CN101889090B

CN101889090B - 用于将分子物质转移入植物细胞中的方法

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Publication number: CN101889090B
Application number: CN200880119539.1A
Authority: CN
Inventors: 杰亚库马·P·塞缪尔; 弗兰克·伯勒斯; 马克·W·泽特勒; 萨拉杰·K·迪克西特
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Kedihua Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2007-10-05
Filing date: 2008-10-03
Publication date: 2018-01-23
Anticipated expiration: 2028-10-03
Also published as: US8722410B2; RU2010112423A; JP2010539989A; AU2008308486A1; AU2008308486B2; WO2009046384A1; RU2495935C2; ES2402341T3; BRPI0817911B8; NZ584406A; US20140242703A1; US20170306339A1; BRPI0817911B1; EP2195438B1; BRPI0817911A2; US9476057B2; CA2701636A1; US20170002369A1; CN101889090A; US20090104700A1

Abstract

提供了用于将感兴趣的分子导入包含细胞壁的植物细胞中的方法。提供了用于以遗传方式或以其它方式修饰植物和用于治疗或预防包含细胞壁的植物细胞中的疾病的方法。

Description

用于将分子物质转移入植物细胞中的方法

优先权要求

本申请要求2007年10月5日提交的美国临时专利申请流水号60/978,059，关于METHODS FOR TRANSFERRING MOLECULAR SUBSTANCES INTOPLANT CELLS的提交日期的权益。

发明背景

纳米颗粒具有已经被利用的在DNA向细胞的投递中使用的独特性质。在所调查的所有纳米颗粒中，金(Au)纳米颗粒趋于是用于投递的卓越候选物，这是由于其低细胞毒性和容易用具有生物学意义的各种配体功能化。Au纳米颗粒通常使用的合成产生带负电荷(例如柠檬酸盐涂层)表面。可以将质粒DNA(它可以具有足以部分解开其碱基的柔性)暴露于金纳米颗粒(“GNP”)。在这些部分解开的条件下，DNA主链上的负电荷可以远得足以使碱基与金纳米颗粒间的范德华引力足以引起质粒DNA附着至金颗粒表面。

在金属纳米颗粒外，在3-5nm大小范围内的半导体纳米颗粒(例如量子点)(“QD”)也已经被作为载体用于将分子投递入细胞中。可以将DNA和蛋白质与附着至QD表面的配体连接在一起(参见例如Patolsky，F.等，J.Am.Chem.Soc.125，13918(2003))。可以通过使用标准的生物偶联方案(参见例如Pinaud，F.，D.King，H.-P.Moore，S.Weiss，J.Am.Chem.Soc.126，6115(2004)；Brachez，M..，M.Moronne，P Gin，S.Weiss，A.PAlivisatos，Science 281，2013(1998))将经羧酸或胺包被(coat)的QD与含有硫醇基团(参见例如Dubertret B等，Science 298，1759(2002)；Akerman，M.E.，W. C.W. Chan，PLaakkonen，S.N.Bhatia，E.Ruoslahti，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，12617(2002)；Mitchell，G.P，C.A.Mirkin，R.L.Letsinger，J.Am.Chem.Soc.121，8122(1999))或N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯基团的分子偶联。备选的方法是经链霉抗生物素蛋白包被的QD与生物素化的蛋白质、寡聚物(oligo)或抗体的偶联(参见例如Dahan M.等，Science 302，442(2003)；Pinaud，F.，D.King，H.-P.Moore，S.Weiss，J.Am.Chem.Soc.126，6115(2004)；DahanM.等，Science 302，442(2003)；Wu.X.Y.等，Nature Biotechnol.21，41(2003)；Jaiswal，J.K.，H.Mattoussi，J.M.Mauro，S.M.Simon，Nature Biotechnol.21，47(2003)；及Mansson，A.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.314，529(2004)。

已经使用纳米颗粒来向多种动物细胞投递质粒DNA。已经发现了，在将经DNA包被的纳米颗粒与没有细胞壁的细胞一起温育时，细胞摄入纳米颗粒，并开始表达DNA上所编码的任何基因。若想要向通常具有细胞壁的细胞进行纳米颗粒投递，则在向植物原生质体添加颗粒前剥去细胞壁(参见Torney，F.等，Nature Nanotechnol.2，(2007)。在植物细胞中，细胞壁充当投递外源应用分子的屏障。已经采用许多侵入性方法(如基因枪(生物射弹)、显微注射、电穿孔、和土壤杆菌(Agrobacterium))来实现基因和小分子向那些有壁的植物细胞中的投递，但是仅通过显微注射实现了蛋白质的投递。小分子和蛋白质在存在植物细胞细胞壁的情况中的投递仍然未经探索而且会是有利的，以便开发要在完整的植物细胞/组织或器官中展开用于进行体外和体内操作的使能技术(enabling technology)。

本发明涉及使用纳米颗粒来将分子物质以非侵入性方式投递入具有细胞壁的细胞中的方法。

发明概述

结合想要作为例示性和说明性的，而并不限制范围的***、工具和方法描述以下实施方案。

依照本发明，提供了将感兴趣的分子导入包含细胞壁的植物细胞中的方法，该方法包括：使所述具有细胞壁的植物细胞放置得与纳米颗粒和感兴趣的分子接触，并容许所述纳米颗粒和所述感兴趣的分子向细胞中的摄入(uptake)。

进一步提供了将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，该方法包括：使具有细胞壁的植物细胞放置得与纳米颗粒和能够治疗疾病的分子接触，并容许纳米颗粒和能够治疗疾病的分子向细胞中的摄入。在上文所描述的例示性方面和实施方案外，考虑到以下描述，别的方面和实施方案会变得显而易见。

附图简述

图1描绘了使用附接至共焦成像***的微分干涉相差显微镜观察的BY2单细胞照片(小图A)。小图B显示了来自用I2KI染色以突出显示质体(造粉体)的BY2变体的单细胞的光学显微视野。

图2，小图A描绘了极限培养基和5％二氧化碳中维持的烟草光合自养细胞(NTl)，如在光学显微镜中所看到的，在那里显著的叶绿体是可见的。图2，小图B显示了在荧光显微镜下观察到类似的NTl细胞，其中活性叶绿体自身发红色荧光。

图3显示了用单独的SAMSA荧光素和用经SAMSA荧光素包被的GNP处理的BY2悬浮聚集体。图3，小图A显示了用单独的SAMSA荧光素处理的细胞的DIC图像，而图3，小图B显示了同一细胞的荧光图像。图3，小图C显示了用经SAMSA荧光素包被的GNP处理的细胞的DIC图像，而图3，小图D显示了经SAMSA荧光素包被的GNP处理的细胞的荧光图像。标示细胞核(Nu)和细胞壁(CW)的位置。

图4显示了在高放大率下的经SAMSA荧光素包被的GNP处理的单细胞。小图B显示了核仁中大量GNP的存在。小图A在不同焦点平面下显示了与小图B所显示相同的核仁的明视野图像。

图5显示了用经SAMSA荧光素包被的GNP处理的光合自养细胞。小图A显示了3-4个细胞簇中极透明的细胞，具有沿细胞壁内侧形成分界线的大叶绿体。小图B显示了叶绿体中的纳米颗粒积累。小图C和小图D显示了使用荧光显微镜得到的较高放大率的单一叶绿体。纳米颗粒在叶绿体的膜薄层中是可见的，并且散布于自身发红色荧光的叶绿素色素间。

图6显示了含有纳米颗粒的细胞的反射和荧光显微图像。图6的小图A显示了一幅反射图像，其中优先看到GNP。小图B显示了自身发红色荧光的叶绿体的背景内的发荧光颗粒。小图C中显示了合并的反射和荧光图像，其中发黄色荧光的颗粒在叶绿体的边界内。

图7显示了依照本发明的实施方案的一种可能的转化方案的图示。

图8显示了处理2小时后GFP的细胞内在化，如经由反射显微术所显现的。小图A和小图A1显示了在DIC显微镜下的未处理的对照细胞(小图A)，和如在DIC显微镜下所看到的经与GFP拴系在一起的Au-NP处理的细胞(小图A1)；小图B和小图B1显示了在反射显微镜下的对照细胞(小图B)，和如在反射显微镜下所看到的经与GFP拴系在一起的Au-NP处理的细胞(小图B1)，自反射的Au-NP显示了颗粒内在化；小图C和小图C1显示了DIC和反射显微镜的对照细胞叠置图像(小图C)，和DIC和反射显微镜的经处理细胞的叠置图像(小图C1)；小图D和D1显示了为了显示背景中没有颗粒的对照细胞反射倒置图像(小图D)，和为了非常清楚地显示颗粒内在化的经处理细胞的反射倒置图像(小图D1)。

图9显示了单细胞中经SAMSA染料包被的GNP内在化。小图A显示了经荧光素染色的单细胞，其中细胞壁和培养基显示荧光，但没有染料内在化；小图B显示了DIC显微镜下的单细胞；小图C显示了为了显示进入胞质溶胶和细胞核中的纳米颗粒(GNP 150nm)内在化的相差成像，其中荧光素仅与颗粒一起内在化且质壁分离的细胞在UV光中在延长的暴露下达1小时。

图10显示了混合单细胞前的具有发荧光的GFP分子的Au-GFP偶联物。小图A(FITC)、小图B(亮视野)、小图C(反射)、小图D(小图A+B+C)：温育后2小时，但在混合细胞前的GFP发荧光的Au-GNP，如经由荧光显微术所观察到的。可以在细胞核中显示反射的颗粒上看到类似的发荧光颗粒(参见图8)。

图11显示了GFP进入BY2-E田胞系中的纳米颗粒(GNP 90nm)介导的细胞内在化。小图A显示了具有活动性胞质丝的***对照细胞(相差图像)；小图B在经由FITC滤光片检查时显示与小图A相同的细胞，其中来自细胞质中的非绿色质体的自身荧光形成外周，并且来自那些与***细胞核有关的质体的自身荧光亦然；且其中接近细胞外周的胞质丝和细胞质没有显示自身荧光；小图C显示了用没有附着至GNP的GFP处理的对照BY2细胞(FITC)，其中细胞没有显示GFP摄入，但是GFP环绕细胞，但是没有被内在化；小图D显示了GNP介导的GFP内在化，如经由FITC滤光片所观察到的，其中外周细胞质、胞质丝和细胞核显示GFP内在化，如与图B中的对照相比的。

图12显示了BY2-E单细胞系，其显示温育细胞后2小时GNP介导的YFP内在化。小图A(FITC)、B(罗丹明)、C(DIC)、D(小图A+B)、E(小图A+B+C)：F(倒置的反射图像)：YFP内在化，如经由荧光显微术所观察到的。黄色的箭显示了活的单细胞中的内在化，其中YFP在胞质溶胶中(细胞核中弥漫的和浓缩的)。橙色的箭显示了质壁分离的细胞中的内在化，其中细胞内收缩的原生质体块显示强烈的荧光，指明细胞中的YFP内在化。在位于其它活细胞附近，但在其下方的活细胞的同一焦平面中找到此细胞。积累高水平颗粒和YFP荧光的细胞在荧光显微镜下进行延长的检查显示了细胞死亡。

图13和图14显示了PAT和YFP扩增基因产物的凝胶图像。

图15显示了对QD-肽偶联物实施的用于确认肽附着至QD的凝胶电泳。

图16显示了质粒pDAB3831。

发明详述

在随后的描述和表中，使用了许多术语。为了提供说明书和权利要求书(包括要给予此类术语的范围)的清楚且一致的理解，提供了以下定义：

回交。回交可以是育种人员将杂种后代向后与亲本之一(例如第一代杂种F₁与F₁杂种的亲本基因型之一)重复杂交的过程。

胚。胚可以是包含在成熟种子内的小植株。

纳米颗粒。具有至少1纳米规模尺寸的微观颗粒，通常小于100nm。适合于在本发明中使用的纳米颗粒可具有1nm-0.4um的大小。量子点可以具有1nm-10nm，优选2-4nm的中值直径。纳米颗粒可以选自：金纳米颗粒、金包被的纳米颗粒、多孔纳米颗粒、中孔(mesoporous)纳米颗粒、硅(silica)纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、钨纳米颗粒、明胶纳米颗粒、纳米壳(nanoshell)、纳米核心(nanocore)、纳米球(nanosphere)、纳米棒(nanorod)、磁性纳米颗粒及其组合。

量子点。量子点指在所有三个空间方向上限制导带电子、价带穴(valencebandhole)、或激子(导带电子和价带穴的结合对)运动的半导体纳米结构。限制可以是由于静电势(由外部电极、掺杂、应变(strain)、杂质产生)、不同半导体材料间的界面存在(例如在核心壳纳米晶体***中)、半导体表面(例如半导体纳米晶体)的存在、或其组合。量子点可以具有离散的量子化能谱。相应的波函数在空间上位于量子点内，但是随着晶体点阵的许多周期延伸。量子点含有小的有限数目(1-100阶)的导带电子、价带穴、或激子(即有限数目的元电荷)。

对草甘膦(glyphosate)有抗性的。对草甘膦剂量的抗性指用该剂量的草甘膦植物仍存活(即植物能不被杀死)的能力。在一些情况中，耐受性植物可以暂时变黄或者在其它方面展现出一些草甘膦诱导的损害(例如过度分蘖和/或生长抑制)，但是能恢复。

稳定化的。稳定化的指自同一品种的近交植物的一个世代可繁殖地传递至下一世代的植物特征。

摄入。摄入指颗粒诸如纳米颗粒(例如金或量子点)穿过细胞壁或细胞膜的移位，其中所述移位并不单独由于由不同于正向其中摄入颗粒的细胞的某物赋予颗粒的动量而发生。单独由于赋予颗粒的动量而引起颗粒穿过细胞壁或细胞膜的移位的装置或方法的非限制性例子是生物射弹、基因枪、显微注射、和/或刺穿感染(impalefection)技术。

依照本发明的实施方案，可以提供一种将感兴趣的分子导入包含细胞壁的植物细胞中的方法，该方法包括将含有感兴趣分子的纳米颗粒放置得与植物细胞接触，并容许纳米颗粒穿过植物细胞壁的摄入。在本发明的具体方面，纳米颗粒可以是任何纳米颗粒，而且可以可逆地或者不可逆地含有、包被有、或者以其它方式结合至和/或携带感兴趣的分子。在某些实施方案中，可以在与具有细胞壁的植物细胞接触前或者与将纳米颗粒导入具有细胞壁的植物细胞中同时将感兴趣的分子导入纳米颗粒。可以在本发明的实施方案中使用的纳米颗粒的例子包括但不限于金、量子点、金包被的纳米颗粒、多孔纳米颗粒、中孔纳米颗粒、二氧化硅(silica)纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、钨纳米颗粒、明胶纳米颗粒、纳米壳、纳米核心、纳米球、纳米棒、磁性纳米颗粒、和/或其组合。

依照本发明的实施方案，具有细胞壁的植物细胞可以是包含完整且整个细胞壁的任何植物细胞。具有细胞壁的细胞的例子包括但不限于藻类、烟草、胡萝卜、玉米、芸苔(canola)、油菜籽(rapeseed)、棉、棕榈、花生、大豆、甘蔗、稻(Oryza sp.)、拟南芥(Arabidopsis sp.)、和蓖麻(Ricinus sp.)，优选烟草、胡萝卜、玉米、棉、芸苔、大豆和甘蔗；更优选烟草和胡萝卜。本发明的实施方案可以包括来自任何组织或者找到它们的任何地方的包含细胞壁的细胞，包括但不限于在胚、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果、茎、和组织培养物中。

在发明的实施方案中，感兴趣的分子可以是可依照本发明向植物细胞投递的任何分子。感兴趣的分子或感兴趣分子的成分可以包含但不限于核酸、DNA、RNA、RNAi分子、基因、质粒、粘粒、YAC、BAC、多肽、酶、激素、糖肽、糖类、脂肪、信号传导肽、抗体、维生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、药物、除草剂、杀真菌剂、抗生素、和/或其组合。

本发明的实施方案包括用于预防或治疗疾病的方法。实施方案的非限制性例子包括使用本发明的方法向有所需要的细胞投递杀真菌剂、抗生素、和/或其它药物。

在本发明的具体的实施方案中，纳米颗粒的表面可以是功能化的，其能例如容许靶向摄入或者容许其它物质对纳米颗粒表面的可逆或不可逆结合。作为非限制性例子，可以用例如链烷硫醇盐(alkanethiolate)的自我装配单层(其可以进一步功能化或衍生化)使纳米颗粒(例如金纳米颗粒或量子点)的表面功能化。在进一步的非限制性例子中，可以用接头(其自身能进一步功能化或衍生化)使纳米颗粒的表面衍生化。在一个实施方案中，纳米颗粒可以是PEG化的。在其它实施方案中，纳米颗粒可以包含，或者可以多功能化有核心(活性或者没有活性)、空间涂层(活性或惰性)、可切割连接、和/或靶向分子或配体之一种或多种。

在本发明的各方面，可以将纳米颗粒摄入入细胞的多个部分中。可以向其中摄入纳米颗粒的位置的例子包括但不限于胞质溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双膜腔。在本发明的其它实施方案中，摄入入包含细胞壁的细胞中的纳米颗粒可以经由共质体或质外体途径发生。

本发明的别的实施方案包括经遗传修饰的植物细胞及其生成方法，其中所述植物细胞具有经由本发明的方法导入其中的一种或多种核酸。在实施方案的一个例子中，可以经由依照本发明的纳米颗粒将包含感兴趣基因和选择标志的质粒导入具有细胞壁的植物细胞中。在进一步的实施方案中，可以选择已经稳定整合感兴趣基因和/或选择标志的稳定转化体。在备选的实施方案中，可以繁殖现在包含感兴趣基因的植物细胞以生成包含感兴趣分子的其它细胞。在其它实施方案中，现在包含感兴趣分子的植物细胞可以是可用于再生包含感兴趣分子的全植物的可再生细胞。

在另一方面，本发明提供了创建在组织培养中使用的包含感兴趣分子的可再生植物细胞的方法。优选地，组织培养会能够再生具有与可再生细胞基本上相同的基因型的植物。此类组织培养中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果或茎。更进一步地，本发明的实施方案提供了自本发明的组织培养物再生的植物。

或者，本发明提供了一种将想要的性状导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，其中所述方法包括：将纳米颗粒和能够向植物细胞提供想要的性状的感兴趣分子放置得与细胞接触，并容许纳米颗粒穿过细胞壁的摄入。想要的性状的例子包括但不限于选自下组的性状：雄性不育、除草剂抗性、昆虫抗性、和对细菌疾病、真菌疾病、和/或病毒疾病的抗性。

本发明的别的方面提供了产生包含想要的性状或感兴趣的分子的稳定化植物系的方法，其中可以首先通过纳米颗粒穿过植物细胞壁的摄入来导入想要的性状或感兴趣的分子。产生稳定化植物系的方法是本领域普通技术人员公知的，并且可以包括如下技术，诸如但不限于自交、回交、杂种生成、与群体杂交等。包含通过纳米颗粒穿过细胞壁的摄入而首先导入植物细胞(或其祖先)中的想要的性状或感兴趣分子的所有植物和植物细胞在本发明的范围内。有利的是，可以在与其它不同植物细胞的杂交中使用包含通过纳米颗粒穿过细胞壁的摄入而首先导入植物或细胞(或其祖先)中的想要的性状或感兴趣分子的植物细胞以产生具有卓越特性的第一代(F1)杂种细胞、种子、和/或植物。

在感兴趣的分子包含一种或多种基因的实施方案中，基因可以是显性或隐性等位基因。举例而言，基因会赋予诸如除草剂抗性、昆虫抗性、细菌抗性、真菌抗性、病毒疾病抗性、雄性能育、雄性不育、营养质量增强、和工业使用等性状。

随着容许编码特定蛋白质或RNA产物(例如RNAi)的基因的分离和表征的分子生物学技术的出现，植物生物学领域中的科学家在工程化改造细胞基因组来含有并表达外来基因，或者天然或内源基因的别的或经修饰的型式(可能由不同启动子驱动)以便以特定形式改变细胞性状方面形成强烈的兴趣。此类外来的别的和/或经修饰的基因在本文中统称为“转基因”。在过去的15至20年里，已经开发了用于产生转基因细胞的数种方法，并且在具体的实施方案中，本发明涉及细胞的经转化型式及其生成方法，其通过经由纳米颗粒穿过细胞壁的摄入来向具有细胞壁的细胞中导入转基因来进行。在本发明的实施方案中，转基因可以包含在表达载体中。

细胞转化可以牵涉会在特定细胞中发挥功能的表达载体的构建。此类载体可以包含如下DNA，其包含在调节元件(例如启动子)的控制下、或者与调节元件(例如启动子)可操作连接的基因。表达载体可以含有一种或多种此类可操作连接的基因/调节元件组合。载体可以处于质粒形式，并且可以单独地或者与其它质粒组合地使用以提供经转化的细胞，其使用如本文中所描述的用于将转基因掺入包含细胞壁的植物细胞的遗传材料中的转化方法来实现。

用于经由纳米颗粒进行摄入的表达载体：标志基因

表达载体可以包含与调节元件(例如启动子)可操作连接的至少一种遗传标志，其容许通过负选择(即抑制不合选择标志基因的细胞生长)或者通过正向选择(即筛选由遗传标志编码的产物)回收含有标记的经转化细胞。许多供转化用的选择标志基因是转化领域中公知的，并且包括例如编码在代谢方面使选择性化学剂(其可以是抗生素或除草剂)解毒的酶的基因，或编码改变过的靶物(其可以是对抑制剂不敏感的)的基因。少许正向选择方法也是本领域中已知的。

一种适合于植物转化的通常使用的选择标志基因可以包含在植物调节信号控制下的新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，其赋予对卡那霉素的抗性。参见例如Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：4803(1983)。另一种通常使用的选择标志基因可以是潮霉素磷酸转移酶基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性。参见例如Vanden Elzen等，PlantMol.Biol.，5：299(1985)。

赋予对抗生素的抗性的细菌起源的别的选择标志基因包括庆大霉素乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶、氨基糖苷-3’-腺嘌呤转移酶、和博来霉素抗性决定子。参见Hayford等，Plant Physiol.86：1216(1988)，Jones等，Mol.Gen.Genet.，210：86(1987)，Svab等，Plant Mol.Biol.14：197(1990)，Hille等，PlantMol.Biol.7：171(1986)。其它选择标志基因赋予对除草剂诸如草甘膦、草丁膦(glufosinate)或溴苯腈(bromoxynil)的抗性。参见Comai等，Nature317：741-744(1985)，Gordon-Kamm等，Plant Cell 2：603-618(1990)和Stalker等，Science 242：419-423(1988)。

其它适合于植物转化的选择标志基因不是细菌起源的。这些基因包括例如小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合酶。参见Eichholtz等，Somatic Cell Mol.Genet.13：67(1987)，Shah等，Science233：478(1986)，Charest等，Plant Cell Rep.8：643(1990)。

适合于植物转化的另一类标记基因要求筛选据推测为经转化的植物细胞，而不是对经转化的细胞直接遗传选择对毒性物质诸如抗生素的抗性。这些基因特别可用于量化或显现基因在特定组织中表达的空间样式，而且常常成为报告基因，因为可以将它们与基因或基因调节序列融合以调查基因表达。用于筛选经转化细胞的常用基因包括β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、萤光素酶和氯霉素乙酰基转移酶。参见Jefferson，R.A.，PlantMol.Biol.Rep.5：387(1987)，Teeri等，EMBO J.8：343(1989)，Koncz等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.84：131(1987)，DeBlock等，EMBO J.3：1681(1984)。

最近，已经可利用不需要破坏植物组织的用于显现GUS活性的体内方法。Molecular Probes出版2908，Imagene Green.TM.，第1页-第4页(1993)和Naleway等，J.Cell Biol.115：151a(1991)。然而，尚未证明这些用于显现GUS活性的体内方法对于经转化细胞的回收有用，这是由于与萤光素酶基因作为选择标志使用有关的低灵敏性、高荧光背景、和限制。

新近，已经利用编码荧光蛋白(例如GFP、EGFP、EBFP、ECFP、和YFP)的基因作为原核和真核细胞中供基因表达用的标记。参见Chalfie等，Science263：802(1994)。可以使用荧光蛋白和荧光蛋白突变作为选择标志。

用于经由纳米颗粒进行摄入的表达载体：启动子

表达载体中包含的基因必须由构成调节元件(例如启动子)的核苷酸序列驱动。现在，数类启动子是转化领域中公知的，如可以单独地或者与启动子组合地使用的其它调节元件。

如本文中所使用的，“启动子”包括提及可以在转录起始上游，而且可以牵涉RNA聚合酶和其它蛋白质的识别和结合以启动转录的DNA区域。“植物启动子”可以是能够在植物细胞中启动转录的启动子。在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织诸如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞、或厚壁组织中启动转录的启动子。此类启动子称为“组织优选的”。仅在某些组织中启动转录的启动子称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动一种或多种器官中的某些细胞类型(例如根或叶中的导管细胞)中的表达。“诱导型”启动子可以是可在环境控制下的启动子。能实现诱导型启动子转录的环境条件的例子包括缺氧条件或光的存在。组织特异性、组织优选的、细胞类型特异性、和诱导型启动子构成“非组成性”启动子的种类。“组成性”启动子可以是在大多数环境条件下有活性的启动子。

A.诱导型启动子

可以将诱导型启动子与用于细胞中表达的基因可操作连接。任选地，可以将诱导型启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述核苷酸序列可以与用于细胞中表达的基因可操作连接。用诱导型启动子，转录速率响应诱导剂而增加。

任何诱导型启动子可以在本发明中使用。参见Ward等，Plant Mol.Biol.22：361-366(1993)。例示性的诱导型启动子包括但不限于：那些来自响应铜的ACEI***的(Mett等，PNAS 90：4567-4571(1993))；响应苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因(Hershey等，Mol.Gen Genetics 227：229-237(1991)和Gatz等，Mol.Gen.Genetics 243：32-38(1994))；和来自Tn10的Tet阻遏物(Gatz等，Mol.Gen.Genetics 227：229-237(1991))。特别有用的诱导型启动子可以是响应植物通常不响应的诱导剂的启动子。例示性的诱导型启动子可以是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可以由糖皮质类固醇激素诱导。Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：0421(1991)。

B.组成性启动子

可以将组成性启动子与用于细胞中表达的基因可操作连接或者可以将组成性启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述核苷酸序列可以与用于细胞中表达的基因可操作连接。可以在本发明中利用不同组成性启动子。例示性的组成性启动子包括但不限于：来自植物病毒的启动子，诸如来自CaMV的35S启动子(Odell等，Nature 313：810-812(1985))；来自稻肌动蛋白基因的启动子(McElroy等，Plant Cell 2：163-171(1990))；泛素(Christensen等，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)和Christensen等，PlantMol.Biol.18：675-689(1992))；pEMU(Last等，Theor.Appl.Genet.81：581-588(1991))；MAS(Velten等，EMBO J.3：2723-2730(1984))；和玉米H3组蛋白(Lepetit等，Mol.Gen.Genetics231：276-285(1992)和Atanassova等，Plant Journal 2(3)：291-300(1992))。ALS启动子，即欧洲油菜(Brassica napus)ALS3结构基因5’的Xbal/NcoI片段(或与所述Xbal/NcoI片段的核苷酸序列相似性)代表一种特别有用的组成性启动子。参见PCT公开文本WO 96/30530。

C.组织特异性或组织优选的启动子

可以将组织特异性启动子与用于细胞中表达的基因可操作连接。任选地，可以将组织特异性启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。用与组织特异性启动子可操作连接的感兴趣基因转化的植物可以专门或优先在特定组织中生成转基因的蛋白质产物。

可以在本发明中利用任何组织特异性或组织优选的启动子。例示性的组织特异性或组织优选的启动子包括但不限于根优选的启动子-诸如来自菜豆蛋白基因(Murai等，Science 23：476-482(1983)和Sengupta-Gopalan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324(1985))；叶特异性和光诱导的启动子，诸如来自cab或rubiSco(Simpson等，EMBOJ.4(11)：2723-2729(1985)和Timko等，Nature 318：579-582(1985))；花药特异性启动子，诸如来自LAT52(Twell等，Mol.Gen.Genetics 217：240-245(1989))；花粉特异性启动子，诸如来自Zm13(Guerrero等，Mol.Gen.Genetics 244：161-168(1993))或小孢子优选的启动子，诸如来自apg(Twell等，Sex.Plant Reprod.6：217-224(1993))。

可以借助于将编码信号序列的核苷酸序列可操作连接至编码感兴趣蛋白质的基因的5’和/或3’区来实现由转基因所生成的蛋白质向亚细胞区室诸如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞壁或线粒体的运输。可以在蛋白质合成和加工过程中在最后可以使所编码的蛋白质区室化的地方测定结构基因5’和/或3’端的靶向序列。或者，可以将此类亚细胞区室靶向蛋白与纳米颗粒直接连接以将用感兴趣分子包被的纳米颗粒引导至想要的亚细胞区室。信号序列的存在将多肽引导至细胞内细胞器或亚细胞区室，或者向质外体分泌。许多信号序列是本领域中已知的。参见例如Becker等，PlantMol.Biol.20：49(1992)，Close，P.S.，Master’s Thesis，Iowa State University(1993)，Knox，C等，“Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes fromBarley”，Plant Mol.Biol.9：3-17(1987)，Lemer等，PlantPhysiol.91：124-129(1989)，Fontes等，Plant Cell 3：483-496(1991)，Matsuoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.88：834(1991)，Gould等，J.Cell.Biol.108：1657(1989)，Creissen等，Plant J.2：129(1991)，Kalderon等，A short amino acid sequence ableto specify nuclear location，Cell39：499-509(1984)，Steifel等，Expression of amaize cell wall hydroxyproline-richglycoprotein gene in early leaf and rootvascular differentiation，Plant Cell2：785-793(1990)。

外来蛋白质基因和农业学基因

关于依照本发明的转基因植物，可以以商业量生成外来蛋白质。如此，用于选择和繁殖经转化植物的技术(其是本领域中充分了解的)产生以常规方式收获的多种转基因植物，然后可以自感兴趣的组织或自总生物质提取外来蛋白质。可以通过例如Heney和Orr，Anal.Biochem.114：92-6(1981)讨论的已知方法来实现来自植物生物质的蛋白质提取。

在本发明的各方面，为外来蛋白质的商业生产提供的转基因植物可以是细胞或植株。在其它方面，感兴趣的生物质可以是种子。对于相对少数显示较高水平表达的转基因植物，可以主要经由常规的RFLP、PCR和SSR分析(其鉴定整合DNA分子的近似染色***置)来产生遗传图谱。关于在这点上的例示性方法，参见Glick和Thompson，Methods in PlantMolecular Biology andBiotechnology CRC Press，Boca Raton 269：284(1993)。关于染色***置的图谱信息对于主题转基因植物的专利保护可以是有用的。若可能进行未被授权的繁殖并与其它种质进行杂交，则可以比较整合区域的图谱与可疑植物的类似图谱以确定后一种是否与可疑植物具有共同的起源。谱图比较会牵涉杂交、RFLP、PCR、SSR和测序，它们都是常规技术。

同样地，可以在经转化的细胞或其后代中表达农艺学基因。更具体地，可以经由本发明的方法来对植物进行遗传改造以表达农艺学感兴趣的各种表型。可以在这点上使用的例示性基因包括但不限于那些下文所分类的。

1.赋予对有害物或疾病的抗性并编码下列各项的基因：

A)植物疾病抗性基因。植物防御通常受到植物中的疾病抗性基因(R)产物与病原体中的相应无毒力(Avr)基因产物之间的特异性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因转化植物品种以工程化改造对特定病原体株有抗性的植物。参见例如Jones等，Science 266：789(1994)(克隆关于对叶霉菌(Cladosporium fulvum)抗性的番茄Cf-9基因))；Martin等，Science 262：1432(1993)(关于对丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.tomato)的抗性的番茄Pro基因编码蛋白质激酶)；Mindrinos等，Cell 78：1089(1994)(Arabidops可以是关于对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)抗性的RSP2基因)。

B)赋予对有害物诸如大豆孢囊线虫(soybean cyst nematode)的基因。参见例如PCT公开文本WO 96/30517；PCT公开文本WO 93/19181。

C)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白，其衍生物或模仿其的合成多肽。参见例如Geiser等，Gene 48：109(1986)，其披露了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以以例如ATCC编号40098、67136、31995和31998购自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)，Manassas，Va.。

D)凝集素。参见例如Van Damme等，Plant Molec.Biol.24：25(1994)的公开内容，其披露了数种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列。

E)维生素结合蛋白，诸如抗生物素蛋白。参见PCT公开文本US93/06487。申请教导了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为针对昆虫有害物的杀幼虫剂的用途。

F)酶抑制剂，例如蛋白酶或蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见例如Abe等，J.Biol.Chem.262：16793(1987)(稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂的核苷酸序列)，Huub等，PlantMolec.Biol.21：985(1993)(编码烟草蛋白酶抑制剂I的cDNA的核苷酸序列)，Sumitani等，Biosci.Biotech.Biochem.57：1243(1993)(硝孢链霉菌(Streptomyces nitrosporeus)α-淀粉酶抑制剂的核苷酸序列)和美国专利No.5,494,813(Hepher和Atkinson，1996年2月27日公告)。

G)昆虫特异性激素或信息素诸如蜕皮类固醇或保幼激素、其变体、基于其的模拟物、或其拮抗剂或激动剂。参见例如Hammock等，Nature 344：458(1990)的公开内容，其关于克隆的保幼激素酯酶(即一种保幼激素灭活剂)的杆状病毒表达。

H)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达后破坏受到影响的害虫的生理学。例如参见Regan，J.Biol.Chem.269：9(1994)的公开内容(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA)，和Pratt等，Biochem.Biophys.Res.Comm.163：1243(1989)(可以在太平洋折翅蠊(DiPloptera puntata)中鉴定抑咽侧体神经肽(allostatin，allatostatin))。还可参见Tomalski等的美国专利No.5,266,317，其披露了编码昆虫特异性麻痹性神经毒素的基因。

I)本质上由蛇、胡蜂、或任何其它生物体生成的昆虫特异性毒液。例如，参见Pang等，Gene 116：165(1992)，关于在植物中异源表达编码蝎昆虫毒性肽的基因的公开内容。

J)负责单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、类苯基丙烷衍生物或具有杀昆虫性活性的另一种非蛋白质分子的超积累的酶。

K)牵涉对生物学活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶(不管是天然的还是合成的)。参见以Scott等名义的PCT公开文本WO93/02197，其披露了纤维二糖酶(callase，cellase)基因的核苷酸序列。含有几丁质酶编码序列的DNA分子可以以编号39637和67152获自例如ATCC。还可参见Kramer等，Insect Biochem.Molec.Biol.23：691(1993)(其教导了编码烟草天蛾几丁质酶的cDNA的核苷酸序列)和Kawalleck等，Plant Molec.Biol.21：673(1993)，其提供了欧芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列。

L)刺激信号转导的分子。例如，参见Botella等，Plant Molec.Biol.24：757(1994)(关于绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)和Griess等，Plant Physiol.104：1467(1994)(其提供了玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)的公开内容。

M)疏水矩肽。参见PCT公开文本WO 95/16776(抑制真菌植物病原体的鲎抗菌肽的肽衍生物的公开内容)和PCT公开文本WO 95/18855(教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽)。

N)膜通透酶、通道形成剂或通道阻断剂。例如参见Jaynes等，Plant Sci89：43(1993)的公开内容，其关于杀菌肽-β溶胞肽类似物的异源表达以给予对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)有抗性的转基因烟草植物。

O)病毒侵入性蛋白或自其衍生的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在经转化植物细胞中的积累赋予对由可以衍生外壳蛋白基因的病毒及相关病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。参见Beachy等，Ann.rev.Phytopathol.28：451(1990)。已经对经转化的植物赋予针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀刻病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。同上。

P)昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆虫肠中的重要代谢功能的抗体会使受影响的酶失活，杀死昆虫。参见Taylor等，摘要号497，Seventh Int’lSymposium on Molecular Plant-Microbe Interactions(Edinburgh，Scotland)(1994)(经由生成单链抗体片段来实现转基因烟草中的酶促失活)。

Q)病毒特异性抗体。参见例如Tavladoraki等，Nature 366：469(1993)，其显示了表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免于病毒攻击。

R)本质上由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白(developmental-arrestiveprotein)。例如，真菌内α-1，4-D-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同-α-1，4-D-半乳糖醛酸酶(galacturonase)来促进真菌定殖(colonization)和植物营养物释放。参见Lamb等，Bio/Technology 10：1436(1992)。编码豆内多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征可以记载于Toubart等，Plant J.2：367(1992)。

S)本质上由植物生成的发育阻滞蛋白。例如Logemann等，Bio/Technology 10：305(1992)已经显示了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌疾病的抗性升高。

2.赋予对除草剂的抗性的基因：

A)抑制生长点或分生组织的除草剂，诸如咪唑啉酮或磺酰脲。在此种类中的例示性基因编码突变型ALS和AHAS酶，如分别记载于例如Lee等，EMBO J.7：1241(1988)和Miki等，Theor.Appl.Genet.80：449(1990)的。

B)草甘膦(分别由例如突变型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)基因(经由导入天然EPSP基因的重组核酸和/或各种形式的体内诱变)、aroA基因和草甘膦乙酰基转移酶(GAT)基因赋予的抗性)、其它膦酰基化合物诸如草丁膦(来自链霉菌(Streptomyces)物种(包括吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)和绿色产色链霉菌(Streptomycesviridichromogenes))的草铵膦乙酰基转移酶(PAT)基因)、和吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)，参见例如Shah等的美国专利No.4,940,835和Barry等的美国专利6，248,876，其披露了可以将草甘膦抗性赋予植物的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变型aroA基因的DNA分子可以以ATCC编号39256获得，并且该突变型基因的核苷酸序列可披露于Comai的美国专利No.4,769,061。Kumada等的欧洲专利申请No.0 333 033和Goodman等的美国专利No.4,975,374披露了赋予对除草剂诸如L-草铵膦的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列可参见Leemans等的欧洲申请No.0242246，DeGreef等，Bio/Technology 7：61(1989)描述了表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予对苯氧基丙酸和环己酮诸如拿捕净(sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop)的抗性的基因的例子包括由Marshall等，Theor.Appl.Genet.83：435(1992)所描述的Accl-S1、Accl-S2和Accl-S3基因。能够赋予草甘膦抗性的GAT基因记载于Castle等的WO2005012515。赋予对2，4-D、Fop和吡啶氧基生长素除草剂抗性的基因记载于转让给DowAgroSciences LLC的WO2005107437。

C)抑制光合成的除草剂，诸如三嗪(psbA和gs+基因)或氰苯(腈水解酶基因)。Przibila等，Plant Cell 3：169(1991)描述了编码突变型psbA基因的质粒转化衣滴虫(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列记载于Stalker的美国专利No.4,810,648，并且含有这些基因的DNA分子以ATCC编号53435、67441、和67442可获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达可记载于Hayes等，Biochem.J.285：173(1992)。

3.赋予或促成如下增值性状的基因，诸如：

A)经修饰的脂肪酸代谢，例如通过用硬脂酰-ACP去饱和酶的反义基因转化植物以增加植物的硬脂酸含量。参见Knultzon等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：2624(1992)。

B)肌醇六磷酸含量降低--1)肌醇六磷酸酶编码基因的导入会增强肌醇六磷酸的分解，向经转化的植物添加更多游离的磷酸盐。例如，参见VanHartingsveldt等，Gene 127：87(1993)，关于黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公开内容。2)可以导入降低肌醇六磷酸含量的基因。例如在玉米中，这可以如下实现，即克隆与如下单一等位基因有关的DNA，然后再次导入，所述单一等位基因可为以低水平植酸表征的玉米突变体负责。参见Raboy等，Maydica 35：383(1990)。

C)通过例如用编码改变淀粉分支样式的酶的基因转化植物实现的经修饰的碳水化合物组成。参见Shiroza等，J.Bacteol.170：810(1988)(链球菌(Streptococcus)突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等，Mol.Gen.Genet.20：220(1985)(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil)的核苷酸序列可以是果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因)，Pen等，Bio/Technology 10：292(1992)(表达地衣芽胞杆菌(Bacillus lichenifonn，Bacilluslicheniformis)的转基因植物的生成可以是α-淀粉酶)，Elliot等，Plant Molec.Biol.21：515(1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，Sogaard等，J.Biol.Chem.268：22480(1993)(定点优点可以是大麦α-淀粉酶的)和Fisher等，Plant Physiol.102：1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。

实施例

本发明在以下实施例中进行进一步描述，所述实施例作为例示提供，而并不意图以任何方式限制本发明。

实施例1

单细胞植物材料的制备

使用BY2细胞和NTl细胞两者。BY2细胞是非绿色的、快速生长的烟草细胞系。NTl细胞是自烟草分离的光合自养细胞。转化前3至4天，通过将2mlNTl或BY2培养物转移入250-mL烧瓶中40ml含有50nM DAS-PMTI-1(一种微管抑制剂)和0.5-0.1％(v/v)DMSO的NTlB或LSBY2培养基中来将1周龄悬浮培养物传代培养至新鲜培养基。在微管抑制剂处理后4天或7天时收集单细胞。经由Beckman流式细胞器处理所使用的BY2单细胞以对活细胞计数。有658250个活细胞/ml，其中直径均值为10.43um而体积为593.8μm³。如图1中可见的，所有细胞都是单细胞(图1中的对具有交叠的边缘)。使用附接至共焦成像***的微分干涉相差(DIC)显微镜来检查细胞(小图A)。小图B显示了来自用I2KI染色以突出显示质体(造粉体)的BY2细胞(EP 12％培养基驯化和维持的培养物)的单细胞的光学显微视野。如其中可见的，BY2细胞的单细胞包含遍及细胞的细胞质分布的大量质体(造粉体)。

图2，小图A描绘了极限培养基和5％二氧化碳中维持的具有显著叶绿体的光学显微镜烟草光合自养细胞(NTl)。通过转移1ml处于3.0OD⁶⁰⁰的悬浮液来以每14天传代培养这些细胞一次。图2，小图B显示了如在荧光显微镜下观察到的类似的NTl细胞，其中可以看到活性叶绿体自身发红色荧光。使用上文所描述的细胞类型作为供转化用的靶细胞。绿色细胞(NTl细胞)是追踪纳米颗粒进入叶绿体中的最佳细胞类型，因为它们在给定的簇中具有很少的细胞，而且是透明的。另外，细胞具有非常显著的能自身发红色荧光的叶绿体(如图2，小图B中可见的)。

实施例2

纳米颗粒制备和细胞处理

为了确定细胞在培养中是否摄入荧光染料，使用BY2细胞的单细胞和多细胞标准聚集体悬浮培养物。在没有纳米颗粒的情况中将细胞悬浮培养物暴露于来自MolecularProbes的SAMSA荧光素(5-((2-(和-3)-S-(乙酰疏基)琥珀酰)氨基)荧光素)20分钟，然后短暂清洗，之后在荧光显微镜下观察。

用SAMSA荧光素依照产品技术准则(在万维网上在probes.invitrogen.com/media/pis/mpOO685.pdf可获得)包被金纳米颗粒(GNP)。通过使用此后所描述的方法来制备金-荧光素偶联物。将1mg SAMSA荧光素在100μl 0.1M NaOH中溶解，并涡旋振荡15分钟以除去保护硫醇的乙酰基基团。然后将此活化的SAMSA与100μl 150nm金胶体(约109个颗粒/ml)混合。然后将所得的溶液温育1小时以确保反应的完成。然后添加50μL 1MHCI以中和溶液。以3000RPM将其离心30分钟，并除去上清液。将所获得的黄色沉淀物在200μL 0.1M PBS中重悬，产生橙色的溶液。重复此纯化步骤2次以确保除去游离的SAMSA荧光素。SAMSA附着至金的模式主要经由硫醇键合。由于有显著的静电排斥(SAMSA在pH＞7时是二价阴离子的)，认为SAMSA与金胶体表面垂直。颗粒在DIC和多光子共焦显微镜下观察时显示清楚的荧光而没有任何背景。将20和40μl的经包被的金纳米颗粒转移至500μlBY2/NTl烟草悬浮液或光合自养烟草细胞，并在黑暗中温育20分钟。

温育后，将细胞悬浮液的50μl等分试样在显微镜灌注载玻片上嵌入，并在显微镜下观察以追踪颗粒。另外，在20分钟温育后2-20小时时为显微观察制备样品的等分试样。

实施例3

BY2/NTl细胞聚集体中和单一光合自养烟草细胞的细胞核和质体中的经荧光素包被的纳米颗粒投递和积累

在低的和高的放大率下使用DIC、明视野、和荧光显微镜检查用单独的SAMSA荧光素和用经SAMSA荧光素包被的GNP处理的BY2/NT1悬浮聚集体。图3，小图A显示了用单独的SAMSA荧光素处理的细胞的DIC图像，而图3，小图B显示了同一细胞的荧光图像。图3，小图C显示了用经SAMSA荧光素包被的GNP处理的细胞的DIC图像，而图3，小图D显示了经SAMSA荧光素包被的GNP处理的细胞的荧光图像。如图3，小图B中清楚可见的，仅用荧光素染色的单独用SAMSA荧光素处理的细胞的细胞壁和极少的其它背景荧光是可见的。这指明细胞在没有纳米颗粒的情况中没有摄入SAMSA荧光素。

比较而言，将经SAMSA荧光素包被的GNP追踪入细胞和细胞核(Nu)中，如图3，小图D中所看到的。从DIC观察清楚的是，在细胞的所有区室(除液泡外)中找到经SAMSA荧光素包被的GNP。在细胞核区室外，沿液泡形成分界线的胞质丝也具有经SAMSA荧光素包被的GNP。纳米颗粒没有表现出已经在其穿过细胞壁的转运方面受到阻碍。如此，经SAMSA荧光素包被的GNP的积累似乎在共质体中，与质外体(连续体)形成对比。在高放大率下进一步检查经SAMSA荧光素包被的GNP处理的单细胞显示核仁中存在大量的GNP，而且表现出GNP优先在这些细胞器中积累(图4：小图B)。图4的小图A在不同焦点平面下显示了与小图B相同的核仁的明视野图像。

图5.显示了用经SAMSA荧光素包被的GNP处理的光合自养细胞。小图A显示了3-4个细胞簇中极透明的细胞，具有沿细胞壁内侧形成分界线的大叶绿体。小图B显示了叶绿体中的纳米颗粒积累。小图C和小图D显示了使用荧光显微镜得到的较高放大率的单一叶绿体。纳米颗粒在叶绿体的膜薄层中是可见的，并且散布于自身发红色荧光的叶绿素色素间。

如此，用明视野和荧光显微镜以实时进行的活的光合自养细胞追踪表明，纳米颗粒正在膜和叶绿体基质两者中积累。还可以在叶绿体的双膜腔中追踪颗粒。

虽然为了在叶绿体内追踪颗粒而完成的实验揭示颗粒表现出在质体中积累，但是由于分辨率不足难以通过使用光学显微镜在视觉上鉴定叶绿体被膜内的颗粒存在。如此，另外使用反射和荧光显微镜追踪颗粒，并合并图像以清楚定位颗粒，如图6中所看到的。图6的小图A显示了一幅反射图像，其中优先看到GNP。此图像不仅指明叶绿体中的纳米颗粒存在，而且还显示了叶绿体内纳米颗粒的大量积累，指明活动性摄入。小图B显示了自身发红色荧光的叶绿体的背景内的发荧光颗粒。小图C中显示了合并的反射和荧光图像，其中发黄色荧光的颗粒在叶绿体的边界内，确认质体中的颗粒存在。

实施例4

用于细胞核转化的附着有DNA的GNP投递

经由2种途径，即非特异性相互作用和特异性相互作用(使用PEG作为平台)合成经DNA包被的GNP，并与BY2/NT1细胞一起温育。对于非特异性相互作用，将9mL 3％甘露醇添加至1mL细胞悬浮液，然后以1000rpm离心5分钟。然后倒掉上清液，并将细胞在300μl 3％甘露醇中重悬。将50μl 150nm直径的金纳米颗粒(购自BBI International(EM.GC150))和50μg编码YFP的质粒DNA(pDAB3831)(图16)(SEQ.ID.NO.1和2)添加至重悬的细胞，并容许混合物温育20分钟。温育后，将20mL 3％甘露醇添加至溶液，并以1000rpm离心所得的混合物5分钟。然后倒掉上清液，并将细胞在3mL生长培养基中重悬。然后将重悬的细胞转移至微孔达至少48小时，之后转移至选择平板。对于特异性相互作用(PEG途径)，使用大大过量的硫醇配体等同物：100个单层/颗粒，其通过假设由单个硫醇分子所占据的表面积为约0.20nm来估计。使用此计算，将2mg SH-PEG(3)-OCH₃添加入柠檬酸盐GNP溶液中。于室温快速搅动混合物达20小时，在这期间溶液的颜色变得略微更黑。然后，将3个体积的THF添加至反应混合物，并于4℃以13Krpm离心所得的溶液30分钟。除去上清液，将沉淀物再次溶解入10mL超纯水(18MΩ.cm)中，添加30mLTHF，并实施在相同条件下的第二次离心。然后将沉淀物溶解入超纯水(18MΩ.em)中，并于室温保持。为了将质粒DNA包被至H₃CO-PEG-SH-GNP上以进行转化实验，将1mg纯化的质粒DNA在50ml水中于23°与10mg金颗粒一起温育2小时。(参见Tomey，F.等，Nature Nanotechnol.2，(2007))。

图7中描绘了一种可能的转化方案的图示。对于转化，使用质粒DNA，即包含YFP报告基因的pDAB3831。如上文所描述的那样处理BY2细胞，并在缓慢搅动的情况中将悬浮液在微孔板中温育48至72小时。自总共0.5-1ml混合物取出悬浮液的50μl等分试样，并在荧光显微镜下检查以观察报告基因的任何表达。用含有YFP报告基因的质粒转化的BY2细胞显示YFP的瞬时表达。

实施例5

用于细胞核转化的附着有DNA的PEG化量子点投递

用于细胞进入评估研究的QD的PEG功能化：自Dubertret B等，Science298，1759(2002)采用此方案。用.015g(5.5μmol)在氯仿中的PEG-PE(1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基-聚(乙二醇)])(Avanti脂质，产品目录编号880160)悬浮2mg经TOPO(三辛基氧化膦)包被的CdSe/ZnS QD(Ocean纳米技术，产品目录编号QSO0630-0010)，接着蒸发溶剂，并用水溶解。完成PEG偶联以确保有免于细胞毒性的完全保护。

QD与质粒DNA的偶联：于约60-70℃用4mg HS-PEG-OCH₃(Prochimia，产品目录编号TH 014-01)悬浮2mg经TOPO(三辛基氧化膦)包被的QD(Ocean纳米技术，产品目录编号QSO0630-0010)过夜。在真空炉中除去溶剂。然后将残余在1mL水(18M)中悬浮。通过将红色残余改变成橙色的、光学清澈的、透明溶液来实现最后的步骤。为了将质粒DNA包被至H₃CO-PEG-SH-QD上以进行转化实验，将0.02mg纯化的质粒DNA(pDAB 3831)在2ml水中于23°在黑暗中与所得的QD偶联物一起温育。(Tomey，F等，Nature Nanotechnol.2，(2007))。

QD与烟草完整细胞的温育：使用于25℃在LSBY2培养基中维持的嫩黄(BY2)烟草单细胞系来实施用细胞系进行的实验。通过IDM#64901中所概述的相同方法来生成这些单细胞系。将1-3μL/mL的浓度添加至24孔微量滴定板中的500μl细胞，并在摇瓶机上温和地旋转20分钟，之后分析细胞。

实施例6

荧光蛋白进入完整植物细胞中的纳米颗粒介导的转导和细胞内在化和潜在应用

用于测试蛋白质进入植物细胞中的纳米颗粒介导转导和细胞内在化的材料包括大小为150nm直径的金胶体(BBI International，GC150)、5-((2-(和-3)-S(乙酰巯基)琥珀酰)氨基)荧光素(SAMSA荧光素：Invitrogen，A-685)、大小为80和90nm的经羧酸包被的金胶体的纳米颗粒(TedPella，32019)、硫代-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)、EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亚胺盐酸盐)(Pierce Bitoechnology，24510，22980)、MES(2-[N-吗啉代]乙烷磺酸)(Fisher Scientific，AC32776-1000)、磷酸盐缓冲盐水缓冲液包(Sigma，P5368-10PAK)、带有组氨酸标签的GFP(Evrogen，激发最大值-482nm，发射最大值-502nm，FP611)、Turbo YFP(Evrogen，激发最大值-525nm，发射最大值-538nm，FP611)、和碘化丙啶(Sigma-P4864)、荧光素二乙酸酯(Sigma，F7378)。

细胞培养物(BY2-E烟草单细胞)：使用BY2细胞和NTl细胞两者。BY2/NTl细胞是非绿色的、快速生长的烟草细胞系。实验前3至4天，通过将2ml NTl或BY2培养物转移入250-mL烧瓶中40ml含有1μl DAS专有的MTI-1(PMTI-1)(一种微管抑制剂)、1-3％甘油、和0.5-0.1％(v/v)DMSO的NTlB或LSBY2培养基中来将1周龄悬浮培养物传代培养至新鲜培养基。在微管抑制剂处理后3.5天或7天时收集单细胞。经由Beckman流式细胞器处理所使用的BY2单细胞以对活细胞计数。有658250个活细胞/ml，其中直径均值为10.43um(体积为593.8μm³)-50.42um(体积为67079.05μm³)。PMTI-1处理后，这些培养物中的活细胞都是单细胞。使用附接至共焦荧光成像***的微分干涉相差(DIC)显微镜检查细胞。

纳米颗粒偶联物：合成金-荧光素偶联物、金-带有组氨酸标签的GFP偶联物、和金-YFP偶联物。

金-荧光素偶联物的合成：通过使用先前所描述的方法来制备金-荧光素偶联物(Cannone，F.，G.Chirico等(2006)，Quenching and Blinking ofFluorescence of aSingle Dye Molecule Bound to Gold Nanoparticles.J.Phys.Chem.B 110(33)：16491-16498.)。将1mg SAMSA荧光素在100μl 0.1M NaOH中溶解，并涡旋振荡15分钟以除去保护硫醇的乙酰基基团。将此活化的SAMSA与100μl 150nm金胶体(约10⁹个颗粒/ml)混合。然后将所得的溶液温育1小时以确保反应的完成。温育后，添加50μL 1M HCl以中和溶液。以3000RPM将其离心30分钟，并除去上清液。将所获得的黄色沉淀物在200μL0.1M PBS中重悬，产生橙色的溶液。重复此纯化步骤2次以确保除去游离的SAMSA荧光素。SAMSA附着至金的模式主要经由硫醇键合。由于有显著的静电排斥(SAMSA在pH＞7时是二价阴离子的)，认为SAMSA与金胶体表面垂直(Cannone等2006)。

金-带有组氨酸标签的GFP和金-YFP偶联物的合成：使用由Grabarek(Grabarek，Z.和J.Gergely(1990)，Zero-length cross linking procedure with theuse of activeesters.Analytical Biochemistry 185(1)：131-135))(其在两种蛋白质的序贯偶联方面进行例示)所描述的方案的略微改良来合成金-蛋白质偶联物。以3000RPM离心0.25ml 90nm经羧酸包被的金胶体溶液(约10⁹个颗粒/ml)达10分钟。倒掉上清液后，将红色沉淀物在1ml活化缓冲液(0.1M MES，0.5MNaCl，pH6.0)中悬浮。将0.4mg EDC和1.1mg硫代-NHS添加至此溶液，并于室温涡旋振荡15分钟。然后，添加9μl蛋白质(带有组氨酸标签的GFP或TurboYFP)，并且为了使蛋白质与金完全起反应，在黑暗中于室温温育所得的溶液2小时。通过寻找金胶体上存在的羧酸数目来确定此反应中所使用的金胶体与蛋白质的比率。首先，通过用1个金颗粒(球体假设)的表面积除以由一个羧基基团所占据的表面(0.20nm²Kimura，K.；Takashima，S.；Ohshima，H.Journal of Physical Chemistry B2002，106，7260-7266)来计算一个金胶体上存在的羧基基团数目。用此结果乘以所存在金胶体的总数来获得整个金胶体溶液中存在的羧基基团的总数。这等于给定量的蛋白质中存在的氨基基团数目。这些金胶体经由金上存在的羧酸与蛋白质上存在的氨基基团之间的酰胺键形成来附着至蛋白质(Grabarek，Z.和J.Gergely(1990).Zero-length crosslinkingprocedure with the use of active esters.Analytical Biochemistry 185(1)：131-135)。有大约127285个蛋白质分子与1个金纳米颗粒拴系在一起。

细胞处理--如下制备三种不同样品进行测试：

金摄入和细胞成活力的时间过程--在24孔无菌平板中制备以下样品：

i)500μl BY2-E单细胞(对照)；

ii)500μl BY2-E单细胞+20μl GNP+25μl荧光素二乙酸酯(FDA)+25μl碘化丙啶；和

iii)其它处理包括40、60、80μl GNP，其中细胞和细胞成活力染色如上文所提及的。在5、20、120分钟时及最后在18-20小时后在荧光显微镜下检查经处理的样品(Ref)。

金-SAMSA荧光素处理--在24孔无菌平板中制备以下样品：

i)500μl BY2-E单细胞(对照)；

ii)500μl BY2-E单细胞+20μl SAMSA-荧光素(对照)；和

iii)500μl BY2-E单细胞+20μl Au-SAMSA-荧光素。

在黑暗中于室温温育经处理的细胞20分钟，之后进行显微术研究。

金-带有组氨酸标签的GFP处理--在24孔无菌平板中制备以下样品：

i)500μl BY2-E单细胞(对照)；

ii)500μl BY2-E单细胞+10μl带有组氨酸标签的GFP(对照)；

iii)500μl BY2-E单细胞+20μl Au-带有组氨酸标签的GFP。

在黑暗中于室温温育经处理的细胞2小时，之后进行显微术研究。

显微术：使用Leica倒置荧光显微镜(DAS)实施用Au-SAMSA荧光素和Au-带有组氨酸标签的GFP进行的单细胞实验的相差和荧光显微术。以20X放大率实施所有实验。分别对SAMSA荧光素和GFP单细胞处理使用FITC(异硫氰酸荧光素)和GFP滤光片。

微分图像相差(DIC)、共焦和反射显微术：于UIUC(伊利诺伊大学厄本那-香槟分校(University of Illinois at Urbana Champaign))显微术中心在Zeiss倒置显微镜上实施这些研究。对于所有这些方法，将放大率保持在63X。对于共焦，对不同细胞处理使用FITC、GFP和YFP滤光片。对于反射研究，用透明玻璃载玻片替换分色镜，并取下发射滤光片。

图像获取：使用装备有与X-Cite 120照明***(Carl Zeiss Microimaging，Obercohen，德国)偶联的Apotome光学断层***的Zeiss Axiovert M 200显微镜使悬浮培养的烟草细胞成像。使用汞照明经由635/20激发滤光片在反射成像设置下使金颗粒成像，并使用IGS偏振滤光片装置(购自33001，ChromaTechnology Corp.，Rockingham，VT)来成像，所述IGS偏振滤光片装置由阻断UV的GG420玻璃、KG5(IR阻断物)、50/50分束器和激发和发射平行偏振镜组成。同时地，使用标准的DIC光学来获得DIC/透射光图像，并用带通FITC滤光片(HQ480/40激发滤光片，Q505LP分色镜和HQ535/50发射)获得GFP-经DNA包被的金颗粒中的GFP(带上假绿色)。使细胞在具有500微米厚度的分室的盖片设置(Grace Bio-labs，Bend，OR)中成等分试样以进行高分辨率成像。根据细胞大小用63x1.4NA平面复消色差物镜或用40x1.4NA平面复消色差物镜(购自Carl Zeiss Microimaging，Obercohen，德国)获得大多数图像。对每道(即DIC、反射和/或FITC)设置曝光时间，并使用与具有1388x1034像素维数的高分辨率Axiocam MRm单色照相机(购自Carl Zeiss，Obercohen，德国)偶联的AxioVision 4.6程序序贯曝光。在需要时，将分辨率设置在1024x1024，并以可能的最高速度获得图像的时滞顺序以在一段2-5分钟的时间里分辨由150-250左右帧构成的颗粒动力学。在AxioVision 4.6图库模块或Adobe Photoshop(Adobe Systems，San Jose，CA)中准备图像。

时间过程和GNP内在化研究：为了评估颗粒摄入和GNP浓度对细胞完整性(intactness)和成活力的影响，对与柠檬酸盐功能化的GNP(90nm直径)一起温育的BY2-E单细胞系实施时间过程实验。在此实验中使用多个浓度的GNP(20、40、60、80μl)。与细胞混合后5分钟内使颗粒内在化，而颗粒积累进行达2小时以显示细胞的胞质溶胶和细胞核中的水平升高。所测试的浓度中，用20μl处理观察到较高水平的细胞成活力和细胞活力，如通过FDA和PI(活细胞/死细胞染色)方案所研究的。在所有经处理的样品中，细胞的平均成活力接近98％，但是用所测试的最高浓度，在80μl处理中没有看到FDA染色的细胞核。然而，这些未染色的细胞核没有响应PI，如此指明没有细胞死亡。此结果指明，最高浓度的颗粒能以如下程度导致内部干扰，即细胞在处理后20小时后可以是静止的但仍然活着。

反射显微镜追踪研究：对用金蛋白质(GFP/YFP)偶联物处理的BY2/NTl烟草单细胞进行的反射研究显示细胞内部的金纳米颗粒的存在。这与未处理的对照BY2单细胞形成比较，所述对照BY2单细胞在类似条件下表现为黑暗，如图8中所显示的。观察到发射明亮反射的单一金纳米颗粒，如图8中所显示的。这是那些有壁的BY2细胞摄入金纳米颗粒的明确指标。

金-SAMSA荧光素实验：在DAS进行的相差实验揭示如与对对照单细胞观察到的银反差相比对经处理细胞的胞内空间和细胞核的嫩黄染色。还有，在许多细胞中，在质壁分离的条件下，质膜使自身退离细胞壁，留下在中间空间，指明细胞的部分或完全质壁分离，如图9中所显示的。在用单独的SAMSA荧光素处理的单细胞的共焦荧光实验下观察时，此类细胞在细胞质和细胞核中显示荧光，而它在未处理的对照细胞中表现为黑暗。还有，用单独的SAMSA荧光素染料处理的细胞显示一些壁荧光，但是不在细胞内部。这意味着SAMSA荧光素没有被细胞主动内在化，而且金纳米颗粒起得作用就像供其摄入用的载体。

金-带有组氨酸标签的GFP实验：为了建立经由GNP向完整细胞进行蛋白质投递，我们使用荧光显微术确认GFP附着至GNP，如图10中所显示的。用带有组氨酸标签的GFP处理的BY2细胞的荧光图像显示细胞外荧光，在中央黑暗的细胞没有荧光。这指明在没有Au颗粒的情况中向细胞添加带有组氨酸标签的GFP的对照处理中不使颗粒内在化。支持细胞内部摄入蛋白质的证据为：i)随着细胞内在化经处理的细胞中的荧光的荧光强度升高，ii)如与对照细胞中的黑暗丝相比经处理的细胞中的发荧光的胞质丝(参见图11)。用与YFP拴系在一起的GNP进行类似的观察，指明这些荧光蛋白进入具有完整细胞壁的植物细胞中的清楚的内在化(参见图12)。

在质壁分离/死亡方面固有的单细胞或显示程序性细胞死亡(PCD)样细胞学特性的细胞中有某种水平的背景反射和自身荧光。为了自此类背景问题描绘已经使蛋白质内在化的细胞并用直接的证据明确证明蛋白质内在化，实施广泛的反射显微镜调查以聚焦和追踪单个颗粒或颗粒聚集体水平。此研究的结果清楚显示了细胞和细胞核内部的具有蛋白质的颗粒的内在化。然而，积累数目增加的具有荧光蛋白的颗粒的细胞在显微镜下观察时具有质壁分离的趋势。有可能的是，由于与GFP或YFP拴系在一起的高GNP积累引起的蛋白质浓度增加达到毒性水平，或者在显微镜下延长的观察诱导ROS，继而其在此类细胞中具有有害效果。

实施例7

对转基因在拟南芥哥伦比亚栽培种（Arabidopsis thaliana cv Columbia)的Tl后代中的基因组整合的分子分析和校对

使用DNeasy植物迷你试剂盒依照制造商的指令(Qiagen Inc)自6周龄的总体叶材料提取来自拟南芥转基因植物的基因组DNA。在使用来自耐受4-5XFinale除草剂耕地水平喷雾的T1幼苗的模板基因组DNA的PCR反应中使用下列YFP和PAT PCR引物。

YFP

正向引物：5’-TGTTCCACGGCAAGATCCCCTACG-3’(SEQ.ID.NO.3)

反向引物：5’-TATTCATCTGGGTGTGATCGGCCA-3’(SEQ.ID.NO.4)

PAT

正向引物：5’-GGAGAGGAGACCAGTTGAGATTAG-3’(SEQ.ID.NO.5)

反向引物：5’-AGATCTGGGTAACTGGCCTAACTG-3’(SEQ.ID.NO.6)

在总反应体积50μL混合物中扩增PAT和YFP(黄色荧光标签，Evrogen)基因产物的PCR，所述50μL混合物含有100ng基因组模板DNA、1x ExTaq反应缓冲液(TaKaRa Bio)、0.2mMdNTP、10pmol每种引物、和0.025个单位/μLExTaq。使用下列PCR条件：1轮于96℃达5分钟和31轮以下PCR程序：94℃，15秒：65℃，30秒；72℃，1分钟，并于72℃实施最终的延伸达7分钟以完成产物合成。使用Bio Rad凝胶成像***来获得凝胶图像。(图13和图14)。使用凝胶纯化试剂盒(Qiagen Inc)依照制造商的指令对所扩增的片段进行凝胶纯化。使用先进的Sanger测序技术(MWG Biotechnologies，Inc)使用PAT正向引物和YFP反向引物来对PCR片段测序，并使用Sequencher软件来分析序列。

结果显示，经由纳米颗粒和量子点介导的DNA投递来投递PAT和YFP序列，如此提供了转基因在T1植物基因组DNA中的稳定基因组整合的清楚证据。

实施例8

QD穿过JTNTl烟草单细胞壁的易化投递

基于实施例7中所讨论的规程来对数种肽进行表面功能化以测试QD穿过细胞壁的非侵入性投递。经由凝胶电泳来实施细胞穿透肽(CPP)/蛋白质转导单元(PTD)附着确定，如下文所描述的。

对QD-肽偶联物实施凝胶电泳以确认肽附着至QD。所使用的样品是QD-胺(对照)、QD-胺-R9、QD-胺-玉米醇溶蛋白、QD-胺-Pepl和QD-胺-MPG。R9、玉米醇溶蛋白、Pepl和MPG是肽。以120V在TBE(1X，pH8)缓冲液中运行2％(w/v)琼脂糖凝胶达1小时。QD-胺-肽朝着电极的负端迁移，显示附着至QD的肽的带强烈正电特性的附着，而QD-胺保持静电的，显示氨基基团带弱正电荷，这是由于处于碱性pH的凝胶缓冲液的中和效果，如图15中所显示的(第1道；QD-胺；2：QD胺-R9；3：QD-胺-γ-玉米醇溶蛋白；4：QD胺-Pepl；5：QD-胺-MPG)。

对肽测试进入细胞中的内在化，并使用QD在细胞内部的发射作为追踪颗粒在细胞和区室内部的内在化水平的措施。在这些实验中使用具有完整壁的JTNTl单细胞作为靶细胞。表1显示了样品的处理。在显微镜下追踪细胞。

在制备样品后1分钟内在转盘式共焦显微镜(Andor TechnologyRevolutionSystem)上实施显微术。将激发滤光片设置在488nm，而将发射滤光片设置超过650nm。

如表1中所显示的，对照原生质体和JTNTl在对QD使用的发射波长处没有显示自身荧光。在这些的每一种样品中观察到相当数量的碎片(破碎的细胞部分)。样品4、5、6、和7没有显示单细胞或原生质体内部的QD内在化。样品8和9指明有壁的单细胞和原生质体两者中的细胞核周围的QD的清楚存在。这是由于QD上具有核定位信号(NLS)的细胞穿透肽的存在。然而，样品号6和7具有与QD拴系在一起的y-玉米醇溶蛋白，没有显示细胞内部的QD内部化。这指明QD由于细胞穿透肽(CPP)或蛋白质转导单元(PTD)而被吸入细胞中，y-玉米醇溶蛋白由于仅用胺而非CPP/PTD功能化的QD而没有被内在化。

表1

功能化类型所使用的单细胞功能化的QD 自身荧光细胞中的

类型(100ul) 体积 480-650nm QD定位

QD-PEG-胺- NA烟草JTNTl 20ul 无 NA

1对照-1

2原生质体-对原生质体烟草 0ul 无 NA

照-2 JTNTl

3单细胞(对照有壁的单细胞烟 0ul 无 NA

-3) 草JTNTl

4QD-PEG-胺原生质体烟草 20ul 无 NA

JTNTl

5QD-PEG-胺有壁的单细胞 20ul 无 NA

草JTNTl

6QD-PEG-胺- 原生质体烟草 20ul 无 NA

玉米醇溶蛋白 JTNTl

7QD-PEG-胺- 有壁的单细胞烟 20ul 无 NA

玉米醇溶蛋白草JTNTl

8QD-胺-y-玉米原生质体烟草 20ul 无 NA

醇溶蛋白 JTNTl

9QD-胺-y-玉米有壁的单细胞 20ul 无 NA

醇溶蛋白

此数据证明与具有核定位信号(NLS)的CPP/PTD拴系在一起的量子点的细胞内在化的证据，经由转盘式共焦显微镜(Andor Technology RevolutionSystem)拍摄穿过完整功能细胞的细胞壁的QD。在样品9中和在没有细胞壁的情况中QD穿过细胞壁的细胞核定位是有可能，如经由酶处理消除细胞壁的基于原生质体的细胞内在化所看到的。如此，细胞壁的略微存在并不阻碍量子点的内在化，证明在具有完整细胞壁的植物细胞中用CPP/PTD非侵入性地演示颗粒进入。

虽然本发明已经在某些实施方案中进行了描述，但是可以在本公开内容的精神和范围内进一步修饰本发明。因此，本申请意图覆盖使用其一般原理的本发明的任何变型、用途、或改编。此外，本申请意图覆盖诸如在本发明所属领域中的已知或习惯实践内和落入所附权利要求书和其等同方案内的本公开内容的偏离。

<110>陶氏益农公司(DOW AGROSCIENCES LLC)

Samuel，Jayakumar P

Dixit，Suraj K

Zettler，Mark W

Burroughs，Frank

<120>用于将分子物质转移入植物细胞中的方法

<130>2971-8455.1US(65502)

<150>US 60/978,05

<151>2007-10-05

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>8448

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pDAB3831

<400>1

ggccgctaaa cccagaaggt aattatccaa gatgtagcat caagaatcca atgtttacgg 60

gaaaaactat ggaagtatta tgtaagctca gcaagaagca gatcaatatg cggcacatat 120

gcaacctatg ttcaaaaatg aagaatgtac agatacaaga tcctatactg ccagaatacg 180

aagaagaata cgtagaaatt gaaaaagaag aaccaggcga agaaaagaat cttgaagacg 240

taagcactga cgacaacaat gaaaagaaga agataaggtc ggtgattgtg aaagagacat 300

agaggacaca tgtaaggtgg aaaatgtaag ggcggaaagt aaccttatca caaaggaatc 360

ttatccccca ctacttatcc ttttatattt ttccgtgtca tttttgccct tgagttttcc 420

tatataagga accaagttcg gcatttgtga aaacaagaaa aaatttggtg taagctattt 480

tctttgaagt actgaggata caacttcaga gaaatttgta agtttgtaga tctccatggg 540

ctccagcggc gccctgctgt tccacggcaa gatcccctac gtggtggaga tggagggcaa 600

tgtggatggc cacaccttca gcatccgcgg caagggctac ggcgatgcca gcgtgggcaa 660

ggtggatgcc cagttcatct gcaccaccgg cgatgtgccc gtgccctgga gcaccctggt 720

gaccaccctg acctacggcg cccagtgctt cgccaagtac ggccccgagc tgaaggattt 780

ctacaagagc tgcatgcccg atggctacgt gcaggagcgc accatcacct tcgagggcga 840

tggcaatttc aagacccgcg ccgaggtgac cttcgagaat ggcagcgtgt acaatcgcgt 900

gaagctgaat ggccagggct tcaagaagga tggccacgtg ctgggcaaga atctggagtt 960

caatttcacc ccccactgcc tgtacatctg gggcgatcag gccaatcacg gcctgaagag 1020

cgccttcaag atctgccacg agatcaccgg cagcaagggc gatttcatcg tggccgatca 1080

cacccagatg aataccccca tcggcggcgg ccccgtgcac gtgcccgagt accaccacat 1140

gagctaccac gtgaagctga gcaaggatgt gaccgatcac cgcgataata tgagcctgaa 1200

ggagaccgtg cgcgccgtgg attgccgcaa gacctacctg tgagagctcg catgcggtca 1260

ccaaaccttg gactcccatg ttggcaaagg caaccaaaca aacaatgaat gatccgctcc 1320

tgcatatggg gcggtttgag tatttcaact gccatttggg ctgaattgaa gacatgctcc 1380

tgtcagaaat tccgtgatct tactcaatat tcagtaatct cggccaatat cctaaatgtg 1440

cgtggcttta tctgtctttg tattgtttca tcaattcatg taacgtttgc ttttcatatg 1500

aattttcaaa taaattatcg cgatagtact acgaatattt cgtatcgctg atcttctcaa 1560

tcacaatgat gcgtagtgac ccgacaaata atttaagcgt ccttaatacc aatcctaaaa 1620

taattgaggc aaataaaatt tttttgtaat ttttatgata gcagatcgat tctccagcaa 1680

gcctgcaaca aaatattgtg tatttctaaa tagattttga tattaaaatc ccgagaaagc 1740

aaaattgcat ttaacaaaac agtaatttag tacattaata aaaattatgc tcggccggcc 1800

gcggccgctt aattaaattt aaatgtttaa accccgcctg caggtcaacg gatcaggata 1860

ttcttgttta agatgttgaa ctctatggag gtttgtatga actgatgatc taggaccgga 1920

taagttccct tcttcatagc gaacttattc aaagaatgtt ttgtgtatca ttcttgttac 1980

attgttatta atgaaaaaat attattggtc attggactga acacgagtgt taaatatgga 2040

ccaggcccca aataagatcc attgatatat gaattaaata acaagaataa atcgagtcac 2100

caaaccactt gcctttttta acgagacttg ttcaccaact tgatacaaaa gtcattatcc 2160

tatgcaaatc aataatcata caaaaatatc caataacact aaaaaattaa aagaaatgga 2220

taatttcaca atatgttata cgataaagaa gttacttttc caagaaattc actgatttta 2280

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ccaaattttt tcttgttttc acaaatgccg aacttggttc cttatatagg aaaactcaag 8040

ggcaaaaatg acacggaaaa atataaaagg ataagtagtg ggggataaga ttcctttgtg 8100

ataaggttac tttccgccct tacattttcc accttacatg tgtcctctat gtctctttca 8160

caatcaccga ccttatcttc ttcttttcat tgttgtcgtc agtgcttacg tcttcaagat 8220

tcttttcttc gcctggttct tctttttcaa tttctacgta ttcttcttcg tattctggca 8280

gtataggatc ttgtatctgt acattcttca tttttgaaca taggttgcat atgtgccgca 8340

tattgatctg cttcttgctg agcttacata atacttccat agtttttccc gtaaacattg 8400

gattcttgat gctacatctt ggataattac cttctgggtt tagcggcc 8448

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于YFP的正向引物

<400>3

tgttccacgg caaga tcccc tacg 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于YFP的反向引物

<400>4

tattcatctg ggtgtgatcg gcca 24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于PAT的正向引物

<400>5

ggagaggaga ccagt tgaga ttag 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于PAT的反向序列

<400>6

agatctgggt aactggccta actg 24

Claims

1.将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，该方法包括：

提供具有细胞壁的植物细胞；

用微管抑制剂处理植物细胞；

用感兴趣的核酸分子包被纳米颗粒，其中所述纳米颗粒是金纳米颗粒或量子点；

用亚细胞区室靶向蛋白包被所述纳米颗粒；

使所述具有细胞壁的细胞和所述经包被的纳米颗粒放置得彼此接触；并

容许所述纳米颗粒和所述感兴趣的分子向所述包含细胞壁的细胞中的摄入。

2.依照权利要求1的方法，其中用感兴趣的核酸分子包被的纳米颗粒包括经由非共价吸收来将所述感兴趣的分子固定化在所述纳米颗粒的表面上。

3.依照权利要求1的方法，其进一步包括将所述感兴趣的核酸分子吸收入所述纳米颗粒中。

4.依照权利要求1的方法，其进一步包括容许所述纳米颗粒向所述包含细胞壁的植物细胞的区室中的摄入。

5.依照权利要求1的方法，其中亚细胞区室靶向蛋白将所述纳米颗粒靶向至质体。

6.依照权利要求1的方法，其中所述包含细胞壁的植物细胞选自下组：烟草、胡萝卜、玉米、芸苔、油菜籽、棉、棕榈、花生、大豆、稻、拟南芥、蓖麻、和甘蔗细胞。

7.依照权利要求1的方法，其中所述植物细胞来自选自下组的组织：胚、分生组织、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、花、种子、荚果和茎。

8.依照权利要求1的方法，其进一步包括使所述纳米颗粒表面衍生化。

9.依照权利要求1的方法，其中所述感兴趣的核酸分子包含基因。

10.依照权利要求9的方法，其中所述基因是外来蛋白质基因、农学基因、或标记基因。

11.依照权利要求1的方法，其进一步包括选择已经稳定整合所述感兴趣的核酸分子的细胞。

12.依照权利要求11的方法，其中所述选定的细胞是可再生细胞。

13.依照权利要求12的方法，其进一步包括自所述可再生细胞再生植株。

14.一种将感兴趣的分子导入具有细胞壁的细胞的方法，该方法包括：

提供具有细胞壁的植物细胞；

用感兴趣的核酸分子包被纳米颗粒，所述纳米颗粒是量子点；

用能够将所述纳米颗粒靶向到亚细胞区室的蛋白质包被所述纳米颗粒，

使所述具有细胞壁的植物细胞和所述经包被的纳米颗粒放置得彼此接触；并

容许所述纳米颗粒和所述感兴趣的分子向所述包含细胞壁的植物细胞中的摄入。

15.依照权利要求14的方法，其中用感兴趣的分子包被纳米颗粒包括经由非共价吸附来将所述感兴趣的分子固定化在所述纳米颗粒的表面上。

16.依照权利要求14的方法，其进一步包括将所述感兴趣的分子吸附入所述纳米颗粒中。

17.依照权利要求14的方法，其中亚细胞区室靶向蛋白将所述纳米颗粒靶向至质体。

18.依照权利要求14的方法，其中所述包含细胞壁的植物细胞选自下组：烟草、胡萝卜、玉米、芸苔、油菜籽、棉、棕榈、花生、大豆、稻、拟南芥、蓖麻、和甘蔗细胞。

19.依照权利要求14的方法，其中所述植物细胞来自选自下组的组织：胚、分生组织、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果和茎。

20.依照权利要求14的方法，其进一步包括使所述纳米颗粒表面衍生化。

21.依照权利要求14的方法，其中所述感兴趣的核酸分子包含基因。

22.权利要求21的方法，其中所述基因是外来蛋白质基因、农学基因、或标记基因。

23.权利要求14的方法，其进一步包括选择已经稳定整合所述感兴趣的分子的细胞。

24.权利要求23的方法，其中所述选定的细胞是可再生细胞。

25.权利要求24的方法，其进一步包括自所述可再生细胞再生植株。