CZ390397A3 - Rekombinantní DNA, bakterie a způsob výroby L-lyzinu - Google Patents
Rekombinantní DNA, bakterie a způsob výroby L-lyzinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ390397A3 CZ390397A3 CZ973903A CZ390397A CZ390397A3 CZ 390397 A3 CZ390397 A3 CZ 390397A3 CZ 973903 A CZ973903 A CZ 973903A CZ 390397 A CZ390397 A CZ 390397A CZ 390397 A3 CZ390397 A3 CZ 390397A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna
- amino acid
- ala
- gly
- seq
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Předkládaný vynález se týká způsobu výroby L-lyzinu kultivací mikroorganismu, získaného modifikací koryneformní bakterie, používané pro fermentativní výrobu aminokyseliny apod., použitím techniky založené na genetickém inženýrství.
Dosavadní stav techniky
L-lyzin, který se používá jako přídavná látka do krmiv, se obvykle vyrábí fermentativním způsobem použitím mutantního kmene náležejícího ke koryneformním bakteriím, produkujícího L-lyzin. V současnosti je známo mnoho bakterií produkujících L-lyzin, které byly vytvořeny umělou mutací standardního kmene, náležejícího ke 15 koryneformním bakteriím.
Co se týče koryneformních bakterií, jsou známy vektorové plazmidy, které se autonomně replikují v bakteriálních buňkách a mají markerový gen rezistence vůči léku (viz US patent No. 4,514,502), a způsob zavádění genu do bakteriálních buněk (například zveřejněná 2o japonská patentová přihláška No. 2-207791). Popisuje se také možnost šlechtění bakterií produkujících L-threonin nebo L-izoleucin použitím výše popsaných způsobů (viz US patenty No. 4,452,890 a 4,442,208). Co se týče šlechtění bakterie produkující L-lyzin, je znám způsob, při kterém se vloží gen účastnící se biosyntézy L-lyzinu 25 do plazmidového vektoru pro zesílení genu v bakteriálních buňkách (např. uveřejněná japonská patentová přihláška No. 56-160997).
- 2 Známými geny pro biosyntézu L-lyzinu jsou např. gen pro dihydrodipikolinát reduktázu (japonská zveřejněná patentová přihláška No. 7-75578) a gen pro diaminopimelát dehydrogenázu (Ishino, S. a další, Nucleic Acids Res., 15. 3917 (1987), ve kterém je klonován 5 gen účastnící se biosyntézy L-lyzinu a gen pro fosfoenolpyruvát karboxylázu (japonská zveřejněná patentová přihláška No. 60-87788), gen pro dihydrodipikolinát syntázu (japonská zveřejněná patentová přihláška No. 6-55149) a gen pro diaminopimelát dekarboxylázu (japonská zveřejněná patentová přihláška No. 60-62994), u kterých io amplifikace genu ovlivňuje míru produkce L-lyzinu.
Co se týče enzymů účastnících se biosyntézy L-lyzinu, je znám příklad enzymu, který podléhá zpětnovazební inhibici při použití ve formě standardního typu. V takovém případě je výtěžnost L-lyzinu zlepšena zavedením genu enzymu s takovou mutací, že 15 zpětnovazebně inhibice se vyřadí. Takovými známými geny jsou zvláště například gen aspartokinázy (zveřejněná mezinárodní přihláška WO 94/25605).
Jak se popisuje výše, určité pozitivní výsledky byly získány pomocí amplifikace genů biosyntetického systému L-lyzinu nebo 20 zavedením mutantních genů. Značné množství L-lyzinu (přibližně 25 g/l) např. produkuje koryneformní bakterie, která nese mutantní gen pro aspartokinázu s vyřazenou spřaženou inhibici lyzinem a threoninem. Nevýhodou této bakterie je však pokles růstové rychlosti při porovnání s bakterií, která mutantní gen aspartokinázy 25 nemá. Popisuje se také, že výtěžnost L-lyzinu se zlepší dalším zavedením genu dihydrodipikolinát syntázy navíc k mutantnímu genu pro aspartokinázu (Applied and Environmental Microbiology, 57(6), 1746 - 1752 (1991). Rovněž tato bakterie však trpí dalším snížením růstové rychlosti.
3o Co se týče genu pro dihydrodipikolinát reduktázu, bylo ukázáno, že aktivita dihydrodipikolinát reduktázy se v koryneformní bakterii se • · «4 · 4 44 4 ··· · · · ····4 • 4 · · · ·♦ • 4 44 4444 4444 zavedeným genem zvýší, avšak chybí údaje o vlivu na produktivitu Llyzinu (zveřejněná japonská patentová přihláška No. 7-75578).
V současnosti tedy není znám žádný případ koryneformní bakterie, u které by se někomu podařilo významně zlepšit výtěžek L5 lyzinu kombinací většího počtu genů biosyntézy L-lyzinu bez omezení růstu. Stejně tak není znám případ, který by se zabýval zvýšením růstu zesílením genu pro biosyntézu L-lyzinu.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je zlepšení schopnosti produkovat L-lyzin a růstové rychlosti koryneformní bakterie použitím genetických materiálů sekvencí DNA kódujících aspartokinázu (dále označovanou jako „AK“, s tím, že gen kódující protein AK se dále v případě potřeby označuje jako JysC“), dihydrodipikolinát reduktázu (dále označovanou jako „DDPR“, s tím, že gen kódující protein DDPR se dále v případě potřeby označuje jako „dapB“). dihydrodipikolinát syntázu (zde zkracovanou jako „DDPS“, s tím, že gen kódující protein DDPS se dále v případě potřeby označuje jako „dapA“), diaminopimelát dekarboxylázu, (dále označovanou jako „DDC“, s tím,
2o že gen kódující protein DDC se dále v případě potřeby označuje jako „lysA“) a diaminopimelát dehydrogenázu (dále označovanou jako „DDH“, s tím, že gen kódující protein DDH se dále v případě potřeby označuje jako „ddh“), které jsou v buňkách koryneformních bakterií důležitými enzymy pro biosyntézu L-lyzinu. Pokud se fermentačním způsobem s použitím mikroorganismu produkuje určitá látka, rychlost produkce, stejně jako výtěžek této látky vzhledem ke vloženému materiálu je extrémně důležitý faktor. Náklady na produkci určité látky mohou být značně sníženy zvýšením produkční rychlosti na jednotku objemu fermentačního zařízení. Je tedy pro průmyslové využití
3o extrémně důležité, aby výtěžek fermentace a rychlost produkce byly • ·· . · · · · ·· • · ··· · · · ···· · • · · · · · · · · ····· ······ ·· ··
- 4 vzájemně kompatibilní. Předkládaný vynález navrhuje řešení tohoto problému, aby bylo možno dosáhnout zlepšení fermentativního způsobu výroby L-lyzinu s použitím koryneformních bakterií.
Podstatou předkládaného vynálezu je skutečnost, že růst koryneformní bakterie je možno zlepšit a tím zvýšit rychlost produkce L-lyzinu dosažením zesílení kombinací dapB s mutantním lysC (dále v případě potřeby jednoduše označovaným jako „mutantní lysC), kódující mutantní AK (dále v případě potřeby jednoduše označovanou jako „AK mutantního typu“), přičemž touto kombinací se vyřadí z činnosti spřažená inhibice lyzinem a threoninem ve srovnání s případem, kdy se zesílí lysC samotný, a že rychlost produkce Llyzinu může být dále zvýšována po krocích postupným zesilováním dapA, lysA a ddh.
Předkládaný vynález spočívá jmenovitě v rekombinantní DNA autonomně replikovatelné v buňkách koryneformní bakterie, obsahující sekvenci DNA kódující aspartokinázu, ve které je zpětnovazební inhibice L-lyzinem a L-threoninem v podstatě vyřazena z činnosti a sekvenci DNA, kódující dihydrodipikolinát reduktázu.
Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní DNA, která dále navíc k výše popsaným sekvencím DNA obsahuje sekvenci DNA kódující dihydrodipikolinát syntázu. Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní DNA, která navíc ke třem výše popsaným sekvencím DNA dále obsahuje sekvenci DNA kódující diaminopimelát dekarboxylázu. Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní DNA, která dále navíc k výše popsaným čtyřem sekvencím DNA obsahuje sekvenci DNA kódující diaminopimelát dehydrogenázu.
V dalším hledisku poskytuje předkládaný vynález koryneformní bakterii nesoucí aspartokinázu, ve které je v podstatě vyřazena z činnosti zpětnovazební inhibice L-lyzinem a L-threoninem, a obsahující zesílenou DNA kódující dihydrodipikolinát reduktázu. Předkládaný vynález poskytuje koryneformní bakterii, která dále
- 5 • ·· · · · ····
9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 99 99 99 9 9 9 9 obsahuje zesílenou DNA kódující ve výše uvedené koryneformní bakterii dihydrodipikolinát syntézu. Předkládaný vynález poskytuje koryneformní bakterii, která dále obsahuje zesílenou DNA, kódující ve výše uvedené koryneformní bakterii navíc ke třem výše popsaným DNA diaminopimelát dekarboxylázu. Předkládaný vynález poskytuje koryneformní bakterii, která dále obsahuje zesílenou DNA, která ve výše uvedené koryneformní bakterii navíc ke čtyřem DNA popisovaným výše kóduje diaminopimelát dehydrogenázu.
V ještě dalším hledisku poskytuje vynález způsob výroby Llyzinu, který zahrnuje kroky kultivace jakékoliv výše popsané koryneformní bakterie ve vhodném médiu, produkce a akumulace Llyzinu v bakteriální kultuře a izolace L-lyzinu z kultury.
Koryneformní bakterie v předkládaném vynálezu jsou skupinou mikroorganismů, jak je definována v publikaci: Berqey's Manual of Determinative Bacterioloqy, 8. vyd., str. 599 (1974), tedy aerobní grampozitivní tyčinky, které nejsou odolné vůči kyselinám a nemají schopnost tvořit spory. Mezi koryneformní bakterie spadají bakterie náležející k rodu Corvnebacterium, bakterie náležející k rodu Brevibacterium, které byly dosud zatříděny do rodu Brevibacterium, ale nyní náležejí k rodu Corvnebacterium, a bakterie náležející k rodu Brevibacterium blízce příbuzné k bakteriím náležejícím k rodu Corvnebacterium.
Dále následuje podrobný popis vynálezu:
(1) Příprava genů biosyntézy L-lyzinu používaných v předkládaném vynálezu
Geny biosyntézy L-lyzinu používané v předkládaném vynálezu se získávají izolací chromozomální DNA z bakterie (donor DNA), vytvořením knihovny chromozomální DNA použitím plazmidového vektoru nebo jiným způsobem, selekcí kmene nesoucího požadovaný gen, a izolací rekombinantní DNA z vybraného kmene, do které je gen
- 6 ~vložen. Volba donoru DNA pro gen biosyntézy L-lyzinu používaný v předkládaném vynálezu není nějak specificky limitována pod podmínkou, že požadovaný gen biosyntézy L-lyzinu exprimuje protein enzymu, který v buňkách koryneformní bakterie funguje. S výhodou je 5 však donorem DNA koryneformní bakterie.
Všechny geny lysC, dapA a dapB, pocházející z koryneformních bakterií, mají známé sekvence. Mohou být tedy získány provedením amplifikace- metodou polymerázové řetězové reakce (PCR; viz White, T. J. a další, Trends Genet., 5, 185 (1989).
io Každý z genů pro biosyntézu L-lyzinu používaný v předkládaném vynálezu je možno získat podle některé metody, jejich příklady se uvádějí níže.
1. Příprava mutantního lysC
Fragment DNA obsahující mutantní gen lysC je možno připravit z mutantního kmene, ve kterém byla v podstatě vyřazena z činnosti synergická zpětnovazební inhibice aktivity AK L-lyzinem a Lthreoninem (mezinárodní publikovaná přihláška WO 94/25605). Takový mutantní kmen může být například získán ze skupiny buněk, které pocházejí ze standardního kmene koryneformní bakterie, vystaveného působení mutace použitím obvyklých metod mutace, jako je ozáření UV a působení mutačních činidel, jako je N-methyl-N'-nitroN-nitrosoguanidin. Aktivita AK může být měřena pomocí metody popsané v: Miyajima, R. a další, v The Journal of Biochemistry (1968),
63(2), 139 - 148. Jako takový mutantní kmen je nejvýhodnější kmen, představovaný bakterií produkující L-lyzin AJ3445 (FERM P-1944), odvozený pomocí mutačního působení z kmene Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 standardního typu (dnes označované novým názvem Corynebacterium qlutamicum).
- 7 • · · · · · ··· 4 · © · · * · · · · · ·· ··
Alternativně je možno mutantní lysC získat mutací plazmidové DNA, obsahující gen lysC standardního typu in vitro. V dalším hledisku je známa specifická informace o mutaci, vedoucí k vyřazení synergické zpětnovazební inhibice AK L-lyzinem a L-threoninem z činnosti (mezinárodní zveřejněná patentová přihláška WO 94/25605). Mutantní gen lysC může být tedy také připraven na základě informace například metodou místně specifické mutageneze.
Fragment obsahující lysC může být izolován z koryneformní bakterie přípravou chromozomální DNA například metodou Saito H. a Miura K., Biochem. Biophys. Acta, 72. 619 (1963), a amplifikací lysC metodou polymerázové řetězové reakce (PCR; viz White, T. J. a další, Trends Genet., 5, 185 (1989).
Jako příklad primerů DNA je možno uvést jednořetězcové DNA 23-meru a 21-meru s nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No.: 1 a 2 ve výpisu sekvencí pro amplifikací například oblasti o velikosti přibližně 1643 bp, kódující lysC, založené na sekvenci známé pro Corynebacterium qlutamicum (viz Molecular Microbioloqy (1991), 5(5), 1197 - 1204; Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317 - 324).DNA je možno syntetizovat obvyklými způsoby použitím syntezátoru DNA model 380B firmy Applied Biosystems a použitím fosfoamiditové metody (viz Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). PCR je možno provádět s použitím přístroje DNA Thermal Cycler Model PJ2000 firmy Takara Shuzo, a Taq DNA polymerázy metodou doporučenou výrobcem. Je výhodné, když je pro přípravu rekombinantní DNA gen lysC, amplifikovaný PCR, ligován s vektorem DNA, který se autonomně replikuje v buňkách E. coli a/nebo koryneformní bakterie, a rekombinantní DNA se předem zavede do buněk E. coli. Dodržení této podmínky usnadní následující postup. Vektorem autonomně se replikujícím v buňkách E. coli íe s výhodou plazmidový vektor, který se s výhodou autonomně replikuje v buňkách hostitele, včetně například
9 9
9 9 9
plazmidů pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 a RSF1010.
Pokud se do těchto vektorů vloží fragment DNA, který má schopnost umožnit plazmidů autonomní replikaci v koryneformní bakterii, může být vektor použit jako tzv. kyvadlový vektor, který se autonomně replikuje jak v E. coli, tak i koryneformní bakterii. Takový kyvadlový vektor zahrnuje následující vektory. Mikroorganismus nesoucí každý takový vektor a depozitní čísla uložení v mezinárodních institucích pro ukládání mikroorganismů jsou uvedena v závorkách.
pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532) PAJ655: Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136)
Corynebacterium qlutamicum SR8201 (ATCC 39135) PAJ1844: Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137)
Corynebacterium qlutamicum SR8202 (ATCC 39136) pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138) pAJ3148: Corynebacterium qlutamicum SR8203 (ATCC 39137) pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140)
Tyto vektory je možno získat z mikroorganismů uložených ve sbírce následujícím způsobem. Buňky oddělené v logaritmické fázi růstu byly lyžovány použitím lysozymu a SDS a poté centrifugací lyzátu při 30 000 x g pro získání supernatantu, ke kterému byl přidán polyethylengiykol. Potom byla provedena frakcionace a purifikace centrifugací v rovnovážném hustotním gradientu chloridu česného ethidiumbromidu.
Buňky E. coli mohou být transformovány například zavedením plazmidů metodou D. M. Morrison, Methods in Enzymoloqy, 68, 326 (1979) nebo metodou, kdy se pro zvýšení permeability pro DNA působí na buňky příjemce chloridem vápenatým (Mandel, M. a Higa, A., J, Mol. Biol., 53, 159 (1970).
- 9 • φ φ ·· · · · · · φ φ ··· φ · · φφφφ · φφφ φφφ φφφ • ΦΦ ·· φφ φφφφ φφ ··
Gen lysC standardního typu se získá izolací genu lysC z AK kmene standardního typu, zatímco mutantní lysC se získá při izolaci lysC z AK mutantního kmene některou z výše popsaných metod.
Příklad sekvence nukleotidů fragmentu DNA obsahujícího 5 standardní typ lysC je uveden ve výpisu sekvencí v SEQ ID No.: 3.
Sekvence aminokyselin α-subjednotky proteinu AK standardního typu se odvozuje ze sekvence nukleotidů, ukázané ve výpisu sekvencí v SEQ ID No.: 4 spolu se sekvencí DNA. V SEQ ID No.: 5 je uvedena pouze sekvence aminokyselin. Aminokyselinová sekvence βίο podjednotky proteinu AK standardního typu se odvozuje ze sekvence nukleotidů DNA, která je uvedena v SEQ ID No.: 6 výpisu sekvencí spolu s DNA. SEQ ID No.: 7 uvádí pouze sekvenci aminokyselin. V každé podjednotce je jako iniciační kodon použit GTG a odpovídající aminokyselina je methionin. Totéž platí pro methionin, valin nebo 15 formylmethionin.
Výběr mutantního genu lysC použitého v předkládaném vynálezu není zvlášť omezován za předpokladu, že kóduje AK, u které je vyřazena synergická zpětnovazební inhibice L-lyzinem a Lthreoninem. Jako příklad mutantního genu lysC je uveden gen s 20 mutací, ve které je 279. zbytek alaninu počítáno od N-konce zaměněn za zbytek aminokyseliny jiný než alanin a jiný než kyselá aminokyselina v α-podjednotce a 30. zbytek alaninu je zaměněn za zbytek aminokyseliny jiný než alanin a jiný než kyselá aminokyselina v β-podjednotce aminokyselinové sekvence AK standardního typu. 25 Sekvence aminokyselin AK standardního typu specificky zahrnuje sekvenci aminokyselin ukázanou v SEQ ID No.: 5 ve výpisu sekvencí jako α-podjednotka a sekvenci aminokyselin, ukázanou v SEQ ID No.: 7 ve výpisu sekvencí jako β-podjednotka. Aminokyseliny, které s výhodou představují zbytek aminokyseliny jiný než alanin a jiný než 3o kyselá aminokyselina, jsou zbytky aminokyselin threonin, arginin, cystein, fenylalanin, prolin, serin, tyrozin a valin.
- 10 • · · · · · · · · · • · · · · · ♦ · · · · · « • · · · · · ··· ··· ·· ♦· ···· ·· ··
Kodon odpovídající zbytku aminokyseliny, která má být substituována není u tohoto typu specificky omezen kromě podmínky, že kóduje zbytek aminokyseliny. Předpokládá se, že sekvence aminokyselin u standardního typu AK se může mírně lišit v závislosti na rozdílu v bakteriálních druzích a bakteriálních kmenech. AK, které mají mutaci založenou např. na substituci, deleci nebo inzerci jednoho nebo více zbytků aminokyselin v jedné nebo více polohách, které nemají vztah k aktivitě enzymu jak je popsáno výše, mohou být v předkládaném vynálezu použity také. Jiné AK, které mají mutaci založenou například na substituci, deleci nebo inzerci jiných jedné nebo více zbytků aminokyselin mohou být použity také za předpokladu, že změny podstatně neovlivní aktivitu AK a vyřazení synergické zpětnovazební inhibice L-lyzinem a L-threoninem.
Kmen AJ12691, získaný zavedením plazmidu p399AK9B nesoucího mutantní gen lysC do kmene AJ12036 (FERM BP-734) standardního typu Brevibacterium lactofermentum, byl uložen
10. 4. 1992 pod depozitním číslem FERM P-12918 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko), a převeden 10. 2. 1995 na mezinárodní uložení založené na Budapěšťské smlouvě pod depozitním číslem FERM BP-4999.
2. Příprava dapB
Fragment DNA obsahující gen dapB je možno připravit z chromozomu koryneformní bakterie pomocí PCR. Výběr donoru DNA není specificky omezen, avšak jako příklad se uvádí kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Sekvence DNA kódující DDPR je pro Brevibacterium lactofermentum známa (Journal of Bacteriology, 175(9), 2743 - 2749 (1993), a na jejím základě je možno připravit primery DNA pro PCR.
- 11 Příklady takových primerů DNA jsou 23-mery DNA, které mají sekvence nukleotidů uvedené ve výpisu sekvencí pod SEQ ID No. 8 a
9. Syntéza DNA, PCR a příprava plazmidu obsahujícího získaný dapB může být provedena stejným způsobem, jak bylo popsáno výše pro 5 IvsC.
Nukleotidová sekvence fragmentu DNA obsahujícího dapB a z ní odvozená aminokyselinová sekvence jsou uvedeny v SEQ ID No: 10. Pouze aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID No: 11. Navíc k fragmentům DNA kódujícím tuto aminokyselinovou sekvenci může io předkládaný vynález ekvivalentně používat fragmenty DNA kódující sekvenci aminokyselin v podstatě stejnou jako je aminokyselinová sekvence ukázaná v SEQ ID No: 11, totiž sekvenci aminokyselin s mutací, založenou například na substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin za předpokladu, že změny nemají podstatný 15 vliv na aktivitu DDPR.
Transformovaný kmen AJ13107, získaný zavedením plazmidu pCRDAPB obsahujícího dapB získaný v dále popisovaných příkladech do E. coli JM109, je od 26. 5. 1995 uložen u mezinárodně uznané instituce pod depozitním číslem FERM BP-5114 v National Institute of 20 Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).
3. Příprava dapA
Fragment DNA obsahující dapA je možno připravit z chromozomu koryneformní bakterie pomocí PCR. Donor DNA nemusí být zvláště vybírán, avšak jako příklad se uvádí kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Sekvence DNA kódující DDPS je známa pro Corynebacterium qlutamicum (viz Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL No. X53993), a na jejím základě je možno připravit primery pro PCR. Takové DNA primery se jako příklady uvádějí prostřednictvím DNA 235 merú s nukleotidovými sekvencemi uvedenými v SEQ ID No: 12 a 13 ve výpisu sekvencí. Syntéza DNA, PCR a příprava plazmidu obsahujícího získaný dapA může být provedena stejným způsobem jako v případě lysC popsaném výše.
Příklad nukleotidové sekvence fragmentu DNA obsahujícího io dapA a z nich odvozené sekvence aminokyselin jsou uvedeny v SEQ ID No: 14. Pouze aminokyselinový sekvence je uvedena v SEQ ID No: 15. Navíc k fragmentům DNA kódujícím tuto sekvenci aminokyselin může předkládaný vynález ekvivalentně využívat fragmenty DNA kódující v podstatě stejné sekvence aminokyselin jako je sekvence 15 uvedená v SEQ ID No: 15, totiž sekvence aminokyselin s mutacemi založenými například na substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin za předpokladu, že nemají podstatný vliv na aktivitu DDPS.
Transformovaný kmen AJ13106, získaný zavedením plazmidu 20 pCRDAPA, obsahujícího dapA, který byl získán podle dále uvedeného příkladu, do kmene E. coli JM109, byl uložen 26. 5. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-5113 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (adresa: 25 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) v souladu s Budapešťskou úmluvou.
4. Příprava lysA
Fragment DNA obsahující lysA může být připraven z chromozomu koryneformní bakterie pomocí PCR. Výběr donoru DNA
- 13 • 9 « · · · · · ···· · φ « · ··· ··· «·> ·· ·· ···· ·· ·· není zvláště omezen, avšak jako příklad se uvádí kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
V koryneformní bakterii tvoří gen lysA operon spolu s arqS (gen pro arginyl-tRNA syntázu), přičemž lysA je po směru translace vzhledem k arqS. Exprese lysA je řízena promotorem, který se vyskytuje proti směru translace vzhledem k arqS (viz Journal of Bacteriology, Nov,, 7356 - 7362 (1993). Sekvence DNA těchto genů jsou známy pro Corynebacterium qlutamicum (viz Molecular Microbioloqy, 4(11), 1819 - 1830 (1990); Molecular and Generál Genetics, 212. 112 - 119 (1988), a na základě těchto sekvencí je možno připravit primery pro PCR. Takové primery DNA jsou v příkladech specificky uváděny jako DNA 23-merů, které mají nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID No: 16 ve výpisu sekvencí (odpovídající číslům nukleotidů 11 až 33 v nukleotidové sekvenci popsané v Molecular Microbioloqy, 4(11), 1819 - 1830 (1990) a SEQ ID No: 17 (odpovídající číslům nukleotidů 1370 až 1392 v nukleotidové sekvenci popsané v Molecular and Generál Genetics, 212, 112 - 119 (1988). Syntéza DNA, PCR a příprava plazmidu obsahujícího získaný gen lysA může být provedena stejným způsobem jako u výše popsaného IvsC.
Pro zesílení lysA byl v dále uvedených příkladech použit fragment DNA, obsahující promotor, arqS a lysA. Pro předkládaný vynález však arqS není nezbytný. Je možné použít fragmentu DNA ve kterém je lysA ligován právě po směru translace vzhledem k promotoru.
Příklad nukleotidové sekvence fragmentu DNA obsahujícího arqS a lysA a aminokyselinové sekvence odvozené ze sekvence nukleotidů, jsou uvedeny v SEQ ID No: 18. Příklad sekvence aminokyselin kódovaný arqS je uveden v SEQ ID No: 19 a příklad aminokyselinové sekvence kódované lysA ie uveden v SEQ ID No: 20. Navíc k fragmentům DNA kódujícím tyto aminokyselinové sekvence • ·
mohou být v předkládaném vynálezu ekvivalentně použity fragmenty DNA kódující v podstatě stejné sekvence aminokyselin jako sekvence aminokyselin uvedená v SEQ ID No: 20, totiž sekvence aminokyselin s mutacemi založenými například na substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin za předpokladu, že tyto změny nemají podstatný vliv na aktivitu DDC.
5. Příprava ddh
Fragment DNA obsahující ddh ie možno připravit z chromozomu koryneformní bakterií pomocí PCR. Výběr donoru DNA není zvláště omezen, avšak v příkladech se uvádí kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
Gen DDH je znám pro Corvnebacterium olutamicum (Ishino, S. a další, Nucleíc Acids Res., 15, 3917 (1987) a na jeho základě je možno připravit primery pro PCR. Příklady těchto primerů DNA jsou uvedeny jako DNA 20-merů s nukleotidovými sekvencemi uvedenými v SEQ ID No: 21 a 22 ve výpisu sekvencí. Syntéza DNA, PCR a příprava plazmidů obsahujícího získaný ddh může být provedena stejným způsobem jako pro výše popsaný lysC.
Sekvence nukleotidů fragmentu DNA kódujícího ddh a sekvence aminokyselin odvozená z této nukleotidové sekvence jsou uvedeny v SEQ ID No: 23. Pouze aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID No: 24. Navíc k fragmentům DNA kódujícím tuto sekvenci aminokyselin může předkládaný vynález ekvivalentně použít fragmenty DNA kódující v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin jako je sekvence aminokyselin ukázaná v SEQ ID No: 24, totiž sekvenci aminokyselin s mutacemi založenými například na substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin za předpokladu, že nemají podstatný vliv na aktivitu DDH.
- 15 ·· ·· · ···· • ··· ·'. ♦ · ···· · ····· · · · ·· · · ···· 9 9 9 9 (2} Rekombinantní DNA a koryneformní bakterie podle předkládaného vynálezu
Koryneformní bakterie podle předkládaného vynálezu nese aspartokinázu (mutantní AK), ve které je v podstatě vyřazena 5 zpětnovazebná inhibice L-lyzinem a L-threoninem, zatímco DNA (dapB), kódující dihydrodipikolinát reduktázu je zesílena. V předkládaném vynálezu je koryneformní bakterií ve výhodném provedení koryneformní bakterie, ve které je dále zesílena DNA (dapA), kódující dihydrodipikolinát syntázu. V ještě výhodnějším io provedení je koryneformní bakterií podle předkládaného vynálezu koryneformní bakterie, ve které je dále zesílena DNA (lysA), kódující diaminopimelát dekarboxylázu. V ještě výhodnějším provedení je koryneformní bakterií podle předkládaného vynálezu koryneformní bakterie, ve které je dále zesílena DNA (ddh), kódující diaminopimelát 15 dehydrogenázu.
Termín „zesílení“ DNA zde označuje skutečnost, že intracelulární aktivita enzymu, kódovaného DNA, je zvýšena například zvýšením počtu kopií v genu, použitím silného promotoru, použitím genu kódujícího enzym s vysokou specifickou aktivitou nebo použitím 20 kombinace těchto prostředků.
Koryneformní bakterií nesoucí mutantní AK může být bakterie, která produkuje mutantní aspartokinázu v důsledku mutace nebo bakterie, které jsou transformovány zavedením mutantního lysC.
Příklady koryneformní bakterie použité pro zavedení výše 25 uvedené DNA například zahrnují následující kmeny produkující lyzin standardního typu.:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;
Corynebacterium acetoqlutamicum ATCC 15806;
Corynebacterium callunae ATCC 15991;
- 16 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032;
(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020;
(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869;
(Corynebacterium lilium) ATCC 15990;
(Brevibacterium flavum) ATCC 14067;
Corynebacterium melassecola ATCC 17965;
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;
Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibacterium thioqenitalis ATCC 19240;
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
Kromě výše uvedených bakteriálních kmenů zahrnují kmeny použitelné jako hostitelské například mutantní kmeny se schopností produkovat L-lyzin, odvozené z výše uvedených kmenů. Takové umělé mutantní kmeny zahrnují následující: mutantní kmeny rezistentní k S(2-aminoethyl)-cysteinu (zde zkracované jako „AEC“) (Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-1147), japonská zveřejněná přihláška No. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 5810075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 a 7-112438); mutantní kmeny, které jsou rezistentní k AEC a vyžadují aminokyseliny jako je L-leucin, L-homoserin, L-prolin, L-serin, Larginin, L-alanin a L-valin (US patenty No. 3,708,395 a 3,825,472); mutantní kmeny produkující L-lyzin, které jsou rezistentní na DL-aamino-s-kaprolaktam, α-amino-lauryllaktam, aspartátový analog, sulfoléčiva, chinoid a N-lauroylleucin; mutantní kmeny produkující Llyzin, které jsou rezistentní na inhibitory oxyaloacetát dekarboxylázy nebo enzymů respiračního systému Qaponská zveřejněná patentová
- 17 • ·· · · · · · ·· • · · · · · » · ··· · · ··· ··· ··· • ·· ·· ·· ···· ·· ·· přihláška No. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 a 56-39778 a japonská zveřejněná přihláška No. 53-43591 a 53-1833); mutantní kmeny produkující Llyzin, které vyžadují inozitol nebo kyselinu octovou (japonské zveřejněné patentové přihlášky No. 55-9784 a 56-8692); mutantní kmeny produkující L-lyzin, které jsou citlivé na fluoropyruvát nebo teploty, které nejsou menší než 34 °C (japonská zveřejněná patentová přihláška No. 55-9783 a 53-86090); a produkční mutantní kmeny náležející do rodu Brevibacterium nebo Corynebacterium, které jsou rezistentní k ethylenglykolu a produkují L-lyzin (US patent No. 4,411,997).
Ve specifickém provedení se pro zesílení genů biosyntézy Llyzinu u hostitele jak je popsáno výše zavádějí geny do hostitele použitím plazmidového vektoru, transpozonu nebo fágového vektoru apod. Po zavedení se očekává, že dojde k zesílení do určité míry i v případě použití vektoru s nízkým počtem kopií. Je však výhodné použít vektoru s větším počtem kopií. Takové vektory zahrnují například plazmidové vektory pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 a pAJ440 popsané výše. Mimoto se v mezinárodních zveřejněných přihláškách WO 02/02627 a WO 93/18151, evropské zveřejněné přihlášce No. 445385, japonské patentové zveřejněné přihlášce No. 646867, Vertes, A. A. a další, Mol. Microbiol., 11, 739 - 746 (1994, Bonamy, C., a další, Mol. Microbiol., 14, 571 - 581 (1994), Vertes, A. A. a další, Mol. Gen. Genet., 245, 397 - 405 (1994), Jagar, W. a další, FEMS Microbiology Letters, 126, 1 - 6 (1995), japonská zveřejněná patentová přihláška No. 7-107976, japonská zveřejněná patentová přihláška No. 7-327680 apod. popisují transpozony odvozené z koryneformní bakterie.
V předkládaném vynálezu není nezbytné, aby byl mutantní IvsC nutně zesílen. Je možné použít kmeny, které mají mutaci na lysC nebo chromozomální DNA, nebo ve kterých je mutantní lysC včleněn do
- 18• · · · · · · ·· ··«· ·· · to.
chromozomální DNA. Alternativně může být mutantní lysC zaveden použitím plazmidového vektoru. Na druhé straně pro produkci L-lyzinu s vysokou účinností je výhodné zesílení dapA, dapB. lysA a ddh.
Každý z genů lysC, dapA. dapB, lysA a ddh může být do hostitele úspěšně zaveden s použitím různých vektorů. Alternativně mohou být dva, tři, čtyři nebo pět z těchto genů zavedeny společně použitím jediného vektoru. Jestliže se použije různých vektorů, geny mohou být~zaváděny v jakémkoliv pořadí, je však výhodné použít vektory, které jsou v hostiteli stabilní a které jsou schopny vzájemné koexistence.
Koryneformní bakterie nesoucí mutantní AK a dále obsahující zesílený dapB se například získává zavedením rekombinantní DNA obsahující mutantní lysC a dapB, která se v buňkách koryneformní bakterie autonomně replikuje, do hostitelské koryneformní bakterie.
Koryneformní bakterie dále obsahující zesílený dapA navíc k mutantnímu lysC a dapB se například získá zavedením rekombinantní DNA obsahující mutantní lysC, dapB a dapA, která se v buňkách koryneformní bakterie autonomně replikuje, do hostitelské koryneformní bakterie.
Koryneformní bakterie dále obsahující zesílený lysA navíc k mutantnímu lysC, dapB a dapA se například získá zavedením rekombinanční DNA, obsahující mutantní lysC, dapB, dapA a lysA, která se v buňkách koryneformní bakterie autonomně replikuje, do hostitelské koryneformní bakterie.
Koryneformní bakterie dále obsahující zesílený ddh navíc k mutantnímu lysC, dapB, dapA a lysA se například získá zavedením rekombinanční DNA, obsahující mutantní lysC, dapB, dapA, lysA a ddh, která se v buňkách koryneformní bakterie autonomně replikuje, do hostitelské koryneformní bakterie.
- 19 « «« ·· *· ·· ·· ,, · · ···· ···· ,,···· ·· ··» · · * · · ··· ··· ··· ·· ·· ···· ·· ··
Výše uvedené rekombinantní DNA mohou být získány například vložením každého z genů, který se účastní biosyntézy L-lyzinu, do vektoru jako je plazmidový vektor, transpozon nebo fágový vektor, jak bylo popsáno výše.
V případě, že se jako vektoru použije plazmidu, rekombinantní DNA může být do hostitele zavedena pomocí elektropulzní metody (Sugimoto a další, japonská zveřejněná patentová přihláška No. 2207791). Zesílení genu s použitím transpozonu je možno provést zavedením plazmidu, nesoucího transpozon, do hostitelské buňky a indukcí transpozice transpozonu.
(3) Způsob výroby L-lyzinu
L-lyzin může být účinně vyráběn kultivací koryneformní bakterie, obsahující zesílené geny biosyntézy L-lyzinu jak bylo popsáno výše ve vhodném médiu, produkcí a akumulací L-lyzinu v kultuře bakterií a izolací L-lyzinu z kultury.
Příkladem použitelného média je obvyklé médium obsahující zdroj uhlíku, zdroj dusíku, anorganické ionty a popřípadě další organické složky.
Jako zdroj uhlíku je možné použít cukry jako je glukóza, fruktóza, sacharóza, melasa a hydrolyzovaný škrob; a organické kyseliny jako je kyselina fumarová, kyselina citrónová a kyselina jantarová.
Jako zdroj dusíku je možné použít anorganické amonné soli jako je síran amonný, chlorid amonný, fosforečnan amonný; a organické zdroje dusíku jako sojový hydrolyzát; dále plynný amoniak a vodný roztok amoniaku.
- 20 • ··
9« 99 99 99 • · 9 · 9 9 · 9 ·
9 9 9 9 99
9999 99 99V 9 9
9 9 9 9 9 ·
9999 99 99
Jako zdroje stopových živin je vhodné použít látek, které obsahují například vitamin Bi a L-homoserin nebo kvasničný extrakt apod. ve vhodném množství. Pokud je nutné, mohou být z jiných stopových látek v malých množstvích použity fosforečnan draselný, síran hořečnatý, iont železa, manganu apod.
Kultivace se s výhodou provádí za aerobních podmínek po dobu přibližně 30 až 90 hod. Kultivační teplota se v průběhu kultivace s výhodou řídí při 25 až 37 °C a pH při 5 až 8. Pro nastavení pH je možno použít organických, kyselých nebo alkalických látek nebo plynného amoniaku apod. L-lyzin je možno z kultury izolovat kombinací běžného způsobu založeného na iontoměničové pryskyřici, srážecí metody a jiných známých způsobů.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ilustruje způsob konstrukce plazmidů p399AKYB a p399AK9B, obsahujících mutantní lysC.
Obr. 2 ilustruje způsob konstrukce plazmidů pDPRB, obsahující dapB a Brevi.-ori.
Obr. 3 ilustruje způsob konstrukce plazmidů pDPSB, obsahující dapA a Brevi.-ori.
Obr. 4 ilustruje způsob konstrukce plazmidů p299LYSA, obsahující lysA.
Obr. 5 ilustruje způsob konstrukce plazmidů pLYSAB, obsahující lysA a Brevi.-ori.
Obr. 6 ilustruje způsob konstrukce plazmidů pPK4D, obsahující ddh a Brevi.-ori.
Obr. 7 ilustruje způsob konstrukce plazmidů pCRCAB, obsahující lysC, dapB a Brevi.-ori.
• ·
-21 Obr. 8 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCB, obsahující mutantní lysC, dapB a Brevi.-ori.
Obr. 9 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pAB, obsahující dapA, dapB a Brevi.-ori.
Obr. 10 ilustruje způsob konstrukce plazmidu p399DL, obsahující ddh, a lysA.
Obr. 11 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pDL, obsahující ddh, lysA a Brevi.-ori.
Obr. 12 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCAB, obsahující io mutantní lysC, dapA, dapB a Brevi.-ori.
Obr. 13 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCABL, obsahující lysC, dapA, dapB, lysA a Brevi.-ori.
Obr. 14 ilustruje způsob konstrukce plazmidu pCABDL, obsahující lysC, dapA, dapB, ddh, lysA a Brevi.-ori.
Předkládaný vynález bude podrobněji vysvětlen níže na následujících příkladech.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Příprava genu lysC standardního typu a mutantního genu lysC z bakterie Brevibacterium lactofermentum (1) Příprava genů lysC standardního a mutantního typu a příprava plazmidů, které je obsahují
Kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 a L-lyzin produkující mutantní kmen AJ3445 (FERM P-1944), získaný z kmene ATCC 13869 mutací byly použity jako dárci chromozomální DNA.
-22• · · · · ·· • · · · ···· · • · · · · · ·· 9 9·· ·· · *
Mutace kmene AJ3445 byla provedena tak, aby byl gen lysC změněn pro dosažení v podstatě úplného vyřazení spřažené inhibice lyzinem a threoninem (Journal of Biochemistrv, 68, 701 - 710 (1970).
Pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce; viz White, T. J. a další, Trends Genet,, 5, 185 (1989) byl z chromozomální DNA amplifikován fragment DNA obsahující lysC. Jako primery byly pro amplifikaci syntetizovány jednořetězcový 23-mer a 21-mer DNA s nukleotidovou sekvencí ukázanou v SEQ ID No: 1 a 2, aby došlo k amplifikaci oblasti o velikosti přibližně 1644 BP kódující lysC, založený na sekvenci známé pro Corvnebacterium qlutamicum (viz Molecular Microbioloqy (1991), 5(5), 1197 - 1204; a Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317 - 324). DNA byla syntetizována obvyklým způsobem s použitím DNA syntezátoru model 380B firmy Applied Biosystems použitím fosfoamiditové metody (viz Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859).
Gen byl amplifikován pomocí PCR použitím přístroje DNA Thermal Cycler Model PJ2000 firmy Takara Shuzo a Taq DNA polymerázy v souladu s doporučením dodavatele. Vznik zesíleného genového fragmentu o velikosti 1643 kb byl potvrzen elektroforézou na agarózovém gelu. Potom byl obvyklým způsobem fragment vyříznutý z gelu vyčištěn a štěpen restrikčními enzymy Nrul (firmy Takara Shuzo) a EcoRI (firmy Takara Shuzo).
Jako klonovacího vektoru pro genový fragment bylo použito plazmidu pHSG399 (viz Takeshita, S. a další, Gene (1987), 61, 63 64). pHSG399 byl štěpen restrikčními enzymy Smál (firmy Takara Shuzo) a EcoRI a byl ligován s amplifikovaným fragmentem lysC. DNA byla ligována s použitím ligačního kitu DNA (firma Takara Shuzo) podle doporučené metody. Byly tedy připraveny plazmidy, ve kterých byly fragmenty lysC, amplifikované z chromozomů Brevibacterium lactofermentum ligovány s pHSG399. Plazmid obsahující gen lysC z ATCC 13869 (kmen standardního typu) byl označen jako p399AKY • · a plazmid obsahující lysC z AJ3463 (bakterie produkující L-lyzin) byl označen jako p399AK9.
Fragment DNA (zde označovaný jako „Brevi.-ori“) se schopností vytvářet plazmid autonomně se replikující v bakterii rodu 5 Corynebacterium byl zaveden do p399AKY a p399AK9 s cílem připravit plazmidy nesoucí lysC, které se autonomně replikují v bakterii rodu Corynebacterium. Brevi.-ori byl připraven z plazmidového vektoru pHK4 obsahujícího Brevi.-ori a autonomně se replikujícího v buňkách jak Escherichia coli tak i v bakteriích rodu 10 Corynebacterium. pHK4 byl zkonstruován štěpením pHC4 Kpnl (firmy Takara Shuzo) a BamHI (firmy Takara Shuzo), extrakcí fragmentu Brevi.-ori a jeho ligací s pHSG298, který byl rovněž štěpen Kpnl a BamHI (viz japonská zveřejněná přihláška No. 5-7491). pHK4 hostiteli poskytuje rezistenci na kanamycin. Escherichia coli nesoucí pHK4 15 byla označena jako Escherichia coli AJ13136 a uložena 1. 8. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-5186 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).
2o pHK4 byl štěpen restrikčními enzymy Kpnl a BamHI a štěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo provedeno s použitím soupravy DNA Blunting kit (firmy Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření rovných konců byl ligován fosforylovaný BamHI linker (firmy Takara Shuzo) pro dosažení takové 25 úpravy, že DNA fragment odpovídající části Brevi.-ori může být vyštěpen z pHK4 štěpením samotným BamHI. Tento plazmid byl štěpen BamHI a vytvořený DNA fragment Brevi.-ori byl ligován s p399AKY a p399AK9, které byly rovněž štěpeny BamHI za vytvoření plazmidů, které vždy obsahovaly gen lysC autonomně se replikující 3o v bakterii rodu Corynebacterium.
• · *«♦·········· • · · ··· ··· ··· ·· ·· ♦··· ·♦ ··
- 24 Plazmid obsahující gen IvsC standardního typu pocházející z p399AKY byl označen jako p399AKYB a plazmid obsahující mutantní gen IvsC pocházející z p399AK9 byl označen jako p399AK9B. Způsob konstrukce p399AK9B a p399AKYB je ukázán na obr. 1. Kmen 5 AJ12691 získaný zavedením mutantního plazmidu IvsC p399AK9B do kmene Brevibacterium lactofermentum standardního typu (kmen AJ12036, FERM BP-374) byl uložen 10. 4. 1993 pod depozitním číslem FERM P-12918 u National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of io Ministry of International Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) a převeden na mezinárodní uložení podle Budapešťské dohody 10. 2. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-4999.
(2) Stanovení nukleotidových sekvencí IvsC standardního typu a mutantního typu z Brevibacterium lactofermentum
Plazmid p399AKY obsahující IvsC standardního typu a plazmid p399AK9 obsahující mutantní IvsC byly připraveny z příslušných transformantů s cílem určit nukleotidové sekvence mutantního 2o a standardního IvsC. Stanovení nukleotidové sekvence bylo provedeno Sangerovou metodou (například F. Sanger a další, Proč. Nati. Acad. Sci., 74, 5463 (1977).
Nukleotidové sekvence lysC standardního typu kódovaného p399AKY je ukázána v SEQ ID No: 3 ve výpisu sekvencí.
Nukleotidové sekvence mutantního IvsC kódovaného p399AK9 měla jedinou mutaci na jednom nukleotidu, kde G v poloze 1051 byl změněn v SEQ ID No: 3 na A ve srovnání s IvsC standardního typu. Je známo, že lysC Corynebacterium qlutamicum má dvě podjednotky (α, β), kódované v identickém čtecím rámci na identickém řetězci DNA (viz 3o Kalinowski, J. a další, Molecular Microbioloqy (1991) 5(5), 1197 1204). Pokud se usuzuje z homologie, předpokládá se, že zde • · sekvenovaný gen má také dvě podjednotky (a, b) kódované ve stejném čtecím rámci na identickém řetězci DNA.
Sekvence aminokyselin podjednotky a proteinu AK standardního typu, odvozená se sekvence nukleotidů DNA, je ukázána v SEQ ID No: 4 spolu se sekvencí DNA. Pouze sekvence aminokyselin je uvedena v SEQ ID No: 5. Sekvence aminokyselin β-podjednotky proteinu AK standardního typu, odvozená z nukleotidové sekvence dna, je uvedena v SEQ ID No: 6 spolu s DNA. Pouze aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID No: 7. V každé z podjednotek se jako iniciační kodon používá GTG a odpovídající aminokyselina je methionin. Toto přiřazení však označuje methionin, valin nebo formylmethionin.
Na druhé straně mutace sekvence mutantního genu lysC výskytem substituce aminokyselinového zbytku spočívá v tom, že zbytek alaninu v poloze 279 α-podjednotky je zaměněn za zbytek threoninu a zbytek alaninu v poloze 30 β-podjednotky je zaměněn za zbytek threoninu v sekvenci aminokyselin standardního typu proteinu AK (SEQ ID No: 5 a 7).
Příklad 2: Příprava dapB z Brevibacterium lactofermentum (1) Příprava dapB a konstrukce plazmidu obsahujícího dapB
Jako donor chromozomální DNA byl použit kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 standardního typu. Chromozomální DNA byla připravena z kmene ATCC 13869 standardní metodou. Fragment DNA obsahující dapB byl amplifikován z chromozomální DNA metodou PCR. Pro amplifikaci byly použity DNA primery založené na 23-merech DNA s nukleotidovými sekvencemi uvedenými ve výpisu sekvencí jako SEQ ID No: 8 a 9, které byly syntetizovány pro zesílení oblasti o velikosti přibližně 2,0 kb, kódující DDPR podle sekvence známé pro
- 26 Brevibacterium lactofermentum (viz Journal of Bacteriology, 157(9), 2743 - 2749 (1993). Syntéza DNA a PCR byly prováděny stejným způsobem jak se popisuje v příkladu 1, Jako klonovací vektor pro amplifikovaný genový fragment o velikosti 2001 bp, který byl ligován 5 s amplifikovaným fragmentem dapB, byl použit plazmid pCR-Script (firma Invitrogen).
Byl tedy zkonstruován plazmid, ve kterém byl fragment dapB o velikosti 2001 bp, amplifikovaný z chromozomu Brevibacterium lactofermentum. ligován s plazmidem pCR-Script. Plazmid získaný io výše popsaným způsobem, jehož dapB ppchází z ATCC13869, byl označen jako pCRDAPB. Transformantní kmen AJ13107, získaný zavedením pCRDAPB do E. coli JM109 byl mezinárodně uložen
26. 5. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-5114 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science 15 and Technology of Ministry of International Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) v souladu s Budapešťskou úmluvou.
Štěpením pCRDAPB enzymem EcoRV a Sphl byl extrahován fragment o velikosti 1101 bp obsahující strukturní gen DDPR. Tento 2o fragment byl ligován s pHSG399, který byl štěpen Hincll a Sphl pro přípravu plazmidu. Připravený plazmid byl označen jako p399DPR.
Do připraveného p399DPR byl zaveden Brevi.-ori za vytvoření plazmidu nesoucího dapB, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. pHK4 byl štěpen restrikčním enzymem Kpnl (firma Takara 25 Shuzo) a štěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo vytvořeno použitím sady DNA Blunting Kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření tupého konce byl ligován fosforylovaný linker BamHI (firmy Takara Shuzo) pro vytvoření takové modifikace, aby fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori mohl být z 30 pHK4 vyříznut pouze enzymem BamHI. Tento plazmid byl štěpen BamHI a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s p399DPR, • · · ·
který byl také štěpen BamHI za vytvoření plazmidu, obsahujícího dapB, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Připravený plazmid byl označen jako pDPRB. Postup konstrukce pDPRB je ukázán na obr. 2.
(2) Stanovení nukleotidové sekvence dapB z Brevibacterium lactofermentum
Plazmidová DNA byla připravena z kmene AH13107 nesoucího p399DPR a nukleotidová sekvence byla určena stejným způsobem, jak io bylo popsáno v příkladu 1. Zjištěná nukleotidová sekvence a z ní odvozená aminokyselinová sekvence jsou uvedeny v SEQ ID No: 10. Samotná aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID No: 11.
Příklad 3: Příprava dapA z Brevibacterium lactofermentum (1) Příprava dapA a konstrukce plazmidu obsahujícího dapA
Jako donoru chromozomální DNA bylo použito kmene
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Chromozomální DNA byla připravena z kmene ATCC 13869 obvyklou metodou. Fragment 20 DNA obsahující gen dapA byl pomocí PCR amplifikován z chromozomální DNA. Jako primery DNA použité pro amplifikaci byly syntetizovány 20-mery DNA s nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No: 12 a 13 ve výpisu sekvencí, aby bylo dosaženo amplifikace oblasti o velikosti přibližně 1,5 kb kódující DDPS, 25 založené na sekvenci známé pro Corynebacterium qlutamicum (viz
Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL No. X53993).
Syntéza DNA a PCR byly provedeny stejným způsobem jak bylo popsáno v příkladu 1. Jako klonovací vektor pro amplifikovaný genový fragment o velikosti 1411 bp, který byl ligován s amplifikovaným fragmentem dapA, byl použit pCR1000 (firma Invitrogen, viz • · • · · · ; ·· · · · · · ·· • φ φ « · I · ♦ · ···· · ··· · · · ·♦· - 28 - ....... ···· ·* “
Bio/Technology, 9, 657 - 663 (1991). Ligace DNA byla provedena s použitím sady DNA ligation kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Byl tedy zkonstruován plazmid, ve kterém byl fragment dapA o velikosti 1411 bp amplifikovaný z chromozomu Brevibacterium lactofermentum ligován s pCR1000. Plazmid získaný uvedeným postupem, který obsahoval gen dapA pocházející z ATCC 13869, byl označen jako pCRDAPA.
Transformovaný kmen AJ13106, získaný zavedením pCRDAPA do E. coli JM109 byl podle mezinárodních předpisů uložen 26. 5. 1995 pod depozitním číslem FERM BP-5113 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry (adresa: 305, 1 - 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) v souladu s Budapešťskou úmluvou.
Do připraveného pCRDAPA byl vložen Brevi.-ori pro vytvoření plazmidu, nesoucího dapA, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. pHK4 byl štěpen restrikčními enzymy Kpnl a BamHI (firma Takara Shuzo) a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo dosaženo použitím sady DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaných konců byl ligován fosforylovaný linker Smál (firma Takara Shuzo) pro vytvoření modifikace, aby mohl být fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori vyříznut z pHK4 štěpením pouze Smál. Tento plazmid byl štěpen Smál a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s pCRDAPA, který byl rovněž štěpen Smál, za vytvoření plazmidu obsahujícího dapA. autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. Tento plazmid byl označen jako pDPSB. Způsob konstrukce pDPSB(Kmr) je ukázán na obr. 3.
• · · · · • · · ♦ · · • · ·
9Λ·9 ·♦ ··
- 29 (2} Stanovení nukleotidové sekvence dapA z Brevibacterium lactofermentum
Byla připravena plazmidová DNA z kmene AJ13106, nesoucího pCRDAPA a stejným způsobem jak bylo popsáno v příkladu 1 byla určena její nukleotidová sekvence. Zjištěná nukleotidová sekvence a z ní odvozená sekvence aminokyselin jsou uvedeny v SEQ ID No: 14. Samotná aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID No: 15.
Příklad 4: Příprava lysA z Brevibacterium lactofermentum (1) Příprava lysA a konstrukce plazmidu obsahujícího lysA
Jako dárce chromozomální DNA byl použit kmen Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 standardního typu. Chromozomální DNA byla připravena z kmene ATCC 13869 obvyklým způsobem. Potom byl pomocí PCR z chromozomální DNA amplifikován fragment DNA, obsahující arqS, lysA a promotor operonu, který je obsahuje. Jako DNA primery použité pro amplifikaci byly syntetizovány 23-mery DNA s nukleotidovou sekvencí, uvedenou v SEQ ID No: 16 a 17 ve výpisu sekvencí, aby bylo dosaženo amplifikace oblasti o velikosti přibližně
3,6 kb kódující arginyl-tRNA syntézu a DDC, založené na sekvenci známé pro Corynebacterium qlutamicum (viz Molecular Microbioloqy, 4(11), 1819 - 1830 (1990); Molecular and Generál Genetics, 212, 112 - 119 (1988). Syntéza DNA a PCR byly provedeny stejným způsobem jak bylo popsáno v příkladu 1. Jako klonovací vektor pro amplifikovaný genový fragment o velikosti 3579 bp byl použit pHSG399. pHSG399 byl štěpen restrikčním enzymem Smál (firma Takara Shuzo), a byl ligován s fragmentem DNA obsahujícím amplifikovaný lysA. Plazmid získaný postupem, který byl popsán výše, který obsahoval lysA pocházející z ATCC 13869, byl označen jako p399LYSA.
• ·
Fragment DNA obsahující lysA byl extrahován štěpením p399LYSA Koni (firma Takara Shuzo) a BamHI (firma Takara Shuzo). Tento fragment DNA byl ligován s pHSG, který byl rovněž štěpen Kpnl a BamHI. Získaný plazmid byl označen jako p299LYSA. Způsob konstrukce p299LYSA je ukázán na obr. 4.
Do získaného p299LYSA byl zaveden Brevi.-ori pro vytvoření plazmidu, nesoucího lysA, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. pHK4 byl štěpen restrikčními enzymy Kpnl a BamHI a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo provedeno použitím sady DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaných konců byl ligován fosforylovaný linker Kpnl (firma Takara Shuzo) pro získání takové modifikace, aby mohl být fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori vyříznut z pHK4 štěpením samotným Kpnl. Tento plazmid byl štěpen Kpnl a získaný fragment Brevi.-ori DNA byl ligován s p299LYSA, který byl rovněž štěpen Kpnl, za vytvoření plazmidu obsahujícího lysA, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. Připravený plazmid byl označen jako pLYSAB. Způsob konstrukce pLYSAB je uveden v obr. 5.
(2) Stanovení nukleotidové sekvence lysA z Brevibacterium lactofermentum
Byla připravena plazmidová DNA p299LYSA a stejným způsobem jako v příkladu 1 byla určena její nukleotidové sekvence. Zjištěná nukleotidové sekvence a z ní odvozená sekvence aminokyselin jsou uvedeny v SEQ ID No: 18. Co se týče nukleotidové sekvence, sekvence aminokyselin kódovaná arqS a sekvence aminokyselin kódovaná lysA jsou uvedeny v SEQ ID No: 19 a 20.
• · · · · • · · · • · · · · • » · ·
- 31 - .......
Příklad 5: Příprava ddh z Brevibacterium lactofermentum
Gen ddh byl získán amplifikací ddh genu z chromozomální DNA bakterie Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 metodou PCR použitím dvou oligonukleotidových primerů (SEQ ID No: 21 a 22), připravených podle známé nukleotidové sekvence genu ddh Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. a další, Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987). Získaný amplifikovaný fragment DNA byl štěpen EcoT22l a -Aval a rozštěpené konce byly zarovnány. Potom byl fragment vložen do místa Smál plazmidu pMW119 za získání plazmidu pDDH.
Potom byl pDDH štěpen Sall a EcoRI, a vytvořené konce byly zarovnány. Získaný fragment byl pak ligován s pUC18, štěpeným enzymem Smál. Takto získaný plazmid byl označen jako pUC18DDH.
Do pUC18DDH byl zaveden Brevi.-ori za vytvoření plazmidu nesoucího ddh, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. pHK4 byl štěpen restrikčními enzymy Kpnl a BamHI a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo dosaženo použitím sady DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaného konce byl ligován fosforylovaný linker Pstl (firma Takara Shuzo) tak, že byl vložen do místa Pstl pHSG299. Takto zkonstruovaný plazmid byl označen jako pPK4. Potom byl pUC18DDH štěpen Xbal a Kpnl a vytvořený fragment byl ligován s pPK4, který byl štěpen rovněž Kpnl a Xbal. Takto byl získán plazmid obsahující gen ddh, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Tento plazmid byl označen jako pPK4D. Způsob konstrukce pPK4D je uveden na obr. 6.
• ·
·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · ·· • · · · · ··· · • · · · · • β ♦··· · ♦ ··
Příklad 6: Konstrukce plazmidů obsahující kombinaci mutantního IvsC a dapA
Plazmid obsahující mutantní IvsC, dapA a počátek replikace koryneformní bakterie byl zkonstruován z plazmidů pCRDAPA, obsahujícího dapA a plazmidů p399AK9B, obsahujícího mutantní IvsC a Brevi.-ori. p399AK9B byl úplně degradován Sall a potom byly vytvořeny zarovnané konce, ke kterým byl ligován linker EcoRI pro vytvoření ptazmidu, ve kterém bylo místo Sall modifikováno na štěpící místo EcoRI. Získaný plazmid byl označen jako p399AK9BSE. Mutantní lysC a Brevi.-ori byly vyříznuty jako jeden fragment částečným štěpením p399AK9BSE enzymem EcoRI. Tento fragment byl ligován s pCRDAPA, štěpeným rovněž EcoRI. Získaný plazmid byl označen jako pCRCAB. Tento plazmid je schopný autonomní replikace v E, coli a koryneformní bakterie a poskytuje hostiteli kanamycinovou rezistenci, přičemž obsahuje kombinaci mutantního IvsC a dapA. Způsob vytvoření pCRCAB je uveden v obr. 7.
Příklad 7: Konstrukce plazmidů obsahujícího mutantní IvsC a dapB
Plazmid obsahující mutantní IvsC a dapB byl zkonstruován z plazmidů p399AK9 s mutantním lysC a plazmidů p399DPR s dapB. Fragment o velikosti 1101 bp nesoucí strukturní gen DDPR byl extrahován štěpením p399DPR EcoRV a Sphl. Tento fragment byl ligován s p399AK9, který byl štěpen Sall a rozštěpené konce byly potom zarovnány a dále byl štěpen Sphl pro vytvoření plazmidů, obsahujícího kombinaci mutantního IvsC a dapB. Tento plazmid byl označen jako p399AKDDPR.
Do získaného p399AKDDPR byl zaveden Brevi.-ori. Plazmid pHK4 obsahující Brevi.-ori byl štěpen restrikčním enzymem Kpnl (firma Takara Shuzo) a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo dosaženo použitím soupravy DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření
zarovnaných konců byl ligován fosforylovaný linker BamHI (firma Takara Shuzo) pro vytvoření takové modifikace, že fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori může být vyříznut z pHK4 štěpením samotnou BamHI. Tento plazmid byl štěpen BamHI a vytvořený 5 fragment Brevi.-ori DNA byl ligován s p399AKDDPR, který byl rovněž štěpen BamHI, za vytvoření plazmidu obsahujícího mutantní lysC a dapB, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pCB. Způsob konstrukce pCB ukazuje obr. 8.
Příklad 8: Konstrukce plazmidu, obsahujícího kombinaci dapA a dapB
Plazmid pCRDAPA obsahující dapA byl štěpen Kpnl a EcoRI pro vyříznutí fragmentu DNA obsahujícího dapA, který byl ligován s vektorovým plazmidem pHSG399, který byl předtím rovněž rozštěpen Kpnl a EcoRI. Získaný plazmid byl označen jako p399DPS.
Na druhé straně byl plazmid pCRDAPB, obsahující dapB, štěpen
Sacll a EcoRI pro vyštěpení fragmentu DNA o velikosti 2,0 kb, obsahující oblast kódující DDPR, která byla ligována s p399DPS, který byl předtím také štěpen Sacll a EcoRI pro vytvoření plazmidu, obsahujícího kombinaci dapA a dapB. Získaný plazmid byl označen jako p399AB.
Potom byl do p399AB zaveden Brevi.-ori. pHK4 obsahující Brevi.-ori byl štěpen restrikčním enzymem BamHI (firma Takara Shuzo) a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření zarovnaných konců bylo provedeno použitím soupravy DNA Blunting kit (firma 25 Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaného konce byl ligován fosforylovaný linker Kpnl (firma Takara Shuzo) za vytvoření takové modifikace, že fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori může být vyštěpen z pHK4 štěpením pouze Kpnl. Tento plazmid byl štěpen Kpnl a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl 30 ligován s p399AB, který byl předtím rovněž rozštěpen enzymem Koni, za vytvoření plazmidu obsahujícího dapA a dapB, autonomně se • ·
replikující v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pAB. Způsob konstrukce pAB ukazuje obr. 9.
Příklad 9: Konstrukce plazmidu obsahujícího kombinaci ddh a lysA
Plazmid pUC18DDH obsahující ddh byl štěpen EcoRI a Xbal pro vyštěpení fragmentu DNA obsahujícího ddh. Tento fragment ddh byl ligován s plazmidem p399LYSA obsahujícím lysA, předem štěpeným BamHI a Xbal, přičemž po štěpení byly vzniklé konce zarovnány. Získaný plazmid byl označen jako p399DL. Způsob io konstrukce p399DL je uveden v obr. 10.
Potom byl do p399DL zaveden Brevi.-ori. pHK4 byl štěpen Xbal a BamHI a štěpené konce byly zarovnány. Po vytvoření rovných konců byl ligován fosforylovaný linker Xbal za vytvoření takové modifikace, že fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori může být vyštěpen z 15 pHK4 štěpením samotným Xbal. Tento plazmid byl štěpen Xbal a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s p399DL, který byl předtím rovněž štěpen Xbal za vytvoření plazmidu, obsahujícího ddh a lysA, autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pDL. Postup konstrukce pDL je ukázán na 2o obr. 11.
Příklad 10: Konstrukce plazmidu obsahujícího mutantní IvsC, dapA a dapB p399DPS byl štěpen EcoRI a Sphl za vytvoření zarovnaných 25 konců a poté bylo provedeno vyštěpení genu dapA. Tento fragment byl ligován s p399AK9, který byl štěpen Sall a vytvořené konce byly zarovnány, za vytvoření plazmidu p399CA, ve kterém koexistují mutantní IvsC a dapA.
Plazmid pCRDAPB obsahující dapB byl štěpen EcoRI a konce 3o byly zarovnány a potom následovalo štěpení Sací pro získání
• · fragmentu DNA o velikosti 2,0 kb, obsahujícího dapB. Plazmid p399CA obsahující dapA a mutantní lysC byl štěpen Spěl a byly vytvořeny zarovnané konce, a získaný produkt byl štěpen Sací a ligován s vyštěpeným fragmentem dapB za získání plazmidu obsahujícího 5 mutantní lysC, dapA a dapB. Tento plazmid byl označen jako P399CAB.
Potom byl do p399CAB zaveden Brevi.-ori. Plazmid pHK4 obsahující Brevi.-ori byl štěpen restrikčním enzymem BamHI (firma Takara Shuzo) a rozštěpené konce byly zarovnány. Vytvoření 10 zarovnaných konců bylo provedeno soupravou DNA Blunting kit (firma Takara Shuzo) podle doporučení výrobce. Po vytvoření zarovnaných konců byl ligován fosforylovaný linker Kpnl (firma Takara Shuzo) za vytvoření takové modifikace, že fragment DNA odpovídající části Brevi.-ori může být vyříznut z pHK4 štěpením samotným Kpnl. Tento 15 plazmid byl štěpen Kpnl a vytvořený fragment DNA Brevi.-ori byl ligován s p399CAB, který byl rovněž štěpen Kpnl za vytvoření plazmidu, obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA a dapB, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen pCAB. Způsob konstrukce pCAB je ukázán na 2o obr. 12.
Příklad 11: Konstrukce plazmidu obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA, dapB a lysA
Plazmid p299LYSA obsahující lysA byl štěpen Kpnl a BamHI a byly zarovnány rozštěpené konce a potom byl vyštěpen fragment genu lysA. Tento fragment byl ligován s pCAB, štěpeným Hpal (produkt Takara Shuzo) a byly zarovnány jeho konce pro vytvoření plazmidu, obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA. dapB a lysA. autonomně se replikující v koryneformní bakterii. Vytvořený x plazmid byl označen jako pCABL. Způsob vytvoření pCABL je uveden v obr. 13. Je nutno uvést, že gen lysA je vložen do místa Hpal ve
- 36 fragmentu DNA obsahujícím dapB v pCABL, avšak místo Hpal je umístěno proti směru translace vůči promotoru pro gen dapB (polohy nukleotidů 611 až 616 v SEQ ID No: 10).
Příklad 12: Vytvoření plazmidu obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA, dapB, ddh a lysA pHSG299 byl štěpen Xbal a Kpnl a byl ligován s p399DL, obsahujícím ddh a lysA, který byl rovněž štěpen Xbal a Kpnl. Vytvořený plazmid byl označen p299DL. p299DL byl štěpen Xbal a Kpnl a rozštěpené konce byly zarovnány. Po vytvoření zarovnaných konců byl vyříznut fragment DNA obsahující ddh a lysA. Tento fragment DNA byl ligován s plazmidem pCAB, obsahujícím kombinaci mutantního lysC, dapA a dapB, který byl také štěpen Hpal a jeho konce byly zarovnány, za vytvoření plazmidu obsahujícího kombinaci mutantního lysC, dapA, dapB, lysA a ddh, autonomně se replikujícího v koryneformní bakterii. Vytvořený plazmid byl označen jako pCABDL. Způsob konstrukce pCABDL je uveden v obr. 14.
Příklad 13: Zavedení plazmidú obsahujících geny pro biosyntézu Llyzinu do bakterie produkující L-Ivzin Brevibacterium lactofermentum
Plazmidy obsahující geny pro biosyntézu L-lyzinu vytvořené podle výše uvedeného popisu, totiž p399AK9B(Cmr), pDPSB(Kmr), pDPRB(Cmr), pLYSAB(Cmr), pPK4D(Cmr), pCRCAB(Kmr), pAB(Cmr), pCB(Cmr), pDL(Cmr), pCAB(Cmr), pCABL(Cmr), pCABDL(Cmr) byly zavedeny do bakterie produkující L-lyzin AJ11082 (NRRL B-11470) Brevibacterium lactofermentum. Kmen AJ11082 se vyznačuje rezistencí na AEC. Plazmidy byly zaváděny elektropulzní metodou (Sugimoto a další, japonská zveřejněná patentová přihláška No. 2207791). Byly zvoleny transformanty s příslušnou rezistencí na markéry, dodanou jednotlivými plazmidy. Selekce transformantů ·· ·· ·· • · · · « • · · · · • · ··· · • · · ’ ··· ·· ··
- 37 probíhala na úplném médiu obsahujícím 5 pg/ml chloramfenikolu pokud byl prováděn výběr bakterií obsahujících plazmid s rezistencí na chloramfenikol nebo byla selekce prováděna na úplném médiu obsahujícím 25pg/ml kanamycinu, jestliže byl v bakterii přítomen plazmid obsahující gen na rezistenci vůči kanamycinu.
Příklad 14: Produkce L-lyzinu
Každý z transformantú získaných v příkladu 13 byl kultivován v produkčním médiu pro L-lyzin pro zhodnocení schopnosti produkovat L-lyzin. Složení produkčního média pro L-lyzin bylo následující:
Produkční médium pro L-lyzin
Složky podle následujícího seznamu kromě uhličitanu vápenatého byly rozpuštěny a pH bylo hydroxidem draselným upraveno na 8,0 (všechny údaje se vztahují na 1 I). Médium bylo sterilizováno 15 min při 115 °C a potom byl přidán uhličitan vápenatý (50 g), který byl odděleně sterilizován v suchém stavu horkým vzduchem.
Glukóza | 100 g |
(NH4)2SO4 | 55 g |
kh2po4 | 1 g |
MgSO4.7H2O | 1 g |
Biotin | 500 pg |
Thiamin | 2000 pg |
FeSO4.7H2O | 0,01 g |
MnSO4.7H2O | 0,01 g |
Nikotinamid | 5 mg |
·· ·· **. ··.
···· ···· ; ; . · · ··
........ :
- 38 Proteinový hydrolyzát (Mámenou) 30 ml
Uhličitan vápenatý 50 g
Každý z různých typů transformantů a rodičovský kmen byl zaočkován do média s výše uvedeným složením a na třepačce byla 5 provedena kultivace při 31,5 °C. Množství vyprodukovaného lyzinu po 40 nebo 72 hodinách kultivace a růst po 72 hodinách (OD562) jsou uvedeny v tabulce 1. V tabulce IvsC* představuje mutantní IvsC. Růst byl kvantitativně určován měřením OD při 560 nm po 101 násobném zředění.
Tabulka 1
Akumulace L-lyzinu po kultivaci 40 nebo 72 hod
Bakteriální kmen/plazmid | Zavedený qen | Vytvořený L- lyzin (g/i) | Růst (OD562/101) | |
po 40 hod | po 72 hod | |||
AJ11082 | 22,0 | 29,8 | 0,450 | |
AJ11082/ p399AK9B | IvsC* | 16,8 | 34,5 | 0,398 |
AJ11082/ pDPSB | dapA | 18,7 | 33,8 | 0,410 |
AJ11082/ pDPRB | dapB | 19,9 | 29,9 | 0,445 |
AJ11082/ pLYSAB | lysA | 19,8 | 32,5 | 0,356 |
AJ11082/ pPK4D | ddh | 19,0 | 33,4 | 0,330 |
AJ11082/ pCRCAB | IvsC*, dapA | 19,7 | 36,5 | 0,360 |
AJ11082/ pAB | dapA,dapB | 19,0 | 34,8 | 0,390 |
AJ11082/pCB | IvsC*, dapB | 23,3 | 35,0 | 0,440 |
AJ11082/pDL | ddh, IvsA | 23,3 | 31,6 | 0,440 |
AJ11082/ pCAB | IvsC*, dapA, dapB | 23,0 | 45,0 | 0,425 |
• · · « · · ··· <· *· ····
AJ11082/ pCABL | IvsC*, dapA, dapB, lysA | 26,2 | 46,5 | 0,379 |
AJ11082/ pCABDL | IvsC*, dapA, | 26,5 | 47,0 | 0,409 |
dapB, lysA, ddh |
Jak je uvedeno v tabulce 1, pokud se samostatně zesílí mutantní lysC, dapA, nebo dapB, množství vyprodukovaného L-lyzinu bylo větší nebo rovno množství vyprodukovanému rodičovským genem po 72 hodinách 5 kultivace, avšak množství vyprodukovaného L-lyzinu bylo menší, než bylo vytvořeno rodičovským kmenem po 40 hod kultivace. Při krátkodobé kultivaci byla totiž rychlost produkce L-lyzinu snížena. Podobně když byly společně zesíleny mutantní lysC a dapA nebo dapA a dapB, množství vyprodukovaného L-lyzinu bylo po 72 hod io kultivace větší než u rodičovského kmene, avšak po 40 hodinách kultivace bylo množství vytvořeného L-lyzinu menší než u rodičovského kmene. Rychlost produkce L-lyzinu byla tedy snížena.
Na druhé straně, pokud byly lysA nebo ddh zesíleny samostatně, nebo při kombinaci zesílení lysA a ddh, množství 15 vyprodukovaného L-lyzinu bylo po 40 hod kultivace větší než množství vytvořené rodičovským kmenem, avšak množství vytvořeného lyzinu bylo menší než množství vyprodukované rodičovským genem v případě dlouhodobé kultivace, protože došlo ke snížení růstu.
Naopak v případě, když byl dapB zesílen spolu s mutantním 2o lysC, došlo ke zlepšení růstu, rychlost produkce L-lyzinu byla při krátkodobé kultivaci úspěšně zachována a množství nahromaděného L-lyzinu bylo rovněž zvýšeno v případě dlouhodobé kultivace. V případě kmenu, u kterého byly současně zesíleny geny mutantní lysC, dapA a dapB, došlo k dalšímu zlepšení produkce. Jak rychlost 25 produkce L-lyzinu, tak i množství nahromaděného L-lyzinu se postupně zvyšovalo postupným zesilováním lysA a ddh.
• · · · · · · : · ·· • · · · · · ··· · · ·· · · · · · ·
-40 Průmyslová využitelnost
Podle předkládaného vynálezu je možno zvýšit produkční schopnost L-lyzinu koryneformní bakterie a její růstovou rychlost.
Rychlost produkce L-lyzinu a produktivita může být u koryneformní bakterie produkující L-lyzin rovněž zvýšena zesílením dapB spolu s mutantním lysC. Rychlost produkce L-lyzinu a produktivita může být dále zvýšena postupným zvýšením dapA, lysA a ddh navíc k uvedeným genům.
« ·
-41 VÝPIS SEKVENCÍ (1) Obecné informace:
(i) Žadatel: Ajinomoto Co., lne.
(ii) Název vynálezu: Způsob výroby L-lysinu (iii) Počet sekvencí: 24 (iv) Adresa pro korespondenci:
(A) Jméno:
(B) Ulice:
(C) Město:
(E) Země:
(F) PSČ:
(v) Počítačová forma:
(A) Typ media: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1.0, verze # 1.30 (vi) Údaje o předkládané přihlášce (A) Číslo přihlášky (B) Datum podání:
(C) Zařazení do třídění:
(vii) Údaje o předchozí přihlášce:
(A) Číslo přihlášky: JP 7-140614 (B) Datum podání: 7. července 1995 (viii) Informace o zástupci (A) Jméno:
(B) Registrační číslo:
(ix) Telekomunikační informace:
(A) Telefon (B) Telefax:
(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:1:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná .. syntetická DNA (A) POPIS: /desc = synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:2:
ACGGAA1TCA ATCTTACGGC C (2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1643 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
• · • · · · · · · · ···· · • · · ··· ··· ··· ·· ·♦ ·♦·· ·· ·· (A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CITTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180
GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGCTGG CCCTGGTCGT ACAGftAATAT240
GGCGGTTCCT CGCCTGftGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC300
ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT360
GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG420
CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT480
GGCGCAGAAG CTCAATCTIT CACTGGCTCT CAGGCTGCTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC540
GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTCTGC CTGAAGCACT CGATGAGGGC600
AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GITAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG660
ITGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT720
GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT780
AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC840
TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC900
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT960
CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGCTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC1020
GTTCTGGCTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG ITITCCGTGC GTTGGCTGAT1080
GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC1140
GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG1200
CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC1260
CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG1320
CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG1380
ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAG1T CCAGCTGGGC1440
GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT1500
TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA1560
CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTITGCT TCCCCGCGTT1620
CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC1643 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1643 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) • · • ·· · · · · · ·· ···»········· • · · ··· · · · ··· ·· ·· ···· ·♦ ·· (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 s (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 217..1482 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATAŤCA ATATACGGTC60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGITGAGCGG180
GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG234
Met Ala Leu Val Val Gin
AAA | TAT | GGC | GGT | TCC | TCG | CTT | GAG | AGT | GCG | GAA | CGC | ATT | AGA | AAC | GTC | 282 |
Lys | Tyr | Gly Gly | Ser | Ser | Leu | Glu | Ser | Ala | Glu | Arg | Ile | Arg Asn | Val | |||
10 | 15 | 20 | ||||||||||||||
GCT | GAA | CGG | ATC | GTT | GCC | ACC | AAG | AAG | GCT | GGA | AAT | GAT | GTC | GTG | GTT | j30 |
Ala | Glu | Arg | ile | Val | Ala | Thr | Lys | Lys | Ala | Gly | Asn | Asp | Val | Val | Val | |
25 | 30 | 35 | ||||||||||||||
GTC | TGC | TCC | GCA | ATG | GGA | GAC | ACC | ACG | GAT | GAA | CTT | CTA | GAA | CTT | GCA | 378 |
Val | Cys | Ser | Ala | Met | Gly | Asp | Thr | Thr | Asp | Glu | Leu | Leu | Glu | Leu | Ala | |
40 | 45 | 50 | ||||||||||||||
GCG | GCA | GTG | AAT | CCC | GTT | CCG | CCA | GCT | CGT | GAA | ATG | GAT | ATG | CTC | CTG | 42é |
Ala | Ala | Val | Asn | Pro | Val | Pro | Pro | Ala | Arg | Glu | Met | Asp | Met | Leu | Leu | |
55 | 60 | 65 | 70 | |||||||||||||
ACT | GCT | GGT | GAG | CGT | ATT | TCT | AAC | GCT | CTC | GTC | GCC | ATG | GCT | ATT | GAG | 474 |
Thr | Ala | Gly | Glu | Arg | Ile | Ser | Asn | Ala | Leu | Val | Ala | Met | Ala | Ile | Glu | |
75 | 80 | 85 | ||||||||||||||
TCC | CTT | GGC | GCA | GAA | GCT | CAA | TCT | TTC | ACT | GGC | TCT | CAG | GCT | GGT | GTG | 522 |
Ser | Leu | Gly | Ala | Glu | Ala | Gin | Ser | Phe | Thr | Gly | Ser | Gin | Ala | Gly | Val | |
90 | 95 | 100 | ||||||||||||||
CTC | ACC | ACC | GAG | CGC | CAC | GGA | AAC | GCA | CGC | ATT | GTT | GAC | GTC | ACA | CCG | 570 |
Leu | Thr | Thr | Glu | Arg | His | Gly | Asn | Ala | Arg | Ile | Val | Asp | Val | Thr | Pro | |
105 | 110 | 115 | ||||||||||||||
GGT | CGT | GTG | CGT | GAA | GCA | CTC | GAT | GAG | GGC | AAG | ATC | TGC | ATT | GTT | GCT | 513 |
Gly Arg | Val | Arg | Glu | Ala | Leu | Asp | Glu | Gly Lys | Ile | Cys | Ile | Val | Ala | |||
120 | 125 | 130 | ||||||||||||||
GGT | TTT | CAG | GGT | GTT | AAT | AAA | GAA | ACC | CGC GAT | GTC | ACC | ACG | TTG | GGT | 566 | |
Gly | Phe | Gin | Gly | Val | Asn | Lys | Glu | Thr | Arg Asp | Val | Thr | Thr | Leu | Gly | ||
135 | 140 | 145 | 150 | |||||||||||||
CGT | GGT | GGT | TCT | GAC | ACC | ACT | GCA | GTT | GCG TTG | GCA | GCT | GCT | TTG | AAC | 714 | |
Arg | Gly Gly | Ser | Asp | Thr | Thr | Ala | Val | Ala | Leu Ala | Ala | Ala | Leu | Asn | |||
155 | 160 | 165 |
GCT | GAT | GTG | TCT | GAG | ATT | TAC | TCG | GAC GTT | GAC | GCT | CTG | TAT | ACC | GCT | 762 | |
Ala | Asp | Val | Cys | Glu | Ile | Tyr | Ser | Asp Val | Asp | Gly | Val | Tyr Thr | Ala | |||
170 | 175 | 180 | ||||||||||||||
GAC | CCG | CGC | ATC | GTT | CCT | AAT | GCA | CAG | AAG | CTG | GAA | AAG | CTC | AGC | TTC | 810 |
Asp | Pro | Arg | Ile | Val | Pro | Asn | Ala | Gin | Lys | Leu | Glu | Lys | Leu | Ser | Phe | |
185 | 190 | 195 | ||||||||||||||
GAA | GAA | ATG | CTG | GAA | CTT | GCT | GCT | CTT | GGC | TCC | AAG | ATT | TTG | GTG | CTG | 353 |
Glu | Glu | Met | Leu | Glu | Leu | Ala | Ala | Val | Gly | Ser | Lys | Ile | Leu | Val | Leu | |
200 | 205 | 210 | ||||||||||||||
CGC | ACT | GIT | GAA | TAC | GCT | CCT | GCA | TTC | AAT | GTG | CCA | CTT | CGC | CTA | CGC | '30'6 |
Arg | Ser | Val | Glu | Tyr | Ala | Arg | Ala | Phe | Asn | Val | Pro | Leu | Arg | Val | Arg | |
215 | 220 | 225 | 230 | |||||||||||||
TCG | TCT | TAT | ACT | AAT | GAT | CCC | GGC | ACT | TTG | ATT | GCC | GGC | TCT | ATG | GAG | 954 |
Ser | Ser | Tyr | Ser | Asn | Asp | Pro | Gly | Thr | Leu | Ile | Ala | Gly | Ser | Met | Glu | |
235 | 240 | 245 | ||||||||||||||
GAT | ATT | CCT | GTG | GAA | GAA | GCA | CTC | CTT | ACC | GCT | CTC | GCA | ACC | GAC | AAG | 1002 |
Asp | Ile | Pro | Val | Glu | Glu | Ala | Val | Leu | Thr | Gly | Val | Ala | Thr | Asp | Lys | |
250 | 255 | 260 | ||||||||||||||
TCC | GAA | GCC | AAA | CTA | ACC | GTT | CTG | GCT | ATT | TCC | GAT | AAG | CCA | GGC | GAG | 1050 |
Ser | Glu | Ala | Lys | Val | Thr | Val | Leu | Gly | Ile | Ser | Asp | Lys | Pro | Gly | Glu | |
265 | 270 | 275 | ||||||||||||||
GCT | GCC | AAG | GTT | TTC | CCT | GCG | TTG | GCT | GAT | GCA | GAA | ATC | AAC | ATT | GAC | 1098 |
Ala | Ala | Lys | Val | Phe | Arg | Ala | Leu | Ala | Asp | Ala | Glu | Ile | Asn | Ile | Asp | |
280 | 285 | 290 | ||||||||||||||
ATG | GTT | CTG | CAG | AAC | GTC | TCC | TCT | GTG | GAA | GAC | GGC | ACC | ACC | GAC | ATC | 1146 |
Met | Val | Leu | Gin | Asn | Val | Ser | Ser | Val | Glu | Asp | Gly | Thr | Thr | Asp | Ile | |
295 | 300 | 305 | 310 | |||||||||||||
ACG | TTC | ACC | TGC | CCT | CGC | GCT | GAC | GGA | CGC | CCT | GCG | ATG | GAG | ATC | TTG | 1194 |
Thr | Phe | Thr | Cys | Pro | Arg | Ala | Asp Gly | Arg Arg | Ala | Met | Glu | Ile | Leu | |||
315 | 320 | 325 | ||||||||||||||
AAG | AAG | CTT | CAG | GIT | CAG | GGC | AAC | TGG | ACC | AAT | GTG | CTT | TAC | GAC | GAC | 1242 |
Lys | Lys | Leu | Gin | Val | Gin | Gly | Asn | Trp | Thr | Asn | Val | Leu | Tyr | Asp | Asp | |
330 | 335 | 340 | ||||||||||||||
CAG | GTC | GGC | AAA | GTC | TCC | CTC | CTG | GGT | GCT | GGC | ATG | AAG | TCT | CAC | CCA | 1290 |
Gin | Val | Gly | Lys | Val | Ser | Leu | Val | Gly | Ala | Gly | Met | Lys | Ser | His | Pro | |
345 | 350 | 355 | ||||||||||||||
GCT | GTT | ACC | GCA | GAG | TTC | ATG | GAA GCT | CTG | CGC | GAT | CTC | AAC | GTG | AAC | 1338 | |
Gly | Val | Thr | Ala | Glu | Phe | Met | Glu Ala | Leu | Arg Asp | Val | Asn | Val | Asn | |||
360 | 365 | 370 |
·· ·· ·· ··
ATC | GAA | TTG | ATT | TCC | ACC | TCT | GAG | ATC | CGC | ATT | TCC | GIG | CTG | ATC | CGT | 1386 |
Ile | Glu | Leu | Ile | Ser | Thr | Ser | Glu | Ile | Arg | Ile | Ser | Val | Leu | Ile | Arg | |
375 | 380 | 385 | 390 | |||||||||||||
GAA | GAT | GAT | CTG | GAT | GCT | GCT | GCA | CGT | GCA | TTG | CAT | GAG | CAG | TTC | CAG | 1434 |
Glu | Asp | Asp | Leu | Asp | Ala | Ala | Ala | Arg | Ala | Leu | His | Glu | Gin | Phe | Gin | |
395 | 400 | 405 | ||||||||||||||
CTG | GGC | GGC | GAA | GAC | GAA | GCC | GTC | GIT | TAT | GCA | GGC | ACC | GGA | CGC | TAA | 1482 |
Leu | Gly Gly | Glu | Asp | Glu | Ala | Val | Val | Tyr Ala | Gly | Thr | Gly Arg | |||||
410 | 415 | 420 |
1542
1602
1643
(2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 421 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
15 | (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0;5: | ||||||||||
Met | Ala | Leu | Val | Val | Gin | Lys Tyr Gly Gly Ser | Ser | Leu | Glu | Ser | Ala |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||
Glu | Arg | Ile | Arg | Asn | Val | Ala Glu Arg Ile Val | Ala | Thr | Lys | Lys | Ala |
20 | 25 | 30 | |||||||||
Gly | Asn | Asp | Val | Val | Val | Val Cys Ser Ala Met | Gly Asp | Thr | Thr | Asp | |
35 | 40 | 45 | |||||||||
Glu | Leu | Leu | Glu | Leu | Ala | Ala Ala Val Asn Pro | Val | Pro | Pro | Ala | Arg |
50 | 55 | 60 | |||||||||
Glu | Met | Asp | Met | Leu | Leu | Thr Ala Gly Glu Arg | Ile | Ser | Asn | Ala | Leu |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||
Val | Ala | Met | Ala | Ile | Glu | Ser Leu Gly Ala Glu | Ala | Gin | Ser | Phe | Thr |
85 | 90 | 95 | |||||||||
Gly | Ser | Gin | Ala | Gly | Val | Leu Thr Thr Glu Arg | His | Gly | Asn | Ala | Arg |
100 | 105 | 110 | |||||||||
Ile | Val | Asp | Val | Thr | Pro | Gly Arg Val Arg Glu | Ala | Leu | Asp | Glu | Gly |
115 | 120 | 125 | |||||||||
Lys | Ile | Cys | Ile | Val | Ala | Gly Phe Gin Gly Val | Asn | Lys | Glu | Thr | Arg |
130 | 135 | 140 | |||||||||
Asp | Val | Thr | Thr | Leu | Gly Arg Gly Gly Ser Asp | Thr | Thr | Ala | Val | Ala | |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||
Leu | Ala | Ala | Ala | Leu | Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr | Ser | Asp | Val | |||
165 | 170 | 175 | |||||||||
Asp | Gly | Val | Tyr | Thr | Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn | Ala | Gin Lys | ||||
180 | 185 | 190 |
Leu | Glu | Lys | Leu Ser | Phe | Glu | Glu | Met | Leu | Glu | Leu | Ala | Ala | Val | Gly |
195 | 200 | 205 | ||||||||||||
Ser | Lys | Ile | Leu Val | Leu | Arg | Ser | Val | Glu | Tyr Ala Arg | Ala | Phe | Asn | ||
210 | 215 | 220 | ||||||||||||
Val | Pro | Leu | Arg Val | Arg | Ser | Ser | Tyr | Ser | Asn Asp | Pro | Gly | Thr | Leu | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||
Ile | Ala | Gly | Ser Met | Glu | Asp | Ile | Pro | Val | Glu | Glu | Ala | Val | Leu | Thr |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
Gly | Val | Ala | Thr Asp | Lys | Ser | Glu | Ala | Lys | Val | Thr | Val | Leu | Gly | Ile |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||
Ser | Asp | Lys | Pro Gly | Glu | Ala | Ala | Lys | Val | Phe | Arg | Ala | Leu | Ala | Asp |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||
Ala | Glu | Ile | Asn Ile | Asp | Met | Val | Leu | Gin | Asn | Val | Ser | Ser | Val | Glu |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||
Asp | Gly | Thr | Thr Asp | Ile | Thr | Phe | Thr | Cys | Pro | Arg | Ala | Asp | Gly Arg | |
305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||
Arg | Ala | Met | Glu Ile | Leu | Lys | Lys | Leu | Gin | Val | Gin | Gly | Asn | Trp Thr | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||
Asn | Val | Leu | Tyr Asp | Asp | Gin | Val | Gly Lys | Val | Ser | Leu | Val | Gly | Ala | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||
Gly | Met | Lys | Ser His | Pro | Gly | Val | Thr | Ala | Glu | Phe | Met | Glu | Ala | Leu |
355 | 360 | 365 | ||||||||||||
Arg | Asp | Val | Asn Val | Asn | Ile | Glu | Leu | Ile | Ser | Thr | Ser | Glu | Ile | Arg |
370 | 375 | 380 | ||||||||||||
Ile | Ser | Val | Leu Ile | Arg | Glu | Asp Asp | Leu | Asp | Ala Ala | Ala | Arg | Ala | ||
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||
Leu | His | Glu | Gin Phe | Gin | Leu | Gly Gly | Glu | Asp Glu Ala | Val | Val | Tyr | |||
405 | 410 | 415 | ||||||||||||
Ala | Gly | Thr | Gly Arg |
420 (2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1643 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ;
(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 964..1482 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC ΑΑΑΤΑΊΤΑΑΑ TCGAATATCA ATATACGGTC60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180
GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT240
GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC300
ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT360
GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG420
CTCCTGACTG C7TGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT480
GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CA2TGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC540
GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC600
AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG660
TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTIT GAACGCTGAT720
GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG C^TCGTTCCT780
AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTCGC840
TCCAAGAITT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC900
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT960
CCT GTG GAA GAA GCA GTC CIT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA1008
Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu
5 1015
GCC | AAA | GTA | ACC | GTT | CTG | GGT | ATT | TCC | GAT | AAG | CCA | GGC | GAG | GCT | GCC | 1056 |
Ala | Lys | Val | Thr | Val | Leu | Gly | Ile | Ser | Asp Lys | Pro | Gly | Glu | Ala | Ala | ||
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
AAG | GTT | TTC | CGT | GCG | TTG | GCT | GAT | GCA | GAA | ATC | AAC | ATT | GAC | ATG | GTT | 1104 |
Lys | Val | Phe | Arg | Ala | Leu | Ala | Asp | Ala | Glu | Ile | Asn | Ile | Asp | Met | Val | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
CTG | CAG | AAC | GTC | TCC | TCT | GTG | GAA | GAC | GGC | ACC | ACC | GAC | ATC | ACG | TTC | 1152 |
Leu | Gin | Asn | Val | Ser | Ser | Val | Glu | Asp Gly | Thr | Thr | Asp | Ile | Thr | Phe | ||
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
ACC | TGC | CCT | CGC | GCT | GAC | GGA | CGC | CGT | GCG | ATG | GAG | ATC | ITG | AAG | AAG | 1200 |
Thr | Cys | Pro | Arg | Ala | Asp | Gly Arg Arg | Ala | Met | Glu | Ile | Leu | Lys | Lys | |||
65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
CTT | CAG | GTT | CAG | GGC | AAC | TGG | ACC | AAT | GTG | CTT | TAC GAC | GAC | CAG | GTC | 1248 | |
Leu | Gin | Val | Gin | Gly | Asn | Tip | Thr | Asn | Val | Leu | Tyr Asp Asp | Gin | Val | |||
80 | 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
GGC | AAA | GTC | TCC | CTC | GTG | GGT | GCT | GGC | ATG | AAG | TCT | CAC | CCA | GGT | GTT | 1296 |
Gly | Lys | Val | Ser | Leu | Val | Gly | Ala | Gly | Met | Lys | Ser | His | Pro | Gly | Val | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
ACC | GCA | GAG | TTC | ATG | GAA | GCT | CTG | CGC | GAT | GTC | AAC | GTG | AAC | ATC | GAA | 1344 |
Thr | Ala | Glu | Phe | Met | Glu | Ala | Leu | Arg | Asp Val | Asn | Val | Asn | Ile | Glu |
- 49 • · · • · · • · · · · ·
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
TTG | ATT | TCC | ACC | TCT | GAG | ATC | CGC ATT | TCC | GTG | CTG | ATC | CGT | GAA | GAT | 1392 | |
Leu | Ile | Ser | Thr | Ser | Glu | Ile | Arg Ile | Ser | Val | Leu | Ile Arg | Glu | Asp | |||
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
GAT | CTG | GAT | GCT | GCT | GCA | CGT | GCA | TTG | CAT | GAG | CAG | TTC | CAG | CTG | GGC | 1440 |
Asp | Leu | Asp | Ala | Ala | Ala | Arg | Ala | Leu | His | Glu | Gin | Phe | Gin | Leu | Gly | |
145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
GGC | GAA | GAC | GAA | GCC | GTC | GTT | TAT | GCA | GGC | ACC | GGA | CGC | TAAAGTTTTAA | 1490 | ||
Gly | Glu | Asp | Glu | Ala | Val | Val Tyr | Ala | Gly | Thr | Gly Arg | ||||||
160 | 165 | 170 |
1550
1610
--TTACAATGAC
CCCTTTTGGA
CCGCAGGCOG
GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TTC
CACCATCGCA
AGAGCGCAAT
TAAGATTGAA
AGGAGTAGTT GTTATGCGCA TCCCCGCGTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
io (A) DÉLKA: 172 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7;
Met | Glu | Glu | Ala | Val | Leu | Thr | Gly | Val | Ala | Thr | Asp | Lys | Ser | Glu | Ala |
1 | 5 | 10 | 1 | 5 | |||||||||||
Lys | Val | Thr | Val | Leu | Gly | Ile | Ser | Asp | Lys | Pro | Gly | Glu | Ala | Ala | Lys |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Val | Phe | Arg | Ala | Leu | Ala | Asp | Ala | Glu | Ile | Asn | Ile | Asp | Met | Val | Leu |
35 | 40 | 4! | |||||||||||||
Gin | Asn | Val | Ser | Ser | Val | Glu | Asp | Gly | Thr | Thr | Asp | Ile | Thr | Phe | Thr |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Cys | Pro | Arg | Ala | Asp | Gly | Arg | Arg | Ala | Met | Glu | Ile | Leu | Lys | Lys | Leu |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Gin | Val | Gin | Gly | Asn | Trp | Thr | Asn | Val | Leu | Tyr | Asp | Asp | Gin | Val | Gly |
85 | 90 | 9 | 5 | ||||||||||||
Lys | Val | Ser | Leu | Val | Gly | Ala | Gly | Met | Lys | Ser | His | Pro | Gly | Val | Thr |
100 | 105 | lil | 3 | ||||||||||||
Ala | Glu | Phe | Met | Glu | Ala | Leu | Arg | Asp | Val | Asn | Val | Asn | Ile | Glu | Leu |
115 | 120 | 12! | 5 | ||||||||||||
Ile | Ser | Thr | Ser | Glu | Ile | Arg | Ile | Ser | Val | Leu | Ile | Arg | Glu | Asp | Asp |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Leu | Asp | Ala | Ala | Ala | Arg | Ala | Leu | His | Glu | Gin | Phe | Gin | Leu | Gly | Gly |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Glu | Asp | Glu | Ala | Val | Val | Tyr | Ala | Gly | Thr | Gly | Arg |
165 170 • · · · · · · • · ··· · · · · · • · · · · · ··· ·· ·· · · · · ··
- 50 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ io (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8: GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
2o (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9: CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2001 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý • · · * (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:
- (A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 730..1473 io (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:
GGATCCCCAA TCGATACCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT50
GACGITGAGG AAGGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTGAATTGG120
ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTGGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC180
TCGCGTGAAC GTTTCGTGCT CGGCAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CGGAGTCACC240
AACTTGAGCC TGCTGCITCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AACGGCGGCA AAGCAGTGGG300
GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GGGCTCTGAA GTGGTAGGCG ACGGGGCAGC360
ATCTGAAGGC GTGCGAGITG TGGTGACCGG GTTAGCGGTT TCAGITTCTG TCACAACTGG420
AGCAGGACTA GCAGAGGITG TAGGCGTTGA GCCGCTTCCA TCACAAGCAC TTAAAAGTAA480
AGAGGCGGAA ACCACAAGCG CCAAGGAACT ACCTGCGGAA CGGGCGGTGA AGGGCAACTT540
AAGTCTCATA TTTCAAACAT AGTTCCACCT GTGTGATTAA TCTCCAGAAC GGAACAAACT600
GATGAACAAT CGTTAACAAC ACAGACCAAA ACGGTCAGTT AGGTATGGAT ATCAGCACCT660
TCTGAATGGG TACGTCTAGA CTGGTGGGCG TTTGAAAAAC TCTTCGCCCC ACGAAAATGA720
AGGAGCATA ATG GGA ATC AAG GTT GGC GIT CTC GGA GCC AAA GGC CGT768
Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg 1510
GTT GGT CAA ACT ATT GTG GCA GCA GTC AAT GAG TCC GAC GAT CTG GAG816
Val Gly Gin Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp LeuGlu
2025
CTT GTT GCA GAG ATC GGC GTC GAC GAT GAT TTG AGC CTT CTG GTA GAC864
Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu ValAsp
35 4045 • ·
AAC | GGC | GCT | GAA | GTT | GTC | GTT | GAC | TTC | ACC ACT | CCT | AAC | GCT | GTG | ATG | |
Asn | Gly | Ala | Glu | Val | Val | Val | Asp | Phe | Thr | Thr | Pro | Asn | Ala | Val | Met |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
GGC | AAC | CTG | GAG | TTC | TGC | ATC | AAC | AAC | GGC | ATT | TCT | GCG | GIT | GTT | GGA |
Gly | Asn | Leu | Glu | Phe | Cys | Ile | Asn | Asn | Gly | Ile | Ser | Ala | Val | Val | Gly |
65 | 70 | 75 | |||||||||||||
ACC | ACG | GGC | ITC | GAT | GAT | GCT | CGT | TTG | GAG | CAG | GTT | CGC | GCC | TGG | CTT |
Thr | Thr | Gly | Phe | Asp | Asp | Ala | Arg | Leu | Glu | Gin | Val | Arg | Ala | Trp | Leu |
80 | 85 | 90 | |||||||||||||
GAA | GGA | AAA | GAC | AAT | GTC | GGT | GTT | CTG | ATC | GCA | CCT | AAC | TTT | GCT | ATC |
Glu | Gly | Lys | Asp | Asn | Val | Gly | Val | Leu | Ile | Ala | Pro | Asn | Phe | Ala | Ile |
95 | 100 | 105 | |||||||||||||
TCT | GCG | GTG | TTG | ACC | ATG | GTC | ΤΊΤ | TCC | AAG | CAG | GCT | GCC | CGC | TTC | TTC |
Ser | Ala | Val | Leu | Thr | Met | Val | Phe | Ser | Lys | Gin | Ala | Ala | Arg | Phe | Phe |
110 | 115 | 120 | 125 | ||||||||||||
GAA | TCA | GCT | GAA | GTT | ATT | GAG | CTG | CAC | CAC | ccc | AAC | AAG | CTG | GAT | GCA |
Glu | Ser | Ala | Glu | Val | Ile | Glu | Leu | His | His | Pro | Asn | Lys | Leu | Asp | Ala |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
CCT | TCA | GGC | ACC | GCG | ATC | CAC | ACT | GCT | CAG | GGC | ATT | GCT | GCG | GCA | CGC |
Pro | Ser | Gly | Thr | Ala | Ile | His | Thr | Ala | Gin | Gly | Ile | Ala | Ala | Ala | Arg |
145 | 150 | 155 | |||||||||||||
AAA | GAA | GCA | GGC | ATG | GAC | GCA | CAG | CCA | GAT | GCG | ACC | GAG | CAG | GCA | CTT |
Lys | Glu | Ala | Gly | Met | Asp | Ala | Gin | Pro | Asp | Ala | Thr | Glu | Gin | Ala | Leu |
160 | 165 | 170 | |||||||||||||
GAG | GGT | TCC | CGT | GGC | GCA | AGC | GTA | GAT | GGA | ATC | CCA | GTT | CAC | GCA | GTC |
Glu | Gly | Ser | Arg | Gly | Ala | Ser | Val | Asp | Gly | Ile | Pro | Val | His | Ala | Val |
175 | 180 | 185 | |||||||||||||
CGC | ATG | TCC | GGC | ATG | GTT | GCT | CAC | GAG | CAA | GTT | ATC | ΤΊΤ | GGC | ACC | CAG |
Arg | Met | Ser | Gly | Met | Val | Ala | His | Glu | Gin Val | Ile | Phe | Gly | Thr | Gin | |
190 | 195 | 200 | 205 | ||||||||||||
GGT | CAG | ACC | TTG | ACC | ATC | AAG | CAG | GAC | TCC | TAT | GAT | CGC | AAC | TCA | TTT |
Gly | Gin | Thr | Leu | Thr | Ile | Lys | Gin | Asp | Ser Tyr Asp Arg | Asn | Ser | Phe | |||
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
GCA | CCA | GGT | GTC | TTG | GTG | GGT | GTG | CGC | AAC | ΑΊΤ | GCA CAG | CAC | CCA | GGC | |
Ala | Pro | Gly | Val | Leu | Val | Gly | Val | Arg | Asn | Ile | Ala | Gin | His | Pro Gly | |
225 | 230 | 235 | |||||||||||||
CTA | GTC | GTA | GGA | CTT | GAG | CAT | TAC | CTA | GGC | CTG | TAAAGGCTCA TTTCAGCAGC | ||||
Leu | Val | Val | Gly | Leu | Glu | His | Tyr | Leu Gly | Leu | ||||||
240 | 245 |
912
960 1008 1056 1104 1152 1200 1248 1296 1344 1392
1440
1493
- 53 1553
1613
1673
1733
1793
1853
1913
1973
2001
GGGTGGAATT TTTTAAAAGG AGCGTTTAAA GGCTGTGGCC GAACAAGTTA AATTGAGCGT GGAGTTGATA GCGTGCAGTT CTTTTACTCC ACCCGCTGAT GTTGAGTGGT CAACTGATGT TGAGGGCGCG GAAGCACTCG TCGAGTTTGC GGGTCGTGCC TGCTACGAAA CTTTTGATAA GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC GTATCTGCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA CACTGCTTTG CTTGAGCATG CCAATGCCAC GATGTATATC CGAGGCATTT CTCGGTCCGC GACCCATGAA TTGGTCCGAC ACCGCCATTT ITCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCGTTTCGT GCACAGCGGA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC CACTCTCATC GATGAAGATC CGCAGTTGCG TGAACITITC ATGCACGCCA TGGATGAGTC TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTTAATGC GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG (2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 248 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:
Met 1 | Gly Ile Lys Val 5 | Gly Val | Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gin | |
10 | 15 | |||
Thr | Ile Val Ala Ala | Val Asn | Glu Ser Asp Asp Leu | Glu Leu Val Ala |
20 | 25 | 30 | ||
Glu | Ile Gly Val Asp Asp Asp | Leu Ser Leu Leu Val | Asp Asn Gly Ala | |
35 | 40 | 45 | ||
Glu | Val Val Val Asp | Phe Thr | Thr Pro Asn Ala Val | Met Gly Asn Leu |
50 | 55 | 60 | ||
Glu | Phe Cys Ile Asn | Asn Gly | Ile Ser Ala Val Val | Gly Thr Thr Gly |
65 | 70 | 75 | 80 | |
Phe | Asp Asp Ala Arg | Leu Glu | Gin Val Arg Ala Trp | Leu Glu Gly Lys |
85 | 90 | 95 | ||
Asp | Asn Val Gly Val | Leu Ile | Ala Pro Asn Phe Ala | Ile Ser Ala Val |
100 | 105 | 110 | ||
Leu | Thr Met Val Phe | Ser Lys | Gin Ala Ala Arg Phe | Phe Glu Ser Ala |
115 | 120 | 125 | ||
Glu | Val Ile Glu Leu | His His | Pro Asn Lys Leu Asp | Ala Pro Ser Gly |
130 | 135 | 140 | ||
Thr | Ala Ile His Thr | Ala Gin | Gly Ile Ala Ala Ala | Arg Lys Glu Ala |
145 | 150 | 155 | 160 | |
Gly | Met Asp Ala Gin | Pro Asp | Ala Thr Glu Gin Ala | Leu Glu Gly Ser |
165 | 170 | 175 | ||
Arg | Gly Ala Ser Val | Asp Gly | Ile Pro Val His Ala | Val Arg Met Ser |
180 | 185 | 190 |
• ·· ·· 0 0 · · · • •••0 0 00 ··· · · • •0 · 0 · ··· ··* ·· ·· * · · · ·· ··
- 54 Gly Met Val Ala His Glu Gin Val Ile Phe Gly Thr Gin Gly Gin Thr
195 200205
Leu Thr Ile Lys Gin Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly
210 215220
Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gin His Pro Gly Leu Val Val
225 230 235240
Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
245 (2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina io (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:12:
GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID N0:13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
2o (A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:13:
GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG
(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1411 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina s (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
io (A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 311..1213 is (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:
CTCTCGATAT CGAGAGAGAA GCAGCGCCAC GGTTTTTCGG TGATTTTGAG ATTGAAACTT60
TGGCAGACGG ATCGCAAATG GCAACMGCC CCTATCTCAT GGACTTTTAA CGCAAAGCTC120
ACACCCACGA GCTAAAAATT CATATAGTTA AGACAACATT TTTGGCTCTA AAAGACAGCC180
CTAAAAACCT CTTGCTCATG TCAATTGTTC TTATCGGAAT CTGGCTTGGG CGATTGTTAT240
GCAAAACTTG TTAGGTTTTT TGCGGGGTTG TTTAACCCCC AAATGAGGGA AGAAGCTAAC 300 CTTGAACTCT ATG AGC ACA GCT TTA AGA GCT AAG ACC GGA OTA GAG CAC349
Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His
1510
TTC | GGC | ACC | GTT | GGA | CTA | GCA ATG | CTT | ACT | CCA | TTC | ACG | GAA | TCC | GGA | 397 | |
Phe | Gly | Thr | Val | Gly | Val | Ala Met | Val | Thr | Pro | Phe | Thr | Glu | Ser | Gly | ||
15 | 20 | 25 | ||||||||||||||
GAC | ATC | GAT | ATC | GCT | GCT | GGC | CGC | GAA | GTC | GCG | GCT | TAT | TTG | CTT | GAT | 44,5 |
Asp | Ile | Asp | Ile | Ala | Ala | Gly Arg | Glu | Val | Ala | Ala | Tyr | Leu | Val | Asp | ||
30 | 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
AAG | GGC | TTG | GAT | TCT | TTG | GTT | CTC | GCG | GGC | ACC | ACT | GCT | GAA | TCC | CCA | 493 |
Lys | Gly | Leu | Asp | Ser | Leu | Val | Leu | Ala | Gly | Thr | Thr | Gly | Glu | Ser | Pro | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
ACG | ACA | ACC | GCC | GCT | GAA | AAA | CTA | GAA | CTG | CTC | AAG | GCC | GTT | CCT | GAG | 541 |
Thr | Thr | Thr | Ala | Ala | Glu | Lys | Leu | Glu | Leu | Leu | Lys | Ala | Val | Arg | Glu | |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
GAA | CTT | GGG | GAT | CGG | GCG | AAC | CTC | ATC | GCC | GCT | GTC | GGA | ACC | AAC | AAC | 589 |
Glu | Val | Gly | Asp | Arg | Ala | Asn | Val | Ile | Ala | Gly | Val | Gly | Thr | Asn | Asn | |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||||
ACG | CGG | ACA | TCT | GTG | GAA | CTT | GCG GAA | GCT | GCT | GCT | TCT | GCT | GGC | GCA | 637 | |
Thr | Arg | Thr | Ser | Val | Glu | Leu | Ala Glu | Ala | Ala | Ala | Ser Ala | Gly | Ala | |||
95 | 100 | 105 |
GAC | GGC | CTT | TTA | GIT | GTA | ACT | CCT | TAT | TAC | TCC | AAG | CCG | AGC | CAA | GAG | 665 |
Asp | Gly | Leu | Leu | Val | Val | Thr | Pro | Tyr Tyr | Ser Lys | Pro | Ser | Gin | Glu | |||
110 | 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
GGA | TTG | CTG | GCG | CAC | TTC | GGT | GCA | ATT | GCT | GCA | GCA | ACA | GAG | GTT | CCA | 763 |
Gly | Leu | Leu | Ala | His | Phe | Gly | Ala | Ile | Ala | Ala | Ala | Thr | Glu | Val | Pro | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
ATT | TGT | CTC | TAT | GAC | ATT | CCT | GGT | CGG | TCA | GCT | ATT | CCA | ATT | GAG | TCT | 7S1 |
Ile | Cys | Leu | Tyr . Asp | Ile | Pro | Gly Arg | Ser | Gly | Ile | Pro | Ile | Glu | Ser | |||
145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
GAT | ACC | ATG | AGA | CGC | CTG | AGT | GAA | TTA | CCT | ACG | ATT | TTG | GCG | GTC | AAG | |
Asp | Thr | Met | Arg Arg | Leu | Ser | Glu | Leu | Pro | Thr | Ile | Leu | Ala | Val | Lys | ||
160 | 165 | 170 | ||||||||||||||
GAC | GCC | AAG | GGT | GAC | CTC | GTT | GCA | GCC | ACG | TCA | TTG | ATC | AAA | GAA | ACG | 877 |
Asp | Ala | Lys | Gly Asp | Leu | Val | Ala | Ala | Thr | Ser | Leu | Ile | Lys | Glu | Thr | ||
175 | 180 | 185 | ||||||||||||||
GGA | CTT | GCC | TGG | TAT | TCA | GGC | GAT | GAC | CCA | CTA | AAC | CTT | GTT | TGG | CTT | 925 |
Gly | Leu | Ala | Trp | Tyr | Ser | Gly Asp | Asp | Pro | Leu | Asn | Leu | Val | Trp | Leu | ||
190 | 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
GCT | TTG | GGC | GGA | TCA | GGT | TTC | ATT | TCC | GTA | ATT | GGA | CAT | GCA | GCC | CCC | 973 |
Ala | Leu | Gly | Gly | Ser | Gly | Phe | Ile | Ser | Val | Ile | Gly | His | Ala | Ala | Pro | |
210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
ACA | GCA | TTA | CGT | GAG | TTG | TAC | ACA | AGC | TTC | GAG | GAA | GGC | GAC | CTC | GTC | 1021 |
Thr | Ala | Leu | Arg | Glu | Leu | Tyr | Thr | Ser | Phe | Glu | Glu | Gly Asp | Leu | Val | ||
225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
CGT | GCG | CGG | GAA | ATC | AAC | GCC | AAA | CTA | TCA | CCG | CTG | GTA GCT | GCC | CAA | 1069 | |
Arg | Ala | Arg | Glu | Ile | Asn | Ala | Lys | Leu | Ser | Pro | Leu | Val | Ala | Ala | Gin | |
240 | 245 | 250 | ||||||||||||||
GGT | CGC | TTG | GGT | GGA | GTC | AGC | TTG | GCA | AAA | GCT | GCT | CTG | CGT | CTG | CAG | 1117 |
Gly Arg | Leu | Gly Gly | Val | Ser | Leu | Ala | Lys | Ala | Ala | Leu | Arg | Leu | Gin | |||
255 | 260 | 265 | ||||||||||||||
GGC | ATC | AAC | GTA | GGA | GAT | CCT | CGA | CTT | CCA | ATT | ATG | GCT | CCA | AAT | GAG | 1165 |
Gly | Ile | Asn | Val | Gly | Asp | Pro | Arg | Leu | Pro | Ile | Met | Ala | Pro | Asn | Glu | |
270 | 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
CAG | GAA | CTT | GAG | GCT | CTC | CGA | GAA | GAC | ATG | AAA | AAA | GCT | GGA | GTT | CTA | 1213 |
Gin | Glu | Leu | Glu | Ala | Leu | Arg | Glu | Asp | Met | Lys | Lys | Ala | Gly | Val | Leu |
290 295 300
TAAATATGAA TGATTCCCGA AATCGCGGCC GGAAGGTTAC CCGCAAGGCG GCCCACCAGA1273
AGCTGGTCAG GAAAACCATC TGGATACCCC TGTCTTTCAG GCACCAGATG CTTCCTCTAA1333
CCAGAGCGCT GTAAAAGCTG AGACCGCCGG AAACGACAAT CGGGATGCTG CGCAAGGTGC1393
TCAAGGATCC CAACATTC1411 • ·
- 57 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 301 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:
Met Ser Thr Gly'Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val | Glu His Phe Gly Thr 15 | ||
1 | 5 | 10 | |
Val Gly Val Ala | Met | Val Thr Pro Phe Thr Glu | Ser Gly Asp Ile Asp |
20 | 25 | 30 | |
Ile Ala Ala Gly Arg | Glu Val Ala Ala Tyr Leu | Val Asp Lys Gly Leu | |
35 | 40 | 45 | |
Asp Ser Leu Val | Leu | Ala Gly Thr Thr Gly Glu | Ser Pro Thr Thr Thr |
50 | 55 | 60 | |
Ala Ala Glu Lys | Leu | Glu Leu Leu Lys Ala Val | Arg Glu Glu Val Gly |
65 | 70 75 | i 80 | |
Asp Arg Ala Asn | Val | Ile Ala Gly Val Gly Thr | Asn Asn Thr Arg Thr |
85 | 90 | 95 | |
Ser Val Glu Leu | Ala | Glu Ala Ala Ala Ser Ala | Gly Ala Asp Gly Leu |
100 | 105 | 110 | |
Leu Val Val Thr | Pro | Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser | Gin Glu Gly Leu Leu |
115 | 120 | 125 | |
Ala His Phe Gly | Ala | Ile Ala Ala Ala Thr Glu | Val Pro Ile Cys Leu |
130 | 135 | 140 | |
Tyr Asp Ile Pro | Gly | Arg Ser Gly Ile Pro Ile | Glu Ser Asp Thr Met |
145 | 150 155 | i 160 | |
Arg Arg Leu Ser | Glu | Leu Pro Thr Ile Leu Ala | Val Lys Asp Ala Lys |
165 | 170 | 175 | |
Gly Asp Leu Val | Ala | Ala Thr Ser Leu Ile Lys | Glu Thr Gly Leu Ala |
180 | 185 | 190 | |
Trp Tyr Ser Gly | Asp | Asp Pro Leu Asn Leu Val | Trp Leu Ala Leu Gly |
195 | 200 | 205 | |
Gly Ser Gly Phe | Ile | Ser Val Ile Gly His Ala | Ala Pro Thr Ala Leu |
210 | 215 | 220 | |
Arg Glu Leu Tyr | Thr | Ser Phe Glu Glu Gly Asp | Leu Val Arg Ala Arg |
225 | 230 235 240 | ||
Glu Ile Asn Ala | Lys | Leu Ser Pro Leu Val Ala | Ala Gin Gly Arg Leu |
245 | 250 | 255 | |
Gly Gly Val Ser | Leu | Ala Lys Ala Ala Leu Arg | Leu Gin Gly Ile Asn |
260 | 265 | 270 | |
Val Gly Asp Pro | Arg | Leu Pro Ile Met Ala Pro | Asn Glu Gin Glu Leu |
275 | 280 | 285 | |
Glu Ala Leu Arg | Glu | Asp Met Lys Lys Ala Gly | Val Leu |
290 | 295 | 300 |
• · • · · · · * • ·· · · · · ······ ♦ · • · · · · · ··» ·· ·· ····
- 58 • · (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý '(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16; GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:
ccaaaaccgc cctccacggc gaa (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3579 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina • · · (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ; ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS o (B) UMÍSTĚNÍ: 533..2182 (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 2188..3522 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT60
TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA120
GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT180
GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC240
GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC300
AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC360
CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA420
CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA480
AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG535
Met
ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT583
Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val GluVal
1015
TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT631
Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gin ValVal
2530
GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT679
Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile | ||||||||||||||||
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
GCA | TTG | CAG | GTG | GCT | AAA | AAG | GTC | GGT | CAG | AAC CCT | CGG | GAT | TTG | GCT | 727 | |
Ala | Leu | Gin | Val | Ala | Lys | Lys | Val | Gly | Gin | Asn | Pro | Arg Asp | Leu | Ala | ||
50 | 55 | 60 | 65 | |||||||||||||
ACC | TGG | CTG | GCA | GAG | GCA | TTG | GCT | GCA | GAT | GAC | GCC | ATT | GAT | TCT | GCT | 775 |
Thr | Trp | Leu | Ala | Glu | Ala | Leu | Ala | Ala | Asp | Asp | Ala | Ile | Asp | Ser | Ala | |
70 | 75 | 80 | ||||||||||||||
GAA | ATT | GCT | GGC | CCA | GGC | TTT | TTG | AAC | ATT | CGC | CTT | GCT | GCA | GCA | GCA | 823 |
Glu | Ile | Ala | Gly | Pro | Gly | Phe | Leu | Asn | Ile | Arg | Leu | Ala | Ala | Ala | Ala | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
CAG | GGT | GAA | ATT | GTG | GCC | AAG | ATT | CTG | GCA | CAG | GGC | GAG | ACT | TTC | GGA | 871 |
Gin | Gly | Glu | Ile | Val | Ala | Lys | Ile | Leu | Ala | Gin | Gly | Glu | Thr | Phe | Gly | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
AAC | TCC | GAT | CAC | CTT | TCC | CAC | TTG | GAC | GTG | AAC | CTC | GAG | TTC | GTT | TCT | 919 |
Asn | Ser | Asp | His | Leu | Ser | His | Leu | Asp | Val | Asn | Leu | Glu | Phe | Val | Ser | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
GCA | AAC | CCA | ACC | GGA | CCT | ATT | CAC | CTT | GGC | GGA | ACC | CGC | TGG | GCT | GCC | 967 |
Ala | Asn | Pro | Thr | Gly | Pro | Ile | His | Leu | Gly Gly | Thr | Arg | Trp | Ala | Ala | ||
130 | 135 | 140 | 145 | |||||||||||||
GTG | GGT | GAC | TCT | TTG | GGT | CCT | GTG | CTG | GAG | GCT | TCC | GGC | GCG | AAA | GTG | 1015 |
Val | Gly Asp | Ser | Leu | Gly Arg | Val | Leu | Glu Ala | Ser | Gly | Ala | Lys | Val | ||||
150 | 155 | 160 | ||||||||||||||
ACC | CGC | GAA | TAC | TAC | TTC | AAC | GAT | CAC | GGT | CGC | CAG | ATC | GAT | CCT | TTC | 1063 |
Thr | Arg | Glu | Tyr | Tyr | Phe | Asn | Asp | His | Gly Arg | Gin | Ile | Asp | Arg | Phe | ||
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
GCT | TTG | TCC | CTT | CTT | GCA | GCG | GCG | AAG | GGC | GAG | CCA | ACG | CCA | GAA | GAC | 1111 |
Ala | Leu | Ser | Leu | Leu | Ala | Ala | Ala | Lys Gly | Glu | Pro | Thr | Pro | Glu | Asp | ||
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
GGT | TAT | GGC | GGC | GAA | TAC | ATT | AAG | GAA | ATT | GCG | GAG | GCA | ATC | GTC | GAA | 1159 |
Gly Tyr Gly Gly | Glu | Tyr | Ile | Lys | Glu | Ile | Ala | Glu | Ala | Ile | Val | Glu | ||||
195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
AAG | CAT | CCT | GAA | GCG | TTG | GCT | TTG | GAG | CCT | GCC | GCA | ACC | CAG | GAG | CTT | 1207 |
Lys | His | Pro | Glu | Ala | Leu | Ala | Leu | Glu | Pro | Ala | Ala | Thr | Gin | Glu | Leu | |
210 | 215 | 220 | 225 | |||||||||||||
TTC | CGC | GCT | GAA | GGC | GTG | GAG | ATG | ATG | TTC | GAG | CAC | ATC | AAA | TCT | TCC | 1255 |
Phe | Arg | Ala | Glu | Gly | Val | Glu | Met | Met | Phe | Glu | His | Ile | Lys | Ser | Ser | |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||||
CTG | CAT | GAG | TTC | GGC | ACC | GAT | TTC | GAT | GTC | TAC | TAC | CAC | GAG | AAC | TCC | 1303 |
Leu | His | Glu | Phe | Gly | Thr | Asp | Phe | Asp | Val | Tyr Tyr | His | Glu | Asn | Ser | ||
245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
CTG | TTC | GAG | TCC | GGT | GCG | GTG | GAC | AAG | GCC | GTG | CAG | GTG | CTG | AAG | GAC | 1351 |
Leu | Phe | Glu | Ser | Gly | Ala | Val | Asp | Lys | Ala | Val | Gin | Val | Leu | Lys | Asp | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
AAC | GGC | AAC | CTG | TAC | GAA | . AAC | GAG | GGC | . GCT | TGG | TGG | CTG CCT | TCC | : acc | 1399 |
• · • ·
Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser Thr | ||||||||||||||||
275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
GAA | TTC | GGC | GAT | GAC | AAA | GAC | CGC | GTG | GTG | ATC | AAG | TCT | GAC | GGC | GAC | 1447 |
Glu | Phe | Gly Asp Asp | Lys Asp Arg | Val | Val | Ile Lys | Ser | Asp | Gly Asp | |||||||
290 | 295 | 300 | 305 | |||||||||||||
GCA | GCC | TAC | ATC | GCT | GGC | GAT | ATC | GCG | TAC | GTG | GCT | GAT | AAG | TTC | TCC | 1495 |
Ala | Ala | Tyr | Ile | Ala | Gly Asp | Ile | Ala | Tyr | Val | Ala | Asp | Lys | Phe | Ser | ||
310 | 315 | 320 | ||||||||||||||
CGC | GGA | CAC | AAC | CTA | AAC | ATC | TAC | ATG | TTG | GGT | GCT | GAC | CAC | CAT | GGT | 1543 |
Arg | Gly | His | Asn- | Leu | Asn | Ile | Tyr | Met | Leu | Gly | Ala | Asp | His | His | Gly | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
TAC | ATC | GCG | CGC | CTG | AAG | GCA | GCG | GCG | GCG | GCA | CTT | GGC | TAC | AAG | CCA | 1591 |
Tyr | Ile | Ala | Arg | Leu | Lys | Ala | Ala | Ala | Ala | Ala | Leu | Gly Tyr | Lys | Pro | ||
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
GAA | GGC | GTT | GAA | CTC | CTG | ATT | GGC | CAG | ATG | GTG | AAC | CTG | CTT | CGC | GAC | 1639 |
Glu | Gly | Val | Glu | Val | Leu | Ile | Gly | Gin | Met | Val | Asn | Leu | Leu | Arg | Asp | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
GGC | AAG | GCA | GTG | CGT | ATG | TCC | AAG | CGT | GCA | GGC | ACC | GTG | GTC | ACC | CTA | 1687 |
Gly | Lys | Ala | Val | Arg | Met | Ser | Lys | Arg | Ala | Gly | Thr | Val | Val | Thr | Leu | |
370 | 375 | 380 | 385 | |||||||||||||
GAT | GAC | CTC | GTT | GAA | GCA | ATC | GGC | ATC | GAT | GCG | GCG | CGT | TAC | TCC | CTG | 1735 |
Asp | Asp | Leu | Val | Glu | Ala | Ile | Gly | Ile | Asp | Ala | Ala | Arg | Tyr | Ser | Leu | |
390 | 395 | 400 | ||||||||||||||
ATC | CGT | TCC | TCC | GTG | GAT | TCT | TCC | CTG | GAT | ATC | GAT | CTC | GGC | CTG | TGG | 1783 |
Ile | Arg | Ser | Ser | Val | Asp | Ser | Ser | Leu | Asp | Ile | Asp | Leu | Gly | Leu | Trp | |
405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
GAA | TCC | CAG | TCC | TCC | GAC | AAC | CCT | GTG | TAC | TAC | GTG | CAG | TAC | GGA | CAC | 1831 |
Glu | Ser | Gin | Ser | Ser | Asp | Asn | Pro | Val | Tyr | Tyr | Val | Gin | Tyr Gly | His | ||
420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
GCT | CGT | CTG | TGC | TCC | ATC | GCG | CGC | AAG | GCA | GAG | ACC | TTG | GGT | GTC | ACC | 1879 |
Ala | Arg | Leu | Cys | Ser | Ile | Ala | Arg | Lys | Ala | Glu | Thr | Leu | Gly | Val | Thr | |
435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
GAG | GAA | GGC | GCA | GAC | CTA | TCT | CTA | CTG | ACC | CAC | GAC | CGC | GAA | GGC | GAT | 1927 |
Glu | Glu | Gly | Ala | Asp | Leu | Ser | Leu | Leu | Thr | His | Asp | Arg | Glu | Gly Asp | ||
450 | 455 | 460 | 465 | |||||||||||||
CTC | ATC | CGC | ACA | CTC | GGA | GAG | TTC | CCA | GCA | GTG | GTG | AAG | GCT | GCC | GCT | 1975 |
Leu | Ile | Arg | Thr | Leu | Gly | Glu | Phe | Pro | Ala | Val | Val | Lys | Ala | Ala | Ala | |
470 | 475 | 480 | ||||||||||||||
GAC | CTA | CGT | GAA | CCA | CAC | CGC | ATT | GCC | CGC | TAT | GCT | GAG | GAA | TTA | GCT | 2023 |
Asp | Leu | Arg | Glu | Pro | His | Arg | Ile | Ala | Arg | Tyr | Ala | Glu | Glu | Leu | Ala | |
485 | 490 | 495 | ||||||||||||||
GGA | ACT | TTC | CAC | CGC | TTC | TAC | GAT | TCC | TGC | CAC | ATC | CTT | CCA | AAG | GTT | 2071 |
Gly | Thr | Phe | His | Arg | Phe | Tyr Asp | Ser | Cys | His | Ile | Leu | Pro | Lys | Val | ||
500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
GAT | GAG | GAT | ACG | GCA | CCA | ATC | CAC ACA | GCA | CGT | CTG | GCA CTT | GCA | GCA | 2119 |
·
Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala | ||||||||||||||||
515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
GCA | ACC | CGC | CAG | ACC | CTC | GCT | AAC | GCC | CTG | CAC | CTG | GTT | GGC | GTT | TCC | 2167 |
Ala | Thr | Arg | Gin | Thr | Leu | Ala Asn | Ala | Leu | His | Leu | Val | Gly | Val | Ser | ||
530 | 535 | 540 | 545 | |||||||||||||
GCA | CCG | GAG | AAG | ATG | TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA | 2214 | ||||||||||
Ala | Pro | Glu | Lys | Met | Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu | |||||||||||
- | 550 | 1 | 5 | |||||||||||||
CTT | CCC | GCA | CAC | GTA | TGG | CCA | CGC | AAT | GCC | GTG | CGC | CAA | GAA | GAC | GGC | 2262 |
Leu | Pro | Ala | His | Val | Trp | Pro | Arg | Asn | Ala | Val Arg | Gin | G1U | Asp | Gly | ||
10 | 15 | 20 | 25 | |||||||||||||
GTT | GTC | ACC | GTC | GCT | GCT | GTG | CCT | CTG | CCT | GAC | CTC | GCT | GAA | GAA | TAC | 2310 |
Val | Val | Thr | Val | Ala | Gly | Val | Pro | Leu | Pro | Asp | Leu | Ala | Glu | Glu | Tyr | |
30 | 35 | 40 | ||||||||||||||
GGA | ACC | CCA | CTG | TTC | GTA | GTC | GAC | GAG | GAC | GAT | TTC | CGT | TCC | CGC | TGT | 2358 |
Gly | Thr | Pro | Leu | Phe | Val | Val | Asp | Glu | Asp | Asp | Phe | Arg | Ser | Arg | Cys | |
45 | 50 | 55 | ||||||||||||||
CGC | GAC | ATG | GCT | ACC | GCA | TTC | GGT | GGA | CCA | GGC | AAT | CTG | CAC | TAC | GCA | 2406 |
Arg | Asp | Met | Ala | Thr | Ala | Phe | Gly Gly | Pro | Gly | Asn | Val | His | Tyr | Ala | ||
60 | 65 | 70 | ||||||||||||||
TCT | AAA | GCG | TTC | CTG | ACC | AAG | ACC | ATT | GCA | CGT | TGG | GTT | GAT | GAA | GAG | 2454 |
Ser | Lys | Ala | Phe | Leu | Thr | Lys | Thr | Ile | Ala | Arg | Trp | Val | Asp | Glu | Glu | |
75 | 80 | 85 | ||||||||||||||
GGG | CTG | GCA | CTG | GAC | ATT | GCA | TCC | ATC | AAC | GAA | CTG | GGC | ATT | GCC | CTG | 2502 |
Gly | Leu | Ala | Leu | Asp | Ile | Ala | Ser | Ile | Asn | Glu | Leu | Gly | Ile | Ala | Leu | |
90 | 95 | 100 | 105 | |||||||||||||
GCC | GCT | GCT | ITC | CCC | GCC | AGC | CGT | ATC | ACC | GCG | CAC | GGC | AAC | AAC | AAA | 2550 |
Ala | Ala | Gly | Phe | Pro | Ala | Ser | Arg | Ile | Thr | Ala | His | Gly | Asn | Asn | Lys | |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||||
GGC | GTA | GAG | TTC | CTG | CGC | GCG | TTG | GTT | CAA | AAC | GGT | CTG | GGA | CAC | GTG | 2598 |
Gly | Val | Glu | Phe | Leu | Arg | Ala | Leu | Val | Gin | Asn | Gly | Val | Gly | His | Val | |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||||
GTG | CTG | GAC | TCC | GCA | CAG | GAA | CTA | GAA | CTG | TTG | GAT | TAC | GTT | GCC | GCT | 26<í6 |
Val | Leu | Asp | Ser | Ala | Gin | Glu | Leu | Glu | Leu | Leu | Asp | Tyr | Val | Ala | Ala | |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||||
GCT | GAA | GGC | AAG | ATT | CAG | GAC | GTG | TTG | ATC | CGC | GTA | AAG | CCA | GGC | ATC | 2694 |
Gly | Glu | Gly | Lys | Ile | Gin | Asp | Val | Leu | Ile | Arg | Val | Lys | Pro | Gly | Ile | |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||||
GAA | GCA | CAC | ACC | CAC | GAG | ITC | ATC | GCC | ACT | AGC | CAC | GAA | GAC | CAG | AAG | 2742 |
Glu | Ala | His | Thr | His | Glu | Phe | Ile | Ala | Thr | Ser | His | Glu | Asp | Gin | Lys | |
170 | 175 | 180 | 185 | |||||||||||||
ITC | GGA | TTC | TCC | CTG | GCA | TCC | GGT | TCC | GCA | TTC | GAA | GCA | GCA | AAA | GCC | 2790 |
Phe | Gly | Phe | Ser | Leu | Ala | Ser | Gly | Ser | Ala | Phe | Glu | Ala | Ala | Lys | Ala | |
190 | 195 | 200 | ||||||||||||||
GCC | AAC | AAC | GCA | GAA | AAC | CTG | AAC | CTG | GTT | GGC | CTG | CAC | TGC | CAC | CTT | 2838 |
• ·
Ala Asn Asn Ala | Glu | Asn | Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val | |||||||||||||
205 | 210 | 215 | ||||||||||||||
GGT | TCC | CAG | GTG | TTC | GAC | GCC | GAA | GGC | TTC | AAG | CTG | GCA | GCA | GAA | CGC | 2886 |
Gly | Ser | Gin | Val | Phe | Asp | Ala | Glu | Gly | Phe | Lys | Leu | Ala | Ala | Glu | Arg | |
220 | 225 | 230 | ||||||||||||||
GTG | TTG | GGC | CTG | TAC | TCA | CAG | ATC | CAC | AGC | GAA | CTG | GGC | GTT | GCC | CTT | 2934 |
Val | Leu | Gly | Leu | Tyr | Ser | Gin | Ile | His | Ser | Glu | Leu | Gly | Val | Ala | Leu | |
235 | 240 | 245 | ||||||||||||||
CCT | GAA | CTG | GAT | CTC | GGT | GGC | GGA | TAC | GGC | ATT | GCC | TAT | ACC | GCA | GCT | 2982 |
Pro | Glu | Leu | Asp | Leu | Gly | Gly Gly | Tyr | Gly | Ile | Ala | Tyr | Thr | Ala | Ala | ||
250 | 255 | 260 | 265 | |||||||||||||
GAA | GAA | CCA | CTC | AAC | GTC | GCA | GAA | GTT | GCC | TCC | GAC | CTG | CTC | ACC | GCA | 3030 |
Glu | Glu | Pro | Leu | Asn | Val | Ala | Glu | Val | Ala | Ser | Asp | Leu | Leu | Thr | Ala | |
270 | 275 | 280 | ||||||||||||||
GTC | GGA | AAA | ATG | GCA | GCG | GAA | CTA | GGC | ATC | GAC | GCA | CCA | ACC | GTG | CTT | 3078 |
Val | Gly | Lys | Met | Ala | Ala | Glu | Leu | Gly | Ile | Asp | Ala | Pro | Thr | Val | Leu | |
285 | 290 | 295 | ||||||||||||||
GTT | GAG | CCC | GGC | CGC | GCT | ATC | GCA | GGC | CCC | TCC | ACC | GTG | ACC | ATC | TAC | 3126 |
Val | Glu | Pro | Gly Arg | Ala | Ile | Ala | Gly | Pro | Ser | Thr | Val | Thr | Ile | Tyr | ||
300 | 305 | 310 | ||||||||||||||
GAA | GTC | GGC | ACC | ACC | AAA | GAC | GTC | CAC | GTA | GAC | GAC | GAC | AAA | ACC | CGC | 3174 |
Glu | Val | Gly | Thr | Thr | Lys | Asp | Val | His | Val | Asp | Asp | Asp | Lys | Thr | Arg | |
315 | 320 | 325 | ||||||||||||||
CGT | TAC | ATC | GCC | GTG | GAC | GGA | GGC | ATG | TCC | GAC | AAC | ATC | CGC | CCA | GCA | 3222 |
Arg | Tyr | Ile | Ala | Val | Asp | Gly Gly | Met | Ser | Asp | Asn | Ile | Arg | Pro | Ala | ||
330 | 335 | 340 | 345 | |||||||||||||
CTC | TAC | GGC | TCC | GAA | TAC | GAC | GCC | CGC | GTA | GTA | TCC | CGC | TTC | GCC | GAA | 3270 |
Leu | Tyr Gly | Ser | Glu | Tyr Asp | Ala | Arg | Val | Val | Ser | Arg | Phe | Ala | Glu | |||
350 | 355 | 360 | ||||||||||||||
GGA | GAC | CCA | GTA | AGC | ACC | CGC | ATC | GTG | GGC | TCC | CAC | TGC | GAA | TCC | GGC | 3318 |
Gly Asp | Pro | Val | Ser | Thr | Arg | Ile | Val | Gly | Ser | His | Cys | Glu | Ser | Gly | ||
365 | 370 | 375 | ||||||||||||||
GAT | ATC | CTG | ATC | AAC | GAT | GAA | ATC | TAC | CCA | TCT | GAC | ATC | ACC | AGC | GGC | 3366 |
Asp | Ile | Leu | Ile | Asn | Asp | Glu | Ile | Tyr | Pro | Ser | Asp | Ile | Thr | Ser | Gly | |
380 | 385 | 390 | ||||||||||||||
GAC | TTC | CTT | GCA | CTC | GCA | GCC | ACC | GGC | GCA | TAC | TGC | TAC | GCC | ATG | AGC | 3414 |
Asp | Phe | Leu | Ala | Leu | Ala | Ala | Thr | Gly | Ala | Tyr Cys | Tyr | Ala | Met | Ser | ||
395 | 400 | 405 | ||||||||||||||
TCC | CGC | TAC | AAC | GCC | TTC | ACA | CGG | CCC | GCC | GTC | GTG | TCC | GTC | CGC | GCT | 3462 |
Ser | Arg | Tyr | Asn | Ala | Phe | Thr | Arg | Pro | Ala | Val | Val | Ser | Val | Arg | Ala | |
410 | 415 | 420 | 425 | |||||||||||||
GCC | AGC | TCC | CGC | CTC | ATG | CTG | CGC | CGC | GAA | ACG CTC | GAC | GAC | ATC | CTC | 3510 | |
Gly | Ser | Ser | Arg | Leu | Met | Leu | Arg Arg | Glu | Thr | Leu | Asp Asp | Ile | Leu |
430 435 440
TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 3562
Ser Leu Glu Ala
445
GTGGAGGGCG GTTTTGG
3579 • · • · (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 550 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:
Met Thr Pro Ala Asp | Leu Ala | Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu | ||||||||||||
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
Val | Leu | Thr | Ser | Arg | Glu | Leu | Asp | Thr | Ser | Val Leu | Pro | Glu | Gin | Val |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Val | Val | Glu | Arg | Pro | Arg | Asn | Pro | Glu | His | Gly Asp | Tyr | Ala | Thr | Asn |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Ile | Ala | Leu | Gin | Val | Ala | Lys | Lys | Val | Gly | Gin Asn | Pro | Arg | Asp | Leu |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Ala | Thr | Trp | Leu | Ala | Glu | Ala | Leu | Ala | Ala | Asp Asp | Ala | Ile | Asp | Ser |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||
Ala | Glu | Ile | Ala | Gly | Pro | Gly | Phe | Leu | Asn | Ile Arg | Leu | Ala | Ala | Ala |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||
Ala | Gin | Gly | Glu | Ile | Val | Ala | Lys | Ile | Leu | Ala Gin | Gly | Glu | Thr | Phe |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||
Gly | Asn | Ser | Asp | His | Leu | Ser | His | Leu | Asp | Val Asn | Leu | Glu | Phe | Val |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||
Ser | Ala | Asn | Pro | Thr | Gly | Pro | Ile | His | Leu | Gly Gly | Thr | Arg | Trp | Ala |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||
Ala | Val | Gly Asp | Ser | Leu | Gly Arg | Val | Leu | Glu Ala | Ser | Gly | Ala | Lys | ||
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||
Val | Thr | Arg | Glu | Tyr Tyr | Phe | Asn | Asp | His | Gly Arg | Gin | Ile | Asp | Arg | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||
Phe | Ala | Leu | Ser | Leu | Leu | Ala | Ala | Ala | Lys | Gly Glu | Pro | Thr | Pro | Glu |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||
Asp | Gly | Tyr | Gly Gly | Glu | Tyr | Ile | Lys | Glu | Ile Ala | Glu | Ala | Ile | Val | |
195 | 200 | 205 | ||||||||||||
Glu | Lys | His | Pro | Glu | Ala | Leu | Ala | Leu | Glu | Pro Ala | Ala | Thr | Gin | Glu |
210 | 215 | 220 | ||||||||||||
Leu | Phe | Arg | Ala | Glu | Gly Val Glu | Met | Met | Phe Glu His | Ile | Lys | Ser | |||
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||
Ser | Leu | His | Glu | Phe | Gly Thr Asp | Phe | Asp | Val Tyr Tyr | His | Glu | Asn | |||
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
Ser | Leu | Phe | Glu | Ser | Gly Ala Val | Asp | Lys Ala Val | Gin | Val | Leu Lys |
260 265 270
Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser | |||||||||||||||
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Thr | Glu | Phe | Gly Asp | Asp | Lys Asp Arg | Val | Val | Ile | Lys | Ser | Asp | Gly | |||
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Asp | Ala | Ala | Tyr | Ile | Ala | Gly Asp | Ile | Ala | Tyr | Val | Ala | Asp | Lys | Phe | |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Ser | Arg | Gly | His | Asn | Leu | Asn | Ile | Tyr | Met | Leu | Gly | Ala | Asp | His | His |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Gly | Tyr | Ile | Ala | Arg | Leu | Lys | Ala | Ala | Ala | Ala | Ala | Leu | Gly Tyr | Lys | |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Pro | Glu | Gly | Val | Glu | Val | Leu | Ile | Gly | Gin | Met | Val | Asn | Leu | Leu | Arg |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Asp | Gly | Lys | Ala | Val | Arg | Met | Ser | Lys | Arg | Ala | Gly | Thr | Val | Val | Thr |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Leu | Asp | Asp | Leu | Val | Glu | Ala | Ile | Gly | Ile | Asp | Ala | Ala | Arg | Tyr | Ser |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Leu | Ile | Arg | Ser | Ser | Val | Asp | Ser | Ser | Leu | Asp | Ile | Asp | Leu | Gly | Leu |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Trp | Glu | Ser | Gin | Ser | Ser | Asp | Asn | Pro | Val | Tyr | Tyr | Val | Gin | Tyr | Gly |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
His | Ala | Arg | Leu | Cys | Ser | Ile | Ala | Arg | Lys | Ala | Glu | Thr | Leu | Gly | Val |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Thr | Glu | Glu | Gly | Ala | Asp | Leu | Ser | Leu | Leu | Thr | His | Asp | Arg | Glu | Gly |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Asp | Leu | Ile | Arg | Thr | Leu | Gly | Glu | Phe | Pro | Ala | Val | Val | Lys | Ala | Ala |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Ala | Asp | Leu | Arg | Glu | Pro | His | Arg | Ile | Ala | Arg | Tyr | Ala | Glu | Glu | Leu |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Ala | Gly | Thr | Phe | His | Arg | Phe | Tyr Asp | Ser | Cys | His | Ile | Leu | Pro | Lys | |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Val | Asp | Glu | Asp | Thr | Ala | Pro | Ile | His | Thr | Ala | Arg | Leu | Ala | Leu | Ala |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Ala | Ala | Thr | Arg | Gin | Thr | Leu | Ala | Asn Ala | Leu | His | Leu Val Gly | Val | |||
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Ser | Ala | Pro | Glu | Lys | Met |
545 550 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 445 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein • · • ·
- 66 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO;20:
Met | Ala | Thr Val | Glu | Asn Phe Asn Glu Leu Pro | Ala | His | Val Trp Pro |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||
Arg | Asn | Ala Val | Arg | Gin Glu Asp Gly Val Val | Thr | Val Ala Gly Val | |
20 | 25 | 30 | |||||
Pro | Leu | Pro Asp | Leu | Ala Glu Glu Tyr Gly Thr | Pro | Leu | Phe Val Val |
35 | 40 | 45 | |||||
Asp | Glu | Asp Asp | Phe | Arg Ser Arg Cys Arg Asp | Met | Ala | Thr Ala Phe |
50 | 55 | 60 | |||||
Gly Gly | Pro Gly Asn | Val His Tyr Ala Ser Lys | Ala | Phe | Leu Thr Lys | ||
65 | 70 75 | 80 | |||||
Thr | Ile | Ala Arg | Trp | Val Asp Glu Glu Gly Leu | Ala | Leu | Asp Ile Ala |
85 | 90 | 95 | |||||
Ser | Ile | Asn Glu | Leu | Gly Ile Ala Leu Ala Ala | Gly | Phe | Pro Ala Ser |
100 | 105 | 110 | |||||
Arg | Ile | Thr Ala | His | Gly Asn Asn Lys Gly Val | Glu | Phe | Leu Arg Ala |
115 | 120 | 125 | |||||
Leu | Val | Gin Asn | Gly | Val Gly His Val Val Leu | Asp | Ser | Ala Gin Glu |
130 | 135 | 140 | |||||
Leu | Glu | Leu Leu | Asp | Tyr Val Ala Ala Gly Glu | Gly | Lys | Ile Gin Asp |
145 | 150 155 | 160 | |||||
Val | Leu | Ile Arg | Val | Lys Pro Gly Ile Glu Ala | His | Thr | His Glu Phe |
165 | 170 | 175 | |||||
Ile | Ala | Thr Ser | His | Glu Asp Gin Lys Phe Gly | Phe | Ser | Leu Ala Ser |
180 | 185 | 190 | |||||
Gly | Ser | Ala Phe | Glu | Ala Ala Lys Ala Ala Asn | Asn | Ala | Glu Asn Leu |
195 | 200 | 205 | |||||
Asn | Leu | Val Gly | Leu | His Cys His Val Gly Ser | Gin | Val | Phe Asp Ala |
210 | 215 | 220 | |||||
Glu | Gly | Phe Lys | Leu | Ala Ala Glu Arg Val Leu | Gly | Leu | Tyr Ser Gin |
225 | 230 235 | 240 | |||||
Ile | His | Ser Glu | Leu | Gly Val Ala Leu Pro Glu | Leu | Asp | Leu Gly Gly |
245 | 250 | 255 | |||||
Gly | Tyr | Gly Ile | Ala | Tyr Thr Ala Ala Glu Glu | Pro | Leu | Asn Val Ala |
260 | 265 | 270 | |||||
Glu | Val | Ala Ser | Asp | Leu Leu Thr Ala Val Gly | Lys | Met | Ala Ala Glu |
275 | 280 | 285 | |||||
Leu | Gly | Ile Asp | Ala | Pro Thr Val Leu Val Glu | Pro | Gly | Arg Ala Ile |
290 | 295 | 300 | |||||
Ala | Gly | Pro Ser | Thr | Val Thr Ile Tyr Glu Val | Gly | Thr | Thr Lys Asp |
305 | 310 315 | 320 | |||||
Val | His | Val Asp | Asp | Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile | Ala | Val Asp Gly | |
325 330 | 335 | ||||||
Gly | Met | Ser Asp | Asn | Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly | Ser | Glu Tyr Asp | |
340 | 345 | 350 | |||||
Ala | Arg | Val Val | Ser | Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro | Val | Ser Thr Arg | |
355 | 360 | 365 |
Ile Val 370 | Gly Ser | His | Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu | |||||||||||
375 | 380 | |||||||||||||
Ile | Tyr | Pro | Ser Asp | Ile | Thr | Ser | Gly Asp | Phe | Leu | Ala | Leu | Ala | Ala | |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||
Thr | Gly | Ala | Tyr Cys | Tyr | Ala | Met | Ser Ser | Arg | Tyr | Asn | Ala | Phe | Thr | |
405 | 410 | 415 | ||||||||||||
Arg | Pro | Ala | Val | Val | Ser | Val | Arg Ala Gly Ser | Ser | Arg | Leu | Met | Leu | ||
420 | 425 | 430 | ||||||||||||
Arg | Arg | Glu | Thr | Leu | Asp | Asp | Ile | Leu Ser | Leu | Glu | Ala | |||
435 | 440 | 445 |
(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ is (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:
CATCTAAGTA TGCATCTCGG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „synthetic DNA“ (iv) KÓDUJÍCÍ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:
TGCCCCTCGA GCTAAATTAG • ·
- 68 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1034 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
io (A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum (B) KMEN: ATCC 13869 (ix) VLASTNOSTI:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 61..1020 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:
ATGCATCTCG GTAAGCTCGA CCAGGACAGT GCCACCACAA TTTTGGAGGA TTACAAGAAC 60
ATG | ACC | AAC | ATC | CGC | GTA | GCT | ATC | GTG | GGC | TAC | GGA | AAC | CTG | GGA | CGC | 108 |
Met | Thr | Asn | Ile | Arg | Val | Ala | Ile | Val | Gly Tyr Gly | Asn | Leu | Gly Arg | ||||
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
AGC | GTC | GAA | AAG | CTT | ATT | GCC | AAG | CAG | CCC | GAC | ATG | GAC | CTT | GTA | GGA | 156 |
Ser | Val | Glu | Lys | Leu | Ile | Ala | Lys | Gin | Pro | Asp | Met | Asp | Leu | Val | Gly | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
ATC | TTC | TCG | CGC | CGG | GCC | ACC | CTC | GAC | ACA | AAG | ACG | CCA | GTC | ΤΓΓ | GAT | 204 |
Ile | Phe | Ser | Arg Arg | Ala | Thr | Leu | Asp | Thr | Lys | Thr | Pro | Val | Phe | Asp | ||
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
GTC | GCC | GAC | GTG | GAC | AAG | CAC | GCC | GAC | GAC | GTG | GAC | GTG | CTG | TTC | CTG | 252 |
Val | Ala | Asp | Val | Asp | Lys | His | Ala | Asp | Asp | Val | Asp | Val | Leu | Phe | Leu | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
TGC | ATG | GGC | TCC | GCC | ACC | GAC | ATC | CCT | GAG | CAG | GCA | CCA | AAG | TTC | GCG | 300 |
Cys | Met | Gly | Ser | Ala | Thr | Asp | Ile | Pro | Glu | Gin | Ala | Pro | Lys | Phe | Ala | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
CAG | TTC | GCC | TGC | ACC | GTA | GAC | ACC | TAC | GAC | AAC | CAC | CGC | GAC | ATC | CCA | 348 |
Gin | Phe | Ala | Cys | Thr | Val | Asp | Thr | Tyr Asp | Asn | His | Arg Asp | Ile | Pro | |||
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
CGC | CAC | CGC | CAG | GTC | ATG | AAC | GAA | GCC | GCC | ACC | GCA | GCC | GGC | AAC | GTT | 396 |
Arg | His | Arg | Gin | Val | Met | Asn | Glu | Ala | Ala | Thr | Ala | Ala | Gly | Asn | Val | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
GCA | CTG | GTC | TCT | ACC | GGC | TGG | GAT | CCA | GGA | ATG | TTC | TCC | ATC | AAC | CGC | 444 |
Ala | Leu | Val | Ser | Thr | Gly Trp | Asp | Pro | Gly | Met | Phe | Ser | Ile | Asn | Arg | ||
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
GTC | TAC | GCA | GCG | GCA | GTC | TTA | GCC | GAG | CAC | CAG | CAG | CAC | ACC | TTC | TGG | 492 |
Val | Tyr | Ala | Ala | Ala | Val | Leu | Ala Glu | His | Gin | Gin | His | Thr | Phe | Trp | ||
130 | 135 | 140 |
GGC | CCA | GGT | TTG | TCA | CAG | GGC | CAC | TCC | GAT | GCT | TTG | CGA | CGC ATC | CCT | 540 |
Gly | Pro | Gly | Leu | Ser | Gin | Gly | His | Ser | Asp | Ala | Leu | Arg | Arg Ile | Pro | |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
GGC | GTT | CAA | AAG | GCA | GTC | CAG | TAC | ACC | CTC | CCA | TCC | GAA | GAC GCC | CTG | 588 |
Gly | Val | Gin | Lys | Ala | Val | Gin | Tyr | Thr | Leu | Pro | Ser | Glu | Asp Ala | Leu | |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
GAA | AAG | GCC | CGC | CGC | GGC | GAA | GCC | GGC | GAC | CTT | ACC | GGA | AAG CAA | ACC | 636 |
Glu | Lys | Ala | Arg | Arg Gly | Glu | Ala | Gly Asp | Leu | Thr | Gly | Lys Gin | Thr | |||
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
CAC | AAG | CGC | CAA-TGC | TTC | GTG | GTT | GCC | GAC | GCG | GCC | GAT | CAC GAG | CGC | 684 | |
His | Lys | Arg | Gin Cys | Phe | Val | Val | Ala Asp | Ala | Ala | Asp | His Glu | Arg | |||
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
ATC | GAA | AAC | GAC | ATC | CGC | ACC | ATG | CCT | GAT | TAC | TTC | GTT | GGC TAC | GAA | 732 |
Ile | Glu | Asn | Asp | Ile | Arg | Thr Met | Pro | Asp | Tyr | Phe Val | Gly Tyr | Glu | |||
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
GTC | GAA | GTC | AAC | TTC | ATC | GAC | GAA | GCA | ACC | TTC | GAC | TCC | GAG CAC | ACC | 780 |
Val | Glu | Val | Asn | Phe | Ile | Asp | Glu | Ala | Thr | Phe | Asp | Ser | Glu His | Thr | |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
GGC | ATG | CCA | CAC | GGT | GGC | CAC | GTG | ATT | ACC | ACC | GGC | GAC | ACC GGT | GGC | 828 |
Gly | Met | Pro | His | Gly | Gly | His | Val | Ile | Thr | Thr | Gly | Asp | Thr Gly Gly | ||
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
TTC | AAC | CAC | ACC | GTG | GAA | TAC | ATC | CTC | AAG | CTC | GAC | CGA | AAC CCA | GAT | 876 |
Phe | Asn | His | Thr | Val | Glu | Tyr | Ile | Leu | Lys | Leu | Asp Arg | Asn Pro | Asp | ||
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
TTC | ACC | GCT | TCC | TCA | CAG | ATC | GCT | TTC | GCT | CGC | GCA | GCT | CAC CGC | ATG | 924 |
Phe | Thr | Ala | Ser | Ser | Gin | Ile | Ala | Phe | Gly Axg | Ala | Ala | His Arg | Met | ||
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
AAG | CAG | CAG | GGC | CAA | AGC | GGA | GCT | TTC | ACC | GTC | CTC | GAA | GTT GCT | CCA | 972 |
Lys | Gin | Gin | Gly | Gin | Ser | Gly | Ala | Phe | Thr | Val | Leu | Glu | Val Ala | Pro | |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
TAC | CTG | CTC | TCC | CCA | GAG | AAC | TTG | GAC | GAT | CTG | ATC | GCA | CGC GAC | GTC | 1020 |
Tyr | Leu | Leu | Ser | Pro | Glu | Asn | Leu | Asp | Asp | Leu | Ile | Ala | Arg Asp | Val | |
305 | 310 | 315 | 320 |
TAATTTAGCT CGAG 1034 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 320 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární
- 70 (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:
Met | Thr | Asn | Ile | Arg Val | Ala Ile | Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg | ||
1 | 5 | 10 | 15 | |||||
Ser | Val | Glu | Lys | Leu Ile | Ala Lys | Gin Pro | Asp | Met Asp Leu Val Gly |
20 | 25 | 30 | ||||||
Ile | Phe | Ser | Arg | Arg Ala | Thr Leu | Asp Thr | Lys | Thr Pro Val Phe Asp |
35 | 40 | 45 | ||||||
Val | Ala | Asp | Val | Asp Lys | His Ala | Asp Asp | Val | Asp Val Leu Phe Leu |
50 | 55 | 60 | ||||||
Cys | Met | Gly | Ser | Ala Thr | Asp Ile | Pro Glu | Gin | Ala Pro Lys Phe Ala |
65 | 70 | 75 | i 80 | |||||
Gin | Phe | Ala | Cys | Thr Val | Asp Thr | Tyr Asp | Asn | His Arg Asp Ile Pro |
85 | 90 | 95 | ||||||
Arg | His | Arg | Gin | Val Met | Asn Glu | Ala Ala | Thr | Ala Ala Gly Asn Val |
100 | 105 | 110 | ||||||
Ala | Leu | Val | Ser | Thr Gly | Trp Asp | Pro Gly | Met | Phe Ser Ile Asn Arg |
115 | 120 | 125 | ||||||
Val | Tyr | Ala | Ala | Ala Val | Leu Ala | Glu His | Gin | Gin His Thr Phe Trp |
130 | 135 | 140 | ||||||
Gly | Pro | Gly | Leu | Ser Gin | Gly His | Ser Asp | Ala | Leu Arg Arg Ile Pro |
145 | 150 | 155 160 | ||||||
Gly | Val | Gin | Lys | Ala Val | Gin Tyr | Thr Leu | Pro | Ser Glu Asp Ala Leu |
165 | 170 | 175 | ||||||
Glu | Lys | Ala | Arg Arg Gly | Glu Ala | Gly Asp | Leu | Thr Gly Lys Gin Thr | |
180 | 185 | 190 | ||||||
His | Lys | Arg | Gin | Cys Phe | Val Val | Ala Asp | Ala | Ala Asp His Glu Arg |
195 | 200 | 205 | ||||||
Ile | Glu | Asn | Asp | Ile Arg | Thr Met | Pro Asp | Tyr | Phe Val Gly Tyr Glu |
210 | 215 | 220 | ||||||
Val | Glu | Val | Asn | Phe Ile | Asp Glu | Ala Thr | Phe | Asp Ser Glu His Thr |
225 | 230 | 235 240 | ||||||
Gly | Met | Pro | His | Gly Gly | His Val | Ile Thr | Thr | Gly Asp Thr Gly Gly |
245 | 250 | 255 | ||||||
Phe | Asn | His | Thr | Val Glu | Tyr Ile | Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp | ||
260 | 265 | 270 | ||||||
Phe | Thr | Ala | Ser | Ser Gin | Ile Ala | Phe Gly Arg | Ala Ala His Arg Met | |
275 | 280 | 285 | ||||||
Lys | Gin | Gin | Gly | Gin Ser | Gly Ala | Phe Thr Val | Leu Glu Val Ala Pro | |
290 | 295 | 300 | ||||||
Tyr | Leu | Leu | Ser | Pro Glu | Asn Leu Asp Asp Leu | Ile Ala Arg Asp Val | ||
305 | 310 | 315 320 |
Claims (5)
1. Rekombinantní DNA schopná autonomní replikace v buňkách koryneformní bakterie, obsahující sekvenci DNA kódující aspartokinázu, u které je v podstatě vyřazena z činnosti zpětnovazebná inhibice L-lyzinem a L-threoninem, a sekvenci DNA kódující dihydrodipikolinát reduktázu.
2. Rekombinantní DNA podle nároku 1, dále obsahující sekvenci DNA kódující dihydrodipikolinát syntázu.
3. Rekombinantní DNA podle nároku 2, dále obsahující sekvenci DNA kódující diaminopimelát dekarboxylázu.
4. Rekombinantní DNA podle nároku 3, dále obsahující sekvenci DNA kódující diaminopimelát dehydrogenázu.
5. Rekombinantní DNA podle některého z nároků 1 až 4, kde uvedenou aspartokinázou, ve které je v podstatě vyřazena z činnosti zpětnovazebná inhibice L-lyzinem a L-threoninem, je aspartokináza pocházející z koryneformní bakterie, a kde uvedená aspartokináza je mutantní aspartokináza, ve které je v α-podjednotce zaměněn zbytek alaninu v poloze 279, počítáno od N-konce, za zbytek aminokyseliny jiné než alanin a jiné než kyselá aminokyselina, a v β-podjednotce je zaměněn zbytek alaninu v poloze 30 za zbytek aminokyseliny jiné než alanin a jiné než kyselá aminokyselina.
6. Rekombinantní DNA podle některého z nároků 1 až 4, kde sekvence DNA kódující dihydrodipikolinát reduktázu kóduje sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID No: 15 ve výpisu sekvenci nebo sekvenci aminokyselin v podstatě stejnou jako je sekvence aminokyselin, uvedená v SEQ ID No: 15.
7. Rekombinantní DNA podle nároku 2, kde uvedená sekvence kódující dihydrodipikolinát syntázu kóduje sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID No: 11 ve výpisu sekvencí nebo sekvenci aminokyselin v podstatě stejnou jako je sekvence aminokyselin, uvedená v SEQ ID No: 11.
8. Rekombinantní DNA podle nároku 3, kde uvedená sekvence kódující diaminopimelát dekarboxylázu kóduje sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID No: 19 ve výpisu sekvencí nebo sekvenci aminokyselin v podstatě stejnou jako je sekvence aminokyselin, uvedená v SEQ ID No: 19.
9. Rekombinantní DNA podle nároku 4, kde uvedená sekvence kódující diaminopimelát dehydrogenázu kóduje sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ ID No: 24 ve výpisu sekvencí nebo sekvenci aminokyselin v podstatě stejnou jako je sekvence aminokyselin, uvedená v SEQ ID No: 24.
10. Koryneformní bakterie, vyznačující se tím, ž e nese aspartokinázu, u které je v podstatě vyřazena z činnosti zpětnovazebně inhibice L-lyzinem a L-threoninem, a • · • 4 · · · ·· • 4 · ·44 • 4 4 ··· ·· • e 4 · ··
44 ···* ·«·· která obsahuje zesílenou sekvenci DNA kódující dihydrodipikolinát reduktázu.
11. Koryneformní bakterie podle nároku 10, vyznačující se tím, že je transformována zavedením rekombinantní
DNA podle nároku 1.
12. Koryneformní bakterie podle nároku 10, vyznačující se tím, že dále obsahuje zesílenou sekvenci DNA kódující dihydrodipikolinát syntázu.
13. Koryneformní bakterie podle nároku 12, vyznačující se tím, že je transformována zavedením rekombinantní
DNA podle nároku 2.
14. Koryneformní bakterie podle nároku 12, vyznačující se tím, že dále obsahuje zesílenou sekvenci DNA kódující diaminopimelát dekarboxylázu.
15. Koryneformní bakterie podle nároku 14, vyznačující se tím, že je transformována zavedením rekombinantní
DNA podle nároku 3.
16. Koryneformní bakterie podle nároku 14, vyznačující se tím, že dále obsahuje zesílenou sekvenci DNA kódující diaminopimelát dehydrogenázu.
• · • · · · · ·· ♦ · · · * ..........
·«···· ·· ··· · · a · · · · · · · · ······· ···· ·· ·*
17. Koryneformní bakterie podle nároku 16, vyznačující se tím, že je transformována zavedením rekombinantní DNA podle nároku 4.
5 18. Způsob výroby L-lyzinu, vyznačující se tím, ž e zahrnuje kroky kultivace uvedené koryneformní bakterie podle některého z nároků 10 až 17 ve vhodném médiu, produkce a akumulace L-lyzinu v kultuře bakterií a izolace Llyzinu z kultury.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14061495 | 1995-06-07 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ390397A3 true CZ390397A3 (cs) | 1998-06-17 |
CZ293268B6 CZ293268B6 (cs) | 2004-03-17 |
Family
ID=15272810
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19973903A CZ293268B6 (cs) | 1995-06-07 | 1996-06-05 | Rekombinantní DNA, bakterie a způsob výroby L-lyzinu |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20020086370A1 (cs) |
EP (1) | EP0841395B1 (cs) |
JP (1) | JP3106501B2 (cs) |
KR (1) | KR100268324B1 (cs) |
CN (1) | CN1165619C (cs) |
AU (1) | AU705550B2 (cs) |
BR (1) | BR9606379A (cs) |
CA (1) | CA2224058C (cs) |
CZ (1) | CZ293268B6 (cs) |
DK (1) | DK0841395T3 (cs) |
ES (1) | ES2373863T3 (cs) |
HU (1) | HU222503B1 (cs) |
MX (1) | MX9709923A (cs) |
RU (1) | RU2197528C2 (cs) |
SK (1) | SK285013B6 (cs) |
WO (1) | WO1996040934A1 (cs) |
ZA (1) | ZA964665B (cs) |
Families Citing this family (59)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0841395B1 (en) | 1995-06-07 | 2011-11-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing l-lysine |
JP4035855B2 (ja) * | 1996-06-05 | 2008-01-23 | 味の素株式会社 | L−リジンの製造法 |
SK285201B6 (sk) * | 1996-12-05 | 2006-08-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7 |
JP4075087B2 (ja) * | 1996-12-05 | 2008-04-16 | 味の素株式会社 | L−リジンの製造法 |
AU1619699A (en) | 1997-12-05 | 1999-06-28 | Human Genome Sciences, Inc. | Synferon, a synthetic type i interferon |
JP3965821B2 (ja) * | 1999-03-09 | 2007-08-29 | 味の素株式会社 | L−リジンの製造法 |
JP2003135066A (ja) * | 1999-03-19 | 2003-05-13 | Ajinomoto Co Inc | L−リジンの製造法 |
AU3194300A (en) * | 1999-03-19 | 2000-10-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-amino acid |
DE19912384A1 (de) * | 1999-03-19 | 2000-09-21 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien |
JP2003180355A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-07-02 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2003169674A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-06-17 | Ajinomoto Co Inc | L−リジンの製造法 |
JP2003144161A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-05-20 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2003180348A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-07-02 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2003144160A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-05-20 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
DE19931314A1 (de) * | 1999-07-07 | 2001-01-11 | Degussa | L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von Lysin |
JP2001046067A (ja) | 1999-08-04 | 2001-02-20 | Ajinomoto Co Inc | 好熱性バチルス属細菌由来のl−リジン生合成系遺伝子 |
PL341895A1 (en) * | 1999-08-12 | 2001-02-26 | Ajinomoto Kk | Plasmide autonomously replicable in corynebacter bacteria |
US6927046B1 (en) | 1999-12-30 | 2005-08-09 | Archer-Daniels-Midland Company | Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria |
WO2002064610A1 (en) | 2001-02-08 | 2002-08-22 | Archer-Daniels-Midland Company | Polynucleotide constructs for increased lysine production |
CN100336901C (zh) * | 2001-08-06 | 2007-09-12 | 德古萨股份公司 | 生产化合物ⅱ的棒状细菌 |
DE60335774D1 (de) | 2002-11-26 | 2011-03-03 | Ajinomoto Kk | Methode für die Produktion von L-Glutamin und L-Glutamin-produzierendes Bakterium |
JP4655539B2 (ja) * | 2004-08-06 | 2011-03-23 | 味の素株式会社 | アシラーゼを用いたβアミノ酸の製造方法 |
KR100921644B1 (ko) | 2004-10-07 | 2009-10-14 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 염기성 물질의 제조법 |
JP2009089603A (ja) * | 2006-02-02 | 2009-04-30 | Ajinomoto Co Inc | メタノール資化性細菌を用いたl−リジンの製造法 |
ES2592887T3 (es) * | 2006-03-30 | 2016-12-02 | Basf Se | Procedimiento la producción de cadaverina |
JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2010088301A (ja) | 2007-02-01 | 2010-04-22 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
WO2009093703A1 (ja) | 2008-01-23 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | L-アミノ酸の製造法 |
JP2011510642A (ja) * | 2008-02-04 | 2011-04-07 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | ジピコリネートの産生方法 |
PL2262894T3 (pl) | 2008-03-03 | 2015-02-27 | Global Bio Chem Tech Group Company Limited | Rekombinowany mikroorganizm i sposób wytwarzania l-lizyny |
JP2012029565A (ja) | 2008-11-27 | 2012-02-16 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2010142200A (ja) | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Ajinomoto Co Inc | L−リジンの製造法 |
CN102471790B (zh) | 2009-07-29 | 2014-10-29 | 味之素株式会社 | 产生l-氨基酸的方法 |
JP2012196144A (ja) | 2009-08-03 | 2012-10-18 | Ajinomoto Co Inc | ビブリオ属細菌を用いたl−リジンの製造法 |
JP2012223091A (ja) | 2009-08-25 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
KR101226384B1 (ko) * | 2010-03-05 | 2013-01-25 | 씨제이제일제당 (주) | 개량된 프로모터 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 |
EP2374873A1 (en) * | 2010-04-08 | 2011-10-12 | Technische Universität Hamburg-Harburg | Modified aspartate kinase from corynebacterium and its application for amino acid production |
RU2011134436A (ru) | 2011-08-18 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности |
CN109251934B (zh) * | 2011-12-21 | 2023-07-18 | Cj第一制糖株式会社 | 利用具有产生l-赖氨酸能力的微生物产生l-赖氨酸的方法 |
CN103667165B (zh) * | 2012-09-12 | 2017-05-31 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 高产l‑赖氨酸的生产菌株及其应用 |
JP2016192903A (ja) | 2013-09-17 | 2016-11-17 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのl−アミノ酸の製造方法 |
WO2015050234A1 (ja) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
KR101518860B1 (ko) * | 2013-10-11 | 2015-05-12 | 씨제이제일제당 (주) | L-아미노산의 생산 방법 |
CN105821090B (zh) * | 2015-01-08 | 2019-12-13 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体应用 |
EP3415622A1 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-19 | Evonik Degussa GmbH | Method for production of fine chemicals using a corynebacterium secreting modified alpha-1,6-glucosidases |
EP3456833A1 (en) * | 2017-09-18 | 2019-03-20 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
EP3467099A1 (en) | 2017-10-05 | 2019-04-10 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
EP3498853A1 (en) | 2017-12-14 | 2019-06-19 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-lysine |
EP3594355A1 (en) | 2018-07-12 | 2020-01-15 | Evonik Operations GmbH | Method for the fermentative production of l-lysine |
EP3599282B1 (en) | 2018-07-24 | 2021-03-17 | Evonik Operations GmbH | Method for the fermentative production of l-lysine |
RU2019128538A (ru) | 2018-09-26 | 2021-03-11 | Эвоник Оперейшенс ГмбХ | Способ ферментативного получения l-лизина |
EP3660158A1 (en) | 2018-11-29 | 2020-06-03 | Evonik Operations GmbH | Method for the fermentative production of l-lysine |
EP3670525A1 (en) | 2018-12-18 | 2020-06-24 | Evonik Operations GmbH | Method for the fermentative production of l-lysine using c. glutamicum strains with a mutated kup transporter |
US10829746B2 (en) | 2019-01-23 | 2020-11-10 | Evonik Operations Gmbh | Method for the fermentative production of L-lysine |
EP4405376A1 (en) | 2021-09-20 | 2024-07-31 | Evonik Operations GmbH | Method for the fermentative production of l-lysine using c. glutamicum strains expressing modified gluconate repressor proteins gntr1 and gntr2 |
WO2023222510A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof |
WO2023222505A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof |
WO2023222515A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07112431B2 (ja) * | 1985-09-06 | 1995-12-06 | 味の素株式会社 | 遺伝子発現調節法 |
JPH03147791A (ja) * | 1989-11-01 | 1991-06-24 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 新規dna及び該dnaを含有するプラスミド |
JPH03147792A (ja) * | 1989-11-01 | 1991-06-24 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 新規dna及び該dnaを含有するプラスミド |
DE3943117A1 (de) * | 1989-12-27 | 1991-07-04 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur fermentativen herstellung von aminosaeure, insbesondere l-lysin, dafuer geeignete mikroorganismen und rekombinante dna |
IL99272A0 (en) * | 1990-08-23 | 1992-07-15 | Exogene Corp | Expression vectors for expression of native and heterologous genes in coryneform and a method for expressing bacterial hemoglobin in coryneform |
US5693781A (en) * | 1991-06-03 | 1997-12-02 | Mitsubishi Chemical Corporation | Promoter DNA fragment from coryneform bacteria |
JP3473042B2 (ja) * | 1992-04-28 | 2003-12-02 | 味の素株式会社 | 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子 |
JPH0775578A (ja) * | 1993-09-08 | 1995-03-20 | Mitsubishi Chem Corp | ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含むdna断片およびその利用 |
JPH07155184A (ja) * | 1993-12-08 | 1995-06-20 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるl−リジンの製造法 |
EP0841395B1 (en) | 1995-06-07 | 2011-11-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing l-lysine |
FR2736066B1 (fr) * | 1995-06-30 | 1998-11-20 | Ajinomoto Kk | Procede d'amplification d'un gene par transposon artificiel, bacterie coryneforme obtenue par ce procede et procede de production d'un acide amine a l'aide de cette bacterie |
JP4035855B2 (ja) * | 1996-06-05 | 2008-01-23 | 味の素株式会社 | L−リジンの製造法 |
SK285201B6 (sk) * | 1996-12-05 | 2006-08-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7 |
BR9917880B1 (pt) | 1998-09-25 | 2014-02-18 | Processo para produzir um ácido l-glutâmico | |
WO2000063388A1 (fr) * | 1999-04-19 | 2000-10-26 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouvelle aspartokinase desensibilisee |
DE60027161D1 (de) | 1999-07-02 | 2006-05-18 | Ajinomoto Kk | Für das saccharose-pts-enzym ii kodierende dna |
PL341895A1 (en) | 1999-08-12 | 2001-02-26 | Ajinomoto Kk | Plasmide autonomously replicable in corynebacter bacteria |
WO2001048146A1 (fr) | 1999-12-24 | 2001-07-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production d'acide l-amine et nouveau gene |
JP4655539B2 (ja) | 2004-08-06 | 2011-03-23 | 味の素株式会社 | アシラーゼを用いたβアミノ酸の製造方法 |
ATE464385T1 (de) | 2006-07-26 | 2010-04-15 | Ajinomoto Kk | N-acetyl-(r,s)-b-aminosäuren-acylase-gene |
-
1996
- 1996-06-05 EP EP96916305A patent/EP0841395B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 US US08/952,976 patent/US20020086370A1/en not_active Abandoned
- 1996-06-05 JP JP09500307A patent/JP3106501B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 AU AU59107/96A patent/AU705550B2/en not_active Expired
- 1996-06-05 HU HU9802666A patent/HU222503B1/hu active IP Right Grant
- 1996-06-05 ES ES96916305T patent/ES2373863T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 CA CA2224058A patent/CA2224058C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 WO PCT/JP1996/001511 patent/WO1996040934A1/ja active IP Right Grant
- 1996-06-05 ZA ZA964665A patent/ZA964665B/xx unknown
- 1996-06-05 CN CNB961959525A patent/CN1165619C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 KR KR1019970709002A patent/KR100268324B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 CZ CZ19973903A patent/CZ293268B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 BR BR9606379A patent/BR9606379A/pt unknown
- 1996-06-05 SK SK1640-97A patent/SK285013B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 RU RU98100099/13A patent/RU2197528C2/ru active
- 1996-06-05 DK DK96916305.4T patent/DK0841395T3/da active
- 1996-06-05 MX MX9709923A patent/MX9709923A/es active IP Right Grant
-
2002
- 2002-08-23 US US10/226,136 patent/US7846698B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-10-29 US US12/915,793 patent/US8183017B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK0841395T3 (da) | 2012-01-09 |
US20030054506A1 (en) | 2003-03-20 |
ES2373863T3 (es) | 2012-02-09 |
HU222503B1 (hu) | 2003-07-28 |
KR19990022521A (ko) | 1999-03-25 |
AU705550B2 (en) | 1999-05-27 |
BR9606379A (pt) | 1997-08-12 |
EP0841395A4 (en) | 2005-07-27 |
EP0841395A1 (en) | 1998-05-13 |
ZA964665B (en) | 1997-01-07 |
CA2224058C (en) | 2011-09-13 |
EP0841395B1 (en) | 2011-11-02 |
KR100268324B1 (ko) | 2000-10-16 |
US7846698B2 (en) | 2010-12-07 |
CA2224058A1 (en) | 1996-12-19 |
US8183017B2 (en) | 2012-05-22 |
CN1192242A (zh) | 1998-09-02 |
CZ293268B6 (cs) | 2004-03-17 |
SK285013B6 (sk) | 2006-04-06 |
MX9709923A (es) | 1998-03-31 |
AU5910796A (en) | 1996-12-30 |
HUP9802666A2 (hu) | 1999-02-01 |
US20110065153A1 (en) | 2011-03-17 |
WO1996040934A1 (fr) | 1996-12-19 |
CN1165619C (zh) | 2004-09-08 |
JP3106501B2 (ja) | 2000-11-06 |
US20020086370A1 (en) | 2002-07-04 |
RU2197528C2 (ru) | 2003-01-27 |
HUP9802666A3 (en) | 2001-08-28 |
SK164097A3 (en) | 1998-07-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8183017B2 (en) | Method of producing L-lysine | |
EP0857784B1 (en) | Method for producing L-lysine | |
EP0811682B1 (en) | Method of producing L-lysine | |
EP0854189B1 (en) | Method for producing L-lysine | |
JP4168463B2 (ja) | L−リジンの製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20160605 |