JP2003169674A - Ｌ−リジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来よりもさらに改良された発酵法によるＬ
−リジンの製造法、及びそれに用いる菌株を提供する。 【解決手段】 Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌
にリボースフォスフェートイソメラーゼをコードする遺
伝子を導入し、リボースフォスフェートイソメラーゼ活
性を増強することによって、Ｌ−リジン生産能を向上さ
せる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるＬ−
リジンの製造法に関する。Ｌ−リジンは飼料添加物等と
して広く用いられている。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−リジンは、Ｌ−リジン生産能
を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属
に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産さ
れている。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させ
るために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工
変異株が用いられている。

【０００３】また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−リジン
の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸の
生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例え
ば、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌において、
Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻
害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子
（変異型lysC）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺
伝子（dapB）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子
（dapA）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝
子（lysA）遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子（ddh）（WO96/40934）、lysA及びddh（特
開平9−322774号）、lysC、lysA及びホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）（特開平10-16
5180号）、変異型lysC、dapB、dapA、lysA及びアスパラ
ギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（aspC）（特開
平10-215883号）を導入することにより、同細菌のＬ−
リジン生産能が向上することが知られている。

【０００４】また、エシェリヒア属細菌においては、da
pA、変異型lysC、dapB、ジアミノピメリン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子（ddh）（又はテトラヒドロジピコリン酸
スクシニラーゼ遺伝子（dapD）及びスクシニルジアミノ
ピメリン酸デアシラーゼ遺伝子（dapE））を順次増強す
るとＬ−リジン生産能が向上することが知られている
（WO 95/16042）。尚、WO 95/16042ではテトラヒドロジ
ピコリン酸スクシニラーゼがスクシニルジアミノピメリ
ン酸トランスアミナーゼと誤記されている。

【０００５】しかし、リボースフォスフェートイソメラ
ーゼをコードする遺伝子の構造はコリネ型細菌では報告
されておらず、リボースフォスフェートイソメラーゼを
コードする遺伝子をコリネ型細菌の育種に利用すること
も知られていない。

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来よりも
さらに改良された発酵法によるＬ−リジンの製造法、及
びそれに用いる菌株を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、リボースフォ
スフェートイソメラーゼをコードする遺伝子をコリネ型
細菌に導入し、リボースフォスフェートイソメラーゼ活
性を増幅することにより、Ｌ−リジンの生産量を増大さ
せることができることを見出し、本発明を完成するに至
った。すなわち本発明は、以下のとおりである。

【０００７】（１）細胞中のリボースフォスフェートイ
ソメラーゼ活性が増強され、かつＬ−リジン生産能を有
するコリネ型細菌。 （２）前記リボースフォスフェートイソメラーゼ活性の
増強が、前記細菌細胞内のリボースフォスフェートイソ
メラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めることに
よるものである前記（１）のコリネ型細菌。 （３）前記リボースフォスフェートイソメラーゼをコー
ドする遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である（２）の
コリネ型細菌。 （４）前記（１）〜（３）のいずれかのコリネ型細菌を
培地に培養し、該培養物中にＬ−リジンを生成蓄積せし
め、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とす
るＬ−リジンの製造法。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００９】＜１＞本発明のコリネ型細菌 本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−リジン生産能を有し、細
胞中のリボースフォスフェートイソメラーゼ活性が増強
されたコリネ型細菌である。

【００１０】本発明でいうコリネ型細菌としては、バー
ジーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群
の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子
形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌と
して統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacterio
l., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非
常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリ
ウム属細菌を含む。Ｌ−リジンの製造に好適に用いられ
るコリネ型細菌の菌株としては、例えば以下に示すもの
が挙げられる。

【００１１】 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 （ブレビバクテリウム・ディバリカタム） ATCC14020 （ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869 (コリネバクテリウム・リリウム） ATCC15990 （ブレビバクテリウム・フラバム） ATCC14067 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)

【００１２】これらを入手するには、例えばアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection、住所 12301 Parklawn Drive, Roc
kville, Maryland 20852, United States of America）
より分譲を受けることができる。すなわち、各微生物ご
とに対応する登録番号が付与されており、この登録番号
を引用して分譲を受けることができる。各微生物に対応
する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションのカタログに記載されている。また、AJ12340
株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）にブダペスト条約に基づいて寄託されている。

【００１３】また、上記菌株以外にも、これらの菌株か
ら誘導されたＬ−リジン生産能を有する変異株等も、本
発明に利用できる。この様な人工変異株としては次の様
なものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン
（以下、「AEC」と略記する）耐性変異株（例えば、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRR
L B-11470）、特公昭56-1914号、特公昭56-1915号、特
公昭57-14157号、特公昭57-14158号、特公昭57-30474
号、特公昭58-10075号、特公昭59-4993号、特公昭61-35
840号、特公昭62-24074号、特公昭62-36673号、特公平5
-11958号、特公平7-112437号、特公平7-112438号参
照）、その成長にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要と
する変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、A
ECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、
Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラ
ニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国
特許第3708395号及び第3825472号）、ＤＬ−α−アミノ
−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタ
ム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイ
ド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生
産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラー
ゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生
産変異株（特開昭50-53588号、特開昭50-31093号、特開
昭52-102498号、特開昭53-9394号、特開昭53-86089号、
特開昭55-9783号、特開昭55-9759号、特開昭56-32995
号、特開昭56-39778号、特公昭53-43591号、特公昭53-1
833号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジ
ン生産変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、
フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受
性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号、特
開昭53-86090号）、エチレングリコールに耐性を示し、
Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリ
ネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997
号）。

【００１４】 ＜２＞リボースフォスフェートイソメラーゼ活性の増幅 コリネ型細菌細胞中のリボースフォスフェートイソメラ
ーゼ活性を増幅するには、リボースフォスフェートイソ
メラーゼをコードする遺伝子断片を、該細菌で機能する
ベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結
して組み換えＤＮＡを作製し、これをＬ−リジン生産能
を有するコリネ型細菌に導入して形質転換すればよい。
形質転換株の細胞内のリボースフォスフェートイソメラ
ーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、リ
ボースフォスフェートイソメラーゼ活性が増幅される。
リボースフォスフェートイソメラーゼは、エシェリヒア
・コリではrpi遺伝子にコードされている。

【００１５】リボースフォスフェートイソメラーゼ遺伝
子は、コリネ型細菌の遺伝子を用いることも、エシェリ
ヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用す
ることができる。エシェリヒア・コリのrpi遺伝子の塩
基配列は既に明らかにされている（Sorensen, K. I. et
al., J. Bacteriol., 178(4), 1003-1011 (1996), Gen
bank/EMBL/DDBJ accetion No. X82203）ので、その塩基
配列に基づいて作製したプライマー、例えば配列表配列
番号１及び２に示すプライマーを用いて、エシェリヒア
・コリ染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：po
lymerase chain reaction； White,T.J. et al ;Trends
Genet. 5,185(1989)参照）によって、rpi遺伝子を取得
することができる。コリネ型細菌等の他の微生物のリボ
ースフォスフェートイソメラーゼをコードする遺伝子
も、同様にして取得され得る。

【００１６】染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K. Mi
ura Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。

【００１７】ＰＣＲ法により増幅されたリボースフォス
フェートイソメラーゼをコードする遺伝子は、エシェリ
ヒア・コリ及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自
律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを
調製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておく
と、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞
内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミ
ドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能な
ものが好ましく、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG2
99、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。

【００１８】コリネ型細菌の細胞内において自律複製可
能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報
参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。このようなシャトルベクターとし
ては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクタ
ーを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっ
こ内に示した。

【００１９】リボースフォスフェートイソメラーゼをコ
ードする遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連
結して組み換えＤＮＡを調製するには、リボースフォス
フェートイソメラーゼをコードする遺伝子の末端に合う
ような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通であ
る。

【００２０】上記のように調製した組み換えＤＮＡをコ
リネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている
形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア
・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容
菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増
す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53,159
(1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告
されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセ
ルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wil
son,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）があ
る。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵
母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞
を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまた
はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ
受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Mole
c. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.
M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,
A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。本発明の実施例
で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−
２０７７９１号公報参照）である。

【００２１】リボースフォスフェートイソメラーゼをコ
ードする活性の増幅は、リボースフォスフェートイソメ
ラーゼをコードする遺伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上
に多コピー存在させることによっても達成できる。コリ
ネ型細菌に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にリボースフ
ォスフェートイソメラーゼをコードする遺伝子を多コピ
ーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する
配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体Ｄ
ＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブ
ＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・
リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９
８５号公報に開示されているように、リボースフォスフ
ェートイソメラーゼをコードする遺伝子をトランスポゾ
ンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピ
ー導入することも可能である。いずれの方法によっても
形質転換株内のリボースフォスフェートイソメラーゼを
コードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、リボース
フォスフェートイソメラーゼ活性が増幅される。

【００２２】リボースフォスフェートイソメラーゼ活性
の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮ
Ａ上又はプラスミド上のリボースフォスフェートイソメ
ラーゼをコードする遺伝子のプロモーター等の発現調節
配列を強力なものに置換することによっても達成される
（特開平１−２１５２８０号公報参照）。たとえば、ｌ
ａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモ
ーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰ_Rプ
ロモーター、Ｐ_Lプロモーター等が強力なプロモーター
として知られている。これらのプロモーターへの置換に
より、リボースフォスフェートイソメラーゼをコードす
る遺伝子の発現が強化されることによってリボースフォ
スフェートイソメラーゼ活性が増幅される。

【００２３】また、本発明のコリネ型細菌は、リボース
フォスフェートイソメラーゼ活性に加えて、他のＬ−リ
ジン生合成経路又は解糖系等の酵素遺伝子を強化するこ
とによって、それらの酵素活性が増強されてもよい。そ
のような遺伝子の例としては、Ｌ−リジン及びＬ−スレ
オニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質的に解
除されたアスパルトキナーゼαサブユニット蛋白質又は
βサブユニット蛋白質をコードする遺伝子（WO94/25605
国際公開パンフレット）、コリネホルム細菌由来の野生
型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
（特開昭60-87788号公報）、コリネホルム細菌由来の野
生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子
（特公平6-55149号公報）等が知られている。

【００２４】また、Ｌ−リジン生合成経路から分岐して
Ｌ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素
の活性が低下または欠損していてもよい。そのような酵
素として、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（WO 95/
23864参照）。

【００２５】＜３＞Ｌ−リジンの生産 リボースフォスフェートイソメラーゼ活性が増幅され、
かつ、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌を好適な
培地で培養すれば、Ｌ−リジンが培地に蓄積する。

【００２６】本発明の微生物を用いてＬ−リジンを製造
するのに用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及
び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の
培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、廃糖
蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノールやイノ
シトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエ
ン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。

【００２７】窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモ
ニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、
コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有
機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いること
が できる。

【００２８】無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ₁など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。

【００２９】培養は、振とう培養、通気撹拌培養等によ
る好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培
養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御
する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるい
はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用するこ
とができる。

【００３０】発酵液からのＬ−リジンの採取は、通常イ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わ
せることにより実施できる。

【００３１】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００３２】＜１＞エシェリヒア・コリJM109株のrpi遺
伝子のクローニング エシェリヒア・コリのrpi遺伝子の塩基配列は既に明ら
かにされている（Sorensen, K. I. et al., J. Bacteri
ol., 178(4), 1003-1011 (1996), Genbank/EMBL/DDBJ a
ccetion No. X82203 ）。報告されている塩基配列に基づいて配列表配列番号
１及び２に示すプライマーを合成し、エシェリヒア・コ
リJM109株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を増幅した。

【００３３】合成したプライマーの内、配列番号１は、
Genbank/EMBL/DDBJ accetion No. X82203に記載されて
いるrpi遺伝子の塩基配列の１番目から２４番目の塩基
に至る配列に相当し、配列番号２は、２３１２番目から
２２８９番目の塩基に至る配列に相当する。

【００３４】エシェリヒア・コリJM109株の染色体ＤＮ
Ａの調製は常法によった（生物工学実験書、日本生物工
学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）。また、
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ法最前線（関谷剛男ほか編、共立
出版社、１９８９年）１８５頁に記載されている標準反
応条件を用いた。

【００３５】生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、
SmaIで切断したプラスミドｐＨＣ４と、ライゲーション
キット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒ
ア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を用
いて形質転換を行い、クロラムフェニコール３０μg/ml
を含むＬ培地（バクトトリプトン10g/L、バクトイース
トエキストラクト 5g/L、NaCl 5g/L、寒天15g/L、pH7.
2）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを
釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。取得
した形質転換体よりプラスミドを抽出し、ベクターに
rpi遺伝子が結合したプラスミドｐＨＣ４ｐｐｓを得
た。

【００３６】ｐＨＣ４を保持するエシェリヒア・コリ
は、プライベートナンバーAJ12617と命名され、１９９
１年４月２４日に、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１２２１
５として寄託され、１９９１年８月２６日に、ブタペス
ト条約に基く国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−３５３２が付与されている。

【００３７】次に、クローニングされたＤＮＡ断片がリ
ボースフォスフェートイソメラーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードしていることを確認するため、ＪＭ１０９
株及び、ｐＨＣ４ｒｐｉを保持するＪＭ１０９株のリボ
ースフォスフェートイソメラーゼ活性をRack, E. et a
l., Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.G.
ed.) pp.186-187, Academic Press (1965)に記載の方
法により測定した。その結果、ｐＨＣ４ｒｐｉを保持す
るＪＭ１０９株は、ｐＨＣ４ｒｐｉを保持しないＪＭ１
０９株の約１８倍のリボースフォスフェートイソメラー
ゼ活性を示すことから、rpi遺伝子が発現していること
を確認した。

【００３８】＜３＞コリネ型細菌のＬ−リジン生産株へ
のpHC4rpiの導入とＬ−リジン生産ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムAJ11082を電気パルス法（特開
平2-207791号公報参照）によりプラスミドpHC4rpiで形
質転換し、得られた形質転換株を得た。得られた形質転
換株AJ11082/pHC4rpiを用いてＬ−リジン生産のための
培養を以下のように行った。5μg/mlのクロラムフェニ
コールを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ
11082/pHC4rpi株の菌体を、5μg/mlのクロラムフェニコ
ールを含む下記組成のＬ−リジン生産培地に接種し、3
1.5℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養し
た。コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ11
082株に、既に取得されているコリネバクテリウム属細
菌で自律複製可能なプラスミドpHC4を電気パルス法によ
り形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。

【００３９】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムAJ11082は、1979年６月18日にアグリカルチュラル・
リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Agri
cultural Research Service Culture Collection）に国
際寄託され、受託番号NRRL B-11470が付与されている。

【００４０】〔Ｌ−リジン生産培地〕炭酸カルシウム以
外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製
し、115℃で15分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カ
ルシウムを50ｇ加える。 グルコース 100 g （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ 55 g ＫＨ₂ＰＯ₄ 1 g ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 1 g ビオチン 500 μg チアミン 2000 μg ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.01 g ＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.01 g ニコチンアミド 5 mg 蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml 炭酸カルシウム 50 g

【００４１】培養終了後、培養液中のＬ−リジン蓄積量
を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１
０により測定した。このときの結果を表１に示した。

【００４２】

【表１】

【００４３】表１の結果から、リボースフォスフェート
イソメラーゼ活性を増強することにより、Ｌ−リジン生
産能が向上したことがわかる。リボースフォスフェート
イソメラーゼはペントースリン酸サイクルの酵素であ
る。一方、Ｌ−リジンの生合成にはＮＡＤＰＨが必要で
あり、Ｌ−リジンの生成に伴ってＮＡＤＰ⁺が生成す
る。したがって、リボースフォスフェートイソメラーゼ
活性を増強することによって、ペントースリン酸サイク
ルが進行し、生成するＮＡＤＰＨによってＬ−リジン生
合成反応が円滑に進行するものと考えられる。

【００４４】

【発明の効果】本発明により、コリネ型細菌のＬ−リジ
ンの生産能を向上させることができる。

【００４５】

【配列表】 Sequence Listing

【００４６】 <110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.) <120> Ｌ−リジンの製造法 <130> P-6639 <141> 1999-07-02 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００４７】 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Esherichia coli rpi gene <400> 1 aagcttccac attgcgccag cttt 24

【００４８】 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Esherichia coli rpi gene <400> 2 aatattgcca atggtgtcgt cgat 24

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 倉橋 修 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA72 CA03 DA10 EA04 GA11 4B050 CC03 DD02 LL02 4B064 AE25 CA02 CA19 CC24 DA10 4B065 AA22X AA24X AA26Y AB01 AC14 BA02 CA17 CA41

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞中のリボースフォスフェートイソメ
   ラーゼ活性が増強され、かつＬ−リジン生産能を有する
   コリネ型細菌。
2. 【請求項２】 前記リボースフォスフェートイソメラー
   ゼ活性の増強が、前記細菌細胞内のリボースフォスフェ
   ートイソメラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高め
   ることによるものである請求項１記載のコリネ型細菌。
3. 【請求項３】 前記リボースフォスフェートイソメラー
   ゼをコードする遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である
   請求項２記載のコリネ型細菌。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項に記載のコ
   リネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−リジンを
   生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取するこ
   とを特徴とするＬ−リジンの製造法。