KR100630836B1 - 인-실리코 분석을 통한 균주 개량방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인-실리코(in-silico) 분석을 통한 균주 개량방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 게놈정보를 비교하는 방법으로 유용물질 과생산에 불필요한 유전자를 1차적으로 스크리닝하고, 대사흐름 분석기법을 이용한 가상 시뮬레이션을 통해 결실 대상유전자를 2차적으로 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 인-실리코(in-silico) 균주 개량방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 대사공학적인 접근 방법과 유전공학적인 방법을 이용하여 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주와 유용물질을 다량 생산하는 균주의 유전자 게놈상의 유전자들을 비교분석함으로써 후보 유전자를 스크리닝하고, 상기 스크리닝된 유전자들로부터 구성할 수 있는 다양한 결실 대상유전자의 조합들을 대상으로 인-실리코 (in-silico) 시뮬레이션을 수행하여 유용물질의 생산성이 개선된 변이균주를 효율적으로 선발할 수 있어, 실제 웨트(wet) 실험에 드는 시간, 노력과 비용을 획기적으로 줄일 수 있다.
대사흐름, 균주개량, 유용물질, 숙신산, 게놈, 대사공학, 맨하이미아

Description

인-실리코 분석을 통한 균주 개량방법{Method for Improving a Strain Based on In-Silico Analysis}
도 1은 본 발명에 따른 균주개량방법의 과정을 도시한 것이다
도 2는 본 발명에 따라 유용물질 생산균주를 개량하기 위한 후보 유전자의 스크리닝 방법을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따라 숙신산 생산균주를 개량하기 위한 후보 유전자를 스크리닝하고 변이 대장균을 제작하는 과정을 도시한 것이다.
도 4는 숙신산을 다량 생산하는 균주인 맨하이미아 (A)와 유용물질을 실제로 생산하고자 하는 대상 균주인 대장균(B)의 대사 경로를 대비하여 도시한 것이다.
도 5a 및 도 5b는 숙신산 생성과 비증식속도간의 트레이드 오프 커브(trade off curve)를 도시한 것이다. 도 5a는 하나의 유전자 결실에 따른 트레이드-오프 커브(-○-: ptsG; -■-: ΔaceBA; -△-: wild type/ pykFA/ sdhA/ mqo) 이고, 도 5b는 두 개의 유전자 결실에 따른 가능한 모든 10개의 조합에 대한 트레이드-오프 커브(-○-: ΔptsGΔpykAF; -■-: ΔptsGΔmqo/ ΔptsGΔsdhA/ ΔptsGΔaceBA; -△-: ΔpykAFΔmqo/ ΔpykAFΔsdhA/ ΔpykAFΔaceBA/ ΔmqoΔsdhA/ ΔmqoΔaceBA/ ΔsdhAΔaceBA)이다.
도 6은 메타플럭스 넷을 이용한 트레이드 오프 커브의 작성예를 도시한 것이다.
발명의 분야
본 발명은 인-실리코(in-silico) 분석을 통한 균주 개량방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 게놈정보를 비교하는 방법으로 유용물질 과생산에 불필요한 유전자를 1차적으로 스크리닝하고, 대사흐름 분석기법을 이용한 가상 시뮬레이션을 통해 결실대상 유전자를 2차적으로 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 인-실리코(in-silico) 균주 개량방법에 관한 것이다.
발명의 배경
대사 흐름 연구는 유전자 재조합기술과 관련 분자생물학 기술을 이용하여 새로운 대사회로를 도입하거나 기존의 대사회로를 제거ㅇ증폭 또는 변경시켜 세포나 균주의 대사특성을 우리가 원하는 방향으로 바꾸는 데 필요한 다양한 정보를 제공한다. 이러한 대사 흐름 연구는 기존 대사산물의 과량생산, 신규 대사산물의 생산, 원하지 않는 대사산물의 생산 저해, 값싼 기질의 이용 등의 생물공학 전반의 내용 을 포함하고 있다. 이와 함께 새롭게 개발되어 증가하는 생물정보학의 도움으로 다양한 종의 게놈 정보로부터 각 대사 네트워크 모델이 구축이 가능 하게 되었다. 이러한 대사 네트워크 정보와 대사흐름 분석기술과 결합을 통하여 현재 다양한 1차 대사산물 및 유용 단백질 생산의 산업적 응용 가능성을 보여주고 있다(Hong et al., Biotech. Bioeng, 83:854, 2003; US 2002/0168654).
일반적으로 세포 대사를 분석하는 수학적 모델은 두 가지로 나눌 수 있다. 동적 및 조절 기작 정보가 포함된 모델과 단순히 생화학반응식의 계수만을 고려한 정적 모델이 그것이다. 동적 모델은 시간에 따른 세포 내부의 변화를 예측하여 세포의 동적 상태를 묘사한다. 그러나 동적 모델은 많은 동적 매개변수를 필요로 하므로 실제의 세포 내부를 정확히 예측하는 데 문제점을 가지고 있다.
반면 정적 수학 모델은 대사 흐름을 단지 생화학 반응식의 질량수지와 세포조성 정보만을 이용하여 가능한 세포가 도달 가능한 이상적인 대사 흐름 공간을 구한다. 이러한 대사흐름분석 (Metabolic flux analysis; MFA)은 동적 정보를 필요로 하지 않음에도 세포의 이상적인 대사흐름을 보여주며 실제적으로 세포의 행동을 정확히 모사하는 것으로 알려져 있다 (Varma et al., Bio-Technol, 12:994, 1994; Nielsen et al., Bioreaction Engineering Principles, Plenum Press, 1994; Lee et al., Metabolic Engineering, Marcel Dekker, 1999).
대사흐름분석은 대사 반응식의 계수와 여러 대사산물의 생산 및 소모량을 측정함으로써, 내부의 대사흐름의 변화를 파악하는 기술이다 . 대사흐름분석은 준정 상상태 가정을 기반으로 하고 있다. 즉, 외부의 환경변화에 따른 내부의 대사산물농도 변화는 매우 즉각적이므로, 일반적으로 이의 변화를 무시하고 내부의 대사산물의 농도가 변화하지 않는다고 가정하는 것이다.
모든 대사물질과 대사경로 그리고 경로에서의 화학양론 매트릭스(stoichiometric matrix) (S ij T , metabolite i in the j reaction)가 알려져 있다면, 대사흐름벡터 (v j , flux of j pathway)를 계산할 수 있는데, 시간에 따른 대사산물 X의 변화는 모든 대사 반응의 흐름의 합으로 나타낼 수 있다. 그리고 시간에 따라 X의 변화량이 일정하다고 가정하면, 즉 준정상상태 가정 하에서, 아래의 식으로 정의된다.
S T v = dX/dt = 0
하지만, 경로만이 알려져 있고, 양론값(stoichiometric value for each metabolite and pathway)과 대사흐름(vj)이 부분적으로 알려진 경우가 많아 위의 식은 다음과 같이 확장된다.
S T v = S m v m + S u v u = 0
상기 식에서, 실험적으로 알려진 양론값(S m (I×M), I=total metabolite number, M=total stoichiometrically-known reaction number)과 흐름(v m (M×I))의 내적으로 정의된 행렬과 알려지지 않은 양론값(S u (I×M))과 흐름(v u (M×I))의 곱으 로 된 두 행렬로 분리된다. 이때 m 은 측정값, u 는 측정이 가능하지 않은 값들에 대한 첨자이다.
여기서 알려지지 않은 흐름 벡터(S u )의 rank(S u )가 u 보다 같거나 크다면(즉, 방정식보다 변수의 수가 같거나 적으면) 단순한 행렬 계산으로 흐름이 구해진다. 단, 큰 경우는 (중첩된 방정식이 존재한다면) 좀 더 정확한 값의 계산을 위해 전체 방정식의 일관성과, 대사 흐름의 측정값들에 대한 정확도 그리고 준정상상태의 타당성의 검증 작업이 수행된다.
만일 방정식보다 변수의 수가 크다면 특정 대사반응의 흐름값은 특정범위로 한정되어 질 수 있는 등의 여러 물리 화학적 제한식과 특정 목적함수를 이용하는 선형 계획법(linear programming)을 이용하여 최적 대사흐름분포를 구한다. 이는 아래와 같이 계산할 수 있다.
minimize/maximize : Z = ∑ c i v i
s.t. S T v = 0 and α min,i ≤ v i ≤ α max,i
c i 는 가중치이고, v i 는 대사흐름이다. 일반적으로 생체 조성 형성속도 (biomass formation rate) 즉, 비성장속도 (specific growth rate) 의 최대화, 대사산물 생산최대화, 부산물 생산 최소화 등이 목적함수로 사용되어 지고 있다. α max,i 및 α min,i 은 각 대사흐름이 가질 수 있는 제한값으로서 각 대사흐름이 허용하는 최소값과 최대값을 지정할 수 있다.
지금까지 유용 대사산물을 최대한 생산하기 위하여 균주를 개량하는 방법이 여러 가지 제시되어 왔으나, 유전자를 스크리닝하고 생산성이 우수한 균주를 확인하는 과정이 번거로워 균주개량에 어려움이 있었다. 위에서 살펴 본 대사흐름분석은 균주개량을 통하여 원하는 대사산물의 최대 생산 수율의 계산 등을 위하여 사용될 수 있으며, 이를 이용하여 균주내부의 대사회로 특성을 파악할 수 있다. 이러한 대사회로의 특성을 파악함으로부터 조작이 필요한 대사회로를 파악하고 대사회로 조작을 위한 전략수립을 통하여, 가장 효율적인 방법으로 대사흐름을 조작하고 원하는 대사산물을 생산할 수 있다.
이에 본 발명자들은 실제 유용물질을 생산하고자 하는 균주와 유용물질의 과량생산균주간의 중심 대사 경로상의 게놈정보를 비교하여 유용물질을 과생산하는 균주에 존재하지 않으면서 실제 조작을 하고자 하는 대상 균주에 존재하는 유전자들에 대하여 세포성장에 필수적이지 않거나 방해가 되는 유전자를 1차적으로 스크리닝하고, 이러한 결실대상 후보 유전자들의 다양한 조합을 대상으로 대사흐름 분석기술을 이용하여 비증식속도와 유용물질의 형성속도를 동시에 고려하여 최종 결실시킬 유전자를 선발함으로써 균주를 간단하게 개량할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
결국 본 발명의 주된 목적은 게놈정보와 대사흐름 분석 기술을 이용하여 유 용물질을 생산하고자 하는 대상 균주를 개량하는 인-실리코(in-silico) 균주 개량방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 인-실리코(in-silico) 균주 개량방법을 이용하여 숙신산을 생산하고자 하는 대상 균주를 개량하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의하여 개량된 숙신산 다량생산 변이균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주 및 유용물질 과생산균주를 선정하고, 두 가지 균주의 대사흐름분석 모델시스템을 구축하는 단계; (b) 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 존재하고, 세포성장에 필수적이지 않거나 방해가 되는 유전자 중에서 유용물질을 과생산하는 균주에는 존재하지 않는 유전자들을 스크리닝하는 단계; (c) 상기 스크리닝된 유전자들로부터 결실대상 유전자의 조합을 구성하는 단계; (d) 상기 (a) 단계에서 구축된 대사흐름분석 모델시스템을 이용하되, 상기 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주로부터 상기 (c) 단계에서 구성된 유전자의 조합을 각각 결실시킨 변이균주를 대상으로 인-실리코 (in-silico) 시뮬레이션을 수행하는 단계; (e) 상기 시뮬레이션 결과로부터 비증식속도 대비 유용물질 생산수율이 우수한 결실대상 유전자의 조합을 선별하는 단계; 및 (f) 상기 선별된 유전자의 조합을 결실시킨 변이균주를 제작하는 단계를 포함하는 유용물질 생산균주의 개량방법을 제공한다.
본 발명에 따른 유용물질 생산균주의 개량방법은 (g) 상기 제작된 변이균주를 배양하여 유용물질의 생산성을 실험적으로 확인하는 단계를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 인-실리코 (in-silico) 시뮬레이션은 생산물 형성속도(product formation rate)와 비증식속도(specific growth rate)의 트레이드 오프 커브(trade off curve)를 작성하고, 변이균주의 비증식속도와 유용물질의 수율을 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 숙신산을 생산하고자 하는 대상 균주 및 숙신산 과생산균주를 선정하고, 두 가지 균주의 대사흐름분석 모델시스템을 구축하는 단계; (b) 숙신산을 생산하고자 하는 대상 균주에 존재하고, 세포성장에 필수적이지 않거나 방해가 되는 유전자 중에서 숙신산을 과생산하는 균주에는 존재하지 않는 유전자들을 스크리닝하는 단계; (c) 상기 스크리닝된 유전자들로부터 결실대상 유전자의 조합을 구성하는 단계; (d) 상기 (a) 단계에서 구축된 대사흐름분석 모델시스템을 이용하되, 상기 숙신산을 생산하고자 하는 대상 균주로부터 상기 (c) 단계에서 구성된 유전자의 조합을 각각 결실시킨 변이균주를 대상으로 인-실리코 (in-silico) 시뮬레이션을 수행하는 단계; (e) 상기 시뮬레이션 결과로부터 비증식속도 대비 숙신산 생산수율이 우수한 결실대상 유전자의 조합을 선별하는 단계; 및 (f) 상기 선별된 유전자의 조합을 결실시킨 변이균주를 제작하는 단계를 포함하는 숙신산 생산균주의 개량방법을 제공한다.
본 발명에 따른 숙신산 생산균주의 개량방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 스크리닝된 유전자는 ptsG, pykF, pykA, mqo, sdhA, sdhB, sdhC, sdhD, aceB 및 aceA로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 (e) 단계에서 선별된 결실대상 유전자의 조합은 ptsG, pykF 및 pykA인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 숙신산 생산균주의 개량방법은 (g) 상기 제작된 변이균주를 배양하여 숙신산의 생산성을 실험적으로 확인하는 단계를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 인-실리코 (in-silico) 시뮬레이션은 숙신산 형성속도(product formation rate)와 비증식속도(specific growth rate)의 트레이드 오프 커브(trade off curve)를 작성하고, 변이균주의 비증식속도와 숙신산의 수율을 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 숙신산을 과생산하는 생산균주는 맨하이미아(Mannheimia) 속인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 맨하이미아 속 균주는 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens MBEL55E: KCTC 0769BP)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 숙신산을 생산하고자 하는 대상 균주는 대장균인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, ptsG, pykF 및 pykA 유전자가 결실되어 있고, 숙신산 고생성능을 가지는 변이균주 및 상기 변이균주를 혐기조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 변이균주는 ptsG, pykF 및 pykA 유전자가 결실된 대장균인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 유전자 "결실"이란 유전자의 염기서열 중 전체 혹은 일부를 제거하거나 변경시키는 등의 특정 유전자가 작동하지 않도록 하는 조작을 모두 포괄한다.
본 발명에서는 인위적으로 세포내 대사회로를 바꾸기 위해 특정 유전자를 결실시킨 결과에 대해 인-실리코 (in-silico)로 예측할 수 있는 새로운 목적 유전자를 스크리닝(target gene screening)하여 균주를 개량하는 방법을 개발하였다.
본 발명에 따른 균주의 개량을 위해, 유용물질을 과생산하는 균주에 존재하지 않으면서 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 존재하고 세포성장에 필수적이지 않거나 방해가 되는 유전자를 1차적으로 스크리닝한다.
이후 상기 스크리닝된 유전자 하나 또는 그 이상의 조합을 만들고, 이러한 후보 유전자들을 대사흐름 분석 프로그램을 이용하여 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에서 결실시켰을 때, 비증식속도 대비 유용물질의 형성수율이 높은 유전자를 2차적으로 스크리닝한다.
상기 2차적으로 스크리닝된 유전자의 조합을 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에서 결실시킨 변이균주를 제작하고, 제작된 변이균주를 배양하여 유용물질의 생산성을 확인한다.
도 1은 상기 방법에 따라 숙신산을 다량 생산하는 균주를 선별하는 방법의 전체적인 과정을 도시한 것이다. 즉, 숙신산 경로에 대하여 유용물질을 과생산하는 균주에 존재하지 않으면서 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 존재하고 세포성장에 필수적이지 않거나 방해가 되는 유전자를 1차적으로 스크리닝한 후, 대사흐 름 분석기술을 이용하여 비증식속도 및 숙신산 생산 곡선을 비교한 후, 상기 후보 유전자의 조합으로 변이균주를 제작한다.
도 2에는 유용물질 생산균주를 개량하기 위해, 게놈정보를 이용하여 후보 유전자를 1차 스크리닝하는 방법을 도시하였다. 즉, 1차 스크리닝에서는 유전자들의 유무를 균주에 따라 비교하여 유전자 변이를 일으켰을 때 특별한 변화를 일으키지 않는 유전자를 선별한다.
본 발명에서는 그러한 유전자로서, 유용물질 과생산균주와 유용물질을 직접 생산하고자 하는 대상 균주에서 유용물질을 과생산하는 균주에 존재하지 않으면서 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 존재하고 세포성장에 필수적이지 않거나 방해가 되는 유전자를 스크리닝하였다.
상기 스크리닝된 유전자를 이용하여 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주의 돌연변이를 만들고 인-실리코(in-silico) 시뮬레이션을 하고, 유용물질의 생산성이 개선된 균주를 선별한 후, 이를 실제 배양 실험을 통하여 생산성을 최종 확인하였다.
본 발명에서는 상기 방법을 적용하기 위한 모델 시스템으로 대장균 변이균주와 재조합 대장균을 선정하여 숙신산 생산에 적용하였다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 숙신산 과생산 균주인 맨하이미아 숙시니프로듀센스 (Mannheimia succiniciproducens)를 이용하여 숙신산 생산균주로 대장균의 개량방법을 예시하였으나, 숙신산을 과생산 균주로 다른 균주를 사용하는 것과 숙신산 생산균주로 대장균 이외의 다른 균주를 사용하는 것은 본 발명의 기재사항으로부터 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다. 또한, 하기 실시예에서는 유용물질로 숙신산을 예시하였으나, 숙신산 이외의 다른 유용물질을 생산하는 균주를 개량하는 것 역시 본 발명의 기재사항으로부터 당업자에게 자명하다 할 것이다.
실시예 1 : 모델 시스템의 구축
모델 시스템으로는 대장균의 변이균주와 재조합 대장균, 그리고 대장균 이외의 숙신산 생산 균주인 야생의 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens)를 선정하였다. 이를 위해 대장균과 맨하이미아의 새로운 대사흐름분석 시스템을 구축하였다.
A. 대장균
대장균의 경우 새로운 대사회로는 979개의 생화학 반응으로 구성되어 있으며, 814개의 대사산물이 대사회로 상에 고려하였다. 이 시스템은 대장균의 거의 대부분의 대사회로를 포함하고 있으며 대사흐름 분석에 있어서 목적함수로 사용할 균주의 생체 조성 형성속도 (biomass formation) 식을 구성하기 위한 대장균의 생체 조성은 다음과 같다 (Neidhardt et al., Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 1996).
55% 단백질, 20.5% RNA, 3.1% DNA, 9.1% 지질(lipids), 3.4% 지다당류(lipopolysaccharides), 2.5% 펩티도글리칸(peptidoglycan), 2.5% 글리코겐(glycogen), 0.4% 폴리아민(polyamines), 3.5% 기타 대사산물(other metabolites), 조효소(cofactors), 및 이온.
B. 맨하이미아
게놈의 전체적인 해독과 기능의 분석이 이루어진 균주인 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens MBEL55E: KCTC 0769BP)는 한우의 반추위에서 직접 분리해낸 한국 토종 균주로, 다방면의 산업분야에서 널리 사용되고 있는 숙신산(succinic acid, 일명 호박산으로도 불림)을 과량으로 생산할 수 있는 능력을 지니고 있다.
맨하이미아 게놈은 2,314,078개의 염기로 구성되어 있으며(Hong et al., Nat. Biotechnol., 22:1275, 2004), 2,384개의 유전자 후보를 보유하고 있다는 것을을 생물정보학(bioinformatics)적 기법을 통해 밝혀냈다. 맨하이미아의 유전자들은 원형의 게놈 전체에 걸쳐 분포되어 있으며, 세포내에서 작용하는 기능별로 분류되어, 전체적인 게놈이 보유하고 있는 특성을 예측하는 데 이용되었다.
게놈 정보의 전체적인 분석을 통해, 컴퓨터상에 맨하이미아의 가상적인 세포 모델을 구성하였다. 373개의 효소반응식과 352개의 대사물질로 대사 네트워크를 구 성하였으며 이 결과를 토대로, 세포 내 대사회로의 변화를 비교할 수 있었다.
실시예 2 : 목적 유전자 스크리닝
숙신산을 과생산하는 맨하이미아의 중심 대사경로와 대장균의 중심 대사경로를 구축해놓은 BioSilico(http://biosilico.kaist.ac.kr)의 데이터베이스를 이용하여 시뮬레이션을 위한 모델을 구성하였다.
대사의 비교를 위하여 우선, 숙신산 경로에 대하여 유용물질을 과생산하는 균주인 맨하이미아 (A)와 숙신산을 생산하고자 하는 대상 균주상의 유전자인 대장균(B)의 대사 경로를 대비하여 도 4에 도시하였다. 이어서 중심 대사경로 상의 유전자를 비교하였을 때 숙신산 생산에 있어 대장균에 필요 없거나, 방해가 될 수 있는 유전자들을 선택하였다.
맨하이미아의 숙신산 생산을 위한 중심 대사경로상의 유전자와 대장균의 숙신산 생산을 위한 중심 대사경로상의 유전자를 비교한 결과, 대장균에만 존재하는 유전자는 ptsG, pykF, pykA, mqo, sdhABCD, aceBA, poxB 및 acs이다. 상기 유전자중 혐기조건에서 작동하지 않는다고 알려진 poxB 및 acs를 제외한 유전자를 숙신산 생산에 있어서 필요 없거나 방해가 될 수 있는 유전자 후보 유전자로서 1차적으로 스크리닝 하였다. ptsG, pykF, pykA, mqo, sdhABCD 및 aceBA가 그것이다.
실시예 3 : 변이균주의 스크리닝
일반적으로 미생물을 이용하여 특정 산물을 생산하기 위해서는 단순히 수율 외에 세포의 비증식속도 또한 고려해야 한다. 일반적으로 균주는 유용산물을 형성하기 위해 성장하지 않고 세포 구성성분을 최대로 하기 위해 자란다고 볼 수 있으며 이것은 비증식속도로 표현된다. 따라서 어떠한 유전자를 결실시켰을 때 유용산물을 극대화 하면서 비증식속도가 우수할 것인가를 예측하기 위해 대사흐름 분석 기술을 이용하였다.
1차적으로 고려된 후보 유전자들에 대해 하나의 유전자 결실 및 두 개의 조합에 따른 유전자 결실에 따른 수율과 비증식속도를 동시에 고려하기 위해 두 가지의 목적함수, 즉 유용산물의 형성속도와 비증식속도를 선택하여 x 축을 비증식속도 y 축을 유용산물의 형성속도로 하여 그 결과를 도시하였다 (도 5a 및 도 5b). 즉, 균주의 비증식속도 대비 최적의 생산물 수율을 얻을 수 있는 커브를 선택하여 목적의 대사회로에 해당하는 유전자 조합을 선택한다.
A. 복합 유전자 변이균주의 시뮬레이션
각 유전자의 조합(combination)에 대하여 복합 유전자 변이균주(multi-gene mutant)를 제작하려면 많은 조합의 돌연변이를 만들어야 한다. 현실적으로 이러한 많은 돌연변이를 실제 실험으로 만든다는 것은 불가능에 가까울 정도로 매우 어려우므로, 돌연변이 각각에 대해 구축해놓은 생산물 형성속도(product formation rate)와 비증식속도(specific growth rate)의 트레이드 오프 커브(trade off curve)를 구하는 시뮬레이션 시스템을 바탕으로 인-실리코 (in-silico) 시뮬레이션을 실행하였다. 시뮬레이션은 http://mbel.kaist.ac.kr/를 통해 다운 받을 수 있는 MetaFluxNet 1.6®을 이용하여 수행하였다 (Lee et al., Bioinformatics, 19:2144, 2003).
시뮬레이션에서 탄소원은 포도당을 이용하였으며 일반적으로 알려진 포도당 섭취속도인 10 mmol/g DCW·h 및 혐기 조건을 고려하기 위해 산소 섭취속도를 0으로 하였으며 고려되는 유전자 결실에 대해서는 해당하는 생화학 반응식의 속도를 0으로 하였다.
트레이드 오프 커브를 작성하기 위하여, 선행기술에 의해 제안되어 있는 알고리즘(Burgard et al., Biotechnol. Bioeng., 84:647, 2003)을 변형하였다. 상기 선행문헌의 경우 트레이드 오프 커브를 통하여 후보 유전자를 찾는 방법이 정확히 서술되지 않은 반면, 본 발명에서 사용한 방법에서는 해당 유전자가 결실된 변이균주의 유용물질 생산속도와 바이오매스 형성속도간의 관계를 살펴보아 유용물질의 생산속도가 감소하여도 바이오매스가 감소하지 않는 곡선을 가지는 후보 유전자들의 조합을 선택할 수 있어, 해당 변이균주의 유용물질 생산능력을 비교할 수 있었다.
즉, 우선적으로 유용산물 형성속도를 최대화 하였을 때의 값과 최소화하였을 때의 값을 구하여 허용하는 유용산물 형성속도의 범위를 구한 다음, 허용 범위 내에서 비증식속도를 최대화하여 두 목적함수간의 트레이드 오프 커브를 작성하는 방식을 사용하였다. 도 6은 메타플럭스 넷을 이용한 트레이드 오프 커브의 작성예를 도시한 것이다.
비증식속도를 고려하여 유용산물의 수율을 확인하기 위하여, 대사흐름 조절기술을 적용하는데 필요한 두 가지의 목적함수를 고려하여 생산물 형성속도(product formation rate)와 비증식속도(specific growth rate)의 트레이드 오프 커브(trade off curve)를 구하였다(도 5a 및 도 5b).
도 5b에 나타난 바와 같이, 목적의 대사회로에 해당하는 유전자 조합을 살펴 본 결과, 다른 유전자들의 조합에 따른 결실 균주의 경우와 달리, ptsG, pykF 및 pykA 유전자를 동시에 결실시킨 변이균주의 경우, 비증식속도 대비 최적의 생산수율을 얻을 수 있는 커브가 생성되었다. 즉 해당 유전자의 경우 일반적으로 유용물질 생산속도가 줄어들 때 비증식속도가 증가하는 경향과 다른 곡선을 얻을 수 있었으며, 이 경우 숙신산 생산속도 또한 가장 우수함을 알 수 있었다.
이 결과를 수치적으로 살펴보면, 대장균에서 ptsG, pykF 및 pykA를 동시에 결실시켜 혐기적 조건에서 배양할 경우, 야생균주 및 다른 유전자들의 조합에 따른 결실 균주에 비해 숙신산이 과생산되는 것을 확인할 수 있었다 (표 1).
각 돌연변이에 대한 시뮬레이션 결과
결실 유전자 최대 바이오매스 형성속도 (-h) 숙신산 생산속도 (mM/DCW/h) 최대 숙신산 생산능력a
Wild-Type 0.2156 0.1714 1.000
pykFA 0.2156 0.1714 1.000
ptsG 0.1884 0.1714 0.8738
ptsG pykFA 0.1366 6.834 25.26
ptsG mqo 0.1884 0.1714 0.8738
ptsG sdhA 0.1884 0.1714 0.8738
ptsG aceBA 0.1884 0.1714 0.8738
pykFA sdhA 0.2156 0.1714 1.000
pykFA aceBA 0.2156 0.1714 1.000
mqo sdhA 0.2156 0.1714 1.000
mqo aceBA 0.2156 0.1714 1.000
sdhA aceBA 0.2156 0.1714 1.000
a계산식: (변이균주의 숙신산 생산속도 × 최대 바이오매스 형성속도) / (야생형의 숙신산 생산속도 × 최대 바이오매스 형성속도)
B. 실제 실험결과
시뮬레이션 결과를 바탕으로 대장균 변이균주를 제작하기 위하여, DNA 조작 표준 프로토콜을 사용하고, 람다 박테리오파지(lambda bacteriophage)의 레드 오페론(red operon)에 존재하는 레드 재조합효소(Red recombinase)를 이용하였다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edition, 2001; Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640, 2000). 먼저, 항생제 내성 유전자가 포함된 DNA를 주형으로 하고, 결실시키고자 하는 표적유전자의 상류 및 하류에 위치하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머(표 2 참조)를 제작하여 두 차례 PCR을 수행하였다.
주형 PCR 프라이머 서열 (5'-3')
SpR 1차 서열번호 1: PTSG1 TGC CCG CCG TTG TAT CGC ATG TTA TGG CAG GGG GAT CGA TCC TCT AGA
서열번호 2: PTSG2 TGC AGC AAC CAG AGC CGG TGC CAT TTC GCT GGG CCG ACA GGC TTT
2차 서열번호 3: PTSG3 TGG GCG TCG GTT CCG CGA ATT TCA GCT GGC TGC CCG CCG TTG TAT CGC
서열번호 4: PTSG4 GAG GTT AGT AAT GTT TTC TTT ACC ACC AAA TGC AGC AAC CAG AGC CGG
TcR 1차 서열번호 5: PYKF1 TGG ACG CTG GCA TGA ACG TTA TGC GTC TGA GGG TAG ATT TCA GTG CAA
서열번호 6: PYKF2 CGC CTT TGC TCA GTA CCA ACT GAT GAG CCG GGG TTC CAT TCA GGT CGA
2차 서열번호 7: PYKF3 CCG AAT CTG AAG AGA TGT TAG CTA AAA TGC TGG ACG CTG GCA TGA ACG
서열번호 8: PYKF4 AAG TGA TCT CTT TAA CAA GCT GCG GCA CAA CGC CTT TGC TCA GTA CCA
CmR 1차 서열번호 9: MQO1 GGC ATA CCA TGC CGG ATG TGG CGT ATC ATT GGG GTT TAA GGG CAC CAA
서열번호 10: MQO2 GAA CTA CGG CGA GAT CAC CCG CCA GTT AAT GCC CCG GGC TTT GCG CCG
2차 서열번호 11: MQO3 TGG CGC GTC TTA TCA GCA TAC GCC ACA TCC GGC ATA CCA TGC CGG ATG
서열번호 12: MQO4 AGC CAC GCG TAC GGA AAT TGG TAC CGA TGT GAA CTA CGG CGA GAT CAC
KmR 1차 서열번호 13: SDH1 CAG TCA GAG AAT TTG ATG CAG TTG TGA TTG ATC GGG GGG GGG GGA AAG
서열번호 14: SDH2 ATC GGC TCT TTC ACC GGA TCG ACG TGA GCG ATC CCA ATT CTG ATT AGA
2차 서열번호 15: SDH3 GTT GTG GTG TGG GGT GTG TGA TGA AAT TGC CAG TCA GAG AAT TTG ATG
서열번호 16: SDH4 ATC ATG TAG TGA CAG GTT GGG ATA ACC GGA ATC GGC TCT TTC ACC GGA
PmR 1차 서열번호 17: ACEBA1 GCA CCT TGT GAT GGT GAA CGC ACC GAA GAA CGA GCT CGG TAC CCG GGC
서열번호 18: ACEBA2 CTT TCG CCT GTT GCA GCG CCT GAC CGC CAG CAA TAG ACC AGT TGC AAT
2차 서열번호 19: ACEBA3 GAC GCG CCG ATT ACT GCC GAT CAG CTG CTG GCA CCT TGT GAT GGT GAA
서열번호 20: ACEBA4 ATC CCG ACA GAT AGA CTG CTT CAA TAC CCG CTT TCG CCT GTT GCA GCG
KmR 1차 서열번호 21: PYKA1 CAC CTG GTT GTT TCA GTC AAC GGA GTA TTA CAT CGG GGG GGG GGG AAA G
서열번호 22: PYKA2 GTG GCG TTT TCG CCG CAT CCG GCA ACG TAC ATC CCA ATT CTG ATT AG
2차 서열번호 23: PYKA3 TTA TTT CAT TCG GAT TTC ATG TTC AAG CAA CAC CTG GTT GTT TCA GTC
서열번호 24: PYKA4 GTT GAA CTA TCA TTG AAC TGT AGG CCG GAT GTG GCG TTT TCG CCG CAT C
상기 수득된 PCR 산물을 모균주에 형질전환시켜, 이중 상동 재조합(double homologous recombination)에 의하여 표적 유전자가 항생제 내성유전자로 대치되도록 하여, 표적유전자가 제거된 유전자 결실 균주를 제작하였다. 제작된 균주는 표 3과 같다.
표 3에서, Spr은 스펙티노마이신 저항성(spectinomycin resistance), Tcr은 테트라사이클린 저항성(tetracycline resistance), Cmr은 클로람페니콜 저항성(chloramphenicol resistance), Kmr은 카나마이신 저항성(kanamycin resistance)을 의미하고, Pmr: 플레노마이신 저항성(phleomycin resistance)을 의미한다.
균주 또는 플라스미드 설명
E. coli W3110 Coli Genetic Stock Center strain No. 4474
E. coli W3110G ptsG::Spr
E. coli W3110GF ptsG::Spr , pykF::Tcr
E. coli W3110GFA ptsG::Spr , pykF::Tcr , pykA::Kmr
E. coli W3110GFO ptsG::Spr , pykF::Tcr , mqo::Cmr
E. coli W3110GFH ptsG::Spr , pykF::Tcr , sdh::Kmr
E. coli W3110GFHO ptsG::Spr , pykF::Tcr , sdh::Kmr , mqo::Cmr
E. coli W3110GFHOE ptsG::Spr , pykF::Tcr , sdh::Kmr , mqo::Cmr , aceBA::Pmr
상기 방법에 의하여 제작된 각 변이균주를 초기 포도당 농도 60mM 및 24시간 혐기조건에서 배양하고, 잔류 포도당 농도, 숙신산, 락테이트, 포메이트, 아세테이트 및 에탄올의 농도를 조사하였다. 그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, ptsG, pykF 및 pykA 결실 변이균주(W3110GFA)의 경우, 야생균주(W3110)에 비해, 다른 유기산 대비 숙신산의 비율 (S/A ratio)이 8.29배 증가하였다.
실제 실험결과에서의 각 유기산 비율
균주 (Strain) OD600 기질 또는 산물의 발효 농도 (Concentration of fermentation substrate or products )(mM) a 숙신산 비율c 배수 (Fold)d
포도당 (Glucose)b 숙신산 (Succinic acid) 락테이트 (Lactate) 포메이트 (Formate) 아세 테이트 (Acetate) 에탄올 (Ethanol)
W3110 1.79±0.11 5.07±0.45 2.43±0.03 10.62±2.42 88.03±0.42 40.10±0.20 5.77±0.06 0.017 1
W3110G 1.47±0.01 5.66±1.77 2.16±0.08 13.71±3.46 88.57±2.97 40.69±0.97 5.98±0.09 0.014 0.86
W3110GF 1.46±0.04 4.28±1.42 2.83±0.07 14.13±1.32 86.25±2.02 40.10±0.58 5.92±0.24 0.019 1.15
W3110GFA 0.73±0.06 20.57±3.02 8.16±0.01 5.47±0.49 27.47±2.94 16.48±1.55 1.88±0.24 0.137 8.29
W3110GFO 1.49±0.07 4.68±0.35 2.67±0.33 12.97±0.06 88.39±0.81 40.89±0.18 6.00±0.08 0.018 1.07
W3110GFH 1.35±0.01 4.70±0.39 2.51±0.02 15.18±1.49 85.86±0.10 38.88±0.16 5.84±0.06 0.017 1.02
W3110GFHO 1.28±0.11 4.82±0.48 2.58±0.03 17.06±0.45 90.40±2.55 40.40±0.49 6.20±0.06 0.016 1
W3110GFOHE 1.27±0.05 4.25±0.27 2.49±0.18 13.31±0.78 85.98±0.38 38.66±0.02 5.84±0.01 0.017 1.03
a24시간 혐기 배양.
b측정된 잔류 포도당 농도(초기 포도당 농도: 50 mM).
c계산식: 숙신산/(숙신산+락테이트+포메이트+아세테이트+에탄올).
d계산식: 숙신산 비율/ 0.017(야생형의 숙신산 비율).
상기 결과를 통해, 유용물질 생산을 위한 대표적인 대상 균주인 대장균을 숙신산을 과량으로 생산하는 맨하이미아 균주와 게놈정보를 통해 비교분석하고, 시뮬레이션 프로그램을 이용함으로써 숙신산을 다량 생산하는 변이균주로 개량하는 대사공학적이고 유전공학적인 접근 방법이 본 발명에 의해 제공될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 대사공학적인 접근 방법과 유전공학적인 방법을 이용하여 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주와 유용물질을 다량 생산하는 균주의 유전자 게놈상 유전자를 비교분석함으로써 후보 유전자를 스크리닝하고, 이를 대상으로 인-실리코 (in-silico) 시뮬레이션을 수행하여 유용물질의 생산성이 개선된 결실 대상유전자의 조합을 선정하여 개량된 균주를 효율적으로 제작할 수 있어, 실제 웨트(wet) 실험에 드는 시간, 노력과 비용을 획기적으로 줄일 수 있다.
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Claims (16)

  1. 다음 단계를 포함하는 유용물질 생산균주의 개량방법:
    (a) 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주 및 유용물질 과생산균주를 선정하고, 두 가지 균주의 대사흐름분석 모델시스템을 구축하는 단계;
    (b) 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주에 존재하고, 세포성장에 필수적이지 않거나 방해가 되는 유전자 중에서 유용물질을 과생산하는 균주에는 존재하지 않는 유전자들을 스크리닝하는 단계;
    (c) 상기 스크리닝된 유전자들로부터 결실대상 유전자의 조합을 구성하는 단계;
    (d) 상기 (a) 단계에서 구축된 대사흐름분석 모델시스템을 이용하되, 상기 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주로부터 상기 (c) 단계에서 구성된 유전자의 조합을 각각 결실시킨 변이균주를 대상으로 인-실리코 (in-silico) 시뮬레이션을 수행하는 단계;
    (e) 상기 시뮬레이션 결과로부터 비증식속도 대비 유용물질 생산수율이 우수한 결실대상 유전자의 조합을 선별하는 단계; 및
    (f) 상기 선별된 유전자의 조합을 결실시킨 변이균주를 제작하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인-실리코 (in-silico) 시뮬레이션은 생산물 형성속도 (product formation rate)와 비증식속도(specific growth rate)의 트레이드 오프 커브(trade off curve)를 작성하고, 변이균주의 비증식속도와 유용물질의 수율을 비교하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유용물질을 생산하고자 하는 대상 균주는 대장균인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, (g) 상기 제작된 변이균주를 배양하여 유용물질의 생산성을 실험적으로 확인하는 단계를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 다음 단계를 포함하는 숙신산 생산균주의 개량방법:
    (a) 숙신산을 생산하고자 하는 대상 균주 및 숙신산 과생산균주를 선정하고, 두 가지 균주의 대사흐름분석 모델시스템을 구축하는 단계;
    (b) 숙신산을 생산하고자 하는 대상 균주에 존재하고, 세포성장에 필수적이지 않거나 방해가 되는 유전자 중에서 숙신산을 과생산하는 균주에는 존재하지 않는 유전자들을 스크리닝하는 단계;
    (c) 상기 스크리닝된 유전자들로부터 결실대상 유전자의 조합을 구성하는 단 계;
    (d) 상기 (a) 단계에서 구축된 대사흐름분석 모델시스템을 이용하되, 상기 숙신산을 생산하고자 하는 대상 균주로부터 상기 (c) 단계에서 구성된 유전자의 조합을 각각 결실시킨 변이균주를 대상으로 인-실리코 (in-silico) 시뮬레이션을 수행하는 단계;
    (e) 상기 시뮬레이션 결과로부터 비증식속도 대비 숙신산 생산수율이 우수한 결실대상 유전자의 조합을 선별하는 단계; 및
    (f) 상기 선별된 유전자의 조합을 결실시킨 변이균주를 제작하는 단계.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인-실리코 (in-silico) 시뮬레이션은 숙신산 형성속도(product formation rate)와 비증식속도(specific growth rate)의 트레이드 오프 커브(trade off curve)를 작성하고, 변이균주의 비증식속도와 숙신산의 수율을 비교하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 숙신산을 과생산하는 균주는 맨하이미아(Mannheimia) 속인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 숙신산을 과생산하는 균주는 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens MBEL55E: KCTC 0769BP)인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 숙신산을 생산하고자 하는 대상 균주는 대장균인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 스크리닝된 유전자는 ptsG, pykF, pykA, mqo, sdhA, sdhB, sdhC, sdhD, aceB 및 aceA로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제5항에 있어서, 상기 (e) 단계에서 선별된 결실대상 유전자의 조합은 ptsG, pykF 및 pykA인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제5항에 있어서, (g) 상기 제작된 변이균주를 배양하여 숙신산의 생산성을 실험적으로 확인하는 단계를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
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US11/722,632 US20090075352A1 (en) 2005-04-08 2005-05-23 Method For Improving A Strain Based On In-Silico Analysis
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JP2007552047A JP4755200B2 (ja) 2005-04-08 2005-05-23 インシリコ分析に基づく菌株の改良方法

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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008527992A (ja) * 2005-09-15 2008-07-31 コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ 強化目的のフラックスに基づいたフラックス・スキャニングを用いた生物の改良方法
KR100818202B1 (ko) * 2006-12-22 2008-03-31 한국과학기술원 미생물의 성장에 필수적인 대사산물의 스크리닝 방법
KR100832740B1 (ko) 2007-01-17 2008-05-27 한국과학기술원 분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법
WO2008133131A1 (ja) 2007-04-16 2008-11-06 Ajinomoto Co., Inc. 有機酸の製造方法
BRPI0810011B1 (pt) 2007-04-17 2021-11-30 Ajinomoto Co., Inc Método para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila
JP5644108B2 (ja) 2007-12-06 2014-12-24 味の素株式会社 有機酸の製造方法
US9017976B2 (en) 2009-11-18 2015-04-28 Myriant Corporation Engineering microbes for efficient production of chemicals
EP2825663B1 (en) 2012-03-13 2019-08-07 Board of Trustees of the University of Arkansas Separatome-based protein expression and purification platform
US9657316B2 (en) 2012-08-27 2017-05-23 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for enhancing the availability of reducing equivalents in the presence of methanol, and for producing 1,4-butanediol related thereto
US9932611B2 (en) 2012-10-22 2018-04-03 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for enhancing the availability of reducing equivalents in the presence of methanol, and for producing succinate related thereto
US10150976B2 (en) 2012-12-17 2018-12-11 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for enhancing the availability of reducing equivalents in the presence of methanol, and for producing adipate, 6-aminocaproate, hexamethylenediamine or caprolactam related thereto
US9822371B2 (en) 2013-09-17 2017-11-21 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas E. coli separatome-based protein expression and purification platform
JP2017216881A (ja) 2014-12-26 2017-12-14 味の素株式会社 ジカルボン酸の製造方法
JP7207643B2 (ja) * 2017-06-21 2023-01-18 株式会社日立製作所 連続培養条件のスクリーニング方法
CN108796005A (zh) * 2018-06-19 2018-11-13 天津科技大学 一种实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法
EP3967762A4 (en) 2019-05-10 2023-07-19 Toray Industries, Inc. GENETICALLY MODIFIED MICROORGANISM FOR THE PRODUCTION OF 3-HYDROXYHEXIC ACID, (E)-HEX-2-ENDONIC ACID AND/OR HEXANDOONIC ACID AND MANUFACTURING PROCESSES FOR THESE CHEMICALS
US20220228178A1 (en) 2019-05-10 2022-07-21 Toray Industries, Inc. Genetically modified microorganism for producing 3-hydroxyhexanedioic acid, (e)-hex-2-enedioic acid and/or hexanedioic acid, and production method for said chemicals
WO2022102635A1 (ja) 2020-11-11 2022-05-19 東レ株式会社 ３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
CN117051080B (zh) * 2023-10-12 2024-01-23 山东省食品药品检验研究院 一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6159738A (en) 1998-04-28 2000-12-12 University Of Chicago Method for construction of bacterial strains with increased succinic acid production

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4776146B2 (ja) * 2001-01-10 2011-09-21 ザ・ペン・ステート・リサーチ・ファンデーション 細胞代謝をモデル化する方法及びシステム
US7127379B2 (en) * 2001-01-31 2006-10-24 The Regents Of The University Of California Method for the evolutionary design of biochemical reaction networks
WO2002070730A2 (en) * 2001-03-01 2002-09-12 The Regents Of The University Of California Models and methods for determining systemic properties of regulated reaction networks
CA2491753A1 (en) * 2002-07-10 2004-03-04 The Penn State Research Foundation Method for determining gene knockout strategies
JP2008527992A (ja) * 2005-09-15 2008-07-31 コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ 強化目的のフラックスに基づいたフラックス・スキャニングを用いた生物の改良方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6159738A (en) 1998-04-28 2000-12-12 University Of Chicago Method for construction of bacterial strains with increased succinic acid production

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
2003
제2006-11345호 *

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Publication number Publication date
US20090075352A1 (en) 2009-03-19
CN101175847B (zh) 2011-11-30
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