KR20120025262A - 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법 - Google Patents

부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate를 중간체(intermediate)로 하여 부탄올을 생합성하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 재조합 미생물은 기존의 Clostridium acetobutylicum과 달리 성장이 용이하고, 추가 대사흐름 조작으로 인한 균주개량의 가능성이 크므로 부탄올의 산업적 생성 미생물로 추가 대사흐름 조작으로 인한 균주개량의 가능성이 크므로 부탄올의 산업적 생성 미생물로 유용하며, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 과정을 단순화시킴으로써 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다.

Description

부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법{Enhanced Butanol Producing Recombinant Microorganisms and Method for Preparing Butanol Using the Same}
본 발명은 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate를 중간체(intermediate)로 하고 VorABC 유전자를 도입하여 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 one-step으로 전환시킬 수 있는 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
최근 고유가와 환경 문제로 인해 미생물을 이용한 바이오연료 생산이 큰 관심을 끌고 있다. 최근 바이오 부탄올이 휘발유의 대체 연료로 부상하면서 시장 규모가 매우 빠른 속도로 증가하고 있다. 현재 전세계적으로 연간 10~12 billion pound의 부탄올이 생산되고 있으며, 7~8.4 billion dollar의 시장규모를 이루고 있다 (Lee, S.Y. et al ., Biotechnology and Bioengineering 101: 209, 2008). 특히, 바이오부탄올은 에너지 밀도, 휘발성 제어, 충분한 옥탄가, 낮은 불순물 등 연료로서 적합한 특성을 갖고, 에탄올 보다 에너지 효율이 높고 휘발유와 더욱 잘 섞이며, 기존의 송유관이나 자동차 엔진 등을 그대로 사용할 수 있다는 장점을 지니고 있다. 따라서 대체연료로 가장 적합한 부탄올을 미생물을 이용하여 대량 생산한다면, 원유 수입 대체 효과 및 온실 가스 배출 감소로 인한 환경적 효과 등을 가져올 수 있다.
부탄올은 Clostridial 균주의 혐기적 ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) fermentation에 의해 생물학적 방법으로 생산될 수 있는데 (Jones, D. T. and Woods, D. R., Microbiol . Rev., 50:484, 1986; Rogers, P., Adv . Appl . Microbiol., 31:1, 1986; Lesnik, E. A. et al ., Necleic Acids Research, 29: 3583, 2001), 이러한 방법이 1950년대 까지만 해도 40년 이상에 걸쳐 부탄올과 아세톤의 주요 공급원이었다. Clostridial 균주는 성장 조건이 까다롭고 분자생물학적 tool 및 omics technology 등이 완전히 갖추어져 있지 않아서 추가 균주 개량에 어려움이 있다.
따라서, 성장이 우수하고 다양한 omics technology가 구비된 대장균 등에서의 부탄올 생산이 요구되고 있다. 특히, 대사공학 또는 omics technology 등을 이용한 균주 개발이 전무한 상태이므로 무한한 개발 잠재력이 있다고 하겠다.
Clostridium acetobutylicum 에서의 부탄올 생성 pathway는 도 1에 나타난 바와 같다 (Lee, S.Y. et al ., Biotechnology and Bioengineering 101: 209, 2008). 대장균에도 해당 pathway를 도입하여 부탄올 생산이 시도되었는데, 이 중 일부 효소들 (crotonase, β-hydroxybutyryl-coenzyme A dehydrogenase, butyryl-CoA dehydrogenase)의 활성이 매우 낮거나 거의 없어서 (Boynton, Z. L. et al ., J. Biotechnol., 178: 3015-3024, 1996) Clostridium acetobutylicum 에서처럼 효과적으로 해당 반응을 catalyze 하기는 힘들다.
따라서, 부탄올 생합성 경로를 도입하여 부탄올 생성능을 가지는 재조합 박테리아를 제작하고, 이를 이용하여 부탄올 생산을 시도한 바 있으나, 그 생성량이 미미하였다 (WO2007/041269A2).
또한, valine의 전구체인 2-ketoacid로부터 butanol, isobutanol 등의 다양한 chain alcohol 생산을 시도하였고(Shota Atsumi et al., Nature, 451, 2008), 재조합 미생물을 이용하여 pyruvate로부터 α-ketoisovalerate를 거쳐 isobutanol 생산을 시도하였으나(US2007/0092957A1), 생산되는 butanol 및 isobutanol의 수율이 낮은 문제점이 있었다 (Shota Atsumi et al., Nature, 451, 2008).
또한, 2-ketoisovalerate를 부탄올로 전환시키는 대사회로를 새로이 구성하고, L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자인 bkdAB-lpdV를 도입하여 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제작하였으나, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 과정에 bkdA1 , bkdB 및 lpdV 세가지 유전자가 복잡한 interaction을 통해 관여하고 있어서 세 가지 유전자의 발현량을 조절하기 어렵다는 단점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 과정을 단순화시킴으로써 2-ketoisovalerate를 부탄올로 전환시키는 효율을 증대시키기 위하여 예의 노력한 결과, VorA , VorB 및 VorC 세 가지 유전자가 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 데 관여한다는 것을 규명함과 아울러 이를 도입한 재조합 미생물을 제작하고, 상기 재조합 미생물이 기존의 재조합 미생물에 비하여 부탄올 고생성능을 가지는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 부탄올의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 VorABC 유전자가 도입되어 있는 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA 를 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조되고, L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 leuA(2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvE(branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 (a) lacI(lac operon repressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) ilvH(acetohydroxy acid synthase isozyme III) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition) 제거; (c) ilvGMEDA(acetohydroxy acid synthase isozyme I) 및 ilvBN(Acetohydroxy acid synthase isozyme II) 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환; 및 (d) strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 추가로 변이되어 있는 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 제조된 재조합 미생물을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자(VorABC)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하여 isobutyryl-CoA를 생성시킨 다음, 배양액으로부터 isobutyryl-CoA를 회수하는 것을 특징으로 하는 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소 또는 상기 효소를 발현하는 재조합 미생물을 이용하는 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate로부터 부탄올 생합성능을 가지는 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 기존의 Clostridium acetobutylicum과 달리 성장이 용이하고 추가 대사흐름 조작으로 인한 균주개량의 가능성이 크므로 부탄올의 산업적 생성 미생물로 유용하며, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 과정을 단순화시킴으로써 부탄올 고생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 C. acetobutylicum ATCC 824 균주의 부탄올 생성 pathway를 나타낸 것이다.
도 2는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에서 2-ketoisovalerate로부터 부탄올을 생합성하는 대사회로를 나타낸 것이다.
도 3은 sacB homologous recombination pSacHR06 벡터의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 4는 pKBRilvBNCD-ptac-adhEbdhAB 벡터의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 5는 2-ketoisovalerate가 isobutyryl-CoA로 전환되는 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 pTac15k_VorABC_ptac_icmAB 벡터를 나타낸 것이다.
본 발명에서는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자인 VorABC를 도입함으로써 2-ketoisovalerate를 부탄올로 전환시키는 대사회로를 새로이 구성하여, 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물을 제작하고, 제작된 재조합 미생물이 부탄올을 합성할 수 있는지 확인하고자 하였다.
즉, L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 VorABC 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시킬 경우, 2-ketoisovalerate로부터 부탄올이 생성될 것으로 예측하고, 특히 VorABC 유전자에 의해 2-ketoisovalerate를 one-step으로 isobutyryl-CoA로 전환시킴으로써 부탄올 생성능도 증가할 것으로 예측하였다.
상기 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균 등을 이용할 수 있으나, 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지고 있는 한 제한이 없다.
2-ketoisovalerate는 발린의 전구체이므로, 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물(Val)(한국등록특허 제832,740호)을 이용하거나, 2-ketoisovalerate의 축적율을 더욱 증가시키기 위하여 상기 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물(Val)에서 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시킨 변이 미생물을 이용하고자 하였다.
본 발명에서 "약화"란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나 일부 염기를 도입시켜 해당유전자에 의해 발현되는 효소의 활성을 감소시키는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로의 일부 또는 상당부분을 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 "증폭"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키는 것을 포괄하는 개념이다.
도 2는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에서 2-ketoisovalerate로부터 부탄올을 생합성하는 대사회로를 나타낸 것이다.
2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물을 이용하여, 2-ketoisovalerate로부터 부탄올을 제작하기 위하여, 2-ketoisovalerate를 부탄올로 전환시키는 대사회로를 새로이 구성하고, 이를 구성하는 각 효소들을 코딩하는 유전자를 도입시켰다. 즉, L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시켰다.
본 발명에 있어서, 상기 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소는 isobutyryl-CoA mutase이며, 상기 butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소는 butyraldehyde dehydrogenase이고, 상기 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소는 butanol dehydrogenase인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Methanosarcina acetivorans 유래의 VorABC (서열번호 46)인 것을 특징으로 할 수 있고, 즉, 2-ketoisovalerate ferredoxin reductase를 코딩하는 유전자는 Methanosarcina acetivorans 유래의 VorB이고, 2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase를 코딩하는 유전자는 Methanosarcina acetivorans 유래의 VorA 및 VorC인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Streptomyces avermitilis 유래의 icmAB인 것을 특징으로 할 수 있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다.
또한, 상기 butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutylicum 유래의 adhE인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutylicum 유래의 bdhAB인 것을 특징으로 할 수 있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다.
한편, 본 발명의 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 2-ketoisovalerate의 축적율을 향상시키기 위하여, 변이시킨 미생물을 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 2-ketoisovalerate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 변이시키고, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시킨 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 leuA(2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvE(branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 2-ketoisovalerate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키기 위하여, (a) lacI(lac operon repressor를 암호화하는 유전자) 유전자를 결실시키거고, (b) ilvH(acetohydroxy acid synthase isozyme III) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition)를 제거시키고; (c) ilvGMEDA(acetohydroxy acid synthase isozyme I) 및 ilvBN(Acetohydroxy acid synthase isozyme II) 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시키고, (d) strong promoter를 포함하는 발현벡터를 도입시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 2-ketoisovalerate로부터 부탄올을 제조하기 위하여, 2-ketoisovalerate의 축적율이 우수한 변이 미생물을 제작한 다음, 여기에 2-ketoisovalerate로부터 부탄올을 제조하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제작하였다.
먼저, lacI 유전자가 제거되고, ilvH의 feedback inhibition이 제거되었으며, ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론의 attenuator를 포함한 본래의 promoter가 강력한 전사활성을 가지는 tac promoter로 치환된 대장균 W3110 컴피턴트 세포를 제작한 후, ilvA, panB , leuA 및 ilvE 유전자의 결실을 유도하여, 2-ketoisovalerate의 축적율이 우수한 변이 미생물을 제작하였다.
다음으로, Pseudomonas putida KT2440 유래의 branched chain ketoacid dehydrogenase (bkdA, bkdB, lpdV 유전자에 의해 각각 코딩되는 E1 subunit: the dehydrogenase-decarboxylase, E2 subunit: the transacylase, E3: lipoamide dehydrogenase의 complex) 및 Bacillus subtilis 유래의 branched chain ketoacid dehydrogenase (bkdA1, bkdA2 , bkdB, lpdV 유전자에 의해 각각 코딩되는 subunit의 complex)가 발린의 catabolism에 관여하여 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 과정은(Sokatch, J. R. et al., J. Bacteriol., 148: 647-652, 1981; Sykes P. J. et al., J. Bacteriol., 169: 1619-1625, 1987; Namba, Y., et al ., J. Biol . Chem., 244: 4437-4447) bkdA1, bkdB 및 lpdV 유전자가 복잡한 interaction을 통해 이루어지기 때문에 세 가지 유전자의 발현량을 조절하는 데 어려움이 있었던 점에 착안하여, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 one-step으로 전환시킬 수 있도록 Methanosarcina acetivorans 유래의 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit, 서열번호 43), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase, 서열번호 44) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit, 서열번호 45)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자들을 클로닝하였다.
그리고, Streptomyces avermitilis 유래의 isobutyryl-CoA mutase (icmA, icmB 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 complex)가 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시킨다는 사실 (Zerbe-Burkhardt, K., et al., J. Biol . Chem., 273: 6508-6517, 1998)에 근거하여 상기 유전자를 차례로 클로닝하여 2-ketoisovalerate로부터 butyryl-CoA를 만들고, Clostridium acetobutylicum 유래의 adhE (butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자)와 bdhAB (Clostridium acetobutylicum의 butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 추가로 도입하여 최종적으로 butyryl-CoA로부터 butanol을 합성하고자 하였다.
bkdA, bkdB, lpdV 유전자에 의해 2-ketoisovalerate가 isobutyryl-CoA로 전환되는 과정은, bkdA1 유전자에 의해 코딩되는 효소가 2-ketoisovalerate를 2-methy-1-hydroxypropyl-Thpp로 전환시킨 후 다시 2-(2-methyl propanoyl)-dihydrilpoamide-E로 전환된 다음, bkdB유전자에 의해 코딩되는 효소에 의해 2-(2-methyl propanoyl)-dihydrilpoamide-E가 isobutyryl CoA로 전환되고, 또한 lpdV 유전자에 의해 코딩되는 효소가 상기 과정에 관여하여, 전체적으로 복잡한 interaction을 통해 이루어지는 반면에, VorABC 유전자를 도입한 경우에는 2-ketoisovalerate가 isobutyryl-CoA로 바로 전환되는 것을 확인하였다(도 5).
즉, 2-ketoisovalerate 축적에 필수적인 유전자들인 ilvB(acetohydroxy acid synthase I large subunit을 암호화하는 유전자), ilvN(acetohydroxy acid synthase I small subunit을 암호화하는 유전자), ilvC(acetohydroxy acid isomeroreductase를 암호화하는 유전자), 및 ilvD(dihydroxy-acid dehydratase를 암호화하는 유전자) 등이 순차적으로 클로닝된 pKKilvBNCD 벡터에 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 등을 도입시킨 벡터를 제작한 후, 이를 상기 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에 도입시킴으로써 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제작하였다.
상기 제작된 재조합 미생물을 글루코즈 함유 배지에서 배양한 결과, 부탄올이 생성되는 것을 확인할 수 있었다(표 1).
최종적으로, 본 발명에서는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자(VorABC), isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자(icmAB), butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자(adhE) 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자(bdhAB)를 도입시켜 재조합 미생물을 제작하고, 상기 재조합 미생물에서 부탄올 생성능이 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따르면, VorABC 효소에 의하여 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA로 전환되므로, 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자(VorABC)를 도입시켜 재조합 미생물을 제작하고, 상기 재조합 미생물을 배양하여 isobutyryl-CoA를 생성할 수 있으며, 상기 재조합 미생물을 이용하면 혐기 조건에서도 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 높은 효율로 전환시킬 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 대장균 W3110을 숙주 미생물로 이용하였으나, 다른 대장균이나, 박테리아, 효모 및 곰팡이를 사용하여 L-발린 생성능을 향상시키고, 2-ketoisovalerate로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소의 유전자를 도입시킨 다음, 이를 이용하여 부탄올을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 도입 대상 유전자로 특정 균주 유래인 것만을 예시하였으나, 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 그 제한이 없다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 VorABC 효소의 반응으로 2-ketoacid의 keto기가 제거되고 CoA기가 새롭게 결합함으로써 2-ketoisovalerate가 isobutyryl-CoA로 전환되는 것만을 확인하였으나, VorABC 효소의 이러한 기능을 확인한 이상 VorABC 효소가 2-ketoisovalerate에 대하여만 이러한 반응을 일으키는 것이 아니라 다른 여러 종류의 2-ketoacid에 대하여도 ferredoxin oxidoreductase의 기능을 나타낸다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
아울러, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이, 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것 (Lee et al ., Bioprocess Biosyst . Eng ., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol . Biotechnol ., 58: 663, 2002; Lee et al ., Biotechnol . Lett ., 25: 111, 2003; Lee et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol . Bioeng ., 72: 41, 2001)도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
2- ketoisovalerate 의 생성능을 가지는 미생물을 이용한 부탄올 생성능을 갖는 재조합 미생물 제작 및부탄올의 생성능 측정
본 발명자의 한국 등록특허 (분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법, 등록번호: 10-0832740, 등록일자: 2008. 5. 21)를 참조하여 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물을 이용한 부탄올 생성능을 갖는 재조합 미생물을 제작하였다.
1-1: 2- ketoisovalerate 의 생성능을 가지는 미생물의 제작
1-1-1: pSacHR06 의 제작
염색체 DNA의 특정 염기 또는 염기들의 치환을 위해 바실러스 서틀리스 유래의 sacB homologous recombination 기법(Wohlleben et . al ., J. Bacteriol ., 174: 5462, 1992)을 이용할 목적으로 pSacHR06 벡터를 제작하였다(도 3). 도 3은 도 sacB homologous recombination pSacHR06의 제작과정을 나타낸 것이다.
먼저, pUC19(New England Biolab) 벡터의 엠피실린(ampicillin)에 대한 내성 특성을 카나마이신(kanamycin)에 대한 내성 특성으로 치환하기 위하여 pUC19 벡터를 NdeI 및 AhdI으로 절단하여 얻은 1522bp 절편을 pACYC177 벡터(New England Biolabs)를 StuI으로 절단하여 얻은 1340bp 절편과 DNA 축합반응을 수행하여 pUC19KM 벡터를 얻었다.
다음으로, 상기 pUC19KM 벡터를 PvuII로 절단하여 얻은 2.5kb 절편과 pBlu2KSP(full name: pBluescriptIIKS(+)) 벡터를 PvuII로 절단하여 얻은 400bp 절편을 축합반응하여 pUC19KKS 벡터를 얻었다. 이후 상기 벡터에 DNA 복제 원점의 용이한 제거가 가능하도록 하기 위해 서열번호 1 및 2의 프라이머와 pUC19 벡터 주형을 이용하여 PCR을 수행하였고, 그 결과 동일한 절단효소들의 인식부위를 양쪽 끝에 각각 가지고 있으며 DNA 복제기점을 가지는 DNA 절편을 획득하였다. 상기 절편을 SalI 및 DraIII로 절단하고, pUC19KKS 벡터를 SalI 및 DraIII로 절단하여 얻은 1.5kb 절편과 DNA 축합반응 하여 pUC19K 벡터를 얻었다. 상기 pUC19K 벡터에 바실러스 서틀리스(Bacillus subtilis)의 sacB 유전자를 도입하기 위하여 바실러스 서틀리스의 genomic DNA 주형과 서열번호 3 및 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 sacB 유전자를 가지는 DNA 절편을 합성하였고, 상기 합성된 DNA 절편과 pUC19K 벡터 모두를 XbaI, SpeI 및 EcoRV 효소로 절단하고 축합하여 sacB 유전자를 가지는 새로운 벡터를 제작하였고 이를 pSacHR06으로 명명하였다.
pSacHR06 벡터는 바실러스 서틀리스 유래의 sacB 유전자를 가지며 제한효소를 사용하여 용이하게 DNA 복제 원점의 제거와 재축합 반응을 수행할 수 있기 때문에 sacB positive selection에 사용 가능하다.
[서열번호 1] pucoriup: 5'-agccgtcgacgctagcgcatgcacgcgtgtgcacccatggga cgtcctcactgactcgctgcgctc-3'
[서열번호 2] pucorido: 5'-ggctcacaacgtggctagcgacgtcgtgcacccatgggttcc actgagcgtcagacc-3'
[서열번호 3] sacBf: 5'-actctctagacgcgggtttgttactgataa-3'
[서열번호 4] sacBr: 5'-gctagatatcaggatatcggcattttcttt-3'
1-1-2: lacI 유전자의 결실
2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물인 대장균 W3110(ATTC 39936)에서 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6; 97(12): 6640-6645, 2000)을 이용하여, lac operon의 repressor를 암호화하는 유전자로, lactose 분해를 담당하는 lac operon의 전사를 억제하는 기능을 갖는 lacI 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.
[서열번호 5] lacI_1stup: 5'-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccgg tgtctcttagattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 6] lacI_1stdo: 5'-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctg cattaatgcacttaacggctgacatggg-3'
1-1-3: ilvH 의 feedback inhibition 제거
아지노모토 사에서 출원한 특허(US 6,737,255 B2)를 참고하여 acetohydroxy acid synthase isozyme III를 코딩하는 유전자인 ilvH의 41번째 염기(G)와 50번째 염기(C)를 각각 A와 T로 치환하였고, 대장균 W3110(ATTC 39936)의 염색체 DNA는 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다 (Sambrook, et al., Molecular cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989).
즉, 서열번호 7 및 8과 9 및 10의 프라이머와, 대장균 W3110 genomic DNA 주형을 이용하여 각각 PCR을 수행한 다음, 수득된 두개의 PCR 절편을 동일 농도로 섞어 주형으로 하고, 서열번호 7 및 10을 프라이머로 사용하여 overlapping PCR을 수행하였다. 상기와 같은 방법으로 얻은 1280bp의 PCR 절편을 PstI 및 SalI 효소로 절단하고, 역시 PstI 및 SalI 효소로 절단한 sacB homologous recombination 용 벡터인 pSacHR06에 삽입한 다음, sequencing 하여, ilvH의 41번째 염기(G)와 50번째 염기(C)가 각각 A와 T로 치환되었음을 확인하였다.
상기 수득한 벡터를 NheI 효소로 절단하여, replication origin을 결실시킨 다음, self-ligation 시키고, 상기 1-1-2에서 제작된 lacI 유전자가 결실된 대장균 W3110 컴피턴트 세포(electroporation-competent cell)에 일렉트로포레이션하였다. 다음으로, sacB positive selection (Wohlleben et al., J. Bacteriol., 174: 5462, 1992) 방법에 의해 feedback inhibition이 제거된 균주를 수득하였다.
[서열번호 7] ilvH1: 5'-gactctgcagggtgatcgagactctttggcggttgac-3'
[서열번호 8] ilvH2: 5'-ggaaaaaaggccaatcacgcggaataacgcgtctgattcattttcga gtaag-3'
[서열번호 9] ilvH3: 5'-cttactcgaaaatgaatcagacgcgttattccgcgtgattggccttt tttcc-3'
[서열번호 10] ilvH4: 5'-gctccgtcgaccagtttcacaattgccccttgcgtaaa-3'
1-1-4: ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론의 attenuator 의 tac promoter 로의 치환
1-1-3에서 제작된 lacI 유전자와 ilvH의 feedback inhibition이 제거된 대장균 W3110에서, acetohydroxy acid synthase isozyme I 및 II의 constitutive expression을 유도하기 위하여, acetohydroxy acid synthase isozyme I 및 II를 각각 암호화하는 ilvBN 및 ilvGMEDA 오페론의 전사조절 기작에 관여하는 attenuator를 강력한 promoter인 tac promoter로 치환하였다.
먼저, ilvGMEDA operon attenuator의 치환을 위해, 서열번호 11 및 12와 13 및 14를 각각 한 쌍의 프라이머와 대장균 W3110 genomic DNA 주형을 이용하여 PCR을 수행한 다음, PCR 절편, ilvGatt1 및 ilvGatt2를 각각 수득하였다. 상기 수득된 두 PCR 절편을 각각 SalI/BamHI 및 EcoRI/PstI 효소로 절단하여 pKK223-3 벡터(Pharmacia Biotech)의 해당 효소 절단 부위에 클로닝 한 다음, sequencing으로 염기서열을 확인한 후, SalI 및 PstI 효소로 절단한 부위를 상기 pSacHR06 벡터의 해당 효소 절단 부위에 클로닝하고, 상기 feedback inhibition 제거와 동일한 방법으로, attenuator를 포함하는 native promoter를 tac promoter로 치환하였다.
ilvBN operon의 attenuator 제거를 위해, 서열번호 15 및 16과 17 및 18을 각각 한쌍의 프라이머로 사용하여 상기 ilvGMEDA attenuator 제거와 동일한 방법으로 PCR 및 클로닝한 다음, 상기에서 ilvGMEDA attenuator가 제거된 대장균 W3110 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하였다. 그 결과 ilvBN attenuator를 포함하는 native promoter를 tac promoter로 치환할 수 있었다.
[서열번호 11] ilvGatt1f: 5'-gactgtcgacctaacttattggctgtaagctgttctgaggcc- 3'
[서열번호 12] ilvGatt1r: 5'-gctcggatccgaatgttgttcccttcctcgtagttcatcc-3'
[서열번호 13] ilvGatt2f: 5'-gactgaattcatgaatggcgcacagtgggtggtacatgcg- 3'
[서열번호 14] ilvGatt2r: 5'-gctcctgcagtcaccgctggctaactggatatcttttggg-3'
[서열번호 15] ilvBatt1f: 5'-gactcgtcgacagagatggtagggcggataa-3'
[서열번호 16] ilvBatt1r: 5'-gctcggatcccacactgtattatgtcaaca-3'
[서열번호 17] ilvBatt2f: 5'-gactgaattcatggcaagttcgggcacaac-3'
[서열번호 18] ilvBatt2r: 5'-gctcactgcagtgcgtcacgaatgctttctt-3'
1-1-5: ilvA , panB , ilvE 및 leuA 유전자의 결실
1-1-4에서 수득된 lacI 유전자와 ilvH의 feedback inhibition이 제거되고 ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론 attenuator의 tac promoter로의 치환된 W3110에서 ilvA, panB, ilvE 및 leuA 유전자를 결실시키기 위하여, 서열번호 19 내지 26 프라이머들을 이용하여 상기 1-1-2에 언급한 one step inactivation 방법에 의해 ilvA (isoleucine 생합성 경로의 첫 번째 효소인 threonine dehydratase를 암호화하는 유전자), panB (pantothenate생합성에 필요한 효소 중 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자), ilvE (valine 생합성에 필요한 효소 중 branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자) 및 leuA (leucine 생합성에 필요한 효소 중 2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)등의 유전자를 결실시켰다.
즉, 1-1-4에서 제작된 lacI 유전자가 제거되고, ilvH의 feedback inhibition이 제거되었으며, ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론의 attenuator를 포함한 본래의 promoter가 강력한 전사활성을 가지는 tac promoter로 치환된 대장균 W3110 컴피턴트 세포에서 상기 유전자 4종의 결실을 유도하였다.
[서열번호 19] ilvA1stup: 5'-atggctgactcgcaacccctgtccggtgctccggaaggtgc cgaatatttgattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 20] ilvA1stdo: 5'-ctaacccgccaaaaagaacctgaacgccgggttattggttt cgtcgtggccacttaacggctgacatggg-3'
[서열번호 21] panB1stup: 5'-atgaaaccgaccaccatctccttactgcagaagtacaaac aggaaaaaaagattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 22] panB1stdo: 5'-ttaatggaaactgtgttcttcgcccggataaacgccggact ccacttcagcacttaacggctgacatggg-3'
[서열번호 23] leuA1stup: 5'-atgagccagcaagtcattattttcgataccacattgcgcga cggtgaacagattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 24] leuA1stdo: 5'-ttcagaacgtgcaccatggctttggcagatgactcgacaat atcggtagcacttaacggctgacatggg-3'
[서열번호 25] ilvE1stup: 5'-atcttcgtcggtgatgttggcatgggagtaaacccgccag cgggatactctaggtgacactatagaacgcg-3'
[서열번호 26] ilvE1stdo: 5'-caggttttcgcctgcgccttcagagatataaccgttcacatc cagcgcgatagtggatctgatgggtacc-3'
1-1-6: pKBRilvBNCD 벡터의 제작
서열번호 27 내지 32의 프라이머들을 이용하여 2-ketoisovalerate 축적에 필수적인 유전자들, 즉 ilvB(acetohydroxy acid synthase I large subunit을 암호화하는 유전자), ilvN(acetohydroxy acid synthase I small subunit을 암호화하는 유전자), ilvC(acetohydroxy acid isomeroreductase를 암호화하는 유전자), 및 ilvD(dihydroxy-acid dehydratase를 암호화하는 유전자) 등을 순차적으로 pKK223-3 발현벡터(Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pKKilvBNCD 벡터를 수득하고, sequencing으로 염기서열을 확인하였다. 상기 pKKilvBNCD 벡터를 PciI 및 SphI 효소로 절단한 8.0kb 절편과, pBR322 벡터를 PciI 및 SphI 효소로 절단한 1.9kb 절편을 ligation 하여 pKBRilvBNCD 벡터를 최종 수득하였다(도 4 참조).
[서열번호 27] ilvBNf: 5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'
[서열번호 28] ilvBNr: 5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'
[서열번호 29] ilvCf: 5'-agtgctgcagacgaggaatcaccatggctaac-3'
[서열번호 30] ilvCrSX: 5'-gctcctgcagtctagagctagcgagctcttaacccgc-3'
[서열번호 31] ilvDf: 5'-actcgagctcgagacagacactgggagtaa-3'
[서열번호 32] ilvDr: 5'-tacgtctagattaaccccccagtttcgatt-3'
1-1-7: pKBRilvBNCD - ptac - adhE - bdhAB 벡터의 제작
pTac15K 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 33의 프라이머와 서열번호 34의 프라이머를 사용하여 PCR반응을 수행하였다. 이로부터 확보된 tac 프로모터를 XbaI 로 절단하고, 이를 상기 실시예 1-1-6에서 제작한 pKBRilvBNCD 벡터의 동일한 제한효소 절단부위에 삽입하여 pKBRilvBNCD-ptac 벡터를 수득하였다.
C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA를 주형으로 하고, 서열번호 35의 프라이머와 서열번호 36의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이로부터 확보된 adhE 유전자를 NheI 및 StuI로 절단하고, 이를 상기 pKBRilvBNCD-ptac 벡터의 동일한 제한효소 절단부위에 삽입하여 pKBRilvBNCD-ptac-adhE 벡터를 수득하였다.
다음으로, C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA를 주형으로 하고, 서열번호 37의 프라이머와 서열번호 38의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이로부터 확보된 bdhAB 유전자를 StuI로 절단하고, 이를 상기 pKBRilvBNCD-ptac-adhE 벡터의 동일한 제한효소 절단부위에 삽입하여 pKBRilvBNCD-ptac-adhE-bdhAB 벡터를 제작하였다 (도 4 참조).
[서열번호 33] tacf: 5'-atcttctagaatcggaagctgtggtatggc-3'
[서열번호 34] tacrsn: 5'-gtgctctagaaggcctgatcagctagctgtttcctgtgtga-3'
[서열번호 35] adhEfn: 5'-acgcgctagcatgaaagttacaaatcaaaa-3'
[서열번호 36] adhErs: 5'-acgtaggcctatagtctatgtgcttcatga-3'
[서열번호 37] bdhfst: 5'-atgcaggcctcaacgaaaaattcaccccct-3'
[서열번호 38] bdhrst: 5'-acgtaggcctccggtaggtttacacagatt-3'
1-1-8: pTac15K _ VorABC 벡터의 제작
pTac15K 벡터(p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBEL stock)에 Methanosarcina acetivorans의 vorA, vorB, vorC operon을 서열번호 39과 40의 프라이머들을 이용하여 클로닝하여 pTac15K_VorABC 벡터를 제작하였다.
[서열번호 39] VorABCF-2: 5'-TATAGAGCTCATGGCAAAAAATGATGAAAA-3'
[서열번호 40] VorABCR-2: 5'-TATTTCTAGATCATACCTTATACTCTCTTGCCC-3'
1-1-9: pTac15K_VorABC_ptac_icmAB 벡터의 제작
pTac15K_VorABC 벡터에 Streptomyces avermitilis의 icmA, icmB gene들을 서열번호 41 및 42의 프라이머들을 이용하여 클로닝하여 pTac15K_VorABC_ptac_icmAB 벡터를 제작하였다.
[서열번호 41] tacicmABF-1: 5'-CGCGGCATGCGAAATGAGCTGTTGACAATT-3'
[서열번호 42] tacicmABR-1: 5'-TATAGCATGCCTACGCCCCGGCAGGCTGCC-3'
1-2: 부탄올 생성균주의 제작
상기 1-1-1 내지 1-1-5의 과정을 통해 ilvGMEDA 및 ilvBN operon의 attenuator를 포함하는 native promoter가 tac promoter로 치환되고, ilvH의 feedback inhibition이 제거되고, lacI, ilvA, panB, leuA 및 ilvE 유전자가 결실된 대장균 W3110 균주 {Val(△ilvE)}에 상기 1-1-6 내지 1-1-9에서 제작된 벡터를 도입하여 부탄올 생성 미생물을 제작하였다.
1-3: 부탄올 생성능의 측정
상기 1-2에서 제작된 부탄올 생성 미생물들을 엠피실린(ampicillin) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)이 각각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주와 대한민국 특허출원 제10-2009-0059560호에 명시된 부탄올 생성 미생물을 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼낸 100㎖ LB를 함유한 250㎖ 플라스크에 glucose (10g/L)를 첨가하고 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 31℃에서 12시간 배양하였다. 그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균 W3110에서는 부탄올이 생성되지 않았고, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자로 bkdAB - lpdV를 도입한 재조합 미생물의 경우와 비교할 때(대한민국 특허출원 제10-2009-0059560호), 본 발명에 따른 재조합 변이 미생물은 32mg/L의 부탄올 생산을, bkdAB - lpdV를 도입한 재조합 미생물은 10mg/L의 부탄올을 생산을 나타내었다. 이는 100㎖ flask에서 12시간 배양한 결과이며, 즉, 본 발명에 따른 재조합 미생물에서 더 많은 양의 부탄올을 생산함을 확인하였고, large scale 배양시 더 많은 양의 부탄올이 생성될 것으로 예상된다. 이 결과로부터, 본 발명에서의 VorABC, adhE , icmAB 및 bdhAB 유전자들의 과발현으로 인해 2-ketoisovalerate로부터 부탄올이 성공적으로 생성되었으며, 또한 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에 도입된 유전자 조작에 의해 2-ketoisovalerate가 축적되어 부탄올 생산에 중요한 전구체로 작용한 것을 확인할 수 있었다.
Strain Butanol (mg/L)
W3110 ND1
Val(△ilvE)+pKBRilvBNCD-ptac-adhEbdhAB+ pTac15KlpdVbkdA1-ptac-bkdA2BicmAB 10
Val(△ilvE)+pKBRilvBNCD-ptac-adhEbdhAB+ pTac15K_VorABC_icmAB 32
1 Not detected.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Enhanced Butanol Producing Recombinant Microorganisms and Method for Preparing Butanol Using the Same <130> P10-B186 <160> 46 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agccgtcgac gctagcgcat gcacgcgtgt gcacccatgg gacgtcctca ctgactcgct 60 gcgctc 66 <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggctcacaac gtggctagcg acgtcgtgca cccatgggtt ccactgagcg tcagacc 57 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 actctctaga cgcgggtttg ttactgataa 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gctagatatc aggatatcgg cattttcttt 30 <210> 5 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta gattgcagca 60 ttacacgtct tg 72 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg cacttaacgg 60 ctgacatggg 70 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gactctgcag ggtgatcgag actctttggc ggttgac 37 <210> 8 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggaaaaaagg ccaatcacgc ggaataacgc gtctgattca ttttcgagta ag 52 <210> 9 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cttactcgaa aatgaatcag acgcgttatt ccgcgtgatt ggcctttttt cc 52 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gctccgtcga ccagtttcac aattgcccct tgcgtaaa 38 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gactgtcgac ctaacttatt ggctgtaagc tgttctgagg cc 42 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gctcggatcc gaatgttgtt cccttcctcg tagttcatcc 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gactgaattc atgaatggcg cacagtgggt ggtacatgcg 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gctcctgcag tcaccgctgg ctaactggat atcttttggg 40 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gactcgtcga cagagatggt agggcggata a 31 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gctcggatcc cacactgtat tatgtcaaca 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gactgaattc atggcaagtt cgggcacaac 30 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gctcactgca gtgcgtcacg aatgctttct t 31 <210> 19 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 atggctgact cgcaacccct gtccggtgct ccggaaggtg ccgaatattt gattgcagca 60 ttacacgtct tg 72 <210> 20 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ctaacccgcc aaaaagaacc tgaacgccgg gttattggtt tcgtcgtggc cacttaacgg 60 ctgacatggg 70 <210> 21 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 atgaaaccga ccaccatctc cttactgcag aagtacaaac aggaaaaaaa gattgcagca 60 ttacacgtct tg 72 <210> 22 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ttaatggaaa ctgtgttctt cgcccggata aacgccggac tccacttcag cacttaacgg 60 ctgacatggg 70 <210> 23 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 atgagccagc aagtcattat tttcgatacc acattgcgcg acggtgaaca gattgcagca 60 ttacacgtct tg 72 <210> 24 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ttcagaacgt gcaccatggc tttggcagat gactcgacaa tatcggtagc acttaacggc 60 tgacatggg 69 <210> 25 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 atcttcgtcg gtgatgttgg catgggagta aacccgccag cgggatactc taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 26 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 caggttttcg cctgcgcctt cagagatata accgttcaca tccagcgcga tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 actcgaattc atggcaagtt cgggcacaac at 32 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 actcgaattc atggcaagtt cgggcacaac at 32 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 agtgctgcag acgaggaatc accatggcta ac 32 <210> 30 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gctcctgcag tctagagcta gcgagctctt aacccgc 37 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 actcgagctc gagacagaca ctgggagtaa 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tacgtctaga ttaacccccc agtttcgatt 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 atcttctaga atcggaagct gtggtatggc 30 <210> 34 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gtgctctaga aggcctgatc agctagctgt ttcctgtgtg a 41 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 acgcgctagc atgaaagtta caaatcaaaa 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 acgtaggcct atagtctatg tgcttcatga 30 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 atgcaggcct caacgaaaaa ttcaccccct 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 acgtaggcct ccggtaggtt tacacagatt 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 tatagagctc atggcaaaaa atgatgaaaa 30 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 tatttctaga tcatacctta tactctcttg ccc 33 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cgcggcatgc gaaatgagct gttgacaatt 30 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 tatagcatgc ctacgccccg gcaggctgcc 30 <210> 43 <211> 482 <212> PRT <213> Methanosarcina acetivorans <400> 43 Met Lys Met Ala Ala Glu Ile Ile Asp Gly Glu Lys Val Ile Lys Lys 1 5 10 15 Pro Lys Ala Leu Tyr Ser Glu Tyr Pro Arg Lys Gly Gly Ala Ala Pro 20 25 30 Thr Ala Thr His Tyr Cys Pro Gly Cys Gly His Gly Val Leu His Lys 35 40 45 Leu Ile Ala Glu Ala Ile Asp Asp Leu Gly Ile Gln Asp Arg Thr Val 50 55 60 Met Ile Ser Pro Val Gly Cys Ala Val Phe Ala Tyr Tyr Tyr Phe Asp 65 70 75 80 Thr Gly Asn Ile Gln Val Ala His Gly Arg Ala Pro Ala Val Gly Thr 85 90 95 Gly Val Ser Arg Ala Glu Glu Asn Ala Val Val Ile Ser Tyr Gln Gly 100 105 110 Asp Gly Asp Leu Ala Ser Ile Gly Leu Asn Glu Thr Leu Gln Ala Ala 115 120 125 Asn Arg Gly Glu Lys Leu Ala Val Phe Phe Val Asn Asn Thr Val Tyr 130 135 140 Gly Met Thr Gly Gly Gln Met Ala Pro Thr Thr Leu Ile Gly Glu Lys 145 150 155 160 Thr Thr Thr Thr Pro Glu Gly Arg Asp Pro Arg Phe Ala Gly Tyr Pro 165 170 175 Leu His Met Cys Glu Leu Leu Asp Asn Leu Lys Ala Pro Ile Phe Ile 180 185 190 Glu Arg Val Ser Val Ser Asp Ile Ser His Ile Arg Lys Ala Arg Lys 195 200 205 Ala Val Arg Lys Ala Leu Glu Val Gln Arg Asp Gly Lys Gly Tyr Ala 210 215 220 Phe Val Glu Val Leu Ala Ala Cys Pro Thr Asn Leu Arg Met Asp Ala 225 230 235 240 Glu Gln Ala Ile Gln Phe Ile Asn Glu Gln Met Glu Lys Glu Phe Pro 245 250 255 Leu Arg Asn Phe Arg Asp Asn Phe Glu Ser Ala Glu Pro Leu His Arg 260 265 270 Gly Ile Ser Asp Phe Thr Thr Glu Ser Leu Glu Lys Leu Tyr Gly Ile 275 280 285 Glu Ala Glu Thr Gly Glu Lys Pro Ser Arg Thr Asp Phe Ala Pro Ile 290 295 300 Gln Thr Lys Ile Ala Gly Phe Gly Gly Gln Gly Val Leu Ser Met Gly 305 310 315 320 Leu Ile Leu Ala Gln Ala Gly Val Lys Ala Asn Leu Asn Ala Ser Trp 325 330 335 Phe Pro Ser Tyr Gly Pro Glu Gln Arg Gly Gly Thr Ser Asn Cys Ser 340 345 350 Val Val Ile Ser Gly Gln Ala Ile Gly Ser Pro Thr Val Tyr Thr Pro 355 360 365 Asp Ile Leu Ile Ala Met Asn Arg Pro Ser Leu Glu Arg Phe Glu Gly 370 375 380 Ala Val Lys Glu Gly Gly Phe Ile Leu Tyr Asp Ser Thr Ile Gly Glu 385 390 395 400 Ala Glu Thr Pro Ala Gly Val Asn Ala Ile Ala Val Pro Ala Thr Glu 405 410 415 Lys Ala Lys Glu Ala Gly Asp Glu Arg Ala Ala Asn Ser Phe Met Leu 420 425 430 Gly Val Leu Leu Gly Leu Asn Ala Thr Gly Leu Glu Glu Glu Ala Phe 435 440 445 Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Phe Thr Gly Lys Pro Lys Val Ile Glu 450 455 460 Phe Asn Gln Gln Met Leu Glu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Arg Glu Tyr 465 470 475 480 Lys Val <210> 44 <211> 351 <212> PRT <213> Methanosarcina acetivorans <400> 44 Met Ala Thr Gln Leu Val Lys Gly Asn Ser Ala Ile Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Leu Tyr Ala Gly Cys Asp Cys Phe Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Pro Ala 20 25 30 Ser Glu Ile Leu His Asp Ala Ser Lys Tyr Phe Pro Met Ile Gly Arg 35 40 45 Lys Phe Val Gln Ala Glu Ser Glu Glu Ala Ala Ile Asn Met Val Phe 50 55 60 Gly Gly Ala Ser Ala Gly His Arg Val Met Thr Ser Ser Ser Gly Pro 65 70 75 80 Gly Ile Ser Leu Met Gln Glu Gly Ile Ser Tyr Leu Ala Gly Ala Glu 85 90 95 Leu Pro Cys Val Leu Val Asp Ile Met Arg Ala Gly Pro Gly Leu Gly 100 105 110 Asn Ile Gly Pro Glu Gln Gly Asp Tyr Asn Gln Val Val Lys Gly Gly 115 120 125 Gly His Gly Asn Tyr Lys Asn Ile Val Leu Ala Pro Asn Ser Val Gln 130 135 140 Glu Met Cys Asp Phe Thr Met Lys Ala Phe Glu Leu Ala Phe Lys Tyr 145 150 155 160 Arg Asn Pro Ala Ile Val Leu Ala Asp Gly Val Leu Gly Gln Met Ile 165 170 175 Glu Ser Leu Glu Phe Pro Lys Lys Ala Leu Thr Pro Glu Ile Asp Ala 180 185 190 Ser Trp Ala Val Asn Gly Thr Ala Glu Thr Arg Pro Asn Leu Ile Thr 195 200 205 Ser Ile Phe Leu Asp Phe Asn Glu Leu Gly Gln Phe Asn Glu Lys Leu 210 215 220 Gln Ala Lys Tyr Glu Leu Ile Lys Gln Asn Glu Val Asp Tyr Glu Glu 225 230 235 240 Tyr Met Thr Asp Asp Ala Ser Ile Val Leu Val Ser Tyr Gly Ile Ser 245 250 255 Ser Arg Ile Cys Arg Ser Ala Val Asp Leu Ala Arg Lys Glu Gly Ile 260 265 270 Lys Val Gly Leu Phe Arg Pro Lys Thr Leu Phe Pro Phe Pro Glu Ala 275 280 285 Gln Leu Lys Ala Leu Ala Asp Lys Glu Ala Ser Phe Ile Ser Val Glu 290 295 300 Met Ser Asn Gly Gln Met Ile Asp Asp Ile Arg Leu Ala Ile Asp Cys 305 310 315 320 Ser Gln Pro Val Glu Leu Val Asn Arg Met Gly Gly Asn Leu Ile Thr 325 330 335 Leu Asp Gln Ile Met Asp Lys Ile Arg Lys Val Ala Gly Glu Ala 340 345 350 <210> 45 <211> 82 <212> PRT <213> Methanosarcina acetivorans <400> 45 Met Ala Lys Asn Asp Glu Lys Glu Pro Tyr Pro Val Ile Asn Ile Leu 1 5 10 15 Glu Cys Lys Ala Cys Gly Arg Cys Leu Leu Ala Cys Pro Lys Asp Val 20 25 30 Leu Phe Met Ser Asp Asn Leu Asn Ala Arg Gly Tyr His Tyr Val Glu 35 40 45 Tyr Lys Gly Glu Gly Cys Ser Gly Cys Ala Ser Cys Tyr Tyr Thr Cys 50 55 60 Pro Glu Pro Leu Ala Leu Glu Ile His Ile Pro Leu Lys Lys Glu Glu 65 70 75 80 Ala Asp <210> 46 <211> 2772 <212> DNA <213> Methanosarcina acetivorans <400> 46 atggcaaaaa atgatgaaaa agaaccgtac cctgttatca acattctgga gtgcaaggct 60 tgtgggcgct gccttcttgc ctgcccgaag gatgtgcttt tcatgagtga taacctgaac 120 gccaggggtt accactacgt agagtataaa ggagaaggct gttcaggctg tgcgagctgc 180 tactatacct gtcctgaacc ccttgcactg gaaatccata ttcccctgaa aaaggaggaa 240 gccgactaag gcaggataag gagggaaaaa gatggcaaca caactcgtaa aaggcaactc 300 cgcaatagtc gttggcgcac tttatgccgg atgtgactgt ttctttggat atcccattac 360 tccggcaagc gaaattctgc atgatgcatc caaatacttt cccatgatag gaaggaaatt 420 cgtgcaggcc gagtcagagg aggctgcaat taacatggtc ttcggggggg catcagccgg 480 gcacagggta atgacgtcct cctcaggccc aggaattagc ctgatgcagg aagggatctc 540 ttatcttgca ggcgcagagc ttccttgtgt gcttgtcgat ataatgaggg caggccctgg 600 actagggaac atcggacctg aacagggtga ttataaccag gtagtaaaag gtggagggca 660 cgggaattat aaaaatatcg tacttgcccc caactccgtg caggagatgt gtgactttac 720 catgaaggct tttgagctgg ccttcaagta caggaaccct gcaatcgtgc ttgctgacgg 780 agtgctcggg cagatgattg agtcccttga gtttccgaaa aaagccctta ctcctgaaat 840 cgatgcaagc tgggcagtca acggtacagc cgaaaccagg cctaacctga taacctctat 900 cttccttgac ttcaacgaac tcgggcagtt caacgagaaa ctgcaggcaa aatacgagct 960 gataaagcaa aatgaggttg actacgaaga atacatgacc gacgatgcct caatcgtgct 1020 tgtctcttac ggcataagca gcaggatctg caggtcagct gtagaccttg ccagaaagga 1080 aggcataaag gtggggctct tcaggccaaa gactcttttc ccattcccgg aggcgcagtt 1140 gaaagccctt gcagataagg aagcttcttt catctccgtg gagatgagca acgggcagat 1200 gatagatgac atcaggcttg caatcgactg ctcacagccc gtggaactgg taaaccgcat 1260 gggaggcaac ctgatcaccc ttgaccagat catggacaaa atcagaaagg tagcagggga 1320 ggcatgaaaa tggcagcaga aattattgac ggagaaaagg ttatcaaaaa gccaaaagcc 1380 ctgtactcgg aatacccgcg caaaggaggt gcagctccaa cagccaccca ctattgtcct 1440 ggctgcggac atggggtttt gcacaagctc attgccgagg caattgacga cctcggaatc 1500 caggacagga cggttatgat cagccctgtg ggatgtgcag tttttgctta ttattacttt 1560 gacacaggca atatccaggt tgcccacggc cgggctcctg ctgttggaac aggtgtctca 1620 agggctgaag aaaacgctgt agttatctcc taccagggcg acggagacct tgcttcgatc 1680 ggcctgaacg agacgctgca ggcggcaaac agaggagaaa agcttgcagt ttttttcgta 1740 aataacaccg tatacggcat gaccggcgga cagatggctc caacaaccct tatcggggaa 1800 aagacaacca caacccctga aggtcgcgac ccccgctttg caggctaccc gctccacatg 1860 tgtgagcttc tggacaacct gaaggctccg atttttatcg aaagagtctc ggtttccgat 1920 atctctcata tccgaaaagc ccgaaaagcc gttcgaaagg cgctcgaagt ccagcgtgat 1980 ggcaagggct atgcttttgt ggaagtcctt gcagcctgcc cgaccaacct taggatggat 2040 gcagagcagg ctatccagtt cattaacgag cagatggaaa aggaattccc gctcaggaac 2100 ttcagggaca atttcgaatc tgccgaaccc cttcaccgcg ggatcagtga ctttacaact 2160 gagtcccttg aaaagcttta cggaattgaa gcggaaaccg gagaaaaacc ctcaaggact 2220 gactttgctc cgatccagac caagattgca ggtttcggag gacagggtgt cctgagcatg 2280 ggccttatcc ttgcccaggc aggagtcaaa gcaaacctca atgcttcctg gttcccgtct 2340 tacggcccgg aacagcgcgg cggaacctca aactgctcgg tcgtgatttc aggtcaggct 2400 ataggctcgc ctacggtcta caccccagat atccttatag ccatgaaccg tccctccctc 2460 gagagattcg aaggggcagt aaaagaagga ggcttcatcc tctacgactc tacaatcggc 2520 gaagccgaga cccctgcagg cgtaaacgca attgcagtcc ctgcaaccga aaaagcaaaa 2580 gaagcaggtg atgagagagc cgcaaactcc ttcatgctcg gagtccttct gggcctgaac 2640 gcaaccggcc ttgaagaaga agccttcaaa gaagcccttg ccgaaaactt cacaggcaaa 2700 cccaaagtta ttgagtttaa ccagcagatg ctcgaagccg gggcagcatg ggcaagagag 2760 tataaggtat ga 2772

Claims (32)

  1. L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 2-ketoisovalerate의 축적율을 향상시키기 위하여, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 leuA(2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)이며, 상기 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvE(branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 추가로 변이되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법: (a) lacI(lac operon repressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) ilvH(acetohydroxy acid synthase isozyme III) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition) 제거; (c) ilvGMEDA(acetohydroxy acid synthase isozyme I) 및 ilvBN(Acetohydroxy acid synthase isozyme II) 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환; 및 (d) strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입.
  7. 제6항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB , ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소는 isobutyryl-CoA mutase이며, 상기 butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소는 butyraldehyde dehydrogenase이고, 상기 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소는 butanol dehydrogenase인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자는 Methanosarcina acetivorans 유래의 VorABC인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Streptomyces avermitilis 유래의 icmAB인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutylicum 유래의 adhE인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutylicum 유래의 bdhAB인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  14. L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소는 isobutyryl-CoA mutase이고, 상기 butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소는 butyraldehyde dehydrogenase이고, 상기 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소는 butanol dehydrogenase인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  18. 제14항에 있어서, 상기 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자는 Methanosarcina acetivorans 유래의 VorABC인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  19. 제14항에 있어서, 상기 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Streptomyces avermitilis 유래의 icmAB인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  20. 제14항에 있어서, 상기 butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutylicum 유래의 adhE인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  21. 제14항에 있어서, 상기 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutylicum 유래의 bdhAB인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  22. L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 leuA(2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)이며, 상기 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvE(branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 추가로 변이되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물: (a) lacI(lac operon repressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) ilvH(acetohydroxy acid synthase isozyme III) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition) 제거; (c) ilvGMEDA(acetohydroxy acid synthase isozyme I) 및 ilvBN(Acetohydroxy acid synthase isozyme II) 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환; 및 (d) strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입.
  25. 제24항에 있어서, 상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB , ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  26. 제14항의 재조합 미생물을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
  27. 제22항 또는 제24항의 재조합 미생물을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
  28. L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자(VorABC)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 VorA는 서열번호 43, VorB는 서열번호 44, VorC는 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  30. 제28항 또는 제29항의 재조합 미생물을 배양하여 isobutyryl-CoA를 생성시킨 다음, 배양액으로부터 isobutyryl-CoA를 회수하는 것을 특징으로 하는 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA를 생산하는 방법.
  31. 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소 또는 상기 효소를 발현하는 재조합 미생물을 이용하여 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 VorA는 서열번호 43, VorB는 서열번호 44, VorC는 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 방법.
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