JPH03147791A - 新規ｄｎａ及び該ｄｎａを含有するプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なりＮＡに関し、更に詳しくは、コリネ型
細菌細胞内でプロモーターとして機能する新規なりＮＡ
、及び該ＤＮＡを含有するコリネ型細菌細胞内で自律増
殖可能なプラスミドに関する。

ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ型細菌は、アミ
ノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を生産する工業的
に有用な微生物であるが、組換えＤＮＡ技術の導入によ
る菌株の育種改良は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）等に比べて遅れている。特に
、挿入された有用遺伝子の発現のために必要なプロモー
ターの構造についてはこれまで明らかにされておらず、
コリネ型細菌を宿主として用いて有用遺伝子を発現させ
ようとする場合にはかなり問題となっている。

一般に、プロモーターの構造に関しては、エシェリヒア
・コリ及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｕｓ　５
ｕｂｔｉｒｉｓ）由来のプロモーターが最もよく知られ
ており、該プロモーターの特徴的な塩基配列は既に報告
されている。それらは転写産物であるノツセンジャーＲ
ＮＡの開始点から上流のＩＯ塩塩性付近び３５塩基対付
近に見られる塩基配列でオリ、“ＲＮＡポリメラーゼの
種類に依存して、例」ば以下に示す配列となっている。

（ 〉 コリネ型細菌では、前述のようにプロモーター構造に関
する知見が極めて少なく、また、上記エシェリヒア・コ
リ及びバチルス・サブチリスのプロモーターがコリネ型
細菌内で効率良く発現するかについては未だ不明である
。

従って、本発明の主たる百的は、有用遺伝子をコリネ型
細菌内でｍ実に発現せしめるような新規プロモーターを
創製することである。

以上の問題点に対して、本発明者らは鋭意研究した結果
、今回ＴＴＧＡＣＡで示される塩基配列（ａ）と、該塩
基配列（ａ）の１５〜２０塩基対下流のＡＡＴＡＡＴで
示される塩基配列（ｂ）とを有することを特徴とするコ
リネ型細菌細胞内でプロモーターとして機能するＤＮＡ
断片（ｃ）を創製し、このＤＮＡ断片（ｃ）を、コリネ
型細菌内で自律増殖可能なプロモーター検出用ベクター
プラスミドに組み込み、該ベクタープラスミドをコリネ
型細菌内に導入することにより、上記ＤＮＡ断片（Ｃ）
がコリネ型細菌内でプロモーターとして機能することを
見い出し、本発明を完成するに至った。

かくして、本発明により提供されるＴＴＧＡＣＡで示さ
れる塩基配列（ａ）と、該塩基配列（ａ）の１５〜２０
塩基対下流のＡＡＴＡＡＴで示される塩基配列（ｂ）を
有するコリネ型細菌内でプロモーターとして機能するＤ
ＮＡ断片（ｃ）は、全長が５０〜１００塩基対より構成
され、両末端に制限酵素の認識部位を有し、その塩基配
列は、ＴＴＧＡＣＡで示される配列（ａ）の１５〜２０
塩基対、好ましくは１７〜１８塩基対下流にＡＡＴＡＡ
Ｔで示される配列（ｂ）を有する限り特に制限されるも
のではなく、上記した塩基配列（ａ）及び塩基配列（ｂ
）並びにその位Ｉｔ関係以外の部分はいかなる配列を有
していても良い。このＤＮＡ断片（ｃ）は、通常用いら
れるＤＮＡ合戊合皮、例えば、ベックマン社製Ｓ　ｙｓ
ｔｅｍ　−Ｉ　Ｐｌｕｇを用いて合皮することができる
。

一方、上記ＤＮＡ断片（ｃ）が組み込まれる「コリネ型
ｍ’ｓ内で自律増殖可能なプロモーター検出用ベクター
プラスミド」としては、例えば、コリネ型細菌内で自律
増殖可能なりＮＡ断片（ｅ）と、プロモーターが欠失し
ている発現されるべき遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｄ）と
も保有するプラスミドが包含される。

コリネ型細菌内で自律増殖可能なりＮＡ断片（ｅ）は、
コリネ型細菌内で自律増殖可能なものである限り特に制
限はなく、要はプラスミドの複製開始点を有するＤＮＡ
断片であればよく、複製開始点以外のＤＮＡを含有する
ものであっても特に問題はない。このＤＮＡ断片（ｅ）
の具体例としては、例えば、ブレビバクテリウム・スタ
チオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｔａｔｉ
ｏｎｉｓ）　Ｉ　Ｆ○１２１４４（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
２５１５）由来のｐＢ　Ｙ　５０３プラスミドを制限酵
素Ｋ　ｐｎ　Ｉで切り出すことによって得られる約６ｋ
ｂのＤＮＡ断片が挙げられる。

また、プロモーターが欠失している発現されるべき遺伝
子を含むＤＮＡ断片（ｄ）としては、コリネ型細菌、エ
シェリヒア属細菌、シュードモナス属細菌等の微生物起
源のものであってもよく、或いは動物又は植物起源のも
のであってもよい。

また、発現されるべき遺伝子産物は、酵素、ペプチド、
蛋白質等である。具体的には、例えば、エシェリヒア・
コリのトランポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を、プロ
モーター機能の評価として用いるＤＮＡ断片（ｄ）とし
て挙げることができる。

なおプロモーター検出用ベクタープラスミドには、必要
に応じて、選択マーカーとなる抗生物質耐性を発現する
遺伝子等を更に挿入することができる。

以上に述べた本発明のＤＮＡ断片（ｃ）と、発現される
べき遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｄ）及びコリネ型細菌内
で自律増殖可能なりＮＡ断片（ｅ）等から、コリネ型細
菌内で自律増殖可能なプラスミドは、例えば、以下に述
べる方法で構築することができる。

基本プラスミドとして、コリネ型細菌内で機能するカナ
マイシン耐性遺伝子を担うプラスミドｐＨ３Ｇ２９８　
（宝酒造製）を用いる。このプラスミドｐＨ３Ｇ２９８
を制限酵素ＨｉｎｄＩＩ［によって開裂させ、その部位
に前記したプロモーター機能の評価に用いることができ
るＤＮＡ断片（ｄ）を連結酵素処理により結合させる。

次に、このプラスミドを制限酵素Ｋｐｎｌによって開裂
させ、さの部位に前記したコリネ型細菌内で自律増殖可
能なりＮＡ断片（ｅ）を連結酵素処理により結合させ、
プロモーター検出用ベクタープラスミドが創製できる。

さらに、このプロモーター検出用プラスミドベクターを
制限酵素ＢａｍＨＩによって開裂させ、その部位に前記
した合成りＮＡ断片（ｃ）を連結酵素処理によって結合
させ、本発明のプラスミドを構築することができる。

得られるプラスミドが導入される宿主としては、コリネ
型細菌、殊にブレビバクテリウム・７ラバムＢｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ　　Ｍ　Ｊ　−２３
３（Ｆ　ＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７）由来菌株を挙げる
ことができる。

本発明のプラスミドの導入に際して、ブレビバクテリウ
ム・７ラバムＭＪ−２３３由来曹株を宿主として用いる
場合には、本菌株が保有するプラスミドｐＢＹ５０２（
特開昭６３−３６７８７号明細書参照）の存在により形
質転換が困難になる場合があるので、そのような場合に
は、本菌株より上記プラスミドｐＢＹ５０２を除去する
ことが望ましい。そのようなプラスミドを除去する方法
としては、例えば、継代培養を繰り返すことにより自然
に失わすことも可能であるし、人為的に除去することも
可能である［Ｂａｃｔ、　Ｒｅｖ、、　３６．３６１〜
４０５　（１９７２）参照］。

プラスミドを人為的に除去する方法の一例を具体的に示
せば以下のとおりである。

宿主ブレビバクテリウム・７ラバムＭＪ−２３３の生育
を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレンジ（濃度二
０．２〜５０Ｊ＃ｉ／ｍＱ）もしくはエチジウムプロミ
ド（濃度＝０．２〜５０μｇ／ｍｌ２）等を含む培地に
、ｌ−当り約ｌＯ細胞になるように植菌し、生育を不完
全に阻害しながら、約２４時間３５℃で培養する。培養
液を希釈後寒天培地に塗布し、３５°Ｃで約２日培養す
る。出現したコロニーから各々独立にプラスミド抽出操
作を行ない、プラスミドが除去されている株を選択する
。

この操作によりｐＢＹ５０２が除去されたブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３由来株が得られる。

また、本発明プラスミドの上記の如きコリネ型細菌内へ
の導入は、それ自体既知の方法、例えば、Ｃａ１ｖｉｎ
、　Ｎ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｈａｎａｗａｌｔ、　Ｐ、Ｃ，
、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　
　１７０．２７９６　（１９８８）；１ｏｏ、　Ｋ、、
　Ｎ１５ｈｉｄａ、　Ｔ、　ａｎｄ　１ｚａｋｉ、　Ｋ
、、　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　　ａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　５２、２９
３（１９８８）等の文献に記載の方法により、例えば宿
主微生物にパルス波を通電することにより行なうことが
できる。

次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。し
かしながら、下記の実施例は本発明について具体的な認
識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによっ
て本発明の範囲は何ら限定されるものではない。

実施例１ プロモーター検出用ベクタープラスミドｐＰ　Ｒ３の造
成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調整ニブラスミドｐＢ
Ｙ５０３は、ブレビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｔａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦ
、０１２１４４［昭和６３午７月１８日工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託（微工研条寄第２５１５号）］
から新たに分離された分子量約１０メガダルトンのプラ
スミドであり、特開平ｌ−９５７８５号明細書に記載の
プラスミドである。

プラスミドｐＢＹ５０３は次のようにして調製しｔこ　
。

半合成培地Ａ培地［尿素２　ｇ　、　（Ｎ　Ｈ４：１２
Ｓ　Ｏ４７ｇ、に！ＨＰＯ４０，５ｇ、ＫＨ，ＰＯ４０
，５ｇ。

Ｍｇ５Ｏ，Ｏ，，５ｇ、Ｆｅ５０．・７Ｈ，０５ｍｇ、
Ｍ　ｎ　Ｓ○ａ４〜６Ｈｉ○　６■、酵母エキス２．５
ｇ、カザミノ酸５ｇｓ　ビチオン２００μｇ１塩酸チア
ミン２００μｇ１グルコース２０ｇ１純水１１２］ｌＱ
で、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦ○１２１４
４を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られ
た菌体をｌＯ■／ｍ１２の濃度でリゾチームを含む緩衝
液［２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
、１０ｍＭＥＤＴＡ。

５０ｍＭグルコース］　２０鴫に懸濁し、３７℃で１時
間反応させた。反応液にアルカリ−５ＤＳ液［０，２Ｎ
　　ＮａＯＨ，１％（ｗ／ｖ）Ｓ　Ｄ　Ｓ］　４０ｍ＋
２を添加し、緩やかに混和して室温にて１５分間静置し
た。

次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸カリウ
ム溶液６０ｍ４、酢酸１１．５ｍＱ、純水２８．５−の
混合液１３０−を添加し、充分混和してから氷水中に１
５分間静置した。

溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分間、１５、Ｏ
ＯＯＸｇの遠心分離にかけ、上澄液を得ｔこ　。

これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノール
／クロロホルムｌ／ｌ混和液）を加え懸濁後、遠心管に
移し、室温下で５分間、１５．０００Ｘｇの遠心分離に
かけ、水層を回収した。水層に２倍量のエタノールを加
え、−２０°０で工時間静置後、４°Ｃで１０分間、１
５．ｏｏｏＸｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収した。

沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［トリスｌｏｍＭ、ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭ、ＨＣＱにてｐＨ＝８．０に調整］２−に
溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍濃度のＴＥ
緩衝液１００−に塩化セシウム１７０ｇを溶解１１５−
とｌＯ■／ｍ１２エチジウムブロマイド溶液１−を加え
て、密度を１．３９２ｇ／鵠に合わせた。この溶液を１
２℃で４２時間、１１６．０００Ｘｇの遠心分離を行な
った。

プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射により遠心管内で
下方のバンドとして見い出される。このバンドを注射器
で遠心管の側面から抜きとることにより、プラスミドｐ
ＢＹ５０３を含む分画液を得た。

次いでこの分画液を等量のイソアミルアルコールで４回
処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後Ｔ
Ｅ緩衝液に対して透析を行なった。

このようにして得られたプラスミドｐＢＹ５０３を含む
透析液に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに
添加した後、２倍量のエタノールを加え、−２０’Ｃ！
　１時間静置した。この溶液を１５゜０００Ｘｇの遠心
分離にかけてＤＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０
３を約５０μｇ得た。

（Ｂ）プラスミドｐＨ５Ｇ２９８とプロモーターの欠失
したクロラムフェニコール耐性遺伝子の準備ニ グラスミドｐＨ５Ｇ２９８は、エシェリヒア・コリ内で
複製し、カナマイシン耐性を発現する分子量的１．７メ
ガダルトンのプラスミドであり、市販品として宝酒造よ
り購入可能である。

一方、クロラムフェニコールアセチルトランス７、Ｚラ
ーゼ（ＣＡ　Ｔ）　ＧｅｎＢ　１ｏｃｋは、プロモータ
ーの欠失したトランスボゾンＴｎ９由来のＣＡＴ遺伝子
を有する分子量的０．５メガダルトンのＤＮＡ断片であ
り、市販品として７アルマシアジヤパンより購入可能で
ある。

（Ｃ）プラスミドｐＨＳ　Ｇ　２９８ｃａｔの遺戒ニブ
ラスミドｐＨ５Ｇ２９８（宝酒造製）２μｇに制限酵素
Ｈ１ｎｄＩＩ［（１ｕｎｉｔ）を３７℃で３０分間反応
させ、プラスミドＤＮＡを部分分解した。

このＤＮＡ分解物とＣＡ　Ｔ　Ｇ　ｅｎＢ　１ｏｃｋを
混合し、制限酵素を不活化するために６５°Ｃで１０分
間加熱処理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度とし
て各々５０ｒｎＭトリス緩衝液ｐＨ７，６、ｌｏｍＭＭ
ｇＣＬｌ、、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴ
Ｐ及びＴ４リガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強
化し、１６°Ｃで１５時間保温した。この溶液を用いて
エシェリヒア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒
造製）を形質転換した。

形質転換株は３０μｇ／−（最終濃度）のクロラムフェ
ニコール、ｌＯＯμｇ／ｍ　（ｊｌｔ終濃＆）ＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、１０
０μｇ／ｍｄ（最終濃度）Ｘ−ｇａ（１（５−ブロモ−
４−クロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ１酵母エキス５　
ｇ、　ＮａＣＱ　５　ｇ−純水ｌＱ　、ｐＨ７，２）　
で３７℃にて２４時間培１１Ｌ、生育株として得られた
。これら生育株の、プラスミドをアルカリ−３ＤＳ法［
Ｔ　、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　　Ｅ　。

Ｆ　、Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ、　　Ｊ　、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
；　　“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　　（１
９８２）９０−９１参照］により抽出した。

ＣＡ　Ｔ　Ｇ　ｅｎＢ　１ｏｃｋが正しく挿入されてい
ることを制限酵素ＨｉｎｄＩＩ［、ＥｃｏＲＩおよびＫ
ｐｎＩによって切断されるＤＮＡ断片の大きさによって
確認し、このプラスミドをｐＨ５Ｇ２９８ｃａｔと命名
しプこ。

（Ｄ）プロモーター検出用ベクタープラスミドｐＰＲ３
の造成： 上記（ｃ）項で得ｔ；プラスミドｐＨ３Ｇ２９８ｃａｔ
ｏ、５μｇに制限酵素Ｋ　ｐｎ　Ｉ　（５ｕｎｉｔｓ）
を３７°Ｃ１時間反応させ、グラスミドＤＮＡを完全に
分解した。

前記（Ａ）項で調製したプラスミドｐＢＹ５０３０．５
μｇに制限酵素Ｋ　ｐｎ　Ｉ　（５ｕｎｉｔｓ）を３７
００で１時間反応させ、プラスミドＤＮＡを完全に分解
しｔ；。

両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制限酵素を不
活化するために６５℃で１０分間加熱処理した後、該失
活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭ）リス緩
衝液ｐＨ７，６、ｌｏｍＭＭｇ（１，，１０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４リガーゼｌ　ｕｎ
ｉｔになるように各成分を強化し、１６℃で１５時間保
温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０
９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は５０μｇ／ｄ（最終濃度）のカナマイシン
、１００μｇ／−（最終濃度）ＩＰＴＧ（イソプロピル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、１０ｃ）ｕｇ／ｄ（
最終濃度）Ｘ−ｇａ（２（５−ブロモ−４−クロロ−３
インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬ培
地（トリプトンｌｏｇ。

酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ２５　ｇｓ純水ＩＱ、ｐＨ７
゜２）で３７°Ｃにて２４時間培養し、生育株として得
られた。これら生育株のうち、白いコロニーで生育して
来たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−５ＤＳ
法［Ｔ　、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ　、　Ｆ　、　Ｆ
　ｒｉｔｓｃｈ、　　Ｊ　、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ；　　
“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｔｏｎｉｎｇ（１９８２）９
０〜９１参照ｊにより抽出した。

（Ｅ）複合プラスミドのコリネ型細菌への形質転換： 形質転換には電気パルス法を用いた。ブレビバクテリウ
ム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａ
ｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７）
プラスミド除去様を１００−の前記Ａ培地で対数増殖期
初期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット／−になる
ように添加し、さらに２時間振盪培養し遠心分離により
菌体を集め、菌体を２０−のパルス用溶液［２７２ｍＭ
　Ｓ　ｕｃｒｏｓｅ、　７　ｍＭ　Ｋ　Ｈ２Ｐ○。

ＬｍＭ　Ｍ　ｇＣ１２２：　ｐＨ７−４コにて洗浄する
。さらに菌体を遠心分離にて集め、５ｆｆ１１２のパル
ス用溶液に懸濁し、０．７５ｒＭｌの細胞と前記（Ｄ）
項で得られたＤＮＡ溶液５０−を混合し、水中にて２０
分間静置する。シーンパルサー（バイオラド社製）を用
いて、２５００ボルト、２５μＦＤに認定しパルスを印
加抜水中に２０分間静置する。全量を３ｍ１２の前記Ａ
培地に移し３０°Ｃにて１時間培養後カナマイシン耐性
株ｇ／ｍ１２（Ｊｔ）終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に
植菌し３０℃で２〜３日間培養する。

出現したカナマイシン耐性株より、上記（Ａ）項に記載
の方法を用いてプラスミドを得た。このプラスミドを各
種制限酵素で切断し分子量を測定した。その結果を下記
表１に示す。

表　　　ｌ ＢａｍＨＩ　　　　　　Ｉ　　　　　　６．１（９，４
）Ｋｐｎｌ　　　　　　　２　　　　３．９（６，０）
、　　２．２（３，４）Ｓ　ａｃ　Ｉ　　　　　　　１
　　　　６．１（９，４）上記制限酵素により特徴づけ
られるプラスミドを“ｐＰＲ３″と命名した。

実施例２ 合成プロモーターのベクタープラスミドｐＰ　Ｒ３への
導入： プロモーターはＤＮＡ合成装置（ＢＥＣＫＭＡＮ　　Ｓ
　ｙｓｔａｍ　Ｉ　Ｐ　１ｕｓ）を用いて合成した（そ
の両末端がＢａｍＨＩ断片になるようにした）。そのＤ
ＮＡ断片の塩基配列を下記に示す。

ｒｍ　　　　　　　　　ｒｍ ＧＡＴＣＣＣＧＡＡＡＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡ
ＡＡＡＡＴＧＡＴＴＡＡＴＡＡ丁ＴＴＡＧＧＧＣＴＴＴ
ＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＣ；ＧＧＴＴＴＴＴ　ＡＣＴＡ
　Ａ　ＡＴＡＴＴＡ　Ａ　Ａ　ＴＣＣＴＡ（実施例１で
調製したプラスミドｐＰＲ３０，，５μｓに制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ　（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃で１時間反応させ
、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。

上記合成プロモーターＤＮＡとプラスミドＤＮＡ分解物
を混合し、制限酵素を不活化するために６５°Ｃで１０
分間加熱処理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度と
して各々５０ｍＭｈリス緩衝液ｐＨ７，６、ｌ　ＯｍＭ
　　ＭｇＣ（１２，１−０ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ４リガーゼ１ｕｎｉｔになるよう
に各成分を強化し、１６℃で１５時間＃温した。この溶
液を用いてエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩコンピテント
セル（宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は５０℃ｇ／ｍｌ（最終濃度）のカナマイシ
ンを含むＬ培地（トリプトン１０Ｉ、酵母エキス５．？
、ＮａＣ（２５，？　、純水１（１、ｐＨ７，２）で３
７°Ｃにて２４時間培養し、生育様として得られた。こ
れら生育様のプラスミドをアルカリ−５ＤＳ法［Ｔ　、
　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ　、Ｆ　、　Ｆ　ｒｉｔｓｃ
ｈ、　Ｊ　。

Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ　；　“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　　（１９８２）９０〜９１参照〕により抽
出した。

得られたプラスミドは実施例１の（Ｅ）項に記載の方法
に従い、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７）プラスミド除去様へ形
質転換し、実施例ｉの（Ａ）項に記載の方法を用いてプ
ラスミドを抽出した。

このプラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ　、ＫｐｎＪ　。

Ｓ　ａｃ　Ｉ等の制限酵素による切断パターンによって
ｐＰＲ３に合＋ｆｆ１ＤＮＡが組み込まれていることを
確認し、このプラスミドを“ｐＰＲ３ＢＴ３”と命名し
た。

実施例３ 合成プロモーター強度の測定： 実施例２でｐＰ　Ｒ３に挿入したプロモーターの強度を
、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）の活性を測定することによって調べた。

ｐＰ　Ｒ３を保有するブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３株とｐＰＲ３ＢＴ２を保有するブレビバクテ
リウム・７ラバムＭＪ−２３３株をそれぞれ、実施例１
の（Ａ）項に記載の半合成培地Ａにカナマイシンを５０
μｇ／ｆｆ１１２加えた培地１０−の入った試験管で一
晩前培養し、その培養液を上記の培地１００ｄ２の入っ
た三角フラスコで約６時間培養後集菌し、活性測定に用
いた。ＣＡＴの活性はＷ、Ｖ、Ｓｈａｗらの方法［Ｊ　
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｊａｎ、（１９６８）
２８〜３６参照］により測定した。その結果、ｐＰ　Ｒ
３Ｂ　Ｔ　２を有するＭＪ−２３３株は、プロモーター
の挿入されていないｐｐＲ３を有するＭＪ−２３３株の
約３倍のＣＡＴ活性をもっていた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＴＴＧＡＣＡで示される塩基配列（ａ）と、該塩基
   配列（ａ）の１５〜２０塩基対下流のＡＡＴＡＡＴで示
   される塩基配列（ｂ）とを有することを特徴とするコリ
   ネ型細菌細胞内でプロモーターとして機能するＤＮＡ断
   片（ｃ）。 ２、請求項１記載のＤＮＡ断片（ｃ）と、ＤＮＡ断片（
   ｃ）の下流に直接接続されている発現されるべき遺伝子
   を含むＤＮＡ断片（ｄ）とを保有することを特徴とする
   コリネ型細菌細胞内で自律増殖可能なプラスミド。 ３、コリネ型細菌細胞内で自律増殖可能なプラスミドｐ
   ＢＹ５０３由来のものである請求項２記載のプラスミド
   。 ４、遺伝子（ｄ）が酵素、蛋白質又はペプチドをコード
   する遺伝子である請求項２記載のプラスミド。