KR101119593B1

KR101119593B1 - Ｌ-루신 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 ｌ-루신의 제조방법

Info

Publication number: KR101119593B1
Application number: KR1020090075375A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 박진환; 김태용; 이광호
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2009-08-14
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2012-03-06
Also published as: KR20110017747A

Abstract

본 발명은 L-루신 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 L-루신의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, L-루신 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실되고, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 변이되고, aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, mdh, fba, gnd, aceB, glcB, aceA, glyA 및 folD로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 부분 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 L-루신의 제조방법에 관한 것이다.

부위특위적 돌연변이 방법과 대사흐름 조작에 의해 수득된 본 발명에 따른 변이 미생물은 분지쇄 아미노산의 하나인 L-루신을 고효율로 생성할 수 있어, L-루신의 산업적 생성 미생물로 유용하다.

부위특위적 돌연변이화, L-루신, 대장균, 부분 결실

Description

Ｌ-루신 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-루신의 제조방법 {Mutant Microorganism with Improved Productivity of Ｌ-leucine and Method for Preparing It Using the Same}

현재 대부분의 아미노산이 무작위 돌연변이화 기법으로 제조된 미생물에 의해 생성되고 있는데, 이들 균주는 정확한 생리대사 특성의 파악이 어려워, 추가 균 주 개량이 까다롭다는 단점이 있다. 이에, 특정 유전자만을 결실 또는 증폭하여 필요한 아미노산을 생성하게 하는 rational design 기법이 요구되고 있다.

한편, 분지쇄 아미노산(Branched Chain Amino Acid)이란, 9종의 필수아미노산 중 발린, 루신 및 이소루신의 3종을 지칭하는 것으로, 대부분의 아미노산이 간장에서 대사되는데 비해, 분지쇄 아미노산은 주로 근육에서 대사되어 활동시에 에너지원으로서 이용되는 아미노산을 말한다.

2003년 분지쇄 아미노산의 시장 점유율은 전체 아미노산 시장의 약 1%에 불과 했지만, 최근 분지쇄 아미노산이 활동시 근육의 유지 및 증량에 중요한 역할을 한다고 알려지면서 매우 빠른 속도로 증가하고 있다. 특히, L-루신은 항생제 및 의약품의 전구체로도 사용되고 있다. 현재까지 대부분의 L-루신은 Brevibacterium, Corynebacterium 또는 Serratia 등의 균주로부터 생성되어 왔으나, 최근 배양이 용이하고, 분자생물학적 기술이 발달한 대장균에서의 생성이 보고되고 있다. 특히, 일본 아지노모토 사에서는 무작위 돌연변이화 기법으로 L-루신에 내성을 갖는 대장균을 선별하여 5.2g/ℓ의 L-루신 생성을 보고하였다 (US 6,403,342).

그러나 아직까지 미생물을 이용하여 rational design 방법으로 L-루신을 생성한 예는 보고된 바 없다.

다양한 rational design 방법 중 인실리코 시뮬레이션 방법, 특히 대사회로를 통한 분석 및 예측기술은 최근에야 급속하게 증가하는 게놈정보와 함께 그 가능성을 보이고 있다. 특히 각 미생물의 대사회로 모델들이 수학적 모델 및 최적화 기술 등과 결합되어 유전자의 제거 또는 추가 후에 일어나는 대사회로의 반응을 예 측하는 것이 가능해지고 있다. 또한 대사회로를 이용한 대사흐름분석기법은 동적 정보를 필요로 하지 않음에도 세포의 이상적인 대사흐름을 보여주며 실제적으로 세포의 행동을 정확히 모사하고 예측할 수 있는 것으로 알려져 있다. 대사흐름분석은 생화학 반응식의 질량수지와 세포조성 정보만을 이용하여 세포가 도달 가능한 이상적인 대사 흐름 공간을 구하며 특정한 목적함수를 최적화 방법을 통하여 최대화 하거나 최소화 하는 것을 목적으로 한다 (세포성장속도 최대화 또는 특정 섭동에 의한 대사 조절의 최소화 등). 그밖에 대사흐름분석은 일반적으로 균주개량을 통하여 원하는 대사산물의 특정 유전자의 치사성을 확인하기 위하여 사용될 수 있으며, 이를 이용하여 균주내부의 대사회로 특성을 파악할 수 있다. 또한, 유전자의 제거 또는 추가에 의해 일어나는 대사회로의 흐름변화 등을 예측하기 위해 대사흐름분석 방법을 응용한 다양한 연구가 보고되고 있다.

따라서, 당업계에서는 기존의 무작위 돌연변이화 기법과 달리, 특정 유전자의 결실로 인한 대사회로 재구성 및 필요 유전자의 증폭을 통한 rational design 방법에 의해 분지쇄 아미노산의 고생성능을 갖는 미생물, 특히, L-루신 고생성능을 갖는 대장균의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

한편, 본 발명자들은 2007년에 rational design 방법을 이용하여 분지쇄 아미노산의 하나인 L-발린 고생성능을 갖는 대장균을 개발하여 특허를 출원한 바 있다 (KR0832740).

그러나, 상기 특허에서는 in silico simulation으로 확인한 결실 대상 유전자를 염색체 상에서 100% 제거하였기 때문에 L-발린 생성능은 증가했지만 세포 성 장 속도가 감소하는 단점이 있었다. 특히 aceF(pyruvate dehydrogenase를 코딩하는 유전자)의 결실로 인하여 TCA cycle의 전구체인 acetyl-CoA가 만들어지지 않아서 acetyl-CoA의 전구체인 acetic acid를 외부에서 넣어주어야 하는 단점이 있었다.

이에 본 발명자들은 rational design 방법에 의해 분지쇄 아미노산의 한 종류인 L-루신 고생성능을 갖는 미생물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, L-루신에 의한 feedback 저해를 제거한 후, L-루신 생합성 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환하고, 상기 치환된 promoter를 포함하는 오페론을 재조합 벡터에 삽입한 다음, 경쟁 pathway에 관여하는 유전자들인 ilvA, ilvE, panB가 결실되고, in silico simulation으로 확인한 결실 대상 유전자가 100%가 아닌 부분 결실된 대장균에 도입할 경우, L-루신 생성능을 획기적으로 증가시킴과 동시에 세포 성장 속도도 일정 수준으로 유지할 수 있으며, acetic acid를 추가적으로 넣어줄 필요가 없으므로 배양 비용절감의 효과도 얻을 수 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 L-루신 고생성능 변이 미생물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 미생물을 이용한 L-루신의 제조방법을 제 공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 L-루신 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키고, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 변이시키고, aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, mdh, fba, gnd, aceB, glcB, aceA, glyA 및 folD로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 부분 결실시키는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제작되고, L-루신 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실되고, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 변이되고, aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, mdh, fba, gnd, aceB, glcB, aceA, glyA 및 folD로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 부분 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) ilvA, ilvE 및 panB 유전자가 결실; (b) pfkA 및 mdh 유전자가 부분 결실; (c) lacI 유전자가 결실; (d) leuA 유전자의 피드백 저해가 제거; (e) ilvGMEDA, ilvBN 및 leuABCD 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (f) ilvB, ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; (g) leuABCD 및 tyrB 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입 및; (h) 서열번호 (63)의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자인 ygaZH가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) ilvA, ilvE 및 panB 유전자가 결실; (b) pfkA, mdh 및 aceF 유전자가 부분 결실; (c) lacI 유전자가 결실; (d) leuA 유전자의 피드백 저해가 제거; (e) ilvGMEDA, ilvBN 및 leuABCD 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (f) ilvB, ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; (g) leuABCD 및 tyrB 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입 및; (h) 서열번호 (63)의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자인 ygaZH가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물을 배양한 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 L-루신을 회수하는 것을 특징으로 하는 L-루신의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법은 기존의 무작위 돌연변이 기법과 달리, 특정 유전자의 결실로 인한 대사회로 재구성 및 필요 유전자의 증폭을 통한 rational design 방법에 의해 분지쇄 아미노산의 고생성능을 갖는 미생물을 효과적으로 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 변이 미생물은 부위특위적 돌연변이 방법과 대사흐름 조작에 의해 L-루신을 고효율로 생성할 수 있어, 본 발명의 변이 미생물은 L-루신의 산업적 생성 미생물로 유용하다.

본 발명에서는 L-루신 생성 대사경로를 가지는 미생물에서 in silico simulation으로부터 확인한 대상 유전자(aceF, mdh 및 pfkA)를 결실시키는 대사흐름 조작을 수행할 경우 L-루신의 생성성을 향상시킬 수 있으며, 특히 상기 유전자의 결실이 100%가 아닌 부분 결실일 경우, 균주의 성장이 빨라 생산성이 더욱 증가되며, TCA cycle의 전구체인 acetyl-CoA 생성을 위한 sodium acetate를 추가적으로 공급하지 않아도 된다는 사실을 확인하고자 하였다.

대부분의 아미노산 생성 미생물은 무작위 돌연변이, 또는 생합성 경로의 말단 효소의 증폭 등으로 제조되고 있다. 이와 같은 방법은 각각, 생성 미생물에 해당 아미노산의 내성을 부여하고, 생합성 효소의 농도를 높임으로서 아미노산 생성효율을 높이는 효과를 갖는다. 그러나, 아미노산 생합성에 필요한 전구체의 확보(precursor availability)에 한계가 있기 때문에 일정 수준 이상의 생성능 확보가 불가능하다. 이에, 본 발명에서는 L-루신의 전구체 확보를 용이하게 하기 위해 서 세포내 대사흐름을 조절함으로써 고생성능의 L-루신 생성 미생물를 제조할 수 있을 것으로 예측하였다. 세포내 대사흐름을 최적화하기 위해서 in silico simulation 방법을 이용하여 pyruvate dehydrogenase를 코딩하는 유전자(aceF), malate dehydrogenase를 코딩하는 유전자(mdh), phosphofructokinase를 코딩하는 유전자(pfkA) 등을 결실 대상 유전자로 선정하였다. 도 1은 상기와 같이 제작된 aceF, mdh 및 pfkA 유전자를 결실시킨 변이 미생물 LAMF의 대사회로를 나타낸 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 도 2에 나타난 바와 같이, 대장균 야생균주 W3110으로부터 L-루신에 의한 feedback 저해를 제거한 후, L-루신 생합성 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환하고, 상기 치환된 promoter를 포함하는 오페론을 재조합 벡터에 삽입한 다음, L-루신 pathway에 관여하는 유전자들인 ilvA, ilvE, panB를 결실시키고, in silico simulation으로 확인한 결실 대상 유전자(aceF, mdh 및 pfkA)를 100%가 아닌 부분 결실시켜 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제작하였다. 그리고, 제작된 변이 미생물은 세포 성장속도 뿐만 아니라 L-루신 생산속도가 우수하여, L-루신 생성능이 매우 우수하다는 사실도 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, L-루신 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 결실시키고, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 변이시키고, aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, mdh, fba, gnd, aceB, glcB, aceA, glyA 및 folD로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 부분 결실시키는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 상기 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대장균인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있고, L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvE(branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있으며, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 그 발현이 증가되도록 변이시키는 것은 (a) lacI(lac operon repressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) leuA(2-isopropylmalate synthase) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition) 제거; (c) ilvGMEDA(acetohydroxy acid synthase isozyme I), ilvBN(Acetohydroxy acid synthase isozyme II) 및 leuABCD(2-isopropylmalate synthase) 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환; 및 (d) strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터와 leuABCD 및 tyrB 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 발현벡터는 각각 pKBRilvBNCD 벡터와 pKK184leuABCDtyrB인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, mdh, fba, gnd, aceB, glcB, aceA, glyA 및 folD로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자는 부분 결실시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 pfkA 및 mdh 유전자를 부분 결실시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 pfkA, mdh 및 aceF 유전자를 부분 결실시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, “부분 결실”이라 함은 대상 유전자의 20~80%, 바람직하게는 40~60%를 결실시키는 것을 의미하며, “결실”이라 함은 대상 유전자 100%를 결실시키는 것을 의미한다.

아미노산의 엑스포터(exporter)는 해당 아미노산의 생산에 필수적이며, 생산 능력을 높이기 위해서는 exporter의 증폭이 요구된다. 현재 대장균에서는 yeaS 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 L-루신 exporter의 역할을 한다는 것이 밝혀져 있다 (Kutukova et al., FEBS Lett 579:4629-4634, 2005).

본 발명자들은 상기 yeaS 유전자를 L-루신 생성능을 갖는 대장균에 과발현해보았다. 즉, 즉, 대장균의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 대장균 유전체서열에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 yeaS 유전자를 증폭시켰다. 상기 증폭된 yeaS 유전자를 XbaI으로 절단하고, 동일 제한효소로 절단한 pKBRilvBNCD 벡터에 클로닝하여 pKBRilvBNCDyeaS를 제작하고, 이를 pKK184leuABCDtyrB 벡터와 함께 상기 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물(Leu)에 도입한 결과, L-루신의 생성능이 24% 증가하는 것을 확인했다.

Nicole Kennerknecht 등은 Corynebacterium glutamicum에서 L-발린을 비롯한 분지쇄 아미노산의 엑스포터(exporter) 역할을 하는 단백질(BrnFE)을 보고하였다 (Nicole et al., J. Bacteriol., 184:3947, 2002, US 6,841,360 B2). 또한, Ekaterina Alexsandrovna Tabolina 등은 상기 상동 단백질이 대장균에서도 L-발린의 엑스포터 역할을 하는 것을 보고하였다 (US Patent 2005/0239175).

본 발명자들은 이전 연구에서 상기 BrnFE 단백질과 상동성을 가진 대장균의 YgaZH 단백질이 L-발린 생성능을 갖는 대장균에서 L-발린 엑스포터의 역할을 한다는 것을 보고하였다 (Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 104:7797-7802, 2007).

본 발명자들은 상기 YgaZH 단백질이 L-루신의 exporter 역할도 할 것이라는 가정하에 ygaZH 유전자를 L-루신 생성능을 갖는 대장균에 과발현해보았다. 즉, 대 장균의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 대장균 유전체서열에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 ygaZH 유전자를 증폭시켰다. 상기 증폭된 ygaZH 유전자를 XbaI으로 절단하고, 동일 제한효소로 절단한 pKBRilvBNCD 벡터에 클로닝하여 pKBRilvBNCDygaZH를 제작하고, 이를 pKK184leuABCDtyrB 벡터와 함께 상기 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물(Leu)에 도입한 결과, L-루신의 생성능이 78% 증가하는 것을 확인했다. 상기 결과로부터, YgaZH 단백질이 L-루신의 exporter 역할도 한다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법은 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자인 ygaZH를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자는 서열번호 (61) 및 서열번호 (62)의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상이거나, 서열번호 (63)의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법은 L-루신 엑스포터(exporter) 유전자인 yeaS를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 L-루신 엑스포터(exporter) 유전자는 서열번호 (64)의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

한편, global regulator인 Lrp가 L-루신 생합성의 중요한 아이소엔자임 중의 하나인 acetohydroxyacid synthase III 효소를 코딩하는 ilvIH operon의 발현을 촉 진한다는 사실(Platko et al., J. Bacteriol., 172:4563~4570. 1990)과 L-루신의 흡수에 관여하는 트랜스포터를 코딩하는 livK 유전자의 발현을 억제한다는 사실(Haney et al., J.Bacteriol., 174:108-115. 1992)이 밝혀진 바 있다. 또한, 본 발명자들은 이전 연구에서 Lrp가 분지쇄 아미노산의 exporter인 YgaZH의 발현을 촉진한다는 사실을 확인한 바 있다 (Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 104:7797-7802, 2007). 상기 사실들에 기반하여 본 발명자들은 lrp 유전자의 증폭이 L-루신의 생성능을 증가시킬 것으로 예상하고 lrp 유전자를 클로닝 하였다. 즉, 대장균의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 대장균 유전체서열에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 lrp 유전자를 증폭시켰다. 상기 증폭된 lrp 유전자를 XbaI으로 절단하고, pKBRilvBNCD 벡터에 클로닝하여 pKBRilvBNCDlrp를 제작하고, 이를 상기 pKK184leuABCDtyrB 벡터와 함께 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물(Leu)에 도입한 결과, L-루신의 생성능이 20% 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법은 global regulator인 lrp 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 lrp 유전자는 서열번호 (65)의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제작되고, L-루신 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-발 린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실되고, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 변이되고, aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, mdh, fba, gnd, aceB, glcB, aceA, glyA 및 folD로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 부분 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) ilvA, ilvE 및 panB 유전자가 결실; (b) pfkA 및 mdh 유전자가 부분 결실; (c) lacI 유전자가 결실; (d) leuA 유전자의 피드백 저해가 제거; (e) ilvGMEDA, ilvBN 및 leuABCD 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (f) ilvB, ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; (g) leuABCD 및 tyrB 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입 및; (h) 서열번호 (63)의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자인 ygaZH가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) ilvA, ilvE 및 panB 유전자가 결실; (b) pfkA, mdh 및 aceF 유전자가 부분 결실; (c) lacI 유전자가 결실; (d) leuA 유전자의 피드백 저해가 제거; (e) ilvGMEDA, ilvBN 및 leuABCD 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환; (f) ilvB, ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; (g) leuABCD 및 tyrB 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입 및; (h) 서열번호 (63)의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자인 ygaZH가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물은 L-루신 엑스포터(exporter) 유전자인 서열번호 (64)의 yeaS가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물은 서열번호 (65)의 lrp 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물을 배양한 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 L-루신을 회수하는 것을 특징으로 하는 L-루신의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 변이 미생물의 배양 및 L-루신의 수득 과정은 종래 발효공정에서 통상적으로 알려진 배양방법(회분식 배양, 유가식 배양) 및 L-루신의 분리 및 정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, L-루신의 생물공학적 생산은 세포 내 혹은 세포 외(in vivo or in vitro)에서 수행될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

하기 실시예에서는 대장균 W3110 유래의 L-루신 생성 미생물에 결실 대상 유전자를 도입하여, 분지쇄 아미노산 중, L-루신을 고농도로 제조하는 방법에 대하여 기재하였으나, 다른 대장균 및 미생물을 사용하여 동일 결실 대상 유전자를 도입하고, 이를 이용하여 L-루신을 제조하는 것과, L-루신이 아닌 L-발린 및 L-이소루신을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이(Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41, 2001), 유청(whey), CSL(corn steep liguor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: L-루신 고생성 변이 미생물의 제작 및 L-루신의 생성능 측정

1-1: L-루신 고생성 미생물의 제작

1-1-1: pSacHR06의 제작

염색체 DNA의 특정 염기 또는 염기들의 치환을 위해 바실러스 서틀리스 유래의 sacB homologous recombination 기법(Wohlleben et. al., J. Bacteriol., 174:5462, 1992)을 이용할 목적으로 pSacHR06 벡터를 제작하였다(도 3). 도 3은 pSacHR06 벡터를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.

먼저, pUC19(New England Biolab) 벡터의 엠피실린(ampicillin)에 대한 내성 특성을 카나마이신(kanamycin)에 대한 내성 특성으로 치환하기 위하여 pUC19 벡터를 NdeI 및 AhdI으로 절단하여 얻은 1.5kb 절편을 pACYC177 벡터(New England Biolabs)를 StuI으로 절단하여 얻은 1.3kb 절편과 DNA 축합반응을 수행하여 pUC19KM 벡터를 얻었다.

다음으로, 상기 pUC19KM 벡터를 PvuII로 절단하여 얻은 2.5kb 절편과 pBlu2KSP(full name: pBluescriptIIKS(+)) 벡터를 PvuII로 절단하여 얻은 400bp 절편을 축합반응 하여 pUC19KKS 벡터를 얻었다. 이후 상기 벡터에 DNA 복제 원점의 용이한 제거가 가능하도록 하기 위해 서열번호 1 및 2의 프라이머와 pUC19 벡터 주형을 이용하여 PCR을 수행하였고, 그 결과 동일한 절단효소들의 인식부위를 양쪽 끝에 각각 가지고 있으며 DNA 복제기점을 가지는 DNA 절편을 획득하였다. 상기 절편을 SalI 및 DraIII로 절단하고, pUC19KKS 벡터를 SalI 및 DraIII로 절단하여 얻은 1.5kb 절편과 DNA 축합반응 하여 pUC19K 벡터를 얻었다. 상기 pUC19K 벡터에 바실러스 서틀리스(Bacillus subtilis)의 sacB 유전자를 도입하기 위하여 바실러스 서틀리스의 genomic DNA 주형과 서열번호 3 및 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 sacB 유전자를 가지는 DNA 절편을 합성하였고, 상기 합성된 DNA 절편과 pUC19K 벡터 모두를 XbaI 및 SpeI 효소로 절단하고 축합하여 sacB 유전자를 가지는 새로운 벡터를 제작하였고 이를 pSacHR06으로 명명하였다.

pSacHR06 벡터는 바실러스 서틀리스 유래의 sacB 유전자를 가지며 제한효소를 사용하여 용이하게 DNA 복제 원점의 제거와 재축합 반응을 수행할 수 있기 때문에 sacB positive selection에 사용 가능하다.

[서열번호 1] pucoriup: 5'-agccgtcgacgctagcgcatgcacgcgtgtgcacccatgggacgtcctc actgactcgctgcgctc-3'

[서열번호 2] pucorido: 5'-ggctcacaacgtggctagcgacgtcgtgcacccatgggttccactgagc gtcagacc-3'

[서열번호 3] sacBf: 5'-actctctagacgcgggtttgttactgataa-3'

[서열번호 4] sacBr: 5'-gctagatatcaggatatcggcattttcttt-3'

1-1-2: lacI 유전자의 결실

L-루신 생성 미생물인 대장균 W3110(ATTC 39936)에서 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640-6645, 2000)을 이용하여, lac operon의 repressor를 암호화하는 유 전자로, lactose 분해를 담당하는 lac operon의 전사를 억제하는 기능을 갖는 lacI 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.

[서열번호 5] lacI_1stup: 5'-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctc ttagattgcagcattacacgtcttg-3'

[서열번호 6] lacI_1stdo: 5'-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaat gcacttaacggctgacatggg-3'

1-1-3: leuA의 feedback inhibition 제거

아지노모토 사에서 출원한 특허(US 6,403,342 B1)를 참고하여 2-isopropylmalate synthase를 코딩하는 유전자인 leuA의 1435번째 염기(G)를 T로 치환하였고, 대장균 W3110(ATTC 39936)의 염색체 DNA는 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다 (Sambrook, et al., Molecular cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989).

즉, 서열번호 7 및 8과 9 및 10의 프라이머와, 대장균 W3110 genomic DNA 주형을 이용하여 각각 PCR을 수행한 다음, 수득된 두개의 PCR 절편을 동일 농도로 섞어 주형으로 하고, 서열번호 7 및 10을 프라이머로 사용하여 overlapping PCR을 수행하였다. 상기와 같은 방법으로 얻은 1280bp의 PCR 절편을 PstI 및 SalI 효소로 절단하고, 역시 PstI 및 SalI 효소로 절단한 sacB homologous recombination 용 벡터인 pSacHR06에 삽입한 다음, sequencing 하여, leuA의 1435번째 염기(G)가 T로 치환되었음을 확인하였다.

상기 수득한 벡터를 NheI 효소로 절단하여, replication origin을 결실시킨 다음, self-ligation 시키고, 상기 1-1-2에서 제작된 lacI 유전자가 결실된 대장균 W3110 컴피턴트 세포(electroporation-competent cell)에 일렉트로포레이션하였다. 다음으로, sacB positive selection (Wohlleben et al., J. Bacteriol., 174:5462, 1992) 방법에 의해 feedback inhibition이 제거된 균주를 수득하였다.

[서열번호 7] leuA1: 5'-gactggatccgagatatggcgcaccagccagttagttagc-3'

[서열번호 8] leuA2: 5'-atgactcgacaatatcggtagccaggcagacgccgtggaagcggcgaccgtt-3'

[서열번호 9] leuA3: 5'-aacggtcgccgcttccacggcgtctgcctggctaccgatattgtcgagtcat-3'

[서열번호 10] leuA4: 5'-gctccgtcgactcgatctcaaaacggtgatacacctcggt-3'

1-1-4: ilvGMEDA 와 ilvBN 및 leuABCD 오페론의 attenuator 의 tac promoter로의 치환

1-1-3에서 제작된 lacI 유전자와 leuA의 feedback inhibition이 제거된 대장균 W3110에서, acetohydroxy acid synthase isozyme I과 II 및 2-isopropylmalate synthase의 constitutive expression을 유도하기 위하여, acetohydroxy acid synthase isozyme I과 II 및 2-isopropylmalate synthase를 각각 암호화하는 ilvBN 과 ilvGMEDA 및 leuABCD 오페론의 전사조절 기작에 관여하는 attenuator를 강력한 promoter인 tac promoter로 치환하였다.

먼저, ilvGMEDA operon attenuator의 치환을 위해, 서열번호 11 및 12와 13 및 14를 각각 한 쌍의 프라이머와 대장균 W3110 genomic DNA 주형을 이용하여 PCR을 수행한 다음, PCR 절편, ilvGatt1 및 ilvGatt2를 각각 수득하였다. 상기 수득된 두 PCR 절편을 각각 SalI/BamHI 및 EcoRI/PstI 효소로 절단하여 pKK223-3 벡터(Pharmacia Biotech)의 해당 효소 절단 부위에 클로닝 한 다음, sequencing으로 염기서열을 확인한 후, SalI 및 PstI 효소로 절단한 부위를 상기 pSacHR06 벡터의 해당 효소 절단 부위에 클로닝하고, 상기 feedback inhibition 제거와 동일한 방법으로, attenuator를 포함하는 native promoter를 tac promoter로 치환하였다.

ilvBN operon의 attenuator 제거를 위해, 서열번호 15 및 16과 17 및 18을 각각 한 쌍의 프라이머로 사용하여 상기 ilvGMEDA attenuator 제거와 동일한 방법으로 PCR 및 클로닝한 다음, 상기에서 ilvGMEDA attenuator가 제거된 대장균 W3110 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하였다. 그 결과 ilvBN attenuator를 포함하는 native promoter를 tac promoter로 치환할 수 있었다.

leuABCD operon의 attenuator 제거를 위해, 서열번호 19 및 20과 21 및 22를 각각 한쌍의 프라이머로 사용하여 상기 ilvGMEDA attenuator 제거와 동일한 방법으로 PCR 및 클로닝한 다음, 상기에서 ilvGMEDA 및 ilvBN attenuator가 제거된 대장균 W3110 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하였다. 그 결과 leuABCD attenuator를 포함하는 native promoter를 tac promoter로 치환할 수 있었다.

[서열번호 11] ilvGatt1f: 5'-gactgtcgacctaacttattggctgtaagctgttctgaggcc-3'

[서열번호 12] ilvGatt1r: 5'-gctcggatccgaatgttgttcccttcctcgtagttcatcc-3'

[서열번호 13] ilvGatt2f: 5'-gactgaattcatgaatggcgcacagtgggtggtacatgcg-3'

[서열번호 14] ilvGatt2r: 5'-gctcctgcagtcaccgctggctaactggatatcttttggg-3'

[서열번호 15] ilvBatt1f: 5'-gactcgtcgacagagatggtagggcggataa-3'

[서열번호 16] ilvBatt1r: 5'-gctcggatcccacactgtattatgtcaaca-3'

[서열번호 17] ilvBatt2f: 5'-gactgaattcatggcaagttcgggcacaac-3'

[서열번호 18] ilvBatt2r: 5'-gctcactgcagtgcgtcacgaatgctttctt-3'

[서열번호 19] leuAatt1f: 5'-actcgtcgacatctgcgaggtcagaatgct-3'

[서열번호 20] leuAatt1r: 5'-cgctcggatccttcgcaacaaaaacattatg-3'

[서열번호 21] leuAatt2f: 5'-cgactgaattcatgagccagcaagtcattat-3'

[서열번호 22] leuAatt2r: 5'-gctcactgcagataatggctttgtcgatgtta-3'

1-1-5: ilvA, ilvE 및 panB 유전자의 결실

1-1-4에서 수득된 lacI 유전자와 leuA의 feedback inhibition 제거되고 ilvGMEDA와 ilvBN 및 leuABCD 오페론의 attenuator가 tac promoter로의 치환된 W3110에서 ilvA, ilvE 및 panB 유전자를 결실시키기 위하여, 서열번호 23 내지 28 프라이머들을 이용하여 상기 1-1-2에 언급한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640, 2000)에 의해 ilvA(isoleucine 생합성 경로의 첫 번 째 효소인 threonine dehydratase를 암호화하는 유전자), panB(pantothenate 생합성에 필요한 효소 중 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자) 및 ilvE(valine 생합성에 필요한 효소 중 branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자)등의 유전자를 결실시켰다.

즉, 1-1-4에서 제작된 lacI 유전자가 제거되고, leuA의 feedback inhibition이 제거되었으며, ilvGMEDA와 ilvBN 및 leuABCD 오페론의 attenuator를 포함한 본래의 promoter가, 강력한 전사활성을 가지는 tac promoter로 치환된 대장균 W3110 컴피턴트 세포에서 상기 유전자 3종의 결실을 유도하였다.

[서열번호 23] ilvA1stup: 5'-atggctgactcgcaacccctgtccggtgctccggaaggtgccgaatatt tgattgcagcattacacgtcttg-3'

[서열번호 24] ilvA1stdo: 5'-ctaacccgccaaaaagaacctgaacgccgggttattggtttcgtcgtg gccacttaacggctgacatggg-3'

[서열번호 25] panB1stup: 5'-atgaaaccgaccaccatctccttactgcagaagtacaaacaggaaaaa aagattgcagcattacacgtcttg-3'

[서열번호 26] panB1stdo: 5'-ttaatggaaactgtgttcttcgcccggataaacgccggactccacttca gcacttaacggctgacatggg-3'

[서열번호 27] ilvE1stup: 5'-agaaagctgattacatttggttcaatggggagatggttcgctggg aagacgattgcagcattacacgtcttg-3'

[서열번호 28] ilvE1stdo: 5'-ttattgattaacttgatctaaccagccccatttatcttcggtttcgcc agcacttaacggctgacatggga-3'

1-1-6: pKBRilvBNCD vector의 제작

서열번호 29 내지 34의 프라이머들을 이용하여 L-루신 생합성 경로에 필수적인 유전자들, 즉 ilvB(acetohydroxy acid synthase I large subunit을 암호화하는 유전자), ilvN(acetohydroxy acid synthase I small subunit을 암호화하는 유전자), ilvC(acetohydroxy acid isomeroreductase를 암호화하는 유전자) 및 ilvD(dihydroxy-acid dehydratase를 암호화하는 유전자) 등을 순차적으로 pKK223-3 발현벡터(Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pKKilvBNCD 벡터를 수득하고, sequencing으로 염기서열을 확인하였다. 상기 pKKilvBNCD 벡터를 PciI 및 SphI 효소로 절단한 8.0kb 절편과, pBR322 벡터를 PciI 및 SphI 효소로 절단한 1.9kb 절편을 ligation 하여 pKBRilvBNCD 벡터를 최종 수득하였다 (도 4).

[서열번호 29] ilvBNf: 5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'

[서열번호 30] ilvBNr: 5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'

[서열번호 31] ilvCf: 5'-agtgctgcagacgaggaatcaccatggctaac-3'

[서열번호 32] ilvCrSX: 5'-gctcctgcagtctagagctagcgagctcttaacccgc-3'

[서열번호 33] ilvDf: 5'-actcgagctcgagacagacactgggagtaa-3'

[서열번호 34] ilvDr: 5'-tacgtctagattaaccccccagtttcgatt-3'

1-1-7: pKK184leuABCDtyrB vector의 제작

서열번호 35 내지 36의 프라이머들을 이용하여 L-루신 생합성 경로에 필수적인 유전자들, 즉 leuA(2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자), leuB(3-isopropylmalate dehydrogenase를 암호화하는 유전자) 및 leuCD(isopropylmalate isomerase를 암호화하는 유전자)등을 pKK223-3 발현벡터(Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pKKleuABCD 벡터를 수득하고, sequencing으로 염기서열을 확인하였다. SalI-ScaI-digested 6.0-kb fragment of pKKleuABCD ligated with EcoRV-SalI-digested 3.8-kb fragment of pACYC184, 9.8-kb 상기 pKKleuABCD 벡터를 SalI 및 ScaI 효소로 절단한 6.0kb 절편과, pACYC184 벡터를 EcoRV 및 SalI 효소로 절단한 1.9kb 절편을 ligation 하여 pKK184leuABCD 벡터를 수득하였다. 서열번호 37 내지 38의 프라이머들을 이용하여 L-루신 생합성에 필수적인 유전자인 tyrB(aromatic amino acid transaminase를 암호화하는 유전자)를 상기 pKK184leuABCD 벡터에 추가로 클로닝하여 pKK184leuABCDtyrB 벡터를 수득하고, sequencing으로 염기서열을 확인하였다 (도 5).

[서열번호 35] leuABCDf: 5'-gctcgaattcatgagccagcaagtcattat-3'

[서열번호 36] leuABCDr: 5'-gctactgcaggagctcgctagcggtaccttaattcataaacgcaggtt-3'

[서열번호 37] tyrBfk: 5'-actcggtaccgtgtttcaaaaagttgacgc-3'

[서열번호 38] tyrBrs: 5'-acatgagctcttacatcaccgcagcaaacg-3'

1-1-8: L-루신 생성 미생물의 제작

상기 1-1-1 내지 1-1-7의 과정을 통해 ilvGMEDA와 ilvBN 및 leuABCD operon의 attenuator를 포함하는 native promoter가 tac promoter로 치환되고, leuA의 feedback inhibition이 제거되고, lacI, ilvA, panB 및 ilvE 유전자가 결실된 대장균 W3110 균주에 상기 1-1-6 및 1-1-7에서 제작된 pKBRilvBNCD 및 pKK184leuABCDtyrB 벡터를 도입하여 L-루신 생성 미생물(Leu+pKBRilvBNCD+pKK184leuABCDtyrB)를 제작하였다.

1-2: L-루신의 생성능 측정

1-1-8에서 제작된 L-루신 생성 미생물(Leu+pKBRilvBNCD+pKK184leuABCDtyrB)을 엠피실린(ampicillin) 50㎍/㎖, 클로람페니콜(chloramphenicol) 30㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다.

상기 형질전환 균주를 5g/ℓ glucose를 포함하는 200㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 24시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g glucose, 2g KH₂PO₄, 30g (NH₄)₂SO₄ㆍ7H₂O, 0.4g MgSO₄ㆍ7H₂O, 3g yeast extract, 262mg L-isoleucine, 262mg L-valine, 425㎍ D-pantothenic acid hemicalcium, salt, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO₄ㆍ7H₂O, 1.35g CaCl₂, 2.25g ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.5g MnSO₄ㆍ4H₂O, 1g CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.106g (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O, 0.23g Na₂B₄O₇ ㆍ10H₂O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분으로 구성된 배지 1.8 리터를 함유한 6.6 리터 발효기(Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA)에 상기 전배양액을 접종하여, 31℃에서 배양하였다. pH는 25%(v/v) NH₄OH의 automatic feeding에 의해 6.0으로 유지되었고, 용존 산소 농도(dissolved oxygen concentration)는 공기를 1vvm(air volume/working volume/minute)으로 공급하면서 교반속도를 1000rpm 까지 자동 조절함으로써 포화 공기(air saturation)의 40% 이상으로 유지했다.

상기 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다. 그 결과, 표 1에서 보는바와 같이 W3110 야생균주에서는 생성되지 않았던 L-루신이 본 발명의 L-루신 생성 미생물(Leu+pKBRilvBNCD+pKK184leuABCDtyrB)에서는 1.00g/ℓ의 농도로 생성되었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 attenuator를 포함하는 native promoter의 strong tac promoter로의 치환, feedback inhibition의 제거, 경쟁 유전자의 결실, 그리고 L-루신 생합성에 필수적인 유전자의 증폭이 L-루신의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

Strain	W3110	Leu + pKBRilvBNCD + pKK184leuABCDtyrB
L-루신 (g/ℓ)	ND¹	1.00

¹ Not detected.

실시예 2: L-루신 생성 미생물에 대장균의 ygaZH operon을 포함하는 재조합 벡터의 도입 및 L-발린의 생성능 측정

2-1: 대장균의 ygaZH operon을 포함하는 재조합 벡터(pKBRilvBNCDygaZH)의 제작

대장균 W3110(ATTC 39936)의 염색체 DNA를 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다. 상기 정제된 유전체서열을 주형으로 하고, 서열번호 39 및 40을 프라이머로 사용하여, 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 1분 20초간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복하면서, PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다.

[서열번호 39] ygaZHfx: 5'-gacttctagagctactttattggcggtgcc-3'

[서열번호 40] ygaZHrx: 5'-actctctagatgataaggaaaatcttcgtg-3'

상기 증폭된 PCR 절편(ygaZH 유전자)을 XbaI으로 절단하고, 동일 제한효소로 절단한 pKBRilvBNCD 벡터에 클로닝하여 pKBRilvBNCDygaZH를 제작하였다 (도 6).

2-2: 재조합 벡터(pKBRilvBNCDygaZH)의 L-루신 생성 미생물로의 도입

실시예 1에서 제작된 L-루신 생성 미생물 Leu에, 상기 1-1-7에서 제작된 벡터 pKK184leuABCDtyrB와 함께 상기 2-1에서 제작된 벡터 pKBRilvBNCDygaZH를 도입하여, 재조합 대장균 (Leu+pKBRilvBNCDygaZH+pKK184leuABCDtyrB)을 제작하였다.

2-3: L-루신의 생성능 측정

상기 2-2에서 제작된 L-루신 생성 대장균(Leu+pKBRilvBNCDygaZH+pKK184leuABCDtyrB)를 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 선별된 균주를 1-2와 동일한 방법으로 전배양 및 배양시킨 후, 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다.

그 결과, 표 2에서 보는바와 같이 Leul+pKBRilvBNCD+pKK184leuABCDtyrB에 비해, exporter를 도입시킨 Leul+pKBRilvBNCDygaZH+pKK184leuABCDtyrB의 경우, L-루신의 생성이 증가된다는 것을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과로부터, ygaZH 유전자의 과발현이 L-루신의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

Strain	Leu+pKBRilvBNCD+pKK184leuABCDtyrB	Leu+pKBRilvBNCDygaZH+pKK184leuABCDtyrB
L-루신 (g/ℓ)	1.00	1.78

실시예 3: L-루신 생성 미생물에 대장균의 yeaS 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 도입 및 L-루신의 생성능 측정

3-1: 대장균의 yeaS 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pKBRilvBNCDyeaS)의 제작

대장균 W3110(ATTC 39936)의 염색체 DNA를 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다. 상기 정제된 유전체서열을 주형으로 하고, 서열번호 41 및 42를 프라이머로 사용하여, 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 1분 20초간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복하면서, PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다.

[서열번호 41] yeaSfx: 5'-gcagtctagagattcaattatcgggttgat-3'

[서열번호 42] yeaSrx: 5'-acattctagaggctgaaagcatcaggattg-3'

상기 증폭된 PCR 절편(yeaS 유전자)을 XbaI으로 절단하고, 동일 제한효소로 절단한 pKBRilvBNCD 벡터에 클로닝하여 pKBRilvBNCDyeaS를 제작하였다 (도 7).

3-2: 재조합 벡터(pKBRilvBNCDyeaS)의 L-루신 생성 미생물로의 도입

실시예 1에서 제작된 L-루신 생성 미생물 Leu에, 상기 1-1-7에서 제작된 벡터 pKK184leuABCDtyrB와 함께 상기 3-1에서 제작된 벡터 pKBRilvBNCDyeaS를 도입하여, 재조합 대장균 (Leu+pKBRilvBNCDyeaS+pKK184leuABCDtyrB)을 제작하였다.

3-3: L-루신의 생성능 측정

상기 3-2에서 제작된 L-루신 생성 대장균(Leu+pKBRilvBNCDyeaS+pKK184leuABCDtyrB)를 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 선별된 균주를 1-2와 동일한 방법으로 전배양 및 배양시킨 후, 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다.

그 결과, 표 3에서 보는바와 같이 Leu+pKBRilvBNCD+pKK184leuABCDtyrB에 비해, exporter를 도입시킨 Leu+pKBRilvBNCDyeaS+pKK184leuABCDtyrB의 경우, L-루신의 생성이 증가된다는 것을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과로부터, yeaS 유전자의 과발현이 L-루신의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

Strain	Leu+pKBRilvBNCD+pKK184leuABCDtyrB	Leu+pKBRilvBNCDyeaS+pKK184leuABCDtyrB
L-루신 (g/ℓ)	1.00	1.24

실시예 4: L-루신 생성 미생물에 대장균의 ygaZH 유전자와 yeaS 유전자의 동시 발현 및 L-루신의 생성능 측정

4-1: 대장균의 yeaS 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pKK184leuABCDtyrByeaS)의 제작

대장균 W3110(ATTC 39936)의 염색체 DNA를 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다. 상기 정제된 유전체서열을 주형으로 하고, 서열번호 43 및 44를 프라이머로 사용하여, 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 1분 20초간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복하면서, PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다.

[서열번호 43] yeaSfs: 5'-atcggagctcagtgcaagtgctaccggaat-3'

[서열번호 44] yeaSrs: 5'-agctgagctcggctgaaagcatcaggattg-3'

상기 증폭된 PCR 절편(yeaS 유전자)을 SacI으로 절단하고, 동일 제한효소로 절단한 pKK184leuABCDtyrB 벡터에 클로닝하여 pKK184leuABCDtyrByeaS를 제작하였다 (도 10).

4-2: 재조합 벡터(pKK184leuABCDtyrByeaS)의 L-루신 생성 미생물로의 도입

실시예 1에서 제작된 L-루신 생성 미생물 Leu에, 상기 2-1에서 제작된 벡터 pKBRilvBNCDygaZH와 함께 상기 4-1에서 제작된 벡터 pKK184leuABCDtyrByeaS를 도입하여, 재조합 대장균 (Leu+pKBRilvBNCDygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS)을 제작하였다.

4-3: L-루신의 생성능 측정

상기 4-2에서 제작된 L-루신 생성 대장균(Leu+pKBRilvBNCDygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS)를 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 선별된 균주를 1-2와 동일한 방법으로 전배양 및 배양시킨 후, 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다.

그 결과, 표 4에서 보는바와 같이 YgaZH exporter만 도입된 Leu+pKBRilvBNCDygaZH+pKK184leuABCDtyrB에 비해, YeaS exporter를 추가로 도입시킨 Leu+pKBRilvBNCDygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS의 경우, L-루신의 생성이 추가로 증가된다는 것을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과로부터, ygaZH 유전자와 yeaS 유전자의 동시 과발현이 L-루신의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

Strain	Leu+pKBRilvBNCDygaZH+pKK184leuABCDtyrB	Leu+pKBRilvBNCDygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS
L-루신 (g/ℓ)	1.78	2.15

실시예 5: L-루신 생성 미생물에 대장균의 lrp 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 도입 및 L-루신의 생성능 측정

5-1: 대장균의 lrp 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pKBRilvBNCDlrp)의 제작

대장균 W3110(ATTC 39936)의 염색체 DNA를 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다. 상기 정제된 유전체서열을 주형으로 하고, 서열번호 45 및 46를 프라이머로 사용하여, 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 40초간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복하면서, PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다.

[서열번호 45] lrpf-n: 5'-atgctctagatttcccgctttataagccga-3'

[서열번호 46] lrpr-n: 5'-agcttctagactgacgctagcgctgtatggattaacaggag-3'

상기 증폭된 PCR 절편(lrp 유전자)을 XbaI으로 절단하고, 동일 제한효소로 절단한 pKBRilvBNCD 벡터에 클로닝하여 pKBRilvBNCDlrp를 제작하였다 (도 8).

5-2: 재조합 벡터(pKBRilvBNCDlrp)의 L-루신 생성 미생물로의 도입

실시예 1에서 제작된 L-루신 생성 미생물 Leu에, 상기 1-1-7에서 제작된 벡터 pKK184leuABCDtyrB와 함께 상기 5-1에서 제작된 벡터 pKBRilvBNCDlrp를 도입하여, 재조합 대장균 (Leu+pKBRilvBNCDlrp+pKK184leuABCDtyrB)을 제작하였다.

5-3: L-루신의 생성능 측정

상기 5-2에서 제작된 L-루신 생성 대장균(Leu+pKBRilvBNCDlrp+pKK184leuABCDtyrB)를 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 선별된 균주를 1-2와 동일한 방법으로 전배양 및 배양시킨 후, 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다.

그 결과, 표 5에서 보는바와 같이 Leu+pKBRilvBNCD+pKK184leuABCDtyrB에 비해, lrp 유전자를 도입시킨 Leu+pKBRilvBNCDlrp+pKK184leuABCDtyrB의 경우, L-루신의 생성이 증가된다는 것을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과로부터, lrp 유전자의 과발현이 L-루신의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

Strain	Leu+pKBRilvBNCD+pKK184leuABCDtyrB	Leu+pKBRilvBNCDlrp+pKK184leuABCDtyrB
L-루신 (g/ℓ)	1.00	1.20

실시예 6: L-루신 생성 미생물에 대장균의 ygaZH 유전자와 yeaS 유전자 및 lrp 유전자의 동시 발현 및 L-루신의 생성능 측정

6-1: 대장균의 lrp 유전자와 ygaZH 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터(pKBRilvBNCDlrpygaZH)의 제작

대장균 W3110(ATTC 39936)의 염색체 DNA를 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다. 상기 정제된 유전체서열을 주형으로 하고, 서열번호 47 및 48을 프라이머로 사용하여, 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 1분 20초간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복하면서, PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다.

[서열번호 47] ygaZHfn: 5'-atcggctagcacatgactagctactttatt-3'

[서열번호 48] ygaZHrn: 5'-agctgctagcgatatagtaacgacagtgac-3'

상기 증폭된 PCR 절편(ygaZH 유전자)을 NheI으로 절단하고, 동일 제한효소로 절단한 pKBRilvBNCDlrp 벡터에 클로닝하여 pKBRilvBNCDlrpygaZH를 제작하였다 (도 9).

6-2: 재조합 벡터(pKBRilvBNCDlrpygaZH)의 L-루신 생성 미생물로의 도입

실시예 1에서 제작된 L-루신 생성 미생물 Leu에, 상기 4-1에서 제작된 벡터 pKK184leuABCDtyrByeaS와 함께 상기 6-1에서 제작된 벡터 pKBRilvBNCDlrpygaZH를 도입하여, 재조합 대장균 (Leu+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS)을 제작하였다.

6-3: L-루신의 생성능 측정

상기 6-2에서 제작된 L-루신 생성 대장균(Leu+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS)을 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 선별된 균주를 1-2와 동일한 방법으로 전배양 및 배양시킨 후, 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다.

그 결과, 표 6에서 보는바와 같이 YgaZH exporter와 YeaS exporter가 동시에 도입된 Leu+pKBRilvBNCDygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS에 비해, lrp 유전자를 추가로 도입시킨 Leu+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS의 경우, L-루신의 생성이 추가로 증가된다는 것을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과로부터, ygaZH 유전자와 yeaS 유전자 및 lrp 유전자의 동시 과발현이 L-루신의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

Strain	Leu+pKBRilvBNCDygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS	Leu+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS
L-루신 (g/ℓ)	2.15	2.45

실시예 7: in silico simulation 방법에 의한 결실 대상 유전자 선정

상기 실시예 1에서 제작된 L-루신 생성 미생물(Leu+pKBRilvBNCD+pKK184leuABCDtyrB)의 L-루신 생성능을 더욱 향상시키기 위하여, 인-실리코 시뮬레이션 방법을 이용하여, 대사흐름을 L-루신 생성에 맞게 최적화하기 위해 도입할 결실 대상 유전자를 선정하였다. 본 실시예의 인-실리코 시뮬레이션 방법은 본 출원인의 국제특허 출원 WO2006/107127 및 기 등록된 특허(KR0832740)의 방법을 참고하여 각 유전자의 조합(combination)에 대하여 복합 유전자 변이균주(multi-gene mutant)에 대한 시뮬레이션을 실시하여 예측된 L-루신 생산속도를 비교하여 가장 높은 후보 유전자를 스크리닝하였다.

7-1: Leu 균주에 근거한 대사회로의 구축

본 발명에서는 L-루신을 생성하기 위한 대장균 변이 미생물의 새로운 대사흐름분석 시스템을 구축하였다. 상기 시스템은 대장균의 대사회로를 대부분 포함하고 있으며, 실시예 1에서 제작된 L-루신 생성 미생물(Leu+pKBRilvBNCD+pKK184leuABCDtyrB)의 배지조건을 대사회로상에 모두 반영하였다. 상기 구축한 대사회로를 이용하여 유전자 하나 또는 그 이상의 조합을 만들고, 이러한 후보 유전자들을 대사흐름 분석을 이용하여 L-루신을 생성하고자 하는 대상균주에서 시뮬레이션상으로 불활성화 시켰을 때, 비증식 속도와 유용물질의 형성수율을 예측하여 효율이 가장 높은 유전자를 스크리닝하였다.

7-2: 복합 유전자 변이 미생물의 시뮬레이션

상기 7-1과 같이 구축된 대사회로를 수학적으로 표현하기 위하여 모든 대사산물, 상기 대사산물의 대사경로 및 상기 대사경로에서의 화학양론 매트릭스(stoichiometric matrix)(S _ij , j 번째 반응에서 i 번째 대사산물의 시간에 따른 화학양론 계수)를 이용하여, 대사흐름 벡터(ν _j , j 번째 대사반응의 대사흐름)를 계산할 수 있는데, 시간에 따른 대사산물 농도 X의 변화는 모든 대사 반응의 흐름의 합으로 나타낼 수 있다. 또한, 시간에 따른 X의 변화량이 일정하다고 가정하면, 즉 준정상상태 가정 하에서, 시간에 따른 대사산물 농도의 변화량은 아래의 수학식 1로 정의될 수 있다.

(여기서, Sㆍν: 시간에 따른 X의 변화량, X: 대사산물의 농도, t: 시간)

이 때, 특정 대사반응의 흐름값은 특정범위로 한정될 수 있는 등의 여러 물 리 화학적 제한식과 특정 목적함수를 이용하는 선형 계획법(linear programming)을 이용하여 최적 대사흐름분포를 구하는 것이 가능하다. 이는 아래와 같이 계산할 수 있다.

minimize/maximize : Z = ∑ c _i v _i

이 때, S ^T v =0 이고, α _min,i ≤ v _i ≤ α _max,i 라 가정

여기서, c _i 는 가중치이고, v _i 는 대사흐름이다. 일반적으로 균주성장 최대화, 대사산물 생산최대화, 부산물 생산 최소화 등이 목적함수로 사용되고 있다. α _max,i 및 α _min,i 은 각 대사흐름이 가질 수 있는 제한값으로서, 각 대사흐름이 허용하는 최소값과 최대값을 지정할 수 있다.

위 선형 계획법을 바탕으로 각 유전자의 조합(combination)에 대하여 복합 유전자 변이 미생물(multi-gene mutant)에 대한 시뮬레이션을 실시하려면, 다양한 조합의 돌연변이에 대한 시뮬레이션을 수행해야 한다. 먼저, in silico gene knockout 시뮬레이션을 이용하여 단일 유전자를 결실할 경우 L-루신 생성속도가 가장 높은 유전자 군을 찾아냈다 (표 7). 상기 시뮬레이션은 http://mbel.kaist.ac.kr/를 통해 다운 받을 수 있는 MetaFluxNet 을 이용하여 수행하였다 (Lee et al., Bioinformatics, 19:2144, 2003).

즉, 표 7에 나타난 바와 같이, aceE, aceF, lpdA, pfkA, pfkB, mdh, fba, gnd, aceB, glcB, aceA, glyA 및 folD 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상 의 유전자를 결실 시키는 경우, 단일 유전자를 결실할 경우에도 실시예 1에서 제작된 기준 균주인 L-루신 생성 미생물(Leu+pKBRilvBNCD+pKK184leuABCDtyrB)에 비해 L-루신 생성속도가 현저히 높아짐을 알 수 있었다.

본 발명자는 상기 유전자들의 최적 조합을 찾아내어, L-루신 생성속도 및 생성 효율을 더욱 높이고자, 보고되어 있는 순차적인(sequential) 복합유전자 시뮬레이션 방법을 이용하여(Segre et al., PNAS, 99:15112-15117. 2002), 복합 유전자 변이 미생물에 대한 시뮬레이션을 실시하였다. 즉, 단일 유전자 결실에 따라 예측된 L-루신 생성속도를 비교하여 가장 높은 후보 유전자를 스크리닝하였다 (표 7).

즉, 첫 번째 시뮬레이션 상에서 스크리닝 된 후보 유전자를 시뮬레이션 상에서 불활성화시킨 상태에서 또 다른 단일 유전자 결실에 따라 예측된 L-루신 생성속도를 비교하여 가장 높은 후보 유전자를 스크리닝하고, 이렇게 결정된 후보 유전자도 시뮬레이션상에서 불활성화시킨 상태에서 다음 단일 유전자 결실에 따른 L-루신 생성속도를 비교하여 최고의 L-루신 수율을 보이는 조합을 스크리닝 하였다 (표 7 및 도 11).

도 11 은 순차적 접근방식을 이용하여 세 번째까지의 결실에 따른 L-루신 생성속도와 세포 성장속도간의 관계를 도시한 것으로, 그 구체적인 값들은 아래 표 7 에 나타냈다.

결실대상유전자	예측 세포성장속도	예측 L-루신 생산속도 (mmol x gDW-1 x hr-1)
Single KO
fba	0.089	0.221
pfkA/B	0.105	0.206
mdh	0.213	0.068
aceE/F/lpdA	0.146	0.059
gnd	0.208	0.057
*Double KO*
mdh	0.152	0.316
aceE/F/lpdA	0.091	0.296
aceB/glcB	0.187	0.254
aceA	0.187	0.246
glyA	0.176	0.238
*Triple KO*
aceE/F/lpdA	0.151	0.344
folD	0.172	0.333

표 7에 나타난 바와 같이, 목적의 대사회로에 해당하는 유전자 조합을 살펴 본 결과, 단일 유전자 결실 시에도 기본 균주보다 높은 생성속도를 나타냈으며, fba를 결실시킨 변이 미생물의 L-루신 생성속도가 가장 높음을 알 수 있었다. 그러나, fba 유전자를 결실시킬 경우, 표 7에 나타난 바와 같이, 세포 성장속도가 크게 감소할 것으로 예측되어, 두 번째로 L-발린 생성속도가 높은 pfkA 및 B를 후보 유전자로 결정하였고, 이중 6-phosphofructokinase-1의 활성 중 90%를 차지하고 있는 pfkA를 최종 첫 번째 결실 대상 유전자로 선택하였다 (Daldal F, J. Mol. Biol., 168:285-305. 1983).

이중 유전자 결실 시뮬레이션은 pfkA를 기본으로 하여, 다른 후보 유전자들을 추가로 결실시켰을 때를 시뮬레이션 하였다. 그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, mdh 결실시 최고의 L-루신 생성속도를 보였으므로, 두 번째 유전자 결실 대상으로 mdh를 선택하였다.

최종적으로 pfkA와 mdh를 기본으로 하여 삼중 유전자 결실 시뮬레이션 결과, aceE 및 aceF 및 lpdA를 결실시킨 변이 미생물의 L-루신 생성속도가 가장 높음을 알 수 있었다. 순차적인 시뮬레이션을 위한 유전자는 aceE 및 aceF 및 lpdA 유전자 중에서, pyruvate dehydrogenase 역할을 하는 유전자 중 효소 활성이 가장 높다 (Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 65:56-60. 2004)고 알려져 있는 aceF 유전자를 세 번째 유전자 결실 대상으로 선택하였다. 한편, 추가적인 유전자 결실 시뮬레이션으로 L-루신 생성속도를 높이는 후보군을 찾을 수는 있으나, 표 7의 예측성장속도가 유전자 결실에 따라 감소되었으므로, 추가적인 유전자 결실 시뮬레이션은 실시하지 않았다. 이에 상기 인실리코 시뮬레이션 결과를 바탕으로 최종적으로 aceF 및 pfk 및 mdh를 결실대상 유전자로 선정하였다.

실시예 8: aceF , mdh 및 pfkA 의 결실 및 L-루신 생성능 측정

8-1: aceF, mdh 및 pfkA의 결실

상기 실시예 6에서 제작된 L-루신 생성 미생물(Leu+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS)에 상기 실시예 7에서 선정된 결실 대상 유전자를 결실 시켜 고성능 L-루신 생성 미생물(LAMF+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS)을 제작하였다.

서열번호 49 내지 54 프라이머들을 이용하여 실시예 1에서 개시한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640, 2000) 및 본 발명자들이 이전 연구(Lee et al., Mol. Syst. Biol. 3:149, 2007)에서 사용했던 방법에 의해 aceF(pyruvate dehydrogenase를 암호화하는 유전자), mdh(malate dehydrogenase를 암호화하는 유전자) 및 pfkA(phosphofructokinase를 암호화하는 유전자)등의 유전자를 결실시켰다. 즉, 실시예 1-1-5에서 제작된 대장균 W3110 변이 미생물에서 상기 유전자 3종의 결실시킨 다음, 실시예 4-1에서 제작된 pKK184leuABCDtyrByeaS 벡터와 실시예 6-1에서 제작된 pKBRilvBNCDlrpygaZH 벡터를 도입하여 고성능 L-발린 생성 미생물(LAMF+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS)를 제작하였다.

[서열번호 49] aceFloxcup: 5'-atggctatcgaaatcaaagtaccggacatcggggctgatgaagttg aaattaggtgacactatagaacgcg-3'

[서열번호 50] aceFloxcdo: 5'-ttacatcaccagacggcgaatgtcagacagcgtgttgttaatgat ggtaatagtggatctgatgggtacc-3'

[서열번호 51] mdhloxcup: 5'-atgaaagtcgcagtcctcggcgctgctggcggtattggccaggcgcttg ctaggtgacactatagaacgcg-3'

[서열번호 52] mdhloxcdo: 5'-ttacttattaacgaactcttcgcccagggcgatatctttcttcagcgta ttagtggatctgatgggtacc-3'

[서열번호 53] pfkAloxcup: 5'-atgattaagaaaatcggtgtgttgacaagcggcggtgatgcgccagg cattaggtgacactatagaacgcg-3'

[서열번호 54] pfkAloxcdo: 5'-ttaatacagttttttcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggac gcttagtggatctgatgggtacc-3'

8-2: L-루신의 생성능 측정

상기 8-1에서 제작된 L-루신 생성 미생물(Leu+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS)을 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 선별된 균주를 sodium acetate 3g이 추가된 것을 제외하고는 1-2와 동일한 배지에서 동일한 방법으로 전배양 및 배양시킨 후, 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-루신의 농도를 아미노산 분석기로 측정하였다.

그 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, 결실 대상 유전자의 결실 도입 전 생성 미생물에서 2.45g/ℓ의 농도를 보였으며, 결실 대상 유전자(aceF, mdh 및 pfkA)를 추가 결실시킨 L-루신 생성 미생물에서 생성된 L-루신의 농도는 4.25g/ℓ로, 결실 대상 유전자의 결실을 도입하지 않은 L-발린 생성 미생물(2.45g/ℓ)에 비해 약 73.5% 증가하였다. 이러한 결과로부터, 결실 대상 유전자 도입으로 인한 대사흐름 조작이 L-루신의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

Strain	Leu+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS	LAMF+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS
L-루신 (g/ℓ)	2.45	4.25

8-3: aceF, mdh 및 pfkA의 부분 결실에 의한 생산성 향상

상기 8-1에서 제작된 L-루신 생성 미생물은 aceF, mdh 및 pfkA 유전자가 100% 결실되어 있기 때문에 growth가 느리고, 특히 aceF(pyruvate dehydrogenase를 코딩하는 유전자)의 100% 결실로 인해 TCA cycle의 전구체인 acetyl-CoA가 전혀 만들어지지 않아서 acetyl-CoA의 생성을 위해 sodium acetate를 넣어주어야 하는 단점이 있었다. 따라서, 해당 효소들의 기능을 일부 유지시키기 위해 상기 유전자들을 부분적으로 결실시키기로 하고 서열번호 55 내지 60 프라이머들을 이용하여 실시예 1에서 제시한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640, 2000) 및 본 발명자들이 이전 연구(Lee et al., Mol. Syst. Biol. 3:149, 2007)에서 사용했던 방법에 의해 aceF(pyruvate dehydrogenase를 암호화하는 유전자), mdh(malate dehydrogenase를 암호화하는 유전자) 및 pfkA(phosphofructokinase를 암호화하는 유전자)등의 유전자를 부분적으로 결실시켰다. 즉, aceF의 경우 전체 1893 bp 중 앞부분의 460 bp 부분을 남기고 결실시켰고, mdh의 경우 전체 939 bp 중 앞부분과 뒷부분의 250 bp와 239 bp를 각각 남기고 결실시켰으며, pfkA의 경우 전체 963 bp 중 앞부분과 뒷부분의 250 bp와 253 bp를 각각 남기고 결실시켰다. 즉, 실시예 1-1-5에서 제작된 대장균 W3110 변이 미생물에서 상기 유전자 3종을 부분적으로 결실시킨 다음, 실시예 4-1에서 제작된 pKK184leuABCDtyrByeaS 벡터와 실시예 6-1에서 제작된 pKBRilvBNCDlrpygaZH 벡터를 도입하여 고성능 L-루신 생성 미생물(LAMF+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS)를 제작하였다. 상기 균주의 L-루신 생성능과 유전자 3종의 부분결실의 효과를 확인하기 위해 상기 8-2의 방법과 동일하게 배양을 수행하였다. 단, 유전자 3종, 특히 aceF의 부분결실로 인해 sodium acetate는 첨가하지 않았다. 그 결과, 표 9에 나타난 바와 같이, 결실 대상 유전자(aceF, mdh 및 pfkA)가 부분적으로 결실된 미생물에서 생성된 L-루신의 농도는 4.45g/ℓ로, 결실 대상 유전자가 100%의 결실된 미생물(4.25g/L)에 비해 4.7%로 소폭 증가하였다. 특히, 발효시간이 44%(25->14시간) 단축되었고, 세포성장(OD₆₀₀)이 45.3%(15->21.8) 증가하였기 때문에 생산성은 획기적으로 증가(88.2%)한 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터, 결실 대상 유전자의 부분 결실이 L-루신의 생성성 향상에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

[서열번호 55] aceFloxcup-1: 5'-gatcaccgtagaaggcgacaaggcttctatggaagttccggctcc gtttgtaggtgacactatagaacgcg-3'

[서열번호 56] aceFloxcdo-1: 5'-ttacatcaccagacggcgaatgtcagacagcgtgttgttaatgatg gtaatagtggatctgatgggtacc-3'

[서열번호 57] mdhloxcup-1: 5'-ggaaggcgcagatgtcgttcttatctctgcaggcgtagcgcgtaaa ccggtaggtgacactatagaacgcg-3'

[서열번호 58] mdhloxcdo-1: 5'-ccttgttcgccctgcagtgcacgaaccagagacagaccaaaacgtg cagctagtggatctgatgggtacc-3'

[서열번호 59] pfkAloxcup-1: 5'-gttcctcggttctgcgcgtttcccggaattccgcgacgagaaca tccgcgtaggtgacactatagaacgcg-3'

[서열번호 60] pfkAloxcdo-1: 5'-cgcgctggatgtggcccagcacagttgcgcgggtttcacgaccgg tttcttagtggatctgatgggtacc-3'

Strain	LAMF+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS (유전자 3종 100% 결실)	LAMF+pKBRilvBNCDlrpygaZH+pKK184leuABCDtyrByeaS (유전자 3종 부분결실)
L-루신 (g/ℓ)	4.25	4.45
발효시간	25	14
OD₆₀₀	15	21.8
생산성(g/L/h)	0.17	0.32

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 대장균 L-루신 생성 미생물로부터 aceF, mdh 및 pfkA 유전자를 결실시킨 변이 미생물 LAMF의 대사회로를 나타낸 것이다.

도 2는 대장균 야생균주 W3110으로부터 목적유전자만을 조작하여 L-루신 생성 미생물을 제작하고, 상기 생성 미생물에 결실 대상 유전자의 결실을 도입하는 과정을 나타낸 것이다.

도 3은 sacB homologous recombination vector pSacHR06의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 4는 ilvBNCD 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pKBRilvBNCD의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 5는 leuABCD 유전자와 tyrB 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터 pKK184leuABCDtyrB의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 6은 lvBNCD 유전자와 ygaZH 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터 pKBRilvBNCDygaZH의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 7은 lvBNCD 유전자와 yeaS 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터 pKBRilvBNCDyeaS의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 8은 ilvBNCD 유전자와 lrp 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터 pKBRilvBNCDlrp의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 9는 lvBNCD 유전자와 lrp 유전자 그리고 ygaZH 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터 pKBRilvBNCDlrpygaZH의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 10은 leuABCD 유전자와 tyrB 유전자 그리고 yeaS 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터 pKK184leuABCDtyrByeaS의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 11a 내지 도 11c는 인실리코 시뮬레이션 결과를 나타낸 것으로, 도 11a는 첫 번째 유전자 결실에 따른 세포 성장속도와 L-루신 생성속도와의 관계, 도 11b는 두 번째 유전자 결실에 따른 세포 성장속도와 L-루신 생성속도와의 관계 및 도 11c는 세 번째 유전자 결실에 따른 세포 성장속도와 L-루신 생성속도와의 관계를 도시한 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Mutant Microorganism with Improved Productivity of L-leucine and Method for Preparing It Using the Same <130> P09-B162 <160> 65 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agccgtcgac gctagcgcat gcacgcgtgt gcacccatgg gacgtcctca ctgactcgct 60 gcgctc 66 <210> 2 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gctcacaacg tggctagcga cgtcgtgcac ccatgggttc cactgagcgt cagacc 56 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 actctctaga cgcgggtttg ttactgataa 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gctagatatc aggatatcgg cattttcttt 30 <210> 5 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta gattgcagca 60 ttacacgtct tg 72 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 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ggtacatgcg 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gctcctgcag tcaccgctgg ctaactggat atcttttggg 40 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gactcgtcga cagagatggt agggcggata a 31 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gctcggatcc cacactgtat tatgtcaaca 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gactgaattc atggcaagtt cgggcacaac 30 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gctcactgca gtgcgtcacg aatgctttct t 31 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 actcgtcgac atctgcgagg tcagaatgct 30 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cgctcggatc cttcgcaaca aaaacattat g 31 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cgactgaatt catgagccag caagtcatta t 31 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gctcactgca gataatggct ttgtcgatgt ta 32 <210> 23 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 atggctgact cgcaacccct gtccggtgct ccggaaggtg ccgaatattt gattgcagca 60 ttacacgtct tg 72 <210> 24 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ctaacccgcc aaaaagaacc tgaacgccgg gttattggtt tcgtcgtggc cacttaacgg 60 ctgacatggg 70 <210> 25 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 atgaaaccga ccaccatctc cttactgcag aagtacaaac aggaaaaaaa gattgcagca 60 ttacacgtct tg 72 <210> 26 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ttaatggaaa ctgtgttctt cgcccggata aacgccggac tccacttcag cacttaacgg 60 ctgacatggg 70 <210> 27 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 agaaagctga ttacatttgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac gattgcagca 60 ttacacgtct tg 72 <210> 28 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ttattgatta acttgatcta accagcccca tttatcttcg gtttcgccag cacttaacgg 60 ctgacatggg a 71 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 actcgaattc atggcaagtt cgggcacaac at 32 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 actcgaattc atggcaagtt cgggcacaac at 32 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 agtgctgcag acgaggaatc accatggcta ac 32 <210> 32 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gctcctgcag tctagagcta gcgagctctt aacccgc 37 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 actcgagctc gagacagaca ctgggagtaa 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 tacgtctaga ttaacccccc agtttcgatt 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gctcgaattc atgagccagc aagtcattat 30 <210> 36 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gctactgcag gagctcgcta gcggtacctt aattcataaa cgcaggtt 48 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 actcggtacc gtgtttcaaa aagttgacgc 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 acatgagctc ttacatcacc gcagcaaacg 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gacttctaga gctactttat tggcggtgcc 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 actctctaga tgataaggaa aatcttcgtg 30 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gcagtctaga gattcaatta tcgggttgat 30 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 acattctaga ggctgaaagc atcaggattg 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 atcggagctc agtgcaagtg ctaccggaat 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 agctgagctc ggctgaaagc atcaggattg 30 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 atgctctaga tttcccgctt tataagccga 30 <210> 46 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 agcttctaga ctgacgctag cgctgtatgg attaacagga g 41 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 atcggctagc acatgactag ctactttatt 30 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 agctgctagc gatatagtaa cgacagtgac 30 <210> 49 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 atggctatcg aaatcaaagt accggacatc ggggctgatg aagttgaaat taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 50 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 ttacatcacc agacggcgaa tgtcagacag cgtgttgtta atgatggtaa tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 51 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 atgaaagtcg cagtcctcgg cgctgctggc ggtattggcc aggcgcttgc taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 52 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ttacttatta acgaactctt cgcccagggc gatatctttc ttcagcgtat tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 53 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 atgattaaga aaatcggtgt gttgacaagc ggcggtgatg cgccaggcat taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 54 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 ttaatacagt tttttcgcgc agtccagcca gtcacctttg aacggacgct tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 55 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gatcaccgta gaaggcgaca aggcttctat ggaagttccg gctccgtttg taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 56 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 ttacatcacc agacggcgaa tgtcagacag cgtgttgtta atgatggtaa tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 57 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 ggaaggcgca gatgtcgttc ttatctctgc aggcgtagcg cgtaaaccgg taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 58 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 ccttgttcgc cctgcagtgc acgaaccaga gacagaccaa aacgtgcagc tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 59 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 gttcctcggt tctgcgcgtt tcccggaatt ccgcgacgag aacatccgcg taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 60 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 cgcgctggat gtggcccagc acagttgcgc gggtttcacg accggtttct tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 61 <211> 245 <212> PRT <213> ygaZH exporter 1 <400> 61 Met Glu Ser Pro Thr Pro Gln Pro Ala Pro Gly Ser Ala Thr Phe Met 1 5 10 15 Glu Gly Cys Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val 20 25 30 Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Ser Pro Leu 35 40 45 Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe 50 55 60 Val Ile Thr Ala Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Ile Ala Ala 65 70 75 80 Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser 85 90 95 Leu Arg Ser Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Lys Ser Lys Thr Ala Leu 100 105 110 Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys 115 120 125 Leu Val Arg Asn Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile 130 135 140 Ala Phe Ser Ser Trp Ser Ser Trp Val Phe Gly Thr Val Ile Gly Ala 145 150 155 160 Phe Ser Gly Ser Gly Leu Leu Gln Gly Tyr Pro Ala Val Glu Ala Ala 165 170 175 Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser 180 185 190 Phe Gln Arg Lys Gln Ser Leu Cys Val Thr Ala Ala Leu Val Gly Ala 195 200 205 Leu Ala Gly Val Thr Leu Phe Ser Ile Pro Val Ala Ile Leu Ala Gly 210 215 220 Ile Val Cys Gly Cys Leu Thr Ala Leu Ile Gln Ala Phe Trp Gln Gly 225 230 235 240 Ala Pro Asp Glu Leu 245 <210> 62 <211> 111 <212> PRT <213> ygaZH exporter 2 <400> 62 Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Val Ala Asn 1 5 10 15 Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Arg Val Gly Asn Ala Arg 20 25 30 Pro Thr Lys Arg Gly Ala Val Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met 50 55 60 His Asp Thr Arg Arg Phe Val Pro Thr Leu Val Gly Phe Ala Val Leu 65 70 75 80 Gly Ala Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Val Met Ala Ile Ile 100 105 110 <210> 63 <211> 1063 <212> DNA <213> ygaZH exporter 3 <400> 63 atggaaagcc ctactccaca gcctgctcct ggttcggcga ccttcatgga aggatgcaaa 60 gacagtttac cgattgttat tagttatatt ccggtggcct ttgcgttcgg tctgaatgcg 120 acccgtctgg gattctctcc tctcgaaagc gtttttttct cctgcatcat ttatgcaggc 180 gcgagccagt tcgtcattac cgcgatgctg gcagccggga gtagtttgtg gattgctgca 240 ctgaccgtca tggcaatgga tgttcgccat gtgttgtatg gcccgtcact gcgtagccgt 300 attattcagc gtctgcaaaa atcgaaaacc gccctgtggg cgtttggcct gacggatgag 360 gtttttgccg ccgcaaccgc aaaactggta cgcaataatc gccgctggag cgagaactgg 420 atgatcggca ttgccttcag ttcatggtca tcgtgggtat ttggtacggt aataggggca 480 ttctccggca gcggcttgct gcaaggttat cccgccgttg aagctgcatt aggttttatg 540 cttccggcac tctttatgag tttcctgctc gcctctttcc agcgcaaaca atctctttgc 600 gttaccgcag cgttagttgg tgcccttgca ggcgtaacgc tattttctat tcccgtcgcc 660 attctggcag gcattgtctg tggctgcctc actgcgttaa tccaggcatt ctggcaagga 720 gcgcccgatg agctatgagg ttctgctgct tgggttacta gttggcgtgg cgaattattg 780 cttccgctat ttgccgctgc gcctgcgtgt gggtaatgcc cgcccaacca aacgtggcgc 840 ggtaggtatt ttgctcgaca ccattggcat cgcctcgata tgcgctctgc tggttgtctc 900 taccgcacca gaagtgatgc acgatacacg ccgtttcgtg cccacgctgg tcggcttcgc 960 ggtactgggt gccagtttct ataaaacacg cagcattatc atcccaacac tgcttagtgc 1020 gctggcctat gggctcgcct ggaaagtgat ggcgattata taa 1063 <210> 64 <211> 639 <212> DNA <213> yeaS exporter <400> 64 gtgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60 gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120 aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180 gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240 tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300 ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360 ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420 tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480 gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540 tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600 gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639 <210> 65 <211> 495 <212> DNA <213> Irp(global regulator) <400> 65 atggtagata gcaagaagcg ccctggcaaa gatctcgacc gtatcgatcg taacattctt 60 aatgagttgc aaaaggatgg gcgtatttct aacgtcgagc tttctaaacg tgtgggactt 120 tccccaacgc cgtgccttga gcgtgtgcgt cggctggaaa gacaagggtt tattcagggc 180 tatacggcgc tgcttaaccc ccattatctg gatgcatcac ttctggtatt cgttgagatt 240 actctgaatc gtggcgcacc ggatgtgttt gaacaattca ataccgctgt acaaaaactt 300 gaagaaattc aggagtgtca tttagtatcc ggtgatttcg actacctgtt gaaaacacgc 360 gtgccggata tgtcagccta ccgtaagttg ctgggggaaa ccctgctgcg tctgcctggc 420 gtcaatgaca cacggacata cgttgttatg gaagaagtca agcagagtaa tcgtctggtt 480 attaagacgc gctaa 495

Claims

L-루신 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 100% 결실시키고; L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 변이시키고; (a) fba, pfkA 및 pfkB로 구성된 군에서 선택되는 유전자와 mdh 유전자, (b) fba, pfkA 및 pfkB로 구성된 군에서 선택되는 유전자와 aceE, aceF, lpdA 및 folD로 구성된 군에서 선택되는 유전자, 또는 (c) fba, pfkA 및 pfkB로 구성된 군에서 선택되는 유전자, aceE, aceF, lpdA 및 folD로 구성된 군에서 선택되는 유전자, 및 mdh 유전자를, 100% 결실시킨 경우에 비해, L-루신 생산성이 1.8배 이상 증가되도록 부분 결실시키는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvE(branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 그 발현이 증가되도록 변이시키는 것은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법:

(a) lacI(lac operon repressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 100% 결실;

(b) leuA(2-isopropylmalate synthase) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition) 제거;

(c) ilvGMEDA(acetohydroxy acid synthase isozyme I), ilvBN(Acetohydroxy acid synthase isozyme II) 및 leuABCD(2-isopropylmalate synthase) 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환; 및

(d) strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입.
제7항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터와 leuABCD 및 tyrB 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 발현벡터는 각각 pKBRilvBNCD 벡터와 pKK184leuABCDtyrB인 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자인 ygaZH를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자는 서열번호 (61) 및 서열번호 (62)의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상이거나, 서열번호 (63)의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, L-루신 엑스포터(exporter) 유전자인 yeaS를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 L-루신 엑스포터(exporter) 유전자는 서열번호 (64)의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, global regulator인 lrp 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
제15항에 있어서, 상기 lrp 유전자는 서열번호 (65)의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이 미생물의 제조방법.
L-루신 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 100% 결실되어 있고; L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 변이되어 있고; (a) fba, pfkA 및 pfkB로 구성된 군에서 선택되는 유전자와 mdh 유전자, (b) fba, pfkA 및 pfkB로 구성된 군에서 선택되는 유전자와 aceE, aceF, lpdA 및 folD로 구성된 군에서 선택되는 유전자, 또는 (c) fba, pfkA 및 pfkB로 구성된 군에서 선택되는 유전자, aceE, aceF, lpdA 및 folD로 구성된 군에서 선택되는 유전자, 및 mdh 유전자가, 100% 결실되어 있는 경우에 비해, L-루신 생산성이 1.8배 이상 증가되도록 부분 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물.
(a) ilvA, ilvE 및 panB 유전자가 100% 결실;

(b) pfkA 및 mdh 유전자가 100% 결실된 경우에 비해, L-루신 생산성이 1.8배 이상 증가되도록 부분 결실;

(c) lacI 유전자가 100% 결실;

(d) leuA 유전자의 피드백 저해가 제거;

(e) ilvGMEDA, ilvBN 및 leuABCD 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환;

(f) ilvB, ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입;

(g) leuABCD 및 tyrB 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; 및

(h) 서열번호 (63)의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자인 ygaZH가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물.
제18항에 있어서, 상기 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물은 L-루신 엑스포터(exporter) 유전자인 서열번호 (64)의 yeaS가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물.
제18항에 있어서, 상기 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물은 서열번호 (65)의 lrp 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물.
(a) ilvA, ilvE 및 panB 유전자가 100% 결실;

(b) pfkA, mdh 및 aceF 유전자가 100% 결실된 경우에 비해, L-루신 생산성이 1.8배 이상 증가되도록 부분 결실;

(c) lacI 유전자가 100% 결실;

(d) leuA 유전자의 피드백 저해가 제거;

(e) ilvGMEDA, ilvBN 및 leuABCD 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter가 strong promoter로 치환;

(f) ilvB, ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입;

(g) leuABCD 및 tyrB 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; 및

(h) 서열번호 (63)의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자인 ygaZH가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물.
제21항에 있어서, 상기 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물은 L-루신 엑스포터(exporter) 유전자인 서열번호 (64)의 yeaS가 추가로 증폭 또는 도입되어 있 는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물.
제21항에 있어서, 상기 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물은 서열번호 (65)의 lrp 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-루신 고생성능을 가지는 변이 미생물.
제17항 내지 제23항중 어느 한 항의 변이 미생물을 배양한 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 L-루신을 회수하는 것을 특징으로 하는 L-루신의 제조방법.