KR102153534B1

KR102153534B1 - 신규한 프로모터 및 이를 이용한 아미노산 생산 방법

Info

Publication number: KR102153534B1
Application number: KR1020190108263A
Authority: KR
Inventors: 윤병훈; 장진숙; 김선혜; 이지혜; 최선형; 김경림; 김형준
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2020-09-09
Also published as: EP4023756A1; WO2021045472A1; EP4023756A4; US20220340940A1; JP7350994B2; CA3153110A1; CN114729378B; JP2022547466A; MX2022002563A; BR112022003828A2; CN114729378A

Abstract

본 출원은 신규한 프로모터 및 이를 이용하여 아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 프로모터 및 이를 이용한 아미노산 생산 방법 {A novel promoter and preparation method of amino acids using thereof}

본 출원은 신규한 프로모터 및 이를 이용한 아미노산 생산 방법에 관한 것이다.

L-아미노산은 단백질의 기본 구성단위로서, 약품 원료와 식품첨가제, 동물 사료, 영양제, 살충제, 살균제 등의 중요 소재로 사용된다. 따라서 아미노산을 산업적으로 생산하는 것은 경제적으로 중요한 산업 공정이 되어 왔다.

아미노산을 효율적으로 생산하기 위한 다양한 연구, 예를 들어, 아미노산 고효율 생산 미생물이나 발효공정 기술을 개발하기 위한 노력이 이루어지고 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 속 균주에서 아미노산 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 아미노산 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적인 접근 방법이 개발되었고(한국 등록특허공보 제10-0924065호, 제10-1208480호), 이러한 방법 이외에 아미노산 생산에 관여하지 않는 유전자를 제거하는 방법, 아미노산 생산에 있어 구체적으로 기능이 알려지지 않은 유전자를 제거하는 방법 또한 활용되고 있다. 그러나, 여전히 효율적이고 높은 수율로 아미노산을 생산할 수 있는 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

코리네형 미생물은 아미노산과 핵산관련 물질의 생산에 전통적으로 가장 널리 이용되는 산업용 미생물이다. 주로 아미노산 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는데 이용되는 그람양성세균이며, 생육에 비오틴을 요구한다. 세포분열시 직각으로 굽어지는 특징(snapping)을 가지고 있으며, 생성된 대사물질에 대한 분해 활성이 낮은 것이 이 균이 가지는 장점 중 하나이다.

상기와 같이 코리네형 미생물을 유전공학적 또는 대사공학적 기술을 이용하여 목적 물질들을 고역가로 생산할 수 있는 균주로 개발하기 위해서는 미생물 내의 여러 가지 대사과정에 관련된 유전자의 발현을 선택적으로 조절할 수 있어야 한다. 이러한 조절을 위해서는, 조절 유전자의 하나로서 DNA 분자 상에 RNA 합성 효소가 결합하여 전사(transcription)를 시작하는 부위인 프로모터의 활성을 조절하는 것이 중요하다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈(Acetohydroxy-acid isomeroreductase; EC 1.1.1.86; ilvC) 유전자의 프로모터를 개량하여 발현율을 높이기 위해 예의 노력한 결과, 코리네박테리움 염색체 상의 ilvC 유전자 프로모터를 염기치환을 통해 개량시키고, 개량된 프로모터를 도입시켜 코리네형 미생물에서 L-아미노산 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환되고, 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 뉴클레오티드를 포함하는 프로모터를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기의 배지에서 목적 물질을 회수하는 단계;를 포함하는 목적 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 프로모터를 목적 유전자에 작동 가능하게 연결시키는 단계를 포함하는, 목적 유전자의 발현 강화 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 출원에 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시예는 공통된 사항에 대하여 다른 실시 양태의 설명 및 실시예에서도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원의 상세한 설명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합은 본 출원의 권리범위에 속하는 것은 물론이다. 그뿐만 아니라, 하기 기술된 구체적인 설명에 의하여 본 발명출원의 권리범위가 제한되는 것이 아니다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.

본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환되고, 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 가닥이다.

본 출원에서 용어, "프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드"는 뒤에 연결시키는 유전자, 즉 목적 유전자의 발현을 위해 RNA 폴리머라제 또는 인핸서 등이 결합하는 부위를 포함하는 목적 유전자의 전사시키는 부위 근처에 존재하는 DNA 영역을 의미한다. 본 출원의 목적상 상기 폴리뉴클레오티드는 범용적 강화 프로모터로 이용될 수 있으며, 그 예로, 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈의 발현을 강화시킬 수 있는 프로모터로 사용될 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노산, 구체적으로는 분지쇄 아미노산, 보다 구체적으로는 류신, 발린, 이소류신을 포함하는 아미노산의 생산 또는 생산량을 증가시키는데 관여하는 폴리뉴클레오티드를 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.

본 출원에서 상기 서열번호 1은 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈(acetohydroxy acid isomeroreductase)의 프로모터 역할을 할 수 있는 서열을 의미한다. 상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank에서 그 서열을 확인할 수 있고, 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 상기 뉴클레오티드와 동일한 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함될 수 있다.

본 출원에서 용어 "아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈(acetohydroxy acid isomeroreductase)"는 L-분지쇄 아미노산의 생합성에 관여하는 효소이다. L-분지쇄 아미노산의 생합성 경로를 살피면, 먼저 아세토하이드록시산 신타아제(acetohydroxy acid synthase)가 피루브산의 디카르복실화(decarboyxlation)와 다른 피루브산 분자와의 축합 반응을 촉매하여 발린의 전구체인 아세토젖산을 생산하거나 피루브산의 디카르복실화와 2-케토부티레이트(2-ketobutyrate)와의 축합 반응을 촉매하여 이소류신의 전구체인 아세토하이드록시부티레이트를 생산할 수 있다. 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈는 이렇게 생성된 아세토젖산 또는 아세토하이드록시부티레이트를 기질로 하여 반응을 다음 단계로 진행시켜 L-발린, L-류신 및 L-이소류신을 생성시킨다. 구체적으로, 아세토하이드록시산 신타아제의 반응으로 생성된 아세토젖산 또는 아세토하이드록시부티레이트와 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈의 반응으로 이성질화가 일어나고, 이후 환원 반응이 진행되어 각각의 기질로부터 (2R)-2,3-디하이드록시-3-이소발러레이트((2R)-2,3-dihydroxy-3-isovalerate) 또는 (2R,3R)-2,3-디하이드록시-3-메틸발러레이트((2R,3R)-2,3-dihydroxy-3-methylvalerate)가 생성된다. (2R)-2,3-디하이드록시-3-이소발러레이트가 디하이드록시산 디아히드레타아제(dihydroxy acid dehydratase), 트랜스아미나제 B(transaminase B)에 의해 촉매된 반응을 거치면 L-발린이, 디하이드록시산 디아히드레타아제(dihydroxy acid dehydratase), 2-이소프로필말산 신타아제(2-isopropylmalate synthase), 이소프로필말산 이소메라제(isopropylmalateisomerase), 3-이소프로필말산 디하이드로게나제(3-isopropylmalate dehydrogenase), 트랜스아미나제 B (transaminase B)에 의하여 촉매된 반응을 순차적으로 거치면 L-류신이 생성되고, (2R,3R)-2,3-디하이드록시-3-메틸발러레이트가 디하이드록시산 디아히드레타아제, 트랜스아미나제 B에 의해 촉매된 반응을 거치면 L-이소류신이 생성된다. 따라서, 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈는 L-분지쇄 아미노산의 생합성 경로에 있어서 중요한 효소이다.

상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 것을 의미한다. 상동성 또는 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열은 상기 범주 중 100% 동일성을 갖는 서열은 제외되거나, 100% 미만의 동일성을 갖는 서열일 수 있다.

구체적으로, 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있다.

상기 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 일반식 X-Y-Z로 표시되고, 상기 식에서, i) X는 CNGN이고, ii) Y는 CTAATTN이고, iii) Z는 CATGTGTGTGGTANAAN이고, iv) 상기 N은 A(아데닌), T(티민), G(구아닌), 또는 C(시토신)중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 또한, 상기 일반식의 폴리뉴클레오티드 서열 중 Z는 서열번호 2로, Y는 서열번호 3으로, X는 서열번호 4로 이루어진 것일 수 있다.

구체적으로 상기 일반식은, X는 CN₁GN₂이고, Y는 CTAATTN₃이고, Z는 CATGTGTGTGGTATAAT로 표시될 수 있고 상기 N₁, N₂ 및 N₃은 각각 A(아데닌), T(티민), G(구아닌), 또는 C(시토신)중에서 선택되는 어느 하나 일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 일반식에서 i) N₁은 C(시토신) 또는 G(구아닌), ii) N₂는 A(아데닌) 또는 T(티민), iii) N₃은 A(아데닌) 또는 G(구아닌), 또는 iv) 상기 i) 내지 iii)의 치환 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 구현예로, 상기 일반식의 폴리뉴클레오티드 서열 중 Z는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중 14번째 N 및 17번째 N이 T(티민)일 수 있으며, 이 때 X는 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 2번째 N이 C(시토신) 또는 G(구아닌)이고, 4번째 N이 A(아데닌) 또는 T(티민)일 수 있으며, 서열번호 8 내지 11 중 어느 하나일 수 있고, Y는 서열번호 3로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 7번째 N이 A(아데닌) 또는 G(구아닌)일 수 있다. 구체적으로, Z는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중 14번째 N 및 17번째 N이 T(티민)이고, X는 서열번호 8 내지 11 중 어느 하나이고, Y는 서열번호 6 또는 7인 것일 수 있다.

또 다른 구현예로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13 내지 20 중에서 선택되는 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 것일 수 있다.

본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드', '특정 서열번호로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드' 라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 뉴클레오티드 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 혹은 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.

상동성(homology) 및 동일성(identity)은 두 개의 주어진 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.

용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.

또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들어 전술한 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하고 동일한 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본 출원의 다른 하나의 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로모터를 제공한다.

본 출원에서 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제(polymerase)에 대한 결합 부위를 포함하고 목적 유전자의 mRNA로의 전사(transcription) 개시 활성을 가지는, 코딩 영역의 상위(upstream)의 비 해독된 뉴클레오티드 서열, 즉 RNA 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 의미한다. 상기 프로모터는 mRNA로의 전사 개시부위의 5' 부위에 위치할 수 있다. 본 발명의 프로모터는 종래의 프로모터에 비하여 증가된 프로모터 활성을 가질 수 있다. 즉, 숙주 세포에서 목적 유전자의 발현뿐만 아니라 목적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 및 활성을 증가시킬 수 있다. 본 출원의 목적상, 생산하고자 하는 산물에 따라 발현 강화를 위한 목적 유전자가 변경될 수 있고, 상기 프로모터는 목적 유전자의 강화를 위한 범용적 프로모터로써 사용될 수 있다.

상기 "목적 유전자"는, 본 출원의 목적상 본 출원의 프로모터 서열에 의해 발현을 조절하고자 하는 유전자를 의미한다. 상기 목적 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 "목적 단백질"로 표현할 수 있고, 상기 "목적 단백질"을 코딩하는 유전자는 "목적 유전자"로 표현할 수 있다. 일 예로, 상기 프로모터의 목적 유전자는 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈를 코딩하는 유전자, 즉 ilvC일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다. 구체적으로, 상기 목적 단백질은 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈인 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물을 제공한다.

구체적으로 상기 미생물은 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환에 의해 제조되는 미생물이거나, 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 포함된 미생물 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어 "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 목적 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 목적 단백질이 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 형질전환된 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환되어, 목적 단백질의 활성을 강화시시킨 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 미생물은, 예를 들어 목적 단백질이 분지쇄 아미노산 생산에 관여하는 단백질인 경우, 자연적으로 분지쇄 아미노산 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 분지쇄 아미노산 생산능이 없는 모균주에 분지쇄 아미노산 생산능이 부여된 미생물 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 미생물은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 내 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환되어 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물로서, 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 일반식 X-Y-Z로 표시되고, 상기 식에서, X는 CNGN이고, Y는 CTAATTN이고, Z는 CATGTGTGTGGTANAAN이고, 상기 N은 A(아데닌), T(티민), G(구아닌), 또는 C(시토신) 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같다.

상기 미생물은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 예를 들어 목적 단백질 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈의 활성을 강화시킬 수 있는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적 상 상기 숙주세포 또는 미생물은 상기 목적 단백질을 포함하여 분지쇄 아미노산을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다.

본 출원에서 상기 "분지쇄 아미노산을 생산할 수 있는 미생물"은 "분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물", "분지쇄 아미노산 생산능을 갖는 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.

본 출원의 용어 "분지쇄 아미노산"이란 곁사슬에 분지알킬기가 있는 아미노산을 말하며, 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다. 구체적으로, 본 출원에서 상기 분지쇄 아미노산은 L-분지쇄 아미노산일 수 있고, 상기 L-분지쇄 아미노산은 L-발린, L-이소류신 또는 L-류신일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, "분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 분지쇄 아미노산 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물일 수 있다. 본 출원의 목적상 상기 분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물은 상기 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 목적하는 분지쇄 아미노산 생산능이 증가된 것을 특징으로 하며, 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물 또는 분지쇄 아미노산 생산능을 갖는 미생물은, 분지쇄 아미노산 생합성 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화되거나, 분지쇄 아미노산 분해 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화된 미생물 일 수 있다. 예를 들면, 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈를 코딩하는 ilvC의 발현이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 용어 "분지쇄 아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물"이란, 천연형 또는 변이를 통하여 분지쇄 아미노산 생산능을 가지고 있는 코리네박테리움 속 미생물 일 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 분지쇄 아미노산 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물이란 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈를 코딩하는 ilvC가 포함되고 ilvC의 프로모터의 활성을 강화시킴으로써 향상된 분지쇄 아미노산 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다. 보다 구체적으로 본 출원에서 분지쇄 아미노산 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 향상된 분지쇄 아미노산 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다.

상기 "향상된 분지쇄 아미노산 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물"은 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물보다 분지쇄 아미노산 생산능이 향상된 미생물을 의미한다. 상기 '비변형 미생물'은 천연형 균주 자체이거나, 상기 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 포함하지 않는 미생물, 또는 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미한다. 또한 상기 '모균주'는 분지쇄 아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 속 미생물에 변이[ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467]를 도입하여 L-발린 생산능이 향상된 균주일 수 있고, 또는 코리네박테리움 속 미생물에 lysC(L377K) 변이체 및 hom(G378E) 변이체(Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 612-620 (1996))를 도입하고 트레오닌 디하이드라타제(L-threonine dehydratase)를 코딩하는 유전자에 ilvA(V383A) 변이(World J Microbiol Biotechnol (2015) 31:1369-1377)를 도입하여 L-이소류신 생산능이 향상된 균주일 수 있다. 또한, 코리네박테리움 속 미생물에 변이[leuA(R558H,G561D); 대한민국 출원번호 10-2017-0136244호]를 도입하여 L-류신 생산능이 향상된 균주일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계 및 상기 배지에서 목적 물질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로, 상기 목적 물질은 아미노산일 수 있고, 보다 구체적으로는 분지쇄 아미노산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 ℃ 구체적으로는 25 내지 40 ℃ 를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 아미노산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세(molasses), 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 아미노산을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집(collect)할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 아미노산을 회수 할 수 있다.

또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 아미노산은 정제된 형태 또는 아미노산을 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).

또한, 본 출원의 목적상 상기 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물의 경우, 발린, 류신 또는 이소류신을 포함하는 분지쇄 아미노산 생산량이 증가하는 것을 특징으로 한다. 이는 야생형 코리네박테리움속 균주가 분지쇄 아미노산을 아주 극미량으로 생산할 수 있거나 생산하지 못하는 것에 비해, 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 통해 분지쇄 아미노산 생산량을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는, 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로모터를 목적 유전자에 작동 가능하게 연결시키는 단계를 포함하는, 목적 유전자 발현 강화 방법을 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드, 목적 유전자, 프로모터 등은 전술한 바와 같다.

본 출원의 신규한 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 아미노산을 생산하는 미생물을 배양하는 경우, 아미노산을 높은 효율로 생산할 수 있다. 또한, 제조된 아미노산은 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제, 의약품 등 다양한 제품에 응용될 수 있다.

도 1 내지 도 4는 발린 생산 균주의 ilvC 프로모터 영역을 나타낸 것이다.
도 5 내지 도 6은 이소류신 생산 균주의 ilvC 프로모터 영역을 나타낸 것이다.
도 7 내지 도 8은 류신 생산 균주의 ilvC 프로모터 영역을 나타낸 것이다.

이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 무작위 변이법을 통한 발린 생산능 증가 변이주 선별

실시예 1-1: UV조사를 통한 무작위돌연변이 유발

발린 생산능 증가된 변이주를 선별하기 위하여 발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P(대한민국 등록특허 제10-1117022호)를 한천을 포함하는 영양배지에 도말하여 30℃에서 36시간 배양하였다. 이렇게 획득한 수백 개의 콜로니를 실온에서 UV를 조사하여 균주 내 게놈상에 무작위 돌연변이를 유발시켰다.

<영양배지 (pH 7.2)>

포도당 10g, 육즙 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모엑기스 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1리터 기준)

실시예 1-2: 돌연변이 유발 균주 발효역가 실험 및 균주 선별

모균주로 사용된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 대비하여 L-발린의 생산능이 증가된 변이주를 선별하고자 무작위 돌연변이가 유발된 균주들을 대상으로 발효 역가 실험을 실시하였다. 각각의 콜로니는 영양배지에서 계대 배양된 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표1에 나타내었다.

<영양배지 (pH 7.2)>

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 판토텐산칼슘 2 ㎎, 니코틴아마이드 3 ㎎, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)

	균주명	L-발린(g/L)
대조군	KCCM11201P	2.7
실험군	M1	3.0
	M2	2.8
	M3	2.5
	M4	4.8
	M5	3.5
	M6	3.3
	M7	2.9
	M8	3.9
	M9	3.5
	M10	2.1
	M11	1.1
	M12	2.9
	M13	2.5
	M14	3.1
	M15	4.7
	M16	3.2

표 1을 참고하면, 대조군인 KCCM11201P 균주에 비하여 발린 생산량이 각각 178%, 174%로 가장 많이 증가한 M4와 M15균주를 선별하였다.

실시예 2: 유전자 시퀀싱을 통한 변이 확인

발린 생산능 증가된 상기 M4과 M15 균주의 발린 생합성 경로에 있는 주요 유전자들을 시퀀싱하여 KCCM11201P 균주, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 균주 ATCC14067, ATCC13032 및 ATCC13869와 비교하였다. 그 결과, 상기 M4와 M15균주가 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈 (Acetohydroxy acid isomeroreductase; AHAIR)를 코딩하는 유전자인 ilvC 의 프로모터 영역(promoter region)의 특정 위치에 동일한 변이를 포함하고 있음을 확인하였다(도 1). 구체적으로 M4과 M15는, 서열번호 5로 표시되는 서열을 포함하는 프로모터 영역의 서열 내 14번째 뉴클레오티드인 G 및 17번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환됨을 확인하였다. 상기 서열번호 5로 표시되는 서열은 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC14067, ATCC13032 및 ATCC13869)의 ilvC 의 프로모터 영역에 공통적으로 포함된 서열이다. 이하 실시예에서는, 상기 변이가 코리네박테리움 속 미생물의 아미노산의 생산량에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.

실시예 3: 변이가 도입된 균주 제작 및 발린 생산능 확인

실시예 3-1: 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 변이가 도입된 균주 제작 및 발린 생산능 평가

실시예 3-1-1: 균주 제작

서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 14번째, 17번째 뉴클레오티드를 T로 치환하기 위하여, 상기의 변이를 발린 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 에 도입하기 위하여 타겟 변이를 포함한 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 G-spin Total DNA 추출 미니 키트(Intron사, Cat. No 17045)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 추출하였다. 상기 각 게노믹 DNA들을 주형으로 PCR을 실시하였다. ilvC 유전자의 프로모터 영역에 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서, 프라이머1 (서열번호 21)과 프라이머2 (서열번호 22)의 프라이머 쌍 및 프라이머 3(서열번호 23)과 프라이머 4(서열번호 24)의 프라이머 쌍을 이용하여 DNA 단편(A, B)을 각각 얻었다.

상기 두 단편을 주형으로 프라이머 1(서열번호 21)과 프라이머 4(서열번호 24)을 이용하여 Overlapping PCR을 실시하여 대략 1.4kb의 PCR 결과물 (이하, "변이 도입 단편"이라 명명함)을 얻었다. 사용한 프라이머 서열을 하기 표 2에 나타내었다.

프라이머	염기 서열	서열번호
프라이머 1	CTAT TCTAGA GTGATGAATCTGCAGCAGAAGATC	21
프라이머 2	GACAACTACATTATTATTATACCACACACATGCA	22
프라이머 3	TGCATGTGTGTGGTA TAAT AATAATGTAGTTGTC	23
프라이머 4	CTAT TCTAGA GAAGAGGTCGGTGACGGTCTCAGC	24

상기 얻어진 변이 도입 단편들을 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터 (대한민국 등록특허 제10-0924065호 및 국제 공개특허 제2008-033001호)와 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하였다. 상기 제작한 유전자를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 함유 LB배지에서 선별하고, DNA-spin 플라스미드 DNA 정제 키트(iNtRON 사)로 DNA를 획득하여 재조합 플라스미드 pDZ-ilvC(Pm3)-14067를 제조하였다.

상기 ATCC14067의 게노믹 DNA를 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC13869 및 ATCC13032 각각으로 치환하여 동일한 과정을 수행하였고, 각각 pDZ-ilvC(Pm3)-13869 및 pDZ-ilvC(Pm3)-13032라 명명한 재조합 플라스미드를 추가로 제조하였다.

상기에서 제작한 3종의 재조합 플라스미드 중 pDZ-ilvC(Pm3)-14067를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 L-발린 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P(대한민국 등록특허 제10-1117022호)에 형질 전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 프라이머 1과 프라이머 4을 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 ilvC 프로모터에 변이가 도입된 균주 KCCM11201P-ilvC(Pm3)를 제조하였다(도 2). 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA08-1063 로 명명하여, 2019년 8월 21일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12574P를 부여받았다.

실시예 3-1-2: 발린 생산능 평가

발린 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P와 KCCM11201P-ilvC(Pm3) 의 발린 생산능을 비교하기 위하여 발효 역가 평가를 수행하였다. 각각 균주를 영양배지에서 계대 배양한 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 3에 나타내었다.

<영양배지 (pH 7.2)>

<생산배지 (pH 7.0)>

KCCM11201P, KCCM11201P-ilvC(Pm3) 의 L-발린 생산능

	균주	L-발린 (g/L)
	균주	배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	KCCM11201P	2.8	2.6	2.7	2.7
실험군	KCCM11201P-ilvC(Pm3)	3.2	2.9	2.9	3.0

상기 결과와 같이, KCCM11201P-ilvC(Pm3) 균주의 L-발린 생산능은 대조군 대비 11% 증가함을 확인하였다. 결과적으로, ilvC 유전자의 프로모터 변이를 통해서 L-발린의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 3-2: 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V에 변이가 도입된 균주의 제작 및 L-발린 생산능 평가

실시예 3-2-1: 발린 생산 균주 CJ7V 제작

L-발린을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 상기와 동일한 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 1종의 변이[ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467]를 도입하여 L-발린 생산능이 향상된 균주를 제작하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 G-spin Total DNA 추출 미니 키트(Intron사, Cat. No 17045)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 추출하였다. 상기 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. ilvN 유전자에 A42V 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서, 프라이머 5(서열번호 25)과 프라이머 6(서열번호 26)의 프라이머 쌍 및 프라이머 7(서열번호 27)과 프라이머 8(서열번호 28)의 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 단편(A, B)을 각각 얻었다. PCR의 조건은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 사용한 프라이머 서열을 하기 표 4에 나타내었다.

프라이머	염기 서열	서열번호
프라이머 5	AATTTCTAGAGGCAGACCCTATTCTATGAAGG	25
프라이머 6	AGTGTTTCGGTCTTTACAGACACGAGGGAC	26
프라이머 7	GTCCCTCGTGTCTGTAAAGACCGAAACACT	27
프라이머 8	AATTTCTAGACGTGGGAGTGTCACTCGCTTGG	28

그 결과, 단편 A, B 모두 537bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 상기 두 단편을 주형으로 프라이머 5(서열번호 25)과 프라이머 8(서열번호 28)을 이용하여 Overlapping PCR을 실시하여 1044bp의 PCR 결과물 (이하, "변이 도입 단편"이라 명명함)을 얻었다.

상기 얻어진 변이 도입 단편을 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터와 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하였다. 상기 제작한 유전자를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 함유 LB배지에서 선별하고, DNA-spin 플라스미드 DNA 정제 키트(iNtRON 사)로 DNA를 획득하였다. 상기 ilvN 유전자의 A42V 변이 도입을 목적으로 하는 벡터를 pDZ-ilvN(A42V)라 명명하였다.

이후, 상기에서 제작된 재조합 플라스미드 pDZ-ilvN(A42V)를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 야생형인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 프라이머 5과 프라이머 8을 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이 도입 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V라 명명하였다.

실시예 3-2-2: 발린 생산능 평가

실시예 3-2-1에서 제조한 L-발린 생산능을 갖게된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V를 대상으로, 상기 실시예 3-1와 같은 방법으로 pDZ-ilvC(Pm3)-14067가 형질 전환되어 ilvC 유전자의 프로모터에 변이가 도입된 균주를 제작하고 CJ7V-ilvC(Pm3)로 명명하였다(도 3). 제작된 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 5에 나타내었다.

CJ7V, CJ7V-ilvC(Pm3) 의 L-발린 생산능

	균주	L-발린 (g/L)
	균주	배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	CJ7V	3.4	3.5	3.5	3.5
실험군	CJ7V-ilvC(Pm3)	3.8	3.9	3.8	4.0

상기 결과와 같이, CJ7V-ilvC(Pm3) 균주의 L-발린 생산능은 대조군 대비 14% 증가함을 확인하였다. 즉, 코리네박테리움 속 미생물에서 ilvC 유전자의 프로모터 변이를 통해서 L-발린의 생산능을 향상시킬 수 있음을 다시 한번 확인하였다.

실시예 3-3: 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V에 변이가 도입된 균주의 제작 및 L-발린 생산능 평가

실시예 3-3-1: 발린 생산 균주 CJ8V 제작

L-발린을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 상기와 동일한 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 3-2와 같은 방법으로 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869에 1종의 변이[ilvN(A42V)]를 도입하여 L-발린 생산능을 갖게 된 변이주를 제작하고, 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V라 명명하였다.

실시예 3-3-2: 발린 생산능 평가

실시예 3-3-1에서 제작한 L-발린 생산능을 갖게 된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V를 대상으로 ilvC 프로모터 변이가 도입된 균주를 제작하고자 하였다. 이에 실시예 3-1-1에서 제작한 재조합 벡터 pDZ-ilvC(Pm3)-14067, pDZ-ilvC(Pm3)-13869를 각각 CJ8V에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 프라이머 1과 프라이머 4을 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 ilvC 프로모터에 변이가 도입된 균주 CJ8V-ilvC(Pm3)와 CJ8V-ilvC(Pm3)-2를 제조하였다(도 4). 상기 재조합 균주 중 CJ8V-ilvC(Pm3)-2를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA08-2034로 명명하여, 2019년 8월 21일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12575P를 부여받았다.

제작한 상기 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 6에 나타내었다.

CJ8V, CJ8V-ilvC(Pm3)및 CJ8V-ilvC(Pm3)-2의 L-발린 생산능

	균주	L-발린 (g/L)
	균주	배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	CJ8V	3.5	3.4	3.4	3.5
실험군	CJ8V-ilvC(Pm3)	3.9	3.9	3.8	3.8
실험군	CJ8V-ilvC(Pm3)-2	3.8	3.8	3.8	3.8

상기 결과와 같이, CJ8V-ilvC(Pm3) 및 CJ8V-ilvC(Pm3)-2 균주의 L-발린 생산능은 대조군 대비 모두 8.6% 증가함을 확인하였다. 즉, 코리네박테리움 속 미생물에서 ilvC 유전자의 프로모터 변이를 통해서 L-발린의 생산능을 향상시킬 수 있음을 다시 한번 확인하였다.

실시예 4: 이소류신 생산 균주 제작 및 생산능 평가

실시예 4-1: L-이소류신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P 균주에서 ilvC 프로모터 변이가 도입된 균주의 제작 및 평가

상기 실시예 3와 동일한 방법으로 L-이소류신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P(대한민국 등록특허 제 10-1335789호)에 실시예 3-1에서 제작한 재조합 플라스미드 pDZ-ilvC(Pm3)-14067과 pDZ-ilvC(Pm3)-13869를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 도입된 균주들을 제작하고 각각 KCCM11248P::ilvC(Pm3)과 KCCM11248P::ilvC(Pm3)-2 라 명명하였다(도 5). 제작된 균주들을 아래와 같은 방법으로 배양하여 이소류신 생산능을 비교하였다.

종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃ 에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.

<종 배지(pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄　4 g, K₂HPO₄　8 g, MgSO₄　7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 50 g, (NH₄)₂SO₄　12.5 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄　1 g, MgSO₄7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO₃　30 g (증류수 1리터 기준)

배양종료 후 HPLC로 L-이소류신의 생산능을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신 농도는 아래 표 7과 같다.

	균주	L-이소류신 (g/L)
	균주	배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	KCCM11248P	1.3	1.5	1.2	1.33
실험군	KCCM11248P-ilvC(Pm3)	1.8	1.5	2.0	1.76
실험군	KCCM11248P-ilvC(Pm3)-2	1.7	1.6	1.8	1.70

상기 표 7에서 나타난 바와 같이 L-이소류신 생산 균주 KCCM11248P에 비하여 ilvC 프로모터 강화 변이가 도입된 KCCM11248P::ilvC(Pm3)과 KCCM11248::ilvC(Pm3)-2 에서는 L-이소류신의 농도가 각각 약 32.3% , 27.8% 씩 증가함을 확인하였다. 이를 통해 ilvC 유전자의 프로모터 변이를 통해서 L-이소류신의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

상기의 결과는 코리네박테리움 속 L-이소류신 생산 균주에서 ilvC 프로모터 변이의 도입이 L-이소류신 생산에 효과적임을 나타낸다.

실시예 4-2: 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주 ATCC13032에서의 ilvC 프로모터 변이가 도입된 L-이소류신 균주의 제작 및 L-이소류신 생산능 평가

ilvC 프로모터 도입에 의한 L-이소류신 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(이하 WT) 균주 기반으로 lysC(L377K) 변이체 (KR 10-2019-0003019 A)와 hom(G378E) 변이체 (Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 612-620 (1996))를 도입하여 균주를 제작하고, 기 공지된 트레오닌 디하이드라타제(L-threonine dehydratase)를 코딩하는 유전자에 ilvA(V383A) 변이(World J Microbiol Biotechnol (2015) 31:1369-1377)를 도입하여 L-이소류신 생산능을 비교하였다. 사용한 프라이머 서열을 하기 표 8에 나타내었다.

프라이머	염기서열(5'-3')	서열번호
9	TCCTCTAGAGCTGCGCAGTGTTGAATACG	29
10	TGGAAATCTTTTCGATGTTCACGTTGACAT	30
11	ACATCGAAAAGATTTCCACCTCTGAGATTC	31
12	GACTCTAGAGTTCACCTCAGAGACGATTA	32

실시예 4-2-1: L377K 변이 도입

WT의 염색체를 주형으로 하여 프라이머 9 및 10 혹은 프라이머 11 및 12 쌍를 이용하여 PCR을 수행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 lysC 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 509 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 520 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.

증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 프라이머9와 프라이머 12 쌍으로 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 377번째 류신이 라이신으로 치환된 아스파토키나제 변이체를 암호화하는 lysC 유전자의 변이를 포함하는 1011 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.

코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(한국 등록특허 제0924065호)와 1011 bp의 DNA 단편들을 제한효소 XbaⅠ으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-lysC(L377K)라 명명하였다.

위에서 획득한 pDZ-lysC(L377K) 벡터를 WT 균주에 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999, 52:541-545))으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 lysC 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 균주, WT::lysC(L377K)를 획득하였다.

실시예 4-2-2: G378E 변이 도입

hom(G378E) 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위하여 WT genomic DNA를 주형으로 프라이머 13와 프라이머14, 프라이머15와 프라이머16 쌍을 이용하여 각각 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 hom 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 220 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 220 bp의 DNA 단편을 수득하였다. 이 두 개의 PCR product를 주형으로 프라이머 13와 16의 쌍을 이용하여 PCR을 진행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, hom 유전자의 변이를 포함하는 440 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 사용한 프라이머 서열을 하기 표 9에 나타내었다.

프라이머	염기서열(5'-3')	서열번호
13	TCCTCTAGACTGGTCGCCTGATGTTCTAC	33
14	GCCAAAACCTCCACGCGATC	34
15	ATCGCGTGGAGGTTTTGGCT	35
16	GACTCTAGATTAGTCCCTTTCGAGGCGGA	36

앞서 사용된 pDZ 벡터와 440 bp의 DNA 단편을 제한효소 XbaⅠ으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-hom(G378E)라 명명하였다.

획득한 pDZ-hom(G378E) 벡터를 실시예 4-2-1에서 제작한 WT::lysC(L377K) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 hom 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 균주, WT::lysC(L377K)-hom(G378E)를 획득하였다.

실시예 4-2-3: ilvC 프로모터 변이 도입

상기 실시예와 동일한 방법으로, 실시예 4-2-2에서 제작한 WT::lysC(L377K)-hom(G378E) 균주에 실시예 3-1에서 제작한 재조합 플라스미드 pDZ-ilvC(Pm3)-14067과 pDZ-ilvC(Pm3)-13032를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 도입된 균주를 제작하고 각각 WT::lysC(L377K)-hom(G378E)-ilvC(Pm3)와 WT::lysC(L377K)-hom(G378E)-ilvC(Pm3)-3 이라 명명하였다.

실시예 4-2-4: ilvA 변이 도입

ilvA 유전자를 대상으로 기 공지된 ilvA(V383A) 변이 (World J Microbiol Biotechnol (2015) 31:1369-1377)가 도입된 벡터를 제작하기 위하여 변이 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(프라이머17 및 18)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(프라이머19 및 20 )을 고안하였다. 프라이머 17 및 20의 각 말단에 BamHⅠ 제한 효소 부위(밑줄로 표시)를 삽입하였고, 프라이머 18과 19는 서로 교차되도록 고안한 부위에 뉴클레오티드 치환 변이(밑줄로 표시)가 위치하도록 하였다. 사용한 프라이머 서열을 하기 표 10에 나타내었다.

프라이머	염기서열(5'-3')	서열번호
17	ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG	37
18	GCGCTTGAGGTACTCtgcCAGCGTGATGTC	38
19	GACATCACGCTGgcaGAGTACCTCAAGCGC	39
20	ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC	40

증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 프라이머 17 및 WT의 염색체를 주형으로 하여 프라이머 17 및 프라이머18, 프라이머 19 및 프라이머 20의 쌍를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 627 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 608 bp의 DNA 단편을 수득하였다. 프라이머 20의 쌍으로 PCR을 수행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 383번째 발린이 알라닌으로 치환된 IlvA 변이체를 암호화하는 ilvA 유전자의 변이를 포함하는 1217 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.

pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 1011 bp의 DNA 단편을 제한 효소 BamHⅠ으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117- ilvA(V383A) 라 명명하였다.

pECCG117-ilvA(V383A)벡터를 위 실시예의 ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3) 및 ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)-3 에 도입된 균주를 각각 제작하여 ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)/pECCG117-ilvA(V383A) 및 ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)-3/pECCG117-ilvA(V383A)으로 각각 명명하였다(도 6). 또한 이의 대조군으로 ATCC13032::-hom(G378E)-lysC(L377K) 에 ilvA(V383A) 변이만 도입된 균주도 제작하였다.

실시예 4-2-5: 이소류신 생산능 평가

실시예 4-1에 나타낸 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중의 L-이소류신 농도를 분석하였다.

	균주	L-이소류신 (g/L)
	균주	배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	ATCC13032::-hom(G378E)-lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(V383A)	4.1	4.3	4.3	4.23
실험군	ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)/pECCG117-ilvA(V383A)	5.2	5.1	5.6	5.30
실험군	ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)-3/pECCG117-ilvA(V383A)	5.1	5.3	5.4	5.26

상기 표 11에서 나타난 바와 같이 야생형 균주 ATCC13032::-hom(G378E)-lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(V383A)에 비하여 ilvC 변이가 포함된 ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)/pECCG117-ilvA(V383A)과 ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)-3/pECCG117-ilvA(V383A)에서는 L-이소류신의 농도가 약 25%, 24% 증가함을 확인하였다. 상기의 결과는 코리네박테리움 속 L-이소류신 생산 균주에서 ilvC 프로모터 변이의 도입이 L-이소류신 생산에 효과적임을 나타낸다.

실시예 5: 류신 생산균주 제작 및 생산능 확인

실시예 5-1: L-류신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11661P, KCCM11662P 균주에 ilvC 프로모터 변이가 도입된 균주의 제작 및 류신 생산능 평가

상기 실시예 3-1에서 제작한 재조합 플라스미드 pDZ-ilvC(Pm3)-14067를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 L-류신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11661P(대한민국 등록특허 제10-1851898호), KCCM11662P(대한민국 등록특허 제10-1796830호)에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 프라이머 1과 프라이머 4을 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 ilvC 프로모터에 변이가 도입된 균주를 제조하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11661P-ilvC(Pm3) 및 KCCM11662P-ilvC(Pm3)라 명명하였다(도 7). 류신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11661P-ilvC(Pm3) 및 KCCM11662P-ilvC(Pm3)의 류신 생성능을 비교하기 위하여 발효 역가 평가를 수행하였다. 각각 균주를 영양배지에서 계대 배양한 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-류신의 농도를 분석하였고, 분석한 L-류신의 농도를 하기 표12에 나타내었다.

<영양배지 (pH 7.2)>

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 50 g, 황산암모늄 20 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 20 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 탄산칼슘 15 g (증류수 1리터 기준)

KCCM11661P, KCCM11661P-ilvC(Pm3) 및 KCCM11662P, KCCM11662P-ilvC(Pm3)의 L-류신 생산능

	균주	L-류신 (g/L)
	균주	배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	KCCM11661P	2.8	2.6	2.7	2.7
실험군	KCCM11661P-ilvC(Pm3)	3.1	2.9	2.9	3.0
대조군	KCCM11662P	3.0	3.1	2.9	3.0
실험군	KCCM11662P-ilvC(Pm3)	3.3	3.3	3.2	3.3

상기 결과와 같이, KCCM11661P-ilvC(Pm3) 및 KCCM11662P-ilvC(Pm3) 균주의 L-류신 생산능은 대조군 대비 약 11% 및 10% 증가함을 확인하였다. 따라서 ilvC 유전자의 프로모터 변이를 통해서 L-류신의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 5-2: 류신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJL8001에 변이가 도입된 균주의 제작 및 L-류신 생산능 평가

L-류신을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 상기와 동일한 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 1종의 변이[leuA(R558H,G561D); 대한민국 출원번호 10-2017-0136244호]를 도입하여 L-류신 생산능이 향상된 균주를 제작하였다.

구체적으로, 상기 특허에서 제작된 재조합 플라스미드 pDZ-leuA(R558H, G561D)를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 야생형인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 유전자 서열 분석을 통하여 변이 도입 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJL8001라 명명하였다.

마지막으로, L-류신 생산능을 갖게된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJL8001를 대상으로 상기 실시예 5-1와 같은 방법으로 pDZ-ilvC(Pm3)-14067와 pDZ-ilvC(Pm3)-13032벡터를 형질전환하여 ilvC 유전자의 프로모터에 변이가 도입된 균주 CJL8001-ilvC(Pm3)와 CJL8001-ilvC(Pm3)-3를 제작하였고(도 8), CJL8001-ilvC(Pm3)-3는 코리네박테리움 글루타미쿰 CA13-8101로 명명되어 2019년 8월 21일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12576P를 부여받았다.

제작된 균주의 L-류신 생산능을 비교하고자 상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-류신의 농도를 분석하였고, 분석한 L-류신의 농도를 하기 표 13에 나타내었다.

CJL8001, CJL8001-ilvC(Pm3) 및 CJL8001-ilvC(Pm3)-3 의 L-류신 생산능

	균주	L-류신 (g/L)
	균주	배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	CJL8001	3.4	3.3	3.5	3.4
실험군	CJL8001-ilvC(Pm3)	3.8	3.9	4.0	3.9
실험군	CJL8001-ilvC(Pm3)-3	3.9	3.9	3.9	3.9

상기 결과와 같이, CJL8001-ilvC(Pm3) 및 CJL8001-ilvC(Pm3)-3 균주의 L-류신 생산능은 대조군 대비 모두 약 15% 증가한 것을 확인하였다. 즉, 코리네박테리움 속 미생물에서 ilvC 유전자의 프로모터 변이를 통해서 L-류신 생산능을 향상시킬 수 있음을 다시 한번 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12574P

20190821

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12575P

20190821

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12576P

20190821

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A novel promoter and preparation method of amino acids using thereof <130> KPA181033-KR <160> 40 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Corynebacterium glutamicum <400> 1 ccgtctaatt gcatgtgtgt ggtagaac 28 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter_general formula Z <400> 2 catgtgtgtg gtanaan 17 <210> 3 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter_general formula Y <400> 3 ctaattn 7 <210> 4 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter_general formula X <400> 4 cngn 4 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter_formula Z <400> 5 catgtgtgtg gtagaac 17 <210> 6 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter_formula Y <400> 6 ctaattg 7 <210> 7 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter_formula Y <400> 7 ctaatta 7 <210> 8 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter_formula X <400> 8 ccgt 4 <210> 9 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter_formula X <400> 9 cgga 4 <210> 10 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter_formula X <400> 10 cggt 4 <210> 11 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter_formula X <400> 11 ccga 4 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter_formula Z <400> 12 catgtgtgtg gtataat 17 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 13 ccgtctaatt gcatgtgtgt ggtataat 28 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 14 ccgtctaatt acatgtgtgt ggtataat 28 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 15 cggactaatt gcatgtgtgt ggtataat 28 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 16 cggactaatt acatgtgtgt ggtataat 28 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 17 ccgactaatt gcatgtgtgt ggtataat 28 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 18 ccgactaatt acatgtgtgt ggtataat 28 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 19 cggtctaatt gcatgtgtgt ggtataat 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 20 cggtctaatt acatgtgtgt ggtataat 28 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ctattctaga gtgatgaatc tgcagcagaa gatc 34 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gacaactaca ttattattat accacacaca tgca 34 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tgcatgtgtg tggtataata ataatgtagt tgtc 34 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ctattctaga gaagaggtcg gtgacggtct cagc 34 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 aatttctaga ggcagaccct attctatgaa gg 32 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact 30 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 aatttctaga cgtgggagtg tcactcgctt gg 32 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tcctctagag ctgcgcagtg ttgaatacg 29 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 acatcgaaaa gatttccacc tctgagattc 30 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gactctagag ttcacctcag agacgatta 29 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 tcctctagac tggtcgcctg atgttctac 29 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gccaaaacct ccacgcgatc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 atcgcgtgga ggttttggct 20 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gactctagat tagtcccttt cgaggcgga 29 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 acggatccca gactccaaag caaaagcg 28 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gcgcttgagg tactctgcca gcgtgatgtc 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gacatcacgc tggcagagta cctcaagcgc 30 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 acggatccaa ccaaacttgc tcacactc 28

Claims

하기 일반식 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드:
[일반식 1]
X-Y-Z
상기 식에서,
X는 CN₁GN₂이고,
Y는 CTAATTN₃이고,
Z는 CATGTGTGTGGTATAAT이고,
상기 N₁, N₂ 및 N₃은 각각 A(아데닌), T(티민), G(구아닌), 또는 C(시토신)중에서 선택되는 어느 하나인 것.
제1항에 있어서,
상기 X의 N₁은 C(시토신) 또는 G(구아닌)인 것인, 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
상기 X의 N₂는 A(아데닌) 또는 T(티민)인 것인, 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
상기 Y의 N₃은 A(아데닌) 또는 G(구아닌)인 것인, 폴리뉴클레오티드.
제3항에 있어서,
상기 X는 서열번호 8 내지 11 중 어느 하나이고, Y는 서열번호 6 또는 7인 것인, 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13 내지 20으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 것인, 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로모터.
제7항의 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터.
제8항에 있어서,
상기 목적 단백질은 아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈(acetohydroxy acid isomeroreductase)인, 벡터.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물.
제10항에 있어서,
상기 코리네박테리움 속 미생물은, 코리네박테리움 글루타미쿰인, 미생물.
제10항의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
상기의 배지에서 목적 물질을 회수하는 단계;
를 포함하는 목적 물질을 생산하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 목적 물질은 아미노산인 것인, 방법.
제13항에 있어서,
상기 아미노산은 L- 분지쇄 아미노산인, 방법.
제1항 내지 6항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 프로모터를 목적 유전자와 작동 가능하게 연결시키는 단계를 포함하는, 목적 유전자 발현 강화 방법.