KR100832740B1

KR100832740B1 - 분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법

Info

Publication number: KR100832740B1
Application number: KR1020070005268A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 박진환; 이광호; 김태용
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2007-01-17
Filing date: 2007-01-17
Publication date: 2008-05-27
Also published as: JP4790025B2; US20090053779A1; WO2008088104A1; EP2038403A1; US8148137B2; JP2009521960A; EP2038403A4

Abstract

본 발명은 분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시키고, L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 그 발현이 증가되도록 변이시켜 수득된 L-발린 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 L-발린의 제조방법에 관한 것이다.

부위특위적 돌연변이 방법과 대사흐름 조작에 의해 수득된 본 발명에 따른 변이 미생물은 분지쇄 아미노산, 특히, L-발린을 고효율로 생성할 수 있어, L-발린의 산업적 생성 미생물로 유용하다.

부위특위적 돌연변이화, 분지쇄 아미노산, L-발린, 대장균

Description

분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법 {Mutant Microorganism with Improved Productivity of Branched Amino Acid and Method for Preparing It Using the Same}

도 1은 대장균 야생균주 W3110으로부터 목적유전자만을 조작하여 L-발린 생성 미생물을 제작하고, 상기 생성 미생물에 결실 대상 유전자의 결실을 도입하는 과정을 나타낸 것이다.

도 2는 대장균 L-발린 생성 미생물로부터 aceF, mdh 및 pfkA 유전자를 결실시킨 변이 미생물 VAMF의 대사회로를 나타낸 것이다.

도 3은 sacB homologous recombination vector pSacHR06의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 4는 ilvBNCED 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pKBRilvBNCED의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 5a 내지 도 5b는 인실리코 시뮬레이션 결과를 나타낸 것으로, 도 5a는 첫 번째 유전자 결실에 따른 세포 성장속도와 L-발린 생성속도와의 관계, 도 5b는 두 번째 유전자 결실에 따른 세포 성장속도와 L-발린 생성속도와의 관계 및 도 5c는 세 번째 유전자 결실에 따른 세포 성장속도와 L-발린 생성속도와의 관계를 도시한 것이다.

도 6은 ygaZH 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pTrc184ygaZH의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 7은 lrp 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pTrc184lrp의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 8은 ygaZH 유전자와 lrp 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터 pTrc184ygaZHlrp의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

현재 대부분의 아미노산이 무작위 돌연변이화 기법으로 제조된 미생물에 의 해 생성되고 있는데, 이들 균주는 정확한 생리대사 특성의 파악이 어려워, 추가 균주 개량이 까다롭다는 단점이 있다. 이에, 특정 유전자만을 결실 또는 증폭하여 필요한 아미노산을 생성하게 하는 rational design 기법이 요구되고 있다.

한편, 분지쇄 아미노산(Branched Chain Amino Acid)이란, 9종의 필수아미노산 중 발린, 류신 및 이소류신의 3종을 지칭하는 것으로, 대부분의 아미노산이 간장에서 대사되는데 비해, 분지쇄 아미노산은 주로 근육에서 대사되어 활동시에 에너지원으로서 이용되는 아미노산을 말한다.

현재 분지쇄 아미노산의 시장 점유율은 전체 아미노산 시장의 약 1%에 불과 하지만, 최근 분지쇄 아미노산이 활동시 근육의 유지 및 증량에 중요한 역할을 한다고 알려지면서 매우 빠른 속도로 증가하고 있다. 특히 L-발린의 경우 높은 환원력을 지니고 있어, 모돈의 비유 능력을 높인다고 알려지면서, 사료 성분으로 유용하게 쓰이고 있다. 현재까지 대부분의 L-발린은 Brevibacterium, Corynebacterium 또는 Serratia 등의 균주로부터 생성되어 왔으나, 최근 배양이 용이하고, 분자생물학적 기술이 발달한 대장균에서의 생성이 보고되고 있다. 특히, 일본 아지노모토 사에서는 무작위 돌연변이화 기법으로 L-발린에 내성을 갖는 균주를 선별하여 23.4g/ℓ의 L-발린 생성을 보고하였다 (US 6,737,255).

또한, rational design 방법에 의한 L-발린 생성 미생물 제조가 최근 Corynebacterium glutamicum에서 보고 되었는데, 두 개의 유전자(ilvA, panB)를 결실시키고, L-발린 생합성에 관여하는 오페론(ilvBNC)을 증폭한 후, ilvN 유전자에 존재하는 feedback inhibition을 제거하여 130mM의 L-발린을 생성하였다는 내용이 발표되었다 (Veronika et al., Appl. Environ. Microbiol., 71:207, 2005). 그러나 아직까지 대장균을 이용하여 rational design 방법으로 L-발린을 생성한 예는 보고된 바 없다.

다양한 rational design 방법 중 인실리코 시뮬레이션 방법, 특히 대사회로를 통한 분석 및 예측기술은 최근에야 급속하게 증가하는 게놈정보와 함께 그 가능성을 보이고 있다. 특히 각 미생물의 대사회로 모델들이 수학적 모델 및 최적화 기술 등과 결합되어 유전자의 제거 또는 추가 후에 일어나는 대사회로의 반응을 예측하는 것이 가능해지고 있다. 또한 대사회로를 이용한 대사흐름분석기법은 동적 정보를 필요로 하지 않음에도 세포의 이상적인 대사흐름을 보여주며 실제적으로 세포의 행동을 정확히 모사하고 예측할 수 있는 것으로 알려져 있다. 대사흐름분석은 생화학 반응식의 질량수지와 세포조성 정보만을 이용하여 세포가 도달 가능한 이상적인 대사 흐름 공간을 구하며 특정한 목적함수를 최적화 방법을 통하여 최대화 하거나 최소화 하는 것을 목적으로 한다 (세포성장속도 최대화 또는 특정 섭동에 의한 대사 조절의 최소화 등). 그밖에 대사흐름분석은 일반적으로 균주개량을 통하여 원하는 대사산물의 특정 유전자의 치사성을 확인하기 위하여 사용될 수 있으며, 이를 이용하여 균주내부의 대사회로 특성을 파악할 수 있다. 또한, 유전자의 제거 또는 추가에 의해 일어나는 대사회로의 흐름변화 등을 예측하기 위해 대사흐름분석 방법을 응용한 다양한 연구가 보고되고 있다.

따라서, 당업계에서는 기존의 무작위 돌연변이화 기법과 달리, 특정 유전자의 결실로 인한 대사회로 재구성 및 필요 유전자의 증폭을 통한 rational design 방법에 의해 분지쇄 아미노산의 고생성능을 갖는 미생물, 특히, L-발린 고생성능을 갖는 대장균의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 rational design 방법에 의해 분지쇄 아미노산, 특히, L-발린 고생성능을 갖는 미생물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, L-발린 생합성 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환하고, 상기 치환된 promoter를 포함하는 오페론을 재조합 벡터에 삽입한 다음, 경쟁 pathway에 관여하는 유전자들인 ilvA, leuA 및 panB 등이 결실된 대장균에 도입하여 고 효율의 L-발린 생성능이 획기적으로 증가하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 L-발린 고생성능 변이 미생물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 미생물을 이용한 L-발린의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실 시키고, L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 변이시키는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제작된 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 상기 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대장균인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있고, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 leuA(2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있으며, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 그 발현이 증가되도록 변이시키는 것은 (a) lacI(lac operon repressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) ilvH(acetohydroxy acid synthase isozyme III) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition) 제거; (c) ilvGMEDA(acetohydroxy acid synthase isozyme I) 및 ilvBN(Acetohydroxy acid synthase isozyme II) 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환; 및 (d) strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvN, ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 발현벡터는 pKBRilvBNCED 벡터인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, tpiA, sdhA, sdhB, sdhC, sdhD, fumA, fumB, fumC, eptB, gpmA, gpmB, ptsG, mdh, ppc, pgi, glgC, sucA, sucB, ribA, folE 및 ackA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 추가로 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 aceF 및 pfkA 유전자를 추가로 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 aceF, pfkA 및 mdh 유전자를 추가로 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자는 서열번호 43 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상이거나, 서열번호 45의 염기서 열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, global regulator인 lrp 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 lrp 유전자는 서열번호 46의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제작되고, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되고, L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 변이된 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) ilvA, leuA 및 panB가 약화 또는 결실; (b) lacI 유전자가 결실; (c) ilvH 유전자의 피드백 저해가 제거; (d) ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (e) ilvB, ilvN, ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; 및 (f) 서열번호 45의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물은 서열번호 46의 lrp 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) ilvA, leuA 및 panB가 약화 또는 결실; (b) lacI 유전자가 결실; (c) ilvH 유전자의 피드백 저해가 제거; (d) ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론 의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (e) ilvB, ilvN, ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; 및 (f) aceF 및 pfkA 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물은 서열번호 45의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 서열번호 46의 lrp 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) ilvA, leuA 및 panB가 약화 또는 결실; (b) lacI 유전자가 결실; (c) ilvH 유전자의 피드백 저해가 제거; (d) ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (e) ilvB, ilvN, ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; 및 (f) aceF, pfkA 및 mdh 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 L-발린 생성 고생성능을 가지는 변이 미생물를 배양한 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 L-발린을 회수하는 것을 특징으로 하는 L-발 린의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물(Val)은 도 1에 나타난 바와 같이, 대장균 야생균주 W3110으로부터 L-발린 생합성에 관여하는 효소의 활성을 증가시키고, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소, L-루신 생합성에 관여하는 효소 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소의 활성을 약화 또는 결실 시켜 제조한다. 즉, L-발린 생합성 오페론의 native promoter를 strong promoter로 치환하고, L-발린 생합성경로와 경쟁관계에 있는 pathway에 관여하는 유전자인 ilvA, leuA 및 panB 등을 결실하여 제작한다.

또한, 상기 제작된 변이 미생물의 L-발린 생성능을 향상시키기 위하여, 추가로 결실 대상 유전자를 선정하여 제작한 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물(VAMF)은 도 1에 나타난 바와 같이 대장균 변이균주 Val으로부터 aceF, mdh 및 pfkA를 결실시켜 제작한다.

현재, 대부분의 아미노산 생성 미생물가 무작위 돌연변이, 또는 생합성 경로의 말단 효소의 증폭등으로 제조되고 있다. 이와 같은 방법은 각각, 생성 미생물에 해당 아미노산의 내성을 부여하고, 생합성 효소의 농도를 높임으로서 아미노산 생성효율을 높이는 효과를 갖는다. 그러나, 아미노산 생합성에 필요한 전구체의 확보(precursor availability)에 한계가 있기 때문에 일정 수준 이상의 생성능 확보가 불가능하다. 이에, 본 발명에서는 L-발린의 전구체 확보를 용이하게 하기 위 해서 세포내 대사흐름을 조절함으로써 고생성능의 L-발린 생성 미생물를 제조할 수 있었다. 세포내 대사흐름을 최적화하기 위해서 in silico simulation 방법을 이용하여 pyruvate dehydrogenase를 코딩하는 유전자(aceF), malate dehydrogenase를 코딩하는 유전자(mdh), phosphofructokinase를 코딩하는 유전자(pfkA)등을 결실 대상 유전자로 선정하였다. 도 2는 상기와 같이 제작된 aceF, mdh 및 pfkA 유전자를 결실시킨 변이 미생물 VAMF의 대사회로를 나타낸 것이다.

또한, 아미노산의 엑스포터(exporter)는 해당 아미노산의 생산에 필수적이며, 특히 L-발린의 경우 대장균이 기타 균주에 비해 charge율이 매우 낮기 때문에, 생산능력을 높이기 위해서는 exporter의 증폭이 요구된다. 그러나 현재 대장균의 L-발린 exporter가 아직 밝혀져 있지 않아서 L-발린 생산효율 향상에 한계가 있었다.

Nicole Kennerknecht 등은 Corynebacterium glutamicum에서 L-발린을 비롯한 분지쇄 아미노산의 엑스포터(exporter) 역할을 하는 단백질(BrnFE)을 보고하였다 (Nicole et al., J. Bacteriol., 184:3947, 2002, US 6,841,360 B2). 또한, Ekaterina Alexsandrovna Tabolina 등은 상기 상동 단백질이 대장균에서도 L-발린의 엑스포터 역할을 하는 것을 보고하였다 (US Patent 2005/0239175).

본 발명자들은 상기 L-발린 엑스포터를 본 발명에서 제조한 L-발린 생성 변이균주에서 확인하기 위하여, YgaZH 단백질을 암호화하는 ygaZH operon을 클로닝 하였다. 즉, 대장균의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 대장균 유전체서열에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 ygaZH 오페론을 증폭시켰다. 상기 증폭된 ygaZH 유전자를 NcoI/KpnI로 절단하고, pTrc99A 발현벡터에 클로닝하여 pTrc99AygaZH를 제작하고, 상기 pTrc99AygaZH 벡터를 BspHI/EcoRV로 절단하여 수득한 유전자 조각을, 동일 효소(BspHI/EcoRV)로 절단한 pACYC184에 삽입하여 ygaZH 유전자를 과발현시키기 위한 발현벡터인 pTrc184ygaZH를 제작하여, 이를 상기 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물(Val+pKBRilvBNCED)에 도입한 경우, Ekaterina Alexsandrovna Tabolina 등이 제안했던 수준 보다 L-발린의 생성능이 월등히 증가하는 것을 확인했다.

또한, global regulator인 Lrp가 L-발린 생합성의 중요한 아이소엔자임 중의 하나인 acetohydroxyacid synthase III 효소를 코딩하는 ilvIH operon의 발현을 촉진한다는 사실(Platko et al., J. Bacteriol., 172:4563??4570. 1990)과 L-발린의 흡수에 관여하는 트랜스포터를 코딩하는 livJ 유전자의 발현을 억제한다는 사실(Haney et al., J.Bacteriol., 174:108-115. 1992)에 기반하여 본 발명자들은 lrp 유전자의 증폭이 L-발린의 생성능을 증가시킬 것으로 예상하고 lrp 유전자를 클로닝 하였다. 즉, 대장균의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 대장균 유전체서열에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 lrp 유전자를 증폭시켰다. 상기 증폭된 lrp 유전자를 NcoI/KpnI로 절단하고, pTrc99A 발현벡터에 클로닝하여 pTrc99Alrp를 제작하고, 상기 pTrc99Alrp 벡터를 BspHI/EcoRV로 절단하여 수득한 유전자 조각을, 동일 효소(BspHI/EcoRV)로 절단한 pACYC184에 삽입하여 lrp 유전자를 과발현시키기 위한 발현벡터인 pTrc184lrp를 제작하여, 이를 상기 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물(Val+pKBRilvBNCED)에 도 입한 경우, L-발린의 생성능이 증가하는 것을 확인했다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

하기 실시예에서는 대장균 W3110 유래의 L-발린 생성 미생물에 결실 대상 유전자를 도입하여, 분지쇄 아미노산 중, L-발린을 고농도로 제조하는 방법에 대하여 기재하였으나, 다른 대장균 및 미생물을 사용하여 동일 결실 대상 유전자를 도입하고, 이를 이용하여 L-발린을 제조하는 것과, L-발린이 아닌 L-류신 및 L-이소류신을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 대장균 W3110으로부터 분리 및 정제된 ygaZH를 이용하여, 분지쇄 아미노산 중, L-발린을 고농도로 제조하는 방법 및 ygaZH를 함유하는 벡터 제조방법에 대하여 기재하였으나, 다른 대장균을 사용하여 L-발린 엑스포터를 분리 및 정제하고, 이를 이용하여 L-발린을 제조하는 것과, L-발린이 아닌 L-류신 및 L-이소류신을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 대장균 유래 L-발린 엑스포터(exporter) 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 대장균 W3110에 기반하여 제조된 L-발린 생성 미생물(WLGBHABA+pKBRilvBNCED)에 도입하여 형질전환 미생물을 제조하는 방법 및 L-발 린을 수득하는 방법에 대하여만 기재하였으나, 본 발명의 재조합 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택된 L-발린 생성능을 가지는 숙주세포에 도입하여 제조되는 형질전환된 미생물 및 이로부터 L-발린을 수득하는 것도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이(Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41, 2001), 유청(whey), CSL(corn steep liguor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: L-발린 고생성 변이 미생물의 제작 및 L- 발린의 생성능 측정

1-1: L-발린 고생성 미생물의 제작

1-1-1: pSacHR06의 제작

염색체 DNA의 특정 염기 또는 염기들의 치환을 위해 바실러스 서틀리스 유래의 sacB homologous recombination 기법(Wohlleben et. al., J. Bacteriol., 174:5462, 1992)을 이용할 목적으로 pSacHR06 벡터를 제작하였다 (도 3). 도 3은 pSacHR06 벡터를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.

먼저, pUC19(New England Biolab) 벡터의 엠피실린(ampicillin)에 대한 내성 특성을 카나마이신(kanamycin)에 대한 내성 특성으로 치환하기 위하여 pUC19 벡터를 NdeI 및 AhdI으로 절단하여 얻은 1.5kb 절편을 pACYC177 벡터(New England Biolabs)를 StuI으로 절단하여 얻은 1.3kb 절편과 DNA 축합반응을 수행하여 pUC19KM 벡터를 얻었다.

다음으로, 상기 pUC19KM 벡터를 PvuII로 절단하여 얻은 2.5kb 절편과 pBluescriptIIKS(+) 벡터를 PvuII로 절단하여 얻은 400bp 절편을 축합반응 하여 pUC19KKS 벡터를 얻었다. 이후 상기 벡터에 DNA 복제 원점의 용이한 제거가 가능하도록 하기 위해 서열번호 1 및 2의 프라이머와 pUC19 벡터 주형을 이용하여 PCR을 수행하였고, 그 결과 동일한 절단효소들의 인식부위를 양쪽 끝에 각각 가지고 있으며 DNA 복제기점을 가지는 DNA 절편을 획득하였다. 상기 절편을 SalI 및 DraIII로 절단하고, pUC19KKS 벡터를 SalI 및 DraIII로 절단하여 얻은 1.5kb 절편과 DNA 축합반응 하여 pUC19K 벡터를 얻었다. 상기 pUC19K 벡터에 바실러스 서틀리스(Bacillus subtilis)의 sacB 유전자를 도입하기 위하여 바실러스 서틀리스의 genomic DNA 주형과 서열번호 3 및 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 sacB 유전자를 가지는 DNA 절편을 합성하였고, 상기 합성된 DNA 절편과 pUC19K 벡터 모두를 XbaI 및 SpeI 효소로 절단하고 축합하여 sacB 유전자를 가지는 새로운 벡터를 제작하였고 이를 pSacHR06으로 명명하였다.

pSacHR06 벡터는 바실러스 서틀리스 유래의 sacB 유전자를 가지며 제한효소 를 사용하여 용이하게 DNA 복제 원점의 제거와 재축합 반응을 수행할 수 있기 때문에 sacB positive selection에 사용 가능하다.

[서열번호 1]pucoriup

5'-agccgtcgacgctagcgcatgcacgcgtgtgcacccatgggacgtcctcactgactcgctgcgctc-3'

[서열번호 2]pucorido

5'-ggctcacaacgtggctagcgacgtcgtgcacccatgggttccactgagcgtcagacc-3'

[서열번호 3]sacBf

5'-actctctagacgcgggtttgttactgataa-3'

[서열번호 4]sacBr

5'-gctagatatcaggatatcggcattttcttt-3'

1-1-2: lacI 유전자의 결실

L-발린 생성 미생물인 대장균 W3110(ATTC 39936)에서 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640-6645, 2000)을 이용하여, lac operon의 repressor를 암호화하는 유전자로, lactose 분해를 담당하는 lac operon의 전사를 억제하는 기능을 갖는 lacI 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.

[서열번호 5] lacI_1stup:

5'-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttagattgcagcattacacgt

cttg-3'

[서열번호 6] lacI_1stdo:

5'-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgcacttaacggctgacat

ggg-3'

1-1-3: ilvH의 feedback inhibition 제거

아지노모토 사에서 출원한 특허(US 6,737,255 B2)를 참고하여 acetohydroxy acid synthase isozyme III를 코딩하는 유전자인 ilvH의 41번째 염기(G)와 50번째 염기(C)를 각각 A와 T로 치환하였고, 대장균 W3110(ATTC 39936)의 염색체 DNA는 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다 (Sambrook, et al., Molecular cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989).

즉, 서열번호 7 및 8과 9 및 10의 프라이머와, 대장균 W3110 genomic DNA 주형을 이용하여 각각 PCR을 수행한 다음, 수득된 두개의 PCR 절편을 동일 농도로 섞어 주형으로 하고, 서열번호 7 및 10을 프라이머로 사용하여 overlapping PCR을 수행하였다. 상기와 같은 방법으로 얻은 1280bp의 PCR 절편을 PstI 및 SalI 효소로 절단하고, 역시 PstI 및 SalI 효소로 절단한 sacB homologous recombination 용 벡터인 pSacHR06에 삽입한 다음, sequencing 하여, ilvH의 41번째 염기(G)와 50번째 염기(C)가 각각 A와 T로 치환되었음을 확인하였다.

상기 수득한 벡터를 NheI 효소로 절단하여, replication origin을 결실시킨 다음, self-ligation 시키고, 상기 1-1-2에서 제작된 lacI 유전자가 결실된 대장균 W3110 컴피턴트 세포(electroporation-competent cell)에 일렉트로포레이션하였다. 다음으로, sacB positive selection (Wohlleben et al., J. Bacteriol., 174:5462, 1992) 방법에 의해 feedback inhibition이 제거된 균주를 수득하였다.

[서열번호 7] ilvH1:

5'-gactctgcagggtgatcgagactctttggcggttgac-3'

[서열번호 8] ilvH2:

5'-ggaaaaaaggccaatcacgcggaataacgcgtctgattcattttcgagtaag-3'

[서열번호 9] ilvH3:

5'-cttactcgaaaatgaatcagacgcgttattccgcgtgattggccttttttcc-3'

[서열번호 10] ilvH4:

5'-gctccgtcgaccagtttcacaattgccccttgcgtaaa-3'

1-1-4: ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론의 attenuator 의 tac promoter로의 치환

1-1-3에서 제작된 lacI 유전자와 ilvH의 feedback inhibition이 제거된 대장균 W3110에서, acetohydroxy acid synthase isozyme I 및 II의 constitutive expression을 유도하기 위하여, acetohydroxy acid synthase isozyme I 및 II를 각각 암호화하는 ilvBN 및 ilvGMEDA 오페론의 전사조절 기작에 관여하는 attenuator를 강력한 promoter인 tac promoter로 치환하였다.

먼저, ilvGMEDA operon attenuator의 치환을 위해, 서열번호 11 및 12와 13 및 14를 각각 한 쌍의 프라이머와 대장균 W3110 genomic DNA 주형을 이용하여 PCR을 수행한 다음, PCR 절편, ilvGatt1 및 ilvGatt2를 각각 수득하였다. 상기 수득된 두 PCR 절편을 각각 SalI/BamHI 및 EcoRI/PstI 효소로 절단하여 pKK223-3 벡터(Pharmacia Biotech)의 해당 효소 절단 부위에 클로닝 한 다음, sequencing으로 염기서열을 확인한 후, SalI 및 PstI 효소로 절단한 부위를 상기 pSacHR06 벡터의 해당 효소 절단 부위에 클로닝하고, 상기 feedback inhibition 제거와 동일한 방법으로, attenuator를 포함하는 native promoter를 tac promoter로 치환하였다.

ilvBN operon의 attenuator 제거를 위해, 서열번호 15 및 16과 17 및 18을 각각 한쌍의 프라이머로 사용하여 상기 ilvGMEDA attenuator 제거와 동일한 방법으로 PCR 및 클로닝한 다음, 상기에서 ilvGMEDA attenuator가 제거된 대장균 W3110 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하였다. 그 결과 ilvBN attenuator를 포함하는 native promoter를 tac promoter로 치환할 수 있었다.

[서열번호 11] ilvGatt1f: 5'-gactgtcgacctaacttattggctgtaagctgttctgaggcc-3'

[서열번호 12] ilvGatt1r: 5'-gctcggatccgaatgttgttcccttcctcgtagttcatcc-3'

[서열번호 13] ilvGatt2f: 5'-gactgaattcatgaatggcgcacagtgggtggtacatgcg-3'

[서열번호 14] ilvGatt2r: 5'-gctcctgcagtcaccgctggctaactggatatcttttggg-3'

[서열번호 15] ilvBatt1f: 5'-gactcgtcgacagagatggtagggcggataa-3'

[서열번호 16] ilvBatt1r: 5'-gctcggatcccacactgtattatgtcaaca-3'

[서열번호 17] ilvBatt2f: 5'-gactgaattcatggcaagttcgggcacaac-3'

[서열번호 18] ilvBatt2r: 5'-gctcactgcagtgcgtcacgaatgctttctt-3'

1-1-5: ilvA, panB 및 leuA 유전자의 결실

1-1-4에서 수득된 lacI 유전자와 ilvH의 feedback inhibition 제거되고 ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론 attenuator의 tac promoter로의 치환된 W3110에서 ilvA, panB 및 leuA 유전자의 결실시키기 위하여, 서열번호 19 내지 24 프라이머들을 이용하여 상기 1-1-2에 언급한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640, 2000)에 의해 ilvA(isoleucine 생합성 경로의 첫 번째 효소인 threonine dehydratase를 암호화하는 유전자), panB(pantothenate 생합성에 필요한 효소 중 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자) 및 leuA(leucine 생합성에 필요한 효소 중 2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)등의 유전자를 결실시켰다.

즉, 1-1-4에서 제작된 lacI 유전자가 제거되고, ilvH의 feedback inhibition이 제거되었으며, ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론의 attenuator를 포함한 본래의 promoter가, 강력한 전사활성을 가지는 tac promoter로 치환된 대장균 W3110 컴피턴트 세포에서 상기 유전자 3종의 결실을 유도하였다.

[서열번호 19] ilvA1stup:

5'-atggctgactcgcaacccctgtccggtgctccggaaggtgccgaatatttgattgcagcattacacg

tcttg-3'

[서열번호 20] ilvA1stdo:

5'-ctaacccgccaaaaagaacctgaacgccgggttattggtttcgtcgtggccacttaacggctgacat

ggg-3'

[서열번호 21] panB1stup:

5'-atgaaaccgaccaccatctccttactgcagaagtacaaacaggaaaaaaagattgcagcattacac

gtcttg-3'

[서열번호 22] panB1stdo:

5'-ttaatggaaactgtgttcttcgcccggataaacgccggactccacttcagcacttaacggctgac

atggg-3'

[서열번호 23] leuA1stup:

5'-atgagccagcaagtcattattttcgataccacattgcgcgacggtgaacagattgcagcattacac

gtcttg-3'

[서열번호 24] leuA1stdo:

5'-ttcagaacgtgcaccatggctttggcagatgactcgacaatatcggtagcacttaacggctgaca

tggg-3'

1-1-6: pKBRilvBNCED vector의 제작

서열번호 25 내지 30의 프라이머들을 이용하여 L-발린 생합성 경로에 필수적인 유전자들, 즉 ilvB(acetohydroxy acid synthase I large subunit을 암호화하는 유전자), ilvN(acetohydroxy acid synthase I small subunit을 암호화하는 유전자), ilvC(acetohydroxy acid isomeroreductase를 암호화하는 유전자), ilvE(branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자) 및 ilvD(dihydroxy-acid dehydratase를 암호화하는 유전자) 등을 순차적으로 pKK223-3 발현벡터(Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pKKilvBNCED 벡터를 수득하고, sequencing으로 염기서열을 확인하였다. 상기 pKKilvBNCED 벡터를 PciI 및 SphI 효소로 절단한 9.0kb 절편과, pBR322 벡터를 PciI 및 SphI 효소로 절단한 1.9kb 절편을 ligation 하여 pKBRilvBNCED 벡터를 최종 수득하였다 (도 4).

[서열번호 25] ilvBNf: 5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'

[서열번호 26] ilvBNr: 5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'

[서열번호 27] ilvCf: 5'-agtgctgcagacgaggaatcaccatggctaac-3'

[서열번호 28] ilvCrSX: 5'-gctcctgcagtctagagctagcgagctcttaacccgc-3'

[서열번호 29] ilvEDepfs: 5'-actcgagctctttccacgtctgctcaatgaatat-3'

[서열번호 30] ilvEDr: 5'-tacgtctagattaaccccccagtttcgatttatc-3'

1-1-7: L-발린 생성 미생물의 제작

상기 1-1-1 내지 1-1-5의 과정을 통해 ilvGMEDA 및 ilvBN operon의 attenuator를 포함하는 native promoter가 tac promoter로 치환되고, ilvH의 feedback inhibition이 제거되고, lacI, ilvA, panB 및 leuA 유전자가 결실된 대장 균 W3110 균주에 상기 1-1-6에서 제작된 pKBRilvBNCED 벡터의 도입하여 L-발린 생성 미생물(Val+pKBRilvBNCED)를 제작하였다.

1-2: L-발린의 생성능 측정

상기 1-1에서 제작된 L-발린 생성 미생물(Val+pKBRilvBNCED)를 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 이 형질전환 균주를 5g/ℓ glucose를 포함하는 30㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 24시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 50g glucose, 4g KH₂PO₄, 15g (NH₄)₂SO₄ㆍ7H₂O, 20mg MnSO₄ㆍ5H₂O, 2g MgSO₄ㆍ7H₂O, 30g CaCO₃, 2g yeast extract, 262mg L-isoleucine, 262mg L-leucine, 425㎍ D-pantothenic acid hemicalcium, salt, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO₄ㆍ7H₂O, 1.35g CaCl₂, 2.25g ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.5g MnSO₄ㆍ4H₂O, 1g CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.106g (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O, 0.23g Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분이 있고 KOH로 pH를 8.0으로 맞춘 배지 30㎖을 함유한 250㎖ 베플플라스크에 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 31℃에서 250rpm으로 48시간 배양하였다.

상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-발린의 농도를 HPLC로 측정하였다. 그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, W3110 야생균주에서는 생성되지 않았던 L-발린이 본 발명의 L-발린 생성 미생물(Val+pKBRilvBNCED)에서는 3.73g/ℓ의 농도로 생성되었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 attenuator를 포함하는 native promoter의 strong tac promoter로의 치환, 경쟁 유전자 결실이 L-발린의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

Strain	W3110	Val + pKBRilvBNCED
L-발린 (g/ℓ)	ND¹	3.73

¹ Not detected.

실시예 2: in silico simulation 방법에 의한 결실 대상 유전자 선정

상기 1-1에서 제작된 L-발린 생성 미생물(Val+pKBRilvBNCED)의 L-발린 생성능을 더욱 향상시키기 위하여, 인-실리코 시뮬레이션 방법을 이용하여, 대사흐름을 L-발린 생성에 맞게 최적화하기 위해 도입할 결실 대상 유전자를 선정하였다. 본 실시예의 인-실리코 시뮬레이션 방법은 본 출원인의 국제특허 출원 WO2006/107127의 방법을 참고하여 각 유전자의 조합(combination)에 대하여 복합 유전자 변이균주(multi-gene mutant)에 대한 시뮬레이션을 실시하여 예측된 L-발린 생산속도를 비교하여 가장 높은 후보 유전자를 스크리닝하였다.

2-1: Val 균주에 근거한 대사회로의 구축

본 발명에서는 L-발린을 생성하기 위한 대장균 변이 미생물의 새로운 대사흐름분석 시스템을 구축하였다. 상기 시스템은 대장균의 대사회로를 대부분 포함하고 있으며 실시예 1에서 제작된 L-발린 생성 미생물(Val+pKBRilvBNCED)의 배지조건을 대사회로상에 모두 반영하였다. 상기 구축한 대사회로를 이용하여 유전자 하나 또는 그 이상의 조합을 만들고, 이러한 후보 유전자들을 대사흐름 분석을 이용하여 L-발린을 생성하고자 하는 대상균주에서 시뮬레이션상으로 불활성화 시켰을 때, 비증식 속도와 유용물질의 형성수율을 예측하여 효율이 가장 높은 유전자를 스크리닝하였다.

2-2: 복합 유전자 변이 미생물의 시뮬레이션

상기 2-1과 같이 구축된 대사회로를 수학적으로 표현하기 위하여 모든 대사산물, 상기 대사산물의 대사경로 및 상기 대사경로에서의 화학양론 매트릭스(stoichiometric matrix)(S _ij , j 번째 반응에서 i 번째 대사산물의 시간에 따른 화학양론 계수)를 이용하여, 대사흐름 벡터(ν _j , j 번째 대사반응의 대사흐름)를 계산할 수 있는데, 시간에 따른 대사산물 농도 X의 변화는 모든 대사 반응의 흐름의 합으로 나타낼 수 있다. 또한, 시간에 따른 X의 변화량이 일정하다고 가정하면, 즉 준정상상태 가정 하에서, 시간에 따른 대사산물 농도의 변화량은 아래의 수학식 1로 정의될 수 있다.

(여기서, Sㆍν: 시간에 따른 X의 변화량, X: 대사산물의 농도, t: 시간)

각 유전자의 조합(combination)에 대하여 복합 유전자 변이 미생물(multi-gene mutant)에 대한 시뮬레이션을 실시하려면, 다양한 조합의 돌연변이에 대한 시뮬레이션을 수행해야 한다. 먼저, in silico gene knockout 시뮬레이션을 이용하여 단일 유전자를 결실할 경우 L-발린 생성속도가 가장 높은 유전자 군을 찾아냈다 (표 2). 상기 시뮬레이션은 http://mbel.kaist.ac.kr/를 통해 다운 받을 수 있는 MetaFluxNet 을 이용하여 수행하였다 (Lee et al., Bioinformatics, 19:2144, 2003).

즉, 표 2에 나타난 바와 같이, aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, tpiA, sdhA, sdhB, sdhC, sdhD, fumA, fumB, fumC, eptB, gpmA, gpmB, ptsG, mdh, ppc, pgi, glgC, sucA, sucB, ribA, folE 및 ackA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 결실 시키는 경우, 단일 유전자를 결실할 경우에도 실시예 1에서 제작된 기준 균주인 L-발린 생성 미생물(Val+pKBRilvBNCED)에 비해 L-발린 생성속도가 현저히 높아짐을 알 수 있었다.

본 발명자는 상기 유전자들의 최적 조합을 찾아내어, L-발린 생성속도 및 생성 효율을 더욱 높히고자, 보고되어 있는 순차적인(sequential) 복합유전자 시뮬레 이션 방법을 이용하여(Segre et al., PNAS, 99:15112-15117. 2002), 복합 유전자 변이 미생물에 대한 시뮬레이션을 실시하였다. 즉, 단일 유전자 결실에 따라 예측된 L-발린 생성속도를 비교하여 가장 높은 후보 유전자를 스크리닝하였다 (표 2).

즉, 첫 번째 시뮬레이션 상에서 스크리닝 된 후보 유전자를 시뮬레이션 상에서 불활성화시킨 상태에서 또 다른 단일 유전자 결실에 따라 예측된 L-발린 생성속도를 비교하여 가장 높은 후보 유전자를 스크리닝하고, 이렇게 결정된 후보 유전자도 시뮬레이션상에서 불활성화시킨 상태에서 다음 단일 유전자 결실에 따른 L-발린 생성속도를 비교하여 최고의 L-발린 수율을 보이는 조합을 스크리닝하는 하였다 (표 2 및 도 5).

도 5는 순차적 접근방식을 이용하여 세 번째까지의 결실에 따른 L-발린 생성속도와 세포 성장속도간의 관계를 도시한 것으로, 그 구체적인 값들은 아래 표 2 에 나타냈다.

표 2에 나타난 바와 같이, 목적의 대사회로에 해당하는 유전자 조합을 살펴 본 결과, 단일 유전자 결실시에도 기본 균주보다 높은 생성속도를 나타냈으며, aceE 및 aceF 및 lpdA를 결실시킨 변이 미생물의 L-발린 생성속도가 가장 높음을 알 수 있었다. 순차적인 시뮬레이션을 위한 유전자는 aceE 및 aceF 및 lpdA 유전자 중에서, pyruvate dehydrogenase 역할을 하는 유전자 중 효소 활성이 가장 높다 (Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 65:56-60. 2004)고 알려져 있는 aceF 유전자를 첫번째 유전자 결실 대상으로 선택하였다.

이중 유전자 결실 시뮬레이션은 aceF를 기본으로 하여, 다른 후보 유전자들을 추가로 결실시켰을 때를 시뮬레이션 하였다. 그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, aceF와 tpiA 결실시 최고의 L-발린 생성속도를 보였다. 그러나, tpiA 유전자를 결실시킬 경우, 표 2에 나타난 바와 같이, 세포 성장속도가 크게 감소할 것으로 예측되어, 두 번째로 L-발린 생성속도가 높은 pfkA 및 B를 후보 유전자로 결정하였고, 이중 6-phosphofructokinase-1의 활성 중 90%를 차지하고 있는 pfkA를 최종 두 번째 결실 대상 유전자로 선택하였다 (Daldal F, J. Mol. Biol., 168:285-305. 1983).

최종적으로 aceF와 pfkA를 기본으로 하여 삼중 유전자 결실 시뮬레이션 결과, mdh 결실시 최고의 L-발린 생성속도를 보였으므로, 세 번째 유전자 결실 대상으로 mdh를 선택하였다. 한편, 추가적인 유전자 결실 시뮬레이션으로 L-발린 생성속도를 높이는 후보군을 찾을 수는 있으나, 표 2의 예측성장속도가 유전자 결실에 따라 감소되었으므로, 추가적인 유전자 결실 시뮬레이션은 실시하지 않았다. 이에 상기 인실리코 시뮬레이션 결과를 바탕으로 최종적으로 aceF 및 pfk 및 mdh를 결실대상 유전자로 선정하였다.

실시예 3: aceF , pfk 및 mdh 의 추가 결실 및 L-발린 생성능 측정

3-1: aceF, mdh 및 pfkA의 추가 결실

상기 1-1-7에서 제작된 L-발린 생성 미생물에서 상기 실시예 2에서 선정된 결실 대상 유전자를 결실 시켜 고성능 L-발린 생성 미생물(VAMF+pKBRilvBNCED)를 제작하였다.

서열번호 31 내지 36 프라이머들을 이용하여 실시예 1에서 개시한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640, 2000)에 의해 aceF(pyruvate dehydrogenase를 암호화하는 유전자), mdh(malate dehydrogenase를 암호화하는 유전자) 및 pfkA(phosphofructokinase를 암호화하는 유전자)등의 유전자를 결실시켰다. 즉, 실시예 1-1-5에서 제작된 대장균 W3110 변이 미생물에서 상기 유전자 3종의 결실시킨 다음, 실시예 1-1-6에서 제작된 pKBRilvBNCED 벡터의 도입하여 고성능 L-발린 생성 미생물(VAMF+pKBRilvBNCED)를 제작하였다.

[서열번호 31] aceF1stup:

5'-ttgaagccgaacagtcgctgatcaccgtagaaggcgacaaagcctctatggattgcagcattacac

gtcttg-3'

[서열번호 32] aceF1stdo:

5'-aaggagagagaaatcggcagcatcagacgcggcacgaactctttaccattcacttaacggctgac

atggga-3'

[서열번호 33] mdh1stup:

5'-atgaaagtcgcagtcctcggcgctgctggcggtattggccaggcgcttgcgattgcagcattaca

cgtcttg-3'

[서열번호 34] mdh1stdo:

5'-ttacttattaacgaactcttcgcccagggcgatatctttcttcagcgtatcacttaacggctgacatg

gga-3'

[서열번호 35] pfkA1stup:

5'-atgattaagaaaatcggtgtgttgacaagcggcggtgatgcgccaggcatgattgcagcattaca

cgtcttg-3'

[서열번호 36] pfkA1stdo:

5'-ttaatacagttttttcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgctcacttaacggctgacat

ggga-3'

3-2: L-발린의 생성능 측정

상기 3-1에서 제작된 L-발린 생성 미생물(Val+pKBRilvBNCED)를 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 이 형질전환 균주를 5g/ℓ glucose를 포함하는 30㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 24시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 50g glucose, 4g KH₂PO₄, 15g (NH₄)₂SO₄ㆍ7H₂O, 20mg MnSO₄ㆍ5H₂O, 2g MgSO₄ㆍ7H₂O, 30g CaCO₃, 2g yeast extract, 262mg L-isoleucine, 262mg L-leucine, 425㎍ D-pantothenic acid hemicalcium, salt, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO₄ㆍ7H₂O, 1.35g CaCl₂, 2.25g ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.5g MnSO₄ㆍ4H₂O, 1g CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.106g (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O, 0.23g Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분이 있고 KOH로 pH를 8.0으로 맞춘 배지 30㎖을 함유한 250㎖ 베플플라스크에 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 31℃에서 250rpm으로 48시간 배양하였다. VAMF 균주에는 sodium acetate 3g/ℓ를 첨가하였다.

상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-발린의 농도를 아미노산 분석기(Sykam S433; Sykam GmbH, Eresing,Germany)로 측정하였다. 그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 결실 대상 유전자의 결실 도입 전 생성 미생물에서 3.73g/ℓ의 농도를 보였으며, 결실 대상 유전자(aceF, mdh 및 pfkA)를 추가 결실시킨 L-발린 생성 미생물에서 생성된 L-발린의 농도는 4.22g/ℓ로, 결실 대상 유전자의 결실을 도입하지 않은 L-발린 생성 미생물(3.73g/ℓ)에 비해 약 13.1% 증가하였다. 이러한 결과로부터, 결실 대상 유전자 도입으로 인한 대사흐름 조작이 L-발린의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

Strain	Val + pKBRilvBNCED	VAMF + pKBRilvBNCED
L-발린(g/ℓ)	3.73	4.22

실시예 4: L-발린 생성 미생물에 대장균의 ygaZH operon을 포함하는 재조합 벡터의 도입 및 L-발린의 생성능 측정

4-1: 대장균의 ygaZH operon을 포함하는 재조합 벡터(pTrc184ygaZH)의 제작

대장균 W3110(ATTC 39936)의 염색체 DNA를 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다 (Sambrook, et al., Molecular cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989). 상기 정제된 유전체서열을 주형으로 하고, 서열번호 37 및 38을 프라이머로 사용하여, 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 1분 20초간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복하면서, PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다.

[서열번호 37] ygaZHf: 5'-actaccatggaaagccctactccaca-3'

[서열번호 38] ygaZHr: 5'-gctcggtaccttatataatcgccatcactt-3'

상기 증폭된 PCR 절편(ygaZH 유전자)을 NcoI 및 KpnI로 절단하고, pTrc99A 발현벡터(Amersham Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pTrc99AygaZH를 제작하고, 상기 pTrc99AygaZH 벡터를 BspHI 및 EcoRV로 절단하여 수득한 유전자 조각을, 동일 효소(BspHI 및 EcoRV)로 절단한 pACYC184(New England Biolabs)에 삽입하여 ygaZH 유전자를 발현시키기 위한 발현벡터인 pTrc184ygaZH를 제작하였다 (도 6).

4-2: 재조합 벡터(pTrc184ygaZH)의 L-발린 생성 미생물로의 도입

실시예 1에서 제작된 L-발린 생성 미생물 Val+pKBRilvBNCED에, 상기 4-1에서 제작된 벡터 pTrc184ygaZH를 도입하여, 재조합 대장균 (Val+pKBrilvBNCED+pTrc184ygaZH)을 제작하였다.

4-3: L-발린의 생성능 측정

상기 4-2에서 제작된 L-발린 생성 대장균(Val+pKBrilvBNCED+pTrc184ygaZH)를 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주 각각을 5g/ℓ glucose를 포함하는 30㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 24시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 50g glucose, 4g KH₂PO₄, 15g (NH₄)₂SO₄ㆍ7H₂O, 20mg MnSO₄ㆍ5H₂O, 2g MgSO₄ㆍ7H₂O, 30g CaCO₃, 2g yeast extract, 262mg L-isoleucine, 262mg L-leucine, 425㎍ D-pantothenic acid hemicalcium, salt, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO₄ㆍ7H₂O, 1.35g CaCl₂, 2.25g ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.5g MnSO₄ㆍ4H₂O, 1g CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.106g (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O, 0.23g Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분이 있고 KOH로 pH를 8.0으로 맞춘 배지 30㎖을 함유한 250㎖ 베플플라스크에 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 31℃에서 250rpm으로 48시간 배양하였다.

상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-발린의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다. 그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 Val+ pKBRilvBNCED에 비해, exporter를 도입시킨 Val+pKBrilvBNCED+pTrc184ygaZH의 경우, L-발린의 생성이 증가된다는 것을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과로부터, ygaZH 유전자의 과발현이 L-발린의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

Strain	Val+ pKBRilvBNCED	Val+pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZH
L-발린 (g/ℓ)	3.73	5.25

실시예 5: L-발린 생성 미생물에 대장균의 lrp 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 도입 및 L- 발린의 생성능 측정

5-1: 대장균의 lrp 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pTrc184lrp)의 제작

대장균 W3110(ATTC 39936)의 염색체 DNA를 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다 (Sambrook, et al., Molecular cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989). 상기 정제된 유전체서열을 주형으로 하고, 서열번호 39 및 40을 프라이머로 사용하여, 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 1분 20초간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복하면서, PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다.

[서열번호 39] lrpf: 5'-actgccatggtagatagcaagaagcgcc-3'

[서열번호 40] lrpr: 5'-gctcggtaccttagcgcgtcttaataacca-3'

상기 증폭된 PCR 절편(lrp 유전자)을 NcoI 및 KpnI로 절단하고, pTrc99A 발현벡터(Amersham Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pTrc99Alrp를 제작하고, 상기 pTrc99Alrp 벡터를 BspHI 및 EcoRV로 절단하여 수득한 유전자 조각을, 동일 효소(BspHI 및 EcoRV)로 절단한 pACYC184(New England Biolabs)에 삽입하여 lrp 유전자를 발현시키기 위한 발현벡터인 pTrc184lrp를 제작하였다 (도 7).

5-2: 재조합 벡터(pTrc184lrp)의 L-발린 생성 미생물로의 도입

실시예 1에서 제작된 L-발린 생성 미생물 Val+pKBRilvBNCED에, 상기 5-1에서 제작된 벡터 pTrc184lrp를 도입하여, 재조합 대장균 (Val+pKBrilvBNCED+pTrc184ygaZH)을 제작하였다.

5-3: L-발린의 생성능 측정

상기 5-1에서 제작된 L-발린 생성 대장균(Val+pKBRilvBNCED+pTrc184lrp)를 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 각 50㎍/ml 및 30㎍/ml이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주 각각을 5g/ℓ glucose를 포함하는 30㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 24시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 50g glucose, 4g KH₂PO₄, 15g (NH₄)₂SO₄ㆍ7H₂O, 20mg MnSO₄ㆍ5H₂O, 2g MgSO₄ㆍ7H₂O, 30g CaCO₃, 2g yeast extract, 262mg L-isoleucine, 262mg L-leucine, 425㎍ D-pantothenic acid hemicalcium, salt, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO₄ㆍ7H₂O, 1.35g CaCl₂, 2.25g ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.5g MnSO₄ㆍ4H₂O, 1g CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.106g (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O, 0.23g Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분이 있고 KOH로 pH를 8.0으로 맞춘 배지 30㎖을 함유한 250㎖ 베플플라스크에 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 31℃에서 250rpm으로 48시간 배양하였다.

상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-발린의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다. 그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이 Val+ pKBRilvBNCED에 비해, lrp 유전자를 도입시킨 Val+pKBrilvBNCED+pTrc184lrp의 경우, L-발린의 생성이 증가된다는 것을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과로부터, lrp 유전자의 과발현이 L-발린의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

Strain	Val+ pKBRilvBNCED	Val+pKBRilvBNCED+pTrc184lrp
L-발린 (g/ℓ)	3.73	4.34

실시예 6: L-발린 생성 미생물에 대장균의 ygaZH operon과 lrp 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터의 도입 및 L-발린의 생성능 측정

6-1: 대장균의 ygaZH operon과 lrp 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터(pTrc184ygaZHlrp)의 제작

대장균 W3110(ATTC 39936)의 염색체 DNA를 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다 (Sambrook, et al., Molecular cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989). 상기 정제된 유전체서열을 주형으로 하고, 서열번호 41 및 42을 프라이머로 사용하여, 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 1분 20초간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복하면서, PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다.

[서열번호 41] lrpacfb: 5'-atgcggatccgaacagtgatgtttcagggt-3'

[서열번호 42] lrpacrp: 5'-atctctgcaggttccgtgttagcgcgtctt-3'

상기 증폭된 PCR 절편(lrp 유전자)을 BamHI 및 PstI로 절단한 후, 상기 4-1에서 제작된 벡터 pTrc184ygaZH를 동일 효소(BamHI 및 PstI)로 절단하여 수득한 pTrc184ygaZH의 유전자 절편에 삽입하여 ygaZH operon과 lrp 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터 pTrc184ygaZHlrp를 제작하였다 (도 8).

6-2: 재조합 벡터(pTrc184ygaZHlrp)의 L-발린 생성 미생물로의 도입

실시예 1에서 제작된 L-발린 생성 미생물 Val+pKBRilvBNCED에, 상기 6-1에서 제작된 벡터 pTrc184ygaZHlrp를 도입하여, 재조합 대장균 (Val+pKBrilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)을 제작하였다.

6-3: L-발린의 생성능 측정

상기 6-2에서 제작된 L-발린 생성 대장균(Val+pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)를 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 각 50㎍/ml 및 30㎍/ml이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 5g/ℓ glucose를 포함하는 30㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 24시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 50g glucose, 4g KH₂PO₄, 15g (NH₄)₂SO₄ㆍ7H₂O, 20mg MnSO₄ㆍ5H₂O, 2g MgSO₄ㆍ7H₂O, 30g CaCO₃, 2g yeast extract, 262mg L-isoleucine, 262mg L-leucine, 425㎍ D-pantothenic acid hemicalcium, salt, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO₄ㆍ7H₂O, 1.35g CaCl₂, 2.25g ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.5g MnSO₄ㆍ4H₂O, 1g CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.106g (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O, 0.23g Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분이 있고 KOH로 pH를 8.0으로 맞춘 배지 30㎖을 함유한 250㎖ 베플플라스크에 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 31℃에서 250rpm으로 48시간 배양하였다.

상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-발린의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다. 그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이 Val+ pKBRilvBNCED, Val+ pKBRilvBNCED+ pTrc184ygaZH, Val+ pKBRilvBNCED+ pTrc184lrp, Val+ pKBRilvBNCED+ pTrc184ygaZHlrp에 비해, ygaZH operon과 lrp를 동시에 도입시킨 Val+pKBrilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp의 경우, L-발린의 생성이 증가된다는 것을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과로부터, ygaZH operon과 lrp 유전자의 동시 과발현이 L-발린의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

Strain	Val+ pKBRilvBNCED	Val+pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZH	Val+pKBRilvBNCED+pTrc184lrp	Val+pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp
L-발린 (g/ℓ)	3.73	5.25	4.34	7.61

실시예 7: aceF , pfkA 및 mdh 가 추가 결실된 고성능 L-발린 생성 미생물(VAMF+pKBRilvBNCED)에 대장균의 ygaZH operon과 lrp 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터의 도입 및 L-발린의 생성능 측정

7-1: 재조합 벡터(pTrc184ygaZHlrp)의 고성능 L-발린 생성 미생물로의 도입

실시예 2에서 제작된 고성능 L-발린 생성 미생물 VAMF+pKBRilvBNCED에, 상기 6-1에서 제작된 벡터 pTrc184ygaZHlrp를 도입하여, 재조합 대장균 (VAMF+pKBrilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)을 제작하였다.

7-2: L-발린의 생성능 측정

상기 7-1에서 제작된 L-발린 생성 대장균(VAMF+pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)를 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 및 카나마이신(kanamycin)이 각 50㎍/ml, 30㎍/ml 및 40㎍/ml이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주 및 Val+ pKBRilvBNCED, VAMF+ pKBRilvBNCED, Val+ pKBRilvBNCED+ pTrc184ygaZHlrp 균주를 5g/ℓ glucose를 포함하는 200㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 24시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g glucose, 2g KH₂PO₄, 20g (NH₄)₂SO₄ㆍ7H₂O, 0.4g MgSO₄ㆍ7H₂O, 1.6g NaCl, 2g yeast extract, 262mg L-isoleucine, 262mg L-leucine, 425㎍ D-pantothenic acid hemicalcium, salt, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO₄ㆍ7H₂O, 1.35g CaCl₂, 2.25g ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.5g MnSO₄ㆍ4H₂O, 1g CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.106g (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O, 0.23g Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분으로 구성된 배지 1.8 리터를 함유한 6.6 리터 발효기(Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA)에 상기 전배양액을 접종하여, 31℃에서 배양하였다. pH는 25%(v/v) NH₄OH의 automatic feeding에 의해 6.0으로 유지되었고, 용존 산소 농도(dissolved oxygen concentration)는 공기를 1vvm(air volume/working volume/minute)으로 공급하면서 교반속도를 1000rpm 까지 자동 조절함으로써 포화 공기(air saturation)의 40% 이상으로 유지했다. VAMF 균주에는 sodium acetate 3g/ℓ를 첨가하였다.

상기 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-발린의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다. 그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이 Val+ pKBRilvBNCED 균주에 aceF, pfkA 및 mdh가 추가 결실을 도입했을 때의 L-발린의 생성 증가 효과(45.5%) 보다 Val+ pKBRilvBNCED+ pTrc184ygaZHlrp 균주에 aceF, pfkA 및 mdh가 추가 결실을 도입했을 때의 L-발린의 생성 증가 효과(126.7%)가 훨씬 크다는 것을 알 수 있다.

상기와 같은 결과로부터, aceF, pfkA 및 mdh의 추가 결실로 인한 대사흐름 조절 효과가 exporter(ygaZH operon)와 global regulator(lrp 유전자)의 동시 과발현시에 더욱 상승한다는 것을 알 수 있었다. 또한, aceF, pfkA 및 mdh의 추가 결실로 인한 대사흐름 조절 효과와 exporter(ygaZH operon), global regulator(lrp 유전자)의 동시 과발현 효과가 서로 시너지 효과를 발생하여 L-발린 생성 증가에 더욱 효과적이라는 것을 알 수 있었다.

Strain	Val+ pKBRilvBNCED	VAMF+ pKBRilvBNCED	Val+pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp	VAMF+pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp
L-발린 (g/ℓ)	2.75	4.00	3.33	7.55

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법은 기존의 무작위 돌연변이 기법과 달리, 특정 유전자의 결실로 인한 대사회로 재구성 및 필요 유전자의 증폭을 통한 rational design 방법에 의해 분지쇄 아미노산의 고생성능을 갖는 미생물을 효과적으로 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 변이 미생물은 부위특위적 돌연변이 방법과 대사흐름 조작에 의해 분지쇄 아미노산을 고효율로 생성할 수 있고, 특히, 분지쇄 아미노산 중 L-발린을 고효율로 생성할 수 있어, 본 발명의 변이 미생물은 L-발린의 산업적 생성 미생물로 유용하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

L-발린 생성능을 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시키고, L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 그 발현이 증가되도록 변이시키는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 L-발린 생성능을 가지는 미생물은 L-발린 생성능을 가지는 박테리아, L-발린 생성능을 가지는 효모 및 L-발린 생성능을 가지는 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 leuA(2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 그 발현이 증가되도록 변이시키는 것은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) lacI(lac operon repressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실;

(b) ilvH(acetohydroxy acid synthase isozyme III) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition) 제거;

(c) ilvGMEDA(acetohydroxy acid synthase isozyme I) 및 ilvBN(Acetohydroxy acid synthase isozyme II) 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환; 및

(d) strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입.
제7항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvN, ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 발현벡터는 pKBRilvBNCED 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, tpiA, sdhA, sdhB, sdhC, sdhD, fumA, fumB, fumC, eptB, gpmA, gpmB, ptsG, mdh, ppc, pgi, glgC, sucA, sucB, ribA, folE 및 ackA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 추가로 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, aceF 및 pfkA 유전자를 추가로 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, aceF, pfkA 및 mdh 유전자를 추가로 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자는 서열번호 43 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상이거나, 서열번호 45의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, global regulator인 lrp 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 lrp 유전자는 서열번호 46의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법으로 제작되고, L-발린 생성능을 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있고, L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 변이되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물.
(a) ilvA, leuA 및 panB가 약화 또는 결실;

(b) lacI 유전자가 결실;

(c) ilvH 유전자의 피드백 저해가 제거;

(d) ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환;

(e) ilvB, ilvN, ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; 및

(f) 서열번호 45의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물.
제19항에 있어서, 서열번호 46의 lrp 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물.
(a) ilvA, leuA 및 panB가 약화 또는 결실;

(b) lacI 유전자가 결실;

(c) ilvH 유전자의 피드백 저해가 제거;

(d) ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환;

(e) ilvB, ilvN, ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; 및

(f) aceF 및 pfkA 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물.
제21항에 있어서, 서열번호 45의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물.
제21항에 있어서, 서열번호 46의 lrp 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물.
(a) ilvA, leuA 및 panB가 약화 또는 결실;

(b) lacI 유전자가 결실;

(c) ilvH 유전자의 피드백 저해가 제거;

(d) ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환;

(e) ilvB, ilvN, ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; 및

(f) aceF, pfkA 및 mdh 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물.
제24항에 있어서, 서열번호 45의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물.
제24항에 있어서, 서열번호 46의 lrp 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물.
제18항의 L-발린 생성 고생성능을 가지는 변이 미생물를 배양한 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 L-발린을 회수하는 것을 특징으로 하는 L-발린의 제조방법.
제19항 내지 제26항 중 어느 한 항의 L-발린 생성 고생성능을 가지는 변이 미생물를 배양한 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 L-발린을 회수하는 것을 특 징으로 하는 L-발린의 제조방법.