CN105821090B - 嗜热共生杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了以来源于嗜热共生杆菌（Symbiobacterium thermophilum）meso‑二氨基庚二酸脱氢酶突变体为生物催化剂，以NAD（H）为辅酶，α‑酮酸为底物合成D‑丙氨酸的方法，该方法与现有的生物相比，首次成功利用更为廉价的NAD（H）为辅因子，本发明中的生物催化剂可以通过一步加热法从粗酶中制得，因此本方法具有操作简单、反应条件温和、对环境友好、产物产率高、光学纯度高的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物催化领域，涉及一种利用嗜热共生杆菌（Symbiobacterium thermophilum）meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体为生物催化剂，以NAD（H）为辅酶，α-酮酸为底物合成D-丙氨酸的方法，产物D-丙氨酸的光学纯度 >98%，以及通过对粗酶一步热处理制备该生物催化剂的方法。
背景技术
D-氨基酸约占自然界已发现的400多种氨基酸及其类似物的10％左右，（蒋耀忠，刘桂兰。D-苯丙氨酸的不对称合成， 氨基酸杂志，1988，2：1-3）。在各种D-氨基酸中，D-丙氨酸的应用更是广泛。在食品添加剂领域，D-丙氨酸与L-天冬氨酸合成天丙二肽（商品名为阿力甜，alitame），其甜度是蔗糖的2000倍，对热、pH值稳定，可广泛用于食品工业、日用化学工业做甜味剂，具有极好的市场前景（Ellis, J. W. [J] Journal of Chemical Education1995,72 (8): 671–675）。D-丙氨酸可作为杀菌剂精甲霜灵的合成原料之一（赵克健。中国化学药品大全 [M]，第二版。北京：新时代出版社，1999）。丙氨酸在医药领域的应用也极为广泛。
在D-丙氨酸生物合成方面，目前用的酶主要有转氨酶（Koma D., Sawai T.,Hara, R., Harayama S., Kino, K., Appl. Microbiol. Biot. 2008, 79, 775-784），D-氨基酰化酶和D-海因酶/N-氨甲酰-D-氨基酰胺水解酶组合酶***（Turner R. J., AikensJ., Royer S., DeFilippi L., Yap A., Holzle D., Somers N., Fotheringham I. G.,Eng. Life Sci. 2004, 4, 517-520），meso-二氨基庚二酸脱氢酶（DAPDH）（Gao X., ChenX., Liu W., Feng J., Wu Q., Hua L., Zhu D., Appl. Environ. Microbiol. 2012,78, 8595-8600，专利申请号：201210334554.6）等，这些酶合成方法都有实际应用。DAPDH能在辅酶NADP（H）的存在下，催化氨基酸可逆氧化脱氨/还原氨化反应（Ohshima T., SodaK., in Bioprocesses and Applied Enzymology, Vol. 42, Springer Berlin /Heidelberg, 1990, pp. 187-209）。但是目前所有已知的DAPDH酶及突变子的辅酶偏好性均为NADP(H)依赖型。辅酶NAD(H)相比NADP(H)有更好的稳定性，更低廉的价格及更广的辅酶循环方法，NAD(H)依赖型氨基酸脱氢酶可使用甲酸脱氢酶（FDH）以及甲酸氨作为辅酶循环体系。它们能从前手性的酮酸出发，利用游离NH4 +作为氨基供体，在辅酶循环体系存在下，合成手性氨基酸。因此以NAD（H）依赖的ADPDH比NADP（H）依赖型的DAPDH更具有原子经济性，该方法是合成氨基酸的绿色经济的方法（Zhu D., Hua L., Biotech. J. 2009, 4, 1420-1431）。
发明内容
本发明利用辅酶偏好性改造为NAD(H)依赖型的StDapdh突变体为生物催化剂，通过一步热处理破碎上清的方法，直接制备可以用于催化反应的催化剂，并且将该催化剂应用到D-丙氨酸的合成中，产物的ee值>98%。
StDapdh突变体反应示意图
本发明中所用生物催化剂，获取步骤如下：
1.以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35E单位点突变；
2.以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35E/R36V两位点组合突变；
3.以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35D/R36V两位点组合突变；
4.以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35D/R36Q两位点组合突变；
5.以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35D/R36Q/Y76V三位点组合突变；
6.将构建的突变子工程菌进行培养、并对目的蛋白进行诱导表达；
7.将步骤6中的单位点、双位点、三位点组合突变体分别收集菌体后，用缓冲液进行重悬，进行高压破碎，离心取破碎上清，通过Ni-NTA层析柱纯化；
8.将步骤6中三位点组合突变体收集菌体后，用缓冲液进行重悬，进行高压破碎，离心取破碎上清。将破碎上清于70℃水浴中热处理30 min,再次离心取热处理上清。
将Ni柱纯化后的StDapdh突变体或热处理后的StDapdh突变体进行D-氨基酸合成反应的方法为：
将底物α-酮酸和氨基化合物与溶剂构成反应体系，加入NAD（H）辅因子，生物催化剂StDapdh突变体后在20 C ~60℃条件下，pH在6-11之间，反应4小时~72小时，制得光学纯的D-丙氨酸。
每升反应体系中生物催化剂的用量为0.1 g~100 g，溶剂为单一溶剂或多种溶剂。
反应产物构型确定检测：
向反应产物中加入高氯酸变性蛋白后，对反应产物氨基酸进行衍生，利用衍生后的L、D-丙氨酸标样做对照，确定产物构型以及ee值。
本发明方法中的StDapdh突变体酶，其辅酶偏好性为NAD(H)依赖型，而且通过一步简单热处理就能获可以催化生成D-丙氨酸，光学纯度 >98%
附图说明：
附图1：StDapdh突变子蛋白热处理过程SDS-PAGE电泳图谱。图中，泳道Ｍ：蛋白质分子量Marker, 泳道1：表达后的突变子初酶；泳道2：突变子初酶热处理10min上清，泳道3：突变子初酶热处理20min上清，突变子初酶热处理30min上清，突变子初酶热处理40min上清。
附图2：FDAA衍生D-丙氨酸标样。
附图3：FDAA衍生L-丙氨酸标样。
附图4：FDAA衍生对照反应(不进行热处理的初酶)检测结果。
附图5：FDAA衍生突变子粗酶70℃热处理10 min后催化反应检测结果。
附图6：FDAA衍生突变子粗酶70℃热处理20 min后催化反应检测结果。
附图7：FDAA衍生突变子粗酶70℃热处理30 min后催化反应检测结果。
附图8：FDAA衍生突变子粗酶70℃热处理40 min后催化反应检测结果。
附图9：StDapdh R35E/R36V/Y76V 突变体粗酶热处理时间和催化产物ee值对应关系。
具体实施方式
以下通过具体的实施例来进一步说明本发明内容，但是这些实施例不构成对本发明的限制。下列实例中所用材料除特别说明外，所用化学药品、试剂均购自Sigma公司。DNA和蛋白质Marker均购自Fermentas公司，蛋白纯化Ni-NTA填料购自GE。Quick ChangeMutagenesis Kit购自Agilent公司，突变引物按照试剂盒要求进行设计。引物合成、DNA序列测定均由华大基因公司（北京）进行。pET32质粒载体，TOP10、BL21(DE3)高效感受态（Novagen）。液相色谱分析使用Agilent-1200色谱仪，色谱柱为Eclipse XDB-C18柱(4.6 ×150 mm)。
实施例1：突变体的获得
所用StDapdh基因Genbank号为AP006840.1，先将该基因全合成并连接到pET32载体上获得质粒：pET32-StDapdh，并在大肠杆菌BL21（DE3）中对野生型基因进行可溶表达，表达出的蛋白N-端带有6×his tag，以利于后续Ni-NTA纯化。根据需要突变的位点，参照QuickChange Mutagenesis Kit试剂盒使用说明，合成表1中所用PCR突变引物，PCR产物扩增、Dpn1切割及后续核酸回收均按试剂盒使用说明进行。
表1：突变PCR引物
以pET32-StDapdh质粒为模板，使用引物1和2在质粒上引入R35E/R36V双突变，并转化至大肠杆菌TOP10感受态，提取质粒并测序确认获得双突变质粒pET32-StDapdhR35E/R36V。以获得的双突变质粒为模板，使用引物3和4在该突变子上继续引入Y76V突变，获得三突变质粒：pET32-StDapdhR35E/R36V/Y76V，转化入大肠杆菌BL21(DE3)高效感受态中，并提取质粒测序确证。
实施例2：突变体酶的表达、热击处理制备
将含有三突变质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)在2 L LB液体培养基中进行培养，37℃培养至OD600约0.8后，向其中加入终浓度0.5 mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，诱导温度为30℃，诱导时间为20小时。诱导表达结束后，于5000 rpm离心5分钟收集菌体。取部分菌体样品进行纯化及活力确定，利用缓冲液A（20 mM Tris-Cl pH 8.0，500 mM 氯化钠）重悬并洗涤菌体，高压匀浆破碎，14000 rpm离心30分钟去除破碎沉淀。由于粗酶中的其他杂酶(L-氨基酸脱氢酶，羰基还原酶等)对产物的ee值、产物纯度都有影响。StDAPDH突变子有较好的热稳定性，通过对粗酶进行热处理，在维持StDAPDH活力的情况下去除对反应有影响的杂酶。在70℃水浴中对上清进行热处理，每隔10 min取一次样100 μL，连续取样40 min。每次取样后均离心取上清，上清一部分进行SDS-PAGE电泳（结果见附图1）。
实施例3：催化反应体系建立，及产物ee值的测定
在1 mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液(100 mM, pH 9.0)中，加入50 mM底物丙酮酸，20 mg甲酸铵，1 mg葡萄糖脱氢酶GDH，1 mM 辅酶NAD+，以及适量突变子酶处理后的上清，调整体系pH值至9.0，以200 rpm转速于30°C进行反应24小时。通过向催化反应体系中加入10µl高氯酸来结束反应或加热终止反应，变性蛋白通过离心去除，取反应液200 μL，加入400μL FDAA衍生试剂，再加入80 μL的1 M的NaHCO3， 40 °C反应1 h后加入40 μL 的2 M的HCl，0.45 μm的膜过滤HPLC分析。
丙氨酸对映体保留时间分别为：tR (D-丙氨酸) = 14.9 min，tR (L-丙氨酸) =7.7 min。不同热处理时间后的上清反应的ee值见附图2、3、4、5、6、7、8，该突变体粗酶热处理时间和催化产物ee值对应关系见附图9。从附图9中我们可以看出：不进行热处理时，破碎上清催化反应产物中有大量L-型产物，随着处理时间延长，L-型产物的量逐步减少，70℃处理20 min时，处理后上清催化反应产物中L-型含量已经很少，D-型产物的ee值已经>95%；而在70℃处理30 min及以上时，处理后上清催化反应产物ee值均>98%。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
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Claims (1)
1.利用来源于嗜热共生杆菌（Symbiobacterium thermophilum）的meso- 二氨基庚二酸脱氢酶突变体作为生物催化剂合成光学纯度>98% D- 丙氨酸的方法，包括：α-酮酸、α-酮酸盐与氨基化合物作为底物与溶剂构成的反应体系；加入生物催化剂和辅酶NAD+循环体系进行催化还原胺化反应，反应温度20~60℃，反应pH 值为6-11，反应时间4~72小时，制得光学纯度>98% D- 氨基酸，其中meso- 二氨基庚二酸脱氢酶突变体是将Genbank 号为AP006840.1对应的氨基酸序列第35 位精氨酸（R）替换为谷氨酸(E) ；将第36 位精氨酸（R）替换为缬氨酸（V）；将第76 位酪氨酸（Y）替换为缬氨酸（V），即R35E/R36V/Y76V。
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