082(NRRL B-11470), 일본 특허공고 소 56-1914호, 일본 특허공고 소 56-1915호, 일본 특허공고 소 57-14157호, 일본 특허공고 소 57-14158호, 일본 특허공고 소 57-30474호, 일본 특허공고 소 58-10075호, 일본 특허공고 소 59-4993호, 일본 특허공고 소 61-35840호, 일본 특허공고 소 62-24074호, 일본 특허공고 소 62-36673호, 일본 특허공고 평 5-11958호, 일본 특허공고 평 7-12437호, 일본 특허공고 평 7-112438호 참조), 그 성장에 L-호모세린 등의 아미노산을 필요로 하는 변이주(일본 특허공고 소 48-28078호, 일본 특허공고 소 56-6499호), AEC에 내성을 나타내고, 또한 L-로이신, L-호모세린, L-프롤린, L-세린, L-아르기닌, L-알라닌, L-발린 등의 아미노산을 요구하는 변이주(미국 특허 제3708395호 및 제3825472호), DL-α-아미노-ε-카프로락탐, α-아미노-라우릴락탐, 아스파라긴산-아날로그, 설파제, 퀴노이드, N-라울로일 로이신에 내성을 나타내는 L-리신 생산 변이주, 옥잘로 아세트산 탈탄산 효소(데카르복실라제) 또는 호흡계 효소 저해제의 내성을 나타내는 L-리신 생산 변이주(일본 특허공개 소 50-53588호, 일본 특허공개 소 50-31093호, 일본 특허공개 소 52-102498호, 일본 특허공개 소 53-9394호, 일본 특허공개 소 53-86089호, 일본 특허공개 소 55-9783호, 일본 특허공개 소 55-9759호, 일본 특허공개 소 56-32995호, 일본 특허공개 소 56-39778호, 일본 특허공고 소 53-43591호, 일본 특허공고 소 53-1833호), 이노시톨 또는 아세트산을 요구하는 L-리신 생산변이주(일본 특허공개 소 55-9784호, 일본 특허공개 소 56-8692호), 플루오르 피루브산 또는 34℃ 이상 온도에 대하여 감수성을 나타내는 L-리신 생산 변이주(일본 특허공개 소 55-9783호, 일본 특허공개 소 53-86090호), 에틸렌 글리콜에 내성을 나타내고, L-리신을 생산하는 브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속의 생산 변이주(미국 특허 제4411997호).
상기한 바와 같은 숙주에 있어서 L-리신 생합성 유전자를 증강하기 위해서는, 구체적인 예로서는, 이들의 유전자를 플러스미드 벡터, 트랜스포좀, 파아지 벡터 등을 사용하여 숙주에 도입한다. 이 때, 저카피형의 벡터를 사용하여도 어느 정도의 증강은 기대할 수 있지만, 멀티카피형의 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 벡터로서, 상기 pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 및 pAJ440 등의 플러스미드 벡터를 들 수 있다. 또한, 코리네형 세균 유래의 트랜스포좀은, WOO2/02627 국제공개 팜플렛, WO93/18151 국제공개 팜플렛, 구라파 특허 공개 0445385호, 일본 특허공개 평 6-46867호, Vertes, A. A. et al., Mol. Microbiol., 11, 739-746(1994), Bonamy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571-581(1994), Vertes, A. A. et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397-405(1994), Jagar, W. et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6(1995), 일본 특허공개 평 7-107976호, 일본 특허공개 평 7-327680호 등에 기재되어 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 변이형 lysC는 반드시 증강되어 있을 필요는 없고, 상기한 것같이 염색체 DNA 상의 lysC에 변이를 가지는 것, 혹은 변이형 lysC가 염색체 DNA에 도입된 것이라도 좋지만, 플러스미드 벡터를 사용하여 도입되더라도 지장이 없다. 한편, dapA, dapB, lysA 및 ddh는, 효율이 좋고 L-리신을 생산시키기 위해서는 증강되어 있는 것이 바람직하다.
lysC, dapA, dapB, lysA 및 ddh의 각 유전자의 도입은, 각각 별개의 벡터를 사용하여 숙주에 순차 도입하여도 좋고, 단일의 벡터를 사용하여 2종류, 3종류, 4종류, 또는 5종류의 유전자를 동시에 도입하여도 좋다. 별개의 벡터를 사용하는 경우에는, 유전자의 도입의 순서는 묻지 않지만, 숙주에서의 안정한 분배 유지 기구를 가지고, 상호 공존 가능한 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.
변이형 AK를 유지하고, 또한 dapB가 증강된 코리네형 세균은, 예를 들면, 변이형 lysC, 및 dapB를 포함하며, 코리네형 세균 세포속에서 자율 증식 가능한 재조합 DNA를 숙주 코리네형 세균에 도입함으로써, 수득된다.
또한, 변이형 lysC 및 dapB에 추가하여, 또한, dapA가 증강된 코리네형 세균은, 예를 들면, 변이형 lysC, dapB 및 dapA를 포함하고, 코리네형 세균 세포속에서 자율 증식 가능한 재조합 DNA를 숙주 코리네형 세균에 도입함으로써 수득된다.
또한, 변이형 lysC, dapB 및 dapA에 추가하여, 또한, lysA가 증강된 코리네형 세균은, 예를 들면, 변이형 lysC, dapB, dapA 및 lysA를 포함하며, 코리네형 세균 세포속에서 자율 증식 가능한 재조합 DNA를 숙주 코리네형 세균에 도입함으로써 수득된다.
그리고 또한, 변이형 lysC, dapB, dapA 및 lysA에 가하여, 또한, ddh가 증강된 코리네형 세균은, 예를 들면, 변이형 lysC, dapB, dapA, lysA 및 ddh를 포함하며, 코리네형 세균 세포속에서 자율 증식 가능한 재조합 DNA를 숙주 코리네형 세균에 도입함으로써 수득된다.
상기한 바와 같이 재조합 DNA은, 예를 들면, 플러스미드 벡터, 트랜스포좀, 파아지 벡터 등의 벡터에, L-리신 생합성 유전자의 각각을 삽입함으로써 수득된다.
숙주에의 재조합 DNA의 도입 방법은, 플러스미드인 경우, 전기펄스법(스기모토 등, 일본 특허공개 평 2-207791호 공보)에 의해서 행할 수 있다. 트랜스포좀을 사용한 유전자의 증폭은, 플러스미드에 트랜스포좀을 탑재시켜 세포내에 도입하고, 트랜스포좀의 전위를 유도함에 의해 행할 수 있다.
3 L-리신의 제조 방법
상기한 바와 같이하여 L-리신 생합성 유전자가 증강된 코리네형 세균을 적합한 배지로 배양하고, 해당 배양물중에 L-리신을 생산 축적시키도록 하여, 해당 배양물로부터 L-리신을 채취함에 의해, L-리신을 효율좋게 제조할 수 있다.
사용하는 배지로서는, 탄소원, 질소원, 무기이온 및 필요에 따라 그 밖에 유기성분을 함유하는 통상의 배지를 들 수 있다.
탄소원에서는, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 당밀이나 전분의 가수분해물 등의 당류, 푸마르산, 구연산, 호박산 등의 유기산류를 사용할 수 있다.
질소원에서는 황산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄 등의 무기암모늄염, 가수분해물 등의 유기질소, 암모니아 가스, 암모니아수 등을 사용할 수 있다.
유기 미량 영양원으로서는, 비타민 B1, L-호모세린 등의 요구물질 또는 효모엑기스 등을 적량 함유시키는 것이 바람직하다. 이들의 이외에, 필요에 따라서 인산 칼륨, 황산 마그네슘, 철이온, 망간 이온 등이 소량 첨가된다.
배양은 호기적 조건하에서 30 내지 90시간 실시하는 것이 좋고, 배양 온도는 25℃ 내지 37℃로, 배양중 pH는 5 내지 8로 제어하는 것이 바람직하다. 또한, pH 조정에는 무기 혹은 유기의 산성 혹은 알칼리성 물질, 또한 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다. 배양물로부터의 L-리신의 채취는 통상의 이온교환 수지법, 침전법 그 밖의 공지의 방법을 조합시킴에 의해 실시할 수 있다.
이하에, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.
실시예 1 브레비박테리움 락토퍼멘텀 야생형 lysC 유전자 및 변이형 lysC 유전자의 취득
1 야생형 및 변이형 lysC의 취득, 및 그것들을 함유하는 플러스미드의 제작
브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869주, 및 ATCC 13869주에서 변이 처리에 의해 수득된 L-리신 생산성 변이주 AJ3445(FERM P-1944)를 염색체 DNA의 공여체로서 사용하였다. AJ3445주는 변이에 의해 lysC가 리신 및 스레오닌에 의한 협력 저해가 실질적으로 해제되어 있다(Journal of Biochemistry 68, 701-710(1970)).
염색체 DNA에서 PCR법(polymerase chain reaction ; White, T. J. et al ; Trends Genet. 5, 185(1989) 참조)에 의해 lysC를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭에 사용한 DNA 프라이머는 코리네박테리움 글루타미캄에서 이미 공지되어 있는 서열(Molecular Microbiology(1991)5(5), 1197-1204, Mol. Gen. Genet.(1990) 224, 317-324 참조)를 기초로 하여 lysC를 암호화하는 약 1643bp의 영역을 증폭하기 위하여, 서열 1 및 서열 2에 나타내는 염기서열을 가지는 23mer 및 21mer의 단일사슬 DNA를 합성하였다. DNA의 합성은 Applied Biosystems 사제 DNA 합성기 model 380B를 사용하여, 포스포아미다이트법을 사용하여(Tetrahedron Letters(1981), 22, 1859 참조) 일상법에 따라서 합성하였다.
PCR 반응은, 다까라슈조(주)제 DNA 서멀사이클러 PJ2000형을 사용하여, TaqDNA 폴리머라제를 사용하여, 공급자에 의해 지정된 방법에 따라서 유전자 증폭을 하였다. 증폭된 1643kb의 유전자 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인한 후, 겔에서 잘라낸 해당 단편을 일상법에 의해 정제하고, 제한효소 NruI(다까라슈조(주)제) 및 EcoRI(다까라슈조(주)제)로써 절단하였다.
유전자 단편의 클론화용 벡터에는 pHSG399(Takeshita, S et al ; Gene(1987), 61, 63-74 참조)를 사용하였다. pHSG399를 제한효소 Smal(다까라슈조(주)제) 및 제한효소 EcoRI으로 절단하고, 증폭된 lysC 단편으로 접속하였다. DNA의 접속은 DNA 라이게이션 키트(다까라슈조(주)제)를 사용하여, 지정된 방법으로 행하였다. 이렇게 하여 pHSG399에 브레비박테리움 락토퍼멘텀 염색체에서 증폭된 lysC 단편이 접속된 플러스미드를 제작하였다. 야생주인 ATCC 13869 주 유래의 lysC를 가지는 플러스미드를 P399AKY, L-리신 생산균인 AJ3463 유래의 lysC를 가지는 플러스미드를 p399AK9라 명명하였다.
p399AKY 및 p399AK9에, 각각 코리네박테리움속 세균속에서 플러스미드를 자율복제 가능하게 하는 능력을 갖는 DNA 단편(이하 「Brevi.-ori」N라고 기재한다)을 도입하고, 코리네박테리움속 세균속에서 자율복제 가능한 lysC를 탑재한 플러스미드를 제작하였다. brevi.-ori는, 이것을 포함하며, 에셔리히아 콜리와, 코리네박테리움속 세균의 쌍방의 균체내로 자율복제 가능한 플러스미드 벡터 pHX4로부터 제조하였다. pHX4는, pHC4를 KpnI(다까라슈조(주)제) 및 BamHI(다까라슈조(주)제)으로 절단하고, Brevi.-ori 단편을 추출하고, 마찬가지로 KpnI 및 BamHI에서 절단한 pHSG298에 접속함으로써 구축된다(일본 특허공개 평 5-7491호 공보 참조). pHK4는, 숙주에 가나마이신 내성을 부여한다. 또한, pHK4를 유지하는 에셔리히아 콜리 HB101은, 에세리히아 콜리 AJ13136으로 명명되고, 1995년 8월 1일에, 통상산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본국 이바라기겐 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 수탁번호 FERM BP-5186으로서 기탁되어 있다.
pHK4를, 제한효소 KpnI 및 BamHI으로 절단하고, 절단면을 평활말단화하였다. 평활말단화는 DNA Blunting kit(다까라슈조(주)제)를 사용하여, 지정된 방법으로 행하였다. 평활말단화후, 인산화완료 BamHI 링커(다까라슈조(주)제)를 접속하고, pHK4에서 Brevi.-ori 부분의 DNA 단편을 BamHI 하나만에 의한 절단에 의해서 잘라내도록 개량변경하였다. 이 플러스미드를 BamHI에 의해 절단하고, 생성된 Brevi.-ori DNA 단편을 마찬가지로 BamHI으로 절단한 p399AKY, p399AK9에 접속하고, 코리네박테리움속 세균속에서 자율복제 가능하고 또한 lysC 유전자를 포함하는 플러스미드를 제작하였다.
p399 AKY 유래의 야생형 lysC 유전자를 포함하는 플러스미드를 p399AKYB라 명명하고, p399AK9 유래의 변이형 lysC 유전자를 포함하는 플러스미드를 p399AK9B라 명명하였다. p399AK9B, p399AKYB 구축의 과정을 도 1에 나타낸다. 브레비박테리움 락토퍼멘텀 야생주인 AJ12036주(FERM BP-734)에 변이형 lysC 플러스미드 p399AK9B를 도입한 균주 AJ12691은, 1992년 4월 10일에 통상산업성 공업 기술원 생명공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본국 이바라기겐 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 수탁번호 FERM P-12918로서 기탁되고, 1995년 2월 10일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁에 이관되고, FERM BP-4999의 수탁번호로 기탁되어 있다.
2 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 야생형 lysC 및 변이형 lysC의 염기서열의 결정
야생형 lysC를 포함하는 플러스미드 p399AKY 및 변이형 lysC를 포함하는 플러스미드 p399AK9를 각각의 형질전환체로부터 제조하여, 야생형 및 변이형 lysC의 염기서열의 결정을 하였다. 염기서열의 결정은 생거의 방법(F.Sanger et al : Proc.Natl.Acad.Sci.74.5463(1977) 등이 있다)에 의하였다.
p399AKY에 암호화되어 있는 야생형 lysC의 염기서열을 서열목록의 서열 3에 나타낸다. 한편, p399AK9에 암호화되어 있는 변이형 lysC의 염기서열은 아생형 lysC와 비교하여, 서열 3에 있어서 1051번째의 G가 A로 변화하고 있다고 하는 1 염기의 변이만을 가지고 있었다. 코르네박테리움 글루타미캄의 lysC는, 동일한 DNA 사슬에 α, β의 2개의 아단위이 동일의 리딩 프레임으로 암호회되어 있는 것이 공지되어 있지만(Kalinowski, J et al ; MolecularI Microbiology(1991)5(5), 1197-1204 참조), 상동성으로부터 판단하여 본 유전자도 동일한 DNA 사슬에 α, β의 2개의 아단위이 동일한 리딩프레임으로 암호화되어 있다고 생각된다.
DNA 염기서열에서 추정되는 야생형 AK 단백질의 α 아단위의 아미노산 서열을 DNA 서열과 동시에 서열목록의 서열 4에, 아미노산 서열만을 서열 5에 나타낸다. 또한, DNA 염기서열에서 추정되는 야생형 AK 단백질의 β 아단위의 아미노산 서열을 DNA와 동시에 서열목록의 서열 6에, 아미노산 서열만을 서열 7에 나타낸다. 또한, 각 아단위과도, 개시코든에 GTG가 사용되고 있고, 대응하는 아미노산을 메티오닌으로 표기하고 있지만, 이것은, 메티오닌, 발린, 또는 포르밀 메티오닌을 나타내는 것이다.
한편, 변이형 lysC 서열상의 변이온, 야생형 AK 단백질의 아미노산 서열(서열 5, 7)에 있어서, α 아단위으로서는 279번째의 알라닌 잔기가 스레오닌 잔기에 β 아단위에서는 30번째의 알라닌 잔기가 스레오닌 잔기라고 하는 아미노산 잔기치환을 일으키고 있는 것을 의미한다.
실시예 2 브레비박테리움 락토퍼멘텀 dapB의 취득
1 dapB의 취득 및 그것을 함유하는 플러스미드의 제작
브레비박테리움 락토퍼멘텀 야생주 ATCC 13869 주를 염색체 DNA의 공여체로서 사용하였다. ATCC 13869주에서 일상법에 따라서, 염색체 DNA를 제조하였다. 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 dapB를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭에 사용한 DNA 프라이머는 브레비박테리움 락토퍼멘텀에서 이미 공지되어 있는 서열(Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749(1993) 참조)를 기초로 하여 DDPR를 암호화는 약 2.0kb의 영역을 증폭하기 위하여, 서열목록의 서열 8 및 9에 기재된 염기서열을 가지는 각각 23mer의 DNA 단편을 합성하였다. DNA의 합성 및 PCR 반응은, 실시예 1과 같이 하여 행하였다. 증폭된 2001bp의 유전자 단편의 클론화용 벡터에는 pCR-Script(Invitrovitrogen사제)를 사용하여, 증폭된 dapB 단편과 접속하였다. 이렇게 하여 pCR-Script에 브레비박테리움 락토퍼멘텀 염색체로부터 증폭된 dapB 단편 2001bp의 접속된 플러스미드를 제작하였다. 이렇게 하여 취득한 ATCC 13869 유래의 dapB를 가지는 플러스미드를 pCRDAPB로 명명하였다. E.coliJM109주에 pCRDAPB를 도입하여 수득된 형질전환주 AJ13107주는, 1995년 5월 26일부터 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본국 이바라기겐 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 수탁번호 FERM BP-5114의 수탁번호로, 부다페스트조약에 근거하여 국제기탁되어 있다.
또한, pCRDAPB를 EcoRV와 SphI로 절단함에 의해, DDPR의 구조 유전자를 포함하는 1101bp의 단편을 추출하였다. 이 단편을, pHSG399을 HincⅡ 및 SphI로 절단한 것으로 연결한 플러스미드를 작성하였다. 이 작성한 플러스미드를 p399DPR라 명명하였다.
제작한 p399DPR에 Brevi.-ori를 도입하여, 코리네형 세균속에서 자율복제 가능한 dapB를 탑재한 플러스미드를 제작하였다. pHK4를 제한효소 KpnI(다까라슈조(주)제)로써 절단하고, 절단면을 평활말단화하였다. 평활말단화는 DNA Blunting kit(다까라슈조(주)제)를 사용하여, 지정된 방법으로써 행하였다. 평활말단화후, 인산화 완료 BamHI 링커(다까라슈조(말)제)를 접속하고, pHK4로부터 BGrevi.-ori 부분의 DNA 단편을 BamHI 하나만에 의한 절단에 의해서 잘라내도록 개량변경하였다. 이 플러스미드를 BamHI에 의해 절단하고, 발생한 Brevi.-ori DNA 단편을 동일하게 BamHI에서 절단한 p399DPR에 접속하고, 코리네형 세균속에서 자율증식 가능하고 또한 dapB를 포함하는 플러스미드를 제작하였다. 제작한 플러스미드를 pDPRB라 명명하였다. pDPRB 구축의 과정을 도 2에 나타낸다.
2 브레비박테리움 락토퍼멘텀 dapB의 염기서열의 결정
p399DPR를 유지하는 AJ13107주로부터 플러스미드 DNA를 제조하여, 실시예 1과 같이 하여 염기서열의 결정을 하였다. 결정한 염기서열 및 이 서열로부터 예상되는 아미노산 서열을 서열 10에 나타낸다. 또한, 아미노산 서열만을 서열 11에 나타낸다.
실시예 3 브레비박테리움 락토퍼멘텀 dapA의 취득
1 dapA의 취득 및 그것을 함유하는 플러스미드의 제작
브레비박테리움 락토퍼멘텀 야생주 ATCC 13869주를 염색체 DNA의 공여체로서 사용하였다. ATCC 13869주로부터 일상법에 따라서, 염색체 DNA를 제조하였다. 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 dapA를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭에 사용한 DNA 프라이머는 코리네박테리움 글루타미캄에 있어서 이미 공지되어 있는 서열(Nucleic Acids Research 18(21), 6421(1990), EMBL accession No. X53993 참조)를 기초로 하여 DDPS를 암호화하는 약 1.5kb의 영역을 증폭하기 위하여, 서열목록의 서열 12 및 13에 기재된 염기서열을 가지는 각각 23mer의 DNA를 합성하였다. DNA의 합성 및 PCR 반응은, 실시예 1와 같이 하여 행하였다. 증폭된 1411bp의 유전자 단편의 클론화용의 벡터에는 pCR1000(Invitrogen사제 ; Bio/Technology 9, 657-663(1991) 참조)를 사용하여, 증폭한 dapA 단편과 접속하였다. DNA의 접속은 DNA 라이게이션 키트(다까라슈조(주)제)를 사용하여, 지정된 방법으로써 행하였다. 이렇게 하여 pCR1000에 브레비박테리움 락토퍼멘텀 염색체로부터 증폭된 dapA 단편 1411bp의 접속된 플러스미드를 제작하였다. 이렇게 하여 취득한 ATCC 13869 유래의 dapA를 가지는 플러스미드를 pCRDAPA라 명명하였다.
E. coliJM109주에 pCRDAPA를 도입하여 수득된 형질전환주 AJ13106주는, 1995년 5월 26일로부터 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본국 이바라기겐 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 수탁번호 FERM BP-5113의 수탁번호로 부다페스트 조약에 근거하여 국제기탁되어 있다.
제작한 pCRDAPA에 Brevi.-ori를 도입하여, 코리네형 세균속에서 자율복제 가능한 dapA를 탑재한 플러스미드를 제작하였다. pHK4를 제한효소 KpnI 및 BamHI(다까라슈조(주)제)로써 절단하여, 절단면을 평활말단화하였다. 평활말단화는 DNA Blunting kit(다까라슈조(주)제)를 사용하여, 지정된 방법으로 행하였다. 평활말단화후, 인산화 완료 SmaI 링커(다까라슈조(주)제)를 접속하여, pHK4로부터 Brevi.-ori 부분의 DNA 단편을 SmaI 하나에만 의한 절단에 의해서 잘라내도록 개량변경하였다. 이 플러스미드를 SmaI에 의해 절단하여, 생긴 Brevi.-ori DNA 단편을 동일하게 SmaI으로써 절단한 pCRDAPA에 접속하여, 코리네형 세균속에서 자율증식 가능하고 또한 dapA를 포함하는 플라스미드를 작제하였다. 이 플라스미드를 pDPSB라 명명하였다. pDPSB(KMr)의 구축과정을 도 3에 나타낸다.
2 브레비박테리움 락토퍼멘텀 dapA의 염기서열의 결정
pCRDAPA를 유지하는 AJ13106주로부터 플라스미드 DNA를 제조하여, 실시예 1과 같이 하여 염기서열의 결정을 하였다. 결정한 염기서열 및 이 서열로부터 예상되는 아미노산 서열을 서열 14에 나타낸다. 또한, 아미노산 서열만을 서열 15에 나타낸다.
실시예 4 브레비박테리움 락토퍼멘텀 lysA의 수득
1 lyaA의 수득 및 그것을 함유하는 플라스미드의 작제
브레비박테리움 락토퍼멘텀 야생주 ATCC 13869주를 염색체 DNA의 공여체로서 사용한 ATCC 13869주로부터 일상법에 따라서, 염색체 DNA를 제조하였다. 염색체 DNA로부터 PCR에 의해, argS, dapA 및 이들을 포함하는 오페론의 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭에 사용한 DNA 프라이머로서는, 코리네박테리움 글루타미캄에서 이미 공지되어 있는 서열(Molecular Microbilogy 4(11), 1819-1830(1990), MOlecular and General Genetics 212, 112-119(1988) 참조)를 기초로 하여 아르기닌-tRNA 신타제 및 DDC를 암호화하는 약 3.6kb의 영역을 증폭하기 위하여, 서열목록의 서열 16 및 17에 기재된 염기서열을 가지는 각각 23-머의 합성 DNA를 사용하였다. DNA의 합성 및 PCR 반응은, 실시예 1와 같이 하여 행하였다. 증폭된 3579bp의 유전자 단편의 클론화용의 벡터에는 pHSG399을 사용하였다. pHSG399를 제한효소 SmaI(다까라슈조(주)제)으로써 절단하고, 증폭된 lysA를 포함하는 DNA 단편과 접속하였다. 이렇게 하여 수득한 ATCC 13869 유래의 lysA를 가지는 플라스미드를 p399LYSA라 명명하였다.
또한, p399LYSA를 KpnI(다까라슈조(주)제)와 BamHI(다까라슈조(주)제)로 절단함에 의해, lysA를 포함하는 DNA 단편을 추출하였다. 이 DNA 단편을, pHSG299를 KpnI과 BamHI으로 절단한 것과 연결하였다. 수득된 플라스미드를 p299LYSA라 명명하였다. p299LYSA 구축의 과정을 도 4에 나타낸다.
수득된 p299LYSA에 Brevi.-ori를 도입하여, 코리네형 세균속에서 자율복제 가능한 lysA를 탑재한 플라스미드를 작제하였다. pHK4를 제한효소 KpnI 및 BamHI으로 절단하여, 절단면을 평활말단화하였다. 평활말단화는 DNA Blunting kit(다까라슈조(주)제)를 사용하여 지정된 방법으로써 행하였다. 평활말단화후, 인산화 완료 KpnI 링커(다까라슈조(주)제)를 접속하여, pHK4로부터 Brevi.-ori 부분의 DNA 단편을 KpnI 하나에만 의한 절단에 의해서 잘라내도록 개량변경하였다. 이 플라스미드를 KpnI에 의해 절단하고, 발생한 Brevi.-ori DNA 단편을 마찬가지로 KpnI에서 절단한 p299LYSA에 접속하고, 코리네형 세균속에서 자율복제 가능하고 또한 lysA를 포함하는 플라스미드를 작제하였다. 작제한 플라스미드를 pLYSAB라 명명하였다. pLYSAB 구축의 과정을 도 5에 나타낸다.
2 브레비박테리움 락토퍼멘텀 lysA의 염기서열의 결정
p299LYSA의 플라시므드 DNA를 제조하고, 실시예 1과 같이 하여 염기서열의 결정을 하였다. 결정한 염기서열 및 이 서열이 암호화한다고 예상되는 아미노산 서열을 서열 18에 나타낸다. 또한, 이개 염기서열중, argS가 암호화하는 아미노산 서열 및 lysA가 암호화하는 아미노산 서열을, 각각 서열 19 및 20에 나타낸다.
실시예 5 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ddh의 수득
ddh 유전자는, 코리네박테리움 글루타미캄(Corynebacterium glutamicum)의 ddh 유전자의 이미 공지되어 있는 뉴클레오티드 서열(Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917(1987))을 바탕으로 작성한 2종의 올리고 뉴클레오티드 프라이머(서열 21, 22)를 사용한 PCR법에 의해, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869의 염색체 DNA에서 ddh 유전자를 증폭함으로써 수득했다. 수득된 증폭 DNA 단편을 EcoT22I와 AvaI으로 절단하고, 말단을 평활화한 후, pMW119의 SmaI 부위에 삽입하여, 플라스미드 pDDH를 수득했다.
다음에, pDDH를 SalI과 EcoRI으로 절단하여, 평활말단화한 후, 수득된 단편을 SmaI으로 절단한 PUC18과 연결하였다. 이렇게 해서 수득된 플라스미드를 pUC18DDH라 명명하였다.
pUC18DDH에 Brevi.-ori를 도입하고, 코리네형 세균속에서 자율복제 가능한 ddh를 탑재한 플라스미드를 작제하였다. pHK4를 제한효소 KpnI 및 BamHI으로 절단하여, 절단면을 평활말단화하였다. 평활말단화는 DNA Blunting kit(다까라슈조(주)제)를 사용하여, 지정된 방법으로 행하였다. 평활말단화후, 인산화 완료 PstI 링커(다까라슈조(주)제)를 접속하여, pHSG299의 PstI 부위에 삽입하였다. 이렇게하여 작제한 플라스미드를 pPK4라 명명하였다. 다음에, pUC18DDH를 XbaI와 KpnI로 절단하고, 발생한 ddh 단편을 KpnI와 XbaI로 절단한 pPK4에 접속하였다. 이렇게하여, 코리네형 세균속에서 자율복제 가능하고, 또한, ddh를 포함하는 플라스미드를 작제하여, 이 플라스미드를 pPK4D라 명명하였다. pPK4D 구축의 과정을 도 6에 나타낸다.
실시예 6 변이형 lysC 및 dapA를 겸하여 가진 플라스미드의 작제
dapA를 가지는 플라스미드 pCRDAPA와 변이형 lysC 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 p399AK9B로부터, 변이형 lysC, dapA 및 코리네형 세균의 복제기점을 가지는 플라스미드를 작제하였다. p399AK9B를 SalI으로 완전분해한 후, 평활말단화하여, EcoRI 링커를 접속하는 일에 의해 SalI 부위를 EcoRI 부위에 개량변경한 플라스미드를 작제하였다. 수득된 플라스미드를 p399AK9BSE라 명명하였다. p399AK9BSE를 EcoRI에서 부분 분해함에 의하여 변이형 lysC과 Brevi.-ori를 하나의 프레그먼트로서 잘라내었다. 이 프레그먼트를 pCRDAPA를 EcoRI으로 절단한 것으로 연결하였다. 수득된 플라스미드를 pCRCAB라 명명하였다. 이 플라스미드는 E.coli과 코리네형 세균속에서 자율증식 가능하고, 또한 숙주에서 가나마이신 내성을 부여하고, 변이형 lysC과 dapA를 더불어 유지하고 있는 플라스미드이다. pCRCAB의 작제과정을 도 7에 나타낸다.
실시예 7 변이형 lysC 및 dapB를 겸하여 가진 플라스미드의 작제
변이형 lysC를 가지는 플라스미드 p399AK9와 dapB를 가지는 플라스미드 p399DPR로부터, 변이형 lysC, dapB를 포함하는 플라스미드를 작제하였다. p399DPR를 EcoRV와 SphI으로 절단함에 의해, DDPR의 구조 유전자를 포함하는 1101bp의 단편을 추출하였다. 이 단편을, p399AK9을 SalI으로 절단한 후 평활말단화하고, 또한 SphI으로 절단한 것으로 결합하여, 변이형 lysC과 dapB를 겸하여 가지는 플라스미드를 작제하였다. 이 플라스미드를 p399AKDDPR이라 명명하였다.
다음에, 수득된 p399AKDPR에 Brevi.-ori를 도입하였다. Brevi.-ori를 포함하는 플라스미드 pHK4를 제한효소 KpnI(다까라슈조(주)제)로써 절단하고, 절단면을 평활말단화하였다. 평활말단화는 DNA Blunting kit(다까라슈조(주)제)를 사용하여, 지정된 방법으로 행하였다. 평활말단화후, 인산화 완료 BamHI 링커(다까라슈조(주)제)를 접속하여, pHK4로부터 Brevi.-ori 부분의 DNA 단편을 BamHI 하나에만 의한 절단에 의해서 잘라내도록 개량변경하였다. 이 플라스미드를 BamHI으로 절단하고, 발생한 Brevi.-ori DNA 단편을 동일하게 BamHI으로 절단한 p399ADDPR에 접속하고, 코리네형 세균속에서 자율증식 가능하게 또한 변이형 lysC 및 dapB를 포함하는 플라스미드를 작제하여 pCB라 명명하였다. pCB의 구축의 과정을 도 8에 나타낸다.
실시예 8 dapA 및 dapB를 겸하여 가지는 플라스미드에 작제
dapA를 가지는 플라스미드 pCRDAPA를 KpnI 및 EcoRI으로 절단하고, 3를 포함하는 DNA 단편을 추출하여, 벡터 플라스미드 pHSG399를 KpnI 및 EcoRI으로 절단한 것으로 접속하였다. 수득된 플라스미드를 p399DPS라 명명하였다.
한편, dapB를 가지는 플라스미드 pCRDAPB를 SacII 및 EcoRI으로 절단하고 DDPR를 암호화하는 영역을 포함하는 2.0kb의 DNA 단편을 추출하고, SacII 및 EcoRI으로 절단한 p399DPS와 접속하고, dapA와 dapB를 겸하여 가지는 플라스미드를 작제하였다. 수득된 플라스미드를 p399AB라 명명하였다.
다음에, p399AB에 Brevi.-ori를 도입하였다. Brevi.-ori를 포함하는 pHK4를 제한효소 BamHI(다까라슈조(주)제)로써 절단하고, 절단면을 평활말단화하였다. 평활말단화는 DNA Blunting kit(다까라슈조(주)제)를 사용하여, 지정된 방법으로써 행하였다. 평활말단화후, 인산화 완료 KpnI 링커(다까라슈조(주)제)를 접속하고, pHK4로부터 Brevi.-ori 부분의 DNA 단편을 KpnI 하나에만 의한 절단에 의해서 잘라내도록 개량변경하였다. 이 플라스미드를 KpnI에 의해 절단하고, 발생한 Brevi.-ori DNA 단편을 동일하게 KpnI으로 절단한 p399AB에 접속하고, 코리네형 세균속에서 자율증식 가능하고 또한 dapA 및 dapB를 포함하는 플라스미드를 작제하여, pAB라 명명하였다. pAB의 구축의 과정을 도 9에 나타낸다.
실시예 9 ddh 및 lysA를 겸하여 가지는 플라스미드의 작제
ddh를 가지는 플라스미드를 pUC18DDH를 EcoRI 및 XbaI로서 절단하고, ddh를 포함하는 DNA 단편을 추출하였다. 이 ddh 단편을, lysA를 가지는 플라스미드 p399LYSA를 BamHI 및 Xbal로서 절단한 후, 절단면을 평활말단화한 것으로 연결하였다. 수득된 플라스미드를 p399DL로 명명하였다. p399DL 구축의 과정을 도 10에 나타낸다.
다음에, p399DL에 Brevi.-ori를 도입하였다. pHK4를 Xbal 및 BamHI으로 절단하여, 절단면을 평활말단화하였다. 평활말단화후, 인산화 완료 XbaI 링커를 접속하고, pH4로부터 Brevi.-ori 부분의 DNA 단편을 XbaI 하나에만 의한 절단에 의해서 잘라내도록 개량변경하였다. 이 플라스미드를 Xbal로서 절단하고, 발생한 Brevi.-ori DNA 단편을 동일하게 XbaI으로 절단한 p399DL에 접속하고, 코리네형 세균속에서 자율증식 가능하고 또한 ddh 및 lysA를 포함하는 플라스미드를 작제하고 pDL과 명명하였다. pDL의 구축의 과정을 도 11에 나타낸다.
실시예 10 변이형 lysC, dapA 및 dapB를 겸하여 가지는 플라스미드의 작제
p399DPS를 EcoRI, SphI으로 분해하여, 평활말단화한 후, dapA 유전자 단편을 추출하였다. 이 단편을, p399AK9를 SalI로써 절단하여 평활말단화한 것과 라이게이션하여, 변이형 lysC과 dapA가 공존한 플라스미드 p399CA를 구축하였다.
dapB를 가지는 플라스미드 pCRDAPB를 EcoRl으로 절단, 평활말단화한 후, SacI으로 절단하고, dapB를 포함하는 2.0kb의 DNA 단편을 추출하였다. dapA 및 변이형 lysC를 가지는 플라스미드 p399CA를 SpeI로서 절단, 평활말단화한 후, SacI으로 절단하고, 추출한 dapB 단편과 접속하여, 변이형 lysC, dapA 및 dapB를 포함하는 플라스미드를 수득했다. 이 플라스미드를 p399CAB라 명명하였다.
다음에, p399CAB에 Brevi.-ori를 도입하였다. Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pHX4를 제한효소 BamHI(다까라슈조(주)제)으로서 절단하고, 절단면을 평활말단화하였다. 평활말단화는 DNA Blunting kit(다까라슈조(주)제)를 사용하여, 지정된 방법으로써 행하였다. 평활말단화후, 인산화 완료 KpnI 링커(다까라슈조(주)제)를 접속하여, pH4에서 Brevi.-ori 부분의 DNA 단편을 KpnI 하나에만 의한 절단에 의해서 잘라내도록 개량변경하였다. 이 플라스미드를 KpnI에 의해 절단하고, 발생한 Brevi.-ori DNA 단편을 동일하게 KpnI에서 절단한 p399CAB에 접속하고, 코리네형 세균속에서 자율증식 가능하고 또한 변이형 lysC, dapA 및 dapB를 더불어 가지는 플라스미드를 작제하여, pCAB라 명명하였다. pCAB의 구축의 과정을 도 12에 나타낸다.
실시예 11 변이형 lysC, dapA, dapB 및 lsyA를 겸하여 가진 플라스미드의 작제
lysA를 가지는 플라스미드를 p299LYSA를 KpnI 및 BamHI으로 절단하고, 평활말단화한 후, lysA 유전자 단편을 추출하였다. 이 단편을, pCAB를 HpaI(다까라슈조(주)제)로써 절단하여 평활말단화한 것과 라이게이션하여, 코리네형 세균속에서 자율증식 가능하고 또한 변이형 lysC, dapA, dapB, 및 lysA를 더불어 가지는 플라스미드를 작제하여, pCABL 명명하였다. pCABL 구축의 과정을 도 18에 나타낸다. 또한, pCABL 중에서, lysA 유전자 단편은 dapB 유전자를 포함하는 DNA 단편내의 HpaI 부위에 삽입되어 있지만, 이 HpaI 부위는, dapB 유전자의 프로모터보다도 상류(서열 10중 염기번호 611 내지 616)에 위치하고 있고, dapB 유전자는 분리되어 있지 않다.
실시예 12 변이형 lysC, dapA, dapB, ddh 및 lysA를 겸하여 가진 플라스미드의 작제
pHSG299를 XbaI 및 XpnI로서 절단하고, ddh 및 lysA를 가지는 플라스미드 p399DL을 XbaI 및 KpnI으로 절단한 것으로 연결하였다. 작제된 플라스미드를 p299DL라 명명하였다. 이 p299DL를 XbaI 및 KpnI로서 절단하여, 평활말단화하였다. 평활말단화후, ddh 및 lysA를 포함하는 DNA 단편을 추출하였다. 이 DNA 단편을, 변이형 lysC, dapA 및 dapB를 더불어 가지는 플라스미드 pCAB를 HpaI으로 절단하여 평활말단화한 것으로 연결하여, 코리네형 세균속에서 자율증식 가능하고 또한 변이형 lysC, dapA, dapB, lysA 및 ddh를 더불어 가지는 플라스미드를 작제하여 pCABDL이라 명명하였다. pCABDL 구축의 과정을 도 14에 나타낸다.
실시예 13 L-리신 생합성 유전자를 포함하는 플라스미드의 브레비박테리움 락토퍼멘텀 L-리신 생산균으로의 도입
상기한 바와 같이 하여 작제된 L-리신 생합성 유전자를 가지는 플라스미드 p399AK9B(Cmr), pDPSB(Kmr), pDPRB(Cmr), pLYSAB(Cmr), pPK4D(Cmr), pCRCAB(Kmr), pAB(Cmr), pCB(Cmr), pDL(Cmr), pCAB(Cmr), pCABL(Cmr), pCABDL(Cmr)을 브레비박테리움 락토퍼멘텀 L-리신 생산균인 AJ11082(NRRL B-11470)에 도입하였다. AJ11082주는, AEC 내성의 성질을 가진다. 플라스미드의 도입의 방법은, 전기펄스법(스기모토 등, 일본 특허공개 평 2-207791호 공보)에 의하였다. 형질전환체의 선택은 각각의 플라스미드가 가지는 약제 내성 메이커에 의하였다. 클로람페니콜 내성 유전자를 가지는 플라스미드를 도입한 경우는 5㎍/㎖의 클로람페니콜을 포함하는 완전배지로써, 또한, 가나마이신 내성 유전자를 가지는 플라스미드를 도입한 경우에는 25㎍/㎖의 가나마이신을 포함하는 완전배지로써 형질전환체의 선택을 하였다.
실시예 14 L-리신의 제조
실시예 13에서 수득한 각 형질전환체를 L-리신 생산 배지로써 배양하고, 그 L-리신 생산능력을 평가하였다. L-리신 생산 배지의 조성은 이하에 나타내는 대로이다.
[L-리신 생산 배지]
탄산칼슘 이외의 하기 성분(1L중)을 용해하고, KOH로 pH 8.0으로 제조하고, 115℃에서 15분 살균한 후, 별도로 건열살균한 탄산칼슘을 50g 가하였다.
글루코스100g
(NH4)2SO455g
KH2PO41g
MgSO4·7H2O1g
바이오틴500㎍
치아민2000㎍
FeSO4·7H2O0.01g
MgSO4·7H2O0.01g
니코틴아미드5㎎
단백질 가수분해물(豆濃)30㎖
탄산칼슘50g
상기 조성의 배지에 각종 형질전환체 및 모균주(母菌株 : 親株)를 식균하고, 31.5℃에서 왕복진탕배양을 행하였다. 배양 40시간, 72시간후의 L-리신 생성량, 및 72시간후의 생육(OD562)를 표에 나타낸다. 표중, lysC*는 변이형 lysC를 나타낸다. 생육은 101배 희석한 후, 560nm로서 OD를 측정함에 의해 정량했다.
[표 1]
배양 40 및 72시간후의 L-리신 축적
이상에 나타난 것같이, 변이형 lysC, dapA, 또는 dapB의 단독의 증강에서는, 배양 72시간후에는 L-리신 생산량은 모균주보다도 많은가 동등한 것인가, 40시간 후에는 모균주보다도 생산량이 적다. 즉 단기간 배양에 있어서의 L-리신 생산 속도는 저하됐다. 동일하게, 변이형 lys 및 dapA, 및 dapA 및 dapB를 조합시켜 증강된 경우에는, 배양 72시간후에는 L-리신 생산량은 모균주보다도 많지만, 40시간후에는 모균주보다도 생산량이 적고, L-리신 생산속도는 저하하였다.
마찬가지로, lysA 또는 ddh를 단독으로 증강한 경우에는, 배양 40시간 후에는 L-리신 생산량은 모균주보다도 많지만, 생육이 저하했기 때문에 장시간 배양에서는 모균주보다도 생산량이 적은 결과로 되었다.
이들에 대하여, 변이형 lysC과 동시에 dap8를 증강한 균주에서는 생육이 개선되고, 단기간 배양에 있어서의 L-리신 생산 속도를 회복시킬 수 있는데다가, 장기간 배양에서의 L-리신 축적량도 향상하였다. 또한, 변이형 lysC, dapA 및 dapB의 3자가 동시에 증강된 균주에서는 L-리신 생산성이 한층더 향상되었다. 또한, 다시 lysA, ddh를 순차 증강함으로써, 단계적으로 L-리신의 생산 속도 및 축적량은 함꼐 향상하였다. 또한, lysA 및 ddh만을 조합하여 증강한 경우에도, 모균주와 비교하여 L-리신 생산 속도가 향상되었다.
본 발명에 의해, 코리네형 세균의 L-리신 생산 능력을 향상시킬 수 있고, 생육 속도도 개선된다.
코리네형 L-리신 생산균에 있어서, 변이형 lysC과 동시에 dapB를 증강함에 의해, L-리신 생산 속도를 향상시킬 수 있으므로 생산성도 향상시킬 수 있다. 이들의 유전자에 가하여, dapA, lysA, ddh를 순차 증강함으로써, L-리신 생산 속도 및 생산성을 한층 더 향상시킬 수 있다.
서열목록
(1) 일반정보
(ⅰ) 출원인 : 아지노모토 가부시키가이샤
(ⅱ) 발명의 명칭 :
(ⅲ) 서열수 :
(ⅳ) 연락처 :
(A) 수신자명 :
(B) 번지 :
(C) 시(市) :
(D) 주(州) :
(E) 나락(國) :
(F) ZIP :
(ⅴ) 컴퓨터 판독 가능 형식
(A) 매체 :
(B) 컴퓨터 :
(C) 조작시스템 :
(D) 소프트웨어 :
(ⅵ) 현행출원 데이터
(A) 출원번호
(B) 출원일
(C) 분류
(ⅷ) 대리인/사무소정보
(A) 이름 :
(B) 등록번호 :
(C) 정리번호 :
(ⅸ) 통신정보
(A) 전화번호 :
(B) 팩시밀리번호 :
(2) 서열 1의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티 센스 : 없음
(xi) 서열 :
[서열 1]
(2) 서열 2의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 21개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티 센스 : 있음
(xi) 서열 :
[서열 2]
(2) 서열 3의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 1643 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘텀
(B) 균주명 : ATCC 13869
(xi) 서열 :
[서열 3]
(2) 서열 4의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 1643개 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 이본쇄
(D) 위상 : 일본쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘텀
(B) 균주명 : ATCC 13869
(ⅸ) 서열 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 217..1482
(xi) 서열 :
[서열 4]
(2) 서열 5의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 421개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(D) 위상 : 일본쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 5]
(2) 서열 6의 서열의 정보
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 1643개의 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 이본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘텀
(B) 균주명 : ATCC 13869
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 964..1482
(xi) 서열 :
[서열 6]
(2) 서열 7의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 172개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(C) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 7]
(2) 서열 8의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 없음
(xi) 서열 :
[서열 8]
(2) 서열 9의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 없음
(xi) 서열 : 없음
[서열 9]
(2) 서열 10의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 2001개 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 이본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘텀
(B) 균주명 : ATCC 13869
(ix) 서열 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 730..1473
(xi) 서열 :
[서열 10]
(2) 서열 11의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 248개의 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(D) 위상 : 일본쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 11]
(2) 서열 12의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅵ) 안티센스 : 없음
(xi) 서열 :
[서열 12]
(2) 서열 13의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 있음
(xi) 서열 :
[서열 13]
(2) 서열 14의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 1411개 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 이본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅳ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘텀
(B) 균주명 : ATCC 13869
(xi) 서열특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 311.. 1213
(xi) 서열 :
[서열 14]
(2) 서열 15의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 :301개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(C) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 15]
(2) 서열 16개의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 없음
(xi) 서열 :
[서열 16]
(2) 서열 17의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 있음
(xi) 서열 :
[서열 17]
(2) 서열 18의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 3579개 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 이본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘텀
(B) 균주명 : ATCC 13869
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 533..2182
(ix) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 2188..3522
(xi) 서열 :
[서열 18]
(2) 서열 19의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 550개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(C) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 19]
(2) 서열 20의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 445개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 20]
(2) 서열 21의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 20개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 없음
(xi) 서열 :
[서열 21]
(2) 서열 22의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 20개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 있음
(xi) 서열 :
[서열 22]
(2) 서열 23의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 1034개 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 이본쇄
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘텀
(B) 균주명 : ATCC 13869
(ⅸ) 서열 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 61..1020
(xi) 서열 :
[서열 23]
(2) 서열 24의 서열의 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 320개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 24]

Claims (18)

  1. L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피이드백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제를 암호화하는 DNA 서열, 및 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 코리네형 세균세포내에서 자율증식 가능한 재조합 DNA.
  2. 제1항에 있어서, 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 DNA 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA.
  3. 제2항에 있어서, 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 DNA 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA.
  4. 제3항에 있어서, 디아미노피멜산 디하이드로게나제를 암호화하는 DNA 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한항에 있어서, 상기 L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제가, 코리네형 세균에서 기원한 아스파르토키나제이고, 이의 α 아단위에서는 N 말단에서 279번째의 알라닌 잔기가 알라닌 및 산성 아미노산 이외의 아미노산 잔기로 변화되고, 이의 β 아단위에서는 30번째의 알라닌 잔기가 알라닌 및 산성 아미노산 이외의 아미노산 잔기로 변화된 변이형 아스파르토키나제인 재조합 DNA.
  6. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA 서열이, 서열목록중 서열 15의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 재조합 DNA.
  7. 제2항에 있어서, 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 DNA 서열이 서열목록중 서열 11에 나타내는 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 재조합 DNA.
  8. 제3항에 있어서, 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 DNA 서열이 서열목록중 서열 19의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 재조합 DNA.
  9. 제4항에 있어서, 디아미노피멜산 디하이드로게나제를 암호화하는 DNA 서열이, 서열목록중 서열 24의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 재조합 DNA.
  10. L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제를 보존 유지하며 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 증강된 DNA 서열을 포함하는 코리네형 세균.
  11. 제10항에 있어서, 제1항에 따른 재조합 DNA의 도입에 의해 형질전환된 코리네형 세균.
  12. 제10항에 있어서, 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 증강된 DNA 서열을 추가로 포함하는 코리네형 세균.
  13. 제12항에 있어서, 제2항에 따른 재조합 DNA의 도입에 의해 형질전환된 코리네형 세균.
  14. 제12항에 있어서, 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 증강된 DNA 서열을 추가로 포함하는 코리네형 세균.
  15. 제14항에 있어서, 제3항에 따른 재조합 DNA의 도입에 의해 형질전환된 코리네형 세균.
  16. 제14항에 있어서, 디아미노피멜산 디하이드로게나제를 암호화하는 증강된 DNA 서열을 추가로 포함하는 코리네형 세균.
  17. 제16항에 있어서, 제4항에 따른 재조합 DNA의 도입에 의해 형질전환된 코리네형 세균.
  18. 제10항 내지 제17항중 어느 한 항에 따른 코리네형 세균을 적합한 배지중에서 배양하는 단계, 해당 배양물중의 L-리신을 생산 능력 및 축적시키는 단계 및 해당 배양물로부터 L-리신을 수집하는 단계를 포함하는 L-리신의 제조 방법.
KR1019970709002A 1995-06-07 1996-06-05 L-리신의 제조 방법 KR100268324B1 (ko)

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JP14061495 1995-06-07

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