CN102131921A - 生产己二酰基-7-adca的菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及突变体微生物菌株，其源自在包含己二酸的培养基中培养时能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的亲本微生物菌株的，其特征是所述突变体微生物菌株具有经改进的将来自培养基的己二酸向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入。
Description
发明领域
本发明涉及生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株，它们的构建方法，以及鉴定与过表达涉及将来自发酵培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的基因和酶的方法。
发明背景
半合成的β-内酰胺抗生素(SSA’s)从β-内酰胺中间产物开始以工业规模生产，例如6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基-去乙酰氧基-头孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基头孢烷酸(7-ACA)和7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸酯/盐(7-ACCA)、7-氨基-3-[(Z/E)-1-丙烯-1-基]-3-头孢烯-4-羧酸酯/盐(7-PACA)、7-氨基去乙酰基头孢烷酸(7-ADAC)、7-氨基-3-氨甲酰基氧甲基-3-头孢烯-4-羧酸(7-ACCCA)等等。
第一代7-ADCA制品衍生自PenG，其中5-元青霉烯环到6-元头孢烯环的扩环和随后苯乙酰基-7-ADCA苯乙酸侧链的切割均使用化学反应进行。下一代7-ADCA制品仍然从PenG获得，但是在化学扩环之后，使用合适的(青霉素)酰基酶酶促切除苯乙酰基-7-ADCA的苯乙酸侧链。已开发出其它方法，其中使用合适的扩环酶体外进行PenG到苯乙酰基-7-ADCA的扩环，但是这些方法仅具有很低的工业重要性。
最近期和最精致的7-ADCA生产方法包括：培养下述Penicillium chrysogenum，所述Penicillium chrysogenum用编码合适扩环酶的基因转化并表达所述基因。该经改造的Penicillium chrysogenum菌株在存在己二酸作为侧链前体时在发酵管中生长时，生产并分泌己二酰基-7-ADCA-见WO93/05158。在该生产过程中，从发酵液中回收己二酰基-7-ADCA，对其进行合适的酰基酶处理，从而切除己二酸侧链，之后进一步纯化、结晶和干燥由此获得的7-ADCA。其它侧链前体已公开于WO95/04148(2-(羧乙基硫代)乙酸和3-(羧甲基硫代)-丙酸)、WO95/04149(2-(羧乙基硫代)丙酸)、WO96/38580(苯乙酸)和WO98/048034和WO98/048035(多种二羧酸)中。扩环酶负责多种N-酰基化青霉烷酸5元环的扩环，从而得到相应的N-酰化去乙酰氧基头孢烷酸。
然而，除了被用作侧链前体以外，己二酸盐可以被降解并在初级代谢中被用作碳源。这由Robin et al.(Appl.Microbiol.Biotechnol.(2001)57，357-362))在使用蔗糖作为主要碳源的分批培养物中证实。耗尽(源自蔗糖的)葡萄糖和果糖后，开始形成己二酰基-6-APA和己二酰基-7-ADCA，并且在这一阶段中，仅至多2％的己二酸被并入β-内酰胺化合物中，而剩余部分被用作碳源。作者提出，由于己二酸和脂肪酸之间的相似性，己二酸降解很可能通过β-氧化而发生。在较晚的研究中，Thykaer et al.(Metabolic Engineering(2002)，4，151-158)以生产己二酰基-7-ADCA的Penicillium chrysogenum菌株的代谢网络分析为基础得出下述结论：己二酸盐降解通过β-氧化酶发生在微体(乙醛酸循环体)中，而不是胞质溶胶或线粒体中。
通常(丝状)真菌和酵母中，特别是Penicillium chrysogenum中，在细胞内定位、涉及的酶以及β-氧化通路在微生物总体代谢中的作用方面，β-氧化通路的本质仍然是不清楚的。为了减少己二酸降解，Thykaer et al.(2002)已提出缺失负责己二酸盐降解的酶，然而没有将任何此类酶指定为合适的候选者。
因为与葡萄糖或甘油相比，己二酸盐是昂贵的，所以己二酸盐的降解是不想要的。取而代之，从工业生产工艺的观点来看，人们非常希望己二酸盐向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率(incorporation yield)接近100％。
我们惊讶地发现，在能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株中过表达编码己二酰基-CoA形成酶的基因导致突变体微生物菌株具有经改进的由来自培养基的己二酸进入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入。
发明详述
本发明第一方面提供了用于鉴定能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株的一个或多个基因的方法，所述基因编码涉及在包含己二酸的培养基中培养时微生物菌株将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的一种或多种酶。将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物可包括以下步骤：
1.将己二酸从培养基转运至微生物细胞内部。
2.通过酶，例如CoA连接酶(EC 6.2.1.xx)或CoA-转移酶(EC2.8.3.xx)，将细胞内己二酸转化成己二酰基-CoA。
3.通过酶酰基辅酶A：异青霉素N酰基转移酶(EC 2.3.1.164)，将来自己二酰基-CoA的己二酰基片段转移至异青霉素N，得到己二酰基-6-APA。
4.任选地，可以借助于扩环酶(EC 1.14.20.1)将己二酰基-6-APA转化成己二酰基-7-ADCA。
用于鉴定微生物菌株的编码涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的一种或多种酶的一个或多个基因的方法可包括以下步骤：
a.选择涉及将酸活化成各自酰基-CoA化合物的一个或多个已知基因的核苷酸序列和/或任选地由所述基因编码的一个或多个已知酶的氨基酸序列；
b.使用从步骤(a)中选择的序列作为BLAST搜索中的探针，用于在能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株的可获得的核苷酸或氨基酸序列中鉴定同源序列。
在一个优选的实施方案中，编码涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的一种或多种酶的基因可以选自由以下组成的组：编码能够催化细胞内己二酸转化成己二酰基-CoA的酶(例如CoA-连接酶和CoA-转移酶)的基因。
CoA-连接酶(EC 6.2.1.xx)优选地具有合成二羧酸(如草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、羧基-甲基-硫代-丙酸、硫代-二-丙酸、反式-β-氢粘康酸和/或己二酸)的CoA-衍生物的能力。高度优选的CoA-连接酶(EC 6.2.1.xx)具有合成己二酰基-CoA的能力。
CoA-转移酶(EC 2.8.3.xx)优选地具有合成二羧酸(如草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸和/或己二酸)的能力。高度优选的CoA-转移酶(EC2.8.3.xx)具有合成己二酰基-CoA的能力。
在一个优选的实施方案中，所选择的序列(探针)是已知的基因核苷酸序列，或已知的酶氨基酸序列(任选地由所述基因编码)，并且可选自(但不限于)由以下基因组成的组：
探针A.来自Saccharomyces cerevisiae的乙酰-辅酶A合成酶(EC6.2.1.1)(Entrez登记号AAB35143)。
探针B.来自Penicillium chrysogenum的苯乙酸-CoA连接酶(EC6.2.1.30)(Entrez登记号CAA04820)。
探针C.来自Saccharomyces cerevisiae的极长链脂肪酰基-CoA合酶(EC6.2.1.3)(Entrez登记号CAA84983)
探针D.来自Aspergillus oryzae的酰基-CoA合成酶(Entrez登记号Q2UHE5)
探针E.来自Homo sapiens的琥珀酰基-CoA：3-酮酸-辅酶A转移酶A亚基(EC 2.8.3.5)(Entrez登记号BAB40810)
探针F.来自Escherichia coli的甲酰-辅酶-A转移酶(EC 2.8.3.2)(Entrez登记号P69902)
在一个优选的实施方案中，所述方法利用来自Saccharomyces cerevisiae的乙酰基-辅酶A合成酶(EC 6.2.1.1)(Entrez登记号AAB35143)的氨基酸序列作为探针(探针A)和/或来自Penicillium chrysogenum的苯乙酸-CoA连接酶(EC 6.2.1.30)(Entrez登记号CAA04820)的氨基酸序列作为探针(探针B)。
就本发明的目的而言，使用BLAST算法鉴定同源序列(Altschul，et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。用于进行BLAST分析的软件是公众可以通过National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述作为默认：词长(W)11、BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))、比对(B)50、预期(E)10、M＝5、N＝-4和并比较两条链。
除了上述本发明的方法以外，可以基于在含有己二酸的培养基中培养亲本菌株时基因的转录水平与在不含己二酸的对照培养基中培养亲本菌株时基因的转录水平的比例(本文中定义为“己二酸盐/对照”比例)，来进一步选择编码涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的的一种或多种酶的基因。优选地，此类基因具有大于1，优选地≥2，优选地≥3，优选地≥4，优选地≥5，优选地≥10，优选地≥15，优选地≥20，优选地≥30，优选地≥40，优选地大于≥50，优选地≥60，优选地≥70，优选地≥80，最优选地≥90的“己二酸盐/对照”比例。作为第二对照，可以测定在含有苯乙酸的培养基中培养亲本菌株时基因的转录水平与在不含苯乙酸的对照培养基中培养亲本菌株时基因的转录水平的比例(称作“PAA/对照”比例)。
可以通过用“己二酸盐/对照”比例除以“PAA/对照”比例从而得到“己二酸盐/PAA”比例，来计算第三比例。优选地，本发明的基因具有≥1，优选地≥2，优选地≥3，优选地≥4，优选地≥5，优选地≥10，优选地≥15，优选地≥20，优选地≥30，优选地≥40，优选地大于≥50，优选地≥60，优选地≥70，优选地≥80，最优选地≥90的“己二酸盐/PAA”比例。优选的基因将组合高“己二酸盐/对照”比例与低“PAA/对照”比例。例如，具有50左右“己二酸盐/对照”比例和10左右“PAA/对照”比例(即己二酸盐/PAA为5)的基因比己二酸盐/对照比例在50左右且PAA/对照比例在50左右(即己二酸盐/PAA为1)的基因更加优选。
本发明第二方面中提供了编码涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的多肽的基因。优选地，编码涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的一种或多种酶的基因可选自由以下组成的组：编码能够催化细胞内己二酸转化成己二酰基-CoA的酶(例如CoA-连接酶和CoA-转移酶)的基因。
在一个实施方案中，编码是具有CoA-连接酶(EC 6.2.1.xx)活性的酶的多肽的基因，
·可具有选自下组的基因组核苷酸序列，所述组由以下组成：Pc13g14420(SEQ ID No：1)；Pc21g22010(SEQ ID No：2)；Pc22g20270(SEQ ID No：3)；Pc22g00960(SEQ ID No：4)；Pc12g05520(SEQ ID No：5)；Pc13g12270(SEQ ID No：6)；Pc18g05710(SEQ ID No：7)；Pc20g13500(SEQ ID No：8)；Pc13g01890(SEQ ID No：9)；Pc20g10840(SEQ ID No：10)；Pc13g05130(SEQ ID No：11)；Pc13g10810(SEQ ID No：12)；Pc22g06680(SEQ ID No：13)；Pc22g14900(SEQ ID No：14)；Pc22g16410(SEQ ID No：15)；Pc21g13540(SEQ ID No：16)；Pc21g20650(SEQ ID No：17)；Pc21g23730(SEQ ID No：18)；Pc21g21960(SEQ ID No：19)；Pc22g24780(SEQ ID No：20)；Pc06g01160(SEQ ID No：21)；Pc12g09980(SEQ ID No：22)；Pc15g00420(SEQ ID No：23)；Pc21g07810(SEQ ID No：24)和Pc21g09470(SEQ ID No 25)；或
·可具有选自下组的相应的cDNA核苷酸，所述组由以下组成：SEQ ID No：32；SEQ ID No：33；SEQ ID No：34；SEQ ID No：35；SEQ ID No：36；SEQ ID No：37；SEQ ID No：38；SEQ ID No：39；SEQ ID No：40；SEQ ID No：41；SEQ ID No：42；SEQ ID No：43；SEQ ID No：44；SEQ ID No：45；SEQ ID No：46；SEQ ID No：47；SEQ ID No：48；SEQ ID No：49；SEQ ID No：50；SEQ ID No：51；SEQ ID No：52；SEQ ID No：53；SEQ ID No：54；SEQ ID No：55；SEQ ID No：56；
·可编码选自下组的相应氨基酸序列，所述组由以下组成：SEQ ID No：63；SEQ ID No：64；SEQ ID No：65；SEQ ID No：66；SEQ ID No：67；SEQ ID No：68；SEQ ID No：79；SEQ ID No：70；SEQ ID No：71 SEQ ID No：72；SEQ ID No：73；SEQ ID No：74；SEQ ID No：75；SEQ ID No：76；SEQ ID No：77；SEQ ID No：78；SEQ ID No：79；SEQ ID No：80；SEQ ID No：81；SEQ ID No：82；SEQ ID No：83；SEQ ID No：84；SEQ ID No：85；SEQ ID No：86；SEQ ID No：87；
在第二个实施方案中，编码是具有CoA-转移酶(EC 2.8.3.xx)活性的酶的多肽的基因，
·可具有选自下组的基因组核苷酸序列，所述组由以下组成：Pc20g15639(SEQ ID No：26)；Pc13g02780(SEQ ID No：27)；Pc22g13680(SEQ ID No：28)；Pc22g03940(SEQ ID No：29)；Pc 14g00590(SEQ ID No：30)；Pc16g00210(SEQ ID No：31)。
·可具有选自下组的相应的cDNA核苷酸，所述组由以下组成：SEQ ID No：57；SEQ ID No：58；SEQ ID No：59；SEQ ID No：60；SEQ ID No：61；SEQ ID No：62；
·可编码选自下组的相应氨基酸序列，所述组由以下组成：SEQ ID No：88；SEQ ID No：89；SEQ ID No：90；SEQ ID No：91；SEQ ID No：92；SEQ ID No：93
表1和表2展示了基因组核苷酸序列、cDNA序列和氨基酸序列的SEQ ID No如何彼此相关。
本发明的核苷酸序列不限于上文所列的序列，其还包括与所述序列“基本同源”的序列，前提是所述基因分别编码具有CoA-连接酶(EC6.2.1.xx)活性或CoA-转移酶(EC 2.8.3.xx)的酶。
氨基酸序列不限于上文所列序列，而是还包括与所述序列“基本同源”的序列，前提是具有此类氨基酸序列的多肽分别具有CoA-连接酶(EC6.2.1.xx)活性或CoA-转移酶(EC 2.8.3.xx)活性。
当序列1具有与序列2至少75％，优选地至少80％，优选地至少85％，优选地至少90％，优选地至少95％，仍然更优选地至少96％，仍然更优选地至少97％，仍然更优选地至少98％和最优选地至少99％的同一性程度时，在本文中定义为一条序列(序列1)与另一序列(序列2)“基本同源”。“基本同源”的所述定义适用于核苷酸序列以及氨基酸序列。
本发明提供了编码CoA-连接酶(EC 6.2.1.xx)的以下基因：
1.具有SEQ ID No.1中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.32中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.63中所示相应的氨基酸序列的Pc13g14420，以及与这些序列大于55％同源，更优选地与这些序列大于60％，更优选地大于70％，更优选地大于80％，更优选地大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
2.具有SEQ ID No.2中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.33中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.64中所示相应的氨基酸序列的Pc21g22010，以及与这些序列大于45％同源，更优选地与这些序列大于50％，更优选地大于60％，更优选地大于70％，更优选地大于80％，更优选地大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
3.具有SEQ ID No.3中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.34中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.65中所示相应的氨基酸序列的Pc22g20270。
4.具有SEQ ID No.4中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.35中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.66中所示相应的氨基酸序列的Pc22g00960，以及与这些序列大于70％同源，更优选地与这些序列大于80％，更优选地大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
5.具有SEQ ID No.5中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.36中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.67中所示相应的氨基酸序列的Pc12g05520，以及与这些序列大于85％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
6.具有SEQ ID No.6中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.37中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.68中所示相应的氨基酸序列的Pc13g12270，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
7.具有SEQ ID No.7中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.38中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.69中所示相应的氨基酸序列的Pc18g05710，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
8.具有SEQ ID No.8中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.39中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.70中所示相应的氨基酸序列的Pc20g13500，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
9.具有SEQ ID No.9中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.40中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.71中所示相应的氨基酸序列的Pc13g01890，以及与这些序列大于75％同源，更优选地与这些序列大于80％，更优选地大于95％同源的序列。
10.具有SEQ ID No.10中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.41中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.72中所示相应的氨基酸序列的Pc20g10840，以及与这些序列大于55％同源，更优选地与这些序列大于60％，更优选地大于70％，更优选地大于80％，更优选地大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
11.具有SEQ ID No.11中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.42中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.73中所示相应的氨基酸序列的Pc13g05130，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
12.具有SEQ ID No.12中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.43中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.74中所示相应的氨基酸序列的Pc13g10810，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
13.具有SEQ ID No.13中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.44中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.75中所示相应的氨基酸序列的Pc22g06680。
14.具有SEQ ID No.14中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.45中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.76中所示相应的氨基酸序列的Pc22g14900。
15.具有SEQ ID No.15中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.46中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.77中所示相应的氨基酸序列的Pc22g16410，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
16.具有SEQ ID No.16中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.47中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.78中所示相应的氨基酸序列的Pc21g13540，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
17.具有SEQ ID No.17中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.48中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.79中所示相应的氨基酸序列的Pc21g20650，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
18.具有SEQ ID No.18中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.49中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.80中所示相应的氨基酸序列的Pc21g23730，以及与这些序列大于85％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
19.具有SEQ ID No.19中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.50中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.81中所示相应的氨基酸序列的Pc21g21960，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
20.具有SEQ ID No.20中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.51中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.82中所示相应的氨基酸序列的Pc22g24780，以及与这些序列大于70％同源，更优选地与这些序列大于80％，更优选地大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
21.具有SEQ ID No.21中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.52中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.83中所示相应的氨基酸序列的Pc06g01160，以及与这些序列大于65％同源，更优选地与这些序列大于70％，更优选地大于80％，更优选地大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
22.具有SEQ ID No.22中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.53中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.84中所示相应的氨基酸序列的Pc12g09980，以及与这些序列大于45％同源，更优选地与这些序列大于50％，更优选地大于60％，更优选地大于70％，更优选地大于80％，更优选地大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
23.具有SEQ ID No.23中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.54中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.85中所示相应的氨基酸序列的Pc15g00420，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
24.具有SEQ ID No.24中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.55中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.86中所示相应的氨基酸序列的Pc21g07810，以及与这些序列大于70％同源，更优选地与这些序列大于80％，更优选地大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
25.具有SEQ ID No.25中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.56中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.87中所示相应的氨基酸序列的Pc21g09470，以及与这些序列大于70％同源，更优选地与这些序列大于80％，更优选地大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
本发明提供了编码CoA-转移酶(EC 2.8.3.xx)的以下基因：
26.具有SEQ ID No.26中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.57中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.88中所示相应的氨基酸序列的Pc20g15630，以及与这些序列大于60％同源，更优选地与这些序列大于70％，更优选地大于80％，更优选地大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
27.具有SEQ ID No.27中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.58中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.89中所示相应的氨基酸序列的Pc13g02780，以及与这些序列大于85％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
28.具有SEQ ID No.28中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.59中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.90中所示相应的氨基酸序列的Pc22g13680，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
29.具有SEQ ID No.29中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.60中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.91中所示相应的氨基酸序列的Pc22g03940，以及与这些序列大于95％同源的序列。
30.具有SEQ ID No.30中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.61中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.92中所示相应的氨基酸序列的Pc14g00590，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
31.具有SEQ ID No.31中所示基因组核苷酸序列和SEQ ID No.62中所示相应的cDNA序列和SEQ ID No.93中所示相应的氨基酸序列的Pc16g00210，以及与这些序列大于80％同源，更优选地与这些序列大于90％，更优选地大于95％同源的序列。
就本发明的目的而言，两条氨基酸序列之间的同源性是指两条序列之间相同的氨基酸的百分比。使用BLAST算法测定同源性，所述BLAST算法在Altschul et al.(J.Mol.Biol.215：403-410(1990))中描述。用于进行BLAST分析的软件是公众可以通过National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述作为默认：词长(W)11、BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))、比对(B)50、预期(E)10、M＝5、N＝-4和并比较两条链。
基本同源的多肽包括可由于天然等位基因变异或株系内变异而存在于来自不同种群的细胞中或存在于种群中的多态现象。除了所述特定的氨基酸和/或DNA序列的来源真菌以外，基本同源的多肽可还衍生自其它真菌，或者可以由人工设计和合成的DNA序列编码。
就本发明的目的而言，两条核苷酸序列之间的同源性是指两条序列之间相同的碱基的百分比。与特定的DNA序列相关并通过遗传密码子简并性获得的DNA序列也是本发明的一部分。同源物也可以包括全长序列的具有生物活性的片段。
基本同源的多肽可仅含有特定氨基酸序列的一个或多个氨基酸的保守取代，或非必需氨基酸的取代、***或缺失。因此，非必需的氨基酸是在这些序列之一中可以被改变而不显著改变生物功能的残基。例如，涉及如何制造表型沉默氨基酸取代的指南在Bowie，J.U.et al.，Science 247：1306-1310(1990)中提供，其中作者指出存在两种研究氨基酸序列对改变的耐受的途径。第一种方法依赖于进化过程，其中突变被自然选择接受或拒绝。第二种途径使用基因工程在被克隆的基因的特定位置上引入氨基酸改变，并选择或筛选以鉴定维持功能性的序列。如作者所述，这些研究解释了蛋白质惊人地耐受氨基酸取代。作者还指出在蛋白质的某位置上何种改变可能是允许的。例如，大部分被埋藏的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链通常很少有特征是保守的。其它这类表型沉默取代被描述于Bowie et al和其中所引用的参考文献中。
术语“保守取代”旨在表示下述取代，其中氨基酸残基被替换为具有相似侧链的氨基酸残基。这些家族是本领域已知的，并包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
导致经改进的催化功能(即己二酸盐转化成为己二酰基-CoA)的本发明的氨基酸序列的变体可以通过修饰本发明的相应基因来获得。此类修饰包括：
1.易错PCR，以引入随机突变，之后筛选获得的变体(基本如实施例4中所述)，并分离具有经改进的动力学特性的变体
2.对编码己二酰基-CoA形成酶的基因的相关变体进行家族改组，之后筛选获得的变体(基本如实施例4中所述)，并分离具有经改进的动力学特性的变体
导致提高的mRNA和/或蛋白质水平，导致更多酶活性(即己二酸盐转化成为己二酰基-CoA)的本发明的基因的变体可以通过修饰所述基因的多核苷酸序列来获得。此类修饰为：
1.以下述方式改进密码子选择，所述方式使得密码子(最优地)适应亲本微生物宿主。
2.以下述方式改进密码子对选择，所述方式使得密码子(最优地)适应亲本微生物宿主。
3.对编码己二酰基-CoA形成酶的基因组信息添加稳定化序列，得到具有提高的半衰期的mRNA分子。
用于分离具有改进的催化特性或提高的mRNA或蛋白质水平的变体的优选方法描述于WO03010183和WO0301311中。优化亲本微生物菌株中密码子选择的优选方法描述于PCT/EP2007/05594中。对编码己二酰基-CoA形成酶的基因基因添加稳定化元件的优选方法描述于WO2005059149中。
本发明在第三方面提供了源自亲本微生物菌株的突变体微生物菌株，所述亲本微生物菌株在包含己二酸的培养基中培养时能够生产N-己二酰基化的β-内酰胺化合物，其特征是所述突变体微生物菌株与亲本微生物菌株相比，具有经改进的由来自培养基的己二酸向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率。
并入产率在本文中被定义为相对于消耗的己二酸的总摩尔量，被并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物中的己二酸的摩尔百分比。消耗的己二酸的总量等于添加至发酵过程中的己二酸的总摩尔量减去发酵过程后残余的己二酸的摩尔量。经改进的并入产率可以被表述为突变体微生物菌株与亲本微生物菌株相比的相对改进。例如，当亲本微生物菌株具有上文定义的5％的并入产率而突变体微生物菌株具有6％的并入产率时，突变体的经改进的并入产率为20％(6/5*100-100)。
优选地，本发明的突变体菌株具有至少5％，更优选地至少7.5％，更优选地至少10％，更优选地至少15％，更优选地至少20％，更优选地至少30％，更优选地至少40％，更优选地至少50％，更优选地至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，更优选地至少97％，更优选地至少98％，更优选地至少99％，更优选地至少100％的经改进的并入产率。
能够获得的最大的经改进的并入产率取决于亲本微生物菌株的实际并入产率。当亲本微生物菌株具有5％的并入产率且理论最大并入产率为100％时，则突变体微生物菌株可具有1900％(100/5*100-100)的最大经改进的并入产率。类似地，当亲本微生物菌株已经具有50％的并入产率并且理论最大并入产率为100％时，则突变体微生物菌株可具有100％(100/50*100-100)的最大经改进的并入产率。
在一个优选的实施方案中，前文概括的、通过前文所述的本发明方法鉴定的、编码一个或多个涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的一种或多种酶(优选地CoA-连接酶和/或CoA-转移酶)的本发明的一个或多个基因，与其中所述基因未被过表达的亲本微生物菌株相比，在本发明的突变体微生物菌株中被过表达。
基因的过表达在本文中被定义为下述基因表达，所述表达会导致突变体微生物菌株中所述基因编码的酶的活性至少是亲本微生物中酶活性的1.5倍；优选地，所述酶的活性是亲本微生物中酶活性的至少2倍，更优选地至少3倍，更优选地至少4倍，更优选地至少5倍，进一步更优选地至少10倍和最优选地至少20倍。
由微生物菌株生产的β-内酰胺化合物可以是任何N-己二酰化的β-内酰胺，其中所述β-内酰胺片段是青霉烯或头孢烯。优选的N-己二酰化的β-内酰胺化合物是之前所列中间产物的己二酰基衍生物：6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基-去乙酰氧基-头孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基头孢烷酸(7-ACA)和7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-羧酸酯/盐(7-ACCA)、7-氨基-3-[(Z/E)-1-丙烯-1-基]-3-头孢烯-4-羧酸酯/盐(7-PACA)、7-氨基去乙酰基头孢烷酸(7-ADAC)、7-氨基-3-氨甲酰基氧甲基-3-头孢烯-4-羧酸(7-ACCCA)及其它。最优选的是N-己二酰基化的头孢菌素，最优选的是己二酰基-7-ADCA。
能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株可以选自由真菌、细菌或酵母组成的组。优选地，本发明的微生物菌株是真菌，优选地是丝状真菌。一种优选的丝状真菌可选自由Aspergillus、Acremonium、Trichoderma和Penicillium组成的组。更优选地，本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地为Penicillium chrysogenum。一种优选的细菌可以选自由Streptomyces、Nocardia或Flavobacterium组成的组。
在一个优选的实施方案中，能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地是Penicillium chrysogenum，所述微生物菌株已用编码扩环酶的基因、优选地用Streptomyces clavuligerus cefE基因转化过，所述编码扩环酶的基因使得菌株在存在前体己二酸时培养时能够生产己二酰基-7-ADCA。
在另一实施方案中，能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地是Penicillium chrysogenum，并且除了扩环酶基因(优选Streptomyces clavuligerus cefE基因)以外，还经羟化酶基因(优选Streptomyces clavuligerus cefF基因)转化过，所述羟化酶基因的表达产物将己二酰基-7-ADCA的3-甲基侧链转化为3-羟甲基，得到己二酰基-7-氨基去乙酰基头孢烷酸(己二酰基-7-ADAC)。
在另一个实施方案中，能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地是Penicillium chrysogenum，并且经扩环酶/羟化酶基因(优选Acremonium chrysogenum cefEF基因)转化过，所述基因的表达产物将己二酰基-7-ADCA的3-甲基侧链转化成3-羟甲基，得到己二酰基-7-氨基去乙酰基头孢烷酸(己二酰基-7-ADAC)。
在另一实施方案中，能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地是Penicillium chrysogenum，并且除了编码扩环酶的基因(优选Streptomyces clavuligerus cef基因)和羟化酶基因以外，还经乙酰基转移酶基因(优选Streptomyces clavuligerus cefG基因)转化过，所述乙酰基转移酶基因的表达产物(即酰基转移酶)将3-羟甲基侧链转化为3-乙酰氧甲基侧链，得到己二酰基-7-ACA。
在又一个实施方案中，能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地是Penicillium chrysogenum，并且用编码扩环酶的基因(优选Streptomyces clavuligerus cefE基因)、编码羧化酶的基因(优选Streptomyces clavuligerus cefF基因)和O-氨甲酰基转移酶的基因(优选Streptomyces clavuligerus cmcH基因)转化过，从而得到己二酰基-7-氨基-3-氨甲酰基氧甲基-3-头孢烯-4-羧酸。
在另一个实施方案中，本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地为Penicillium chrysogenum，任选地用编码扩环酶、羟化酶、扩环酶/羟化酶、乙酰基转移酶和/或O-氨甲酰基转移酶的一个或多个上述基因转化过，另外在编码涉及己二酸消耗的酶的一个或多个基因中具有缺失。此类修饰的优选的例子是(但不限于)β-氧化编码酶。涉及的各种酶可以分别是CoA连接酶(EC 6.2.1.xx)，酰基-CoA脱氢酶(EC1.3.99.xx)，酰基-CoA氧化酶(EC 1.3.3.xx)，烯酰基-CoA水合酶(EC4.2.1.17)，3-羟基酰基-CoA脱氢酶(EC 1.1.1.35)或乙酰基-CoA C-酰基转移酶(EC 2.3.1.16)。
在又一个实施方案中，本发明的突变体微生物菌株属于Penicillium物种，最优选地为Penicillium chrysogenum，任选地用编码扩环酶、羟化酶、扩环酶/羟化酶、乙酰基转移酶、O-氨甲酰基转移酶的一个或多个上述基因转化过，和/或在编码涉及己二酸消耗的酶的基因中含有缺失，另外还用编码能够提高培养基中N-己二酰化的β-内酰胺分泌的酶的基因转化过。此类基因的优选的例子是(但不限于)：Acremonium chrysogenum cefT基因或其同源物或Acremonium chrysogenum cefM基因或其同源物。
本发明的突变体微生物菌株的一种高度优选的实施方案具有以下特征：
1)其属于Penicillium物种，最优选地为Penicillium chrysogenum，和，
2)任选地用编码以下的基因转化：
a.扩环酶，优选地为Streptomyces clavuligerus cefE基因；
b.羟化酶，优选地为Streptomyces clavuligerus cefF基因；
c.扩环酶/羟化酶，优选地为Acremonium chrysogenum cefEF基因；
d.乙酰基转移酶基因，优选地为Streptomyces clavuligerus cefG基因，和/或
e.O-氨甲酰基转移酶，优选地为Streptomyces clavuligerus cmcH基因；
f.N-己二酰基β-内酰胺转运蛋白，优选地为Acremonium chrysogenum cefT基因，
包括能够(通过上文列出的方法)从这些例子获得的经优化的变体。
3.任选地，编码己二酸盐降解酶或己二酸盐消耗酶的基因也以下述方式被修饰，所述方式使得与亲本微生物菌株相比降解或消耗被降低。
本发明第四方面提供了构建本发明的突变体微生物菌株的方法。使用核酸构建体例如表达构建体获得本发明基因在本发明突变体微生物菌株中的功能性过表达，所述核酸构建体含有一个或多个所选择的基因，各自与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列指导编码的多肽在合适的表达宿主中表达。核酸构建体可以在一个DNA片段上，或优选地在独立的片段上。表达应被理解为包括多肽生产中涉及的任何步骤，并可包括转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。当核酸构建体含有编码序列在特定宿主生物中表达所需的所有控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达载体”或“盒”同义。术语“控制序列”在本文中被定义为包括对多肽的表达来说必需的或有利的所有组件。每种控制序列对编码多肽的核酸而言可以是内源的(native)或外源的(foreign)。这类控制序列可包括，但不限于启动子、前导序列、最适翻译起始序列(如Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870中所述)、分泌信号序列、前肽序列、多聚腺苷酸化序列、转录终止子。控制序列至少包括启动子以及转录和翻译终止信号。术语“可操作地连接”在本文中被定义为下述构型，其中控制序列被适当地置于与DNA序列的编码序列相关的位置，使得控制序列能指导多肽的生产。
控制序列可包括含有转录控制序列的适当的启动子序列。启动子可以是在细胞中显示转录调控活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂交的启动子，它们可得自编码细胞外或细胞内多肽的基因。启动子对细胞或多肽而言可以是同源的或异源的。
丝状真菌细胞优选的启动子是本领域已知的，并且可以是例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶gpdA启动子；蛋白酶启动子如pepA、pepB、pepC；葡糖淀粉酶glaA启动子；淀粉酶amyA、amyB启动子；过氧化氢酶catR或catA启动子；葡萄糖氧化酶goxC启动子；β-半乳糖苷酶lacA启动子；α-葡糖苷酶aglA启动子；翻译延伸因子tefA启动子；木聚糖酶启动子如xlnA、xlnB、xlnC、xlnD；纤维素酶启动子如eglA、eglB、cbhA；转录调节子启动子如areA、creA、xlnR、pacC、prtT等或任何其它，并且可在诸如NCBI的网站上找到(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)。
在一个优选的实施方案中，启动子可源于被高度表达的基因(在本文中定义为mRNA浓度至少为总细胞mRNA的0.5％(w/w))。在另一个优选的实施方案中，启动子可源于被中度表达的基因(在本文中定义为mRNA浓度至少为总细胞mNRA的0.01％至0.5％(w/w))。在另一优选的实施方案中，启动子可源于被低表达的基因(在本文中定义为mRNA浓度低于总细胞mRNA的0.01％(w/w))。
在一个进一步更优选的实施方案中，使用微阵列数据选择基因，并进而选择这些基因的启动子，所述启动子具有确定的转录水平和调节。藉此，可以使基因表达盒最适地适应其应当发挥功能的条件。其中要通过该方法选择的合适启动子是具有非常高的如上文解释的“己二酸盐/对照”比例的基因的启动子。另外，由WO2007071399分离和/或公开的强和/或组成型启动子可以被考虑作为合适的启动子。
或者，可将随机的DNA片段克隆在本发明的多核苷酸之前。使用WO2007118836公开的乙酰胺平板实验，可以容易地筛选活性启动子，因为这些启动子应当促进在乙酰胺作为唯一氮源上的生长。这些DNA片段可衍生自许多来源，即不同的物种，由PCR扩增得来，合成得来等等。
控制序列还可以包括合适的转录终止子序列，这是被丝状真菌细胞识别为终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的3’末端可操作地连接。在细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明中。对丝状真菌细胞而言优选的终止子得自编码Aspergillus oryzae TAKA淀粉酶，Aspergillus niger葡糖淀粉酶，Aspergillus nidulans氨基苯甲酸合酶，Aspergillus niger α-葡糖苷酶，trpC基因和Fusarium oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶的基因。
控制序列也可以包括合适的前导序列，mRNA的非翻译区，其对于丝状真菌细胞的翻译而言是重要的。前导序列与编码多肽的核酸序列的5’-端可操作地连接。在细胞中有功能的任何前导序列都可以用于本发明中，对丝状真菌细胞而言优选的前导序列得自编码Aspergillus oryzae TAKA淀粉酶和Aspergillus nidulans丙糖磷酸异构酶和Aspergillus niger glaA的基因。其它优选的起始序列由WO2006077258分离和/或公开。
控制序列也可以包括多聚腺苷酸化序列，所述序列与核酸序列的3’-端可操作地连接，并且在被转录后被丝状真菌细胞识别为对经转录的mRNA添加多聚腺苷酸化残基的信号。在细胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列都可用于本发明中。对丝状真菌细胞而言优选的多聚腺苷酸化序列得自编码Aspergillus oryzae TAKA淀粉酶，Aspergillus niger葡糖淀粉酶，Aspergillus nidulans氨基苯甲酸合酶，Fusarium oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶和Aspergillus niger α-葡糖苷酶的基因。
核酸构建体可以是表达载体。表达载体可以是任何载体(例如质粒或病毒)，其可便利地进行重组DNA步骤并可导致编码多肽的核酸序列的表达。载体的选择应典型地取决于载体与要引入载体的细胞的相容性。载体可以是线性的或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、小染色体或人工染色体。用于丝状真菌的自主维持的克隆载体可包含AMA1-序列(参阅例如Aleksenko and Clutterbuck(1997)，Fungal Genet.Biol.21：373-397)。
或者，载体可以是下述载体，当其被引入细胞时整合进基因组中，并与其被整合在其中的染色体一起复制。整合型克隆载体可以随机或在预先确定的靶基因座上整合进宿主细胞的染色体中。在本发明的一个优选的实施方案中，整合型克隆载体包括与宿主细胞基因组中预先确定的靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，用于将克隆载体的整合靶向该预先确定的基因座上。为了促进定向整合，克隆载体优选地在转化宿主细胞前被线性化。优选地进行线性化使得克隆载体的至少一端(但是优选任一端)侧翼是与靶基因座同源的序列。靶基因座侧翼的同源序列的长度优选地至少0.1kb，进一步优选地至少0.2kb，还更优选地至少0.5kb，进一步更优选地至少1kb，最优选地至少2kb。优选地，如WO05095624和/或WO2007115886所述，针对改进的靶向DNA整合频率修饰亲本微生物菌株。
载体***可以是单个载体或质粒，或者可以是两个或多个载体或质粒，其共同含有要被引入宿主细胞基因组中的总DNA。
DNA构建体可在附加型载体上使用。然而在本发明中，构建体优选地被整合进宿主菌株的基因组中。
本发明在第五方面提供了本发明的基因用于构建在包含己二酸的培养基中培养时能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的本发明的突变体微生物的用途，其中所述突变体微生物菌株与亲本微生物菌株相比，具有经改进的由来自培养基的己二酸向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率。
在一个实施方案中，突变体微生物菌株可含有多于一个本发明的基因，所述基因均被过表达，并且其组合导致与亲本微生物菌株相比经改进的由来自培养基的己二酸向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率。
在另一个实施方案中，本发明的突变体微生物菌株含有编码能够催化细胞内己二酸转化成己二酰基-CoA的酶(如前文所述的CoA-连接酶和CoA-转移酶)的一个或多个本发明的基因，以及被功能性失活的编码涉及一个或多个己二酸降解通路的酶的基因。一个单一微生物菌株中功能性失活的涉及己二酸降解的基因与涉及己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的基因的过表达的组合导致与亲本微生物菌株相比进一步改进的由来自培养基的己二酸向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率。“功能性失活的”在本文中被定义为基因的失活，这导致所编码的酶的残余活性优选地少于50％、更优选地少于40％、更优选地少于30％、更优选地少于20％、更优选地少于10％、更优选地少于5％、更优选地少于2％。“基因的失活”在本文中被定义为修饰基因，从而获得如上文定义的功能性失活的基因。用于修饰基因从而获得功能性失活的基因的方法是本领域已知的，并且可包括：通过导致(过早)终止或读码框位移的碱基对突变使基因失活；突变编码一个或多个关键氨基酸(例如水解酶的催化三联体)的一个或多个碱基；引起酶氨基酸序列中突变的基因突变，这导致酶的半衰期降低；以下述方式修饰mRNA分子，所述方式使得mRNA半衰期降低；***破坏开放读码框的第二序列(即选择标记物基因)；基因的部分或完全去除；基因启动子的去除/突变；使用反义DNA或可比较的RNA抑制方法降低细胞中mRNA的有效量。最优选地，通过缺失使基因功能性失活，导致编码的多肽和由此造成的酶活性完全不存在。
本发明第六方面提供了通过培养本发明的突变体微生物菌株生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的方法，其中用于生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的方法与使用亲本微生物菌株生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的方法相比，具有经改进的由来自培养基的己二酸进入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率。
图1展示了涉及缺失Penicillium chrysogenum基因Pc22g20270的步骤。图例：
·实心箭头，Pc22g20270启动子；
·空心箭头，Pc22g20270ORF；
·阴影框，trpC终止子；
·虚线框，ccdA基因；
·实心框，lox位点；
·交叉，重组事件；
·向下的箭头，过程中的先后步骤REKR和KRAM，重叠无功能amdS选择标记物片段；REKRAM，功能性amdS选择标记物基因。
数字指示寡核苷酸的SEQ ID NO。“标签”指示可用于突变体鉴定的特异性核苷酸序列的存在。
图2展示了涉及验证Penicillium chrysogenum基因Pc22g20270实际缺失的步骤。图例：实心箭头，Pc22g20270启动子；空心箭头，Pc22g20270ORF；阴影框，trpC终止子；实心框，lox位点；REKRAM，功能性amdS选择标记物基因。数字指出所示三个PCR反应的寡核苷酸的SEQ ID NO(见表4)。
一般材料和方法
BLAST算法被用于鉴定同源序列(Altschul，et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。公众可通过National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得进行BLAST分析的软件。BLAST算法参数W、T和X决定算法的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述作为默认：词长(W)11、BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))、比对(B)50、预期(E)10、M＝5、N＝-4和并比较两条链。
如别处所述进行标准步骤(Sambrook，J.et al.(1989)，Molecular cloning：a laboratory manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。根据制造商的流程使用校正读码聚合酶Turbo-Pfu-Polymerase(Stratagene，荷兰)或Phusion(Finnzymes)进行DNA扩增，但是构建好的菌株和质粒的验证通过使用Taq聚合酶实现。限制性酶来自Invitrogen或New England Biolabs。对常规克隆而言，使用Escherichia coli菌株Top10和DH10B(Invitrogen)。构建好的质粒的验证通过限制性分析和随后的测序进行。
实施例
实施例1
鉴定编码推定的己二酰基-CoA-合成酶的Penicillium chrysogenum基因
1.CoA连接酶(EC 6.2.1.xx)
使用探针A、探针B、探针C和探针D(见上下文)搜索Penicillium chrysogenum菌株Wisconsin54-1255的基因组，随后的注解揭示了编码推定的CoA-连接酶活性(EC 6.2.1.xx)的25个基因；见表1。
2.CoA-转移酶(EC 2.8.3.xx)
使用探针E和探针F(见上下文)搜索Penicillium chrysogenum菌株Wiscons54-1255的基因组，揭示了编码推定的CoA-转移酶(EC 2.8.3.xx)的6个基因；见表2。
实施例2
编码推定的CoA连接酶(EC 6.2.1.xx)和/或CoA转移酶(EC 2.8.3.xx)的Penicillium chrysogenum基因的微阵列分析
为了鉴定31个经鉴定的推定的己二酰基-CoA合成酶尤其是CoA连接酶(EC 6.2.1)和/或CoA转移酶(EC 2.8.3.xx)中哪些是用于过表达从而提高N-乙酰基化的β-内酰胺化合物的合适候选者，进行微阵列研究。使用Affymetrix Custom GeneChip程序(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)：GeneChip，DSM_PENa520255F，使用P.chrysogenum基因组序列制备专有的DNA微阵列。
将含有或不含有编码扩环酶的Streptomyces clavuligerus cefE基因的P.chrysogenum菌株接种于含有25ml β-内酰胺生产培养基(如US20020039758中所述)的100ml摇瓶中，所述培养基含有10g/l己二酸盐，3g/l苯乙酸(PAA)或不含前体(对照)。将培养物在25℃下孵育，每分钟旋转280次。90小时后对总发酵液取样并迅速冷却。洗涤细胞并将细胞沉淀物冷冻于液氮中。随后通过用研钵和研杵研磨冷冻的沉淀物来破碎细胞，并使用Trizol分离RNA。在Bioanalyzer(Agilent)上常规检查总RNA的品质和数量。使用20微克总RNA进行标准cDNA合成和标记反应(根据Affymetrix说明书)。根据供应商的说明书(Affymetrix，Santa Clara，USA)进行GeneChips
的杂交。使用Affymetrix GeneChip
OperatingSoftware(GCOS，Affymetrix，Santa Clara，USA)扫描和分析经杂交的阵列。所有实验一式三份完成，并采取三次测量的平均作为转录本的相对水平。
通过测定含己二酸盐的培养基上的转录本水平和含PAA或对照培养基上的转录本水平之间的比例，来鉴定由己二酸盐特异性诱导的基因。使用含PAA的培养基，通过注意对照培养基上的转录本水平和含PAA的培养基上的转录本水平之间的比例，来鉴定特异性应答。结果展示于表1和表2中。
实施例3
过表达编码推定的CoA-连接酶的Penicillium chrysogenum基因导致提高的己二酰基-CoA连接酶活性
表达载体的构建
使用SEQ ID NO 94和95的寡核苷酸PCR扩增编码推定的CoA-连接酶的Penicillium chrysogenum Pc22g14900基因，在基因上游和下游引入NdeI和NsiI位点用于克隆，所述CoA-连接酶具有与探针B(探针B＝来自Penicillium chrysogenum(Entrez登记号CAA04820)的苯乙酸-CoA连接酶(EC 6.2.1.30))相同的氨基酸序列。用NdeI和NsiI消化经扩增的片段使得能够将Pc22g14900克隆进用相同的限制性酶预先消化的质粒pISEWAn(如WO04106347中所述)中，得到质粒pIPCLA。因此，Pc22g1400的表达由pcbC(编码来自P.chrysogenum的IPN合酶)启动子和penDE(编码P.chrysogenum的酰基转移酶)终止子控制。
转化至P.chrysogenum
用NotI消化后从pIPCLA质粒获得Pc22g14900表达盒，并通过在亲本微生物宿主(即表达扩环酶基因cefE的P.chrysogenum菌株)中与amdS选择标记物共转化来转染经分离的片段。amdS标记物的整合使得P.chrysogenum转化体在含有乙酰胺作为唯一氮源的选择培养基上生长。用HindIII消化后从质粒pHELY-A1(如WO04106347中所述)中分离amdS片段。
涉及将DNA转移至P.chrysogenum原生质体的技术是本领域公知的，并且描述于许多参考文献中，包括Finkelstein and Ball(eds.)，Biotechnology of filamentous fungi，technology and products，Butterworth-Heinemann(1992)；Bennett and Lasure(eds.)More Gene Manipulations in fungi，Academic Press(1991)；Turner，in：Pühler(ed)，Biotechnology，second completely revised edition，VHC(1992)。如EP635574中所述使用Ca-PEG介导的原生质体转化和乙酰胺选择流程。
将数百个乙酰胺阳性克隆转移至第二个含乙酰胺的平板上，随后转移以诱导孢子形成(例如在YEPD培养基上，所述培养基每升含有：酵母提取物10g；蛋白胨，10g；葡萄糖，20g)。随后菌落纯化若干个克隆，并通过PCR测定Pc22g14900表达盒的存在。为此将一片形成孢子的菌落重悬于50μl水中，并在98℃煮沸10分钟。将细胞碎片离心并在特异性PCR反应中使用1μl上清液。使用下述引物组：正向引物(SEQ ID NO 96)在Pc22g14900盒的pcbC启动子处退火，反向引物(SEQ ID NO 97)在Pc22g14900基因ATG下游退火。只有完整整合了Pc22g14900表达盒的共转化体才会给出262bp的片段。
测定P.chrysogenum转化体的己二酰基-CoA连接酶活性
选择在特异性Pc22g14900表达盒PCR中给出262bp片段的一个乙酰胺阳性的转化体进行进一步测试。如实施例2中所述培养该突变体和亲本菌株，6天后对培养物取样。通过过滤将上清液与细胞分离。用冰冷的生理盐水(0.9％NaCl)将细胞洗涤两次，并将沉淀物在液氮中冷冻。随后冻干冷冻的沉淀物。
通过HPLC(如US 6,410,259中所述)测定滤液中的己二酰基-7-ADCA浓度-见表3。如WO97/38107中所述测定CoA-连接酶活性和酰基-CoA化合物的形成。研磨冷冻的细胞，并将50mg重悬于2ml提取缓冲液(每10.4ml含有：35％硫酸铵，10ml；2ml milliQ水中1片CompleteTMProtease Inhibitor(Roche)，4ml；β-巯基乙醇，3.9μl；ATP，27.1mg；pH8.56)将混合物在4℃下搅拌15分钟，之后在14000rpm下将细胞碎片离心5分钟。直接使用上清液(＝无细胞的提取物)。用Bradford试剂测定蛋白质浓度。
制备三种底物混合物来测定CoA-酶活性：
1.己二酸盐混合物：55.1mg/ml ATP，250μl；15.35mg/ml CoA，250μl；1.0M己二酸盐，240μl；50.83mg/ml MgCl2，50μl；50mM Tris-HCl，360μl；pH 7.04
2.己酸盐混合物：55.1mg/ml ATP，250μl；15.35mg/ml CoA，250μl；0.4M己酸盐，75μl；50.83mg/ml MgCl2，50μl；50mM Tris-HCl，525μl；pH 7.06
3.苯乙酸(PA)混合物：55.1mg/ml ATP，250μl；15.35mg/ml CoA，250μl；0.4M PA，75μl；50.83mg/ml MgCl2，50μl；50mM Tris-HCl，525μl；pH 7.00
将230μl这些混合物与10μl无细胞提取物(在己二酸盐和己酸盐混合物的情况下被1∶10稀释)一起孵育。将混合物孵育0，10，20和30分钟，在这些时间点采取50μl样品，并如WO9738107中所述加工。根据得到的结果计算使用不同底物的CoA-连接酶活性(见表3)。
表3.过表达CoA-连接酶PC22g14900的P.chrysogenum菌株的己二酰基-7-ADCA生产力和CoA-连接酶活性。
如表3中所示，己二酰基-CoA连接酶活性的3倍过表达导致提高的N-己二酰化的β-内酰胺化合物己二酰基-7-ADCA的生产。
实施例4
缺失Penicillium chrysogenum基因Pc22g20270导致与非突变体的亲本菌株相比降低的由来自培养基的己二酸进入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率
缺失突变体的构建
基因Pc22g20270被鉴定为“己二酸盐/对照”比例为6.4并且“己二酸盐/PAA”比例为3.3的基因(见表1)。为了防止所述基因的转录，在启动子和开放读码框(ORF)之间***选择标记物基因。为此，分别使用寡核苷酸SEQ ID NO.98加99和SEQ ID NO.100加101，对启动子和ORF进行PCR扩增。使用Phusion Hot-Start Polymerase(Finnzymes)扩增所述片段。扩增得到的片段长度分别约为1500和1800个碱基对(bp)，并且含有适合所谓的STABY克隆方法(Eurogentec)的14bp尾。
从标准STABY载体pSTC1.3获得两种衍生物。一种pSTamdSL被用于克隆PCR扩增得到的Pc22g20270启动子。另一种pSTamdSR被用于克隆PCR扩增得到的Pc22g20270终止子。通过***amdS选择标记物基因的无活性部分(见例如WO04106347中pHELY-A1的PgpdA-amdS盒)构建pSTamdSL(SEQ ID NO.102)，所述***通过PCR扩增基因(amdS)的最后2/3并将其克隆进pSTC1.3的HindIII-BamHI位点来实现。通过***amdS选择标记物基因的无活性部分(见例如WO04106347中pHELY-A1的PgpdA-amdS盒)构建pSTamdSR(SEQ ID NO.103)，所述***通过PCR扩增基因的PgpdA启动子和最初2/3(其中去除了EcoRV位点)并将其克隆进pSTC1.3的HindIII-PmeI位点来实现。还在PgpdA-amdS之前***强终止子；PCR扩增并通过PgpdA-amdS片段的SbfI-NotI位点引入trpC终止子。这两种载体均含有真菌选择标记物基因amdS的重叠但是非功能性的片段，编码乙酰胺酶并且允许将这两种片段重组成功能性选择标记物的受体细胞在含有乙酰胺作为唯一氮源的琼脂培养基上生长(EP635,574；WO97/06261；Tilburn et al.，1983，Gene 26：205-221)。根据STABY-方案(Eurogentec)，使用T4连接酶(Invitrogen)在16℃下将PCR片段过夜连接进载体中，并转化至化学感受态CYS21细胞(Eurogentec)。分离氨苄西林抗性克隆并用于PCR扩增与非功能性的amdS片段融合的被克隆的片段(见图1)。这使用寡核苷酸SEQ ID NO.104和105完成。合并由此获得的PCR片段(见图1)，并用于转化其中缺失了hdfA基因的P.chrysogenum菌株(WO05095624)。在所述菌株中非同源性的末端接合通路(end-joining pathway)被破坏，因此DNA的随机整合被大幅减少。因为合并的PCR片段自身也能够重组形成功能性amdS选择标记物基因(即所谓的二分(bipartite)标记物方法或***(split)标记物方法)，所以正确靶向的整合体应当经历了三重同源重组事件(见图1)。
在含有乙酰胺的琼脂(EP 635,574；WO97/06261)上获得转化体，随后将它们转移至第二乙酰胺选择平板上以诱导孢子形成。
缺失突变体的验证
使用获得的突变体进行进一步表征：通过PCR验证真实的基因缺失，和在(100ml摇瓶中)25ml分批培养物中培养后N-己二酰化的β-内酰胺化合物的效价和针对己二酸的产率。
为了分离具有正确品质(即使得能够进行多达9kb的PCR扩增)的染色体DNA，使用突变体Pc22g20270的孢子接种24-孔MTP平板中3ml培养基，并在550rpm、25℃和80％湿度下培养2-3天。洗涤细胞并使用标准缓冲液将其原生质体化(见Swinkels，B.W.，Selten，G.C.M.，Bakhuis，J.G.，Bovenberg，R.A.L.，Vollebregt，A.W.1997.The use of homologous amdS genes as selectable markers.WO9706261)。原生质体化使用10mg/ml的Glucanex在24-孔板中于37℃下进行2小时。再次洗涤细胞(原生质体和残余菌丝体)，并根据供应商的说明书，使用Puragen DNA分离试剂盒(Gentra)分离DNA。将DNA晾干并溶于100ul水中。以50μl的终体积进行PCR反应，所述终体积具有以下组成：
5μl DNA模板(从样品制剂5x稀释而来)
21.5μl 水
10μl GC缓冲液(Finnzymes)
1μl dNTP(10mM储存溶液)
2μl DMSO
5μl 正向寡核苷酸(2μM储存溶液)
5μl 反向寡核苷酸(2μM储存溶液)
0.5μl Phusion Polymerase(Finnzymes)
为了验证正确的缺失，进行3种PCR反应(见图2)。第一种PCR反应是为了证实左侧翼的正确整合，对基因Pc22g20270的基因座而言使用特异性的SEQ ID NO.106的正向寡核苷酸和SEQ ID NO.107的反向寡核苷酸；前者对所述基因的基因座是特异性的，并且紧挨着用于基因靶向的片段上游选择，后者在amdS选择标记物中退火，其可以被用于验证所有个体基因突变。第二种PCR反应是为了证实右侧翼的正确整合，对基因Pc22g20270的基因座而言使用SEQ ID NO.108的特异性正向寡核苷酸和SEQ ID NO.109的特异性反向寡核苷酸；前者对所述基因的基因座是特异性的，并且紧挨着用于基因靶向的片段下游选择，后者在amdS选择标记物中退火，其可以被用于验证所有个体基因突变。第三种PCR反应是为了证实WT片段的不存在和所述基因的基因座处的正确整合；为此可以合并前两种PCR反应的两种基因座特异性寡核苷酸，即在基因Pc22g20270的基因座的情况下合并SEQ ID NO.106的正向寡核苷酸和SEQ ID NO.109的反向寡核苷酸；如果基因靶向是正确的，则这产生比WT情况下大得多的条件(见表4)。
使用以下程序在Biorad的Tetrad机器中进行PCR扩增：
步骤1：98℃下30秒
步骤2：98℃下10秒
步骤3：55℃下30秒
步骤4：72℃下1.5-4.5分钟
(通过使用0.5分钟/待扩增的kb来设置实际的延伸时间)
步骤5：将步骤2-4重复35个循环
步骤6：72℃下10分钟
表4.基因座Pc22g20270处突变体的PCR扩增(也见图2)。
同样的程序可适用于根据本发明获得到所有突变体；在所有情况下SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108保持不变，但是SEQ ID NO.106和SEQ ID NO.109的寡核苷酸是基因特异性的。
缺失突变体的生产力
如实施例2中所述，将基因座Pc22g20270的突变体的孢子接种于100ml摇瓶中的25ml培养基中，并于25℃和280rpm下孵育168小时。作为对照菌株，接种在2008年4月15日以保藏号CBS 122850保藏于荷兰，Utrecht，the Centraalbureau voor Schimmelcultures的P.chrysogenum菌株DS17690(S917)，并以相同方式培养。随后通过离心去除细胞，并使用1ml上清液进行NMR分析。在Bruker Avance 600波谱仪上于600MHz下进行定量1H NMR实验。在冻干之前，向已知量的滤液中添加已知量的溶于磷酸盐缓冲液中的内标(例如顺丁烯二酸)。将残余物溶于D2O中并于300°K下测量。扫描之间的延迟(30s)大于所有化合物T1的5倍，使得感兴趣的化合物的总体与内标总体之间的比例是青霉素、中间产物(6-APA和异青霉素N)、降解产物(8-HPA)剩余糖和剩余侧链(己二酸盐)的数量的精确度量。与DS17690菌株相比，基因Pc22g20270的功能性失活显著降低了摇瓶培养中的己二酰基-6APA效价。将DS17690的效价设定为100时，Pc22g20270微生物突变体菌株产生89％的己二酰基-6APA，但是使用苯乙酸作为侧链时，Pc22g20270的突变体微生物菌株具有与DS17690菌株相同的青霉素G生产力。
这些结果提出由基因Pc22g20270编码的推定的酰基-CoA连接酶在活化作为侧链前体的己二酸以生产N-己二酰基化的β-内酰胺中发挥功能。N-己二酰基化的β-内酰胺相对于侧链前体己二酸的相对产率(并入产率如前文中定义)为DS17690的并入产率的84％。
因此，我们可以得出结论，通过缺失基因Pc22g20270，与亲本菌株相比降低了己二酸并入产率，因此基因Pc22g20270应当被过表达以获得下述突变体微生物菌株，所述突变体微生物菌株与非突变体亲本菌株相比具有经改进的由来自培养基的己二酸向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率。
Claims (18)
1.用于鉴定微生物菌株的一个或多个下述基因的方法，所述基因编码涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的一种或多种酶，所述方法可包括以下步骤：
a.选择涉及将酸活化成各自酰基-CoA化合物的一个或多个已知基因的核苷酸序列和/或任选地由所述基因编码的一个或多个已知酶的氨基酸序列；
b.使用从步骤(a)中选择的序列作为BLAST搜索中的探针，用于在能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的微生物菌株的可获得的核苷酸或氨基酸序列中鉴定同源序列。
2.根据权利要求1的方法，编码涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的一种或多种酶的所述基因选自下组，所述组由编码能够催化细胞内己二酸转化成己二酰基-CoA的酶如CoA-连接酶和CoA-转移酶的基因组成。
3.在包含己二酸的培养基中培养时能够生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的突变体微生物菌株，其特征是：所述菌株与非突变体亲本菌株相比，具有改进的将来自培养基的己二酸向N-己二酰化的β-内酰胺化合物的并入产率。
4.根据权利要求1的菌株，其特征是所述经改进的己二酸盐并入产率为至少5％。
5.前述权利要求中任一项的突变体菌株，其中所述突变体菌株的编码涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的一种或多种酶并且用根据权利要求1或2的方法鉴定的一个或多个基因，与其中所述基因未被过表达的亲本微生物菌株相比，在所述突变体菌株中被过表达。
6.根据权利要求3的菌株，其中涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的所述酶是己二酰基-CoA形成酶，优选地是酸性CoA连接酶(EC 6.2.1.xx)和/或酸性-CoA转移酶(EC 2.8.3.xx)。
7.根据权利要求4的菌株，其中所述编码酸性CoA连接酶(EC6.2.1.xx)的基因选自由以下组成的组：Pc13g14420(SEQ ID No：1)；Pc21g22010(SEQ ID No：2)；Pc22g20270(SEQ ID No：3)；Pc22g00960(SEQ ID No：4)；Pc12g05520(SEQ ID No：5)；Pc13g12270(SEQ ID No：6)；Pc18g05710(SEQ ID No：7)；Pc20g13500(SEQ ID No：8)；Pc13g01890(SEQ ID No：9)；Pc20g10840(SEQ ID No：10)；Pc13g05130(SEQ ID No：11)；Pc13g10810(SEQ ID No：12)；Pc22g06680(SEQ ID No：13)；Pc22g14900(SEQ ID No：14)；Pc22g16410(SEQ ID No：15)；Pc21g13540(SEQ ID No：16)；Pc21g20650(SEQ ID No：17)；Pc21g23730(SEQ ID No：18)；Pc21g21960(SEQ ID No：19)；Pc22g24780(SEQ ID No：20)；Pc06g01160(SEQ ID No：21)；Pc12g09980(SEQ ID No：22)；Pc15g00420(SEQ ID No：23)；Pc21g07810(SEQ ID No：24)和Pc21g09470(SEQ ID No 25)和与所述序列基本同源的序列。
8.根据权利要求4的菌株，其中所述编码酸性-CoA转移酶(EC2.8.3.xx)的基因选自由以下组成的组：Pc20g15639(SEQ ID No：26)；Pc13g02780(SEQ ID No：27)；Pc22g13680(SEQ ID No：28)；Pc22g03940(SEQ ID No：29)；Pc14g00590(SEQ ID No：30)；Pc16g00210(SEQ ID No：31)和与所述序列基本同源的序列。
9.根据前述权利要求中任一项的菌株，其中所述N-己二酰化的β-内酰胺化合物选自由己二酰基-6-APA，己二酰基-7-ADCA，己二酰基-7-ACA，己二酰基-7-ACCA，己二酰基-7-PACA，己二酰基-7-ADAC，己二酰基-7-ACCCA组成的组。
10.根据前述权利要求中任一项的菌株，其中所述菌株是真菌、细菌或酵母。
11.根据前述权利要求中任一项的菌株，其中所述真菌属于Penicillium物种。
12.根据前述权利要求中任一项的菌株，其中所述真菌是Penicillium chrysogenum，优选地其经编码扩环酶或扩环酶/水解酶的基因转化过并且表达编码扩环酶或扩环酶/水解酶的基因。
13.用于构建权利要求1-10中任一项所定义的突变体菌株的方法，所述方法包括过表达编码涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的一种或多种酶的一个或多个基因。
14.根据权利要求11的方法，其中涉及将来自培养基的己二酸并入N-己二酰化的β-内酰胺化合物的所述酶是己二酰基-CoA形成酶，优选地是酸性CoA连接酶(EC 6.2.1)和/或酸性-CoA转移酶(EC 2.8.3)。
15.一种基因，其编码酸性CoA连接酶(EC 6.2.1.xx)并且选自由Pc13g14420(SEQ ID No：1)；Pc21g22010(SEQ ID No：2)；Pc22g20270(SEQ ID No：3)；Pc22g00960(SEQ ID No：4)；Pc 12g05520(SEQ ID No：5)；Pc13g12270(SEQ ID No：6)；Pc18g05710(SEQ ID No：7)；Pc20g13500(SEQ ID No：8)；Pc13g01890(SEQ ID No：9)；Pc20g10840(SEQ ID No：10)；Pc13g05130(SEQ ID No：11)；Pc13g10810(SEQ ID No：12)；Pc22g06680(SEQ ID No：13)；Pc22g14900(SEQ ID No：14)；Pc22g16410(SEQ ID No：15)；Pc21g13540(SEQ ID No：16)；Pc21g20650(SEQ ID No：17)；Pc21g23730(SEQ ID No：18)；Pc21g21960(SEQ ID No：19)；Pc22g24780(SEQ ID No：20)；Pc06g01160(SEQ ID No：21)；Pc12g09980(SEQ ID No：22)；Pc15g00420(SEQ ID No：23)；Pc21g07810(SEQ ID No：24)和Pc21g09470(SEQ ID No 25)和与所述序列基本同源的序列构成的组，或者编码酸性-CoA转移酶(EC 2.8.3.xx)且选自Pc20g15639(SEQ ID No：26)；Pc13g02780(SEQ ID No：27)；Pc22g13680(SEQ ID No：28)；Pc22g03940(SEQ ID No：29)；Pc14g00590(SEQ ID No：30)；Pc16g00210(SEQ ID No：31)和与所述序列基本同源的序列构成的组。
16.编码酸性-CoA转移酶(EC 2.8.3.xx)并且选自下组的基因，所述组由以下组成：Pc20g15639(SEQ ID No：26)；Pc13g02780(SEQ ID No：27)；Pc22g13680(SEQ ID No：28)；Pc22g03940(SEQ ID No：29)；Pc14g00590(SEQ ID No：30)；Pc16g00210(SEQ ID No：31)和与所述序列基本同源的序列。
17.由根据权利要求14或15中定义的基因编码的多肽。
18.用于生产N-己二酰化的β-内酰胺化合物的方法，所述方法包括在包含己二酸的发酵培养基中培养根据权利要求1-10中任一项定义的菌株。
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