CN110305829B

CN110305829B - 一种生产l-异亮氨酸的基因工程菌及其应用

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Publication number: CN110305829B
Application number: CN201910552915.6A
Authority: CN
Inventors: 张成林; 李英滋; 韩世宝; 徐庆阳; 李燕军; 张宇; 芦楠; 朱福周; 董解荣; 陈亭利
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-06-25
Filing date: 2019-06-25
Publication date: 2020-08-28
Anticipated expiration: 2039-06-25
Also published as: CN110305829A

Abstract

本发明涉及一种生产L‑异亮氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。所述基因工程菌是通过在宿主细胞中过表达解除L‑异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN^M、苏氨酸脱水酶编码基因ilvA以及苏氨酸操纵子thrABC获得，ilvBN^M编码的乙酰羟酸合成酶在解除了L‑异亮氨酸对其的反馈抑制作用，且其活性较野生型ilvBN编码的乙酰羟酸合成酶未见明显降低；本发明所述的L‑异亮氨酸基因工程菌无营养缺陷、生长快、发酵周期短、产量高、转化率高，经过26‑36h发酵后，发酵液中的L‑异亮氨酸浓度达到42.5‑51.6g/L。

Description

一种生产L-异亮氨酸的基因工程菌及其应用

技术领域：

本发明涉及一种生产L-异亮氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。

背景技术：

L-异亮氨酸属于分支链氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一。L-异亮氨酸是合成人体激素和酶的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的作用，在人体生命活动中扮演着至关重要角色。因此，L-异亮氨酸在食品和医药等行业具有非常广泛的市场及应用前景。

L-异亮氨酸的合成方法有提取法、化学合成法和发酵法。工业化生产主要采用毛发提取法和发酵法合成L-异亮氨酸。由于提取法具有原料来源受限制、生产成本高、污染环境等不足，目前主要采用发酵法生产L-异亮氨酸。目前，L-异亮氨酸的工业生产菌种主要由诱变获得，具有营养缺陷、生长慢、遗传性状不稳定等不足，从而引起发酵周期长、发酵性能不稳定、产量和转化率低等问题。

发明内容：

为了克服目前野生型乙酰羟酸合成酶受L-异亮氨酸反馈抑制以及现有L-异亮氨酸生产菌株生长慢、营养缺陷、发酵不稳定等不足，本发明提供一种解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶突变体及其编码基因，并利用该基因构建生产L-异亮氨酸的基因工程菌。

本发明解决述问题的技术方案之一是：提供一个解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶突变体，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述乙酰羟酸合成酶突变体的编码基因为ilvBN^M，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

所述乙酰羟酸合成酶突变体来自一株谷氨酸棒杆菌突变株，所述突变株筛选过程如下：以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/Lα-氨基丁酸的基本培养基上筛选出菌株ILE396；以ILE396为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/L硫代异亮氨酸的基本培养基上筛选出菌株ILE693。

提取ILE693基因组，通过设计引物进行PCR扩增乙酰羟酸合成酶编码基因，将PCR产物回收后进行测序，发现该基因编码的乙酰羟酸合成酶相对于来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的野生型乙酰羟酸合成酶发生如下氨基酸突变：K30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H673L。

在本发明中采用如下定义：

1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2、乙酰羟酸合成酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示乙酰羟酸合成酶突变体中突变的氨基酸。如K30Q，表示位置30的氨基酸由野生型乙酰羟酸合成酶的Lys替换成Gln，K30表示第30位的氨基酸为Lys，位置的编号对应于SEQ ID NO.3中野生型乙酰羟酸合成酶的氨基酸序列编号。

本发明中，ilvBN代表野生型乙酰羟酸合成酶编码基因(SEQ ID NO.4所示)，ILVBN代表野生型乙酰羟酸合成酶(SEQ ID NO.3所示)；ilvBN^M为乙酰羟酸合成酶突变体基因(SEQ ID NO.2所示)；ILVBN^M为乙酰羟酸合成酶突变体(SEQ ID NO.1所示)。突变前后的氨基酸对照如下表：

乙酰羟酸合成酶	氨基酸
		ILVBN	K30，A84，G128，A226，K227，Y252，T362，H673
ILVBN<sup>M</sup>	K30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H673L

所述乙酰羟酸合成酶突变体ILVBN^M，具有如下酶学特性：在L-异亮氨酸浓度为0-12mmol/L条件下，ILVBN^M酶活性无明显变化，即该突变体解除了L-异亮氨酸对其反馈抑制作用；且在L-异亮氨酸浓度为0-12mmol/L条件下，ILVBN^M的酶活性与野生型乙酰羟酸合成酶ILVBN相比无降低。

本发明解决述问题的技术方案之二是：提供一种生产L-异亮氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌是通过在宿主细胞中过表达本发明获得的解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN^M、苏氨酸脱水酶编码基因ilvA以及苏氨酸操纵子thrABC获得；

所述宿主细胞可以是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等；

所述ilvA基因可以来自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌等，如Genbank编号为JW3745、NCgl2046、BSU21770、BMQ_4058等的ilvA基因；

所述thrABC基因可以来自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等，如Genbank编号为JW0001、JW0002、JW0003；NCgl1136、NCgl1137、NCgl2139；BSU32260、BSU32240、BSU32250；BMQ_4976、BMQ_4974、BMQ_3409等的thrABC基因；

优选地，所述生产L-异亮氨酸的基因工程菌为TUIE03，是以大肠杆菌杆菌(Escherichia coli)W3110为宿主细胞，过表达SEQ ID NO.2所示的ilvBN^M基因，SEQ IDNO.5所示的ilvA基因以及SEQ ID NO.6所示的thrABC获得；

进一步地，上述基因工程菌的构建方法如下：

(1)分别扩增苏氨酸脱水酶编码基因ilvA、以及ilvBN^M基因，并分别构建基因组整合片段；

(2)扩增thrABC基因，并与质粒连接，获得重组质粒；

(3)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将上述基因组整合片段和重组质粒依次在宿主细胞内表达；

进一步地，所述构建方法具体如下：

(1)以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别PCR扩增获得苏氨酸脱水酶编码基因ilvA、以及UHF和DHF片段(分别为lacY基因上、下游同源臂)，并通过重叠PCR获得重组片段UHF-ilvA-DHF；

所述UHF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述DHF的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

(2)将UHF、DHF和ilvBN^M构建重组片段UHF-ilvBN^M-DHF；

(3)以大肠杆菌W3110基因组为模板，PCR扩增获得thrABC基因，并与质粒pTrc99a连接，获得重组质粒pTR-thrABC；

(4)L-异亮氨酸基因工程菌TUIE的构建

分别将PG-1和PG-2以及PG-3和PG-4于52℃条件下退火，然后连接至质粒pGRB，获得pGRB1和pGRB2；以大肠杆菌W3110为出发菌株，分别将pGRB1和UHF-ilvA-DHF转化至大肠杆菌W3110，获得重组菌株TUIE01；以菌株TUIE01为出发菌株，分别将pGRB2和UHF-ilvBN^M-DHF转化至TUIE01，获得菌株TUIE02；将pTR-thrABC转化至TUIE02获得TUIE03。

本发明还提供利用上述基因工程菌发酵合成L-异亮氨酸的方法，具体如下：

以5％-10％接种量将种子培养物接至发酵培养基中进行发酵培养，溶氧维持在20-40％，pH维持在6.8-7.2，培养温度30-35℃，发酵周期26-36h，发酵过程中维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)；经过26-36h发酵后，发酵液中的L-异亮氨酸浓度达到42.5-51.6g/L。

所述发酵培养基成分为：葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄ 2g/L，FeSO₄10mg/L，MnSO₄10mg/L，pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min。

有益效果：

1、本发明所述ilvBN^M基因编码的乙酰羟酸合成酶具有如下特点：该酶在解除了L-异亮氨酸对其的反馈抑制作用(图1)，且其活性较野生型ilvBN编码的乙酰羟酸合成酶未见明显降低(图2)。

2、本发明所述的L-异亮氨酸基因工程菌TUIE03无营养缺陷、生长快、发酵周期短、产量高、转化率高，经过26-36h发酵后，发酵液中的L-异亮氨酸浓度达到42.5-51.6g/L(图3)。

附图说明：

图1 L-异亮氨酸对ilvBN和ilvBN^M基因编码的乙酰羟酸合酶活性的影响；

图2 ilvBN^M与ilvBN编码的乙酰羟酸合酶活性对比；

图3 L-异亮氨酸基因工程菌TUIE03发酵过程曲线；

图4 过表达ilvBN^M对L-异亮氨酸合成的影响。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明所构建的生产L-异亮氨酸的基因工程菌，是通过在宿主细胞中过表达本发明获得的解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN^M、苏氨酸脱水酶编码基因ilvA以及苏氨酸操纵子thrABC获得；

在一些实施例方式中，宿主细胞可以是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等；

在一些实施方式中，ilvA基因可以来自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌等，如Genbank编号为JW3745、NCgl2046、BSU21770、BMQ_4058等的ilvA基因；

在一些实施方式中，thrABC基因可以来自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等，如Genbank编号为JW0001、JW0002、JW0003；NCgl1136、NCgl1137、NCgl2139；BSU32260、BSU32240、BSU32250；BMQ_4976、BMQ_4974、BMQ_3409等的thrABC基因；

上述来源的宿主细胞、ilvA基因及thrABC基因均可实现本发明所述的效果，以下实施例，以大肠杆菌杆菌(Escherichia coli)W3110为宿主细胞，过表达SEQ ID NO.2所示的ilvBN^M基因，SEQ ID NO.5所示的ilvA基因以及SEQ ID NO.6所示的thrABC为例，构建生产L-异亮氨酸的基因工程菌为TUIE03，对本发明做示例性说明。

以下实施例所用引物序列列表：

实施例1：解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN^M的获得

(1)抗L-异亮氨酸结构类似物突变株的筛选

①谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032菌悬液的制备

将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032接种至LB液体培养基，于32℃，200rpm，培养12h，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤3次后重悬，使得OD₆₀₀＝0.6-0.8，取10μL菌悬液涂在载片上。

②常压室温等离子诱变

诱变参数为：载片置于气流端口2mm处，功率120W，气流量10SLM，作用时间25s。

③抗L-异亮氨酸结构类似物α-氨基丁酸突变株的筛选

将步骤②诱变后的菌悬液涂布在含50mg/Lα-氨基丁酸的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。

④菌株产L-异亮氨酸能力测定

将步骤③筛选的菌株利用种子培养基进行96孔板培养，然后以10％的接种量接种至含发酵培养基的96孔板进行发酵实验，ILE396的L-异亮氨酸产量最高。

⑤抗L-异亮氨酸结构类似物硫代异亮氨酸突变株的筛选及产L-异亮氨酸能力测定

以ILE396为诱变对象，重复步骤①和②，将诱变后的菌悬液涂布在含50mg/L硫代异亮氨酸的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。重复步骤④，ILE693的L-异亮氨酸产量最高。

⑥培养基

种子培养基：葡萄糖25g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄2g/L，MnSO₄ 0.6g/L，玉米浆40mL，pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖80g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.6g/L，MnSO₄0.015g/L，V_B1 0.001g/L，玉米浆30mL。pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。

⑦检测方法

将发酵液于8000g离心5min后取上清液，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对其进行衍生反应，采用高效液相色谱测定L-异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(15mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm，根据高效液相法的测定结果，根据与标准品出峰时间及峰面积对比，确定L-异亮氨酸产量。

(2)解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN^M突变体的获得

提取ILE693基因组，利用引物ilvBN-1和ilvBN-2进行PCR扩增，PCR条件为：94℃5min1个循环，94℃30s、56℃30s、72℃1min 30个循环，72℃10min 1个循环，反应体系为100μL。取10μL PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR扩增的目的片段回收后连接至pMD^TM18-T Vector并转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中，然后涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养上，于37℃倒置培养24h。挑取3个单克隆，提取重组质粒并测定其序列。

测序结果表明，与野生型ilvBN相比，突变后基因编码的乙酰羟酸合成酶发生了K30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H673L突变，将该突变体命名为ILVBN^M，编码基因命名为ilvBN^M。

(3)乙酰羟酸合成酶突变体ILVBN^M与野生型乙酰羟酸合成酶ILVBN的酶学性质比较

分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032和ILE693基因组为模板，利用引物IV-1和IV-2进行PCR扩增，产物回收后连接至经BamH I酶切的pET-His质粒，然后转化至大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)，获得菌株E.coli-ilvBN和E.coli-ilvBN^M。利用IPTG对E.coli-ilvBN和E.coli-ilvBN^M诱导表达重组蛋白ILVBN和ILVBN^M，收集菌体，用100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.8)重悬后进行超声破碎并离心后取上清液。

ILVBN^M和ILVBN的酶活性测定方法如下：取100μL上述上清液至1mL磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 7.8含100mmol/L丙酮酸钠、100mmol/L 2-酮丁酸、10mmol/LMgCl₂，0.2mmol/L焦磷酸硫胺素)，于37℃反应1h后，加入100μL硫酸(3mol/L)，并于65℃处理15min以终止反应。将上述反应液与1mL 0.5％肌酸和1mLα-萘酚溶液(含2.5mol/LNaOH)混合，于65℃处理20min后冷却取室温，利用分光光度测定2-酮基-2-羟基丁酸生成量(OD₅₂₅)。结果如图2所示，ILVBN^M和ILVBN的活性分别为16.7和16.9nmol/(min·mg总蛋白)，二者无明显差异。

L-异亮氨酸对ILVBN^M和ILVBN的酶活性影响测定方法如下：向上述反应液中分别加入0、2、4、6、8、10、12mmol/LL-异亮氨酸，然后测定2-酮基-2-羟基丁酸生成量，以考察ILVBN^M解除L-异亮氨酸的反馈抑制作用。将L-异亮氨酸添加浓度为0时的酶活性定义为100％，其余L-异亮氨酸浓度条件下的ILVBN^M和ILVBN的酶活性与之相比即为相对酶活性。结果如图1所示，ILVBN的相对酶活性随L-异亮氨酸浓度增加迅速降低，L-异亮氨酸浓度高于8mmol/L时，几乎无活性，表明该酶受L-异亮氨酸反馈抑制作用；而突变体ILVBN^M的相对活性随L-异亮氨酸浓度的增加无明显变化，表明其解除了L-异亮氨酸的反馈抑制作用。

综合以上结果，乙酰羟酸合成酶突变体ILVBN^M解除了L-异亮氨酸的反馈抑制作用，同时其活性较野生型ILVBN相比未见降低。

实施例2：L-异亮氨酸生产菌TUIE03的构建

(1)重组片段UHF-ilvA-DHF的构建

以大肠杆菌W3110基因组为模板，利用引物Ilv-3、Ilv-4、Ilv-5和Ilv-6通过重叠PCR的方法扩增获得解除L-异亮氨酸反馈抑制苏氨酸脱水酶编码基因ilvA(SEQ ID NO.5所示)。以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别利用引物Ilv-1、Ilv-2、Ilv-3、Ilv-6、Ilv-7和Ilv-8进行重叠PCR扩增，回收后即为重组片段UHF-ilvA-DHF，UHF和DHF分别为lacY基因的上、下游同源臂。

(2)重组片段UHF-ilvBN-DHF的构建

以人工合成的包含ilvBN^M基因的质粒为模板、以IlvB-3和IlvB-4为引物，进行PCR扩增，获得ilvBN^M；以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别利用引物IlvB-1和IlvB-2以及IlvB-5和IlvB-6扩增获得片段UHF和DHF，UHF和DHF分别为lacZ基因的上、下游同源臂；以UHF、DHF和ilvBN^M为模板，利用引物IlvBN-1和IlvBN-6进行PCR扩增，回收后即为重组片段UHF-ilvBN^M-DHF。

(3)重组质粒pTR-thrABC的构建

以大肠杆菌W3110基因组为模板、以thr-1和thr-2为引物，进行PCR扩增，获得thrABC，将质粒pTrc99a经BamHI酶切，经电泳、切胶回收后与thrABC连接，获得重组质粒pTR-thrABC。

(4)L-异亮氨酸基因工程菌TUIE03的构建

分别将PG-1和PG-2以及PG-3和PG-4于52℃条件下退火，然后连接至质粒pGRB，获得pGRB1和pGRB2。其中PG-1和PG-2及PG-3和PG-4为用于Cas9识别W3110基因组lacY和lacZ基因序列的引导序列单链DNA，二者退火后成为双链DNA，可与pGRB连接。将pREDCas9质粒转化入大肠杆菌W3110，挑取阳性克隆菌，获得W3110-pREDCas9菌株。分别将pGRB1和UHF-ilvA-DHF转化至W3110-pREDCas9，挑取阳性克隆菌，进行pGRB-gRNA和pREDCas9质粒的消除，即获得TUIE01菌株。同理将pGRB2和UHF-ilvBN^M-DHF转化至含pREDCas9的TUIE01，获得TUIE02。将pTR-thrABC转化至TUIE02获得TUIE03。

实施例3：L-异亮氨酸生产菌TUIE03的发酵罐发酵实验

(1)种子培养

用接种环将3-5支经新鲜斜面活化的TUIE03全部接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20-40％，通风量3-5m³/h，搅拌转速400rpm，37℃培养6-8h。

(2)发酵罐发酵

以5％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发罐培养，发酵温度35℃，通风量3-5m³/h，搅拌转速500rpm，溶氧维持在20-40％，流加浓度为70％(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期36h。

(3)发酵液中L-异亮氨酸的检测

方法同实施例1(1)⑦，经检测，发酵32h时L-异亮氨酸产量最高，达到51.6g/L，转化率为18.3％。

其中：种子培养组成为：

葡萄糖14g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄ 1g/L，FeSO₄10mg/L，MnSO₄10mg/L，pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min。

发酵培养基成分组成为：

葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄ 2g/L，FeSO₄10mg/L，MnSO₄10mg/L，pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min。

实施例4过表达ilvBN^M对L-异亮氨酸合成的影响

采用实例1中相同的方法，分别构建①ilvA和thrABC过表达菌TUIE04，②ilvA、ilvBN和thrABC过表达菌株TUIE05，采用实施例3相同的方法进行发酵实验。经检测，经发酵32h，TUIE03的L-异亮氨酸产量最高(51.3g/L)，TUIE04和TUIE05的L-异亮氨酸产量分别为0.58和3.14g/L(图4)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种生产L-异亮氨酸的基因工程菌及其应用

<130> 1

<141> 2019-06-25

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 798

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser

1 5 10 15

Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Gln Ala Ile

20 25 30

Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro

35 40 45

Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys

50 55 60

Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala

65 70 75 80

Thr Gly Tyr Thr Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr

85 90 95

Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn

100 105 110

Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Ser

115 120 125

Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr

130 135 140

Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp Ile

145 150 155 160

Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro

165 170 175

Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu

180 185 190

Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val

195 200 205

Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly

210 215 220

Glu Ser Arg Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Ile Lys Ala

225 230 235 240

Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu His Thr Gly Ile Pro

245 250 255

Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu

260 265 270

Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly

275 280 285

Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly Ser Arg Phe Asp

290 295 300

Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys Ile

305 310 315 320

Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Ile Lys Gln Val

325 330 335

Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu

340 345 350

Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Ser Glu Asp Ile Ser Glu Trp

355 360 365

Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp

370 375 380

Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val Ile Glu Thr Leu

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Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly Asn

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Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr

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Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr Met Pro Asp Phe Val

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC13032)

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Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln

405 410 415

His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr

420 425 430

Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala

435 440 445

Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile

450 455 460

Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala

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485 490 495

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<210> 4

<211> 2413

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC13032)

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<213> 大肠杆菌W3110()

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tgacactcgt ttgctggctt tgatgggcga gctggaaggc cgtatctccg gcagcattca 2880

ttacgacaac gtggcaccgt gttttctcgg tggtatgcag ttgatgatcg aagaaaacga 2940

catcatcagc cagcaagtgc cagggtttga tgagtggctg tgggtgctgg cgtatccggg 3000

gattaaagtc tcgacggcag aagccagggc tattttaccg gcgcagtatc gccgccagga 3060

ttgcattgcg cacgggcgac atctggcagg cttcattcac gcctgctatt cccgtcagcc 3120

tgagcttgcc gcgaagctga tgaaagatgt tatcgctgaa ccctaccgtg aacggttact 3180

gccaggcttc cggcaggcgc ggcaggcggt cgcggaaatc ggcgcggtag cgagcggtat 3240

ctccggctcc ggcccgacct tgttcgctct gtgtgacaag ccggaaaccg cccagcgcgt 3300

tgccgactgg ttgggtaaga actacctgca aaatcaggaa ggttttgttc atatttgccg 3360

gctggatacg gcgggcgcac gagtactgga aaactaaatg aaactctaca atctgaaaga 3420

tcacaacgag caggtcagct ttgcgcaagc cgtaacccag gggttgggca aaaatcaggg 3480

gctgtttttt ccgcacgacc tgccggaatt cagcctgact gaaattgatg agatgctgaa 3540

gctggatttt gtcacccgca gtgcgaagat cctctcggcg tttattggtg atgaaatccc 3600

acaggaaatc ctggaagagc gcgtgcgcgc ggcgtttgcc ttcccggctc cggtcgccaa 3660

tgttgaaagc gatgtcggtt gtctggaatt gttccacggg ccaacgctgg catttaaaga 3720

tttcggcggt cgctttatgg cacaaatgct gacccatatt gcgggtgata agccagtgac 3780

cattctgacc gcgacctccg gtgataccgg agcggcagtg gctcatgctt tctacggttt 3840

accgaatgtg aaagtggtta tcctctatcc acgaggcaaa atcagtccac tgcaagaaaa 3900

actgttctgt acattgggcg gcaatatcga aactgttgcc atcgacggcg atttcgatgc 3960

ctgtcaggcg ctggtgaagc aggcgtttga tgatgaagaa ctgaaagtgg cgctagggtt 4020

aaactcggct aactcgatta acatcagccg tttgctggcg cagatttgct actactttga 4080

agctgttgcg cagctgccgc aggagacgcg caaccagctg gttgtctcgg tgccaagcgg 4140

aaacttcggc gatttgacgg cgggtctgct ggcgaagtca ctcggtctgc cggtgaaacg 4200

ttttattgct gcgaccaacg tgaacgatac cgtgccacgt ttcctgcacg acggtcagtg 4260

gtcacccaaa gcgactcagg cgacgttatc caacgcgatg gacgtgagtc agccgaacaa 4320

ctggccgcgt gtggaagagt tgttccgccg caaaatctgg caactgaaag agctgggtta 4380

tgcagccgtg gatgatgaaa ccacgcaaca gacaatgcgt gagttaaaag aactgggcta 4440

cacttcggag ccgcacgctg ccgtagctta tcgtgcgctg cgtgatcagt tgaatccagg 4500

cgaatatggc ttgttcctcg gcaccgcgca tccggcgaaa tttaaagaga gcgtggaagc 4560

gattctcggt gaaacgttgg atctgccaaa agagctggca gaacgtgctg atttaccctt 4620

gctttcacat aatctgcccg ccgattttgc tgcgttgcgt aaattgatga tgaatcatca 4680

gtaa 4684

<210> 7

<211> 497

<212> DNA

<213> 大肠杆菌W3110()

<400> 7

gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 60

tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg 120

gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag 180

tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc 240

gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa 300

cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt 360

gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc 420

actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt 480

ttctcccatg aagacgg 497

<210> 8

<211> 535

<212> DNA

<213> 大肠杆菌W3110()

<400> 8

gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 60

atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 120

gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 180

ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 240

cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 300

cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 360

cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 420

ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 480

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtga 535

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gtgaaaccag taacgttata cg 22

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

ccacacatta tacgagccgg atgattaatt gtcaaccgtc ttcatgggag aa 52

<210> 11

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacaag gagatatacc 60

atggctgact cgcaaccc 78

<210> 12

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

ttccagtacg tacccagcgt gttggcgaag cgcagaaacg cgcccggtga ttc 53

<210> 13

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

cgtttctgcg cttcgccaac acgctgggta cgtactggaa catttctttg ttccactatc 60

gca 63

<210> 14

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

caaacaacag ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgcta 60

acccgccaaa aagaacctga ac 82

<210> 15

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat gctgttagcg 60

ggc 63

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

tcactgcccg ctttccag 18

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

atgaccatga ttacggattc ac 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

ttagatcttg gccggagcca tgg 23

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

atgaccatga ttacggattc ac 22

<210> 20

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

ccacacatta tacgagccgg atgattaatt gtcaacgggt tttcgacgtt cagacgta 58

<210> 21

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacaag gagatatacc 60

atgaatgtgg cagcttctc 79

<210> 22

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

caaacaacag ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgtta 60

gatcttggcc ggagccatgg tc 82

<210> 23

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 60

ttgatggtag tggtcaaatg g 81

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

ttatttttga caccagacca a 21

<210> 25

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgca tgaccatgat tacggattca c 51

<210> 26

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

tgatgatgtt agctagcgct gaattctgct tagatcttgg ccggagccat gg 52

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

cagaccatgg aattcgagct cggtacccgg atgcgagtgt tgaagttcgg 50

<210> 28

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagatta ctgatgattc atcatcaatt ta 52

<210> 29

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

agtcctaggt ataatactag tttctcccat gaagacgggt tttagagcta gaa 53

<210> 30

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

ttctagctct aaaacccgtc ttcatgggag aaactagtat tatacctagg act 53

<210> 31

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

agtcctaggt ataatactag taaactgtgg agcgccgaaa tccgttttag agctagaa 58

<210> 32

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

ttctagctct aaaacggatt tcggcgctcc acagtttact agtattatac ctaggact 58

Claims

1.一种生产L-异亮氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过在宿主细胞大肠杆菌(Escherichia coli)中过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN ^M、苏氨酸脱水酶编码基因ilvA以及苏氨酸操纵子thrABC获得；

所述ilvBN ^M核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的一种生产L-异亮氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述ilvA基因是Genbank编号为JW3745 、NCgl2046、BSU21770或BMQ_4058的ilvA基因。

3.如权利要求1所述的一种生产L-异亮氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述thrABC基因是由Genbank编号分别为JW0001的thrA、JW0002的thrB和JW0003的thrC组成，或者由Genbank编号分别为NCgl1136的thrA、NCgl1137的thrB和NCgl2139的thrC组成，或者由Genbank编号分别为BSU32260的thrA、BSU32240的thrB、BSU32250的thrC组成，或者由Genbank编号分别为BMQ_4976的thrA、BMQ_4974的thrB和BMQ_3409的thrC组成。

4.如权利要求1所述的一种生产L-异亮氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌(Escherichia coli) W3110为宿主细胞，过表达SEQ ID NO.2所示的ilvBN ^M基因，SEQ ID NO.5所示的ilvA基因以及SEQ ID NO.6所示的thrABC获得。

5.如权利要求1所述的一种生产L-异亮氨酸的基因工程菌，其特征在于，构建方法如下：

（1）分别扩增苏氨酸脱水酶编码基因ilvA、以及ilvBN ^M基因，并分别构建基因组整合片段，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将上述整合片段在宿主细胞内表达获得重组菌；

（2）扩增thrABC基因，并与质粒连接，获得重组质粒，并将重组质粒转化至步骤（1）获得的重组菌中。

6.权利要求1-4任意一项所述基因工程菌在生产L-异亮氨酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，利用权利要求1-4任意一项所述的基因工程菌发酵合成L-异亮氨酸的方法具体如下：

以5%-10% 接种量将种子培养物接至发酵培养基中进行发酵培养，溶氧维持在20-40%，pH维持在6.8-7.2，培养温度30-35℃，发酵周期26-36 h，发酵过程中维持残糖浓度为0.1-0.5%。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基成分为：葡萄糖 25 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母粉5 g/L，KH₂PO₄ 4 g/L，MgSO₄ 2 g/L，FeSO₄10mg/L，MnSO₄10mg/L，pH7.0，0.075MPa 高压蒸汽灭菌 15min。