CN1165619C - 制备l-赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

通过相继增强编码二氢吡啶二羧酸还原酶的DNA、编码二氢吡啶二羧酸合酶的DNA、编码二氨基庚二酸脱羧酶的DNA，和编码二氨基庚二酸脱氢酶的DNA提高了含有对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制被基本上脱敏的天冬氨酸激酶的棒杆状菌的产L-赖氨酸能力和产L-赖氨酸速度。

Description

制备L-赖氨酸的方法
                        技术领域
本发明涉及通过培养微生物而制备L-赖氨酸的方法，该微生物通过遗传工程技术方法修饰用于发酵制备氨基酸等的棒杆状菌而获得。
                        背景技术
用作饲料添加剂的L-赖氨酸通常通过使用棒杆状菌的产L-赖氨酸突变型菌株通过发酵方法制备，目前已知的产L-赖氨酸细菌为那些通过对棒杆状菌野生型菌株的人工突变而产生的细菌。
对于棒杆状菌，公开了能在细菌细胞中自主复制并具有药物抗性标记基因的载体质粒(见美国专利No.4,514,502)，以及将基因导入细菌细胞的方法(例如，日本专利公开No.2-207791)。也公开了使用上述技术繁殖产L-苏氨酸或产L-异亮氨酸的细菌的可能性(见美国专利Nos.4,452,890和4,442,208)。对于繁殖产L-赖氨酸的细菌，技术是已知的，其中的参与L-赖氨酸生物合成的基因掺入到质粒载体以在宿主细胞中的扩增该基因(例如，日本专利公开No.56-160997)。
已知的用于L-赖氨酸生物合成的基因包括，如，二氢吡啶二羧酸还原酶基因(日本专利公开No.7-75578)和二氨基庚二酸脱氢酶基因(lshino，S，等， 核酸研究， 15，3917(1987)，其中的参与L-赖氨酸生物合成的基因被克隆以及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(日本专利公开No.60-87788)，二氢吡啶二羧酸合酶基因(日本专利公开No.6-55149)，以及二氨基庚二酸脱羧酶基因(日本专利公开No.60-62994)，其中的基因扩增影响L-赖氨酸产力。
对于参与L-赖氨酸生物合成的酶，已知这样一种实例，即当作野生型时，酶受到反馈抑制。在此情况，L-赖氨酸产力通过导入具有反馈抑制被脱敏的突变的酶基因而提高。已知这些基因具体地包括，例如，天冬氨酸激酶基因(WO94/25605国际公开手册)。
正如上述，有些成功的结果通过L-赖氨酸生物合成***基因扩增，或导入突变型基因的方法获得。例如，带有对赖氨酸和苏氨酸协同抑制脱敏的突变型天冬氨酸激酶基因的棒杆状菌产生相当多量的L-赖氨酸(约25g/L)。然而，此细菌与不带有突变型天冬氨酸激酶基因的细菌相比生长速度下降。也有报导L-赖氨酸产率除了突变型天冬氨酸激酶基因以外可通过进一步导入二氢吡啶二羧酸合酶基因而被提高( 应 用与环境微生物学，57(6)，1746-1752(1991))。然而，这种细菌生长速度下降。
对于二氢吡啶二羧酸还原酶基因，已证实二氢吡啶二羧酸还原酶活性在导入该基因的棒杆状菌中增加，然而，没有包括对L-赖氨酸产率的影响的报导(日本专利公开No.7-75578)。
在目前情况下，已知没有这样的棒杆状菌，即在该细菌中任何人通过联合L-赖氨酸生物合成的多个基因成功地显著提高L-赖氨酸产量而不延缓生长，也没有报导试图通过增强L-赖氨酸生物合成基因而加快生长的实例。
                       发明内容
本发明的目的是通过使用编码从述酶DNA序列的遗传物质提高棒杆状菌产L-赖氨酸能力和生长速度，包括天冬氨酸激酶(如果必要，则下文中称为“AK”，前提是编码AK蛋白的基因在下文称为“lysC”)。二氢吡啶二羧酸还原酶(如果必要，在下文中称为“DDPR”假设编码DDPR蛋白的基因在下文中称为“ dapB”)，二氢吡啶二羧酸合酶(如果必要，则在下文中简称为“DDPS”，前提是编码DDPS蛋白的基因在下文中称为“ dapA”)，二氨基庚二酸脱羧酶(如果必要，则在下文中称“DDC”，前提是编码DDC蛋白的基因在下文中成为“ lysA”)，以及二氨基庚二酸脱氢酶(如果必要，则在下文中称为“DDH”，前提是编码DDH蛋白的基因在下文中称为“ ddh”)，这些酶均是棒杆状菌细胞中L-赖氨酸生物合成中重要的酶。
当一种目标物质通过使用微生物发酵而制备时，目标物质相对于导入物质的产生速度，以及产率是一个极为重要的因素。通过增加发酵设备中每单位的产生速度可异常廉价地制备。因此，发酵产率和产生速度彼此兼容在工业上是极为重要的。为了通过用棒杆状菌发酵制备L-赖氨酸本发明建议了一种上述问题的解决方法。
本发明的原理基于这样的事实：即通过下述方法棒杆状菌的生长可加快，且其L-赖氨酸产生速度可加快，包括当联合 dapB与编码突变型AK(如果必要，下文中简称为“突变型AK”)的突变型 lysC(如果必要，下文中简称为“突变型 lysC”)时造成增强，与 lysC被单独增强相比，突变型AK中对赖氨酸和苏氨酸的协同抑制被脱敏，并且L-赖氨酸生产速度可通过相继增强 dapA， lysA及 ddh以分段的方式进一步提高。
即，本发明在于能在棒杆状菌细胞中自主复制的重组DNA，包括编码其中的对L-赖氨酸和L-苏氨酸反馈抑制被基本上脱敏的天冬氨酸激酶的DNA序列，和编码二氢吡啶二羧酸还原酶的DNA序列。除了上述的每种DNA序列以外，本发明提供了进一步包括编码二氢吡啶二羧酸合酶DNA序列的重组DNA。除了上述三种DNA序列外，本发明提供了进一步包括编码二氢吡啶二羧酸脱羧酶DNA序列的重组DNA。除了上述的四种DNA以外，本发明提供了进一步包括编码二氨基庚二酸脱氢酶DNA序列的重组DNA。
在另一方面，本发明提供了含有对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制被基上脱敏的天冬氨酸激酶，并包括编码二氢吡啶二羧酸还原酶增强的DNA的棒杆状菌。本发明提供了进一步包括编码在前面提到细菌中的二氢吡啶二羧酸合酶增强的DNA的棒杆状菌。除了上述三种DNA以外，本发明提供了进一步包括编码上面提到的棒杆状菌中的二氨基庚二酸脱羧酶增强的DNA的棒杆状菌。除了上述四种DNA之外，本发明提供了进一步包括编码前面提到的棒杆状菌中的二氨基庚二酸脱氢酶增强的DNA的棒杆状菌。
在另外一个方面，本发明提供了产生L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：在适当的培养基中培养任何一种上述的棒杆状菌，在细菌培养液中产生积累L-赖氨酸，并从培养中收集L-赖氨酸。
本发明中提及的棒杆状菌为在 伯杰氏细菌鉴定手册，第8版，599页(1974)中定义的微生物类群，为无酸抗性且无孢子形成能力的需氧型格兰氏阳性杆菌。该棒杆状菌包括 棒状杆菌属细菌、到目前为止被划为 短杆菌属但现在统一为 棒状杆菌属细菌的 短杆菌属细菌，以及与 棒状 杆菌属密切相关的 短杆菌属的细菌。
本发明将在下面作详细解释。
<1>用于本发明L-赖氨酸生物合成基因的制备
用于本发明L-赖氨酸生物合成的基因分别通过以下方法获得，包括制备细菌染色体DNA作为DNA供体，通过用质粒载体等构建染色体DNA文库，筛选带有所需基因的菌株，并从筛选到的菌株中回收该基因被***其中的重组DNA。只要用于L-赖氨酸生物合成的所需基因表达在棒杆状菌细胞中发挥功能的酶蛋白，用于本发明的L-赖氨酸生物合成基因的DNA供体没有特别的限制。然而，该DNA供体优迭棒杆状菌。
源自棒杆状菌的 LysC， dapA及 dapB基因均具有已知的序列。因此，它们可通过根据聚合酶链式反应方法(PCR；见White，T.J.等，遗传学动态， 5，185(1989))的扩增而获得。
用于本发明的L-赖氨酸生物合成的每个基因可根据下面例举的一些方法获得。
(1)突变型lysC的制备
含有突变型 lysC的DNA片段可从对L-赖氨酸和L-苏氨酸AK活性的协同抑制被基本脱敏的突变型菌株中(WO94/25605国际公开手册)制备。例如，这种突变型菌株可获自一组源自棒杆状菌野生型菌株的细胞，该菌株通过用普通的突变处理如紫外照射及以突变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍的处理进行突变处理。可通过Miyajima，R，等在 生物化学杂志(1968)，63(2)，139-148中描述的方法加以测定。最优选的这种突变型菌株由通过对 乳发酵短杆菌ATCC13869(具有改变的现名为 谷氨酸棒杆菌野生型菌株的突变处理而获得的L-赖氨酸生产菌AJ3445(FERM P-1944)所代表。
或者，突变型 lysC也可通过对含有野生型 lysC的质粒DNA进行体外突变处理而获得。在另一方面，有关突变使AK对L-赖氨酸和L-苏氨酸协同反馈抑制脱敏(WO94/25605国际公开手册)的信息具体是已知的。因此，突变型 lysC也可根据例如，定点诱变方法的信息从野生型 lysC中制备。
通过，例如，Saito和Miura方法(H.Saito和K.Miura， 生物化学与 生物物理杂志， 72，619(1963))制备染色体DNA，并根据聚合酶链式反应方法(PCR，见White，T.J.等， 遗传学动态.， 5，185(1989))扩增 lysC，包括 lysC的片段可分离自棒杆状菌。
为了扩增，例如，编码根据谷氨酸棒杆菌已知序列(见 分子微生物 学(1991)， 5(5)，1197-1204， 分子和普通遗传学.(1990)，224，317-324)编码 lysC的约1,643bp的区域，DNA引物通过具有序列表中序列1和2显示核苷酸序列的23和21聚体的单链DNA来举例说明。DNA可根据普通方法合成，该方法使用应用生物***部生产的380B型DNA合成仪及亚磷酸胺(phosphoamidite)方法(见 四面体通 迅(Tetrahedron Letters(1981)， 22，1859)。PCR可用Takara Shuzo生产的PJ2000型DNA热循环仪和用Taq DNA聚合酶根据供应商指定的方法加以完成。
PCR扩增的 lysC与能在大肠杆菌和/或棒杆状菌细胞中自主复制的载体DNA连接以制备重组DNA。且将重组DNA导入前述的大肠杆菌细胞中是优选的。这种措施使下面的操作变得容易。能在大肠杆菌细胞中自主复制的载体优选为优选能在宿主细胞中自主复制的质粒载体，包括，例如，pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398和RSF1010。
当具有允许质粒能在棒杆状菌中自主复制能力的DNA片段***这些载体时，它们可用作既能在大肠杆菌又能在棒杆状菌中自主复制的所谓穿梭载体。
这种穿梭载体包括如下内容。具有每种质粒的微生物及国际保藏机构的保藏号列于括弧中。
pHC4：      大肠杆菌AJ12617(FERM BP-3532)
pAJ655；    大肠杆菌AJ11882(FERM BP-136)
            谷氨酸棒杆菌SR8201(ATCC39135)
pAJ1844：   大肠杆菌AJ11883(FERM BP-137)
            谷氨酸棒杆菌SR8202(ATCC39136)
pAJ611：    大肠杆菌AJ11884(FERM BP-138)
pAJ3148：   谷氨酸棒杆菌SR8203(ATCC39137)
pAJ440：    枯草芽孢杆菌AJ1190(FERM BP-140)
这些载体可按如下从保藏的微生物中获得。对数期收集的细胞以溶菌酶和SDS裂解，接着通过以30,000×g离心从裂解液中分离获得上清并向其中加入聚乙二醇，然后通过氯化铯-溴化乙锭平衡密度梯度离心方法加以分级和纯化。
大肠杆菌可根据如下方法导入质粒而转化，例如，D.M.Morrison方法( 酶学方法， 68，326(1979)或其中的受体细胞以氯化钙处理以增加DNA通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.， 分子生物学杂志.， 53，159(1970))。
根据上述方法当 lysC分离自AK野生型菌株时获得野生型 lysC，而当 lysC分离自AK突变型菌株时获得突变型 lysC。
含有野生型 lysCDNA片段核苷酸序列的一个实例列于序列表中的序列3。野生型AK蛋白的α-亚基氨基酸序列推导自该核苷酸序列，并与DNA序列一起列于序列表中的序列4中。序列5中仅列其氨基酸序列。野生型AK蛋白的β-亚基氨基酸序列推导自该DNA的核苷酸序列，并与DNA一起列于序列表中的序列6中。序列7中仅列其氨基酸序列。在每个亚基中，GTG用作起始密码子，并且相应的氨基酸为甲硫氨酸所代表。然而，此代表涉及甲硫氨酸、缬氨酸、或甲酰甲硫氨酸。
只要它编码其中的对L-赖氨酸和L苏氨酸的协同反馈抑制被脱敏的AK，那么用于本发明的突变型 lysC没有特别的限制。然而，突变型lysC通过一个包括突变的实例加以举例说明，在该突变中，野生型AK氨基酸序列的α-亚基自N-末端的279位的丙氨酸残基变为非丙氨酸非酸性氨基酸的氨基酸残基，且β-亚基30位的丙氨酸残基变为非丙氨酸非酸性氨基酸的氨基酸残基。野生型AK的氨基酸序列具体地包括列于序列表中序列5的α-亚基氨基酸序列和列于序列表中序列7的β-亚基氨基酸序列。
那些优选的除丙氨酸以外的其它氨基酸残基包括苏氨酸、精氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、和缬氨酸残基。
只要其编码氨基酸残基，相应于待替代氨基酸残基的密码子类型没有特别的限制。据认为已有的野生型AK的氨基酸序列依细菌种类和菌株的不同可略有不同。例如，在一个或更多个与酶活性无关的位置按上述具有一个或更多个氨基酸残基的替代、缺失、或***的AK也可用于本发明。只要对AK活性及L-赖氨酸和L-苏氨酸的协同反馈抑制脱敏基本上没有影响，例如，具有其它一个或更多个氨基酸残基替代、缺失或***突变的其它AK也可使用。
通过导入突变型 lysC质粒p399AK9B于作为乳发酵短杆菌野生型菌株的AJ12036菌株(FERM BP-734)中而获得的AJ12691菌株已于1992年4月10日以FERM P-12918的保藏号保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码：305日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)，根据布达佩斯条约于1995年2月10日转为国际保藏，且保藏号为FERM BP-4999。
(2)dapB的制备
含有 dapB的DNA片段可通过PCR方法从棒杆状菌染色体中制备。DNA供体没有特别的限制，然而，其通过乳发酵短杆菌ATCC13869菌株加以说明。
对于乳发酵短杆菌，其编码DDPR的DNA序列为已知的( 细菌学杂 志， 175(9)，2743-2749(1993))，根据它可制备用于PCR的DNA引物。这种DNA引物通过分别具有序列表中序列8和序列9描述核苷酸序列的23聚体DNA来具体地加以说明，DNA合成、PCR及含有获得 dapB质粒的制备可以与上述 lysC相同的方式完成。
含有 dapB DNA片段的核苷酸序列和自此核苷酸序列中推断的氨基酸序列说明序列10中。序列11中仅列有氨基酸序列。除了编码此氨基酸序列的DNA片段以外，本发明可同样使用编码与序列11中所列氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的DNA片段，即只要对DDPR活性基本没有影响，具有，例如，一个或更多个氨基酸替代、缺失、或***突变的氨基酸序列。
通过导入含有在后面所述实例中获得的 dapB的质粒pCRDAPB于大肠杆菌JM109菌株而获得的转化子菌株已于1995年5月26日根据布达佩斯条约以FERM BP-5114的保藏号国际保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)。
(3) dapA的制备
含有 dapA的DNA片段可通过PCR方法从棒杆状菌的染色体中制备。DNA供体没有特别的限制，然而，其通过 乳发酵短杆菌ATCC13869菌株加以说明。
对于 谷氨酸棒杆菌，编码DDPS的DNA序列是已知的(见 核酸研究，18(21)，6421(1990)； EMBL接受号X53993).，根据其可制备用于PCR的DNA引物。这种DNA引物通过分别具有序列表中序列12和13中描述的核苷酸序列的23聚体DNA加以具体说明。DNA合成、PCR和含有 dapA质粒的制备可用与上述 lysC中相同的方式完成。
含有 dapA DNA片段的核苷酸序列和自该核苷酸序列推导的氨基酸序列在序列14中加以说明。序列15中仅列有氨基酸序列。除了编码此氨基酸序列的DNA片段之外，本发明可同样使用编码与序列15中所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的DNA片段，即只要对DDPS活性基本没有影响，具有，例如，一个或更多个氨基酸替代、缺失、或***突变的氨基酸序列。
通过导入含有在所述以后实例中获得的 dapA的质粒pCRDAPA的 大 肠杆菌JM109菌株而获得的转化子菌株AJ13106已于1995年5月26日根据布达佩斯条约以FERM BP-5113的保藏号国际保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)。
(4)lysA的制备
含有 lysA的DNA片段可通过PCR方法从棒杆状菌染色体中制备。DNA供体没有特别的限制，然而，其通过乳发酵短杆菌ATCC13869菌株加以说明。
在棒杆状菌中， lysA与 argS(精氨酰-tRNA合酶基因)一起形成操纵子，且 lysA存在于 argS的下游。lysA的表达通过存在于argS上游的启动子调节(见 细菌学杂志， 11月7356-7362(1993))。对于谷氨酸棒杆菌，这些基因的DNA序列是已知的(见 分子微生物学， 4 (11)，1819-1830(1990)； 分子及普通遗传学， 212，112-119(1988))，据此可制备用于PCR的DNA引物。这种DNA引物23聚体的DNA加以具体说明，其分别具有序列表中的序列16中所列的核苷酸序列(相应于 分子微生物学， 4(11)，1819-1830(1990)中描述核苷酸序列编码的11～33核苷酸)和序列17中所列的核苷酸序列(相当于分子及普通遗传学，212，112-119(1988)中所述核苷酸序列的编号1370-1392核苷酸)。DNA合成、PCR和含有获得 lysA质粒的制备可用与上述lysC相同的方式完成。
在后面描述的实例中，为了增强 lysA，使用了含有启动子、 argS、和 lgsA的DNA片段。然而， argS对本发明并非必要的。也可使用其中的 lysA刚好连到启动子下游的DNA片段。
含有 argS和 lysA DNA片段的核苷酸序列及推导由此核苷酸序列所编码的氨基酸序列在序列18中加以说明。 argS编码的氨基酸序列的实例列于序列19中，且 lysA编码的氨基酸序列实例列于序列20中。除了编码这些氨基酸序列的的DNA片段之外，本发明同样使用编码与序列20中所列氨基酸序列基本相同氨基酸序列的DNA片段，即只要对DDC活性基本没有影响，具有，例如，一个或更多个氨基酸替代、缺失或***突变的氨基酸序列。
(5)ddh的制备
含有 ddh的DNA片段可通过PCR方法从棒杆状菌染色体中制备。DNA供体没有特别的限制，然而，其通过 乳发酵短杆菌ATCC13869菌株加以说明。
对于 谷氨酸棒杆菌，DDH基因是已知的(Ishino，S.，等， 核酸研 究.， 15，3917(1987))，据其可制备用于PCR的引物。这种DNA引物通过分别具有序列表中序列21和22所描述的核苷酸序列的20聚体DNA加以具体说明。DNA合成PCR及含有获得 ddh质粒的制备可用与上述 lysC相同的方式加以完成。
含有 ddh DNA片段的核苷酸序列和从该核苷酸序列推断的氨基酸序列说明于序列23中。序列24中仅列有氨基酸序列。除了编码此氨基酸序列的DNA片段之外，本发明可同样使用编码与序列24中所列氨基酸序列基本相同氨基酸序列的DNA片段，即只要对DDH活性基本没有影响，具有，例如，一个或更多个氨基酸替代、缺失、或***突变的氨基酸序列。
<2>本发明的重组DNA和棒杆状菌
本发明的棒杆状菌具有其中的对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制被基本上脱敏的天冬氨酸激酶(突变型AK)，其中的编码二氢吡啶二羧酸还原酶的DNA( dapB)被增强。在优选的实施方案中，本发明的棒杆状菌为其中的编码二氢吡啶二羧酸合酶DNA( dapA)被进一步增强的棒杆状菌。在更为优选的实施方案中，本发明的棒杆状菌为其中的编码二氨基庚二酸脱羧酶的DNA( lysA)被进一步增强的棒状细菌。在更为优选的实施方案中，本发明的棒杆状菌为其中的编码二氨基庚二酸脱氢酶的DNA(ddh)被进一步增强的棒状细菌。
术语“增强”DNA这里指这样的事实，即由该DNA编码的细胞内酶活性通过以下方法加以提高，例如，增加基因的拷贝数，使用强的启动子，使用编码具有高度特异活性酶的基因，或联合这些方法。
具有突变型AK的棒状细菌可以是那些由于突变而产生突变型天冬氨酸激酶的棒杆状菌或那些通过导入突变型 lysC而转化的棒杆状菌。
用于穿入上述DNA的棒杆状菌实例包括，例如，下面的产L-赖氨酸野生型菌株；
嗜乙酰棒杆菌                        ATCC13870；
醋谷棒杆菌                          ATCC15806；
美棒杆菌                            ATCC15991；
谷氨酸棒杆菌                        ATCC13032；
扩展短杆菌                          ATCC14020；
乳发酵短杆菌                        ATCC13869；
百合花棒杆菌                        ATCC15990；
黄色短杆菌                          ATCC14067；
Corynebacterium melassecola        ATCC17965；
解糖短杆菌                          ATCC14066；
Brevibacterium immariophilum       ATCC14068；
玫瑰色短杆菌                        ATCC13825；
生硫短杆菌                          ATCC19240；
嗜氨微杆菌                          ATCC15354；
嗜热产氨棒杆菌                      AJ12340(FERM BP-1539)。
除了上述菌株以外，可用作宿主的菌株包括，例如，源自前面提到菌株的具有产L-赖氨酸能力的突变型菌株。这种人工突变型菌株包括如下：S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸(以下简称为“AEC”)抗性突变型菌株(乳发酵短杆菌AJ11082(NRRL B-1147)，日本专利公报Nos.56-1914、56-1915、57-14157、57-14158、57-30474、58-10075、59-4993、61-35840、62-24074、62-36673、5-11958、7-112437、以及7-112438)；需要氨基酸如L-高丝氨酸用于其生长的突变型菌株(日本专利公报Nos.48-28078及56-6499)；对AEC显示抗性并需要氨基酸如L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸及L-缬氨酸的突变型菌株(美国专利Nos.3,708,395和3,825,472)对DL-α-氨基-∈-己内酰胺、α-氨基-月桂酰内酰胺、天冬氨酸类似物、磺胺药物、醌型(quinoid)、及N-月桂酰亮氨酸显示抗性的产L-赖氨酸突变型菌株对氧化芦荟酸(oxyaloacetate)脱羧酶或呼吸***酶抑制剂显示抗性的产L-赖氨酸突变型菌株(日本专利公报Nos.50-53588，50-31093，52-102498，53-9394，53-86089，55-9783，55-9759，56-32995和56-39778，以及日本专利公报Nos.53-43591和53-1833)；需要肌醇或醋酸的产L-赖氨酸突变型菌株(日本专利公报Nos.55-9784和56-8692)；对氟代丙酮酸或低于34℃的温度显示敏感性的产L-赖氨酸突变型菌株(日本专利公报Nos.55-9783和53-86090)；以及对乙二醇显示抗性并产生L-赖氨酸的 短杆菌属或 棒状杆菌属突变型菌株(美国专利No.4,411,997)。
在具体的实施方案中，为了增强上述宿主中L-赖氨酸生物合成的基因，基因通过用质粒载体，转座子或噬菌体载体等导入宿主。当导入时，预期甚至通过用低拷贝型载体造成某种程度的增强。然而，使用多拷贝型载体是优选的。这种载体包括，例如，上述的质粒载体、pAJ655、pAJ1844、pAJ611、pAJ3148、以及pAJ440，除此之外，源自棒杆状菌的转座子在以下文献中被描述，包括WO02/02627和WO93/18151的国际公开手册，欧洲专利公报No.445 385，日本专利公报No.6-46867，Vertes，A.A.等.，分子微生物学.，14，571-581(1994)Vevtes，A.A，分子及普通遗传学.，245，397-405(1994)，Jagar，W.等.，FEMS微生物学快讯，126，1-6(1995)，日本专利公报No7-107976，日本专利公报No7-327680等。
在本发明中，突变型 lysC必需被增强是不必要的。也可使用那些在染色体DNA中具有 lysC突变，或突变型 lysC***其染色体DNA中的菌株，或者，突变型 lysC可通过使用质粒载体而导入。另一方面，为了有效地制备L-赖氨酸， dapA、 dapB、 lysA及 ddh优选被增强。
lysC、 dapA、 dapB、 lysB及 ddh的每种基因可通过分别使用不同的载体而相继导入宿主中。或者，2种、3种、4种或5种基因可用一个载体一起导入。当使用不同的载体时，基因可用任何顺序导入，然而，使用在宿主中具有稳定的共享和驻留(harboring)机制并能够彼此共存的载体是优选的。
具有突变型AK并进一步包括增强 dapB的棒杆状菌通过，例如，将能在棒杆状菌细胞中自主复制的含有突变型 lysC和 dapB的重组DNA导入宿主棒杆状菌中而获得。
除了突变型l ysC和 dapB以外还进一步包括增强 dapA的棒杆状菌，例如，通过将能在棒杆状菌细胞中自主复制含有突变型 lysC、 dapB、dapA的重组DNA导入宿主棒杆状菌中而获得。
除了突变型 lysC、 dapB和 dapA以外，还进一步包括增强 ddh的棒杆状菌例如，通过将能在棒杆状菌细胞中自主复制的含有突变型 lysC、dapB、 dapA、 lysA和 ddh的重组DNA导入宿主棒杆状菌中而获得。
上面提到的重组DNA可通过，例如，将参与L-赖氨酸生物合成的每个基因***载体的上述的质粒载体、转座子或噬菌体载体中而获得。
在质粒用作载体的情况，重组DNA可根据电脉冲方法(Sugimoto等.，日本专利公报No.2-207791)导入宿主中。使用转座子的基因扩增可通过将带有转座子的质粒导入宿主细胞并诱导转座子的转位而完成。
(3) 制备L-赖氨酸的方法
L-赖氨酸可通过以下方法有效地制备，包括在适当的培养基中，培养包括上述用于L-赖氨酸生物合成增强基因的棒杆状菌，在细菌培养液中制备和积累L-赖氨酸以及从培养液中收集L-赖氨酸。
待用的培养基通过含有碳源、氮源、无机盐和任选其它有机成分的普通培养基加以说明。
作为碳源、使用糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜及淀粉水解物；和有机酸如延胡索酸、柠檬酸、及琥珀酸是可能的。
作为碳源，使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵；有机氮如大豆水解物；氨气；以及氨水是可能的。
作为有机微量营养源，含有适当量的必需物质如维生素B1和L-高丝氨酸或酶母提取物等是必要的。除了上述成分外，如果必要，加入小量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
培养优选在有氧条件下进行约30至90小时。培养过程中培养温度优选控制在25℃至37℃，且pH优选控制在5至8。无机或有机、酸性或碱性物质，或氨气等可用于pH调节。通过结合普通的离子交换树脂方法、沉淀方法及其它已知方法可从培养液中收集L-赖氨酸。
                        附图简述
图1说明了包含突变型 lysC质粒p399AKYB和p399AK9B的构建方法。
图2说明了包含 dapB和Brevi.-ori的质粒pDPRB的构建方法。
图3说明了包含 dapA和Brevi.-ori的质粒pDPSB的构建方法。
图4说明了包含 lysA的质粒p299LYSA的构建方法。
图5说明了包含 lysA和Brevi.-ori的质粒pLYSAB的构建方法。
图6说明了包含 ddh和Brevi.-ori的质粒pPK4D的构建方法。
图7说明了包含 lysC、 dapB和Brevi.-ori的质粒pCRCAB的构建方法。
图8说明了包含突变型 lysC、 dapB和Brevi.-ori的质粒的pCB的构建方法。
图9说明了包含 dapA、 dapB和Brevi.-ori的质粒pAB的构建方法。
图10说明了包含 ddh和 lysA的质粒p399DL的构建方法。
图11说明了包含 ddh、 lysA和Brevi.-ori的质粒pDL的构建方法。
图12说明了包含突变 lysC、 dapA、 dapB和Brevi.-ori的质粒pCAB的构建方法。
图13说明了包含突变型 lysC、 dapA、 dapB、 lysA和Brevi.-ori的质粒pCABL的构建方法。
图14说明了包含突变型 lysC、 dapA、 dapB、 ddh、 lysA、和Brevi-ori的质粒pCABDL的构建方法。
                     优选实施方案描述
本发明将在下面参考实施例更为具体地加以解释。
                   实施例1：从乳发酵短杆菌
              中制备野生型lysC基因和突变型lysC基因
<1>野生型和突变型lysC的制备和含有它们的质粒的制备
乳发酵短杆菌ATCC13869菌株和通过突变处理获自ATCC13869菌株的产L-赖氨酸突变菌株AJ3445(FERM P-1944)用作染色体DNA供体。将AJ3445菌株进行突变处理从而使lysC发生改变以包括对赖氨酸和苏氨酸协同抑制的基本上脱敏( 生物化学杂志， 68，701-710(1970))。
含有lysC的DNA片段用PCR方法从染色体DNA中扩增(聚合酶链式反应；见White，T.J.等.， 遗传学动态.， 5，185(1989))。为了根据 谷氨酸棒杆菌的已知序列(见分子微生物学(1991)， 5(5)，1197-1204；和 分子和 普通遗传学.，(1990)， 224，317-324)扩增编码 lysC的约1,643bp的区域，对于用于扩增的DNA引物，合成具有列于序列1和2中核苷酸序列的23聚体和21聚体单链DNA，DNA用Applied Biosystems生产的380B型DNA合成仪和用亚磷酰胺方法(见四面体通讯(1981)， 22，1859)以普通方法合成。
基因用Takara Shuzo生产的PJ2000型DNA热循环仪和用Taq DNA聚合酶根据供应商指定的方法通过PCR扩增。扩增的1,643kb的基因片段通过琼脂糖凝胶电泳加以确证。之后，从凝胶中切下的片段根据普通方法加以纯化，并以限制性酶 NruI(Takara Shuzo生产)和 EcoRI(Takara Shuzo生产)消化。
pHSG399(见Takeshita，S.等.， 基因(1987)， 61，63-74)用作基因片段的克隆载体。pHSG399从限制性酶 Smal(由Takara Shuzo生产)和 EcoRI消化，并与扩增的 lysC片段连接。DNA根据指定的方法用DNA连接试剂盒(由Takara Shuzo生产)连接。这样制备其中的扩增自乳发酵短杆菌染色体的 lysC片段分别与pHSG399连接的质粒。包括来自ATCC13869(野生型菌株) lysC的质粒命名为p399AKY，但包括来自AJ3463(L-赖氨酸生产菌) lysC的质粒命名为p399AK9。
具有能使质粒在棒杆状菌属细菌中自主复制能力的DNA片段(下文称为“Brevi.-ori”)分别导入p399AKY和p399AK9中以制备能在棒杆状菌属细菌中自主复制的带有 lysC的质粒。Brevi.-ori从含有Brevi.-ori并既能在大肠杆菌细胞中又能在棒杆状菌属细菌中自主复制的质粒载体pHK4中制备。通过以 KpnI(Takara Shuzo生产)和 BamHI(Takara Shuzo生产)消化pHC4，回收Brevi.-ori片段，并将其与也以 KpnI和 BamHI消化的pHSG298(见日本专利公报No.5-7491)连接。pHK4赋予宿主卡那霉素抗性。带有pHK4的大肠杆菌命名为大肠杆菌AJ13136，并以FERM BP-5186的保藏号于1995年8月1日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)。
pHK4以限制酶 KpnI和 BamHI消化，并将切割边缘的末端变平。平末端形成通过用DNA变平试剂盒(Takara Shuzo生产)以指定的方法完成。平末端形成以后，磷酸化的 BamHI接头(Takara Shuzo生产)被连接以造成修饰从而使相应于Brevi.-ori的DNA片段可仅用 BamHI消化而从pHK4中切下。此质粒以 BamHI消化，且得到的Brevi.-ori DNA片段分别与也以 BamHI消化的p399AKY和p399AK9连接以制备每个含有能在棒杆状菌属细菌中自主复制的 lysC基因的质粒。
含有源自p399AKY野生型 lysC基因的质粒命名为p399AKYB，且含有源自p399AK9突变型 lysC基因的质粒命名为p399AK9B。p399AK9B和p399AKYB的构建方法列于图1中。通过将突变型 lysC质粒p399AK9B导入乳发酵短杆菌野生型菌株中(AJ12036菌株，EFRMBP-734)而获得的菌株AJ12691以FERM P-12918的保藏号于1992年4月10日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)，根据布达佩斯条约于1995年2月10日转为国际保藏，且保藏号为FERM BP-4999。
<2>源自乳发酵短杆菌野生型lysC和突变型lysC核苷酸序列的测定
含有野生型 lysC的质粒p399AKY和含有突变型 lysC的质粒p399AK9从各自的转化子中制备以测定野生型和突变型 lysC的核苷酸序列。核苷酸序列测定根据Sanger等的方法(例如，F.Sanger等， 美国 国家科学院院报.， 74，5463(1977))完成。
由p399AKY编码的野生型 lysC核苷酸序列列于序列表的序列3中。另一方面，由p399AK9编码的突变型 lysC核苷酸序列仅具有一个核苷酸的突变从而与野生型 lysC相比，1051位的G变成序列3中的A。已知谷氨酸棒杆菌的 lysC具有两个亚基(α，β)，被编码于相同阅读框中的相同DNA链上(见Kalinowski，J.等.， 分子微生物学(1991) 5 (5)，1197-1204)。根据同源性判断，据认为这里测序的基因也具有2个亚基(α，β)，被编码于相同阅读框中的相同DNA链上。
推断自DNA核苷酸序列的野生型AK蛋白α-亚基氨基酸序列与其DNA序列一起列于序列4中。序列5中仅列有氨基酸序列。推断自DNA核苷酸序列的野生型AK蛋白β-亚该氨基酸序列与DNA一起列于序列6中。序列7中仅列有氨基酸序列。在每个亚基中，GTG用作起始密码子，且相应的氨基酸由甲硫氨酸所代表。然而，此代表涉及甲硫氨酸、缬氨酸或甲酰甲硫氨酸。
另一方面，在突变型 lysC序列中的突变意味着氨基酸残基替代的发生从而在野生型AK蛋白的氨基酸序列中α-亚基的279位的丙氨酸残基变成苏氨酸残基，且β-亚基的30位点丙氨酸残基变成苏氨酸残基(序列：5，7)。
              实施例2：从乳发酵短杆菌中制备dapB
<1>dapB的制备和含有dapB质粒的构建
野生型乳发酵短杆菌菌株ATCC13869用作染色体DNA供体。
根据普通方法从ATCC13869菌株中制备染色体DNA。含有 dapB的DNA片段用PCR从该染色体DNA中扩增。对于用于扩增的DNA引物，为了根据乳发酵短杆菌已知的序列(见 细菌学杂志， 157(91)，2743-2749(1993))扩增编码DDPR的约2.0kb的区域，合成分别具有序列表中序列8和9描述核苷酸序列的23聚体DNA。DNA合成和PCR以实施例1中描述的相同的方式完成。PCR-Script(Invitrogen生产)用作与扩增 dapB片段连接的2,001bp扩增基因片段的克隆载体。因此构建质粒，其中的扩增自乳发酵短杆菌染色体的2,001bp  dapB片段与PCR-Script连接。具有源自ATCC13869 dapB的上述获得的质粒命名为pCRDAPB。通过将pCRDAPB导入大肠杆菌JM109菌株而获得的转化子菌株AI13107已于1995年5月26日根据布达佩斯条约以FERM BP-5114的保藏号国际保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)。
含有DDPR结构基因的1,101bp的片段通过以 EcoRV和 SphI消化pCRDAPB而回收。此片段与以 HincII和 SphI消化的pHSG399连接以制备质粒。制备的质粒命名为p399DPR。
将Brevi.-ori导入制备的p399DPR中以构建能在棒杆状菌中自主复制并带有 dapB的质粒。pHK4以限制性酶 KpnI(Takara Shuzo)消化且将切割边缘变为平末端。平末端形成通过用DNA平齐试剂盒(TakaraShuzo生产)根据指定的方法完成。平末端形成以后，连接磷酸化的 BamHI接头(Takara Shuzo生产)以造成修饰从而使相应于Brevi.-ori部分的DNA片段可仅以 BamHI消化从pHK4中切下。此质粒以 BamHI消化，且产生的Brevi.-ori DNA片段与也以 BamHI消化的p399DPR连接以制备能在棒杆状菌中自主复制含有 dapB的质粒。制备的质粒命名为pDPRB。pDPRB的构建方法列于图2。
<2>来自乳发酵短杆菌dapB核苷酸序列的测定
从具有p399DR的AJ13107菌株制备质粒DNA，且其核苷酸序列以与实施例1中描述的相同方式测定。测定的核苷酸序列和从该核苷酸序列推断的氨基酸序列列于序列10中。序列11中仅列有氨基酸序列。
                    实施例3：来自乳
                  发酵短杆菌dapA的制备
<1>dapA的制备和含有dapA质粒的构建
野生型 乳发酵短杆菌菌株ATCC13869用作染色体DNA供体。染色体DNA根据普通方法从ATCC13869菌株中制备。含有 dapA的DNA片段用PCR从染色体DNA中扩增。对于用于扩增的DNA引物，为了根据谷氨酸棒杆菌的已知序列(见 核酸研究， 18(21)，6421(1990)；EMBL接受号No.X53993)扩增编码DDPS的约1.5kb的区域，合成分别具有序列表中序列12和13所列核苷酸序列的20聚体DNA。DNA合成和PCR以与实施例1中描述的相同方式完成。pCR1000(Invitrogen生产，见 生物/技术， 9，657-663(1991))用作与扩增的 dapA片段连接的1,411bp扩增基因片段的克隆载体。DNA连接通过用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo生产)根据指定的方法完成。因此构建出质粒，其中的扩增自乳发酵短杆菌染色体的1,411bp的 dapA片段与pCR1000连接。具有源自ATCC13869 dapA的上述获得的质粒命名为pCRDAPA。
通过将pCRDAPA导入大肠杆菌JM109菌株而获得的转化子菌株AJ13106已于1995年5月26日根据布达佩斯条约以FERM BP-5113的保藏号国际保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)。
将Brevi.-ori导入制备的pCRDAPA中以构建能在棒杆状菌中自主复制带有 dapA的质粒。pHK4以限制性酶 KpnI和 BamHI(TakaraShuzo)消化且将切割的边缘末端平齐化。平末端形成通过用DNA平齐化试剂盒(Takara Shuzo生产)以指定的方法。平末端形成以后，连接磷酸化的 SmaI接头(Takara Shuzo生产)以造成修饰从而使相应于Breri.-ori部分的DNA片段可仅以 SmaI消化从pHK4中切下。此质粒以 SmaI消化，且产生的Breri.-ori DNA片段与也以 SmaI消化的pCRDAPA连接以制备能在棒杆状菌中自主复制含有 dapA的质粒。此质粒命名为pDPSB。pDPSB(kmr)的构建方法列于图3。
<2>来自乳发酵短杆菌dapA核苷酸序列的测定
从具有pCRDAPA的AJ13106杆菌中制备质粒DNA，且其核苷酸序列以与实施例1中描述的相同的方式测定。测定的核苷酸序列和以该核苷酸序列推断的氨基酸序列列于序列14中。序列15中仅列有氨基酸序列。
                        实施例4：从乳酸
                      发酵短杆菌中制备lysA
<1>lysA的制备和含有lysA质粒的构建
野生型乳发酵短杆菌菌株ATC13869用作染色体DNA供体。根据普通方法从ATCC13869菌株中制备染色体DNA。用PCR从染色体DNA中扩增含有 argS、 lysA和含有它们操纵子中的启动子的DNA片段。对于用于扩增的DNA引物，为了根据 谷氨酸棒杆菌已知的序列(见 分子微 生物学， 4(11)，1819-1830(1990)； 分子和普通遗传学， 212，112-119(1988))扩增编码精氨酰-tRNA合酶和DDC的约3.6kb的区域，使用分别具有序列表中序列16和17中描述核苷酸序列的23聚体合成DNA。DNA的合成和PCR以与实施例1中描述的相同方式完成。pHSG399用作3,579bp扩增基因片段的克隆载体。与含有扩增 lysADNA片段连接的pHSG399以限制性酶 SmaI(Takara Shuzo生产)消化。具有源自ATCC13869 lysA的按上述获得的质粒命名为p399LYSA。
含有 lysA的DNA片段通过以 KpnI(Takara Shuzo生产)和 BamHI(Takara Shuzo生产)消化p399LYSA而回收。此DNA片段与已以 kpnI和 BamHI消化的pHSG299连接。获得的质粒命名为p299LYSA。
p299SLYA的构建方法列于图4中。
将Brevi.-ori导入获得的p299LYSA以构建能在棒杆状菌中自主复制带有 lysA的质粒。pHK4以限制性酶 kpnI和 BamHI消化，并将切割的边缘末端平齐化。平末端形成用DNA补平剂盒(Takara Shuzo生产)以指定的方法完成。平末端形成以后，连接磷酸化的 KpnI接头(TakaraShuzo制备)以造成修饰从而使相应于Brevi.-ori部分的DNA片段可仅以 KpnI消化从pHK4中切下。此质粒以 KpnI消化，且产生的Brevi.-ori DNA片段与也已 KpnI消化的p299LYSA连接以制备能在棒杆状菌中自主复制含有 lysA的质粒。制备的质粒命名为pLYSAB。pLYSAB的构建方法列于图5。
<2>来自乳发酵短杆菌lysA核苷酸序列的测定
以与实施例1中描述的相同方式制备p299LYSA质粒DNA并测定其核苷酸序列。测定的核苷酸序列及推断的由此核苷酸序列编码的氨基酸序列列于序列18中。关于核苷酸序列，由 argS编码的氨基酸序列和由lysA编码的氨基酸序列分别列于序列19和20中。
               实施例5：从乳发酵短杆菌制备ddh
ddh基因通过用根据谷氨酸棒杆菌 ddh基因的已知核苷酸序列(Ishino.，S.等.，核酸研究.，15，3917(1987))而制备的2个寡核苷酸引物(序列21，22)用PCR方法从 乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA中通过扩增 ddh基因而获得。获得的扩增DNA片段以EcoT22I和 AvaI消化并使切割边缘末端平齐。之后，将此片段***pMW119的 SmaI位点以获得质粒pDDH。
其次，pDDH以 SalI和 EcoRI消化，接着形成平末端。之后，将获得的片段与以 SmaI消化的pUC18连接。这样获得的质粒命名为pUC18DDH。
将Brevi.-ori导入pUC18DDH中以构建能在棒杆状菌中自主复制带有 ddh的质粒。pHK4以限制性酶 KpnI和 BamHI消化，并使切割的边缘末端平齐化。平末端形成用DNA平齐化试剂盒(Takara Shuzo生产)以指定的方法完成。平末端形成以后，连接磷酸化的 PstI接头(TakaraShuzo生产)从而使其***到pHSG299的 PstI位点。按上述构建的质粒命名为pPK4。然后，pUC18DDH以 XbaI和 KpnI消化，并且产生的片段与以 KpnI和 XbaI消化的pPK4连接。因此，能在棒杆状菌中自主复制含有 ddh的质粒得以构建。此质粒命名为pPK4D。pPK4D的构建方法列于图6中。
                     实施例6：包括突变型
                  lysC和dapA组合的质粒的构建
包括突变 lysC、 dapA和棒杆状菌复制起点的质粒从包括 dapA的质粒pCRDAPA和包括突变型lysC和Brevi.-ori的质粒p399AK9B中构建。p399AK9B以 SalI完全消化，且然后使其末端平齐化，并与 EcoRI接头连接以构建子连接以构建其中的 SalI位点被修饰成 EcoRI位点的质粒。获得的质粒命名为p399AK9BSE。通过以 EcoRI部分消化p399AK9BSE，突变型 lysC和Brevi.-ori被切割成一个片段。此片段与以 EcoRI消化的pCRDAPA连接。获得的质粒命名为pCRCAB。此质粒可在 大肠杆菌和棒杆状菌中自主复制，并且其赋予宿主卡那霉素抗性，质粒包括突变型 lysC和 dapA的组合。pCRCAB的构建方法列于图7。
                      实施例7：包括突变型
                   lysC和dapB组合的质粒的构建
包括突变型 lysC和 dapB的质粒构建自具有突变型 lysC的质粒p399AK9和具有 dapB的质粒p399DPR。含有DDPR结构基因的1,101bp的片段通过以 EcoRV和 SphI消化p399DPR而回收。此片段与以 SalI消化且然后末端平齐并从 SphI进一步消化的p399AK9以构建包括突变型lysC和 dapB组合的质粒。此质粒命名为p399AKDDPR。
然后，将Brevi.-ori导入获得的p399AKDDPR。含有Brevi.-ori的质粒pHK4以限制性酶 KpnI(Takara Shuzo生产)消化，并将切割边缘末端平齐化。平末端形成用DNA平齐化试剂盒(Takara Shuzo生产)以指定的方法完成。平末端形成以后，连接磷酸化的 BamHI接头(TakaraShuzo生产)以造成修饰从而使相应于Brevi.-ori部分的DNA片段可仅以 BamHI消化从pHK4中切下。此质粒以 BamHI消化，且将产生的Brevi.-ori DNA片段与也从 BamHI消化的p399AKDDPR连接以构建能在棒杆状菌中自主复制含有突变型 lysC和 dapB的质粒构建的质粒命名为pCB。pCB的构建方法列于图8。
              实施例8：包括dapA
             和dapB组合质粒的构建
包括dapA的质粒pCRDAPA以 KpnI和 EcoRI消化以回收含有 dapA的DNA片段，并将其与以 KpnI和 EcoRI消化的载体质粒pHSG399连接。获得的质粒命名为p399DPS。
另一方面，包括dapB的质粒pCRDAPB从SacII和 EcoRI消化以回收含有编码DDPR区域的2.0kb的DNA片段，并与以 SacII和 EcoRI消化的p399DPS连接以构建包括 dapA和 dapB组合的质粒。获得的质粒命名为p399AB。
然后，将Brevi.-ori导入p399AB中。含有Brevi.-ori pHK4以限制性酶 BamHI(Takara Shuzo生产)消化，并将切割的边缘末端平齐。平末端形成用DNA平齐化试剂盒以指定的方法(Takara Shuzo生产)完成。平末端形成以后，连接磷酸化的 KpnI接头(Takara Shuzo生产)以造成修饰从而使相应于Brevi.-ori部分的DNA片段可仅以 KpnI消化从pHK4中切下。此质粒以 KpnI消化，且产生的Brevi.-ori DNA片段与也以 KpnI消化的p399AB连接以构建能在棒杆状菌中自主复制含有 dapA和 dapB的质粒。构建的质粒命名为pAB。pAB的构建方法列于图9。
                    实施例9：包括ddh
                   和lysA组合的质粒的构建
包括 ddh的质粒pUC18DDH以 EcoRI和 XbaI消化以回收含 ddh的DNA片段。此 ddh片段与包括 lysA的质粒p399LYSA连接，该质粒以BamHI和 XbaI消化，消化后的切割边缘被末端平齐化。获得的质粒命名为p399DL。p399DL的构建方法列于图10。
然后，将Brevi.-ori导入p399DL中。pHK4从 XbaI和 BamHI消化，并将切割的边缘末端平齐化。平末端形成以后，连接磷酸化的 XbaI接头以造成修饰从而使相应于Brevi.-ori部分的DNA片段可仅从 XbaI消化从pHK4中切下。此质粒从 XbaI消化，并将产生的Brevi.-ori DNA片段与也从 XbaI消化的p399DL连接以构建能在棒杆状菌中自主复制含有 ddh和 lysA的质粒。构建的质粒命名为pDL。pDL的构建方法列于图11中。
               实施例10：包括突变型
           lysC、dapA和dapB组合质粒的构建
p399DPS以 EcoRI和 SphI消化以形成平末端然后回收 dapA基因片段。此片段与以 SalI消化并且末端平齐化的p399AK9连接以构建突变型lysC和 dapA在其中共存的质粒p399CA。
包括 dapB的质粒pCRDAPB以 EcoRI消化且将末端平齐化，然后以SacI消化以回收包括 dapB的2.0kb的DNA片段。包括 dapA和突变型l ysC的质粒p399CA以 SpeI消化并使末端平齐化，之后以 SacI消化并与回收的 dapB片段连接以获得包括突变型 lysC、 dapA和 dapB的质粒。此质粒命名为p399CAB。
然后，将Brevi.-ori导入p399CAB。包括Brevi.-ori的质粒pHK4以限制性酶 BamHI(Takara Shuzo生产)消化，并使切割的边缘末端平齐化。平末端形成用DNA平齐化试剂盒(Takara Shuzo生产)以指定的方法完成。平末端形成以后，连接磷酸化的 KpnI接头(Takara Shuzo生产)以造成修饰从而使相应于Brevi.-ori部分的DNA片段可仅从 KpnI消化而从pHk4中切下。此质粒以 kpnI消化，并将产生的Brevi.-ori DNA片段与也以 kpnI消化的p399CAB连接以构建能在棒杆状菌中自主复制包括突变型 lysC、 dapA和 dapB组合的质粒。构建的质粒命名为pCAB。pCAB的构建方法列于图12中。
              实施例11：包括突变型lysC.
           dapA、dapB和lysA组合的质粒的构建
包括 lysA的质粒p299 LYSA以 kpnI和 BamHI消化并将末端平齐化，且然后回收 lysA基因片段。此片段与以 HpaI(Takara Shuzo生产)消化并末端平齐化的pCAB连接以构建能在棒杆状菌中自主复制包括突变型 lysC、 dapA、 dapB及 lysA组合的质粒。构建的质粒命名为pCABL。pCABL的构建方法列于图13。应该注意到 lysA基因片段***到pCABL中含有 dapG基因DNA片段中的 HpaI位点，然而 HpaI位点位于 dapB基因启动子(序列10中第611至616个核苷酸)的上游，且 dapB基因没有被脱偶联。
           实施例12：包括突变型lysC、depA、
           dapB、ddh及lysA组合的质粒的构建
pHSG299以 XbaI和 KpnI消化，并与以 XbaI和 KpnI消化的包括 ddh和 lysA的p399DL连接。构建的质粒命名为p299DL。p299DL以 XbaI和 KpnI消化并将末端平齐化。平末端形成以后，回收包括 ddh和 lysA的DNA片段。此DNA片段与以 HpaI消化并使末端平齐化包括突变型lysC、 dapA和 dapB组合的质粒pCAB连接以构建能在棒杆状菌中自主复制包括突变型 lysC、 dapA、 dapB、 lysA和 ddh组合的质粒。构建的质粒命名为pCABDL。pCABDL的构建方法列于图14。
               实施例13：包括用于L-
            赖氨酸生物合成基因的质粒向
          乳发酵短杆菌产L-赖氨酸菌中的导入
包括L-赖氨酸生物合成基因的质粒按上述构建，即将p399AK9B(Cmr)、pDPSB(Kmr)、pDPRB(Cmr)、pLYSAB(Cmr)、pPK4D(Cmr)、pCRCAB(Kmr)、pAB(Cmr)、pCB(Cmr)、pDL(Cmr)、pCAB(Cmr)、pCABL(Cmr)及pCABDL(Cmr)分别导入 乳发酵短杆菌的产L-赖氨酸菌AJ11082(NRRL B-11470)中。AJ11082菌株具AEC抗性特征。质粒以电脉冲方法(Sugimoto等.，日本专利公开No.2-207791)导入。根据各自质粒所带的药物抗性标记筛选转化子。当导入包括氯霉素抗性基因的质粒时于含有5μg/ml的完全培养基中筛选转化子，或当导入包括卡那霉素抗性基因的质粒时于含有25μg/ml卡那霉素的完全培养基中筛选转化子。
              实施例14：L-赖氨酸的制备
实施例13中获得的每种转化子培养于产L-赖氨酸培养基中以计算其L-赖氨酸的产率。L-赖氨酸制备培养基具有下面的组成。
[L-赖氨酸制备培养基]
除碳酸钙外溶解下面的成分(每1L)以用KOH调节pH至8.0。培养基于115℃灭菌15分钟然后向其中加入在干燥状态空气中被单独灭菌的碳酸钙(50g)。
葡萄糖                                      100g
(NH4)2SO4                               55g
KH2PO4                                   1g
MgSO4·7H2O                              1g
生物素                                      500μg
硫胺素                                      2000μg
FeSO4·7H2O                              0.01g
MnSO4·7H2O                              0.01g
烟酰胺                                      5mg
蛋白水解物(Mamenou)                         30ml
碳酸钙                                      50g
各种转化子和母本菌株中的每一种都接种至具有上述组成的培养基中从而于31.5℃进行往复式振摇培养。培养40或72小时后产生的L-赖氨酸量以及72小时后的生长(OD562)列于表1。在表中， lysC *代表突变型 lysC。生长以101倍稀释后测量560nm处的OD加以定量测定。
                           表1
                    培养40或72小时后L-赖氨酸的积累
菌株/质粒         导入的基因                            产生的L-赖氨酸量(g/L)     生长
                                                        40小时后    72小时后   (OD562/101)
AJ11082                                                 22.0         29.8        0.450
AJ11082/p399AK9B  lysC *                                16.8         34.5        0.398
AJ11082/pDPSB     dapA                                 18.7         33.8        0.410
AJ11082 /pDPRB   dapB                                 19.9         29.9        0.445
AJ11082/pLYSAB    lysA                                 19.8         32.5        0.356
AJ11082/pPK4D     ddh                                  19.0         33.4        0.330
AJ11082/pCRCAB    lysC *， dapA                        19.7         36.5        0.360
AJ11082/pAB       dapA， dapB                         19.0         34.8        0.390
AJ11082/pCB       lysC *， dapB                        23.3         35.0        0.440
AJ11082/pDL       ddh， lysA                           23.3         31.6        0.440
AJ11082/pCAB      lysC *， dapA， dapB                 23.0         45.0        0.425
AJ11082/pCABL     lysC *， dapA， dapB， lysA         26.2         46.5        0.379
AJ11082/pCABDL    lysC *， dapA， dapB， lysA， ddh  26.5         47.0        0.409
如表1所示，当突变型 lysC、 dapA或 dapB被单独增强时，培养72小时后产生的L-赖氨酸量大于或等于母本菌株产生的L-赖氨酸量，然而，培养40小时以后，产生的L-赖氨酸量小于母本菌株产生的L-赖氨酸量。即，在短期培养中L-赖氨酸产生速度降低。同样地，当突变型 lysC和 dapA，或 dapA和 dapB被联合增强时，培养72小时后产生的L-赖氨酸量大于由母本菌株产生的L-赖氨酸量，然而，培养40小时后产生的L-赖氨酸量小于母本菌株产生的L-赖氨酸量。因此L-赖氨酸产生速度降低。
另一方面，当 lysA或 ddh被单独增强，或当 lysA和 ddh被联合增强时，培养40小时以后产生的L-赖氨酸量大于母本菌株产生的L-赖氨酸量，然而，经长期培养后由于生长的下降，产生的L-赖氨酸量因此小于母本菌株产生的L-赖氨酸量。
相反，在其中的 dapB与突变型 lysC被一起增强的菌株中，生长加快，在短期培养中L-赖氨酸产生速度被成功恢复，并且在长期培养中积累的L-赖氨酸量也被提高。在其中的三种突变型 lysC、 dapA和 dapB被同时增强的菌株中，L-赖氨酸产率进一步提高。通过相继增强 lysA和 ddh，  L-赖氨酸产生速度和积累的L-赖氨酸量均逐渐提高。
                     工业上的可应用性
根据本发明，棒杆状菌的产L-赖氨酸能力可被提高，并且生长速度也可被加快。
通过同时增强 dapB与突变型 lysC，产L-赖氨酸棒杆状菌中L-赖氨酸生产速度可被提高，且产率也可提高。除了前面提到的基因以外通过相继增强 dapA、 lysA及 ddh，L-赖氨酸产生速度和产率可进一步提高。
                      序列表
(1)一般信息：
  (i)申请人：AJINOMOTO CO.，INC.
  (ii)发明题目：L-赖氨酸制备方法
  (iii)序列数目：24
  (iv)通讯地址：
    (A)地址：
    (B)街道：
    (C)城市：
    (E)国家：
    (F)邮编：
  (v)计算机可读形式：
    (A)介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release #1.0，#1.30版
  (vi)当前申请数据：
    (A)申请号：
    (B)提交日期：
    (C)分类：
  (vii)优先申请数据：
    (A)申请号：JP7-140614
    (B)提交日期：1995年7月7日
  (viii)律师/事务所信息：
    (A)名字：
    (B)注册号：
  (ix)电讯信息：
    (A)电话：
    (B)电传：
(2)序列1信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：23个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“合成的DNA”
  (iv)反义：无
(xi)序列描述：序列1：
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT                    23
(2)序列2信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：21个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：其它…合成DNA
    (A)描述：/desc＝“合成DNA”
  (iv)反义：有
(xi)序列描述：序列2：
ACGGAATTCA ATCTTACGGC C                     21
(2)序列3信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：1643个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (iv)反义：无
  (vi)最初来源：
    (A)生物：乳发酵短杆菌
    (B)菌株：ATCC13869
(xi)序列描述：序列3：
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC       60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT      120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG      180
GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT      240
GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC      300
ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT      360
GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG      420
CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT      480
GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC      540
GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC      600
AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG      660
TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT      720
GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT      780
AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC      840
TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC      900
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT      960
CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC     1020
GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT     1080
GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC     1140
GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG     1200
CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCWGGTCGG CAAAGTCTCC     1260
CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG     1320
CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG     1380
ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC     1440
GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT     1500
TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA     1560
CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT     1620
CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC                                             1643
(2)序列4信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：1643个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (iv)反义：无
  (vi)最初来源：
    (A)生物：乳发酵短杆菌
    (B)菌株：ATCC13869
  (ix)特征：
    (A)名字/关键词：CDS
    (B)位置：217..1482
(xi)序列描述：序列4：
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC       60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT      120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG      180
GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG        234
                                        Met Ala Leu Val Val Gln
                                          1               5
AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC        282
Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val
             10                   15                  20
GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT        330
Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val
         25                   30                  35
GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA        378
Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala
     40                   45                  50
GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG        426
Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu
 55                   60                  65                  70
ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG        474
Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu
                 75                   80                  85
TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG        522
Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val
             90                   95                 100
CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG        570
Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro
        105                  110                 115
GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT        618
Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala
    120                  125                 130
GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT        666
Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly
135                 140                  145                 150
CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC        714
Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn
                155                  160                 165
GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT        762
Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala
            170                  175                 180
GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC      810
Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe
        185                  190                 195
GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG      858
Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu
    200                  205                 210
CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC      906
Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg
215                 220                  225                 230
TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG      954
Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu
                235                  240                 245
GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG      1002
Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys
            250                  255                 260
TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG      1050
Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu
        265                  270                 275
GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC      1098
Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp
    280                 285                  290
ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC      1146
Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile
295                 300                  305                 310
ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG      1194
Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu
                315                  320                 325
AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC      1242
Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp
            330                  335                 340
CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA      1290
Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro
        345                  350                 355
GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC      1338
Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn
    360                  365                 370
ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT      1386
Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg
375                 380                  385                 390
GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG      1434
Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln
                395                  400                 405
CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA      1482
Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
            410                  415                 420
AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG    1542
TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT    1602
TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C                        1643
(2)序列5信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：421个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：序列5：
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
  1              5                   10                  15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
             20                   25                  30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
         35                   40                  45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
     50                   55                  60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
 65                  70                   75                  80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                 85                   90                  95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                  105                 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                  120                 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                  140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                  155                160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                  170                 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                  185                 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                  200                 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                  215                 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                  230                 235                 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                  250                 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                  265                 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                  280                 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                  295                 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg
305                 310                  315                 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                  330                 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                  345                 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                  360                 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                  375                 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                  390                 395                 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                  410                 415
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
(2)序列6信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：1643个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (iv)反义：无
  (vi)最初来源：
    (A)生物：乳发酵短杆菌
    (B)菌株：ATCC13869
  (ix)特征：
    (A)姓名/关键词：CDS
    (B)位置：964..1482
(xi)序列描述：序列6：
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATCGGTC       60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT     120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG     180
GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT     240
GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC     300
ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT     360
GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG     420
CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCAGGGCTAT TGAGTCCCTT     480
GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC     540
GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC     600
AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG     660
TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT     720
GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT     780
AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC     840
TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC     900
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT     960
CCT  GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA     1008
     Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu
       1               5                   10                  15
GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC      1056
Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala
                 20                   25                  30
AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT      1104
Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val
             35                   40                  45
CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC      1152
Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe
         50                   55                  60
ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG      1200
Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys
     65                   70                  75
CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC      1248
Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val
80                   85                   90                  95
GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT      1296
Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val
                100                  105                 110
ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA      1344
Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu
            115                  120                 125
TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT      1392
Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp
        130                  135                 140
GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC      1440
Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly
    145                 150                  155
GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA      1490
Gly Glu Asp Glu Ala Val ValTyr Ala Gly Thr Gly Arg
160                 165                170
AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG    1550
GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT    1610
TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC                                 1643
(2)序列7信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：172个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：序列7：
Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala
  1               5                   10                  15
Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys
             20                   25                  30
Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Mat Val Leu
         35                   40                  45
Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr
     50                  55                   60
Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu
 65                  70                   75                  80
Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly
                 85                   90                  95
Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr
            100                  105                 110
Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu
        115                  120                 125
Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp
    130                  135                 140
Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly
145                  150                 155                 160
Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
                165                  170
(2)序列8信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：23个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“合成DNA”
  (iv)反义：非
(xi)序列描述：序列8：
GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA                         23
(2)序列9信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：23个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“合成DNA”
  (iv)反义：是
(xi)序列描述：序列9：
CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT                         23
(2)序列10信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：2001个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (iv)反义：非
  (vi)最初来源：
    (A)生物：乳发酵短杆菌
    (B)菌株：ATCC13869
  (ix)特征：
    (A)名字/关键词：CDS
    (B)位置：730..1473
(xi)序列描述：序列10：
GGATCCCCAA TCGATACCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT     60
GACGTTGAGG AAGGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTGAATTGG    120
ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTGGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC    180
TCGCGTGAAC GTTTCGTGCT CGGCAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CGGAGTCACC    240
AACTTGAGCC TGCTGCTTCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AACGGCGGCA AAGCAGTGGG    300
GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GGGCTCTGAA GTGGTAGGCG ACGGGGCAGC      360
ATCTGAAGGC GTGCGAGTTG TGGTGACCGG GTTAGCGGTT TCAGTTTCTG TCACAACTGG      420
AGCAGGACTA GCAGAGGTTG TAGGCGTTGA GCCGCTTCCA TCACAAGCAC TTAAAAGTAA      480
AGAGGCGGAA ACCACAAGCG CCAAGGAACT ACCTGCGGAA CGGGCGGTGA AGGGCAACTT      540
AAGTCTCATA TTTCAAACAT AGTTCCACCT GTGTGATTAA TCTCCAGAAC GGAACAAACT      600
GATGAACAAT CGTTAACAAC ACGACCCAAA ACGGTCAGTT AGGTATGGAT ATCAGCACCT      660
TCTGAATGGG TACGTCTAGA CTGGTGGGCG TTTGAAAAAC TCTTCGCCCC ACGAAAATGA      720
AGGAGCATA ATG GGA ATC AAG GTT GGC GTT CTC GGA GCC AAA GGC CGT          768
          Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg
            1               5                   10
GTT GGT CAA ACT ATT GTG GCA GCA GTC AAT GAG TCC GAC GAT CTG GAG        816
Val Gly Gln Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu
     15                   20                  25
CTT GTT GCA GAG ATC GGC GTC GAC GAT GAT TTG AGC CTT CTG GTA GAC        864
Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp
  30                  35                  40                  45
AAC GGC GCT GAA GTT GTC GTT GAC TTC ACC ACT CCT AAC GCT GTG ATG        912
Asn Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met
                 50                   55                  60
GGC AAC CTG GAG TTC TGC ATC AAC AAC GGC ATT TCT GCG GTT GTT GGA        960
Gly Asn Leu Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly
             65                   70                  75
ACC ACG GGC TTC GAT GAT GCT CGT TTG GAG CAG GTT CGC GCC TGG CTT        1008
Thr Thr Gly Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu
         80                   85                  90
GAA GGA AAA GAC AAT GTC GGT GTT CTG ATC GCA CCT AAC TTT GCT ATC        1056
Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile
     95                 100                  105
TCT GCG GTG TTG ACC ATG GTC TTT TCC AAG CAG GCT GCC CGC TTC TTC        1104
Ser Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe
110                  115                 120                 125
GAA TCA GCT GAA GTT ATT GAG CTG CAC CAC CCC AAC AAG CTG GAT GCA        1152
Glu Ser Ala Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala
                130                  135                 140
CCT TCA GGC ACC GCG ATC CAC ACT GCT CAG GGC ATT GCT GCG GCA CGC        1200
Pro Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg
            145                  150                 155
AAA GAA GCA GGC ATG GAC GCA CAG CCA GAT GCG ACC GAG CAG GCA CTT        1248
Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu
        160                  165                 170
GAG GGT TCC CGT GGC GCA AGC GTA GAT GGA ATC CCA GTT CAC GCA GTC        1296
Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val
    175                  180                 185
CGC ATG TCC GGC ATG GTT GCT CAC GAG CAA GTT ATC TTT GGC ACC CAG        1344
Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln
190                  195                 200                 205
GGT CAG ACC TTG ACC ATC AAG CAG GAC TCC TAT GAT CGC AAC TCA TTT        1392
Gly Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe
                210                  215                 220
GCA CCA GGT GTC TTG GTG GGT GTG CGC AAC ATT GCA CAG CAC CCA GGC       1440
Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly
            225                  230                 235
CTA GTC GTA GGA CTT GAG CAT TAC CTA GGC CTG TAAAGGCTCA TTTCAGCAGC     1493
Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
        240                  245
GGGTGGAATT TTTTAAAAGG AGCGTTTAAA GGCTGTGGCC GAACAAGTTA AATTGAGCGT     1553
GGAGTTGATA GCGTGCAGTT CTTTTACTCC ACCCGCTGAT GTTGAGTGGT CAACTGATGT     1613
TGAGGGCGCG GAAGCACTCG TCGAGTTTGC GGGTCGTGCC TGCTACGAAA CTTTTGATAA     1673
GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC GTATCTGCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA     1733
CACTGCTTTG CTTGAGCATG CCAATGCCAC GATGTATATC CGAGGCATTT CTCGGTCCGC     1793
GACCCATGAA TTGGTCCGAC ACCGCCATTT TTCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCGTTTCGT     1853
GCACACCGGA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC CACTCTCATC GATGAAGATC CGCAGTTGCG     1913
TGAACTTTTC ATGCACGCCA TGGATGAGTC TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTTAATGC     1973
GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG                                        2001
(2)序列11信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：248个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：序列11：
Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln
  1               5                   10                  15
Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala
             20                   25                  30
Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala
         35                   40                  45
Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu
     50                   55                  60
Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly
 65                   70                  75                  80
Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu Glu Gly Lys
                 85                   90                  95
Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val
            100                  105                 110
Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala
        115                  120                 125
Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly
    130                  135                 140
Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala
145                 150                  155                 160
Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser
                165                  170                 175
Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser
            180                  185                 190
Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr
        195                  200                 205
Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly
    210                  215                 220
Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val
225                  230                 235                 240
Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
                245
(2)序列12信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：23个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“合成DNA”
  (iv)反义：无
(xi)序列描述：序列12：
GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC                   23
(2)序列13信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：23个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“合成DNA”
  (iv)反义：有
(xi)序列描述：序列13：
GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG                   23
(2)序列14信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：1411个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (iv)反义：无
  (vi)最初来源：
    (A)生物：乳发酵短杆菌
    (B)菌株：ATCC13869
  (ix)特征：
    (A)名字/关键词：CDS
    (B)位置：311..1213
(xi)序列描述：序列14：
CTCTCGATAT CGAGAGAGAA GCAGCGCCAC GGTTTTTCGG TGATTTTGAG ATTGAAACTT      60
TGGCAGACGG ATCGCAAATG GCAACAAGCC CGTATGTCAT GGACTTTTAA CGCAAAGCTC     120
ACACCCACGA GCTAAAAATT CATATAGTTA AGACAACATT TTTGGCTGTA AAAGACAGCC     180
GTAAAAACCT CTTGCTCATG TCAATTGTTC TTATCGGAAT GTGGCTTGGG CGATTGTTAT     240
GCAAAAGTTG TTAGGTTTTT TGCGGGGTTG TTTAACCCCC AAATGAGGGA AGAAGGTAAC     300
CTTGAACTCT ATG AGC ACA GGT TTA ACA GCT AAG ACC GGA GTA GAG CAC        349
           Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His
             1               5                   10
TTC GGC ACC GTT GGA GTA GCA ATG GTT ACT CCA TTC ACG GAA TCC GGA       397
Phe Gly Thr Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly
     15                  20                   25
GAC ATC GAT ATC GCT GCT GGC CGC GAA GTC GCG GCT TAT TTG GTT GAT       445
Asp Ile Asp Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp
 30                  35                   40                  45
AAG GGC TTG GAT TCT TTG GTT CTC GCG GGC ACC ACT GGT GAA TCC CCA       493
Lys Gly Leu Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro
                 50                   55                  60
ACG ACA ACC GCC GCT GAA AAA CTA GAA CTG CTC AAG GCC GTT CGT GAG        541
Thr Thr Thr Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu
             65                   70                  75
GAA GTT GGG GAT CGG GCG AAC GTC ATC GCC GGT GTC GGA ACC AAC AAC        589
Glu Val Gly Asp Arg Ala Asn Val Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn
         80                   85                  90
ACG CGG ACA TCT GTG GAA CTT GCG GAA GCT GCT GCT TCT GCT GGC GCA        637
Thr Arg Thr Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala
     95                 100                  105
GAC GGC CTT TTA GTT GTA ACT CCT TAT TAC TCC AAG CCG AGC CAA GAG        685
Asp Gly Leu Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu
110                 115                  120                 125
GGA TTG CTG GCG CAC TTC GGT GCA ATT GCT GCA GCA ACA GAG GTT CCA        733
Gly Leu Leu Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro
                130                  135                 140
ATT TGT CTC TAT GAC ATT CCT GGT CGG TCA GGT ATT CCA ATT GAG TCT        781
Ile Cys Leu Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser
            145                  150                 155
GAT ACC ATG AGA CGC CTG AGT GAA TTA CCT ACG ATT TTG GCG GTC AAG        829
Asp Thr Met Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys
        160                  165                 170
GAC GCC AAG GGT GAC CTC GTT GCA GCC ACG TCA TTG ATC AAA GAA ACG        877
Asp Ala Lys Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr
    175                  180                 185
GGA CTT GCC TGG TAT TCA GGC GAT GAC CCA CTA AAC CTT GTT TGG CTT        925
Gly Leu Ala Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu
190                 195                  200                 205
GCT TTG GGC GGA TCA GGT TTC ATT TCC GTA ATT GGA CAT GCA GCC CCC        973
Ala Leu Gly Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro
                210                  215                 220
ACA GCA TTA CGT GAG TTG TAC ACA AGC TTC GAG GAA GGC GAC CTC GTC        1021
Thr Ala Leu Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val
            225                  230                 235
CGT GCG CGG GAA ATC AAC GCC AAA CTA TCA CCG CTG GTA GCT GCC CAA        1069
Arg Ala Arg Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln
        240                  245                 250
GGT CGC TTG GGT GGA GTC AGC TTG GCA AAA GCT GCT CTG CGT CTG CAG        1117
Gly Arg Leu Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln
    255                 260                  265
GGC ATC AAC GTA GGA GAT CCT CGA CTT CCA ATT ATG GCT CCA AAT GAG        1165
Gly Ile Asn Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu
270                  275                 280                 285
CAG GAA CTT GAG GCT CTC CGA GAA GAC ATG AAA AAA GCT GGA GTT CTA        1213
Gln Glu Leu Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu
                290                  295                 300
TAAATATGAA TGATTCCCGA AATCGCGGCC GGAAGGTTAC CCGCAAGGCG GCCCACCAGA      1273
AGCTGGTCAG GAAAACCATC TGGATACCCC TGTCTTTCAG GCACCAGATG CTTCCTCTAA      1333
CCAGAGCGCT GTAAAAGCTG AGACCGCCGG AAACGACAAT CGGGATGCTG CGCAAGGTGC      1393
TCAAGGATCC CAACATTC                                                    1411
(2)序列15信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：301个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：序列15：
Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr
  1               5                   10                  15
Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp
             20                   25                  30
Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu
         35                   40                  45
Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr
     50                   55                  60
Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly
 65                   70                  75                  80
Asp Arg Ala Asn Val Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr
                 85                   90                  95
Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu
            100                  105                 110
Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu
        115                  120                 125
Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu
    130                  135                 140
Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met
145                 150                  155                 160
Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys
                165                  170                 175
Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala
            180                  185                 190
Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly
        195                  200                  205
Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu
    210                  215                 220
Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg
225                  230                 235                 240
Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu
                245                  250                 255
Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln Gly Ile Asn
            260                  265                 270
Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu Gln Glu Leu
        275                  280                 285
Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu
    290                  295                 300
(2)序列16信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：23个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“合成DNA”
  (iv)反义：无
(xi)序列描述：序列16：
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG                     23
(2)序列17信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：23个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“合成DNA”
  (iv)反义：有
(xi)序列描述：序列17：
CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA                     23
(2)序列18信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：3579个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (iv)反义：无
  (vi)最初来源：
    (A)生物：乳发酵短杆菌
    (B)菌株：ATCC13869
  (ix)特征：
    (A)名字/关键词：CDS
    (B)位置：533..2182
  (ix)特征：
    (A)名字/关键词：CDS
    (B)位置：2188..3522
(xi)序列描述：序列18：
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT       60
TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA      120
GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT      180
GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC      240
GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC      300
AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC      360
CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA      420
CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA      480
AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG          535
                                                          Met
                                                            1
ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT        583
Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu Val
              5                   10                  15
TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT        631
Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val Val
         20                   25                  30
GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT        679
Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile
     35                   40                  45
GCA TTG CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT TTG GCT        727
Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu Ala
 50                   55                  60                  65
ACC TGG CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT TCT GCT        775
Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser Ala
                 70                   75                  80
GAA ATT GCT GGC CCA GGC TTT TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA GCA GCA        823
Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala Ala
             85                   90                  95
CAG GGT GAA ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GGC GAG ACT TTC GGA        871
Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe Gly
        100                  105                 110
AAC TCC GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC GTT TCT        919
Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val Ser
    115                  120                 125
GCA AAC CCA ACC GGA CCT ATT CAC CTT GGC GGA ACC CGC TGG GCT GCC        967
Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala
130                 135                  140                 145
GTG GGT GAC TCT TTG GGT CGT GTG CTG GAG GCT TCC GGC GCG AAA GTG        1015
Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys Val
                150                  155                 160
ACC CGC GAA TAC TAC TTC AAC GAT CAC GGT CGC CAG ATC GAT CGT TTC        1063
Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg Phe
            165                  170                 175
GCT TTG TCC CTT CTT GCA GCG GCG AAG GGC GAG CCA ACG CCA GAA GAC        1111
Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp
        180                  185                 190
GGT TAT GGC GGC GAA TAC ATT AAG GAA ATT GCG GAG GCA ATC GTC GAA        1159
Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val Glu
    195                  200                 205
AAG CAT CCT GAA GCG TTG GCT TTG GAG CCT GCC GCA ACC CAG GAG CTT        1207
Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu Leu
210                 215                  220                 225
TTC CGC GCT GAA GGC GTG GAG ATG ATG TTC GAG CAC ATC AAA TCT TCC        1255
Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser Ser
                230                  235                 240
CTG CAT GAG TTC GGC ACC GAT TTC GAT GTC TAC TAC CAC GAG AAC TCC        1303
Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn Ser
            245                  250                 255
CTG TTC GAG TCC GGT GCG GTG GAC AAG GCC GTG CAG GTG CTG AAG GAC        1351
Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys Asp
        260                  265                 270
AAC GGC AAC CTG TAC GAA AAC GAG GGC GCT TGG TGG CTG CGT TCC ACC        1399
Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser Thr
    275                  280                 285
GAA TTC GGC GAT GAC AAA GAC CGC GTG GTG ATC AAG TCT GAC GGC GAC        1447
Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly Asp
290                 295                  300                 305
GCA GCC TAC ATC GCT GGC GAT ATC GCG TAC GTG GCT GAT AAG TTC TCC        1495
Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe Ser
                310                  315                 320
CGC GGA CAC AAC CTA AAC ATC TAC ATG TTG GGT GCT GAC CAC CAT GGT        1543
Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His Gly
            325                  330                 335
TAC ATC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA CTT GGC TAC AAG CCA        1591
Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Pro
        340                  345                 350
GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC        1639
Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg Asp
    355                 360                  365
GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG CGT GCA GGC ACC GTG GTC ACC CTA        1687
Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr Leu
370                 375                  380                 385
GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC GGC ATC GAT GCG GCG CGT TAC TCC CTG        1735
Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser Leu
                390                  395                 400
ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTG TGG        1783
Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu Trp
            405                  410                 415
GAA TCC CAG TCC TCC GAC AAC CCT GTG TAC TAC GTG CAG TAC GGA CAC        1831
Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly His
        420                  425                 430
GCT CGT CTG TGC TCC ATC GCG CGC AAG GCA GAG ACC TTG GGT GTC ACC        1879
Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val Thr
    435                  440                 445
GAG GAA GGC GCA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA GGC GAT        1927
Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp
450                 455                  460                 465
CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GCT        1975
Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala Ala
                470                  475                 480
GAC CTA CGT GAA CCA CAC CGC ATT GCC CGC TAT GCT GAG GAA TTA GCT        2023
Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu Ala
            485                  490                 495
GGA ACT TTC CAC CGC TTC TAC GAT TCC TGC CAC ATC CTT CCA AAG GTT        2071
Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys Val
        500                  505                 510
GAT GAG GAT ACG GCA CCA ATC CAC ACA GCA CGT CTG GCA CTT GCA GCA        2119
Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala
    515                 520                  525
GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC        2167
Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val Ser
530                 535                  540                 545
GCA CCG GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA          2214
Ala Pro Glu Lys Met       Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu
                550         1               5
CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC        2262
Leu Pro Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly
 10                   15                  20                  25
GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC        2310
Val Val Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr
                 30                   35                  40
GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT        2353
Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys
             45                   50                  55
CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA        2406
Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala
         60                   65                  70
TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG        2454
Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu
     75                  80                   85
GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG        2502
Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu
 90                  95                  100                 105
GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA        2550
Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys
                110                  115                 120
GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG        2598
Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val
            125                  130                 135
GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT        2646
Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala
        140                  145                 150
GGT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG TTG ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC        2694
Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile
    155                  160                 165
GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG        2742
Glu Ala His Thr His Glu Phe Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys
170                 175                  180                 185
TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC        2790
Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala
                190                  195                 200
GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT        2838
Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val
            205                  210                 215
GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC        2886
Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg
        220                  225                 230
GTG TTG GGC CTG TAC TCA CAG ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT        2934
Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu
    235                 240                  245
CCT GAA CTG GAT CTC GGT GGC GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT        2982
Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Ile Ale Tyr Tyr Ala Ala
250                  255                 260                 265
GAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA       3030
Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala
                270                  275                 280
GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTG CTT       3078
Val Gly Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu
            285                  290                 295
GTT GAG CCC GGC CGC GCT ATC GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC       3126
Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr
        300                 305                  310
GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC       3174
Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg
    315                 320                  325
CGT TAC ATC GCC GTG GAC GGA GGC ATG TCC GAC AAC ATC CGC CCA GCA       3222
Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala
330                  335                 340                 345
CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC GAA       3270
Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu
                350                  355                 360
GGA GAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC       3318
Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly
            365                  370                 375
GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC       3366
Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly
        380                 385                  390
GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC       3414
Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser
    395                  400                 405
TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT       3462
Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala
410                 415                  420                 425
GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC       3510
Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu
                430                  435                 440
TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCTT CACCTTCGCC            3562
(2)序列19信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：550个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：序列19：
Met Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu
  1               5                   10                  15
Val Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val
              20                  25                  30
Val Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn
         35                   40                  45
Ile Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu
     50                   55                  60
Ala Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser
 65                   70                  75                  80
Ala Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala
                  85                  90                  95
Ala Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe
            100                  105                 110
Gly Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val
        115                  120                 125
Ser Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala
    130                  135                 140
Ala Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys
145                 150                  155                 160
Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg
                165                  170                 175
Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu
            180                  185                 190
Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val
        195                  200                 205
Glu Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu
    210                  215                 220
Leu Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser
225                 230                  235                 240
Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn
                245                  250                 255
Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys
            260                  265                 270
Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser
        275                  280                 285
Thr Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly
    290                  295                 300
Asp Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe
305                 310                  315                 320
Ser Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His
                325                  330                 335
Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys
            340                  345                 350
Pro Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg
        355                  360                 365
Asp Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr
    370                  375                 380
Leu Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser
385                 390                  395                 400
Leu Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu
                 405                 410                 415
Trp Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly
            420                  425                 430
His Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val
        435                  440                 445
Thr Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly
    450                 455                  460
Asp Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala
465                 470                  475                 480
Ala Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu
                 485                 490                 495
Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys
            500                  505                 510
Val Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala
         515                 520                 525
Ala Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val
    530                  535                 540
Ser Ala Pro Glu Lys Met
545                 550
(2)序列20信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：445个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：序列20：
Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro
  1               5                  10                   15
Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
             20                   25                  30
Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
         35                   40                  45
Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
     50                   55                  60
Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys
 65                   70                  75                  80
Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
                 85                   90                  95
Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
            100                  105                 110
Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
        115                  120                 125
Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu
    130                  135                 140
Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp
145                 150                  155                 160
Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
                165                  170                 175
Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Pha Gly Phe Ser Leu Ala Ser
            180                  185                 190
Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
        195                  200                 205
Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala
    210                 215                   220
Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln
225                 230                  235                 240
Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
                245                  250                 255
Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
            260                  265                 270
Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
        275                  280                 285
Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile
    290                  295                 300
Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp
305                 310                  315                 320
Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly
                325                  330                 335
Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
            340                  345                 350
Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
        355                  360                 365
Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu
    370                 375                  380
Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala
385                 390                  395                 400
Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
                405                  410                 415
Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
            420                  425                 430
Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala
        435                  440                 445
(2)序列21信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：20个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“合成DNA”
  (iv)反义：无
(xi)序列描述：序列21：
CATCTAAGTA TGCATCTCGG                          20
(2)序列22信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：20个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“合成DNA”
  (iv)反义：有
(xi)序列描述：序列22：
TGCCCCTCGA GCTAAATTAG                          20
(2)序列23信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：1034个碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组)
  (iv)反义：无
  (vi)最初来源：
    (A)生物：乳发酵短杆菌
    (B)菌株：ATCC13869
  (ix)特征：
    (A)名字/关键词：CDS
    (B)位置：61..1020
(xi)序列描述：序列23：
ATGCATCTCG GTAAGCTCGA CCAGGACAGT GCCACCACAA TTTTGGAGGA TTACAAGAAC      60
ATG ACC AAC ATC CGC GTA GCT ATC GTG GGC TAC GGA AAC CTG GGA CGC        108
Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
  1               5                   10                  15
AGC GTC GAA AAG CTT ATT GCC AAG CAG CCC GAC ATG GAC CTT GTA GGA        156
Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
             20                   25                  30
ATC TTC TCG CGC CGG GCC ACC CTC GAC ACA AAG ACG CCA GTC TTT GAT        204
Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
         35                   40                  45
GTC GCC GAC GTG GAC AAG CAC GCC GAC GAC GTG GAC GTG CTG TTC CTG        252
Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
     50                   55                  60
TGC ATG GGC TCC GCC ACC GAC ATC CCT GAG CAG GCA CCA AAG TTC GCG        300
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala
 65                   70                  75                  80
CAG TTC GCC TGC ACC GTA GAC ACC TAC GAC AAC CAC CGC GAC ATC CCA        348
Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro
                 85                   90                  95
CGC CAC CGC CAG GTC ATG AAC GAA GCC GCC ACC GCA GCC GGC AAC GTT        396
Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
            100                  105                 110
GCA CTG GTC TCT ACC GGC TGG GAT CCA GGA ATG TTC TCC ATC AAC CGC        444
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg
        115                  120                 125
GTC TAC GCA GCG GCA GTC TTA GCC GAG CAC CAG CAG CAC ACC TTC TGG        492
Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp
    130                 135                  140
GGC CCA GGT TTG TCA CAG GGC CAC TCC GAT GCT TTG CGA CGC ATC CCT        540
Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro
145                 150                  155                 160
GGC GTT CAA AAG GCA GTC CAG TAC ACC CTC CCA TCC GAA GAC GCC CTG        588
Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Sar Glu Asp Ala Leu
                165                  170                 175
GAA AAG GCC CGC CGC GGC GAA GCC GGC GAC CTT ACC GGA AAG CAA ACC        636
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr
            180                  185                 190
CAC AAG CGC CAA TGC TTC GTG GTT GCC GAC GCG GCC GAT CAC GAG CGC        684
His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
        195                  200                 205
ATC GAA AAC GAC ATC CGC ACC ATG CCT GAT TAC TTC GTT GGC TAC GAA        732
Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
    210                  215                 220
GTC GAA GTC AAC TTC ATC GAC GAA GCA ACC TTC GAC TCC GAG CAC ACC        780
Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr
225                 230                  235                 240
GGC ATG CCA CAC GGT GGC CAC GTG ATT ACC ACC GGC GAC ACC GGT GGC    828
Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
                245                  250                 255
TTC AAC CAC ACC GTG GAA TAC ATC CTC AAG CTG GAC CGA AAC CCA GAT    876
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
            260                  265                 270
TTC ACC GCT TCC TCA CAG ATC GCT TTC GGT CGC GCA GCT CAC CGC ATG    924
Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
        275                  280                 285
AAG CAG CAG GGC CAA AGC GGA GCT TTC ACC GTC CTC GAA GTT GCT CCA    972
Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phs Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
    290                  295                 300
TAC CTG CTC TCC CCA GAG AAC TTG GAC GAT CTG ATC GCA CGC GAC GTC    1020
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val
305                 310                  315                 320
TAATTTAGCT CGAG                                                    1034
(2)序列24信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：320个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：序列24：
Met Thr Asn Ile Arg Val AlaIle Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
  1               5                  10                  15
Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
             20                   25                  30
Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
         35                   40                  45
Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
     50                   55                  60
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala
 65                   70                  75                  80
Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro
                 85                   90                  95
Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
            100                  105                 110
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg
        115                  120                 125
Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp
    130                 135                  140
Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro
145                 150                  155                 160
Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
                165                   170                175
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr
            180                  185                 190
His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
        195                  200                 205
Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
    210                  215                 220
Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr
225                 230                  235                 240
Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
                245                  250                 255
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
            260                  265                 270
Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
        275                  280                 285
Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
    290                  295                 300
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val
305                 310                  315                 320

Claims (13)

1.能在棒杆状菌细胞中自主复制的重组DNA，包括：
(1)编码其中由L-赖氨酸和L-苏氨酸导致的反馈抑制被脱敏的天冬氨酸激酶的DNA序列，其中其α亚基具有序列5所示的氨基酸序列或者在序列5所示的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸的置换、缺失、或***的氨基酸序列，其β亚基具有序列7所示的氨基酸序列或者在序列7所示的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸的置换、缺失或***的氨基酸序列，α亚基和β亚基形成具有天冬氨酸激酶活性的酶，并且
其中α-亚基N-末端279位的丙氨酸残基变成非丙氨酸和非酸性氨基酸的氨基酸残基，而β-亚基中30位的丙氨酸残基变成非丙氨酸和非酸性氨基酸的氨基酸残基，所述位置均从其N末端计数，和
(2)一种DNA序列，其编码具有序列11所示的氨基酸序列的二氢吡啶二羧酸还原酶或具有在序列11所示的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸的置换、缺失或***的氨基酸序列并具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的酶。
2.根据权利要求1的重组DNA，进一步包括如下DNA序列，其编码具有序列15所示的氨基酸序列的二氢吡啶二羧酸合酶或具有在序列15所示的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸的置换、缺失或***的氨基酸序列并具有二氢吡啶二羧酸合酶活性的酶。
3.根据权利要求2的重组DNA，进一步包括如下DNA序列，其编码具有序列20所示的氨基酸序列的二氨基庚二酸脱羧酶或具有在序列20所示的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸的置换、缺失或***的氨基酸序列并具有二氨基庚二酸脱羧酶活性的酶。
4.根据权利要求3的重组DNA，进一步包括如下DNA序列，其编码具有序列24所示的氨基酸序列的二氨基庚二酸脱氢酶或具有在序列24所示的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸的置换、缺失或***的氨基酸序列并具有二氨基庚二酸脱氢酶活性的酶。
5.根据权利要求1的重组DNA，其中所述的DNA序列编码具有序列11描述的氨基酸序列的二氢吡啶二羧酸还原酶。
6.根据权利要求2的重组DNA，其中所述的DNA序列编码具有序列15描述的氨基酸序列的二氢吡啶二羧酸合酶。
7.根据权利要求3的重组DNA，其中所述的DNA序列编码具有序列20描述的氨基酸序列的二氨基庚二酸脱羧酶。
8.根据权利要求4的重组DNA，其中所述的DNA序列编码具有序列24描述的氨基酸序列的二氨基庚二酸脱氢酶。
9.一种棒杆状菌，其含有由L-赖氨酸和L-苏氨酸导致的反馈抑制被脱敏的天冬氨酸激酶，并且具有增加的胞内二氢吡啶二羧酸还原酶活性，该棒杆状菌是通过导入在棒状细菌细胞中可自主复制的重组DNA而被转化的，所述重组DNA包括：
(1)编码其中由L-赖氨酸和L-苏氨酸导致的反馈抑制被脱敏的天冬氨酸激酶的DNA序列，其中其α亚基具有序列5所示的氨基酸序列或者在序列5所示的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸的置换、缺失、或***的氨基酸序列，其β亚基具有序列7所示的氨基酸序列或者在序列7所示的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸的置换、缺失或***的氨基酸序列，α亚基和β亚基形成具有天冬氨酸激酶活性的酶，并且
其中α-亚基中序列5的279位的丙氨酸残基变成非丙氨酸和非酸性氨基酸的氨基酸残基，而β-亚基中序列7的30位的丙氨酸残基变成非丙氨酸和非酸性氨基酸的氨基酸残基，所述位置均从其N末端计数，和
(2)一种DNA序列，其编码具有序列11所示的氨基酸序列的二氢吡啶二羧酸还原酶或具有在序列11所示的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸的置换、缺失或***的氨基酸序列并具有二氢吡啶二羧酸还原酶活性的酶。
10.根据权利要求9的棒杆状菌，进一步具有增加的胞内二氢吡啶二羧酸合酶活性，其中所述重组DNA进一步包括：
(3)一种DNA序列，其编码具有序列15所示的氨基酸序列的二氢吡啶二羧酸合酶或具有在序列15所示的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸的置换、缺失或***的氨基酸序列并具有二氢吡啶二羧酸合酶活性的酶。
11.根据权利要求10的棒杆状菌，进一步具有增加的胞内二氨基庚二酸脱羧酶活性，其中所述重组DNA进一步包括：
(4)一种DNA序列，其编码具有序列20所示的氨基酸序列的二氨基庚二酸脱羧酶或具有在序列20所示的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸的置换、缺失或***的氨基酸序列并具有二氨基庚二酸脱羧酶活性的酶。
12.根据权利要求11的棒杆状菌，进一步具有增加的胞内二氨基庚二酸脱氢酶活性，其中所述重组DNA进一步包括：
(5)一种DNA序列，其编码具有序列24所示的氨基酸序列的二氨基庚二酸脱氢酶或具有在序列24所示的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸的置换、缺失或***的氨基酸序列并具有二氨基庚二酸脱氢酶活性的酶。
13.一种产生L-赖氨酸的方法，包括步骤：在适当的培养基中培养权利要求9到12中任何一个权利要求所定义的所述棒杆状菌以在细菌培养液中产生和积累L-赖氨酸，和从培养液中收集L-赖氨酸。
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