CN113683667A - Yh66-rs10865基因改造得到的工程菌及其在制备缬氨酸中的应用 - Google Patents

Yh66-rs10865基因改造得到的工程菌及其在制备缬氨酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种YH66‑RS10865基因改造得到的工程菌及其在制备缬氨酸中的应用。本发明提供了用于抑制YH66‑RS10865基因表达的物质或降低YH66‑RS10865蛋白丰度的物质或降低YH66‑RS10865蛋白活性的物质在提高细菌缬氨酸产量中的应用。本发明提供了重组菌，是抑制细菌中的YH66‑RS10865基因表达得到的。本发明还保护制备缬氨酸的方法：发酵所述重组菌。本发明发现YH66‑RS10865蛋白对细菌的缬氨酸产量存在负调控，抑制YH66‑RS10865基因表达提高缬氨酸产量，过表达YH66‑RS10865基因降低缬氨酸产量。进一步，本发明发现了YH66‑RS10865A844C,C846A蛋白蛋白及其编码基因和应用。本发明对于缬氨酸工业化生产，具有重大的应用价值。

Description

YH66-RS10865基因改造得到的工程菌及其在制备缬氨酸中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种YH66-RS10865基因改造得到的工程菌及其在制备缬氨酸中的应用，具体的所述改造为A844C和C846A。
背景技术
缬氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸之一，是人体必需的8种氨基酸和生糖氨基酸，它与其他两种高浓度氨基酸(异亮氨酸和亮氨酸)一起工作促进身体正常生长，修复组织，调节血糖，并提供需要的能量。在参加激烈体力活动时，缬氨酸可以给肌肉提供额外的能量产生葡萄糖，以防止肌肉衰弱。缬氨酸还帮助从肝脏清除多余的氮(潜在的毒素)，并将身体需要的氮运输到各个部位。
缬氨酸是一种必需氨基酸，这意味着身体本身不能生产，必须通过膳食来源获得补充。它的天然食物来源包括谷物、奶制品、香菇、蘑菇、花生、大豆蛋白和肉类。尽管大多数人都可以从饮食中获得足够的数量，但是缬氨酸缺乏症的案例也屡见不鲜。当缬氨酸不足时，大脑中枢神经***功能会发生紊乱，共济失调而出现四肢震颤。通过解剖切片脑组织，发现有红核细胞变性现象，晚期肝硬化病人因肝功能损害，易形成高胰岛素血症，致使血中支链氨基酸减少，支链氨基酸和芳香族氨基酸的比值由正常人的3.0-3.5降至1.0-1.5，故常用缬氨酸等支链氨基酸的注射液治疗肝功能衰竭以及酗酒和吸毒对这些器官造成的损害。此外，缬氨酸也可作为加快创伤愈合的治疗剂。L-缬氨酸，别名为2-氨基-3-甲基丁酸，CAS号为72-18-4，MDL号为MFCD00064220，EINECS号为200-773-6。目前制备L-缬氨酸主要是化学合成法。化学合成法的局限性：生产成本高，反应复杂，步骤多，且有许多副产物。
发明内容
本发明的目的是提供一种YH66-RS10865基因改造得到的工程菌及其在制备缬氨酸中的应用。
本发明提供了用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质或降低YH66-RS10865蛋白丰度的物质或降低YH66-RS10865蛋白活性的物质的应用；
所述应用为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：
(Ⅰ)在提高细菌缬氨酸产量中的应用；
(Ⅱ)在生产缬氨酸中的应用。
所述YH66-RS10865基因为编码YH66-RS10865蛋白的基因；
所述YH66-RS10865蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；
(a2)来源于细菌且与(a1)具有95％以上同一性且与细菌产缬氨酸相关的蛋白质；
(a3)将(a1)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与细菌产缬氨酸相关的由(a1)衍生的蛋白质。
这里使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95％以上同一性具体可为96％以上同一性或97％以上同一性或98％以上同一性或99％以上同一性。
具体的，所述YH66-RS10865基因为如下(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)编码区如序列表的序列4所示的DNA分子；
(b2)来源于细菌且与(b1)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95％以上同一性具体可为96％以上同一性或97％以上同一性或98％以上同一性或99％以上同一性。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
所述抑制YH66-RS10865基因表达可为敲除YH66-RS10865基因，也可为突变YH66-RS10865基因。
所述敲除可为敲除基因的部分区段，也可为敲除基因的整个编码框。
示例性的，所述用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质具体可为序列表的序列5所示的DNA分子或具有序列表的序列5所示的DNA分子的重组质粒。
示例性的，所述用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质具体可为序列表的序列8所示的DNA分子或具有序列表的序列8所示的DNA分子的重组质粒。
示例性的，所述用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质具体可为实施例中的重组质粒pK18-YH66-RS10865A844C,C846A或重组质粒pK18-ΔYH66-RS10865。
本发明还提供了一种重组菌，是抑制细菌中的YH66-RS10865基因表达得到的。
所述抑制细菌中的YH66-RS10865基因表达可为敲除细菌中的YH66-RS10865基因，也可为突变细菌中的YH66-RS10865基因。
所述敲除可为敲除基因的部分区段，也可为敲除基因的整个编码框。
示例性的，敲除细菌中的YH66-RS10865基因具体可为：使细菌基因组DNA中缺失序列表的序列4所示的DNA分子。
对于突变细菌中的YH66-RS10865基因，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向突变或基因编辑等。
示例性的，突变细菌中的YH66-RS10865基因具体可为：使细菌基因组DNA中编码的YH66-RS10865蛋白的第282位氨基酸残基的密码子由编码N的密码子突变为编码其他氨基酸残基的密码子。具体的，所述其他氨基酸残基为Q。
示例性的，突变细菌中的YH66-RS10865基因具体可为：使细菌基因组DNA中的YH66-RS10865基因发生如下两个点突变：第844位核苷酸由A突变为其他核苷酸(具体可为C)、846位核苷酸由C突变为其他核苷酸(具体可为A)。
示例性的，抑制细菌中的YH66-RS10865基因表达的实现方式可为：在细菌中导入用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质。
示例性的，所述用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质具体可为序列表的序列5所示的DNA分子或具有序列表的序列5所示的DNA分子的重组质粒。
示例性的，所述用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质具体可为序列表的序列8所示的DNA分子或具有序列表的序列8所示的DNA分子的重组质粒。
示例性的，所述用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质具体可为实施例中的重组质粒pK18-YH66-RS10865A844C,C846A或重组质粒pK18-ΔYH66-RS10865。
本发明还保护所述重组菌在制备缬氨酸中的应用。
本发明还保护一种制备缬氨酸的方法，包括如下步骤：发酵所述重组菌。
本领域技术人员可以采用现有技术中的发酵方法进行发酵。也可通过常规试验进行发酵方法的优化和改进。可以在本领域中已知的发酵条件下在合适的培养基中进行细菌的发酵。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的pH。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃。
所述方法还可包括如下步骤：从培养物中获得缬氨酸。从培养物中获得缬氨酸可通过各种方式实现，包括但不限于：用硫酸或氢氯酸等处理培养物，接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。
所述发酵中，示例性的发酵培养基的配方见表3，余量为水。
所述发酵中，示例性的发酵控制工艺见表4。
示例性的，所述发酵中，完成接种的初始时刻，体系OD值可为0.3-0.5。
示例性的，所述发酵的发酵过程中：用于调pH的为氨水；发酵体系中有泡沫时，加入适量消泡剂antifoam(CB-442)；通过补加70％葡萄糖水溶液控制体系含糖量(残糖)。
本发明还提供了一种提高细菌的缬氨酸产量的方法，包括如下步骤：抑制细菌中的YH66-RS10865基因表达或降低细菌中YH66-RS10865蛋白丰度或降低细菌中YH66-RS10865蛋白活性。
所述抑制细菌中的YH66-RS10865基因表达可为敲除细菌中的YH66-RS10865基因，也可为突变细菌中的YH66-RS10865基因。
所述敲除可为敲除基因的部分区段，也可为敲除基因的整个编码框。
示例性的，敲除细菌中的YH66-RS10865基因具体可为：使细菌基因组DNA中缺失序列表的序列4所示的DNA分子。
对于突变细菌中的YH66-RS10865基因，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向突变或基因编辑等。
示例性的，突变细菌中的YH66-RS10865基因具体可为：使细菌基因组DNA中编码的YH66-RS10865蛋白的第282位氨基酸残基的密码子由编码N的密码子突变为编码其他氨基酸残基的密码子。具体的，所述其他氨基酸残基为Q。
示例性的，突变细菌中的YH66-RS10865基因具体可为：使细菌基因组DNA中的YH66-RS10865基因发生如下两个点突变：第844位核苷酸由A突变为其他核苷酸(具体可为C)、846位核苷酸由C突变为其他核苷酸(具体可为A)。
示例性的，抑制细菌中的YH66-RS10865基因表达的实现方式可为：在细菌中导入用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质。
示例性的，所述用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质具体可为序列表的序列5所示的DNA分子或具有序列表的序列5所示的DNA分子的重组质粒。
示例性的，所述用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质具体可为序列表的序列8所示的DNA分子或具有序列表的序列8所示的DNA分子的重组质粒。
示例性的，所述用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质具体可为实施例中的重组质粒pK18-YH66-RS10865A844C,C846A或重组质粒pK18-ΔYH66-RS10865。
本发明还保护YH66-RS10865蛋白在调控细菌的缬氨酸产量中的应用。
所述调控为负调控，即YH66-RS10865蛋白含量增高，缬氨酸产量降低。
所述调控为负调控，即YH66-RS10865蛋白含量降低，缬氨酸产量增高。
本发明还保护一种突变蛋白，命名为YH66-RS10865A844C,C846A蛋白，是将YH66-RS10865蛋白第282位氨基酸残基由N突变为其他氨基酸残基得到的。
具体的，所述其他氨基酸残基为Q。
示例性的，所述突变蛋白如序列表的序列1所示。
本发明还保护YH66-RS10865A844C,C846A蛋白的编码基因，命名为YH66-RS10865A844C ,C846A基因。
具体的，YH66-RS10865A844C,C846A基因为如下(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(c2)来源于细菌且与(c1)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
(c3)在严格条件下与(c1)杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
本发明还保护具有YH66-RS10865A844C,C846A基因的表达盒或具有YH66-RS10865A844C ,C846A基因的重组载体或具有YH66-RS10865A844C,C846A基因的重组菌。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述95％以上同一性具体可为96％以上同一性或97％以上同一性或98％以上同一性或99％以上同一性。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
本发明还保护YH66-RS10865A844C,C846A蛋白、YH66-RS10865A844C,C846A基因、具有YH66-RS10865A844C,C846A基因的表达盒或具有YH66-RS10865A844C,C846A基因的重组载体或具有YH66-RS10865A844C,C846A基因的重组菌在制备缬氨酸中的应用。
本发明还提供了一种提高细菌的缬氨酸产量的方法，包括如下步骤：使细菌基因组DNA中编码的YH66-RS10865蛋白的第282位氨基酸残基的密码子由编码N的密码子突变为编码其他氨基酸残基的密码子。具体的，所述其他氨基酸残基为Q。
所述方法具体包括如下步骤：使细菌基因组DNA中的YH66-RS10865基因发生如下两个点突变：第844位核苷酸由A突变为其他核苷酸(具体可为C)、846位核苷酸由C突变为其他核苷酸(具体可为A)。
所述方法具体包括如下步骤：在细菌中导入序列表的序列5所示的DNA分子或具有序列表的序列5所示的DNA分子的重组质粒。
以上任一所述细菌包括但不限于如下：棒杆菌属细菌，优选嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)。
以上任一所述细菌为具有生产缬氨酸的能力的细菌。
“具有生产缬氨酸的能力的细菌”是指细菌具有以下能力：在培养基和/或细菌的细胞中产生并累积缬氨酸的能力。从而，当细菌在培养基中培养时可以收集缬氨酸。
所述细菌可为自然采集的野生型细菌也可为修饰后的细菌。
“修饰后的细菌”指的是将自然采集的野生型细菌进行人工突变和/或诱变得到的改造后的细菌。
具体的，所述谷氨酸棒杆菌可为谷氨酸棒杆菌CGMCC21260。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPFV1，已于2020年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21260。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPFV1，又称为谷氨酸棒杆菌CGMCC21260。
以上任一所述缬氨酸的含义为广义的缬氨酸，包括游离形式缬氨酸、缬氨酸的盐或两者的混合物。
具体的，所述缬氨酸为L-缬氨酸。
以上任何方法或应用还可用于缬氨酸的下游产品的制备。
谷氨酸棒杆菌中的YH66-RS10865蛋白如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4所示。本发明中通过引入点突变，得到了序列表的序列1所示的YH66-RS10865A844C,C846A蛋白，YH66-RS10865A844C,C846A蛋白的编码基因如序列表的序列2所示。与YH66-RS10865基因相比，YH66-RS10865A844C,C846A基因的差异在于第844位核苷酸由A突变为C且第846位核苷酸由C突变为A。与YH66-RS10865蛋白相比，YH66-RS10865A844C,C846A蛋白的差异在于第282位氨基酸残基由N突变为Q。
本发明发现YH66-RS10865蛋白对细菌的缬氨酸产量存在负调控，即YH66-RS10865蛋白含量增高、缬氨酸产量降低，YH66-RS10865蛋白含量降低、缬氨酸产量增高。抑制YH66-RS10865基因表达可以提高缬氨酸产量，过表达YH66-RS10865基因降低缬氨酸产量。进一步，本发明发现了YH66-RS10865A844C,C846A蛋白蛋白及其编码基因和应用。本发明对于缬氨酸工业化生产，具有重大的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pK18mobsacB质粒：Addgene公司；pK18mobsacB质粒中具有卡那霉素抗性基因作为筛选标记。pXMJ19质粒：BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；pXMJ19质粒中具有氯霉素抗性基因作为筛选标记。NEBuilder酶：NEB公司。如无特殊说明，实施例中的培养基为配方为表1的培养基(余量为水，pH为7.0)。不含卡那霉素培养基即表1所示的培养基。含卡那霉素的培养基由表1所示的培养基和卡那霉素组成，卡那霉素的含量为50μg/ml。如无特殊说明，实施例中的培养指的是32℃静置培养。实施例中的单链构象多态性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sscp-PAGE)：采用的胶浓度为8％，电泳胶的组成见表2；电泳条件为：使用1×TBE缓冲液，120V电压，电泳时间10h。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
表1
组分 在培养基中的浓度
蔗糖 10g/L
多聚蛋白胨 10g/L
牛肉膏 10g/L
酵母粉 5g/L
尿素 2g/L
氯化钠 2.5g/L
琼脂粉 20g/L
表2
组分 加入量
40％丙烯酰胺 8mL
ddH<sub>2</sub>O 26mL
甘油 4mL
10×TBE 2mL
TEMED 40μL
10％AP 600μL
实施例1、谷氨酸棒杆菌CGMCC21260的获得
谷氨酸棒杆菌ATCC15168：ATCC中编号为15168的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
将谷氨酸棒杆菌ATCC15168进行诱变，获得谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)YPFV1。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPFV1，已于2020年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21260。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPFV1，又称为谷氨酸棒杆菌CGMCC21260。
实施例2、构建重组菌YPV-031
P1：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGCTTCGTTTGCTTGAGCGTG-3'；
P2：5'-CGCTGCAGGTTGCATTGAACCACGAAGGTCAGGT-3'；
P3：5'-ACCTGACCTTCGTGGTTCAATGCAACCTGCAGCG-3'；
P4：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTAGCCACCGAGCGCTGCGCG-3'。
P5：5'-ACGTTTCAACCGCTACCTCG-3'；
P6：5'-ATCCCACTCGCGACCCCAAAC-3'。
一、构建重组质粒
1、以谷氨酸棒杆菌ATCC15168为模板，采用引物P1和引物P2组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物(720bp)。
2、以谷氨酸棒杆菌ATCC15168为模板，采用引物P3和引物P4组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物(678bp)。
3、同时将步骤1回收的扩增产物和步骤2回收的扩增产物作为模板，采用引物P1和引物P4组成的引物对进行PCR扩增(Overlap PCR)，回收扩增产物(1364bp)。经测序，扩增产物如序列表的序列5所示。
4、取pK18mobsacB质粒，采用限制性内切酶Xba I进行单酶切，回收线性化质粒。
5、将步骤3回收的扩增产物与步骤4回收的线性化质粒共孵育(采用NEBuilder酶，50℃孵育30min)，得到重组质粒pK18-YH66-RS10865A844C,C846A。经测序验证，重组质粒pK18-YH66-RS10865A844C,C846A中具有序列表的序列5所示的DNA分子。
二、构建重组菌YPV-031
1、采用重组质粒pK18-YH66-RS10865A844C,C846A对谷氨酸棒杆菌CGMCC21260进行电击转化，然后培养。
2、挑取步骤1中的菌株，采用含15％蔗糖的培养基培养，然后挑取单菌落，分别采用含卡那霉素的培养基和不含卡那霉素的培养基进行培养，筛选在含卡那霉素的培养基上不能生长且在不含卡那霉素的培养基上可以生长的菌株。
3、取步骤2筛选的菌株，采用引物P5和引物P6组成的引物对进行PCR扩增，然后回收扩增产物(283bp)。
4、取步骤3的扩增产物，先95℃变性10min再冰浴5min，然后进行sscp-PAGE。电泳时，采用重组质粒pK18-YH66-RS10865A844C,C846A的扩增片段(即以重组质粒pK18-YH66-RS10865A844C,C846A为模板，采用引物P5和引物P6组成的引物对进行PCR扩增的扩增产物)为阳性对照，采用谷氨酸棒杆菌CGMCC21260的扩增片段(即以谷氨酸棒杆菌CGMCC21260为模板，采用引物P5和引物P6组成的引物对进行PCR扩增的扩增产物)为阴性对照，水作为空白对照。由于片段结构不同，电泳位置不同，电泳位置与阴性对照不一致且与阳性对照一致的菌株为筛选的目的菌株(等位替换成功的重组菌株)。
5、根据步骤4的结果，将筛选得到的菌株的步骤3的扩增产物进行测序验证，得到重组菌YPV-031。与谷氨酸棒杆菌CGMCC21260相比，重组菌YPV-031的差异仅在于：将谷氨酸棒杆菌CGMCC21260基因组中的序列表的序列4所示的YH66-RS10865基因取代为了序列表的序列2所示的YH66-RS10865A844C,C846A基因。序列2和序列4仅存在两个核苷酸差异，位于第844位和第846位。重组菌YPV-031即将谷氨酸棒杆菌CGMCC21260中的YH66-RS10865基因进行突变(两个位点突变)得到的工程菌株。
实施例2、构建重组菌YPV-032和重组菌YPV-033
P7：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCATGACGGCTGACTGGACTC-3'；
P8：5'-ACTGGGATTTCAGGTATCCAAATCGGACTCCTTAAATGGG-3'；
P9：5'-CCCATTTAAGGAGTCCGATTTGGATACCTGAAATCCCAGT-3'；
P10：5'-CTATGTGAGTAGTCGATTTATTATTCCTCAGGAGCGTTTG-3'；
P11：5'-CAAACGCTCCTGAGGAATAATAAATCGACTACTCACATAG-3'；
P12：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTGCATAAGAAACAACCACTT-3'。
P13：5'-GTCCGCTCTGTTGGTGTTCA-3'；
P14：5'-TGTTACCGCGGACAGGTCCG-3'。
P15：5'-GCAAGCAGCAGATCGCTACC-3'；
P16：5'-TGGAGGAATATTCGGCCCAG-3'。
一、构建重组菌YPV-033
1、以重组菌YPV-031为模板，采用引物P7和引物P8组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物(806bp)。
2、以重组菌YPV-031为模板，采用引物P9和引物P10组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物(3014bp)。
3、以重组菌YPV-031为模板，采用引物P11和引物P12组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物(783bp)。
4、取pK18mobsacB质粒，采用限制性内切酶Xba I进行单酶切，回收线性化质粒。
5、将步骤1回收的扩增产物、步骤2回收的扩增产物、步骤3回收的扩增产物与步骤4回收的线性化质粒共孵育(采用NEBuilder酶，50℃孵育30min)，得到重组质粒033。经测序验证，重组质粒033中具有序列表的序列6所示的DNA分子。
6、采用重组质粒033对谷氨酸棒杆菌CGMCC21260进行电击转化，然后培养，然后对各个单菌落分别进行PCR鉴定(采用引物P13和引物P14组成的引物对)，能扩增出1921bp条带的菌株为阳性菌株。
7、挑取步骤6中的阳性菌株，采用含15％蔗糖的培养基培养，然后挑取单菌落，分别采用含卡那霉素的培养基和不含卡那霉素的培养基进行培养，筛选在含卡那霉素的培养基上不能生长且在不含卡那霉素的培养基上可以生长的菌株。
8、取步骤7筛选的菌株，采用引物P15和引物P16组成的引物对进行PCR扩增，扩增出2013bp条带的菌株为YH66-RS10865A844C,C846A基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC21260基因组上的阳性菌株，将其命名为重组菌YPV-033。重组菌YPV-033为基因组上过表达YH66-RS10865A844C,C846A基因的工程菌株。
二、构建重组菌YPV-032
将模板均由“重组菌YPV-031”替换为“谷氨酸棒杆菌ATCC15168”，其他同步骤一。
得到YH66-RS10865基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC21260基因组上的阳性菌株，将其命名为重组菌YPV-032。重组菌YPV-032为基因组上过表达YH66-RS10865基因的工程菌株。与重组菌YPV-033相比，重组菌YPV-032的差异仅在于：整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC21260基因组的外源DNA的序列中，序列4取代了序列2。
实施例3、构建重组菌YPV-035和重组菌YPV-034
一、构建重组菌YPV-035
1、以重组菌YPV-031为模板，采用引物P17和引物P18组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物(3044bp)。经测序，扩增产物如序列表的序列7所示。
P17：5'-GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTGGATACCTGAAATCCCAGT-3'；
P18：5'-ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTTATTCCTCAGGAGCGTTTG-3'。
2、取pXMJ19质粒，采用限制性内切酶EcoR I酶切进行单酶切，回收线性化质粒。
3、将步骤1回收的扩增产物与步骤2回收的线性化质粒共孵育(采用NEBuilder酶，50℃孵育30min)，得到重组质粒pXMJ19-YH66-RS10865A844C,C846A。经测序验证，重组质粒pXMJ19-YH66-RS10865A844C,C846A中具有序列表的序列7所示的DNA分子。
4、将重组质粒pXMJ19-YH66-RS10865A844C,C846A电转导入谷氨酸棒杆菌CGMCC21260，得到重组菌YPV-035。重组菌YPV-035为通过质粒过表达pXMJ19-YH66-RS10865A844C,C846A基因的工程菌株。
二、构建重组菌YPV-034
将模板由“重组菌YPV-031”替换为“谷氨酸棒杆菌ATCC15168”，其他同步骤一。
得到重组菌YPV-034。重组菌YPV-034为通过质粒过表达YH66-RS10865基因的工程菌株。与重组菌YPV-035相比，重组菌YPV-034的差异仅在于：通过质粒过表达的外源DNA的序列中，序列4取代了序列2。
实施例4、构建基因组上缺失YH66-RS10865基因的工程菌株
P19：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTCGGCCACTTTAATAATCCT-3'；
P20：5'-TATCTGTCCCTTGAGGTGATTTCCACACCTCCTGTTGGAA-3'；
P21：5'-TTCCAACAGGAGGTGTGGAAATCACCTCAAGGGACAGATA-3'；
P22：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCAACAATGTAAACAAGATGTC-3'。
P23：5'-TCGGCCACTTTAATAATCCT-3'；
P24：5'-AACAATGTAAACAAGATGTC-3'。
一、构建重组质粒
1、以谷氨酸棒杆菌ATCC15168为模板，采用引物P19和引物P20组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物(上游同源臂片段，730bp)。
2、以谷氨酸棒杆菌ATCC15168为模板，采用引物P21和引物P22组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物(下游同源臂片段，725bp)。
3、同时将步骤1回收的扩增产物和步骤2回收的扩增产物作为模板，采用引物P19和引物P22组成的引物对进行PCR扩增(Overlap PCR)，回收扩增产物。经测序，扩增产物如序列表的序列8所示。
4、取pK18mobsacB质粒，采用限制性内切酶Xba I进行单酶切，回收线性化质粒。
5、将步骤3回收的扩增产物与步骤4回收的线性化质粒共孵育(采用NEBuilder酶，50℃孵育30min)，得到重组质粒pK18-ΔYH66-RS10865。经测序，重组质粒pK18-ΔYH66-RS10865中具有序列表的序列8所示的DNA分子。
二、构建重组菌YPV-036
1、采用重组质粒pK18-ΔYH66-RS10865对谷氨酸棒杆菌CGMCC21260进行电击转化，然后培养，然后对各个单菌落分别进行PCR鉴定(采用引物P23和引物P24组成的引物对)。能同时扩增出1341bp及4110bp条带的菌株为阳性菌株。只扩增出4110bp条带的菌株为转化失败的出发菌，其中的4110bp片段如序列表的序列9所示。
2、挑取步骤1中的阳性菌株，采用含15％蔗糖的培养基培养，然后挑取单菌落，分别采用含卡那霉素的培养基和不含卡那霉素的培养基进行培养，筛选在含卡那霉素的培养基上不能生长且在不含卡那霉素的培养基上可以生长的菌株。
3、取步骤2筛选的菌株，采用引物P23和引物P24组成的引物对进行PCR扩增，只显示单一扩增产物且大小为1341bp的菌株为YH66-RS10865基因编码区被敲除的阳性菌株。
4、取步骤3筛选得到的菌株，再次采用引物P23和引物P24组成的引物对进行PCR扩增并测序，将测序正确的菌株命名为重组菌YPV-036。与谷氨酸棒杆菌CGMCC21260的基因组DNA相比，重组菌YPV-036的差异仅在于缺失了序列表的序列4所示的DNA分子。
实施例5、发酵制备L-缬氨酸
供试菌株分别为：谷氨酸棒杆菌CGMCC21260、重组菌YPV-031、重组菌YPV-032、重组菌YPV-033、重组菌YPV-034、重组菌YPV-035和重组菌YPV-036。
发酵罐：BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)。
发酵培养基的配方见表3，余量为水。
表3发酵培养基配方
成分 含量
硫酸铵 14g/L
磷酸二氢钾 1g/L
磷酸氢二钾 1g/L
硫酸镁 0.5g/L
酵母粉 2g/L
硫酸亚铁 18mg/L
硫酸锰 4.2mg/L
生物素 0.02mg/L
维生素B1 2mg/L
消泡剂antifoam(CB-442) 0.5mL/L
葡萄糖(底糖) 40g/L
发酵控制工艺见表4。
完成接种的初始时刻，体系OD值为0.3-0.5。
发酵过程中：用于调pH的为氨水；发酵体系中有泡沫时，加入适量消泡剂antifoam(CB-442)；通过补加70％葡萄糖水溶液控制体系含糖量(残糖)。
表4发酵控制工艺
Figure BDA0003228737220000101
Figure BDA0003228737220000111
完成发酵后，收集上清，采用HPLC检测上清中的L-缬氨酸产量。
结果见表5。重组菌YPV-031和重组菌YPV-036的L-缬氨酸产量显著高于谷氨酸棒杆菌CGMCC21260。结果表明，抑制YH66-RS10865基因表达可以提高L-缬氨酸产量，过表达YH66-RS10865基因降低L-缬氨酸产量。
表5 L-缬氨酸发酵实验结果
菌株 OD<sub>610</sub> L-缬氨酸产量(g/L)
谷氨酸棒杆菌CGMCC21260 97.8 83.2
重组菌YPV-031 98.1 85.6
重组菌YPV-032 98.4 82.3
重组菌YPV-033 98.2 83.1
重组菌YPV-034 98.6 82.4
重组菌YPV-035 98.3 82.6
重组菌YPV-036 97.9 84.3
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司
<120> YH66-RS10865基因改造得到的工程菌及其在制备缬氨酸中的应用
<130> GNCYX211995
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 922
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Asp Gln Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro Ser Asp Asp Ser Asn
1 5 10 15
Phe Ala Met Ile Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Asp
20 25 30
Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu Asp Gly Leu Leu Gln
35 40 45
Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met Leu Arg Leu Leu Glu
50 55 60
Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val Ser Leu Pro Pro Met Thr Ser Thr Asp
65 70 75 80
Tyr Val Asn Thr Ile Pro Thr Ser Met Glu Pro Glu Phe Pro Gly Asp
85 90 95
Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp Ile Arg Trp Asn Ala Ala
100 105 110
Ile Met Val His Arg Ala Gln Arg Pro Gly Ile Gly Val Gly Gly His
115 120 125
Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr Glu Val Gly Phe Asn
130 135 140
His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly Gly Asp Gln Ile Phe
145 150 155 160
Phe Gln Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala Arg Ala Phe Met Glu
165 170 175
Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe Arg Gln Glu Val Ser
180 185 190
Arg Glu Gln Gly Gly Ile Pro Ser Tyr Pro His Pro His Gly Met Lys
195 200 205
Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Met Asp
210 215 220
Ala Ile Tyr Gln Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Glu Asn Arg Gly Ile
225 230 235 240
Lys Asp Thr Ser Asp Gln His Val Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu
245 250 255
Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu Ile Gln Gln Ala Ala Leu Asn
260 265 270
Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Gln Cys Asn Leu Gln Arg Leu
275 280 285
Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile Gln Glu Leu Glu Ser
290 295 300
Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val Ile Lys Val Val Trp Gly Arg
305 310 315 320
Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gln Asp Gly Ala Leu Val Glu
325 330 335
Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gln Thr Phe Lys Ala Asn
340 345 350
Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro Arg Thr
355 360 365
Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu Ile Trp Lys Leu Pro
370 375 380
Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala Ala Tyr Lys Arg Ala
385 390 395 400
Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val Ile Leu Ala His Thr Ile Lys
405 410 415
Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg Asn Ala Thr His Gln
420 425 430
Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu Phe Arg Asp Lys Gln
435 440 445
Gly Ile Pro Ile Thr Asp Glu Gln Leu Glu Lys Asp Pro Tyr Leu Pro
450 455 460
Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu Ile Lys Tyr Met Lys
465 470 475 480
Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Glu Arg Arg Glu Asn
485 490 495
Tyr Asp Pro Ile Gln Val Pro Pro Leu Asp Lys Leu Arg Ser Val Arg
500 505 510
Lys Gly Ser Gly Lys Gln Gln Ile Ala Thr Thr Met Ala Thr Val Arg
515 520 525
Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu Ala Asp Arg Leu Val
530 535 540
Pro Ile Ile Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly Leu Asp Ser Trp Phe
545 550 555 560
Pro Thr Leu Lys Ile Tyr Asn Pro His Gly Gln Asn Tyr Val Pro Val
565 570 575
Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala Pro Glu Gly Gln Ile
580 585 590
Leu His Glu Gly Ile Asn Glu Ala Gly Ser Met Ala Ser Phe Ile Ala
595 600 605
Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala Met Ile Pro Leu Tyr
610 615 620
Ile Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gln Arg Thr Gly Asp Ser Ile Trp
625 630 635 640
Ala Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Gly Phe Leu Leu Gly Ala Thr Ala
645 650 655
Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gln His Met Asp Gly His
660 665 670
Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val Glu Thr Tyr Asp Pro
675 680 685
Ser Phe Ala Tyr Glu Ile Ala His Leu Val His Arg Gly Ile Asp Arg
690 695 700
Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val Ile Tyr Tyr Ile Thr Ile
705 710 715 720
Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gln Pro Ala Glu Pro Glu Gly Leu Asp Val
725 730 735
Glu Gly Leu His Lys Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Arg Gly Glu Gly Thr
740 745 750
Gly His Glu Ala Asn Ile Leu Ala Ser Gly Val Gly Met Gln Trp Ala
755 760 765
Leu Lys Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ala Asp Tyr Gly Val Arg Ala Asn
770 775 780
Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala Arg Asp Gly Ala Ala
785 790 795 800
Arg Asn Lys Ala Gln Leu Arg Asn Pro Gly Ala Asp Ala Gly Glu Ala
805 810 815
Phe Val Thr Thr Gln Leu Lys Gln Thr Ser Gly Pro Tyr Val Ala Val
820 825 830
Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gln Ile Arg Glu Trp Val Pro
835 840 845
Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly Phe Ser Asp Thr
850 855 860
Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn Ile Asp Ala Glu Ser Ile Val
865 870 875 880
Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly Lys Ile Asp Val Ser
885 890 895
Val Ala Ala Gln Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu Asp Asp Pro Thr Ser
900 905 910
Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu
915 920
<210> 2
<211> 2769
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccgatc aagcaaaact tggtggcaag ccctcggatg actctaactt cgcgatgatc 60
cgcgatggcg tggcatctta tttgaacgac tcagatccgg aggagaccaa cgagtggatg 120
gattcactcg acggattact ccaggagtct tctccagaac gtgctcgtta cctcatgctt 180
cgtttgcttg agcgtgcatc tgcaaagcgc gtatctcttc ccccaatgac gtcaaccgac 240
tacgtcaaca ccattccaac ctctatggaa cctgaattcc caggcgatga ggaaatggag 300
aagcgttacc gtcgttggat tcgctggaac gcagccatca tggttcaccg cgctcagcga 360
ccaggcatcg gcgtcggcgg gcacatttcc acttacgcag gcgcagcccc tctgtacgaa 420
gttggcttca accacttctt ccgcggcaag gatcacccag gcggcggcga ccagatcttc 480
ttccagggcc acgcatcacc aggtatgtac gcacgtgcat tcatggaggg tcgcctttct 540
gaagacgatc tcgatggctt ccgtcaggaa gtttcccgtg agcagggtgg tattccgtcc 600
taccctcacc cacacggtat gaaggacttc tgggagttcc caactgtgtc catgggtctt 660
ggcccaatgg atgccattta ccaggcacgt ttcaaccgct acctcgaaaa ccgtggcatc 720
aaggacacct ctgaccagca cgtctgggcc ttccttggcg acggcgaaat ggacgagcca 780
gaatcacgtg gtctcatcca gcaggctgca ctgaacaacc tggacaacct gaccttcgtg 840
gttcaatgca acctgcagcg tctcgacgga cctgtccgcg gtaacaccaa gatcatccag 900
gaactcgagt ccttcttccg tggcgcaggc tggtctgtga tcaaggttgt ttggggtcgc 960
gagtgggatg aacttctgga gaaggaccag gatggtgcac ttgttgagat catgaacaac 1020
acctccgatg gtgactacca gaccttcaag gctaacgacg gcgcatatgt tcgtgagcac 1080
ttcttcggac gtgacccacg caccgcaaag ctcgttgaga acatgaccga cgaagaaatc 1140
tggaagctgc cacgtggcgg ccacgattac cgcaaggttt acgcagccta caagcgagct 1200
cttgagacca aggatcgccc aaccgtcatc cttgctcaca ccattaaggg ctacggactc 1260
ggccacaatt tcgaaggccg taacgcaacc caccagatga agaagctgac gcttgatgat 1320
ctgaagttgt tccgcgacaa gcagggcatc ccaatcaccg atgagcagct ggagaaggat 1380
ccttaccttc ctccttacta ccacccaggt gaagacgctc ctgaaatcaa gtacatgaag 1440
gaacgtcgcg cagcgctcgg tggctacctg ccagagcgtc gtgagaacta cgatccaatt 1500
caggttccac cactggataa gcttcgctct gtccgtaagg gctccggcaa gcagcagatc 1560
gctaccacca tggcgactgt tcgcaccttc aaggaactga tgcgcgataa gggcttggct 1620
gatcgccttg tcccaatcat tcctgatgag gcacgtacct tcggtcttga ctcttggttc 1680
ccaaccttga agatctacaa cccgcacggt cagaactacg tgcctgttga ccacgacctg 1740
atgctctcct accgtgaggc acctgaagga cagatcctgc acgaaggcat caacgaggct 1800
ggttccatgg catcgttcat cgctgcgggt acctcctacg ccacccacgg caaggccatg 1860
attccgctgt acatcttcta ctcgatgttc ggattccagc gcaccggtga ctccatctgg 1920
gcagcagccg atcagatggc acgtggcttc ctcttgggcg ctaccgcagg tcgcaccacc 1980
ctgaccggtg aaggcctcca gcacatggat ggacactccc ctgtcttggc ttccaccaac 2040
gagggtgtcg agacctacga cccatccttt gcgtacgaga tcgcacacct ggttcaccgt 2100
ggcatcgacc gcatgtacgg cccaggcaag ggcgaagatg ttatctacta catcaccatc 2160
tacaacgagc caaccccaca gccagctgag ccagaaggac tggacgtaga aggcctgcac 2220
aagggcatct acctctactc ccgcggtgaa ggcaccggcc atgaggcaaa catcttggct 2280
tccggtgttg gtatgcagtg ggctctcaag gctgcatcca tccttgaggc tgactacgga 2340
gttcgtgcaa acatttactc cgctacttct tgggttaact tggctcgcga tggcgctgct 2400
cgtaacaagg cacagctgcg caacccaggt gcagatgctg gcgaggcatt cgtaaccacc 2460
cagctgaagc agacctctgg cccatacgtc gcagtgtctg acttctccac tgatctgcca 2520
aaccagatcc gtgaatgggt cccaggcgac tacaccgttc tcggtgcaga tggcttcggt 2580
ttctctgata cccgcccagc tgctcgtcgc ttcttcaaca tcgacgctga gtccattgtt 2640
gttgcagtgc tgaactccct ggcacgcgaa ggcaagatcg acgtctccgt tgctgctcag 2700
gctgctgaga agttcaagtt ggatgatcct acgagtgttt ccgtagatcc aaacgctcct 2760
gaggaataa 2769
<210> 3
<211> 922
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
Met Ala Asp Gln Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro Ser Asp Asp Ser Asn
1 5 10 15
Phe Ala Met Ile Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Asp
20 25 30
Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu Asp Gly Leu Leu Gln
35 40 45
Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met Leu Arg Leu Leu Glu
50 55 60
Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val Ser Leu Pro Pro Met Thr Ser Thr Asp
65 70 75 80
Tyr Val Asn Thr Ile Pro Thr Ser Met Glu Pro Glu Phe Pro Gly Asp
85 90 95
Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp Ile Arg Trp Asn Ala Ala
100 105 110
Ile Met Val His Arg Ala Gln Arg Pro Gly Ile Gly Val Gly Gly His
115 120 125
Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr Glu Val Gly Phe Asn
130 135 140
His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly Gly Asp Gln Ile Phe
145 150 155 160
Phe Gln Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala Arg Ala Phe Met Glu
165 170 175
Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe Arg Gln Glu Val Ser
180 185 190
Arg Glu Gln Gly Gly Ile Pro Ser Tyr Pro His Pro His Gly Met Lys
195 200 205
Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Met Asp
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Ala Ile Tyr Gln Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Glu Asn Arg Gly Ile
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Lys Asp Thr Ser Asp Gln His Val Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu
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Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu Ile Gln Gln Ala Ala Leu Asn
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275 280 285
Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile Gln Glu Leu Glu Ser
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Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gln Asp Gly Ala Leu Val Glu
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Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gln Thr Phe Lys Ala Asn
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Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro Arg Thr
355 360 365
Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu Ile Trp Lys Leu Pro
370 375 380
Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala Ala Tyr Lys Arg Ala
385 390 395 400
Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val Ile Leu Ala His Thr Ile Lys
405 410 415
Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg Asn Ala Thr His Gln
420 425 430
Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu Phe Arg Asp Lys Gln
435 440 445
Gly Ile Pro Ile Thr Asp Glu Gln Leu Glu Lys Asp Pro Tyr Leu Pro
450 455 460
Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu Ile Lys Tyr Met Lys
465 470 475 480
Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Glu Arg Arg Glu Asn
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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Pro Ile Ile Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly Leu Asp Ser Trp Phe
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595 600 605
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Ala Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Gly Phe Leu Leu Gly Ala Thr Ala
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Glu Gly Leu His Lys Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Arg Gly Glu Gly Thr
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Gly His Glu Ala Asn Ile Leu Ala Ser Gly Val Gly Met Gln Trp Ala
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Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala Arg Asp Gly Ala Ala
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Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly Lys Ile Asp Val Ser
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Val Ala Ala Gln Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu Asp Asp Pro Thr Ser
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<211> 2769
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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ctgaccggtg aaggcctcca gcacatggat ggacactccc ctgtcttggc ttccaccaac 2040
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gaggaataa 2769
<210> 5
<211> 1364
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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ccaggcacgt ttcaaccgct acctcgaaaa ccgtggcatc aaggacacct ctgaccagca 600
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caccgcaaag ctcgttgaga acatgaccga cgaagaaatc tggaagctgc cacgtggcgg 1020
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<210> 6
<211> 4523
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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cgggttttct ggaacttttt gggcgtatgc tgggaatgat tctattattg ccaaatcaga 300
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ggttcacacc ctgttcgggg atttaggttt agacggactc tcgggaaact acaccgacac 480
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ccgatttgga tacctgaaat cccagtgagc gcaccactcc ccttacgtca cagtctgtaa 840
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ttcggcgtgt cacaattagg tacgaccaag aatgggaccg ggaaaccggg acgtataaac 960
gaaataaaac attccaacag gaggtgtgga aatggccgat caagcaaaac ttggtggcaa 1020
gccctcggat gactctaact tcgcgatgat ccgcgatggc gtggcatctt atttgaacga 1080
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cgtatctctt cccccaatga cgtcaaccga ctacgtcaac accattccaa cctctatgga 1260
acctgaattc ccaggcgatg aggaaatgga gaagcgttac cgtcgttgga ttcgctggaa 1320
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ggatcaccca ggcggcggcg accagatctt cttccagggc cacgcatcac caggtatgta 1500
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ctgggagttc ccaactgtgt ccatgggtct tggcccaatg gatgccattt accaggcacg 1680
tttcaaccgc tacctcgaaa accgtggcat caaggacacc tctgaccagc acgtctgggc 1740
cttccttggc gacggcgaaa tggacgagcc agaatcacgt ggtctcatcc agcaggctgc 1800
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acctgtccgc ggtaacacca agatcatcca ggaactcgag tccttcttcc gtggcgcagg 1920
ctggtctgtg atcaaggttg tttggggtcg cgagtgggat gaacttctgg agaaggacca 1980
ggatggtgca cttgttgaga tcatgaacaa cacctccgat ggtgactacc agaccttcaa 2040
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ccgcaaggtt tacgcagcct acaagcgagc tcttgagacc aaggatcgcc caaccgtcat 2220
ccttgctcac accattaagg gctacggact cggccacaat ttcgaaggcc gtaacgcaac 2280
ccaccagatg aagaagctga cgcttgatga tctgaagttg ttccgcgaca agcagggcat 2340
cccaatcacc gatgagcagc tggagaagga tccttacctt cctccttact accacccagg 2400
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ctacaccgtt ctcggtgcag atggcttcgg tttctctgat acccgcccag ctgctcgtcg 3600
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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ggaacgtcgc gcagcgctcg gtggctacct gccagagcgt cgtgagaact acgatccaat 1740
tcaggttcca ccactggata agcttcgctc tgtccgtaag ggctccggca agcagcagat 1800
cgctaccacc atggcgactg ttcgcacctt caaggaactg atgcgcgata agggcttggc 1860
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cccaaccttg aagatctaca acccgcacgg tcagaactac gtgcctgttg accacgacct 1980
gatgctctcc taccgtgagg cacctgaagg acagatcctg cacgaaggca tcaacgaggc 2040
tggttccatg gcatcgttca tcgctgcggg tacctcctac gccacccacg gcaaggccat 2100
gattccgctg tacatcttct actcgatgtt cggattccag cgcaccggtg actccatctg 2160
ggcagcagcc gatcagatgg cacgtggctt cctcttgggc gctaccgcag gtcgcaccac 2220
cctgaccggt gaaggcctcc agcacatgga tggacactcc cctgtcttgg cttccaccaa 2280
cgagggtgtc gagacctacg acccatcctt tgcgtacgag atcgcacacc tggttcaccg 2340
tggcatcgac cgcatgtacg gcccaggcaa gggcgaagat gttatctact acatcaccat 2400
ctacaacgag ccaaccccac agccagctga gccagaagga ctggacgtag aaggcctgca 2460
caagggcatc tacctctact cccgcggtga aggcaccggc catgaggcaa acatcttggc 2520
ttccggtgtt ggtatgcagt gggctctcaa ggctgcatcc atccttgagg ctgactacgg 2580
agttcgtgca aacatttact ccgctacttc ttgggttaac ttggctcgcg atggcgctgc 2640
tcgtaacaag gcacagctgc gcaacccagg tgcagatgct ggcgaggcat tcgtaaccac 2700
ccagctgaag cagacctctg gcccatacgt cgcagtgtct gacttctcca ctgatctgcc 2760
aaaccagatc cgtgaatggg tcccaggcga ctacaccgtt ctcggtgcag atggcttcgg 2820
tttctctgat acccgcccag ctgctcgtcg cttcttcaac atcgacgctg agtccattgt 2880
tgttgcagtg ctgaactccc tggcacgcga aggcaagatc gacgtctccg ttgctgctca 2940
ggctgctgag aagttcaagt tggatgatcc tacgagtgtt tccgtagatc caaacgctcc 3000
tgaggaataa gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgat 3044
<210> 8
<211> 1415
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagtcgg ccactttaat aatcctcctc 60
gtgtgggccc cgatgtgttt ttcgattaca tggattcaac atgaaaccgc ggggctattg 120
atatatccga attgcacatt accgtccaac cggtactttg aaccaccttt ccctggaatt 180
ttttcctttt cctccccctt tacgctcaag aatcaatgaa ttcaatcact ggccagcgat 240
taacttttcg agttttcagt cttggatttc cacaattctc ttcaaaataa tggtggctag 300
atttttcatc aaaccttcac caaaaggaca tcagacctgt agttttatgc gattcgcgtc 360
aaacgtgaga gaaacatcac atctcgcggg aaactacccg ataattcttt gcaaaacttt 420
gcaaagcgga atgaacatgc agctagtttc cgtagaaatg ttctttaaaa aatccacaac 480
aattgccagg aagcacaccg attgatggat acctgaaatc ccagtgagcg caccactccc 540
cttacgtcac agtctgtaaa acaaatcttc ggtgttgcgt atccttgtta ataacttatg 600
cgttgactca ttcgtgcact tcggcgtgtc acaattaggt acgaccaaga atgggaccgg 660
gaaaccggga cgtataaacg aaataaaaca ttccaacagg aggtgtggaa atcacctcaa 720
gggacagata aatcccgccg ccagacgtta gtctggcggc gggattcgtc gtaaagcaag 780
ctctttttag ccgaggaacg ccttgtcaga caatgttgcg cccttgatgt tggcgaactc 840
ctgcagcaaa tcgcgcacag tcaacttcga cttggtagcc tgatctgcct ggtagacaat 900
ctggccttca tgcatcatga tcaggcgatt gcccaggcga attgcctgtt ccatgttgtg 960
cgtgaccata agcgtagtca gagttccatc tgccacgatc ttttcggtca aggtggtcac 1020
aagctctgca cgctgtggat caagtgctgc ggtgtgctca tccaacagca tgattttagg 1080
ttgagtaaaa ccagccatca gcagggacaa tgcctgacgc tgaccgccag agagcaaacc 1140
aactttggca gtgagcctgt tttccagacc cagctcgagg cgctcaagtt cctgcttgaa 1200
ttgctcacgg cgcttcgagg tcagtgcaaa gcccaatcca cggcgcttgc cgcgcagcaa 1260
cgcgatggcc agattctctt caatggtgag attcggcgcg gtgccggcca gaggatcctg 1320
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<210> 9
<211> 4110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgaattcaat cactggccag cgattaactt ttcgagtttt cagtcttgga tttccacaat 240
tctcttcaaa ataatggtgg ctagattttt catcaaacct tcaccaaaag gacatcagac 300
ctgtagtttt atgcgattcg cgtcaaacgt gagagaaaca tcacatctcg cgggaaacta 360
cccgataatt ctttgcaaaa ctttgcaaag cggaatgaac atgcagctag tttccgtaga 420
aatgttcttt aaaaaatcca caacaattgc caggaagcac accgattgat ggatacctga 480
aatcccagtg agcgcaccac tccccttacg tcacagtctg taaaacaaat cttcggtgtt 540
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aggtacgacc aagaatggga ccgggaaacc gggacgtata aacgaaataa aacattccaa 660
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cccctctgta cgaagttggc ttcaaccact tcttccgcgg caaggatcac ccaggcggcg 1140
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gtggtattcc gtcctaccct cacccacacg gtatgaagga cttctgggag ttcccaactg 1320
tgtccatggg tcttggccca atggatgcca tttaccaggc acgtttcaac cgctacctcg 1380
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aaatggacga gccagaatca cgtggtctca tccagcaggc tgcactgaac aacctggaca 1500
acctgacctt cgtggttaac tgcaacctgc agcgtctcga cggacctgtc cgcggtaaca 1560
ccaagatcat ccaggaactc gagtccttct tccgtggcgc aggctggtct gtgatcaagg 1620
ttgtttgggg tcgcgagtgg gatgaacttc tggagaagga ccaggatggt gcacttgttg 1680
agatcatgaa caacacctcc gatggtgact accagacctt caaggctaac gacggcgcat 1740
atgttcgtga gcacttcttc ggacgtgacc cacgcaccgc aaagctcgtt gagaacatga 1800
ccgacgaaga aatctggaag ctgccacgtg gcggccacga ttaccgcaag gtttacgcag 1860
cctacaagcg agctcttgag accaaggatc gcccaaccgt catccttgct cacaccatta 1920
agggctacgg actcggccac aatttcgaag gccgtaacgc aacccaccag atgaagaagc 1980
tgacgcttga tgatctgaag ttgttccgcg acaagcaggg catcccaatc accgatgagc 2040
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tcaagtacat gaaggaacgt cgcgcagcgc tcggtggcta cctgccagag cgtcgtgaga 2160
actacgatcc aattcaggtt ccaccactgg ataagcttcg ctctgtccgt aagggctccg 2220
gcaagcagca gatcgctacc accatggcga ctgttcgcac cttcaaggaa ctgatgcgcg 2280
ataagggctt ggctgatcgc cttgtcccaa tcattcctga tgaggcacgt accttcggtc 2340
ttgactcttg gttcccaacc ttgaagatct acaacccgca cggtcagaac tacgtgcctg 2400
ttgaccacga cctgatgctc tcctaccgtg aggcacctga aggacagatc ctgcacgaag 2460
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gtgactccat ctgggcagca gccgatcaga tggcacgtgg cttcctcttg ggcgctaccg 2640
caggtcgcac caccctgacc ggtgaaggcc tccagcacat ggatggacac tcccctgtct 2700
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cttgtgctct gacatcttgt ttacattgtt 4110

Claims (10)

1.用于抑制YH66-RS10865基因表达的物质或降低YH66-RS10865蛋白丰度的物质或降低YH66-RS10865蛋白活性的物质的应用；
所述应用为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：
(Ⅰ)在提高细菌缬氨酸产量中的应用；
(Ⅱ)在生产缬氨酸中的应用；
所述YH66-RS10865基因为编码YH66-RS10865蛋白的基因；
所述YH66-RS10865蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；
(a2)来源于细菌且与(a1)具有95％以上同一性且与细菌产缬氨酸相关的蛋白质；
(a3)将(a1)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与细菌产缬氨酸相关的由(a1)衍生的蛋白质。
2.一种重组菌，是抑制细菌中的YH66-RS10865基因表达得到的；所述YH66-RS10865基因为权利要求1中所述的YH66-RS10865基因。
3.权利要求2所述重组菌在制备缬氨酸中的应用。
4.一种制备缬氨酸的方法，包括如下步骤：发酵权利要求2所述重组菌。
5.一种提高细菌的缬氨酸产量的方法，包括如下步骤：抑制细菌中的YH66-RS10865基因表达或降低细菌中YH66-RS10865蛋白丰度或降低细菌中YH66-RS10865蛋白活性；
所述YH66-RS10865基因为权利要求1中所述的YH66-RS10865基因；
所述YH66-RS10865蛋白为权利要求1中所述的YH66-RS10865蛋白。
6.YH66-RS10865蛋白在调控细菌的缬氨酸产量中的应用；所述YH66-RS10865蛋白为权利要求1中所述的YH66-RS10865蛋白。
7.突变蛋白，是将YH66-RS10865蛋白第282位氨基酸残基由N突变为其他氨基酸残基得到的；所述YH66-RS10865蛋白为权利要求1中所述的YH66-RS10865蛋白。
8.权利要求7所述突变蛋白的编码基因或具有权利要求7所述突变蛋白的编码基因的表达盒或具有权利要求7所述突变蛋白的编码基因的重组载体或具有权利要求7所述突变蛋白的编码基因的重组菌。
9.权利要求7所述突变蛋白、权利要求8所述编码基因、权利要求8所述表达盒、权利要求8所述重组载体或权利要求8所述重组菌在制备缬氨酸中的应用。
10.一种提高细菌的缬氨酸产量的方法，包括如下步骤：使细菌基因组DNA中编码的YH66-RS10865蛋白的第282位氨基酸残基的密码子由编码N的密码子突变为编码其他氨基酸残基的密码子；所述YH66-RS10865蛋白为权利要求1中所述的YH66-RS10865蛋白。
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