JPH0775578A - ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片およびその利用 - Google Patents
ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片およびその利用Info
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- JPH0775578A JPH0775578A JP5223501A JP22350193A JPH0775578A JP H0775578 A JPH0775578 A JP H0775578A JP 5223501 A JP5223501 A JP 5223501A JP 22350193 A JP22350193 A JP 22350193A JP H0775578 A JPH0775578 A JP H0775578A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
の染色体ＤＮＡから得られ、ジヒドロピコリン酸レダク
ターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ
断片が導入された組換えプラスミド、および該組換えプ
ラスミドにより形質転換されたコリネ型細菌。 【効果】該ＤＮＡ断片が導入された組換えプラスミドに
より形質転換されたコリネ型細菌を用いることで、従来
よりも高効率に有用微生物産物を生産することができ
る。
の染色体ＤＮＡから得られ、ジヒドロピコリン酸レダク
ターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ
断片が導入された組換えプラスミド、および該組換えプ
ラスミドにより形質転換されたコリネ型細菌。 【効果】該ＤＮＡ断片が導入された組換えプラスミドに
より形質転換されたコリネ型細菌を用いることで、従来
よりも高効率に有用微生物産物を生産することができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ジヒドロジピコリン酸
レダクターゼ（EC 1.3.1.26）をコードする遺伝子を含
むコリネ型細菌由来のＤＮＡ断片およびその利用に関
し、より詳しくは、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
をコードする遺伝子を含むブレビバクテリウム・フラバ
ム（Brevibacterium flavum）由来のＤＮＡ断片、該Ｄ
ＮＡ断片を保有する組換えプラスミド、および該プラス
ミドにより形質転換されたコリネ型細菌に関する。
レダクターゼ（EC 1.3.1.26）をコードする遺伝子を含
むコリネ型細菌由来のＤＮＡ断片およびその利用に関
し、より詳しくは、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
をコードする遺伝子を含むブレビバクテリウム・フラバ
ム（Brevibacterium flavum）由来のＤＮＡ断片、該Ｄ
ＮＡ断片を保有する組換えプラスミド、および該プラス
ミドにより形質転換されたコリネ型細菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（EC
1.3.1.26）は、医薬や食品添加物として用いられるＬ
−リジンの生合成に関与する工業的に有用な酵素であ
る。ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺
伝子としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)
由来の遺伝子（J. Biol. Chem., 259, 14829-14834, 19
88参照)、およびコリネバクテリウム・グルタミカム(Co
rynebacterium glutamicum）由来の遺伝子（Mol. Gene
r. Genet., 220, 478-480, 1990 参照）についての報告
例はあるものの、本発明者らの知る限りでは、産業上重
要な微生物であるブレビバクテリウム・フラバム（Brev
ibacterium flavum）由来のジヒドロジピコリン酸レダ
クターゼをコードする遺伝子についての報告例は見当た
らない。一方、従来提案されている微生物を用いるＬ−
リジンの製造法では、Ｌ−リジンの蓄積等に限界があ
り、新たな観点から遺伝子工学的手法による苗株の改良
も含め、Ｌ−リジンをより効率的に生成させる方法の提
供が強く求められている。
1.3.1.26）は、医薬や食品添加物として用いられるＬ
−リジンの生合成に関与する工業的に有用な酵素であ
る。ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺
伝子としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)
由来の遺伝子（J. Biol. Chem., 259, 14829-14834, 19
88参照)、およびコリネバクテリウム・グルタミカム(Co
rynebacterium glutamicum）由来の遺伝子（Mol. Gene
r. Genet., 220, 478-480, 1990 参照）についての報告
例はあるものの、本発明者らの知る限りでは、産業上重
要な微生物であるブレビバクテリウム・フラバム（Brev
ibacterium flavum）由来のジヒドロジピコリン酸レダ
クターゼをコードする遺伝子についての報告例は見当た
らない。一方、従来提案されている微生物を用いるＬ−
リジンの製造法では、Ｌ−リジンの蓄積等に限界があ
り、新たな観点から遺伝子工学的手法による苗株の改良
も含め、Ｌ−リジンをより効率的に生成させる方法の提
供が強く求められている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、コリ
ネ型細菌に属するブレビバクテリウム・フラバム（Brev
ibacterium flavum）由来のジヒドロジピコリン酸レダ
クターゼをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を同種
であるコリネ型細菌に導入し、該コリネ型細菌を用いて
新たな観点から効率的にＬ−リジンを製造することであ
る。
ネ型細菌に属するブレビバクテリウム・フラバム（Brev
ibacterium flavum）由来のジヒドロジピコリン酸レダ
クターゼをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を同種
であるコリネ型細菌に導入し、該コリネ型細菌を用いて
新たな観点から効率的にＬ−リジンを製造することであ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成すべく鋭意研究を行った結果、コリネ型細菌染色体
からジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、該ＤＮＡ断片を適当な
ベクタープラスミドに導入してコリネ型細菌を形質転換
し、該形質転換されたコリネ型細菌がＬ−リジンの中間
体であるテトラヒドロジピコリン酸の高生産能力を有す
ることを見いだし、本発明を完成するに至った。即ち本
発明は、（１） ブレビバクテリウム・フラバム（Brev
ibacterium flavum）由来のジヒドロジピコリン酸レダ
クターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、（２）
該ＤＮＡ断片を保有する組換えプラスミド、（３）
該組換えプラスミドにより形質転換されたコリネ型細
菌、を提供するものである。本発明の上記ＤＮＡ断片を
用いることにより、コリネ型細菌内でジヒドロジピコリ
ン酸レダクターゼを高生産し得るベクタープラスミドを
造成することができ、このベクタープラスミドでコリネ
型細菌を形質転換することにより、リジン生合成経路の
中間体であるテトラヒドロジピコリン酸の高産生能力を
有するコリネ型細菌を育種することが可能である。かく
して育種されたコリネ型細菌を用いてＬ−リジンを効率
的に製造することができる。以下に、本発明についてさ
らに詳細に説明する。
達成すべく鋭意研究を行った結果、コリネ型細菌染色体
からジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、該ＤＮＡ断片を適当な
ベクタープラスミドに導入してコリネ型細菌を形質転換
し、該形質転換されたコリネ型細菌がＬ−リジンの中間
体であるテトラヒドロジピコリン酸の高生産能力を有す
ることを見いだし、本発明を完成するに至った。即ち本
発明は、（１） ブレビバクテリウム・フラバム（Brev
ibacterium flavum）由来のジヒドロジピコリン酸レダ
クターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、（２）
該ＤＮＡ断片を保有する組換えプラスミド、（３）
該組換えプラスミドにより形質転換されたコリネ型細
菌、を提供するものである。本発明の上記ＤＮＡ断片を
用いることにより、コリネ型細菌内でジヒドロジピコリ
ン酸レダクターゼを高生産し得るベクタープラスミドを
造成することができ、このベクタープラスミドでコリネ
型細菌を形質転換することにより、リジン生合成経路の
中間体であるテトラヒドロジピコリン酸の高産生能力を
有するコリネ型細菌を育種することが可能である。かく
して育種されたコリネ型細菌を用いてＬ−リジンを効率
的に製造することができる。以下に、本発明についてさ
らに詳細に説明する。
【０００５】
【本発明の具体的説明】本発明の、ジヒドロジピコリン
酸レダクターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片
（以下これを「Ａ断片」と略称することがある。）と
は、ジヒドロジピコリン酸を還元して、テトラヒドロジ
ピコリン酸を合成する酵素、即ちジヒドロジピコリン酸
レダクターゼ（EC 1.3.1.26）をコードする遺伝子ＤＮ
Ａを含むＤＮＡ断片を意味する。
酸レダクターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片
（以下これを「Ａ断片」と略称することがある。）と
は、ジヒドロジピコリン酸を還元して、テトラヒドロジ
ピコリン酸を合成する酵素、即ちジヒドロジピコリン酸
レダクターゼ（EC 1.3.1.26）をコードする遺伝子ＤＮ
Ａを含むＤＮＡ断片を意味する。
【０００６】本発明のジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片はその塩基配列
が決定された後においては合成することも可能である
が、通常は該酵素を生産する微生物から単離およびクロ
ーニングして取得可能であり、その供給源となる微生物
としてはコリネ型細菌、特にブレビバクテリウム・フラ
バム（Brebibacterium flavum）ＭＪ−２３３（FERM BP
-1497）およびその由来株が好適に用いられる。これら
供給源微生物からＡ断片を調製するための基本的操作の
１例を以下に示す。Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例え
ばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM B
P-1497）株の染色体ＤＮＡ上に存在し、その染色体ＤＮ
Ａを適当な制限酵素で切断し、生じる切断断片の中から
分離、取得することができる。まず、ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３株の培養物から常法により染
色体ＤＮＡを抽出し、該染色体ＤＮＡを適当な制限酵
素、例えばＨｉｎｄIIIを用いて完全分解する。次に得
られたＤＮＡ断片を、適当なマーカー遺伝子を有するベ
クタープラスミド、例えばカナマイシン耐性遺伝子を有
するｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）に常法により挿入す
る。得られたベクタープラスミドを用い、通常の形質転
換法、例えば塩化カルシウム法または電気パルス法等に
より適当な宿主細菌、例えばジヒドロジピコリン酸レダ
クターゼ遺伝子が欠損した大腸菌（エシエリヒア・コ
リ）変異株ＣＧＳＣ４５４９［エシエリヒア・コリ ジ
ェネテック・ストック・センター（Escherichia coli G
enetic Stock Center)、デパートメント・オブ・バイオ
ロジー、エール・ユニバーシィティ（Department of Bi
ology, Yale University）：P.O.Box 6666 New-Haven,
GT 06511-74, USA 保存菌株］を形質転換し、菌体を選
択培地上で培養して形質転換株の有する組換えプラスミ
ドのマーカー遺伝子発現の有無により、形質転換株を分
離、取得する。得られた形質転換株より、プラスミドＤ
ＮＡを常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法等により抽出
し、適当な制限酵素で切断する。得られたＤＮＡ断片を
常法、例えばポリアクリルアミド電気泳動法等により解
析することにより、前記プラスミドＤＮＡに挿入された
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株由来のＡ
断片を確認および取得することができる。
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片はその塩基配列
が決定された後においては合成することも可能である
が、通常は該酵素を生産する微生物から単離およびクロ
ーニングして取得可能であり、その供給源となる微生物
としてはコリネ型細菌、特にブレビバクテリウム・フラ
バム（Brebibacterium flavum）ＭＪ−２３３（FERM BP
-1497）およびその由来株が好適に用いられる。これら
供給源微生物からＡ断片を調製するための基本的操作の
１例を以下に示す。Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例え
ばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM B
P-1497）株の染色体ＤＮＡ上に存在し、その染色体ＤＮ
Ａを適当な制限酵素で切断し、生じる切断断片の中から
分離、取得することができる。まず、ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３株の培養物から常法により染
色体ＤＮＡを抽出し、該染色体ＤＮＡを適当な制限酵
素、例えばＨｉｎｄIIIを用いて完全分解する。次に得
られたＤＮＡ断片を、適当なマーカー遺伝子を有するベ
クタープラスミド、例えばカナマイシン耐性遺伝子を有
するｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）に常法により挿入す
る。得られたベクタープラスミドを用い、通常の形質転
換法、例えば塩化カルシウム法または電気パルス法等に
より適当な宿主細菌、例えばジヒドロジピコリン酸レダ
クターゼ遺伝子が欠損した大腸菌（エシエリヒア・コ
リ）変異株ＣＧＳＣ４５４９［エシエリヒア・コリ ジ
ェネテック・ストック・センター（Escherichia coli G
enetic Stock Center)、デパートメント・オブ・バイオ
ロジー、エール・ユニバーシィティ（Department of Bi
ology, Yale University）：P.O.Box 6666 New-Haven,
GT 06511-74, USA 保存菌株］を形質転換し、菌体を選
択培地上で培養して形質転換株の有する組換えプラスミ
ドのマーカー遺伝子発現の有無により、形質転換株を分
離、取得する。得られた形質転換株より、プラスミドＤ
ＮＡを常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法等により抽出
し、適当な制限酵素で切断する。得られたＤＮＡ断片を
常法、例えばポリアクリルアミド電気泳動法等により解
析することにより、前記プラスミドＤＮＡに挿入された
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株由来のＡ
断片を確認および取得することができる。
【０００７】上記手法により得られるＡ断片の例として
は、上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の
染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIにより完全分解し
て得られる、大きさ約３.５ｋｂのＤＮＡ断片を挙げる
ことができる。このジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
をコードする遺伝子を含む大きさが約３.５ｋｂのＤＮ
Ａ断片を各種制限酵素により切断した際の、制限酵素認
識部位数および切断断片の大きさを下記表１に示す。
は、上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の
染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIにより完全分解し
て得られる、大きさ約３.５ｋｂのＤＮＡ断片を挙げる
ことができる。このジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
をコードする遺伝子を含む大きさが約３.５ｋｂのＤＮ
Ａ断片を各種制限酵素により切断した際の、制限酵素認
識部位数および切断断片の大きさを下記表１に示す。
【０００８】
【表１】
【０００９】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片またはプラスミドを、制
限酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自
体既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および
４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能
な断片の数から決定した値を採用した。また、「切断断
片の大きさ」及びプラスミドの大きさは、アガロースゲ
ル電気泳動を用いる場合には、エシエリヒア・コリのラ
ムダファージ（λphage）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄI
IIで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ア
ガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づ
き、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場
合には、エシエリヒア・コリのファイ・エックス１７４
ファージ（φｘ１７４ phage）のＤＮＡを制限酵素Ｈａ
ｅIIIで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同
一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標
準線に基づき、切断ＤＮＡ断片またはプラスミドの各Ｄ
ＮＡ断片の大きさを算出する。プラスミドの大きさは、
切断断片それぞれの大きさを加算して求める。なお、各
ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片
の大きさついては、１％アガロースゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用し、約０.１ｋｂから１ｋｂ未満
の断片の大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって得られる結果を採用した。
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片またはプラスミドを、制
限酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自
体既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および
４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能
な断片の数から決定した値を採用した。また、「切断断
片の大きさ」及びプラスミドの大きさは、アガロースゲ
ル電気泳動を用いる場合には、エシエリヒア・コリのラ
ムダファージ（λphage）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄI
IIで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ア
ガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づ
き、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場
合には、エシエリヒア・コリのファイ・エックス１７４
ファージ（φｘ１７４ phage）のＤＮＡを制限酵素Ｈａ
ｅIIIで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同
一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標
準線に基づき、切断ＤＮＡ断片またはプラスミドの各Ｄ
ＮＡ断片の大きさを算出する。プラスミドの大きさは、
切断断片それぞれの大きさを加算して求める。なお、各
ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片
の大きさついては、１％アガロースゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用し、約０.１ｋｂから１ｋｂ未満
の断片の大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって得られる結果を採用した。
【００１０】一方、上記したブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄII
Iによって切断することにより得られる大きさが約３.５
ｋｂのＤＮＡ断片については、その塩基配列をプラスミ
ドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９（宝酒造）を用いる
ジデオキシヌクレオチド酵素法（dideoxy chaintermina
tion method, Sanger,F. ら, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 74, p5463,1977）により決定することができる。
このようにして決定した上記大きさが約３.５ｋｂのＤ
ＮＡ断片の塩基配列中のオープン・リーディング・フレ
ーム（ＯＲＦ）の存在から決定したジヒドロジピコリン
酸レダクターゼをコードする遺伝子は、２４９個のアミ
ノ酸をコードする７４７塩基対から構成されている。そ
の塩基配列を後記配列表の配列番号：１に示す。
バムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄII
Iによって切断することにより得られる大きさが約３.５
ｋｂのＤＮＡ断片については、その塩基配列をプラスミ
ドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９（宝酒造）を用いる
ジデオキシヌクレオチド酵素法（dideoxy chaintermina
tion method, Sanger,F. ら, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 74, p5463,1977）により決定することができる。
このようにして決定した上記大きさが約３.５ｋｂのＤ
ＮＡ断片の塩基配列中のオープン・リーディング・フレ
ーム（ＯＲＦ）の存在から決定したジヒドロジピコリン
酸レダクターゼをコードする遺伝子は、２４９個のアミ
ノ酸をコードする７４７塩基対から構成されている。そ
の塩基配列を後記配列表の配列番号：１に示す。
【００１１】配列番号：１に示される塩基配列を包含し
てなる本発明のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細
菌染色体ＤＮＡから単離されたもののみならず、通常用
いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシ
ステムズ社製３９４型を用いて合成されたものであって
もよい。また、配列番号：１に示される塩基配列を包含
してなる本発明のＤＮＡ断片は、ジヒドロジピコリン酸
レダクターゼをコードする機能を実質的に損なうことが
ない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基で置換され
ていてもよく、あるいは新たに塩基が挿入されていても
よく、また一部の塩基が欠損または転位していてもよ
く、これら誘導体のいずれもが、本発明のジヒドロジピ
コリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片に包含されるものである。以上に詳述したジヒドロ
ジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含む大
きさ約３.５ｋｂのＤＮＡ断片の各種制限酵素による切
断点地図を図１に示す。
てなる本発明のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細
菌染色体ＤＮＡから単離されたもののみならず、通常用
いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシ
ステムズ社製３９４型を用いて合成されたものであって
もよい。また、配列番号：１に示される塩基配列を包含
してなる本発明のＤＮＡ断片は、ジヒドロジピコリン酸
レダクターゼをコードする機能を実質的に損なうことが
ない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基で置換され
ていてもよく、あるいは新たに塩基が挿入されていても
よく、また一部の塩基が欠損または転位していてもよ
く、これら誘導体のいずれもが、本発明のジヒドロジピ
コリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片に包含されるものである。以上に詳述したジヒドロ
ジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含む大
きさ約３.５ｋｂのＤＮＡ断片の各種制限酵素による切
断点地図を図１に示す。
【００１２】本発明のジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）を適
当なプラスミドベクター、例えば、コリネ型細菌内でプ
ラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも保有
するプラスミドベクターに導入することにより、コリネ
型細菌内でジヒドロジピコリン酸レダクターゼを高発現
する優れた組換えプラスミドを得ることができる。
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）を適
当なプラスミドベクター、例えば、コリネ型細菌内でプ
ラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも保有
するプラスミドベクターに導入することにより、コリネ
型細菌内でジヒドロジピコリン酸レダクターゼを高発現
する優れた組換えプラスミドを得ることができる。
【００１３】また、本発明のジヒドロジピコリン酸レダ
クターゼをコードする遺伝子を発現させるためのプロモ
ーターは、コリネ型細菌が保有する該遺伝子自身のプロ
モーターのみならず、コリネ型細菌内でジヒドロジピコ
リン酸レダクターゼ遺伝子の転写を開始させ得るプロモ
ーターであれば、原核生物に由来する天然または合成塩
基配列であっても、その他のいかなる塩基配列であって
もよい。
クターゼをコードする遺伝子を発現させるためのプロモ
ーターは、コリネ型細菌が保有する該遺伝子自身のプロ
モーターのみならず、コリネ型細菌内でジヒドロジピコ
リン酸レダクターゼ遺伝子の転写を開始させ得るプロモ
ーターであれば、原核生物に由来する天然または合成塩
基配列であっても、その他のいかなる塩基配列であって
もよい。
【００１４】本発明のＡ断片を導入することができ、コ
リネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子
を少なくとも保有するプラスミドベクターとしては、例
えば、プラスミドｐＣＲＹ３０（特開平3-210184号公
報)；プラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣ
ＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣ
ＲＹ３ＫＸ(特開平2-276579号公報)；プラスミドｐＣＲ
Ｙ２およびｐＣＲＹ３（特開平1-191686号公報)；プラ
スミドｐＡＭ３３０（特開昭58-67679号公報);プラスミ
ドｐＨＭ１５１９（特開昭58-77895号公報)；プラスミ
ドｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１およびｐＡＪ１８４４
（特開昭58-192900号公報）；プラスミドｐＣＧ１（特
開昭57-134500号公報)；プラスミドｐＣＧ２（特開昭58
-35197号公報）；プラスミドｐＣＧ４およびｐＣＧ１１
（特開昭57-183799号公報）等のプラスミドを例示する
ことができる。これらの中でも、コリネ型細菌内でプラ
スミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域およ
びコリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤ
ＮＡ領域を保有するプラスミドが好ましく、例えば、プ
ラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２Ｋ
Ｅ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、
ｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に用いられる。
リネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子
を少なくとも保有するプラスミドベクターとしては、例
えば、プラスミドｐＣＲＹ３０（特開平3-210184号公
報)；プラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣ
ＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣ
ＲＹ３ＫＸ(特開平2-276579号公報)；プラスミドｐＣＲ
Ｙ２およびｐＣＲＹ３（特開平1-191686号公報)；プラ
スミドｐＡＭ３３０（特開昭58-67679号公報);プラスミ
ドｐＨＭ１５１９（特開昭58-77895号公報)；プラスミ
ドｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１およびｐＡＪ１８４４
（特開昭58-192900号公報）；プラスミドｐＣＧ１（特
開昭57-134500号公報)；プラスミドｐＣＧ２（特開昭58
-35197号公報）；プラスミドｐＣＧ４およびｐＣＧ１１
（特開昭57-183799号公報）等のプラスミドを例示する
ことができる。これらの中でも、コリネ型細菌内でプラ
スミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域およ
びコリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤ
ＮＡ領域を保有するプラスミドが好ましく、例えば、プ
ラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２Ｋ
Ｅ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、
ｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に用いられる。
【００１５】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法の１例を以下に示す。ブレビバクテリウム・
スタチオニス（Brevibacterium stationis）IFO12144
（FERM BP-2515）からプラスミドｐＢＹ５０３（特開平
1-95785号公報）ＤＮＡを常法により抽出し、これを制
限酵素ＸｈｏＩで処理して、プラスミド複製増殖機能を
司る遺伝子を含む大きさが約４.０ｋｂのＤＮＡ断片を
切り出す。同様にして該プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで処理して、プラスミド安定化
機能を司る遺伝子を含む大きさが約２.１ｋｂのＤＮＡ
断片を切り出す。得られた２つのＤＮＡ断片をプラスミ
ドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ
部位およびＳａｌＩ部位にそれぞれ組込むことにより、
プラスミドｐＣＲＹ３０を調製することができる。
製する方法の１例を以下に示す。ブレビバクテリウム・
スタチオニス（Brevibacterium stationis）IFO12144
（FERM BP-2515）からプラスミドｐＢＹ５０３（特開平
1-95785号公報）ＤＮＡを常法により抽出し、これを制
限酵素ＸｈｏＩで処理して、プラスミド複製増殖機能を
司る遺伝子を含む大きさが約４.０ｋｂのＤＮＡ断片を
切り出す。同様にして該プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで処理して、プラスミド安定化
機能を司る遺伝子を含む大きさが約２.１ｋｂのＤＮＡ
断片を切り出す。得られた２つのＤＮＡ断片をプラスミ
ドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ
部位およびＳａｌＩ部位にそれぞれ組込むことにより、
プラスミドｐＣＲＹ３０を調製することができる。
【００１６】次に、上記プラスミドベクターへの本発明
のＡ断片の導入は、例えば、プラスミドベクター中に１
箇所だけ存在する制限酵素部位を該制限酵素で開裂し、
そこに前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下にＤＮＡ
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のＡ断片の導入
は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素ＢａｍＨＩで開
裂させ、そこに前記ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）をＤＮ
Ａリガーゼで連結させることにより行うことができる。
のＡ断片の導入は、例えば、プラスミドベクター中に１
箇所だけ存在する制限酵素部位を該制限酵素で開裂し、
そこに前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下にＤＮＡ
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のＡ断片の導入
は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素ＢａｍＨＩで開
裂させ、そこに前記ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）をＤＮ
Ａリガーゼで連結させることにより行うことができる。
【００１７】かくして造成される本発明のＡ断片をプラ
スミドｐＣＲＹ３０に導入した組換えプラスミドは、ジ
ヒドロジピコリン酸レダクターゼの高産生能力を有して
おりＬ−リジンの製造に好適に利用することができる。
本発明者らは、このプラスミドを“プラスミドｐＣＲＹ
３０−ｄａｐＢ”と命名した。本プラスミドｐＣＲＹ３
０−ｄａｐＢの作製方法については、後記実施例２にて
詳細に説明する。上記手法により造成される本発明のジ
ヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を
含むコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドを宿主
微生物に導入し、該微生物を形質転換して得られる形質
転換微生物を用いてＬ−リジンを安定して効率良く生産
することができる。
スミドｐＣＲＹ３０に導入した組換えプラスミドは、ジ
ヒドロジピコリン酸レダクターゼの高産生能力を有して
おりＬ−リジンの製造に好適に利用することができる。
本発明者らは、このプラスミドを“プラスミドｐＣＲＹ
３０−ｄａｐＢ”と命名した。本プラスミドｐＣＲＹ３
０−ｄａｐＢの作製方法については、後記実施例２にて
詳細に説明する。上記手法により造成される本発明のジ
ヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を
含むコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドを宿主
微生物に導入し、該微生物を形質転換して得られる形質
転換微生物を用いてＬ−リジンを安定して効率良く生産
することができる。
【００１８】本発明による上記組換えプラスミドで形質
転換しうる宿主微生物としては、コリネ型細菌、例え
ば、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM
BP-1497)、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３
−ＡＢ−４１（FERM BP-1498)、ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ２３３−ＡＢＴ−１１（FERM BP-1500)、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＡＢＤ−２
１（FERM BP-1499）等が挙げられる。なお、上記 FERM
BP-1498 の菌株は FERM BP-1497 の菌株を親株としてＤ
Ｌ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノー
ル資化性微生物である（特公昭59-28398号公報参照）。
また、FERM BP-1500 の菌株は FERM BP-1497 の菌株を
親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活
性変異株である（特開昭62-51998号公報参照）。さら
に、FERM BP-1499 の菌株は FERM BP-1497 の菌株を親
株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株
である（特開昭61-177993号公報参照）。
転換しうる宿主微生物としては、コリネ型細菌、例え
ば、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM
BP-1497)、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３
−ＡＢ−４１（FERM BP-1498)、ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ２３３−ＡＢＴ−１１（FERM BP-1500)、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＡＢＤ−２
１（FERM BP-1499）等が挙げられる。なお、上記 FERM
BP-1498 の菌株は FERM BP-1497 の菌株を親株としてＤ
Ｌ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノー
ル資化性微生物である（特公昭59-28398号公報参照）。
また、FERM BP-1500 の菌株は FERM BP-1497 の菌株を
親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活
性変異株である（特開昭62-51998号公報参照）。さら
に、FERM BP-1499 の菌株は FERM BP-1497 の菌株を親
株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株
である（特開昭61-177993号公報参照）。
【００１９】上記微生物の他に、ブレビバクテリウム・
アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC
6871、同 ATCC 13745、同 ATCC 13746、ブレビバクテ
リウム・デバリカム（Brevibacterium divaricatum）AT
CC 4020、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
（Brevibacterium lactofermentum）ATCC 13869、コリ
ネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glut
amicum）ATCC 31830等を宿主微生物として用いることも
できる。なお、宿主としてブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株の保有
するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭63-36787号公報参
照）のために形質転換が困難な場合があるので、そのよ
うな場合には、本菌株よりプラスミドｐＢＹ５０２を除
去することが望ましい。プラスミドｐＢＹ５０２を除去
する方法としては、例えば、継代培養を繰り返すことに
より自然に欠落させることも可能であるし、人為的に除
去することも可能である［Bacteriologi-cal Review, 3
6, 361, 1972 参照]。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人
為的に除去する方法の１例を以下に示す。
アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC
6871、同 ATCC 13745、同 ATCC 13746、ブレビバクテ
リウム・デバリカム（Brevibacterium divaricatum）AT
CC 4020、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
（Brevibacterium lactofermentum）ATCC 13869、コリ
ネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glut
amicum）ATCC 31830等を宿主微生物として用いることも
できる。なお、宿主としてブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株の保有
するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭63-36787号公報参
照）のために形質転換が困難な場合があるので、そのよ
うな場合には、本菌株よりプラスミドｐＢＹ５０２を除
去することが望ましい。プラスミドｐＢＹ５０２を除去
する方法としては、例えば、継代培養を繰り返すことに
より自然に欠落させることも可能であるし、人為的に除
去することも可能である［Bacteriologi-cal Review, 3
6, 361, 1972 参照]。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人
為的に除去する方法の１例を以下に示す。
【００２０】宿主菌ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の生育を不完全に阻害する濃度、例えば０.２
〜５０ μg/ml 濃度のアクリジンオレンジもしくはエチ
ジウムブロミド等を含有する培地に１ｍｌ当たり約１０
菌体の密度で該宿主菌を植菌し、その生育を不完全に阻
害しながら約３５℃で約２４時間培養する。この培養液
を希釈して寒天培地に塗布し、約３５℃で約２日間培養
する。得られたコロニーから各々独立にプラスミド抽出
操作を行ない、プラスミドｐＢＹ５０２が除去されてい
る株を選抜する。この一連の操作により、プラスミドｐ
ＢＹ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来株が得られる。
−２３３の生育を不完全に阻害する濃度、例えば０.２
〜５０ μg/ml 濃度のアクリジンオレンジもしくはエチ
ジウムブロミド等を含有する培地に１ｍｌ当たり約１０
菌体の密度で該宿主菌を植菌し、その生育を不完全に阻
害しながら約３５℃で約２４時間培養する。この培養液
を希釈して寒天培地に塗布し、約３５℃で約２日間培養
する。得られたコロニーから各々独立にプラスミド抽出
操作を行ない、プラスミドｐＢＹ５０２が除去されてい
る株を選抜する。この一連の操作により、プラスミドｐ
ＢＹ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来株が得られる。
【００２１】上記コリネ型細菌への前記組換えプラスミ
ドの形質転換法としては、エシエリヒア・コリ(E. col
i)およびエルビニア・カロトボラ(Erwinia carotovora)
について知られているように［N.M.Calvin および P.C.
Hanawalt, J. Bacteriology,170, 2796, 1988； K.Ito
ら、Agricultural and Biological Chemistry, 52,293,
1988 参照]、ＤＮＡ受容菌にパルス波を通電する方法
［Y.Satoh ら, J.Industrial Microbiology, 5, 159, 1
990］等を利用することができる。
ドの形質転換法としては、エシエリヒア・コリ(E. col
i)およびエルビニア・カロトボラ(Erwinia carotovora)
について知られているように［N.M.Calvin および P.C.
Hanawalt, J. Bacteriology,170, 2796, 1988； K.Ito
ら、Agricultural and Biological Chemistry, 52,293,
1988 参照]、ＤＮＡ受容菌にパルス波を通電する方法
［Y.Satoh ら, J.Industrial Microbiology, 5, 159, 1
990］等を利用することができる。
【００２２】上記の方法で形質転換して得られるジヒド
ロジピコリン酸レダクターゼ高産生能を有するコリネ型
細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３に由来する形質転換株の培養方法を、以下に述べる。
得られた形質転換コリネ型細菌は、炭素源、窒素源、無
機非金属または金属塩、ビタミン類等、該細菌の増殖に
必要かつ十分な栄養成分を含有する培地を用いて、適当
な好気、温度、ｐＨ条件の下に培養することができる。
培地に含有される栄養成分は、培養の開始時に全て添加
することもできるし、また培養の進展に伴い逐次または
連続的に添加することもできる。
ロジピコリン酸レダクターゼ高産生能を有するコリネ型
細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３に由来する形質転換株の培養方法を、以下に述べる。
得られた形質転換コリネ型細菌は、炭素源、窒素源、無
機非金属または金属塩、ビタミン類等、該細菌の増殖に
必要かつ十分な栄養成分を含有する培地を用いて、適当
な好気、温度、ｐＨ条件の下に培養することができる。
培地に含有される栄養成分は、培養の開始時に全て添加
することもできるし、また培養の進展に伴い逐次または
連続的に添加することもできる。
【００２３】培地中の炭素源としては、例えば、グルコ
ース、グリセロール、フルクトース、シュクロース、マ
ルトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の炭水化物；コハク
酸、フマル酸、酢酸、乳酸等の有機酸；エタノール、メ
タノール等のアルコール類の中から培養対象細菌が資化
可能な炭素源を選択して、単独でまたは組合わせて用い
ることができる。培養開始時の炭素源濃度は１〜５容量
％であることが好ましく、さらに好ましくは２〜３容量
％である。窒素源としては、例えば、アンモニアまたは
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各種無機
あるいは有機アンモニウム塩類；尿素等の他の無機含窒
素化合物；グルタミン酸等のアミノ酸類；ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、カゼミノ酸、コーンスチープリカ
ー等の含窒素天然栄養源等を用いることができる。
ース、グリセロール、フルクトース、シュクロース、マ
ルトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の炭水化物；コハク
酸、フマル酸、酢酸、乳酸等の有機酸；エタノール、メ
タノール等のアルコール類の中から培養対象細菌が資化
可能な炭素源を選択して、単独でまたは組合わせて用い
ることができる。培養開始時の炭素源濃度は１〜５容量
％であることが好ましく、さらに好ましくは２〜３容量
％である。窒素源としては、例えば、アンモニアまたは
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各種無機
あるいは有機アンモニウム塩類；尿素等の他の無機含窒
素化合物；グルタミン酸等のアミノ酸類；ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、カゼミノ酸、コーンスチープリカ
ー等の含窒素天然栄養源等を用いることができる。
【００２４】無機非金属塩または金属塩としては、リン
酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸アンモ
ニウム、硫酸第一鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化マンガン、硫酸マンガン等を用いることがで
きる。ビタミン類としてはビオチン、チアミンなどを必
要に応じて用いるが、含窒素天然栄養源の中にはこれら
のビタミン類を含有するものがあるので、これをもって
ビタミン類の代替とすることも可能である。培養は通
常、振盪培養、通気攪拌培養等の好気条件下で行なう。
培養温度は一般に約２０〜４０℃、好ましくは約２５〜
３５℃に、培地のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８の
中性付近に、それぞれ維持することが好ましい。培地の
ｐＨ調整は、適当な酸またはアルカリを添加して行うこ
とができる。培養期間は通常１〜７日間とすることがで
きる。培養菌体は、培養終了後に遠心分離、膜分離等の
適当な手段で培養液から分離回収することができる。
酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸アンモ
ニウム、硫酸第一鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化マンガン、硫酸マンガン等を用いることがで
きる。ビタミン類としてはビオチン、チアミンなどを必
要に応じて用いるが、含窒素天然栄養源の中にはこれら
のビタミン類を含有するものがあるので、これをもって
ビタミン類の代替とすることも可能である。培養は通
常、振盪培養、通気攪拌培養等の好気条件下で行なう。
培養温度は一般に約２０〜４０℃、好ましくは約２５〜
３５℃に、培地のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８の
中性付近に、それぞれ維持することが好ましい。培地の
ｐＨ調整は、適当な酸またはアルカリを添加して行うこ
とができる。培養期間は通常１〜７日間とすることがで
きる。培養菌体は、培養終了後に遠心分離、膜分離等の
適当な手段で培養液から分離回収することができる。
【００２５】上記手法で得られる培養物または培養物か
ら得られる菌株を用いて発酵法または酵素法によりＬ−
リジンを製造することができる。次に実施例により本発
明をさらに具体的に説明する。当然ながら、下記実施例
は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙
げたものであり、本発明の範囲を何ら限定するものでは
ない。
ら得られる菌株を用いて発酵法または酵素法によりＬ−
リジンを製造することができる。次に実施例により本発
明をさらに具体的に説明する。当然ながら、下記実施例
は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙
げたものであり、本発明の範囲を何ら限定するものでは
ない。
【００２６】
【実施例】実施例１ ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子
を含むブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来
のＤＮＡ断片（Ａ断片）のクローン化（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素 ２ｇ、硫酸アンモニウ
ム ７ｇ、リン酸一カリウム ０.５ｇ、リン酸二カリウ
ム ０.５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.５ｇ、ＭｎＳＯ4
・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、
酵母エキス２.５ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２０
０μｇ、塩酸チアミン １００μｇ、グルコース ２０ｇ
を蒸留水に溶解して１ｌとする］１ｌを用いてブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）を
対数増殖期後期まで培養し、培養菌体を回収した。得ら
れた菌体を、リゾチームを１０ mg/ml の濃度で含有す
る溶液［組成：１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス緩
衝液（ｐＨ８.０)、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ]１５ｍｌ
に懸濁した。続いて最終濃度１００ μg/ml 量のプロテ
ナーゼＫを添加し、３７℃で１時間インキュベートし
た。さらに最終濃度０.５％量のドデシル硫酸ナトリウ
ムを添加し、５０℃で６時間インキュベートして溶菌し
た。この溶菌液に、等量のフェノール/クロロホルム溶
液（１：１、ｖ/ｖ）を添加し、室温で１０分間穏やかに
振盪した後、全量を１０〜１２℃で２０分間、５,００
０×ｇの遠心分離にかけ、その上清画分を分取した。酢
酸ナトリウムをその最終濃度が０.３Ｍとなるように該
画分に添加し、次いで２倍量のエタノールを穏やかに添
加した。水層とエタノール層との間に存在するＤＮＡを
ガラス棒で搦め取り、これを７０％エタノールで洗浄し
た後に風乾した。得られたＤＮＡは、溶液［組成；１０
ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.５)、１ｍＭＥＤＴＡ・２
Ｎａ］５ｍｌを添加して４℃で一晩静置した後、実験に
供した。
を含むブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来
のＤＮＡ断片（Ａ断片）のクローン化（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素 ２ｇ、硫酸アンモニウ
ム ７ｇ、リン酸一カリウム ０.５ｇ、リン酸二カリウ
ム ０.５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.５ｇ、ＭｎＳＯ4
・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、
酵母エキス２.５ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２０
０μｇ、塩酸チアミン １００μｇ、グルコース ２０ｇ
を蒸留水に溶解して１ｌとする］１ｌを用いてブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）を
対数増殖期後期まで培養し、培養菌体を回収した。得ら
れた菌体を、リゾチームを１０ mg/ml の濃度で含有す
る溶液［組成：１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス緩
衝液（ｐＨ８.０)、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ]１５ｍｌ
に懸濁した。続いて最終濃度１００ μg/ml 量のプロテ
ナーゼＫを添加し、３７℃で１時間インキュベートし
た。さらに最終濃度０.５％量のドデシル硫酸ナトリウ
ムを添加し、５０℃で６時間インキュベートして溶菌し
た。この溶菌液に、等量のフェノール/クロロホルム溶
液（１：１、ｖ/ｖ）を添加し、室温で１０分間穏やかに
振盪した後、全量を１０〜１２℃で２０分間、５,００
０×ｇの遠心分離にかけ、その上清画分を分取した。酢
酸ナトリウムをその最終濃度が０.３Ｍとなるように該
画分に添加し、次いで２倍量のエタノールを穏やかに添
加した。水層とエタノール層との間に存在するＤＮＡを
ガラス棒で搦め取り、これを７０％エタノールで洗浄し
た後に風乾した。得られたＤＮＡは、溶液［組成；１０
ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.５)、１ｍＭＥＤＴＡ・２
Ｎａ］５ｍｌを添加して４℃で一晩静置した後、実験に
供した。
【００２７】（Ｂ）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドの創製およ
び選抜 前記（Ａ）項で得られたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３の全ＤＮＡ溶液 ９０μｌを、５０ unit
の制限酵素ＨｉｎｄIIIと３７℃で１時間反応させて完
全分解した。また、カナマイシン耐性遺伝子を有するク
ローニングベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）を制限
酵素ＨｉｎｄIIIで分解した後、その分解物を脱リン酸
化した。得られたそれぞれのＤＮＡ分解物溶液を６５℃
で１０分間加熱して制限酵素を失活させた後に混合し、
該液に、それぞれの最終濃度が５０ｍＭ トリス緩衝液
（ｐＨ７.６)、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、およびＴ４ＤＮＡリガー
ゼ １ unit となるように各成分を添加し、４℃で１５
時間反応させて、ＤＮＡを結合させた。
をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドの創製およ
び選抜 前記（Ａ）項で得られたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３の全ＤＮＡ溶液 ９０μｌを、５０ unit
の制限酵素ＨｉｎｄIIIと３７℃で１時間反応させて完
全分解した。また、カナマイシン耐性遺伝子を有するク
ローニングベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）を制限
酵素ＨｉｎｄIIIで分解した後、その分解物を脱リン酸
化した。得られたそれぞれのＤＮＡ分解物溶液を６５℃
で１０分間加熱して制限酵素を失活させた後に混合し、
該液に、それぞれの最終濃度が５０ｍＭ トリス緩衝液
（ｐＨ７.６)、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、およびＴ４ＤＮＡリガー
ゼ １ unit となるように各成分を添加し、４℃で１５
時間反応させて、ＤＮＡを結合させた。
【００２８】上記手順により得られたプラスミド混液を
用い、塩化カルシウム法［J. Mol.Biol., 53, 159 (197
0)］により前記ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ欠損
大腸菌変異株、エシエリヒア・コリ（Escherichia col
i）ＣＧＳＧ４５４９（ｄａｐＢ)［(）内はジヒドロジ
ピコリン酸レダクターゼ遺伝子型を示す］を形質転換し
た。形質転換した前記エシエリヒア・コリＣＧＳＧ４５
４９（ｄａｐＢ）株を、カナマイシン ５０ｍｇを含有
する選択培地［組成；Ｋ2ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4２
ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１
ｇ、グルコース ２０ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水 １
ｌに溶解する］に塗抹した。この培地上に生育したジヒ
ドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含
むプラスミドを保持する菌株を、常法により液体培養し
て培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプ
ラスミドを制限酵素により分解し、得られた分解物をア
ガロースゲル電気泳動に供して解析した結果、プラスミ
ドｐＨＳＧ２９８の大きさ２.７ｋｂのＤＮＡ断片に加
えて、大きさ約３.５ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められ
た。本発明者らは、このプラスミドを“プラスミドｐＨ
ＳＧ２９８−ｄａｐＢ”と命名した。
用い、塩化カルシウム法［J. Mol.Biol., 53, 159 (197
0)］により前記ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ欠損
大腸菌変異株、エシエリヒア・コリ（Escherichia col
i）ＣＧＳＧ４５４９（ｄａｐＢ)［(）内はジヒドロジ
ピコリン酸レダクターゼ遺伝子型を示す］を形質転換し
た。形質転換した前記エシエリヒア・コリＣＧＳＧ４５
４９（ｄａｐＢ）株を、カナマイシン ５０ｍｇを含有
する選択培地［組成；Ｋ2ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4２
ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１
ｇ、グルコース ２０ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水 １
ｌに溶解する］に塗抹した。この培地上に生育したジヒ
ドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含
むプラスミドを保持する菌株を、常法により液体培養し
て培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプ
ラスミドを制限酵素により分解し、得られた分解物をア
ガロースゲル電気泳動に供して解析した結果、プラスミ
ドｐＨＳＧ２９８の大きさ２.７ｋｂのＤＮＡ断片に加
えて、大きさ約３.５ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められ
た。本発明者らは、このプラスミドを“プラスミドｐＨ
ＳＧ２９８−ｄａｐＢ”と命名した。
【００２９】（Ｃ）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）のサブ
クローニング 前記（Ｂ）で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｄａ
ｐＢに含まれる挿入ＤＮＡ断片を下記手順にてプラスミ
ドｐＵＣ１１８（宝酒造製）にサブクローニングした。
前記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｄａｐＢを制限酵素Ｈ
ｉｎｄIIIと反応させて言えられる分解物と、プイラス
ミドｐＵＣ１１８を制限酵素ＨｉｎｄIIIと反応させて
得られる分解物とを混合した。この混合液を６５℃で１
０分間加熱して酵素を失活させた後に、それぞれの最終
濃度が ５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.６)、１０ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ unit となるよう
に各成分を添加し、１２℃で１５時間反応させて、ＤＮ
Ａ分解物を結合させた。
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）のサブ
クローニング 前記（Ｂ）で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｄａ
ｐＢに含まれる挿入ＤＮＡ断片を下記手順にてプラスミ
ドｐＵＣ１１８（宝酒造製）にサブクローニングした。
前記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｄａｐＢを制限酵素Ｈ
ｉｎｄIIIと反応させて言えられる分解物と、プイラス
ミドｐＵＣ１１８を制限酵素ＨｉｎｄIIIと反応させて
得られる分解物とを混合した。この混合液を６５℃で１
０分間加熱して酵素を失活させた後に、それぞれの最終
濃度が ５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.６)、１０ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ unit となるよう
に各成分を添加し、１２℃で１５時間反応させて、ＤＮ
Ａ分解物を結合させた。
【００３０】得られたプラスミド混液を用いて、塩化カ
ルシウム法(J. Mol. Bio., 53, 159, 1970）により前記
エシエリヒア・コリＣＧＳＧ４３４５株を形質転換し、
カナマイシンを５０ｍｇ含有する選択培地［組成：Ｋ2
ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＫＨ4)2ＳＯ4 １
ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコース ２０ｇ
および寒天 １６ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする］に
塗抹した。この培地上に生育した菌株を常法により液体
培養し、該培養液から常法によりプラスミドＤＮＡを抽
出した。抽出したプラスミドを制限酵素により分解し、
得られた分解物をアガロースゲル電気泳動に供した結
果、プラスミドｐＵＣ１１８の大きさ約３.２ｋｂのＤ
ＮＡ断片に加え、大きさ約３.５ｋｂの挿入ＤＮＡ断片
が認められた。確認された大きさ約３.５ｋｂの挿入Ｄ
ＮＡ断片を各種の制限酵素で切断したときの制限酵素認
識部位数および切断断片の大きさは前記表１に示したと
同一であった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を
図１に示す。また、上記手法により得られたプラスミド
を各種制限酵素で切断したときの制限酵素認識部位数お
よび切断断片の大きさを下記表２に示す。
ルシウム法(J. Mol. Bio., 53, 159, 1970）により前記
エシエリヒア・コリＣＧＳＧ４３４５株を形質転換し、
カナマイシンを５０ｍｇ含有する選択培地［組成：Ｋ2
ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＫＨ4)2ＳＯ4 １
ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコース ２０ｇ
および寒天 １６ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする］に
塗抹した。この培地上に生育した菌株を常法により液体
培養し、該培養液から常法によりプラスミドＤＮＡを抽
出した。抽出したプラスミドを制限酵素により分解し、
得られた分解物をアガロースゲル電気泳動に供した結
果、プラスミドｐＵＣ１１８の大きさ約３.２ｋｂのＤ
ＮＡ断片に加え、大きさ約３.５ｋｂの挿入ＤＮＡ断片
が認められた。確認された大きさ約３.５ｋｂの挿入Ｄ
ＮＡ断片を各種の制限酵素で切断したときの制限酵素認
識部位数および切断断片の大きさは前記表１に示したと
同一であった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を
図１に示す。また、上記手法により得られたプラスミド
を各種制限酵素で切断したときの制限酵素認識部位数お
よび切断断片の大きさを下記表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】上記表２に示した制限酵素の切断断片によ
り特徴付けられるプラスミドを、“プラスミドｐＵＣ１
１８−ｄａｐＢ”と命名した。以上により、ジヒドロジ
ピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含む大き
さ約３.５ｋｂのＤＮＡ断片（ＨｉｎｄIII断片；Ａ断
片）を取得した。
り特徴付けられるプラスミドを、“プラスミドｐＵＣ１
１８−ｄａｐＢ”と命名した。以上により、ジヒドロジ
ピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含む大き
さ約３.５ｋｂのＤＮＡ断片（ＨｉｎｄIII断片；Ａ断
片）を取得した。
【００３３】実施例２ ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子
のＤＮＡ塩基配列の決定 実施例１（Ｃ）項で得たジヒドロジピコリン酸レダクタ
ーゼをコードする遺伝子を含む大きさ約３.５ｋｂのＤ
ＮＡ断片の塩基配列を、プラスミドｐＵＣ１１８または
ｐＵＣ１１９を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
（dideoxy chaintermination 法）により、図２に示し
た戦略図に従って決定した。得られた塩基配列中のオー
プン・リーディング・フレームの存在からジヒドロジピ
コリン酸レダクターゼをコードする遺伝子は後記配列表
の配列番号：１に示す塩基配列を有する２４９個のアミ
ノ酸をコードする７４７塩基対より構成されていること
が判明した。
のＤＮＡ塩基配列の決定 実施例１（Ｃ）項で得たジヒドロジピコリン酸レダクタ
ーゼをコードする遺伝子を含む大きさ約３.５ｋｂのＤ
ＮＡ断片の塩基配列を、プラスミドｐＵＣ１１８または
ｐＵＣ１１９を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
（dideoxy chaintermination 法）により、図２に示し
た戦略図に従って決定した。得られた塩基配列中のオー
プン・リーディング・フレームの存在からジヒドロジピ
コリン酸レダクターゼをコードする遺伝子は後記配列表
の配列番号：１に示す塩基配列を有する２４９個のアミ
ノ酸をコードする７４７塩基対より構成されていること
が判明した。
【００３４】実施例３ プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＢの調製およびコリネ
型細菌への導入（Ａ）プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＢの調製 実施例１（Ｂ）で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９８−
ｄａｐＢ ５μｇを、各々 ５ units の制限酵素Ｘｂａ
ＩおよびＤｒａＩと、３７℃で１時間反応させて分解
し、そのＤＮＡ分解物の末端部位を常法により処理して
平滑末端とした。このＤＮＡ分解物とＢａｍＨIリンカ
ー（宝酒造製） １μｇとを混合した。混合液を６５℃
で１０分間加熱して酵素を失活させた後に、それぞれの
最終濃度が５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.６)、１０
ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ unit となるよ
うに各成分を添加し、１２℃で１５時間反応させて結合
させた。得られた連結ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨI ３ u
nits と３７℃で１時間反応させて得られたＤＮＡ分解
物と、特開平3-210184号公報に記載の方法に基いて調製
したプラスミドｐＣＲＹ３０ １μｇを制限酵素Ｂａｍ
ＨI １ unit と３７℃で１時間反応させて得られたＤＮ
Ａ分解物とを混合し、この混合液を６５℃で１０分間加
熱して酵素を失活させた後に、それぞれの最終濃度が
５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.６)、１０ｍＭ ジチオ
スレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ2、お
よびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ unit となるように各成分
を添加し、１２℃で１５時間反応させて、ＤＮＡ分解物
を結合させた。
型細菌への導入（Ａ）プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＢの調製 実施例１（Ｂ）で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９８−
ｄａｐＢ ５μｇを、各々 ５ units の制限酵素Ｘｂａ
ＩおよびＤｒａＩと、３７℃で１時間反応させて分解
し、そのＤＮＡ分解物の末端部位を常法により処理して
平滑末端とした。このＤＮＡ分解物とＢａｍＨIリンカ
ー（宝酒造製） １μｇとを混合した。混合液を６５℃
で１０分間加熱して酵素を失活させた後に、それぞれの
最終濃度が５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.６)、１０
ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ unit となるよ
うに各成分を添加し、１２℃で１５時間反応させて結合
させた。得られた連結ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨI ３ u
nits と３７℃で１時間反応させて得られたＤＮＡ分解
物と、特開平3-210184号公報に記載の方法に基いて調製
したプラスミドｐＣＲＹ３０ １μｇを制限酵素Ｂａｍ
ＨI １ unit と３７℃で１時間反応させて得られたＤＮ
Ａ分解物とを混合し、この混合液を６５℃で１０分間加
熱して酵素を失活させた後に、それぞれの最終濃度が
５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.６)、１０ｍＭ ジチオ
スレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ2、お
よびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ unit となるように各成分
を添加し、１２℃で１５時間反応させて、ＤＮＡ分解物
を結合させた。
【００３５】得られたプラスミド混液を用いて、前記実
施例１（Ｂ）に記載の常法により、前記エシェリヒア・
コリＣＧＳＧ４５４９株を形質転換し、カナマイシンを
５０μg/ml の濃度で含有する選択培地［組成：Ｋ2ＨＰ
Ｏ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 １ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコース ２０ｇおよび
寒天 １６ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする］に塗抹し
た。この培地上に生育した菌株を常法により液体培養
し、該培養液から常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し
た。抽出したプラスミドを制限酵素により分解し、得ら
れた分解物をアガロースゲル電気泳動に供した結果、プ
ラスミドｐＣＲＹ３０の大きさ約８.６ｋｂのＤＮＡ断
片に加え、大きさ約８００ｂｐの挿入ＤＮＡ断片が認め
られた。
施例１（Ｂ）に記載の常法により、前記エシェリヒア・
コリＣＧＳＧ４５４９株を形質転換し、カナマイシンを
５０μg/ml の濃度で含有する選択培地［組成：Ｋ2ＨＰ
Ｏ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 １ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコース ２０ｇおよび
寒天 １６ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする］に塗抹し
た。この培地上に生育した菌株を常法により液体培養
し、該培養液から常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し
た。抽出したプラスミドを制限酵素により分解し、得ら
れた分解物をアガロースゲル電気泳動に供した結果、プ
ラスミドｐＣＲＹ３０の大きさ約８.６ｋｂのＤＮＡ断
片に加え、大きさ約８００ｂｐの挿入ＤＮＡ断片が認め
られた。
【００３６】（Ｂ）プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＢ
のコリネ型細菌への導入 上記の如く調整されたプラスミドＤＮＡを、電気パルス
法を用いて次のとおりコリネ型細菌へ形質転換した。ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-14
97）プラスミド除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数
増殖期初期まで培養した後、ペニシリンＧを１ unit/m
ｌ となるように添加してさらに２時間振盪培養した。
培養菌体を遠心分離にて集め、２０ｍｌのパルス用溶液
［組成：２７２ｍＭ シュークロース、７ｍＭ ＫＨ2Ｐ
Ｏ4、１ｍＭ ＭｇＣｌ2；ｐＨ７.４］にて洗浄した。再
度、遠心分離にて菌体を集め、５ｍｌのパルス用溶液に
懸濁し、０.７５ｍｌの細胞と前記（Ａ）で得られたプ
ラスミド溶液５０μｌとを混合し、氷中にて２０分間静
置した。ジーンパルサー（バイオラド社製）を用いて、
２５００ボルト、２５μＦＤに設定し、パルスを印加後
氷中に２０分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に
移し、３０℃にて１時間培養した後、カナマイシン １
５ μg/ml（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌し
て３０℃で２〜３日間培養した。出現したカナマイシン
耐性株より、常法によりプラスミドを得た。このプラス
ミドを各種制限酵素で切断し、得られた切断断片の大き
さを測定した。その結果を下記表３に示す。
のコリネ型細菌への導入 上記の如く調整されたプラスミドＤＮＡを、電気パルス
法を用いて次のとおりコリネ型細菌へ形質転換した。ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-14
97）プラスミド除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数
増殖期初期まで培養した後、ペニシリンＧを１ unit/m
ｌ となるように添加してさらに２時間振盪培養した。
培養菌体を遠心分離にて集め、２０ｍｌのパルス用溶液
［組成：２７２ｍＭ シュークロース、７ｍＭ ＫＨ2Ｐ
Ｏ4、１ｍＭ ＭｇＣｌ2；ｐＨ７.４］にて洗浄した。再
度、遠心分離にて菌体を集め、５ｍｌのパルス用溶液に
懸濁し、０.７５ｍｌの細胞と前記（Ａ）で得られたプ
ラスミド溶液５０μｌとを混合し、氷中にて２０分間静
置した。ジーンパルサー（バイオラド社製）を用いて、
２５００ボルト、２５μＦＤに設定し、パルスを印加後
氷中に２０分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に
移し、３０℃にて１時間培養した後、カナマイシン １
５ μg/ml（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌し
て３０℃で２〜３日間培養した。出現したカナマイシン
耐性株より、常法によりプラスミドを得た。このプラス
ミドを各種制限酵素で切断し、得られた切断断片の大き
さを測定した。その結果を下記表３に示す。
【００３７】
【表３】
【００３８】上記表３に示した制限酵素の切断断片によ
り特徴付けられるプラスミドを、“プラスミドｐＣＲＹ
３０−ｄａｐＢ"、該プラスミドを保持する菌株を“ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ｄａｐＢ”と
それぞれ命名した。上記表３から明らかな如く、前記プ
ラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＢを制限酵素ＢａｍＨI
で切断することにより、プラスミドｐＨＳＧ２９８に由
来する大きさ８.６ｋｂのＤＮＡ断片に加えて、ジヒド
ロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含む
大きさ約８００ｂｐのＤＮＡ断片が確認された。なお、
複合プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＢにより形質転換
されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ｄａ
ｐＢは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院
生命工学工業技術研究所に、平成５年８月６日付けで受
託番号：FERM P-13790 として寄託されている。
り特徴付けられるプラスミドを、“プラスミドｐＣＲＹ
３０−ｄａｐＢ"、該プラスミドを保持する菌株を“ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ｄａｐＢ”と
それぞれ命名した。上記表３から明らかな如く、前記プ
ラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＢを制限酵素ＢａｍＨI
で切断することにより、プラスミドｐＨＳＧ２９８に由
来する大きさ８.６ｋｂのＤＮＡ断片に加えて、ジヒド
ロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含む
大きさ約８００ｂｐのＤＮＡ断片が確認された。なお、
複合プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＢにより形質転換
されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ｄａ
ｐＢは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院
生命工学工業技術研究所に、平成５年８月６日付けで受
託番号：FERM P-13790 として寄託されている。
【００３９】実施例４ プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＢの安定性の確認 前記Ａ培地 １００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理した後、この培地
に実施例３で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３−ｄａｐＢを植菌し、３０℃で２４時間の振盪培養
を行った。次いで、同様にしてＡ培地１００ｍｌを５０
０ｍｌ容三角フラスコに分注して１２０℃で１５分間滅
菌した培地に、培地１ｍｌ当たり５０細胞の密度で植継
し、再度３０℃で２４時間の振盪培養を行った。培養物
を遠心分離して菌体を回収し、回収した菌体を洗浄し
た。得られた菌体を、カナマイシンを１５ μg/ml の濃
度で添加した平板Ａ培地およびカナマイシン無添加の平
板Ａ培地に一定量塗抹し、３０℃で１日培養した後に、
生育したコロニーの数を計測した。また、カナマイシン
無添加のＡ培地上に生育したコロニーの菌株について
は、カナマイシン添加Ａ培地上での生育の可否も調査し
た。その結果、カナマイシン添加Ａ培地および無添加Ａ
培地における生育コロニー数は同数であり、さらにカナ
マイシン無添加Ａ培地上に生育したコロニーの菌株は全
てカナマイシン添加Ａ培地上に生育可能であった。これ
により、本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＢが
高度の安定性を有することが確認された。
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理した後、この培地
に実施例３で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３−ｄａｐＢを植菌し、３０℃で２４時間の振盪培養
を行った。次いで、同様にしてＡ培地１００ｍｌを５０
０ｍｌ容三角フラスコに分注して１２０℃で１５分間滅
菌した培地に、培地１ｍｌ当たり５０細胞の密度で植継
し、再度３０℃で２４時間の振盪培養を行った。培養物
を遠心分離して菌体を回収し、回収した菌体を洗浄し
た。得られた菌体を、カナマイシンを１５ μg/ml の濃
度で添加した平板Ａ培地およびカナマイシン無添加の平
板Ａ培地に一定量塗抹し、３０℃で１日培養した後に、
生育したコロニーの数を計測した。また、カナマイシン
無添加のＡ培地上に生育したコロニーの菌株について
は、カナマイシン添加Ａ培地上での生育の可否も調査し
た。その結果、カナマイシン添加Ａ培地および無添加Ａ
培地における生育コロニー数は同数であり、さらにカナ
マイシン無添加Ａ培地上に生育したコロニーの菌株は全
てカナマイシン添加Ａ培地上に生育可能であった。これ
により、本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＢが
高度の安定性を有することが確認された。
【００４０】実施例５ ジヒドロジピコリン酸レダクターゼの酵素活性測定（Ａ）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性測定用粗
酵素液の調製 培地［組成：尿素 ０.４％、硫酸アンモニウム １.４
％、リン酸一カリウム０.０５％、リン酸二カリウム
０.０５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％、ＣａＣｌ2
・２Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、
ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ ２ｐｐｍ、ＮａＣｌ ２ｐｐｍ、ビオチン ２００μ
ｇ/ｌ、塩酸チアミン １００μｇ/ｌ、カザミノ酸 ０.
１％、酵母エキス ０.１％を蒸留水に溶解］１００ｍｌ
を５００ｍｌ容三角フラスコに分注して滅菌（滅菌後ｐ
Ｈ７.０）した後、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３−ｄａｐＢを植菌した。次いで５ｇ/ｌ(最終濃
度）のグルコースを無菌的に添加し、３０℃で２日間振
盪培養を行った。次に、本培養培地［組成：グルコース
５％、硫酸アンモニウム ２.３％、リン酸一カリウム
０.０５％、リン酸二カリウム ０.０５％、ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ０.５％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ、Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ、ビオチン ２００μ
ｇ/ｌ、塩酸チアミン １００μｇ/ｌ、カザミノ酸０.３
％、酵母エキス ０.３％を蒸留水に溶解］１０００ｍｌ
を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、１２０℃で２０分間滅菌
した後、この槽に前記振盪培養により得られた培養物
２０ｍｌを添加し、回転数１０００ｒｐｍ、通気量１ｖ
ｖｍ、温度３３℃、培地のｐＨ７.６の培養条件下で２
４時間培養を行った。培養終了後、培養物 ５００ｍｌ
を遠心分離にかけて培養菌体を回収した。得られた菌体
を脱塩蒸留水にて２回洗浄した後、該菌体を０.１Ｍ リ
ン酸緩衝液（ｐＨ６.８) ３〜５ｍｌに懸濁し、これを
超音波処理（３分間単位で３回、処理温度−１０℃）し
て菌体を破砕した。菌体を破砕した後、破砕液を４℃で
２０分間、６,０００ｒｐｍの遠心分離に供し、その上
澄画分を分取した。得られた上澄液、即ち菌体抽出液を
粗酵素液として常法に従いジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼ活性の測定に供した（TamirH., Meth. Enzymol.
17B, 134-139, 1971）。
酵素液の調製 培地［組成：尿素 ０.４％、硫酸アンモニウム １.４
％、リン酸一カリウム０.０５％、リン酸二カリウム
０.０５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％、ＣａＣｌ2
・２Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、
ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ ２ｐｐｍ、ＮａＣｌ ２ｐｐｍ、ビオチン ２００μ
ｇ/ｌ、塩酸チアミン １００μｇ/ｌ、カザミノ酸 ０.
１％、酵母エキス ０.１％を蒸留水に溶解］１００ｍｌ
を５００ｍｌ容三角フラスコに分注して滅菌（滅菌後ｐ
Ｈ７.０）した後、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３−ｄａｐＢを植菌した。次いで５ｇ/ｌ(最終濃
度）のグルコースを無菌的に添加し、３０℃で２日間振
盪培養を行った。次に、本培養培地［組成：グルコース
５％、硫酸アンモニウム ２.３％、リン酸一カリウム
０.０５％、リン酸二カリウム ０.０５％、ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ０.５％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ、Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ、ビオチン ２００μ
ｇ/ｌ、塩酸チアミン １００μｇ/ｌ、カザミノ酸０.３
％、酵母エキス ０.３％を蒸留水に溶解］１０００ｍｌ
を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、１２０℃で２０分間滅菌
した後、この槽に前記振盪培養により得られた培養物
２０ｍｌを添加し、回転数１０００ｒｐｍ、通気量１ｖ
ｖｍ、温度３３℃、培地のｐＨ７.６の培養条件下で２
４時間培養を行った。培養終了後、培養物 ５００ｍｌ
を遠心分離にかけて培養菌体を回収した。得られた菌体
を脱塩蒸留水にて２回洗浄した後、該菌体を０.１Ｍ リ
ン酸緩衝液（ｐＨ６.８) ３〜５ｍｌに懸濁し、これを
超音波処理（３分間単位で３回、処理温度−１０℃）し
て菌体を破砕した。菌体を破砕した後、破砕液を４℃で
２０分間、６,０００ｒｐｍの遠心分離に供し、その上
澄画分を分取した。得られた上澄液、即ち菌体抽出液を
粗酵素液として常法に従いジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼ活性の測定に供した（TamirH., Meth. Enzymol.
17B, 134-139, 1971）。
【００４１】（Ｂ）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
の酵素活性測定 上記（Ａ）で得た粗酵素液を５０μｌ、基質であるジヒ
ドロジピコリン酸を０.１Ｍ、さらに２ｍＭのニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸：還元型（ＮＡＤ
ＰＨ）またはニコチンアミドジヌクレオチド：還元型
（ＮＡＤＨ）を２０ｍＭ トリス塩酸リン酸緩衝液に溶
解した補酵素液を８００μｌ、それぞれ０.１Ｍ リン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ６.８）に添加してジヒドロジピ
コリン酸レダクターゼ活性測定用反応液とし、これを３
０℃で数分間反応させた。ジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼが１ｍｏｌのジヒドロジピコリン酸を還元する際
には、補酵素であるＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＨ）が１ｍｏｌ
酸化されるので、還元型補酵素の減少量を測定すること
によりジヒドロジピコリン酸レダクターゼの活性を測定
することができる。反応が終了した後、波長３４０ｎｍ
における吸光度を測定してＮＡＤＰＨの減少量を測定し
たところ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−
ｄａｐＢから調製した粗酵素液のジヒドロジピコリン酸
レダクターゼ活性は、１.０unit/mg であった。また、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-
1497）を上記（Ａ）と同一条件にて培養して粗酵素液を
調製し、その粗酵素液を上記と同一条件にて基質と反応
させてＮＡＤＰＨの減少量を測定した。測定の結果、ジ
ヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性は０.５ units/mg
であった。
の酵素活性測定 上記（Ａ）で得た粗酵素液を５０μｌ、基質であるジヒ
ドロジピコリン酸を０.１Ｍ、さらに２ｍＭのニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸：還元型（ＮＡＤ
ＰＨ）またはニコチンアミドジヌクレオチド：還元型
（ＮＡＤＨ）を２０ｍＭ トリス塩酸リン酸緩衝液に溶
解した補酵素液を８００μｌ、それぞれ０.１Ｍ リン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ６.８）に添加してジヒドロジピ
コリン酸レダクターゼ活性測定用反応液とし、これを３
０℃で数分間反応させた。ジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼが１ｍｏｌのジヒドロジピコリン酸を還元する際
には、補酵素であるＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＨ）が１ｍｏｌ
酸化されるので、還元型補酵素の減少量を測定すること
によりジヒドロジピコリン酸レダクターゼの活性を測定
することができる。反応が終了した後、波長３４０ｎｍ
における吸光度を測定してＮＡＤＰＨの減少量を測定し
たところ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−
ｄａｐＢから調製した粗酵素液のジヒドロジピコリン酸
レダクターゼ活性は、１.０unit/mg であった。また、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-
1497）を上記（Ａ）と同一条件にて培養して粗酵素液を
調製し、その粗酵素液を上記と同一条件にて基質と反応
させてＮＡＤＰＨの減少量を測定した。測定の結果、ジ
ヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性は０.５ units/mg
であった。
【００４２】
配列番号：1 配列の長さ：747 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：染色体ＤＮＡ 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名：MJ-233 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1-747 特徴を決定した方法：E 配列 ATG GGA ATC AAG GTT GGC GTT CTC GGA GCC AAA GGC CGT GTT GGT CAA 48 Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln 1 5 10 15 ACT ATT GTG GCA GCA GTC AAT GAG TCC GAT GAT CTG GAG CTT GTT GCA 96 Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala 20 25 30 GAG ATC GGC GTC GAC GAT GAT TTG AGC CTT CTG GTA GAC AAC GGC GCT 144 Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala 35 40 45 GAA GTT GTC GTT GAC TTC ACC ACT CCT AAC GCT GTG ATG GGC AAC CTG 192 Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu 50 55 60 GAG TTC TGC ATC AAC AAC GGC ATT TCT GCG GTT GTT GGA ACC ACG GGC 240 Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly 65 70 75 80 TTC GAT GAT GCT CGT TTG GAG CAG GTT CGC GCT TGG CTT GAA GGA AAA 288 Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu Glu Gly Lys 85 90 95 GAC AAT GTC GGT GTT CTG ATC GCA CCT AAC TTT GCT ATC TCT GCG GTG 336 Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val 100 105 110 TTG ACC ATG GTC TTT TCC AAG CAG GCT GCC CGC TTC TTC GAA TCA GCT 384 Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala 115 120 125 GAA GTT ATT GAG CTG CAC CAC CCC AAC AAG CTG GAT GCA CCT TCA GGC 432 Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly 130 135 140 ACC GCG ATC CAC ACT GCT CAA GGC ATT GCT GCG GCA CGA AAA GAA GCA 480 Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala 145 150 155 160 GGC ATG GAC GCA CAG CCA GAT GCG ACC GAG CAG GCA CTT GAG GGT TCC 528 Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser 165 170 175 CGT GGC GCA AGG TTA GAT GGA ATC CCA GTT CAC GCA GTC CGG ATG TCC 576 Arg Gly Ala Arg Leu Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser 180 185 190 GGC ATG GTT GCT CAC GAG CAA GTT ATC TTT GGC ACC CAG GGT CAG ACC 624 Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr 195 200 205 TTG ACC ATC AAG CAG GAC TCC TAT GAT CGC AAC TCA TTT GCA CCA GGT 672 Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly 210 215 220 GTC TTG GTG GGT GTG CGC AAC ATT GCA CAG CAC CCA GGC CTA GTC GTA 720 Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val 225 230 235 240 GGA CTT GAG CAT TAC CTA GGC CTG TAA 747 Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu Sto 245
【図１】本発明のジヒドロジピコリン酸レダクターゼを
コードする遺伝子を含む大きさ約３.５ｋｂのＤＮＡ断
片の制限酵素による切断点地図。
コードする遺伝子を含む大きさ約３.５ｋｂのＤＮＡ断
片の制限酵素による切断点地図。
【図２】本発明のジヒドロジピコリン酸レダクターゼを
コードする遺伝子を含む大きさ約３.５ｋｂのＤＮＡ断
片の塩基配列決定のための戦略図である。
コードする遺伝子を含む大きさ約３.５ｋｂのＤＮＡ断
片の塩基配列決定のための戦略図である。
【図３】本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＢの
制限酵素切断点地図である。
制限酵素切断点地図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:13）
Claims (8)
- 【請求項１】 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevib
acterium flavum）由来のジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼ（EC 1.3.1.26）をコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片。 - 【請求項２】 前記ブレビバクテリウム・フラバム（Br
evibacterium flavum）がブレビバクテリウム・フラバム
（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３である請求項
１に記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項３】 次のＤＮＡ塩基配列： ATGGGAATCA AGGTTGGCGT TCTCGGAGCC AAAGGCCGTG TTGGTCAAAC TATTGTGGCA 60 GCAGTCAATG AGTCCGATGA TCTGGAGCTT GTTGCAGAGA TCGGCGTCGA CGATGATTTG 120 AGCCTTCTGG TAGACAACGG CGCTGAAGTT GTCGTTGACT TCACCACTCC TAACGCTGTG 180 ATGGGCAACC TGGAGTTCTG CATCAACAAC GGCATTTCTG CGGTTGTTGG AACCACGGGC 240 TTCGATGATG CTCGTTTGGA GCAGGTTCGC GCTTGGCTTG AAGGAAAAGA CAATGTCGGT 300 GTTCTGATCG CACCTAACTT TGCTATCTCT GCGGTGTTGA CCATGGTCTT TTCCAAGCAG 360 GCTGCCCGCT TCTTCGAATC AGCTGAAGTT ATTGAGCTGC ACCACCCCAA CAAGCTGGAT 420 GCACCTTCAG GCACCGCGAT CCACACTGCT CAAGGCATTG CTGCGGCACG AAAAGAAGCA 480 GGCATGGACG CACAGCCAGA TGCGACCGAG CAGGCACTTG AGGGTTCCCG TGGCGCAAGG 540 TTAGATGGAA TCCCAGTTCA CGCAGTCCGG ATGTCCGGCA TGGTTGCTCA CGAGCAAGTT 600 ATCTTTGGCA CCCAGGGTCA GACCTTGACC ATCAAGCAGG ACTCCTATGA TCGCAACTCA 660 TTTGCACCAG GTGTCTTGGT GGGTGTGCGC AACATTGCAC AGCACCCAGG CCTAGTCGTA 720 GGACTTGAGC ATTACCTAGG CCTGTAA 747 で表されるジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（EC 1.
3.1.26）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。 - 【請求項４】 次のアミノ酸配列： Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala 20 25 30 Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala 35 40 45 Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu 50 55 60 Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly 65 70 75 80 Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu Glu Gly Lys 85 90 95 Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val 100 105 110 Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala 115 120 125 Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly 130 135 140 Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala 145 150 155 160 Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser 165 170 175 Arg Gly Ala Arg Leu Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser 180 185 190 Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly 210 215 220 Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val 225 230 235 240 Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu 245 で表されるジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（EC 1.
3.1.26）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。 - 【請求項５】 両末端に制限酵素ＨｉｎｄIII認識部位
を有し、下記の制限酵素で切断した場合に、下記の認識
部位数と切断断片の大きさを示す請求項２に記載のＤＮ
Ａ断片： 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＣｌａＩ １ ０.７，２.８ ＸｂａＩ １ １.５，２.０ ＰｓｔＩ ２ ０.２５，０.５，２.７５ ＤｒａＩ １ １.２，２.３ - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかひとつに記載の
ＤＮＡ断片が導入された組換えプラスミド。 - 【請求項７】 請求項１〜５のいずれかひとつに記載の
ＤＮＡ断片とコリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝
子を含むＤＮＡ断片を保有する組換えプラスミド。 - 【請求項８】 請求項６〜７のいずれかひとつに記載の
組換えプラスミドにより形質転換されたコリネ型細菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5223501A JPH0775578A (ja) | 1993-09-08 | 1993-09-08 | ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片およびその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5223501A JPH0775578A (ja) | 1993-09-08 | 1993-09-08 | ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片およびその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0775578A true JPH0775578A (ja) | 1995-03-20 |
Family
ID=16799138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5223501A Pending JPH0775578A (ja) | 1993-09-08 | 1993-09-08 | ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片およびその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0775578A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996040934A1 (fr) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de l-lysine |
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
-
1993
- 1993-09-08 JP JP5223501A patent/JPH0775578A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996040934A1 (fr) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de l-lysine |
| AU705550B2 (en) * | 1995-06-07 | 1999-05-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing L-lysine |
| US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7425435B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-09-16 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
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