SK285013B6 - Rekombinantná DNA, autonómne replikovateľná v bunkách koryneformných baktérií, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu - Google Patents

Abstract

Schopnosť produkovať L-lyzín a rýchlosť produkcie L-lyzínu sú zlepšené v koryneformných baktériách kotviacich aspartokinázu, v ktorej bola v podstate znecitlivená spätná inhibícia spôsobovaná L-lyzínom a L-treonínom, a obsahujúcich zosilnenú DNA kódujúcu dihydrodipikolinát reduktázu, DNA kódujúcu dihydrodipikolinát syntázu, DNA kódujúcu diaminopimelát dekarboxylázu a DNA kódujúcu diaminopimelát dehydrogenázu.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu výroby L-Iyzínu kultiváciou mikroorganizmu, získaného modifikáciou koryneformnej baktérie, používanej na výrobu aminokyseliny a podobných látok fermentáciou. Modifikácia sa vykoná technikou, založenou na genetickom inžinierstve.

Doterajší stav techniky

L-lyzín sa využíva ako prídavná látka do krmív a zvyčajne sa vyrába fermentačným spôsobom s použitím L-lyzín-produkujúceho mutantného kmeňa, patriaceho ku koryneformným baktériám. V súčasnosti známe rôzne baktérie, produkujúce L-lyzín sú také, ktoré boli vytvorené umelou mutáciou, pričom sa vychádza z divokých typov kmeňov, patriacich ku koryneformným baktériám.

Čo sa týka koryneformných baktérií, je zverejnený vektorový plazmid, ktorý je autonómne replikovateľný v bakteriálnych bunkách, ktorý má liečivám odolný signálny gén (marker) (pozri patent USA číslo 4 514 502), ako aj spôsob na vloženie génu do buniek baktérií (napríklad zverejnený japonský patent číslo 2-207 791). Zverejnená je tiež možnosť množenia baktérií, produkujúcich L-treonín alebo L-leucín, použitím uvedených techník (pozri patenty USA čísla 4 452 890 a 4 442 208). Na množenie baktérií produkujúcich L-lyzín je známa technika, pri ktorej sa vloží gén zúčastňujúci sa na biosyntéze L-lyzínu do vektorového plazmidu a amplifikuje sa v bakteriálnych bunkách (napríklad zverejnený japonský patent číslo 56-160 997).

Známe gény na biosyntézu L-lyzínu zahŕňajú napríklad dihydro-dipikolinátový reduktázový gén (japonský zverejnený patent č. 7-75 578) a diatninopimelátový dehydrogenázový gén (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res. 15, 3917 (1987)), v ktorých gén, ktorý sa podieľa na biosyntéze L-lyzínu, je klonovaný, ako aj fosfoenolpyruvátový karboxylázový gén (japonský zverejnený patent číslo 60-87 788), dihydrodipikolinátový syntázový gén (japonská patentová publikácia číslo 6-55 149) a diamino-pimelátový dekarboxylázový gén (japonský zverejnený patent číslo 60-62 994), v ktorých sa amplifikáciou génu ovplyvňuje produktivitu tvorby L-lyzínu.

Pokiaľ sa týka enzýmov, zúčastňujúcich sa na biosyntéze L-lyzínu, je známy prípad enzýmu, ktorý - ak sa použije ako divoký typ - podlieha spätnej inhibícii účinkom vznikajúceho L-lyzínu. V takom prípade sa produktivita tvorby L-lyzínu zlepší zavedením takého génu do enzýmu, ktorý má mutáciu, ktorou sa spätná väzba znecitlivie. Známe gény tohto typu napríklad zahŕňajú najmä aspartokinázový gén (medzinárodný patent WO94/24 605).

Ako už bolo spomenuté, niektoré úspešné výsledky sa dosahujú pomocou amplifikácie génov v systéme L-lyzínovej biosyntézy alebo vložením mutantných génov. Napríklad, významné množstva L-lyzínu (okolo 25 g/liter) produkuje koryneformná baktéria, ktorá kotví mutantný asparto-kinázový gén so znecitlivenou inhibíciou lyzínom a treonínom. Táto baktéria však trpí spomaľovaním rýchlosti rastu v porovnaní s baktériou, ktorá nekotvi nijaký mutantný aspartokinázový gén. Uvádza sa tiež, že produktivita tvorby L-lyzínu sa zlepší, ak sa k mutantnému aspartokinázovému génu navyše ďalej vloží dihydrodipikolinátový syntázový gén (Applied and Enviromental Microbiology 57 (6), 1746 až 1752 (1991)). Ale aj táto baktéria podlieha spomaľovaniu rýchlosti rastu.

Čo sa týka dihydrodipikolinátového reduktázového génu sa ukázalo, že účinnosť dihydrodipikolinátovej reduktázy sa zvyšuje v koryneformnej baktérii, do ktorej bol vlo žený uvedený gén, ale zdroj pritom neuvádza nijaký údaj o vplyve na produktivity tvorby L-lyzínu (japonský zverejnený patent číslo 7-75 578).

V súčasnosti nie je známy nijaký prípad koryneformných baktérií, v ktorých by niekto úspešne dosiahol významné zvýšenie výťažkov L-lyzínu kombináciou viacerých génov biosyntézy L-lyzínu bez obmedzovania rastu uvedených baktérií, Rovnako nebol doteraz zverejnený prípad, v ktorom by sa zámerne zvyšoval rast zosilnením génu biosyntézy L-lyzínu.

Podstata vynálezu

Podstatou tohto vynálezu je zlepšenie schopnosti produkcie L-lyzinu a rýchlosti rastu koryneformných baktérií použitím genetických materiálov DNA sekvencií, kódujúcich pre aspartokinázu (v ďalšom texte označovaná ako „AK“, a ak je vhodné, označuje sa gén, kódujúci pre AK proteín ako „lysC“), dihydrodipikolinátovú reduktázu (v ďalšom texte označovanú ako „DDPR“ a ak je vhodné, označuje sa gén, kódujúci pre DDPR proteín ako „dapB“), dihydrodipikolinátovú syntázu (v ďalšom texte označovanú ako „DDPS“ a ak je vhodné, označuje sa gén, kódujúci pre DDPS proteín ako „dapA“), diaminopimelátovú dekarboxylázu (v ďalšom texte označovanú ako „DDC“ a ak je vhodné, označuje sa gén, kódujúci pre DDC proteín ako „lysA“). a diaminopimelátovú dehydrogenázu (v ďalšom texte označovanú ako „DDH“ a ak je vhodné, označuje sa gén, kódujúci pre DDH proteín ako „ddh“) čo sú dôležité enzýmy pre biosyntézu L-lyzínu v bunkách koryneformných baktérií.

Keď sa predmetná látka produkuje fermentáciou použitím mikroorganizmu, je mimoriadne dôležitým činiteľom produkčná rýchlosť, ako aj výťažnosť predmetnej látky vo vzťahu k vstupujúcemu materiálu. Zvýšením produkčnej rýchlosti na jednotku fermentačného zariadenia môže sa predmetná látka vyrábať s významne nižšími nákladmi. Podľa toho je v priemysle mimoriadne dôležité, aby výťažnosť fermentácie a produkčná rýchlosť pri fermentácii boli vzájomne zosúladené. Tento vynález navrhuje riešenie tohto uvedeného problému výroby L-lyzínu fermentáciou s použitím koryneformných baktérií.

Podstatou tohto vynálezu je skutočnosť, že sa rast koryneformných baktérií môže zvýšiť a produkčná rýchlosť L-lyzínu sa môže zväčšiť zosilnením kombináciou dapB s mutantným lysC (v ďalšom texte tam, kde je to vhodné, je zjednodušene označovaný ako „mutantný lysC“) kódujúci pre mutantnú AK (v ďalšom texte tam, kde je to vhodné sa zjednodušenie označuje ako „mutantný typ AK“), v ktorej je znecitlivená spätná inhibícia lyzínom a treonínom v porovnaní s prípadom, v ktorom je zosilnený iba samotný lysC; produkčná rýchlosť L-lyzinu sa ďalej môže zvýšiť postupným zosilňovaním dapA, lysA a ddh.

Tento vynález sa menovite zakladá na rekombinantnej DNA, autonómne replikovateľnej v bunkách koryneformných baktérií, zahŕňajúcej sekvenciu DNA, kódujúcu pre aspartokinázu, ktorej spätná inhibícia L-lyzínom a L-treonínom bola v podstate znecitlivená a na sekvencií DNA, kódujúcej pre dihydrodipikolinátovú reduktázu.

Tento vynález poskytuje rekombinantnú DNA ďalej obsahujúcu sekvenciu DNA, kódujúcu navyše k uvedeným sekvenciám DNA ešte pre dihydrodipikolinátovú syntázu. Tento vynález poskytuje rekombinantnú DNA ďalej zahŕňajúcu sekvenciu DNA, kódujúcu navyše k uvedeným trom sekvenciám DNA ešte pre diaminopimelátovú dekarboxylázu. Tento vynález poskytuje rekombinantnú DNA, ďalej zahŕňajúcu sekvenciu DNA, kódujúcu navyše k uvedeným štyrom sekvenciám DNA ešte pre diaminopimelátovú dehydrogenázu.

Z iného hľadiska poskytuje tento vynález koryneformnú baktériu, kotviacu aspartokinázu, v ktorej je spätná inhibícia L-lyzínom a L-treoninom v podstate znecitlivená a obsahujúcu zosilnenú DNA, kódujúcu pre dihydro-dipikolinátovú reduktázu. Tento vynález poskytuje koryneformnú baktériu, zahŕňajúcu ďalej posilnenú DNA, kódujúcu pre dihydrodipikolinátovú syntázu v uvedenej koryneformnej baktérii. Tento vynález poskytuje koryneformnú baktériu, zahŕňajúcu ďalej zosilnenú DNA, kódujúcu navyše k uvedeným trom DNA aj pre diaminopimelátovú dekarboxylázu v uvedenej koryneformnej baktérii. Tento vynález poskytuje koryneformnú baktériu, ďalej zahŕňajúcu zosilnenú DNA, kódujúcu navyše k uvedeným štyrom DNA aj pre diaminopimelátovú dehydrogenázu v uvedenej koryneformnej baktérii.

Z ďalšieho hľadiska poskytuje tento vynález spôsob prípravy L-lyzínu, zahŕňajúce kroky: kultiváciu ktorýchkoľvek z opísaných koryneformných baktérií vo vhodnom kultivačnom prostredí, produkciu a akumuláciu L-lyzínu v kultúre baktérií, a oddelenie L-lyzínu z kultúry.

V tomto vynáleze uvádzané koryneformné baktérie znamenajú skupinu mikroorganizmov, ako je určená v Bergey‘s Manual of Determinative Bacteriology, 8. vydanie, strana 599 (1974), ktoré sú aeróbne Gram-pozitívne tyčinky, ktoré nemajú odolnosť proti kyseline a nemajú schopnosť vytvárať spóry. Koryneformné baktérie zahŕňajú baktérie, ktoré patria k rodu Corynebacterium, baktérie, ktoré patria k rodu Brevibacterium, ktoré boli doteraz zatriedené do rodu Brevibacterium, ale jednotne sa v súčasnosti považujú za baktérie patriace do rodu Corynebacterium, a baktérie, patriace do rodu Brevibacterium, veľmi príbuzné baktériám, patriacim do rodu Corynebacterium.

Vynález sa podrobne opisuje v ďalšom texte.

L Príprava génov na biosyntézu L-lyzínu, použitých v tomto vynáleze

Gény na biosyntézu L-lyzínu, ktoré sa používajú v tomto vynáleze, sa získajú prípravou chromozomálnej DNA z baktérií ako donora DNA, vybudovaním chromozomálnej DNA knižnice použitím plazmidového vektora alebo podobne, výberom kmeňa, kotviaceho vyžadovaný gén, získaním rekombinantnej DNA (do ktorej je vložený uvedený gén) z vyselektovaného kmeňa. Donor DNA génu na biosyntézu L-lyzínu, použitý v tomto vynáleze sa výslovne nevymedzuje za predpokladu, že vyžadovaný gén na biosyntézu L-lyzínu exprimuje enzýmový proteín, ktorý pôsobí v bunkách koryneformných baktérií.

Sekvencie všetkých z uvedených génov lysC. dapA a dapB, vznikajúce v koryneformných baktériách sú známe. Môžu sa získať vykonaním amplifikácie spôsobom polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR; pozri White, T. J. et al., Trends Genet. 5,185 (1989)).

Každý z génov na biosyntézu L-lyzínu, použitý v tomto vynáleze sa môže získať tiež špecifickým postupom, ako sa napríklad uvádza nižšie.

(1) Príprava mutantného lysC

Fragment DNA, obsahujúci mutantný lysC sa môže pripraviť z mutantného kmeňa, v ktorom je v podstate znecitlivená synergická spätná inhibícia aktivity AK L-lyzínom a L-treoninom (medzinárodný patent WO 94/25 605). Mutantný kmeň sa môže napríklad získať zo skupiny buniek, vznikajúcich z divokého typu kmeňa koryneformných baktérií, podrobených mutačným faktorom, použitím bež ných mutačných účinkov ožiarenia ultrafialovým žiarením a vplyvu mutačného činidla, ako je N-metyl-N'-nitro-N-nitrózoguanidin. Aktivita AK sa môže merať spôsobom, ktorý opisuje Miyajima, R. et al. v The Journal of Biochcmistry 63 (2), 139 až 148 (1968). Predstaviteľom najvýhodnejšieho samotného mutantného kmeňa produkujúceho L-lyzin je baktéria AJ3445 (FERM - 1944), odvodená mutačným účinkom z divokého kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 (ktorý má v súčasnosti zmenený názov na Corynebacterium glutamicum).

Mutantný lysC sa voliteľne môže získať mutačným účinkom in vitro na plazmid DNA, obsahujúci divoký typ lysC. Z iného hľadiska je známa informácia o mutácii, ktorá znecitlivuje synergickú spätnú inhibíciu aktivity AK, spôsobovanú L-lyzínom a L-treonínom (medzinárodný patent WO 94/25 605). Podľa uvedenej informácie sa mutantný lysC môže pripraviť tiež z divokého typu lysC napríklad miestne cieleným spôsobom mutagenézy.

Fragment, obsahujúci lysC, sa môže z koryneformných baktérií izolovať prípravou chromozomálnej DNA, napríklad spôsobom, ktorý opísal Saito a Miura (H. Saito a K. Miura, Biochcm. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)), a amplifikáciou lysC pomocou spôsobu polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR; pozri White, T. J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)).

Ako príklady DNA primerov možno uviesť jednovláknové DNA 23- a 21- méry, ktoré majú nukleotidové sekvencie uvedené pod označením SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 2 v priloženom zozname sekvencií, ktoré sa amplifikujú napríklad v oblasti okolo 1 643 bp, kódujúcej pre lysC, založenej na sekvencií, ktorá je známa pre Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Microbiology 5 (5), 1197 až 1204 (1991); Mol. Gen. Genet. 224, 317 až 324 (1990)). DNA sa môže syntetizovať bežným spôsobom použitím syntetizátora DNA, modelu 38OB, vyrábaného firmou Applied Biosystems s použitím spôsobu s fosfoamiditínom (pozri Tetrahedron Letters 22, 1589 (1981)). PCR sa môže vykonať použitím zariadenia s DNA Thermal Cycler, Model PJ 2 000, vyrábaný firmou Takara Shuzo, a použitím Taq DNA polymerázy v zhode s postupom, uvádzaným dodávateľom.

Je výhodné, ak lysC, amplifikovaný PCR je na prípravu rekombinantnej DNA ligovaný vektorovou DNA, autonómne replikovateľnou v bunkách E. coli a/alebo v bunkách koryneformných baktérií a rekombinantná DNA sa vopred vloží do buniek E. coli. Táto úprava uľahčuje ďalšie operácie. Autonómne replikovateľným vektorom v bunkách E. coli je výhodne plazmidový vektor, ktorý je výhodne autonómne replikovateľný v hostiteľských bunkách vrátane, napríklad, vektorov pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG396 a RSF1010.

Ak sa do týchto vektorov vloží DNA fragment, ktorý má schopnosť umožniť plazmidu, aby sa autonómne replikoval v koryneformných baktériách, potom sa vektory môžu použiť ako takzvané kyvadlové vektory, autonómne replikovateľné aj v E. coli aj v koryneformných baktériách. Také kyvadlové vektory zahŕňajú ďalej uvedené vektory. V zátvorkách sa súčasne uvádzajú mikroorganizmy, kotviace každý z uvedených vektorov a čísla, pod ktorými sú mikroorganizmy uložené v medzinárodných zbierkach.

pHC4: Escherichia coli A J12 617 (FERM BP-3 532) pAJ655: Escherichia coli AJ11 882 (FERM BP-136) Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATTC 39 135) pAJ1844: Escherichia coli AJ11 883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATTC 39 136) pAJ611: Escherichia coli AJ11 884 (FERM BP-138)

SK 285013 Β6 pAJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATTC39 137) pAJ440: Bacillus subtillis AJ11901 (FERM - BP 140).

Tieto vektory možno získať z uložených mikroorganizmov tak, ako sa uvádza ďalej. Bunky oddelené vo fáze logaritmického rastu sa podrobili lýze s použitím lyzozýmu a SDS, následnou separáciou z lyzátu odstredením pri 30 000 x g sa získa supematant, ku ktorému sa pridá polyetylénglykol. Nasleduje frakcionácia a čistenie pomocou odstreďovania v rovnovážnom gradiente hustoty roztoku chloridu cézneho a etídiumbromidu.

E. coli sa môžu transformovať vložením plazmidu napríklad spôsobom opísaným D. M. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) alebo spôsobom, kde sa prijímajúce bunky preparujú chloridom vápenatým na zvýšenie priepustnosti pre DNA (Mandel, M. a Higa, A., J. Mol. Biol. 53, 159(1970)).

Divoký typ lysC sa získa izoláciou lysC z AK divokého typu kmeňa, zatiaľ čo mutantný lysC sa získa izoláciou lysC z AK mutatného kmeňa postupom, ktorý už bol opísaný skôr.

Príklad nukleotidovej sekvencie DNA fragmentu, obsahujúcom divoký typ lysC je uvedený v SEQ ID No: 3 v priloženom zozname sekvencií. Aminokyselinová sekvencia α-podjednotky divokého typu AK proteínu je odvodená zo sekvencie nukleotidov, a je spolu so sekvenciou DNA uvedená v SEQ ID No: 4 v priloženom zozname sekvencií. Samotná aminokyselinová sekvencia je uvedená v SEQ ID No: 5. Aminokyselinová sekvencia β-podjednotky divokého typu AK proteínu je odvodená z nukleotidovej sekvencie DNA, aje spolu s DNA znázornená v SEQ ID No: 6 priloženého zoznamu sekvencií. Samotná aminokyselinová sekvencia sa uvádza v SEQ ID No: 7. V každej z týchto podjednotiek sa ako iniciačný kodón použije GTC a príslušnú aminokyselinu predstavuje metionín. Príslušné aminokyseliny zahŕňajú však metionín, valín alebo formylmetionín.

Mutantný lysC, použitý podľa v tomto vynáleze nie je osobitne vymedzený za predpokladu, že kóduje pre AK, v ktorej je znecitlivená synergická spätná inhibícia L-lyzínom a L-treoninom. Mutantným lysC môže byť napríklad lysC, ktorý má mutáciu v aminokyselinovej sekvencii divokého typu AK, v ktorom 279. alanínový zvyšok (pri počítaní od N-terminálu) je zmenený na iný aminokyselinový zvyšok, ako alanínový a iný, ako je kyslá aminokyselina v a-podjednotke, a 30. alanínový zvyšok je zmenený na iný aminokyselinový zvyšok, ako je alanínový a iný, ako je kyslá aminokyselina v β-podjednotke. Aminokyselinová sekvencia divokého typu AK výslovne zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú ako SEQ ID No: 5 v priloženom zozname sekvencií ako α-podjednotku, a aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú ako SEQ ID No: 7 v priloženom zozname sekvencií ako β-podjednotku.

Výhodné sú zvyšky aminokyselín, iné ako alanin a iné ako kyslá aminokyselina, zahŕňajúce treonínový, arginínový, cysteínový, fenyl-alanínový, prolínový, serínový, tyrozinový a valínový zvyšok.

Typ príslušného kodónu, zodpovedajúci substituovanému amino-kyselinovému zvyšku nie je výslovne vymedzený za predpokladu, že kóduje pre uvedený aminokyselinový zvyšok. Predpokladá sa, že sekvencia amino-kyselín použitého divokého typu AK sa môže mierne odlišovať v závislosti od rozdielov medzi jednotlivými bakteriálnymi druhmi a medzi bakteriálnymi kmeňmi. Podľa tohto vynálezu možno použiť tiež aspartokinázy, ktoré majú mutáciu založenú napríklad na substitúcii, delécii alebo inzercii jedného alebo viacerých zvyškov aminokyselín na jednom a lebo viacerých miestach, irevelantných vzhľadom na uvedenú enzýmovú aktivitu. Ďalšie aspartokinázy, ktoré majú mutáciu založenú napríklad na substitúcii, delécii alebo inzercii jedného alebo viacerých zvyškov aminokyselín možno tiež využiť za predpokladu, že nemajú žiaden vplyv na aspartokinázovú aktivitu a na znecitlivenie synergickej spätnej inhibície L-lyzínom a L-treonínom.

Kmeň AJ 12 691, získaný vložením mutantného lysC plazmidu p399AK9B do kmeňa AJ12 036 (FERM BP -

- 734) ako divokého kmeňa Brevibacterium lactofermentum je uložený od 10. apríla 1992 pod úložným číslom FERM P

- 12 918 v Národnom ústave pre biologické vedy a humánne technológie Agentúry priemyselných vied a technológií Ministerstva zahraničného obchodu a priemyslu (National Inštitúte of Bioscience and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry, poštový kód 305, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko), a bol 10. februára 1995 prenesený na medzinárodné uloženie podľa Budapeštianskej dohody pod úložným číslom FERM BP-4 999.

(2) Príprava dapB

Pomocou PCR sa z chromozómu koryneformnej baktérie môže pripraviť fragment DNA, obsahujúci dapB. Donor DNA nie je vyslovene vymedzený, ale jeho predstaviteľom môže byť napríklad Brevibacterium lactofermentum kmeň ATCC 13 869.

Pri Brevibacterium lactofermentum jc známa sekvencia DNA, kódujúca pre DDPR (Joumal of Bacteriology, 175 (9), 2743 až 2749 (1993)). Na tomto základe sa môžu pripraviť primery pre PCR. Príkladmi takých DNA primerov sú príslušné 23-mcry, ktoré majú nukleotidové sekvencie uvedené v SEQ ID No: 8 a v SEQ ID No: 9 v priloženom zozname sekvencií. Syntéza DNA, PCR a príprava plazmidu obsahujúceho získaný dapB sa môže vykonať rovnakým spôsobom, ako sa uvádza pre lysC.

Sekvencia nukleotidov DNA fragmentu obsahujúceho dapB a sekvencia aminokyselín odvodená od uvedenej nukleotidovej sekvencie sa uvádzajú v SEQ ID No: 10. Samotná aminokyselinová sekvencia sa uvádza v SEQ ID No: 11. V tomto vynáleze sa popri DNA fragmentoch kódujúcich pre túto aminokyselinovú sekvenciu sa môžu rovnocenne použiť DNA fragmenty, kódujúce pre aminokyselinové sekvencie v podstate rovnaké, ako je aminokyselinová sekvencia uvádzaná v SEQ ID No: 11, najmä aminokyselinové sekvencie, ktoré majú mutáciu založenú napríklad na substitúcii, delécii alebo inzercii jednej alebo viacerých aminokyselín za predpokladu, že sa v podstate nijako neovplyvňuje DDPR aktivita.

Vložením plazmidu pCRDAPB, obsahujúceho dapB, získanom v ďalej uvedenom príklade, do kmeňa JM109 E coli sa získal sa transformantný kmeň AJ13107, ktorý sa podľa Budapeštianskej dohody medzinárodne uložil od 26. mája 1995 pod úložným číslom FERM BP - 5114 v Národnom ústave pre biologické vedy a humánne technológie Agentúry priemyselných vied a technológií Ministerstva zahraničného obchodu a priemyslu (poštový kód 305, 1 -3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).

(3) Príprava dapA

Z chromozómu koryneformných baktérií sa pomocou PCR môže pripraviť DNA fragment, obsahujúci dapA. Donor DNA nie je vyslovene vymedzený, ale jeho predstaviteľom môže byť napríklad Brevibacterium lactofermentum, kmeň ATCC 13 869.

Pri Corynebacterium glutamicum je známa sekvencia DNA, kódujúca pre DDPS (pozri Nucleic Acids Research, (21), 6421 (1990), EMBL accession No. X53 993). Na tomto základe sa môžu pripraviť priméry pre PCR. Príkladmi takých DNA primerov sú príslušné 23-méry, ktoré majú nukleotidové sekvencie uvedené v SEQ ID No: 12 a SEQ ID No: 13 v priloženom zozname sekvencií. Syntéza DNA, PCR a príprava plazmidu, obsahujúceho získaný dapA sa môže vykonať rovnakým spôsobom, ako sa uvádza pre lysC.

Sekvencia nukleotidov DNA fragmentu obsahujúceho dapA a sekvencia aminokyselín odvodená od uvedenej nukleotidovej sekvencie sa uvádzajú v SEQ ID No: 14. Samotná aminokyselinová sekvencia sa uvádza v SEQ ID No: 15. V tomto vynáleze sa popri DNA fragmentoch, kódujúcich pre túto aminokyselinovú sekvenciu môžu rovnocenne použiť DNA fragmenty, kódujúce pre aminokyselinové sekvencie v podstate rovnaké, ako je aminokyselinová sekvencia uvádzaná v SEQ ID No: 15, najmä aminokyselinové sekvencie, ktoré majú mutáciu založenú napríklad na substitúcii, delécii alebo inzercii jednej alebo viacerých aminokyselín za predpokladu, že sa v podstate nijako neovplyvňuje DDPS aktivita.

Vložením plazmidu pCRDAPB, obsahujúceho dapB, získanom v ďalej uvedenom príklade, do kmeňa JM109 E. coli sa získal transformantný kmeň AJ 13 106, ktorý sa podľa Budapeštianskej dohody medzinárodne uložil od 26. mája 1995 pod úložným číslom FERM BP - 5 113 v Národnom ústave pre biologické vedy a humánne technológie Agentúry priemyselných vied a technológií Ministerstva zahraničného obchodu a priemyslu (poštový kód 305, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).

(4) Príprava lysA

Z chromozómu koryneformných baktérií sa pomocou PCR môže pripraviť DNA fragment, obsahujúci lysA, Donor DNA nie je vyslovene vymedzený, ale jeho predstaviteľom môže byť napríklad Brevibacterium lactofermentum kmeň ATCC 13 869.

V koryneformných baktériách tvorí lysA spolu s argS (arginyl-tRNA syntázový gén) operón a lysA sa nachádza v smere od argS. Exprcsia lysA jc regulovaná promótorom, nachádzajúcim sa proti smeru od argS (pozri Joumal of Bacteriology, Nov., 7356 až 7362 (1993)). DNA sekvencie týchto génov sú pri Corynebacterium glutamicum známe (pozri Molecular Biology 4 (11), 1819 až 1830 (1990); Molecular and Generál Genetics 212, 112 až 119 (1988)). Na tomto základe sa môžu pripraviť priméry pre PCR. Príkladmi takých DNA primerov sú príslušné 23-méry, ktoré majú nukleotidové sekvencie uvedené v SEQ ID No: 16 v priloženom Zozname sekvencií (zodpovedajúce nukleotidovým číslam 11 až 33 v nukleotidovej sekvencií opísanej v Molecular Microbiology 4 (11), 1819 až 1830 (1990) a v SEQ ID No: 17 (zodpovedajúce nukleotidovým číslam 1370 až 1392 v nukleotidovej sekvencií opísanej v Molecular and Generál Genetics 212, 112 až 1 19 (1988)). Syntéza DNA, PCR a príprava plazmidu, obsahujúceho získaný lysA sa môže vykonať rovnakým spôsobom, ako sa uvádza pre lysC.

V ďalej opísanom príklade sa na zosilnenie lysA použil fragment DNA, obsahujúci promótor, argS a lysA. argS však nie je pre tento vynález nevyhnutný. Možno použiť DNA fragment, v ktorom je lysA ligovaný v smere práve od promótora.

Sekvencia nukleotidov DNA fragmentu, obsahujúceho argS a lysA, a sekvencia aminokyselín, odvodená na kódovanie uvedenou nukleotidovou sekvenciou sa uvádza v SEQ ID No: 18. Príklad aminokyselinovej sekvencie, kódovanej s argS, je uvedený ako SEQ ID No: 19 a príklad aminokyselinovej sekvencie, kódovanej lysA, je uvedený ako SEQ ID NO: 20. V tomto vynáleze sa popri DNA fragmentoch kódujúcich pre tieto amino-kyselinové sekvencie môžu rovnocenne použiť DNA fragmenty, kódujúce pre aminokyselinové sekvencie v podstate rovnaké, ako je aminokyselinová sekvencia uvádzaná v SEQ ID No: 20, najmä aminokyselinové sekvencie, ktoré majú mutáciu založenú na príklad na substitúcii, delécii alebo inzercii jednej alebo viacerých aminokyselín za predpokladu, že sa v podstate nijako neovplyvňuje DDC aktivita.

(5) Príprava ddh

Z chromozómu koryneformných baktérií sa pomocou PCR môže pripraviť DNA fragment, obsahujúci ddh. Donor DNA nie je vyslovene vymedzený, ale jeho predstaviteľom môže byť napríklad Brevibacterium lactofermentum kmeň ATCC 13 869.

DNA sekvencie týchto génov sú pri Corynebacterium glutamicum známe (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res. 15, 3917 (1987). Na tomto základe sa môžu pripraviť priméry pre PCR. Príkladmi takým DNA primerov sú príslušné 20-méry, ktoré majú nukleotidové sekvencie uvedené v SEQ ID No: 21 a SEQ ID No: 22 v priloženom zozname sekvencií. Syntéza DNA, PCR a príprava plazmidu obsahujúceho získaný ddh sa môže vykonať rovnakým spôsobom ako sa uvádza pre lysC.

Sekvencia nukleotidov DNA fragmentu, obsahujúceho ddh a lysA, a sekvencia aminokyselín, odvodená z uvedenej nukleotidovej sekvencie, sa uvádza v SEQ ID No: 23. Vlastná aminokyselinová sekvencia sa uvádza v SEQ ID No: 24. V tomto vynáleze sa popri DNA fragmentoch, kódujúcich pre túto aminokyselinovú sekvenciu môžu rovnocenne použiť DNA fragmenty, kódujúce pre aminokyselinové sekvencie v podstate rovnaké, ako je aminokyselinová sekvencia, uvádzaná v SEQ ID No: 24, najmä aminokyselinové sekvencie, ktoré majú mutáciu, založenú napríklad na substitúcii, delécii alebo inzercii jednej alebo viacerých aminokyselín za predpokladu, že sa v podstate nijako neovplyvňuje DDH aktivita.

2. Rekombinantná DNA a koryneformná baktéria podľa tohto vynálezu

Koryneformná baktéria podľa vynálezu kotví aspartokinázu (mutantnú AK), v ktorej je v podstate znecitlivená spätná inhibícia, spôsobovaná L-lyzínom a L-treonínom, pričom je zosilnená DNA (dapB ), kódujúca pre dihydrodipikolinátovú reduktázu. Vo výhodnom uskutočnení je koryneformnou baktériou podľa vynálezu koryneformná baktéria, v ktorej je ďalej zosilnená DNA (dapA), kódujúca pre dihydrodipikolinátovú syntázu. Vo výhodnejšom uskutočnení je koryneformnou baktériou podľa vynálezu koryneformná baktéria, v ktorej je ďalej zosilnená DNA (lysA), kódujúca pre diaminopimelátovú dekarboxylázu. V najvýhodnejšom uskutočnení je koryneformnou baktériou podľa vynálezu koryneformná baktéria, v ktorej je ďalej zosilnená DNA (ddh). kódujúca pre diaminopimelátovú dehydrogenázu.

Výraz „zosilnená“ („enhanced“) sa v tomto texte vzťahuje k skutočnosti, že sa zvýši vnútrobunková aktivita enzýmu, kódovaného uvedenou DNA, napríklad zvýšením počtu kópií génu, použitím silného promótora, použitím génu kódujúceho pre enzým ktorý má vysokú špecifickú aktivitu, alebo kombináciou uvedených spôsobov.

Koryneformná baktéria, kotviaca mutantnú AK môže byť taká, ktorá produkuje mutantnú aspartokinázu ako výsledok mutácie, alebo taká, ktorá je transformovaná vložením mutaného lysC.

Príklady uvedených koryneformných baktérií, použitých na opísané vloženie DNA, napríklad zahŕňajú ďalej uvedené divoké typy kmeňov, produkujúcich lyzín: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13 870; Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15 806; Corynebacterium callunae ATCC 15 991; Corynebacterium glutamicum ATCC 13 032; (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14 020; (Brevibacterium lactofermentum} ATCC 13 869; (Corynebacterium lilium) ATTC 15 990; (Brevibacterium flavum) ATCC 14 067;

Corynebacterium melassecola ATCC 17 965; Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14 066; Brevibacterium immariophilum ATCC 14 069; Brevibacterium roseum ATCC 13 825;

Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19 240; Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15 354; Corynebacterium thcrmoaminogenes AJ12 340 (FERM BP-1539).

Ako hostiteľské baktérie sú popri opísaných použiteľné ďalej bakteriálne kmene, napríklad mutantné kmene, ktoré majú schopnosť produkovať L-lyzín, odvodenú od už spomenutých kmeňov. Také umelé mutantné kmene zahŕňajú: mutantné kmene odolné proti S-(2-aminoetyl)-cysteínu (v ďalšom texte skrátene označovaný ako „AEC“) (Brevobacterium lactofermentum AJ 11 082 (NRRL B-1147), Japonské patentové spisy číslo 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075 , 59-4993, 61-35840, 6224074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 a 7-112438); mutantné kmene, ktoré pre svoj rast vyžadujú aminokyselinu ako jc L-homoserín (Japonské patentové spisy číslo 48-28078 a 56-6499); mutantné kmene, ktoré vykazujú rezistenciu proti AEC a vyžadujú aminokyseliny, ako sú L-leucín, L-homoserín, L-prolín, L-serín, L-arginín, L-alanín a L-valín (US patenty 3 708 395 a 3 825 472); mutantné kmene, produkujúce L-lyzín, ktoré vykazujú odolnosť proti DL-a-amino-e-kaprolaktámu, α-amino-lauryllaktámu, aspartátovému analógu, sulfa liečivám, chinoidom a N-lauroylleucínu; mutantné kmene, ktoré produkujú L-lyzin a ktoré vykazujú odolnosť proti inhibítorom oxyaloacetátovej dekarboxylázy alebo respiračným systémovým enzýmom (zverejnené japonské patenty číslo 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 a 56-39778 a Japonské patentové spisy číslo 53-43591 a 53-1833); mutantné kmene, ktoré produkujú L-lyzín a ktoré vyžadujú inozitol alebo kyselinu octovú (zverejnené japonské patenty číslo 55-9784 a 56-8692); mutantné kmene, ktoré produkujú L-lyzin a ktoré sú citlivé na fluórpyrohroznovú kyselinu alebo na teploty nie nižšie ako 34 °C (japonské zverejnené patenty číslo 55-9783 a 53-86090); a produkčné mutantné kmene, ktoré patria do rodu Brevibacterium alebo Corynebacterium, ktoré vykazujú odolnosť proti etylén-glykolu a produkujú L-lyzin (Patent USA 4 411 997).

Na zosilnenie génov L-lyzinovej biosyntézy v hostiteľských bunkách, ako už bolo opísané, sú v uvedenom uskutočnení gény vložené do hostiteľa použitím plazmidového vektora, transpozónu, fágového vektora alebo podobnými spôsobmi. Po vložení sa predpokladá vykonanie ešte určitého zosilnenia použitím vektora typu „low copy“. Uvedený vektor zahŕňa napríklad plazmidové vektory, pAJ655, pAJ1844, pAJôll, pAJ3148 a pAJ440, opísané skôr. Okrem toho sa transpozóny, odvodené z koryneformných baktérií opisujú v spise medzinárodného patentu W002/02627 a WO93/18151, v spise európskeho patentu číslo 445 385, japonského patentového spisu číslo 6-46 867, ďalej v prácach autorov A. A. Vertes ct al., Mol.

Microbiol., 11 739 až 746 (1994), C. Bonamy et al., Mol.

Microbiol. 14, 571 až 581 (1994), A. A. Vertes et al., Mol.

Gen. Genet. 245, 397 až 405 (1994), W. Jagar et al., FEMS

Microbiology Letters 126, 1 až 6 (1995), v japonských zverejnených patentoch číslo 7-107 976, 7-327 680 a inde.

V tomto vynáleze nie je nevyhnutné, aby mutantný kmeň lysC bol nutne zosilnený. Je prípustné použiť také kmene, ktoré majú mutáciu na lysC v chromozomálnej DNA, alebo v ktorých je mutantný lysC zabudovaný do chromozomálnej DNA. Mutantný lysC môže byť voliteľne vložený použitím plazmidového vektora. Na zvýšenie výkonnosti produkcie L-lyzínu môžu byť na druhej strane výhodne zosilnené dapA. dapB. lvsA a ddh.

Každý z uvedených génov dapA. dapB, lysA a ddh môže byť následne vložený do hostiteľa použitím rôznych vektorov. Použitím jedného vektora možno spolu vložiť voliteľne dva, tri, štyri alebo päť druhov génov. Ak sa použijú rôzne vektory, gény sa môžu vkladať v akomkoľvek poradí, ale výhodne sa použijú vektory, ktoré majú stabilné spojenie a kotviaci mechanizmus s hostiteľom, a ktoré sú každý s každým schopné koexistovať. Koryneformné baktérie, kotviace uvedenú mutantnú AK a ďalej obsahujúce zosilnený dapB sa získajú, napríklad, vložením rekombinantnej DNA, obsahujúcej mutantný lysC a dapB, autonómne replikovateľnej v bunkách koryneformných baktérií, do hostiteľských koryneformných baktérií.

Koryneformné baktérie, obsahujúce popri mutantnom lysC a dapB ďalej aj zosilnený dapA sa získajú, napríklad, vložením rekombinantnej DNA, obsahujúcej mutantný lysC a dapB a dapA, autonómne replikovateľnej v bunkách koryneformných baktérií, do hostiteľských koryneformných baktérií.

Koryneformné baktérie, obsahujúce popri mutantnom lysC. dapB a dapA ďalej aj zosilnený lysA sa získajú, napríklad, vložením rekombinantnej DNA, obsahujúcej mutantný lysC. dapB, dapA a lysA, autonómne replikovateľnej v bunkách koryneformných baktérií, do hostiteľských koryneformných baktérií.

Koryneformné baktérie, obsahujúce popri mutantnom lysC. dapB, dapA a lysA ďalej aj zosilnený ddh sa získajú, napríklad, vložením rekombinantnej DNA, obsahujúcej mutantný lysC. dapB. dapA, lysA a ddh, autonómne replikovateľnej v bunkách koryneformných baktérií, do hostiteľských koryneformných baktérií.

Uvedené rekombinantné DNA sa môžu získať, napríklad, vložením každého z génov, podieľajúceho sa na biosyntéze L-lyzínu, do vektora, ako je plazmidový vektor, transpozón alebo fágový vektor, ako už bolo uvedené skôr.

V prípade, keď sa ako vektor použije plazmid, môže sa rekombinantné DNA vložiť do hostiteľa pomocou elektrického pulzného spôsobu (Electric Pulse Method; Sugimoto et al., zverejnený japonský patent číslo 2-207 791). Amplifikácia génu použitím transpozóna sa môže vykonať vložením plazmidu (ktorý je nositeľom transpozóna) do hostiteľskej bunky a vyvolaním transpozície transpozóna.

3. Spôsob prípravy L-lyzínu

L-lyzín sa môže hospodárne vyrábať vo vhodnom prostredí kultiváciou koryneformných baktérii, obsahujúcich opísané zosilnené gény na biosyntézu L-lyzínu, akumuláciou L-lyzínu v bakteriálnej kultúre a oddelením L-lyzínu z kultúry.

Použité vhodné prostredie môže byť napríklad bežné prostredie, obsahujúce zdroj uhlíka, zdroj dusíka, anorganické ióny a voliteľne niektoré organické zložky.

Ako zdroj uhlíka možno použiť cukry, ako je glukóza, fruktóza, sacharóza, melasa a škrobový hydrolyzát; ďalej

SK 285013 Β6 organické kyseliny, ako je kyselina fumárová, kyselina citrónová a kyselina jantárová.

Ako zdroj dusíka možno použiť anorganické amónne soli, ako je síran amónny, chlorid amónny a fosforečnan amónny; a/alcbo organický dusík vo forme napríklad sójového hydrolyzátu; a/alebo plynný amoniak a vodný roztok amoniaku.

Čo sa týka zdrojov organickej mikrovýživy vyžaduje sa, aby prostredie obsahovalo vo vhodnom množstve nevyhnutné látky, ako je vitamín Bl a L-homoserín alebo kvasinkový extrakt alebo podobné látky. Ak je nevyhnutné, pridávajú sa v malých množstvách ďalšie ako už uvedené látky, ako sú fosforečnan draselný, síran horečnatý, ióny železa, ióny mangánu a podobné.

Kultivácia sa výhodne vykonáva v aeróbnych podmienkach počas asi 30 až 90 hodín. Kultivačná teplota sa výhodne udržiava od 25 °C do 37 C, pH je pri kultivácii výhodne udržiavané na hodnotách od 5 do 8. Na nastavovanie pH možno použiť anorganické alebo organické, kyslé alebo zásadité látky, plynný amoniak alebo ďalšie činidlá. Oddeľovanie L-lyzínu z kultúry sa môže vykonávať známym spôsobom použitím ionexových živíc v spojení s bežne používaným precipitačným spôsobom a ďalšími známymi spôsobmi.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje postup konštrukcie plazmidov p399AKYB ap399AK9B, obsahujúcich mutantnv IvsC.

Obr. 2 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu pDPRB, obsahujúceho dapB a Brevi.-ori.

Obr. 3 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu pDPSB, obsahujúceho dapA a Brevi.-ori.

Obr. 4 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu p299LYSA, obsahujúceho lysA.

Obr. 5 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu pLYSAB, obsahujúceho lysA a Brevi.-ori.

Obr. 6 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu pPK4D, obsahujúceho ddh a Brevi.-ori.

Obr. 7 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu pCRCAB, obsahujúceho lvsČ, dapB a Brevi.-ori.

Obr. 8 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu pCB, obsahujúceho IvsC, dapB a Brevi.-ori.

Obr. 9 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu pAB, obsahujúceho dapA. dapB a Brevi.-ori.

Obr. 10 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu p399DL, obsahujúceho ddh. a lysA.

Obr. 11 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu pDL, obsahujúceho ddh, lysA a Brevi.-ori.

Obr. 12 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu pCAB, obsahujúceho IvsC, dapA. dapB a Brevi.-ori.

Obr. 13 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu pCABL, obsahujúceho lysC, dapA. dapB, lysA a Brevi.-ori.

Obr. 14 znázorňuje postup konštrukcie plazmidu pCABDL, obsahujúceho IvsC. dapA. dapB. ddh. lysA a Brevi.-ori.

Vynález sa v ďalšom texte podrobnejšie objasňuje na príkladoch.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava divokého typu IvsC génu a mutantného lysC génu z Brevibacterium lactofermentum (1) Príprava divokého typu a mutantného IvsC a príprava plazmidov, ktoré ich obsahujú

Ako chromozomálne DNA donory sa použili kmeň Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 a mutantný kmeň AJ3445 (FERM P-1944), produkujúci L-lyzín, získaný z kmeňa ATCC 13 869 umelou mutáciou. Kmeň AJ3445 sa podrobil mutácii, ktorou sa zmenil lysC tak, aby bol v podstate znecitlivený k spätnej inhibícii, spôsobovanej lyzínom a treoninom (Joumal of Biochemistry 68, 701 až 710 (1970)).

Fragment DNA, obsahujúci lysC sa amplifikoval z chromozomálnej DNA pomocou spôsobu PCR (Polymerase Chain Reaction; pozri T. J. White et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)). Čo sa týka DNA primerov, použitých pre amplifikáciu, syntetizovali sa jednovláknové DNA 23-méry a 21-méry, ktoré majú nukleotidová sekvencie, uvedené v SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 2 v priloženom zozname sekvencií. Cieľom bola amplifíkácia oblasti okolo 1 643 bp, kódujúca pre lysC na základe sekvencie známej pri Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Microbiology 5 (5), 1197 až 1204 (1991) a Mol. Gen. Genet. 224, 317 až 324 (1990)). DNA sa syntetizovali bežnými spôsobmi s použitím zariadenia DNA Synthesizer, Model 380B, vyrábaného firmou Applied Biosystems a použitím fosfoamiditínového spôsobu prípravy (pozri Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981)).

Gén sa amplifikoval pomocou PCR s použiím zariadenia DNA Thermal Cycler, Model PJ 2 000, vyrábaného firmou Takara Shuzo a použitím Taq DNA polymerázy spôsobom, uvádzaným dodávateľom. Amplifikovaný génový fragment 1643 kb sa overil elektroforézou v agarovom géli. Potom sa fragment podrobil excízii z gélu a čisteniu bežným spôsobom; potom sa digeroval s reštrikčnými enzýmami Nrul a EcoRI (obidva vyrábané firmou Takara Shuzo).

Pre génový fragment sa ako klonujúci vektor použil pHSG399 (pozri S. Takeshita et al., Gene 61, 63 až 74 (1987). pHSG399 sa digeroval s reštrikčnými enzýmami Smal a EcoRI (vyrábanými firmou Takara Shuzo) a podrobil sa ligácii s amplifikovaným fragmentom lysC. DNA sa ligovala použitím DNA-ligačnej súpravy (DNA-Ligation Kit, vyrábanej firmou Takara Shuzo) spôsobom, ktorý sa uvádza na použitie uvedenej súpravy. Tak sa pripravili plazmidy, v ktorých fragmenty lysC. amplifikované z chromozómov Brevibacterium lactofermentum boli podrobené ligácii s pHSG399. Plazmid, obsahujúci lysC z ATCC 13 869 (divoký typ kmeňa) sa označil ako p399AKY a plazmid, obsahujúci IvsC z AJ3 463 (baktéria produkujúca L-lyzin) sa označil ako p399AK9.

DNA fragment (v tomto texte označovaný ako „Brevi.-ori“) so schopnosťou spôsobovať autonómnu replikovateľnosť v baktérii patriacej do rodu Corynebacterium sa vložil do p399AKY a p399AK9, čím sa pripravili plazmidy autonómne replikovateľné v baktériách patriacich do rodu Corynebacterium. Brevi.-ori sa pripravil z plazmidového vektora pHK4, obsahujúceho Brevi.-ori a je autonómne replikovateľný v bunkách Escherichia coli a aj v baktériách, patriacich do rodu Corynebacterium. pHK4 sa konštruoval digesciou pHC4 s KpnI (výroba firmou Takara Shuzo) a BamHI (výroba Takara Shuzo), extrakciou fragmentu Brevi.-ori a jeho ligáciou s pHSG298, keď bol predtým digerovaný tiež s K pni a BamHI (pozri zverejnený japonský patent číslo 5-7491). pHK4 poskytuje hostiteľovi odolnosť proti kanamycínu. Escherichia coli, kotviace pHK4 sa označili ako Escherichia coli AJ13 136 a boli uložené 1. augusta 1995 pod úložným číslom FERM BP-5186 v Národnom ústave pre biologické vedy a humánne tech

SK 285013 Β6 nológie Agentúry priemyselných vied a technológií Ministerstva za hraničného obchodu a priemyslu (National Inštitúte of Bioscience and Technology of Ministry of International Trade and Industry, poštový kód 305, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).

pHK4 sa digeroval s reštrikčnými enzýmami Kpnl a Baml a štepné konce sa zarovnali. Zarovnanie koncov sa vykonalo použitím DNA zarovnávacej súpravy (DNA Blunting kit: výroba firmou Takara Shuzo) spôsobom, ktorý sa v tejto súprave uvádza. Po zarovnaní koncov sa ligoval fosforylovaný BamHI linker (vyrábaný firmou Takara Shuzo), aby sa dosiahla taká úprava, v ktorej by DNA fragment, zodpovedajúci časti Brevi.-ori, mohol byť podrobený excízii z pHK4 digesciou iba s BamHI. Tento plazmid sa digeroval s BamHI a vznikajúci Brevi.-ori DNA fragment sa ligoval s p399AKY a p399AK9, ktoré boli už tiež digerované s BamHI. aby sa pripravili plazmidy, z ktorých každý obsahuje lvsC gén autonómne replikovateľný v baktériách patriacich do rodu Corynebacterium.

Plazmid, obsahujúci divoký typ lvsC génu, pochádzajúci z p399AKY sa označil ako p399AKYB a plazmid, obsahujúci mutantný lysC gén, pochádzajúci z p399AK9 sa označil ako p399AK9B. Uvedený spôsob konštrukcie p399AK9B a p399AKYB je znázornený na obr. 1. Kmeň AJ12 691, získaný vložením mutantného plazmidu p399AK9B do divokého typu kmeňa Brevibacterium lactofermentum (kmeň AJ12 036, FERM BP-734) sa uložil 10. apríla 1992 pod úložným číslom FERM P-12 918 v Národnom ústave pre biologické vedy a humánne technológie Agentúry priemyselných vied a technológií Ministerstva zahraničného obchodu a priemyslu (National Inštitúte of Bioscience and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry, poštový kód 305, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko), a bol 10. februára 1995 prenesený na medzinárodné uloženie podľa Budapeštianskej dohody pod úložným číslom FERM BP - 4 999.

(2) Určenie nukleotidovej sekvencie divokého typu lvsC a mutantného lvsC z Brevibacterium lactofermentum

Na stanovenie nukleotidovej sekvencie divokého typu a mutantného lvsC sa z príslušných transformantov pripravili plazmid p399AKY, obsahujúci divoký typ lysC a plazmid p399AK9, obsahujúci mutantný lysC. Stanovenie nukleotidovej sekvencie sa vykonalo spôsobom, ktorý opísal Sanger et al. (napríklad Sanger F. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463 (1977)).

Nukleotidová sekvencia divokého typu lvsC, kódovaná s p399AKZ je uvedená v SEQ ID No: 3 v priloženom zozname sekvencií. Nukleotidová sekvencia mutantného lysC, kódovaného s p399AK9 má na druhej strane v porovnaní s divokým typom lysC mutáciu iba jedného nukleotidu tak, že v SEQ ID No: 3 je 1051. G zamenený za A. Je známe, že lysC z Corynebacterium glutamicum má dve podjednotky (α, β), kódované v rovnakom čítacom rámci na identickom DNA vlákne (pozri J. Kalinowski et al., Molecular Biology 5 (5), 1197 až 1204 (1991)). Usudzujúc z homológie sa predpokladá, že sekvenované gény majú tiež dve podjednotky (α, β), kódované v rovnakom čítacom rámci na identickom DNA vlákne.

V priloženom zozname sekvencií sa pod označením SEQ ID No: 4 uvádza aminokyselinová sekvencia a-podjednotky divokého typu AK proteínu, odvodená z nukleotidovej sekvencie DNA spolu so sekvenciou DNA. Samotná aminokyselinová sekvencia je uvedená v SEQ ID No: 5. Aminokyselinová sekvencia β-podjednotky divokého typu AK proteínu, odvodená z nukleotidovej sekvencie DNA sa uvádza v SEQ ID No: 6 spolu s DNA. Samotná aminokyselinová sekvencia sa uvádza v SEQ ID No: 7. V každej z podjednotiek sa ako iniciačný kodón použil GTG a zodpovedajúca aminokyselina je zastúpená metionínom. Táto aminokyselina však môže byť metionín, valín alebo formylmetionín.

Mutácia na sekvencií mutantného lvsC znamená na druhej strane výskyt substitúcie aminokyselinového zvyšku tak, že v aminokyselinovej sekvencií divokého typu AK proteínu (SEQ ID No: 5 a 7) je 279. alanínový zvyšok uvedenej α-podjednotky zamenený za treonínový zvyšok a 30. alanínový zvyšok β-podjednotky je zamenený za treonínový zvyšok.

Príklad 2

Príprava dapB z Brevibacterium lactofermentum (1) Príprava dapB a konštrukcia plazmidu, obsahujúceho dapB

Ako donor chromozomálnej DNA sa použil divoký typ kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869. Chromozomálna DNA sa pripravila z kmeňa ATCC 13 869 bežným spôsobom. Fragment DNA, obsahujúci dapB sa amplifíkoval z chromozomálnej DNA už uvedeným spôsobom PCR. Čo sa týka DNA primerov, použitých pre amplifikáciu, syntetizovali sa 23-méry DNA, ktoré majú nukleotidové sekvencie, uvedené v SEQ ID No: 8 a SEQ ID No: 9 v priloženom zozname sekvencií. Cieľom bola amplifikácia oblasti okolo 2,0 kb, kódujúca pre DDPR na základe sekvencie známej pri Brevibacterium lactofermentum (pozri Journal of Bacteriology 157 (9), 2743 až 2749 (1993)). Syntéza DNA a PCR sa vykonali rovnakým spôsobom, aký sa opisuje v príklade 1. Ako klonujúci vektor na amplifikáciu génového fragmentu 2 001 bp sa použil pCR-Script (vyrábaný firmou Invitrogen), ktorý sa podrobil ligácii s amplifikovaným dapB fragmentom. Týmto spôsobom sa skonštruoval plazmid, v ktorom dapB fragment 2 001 bp, amplifikovaný z chromozómu Brevibacterium lactofermentum sa ligoval s plazmidom pCR-Script. Opísaný získaný plazmid, ktorý mal dapB odvodené z ATCC 13 869 sa označil ako pCRDAPB. Transformantný kmeň AJ13 107, získaný vložením pCRDAPB do kmeňa JM109 E. coli sa na základe Budapeštianskej dohody medzinárodne uložil

26. mája 1995 pod úložným číslom FERM BP-5114 v Národnom ústave pre biologické vedy a humánne technológie Agentúry priemyselných vied a technológií Ministerstva zahraničného obchodu a priemyslu (National Inštitúte of Bioscience and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry, poštový kód 305,1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).

Fragment o 1 101 bp, obsahujúci štruktúrny gén z DDPR sa extrahoval digesciou pCRDAPB s EcoRV a Sphl. Na prípravu plazmidu sa tento fragment ligoval s pHSG399, ktorý bol už pred tým digerovaný s HincII a Sphl. Pripravený plazmid sa označil ako p399DPR.

Do pripraveného plazmidu p399DPR sa vložil Brevi.ori, aby sa skonštruoval plazmid, ktorý je nositeľom dapB, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. pHK4 sa digeroval s reštrikčným enzýmom Kpnl (vyrábaným firmou Takara Shuzo) a štepné konce sa zarovnali. Zarovnanie koncov sa vykonalo použitím DNA zarovnávacej súpravy (DNA Blunting Kit; výroba firmou Takara Shuzo) spôsobom, ktorý sa v tejto súprave uvádza. Po zarovnaní koncov sa ligoval fosforylovaný BamHI linker (vyrábaný firmou Takara Shuzo), aby sa dosiahla taká úprava, v ktorej by DNA fragment, zodpovedajúci časti Brevi.-ori, mohol byť podrobený excízii z pHK4 degesciou iba s BamHI. Tento plazmid sa digeroval s BamHI a vznikajúci Brevi.ori DNA fragment sa ligoval s p399DPR, ktorý bol už tiež digerovaný s BamHI. aby sa pripravil plazmid, ktorý obsahuje dapB. autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil pDPRB. Postup konštrukcie plazmidu pDPRB je znázornený na obr. 2.

(2) Stanovenie nukleotidovej sekvencie dapB z Brevibacterium lactofermentum

Z kmeňa AJ13 107, kotviaceho p399DPR, sa pripravila plazmidová DNA a jej nukleotidová sekvencia sa určila rovnakým spôsobom, ako sa opisuje v príklade 1. Stanovená nukleotidová sekvencia a z nej odvodená aminokyselinová sekvencia sú uvedené v SEQ ID No: 10. Samotná amino-kyselinová sekvencia sa uvádza v SEQ ID No: 11.

Príklad 3

Príprava dapA z Brevibacterium lactofermentum (1) Príprava dapA a konštrukcia plazmidu, obsahujúceho dapA

Ako donor chromozomálnej DNA sa použil divoký typ kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869.

Chromozomálna DNA sa pripravila z kmeňa ATCC 13 869 bežným spôsobom. Fragment DNA, obsahujúci dapA, sa amplifikoval z chromozomálnej DNA už uvedeným spôsobom PCR. Čo sa týka DNA primérov, použitých pre amplifikáciu, syntetizovali sa 20-méry DNA, ktoré majú nukleotidové sekvencie, uvedené v SEQ ID No: 12 a SEQ ID No: 13 v priloženom zozname sekvencií. Cieľom bola amplifikácia oblasti okolo 1,5 kb, kódujúca pre DDPS na základe sekvencie, známej pri Corynebacterium glutamicum (pozri Nucleic Acids Research 18 (21), 6421 (1990); EMBL accesion No. X53 993). Syntéza DNA a PCR sa vykonali rovnakým spôsobom, aký sa opisuje v príklade 1. Ako klonujúci vektor na amplifikáciu génového fragmentu 1 411 bp sa použil pCRIOOO (vyrábaný firmou Invitrogen, pozri Bio/Technology 9, 657 až 663 (1991)), ktorý sa podrobil ligácii s amplifikovaným dapA fragmentom. Ligácia DNA sa vykonala použitím DNA ligačnej súpravy (DNA Ligation Kit; vyrábaná firmou Takara Shuzo) postupom, uvádzaným v súprave.

Týmto spôsobom sa skonštruoval plazmid, v ktorom dapA fragment 1 411 bp, amplifikovaný z chromozómu Brevibacterium lactofermentum sa ligoval s plazmidom pCRl 000. Opísaný získaný plazmid, ktorý mal dapA odvodené z ATCC 13 869, sa označil ako pCRDAPA.

Transformantný kmeň AJ 13 106, získaný vložením pCRDAPA do kmeňa JM109 E. coli, sa na základe Budapeštianskej dohody medzinárodne uložil 26. mája 1995 po úložným číslom FERM BP-5113 v Národnom ústave pre biologické vedy a humánne technológie Agentúry priemyselných vied a technológií Ministerstva zahraničného obchodu a priemyslu (National Inštitúte of Bioscience and Tcchnology of Ministry of Intemational Trade and Industry, poštový kód 305, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko).

Do pripraveného plazmidu pCRDAPA sa vložil Brevi.-ori, aby sa skonštruoval plazmid, ktorý je nositeľom dapA a je autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. pHK4 sa digeroval s reštrikčnými enzýmami Kpnl a BamHI (vyrábanými firmou Takar Shuzo) a stepné konce sa zarovnali. Zarovnanie koncov sa vykonalo použitím DNA zarovnávaccj súpravy (DNA Blunting Kit; výroba firmou Takara Shuzo) spôsobom, ktorý sa v tejto súprave uvádza. Po zarovnaní koncov sa ligoval fosforylovaný Smal linker (vyrábaný firmou Takara Shuzo), aby sa dosiahla taká úprava, v ktorej by DNA fragment, zodpovedajúci časti Brcvi.-ori mohol byť podrobený excizii z pHK4 degesciou iba s Smal. Tento plazmid sa digeroval s Smal a vzniknutý Brevi.-ori DNA fragment sa ligoval s pCRDAPA, ktorý bol už tiež digerovaný so Smal. aby sa pripravil plazmid, ktorý obsahuje dapA, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil pDPSB. Postup konštrukcie plazmidu pDPSB (Km^r) je znázornený na obr. 3.

(2) Stanovenie nukleotidovej sekvencie dapA z Brevibacterium lactofermentum

Z kmeňa AJ13 106, kotviaceho pCRDAPA, sa pripravila plazmidová DNA a jej nukleotidová sekvencia sa určila rovnakým spôsobom, ako sa opisuje v príklade 1. Stanovená nukleotidová sekvencia a z nej odvodená aminokyselinová sekvencia sú uvedené v SEQ ID No: 14. Samotná aminokyselinová sekvencia sa uvádza v SEQ ID No: 15.

Príklad 4

Príprava lysA z Brevibacterium lactofermentun (1) Príprava lysA a konštrukcia plazmidu, obsahujúceho lysA

Ako donor chromozomálnej DNA sa použil divoký typ kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869.

Chromozomálna DNA sa pripravila z kmeňa ATCC 13 869 bežným spôsobom. Fragment DNA, obsahujúci argS. lysA a promótor operóna, ktorý ho obsahuje sa amplifikovali z chromozomálnej DNA už uvedeným spôsobom PCR. Čo sa týka DNA primérov, použitých pre amplifikáciu, syntetizovali sa 23-méry DNA, ktoré majú nukleotidové sekvencie, uvedené v SEQ vyznačené v ID No: 16 a SEQ ID No: 17 v priloženom zozname sekvencií. Na základe sekvencie známej pri Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Biology 4 (11), 1819 až 1830 (1990); Molecular and Generál Genetics 212, 112 až 119 (1988)) bola cieľom amplifikácia oblasti okolo 3,6 kb, kódujúca pre arginyl-tRNA syntázu a DDC. Syntéza DNA a PCR sa vykonali rovnakým spôsobom, aký sa opisuje v príklade 1. Ako klonujúci vektor na amplifikáciu génového fragmentu 3579 bp sa použil pHSG399. pHSG399 sa digeroval s reštrikčným enzýmom Smal (vyrábaný firmou Takara Shuzo) ktorý bol ligovaný s DNA fragmentom, obsahujúcim amplifikovaný dapA.

Opísaným spôsobom získaný plazmid, ktorý mal lysA odvodené z ATCC 13 869, sa označil ako p399LYSA. Fragment DNA, obsahujúci lysA sa extrahoval digesciou p399LYSA s Kpnl (vyrábaný firmou Takara Shuzo) a BamI (vyrábaný firmou Takara Shuzo). Tento DNA fragment sa podrobil ligácii s pHSG399, ktorý už bol digerovaný s Kpnl a BamI. Získaný plazmid sa označil ako p299LYSA. Postup konštrukcie p299LYSA je znázornený na obr. 4.

Do pripraveného plazmidu p299LYSA sa vložil Brevi -ori, aby sa skonštruoval plazmid, ktorý je nositeľom lysA. autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. pHK4 sa digeroval s reštrikčnými enzýmami Kpnl a BamHI (vyrábanými firmou Takar Shuzo) a stepné konce sa zarovnali. Zarovnanie koncov sa vykonalo použitím DNA zarovnávacej súpravy (DNA Blunting Kit; výroba firmou Takara Shuzo) spôsobom, ktorý sa v tejto súprave uvádza. Po zarovnaní koncov sa ligoval fosforylovaný Smal linker (vyrábaný firmou Takara Shuzo), aby sa dosiahla taká úprava, v ktorej by DNA fragment, zodpovedajúci časti Brevi.-ori mohol byť podrobený excizii z pHK4 digesciou iba s Kpnl. Tento plazmid sa digeroval s Kpnl a vzniknutý Brevi.-ori DNA fragment sa ligoval s p299LYSA, ktorý bol už tiež digerovaný s Kpnl, aby sa pripravil plazmid, ktorý obsa huje lysA, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil pLYSAB. Postup konštrukcie plazmidu pLYSAB je znázornený na obr. 5.

(2) Stanovenie nukleotidovej sekvencie lysA z Brevibacterium lactofermentum

Pripravila sa plazmidová DNA p299LYSA a jej nukleotidová sekvencia sa určila rovnakým spôsobom, ako sa opisuje v príklade 1. Stanovená nukleotidovú sekvencia a z nej odvodená aminokyselinová sekvencia na kódovanie nukleotidovou sekvenciou sú uvedené v SEQ ID No: 18. Čo sa týka nukleotidovej sekvencie sú aminokyselinová sekvencia kódovaná s argS a aminokyselinová sekvencia kódovaná s IvsA uvedené v SEQ ID No: 19 a SEQ ID No: 20.

Príklad 5

Príprava ddh z Brevibacterium lactofermentum

Gén ddh sa získal amplifikáciou ddh génu z chromozomálnej DNA z Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 869 pomocou spôsobu PCR s použitím dvoch oligonukleotidových primerov (SEQ ID No: 21 a SEQ ID No: 22), pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie ddh génu z Corynebacterium glutamicum (S. Ishino et ah, Nucleic Acids Research 15, 3917 (1987)). Získaný amplifikovaný DNA fragment sa digcroval s EcoT22I a A val a stepné konce sa zarovnali. Aby sa získal plazmid pDDH vložil sa potom fragment do polohy Smal plazmidu pMW119.

V ďalšom sa pDDH digeroval s Sali a EcoRI a nasledovalo zarovnanie koncov. Potom sa získaný fragment podrobil ligácii s pUC18, ktorý už bol digerovaný s Smal. Takto získaný plazmid sa označil ako pUCl 8DDH.

Na konštrukciu plazmidu, ktorý je nositeľom ddh a je autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách sa do pUC18DDH vložil Brevi.-ori. pHK4 sa digeroval s reštrikčnými enzýmami KpnI a BamHl a stepné konce sa zarovnali. Zarovnanie koncov sa vykonalo použitím DNA zarovnávacej súpravy (DNA Blunting Kit; výroba firmou Takara Shuzo) spôsobom, ktorý sa v tejto súprave uvádza. Po zarovnaní koncov sa ligoval fosforylovaný PstI linker (vyrábaný firmou Takara Shuzo) tak, že bol vložený do polohy PstI plazmidu pHSG299. Takto skonštruovaný plazmid sa označil ako pPK4. Ďalej, pUC18DDH sa podrobil digescii s X bal a Koni a vytvorený fragment sa ligoval s pPK4, ktorý už bol digerovaný s KpnI a Xbal. Tak sa vytvoril plazmid autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách, obsahujúci ddh. Tento plazmid sa označil ako pPK4D. Postup pri konštrukcii plazmidu pPK4D je znázornený na obr. 6.

Príklad 6

Konštrukcia plazmidu, obsahujúceho kombináciu mutantného lysC a dapA

Z plazmidu pCRDAPA, obsahujúceho dapA a z plazmidu p399AK9B, obsahujúceho mutantný lysC a Brevi.-ori sa konštruoval plazmid, obsahujúci mutantný lysC. dapA a replikačný počiatok koryneformných baktérií. p399AK9B sa celkom degradoval s Sali, potom sa vykonalo zarovnanie koncov. Potom sa s ním ligoval linker EcoRI, aby sa vytvoril plazmid, v ktorom je miesto Sali modifikované na miesto EcoRI. Získaný plazmid sa označil ako p399AK9BSE. Čiastkovou degradáciou p399AK9BSE pomocou EcoRI bol mutantný lysC a Brevi.-ori excizované ako jeden fragment. Tento fragment sa podrobil ligácii s pCRDAPA, ktorý už bol digerovaný s EcoRI. Získaný plazmid sa označil ako pCRCAB. Tento plazmid je autonómne replikovateľný v E. coli a v koryneformných baktériách a poskytuje hostiteľovi rezistenciu proti kanamycínu; plazmid obsahuje kombináciu mutantného lysC a dapA. Postup pri konštrukcii pCRCAB je znázornený na obr. 7.

Príklad 7

Konštrukcia plazmidu obsahujúceho kombináciu mutantného lysC a dapB

Z plazmidu p399AK9, ktorý má mutatantný lysC a z plazmidu p399DPR, ktorý má dapB sa skonštruoval plazmid obsahujúci mutantný lysC a dapB. Fragment 1 101 bp, obsahujúci štrukturálny gén z DDPR sa extrahoval digesciou p399DPR s EcoRV a Sphl. Tento fragment sa podrobil ligácii s p399AK9, ktorý už bol digerovaný s Sali a potom na koncoch zarovnaný a bol ďalej digerovaný s Sphl na konštrukciu plazmidu, obsahujúceho kombináciu lysC a dapB. Tento plazmid sa označil ako p399AKDDPR.

Ďalej, do získaného plazmidu p399AKDDPR sa vložil Brevi.-ori. Plazmid pHK4, obsahujúci Brevi.-ori sa digeroval s reštrikčným enzýmom KpnI (vyrábaným firmou Takara Shuzo) a stepné konce sa zarovnali. Zarovnanie koncov sa vykonalo použitím DNA zarovnávacej súpravy (DNA Blunting Kit; výroba firmou Takara Shuzo) spôsobom, ktorý sa v tejto súprave uvádza. Po zarovnaní koncov sa ligoval fosforylovaný BamHl linker (vyrábaný firmou Takara Shuzo), aby sa dosiahla taká úprava, v ktorej by DNA fragment, zodpovedajúci časti Brevi.-ori mohol byť podrobený excízii z pHK4 digesciou iba s BamHl. Tento plazmid sa digeroval s BamHl a vzniknutý Brevi.-ori DNA fragment sa ligoval s p399AKDDPR, ktorý bol už tiež digerovaný s BamHl. aby sa pripravil plazmid, ktorý obsahuje mutantný lysC a dapB, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil ako pCB. Postup konštrukcie plazmidu pCB je znázornený na obr. 8.

Príklad 8

Konštrukcia plazmidu, obsahujúceho kombináciu dapA a dapB

Na extrakciu fragmentu, obsahujúceho dapA sa plazmid pCRDAPA, obsahujúci dapA digeroval s KpnI a EcoRI. Potom sa podrobil ligácii s vektorovým plazmidom pHSG399, ktorý už bol digerovaný s KpnI a EcoRI. Získaný plazmid sa označil p399DPS.

Na druhej strane, na konštrukciu plazmidu obsahujúceho kombináciu dapA a dapB sa plazmid pCRDAPB, obsahujúci dapB digeroval s Sacll a EcoRI. aby sa extrahoval DNA fragment s 2,0 kb, obsahujúci oblasť, kódujúcu pre DDPR; fragment sa podrobil ligácii s p399DPS, ktorý už bol digerovaný s Sacll a EcoRI. Získaný plazmid sa označil ako p399AB.

V ďalšom kroku sa do p399AB vložil Brevi.-ori. Plazmid pHK4, obsahujúci Brevi.-ori sa digeroval s reštrikčným enzýmom BamHl (vyrábaným firmou Takara Shuzo) a stepné konce sa zarovnali. Zarovnanie koncov sa vykonalo použitím DNA zarovnávacej súpravy (DNA Blunting Kit; výroba firmou Takara Shuzo) spôsobom, ktorý sa v tejto súprave uvádza. Po zarovnaní koncov sa ligoval fosforylovaný KpnI linker (vyrábaný firmou Takara Shuzo) aby sa dosiahla taká úprava, v ktorej by DNA fragment, zodpovedajúci časti Brevi.-ori mohol byť podrobený excízii z pHK4 degesciou iba s KpnI. Tento plazmid sa digeroval s KpnI a vzniknutý Brevi.-ori DNA fragment sa ligoval s

SK 285013 Β6 p399AB, ktorý bol už tiež digerovaný s KpnI, aby sa pripravil plazmid, ktorý obsahuje dapA a dapB, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil pAB. Postup konštrukcie plazmidu pAB je znázornený na obr. 9.

Príklad 9

Konštrukcia plazmidu, obsahujúceho kombináciu ddh a lysA

Na extrakciu DNA fragmentu, obsahujúceho ddh sa plazmid pUC18DDH digeroval s EcoRI a Xbal. Tento ddh obsahujúci fragment sa podrobil ligácii s plazmidom lysA, ktorý už bol digerovaný s BamHI a Xbal a ktorého stepné konce boli po digescii zarovnané. Získaný plazmid sa označil ako p399DL. Postup konštrukcie plazmidu p399DL je znázornený na obr. 10. V ďalšom kroku sa do p399DL vložil Brevi.-ori. Plazmid pHK4 sa digeroval s Xbal a BamHI a stepné konce sa zarovnali. Po zarovnaní koncov sa ligoval fosforylovaný Xbal linker (vyrábaný firmou Takara Shuzo), aby sa dosiahla taká úprava, v ktorej by DNA fragment, zodpovedajúci časti Brevi.-ori mohol byť podrobený excízii z pHK4 degesciou iba s Xbal. Tento plazmid sa digeroval s Xbal a vzniknutý Brevi.-ori DNA fragment sa ligoval s p399DL, ktorý bol už tiež digerovaný s Xbal. aby sa pripravil plazmid, ktorý obsahuje ddh a lysA, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil pDL. Postup konštrukcie plazmidu pDL je znázornený na obr. 11.

Príklad 10

Konštrukcia plazmidu, obsahujúceho kombináciu mutantného lysC. dapA a dapB

Na zarovnanie koncov sa p399DPS degradoval s EcoRI a Sphl a následne sa extrahoval génový fragment dapA. Tento fragment sa podrobil ligácii s p399AK9, ktorý už bol digerovaný s Sali a zarovnaný, aby sa skonštruoval plazmid p399CA, v ktorom koexistujú mutantný lysC a dapA.

Plazmid pCRDAPB, obsahujúci dapB sa digeroval s EcoRI a zarovnal, následne sa digeroval s Sací, aby sa extrahoval DNA fragment s 2,0 kb, obsahujúci dapB. Uvedený plazmid p399CA, obsahujúci dapA a mutantný lysC sa digeroval s Spel a zarovnal; potom sa digeroval s Sací a ligoval s extrahovaným dapB fragmentom, aby sa získal plazmid, obsahujúci mutantný lysC. dapA a dapB. Tento plazmid sa označil ako p399CAB.

V ďalšom kroku sa do p399CAB vložil Brevi.-ori. Plazmid pHK4, obsahujúci Brevi.-ori, sa digeroval s reštrikčným enzýmom BamHI a stepné konce sa zarovnali. Zarovnanie koncov sa vykonalo použitím DNA zarovnávacej súpravy (DNA Blunting Kit; výroba firmou Takara Shuzo) spôsobom, ktorý sa v tejto súprave uvádza. Po zarovnaní koncov sa ligoval fosforylovaný KpnI linker (vyrábaný firmou Takara Shuzo), aby sa dosiahla taká úprava, v ktorej by DNA fragment, zodpovedajúci časti Brevi.-ori mohol byť podrobený excízii z pHK4 digesciou iba s KpnI. Tento plazmid sa digeroval s KpnI a vzniknutý Brevi.-ori DNA fragment sa ligoval s p399CAB, ktorý bol už tiež digerovaný s KpnI. aby sa pripravil plazmid, ktorý obsahuje lysC, dapA a dapB, autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Pripravený plazmid sa označil pCAB. Postup konštrukcie plazmidu pCAB je znázornený na obr.

12.

Príklad 11

Konštrukcia plazmidu, obsahujúceho kombináciu mutantného lysC. dapA, dapB a lysA

Plazmid p299LYSA, obsahujúci lysA sa digeroval s KpnI a BamHI a zarovnali sa konce. Potom sa extrahoval lysA génový fragment. Tento fragment sa podrobil ligácii s pCAB, ktorý už bol digerovaný s Hpal (vyrábaný firmou Takara Shuzo) a zarovnaný, čím sa konštruoval plazmid, obsahujúci mutantný lysC, dapA, dapB a lysA, ktorý je autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Skonštruovaný plazmid sa označil ako pCABL. Postup konštrukcie plazmidu pCABL jc znázornený na obr. 13.

Poznamenáva sa, že génový fragment lysA je vložený do polohy Hpal v DNA fragmente, obsahujúcom dapB gén v pCABL, ale uvedená poloha Hpal je proti smeru od promótora dapB génu (nukleotidové čísla 611 až 616 v SEQ ID No: 10) a väzba dapB génu nie je zrušená.

Príklad 12

Konštrukcia plazmidu, obsahujúceho kombináciu mutantného lysC, dapA. dapB, ddh a lysA

Plazmid pHSG299 sa digeroval s Xbal a KpnI, potom sa podrobil ligácii s p399DL, obsahujúcom ddh a lysA. ktorý bol už digerovaný s Xbal a KpnI. Skonštruovaný plazmid sa označil ako p299DL. p299DL sa digeroval s Xbal a KpnI a zarovnali sa konce. Po zarovnaní sa extrahoval fragment, obsahujúci ddh a lysA. Tento fragment sa podrobil ligácii s plazmidom pCAB, obsahujúcom kombináciu mutantného lysA, dapA a dapB, ktorý už bol digerovaný s Hpal a zarovnaný, čím sa skonštruoval plazmid, obsahujúci kombináciu mutantného lysA, dapA, dapB, lysA a ddh, ktorý je autonómne replikovateľný v koryneformných baktériách. Skonštruovaný plazmid sa označil ako pCABDL. Postup pri konštrukcii plazmidu pCABDL je znázornený na obr. 14.

Príklad 13

Vloženie plazmidov, obsahujúcich gény L-lyzínovej biosyntézy do L-lyzín produkujúcich baktérií Brevibacterium lactofermentum

Jednotlivé plazmidy, obsahujúce gény na biosyntézu L-lyzínu, skonštruované uvedenými spôsobmi, najmä p399AK9B(Cm^r), pDPSB(Km'), pDPRB(Cm'), pLYSAB(Cm^r), pPK4D(Cm^r), pCRCAB(Krrľ). pAB(Cm^r), pCB(Cm^r), pDL/Crrľ), pCAB(Cm^r), pCABL(Cm^r) a pCABDL(Cm^r), sa vložili do L-lyzín produkujúcej baktérie AJ 11 082 (NRRL B-11 470) z Brevibacterium lactofermentum. Kmeň AJ11 082 vykazuje AEC rezistenciu. Plazmidy sa vložili elektrickým pulzným spôsobom (Sugimoto et al., japonský zverejnený patent číslo 2-207 791). Transformované baktérie sa selektovali na základe markerov rezistencie proti liečivám. Transformované baktérie sa selektovali na úplnom médiu, obsahujúcom 5 pg/ml chloramfcnikolu, ak sa vkladal plazmid, obsahujúci gén rezistentný proti chloramfenikolu, alebo sa transformované baktérie selektovali na úplnom médiu s 25 pg/ml kanamycínu, ak sa vkladal plazmid, obsahujúci gén odolný proti kanamycínu.

Príklad 14

Výroba L-lyzínu

Na zhodnotenie L-lyzínovej produktivity sa každý transformant, získaný v príklade 13 kultivoval vo vhodnom prostredí na produkciu L-lyzinu. Vhodné prostredie na produkciu L-lyzínu malo ďalej uvedené zloženie.

Prostredie na produkciu L-lyzínu

Ďalej uvedené zložky s výnimkou uhličitanu vápenatého (všetko vzťahované na 1 liter) sa rozpustili a pH sa nastavilo na hodnotu 8 pomocou KOH. Médium sa sterilizovalo pri 115 °C počas 15 minút. Uhličitan vápenatý (50 g) sa osobitne sterilizoval horúcim vzduchom v suchom stave a pridal sa uvedenému sterilizovanému roztoku.

Zloženie:

Glukóza100 g (NH₄)₂SO₄55 g

KH₂PO₄1 g

MgSO₄.7H₂O1 g

Biotín 500 pg

Tiamín 2000 pg

FeSO₄.7H₂O 0,01 g

MnSO₄.7H₂O 0,01 g

Nikotinamid 5 mg

Proteínový hydrolyzát (Márnenou) 30 ml Uhličitan vápenatý 50 g

Každý z rôznych druhov transformantov a rodičovský kmeň sa zaočkovali do média s uvedeným zložením. Násada sa kultivovala pri 31,5 °C za protismerného pretrepávania. Množstvo vytvoreného L-lyzinu po 40 a po 72 hodinách kultivácie a rast po 72 hodinách (OD562) sú uvedené v tabuľke I. V uvedenej tabuľke lysC* znamená mutantný lysC. Rast sa kvantitatívne stanovoval meraním absorbancie (optickej hustoty, OD) pri 560 nm po 101-násobnom zriedení.

Tabuľka 1

Akumulácia L-lyzínu (v g/1) po 40 a 72 hodinovej kultivácii

Bakteriálny kmeň/plazmi d	Vložený gén	.Inožstvo vyprodukokovaného L-lyzínu po	Rast (odSS2/ioi)
40 h	72 h (g/1)
AJ 11082		22,0	29.8	0.450
AJ11082/ p399AK9B	íysc·	16.8	34,5	0,398
ΑΗΙΟβΖ/ρΒΡδΒ	dapA	18,7	33.8	0,410
AJ11082/pDRB	dapB	19.9	29,9	0,445
AJ 11082/pLYSAB	lisA	19,8	32.5	0,356
AJ11082/pPK4D	ddh	19,G	33,4	0.330
AJ 11082/pCRCAB	LysC'*. dapA	29. 7	36. 5	D, 360
AJUQB2/pAB	dapA.dapS	19.0	34.8	D.390
AJ11082/pCB	IvsC*, dapB	23,3	35,0	0.440
AJ11082/pDL	iäU. lysA	25.3	31,6	0,440
AJl1O82/pCAR JotSĽ’	dapA. daoB	23,0	45 .0	0,425
AJ11082/pCABL LysC*.dapA-dapB.lvs/	26,2	46,5	O, 379
AJ11082/pCABDI- lv.sC',daPA.danB.
lysí·.		26.5	47,0	0.409

Z tabuľky 1 je zrejmé, že jednotlivo zosilnené mutantné lysC, dapA alebo dapB vyprodukovali väčšie alebo rovnaké L-lyzínu ako bola produkcia rodičovského kmeňa po 72 hodinovej kultivácii, ale vyprodukované množstvo L-lyzínu po 40 hodinovej kultivácii bolo menšie ako rodičovského kmeňa. Z toho vyplýva, že rýchlosť tvorby L-lyzínu pri krátkych dobách kultivácie je znížená.

Podobne, ak mutantný lysC a dapA, alebo dapA a dapB boli zosilnené v kombinácii, množstvo vyprodukovaného L-lyzínu bolo väčšie ako produkcia rodičovského kmeňa po 72 hodinách kultivácie, ale množstvo vyprodukovaného L-lyzinu po 40 hodinovej kultivácii bolo nižšie ako pri rodičovskom kmeni. Rýchlosť produkcie L-lyzínu teda aj tu bola znížená.

Na druhej strane, ak boli zosilnené lysA alebo ddh jednotlivo, alebo ak lvsA a ddh boli zosilnené v kombinácii, množstvo vyprodukovaného L-lyzínu bolo väčšie ako produkcia rodičovského kmeňa po 40 hodinovej kultivácii, ale množstvo vyprodukovaného L-lyzínu po dlhej dobe kultivácie bolo zákonite nižšie ako pri rodičovskom kmeni v dôsledku zníženia rastu.

Naproti tomu, v prípade kmeňa, v ktorom bol zosilnený dapB spolu s mutantným lysC sa zlepšil rast, rýchlosť produkcie L-lyzínu bola uspokojivo obnovená pre krátke doby kultivácie a tiež sa zlepšilo akumulované množstvo L-lyzinu pri dlhej dobe kultivácie. V prípade kmeňa, v ktorom boli súčasne zosilnené mutantný lysC. dapA a dapB, sa produktivita tvorby L-lyzínu ďalej zvýšila. Postupným ďalším zosilnením lysA a ddh sa postupne tiež zvýšila rýchlosť tvorby L-lyzínu, ako aj jeho akumulované množstvo.

Priemyselná využiteľnosť

Podľa tohto vynálezu sa môže zlepšiť schopnosť koryneformných baktérií produkovať L-lyzín, ako aj rýchlosť rastu.

Produkčnú rýchlosť L-lyzínu pri koryneformných baktériách, produkujúcich L-lyzín, možno zvýšiť a tiež sa môže zlepšiť produktivita tvorby L-lyzínu zosilnením dapB spolu s mutantným lysC. Rýchlosť tvorby a produktivita tvorby L-lyzínu sa môžu popri uvedených génov ďalej zlepšiť postupným zosilnením dapA, lysA a ddh.

Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie (i) Prihlasovateľ: AJINOMOTO Co., INC.

(ii) Názov vynálezu: Spôsob výroby L-lyzinu (iii) Počet sekvencii: 24 (iv) Adresa pre korešpondenciu:

(A) Adresát:

(B) Ulica:

(C) Mesto:

(E) Krajina:

(F) Poštový kód (ZIP):

(v) Počítačom čitateľný tvar:

(A) Druh média: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: Patentln Release # 1.0, verzia #1.30 (vi) Údaje o súčasnej prihláške:

(A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum podania:

(C) Zatriedenie:

(vii) Údaje o predchádzajúcej prihláške:

(A) Číslo prihlášky: JP 7-140 614 (B) Dátum podania: 07. júl 1995 (viii) Informácie o právnom zástupcovi:

(A) Meno:

(B) Registračné číslo:

(iv) Telekomunikačné informácie:

(A) Telefón:

(B) Telefax:

(2) Informácie o SEQ ID No: 1:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „synthetic DNA“ (iv) Anti-Sense: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 1: TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23 (2) Informácie o SEQ ID No: 2:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 21 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „synthetic DNA“ (iv) Anti-Sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 2: ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21 (2) Informácie o SEQ ID No: 3:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 1643 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: DNA (genómová) (iv) Anti-Sense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 3:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Poloha: 217..1482 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 4:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CnTTGICTC AAATATTAAA TOSAATATCA ATATACGGTC 60 TOTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TÄAAGCCCCA Q3AAQXTOT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGOTTAGGTA GACACAffTTT ATAAAGGTAG AOTTGAGCGG 180 GTAACTOTCA GCMTOTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTC CTC OTA CAG 234

Met Ala Leu Val Val Gin

282

330

378

426

474

522

570

618

666

714

762

810

858

906

954

TCGCGAAGTA GCAOCTGTCA CTľľlVľCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC

TGITTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TÄAAGCCCCA GGAACCCTGT GCAGAAAGAA AACACICCTC TOGCTAGGTA GACÄCAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG GTAACTOTCA GCAOCTAGAT CGAAAGCTGC ACAAAGCTGG CCCTGCTCGT ACAGAÄATAT

GGCGGTTCCT ACCÄAGÄAGG GAACTTCTW3 CTCCTGACTG GGCO2A3AAG

CGCTľGAGAG CIGGAAATGA AACITGCAGC CTGGTGAGCG CTCftATCm

TGCG3AACGC TGTCGTGGIT □GCAGTGAAT TATTTCTAAC CACTGGCTCT

ATTAGAAACG GIOTGCTCCG CCOOTTOOGC CCTCTCGTCG CAGGCTGGTG

TOGCTGAAOG CAATGGGAGA CAGCTOGTGA CCATGGCTAT TGCTCAOCAC

GA1CGTTGCC

CACCACGGAT AATGGATATG TGAGICCCTr

OSAGCGCCAC

120

180

240

300

360

420

480

540

GGääACGCäC GCATTGTTGA OGTCACACCG GGTCGTGTOC GTGAAGCACT CGATGAGOGC600

AASATCTGCA TTOTT3CTGG TITTCAGOTT OTTAAIAAAG AAAOCO3CGA TOTCACCACG660

TTO3GTCGTG GT3JTTCTGA CACCACTGCA GTTGOTITGG CAGCTGCnT GAACGCTGAT720

GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACOG CTGACCCGCG CATCOTTOCT780

AÄTGCACAGA ACCľGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATOC TGGAACTTGC TCCTGTTGGC840

TCCAÄGATľT TOGTGCTGCG CACTGTTGAA TACGCÍCGIG CATTCAATOT GCCACTTOGC900

OTACGCTOGT CTTATAOTAA TGATOCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT960

CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA ÄGTOCGAÄGC CAÄAGTAACC1020

CTTCTCGGTA nTCOGATAA GCCAQGCGAG OTTOTCAAGG TTTTCCCTGC CTTGQCTGAT1080

GCAGAAAICA ACATIGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC1140

GACATCACOT TCACCTCCCC TCGCCCTGAC GGACGCCCTG CGATGGAGAT CTIGAAGAMJ1200

CTTCAGGTIC AGGGCAACTG GACCAATOTG CTTTACGÄCG ÄCCAGGTCGG CAAAGICTCC1260

CTCGTGGOTG CTGGCATGAA CTCTCACCCA GCTOTTACCG CAGAGTTCAT GGAAOTTCTG1320

CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATIGATT TCCACCTCTG ACATOCGCAT ITCCGTGCTG1380

ATOCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTOCTOCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTľ OCAGCTGGGC1440

GGCGŕAGACG AAGOCGTCOT¹ TTATGCAGGC ÄCCGGACGCT AAAGmTAA AGGAGTAGTT1500

TTACAATCAC CACCATOGCA GTTOTTGGfTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA1560

CCCTITTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTOTTCG TTTCTTOCT TCCCCGCGIT1620

CCQCAGGCCG TAAGATTGAA TTC1643

GAT

ATT

CCT

GTG

GAA

GAA

GCA

GTC

CTT

ACC

GGT

OTC

GCA

ACC

GAC

AAG

1002

ASp

íle

Pro

Val

Glu

Glu

Ala

Val

Leu

Thr

Gly

Val

Ala

mr

Asp

Lys

7.50

255

260

TCC

GAA

OTC

AAA

GTA

ACC

GIT

CTG

GGT

ATT

TCC

GAT

AAG

CCA

GGC

GAG

1050

Ser

Glu

Ala

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

íle

Ser

Asp

Lys

Pro

Gly

Glu

255

270

27!

GCT

GCC

AAG

GTT

TTC

CGT

GCG

TTG

GCT

GAT

GCA

GAA

ATC

AAC

ATT

GAC

1098

Ala

Ala

Lys

Val

Phe

Arg

Ala

ieu

Ala

Asp

Ala

Glu

íle

Asn

íle

Asp

280

285

290

ATG

GTT

CTG

CAG

AAC

OTC

TCC

TCT

GTG

GAA

GAC

GGC

ACC

ACC

GAC

ATC

1146

Mat

Val

Leu

Gin

Asn

Val

Ser

Ser

Val

Glu

Asp

Gly

Thr

Thr

Asp

íle

295

300

305

310

ACG

TTC

ACC

TGC

CCT

CGC

GCT

GAC

GGA

OGC

CGT

GCG

ATG

GAG

ATC

TTG

1194

Thr

Phe

Thr

Cys

Pro

Arg

Ala

Asp

Gly

Arg

Arg

Ala

Mat

Glu

Íle

Leu

315

320

32

5

AAG

AAG

CTT

CAG

GTT

CAG

GGC

AAC

TGG

ACC

AAT

CTG

CTT

TAC

GAC

GAC

1242

Lys

Lys

Leu

Gin

val

Gin

Gly

Asn

Trp

Thr

Asn

Val

Leu

Tyr

Asp

Asp

330

335

34

0

(2) Informácie o SEQ ID No: 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 1643 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: DNA (genómová) (iv) Anti-Sense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (ix) Znaky:

CAG

CTC

GGC

AAA

GTC

TCC

CTC

CTG

GCT

GCT

OGC

ATG

AAG

TCT

CAC

CCA

Gin

Val

Gly

Lys

Val

Ser

Lea

Val

Gly

Ala

Gly

Met

Lys

Ser

His

Pro

345

350

35!

GGT

CTT

ACC

GCA

GAG

TTC

ATC

GAA

GCT

CTC

CGC

GAT

GTC

AAC

CTG

AAC

Gly

val

Thr

Ala

Glu

Phe

Met

G1U

Ala

Leu

Arg

Asp

Val

Asn

Val

Asn

360

365

370

ATC

GAA

TTG

ATT

tcc

ΛΧ

TCT

GAG

ATC

CGC

ATT

TCC

GTG

CTG

ATC

CCT

íle

Glu

Leu

íle

Ser

Thr

Ser

Glu

ne

Arg

íle

Ser

Val

Lau

íle

Arg

375

380

38!

390

GAA

GAT

GAT

CTC

GAT

GCT

GCT

GCA

CGT

GCA

TTG

CAT

GAG

CAG

TTC

CAG

Glu

Asp

Asp

Leu

Asp

Ala

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu

His

Glu

Gin

Pbe

Gin

395

400

405

CTG

GGC

GGC

GAA

GAC

GAA

GCC

OTC

GTT

TAT

GCA

G3C

ACC

GGA

OGC

TAA

Leu

Gly

Gly

Glu

Asp

Glu

Ala

Val

val

Tyr

Ala

Gly

Thr

Gly

Arg

410

41;

42

0

ÄGTTTTAAAG GÄGTAGmT ACAATGhCCA CCATCGCAGT TOTTOGTGCA ACCGGCCAGG TCGGCCAGGT TÄTOCGCÄCC CTľlTGGÄAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTOTTCOTT TCITrGCTTC CCOGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C (2) Informácie o SEQ ID No: 5:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 421 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 5:

1290

1338

1386

1434

1482

1542

1602

1643

Met

Ala

Leu

Val

Val

Gin

Lys

Tyr

Gly

Gly

Ser

Ser

Leu

Glu

Ser

Ala

1

5

10

15

G1U

Arg

íle

Arg

Asn

Val

Ala

Glu

Arg

íle

Val

Ala

Thr

Lys

Lys

Ala

20

25

3'

0

Gly

Asn

Asp

Val

Val

Val

Val

Cys

Ser

Ala

Met

Gly

Asp

Thr

Thr

Asp

35

40

4'

5

Glu

Leu

Leu

Glu

Leu

Ala

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Val

Pro

Pro

Ala

Arg

50

55

60

Glu

Met

ASp

Met

Leu

Leu

Thr

Ala

Gly

Glu

Arg

íle

Ser

Asn

Ala

Leu

65

70

75

80

Val

Ala

Met

Ala

íle

Glu

Ser

Leu

Gly

Ala

Glu

Ala

Gin

Ser

Phe

Thr

85

90

9

5

Gly

Ser

Gin

Ala

Gly

Val

Leu

Thr

Thr

Glu

Arg

HiS

Gly

Asn

Ala

Arg

100

105

11'

0

íle

val

Asp

Val

Thr

Pro

Gly

Arg

Val

Arg

Glu

Ala

Leu

ÄSp

GlU

Gly

115

120

12

5

Lys

íle

Cys

íle

Val

Ala

Gly

Phe

Gin

Gly

Val

Asn

Lys

Glu

Thr

Arg

130

135

140

Asp

Val

Thr

Thr

Leu

Gly

Arg

Gly

Gly

Ser

Asp

Thr

Thr

Ala

Val

Ala

145

150

155

160

Leu

Ala

Ala

Ala

Leu

Asn

Ala

Asp

Val

Cys

Glu

íle

Tyr

Ser

Asp

Val

165

170

17

5

Asp

Gly

Val

Tyr

Thr

Ala

Asp

Pro

Arg

íle

Val

Pro

Asn

Ala

Gin

Lys

180

1Θ5

19(

3

Leu

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

Glu

Glu

Met

Leu

Glu

Leu

Ala

Ala

Val

Gly

195

200

20i

5

Ser

Lys

íle

Leu

Val

Leu

Arg

Ser

Val

Glu

Tyr

Ala

Arg

Ala

Phe

Asn

210

215

220

Val

Pro

Leu

Arg

Val

Arg

Ser

Ser

Tyr

Ser

Asn

Asp

Pro

Gly

Thr

Leu

225

230

235

240

íle

Ala

Gly

Ser

Met

Glu

Asp

íle

Pro

Val

Glu

Glu

Ala

Val

Leu

Thr

245

250

25

5

Gly

Val

Ala

Ihr

ASp

Lys

Ser

Glu

Ala

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

íle

260 265 270

Ser Asp 1

Lys l

Pro

Gly

Glu

Ala

Ala

Lys

Val

Phe

t Arg Alí

a le

U Al

a Asp

275

280

21

B5

Ala

Glu

íle

Asn

íle

Asp

Met

val

Leu

Gin

Asn

Val

Ser

Ser

Val

Glu

290

295

300

Asp

Gly

Thr

Thr

Asp

íle

Thr

Fhe

Thr

Cys

Pro

Arg

Ala

Asp

GLy

Arg

305

310

315

320

Arg

Ala

Met

Glu

íle

Ieu

Lys

Lys

Leu

Gin

Val

Gin

Gly

Asn

Trp

Thr

325

330

33

5

Asn

Val

Leu

Tyr

Asp

Asp

Gin

Val

Gly

Lys

Val

Ser

Leu

Val

GLy

Ala

340

345

350

Gly

Met

Lys

Ser

His

Pro

Gly

Val

Thr

Ala

Glu

Phe

Met

Glu

Ala

Leu

355

360

36!

Axg

Asp

Val

Asn

Val

Asn

íle

Glu

Leu

íle

Ser

Thr

Ser

Glu

íle

Arg

370

375

380

íle

Ser

Val

Leu

íle

Arg

Glu

Asp

Asp

Leu

Asp

Ala

Ala

Ala

Arg

Ala

385

390

395

400

Leu

His

Glu

Gin

Phe

Gin

Leu

Gly

Gly

Glu

Asp

Glu

Ala

Val

Val

Tyr

405

410

41

5

Ala

Gly

Thr

Gly

Arg

420 (2) Informácie o SEQ ID No: 6:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 1643 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: DNA (genómová) (iv) Anti-Sense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Poloha: 964..1482 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 6:

TOGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTCTGTCTC TGTTTATTGG AACGCATCCĽ AGTGGCTGAG GCAGAAAGAA AAĽACTCCTC TGGCTAOGTA CTAACIGrCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC GOCGCTTOCT OGCITGAGAG TGCGGAACGC ACCAAGAM3G CTOGAAATGA TGTCGTGGTT GAACTTCTAG AACTK3CAQC GGCAOTGAAT CTCCTGACTG CTGCTGAGCG TATTTCTAÄC

ΑΑΑΤΑΪΤΑΑΑ TCGAATATCA ATATACGGTC 60

ACGCATCCGC TAAAGOCCCA GGAACOCTGT 120 GACACAGTTT ATAAASCTAG AGITGAGCGG 180 AĽAAAGGIGG CCCTGCTCGT ACAGAAATAT 240 ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGITOCC 300 GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 CCCGITCCGC CAGCTOSTGA AATGGATATG 420 GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGICCCTT 480

G3CGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTOCTG TGCTCACCAC CGAGOGCCAC540

GGAAÄCGCAC GCATTGTTGA COTCACKXG GGTCGTOTGC GTCAASCACT CGATGAGGGC600

AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTCTCAGGCT OTTAATAAAG AAAOCCGCGA TCTCACCACG660

TTGOGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTCCCTTOG CtóCTGCTTT GAACGCTGAT720

GTCTG7GAGA TITACTCGGA CGTTGÄCGGT OTOTATACCG CTSNXCCCG CATCGTTCCT780

AATOCACAGA AGCTCGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATOC TGGAACTTGC TGCTGITGGC840

TCCAAGATTT TCGTCCTGCG CACTCTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATOT GOCACTTCGC900

GTAOjCTCGT CTTATACTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTO CCGGCTCIAT GGAGGATATT960

CCT GTG GAA GAA GCA GTC CIT ACC GCT CTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA1008

Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu 15 1015

GCC

AAA

GTA

ACC

GTT

CTG

GCT

ATT

TCC

GAT

AAC

CCA

GGC

GAG

GCT GCC

1056

Ala

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

Íle

ser

Asp

lys

Pro

Gly

Glu

Ala Ala

20

25

30

AAG

GTT

TTC

CT

GCG

TTG

GCT

GAT

GCA

GAA

ATC

AAC

ATT

GAC

ATG GIT

1104

T.ys

Val

Wte

Arg

Ala

Leu

Ala

Asp

Ala

Glu

íle

Asn

íle

Asp

Met Val

35

40

41

CTG

CAG

AAC

GTC

TCC

TCT

GTG

GAA

GAC

GGC

ACC

ACC

GAC

ATC

ACG TTC

1152

Leu

Gin

Asn

Val

Ser

Ser

Val

Glu

Asp

Gly

Thr

Thr

Asp

íle

Thr pre

50

55

61

0

ACC

TCC

CCT

ccc

CCT

GAC

QGA

CGC

CGT

GCG

ATG

GAG

ATC

TTG

AAG AAG

1200

Thr

Cyg

Pro

Arg

Ala

Asp

Gly

Arg

Aig

Ala

Met

G1U

íle

Leu

Lys Lys

65

70

7!

5

CCT

CAG

GTT

CAG

GGC

AAC

TGG

ACC

AAT

GIG

CIT

TAC

GAC

GAC

CAG GIC

1248

Läj

Gin

Val

Gin

Gly

Asn

Trp

Thr

Asn

val

Leu

Tyr

Asp

Asp

Gin Val

80

85

90

95

GGC

AäA

CTC

TCC

CIC

GTG

GCT

GCT

GCC

ATG

AAG

TCT

CAC

CCA

GCT GIT

1296

Gly

Lys

Va.l

Sex

Leu

Val

Cly

Ala

Gly

tfet

Lys

Ser

Hl S

Pro

Gly Val

100

10!

110

ACC

GCA

GAG

CTC

ATC

GAA

GCT

CTG

CGC

GAT

CTC

AAC

CTG

AAC

ATC GAA

1344

Thr

Ala

Glu

Plť.

Met

Glu

Ala

Leu

Arg

ASp

Val

Asn

Val

Asn

íle Glu

115

120

125

TTG

ATT

TCC

ACC

TCT

GAG

ATC

CGC

ATT

TCC

GTC

CTC

ATC

C&T

GAA GAT

1392

Leu

íle

Ser

Thr

Ser

Clu

íle

Arg

íle

Ser

Val

Leu

íle

Ale

Glu Asp

130

135

140

GAT

CTG

GAT

GCT

GCT

GCA

CCT

GCA

TTG

CAT

GAG

CAG

TTC

CAG

CTG GGC

1440

Asp

teu

Asp

Ala

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu

H1S

Glu

Gin

Prie

Gin

Leu Gly

145

150

155

GGC

GAA

GAC

GAA

GCC

GTC

GIT

TAT

GCA

GGC

ACC

GGA

CGC

TAAAOTTTTAA

1490

Gly

Glu

Asp

Glu

Ale

Val

Val

Tyr

Ala

Gly

Thr

Cly

Axg

150 1ÍS 170

AGGAGrAGTT TTÄCAATGAC CACCATCGCA GTTCITGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 15SO GITATGCOCA CCCríTIGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGľlUG ΊΤΓΟΊΠΌσΐ 1610 TCCOCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 (2) Informácie o SEQ ID No: 7:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 172 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 7:

Met

Glu

Glu

Ala

Val

Leu

Thr

Gly

Val

Ala

Thr Asp

Lys

Ser

Glu

Ala

1

5

10

1

5

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

íle

Ser

Asp

Lys

Pro Gly

Glu

Ala

Ala

Lys

20

25

3

0

Val

Phe

Arg

Ala

Leu

Ala

Asp

Ala

Glu

íle

Asn íle

Asp

Met

Val

Leu

35

40

4!

5

Gin

Asn

Val

Ser

Ser

Val

Glu

Asp

Gly

Thr

Thr Asp

Tie

Thr

Phe

Thr

50

55

60

Cys

Pro

Arg

Ala

Asp

Gly

Arg

Arg

Ala

Met

Glu íle

Leu

Lys

Lys

Leu

65

70

75

81

Gin

Val

Gin

Gly

Asn

Trp

Thr

Asn

Val

Leu

Tyr Asp

Asp

Gin

Val

Gly

85

90

9

5

Lys

Val

Ser

Leu

Val

Gly

Ala

Gly

Met

Lys

Ser His

Pro

Gly

Val

Thr

100

105

lli

3

Ala

Glu

Pte

Met

Glu

Ala

Leu

Arg

Asp

Val

Asn Val

Asn

íle

Glu

Leu

115

120

125

íle

Ser

Thr

Ser

Glu

íle

Arg

íle

Set

Val

Leu íle

Axg

Glu

Asp

Asp

130

135

140

Leu

Asp

Ala

Ala

Ala

Arg

Ala

Leu

His

Glu

Gin Phe

Gin

Leu

Gly

Gly

145

150

155

160

Glu

Asp

Glu

Ala

Val

Val

Tyr

Ala

Gly

Thr

Gly Arg

165 170 (2) Informácie o SEQ ID No: 8:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „synthetic DNA“ (iv) Anti-Sense: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 8:

GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 23 (2) Informácie o SEQ ID No: 9:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (it) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „synthetic DNA“ (iv) Anti-Sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 9:

CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT 23 (2) Informácie o SEQ ID No: 10:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 2001 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: DNA (genómová) (iv) Anti-Sense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Poloha: 730..1473 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 10:

GGATCOOCAA TCGATAOCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATQC CTTGAATMT60

GACCTTGAGG AAGGAATCAC CAGOCATCIC AACTGGAAGA OľTGACGCCT OTGAATTGG120

ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG ITCGCTATTA CCGGCGMAT CAAAAACAAC180

TC3OCTGAAC GTTTCGTGCT CG0CAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CtSGAGTCACC240

AACTIGAGCC TCCTGCTICT GATCCATCGA C3GGGAÄCCC AACGGCGGCA AAGCAGTGGG300

OGAAGGGGAG TTGCTGGACT CTGAATCAOT GGGCTCTGAA OTGGTAGGCG ACGGGQCAGC360

ATCTGAA3GC GTGCGAGTTG TQGTGACCGG GTTAGCGCTT TCAGTTTCTG TCACAACT95420

AGCAGGACTA GCAGAGGTTG TA90ČCTTGA GC33CTCCCA TCACAAGCAC TTÄAAAGľAA480

AGAGGCGGAA ACCACAAGCG CCAACGAACT ACCTGO3GAA CQQQO37IGA AQS3CAAC1T540

AM3TCTCATK TCTCAAACAT AGTTCCACCT OTGTCMTAA TCTCCAGAAC GGAACAAACT600

GATGAACAAT COTTAACAAC ACAGACCAAA ACGCTCAGTT AGGTATGGÄT ATCAGCACCT660

TCTGAATGOS TACGTCTAGA CTOGTGGGCG TCTGAAAAAC TCTTCGCCCC ACGAAAATGA720

AGGAOCATA ATG GGA ATC Μβ GTT GGC GTT CTC GGA GCC AAA GGC CGT 768

Met Gly Ilô Lys Val S.

Ly V;

»1 Isu c.

Ly Ala Lys £

ly Arg

1

5

10

GTT

GGT

CAA

ACT

ATC

CTG

GCA

GCA

GTC

AAT

GAG

TCC

GAC

GAT

CTG

GAG

816

Val

Gly

Gin.

Thr

íle

Val

Ala

Ala

val

AST.

Glu

Ser

Asp

Asp

Leu

Glu

15

20

2S

CTT

CTT

GCA

GAG

ATC

GGC

GTC

GAC

GAT

GAT

TTG

AGC

CTT

CTG

GTA

GAC

864

[ÄU

Val

Ala

Glu

íle

Gly

Val

Asp

Asp

Asp

Leu

Ser

Leu

Leu

Val

Asp

30

35

40

45

AAC

GGC

GCT

GAA

CTT

GTC

CTT

GAC

TTC

ACC

ACT

CCT

AAC

GCT

GTG

ATG

912

Asn

Gly

Ala

Glu

Val

Val

Val

Asp

Phe

Ihr

Thr

Pro

Asn

Ala

Val

Met

50

55

60

GGC

AAC

CTG

GM3

TCC

TG?

ATC

AAC

AAC

GGC

ATT

TCT

GCC

GTC

GTT

GGA

960

Gly

Asn

Leu

G1U

Fte

Cys

íle

Asn

Asn

Gly

íle

Ser

Ala

Val

Val

Gly

65

70

7'

5

ACC

ACG

GGC

TTC

GAT

CAT

GCT

CGT

TTG

GAG

CAG

GTT

CGC

GCC

TGG

CTT

1008

Thr

Thr

Gly

Phe

Asp

Asp

Ala

Arg

leu

Glu

Gin

val

Arg

Ala

Trp

Leu

80

85

9i

0

GAA

GSA

AAA

GAC

AAT

CTC

GGT

CTT

CIC

ATC

GCA

CCT

AAC

TTT

GCT

ATC

1056

Glu

Gly

Lye

Asp

Asn

Val

Gly

Val

Leu

íle

Ala

Pro

Asn

Phe

Ala

íle

95

100

10!

TCT

GCG

GTG

TTG

ACC

ATG

GTC

TTT

TCC

AAG

CAG

GCT

GCC

CGC

TTC

TTC

1104

Ser

Ala

val

Leu

Thr

Met

val

Phe

ser

Lys

Gin

Ala

Ala

Arg

Pne

Pha

no

115

120

125

GAA

TCA

GCT

GAA

CTT

ATT

GAG

CTG

CAC

CAC

CCC

AAC

AAC

CTC

GAT

GCA

1152

Glu

Ser

Ala

Glu

Val

íle

Glu

Leu

His

His

Pro

Asn

Lys

Leu

Asp

Ala

130

135

14

0

CCT

TCA

GGC

A0C

GCG

ATC

CAC

ACT

GCT

CAG

GGC

ATT

GCT

GCG

GCA

CGC

1200

Pro

Sar

Gly

Thr

Ala

íle

ms

Thr

Ala

Gin

Gly

íle

Ala

Ala

Ala

Arg

145

150

15

5

AAA

GAA

GCA

GGC

ATG

GAC

OCA

CAG

CCA

GAT

GCG

ACC

GAG

CAG

GCA

CTT

1248

Lys

Glu

Ala

Gly

Met

Asp

Ala

Gin

Pro

ASp

Ala

Thr

Glu

Gin

Ma

Ieu

160

165

17'

0

GAG

GGT

TCC

CCT

GGC

GCA

AGC

GTA

GAT

GGA

ATC

CCA

CTT

CAC

GCA

GTC

1296

Glu

Gly

Ser

Arg

Gly

Ala

Ser

Val

Asp

Gly

íle

Pro

Val

His

Ala

Val

175

180

18!

CGC

ATG

TCC

GGC

ATG

GTT

GCT

CAC

GAG

CAA

CTT

ATC

TT?

GGC

ACC

CAG

1344

Arg

Mat

Ser

Gly

ttet

Val

Ala

His

Glu

Gin

Val

íle

Ehe

Gly

Thr

Gin

190

195

200

205

GGT

CAG

ACC

TTG

ACC

ATC

AAG

CAG

GAC

TCC

TAT

CAT

CGC

AAC

TCA

TCT

1392

Gly

Gin

Thr

Leu

Thr

íle

Lys

Gin

Asp

Ser

Tyr

Asp

Arg

Asn

Ser

Phe

210 215 220

GCA OCA GCT GTC TTG GTG GCT GTC CGC AAC ATT GCA CAG CAC OCA GGC1440

Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn íle Ala Gin His PreGly

225 230235

CTA GTC GTA GGA CTI GAG CAT TAC CTA GGC CTG TAAAQGCICA TTTCAGCAGC1493

Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr leu GlyLeu

240245

GGGTOGAATT TTtTAAAAGG AGOGTTTAAA GGACTTGATä GCGTGCACTT CTTTTACTCC TGN3GGCGCG GAAGCACTCG TCGACTTTGC GCCGAACCCT CGAACTGCrr CCAATGCTGC CACTGCTITG CTTGAGCÄTG CCAATGCCAC GACCCATGAA TTOOT00GAC A00GXATTT GCACAGCCGA GAATCGGAAG TAGT3OTGCC TGAACTITIO ATGCACCCCA TGRATGAGTC

GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG

GOCTGTGGCC GANCAÄGTTA AATTOAGCGT 1553 ACCCGCTGAT GTTOAGTGGT CAACIGATGT 1613 GGOTCGTGCC TGCTACGAAA CCTTTGATAA 1673 GTATCTGCGC CACATCATOG AAGTGGGGCA 1733 GMCTATATC CGAGGCATTT CTCGGTCCGC 1793 TTOTnCTCT CAACTCTCTC AGCGITTCGT 1853 CACTCTCATC GATGAAGATC CGCACTTGCG 1913 TCGOTTOGCT TTCAATGAGC TOCTTAATGC 1973

2001 (2) Informácie o SEQ ID No: 11:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 248 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 11:

Met

Gly

íle

Lys

Val

Gly

Val

Leu

Gly

Ala

Lys

Gly

Arg

Val

Gly

Gin

1

5

L0

1

5

Thr

íle

Val

Ala

Ala

val

Asn

Glu

Ser

Asp

Asp

Leu

Glu

Leu

Val

Ala

20

25

3

0

Glu

íle

Gly

Val

Asp

Asp

Asp

Leu

Ser

Leu

Leu

Val

Asp

Asn

Gly

Ala

35

40

4!

Glu

Val

val

Val

Asp

Phe

Thr

Thr

Pro

Asn

Ala

Val

t-fet

Gly

Asn

Leu

50

55

60

Glu

Phe

Cys

íle

Asn

Asn

Gly

íle

Ser

Ala

Val

Val

Gly

Thr

Thr

Gly

65

70

7!

j

80

Phe

Asp

Asp

Ala

Arg

Leu

Glu

Gin

Val

Arg

Ala

Trp

Leu

Glu

Gly

Lys

85

90

9

5

Asp

Asn

val

Gly

Val

Leu

íle

Ala

Pro

Asn

Phe

Ala

íle

Ser

Ala

Val

100

105

lli

0

Leu

Thr

Met

Val

Pte

Ser

Lys

Gin

Ala

Ala

Arg

Phe

Phe

Glu

Ser

Ala

115

120

12!

Glu

Val

íle

Glu

Leu

His

His

Pro

Asn

Lys

Leu

Asp

Ala

Pro

Ser

Gly

130

135

140

Thr

Ala

íle

His

Thr

Ala

Gin

Gly

íle

Ala

Ala

Ala

Arg

Lys

Glu

Ala

1« 150 155 160

Gly Met Asp Ala Gin Pro Asp Ala Thr Glu Gin Ala Leu Glu Gly Ser

165 170 175

Arg

Gly

Ala

Ser

Val

Asp

Gly

íle

Pro

Val

His

Ala

Val Arg

Met

Ser

180

185

190

Gly

Met

Val

Ala

His

Glu

Gin

Val

íle

Phe

Gly

Thr

Gin Gly

Gin

Thr

195

200

205

Leu

Thr

íle

Lys

Gin

Asp

Ser

Tyr

Asp

Arg

Asn

Ser

Phe Ala

Pro

Gly

210

215

220

Val

Leu

Val

Gly

Val

Arg

Asn

íle

Ala

Gin

His

Pro

Gly Leu

Val

Val

225

230

235

240

Gly

Leu

Glu

HiS

Tyr

Leu

Gly

Leu

245 (2) Informácie o SEQ ID No: 12:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „synthetic DNA“ (iv) Anti-Sense: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 12:

GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC 23 (2) Informácie o SEQ ID No: 13:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „synthetic DNA“ (iv) Anti-Sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 13:

GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG 23 (2) Informácie o SEQ ID No: 14:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 1411 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: DNA (genómová) (iv) Anti-Sense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Poloha: 311..1213 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 14:

CTCTCGATAT ĽGAGAGAGAA GCAGCGCCAC GGTITTTCOG TCATCVTCAG ATTCAAACTT60

TQXAGMXG ATCGCäääTO GCAACAAGCC CGTATTľCAT GGACTTmA CGCAAAGCTC120

ACACCCACGA GCTAAAAATT CATATAGITA AGACAACATľ TTT3GCTCTA AAAGACAQCC180

CTAAAAACCT CTTCCTCATG TCAATTGTTC TTATCGGAAT CTG3CITCGG CGA1TCTTAT240

GCAÄAAGfrTG TrAOGTTTTT TGCGGQGTTG TTTAACCCCC ÄAATGÄCGGA AGAAGGTAAC300

CTTGAACTCT ATC AGC ACA GGT TTA ACA GCT AAG ACC GGA GTA GAG CAC349 tet Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His

1510

CTC

ggc

ACC

GTT

GGA

GTA

GCA

ATG

GTT

ACT

CCA

CTC

ACT

GAA

rcc

GGA

397

Pte

Gly

Thr

Val

Gly

Val

Ala

Met

Val

Thr

Pro

Ftoô

Thr

Glu

Ser

Gly

15

20

25

GAC

ATC

GAT

ATC

GCT

GCT

GGC

CGC

GAA

GTC

GCG

GCT

TAT

TTG

OTT

GAT

445

Asp

íle

Asp

íle

Ala

Ala

Gly

Arg

Glu

Val

Ala

Ala

Tyr

Leu

Val

Asp

30

35

40

4=

AAG

GGC

CTG

GAT

TCT

TTG

GTT

CTC

GCG

GGC

ACC

ACT

GGT

GAA

TCC

CCA

493

Lys

Gly

1«U

Asp

Ser

Leu

Val

Leu

Ala

Gly

Thr

Thr

Gly

Glu

Ser

Pre

50

55

60

ACG

ACA

ACC

GCC

GCT

GAA

AAA

CTA

GAA

CTG

CTC

AAG

GCC

GIT

CGT

GAG

541

Thr

Ihr

Thr

Ala

Ala

Glu

Lys

teu

Glu

Leu

Leu

Lys

Ala

Val

Arg

Glu

70 75

GAA

GTT

GGG

GAT

CGG

GCG

AAC

GTC

ATC

GCC

GGT

GTC

GGA

ACC

AAC

AAC

589

Glu

Val

Gly

Asp

Arg

Ala

Asn

Val

íle

Ala

Gly

Val

Gly

Thr

Asn

Asn

80

85

90

ACG

CGG

ACA

TCT

GTC

GAA

CTT

GCG

GAA

GCT

GCT

CTT

TCT

GCT

GGC

OCA

637

Thr

Arg

Thr

Ser

Val

Glu

Teu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Ser

Ala

Gly

Ala

95

100

105

GAC

GGC

CTT

TTA

GTT

GTA

ACT

CCT

TAT

TAC

TCC

AAG

CCG

AGC

CAA

GAG

685

Asp

Gly

Leu

teu

Val

Val

Thr

Pro

Tyr

Tyr

Sex

Lys

Pro

Ser

Gin

Glu

110

115

120

125

GGA

rro

CTG

GCG

CAC

CTC

QGT

GCA

ATT

GCT

GCA

GCA

ACA

GAG

GIT

CCA

733

Gly

Leu

Leu

Ala

His

Phe

Gly

Ala

íle

Ala

Ala

Ala

Tltr

Glu

Val

Pro

130

135

14

0

ATT

TGT

CTC

TAT

GAC

ATT

CCT

GGT

CGG

TCA

GGT

ATT

CCA

ATT

CAG

TCT

781

íle

Cys

Leu

Τγτ

Asp

íle

Pro

Gly

Arg

Ser

Gly

íle

Pro

íle

Glu

Ser

145

150

15

5

GAT

ACC

ATG

AGA

CGC

CTC

AGT

GAA

TTA

OCT

ACG

ATT

TTG

GCG

GTC

AAG

829

Asp

Thr

Met

Arg

Arg

teu

Ser

Glu

teu

Pro

Thr

íle

Leu

Ala

Val

Lys

160 165 170

GAC

GCC

AAG

GGT

GAC CTC

GTT

GCA

GTC

ACG

TCA

TTG

ATC

AAA

GAA

ACG

377

Asp

Ala

Lys

Gly

Asp teu

Val

Ala

Ala

Thr

Ser

teu

íle

Lys

Glu

Thr

175

180

18!

5

GGA

CTT

GCC

TGG

ΤΛΓ TCA

GGC

GAT

GAC

CCA

CTA

AAC

CTT

GIT

TGG

CTT

925

Gly

Leu

Ala

Trp

Tyr Ser

Gly

Asp

Asp

Pro

Leu

Asn

teu

Val

Trp

Leu

190

195

200

205

GCT

TTG

GGC

GGA

TCA GGT

TIC

ATT

TCC

GTA

ATT

GGA

CAT

GCA

GCC

coc

973

Ala

Leu

Gly

Gly

Ser Gly

Fbe

íle

Ser

Val

íle

Gly

His

Ala

Ala

Pro

2.10

215

22

0

ACA

GCA

TTA

CGT

GAG TTG

TAC

ACA

AGC

TTC

GAG

GAA

GGC

GAC

CTC

OTC

1021

Thr

Ala

Leu

Arg

Glu Leu

Týr

Thr

Ser

Phe

Glu

Glu

Gly

Asp

Leu

val

22S

230

23!

CGT

GCG

CGG

Caa

ATC AAC

GCC

AAA

CTA

TCA

COG

CTG

GTA

GCT

GCC

CAA

1069

Arg

Ala

Arg

Glu

íle Asn

Ala

Lys

Leu

Ser

Pro

teu

Val

Ala

Ala

Gin

240

245

250

cct

GGC

TTG

GGT

GGA GTC

AGC

TTG

GCA

AAA

GCT

GCT

CTC

CGT

CTG

CAG

1117

Gly

Arg

Leu

Gly

Gly Val

Ser

Leu

Ala

Lys

Ala

Ala

teu

Arg

Leu

Gin

255

260

265

CGC

ATC

AAC

GTA

GGA GAT

CCT

CGA

CTT

CCA

ATT

ATG

GCT

OCA

AAT

GAG

1165

Gly

íle

Asn

Val

Gly Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

íle

Met

Ala

Pro

Asn

Glu

270

275

280

285

CAG

GAA

CTT

GAG

GCT CTC

CGA

GAA

GAC

ATG

AAA

AAA

GCT

GGA

OTT

CTA

1213

Gin

GlU

LQU

Glu

Ala Leu

Arg

Glu

Asp

Met

Lys

Lys

Ala

Gly

Val

Leu

290 295 300

TAAATATGAA TGATTCCCGA AATCGCGGCC GGAAGOTTAC CCGCAAOGCG GCCCACCAGA 1273 AGCTQGTCAG GAAAACCATC TOGATACCCC TCTCITICAG GCAOCAGATG CFICCTCľAA 1333 CCAGAGCGCT GTAAAAGCTG AGACCGCCGG AAACGACAAT CGOGATQCTG CGCAAGGTGC 1393 TCAAGGATCC CAACATTC 141 (2) Informácie o SEQ ID No: 15:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 301 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 15:

hfet

Ser

Tlir

Gly

Leu

Thr

Ala

Lys

Thr

Gly

Val

Glu

His Pta

Gly

Thr

1

5

10

1!

5

Val

Gly

Val

Ala

Met

Val

Thr

Pro

phe

Thr

Glu

Ser

Gly Asp

Ι1Θ

Asp

20

25

3<

3

íle

Ala

Ala

Gly

Arg

Glu

Val

Ala

Ala

Tyr

Leu

val

Asp Lys

Gly

teu

35

40

45

Asp

Sor

Leu

Val

Teu

Ala

Gly

Thr

Thr

Gly

Glu

Ser

Pro Thr

Thr

Thr

50

55

60

Ala

Ala

Glu

Lya

Leu

Glu

Leu

Leu

Lys'

Ala

Val

Arg

Glu Glu

Val

Gly

65

70

75

80

Asp

Arg

Ala

Asn

Val

íle

Ala

Gly

Val

Gly

Thr

Asn

Asn Thr

Arg

Thr

85

90

9

5

Ser

Val

Glu

Leu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Ser

Ala

Gly

Ala Asp

Gly

Leu

100

105

llí

3

Leu

Val

Val

Thr

Pro

Tyr

Tyr

Ser

Lya

Pro

Ser

Gin

Glu Gly

Leu

teu

115

120

125

Ala

His

Phe

Gly

Ala

íle

Ala

Ala

Ala

Thr

Glu

Val

Pro íle

Cys

Teu

130

135

140

Tyr

Asp

íle

Pro

Gly

Arg

Ser

Gly

íle

Pro

íle

Glu

Ser Asp

Thr

Met

145

150

155

160

Arg

Arg

Leu

Sex

Glu

Leu

Pro

Thr

íle

Leu

Ala

val

Lys Asp

Ala

Lys

165

170

17

5

Gly

Asp

Leu

Val

Ala

Ala

Thr

Ser

teu

íle

Lys

Glu

Thr GLy

Leu

Ala

180

185

190

Tip

Tyr

Ser

Gly

Aap

Asp

Pro

Leu

Asn

Leu

Val

Trp

Leu Ala

teu

Gly

195

200

205

Gly

Ser

Gly

Phe

íle

Ser

Val

íle

Gly

His

Ala

Ala

Pro Thr

Ala

Leu

210

215

220

Arg

Glu

Leu

Tyr

Thr

Ser

Plte

Glu

G1U

Gly

Asp

Leu

Val Arg

Ala

Arg

225

230

235

240

Glu

íle

Asn

Ala

Lys

Leu

Ser

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Gin Gly

Arg

Leu

24S 250 255

Gly Gly val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gin Gly Πβ Asn

260 265270

Val Gly Asp Pro Arg Teu Pro íle Met Ala Pro Asn Glu GLn GLu Leu

275 280285

Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu

290 295300 (2) Informácie o SEQ ID No: 16:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „synthetic DNA“ (iv) Anti-Sense: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 16:

GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG 23 (2) Informácie o SEQ ID No: 17:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „synthetic DNA“ (iv) Anti-Sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 17:

CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA 23 (2) Informácie o SEQ ID No: 18:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 3579 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť; dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: DNA (genómová) (iv) Anti-Sense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Poloha: 533..2182 (ix) Znaky (A) Názov/kľúč: CDS (B) Poloha: 2 188..3522

SK 285013 Β6 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 18:

GTO3AGCCGA CCA7TO3GCG ACGCIGCACT GCAA3OGGT CSTAUrms GTACATCGCT60

OGSXAOT TCATGGATTC GCTQCCGAAG AAGCľATAGG CATCtJCACCA GOGCCACCGA120

GITAXGAAG ATXTCCCGT GCT1T1U3CC TTGGGCAGGG ACCTIGACAA AGCCCACGCT180

GÄTATCfiCCA AGTCAQOGAT CÄGAATAGTG CATOQG3ACG TOGATGCTGC CACAITCAGC240

GGAGGCAATA TCTAOCTGAG GIQXCATIC TTCCCAGCOQ ATGTTTTCTT GCOCTOCTOC300

AGTGGKATT GATACCAAAA A03JGCTAAG OGCAOTCGAG GCGGCAAGAA CTOCTACTAC360 ccrrmAtr ctxawxoq gcattmx»c tccakmícg -nroľmu gggicagtta420

COOCAÄAAAG CATATACAGA GACCAATGAT ΤΤΓΓΟΜΤΑΑ AAAQGCAÚGG AT7TOTTATA400

AGTATOGCTC GTA1TCTOTG CGACGGGTCT ACCTOGGCTA GAAmciCC CC ATG535

Met

ACA

CCA

GCT

GAT

CTC

GCA

TTG

NT?

AAA

GAG

ACC

GCG

GTA

GAG

GTT

583

Thr

Pro

Ala

Asp

Leu

Ala

Thr

Leu

He

Lys

Glu

Thr

Ala

Val

Glu

Val

5

10

1

5

TTG

ACC

TCC

CGC

GAG

CTC

GAT

ACT

TCT

GTT

CTT

CCG

GAG

CAG

GTA

σττ

631

Leu

Thr

Ser

Arg

Glu

reu

Asp

Thr

ser

val

Leu

Pra

Glu

Gin

va

val

20

25

3'

GTG

GAG

OST

CCG

CGT

AAC

CCA

GAG

CAC

ooc

GAT

TAC

QCC

ACC

AAC

ATT

679

Val

Glu

Arg

Pro

Arg

Aan

Pro

Glu

His

Gly

Asp

Tyr

Ala

Thr

Asn

Íle

35

40

45

GCA

TTG

CAG

CTG

GCT

AAA

AAG

GTC

GGT

CAG

AAC

CCT

CGG

GAT

TTC

GCT

727

Ala

Leu

Gin

Val

Ala

Lys

Lys

Val

Gly

Gin

Asn

Pro

Arg

Asp

Leu

Ala

50

55

60

65

ACC

TGG

CTG

GCA

GAG

GCA

TTC

GCT

OCA

GAT

GAC

CCC

ATT

GAT

TCT

GGT

775

itír

Trp

Leu

Ala

GlU

Ala

Leu.

Ala

Ala

Asp

ASp

Ala

íle

Asp

Ser

Ala

70

75

B

0

GAA

ATT

GCT

GGC

CCA

GGC

TTT

TTG

AAC

ATT

CGC

CTT

GCT

GCA

GCA

GCA

823

Glu

íle

Ala

Gly

Pro

Gly

Pts

Ten

Asn

Ila

Arg

Leu

Ala

Ala

Ala

Ala

85

90

9!

5

CAG

GCT

GAA

ΑΤΓ

OT3

GCC

AAG

ATT

CTG

GCA

CAG

GGC

GAG

ACT

TTC

GGA

871

Gin

Gly

Glu

íle

Val

Ala

Lys

íle

Leu

Ala

Gin

Gly

Glu

Thr

Phe

Gly

100

105

110

AAC

TCC

GAT

CAC

(CTT

toč

CAC

TTG

GAC

GTG

AAC

CTC

GAG

TTC

GTT

TCT

919

Asn

Ser

ASp

HiS

Leu

Ser

His

Leu

Asp

Val

Asn

Leu

Glu

Phe

Val

Ser

115

120

125

GCA

AAC

CCA

ACC

GGA

CCT

ATT

CAC

crr

GGC

GGA

ACC

CGC

TGG

GCT

GCC

967

Ala

Asn

Pro

Thr

Gly

Pro

íle

His

leu

Gly

Gly

Thr

Arg

Trp

Ala

Ala

130

135

140

145

CTG

GCT

GAC

TCT

TTG

GGT

CGT

GTG

CTG

GAG

GCT

TCC

GGC

GCG

AAA

CTG

1015

Val

Gly

Asp

Ser

Leu

Gly

Arg

val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Ala

Lys

Val

150

155

161

0

ACC

CGC

GAA

TAC

TAC

TTC

AAC

GAT

CAC

GCT

CGC

CAG

ATC

GAT

CGT

TTC

1063

Thr

Arg

Glu

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Asp

His

Gly

Arg

Gin

110

Asp

Arg

Phe

165

170

17!

GCT

TTG

TCC

CTT

CIT

GCA

GCG

GCG

AAG

GGC

GAG

CCA

ACG

CCA

GAA

GAC

1111

Ala

Leu

Ser

Leu

Leu

Ala

Ala

Ala

Lys

Gly

Glu

Pro

Thr

Pro

Glu

Asp

130

185

19(

3

GGT

TAT

GGC

GGC

GAA

TAC

ATT

AAG

GAA

ATT

GCG

GAG

GCA

ATC

GTC

GAA

1159

Gly

Tyr

Gly

Gly

Glu

Tyr

íle

Lys

Glu

ne

Ala

Glu

Ala

110

Val

Glu

195

200

20!

AAG

CAT

CCT

GAA

GCG

TTG

GCT

TTG

GAG

CCT

GCC

GCA

ACC

CAG

GAG

CTT

1207

Lys

H1S

Pro

Glu

Ala

Letí

Ala

Leu

Glu

Pro

Ala

Ala

Thr

Gin

Glu

Leu

210

215

220

225

TTC

CGC

GCT

GAA

GGC

CTG

GAG

ATG

ATG

TTC

GAG

CAC

ATC

AAA

TCT

TCC

1255

Re

Arg

Ala

Glu

Gly

Val

Glu

Met

Met

Phe

Glu

H1S

íle

Lys

Sex

Ser

23D

23í

24

0

CTC

CAT

GAG

TTC

GGC

ACC

GAT

TTC

GAT

GTC

TAC

TAC

CAC

GAG

AAC

TCC

1303

Leu

His

Glu

Phe

Gly

Thr

Asp

Phe

Asp

Val

Tyr

Tyr

His

GLu

Asn

Ser

245

250

25

5

CTG

TTC

GAG

TCC

GGT

GCG

CTG

GAC

AAG

GCC

GTO

CAG

CTG

CTG

AAG

GAC

1351

Leu

Phe

Glu

Ser

Gly

Ala

VaL

Asp

Lys

Ala

Val

Gin

Val

Leu

Lys

Asp

260

265

27i

0

AAC

GGC

AAC

CTG

TAC

GAA

AAC

GAG

GGC

GCT

TCG

TCG

CTG

CGT

TCC

ACC

1399

Asn

Gly

Asn

Leu

Tyr

Glu

Asn

Glu

Gly

Ala

Trp

Trp

Leu

Axg

Ser

Thr

GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TOC 2167

Ala

Thr

Arg

Gin

Thr Leu

Ala

Asn

Ala

Leu His Leu

Val

Gly

Val

Ser

530

535

540

545

GCA

CCG

GAG

AAG

ATG TANCA ATC GCT ACA CTT GAA AAT TTC AAT GAA

2214

Ala

Pro

Glu

Lys

Met

Met Ala Thr Val Glu Asn Pl

ie Asn Glu

550

1

S

CTT

CCC

GCA

CAC

GTA TGG

CCA

CGC

AAT

GCC CTG CGC

CAA

GAA

GAC

GGC

2262

Leu

Pro

Ala

His

Val Trp

Pro

Arg

Asn

Ala Val Arg

Gin

Glu

Asp

Gly

10

15

20

25

GTT

GTC

ACC

GTC

GCT GGT

GTG

CCT

CTG

CCT GAC CTC

GCT

GAA

GAA

TAC

2310

Val

val

Thr

Val

Ala Gly

val

Pro

Leu

Pro Asp Leu

Ala

Glu

Glu

Tyr

30

35

40

GGA

ACC

CCA

CTG

TTC GTA

GTC

GAC

GAG

GAC GAT TTC

CGT

TCC

αχ

TOT

2358

Gly

Thr

Pro

Leu

Phe Val

Val

Asp

Glu

Asp Asp Fhe

Arg

Ser

Arg

cys

45

50

5

5

CGC

GAC

ATG

GCT

ACC GCA

TTC

GOT

GGA

OCA GGC AAT

GTC

CAC

TAC

GCA

2406

Arg

ASp

Met

Ala

Thr Ala

Phe

Gly

Gly

Pro Gly Asn

Val

His

Tyr

Ala

60

65

71

j

TCT

AAA

GCG

TTC

CTG ACC

AAG

ACC

ATT

GCA CGT TCG

GTT

GAT

GAA

GAG

2454

Ser

Lys

Ala

leu Thr

Lys

Thr

Ue

Ala Arg Trp

Val

Asp

Glu

Glu

75

80

8!

GGG

CTC

GCA

CTC

GAC ATT

GCA

TCC

ATC

AAC GAA CTG

GGC

ATT

GCC

CTG

2502

Gly

Leu

Ala

Leu

Asp íle

Ala

Ser

íle

Asn Glu Leu

Gly

íle

Ala

Leu

90

95

100

105

GCC

GCT

GCT

TTC

CCC GCC

AGC

CGT

ATC

ACC GCG CAC

GCC

AAC

AAC

AAA

2550

Kla

Ala

Gly

Phe

Pro Ala

Ser

Arg

íle

Thr Ala His

Gly

Asn

Asn

Lys

110

115

120

GGC

OTA

GAG

TTC

CTG CGC

GCG

TTG

GTT

CAA AAC GCT

CTG

GGA

CAC

GTG

2598

Gly

Val

Glu

Phe

Leu Arg

Ala

Leu

Val

Gin Asn Gly

Val

Gly

His

Val

125

130

13!

5

CTG

CTC

GAC

TCC

GCA CAG

GAA

CTA

GAA

CTG TTO GAT

TAC

CTT

GCC

GCT

2646

Val

Leu

Asp

Ser

Ala Gin

Glu

Leu

Glu

leu Leu Asp

Tyr

Val

Ala

Ala

140

145

150

GGT

GAA

GGC

AAG

ATT CAG

GAC

GTC

TIG

ATC CGC GTA

AAG

OCA

GGC

ATC

2694

Gly

Glu

Gly

Lys

íle Gin

Asp

Val

Leu

íle Arg Val

Lys

Pro

Gly

Íle

155

160

165

GAA

OCA

CAC

ACC

CAC GAG

TTC

ATC

GCC

ACT AGC CAC

GAA

GAC

CAG

AAG

2742

Glu

Ala

His

Tttr

His Glu

Pte

íle

Ala

Thr Ser His

Glu

Asp

Gin

Lys

170

175

180

185

TTC

GGA

TTC

TCC

CTG GCA

TCC

GGT

TCC

GCA TTC GAA

GCA

GCA

AAA

GCC

2790

Pta

Gly

Phe

Ser

Leu Ala

Ser

Gly

Ser

Ala Phe Glu

Ala

Ala

Lys

Ala

190

195

200

GCC

AAC

AAC

GCA

GAA AAC

CTG

AAC

CTG

CTT GGC CTG

CAC

TGC

CAC

GTT

2338

Ala

Asn

Asn

Ala

Glu Asn

Leu

Asn

Leu

Val Gly Leu

His

Cys

H1S

Val

205

21(

3

21

5

2886

2934

2982

3030

2.75

280

285

GAA

rrc

GGC

GAT

GAC

AAA

GAC

CGC

CTG

GTG

ATC

AAG

TCT

GAC

GGC

GAC

1447

Glu

Fťe

Gly

Asp

Asp

Lys

Asp

Arg

Val

Val

íle

Lys

Ser

Asp

Gly

Asp

290

295

300

305

GCA

GCC

TAC

ATC

GCT

GX

GAT

ATC

GCG

TAC

CTG

GCT

GAT

AAG

TTC

TCC

1495

Ala

Ala

Tyr

íle

Ala

Gly

Asp

íle

Ala

Tyr

Val

Ala

Asp

Lys

Phe

Ser

310

315

32

D

CGC

GGA

CAC

AAC

CTA

AAC

ATC

TAC

ATG

TTG

GCT

GCT

GAC

CAC

CAT

GGT

1543

Arg

Gly

lUs

Asn

Leu

Asn

tie

Tyr

Met

leu

Gly

Ala

Asp

His

Hia

Gly

325

330

33!

TAC

ATC

GCG

CGC

CTG

AAG

OCA

GCG

GOG

GCG

GCA

CIT

GGC

TAC

AAG

CCA

1591

Tyr

íle

Ala

Arg

Leu

LyB

Ala

A1B

Ala

Ala

Ala

Leu

Gly

Tyr

Lys

Pro

340

345

3S0

GAA

GGC

CTT

GAA

GTC

CTG

ATT

<XX

CAG

ATG

CTG

AAC

CTG

CTT

CGC

GAC

1639

Glu

Gly

Val

Glu

val

Leu

íle

Gly

Gin

•tet

Val

Asn

Leu

Leu

Arg

Asp

355

360

365

GGC

AAG

GCA

GTC

CGT

ATC

TCC

AAG

CCT

GCA

GGC

AX

GTG

CTC

ACC

CTA

1687

Gly

Lys

Ala

Vel

Arg

hfet

Ser

Lys

Arg

Ala

Gly

Thr

Val

Val

ihr

Leu

370

375

380

305

GAT

GAC

CTC

GTT

GAA

GCA

ATC

GGC

ATC

GAT

GCG

GCG

car

TAC

TCC

CTC

1735

Asp

Asp

Leu

VaL

Glu

Ala

ila

Gly

íle

Asp

Ala

Ala

Arg

Tyr

Ser

Leu

390

395

400

ATC

CCT

TCC

TCC

GTC

GAT

TCT

TCC

CTG

GAT

ATC

GAT

CTC

GGC

CTG

TGG

1783

íle

Arg

Ser

Ser

Val

Asp

Ser

Sar

Leu

Asp

íle

Asp

Leu

Gly

Leu

Trp

405

410

41

5

GAA

TCC

CAG

TCC

TCC

GAC

AAC

CCT

GTC

TAC

TAC

GTG

CAG

TAC

GGA

CAC

1831

Glu

Ser

Gin

Ser

Ser

Asp

Asn

Pro

Val

Tyr

Tyr

Val

Gin

Tyr

Gly

His

420

425

43

3

GCT

CGT

CTC

TCC

TCC

ATC

<303

CGC

AAG

GCA

GAG

ACC

TTG

UJT

CTC

ACC

1879

Ala

Arg

Leu

cys

Sex

íle

Kla

Arg

Lys

Ala

Glu

Thr

r cu

Gly

Val

Thr

435

440

445

GAG

GAA

GGC

GCA

GAC

CTA

TCT

CTA

CIC

ACC

CAC

GAC

ex

GAA

GOC

GAT

1927

Glu

Glu

Gly

Ala

Asp

Leu

Ser

Leu

Teu

Thr

His

Asp

Arg

Glu

Gly

Asp

450

455

460

465

CTC

ATC

CGC

ACA

CTC

GGA

GAG

TTC

CCA

GCA

CTG

GTG

AAG

GCT

GCC

GCT

1975

Leu

Ila

Arg

Thr

Leu

Cly

Clu

Phe

Pro

Ala

Val

Vol

Lys

Ala

Ala

Ala

470

475

480

GAC

CTA

CGT

GAA

CCA

CAC

ex

A1T

XC

CGC

TA?

GCT

GAG

GAA

TTA

GCT

2023

Asp

Leu

Arg

Glu

Pro

His

Arg

íle

Ala

Arg

Tyr

Ala

G1U

Glu

teu

Aia

485

490

49

5

GGA

ACT

TTC

CAC

CGC

nc

TAC

GAT

TCC

TCC

CAC

ATC

CIT

CCA

AAG

GTT

2071

GLy

Thr

Phe

His

Arg

Plte

Tyr

Asp

Ser

Cys

His

ne

Leu

Pro

Lys

val

500

505

51i

0

GAT

GAG

GAT

ACG

GCA

CCA

ATC

CAC

.ACA

GCA

CGT

CTC

GCA

CIT

GCA

GCA

2119

Asp

Glu

Asp

Thr

Ala

Pro

Ho

His

Thr

Ala

Arg

Leu

Ala

Leu

Ala

Ala

515 520 525

GTC

GGA

AAA

ATG

GCA

GCG

GAA

CTA

GGC

ATC

GAC

GCA

CCA

ACC

GTG

CIT

3078

Val

GLy

LyS

Mat

Ala

Ala

Glu

leu

Gly

íle

Asp

Ala

Pre

Thr

Val

Leu

285

290

295

CTT

GAG

CCC

GGC

CGC

GCT

ATC

GCA

GGC

CCC

TCC

ACC

GTG

ACC

ATC

TAC

3126

Val

Glu

Pro

Gly

Arg

Ala

íle

Ala

Cly

Pro

Ser

Thr

Val

TTur

Ila

Tyr

300

305

310

GAA

GTC

GGC

ACC

ACC

AAA

GAC

GTC

CAC

CTA

GAC

GAC

GAC

AAA

ACC

CGC

3174

Glu

Val

Gly

Thr

Wir

Lys

Asp

Val

His

Val

Asp

Asp

Asp

Lys

Thr

Arg

315

320

325

CGC

TAC

ATC

GCC

GTG

GAC

GGA

GGC

ATG

TCC

GAC

AAC

ATC

CQC

CCA

OCA

3222

Arg

Tyr

íle

Ala

Val

Asp

Gly

Gly

Met

Ser

Asp

Asn

Ι1Θ

Arg

Pro

Ala

330

335

340

345

CTC

TAC

GGC

TCC

GAA

TAC

GAC

GCC

CGC

GTA

CTA

TCC

CGC

ITC

GCC

GAA

3270

Leu

Tyr

Gly

Ser

Glu

Tyr

Asp

Ala

Arg

Val

Val

Ser

Arg

Phe

Ala

Glu

350

355

36

0

GGA

GAC

CCA

OTA

AGC

ACC

CGC

ATC

GTG

GGC

TCC

CAC

TGC

GAA

TCC

GGC

3318

Cly

Asp

Pro

Val

Ser

Thr

Arg

Ila

Val

Gly

Ser

His

Cys

Glu

Ser

Gly

365

370

37

5

GAT

ATC

CTG

ATC

AAC

GAT

GAA

ATC

TAC

CCA

TCT

GAC

ATC

ACC

AGC

GGC

3366

Asp

íle

Leu

íle

Asn

ASp

Glu

íle

Tyr

Pro

Ser

ÄSp

íle

Thr

ser

Gly

380

385

39

0

GAC

TTC

CIT

GCA

CTC

GCA

GCC

ACC

GGC

GCA

TAC

TGC

TAC

GCC

ATC

AGC

3414

Asp

Phe

Leu

Ala

Leu

Ala

Ala

Thr

Gly

Kla

Tyr

Cys

Tyr

Ala

Met

Ser

3462

395 400405

TCC OX TAC AAC GCC TTC ACA OGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT

Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Sar Val Arg Ala

410 415 420425

GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC

Gly Ser Ser Arg Leu Mat Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp íle Leu

430 435440

TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CSACGCCT3A OCCCGCCCTT CAOCTTCGCC

Ser Leu Glu Ala

445

GTGGAGGGCG OTTTTGG (2) Informácie o SEQ ID No: 19:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 550 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 19:

3510

3562

3579

Met

Thr

Pro

Ala

Asp

Leu

Ala

Thr

Leu

íle

Lys

Glu

Thr

Ala Val

Glu

1

5

10

1.

5

Val

Leu

Thr

Ser

Arg

GlU

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Leu

Pro

Glu Gin

Val

20

25

30

Val

Val

Glu

Arg

Pro

Axg

Asn

Pro

G1U

His

Gly

Asp

Tyr

Ala Ihr

Asn

35

40

4!

íle

Ala

Leu

Gin

Val

Ala

Lys

Lys

Val

Gly

Gin

Asn

Pro

Axg Asp

Leu

50

55

60

Ala

Thr

Trp

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

Ala

Ala

Asp

Asp

Ala

íle Asp

Ser

65

70

75

80

Ale

Glu

íle

Ala

Gly

Pro

Gly

Phe

Leu

Asn

íle

Arg

Leu

Ala Ala

Ala

85

90

9

5

Ala

Gin

Gly

Glu

íle

Val

Ala

Lys

íle

Leu

ALa

Gin

Gly

Glu Thr

Phe

100

105

110

Gly

Asn

Ser

Asp

His

Leu

Ser

His

Leu

Asp

Val

Asn

Leu

Glu Phe

Val

115

120

12S

Ser

Ala

Asn

Pro

Thr

Gly

Pro

íle

His

Leu

Gly

Gly

Thr

Arg Trp

Ala

230

135

140

Ala

Val

Gly

Asp

Ser

Leu

Gly

Arg

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly Ala

Lys

145

150

155

160

Val

Thr

Ary

Glu

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Asp

His

Gly

Arg

Gin

íle Asp

Arg

165

170

17

5

Phe

Ala

Leu

Ser

Leu

Leu

Ala

Ala

Ala

Lys

Gly

G1U

Pro

Thr Pro

Glu

180

165

190

Asp

Gly

Tyr

Gly

Gly

Glu

Tyr

íle

Lys

Glu

íle

Ala

Glu

Ala íle

Val

L95

200

20!

Glu

Lys

His

Pro

Glu

Ala

Leu

Ala

Leu

Glu

Pro

Ala

Ala

Thr Gin

Glu

210

215

220

ÍÄU

Phe

Arg

Ala

Glu

Gly

Val

Glu

Met

Met

Phe

Glu

His

íle Lys

Ser

225

230

23!

240

Ser

Leu

His

Glu

Phe

Gly

ľhr

ASP

Phe

Asp

Val

Tyr

Tyr

HÍS Glu

Asn

245

250

25

5

Ser

Leu

Phe

Glu

Ser

Gly

Ala

Val

Asp

Lys

Ala

Val

Gin

Val Leu

Lys

260

265

270

Asp

Asn

Gly

Asn

Leu

Tyr

Glu

Asn

Glu

Gly

Ala

Trp

Trp

Leu Arg

Ser

275 200 285

Thr

Glu

Phe

Gly

Asp

Asp

Lys

Asp

Arg

Val

Val íle

Lys

Ser

Asp

Gly

290

295

300

Asp

Ala

Ala

Tyr

íle

Ala

Gly

Asp

íle

Ala

Tyr Val

Ala

Asp

Lys

Phe

305

310

315

320

Ser

Arg

Gly

HÍS

Asn

Leu

Asn

He

Tyr

Met

Leu Gly

Ala

Asp

His

His

325

330

33

5

Gly

Tyr

íle

Ala

Arg

Teu

Lys

Ala

Ala

Ala

Ala Ala

Leu

Gly

Tyr

Lys

340

345

35i

3

Pro

Glu

Gly

Val

Glu

Val

Leu

Íle

Gly

Gin

Met Val

Asn

Leu

Leu

Axg

355

360

36!

Asp

Gly

Lys

Ala

Val

Arg

Met

Ser

Lys

Axg

Ala Gly

Thr

Val

Val

Thr

370

375

380

Leu

Asp

Asp

Leu

Val

Glu

Ala

íle

Gly

íle

Asp Ala

Ala

Arg

Tyr

Ser

385

390

395

400

Leu

íle

Axg

Ser

Ser

Val

Asp

Ser

Ser

Leu

Asp íle

Asp

Leu

Gly

Leu

405

410

41

5

Trp

Glu

Ser

Gin

Ser

Ser

Asp

Asn

Pro

Val

Tyr Tyr

Val

Gin

Tyr

Gly

420

425

43'

0

His

Ala

Arg

Leu

Cys

Ser

íle

Ala

Arg

Lys

Ala Glu

Thr

Leu

Gly

Val

43S

440

44!

Thr

Glu

Glu

Gly

Ala

Asp

Leu

Ser

Leu

Leu

Thr His

Asp

Arg

Glu

Gly

450

455

460

Asp

Leu

íle

Arg

Thr

Leu

Gly

Glu

Phe

Pro

Ala Val

Val

Lys

Ala

Ala

465

470

475

480

Ala

Asp

Leu

Arg

Glu

Pro

His

Arg

íle

Ala

Arg Tyr

Ala

Glu

Glu

Leu

485

490

49

5

Ala

Gly

Thr

Phe

His

Arg

Phe

Tyr

Asp

Ser

Cys His

íle

Leu

Pro

Lys

500

505

51

0

Val

Asp

Glu

Asp

Thr

Ala

Pro

íle

His

Thr

Ala Arg

Leu

Ala

Leu

Ala

515

520

52!

5

Ala

Ala

Thr

Arg

Gin

Thr

Leu

Ala

Asn

Ala

Leu His

Leu

Val

Gly

Val

530

535

540

Ser

Ala

Pro

Glu

Lys

Met

545 550 (2) informácie o SEQ JD No: 20:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 445 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 20:

Met Ale Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro

1

5

10

1!

5

Arg

Asn

Ala

Val

Arg

Gin

G1U

Asp

Gly

Val Val

Thr

Val Ala

Gly

Val

20

25

3i

3

Pro

Leu

Pro

Asp

Leu

Ala

Glu

Glu

Tyr

Gly Thr

Pro

Leu Phe

Val

val

35

40

45

Asp

Glu

Asp

Asp

Phe

Arg

Ser

Arg

Cys

Arg Asp

Met

Ala Thr

Ala

Phe

50

55

60

Gly

Gly

Pro

Gly

Asn

Val

His

Tyr

Ala

Ser lys

Ala

Phe Leu

Thr

Lys

65

70

75

80

Thr

íle

Ala

Arg

Trp

Val

Asp

Glu

Glu

Gly Leu

Ala

Leu Asp

íle

Ala

85

90

9

5

Ser

íle

Asn

Glu

Leu

Gly

íle

Ala

Leu

Ala Ala

Gly

Phe Pro

Ala

Ser

100

105

li(

3

Arg

íle

Thr

Ala

His

Gly

Asn

Asn

Ly3

Gly Val

Glu

Phe Leu

Arg

Ala

115

120

125

Leu

Val

Gin

Asn

Gly

Val

Gly

His

Val

Val Leu

Asp

Ser Ala

Gin

Glu

130

135

140

Leu

Glu

Leu

Leu

ASp

Tyr

Val

Ala

Ala

Gly Glu

Gly

Lys íle

Gin

Asp

145

150

155

160

Val

Leu

íle

Arg

val

Lys

Pro

Gly

íle

Glu Ala

His

Thr His

Glu

Phe

165

170

17

5

íle

Ala

Ihr

Ser

HÍS

Glu

Asp

Gin

Lys

Phe Gly

Fte

Ser Leu

Ala

Ser

180

185

19

0

Gly

Ser

Ala

Phe

Glu

Ala

Ala

Lys

Ala

Ala Asn

Asn

Ala Glu

Asn

Leu

195

200

205

Asn

Leu

Val

Gly

Leu

His

Cys

His

Val

Gly Ser

Gin

Val Phe

Asp

Ala

210

215

220

Glu

Gly

Phe

Lys

Leu

Ala

Ala

Glu

Arg

Val Leu

Gly

Leu Tyr

Ser

Gin

225

230

235

240

Tie

HÍS

Ser

Glu

Leu

Gly

Val

Ala

Leu

Pro Glu

Ieu

ksp Leu

Gly

Gly

245

250

25

5

Gly

Tyr

Gly

íle

Ala

Tyr

Thr

Ala

Ala

GlU Glu

Pro

Leu Asn

Val

Ala

260

265

27

0

Glu

Val

Ala

Ser

Asp

Leu

Leu

Thr

Ala

Val Gly

Lys

Met Ala

Ala

Glu

275

280

285

Leu

Gly

íle

Asp

Ala

Pro

Thr

Val

Leu

Val Glu

Pro

Gly Arg

Ala

íle

290

295

300

Ala

Gly

Pro

Ser

Thr

Val

Ihr

íle

Tyr

Glu Val

Gly

ihr Thr

Lys

Asp

305

310

31!

320

Val

Hig

Val

Asp

Asp

Asp

Lys

Ihr

Arg

Arg Tyr

íle

Ala Val

Asp

Gly

325

330

33

5

Gly

Met

Ser

Asp

Asn

íle

Arg

Pro

Ala

Leu Tyr

Gly

Ser Glu

Tyr

Asp

340

345

350

Ala

Arg

Val

Val

Ser

Arg

Phe

Ala

Glu

Gly Asp

Pro

Val Ser

Thr

Arg

355

360

365

íle

val

Gly

Ser

His

Cys

Glu

Ser

Gly

Asp

íle

Leu

íle

Asn

Asp

Glu

370

375

380

íle

Tyr

Pro

Ser

Asp

íle

Thr

Ser

Gly

Asp

Phe

Leu

Ala

Leu

Ala

Ala

385

390

395

400

Thr

Gly

Ala

Tyr

Cys

Tyr

Ala

Met

Ser

Ser

Arg

Tyr

Asn

Ala

Fhe

Thr

405

410

41

5

Arg

Pro

Ala

Val

Val

Ser

Val

Arg

Ala

Gly

Ser

ser

Arg

Leu

Met

Leu

420

425

431

D

Arg

Arg

Glu

Thr

Leu

Asp

Asp

íle

Leu

Ser

Leu

Glu

Ala

435

440

44!

(2) Informácie o SEQ ID No: 21:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „synthetic DNA“ (iv) Anti-Sense: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 21:

CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20 (2) Informácie o SEQ ID No: 22:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 20 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: jednovláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „synthetic DNA“ (iv) Anti-Sense: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 22: TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20 (2) Informácie o SEQ ID No: 23:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 1034 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitosť: dvojvláknová (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: DNA (genómová) (iv) Anti-Sense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13 869 (ix) Znaky:

(A) Názov/kľúč: CDS (B) Poloha: 61..1020 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 23:

ATOCATCTCC CTAAOCXCGX OCWWCMJT GCCKCACM ITITCCAOCA. TTACMGMC 60

ATG

ACC

AAC

ATC

CGC GTA

GCT

ATC

GTG

GGC

TAC

GGA

aäc

CTG

GGA

CGC

100

Ntet

Thr

Asn

íle

Arg Val

Ala

íle

Val

Gly

Tyr

Gly

Asn

Leu

Gly

Arg

1

5

10

1!

AQC

GTC

GAA

AAG

CIT ATT

GCC

AAG

CAG

CCC

GAC

ATG

GAC

CTT

GTA

GGA

156

Ser

Val

Glu

Lys

Leu. íle

Ala

lys

Gin

Pro

Asp

Met

Asp

Leu

Val

Gly

20

25

30

ATC

TTC

TCG

CGC

CGG GCC

ACC

CTC

GAC

ACA

AAG

ACG

OCA

GTC

TTT

GAT

204

íle

Phe

Ser

Arg

Arg Ala

Thr

Leu

Asp

Thr

Lys

Thr

Pro

Val

Pne

Asp

35

40

45

GTC

GCC

GAC

CTG

GAC AAG

CAC

GCC

GAC

GAC

CTG

GAC

GTG

CTC

TTC

CTC

252

Val

Ala

Asp

Val

Asp Lys

His

Ala

Asp

Asp

val

Asp

Val

Leu

Phe

Leu

50

55

60

TGC

ATG

GGC

TCC

GCC AOC

GAC

ATC

OCT

GŕG

CAG

GCA

CCA

AAG

TTC

GCG

3CO

Cys

htet

Gly

Ser

Ala Thr

Asp

íle

pto

Glu

Gin

Ala

Pro

Lys

Phe

Ala

65

70

75

80

CAG

TTC

GCC

TGC

ACC GTA

GAC

ACC

TAC

GAC

AAC

CAC

CGC

GAC

ATC

CCA

348

Gin

Phe

Ala

Cys

Thr Val

Asp

Thr

Tyr

Asp

Asn

His

Arg

Asp

íle

Pro

85

90

9

5

CGC

CAC

CGC

CAG

GTC ATG

AAC

GAA

GCC

GCC

ACC

OCA

GCC

GGC

AAC

GIT

396

Arg

His

Aig

Gin

Val Met

Asn

Glu

Ala

Ala

Thr

Ala

Ala

Gly

Asn

val

100

10S

11'

0

GCA

CTG

GTC

TCT

ACC GGC

TGG

GAT

CCA

GGA

ATG

TTC

TCC

ATC

AAC

OQC

444

Ala

Leu

Val

Ser

Thr Gly

Tip

Asp

Pro

Gly

Met

Phe

Ser

íle

Asn

Arg

115

120

12

GTC

TAC

GCA

GCG

GCA GTC

TTA

GCC

GAG

CAC

CAG

CAG

CAC

ACC

TTC

TGG

492

val

Tyr

Ala

Ala

Ala Val

Leu

Ala

Glu

His

Gin

Gin

His

Tltr

Phe

Trp

130

135

140

GGC

CCA

GGT

TľG

TCA CAG

GGC

CAC

TCC

GAT

OCT

TTG

CGA

CCC

ATC

CCT

540

Gly

Pro

Gly

Leu

Ser Gin

Gly

H1S

Ser

Asp

Ala

ieu

Arg

Arg

íle

Pro

145

150

15

5

160

GGC

GTT

CAA

AAG

GCA

GTC

CAG TAC KC

CTC

CCA

TCC GAA GAC

GCC

CTG

588

Gly

val

Gin

Lys

Ala

Val

Gin Tyr Thr

Leu

Pro

Ser Glu Asp

Ala

Leu

165

171

3

17

'5

GAA

AAG

GCC

CGC

CGC

GGC

GAA GCC GGC

GAC

CTT

ACC GGA AAG

CAA

ACC

636

Glu

Lys

Ala

Arg

Arg

Gly

Glu Ala Gly

Asp

Uu

Thr Gly Lys

Gin

Thr

180

10

5

190

CAC

AAG

CGC

CAA

TOC

TTC

GTG GTT GCC

: GAC

GCG

GCC GAT CAC

GAG

CGC

684

HiS

Lys

Arg

Gin

Cys

Phe

Val Val Ala

: ASP

Ala

Ala Asp His

G1U

Arg

195

200

205

ATC

GAA

AAC

GAC

ATC

CGC

ACC ATG CCT

GAT

TAC

TTC GIT GGC

TAC

GAA

732

íle

Glu

Asn

Asp

íle

Arg

Thr Met Pro

Asp

Tyr

rhe Val Gly

Tyr

Glu

210

215

220

GTC

GAA

GTC

AAC

TTC

ATC

GAC GAA GCA

ACC

TTC

GAC TCC GAG

CAC

ACC

7 BO

val

G1U

Val

Asn

Phe

íle

Asp G1U Ala

Thr

Phe

Asp Ser Glu

His

Thr

725

230

235

240

GGC

ATG

CCA

CAC

O7T

□GC

CAC GTG ATT

ACC

ACC

GGC GAC ACC

GGT

GGC

828

Gly

Met

Pro

HÍS

Gly

Gly

His Val Ila

Thr

Thr

Gly Asp Thr

Gly

Gly

245

250

25.

TTC

AAC

CAC

ACC

GTG

GAA

TAC ATC CTC

AAG

CTG

GAC CGA AAC

CCA

GAT

876

Phe

Asn

His

Thr

Val

Glu

Tyr íle Leu

Lys

Leu

Asp Arg Asn

Pro

Asp

260

265

270

TTC

ACC

GCT

TCC

TCA

CAG

ATC OCT TTC

GGT

CGC

GCA GCT CAC

CGC

ATG

924

Phe

Thr

Ala

Ser

Sar

Gin

íle Ala Phe

Gly

Arg

Ala Ala His

Arg

Met

275

280

285

AAC

CAG

CAG

GGC

CAA

AQC

GGA GCT TTC

ACC

GTC

CTC GAA GTT

GCT

CCA

972

Lys

Gin

Gin

Gly

Gin

Ser

Gly Ala Phe

Thr

Val

Leu Glu Val

Ala

Pro

290

295

300

TAC

CTG

CTC

TCC

CCA

GAG

aac ttc cac

GAT

CTG

ATC GCA CGC

GAC

GTC

1020

Tyr

Ieu

Leu

Ser

Pro

G1U

Asn Leu Asp

Asp

Leu

íle Ala Arg

Asp

Val

305 310 315 320

TAATTWOCI Ο3Λ3 1034 (2) Informácie o SEQ ID No: 24:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 320 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No: 24:

Met

Thr

Asn

íle

Arg

Val

Ala

íle

Val Gly Tyr

Gly

Asn

Leu

Gly

Arg

1

5

10

1!

5

Ser

Val

Glu

Lys

Leu

Ila

Ala

Lys

Gin Pro Asp

Met

Asp

Leu

Val

Gly

20

25

30

íle

Phe

Ser

Arg

Arg

Ala

Thr

Leu

Asp Thr Ly9

Thr

Pro

Val

Phe

Asp

35

40

4!

Val

Ala

Asp

Val

ASp

Lys

HÍS

Ala

Asp Asp Val

Asp

Val

Leu

Phe

Leu

50

55

60

Cys

Met

Gly

Ser

Ala

Thr

Asp

íle

Pre Glu Gin

Ala

Pro

Lys

Phe

Ala

65

70

75

00

Gin

Phe

Ala

Cys

Thr

val

Asp

Thr

Tyx Asp Asn

His

Arg

Asp

Ilô

Pro

85

90

9

5

Arg

His

Arg

Gin

Val

Met

Asn

Glu

Ala Ala Thr

Ala

Ala

Gly

Asn

Val

100

105

110

Ala

Leu

Val

Ser

Thr

Gly

Trp

Asp

Pro Gly Met

Phe

Ser

íle

Asn

Arg

115

120

12!

Val

Tyr

Ala

Ala

Ala

Val

Leu

Ala

Glu His Gin

Gin

His

Thr

Pte

Trp

130

135

140

Gly

Pro

Gly

Leu

Ser

Gin

Gly

His

Ser Asp Ala

Leu

Arg

Axg

íle

Pro

145

150

155

160

Gly

Val

Gin

Lys

Ala

Val

Gin

Tyr

Thr Leu pro

Sar

Glu

Asp

Ala

Leu

165

170

17

5

Glu

Lys

Ala

Arg

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly Asp Leu

Thr

Gly

Lys

Gin

Thr

180

185

19i

3

His

Lys

Arg

Gin

Cys

Phe

Val

Val

Ala Asp Ala

Ala

Asp

HiS

Glu

Arg

195

200

20!

5

íle

Glu

Asn

Asp

íle

Arg

Thr

Met

Pro Asp Tyr

Phe

Val

Gly

Tyr

Glu

210

215

220

val

Glu

Val

Asn

Phe

íle

Asp

Glu

Ala Thr Phe

Asp

Ser

Glu

His

Thr

225

230

23S

240

Gly

bfet

Pro

His

Gly

Gly

His

Val

íle Thr Thr

Gly

Asp

Thr

Gly

Gly

245

250

25

5

Phe

Asn

His

Thr

Val

Glu

Tyr

íle

Leu Lys Ceu

Asp

Arg

Asn

Pro

Asp

260

265

27

0

Phe

Thr

Ala

Ser

Ser

Gin

íle

Ala

Phe Gly Arg

Ala

Ala

His

Arg

Met

275

7.80

28

5

Lys

Gin

Gin

Gly

Gin

Ser

Gly

Ala

Phe Thr Val

Leu

Glu

Val

Ala

Pro

290

295

300

Tyr

Leu

Leu

Ser

Pro

Glu

Asn

Leu

Asp Asp Leu

íle

Ala

Arg

Asp

Val

305

310

31!

320

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (15)

1. Rekombinantná DNA, autonómne replikovateľná v bunkách koryneformných baktérií, obsahujúca DNA sekvenciu, kódujúcu aspartokinázu, v ktorej je znecitlivená spätná inhibícia L-lyzínom a L-treoninom, DNA sekvenciu, kódujúcu dihydrodipikolinátovú reduktázu a DNA sekvenciu, kódujúcu dihydrodipikolinátovú syntázu.

2. Rekombinantná DNA podľa nároku 1, ďalej obsahujúca DNA sekvenciu, kódujúcu diaminopimelátovú dekarboxylázu.

3. Rekombinantná DNA podľa nároku 2, ktorá ďalej obsahuje DNA sekvenciu, kódujúcu diaminopimelátovú dehydrogenázu.

4. Rekombinantná DNA podľa niektorého z nárokov 1 až 3, v ktorej uvedená aspartokináza, v ktorej je znecitlivená spätná inhibícia L-lyzínom a L-treonínom, je aspartokináza pochádzajúca z koryneformných baktérií, pričom uvedená aspartokináza je mutantná aspartokináza, v ktorej 279. alanínový zvyšok, počítaný od jej N-konca, je v jej a-podjednotke zamenený za iný ako alanínový aminokyselinový zvyšok a iný ako kyslý aminokyselinový zvyšok, a 30. alanínový zvyšok v jej β-podjednotke je zamenený za iný ako alanínový aminokyselinový zvyšok a iný ako kyslý aminokyselinový zvyšok.

5. Rekombinantná DNA podľa niektorého z nárokov 1 až 3, v ktorej uvedená DNA sekvencia, kódujúca dihydrodipikolinátovú reduktázu, kóduje aminokyselinovú sekvenciu označenú ako SEQ ID No: 11 v priloženom zozname sekvencií.

6. Rekombinantná DNA podľa nároku 1, v ktorej uvedená DNA sekvencia, kódujúca dihydrodipikolinátovú syntázu, kóduje aminokyselinovú sekvenciu označenú ako SEQ ID No: 15 v priloženom zozname sekvencií.

7. Rekombinantná DNA podľa nároku 2, v ktorej uvedená DNA sekvencia, kódujúca diaminopimelátovú dekar19

SK 285013 Β6 boxylázu, kóduje aminokyselinovú sekvenciu označenú ako SEQ ID No: 20 v priloženom zozname sekvencií.

8. Rekombinantná DNA podľa nároku 3, v ktorej uvedená DNA sekvencia, kódujúca diaminopimelátovú dehydrogenázu, kóduje aminokyselinovú sekvenciu označenú ako SEQ ID No: 24 v priloženom zozname sekvencií.

9. Koryneformná baktéria nesúca aspartokinázu, v ktorej je znecitlivená spätná inhibícia L-lyzínom a L-treoninom a ktorá obsahuje zosilnenú DNA sekvenciu, kódujúcu dihydrodipikolinátovú reduktázu a zosilnenú DNA sekvenciu, kódujúcu dihydrodipikolinátovú syntázu.

10. Koryneformná baktéria podľa nároku 9, transformovaná vložením rekombinantnej DNA, podľa nároku 1.

11. Koryneformná baktéria podľa nároku 9, ďalej obsahujúca zosilnenú DNA sekvenciu, kódujúcu diaminopimelátovú dekarboxylázu.

12. Koryneformná baktéria podľa nároku 11, transformovaná vložením rekombinantnej DNA, podľa nároku 2.

13. Koryneformná baktéria podľa nároku 11, ďalej obsahujúca zosilnenú DNA sekvenciu, kódujúcu diaminopimelátovú dehydrogenázu.

14. Koryneformná baktéria podľa nároku 13, transformovaná vložením rekombinantnej DNA, podľa nároku 3.

15. Spôsob výroby L-lyzinu, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa kultiváciu uvedenej koryneformnej baktérie podľa niektorého z nárokov 9 až 14 vo vhodnom médiu, produkciu a akumuláciu L-lyzínu v kultúre uvedenej baktérie a oddelenie L-lyzínu z kultúry,