KR100242252B1 - 핵산서열의 증폭방법 - Google Patents

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Abstract

표적 서열의 RNA 사본의 복수개가 자동촉매적으로 부가 사본을 생성하는, 실질적으로 일정한 온도, 이온세기 및 pH 조건하에서 표적 핵산 서열의 복수개의 사본을 자동촉매적으로 합성하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 임상, 환경, 범죄수사 및 유사샘플에서 특정 핵산 서열을 정량화하기 위한 분석등의 목적을 위하여 핵산 표적 서열의 사본을 생성하거나 클로닝 및 프로브를 만드는데 유용하다.

Description

[발명의 명칭]
핵산서열의 증폭방법
[발명의 상세한 설명]
본출원은 1989년 7월 11일 출원된 제379, 501호 출원의 일부 계속 출원이다.
[발명의 분야]
본 발명은 단독으로 혹은 핵산의 동질 또는 이질 혼합물의 큰 또는 작은 구성성분으로 존재할 수 있는 특정핵산서열 또는“표적 서열”의 복사체의 수를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
핵산 혼합물을 진단시험, 환경시험, 연구, 클로닝과 같은 다른 단계를 위한 시약 또는 물질의 제조, 또는 기타 목적을 위하여 채취된 샘플에서 발견되는 것이다.
특정 핵산서열의 선택적인 증폭은 특이성을 유지하면서 진단 및 환경분석의 감도를 증가시키며 다양한 연구단계의 감도, 편리함, 정확도 및 신뢰도를 증가시키며 다양한 목적에 쓰이는 특정 올리고뉴클레오티드의 많은 양을 제공하는데 유용하다.
본 발명은 실시상의 편리함에 기인하여 환경 및 진단시험에 사용할 경우 특히 유용하다.
[발명의 배경]
특정 핵산서열의 검출 및/또는 정량화는 미생물의 동정·분류, 감염성 질병의 진단, 유전적 비정상의 발견 및 특성확인, 암과 관련된 유전변화의 식별, 질병에 대한 유전적 감수성 및 다양한 치료형태에 대한 반응측정에 있어 매우 중요한 기술이다. 음식물, 환경샘플, 종 저장(seed stock) 및 모니터하기 위해서는 특정 미생물이 존재하여야 하는 기타 유형의 물질에서 미생물을 검출하고 정량하는데에도 또한 폭넓게 사용된다. 핵산서열의 상관성을 측정하는 것은 범죄자를 식별하고, 친자확인소송을 해결하고, 혈통적 및 계통발생적 나무를 제조하고 또한 다양한 생명체를 분류하는 등의 법과학, 인류학, 고고학 및 생물학 분야에서 그 사용을 찾아볼 수 있다.
특정 핵산서열을 검출하고 정량화하는 통상의 방법은 핵산혼성화(hybridization) 방법이다.
이 방법은 상보적인 또는 근본적으로 상보적인 서열을 포함하고 있어 적당한 조건하에서 특이적으로 결합하여 이중가닥 구조를 형성할 수 있는 두핵산가닥의 능력에 기초한다.
특정핵산서열(“표적서열”로 지칭)를 검출 및/ 또는 정량화하기 위하여 표적서열에 상보적인 서열을 포함하는 표지된 올리고뉴클레오티드(“프로브”로 지칭을 제조한다. 표적서열을 포함하고 있을 것 같은 샘플에 프로브를 혼합하고 혼성체 형성에 적당한 조건을 만든다. 샘플에 표적서열이 존재한다면 프로브는 표적서열과 혼성화한다. 다음, 프로브-표적 혼성체는 다양한 방법의 하나로 단일-가닥 프로브로부터 분리된다. 혼성체에 결합된 표지의 양을 측정한다.
핵산 혼성화 분석법의 감도는 일차적으로 프로브의 특이활성, 혼성화반응의 속도 및 정도, 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않는 프로브의 분리법의 성능 및 표지의 검출 감도에 의하여 제한된다.
최상의 조건하에서 상기에 기술된 것과 같은 직접 혼성화방법은 대략 1×105내지 1×106표적 분자를 검출할 수 있다. 가장 감도가 높은 반응 단계는 통상의 임상적 및 환경 시험에 요구되는 속도, 용이성 및 경제성등과 같은 여러 특징들을 결여하고 있다. 더욱이, 이들의 감도는 바라던 많은 사용분야에는 불충분하다. 감염성 질병은 혈액 또는 기타 표본 10ml 당 거의 하나 이하의 병원 미생물과 연관되어 있다. 범죄 과학자들은 범죄현장에서 얻을 수 있는 미량의 세포조직만을 이용하기도 한다. 연구자들은 세포군의 전령 RNA 무리 또는 유기체의 유전물질에 존재하는 전서열의 일부분만으로 존재하는 특정 유전자 서열을 검출 및/또는 정량화 할 필요가 있다. 이러한 유형의 분석방법의 구성단계 또는 다양한 구성간의 상호 작용의 결과로서 특이성과 감도사이에 역관계가 거의 항상 존재한다. 따라서, 분석감도를 증가시키기 위한 단계(예컨대 프로브의 특이활성을 증가시킴)는 잘못된 양성 시험결과를 높은 확율로 초래할 수 있다. 감도와 특이성의 연관성은 혼성화분석의 감도를 향상시키는데 크나큰 장애물이 되어왔다. 이 문제점의 해결 방안은 증폭 단계를 이용하여 존재하는 표적 서열의 양을 상당히 증가시키는 것이다. 샘플의 잔존 서열에 코드화된 상당부분의 정보를 증폭시키지 않고 유일한 표적 서열부분만을 증폭시키는 것은 특이성을 저하시키지 않은 동시에 감도를 증가시킨다. 예컨대, 25 염기길이의 핵산서열은 서열상의 25개 위치 각각에 4개의 다른 뉴클레오티드중의 하나가 위치할 수 있기 때문에 1/425또는 1/1015의 발생확률을 가진다.
“중합효소 사슬반응” 또는 “PCR”로 명명된 핵산서열의 특이적 증폭방법은 Mullis 등에 의해 기술되어 있다(미국특허 제4, 683, 195호, 제4, 683, 202호 및 제4, 800, 159호와 유럽특허출원 제86302298.4호, 제86302299.2호 및 제87300203.4호와 Methods in Enzymology, Volume 155, 1987, pp. 335-350 참조). 이 단계는 각각의 상보서열 가닥을 주형으로 사용한, 동시에 일어나는 프라이머-의존 핵산합성단계의 반복적 사이클을 이용한다. 증폭될 서열은 합성을 개시할 프라이머 분자의 위치에 의하여 특정된다. 프라이머는 표적서열 또는 그 상보서열의 3′-말단부에 상보적이며 핵산합성이 개시되도록 이들 부위에 결합하여야 한다. 계속하여 생성물이 합성된 후, 다음의 합성단계전에 일반적으로 열변성에 의하여 가닥이 분리된다. 이 PCR 단계에서 두 상보 서열가닥의 복사체가 합성된다. PCR 반응의 각 사이클의 종결시 새로이 합성된 가닥을 분리하기 위하여 PCR에서 이용된 가닥분리 단계는 보통 열변성법이다. 결과적으로 열변성단계와 DNA 합성의 다음 단계의 개시사이에 열에 안정한 효소가 요구되거나 새로운 효소가 첨가되어야 한다. 몇몇 상이한 온도와 극한 온도사이에서 반복적인 반응온도 사이클의 필요성은 PCR 반응의 단점이다. PCR 반응을 편리하게 하기 위하여서는 고가의 프로그램된 열주기장치가 필요하다. PCR단계는 PCR 반응에 사용된 프라이머중의 하나에 프로모터 서열을 통합시킴으로써 증폭후 단일 -가닥 RNA의 전사를 위한 주형으로서 이중가닥 DNA를 사용한 몇회의 PCR 단계 사이클에 의하여 RNA 전사단계와 연계된다(예컨대 Murakawa 등, DNA 7; 287-295(1988) 참조). 특정 핵산 서열을 증폭하기 위한 또 다른 방법은 프라이머의 사용을 통하여, 프로모터 서열을 포함하고 있는 이중가닥 DNA 중간분자를 제공하는 일련의 프라이머 혼성화, 신장 및 변성단계로 구성된다. 이중가닥 DNA는 표적 서열의 복수개의 RNA 복사체를 생산하기 위하여 사용된다. 얻어진 RNA 복사체는 다른 복사체를 생산하기 위한 표적 서열로 사용될 수 있으며 복수의 사이클이 실시된다(예컨대, Burg 등., WO 89/1050 및 Gingeras 등, WO 88/10315 참조).
실험실상에서 비교적 많은 양의 특정 DNA 서열을 화학적으로 합성하는 방법은 이 분야의 통상의 기술자들에게 잘 알려져 있다; 이 방법으로 DNA를 생산하는 것은 현재에는 일반화 되었다. 그러나 이들 단계는 시간을 많이 요하며 100 염기 길이 이상의 올리고 뉴클레오티드를 합성하는데에 용이하게 이용될수 없다. 또한, 합성될 DNA의 전체 염기서열을 알고 있어야 한다. 이들 방법은 한번에 하나의 서열만을 합성할 수 있는 고가의 장치를 필요로 한다. 이 장치의 작동은 상당한 기술과 숙련도를 요한다. RNA을 화학적으로 합성하는 방법은 개발하기 훨씬 어렵다.
특정 핵산서열을 미생물의 유전물질에 삽입 또는 클로닝하여 유기체가 복제될 때 삽입서열이 복제되도록 하는 기술에 의하여 핵산을 합성할 수 있다. 서열이 적당한 프로모터 서열의 뒤 및 하류에 삽입될 경우, 서열에 코드되어 있는 단백질생성물 또는 서열의 RNA 복사체가 제조된다. 비록 클로닝 방법이 특정 핵산서열을 실질적으로 무한정한 양으로 생산하도록 하지만 관련 조작의 수로 인하여 진단, 환경 또는 범죄 조사에 사용하기에는 적당하지 않다. 클로닝 기술의 사용은 상당한 기술 및 숙련도를 요구한다. 한 서열을 클로닝하는데 수개월 또는 그 이상의 사람의 노력이 소비된다.
비교적 많은 양의 일부 RNA는 RNA- 지시 중합효소, 바람직하게는 Qβ레플리카제(replicase)의 결합을 위한 인식부위를 가지는 재조합 단일- 가닥-RNA 분자를 이용하여 제조할 수 있다(예컨대 Kramer 등에 부여된 미국 특허 제4, 786, 600호 참조). 특정 서열을 다양한 DNA 복사체 분자에 삽입하고, 발현벡터에 클로닝하고 RNA로 전사시키고 Qβ 레플리카제로 복제하는 데에는 많은 단계가 요구된다.
[발명의 요약]
본 발명의 표적 핵산 서열의 복사체를 다수 합성하는 신규의 방법에 관한 것으로 이 방법은 자동촉매적, 즉 온도, pH, 또는 이온세기등과 같은 반응조건을 수정할 필요가 없으며 다음 반응의 제1 사이클 생성물을 사용하면서 자동적으로 사이클될 수 있는 반응이다.
본 방법은 다음의 단계로 이루어진다.
(a) 올리고뉴클레오티드와 복합체를 이루는 표적의 3′-말단부에 충분히 상보적인 복합서열을 가지고, 올리고뉴클레오티드/표적 서열 복합체의 형성 및 DNA 합성이 개시되는 조건하에서 RNA 중합효소의 프로모터를 포함하는 프라이밍(priming) 서열의 5′서열을 선택적으로 가지는 제1 프라이머를 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드로 RNA 표적 서열을 처리하는 단계,
(b) 표적서열을 주형으로 사용하여 신장반응(extension reaction)에서 제1 프라이머를 신장하여 RNA 표적에 상보적인 제1 DNA 프라이머 신장 생성물을 얻은 단계,
(c) RNA 표적을 선택적으로 분해시키는 효소를 사용하여 RNA 표적으로부터 DNA 신장 생성물을 분리시키는 단계,
(d) 프라이머 또는 스플라이스(splice) 주형을 이루고, 또한 올리고뉴클레오티드/표적 서열 복합체가 형성되며 DNA 합성이 개시되는 조건하에서 올리고 뉴클레오티드와 복합체를 이루는 DNA 프라이머 신장 생성물의 3′- 말단부에 충분히 상보적인 복합서열을 가지는 제2의 올리고뉴클레오티드로 DNA 프라이머 신장 생성물을 처리하는 단계. 단, 제1 올리고뉴클레오티드가 프로모터를 가지지 않는다면, 제2 올리고뉴클레오티드는 RNA 중합효소의 프로모터를 포함하는 복합서열의 5′서열을 가지는 스플라이스 주형이다.
(e) RNA 중합효소에 대한 주형을 생성하기 위하여 DNA 신장반응에서 제2 올리고뉴클레오티드 또는 제2프라이머 신장 생성물중 하나, 또는 그둘의 3′-말단을 신장하는 단계; 및
(f) 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 이용하여 표적서열의 RNA 복사체의 복수개를 생산하기 위하여 주형을 사용하는 단계.
올리고뉴클레오티드 및 RNA 복사체는 자동촉매적으로 표적서열의 복수개의 복사체를 합성하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 일반적 방법은 다음의 단계로 이루어진다.
(a) 올리고뉴클레오티드와 복합체를 이루는 표적의 3′-말단부에 충분히 상보적인 복합서열을 가지고, 올리고뉴클레오티드/표적서열 복합체의 형성 및 DNA 합성이 개시되는 조건하에서 RNA 중합효소의 프로모터를 포함하는 복합서열의 5′서열을 가지는 제1 프라이머를 구성하는 제1 올리고뉴클레오티드로 RNA 표적서열을 처리하는 단계.
(b) 표적서열을 주형으로 사용하여 신장반응에서 제1 프라이머를 신장하여 RNA 표적에 상보적인 제1DNA 프라이머 신장생성물을 얻는 단계,
(c) RNA 표적을 선택적으로 분해시키는 효소를 사용하여 RNA 표적으로부터 제1DNA 프라이머 생성물을 분리시키는 단계,
(d) 제2프라이머를 이루고, 또한 올리고뉴클레오티드/표적서열 복합체가 형성되며 DNA 합성이 개시되는 조건하에서 올리고뉴클레오티드와 복합체를 이루는 프라이머 신장생성물의 3′-말단부에 충분히 상보적인 복합서열을 가지는 제2 올리고뉴클레오티드로 DNA프라이머 신장생성물을 처리하는 단계,
(e) 제2DNA 프라이머 신장생성물을 얻어서 RNA 중합효소를 위한 주형을 생성하기 위하여 DNA신장반응에서 제2프라이머의 3′-말단을 신장하는 단계,
(f) 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 이용하여 표적서열의 RNA 복사체의 복수개를 생산하기 위하여 주형을 사용하는 단계. 올리고뉴클레오티드 및 RNA 복사체는 자동촉매적으로 표적서열의 복수개의 복사체를 합성하기 위하여 사용될 수 있다.
이러한 견지에서 다음의 단계도 포함된다;
(g) 올리고뉴클레오티드/표적 서열 복합체가 형성되며 DNA 합성이 개시되는 조건하에서 제2프라이머로 (f)단계의 RNA 복사체를 처리하는 단계,
(h) RNA 복사체를 주형으로 사용하여 제2 DNA 프라이머 신장생성물을 얻기 위한 DNA 신장반응에서 제2 프라이머의 3′-말단을 신장하는 단계;
(i) RNA 복사체를 선택적으로 분해하는 효소를 사용하여 RNA 복사체로부터 제2 DNA 프라이머 신장 생성물을 분리하는 단계;
(j) 올리고뉴클레오티드/표적 서열 복합체가 형성되며 DNA 합성이 개시되는 조건하에서 제2 DNA 프라이머 신장생성물을 제1 프라이머로 처리하는 단계;
(k) RNA 중합효소의 주형을 만들기 위하여 DNA 신장 반응에서 제2 프라이머 신장생성물의 3′말단을 신장하는 단계; 및
(ℓ) 프로모터를 인식하는 RNA 중합효소를 이용하는 표적 서열의 복수개의 복사체를 생산하기 위하여 (k)단계의 주형을 사용하는 단계.
(ℓ) 단계의 RNA 복사체를 이용, (g) 내지 (k)단계를 자동촉매적으로 반복하여 표적 서열의 복수개의 복사체를 합성한다.
(k)단계에서 스플라이스 주형으로 쓰인 제1 프라이머도 (k)단계의 DNA 신장반응에서 신장된다.
본 발명의 일반적 방법의 또다른 면은 다음의 단계로 이루어지는 방법을 제공한다.
(a) 올리고뉴클레오티드/표적 서열 복합체가 형성되며 DNA 합성이 개시되는 조건하에서 제1 프라이머와 복합체를 형성하기 위하여 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 복합서열을 가지는 제1 프라이머로 RNA 표적서열을 처리하는 단계.
(b) RNA 표적에 상보적인 DNA 프라이머 신장생성물을 얻기위하여 표적서열을 주형으로 사용한 신장 반응에서 프라이머의 3′말단을 신장하는 단계.
(c) RNA 표적을 선택적으로 분해하는 효소를 사용하여 RNA 표적으로 부터 DNA 신장 생성물을 분리하는 단계.
(d) 복합체를 형성하는 프라이머 신장생성물의 3′-말단에 충분히 상보적인 복합체화 서열 및 RNA 중합효소의 프로모터를 함유하는 복합체화 서열의 5′서열을 가지는 스플라이스 주형을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드로 올리고뉴클레오티드/표적 서열 복합체가 형성되며 DNA 합성이 개시되는 조건하에서 DNA 프라이머 신장생성물을 처리하는 단계;
(e) 프로모터에 상보적인 서열을 첨가하여 RNA 중합효소의 주형을 생산하기 위하여 DNA 프라이머 신장 생성물의 3′-말단을 신장하는 단계.
(f) 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 사용, 표적서열의 RNA 복사체를 다수 생산하기 위하여 주형을 사용하는 단계; 및
(g) (f)단계의 RNA 복사체를 사용하여 자동 촉매적으로 (a) 내지 (f)단계를 반복하여 표적서열을 증폭하는 단계.
선택적으로 (d)단계의 스플라이스 주형도 또한 프라이머로 작용하며 (e)단계에서 신장되어 제1 프라이머 신장생성물을 주형으로 사용하는 제2프라이머 신장 생성물을 얻는다. 그외에 증폭될 서열이 DNA로서 존재하는, 본발명의 또다른 측면에서 적당한 예비적 단계를 이용하여 본발명의 일반적 방법에 따라 증폭되어질 RNA 복사체를 생산한다.
따라서, 다른 측면에서의 본 발명은 증폭될 복사체의 수를 증가시킬 수 있을뿐만 아니라 증폭을 위한 DNA 서열의 RNA 복사체를 제공할 수 있는 본발명의 증폭방법과 결합하여 사용하는 예비적 단계에 관한 것이다.
본발명은 샘플에 있는 특정 표적핵산서열의 복사체수를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 한편으로 본발명은 여분의 생성물을 생산하는데 사용되는 생성물을 생산하기위한 효소적 혼성체 분리단계와 DNA 중합효소(예컨대 역전사효소) 및 DNA-의존 RNA 중합효소(전사효소)의 공조작용에 관련된다. 따라서 열사이클과 같은 반응조건의 조작을 요하지 않고 자동촉매적 반응을 유발한다. 예비적 단계를 포함한 본 발명 방법의 몇몇 구체예에서 예비적 단계의 개시단계를 제외한 모든 단계는 단일 온도에서 실시된다.
본 발명의 방법은 임상, 환경, 범죄 및 유사한 샘플에서 특정 핵산표적서열을 검출 및/ 또는 정량화하는 분석의 구성방법 또는 다양한 목적에 따라 특정 표적서열의 DNA 및/ 또는 RNA 복사체를 다수 생산하는 방법으로 사용된다. 또한 이들 방법들은 서열화하기 위한 RNA 및 DNA 복사체를 생산하거나 프로브를 클로닝하기 위한 DNA 표적 서열의 DNA 복사체를 다수 생산하는데 사용된다.
전형적인 분석의 한 구체예에서 중화용액, 염, 마그네슘, 뉴클레오티드 3인산, 프라이머 및/또는 스플라이스 주형, 디티오트레이톨 및 스퍼미딘을 함유하는 중화용액에 증폭될 샘플을 혼합한다. 그런다음, 2차적 구조를 변성시키기 위하여 2분간 100℃ 근방에서 선택적으로 반응을 배양하였다. 실온까지 냉각한 다음, 표적이 미지의 3′-말단을 가지는 DNA 표적이다면, 역전사효소를 첨가하고 42℃에서 12분간 반응혼합물을 배양한다. 반응을 다시 100℃ 근방에서 변성하여 이번에는 DNA 주형으로부터 프라이머 신장생성물을 분리한다. 냉각후, 역전사효소, RNA 중합효소 및 RNAse H를 첨가하고 반응을 37℃에서 2 내지 4시간동안 배양하였다. 그런다음 생성물을 변성, 프로브용액에 첨가하고 60℃에서 20분간 배양하고, 미혼성화된 프로브를 선택적으로 가수분해하는 용액에 첨가하고, 60℃에서 6분간 반응을 배양하고, 발광계에서 잔여 화학형광을 측정함으로써 반응을 분석하였다(예컨대 Arnold 등, PCT US88/02746(1988. 9. 21.에 출원 1989. 3. 29.에 공고)는 본 명세서에 참고자료로써 포함되어 있으며, “HPA”로 언급한다).
본발명 방법의 생성물은 이 분야의 통상의 지식을 가진자들에게 알려져 있는 다른 많은 분석 시스템에 사용된다.
표적이 밝혀진 3′-말단을 가지고 있거나 또는 RNA이라면, 전형적인 분석방법은 상기에 언급된 중화용액에 표적을 혼합하고 2차 구조를 변성시킨다. 냉각후, 역전사효소, RNA 중합효소 및 RNAse H를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 2 내지 4시간 배양한다. 그다음 상기 언급된 것과 같이 반응을 분석한다.
본 발명의 방법 및 사용된 물질들을 진단 단계에서 사용하기 위한 진단 키트의 일부로써 포함된다.
[정의]
본 명세서에서 다음 용어들은 다른 언급된 사항이 없으면 다음을 의미한다.
1. 주형
“주형”은 핵산 중합효소에 의하여 복사될 핵산분자이다. 주형은 중합효소에 따라 단일가닥, 이중가닥 또는 부분적 이중가닥일 수 있다. 합성된 복사체는 주형에 상보적이거나 적어도 이중가닥 또는 부분적 이중가닥주형의 한가닥에 상보적이다. RNA 및 DNA 모두 5′에서 3′방향으로 합성되며 핵산 이중가닥의 두가닥은 항상 두가닥의 5′말단이 이중가닥의 반대끝에 있다(필요에 따라서는 3′말단도 동일).
2. 프라이머, 스플라이스 주형
“프라이머”는 주형에 상보적인 올리고뉴클레오티드로서 주형과 결합(수소결합 또는 혼성화)하여 DNA 중합효소에 의한 합성개시로 쓰여지는 프라이머/주형 복합체를 형성하며, DNA 합성단계에서 주형에 상보적인 3′말단에 결합된 공유결합염기의 첨가에 의해 신장된다. 결과적으로 프라이머 신장생성물이 만들어진다. 실질적으로 이미 알려진 모든 DNA 중합효소(역전사효소 포함)들은 DNA 합성을 개시하기 위하여 단일 가닥 주형에 올리고뉴클레오티드의 결합(“프라이밍”)를 필요로 하는 반면, RNA 복제단계 및 전사단계(DNA에서 RNA를 복사)는 일반적으로 프라이머를 필요로 하지 않는다. 적당한 조건하에서 프라이머도 또한 스플라이스 주형으로 작용한다(하기의 “스플라이스 주형”에 대한 정의를 참조).
“스플라이스 주형”은 단일 가닥핵산과 결합하는 올리고뉴클레오티드로서, 표적 핵산의 3′말단을 신장하여 특정 서열을 첨가시키기 위한 주형으로 사용된다. 스플라이스 주형은 표적핵산분자의 3′말단에 충분히 상보적이며, 신장되어 표적핵산과 결합한다. 그런다음, DNA-또는 RNA 의존 DNA 중합효소를 사용하여 스플라이스 주형의 상보적 영역의 5′말단을 주형으로 사용, DNA-또는 RNA 의존 DNA 중합효소를 이용하여 표적 핵산분자를 신장한다. 신장된 분자의 신장생성물은 스플라이스 주형의 5′-말단 서열에 상보적인 3′-말단의 특정서열이다.
스플라이스 주형의 3′말단이 차단되지 않고 표적 핵산에 상보적이라면, 이것은 또한 프라이머로 작용하며 표적핵산분자를 주형으로 사용하여 DNA 중합효소에 의해 신장된다. 스플라이스 주형의 3′말단은 3′-말단 디데옥시뉴클레오티드 또는 표적에 비-상보적인 3′-말단서열을 가지거나 또는 이 분야의 통상의 지식을 가진자에게 알려진 다양한 방법으로 차단될 수 있다.
프라이머 또는 스플라이스 주형은 단일 가닥핵산과 결합하며 DNA 중합효소의 프라이밍 기능을 한다.
3. 표적핵산, 표적서열
“표적핵산”은 증폭될 “표적서열”을 가지며 다일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며 표적서열옆에 증폭하지 않을 다른 서열을 가질수 있다.
“표적서열”이란 용어는 증폭될 표적핵산의 특정 핵산서열을 의미한다. “표적서열”은 본발명의 단게동안 올리고뉴클레오티드(프라이머 및/ 또는 스플라이스 주형)가 결합하는 결합서열을 가진다. “표적서열”이 처음부터 단일가닥인 곳에서는 “표적서열”의 용어는 표적핵산에 존재하는 표적서열에 상보적인 서열을 의미한다. “표적서열”이 처음부터 이중가닥인 곳에서는 “표적서열”은 (+) 및 (-)가닥 모두를 의미한다.
4. 프로모터/ 프로모터 서열
“프로모터 서열”은 핵산에 결합하기 위하여 DNA-의존 RNA 중합효소(“전사효소”)에 의해 단일가닥으로 인식되어지는 특정 핵산서열이며 특정부위에서 RNA 전사를 개시한다. 결합하기 위해서는 이 전사효소는 일반적으로 프로모터 서열 및 그 상보가닥으로 이루어진 영역의 이중가닥 DNA를 필요로 한다; 주형 영역(전사될 서열)은 이중가닥일 필요는 없다.
개의 DNA-의존 RNA 중합효소는 프로모팅 전사에서 효율성이 현저하게 다양한 많은 상이한 프로모터 서열을 인식한다. 전사개시를 위하여 프로모터 서열에 RNA 중합효소가 결합될때 이 프로모터 서열은 전사되는 서열의 일부가 아니다. 따라서 생성된 RNA 전사체는 이 서열을 포함하지 않는다.
5. DNA-의존 DNA 중합효소
“DNA-의존 DNA 중합효소”는 DNA 주형으로부터 상보적 DNA 복사체를 합성하는 효소이다. 그 예로는 E. Coli로부터의 DNA 중합효소 I 및 박테리오 파아지 T7 DNA 중합효소들이 있다. 알려진 모든 DNA-의존 DNA 중합효소는 합성을 개시하는 상보적 프라이머를 필요로 한다. 적당한 조건하에서 DNA-의존 DNA 중합효소는 RNA 주형으로부터 상보적 DNA 복사체를 합성한다.
6. DNA-의존 RNA 중합효소(전사효소)
“DNA-의존 RNA 중합효소” 또는 “전사효소”는 프로모터 서열(대개 이중가닥)을 가지는 이중가닥 또는 부분적 이중가닥 DNA 분자로부터 RNA 복사체를 다수 합성하는 효소이다. RNA 분자는 프로모터의 바로 하류의 특정부위에서 시작하여 5′→3′방향으로 합성된다. 전사효소의 예로는 E. Coli로부터의 DNA-의존 RNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7, T3 및 SP6이 있다.
7. RNA-의존 DNA 중합효소(역전사 효소)
“RNA-의존 DNA 중합효소”또는 “역전사 효소”는 RNA 주형으로부터 상보적 DNA 복사체를 합성하는 효소이다. 알려진 모든 역전사효소도 또한 DNA 주형으로부터 상보적 DNA 복사체를 만들 수 있는 능력을 가진다. RNA 및 DNA 주형 모두에 합성을 개시하는데 프라이머가 필요하다.
8. RNAse H
“RNAse H”는 RNA:DNA 이중가닥의 RNA 부분을 분해하는 효소이다. RNAse H는 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 대부분의 역전사효소는 정상적으로 중합효소활성 이외에 RNAse H 활성을 가진다. 그러나 다른 출처원의 RNAse H는 연관된 중합효소 활성이 없어도 유용하다. 분리는 RNA:DNA 복합체로부터 RNA를 분리시킨다. 한편, RNAse H는 단순히 여러위치의 RNA를 절단하여 RNA 부분을 녹여내거나 효소로 하여금 RNA 부분을 풀어 헤치도록(unwind)한다.
9. +/- 가닥
핵산합성의 명칭은 핵산이중나선의 두 상보가닥을 지칭하는 용어를 채택하여 분류 및 단순화한다. 관례상, 단백질 또는 구조 RNA을 생산하는데 사용되는 서열을 코드하고 있는 가닥을 (+)가닥으로 명명하며 그 상보가닥을 (-)가닥으로 명명한다.
대부분의 경우에 양가닥은 모두 기능적이며 하나에 (+) 및 다른 하나에 (-)의 명칭을 부여하는 것은 임의적이다. 그럼에도 불구하고 이 용어는 핵산의 서열방향을 표시하는데 매우 유용하며, 본 명세서에서 이와같은 목적으로 사용된다.
10. 혼성화, 혼성
“혼성”또는“혼성화”용어는 왓슨- 크릭 염기이중을 통하여 복합체를 형성하는 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열 사이의 복합체 형성을 의미한다. 프라이머(또는 스플라이스 주형) 이 표적(주형)과 혼성화하는 것에서는 DNA 합성을 개시하는 DNA 중합효소에 의해 요구되는 프라이밍 기능을 수행하기에 충분히 안정화 된다.
11. 프라이머 서열
본 명세서에서 언급되는 프라이머서열은 다음과 같은 것이 제시된다.
HBV 영역 2프라이머
12. 특이성
서열 및 분석 조건에 따라 좌우되는, 표적 및 비- 표적 서열을 구별할 수 있는 능력을 기술하는 핵산서열의 특징.
[도면의 간단한 설명]
제1(a)도 내지 제1(o)도는 본 발명의 일반적 방법을 나타낸다.
제2(a)도 내지 제2(e)도는 예비단계 I로 인용되는 본발명의 구체예를 나타낸다.
제3도는 예비단계 II로 언급되는 본 발명의 구체예를 나타낸다.
제4(a)도 내지 제4(d)도는 개선된 증폭방법을 나타낸다.
제5도는 AMV 및 MMLV 및 E. Coli로부터의 RNAse H가 특정 RNA 절단부위를 가진다는 가설을 테스트한 실험 결과를 보여준다.
제6도는 증폭동안32P 표지 프라이머의 통합 결과를 보여준다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명에 따라서 특정 핵산표적서열의 검출 및/또는 정량화분석에 사용하기 위한 특정 핵산표적서열의 신규 증폭방법 및 구성물 또는 다양한 목적에 사용하기 위하여 특정 표적서열의 DNA 및/ 또는 RNA 복사체를 다량 제조하기 위한 신규 방법 및 구성물이 제공된다.
I. 일반적 방법
바람직한 견지에서, 본발명은 RNA 표적서열의 DNA 및 RNA 복사체를 다량 합성하기 위한 자동촉매적 증폭방법을 제공한다. 표적핵산은 증폭할 표적서열을 포함한다. 표적서열은 표적핵산에서 프라이머, 스플라이스 주형 및/또는 중성 표적 핵산말단에 의해 양끝이 한정되어지는 영역이며 (+) 및 (-)가닥을 포함한다.
한편, 본발명은 올리고뉴클레오티드/표적 서열 복합체가 형성되며 DNA 합성이 개시되는 조건하에서 RNA 표적서열로 이루어진 표적핵산을, 복합체를 형성하는 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 복합체화 서열을 가지며 RNA 중합효소의 프로모터 서열을 포함하는 복합체와 서열의 5′서열을 선택적으로 가지는 제1 프라이머로 이루어진 제1 올리고뉴클레오티드로 처리하는 단계로 구성된다. 제1 올리고뉴클레오티드도 역시 프라이밍 서열의 다른 5′서열을 가지고 있다. 제1 프라이머의 3′-말단은 RNA를 주형으로 사용하는 신장 반응에서 적당한 DNA 중합효소에 의하여 신장되어 RNA 주형에 상보적인 제1 DNA 프라이머 신장생성물을 생기게 한다. RNA 주형을 선택적으로 분해하는 효소를 사용하여 RNA주형으로부터 제1 프라이머 신장 생성물을 (적어도 부분적으로) 분리한다. 적당한 효소로는 RNA-DNA 복합체의 RNA 가닥에 선택적으로 작용하는 효소들이며 RNAse H로 구성되는 효소들이다. 비록 일부 역전사효소들이 RNAse H 활성을 가진다하더라도 E. Coli RNAse H와 같은 외래성 RNAse H를 첨가하는 것이 바람직하다.
단일 가닥 제1 프라이머 신장생성물을 올리고뉴클레오티드/표적 서열 복합체가 형성되며 DNA 합성이 개시되는 조건하에서, 복합체를 형성할 제1 프라이머 신장생성물에 포함된 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 복합체화 서열을 가지는 제2프라이머 또는 스플라이스 주형으로 이루어진 제2 올리고뉴클레오티드로 처리한다. 제1 프라이머가 프로모터를 가지고 있지 않다면, 제2 올리고뉴클레오티드는 RNA 중합효소의 프로모터를 포함하는 복합체화 서열의 5′서열을 가지는 스플라이스 주형이다. 선택적으로 스플라이스 주형은 3′-말단이 차단될 수 있다. 제2 올리고뉴클레오티드 및/또는 프라이머 신장생성물의 3′-말단은 DNA 신장반응에서 신장되어 RNA 중합효소의 주형을 만들게 된다. 제조된 RNA 복사체 또는 전사체는 더 이상의 조작단계없이 자동촉매적으로 복제될 수 있다.
올리고뉴클레오티드가 스플라이스 주형으로 작용하는 곳에서는 프라이머 기능은 필요하지 않다. 따라서, 스플라이스 주형의 3′-말단은 차단 또는 차단되지 않을수 있다. 얻어진 반응혼합물(즉, 한정된 3′-말단, 제1 프라이머 및 차단 또는 차단되지 않은 스플라이스 주형으로 제1 프라이머 신장생성물을 제조하도록 한 RNA 표적)은 많은량의 RNA 및 DNA를 자동촉매적으로 합성하는 작용을 한다.
본발명의 다른 측면에서는 제1 및 제2 올리고머 모두가 프라이머이다. 제1 프라이머는 RNA 중합효소의 프로모터를 포함하는 복합체화 서열의 5′서열을 가지며 다른 서열도 포함할 수 있다. 제2프라이머 역시 RNA 중합효소의 프로모터를 포함하는 복합체화 서열의 5′서열을 가지며 선택적으로 다른 서열을 포함할 수 있다. 양 프라이머가 프로모터 서열을 가지는 곳에서는 클로닝과 같은 다른 목적으로 제2프로모터를 도입하지 않는다면 동일한 RNA 중합효소에 의하여 인식되는 것이 바람직하다. 제2프라이머의 3′-말단은 신장반응에서 적당한 DNA 중합효소에 의해 신장되어 제1 프라이머 신장생성물에 상보적인 제2 DNA 프라이머 신장생성물을 생산한다.
제1 프라이머는 표적 서열의 한쪽 말단을 한정하고 있으며, 이제 제2프라이머가 다른 말단을 한정한다는 사실을 주목하기 바란다. 제2신장반응의 이중-가닥 생성물은 RNA 중합효소에 의한 RNA 제조의 적당한 주형이다. 제2프라이머도 또한 프로모터 서열을 가지고 있다면, 이중가닥주형의 양가닥에 상보적인 전사체가 자동촉매반응동안에 제조될 것이다. RNA 전사체는 이제 표적 핵산과 다른 말단을 가지나 제1 프라이머와 제2프라이머 사이의 서열은 그대로 남아있다. 이렇게 제조된 RNA 전사체는 더 이상의 조작단계없이 상기 시스템에서 자동적으로 재순환된다. 따라서 본반응은 자동촉매이다.
제2프라이머의 복합체화 서열이 제1 프라이머 신장 생성물의 3′-말단과 결합한후, 제2프라이머는 스플라이스 주형으로 작용하며 제1 프라이머 신장생성물이 신장되어 프라이밍 서열의 5′쪽 제2 프라이머의 일부 서열을 제1 프라이머 신장생성물에 첨가하게 된다(예컨대 도면 1E 및 1G 참조). 제2프라이머가 스플라이스 주형으로 작용하여 복합체화 서열의 5′쪽 프로모터서열을 포함한다면, 프로모터 서열을 첨가하는 제1 프라이머 신장생성물의 신장은 RNA 중합효소가 부가 주형을 생산하게 되며 이 주형은 전사되어 어느 한가닥의 RNA 복사체를 제조하게 된다(도면 1E 및 1G 참조). 두 프라이머에 프로모터를 삽입하면 합성될 표적서열의 복사체수를 증가시키게 된다.
본 발명의 일반적 방법의 또다른 측면에는 프라이머를 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드 및 스플라이스 주형을 포함하는, 그 자체로서는 프라이머로 작용할 수 있거나 없는(즉, 프라이머 신장반응에서 그 자체로 신장되지 않는) 제2 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 포함된다. 일반적 방법의 이러한 측면은 올리고뉴클레오티드/표적 서열 복합체가 형성되며 DNA 합성이 개시되는 조건하에서, RNA 표적서열을 포함하는 표적핵산을 복합체를 형성하는 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 복합체화 서열을 가지는 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머로 처리하는 것을 포함한다. 제1 프라이머는 프로모터를 포함하며 기타 복합체화 서열의 5′서열을 가진다. 제1 프라이머의 3′말단은 RNA를 주형으로 사용하는 신장반응에서 적당한 DNA 중합효소에 의하여 신장되어 RNA 주형에 상보적인 제1 프라이머 신장생성물을 만들게 된다. RNA 주형을 선택적으로 분해하는 효소를 이용하여 RNA 주형으로부터 제1 프라이머 신장 생성물을 분리한다. 적당한 효소로는 RNA-DNA 복합체의 RNA 가닥에 선택적으로 작용하는 효소이며 RNAse H 활성을 포함하는 효소이다. 비록 일부 역전사효소가 RNAse H 활성을 포함하더라도 E. Coli RNAse H와 같은 외래성 RNAse H를 첨가하는 것이 바람직하다. 단일가닥 제1 프라이머 신장생성물을 올리고뉴클레오티드/표적서열 복합체가 형성되며 DNA 합성이 개시되는 조건하에서, 복합체를 형성하는 프라이머 신장생성물의 3′-말단에 충분히 상보적 복합체화 서열 및 RNA 중합효소의 프로모터를 포함하는 복합체화 서열의 5′서열을 가지는 스플라이스 주형으로 처리하였다. 스플라이스 주형의 3′-말단은 차단되거나(예컨대 디데옥시뉴클레오티드의 첨가) 표적 핵산에 비상보적이거나(따라서 프라이머로 작용하지 않는다) 아니면 비- 차단된다. 제1 프라이머 신장생성물의 3′말단은 DNA 신장반응에서 적당한 DNA 중합효소를 사용하여 신장되어 프로모터를 포함하는 복합체화 서열의 5′쪽 스플라이스 주형의 서열에 상보적인 서열이 제1 프라이머 신장생성물의 3′말단에 첨가된다. 3′말단이 차단되지 않을 경우 스플라이스 주형은 신장되어 제1 프라이머 신장생성물에 상보적인 제2프라이머 신장생성물을 형성한다. 스플라이스 주형(차단 또는 차단되지 않음)과의 신장반응의 생성물은 프로모터를 인식하는 RNA 중합효소를 이용한 RNA 합성의 주형으로 작용할 수 있다. 상기에 언급되었듯이 생성된 RNA 전사체는 더 이상의 조작단계없이 상기 시스템에서 자동적으로 재순환된다. 따라서 반응은 자동촉매적이다.
일부 구체예에서 증폭될 표적 서열은 사용된 프라이머(또는 스플라이스 주형)에 상보적인 특정서열이 위치함으로써 말단이 한정된다. 다른 구체예에서 표적 서열은 사용된 프라이머분자에 상보적인 특정서열이 위치함으로써 한쪽 말단이 한정되며 특이적 제한 엔도큐클레아제 또는 다른 적당한 방법에 의하여 절단되는 천연적인 3′-말단을 가지는 특정서열이 위치함으로써 반대쪽 말단이 한정된다. 다른 구체예에서 표적서열은 하나 또는 그 이상의 특이적 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 특정서열이 위치함으로써 한정된다.
본발명의 바람직한 구체예에서 RNA 표적서열을 결정한 다음, RNAse H 분해가 이중가닥의 RNA 부위의 어디에 절단 또는 제거를 유발할 것인지를 분석 결정하였다. AMV 역전사효소와 MMLV 역전사효소에 존재하는 RNAse H, E. Coli RNAse H 또는 다른 출처원 및 이들의 조합에 의하여 표적 서열의 RNAse 분해효과를 측정하기 위한 분석을 실시하였다.
프라이머 군을 선택하는데 있어서는, 반응혼합물에 존재하는 RNAse H에 의해 실질적으로 분해되지 않는 RNA 부위와 혼성화할 수 있도록 프라이머의 하나를 선택하는 것이 바람직하다. 실질적으로 분해가 되어진다면, 프라이머 영역의 RNA 가닥의 절단은 RNA 합성의 개시를 방해하며, 프라이머의 신장을 저해한다. 따라서 RNAse H가 RNA에 작용될 때 프라이머 신장생성물의 형성을 방해하는 실질적인 분해가 일어나지 않는 위치에 있는, RNAse H의 서열과 혼성화하는 프라이머를 선택하는 것이 바람직하다.
프로모터- 프라이머 혼성화 부위는 RNA 가닥의 충분한 분해가 일어나 프로모터- 프라이머가 혼성화하는 DNA 가닥의 부위에 혼성화된 RNA 가닥의 부위가 제거되도록 선택되어진다. 전형적으로 RNA 일부분만이 RNAse H 분해를 통하여 RNA:DNA 이중체로부터 제거되며 RNA 가닥의 실질적인 부분은 이중체에 남아있다.
RNA 합성을 위한 프로모터-포함 이중가닥 생성물의 제조는 제4도에 도시되어 있다. 제4도에 나타나있듯이, 표적 RNA 서열은 반응 혼합물에 존재하는 RNAse H에 의해 실질적으로 분해되지 않는 RNA 가닥의 영역과 혼성화하기 위해 선택된 프라이머에 혼성화한다. 그다음 프라이머은 신장되어 RNA 가닥에 상보적인 DNA 가닥을 형성한다. 그런다음 RNA 가닥은 반응혼합물에 존재하는 RNAse H에 의해 여러위치에 절단 또는 분해된다. 이 절단 또는 분해는 반응단계중의 이때 또는 기타 다른 시기에도 일어날 수 있다. 그런후에 중요한 절단 또는 분해가 일어난 영역의 DNA 가닥으로부터 RNA 단편이 해리된다. 그 다음 프로모터- 프라이머가 RNA 가닥이 실질적으로 분해되고 DNA 가닥으로 부터 분리되는 곳인 DNA 가닥의 3′말단에 혼성화한다. 다음 DNA 가닥은 신장되어 이중가닥 DNA 프로모터 서열을 형성하여 RNA 합성의 주형을 만들게 한다. 이 주형은 이중가닥-DNA 프로모터 서열을 가지고 있는 것으로 보인다. 이 주형을 RNA 중합효소로 처리할 경우 다수의 RNA 가닥이 형성된다.
RNAse H로 이루어진 RNA 분해의 정확한 특성은 밝혀지지 않았더라도 RNA:DNA 혼성체의 RNA 가닥상의 RNAse H 분해의 결과는 혼성체로부터 작은 RNA 단편의 해리를 초래한다.
또한 작은 단편이 제거되는 영역에서 RNAse H 분해후 DNA에 복합체를 형성하는 프로모터- 프라이머가 선택될 수 있는 것으로 보인다.
제1 및 2도면은 보시는 바와같이 RNAse H 분해후 남아있을 RNA는 나타내지 않는다. 이 도면들이 일반적으로 DNA:RNA 이중체로부터 완전히 RNA을 제거한 것을 나타낼지라도 바람직한 조건하에서는 제2 도면에 도시되었듯이 부분적 제거만이 일어난다. 제1(a) 도면을 참조로 하여 제1도면의 RNA 가닥의 실질적 부분이 분해되지 않고 남아있어 제2프라이머의 혼성화를 방해하거나 또는 프로모터 서열에 상보적인 DNA 가닥을 제조하기 위한 혼성화된 제2프라이머의 신장을 방해한다면, 제시된 반응기작은 일어나지 않을 것으로 보인다. 그러나, 본명세서에 밝혀진 합성원리에 근거하여 이 분야에서 통상의 지식을 가진 사람이 본 발명의 지시에 따라 관례적인 수정을 함으로서 효율적이고 효과적인 RNA 증폭단계를 제공할 수 있다.
본 명세서의 기술 및 제1(a) 내지 10도로부터 알 수 있듯이, 본발명의 방법은 선택적인 변형을 포괄한다.
제1(a)도는 표적핵산이 표적서열에 3′부가서열을 가지는 본발명에 따른 방법을 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 표적서열의 말단에 3′부가서열을 가지는 표적핵산(RNA)의 표적 서열의 3′말단부와 복합체를 형성하는 복합체화 서열의 5′쪽에 프로모터를 가지는 제1 프라이머를 포함한다. 제2 올리고뉴클레오티드는 제1 프라이머 신장생성물의 3′말단과 함께 제1 프라이머 신장생성물의 3′말단부와 복합체를 형성하는 제2프라이머를 포함한다.
단계(1)에서, 제1 프라이머는 표적서열의 3′부가서열에 기인하여 스플라이스 주형으로 작용할 수 없다. 그러나 단계(10)에서 제2프라이머 신장생성물이 표적서열의 3′부가서열을 가지지 않기 때문에 제1 프라이머는 스플라이스 주형으로 작용할 수 있다.
제1(b)도는 표적핵산(RNA)이 표적서열의 5′및 3′모두에 부가서열을 가지는 본발명에 따른 방법을 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 제1(a)도에서 기술된 것과 같다. 제2 올리고뉴클레오티드는 표적서열의 3′에 부가서열을 가지는 제1 프라이머 신장생성물의 표적서열의 3′말단부에 복합체를 형성하는 프라이머를 포함한다.
제1(c)도는 한정된 5′-및 3′-말단 표적서열의 5′또는 3′어느 곳에서도 부가서열을 가지지 않는 표적 핵산(RNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 제1(a) 및 1(b)도에 도시된 것과 같으나, 표적 핵산의 3′-말단과 결합하기 때문에 단계1에서의 프라이머 및 스플라이스 주형 모두로 작용한다. 제2 올리고뉴클레오티드는 제1(a)도에 도시된 것과 같다.
제1(d)도는 한정된 3′말단 즉 표적서열의 3′에 부가서열을 가지지 않으나 5′에 부가서열을 가지는 표적 핵산(RNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 제1(c)도에 도시된 것과 동일하며, 프라이머 및 스플라이스 주형 모두에 작용한다. 제2 올리고뉴클레오티드는 제1(b)도에 도시한 것과 같다.
제1(e)도는 한정된 5′말단 그러나 표적서열의 3′에 부가서열을 가지는 표적핵산(RNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 제1(a)도에 기술된 것과 같다. 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 프라이머를 포함하는데 이것은 제1 프라이머 신장생성물의 3′-말단과 복합체를 형성하기 때문에 스플라이스 주형도 포함한다. 또한 제2 올리고뉴클레오티드는 복합체화 서열의 5′에 프로모터를 가진다.
제1(f)도는 표적서열의 5′및 3′양쪽에 부가서열을 가지는 표적핵산(RNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 제1(e)도에 도시한 것과 같다. 제2 올리고뉴클레오티드는 제1 프라이머 신장생성물이 표적서열의 3′에 부가서열을 가지기 때문에 단계(4)에서 스플라이스 주형으로 작용할 수 없다는 점만 제외하고 제1(e)도에 도시한 것과 같다.
제1(g)도는 한정된 5′및 3′말단을 가지는 즉 표적서열 옆에 다른 서열을 가지지 않는 표적 핵산(RNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 제1(c)도에 도시된 것과 같으며 제2 올리고뉴클레오티드는 제1(e)도에 도시된 것과 같다. 표적서열이 부가서열을 가지지 않기 때문에 두 올리고뉴클레오티드는 스플라이스 주형으로 작용한다.
제1(h)도는 한정된 3′말단을 가지는 즉 표적서열의 3′에는 서열을 가지지 않지만 5′는 부가서열을 가지는 표적핵산(RNA)을 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 제1(c) 및 1(g)도에 도시한 것과 같으며 프라이머 및 스플라이스 주형 모두로 작용한다. 제2 올리고뉴클레오티드는 제1(f)도에 도시한 것과 같다.
제1(i)도는 한정된 5′말단을 가지는 즉 표적서열의 5′에 부가서열을 가지지 않지만 3′에 부가서열을 가지는 표적핵산(RNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 프로모터를 가지지 않는 프라이머를 포함한다. 제2 올리고뉴클레오티드는 복합체화 서열의 5′에 프로모터를 가지는, 차단되지 않은 스플라이스 주형을 포함한다.
제1(j)도는 한정된 5′및 3′말단을 가지며 표적서열옆에 서열을 가지지 않는 표적핵산(RNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 프로모터를 가지지 않은 프라이머를 포함한다. 제2 올리고뉴클레오티드는 제1(i)도에 도시된 것과 같다.
제1(k)도는 표적 서열의 5′에 부가서열을 가지지 않지만 3′에 부가서열을 가지는, 한정된 5′말단을 가지는 표적핵산(RNA)를 도시한다. 제2 올리고뉴클레오티드는 복합체화 서열이 5′에 프로모터를 가지지만 3′말단은 차단된 스플라이스 주형을 포함한다.
제2 올리고뉴클레오티드는 프라이머로 작용할 수 있다.
제1(l)도는 한정된 3′및 5′말단을 가지며 표적서열옆에 부가서열을 가지지않는 표적핵산(RNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 프라이머 및 스플라이스 주형 양쪽으로 작용한다. 제2 올리고뉴클레오티드는 차단된 스플라이스 주형이며 제1(k)도에 도시된 것과 같다.
제1(m)도는 표적서열의 5′에 부가서열을 가지지 않으나 3′에 부가서열을 가지는 한정된 5′-말단을 가지는 표적핵산(RNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 제1(i)도에 도시된 프라이머이다. 제2 올리고뉴클레오티드는 제1(l) 및 1(k)도에 도시된, 프로모터를 가지는, 차단된 스플라이스 주형이다.
제1(n)도는 표적서열옆에 부가서열을 가지지 않는, 한정된 5′및 3′서열을 가지는 표적핵산(RNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 제1(i)도에 도시된 프라이머이다. 제2 올리고뉴클레오티드는 제1(l) 및 1(k)도에 도시된 프로모터를 가지는, 차단된 스플라이스 주형이다.
제1(n)도는 표적서열에 부가서열을 가지지 않는, 한정된 5′및 3′서열을 가지는 표적핵산(RNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 제1(j)도에 도시된 프로모터가 없는 프라이머를 포함한다. 제2 올리고뉴클레오티드는 제1(k), 1(l) 및 1(m)도에 도시된 프로모터를 가지는, 차단된 스플라이스 주형을 포함한다. 제10도는 표적서열의 5′에 부가서열을 가지지 않지만 3′에 부가서열을 가지는, 한정된 5′말단을 가지는 표적핵산(RNA)를 도시한다. 하나의 올리고뉴클레오티드가 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 양쪽으로 사용된다. 올리고뉴클레오티드는 단계(1)에서 나타나듯이 표적서열의 3′-말단 영역에 결합하는 3′-프라이머 서열을 가지며, 단계(4)에서 나타나듯이, 프라이머 신장 생성물의 3′-말단과 복합체를 형성하는 프로모터를 가지는 5′스플라이스 주형 서열을 가진다.
본발명의 방법은 온도, 이온세기 및 pH 등과 같은 반응조건을 반복적으로 조작하지 않고 표적 핵산서열의 복사체를 다수 자동촉매적으로 합성하는 방법을 제공하는 것으로;
(a) RNA 표적서열을 포함하는 표적핵산, 두 올리고뉴클레오티드(복합체를 형성하는 RNA 표적서열(예컨대 (+) 가닥)의 3′말단 영역에 충분히 상보적인 복합체화 서열을 가지는 제1 올리고뉴클레오티드 및 복합체를 형성하는 상보가닥(예컨대 (-)가닥)의 표적서열의 3′-말단 영역에 충분히 상보적인 복합체화 서열을 가지는 제2 올리고뉴클레오티드, 여기서 제1 올리고뉴클레오티드는 프로모터를 포함하는 복합체화 서열의 5′에 선택적으로 서열을 가지는 제1 프라이머를 포함하며 제2 올리고뉴클레오티드는 스플라이스 주형 또는 프라이머를 포함한다)를 반응 혼합물에 혼합시키는 단계를 포함한다. 단, 제1 올리고뉴클레오티드가 프로모터를 가지지 않는다면 제2 올리고뉴클레오티드는 RNA 중합효소, DNA 중합효소의 프로모터, RNA-DNA 복합체의 RNA 가닥을 선택적으로 분해하는 효소활성(예컨대 RNAse H) 및 프로모터를 인식하는 RNA 중합효소를 포함하는 프라이밍 서열의 5′에 서열을 가지는 스플라이스 주형이라는 전제 조건에 따른다. 반응혼합물의 구성요소는 단계적으로 또는 한번에 혼합할 수도 있다. DNA 프라이밍 및 핵산합성 조건(리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 데옥시리보뉴클오티드 트리포스페이트를 포함하는)를 포함하여 올리고뉴클레오티드/표적서열이 형성하는 조건하에서, 표적서열의 복사체를 다수 생산할수 있는 충분한 시간동안 반응 혼합물을 배양한다. 반응은 다행스럽게도 증폭반응단계 동안에 반응 조건의 수정 또는 조작을 필요로 하지 않고, 구성효소와 같은 반응 구성요소의 안정성을 유지하기에 적당한 조건하에서 일어난다. 따라서 반응은 실질적으로 등온인 조건하에서 일어나며 실질적으로 일정한 이온 세기 및 pH를 포함한다.
본 반응은 제1 DNA 신장반응에 의하여 생성된 RNA-DNA 복합체를 분리하기 위한 변성단계를 필요로 하지 않는다. 이러한 단계는 반응혼합물의 온도를 실질적으로 증가시키거나(일반적으로 분위기 온도에서 80℃ 내지 105℃ 까지) 이온세기를 감소시키거나(일반적으로 10X 또는 그 이상) 또는 pH를 변화시키는(보통 10 또는 그 이상 pH를 증가) 것과 같은 반응조건의 조작을 필요로 한다. 이와같은 반응조건의 조작은 종종 효소활성에 나쁜 영향을 미치며 효소의 부가적 첨가를 요하며 또한 핵산합성을 계속하기에 적당한 반응조건으로 돌아가기 위하여 반응혼합물이 또다른 조작을 필요로 한다. 적당한 DNA 중합효소는 역전사효소이다. 특히 적당한 DNA 중합효소는 AMV 역전사효소 및 MMLV 역전사 효소이다.
본발명의 방법에 사용된 프라이머 및/또는 스플라이스 주형에 통합되기에 적당한 프로모터 또는 프로모터 서열은 서열을 인식하고 결합하여 RNA 전사체를 제조하는 전사단계를 개시하는 RNA 중합효소에 의해 특이적으로 인식되는 핵산서열(자연적으로 생기던지, 합성 생산되던지 또는 제한절단의 생성물이던지)이다. 이 서열은 분해 단계에 증가된 안정성 또는 감응성을 부여하거나 전사효율을 증가시키는 RNA 중합효소의 실질적 인식부위를 넘어서 펼쳐져 있는 뉴클레오티드 염기를 선택적으로 포함한다. 개시서열을 인식할 수 있는 밝혀진 유용한 중합효소의 프로모터 서열은 이용하기에 특히 적당하다. 전형적으로 밝혀진 유용한 프로모터는 박테리오파아지 T3, T7 또는 SP6 등과 같은 일부 박테리오파아지 중합효소 또는 E. Coli로부터의 중합효소에 의해 인식되어지는 것들이다.
본발명의 방법에 사용하기에 적당한 일부 역전사효소가 AMV 역전사효소와 같은 RNAse H 활성을 가지고 있다고 하더라도 E. Coli RNAse H와 같은 외래 RNAse H를 첨가하는 것이 더욱 바람직하다. 실시예에서 보여지듯이 외래 RNAse H의 첨가가 필요하지 않더라도 어떤 조건하에서 AMV 역전사효소에 존재하는 RNAse H 활성은 반응혼합물에 존재하는 구성요소에 의해 저해될 수도 있다. 이 경우에 외래 RNAse H의 첨가가 바람직하다. 비교적 많은 양의 이질 DNA가 반응 혼합물에 존재하는 경우에서는 AMV 역전사 효소의 원래의 RNAse H 활성이 다소 저해되며(예컨대 실시예 8 참조) 따라서 생성되는 표적서열의 복사체수가 감소하게 된다. 표적서열이 단지 적은 양의 존재하는 DNA를 포함하는 경우에서는(예컨대 샘플이 상당한 양의 이질 DNA를 함유하는 경우) 외래 RNAse H를 첨가하는 것이 바람직하다. 이와 같은 바람직한 RNAse H 중의 하나는 E. Coli RNAse H이다. 이와같은 외래 RNAse H의 첨가는 많은 양의 DNA에 의해 야기되는 저해현상을 극복할 수 있는 것 같다(에컨대 실시예 8 참조).
이러한 방법에 의하여 생성된 RNA 전사체들은 상술한 반응단계에 따라서 표적 서열의 복사체를 추가로 생성하기 위한 주형으로 작용할 수 있다. 시스템은 자동촉매적이며 본발명의 방법에 의한 증폭단계는 온도, pH, 이온세기 등과 같은 반응조건을 반복적으로 변화 또는 수정시킬 필요가 없이 자동촉매적으로 일어난다. 본방법은 고가의 열사이클 장치를 필요로 하지 않으며, 또한 증폭반응단계 동안에 다른 시약 또는 효소의 부가적 첨가를 필요로 하지 않는다.
본 발명의 방법은 임상, 환경, 범죄수다 및 유사 샘플에서 특정 핵산 표적서열을 검출 및/또는 정량화하기 위한 분석 성분으로서 또는 다양한 사용을 위한 특정 표적서열 DNA 및/또는 RNA의 복사체를 다수 제조하기 위하여 사용될 수 있다.
전형적인 분석에서 증폭될 샘플을 염, 마그네슘, 트리포스페이트, 프라이머 및/또는 스플라이스 주형, 디티오트레이톨 및 스퍼미딘을 함유하는 중화용액으로 혼합한다. 핵산의 2차 구조를 변성하기 위하여 반응을 선택적으로 2분간 100℃ 부근에서 배양한다. 냉각후, 표적이 한정된 3′말단이 없는 DNA 표적이라면 역전사효소를 첨가하고 반응혼합물을 약 42℃에서 12분간 배양한다. 반응을 다시 100℃ 부근에서 변성하고 이번에는 DNA 주형으로 부터 프라이머 신장 생성물을 분리한다. 냉각후, 역전사효소, RNA 중합효소 및 RNAse H을 첨가하고 반응을 37℃에서 2 내지 4시간동안 배양한다. 그다음, 생성물을 변성하여 반응을 분석하고 프로브 용액을 첨가하고 60℃에서 20분간 배양하고, 혼성화하지 않은 프로브의 표지를 선택적으로 가수분해하기 위하여 용액을 첨가하고 60℃에서 6분간 반응을 배양하고 광도계에서 잔여 화학형광표지를 측정한다.
상기 언급된 HPA 사용방법은 본 명세서에 합체된다. 생성물 측정을 위한 다른 몇몇 방법은 용액내-프로브 혼성화 방법 대신에 사용될수 있다.
표적이 한정된 3′-말단을 가지고, 올리고뉴클레오티드의 하나가 복합체를 형성할 3′말단에 충분히 상보적인 복합체화 서열과 복합서열의 5′의 프로모터서열을 가지는 스플라이스 주형이고 또는 표적이 RNA인 경우에는, 전형적인 분석은 표적을 상술한 중화용액으로 혼합하는 단계 및 2차구조를 변성하는 단계를 포함한다. 냉각후, 역전사효소, RNA 중합효소, 바람직하다면 RNAse H를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 2 내지 4시간동안 배양하였다. 그다음, 반응을 상술한 대로 분석한다.
II. 예비단계
다음단계는 본발명의 바람직한 방법과 연계하여 선택적으로 사용할 수 있는 예비단계의 몇몇 실시예들이다. 일부 표적핵산은 자동촉매적 증폭단계에 앞서 수정단계를 필요로하기 때문에 이들 단게는 수정단계를 달성하기 전에 사용될 수 있다. 표적핵산(및 표적서열)이 원래 DNA인 경우에는 이들 단계는 일반적방법에 사용하기 위한 표적서열의 RNA 복사체를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 예비단계는 그 자체 반복적이며 그러므로 당연히 중폭방법으로 사용될 수 있다는 사실을 인식하여야 한다.
[예비단계 I]
본방법은 한정된 3′말단을 가지는(단일 가닥) DNA를 포함하는 표적핵산의 표적서열의 RNA 복사체를 제공한다. 예비단계 I는 두개의 핵산 성분을 사용한다; 표적핵산 분자 및 올리고뉴클레오티드 스플라이스 주형. 이 단계는 한정된 3′-말단을 가지는 DNA 표적핵산을 필요로 한다. 원래의 3′-말단이 밝혀지지 않거나 여러 이유에서 만족스럽지 않다면 제한 뉴클레아제를 사용, 다른 서열에 연결하거나 다른 수단을 이용하여 새로운 한정된 3′-말단을 만든다.
다음 기술에서(제2(a) 내지 2(c)도 참조), 표적핵산은 임의적으로 “-” 센스를 가진다. 따라서 스플라이스 주형은 복합체를 형성할 표적에 충분히 상보적이도록 “+”센스를 가진다. 스플라이스 주형은 복합체를 형성할 표적의 3′말단에 충분히 상보적인 결합서열을 가진다. 또한 스플라이스 주형은 RNA 중합효소의 프로모터서열을 포함하는 복합체화 서열의 5′에 서열을 가진다. 스플라이스 주형은 선택적으로 복합체화 서열과 프로모터 사이의 프로모터의 5′및/또는 복합체화 서열의 3′에 다른 서열을 가진다. 또한 스플라이스 주형은 3′말단에 수정을 받아 “차단”되어서 신장반응에서 부가적 뉴클레오티드를 첨가함으로써 신장될 수 없으며 스플라이스 주형으로 작용하는 것외에 프라이머로 작용할 수 없게 된다.
예비단계 I는 두개의 효소활성을 이용한다; DNA- 의존 DNA 중합효소 및 DNA-의존 RNA 중합효소.
올리고뉴클레오티드/표적서열 복합체가 형성되며 DNA 합성이 개시되는 조건하에서 표적핵산을 스플라이스 주형으로 처리한다. 적당한 DNA 중합효소를 이용한 DNA 신장 반응에서, 복합체화 서열의 5′쪽의 스플라이스 주형의 서열에 상보적인 서열을 표적 DNA의 3′말단에 첨가한다. 3′말단이 차단되지 않는다면 스플라이스 주형은 DNA 중합효소의 프라이머로 작용하며 신장되어 프라이머 신장 생성물을 제공한다. 신장반응 생성물 즉 이중가닥 또는 부분적 이중가닥 표적/스플라이스 주형 복합체는 프로모터를 인식하는 RNA 중합효소를 사용한 RNA 전사체 합성을 위한 주형으로 작용한다. 그 다음 RNA 전사체는 일반적 방법에 사용되거나 다음과 같이 RNA의 DNA 복사체를 제조하는데 사용된다.
표적서열(“+” 센스를 가지는)를 포함하는 RNA 전사체를 올리고뉴클레오티드/표적서열 복합체가 형성되고 DNA 합성이 개시되는 조건하에서 복합체를 형성하는 RNA 전사체의 표적서열의 3′말단에 충분히 상보적인 복합체화 서열을 가지는 프라이머(명칭상의 “-”센스를 가짐)로 처리한다. 그다음, RNA 전사체를 주형으로 사용한 신장반응에서 프라이머가 신장되어 표적서열을 가지는 DNA 프라이머 신장 생성물을 생성하게 된다. RNA 분해 또는 변성에 의하여 RNA 전사체로부터 프라이머 표적서열을 분리하며 스플라이스 주형으로 시작하여 사이클을 반복한다.
또한 프라이머는 선택적으로 프라이밍 서열의 5′에 부가서열을 가진다. 또한 스플라이스 주형은 복합체화 서열의 3′에 부가서열을 가진다.
하나의 구체예에서 스플라이스 주형을 포함하는 서열의 3′에 프라이머를 포함하는 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 상기 방법을 한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 실시할 수 있다(예컨대 제2(c)도 참조).
예비단계 I는 제2(a) 내지 2(e)도에 관련하여 더 자세히 기술되어 있다. 제2(a)도는 표적서열의 3′에 부가서열을 가지지 않는 한정된 3′말단을 가지는 표적핵산(DNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 프라이머 및 스플라이스 주형을 모두 포함하며 복합체화 서열의 5′에 프로모터를 가진다.
제2(b)도는 제2(a)도에 도시된 것과 같은 표적핵산(DNA)를 도시한다. 제1 올리고뉴클레오티드는 3′말단이 차단된 스플라이스 주형을 포함하며 따라서 프라이머로 작용할 수 없다.
제2(c)도는 제2(a)도 및 제2(b)도에 도시된 것과 같은 표적 DNA를 도시한다. 제2(c)도는 3′말단에 프라이머 서열의 5′쪽의 스플라이스 주형(프로모터와 같이) 서열을 가지는 하나의 올리고뉴클레오티드의 사용을 도시한다. 따라서 올리고뉴클레오티드는 단계(1) 및 (7)에서 차단된 스플라이스 주형으로 작용하며 단계(4)에서 프라이머(및 스플라이스 주형)로 작용한다.
제2(d)도는 서두(prefatory) 복합체화, 프라이머 신장 및 분리단계(단계 1 및 2)를 수행하여 한정된 3′말단을 가지는 상보적 DNA 표적을 생성하는 표적서열의 3′에 부가서열 및 한정된 5′-말단을 가지는 표적핵산(DNA)를 도시한다. 단계(1) 및 (7)의 올리고뉴클레오티드는 원 표적 DNA(명칭상(+))의 표적서열의 3′말단영역에 복합체를 형성하는 프라이머를 포함한다. 다른 올리고뉴클레오티드(단계(4)와 (10))는 원표적의 상보체의 3′말단과 결합하는 차단되지 않은 스플라이스 주형을 포함한다.
제2(e)도는 서두 복합체화, 신장 및 분리단계(단계(1)와 (2))을 수행하여 한정된 3′말단을 가지는 상보적 DNA 표적을 생성하는 표적서열의 3′에 부가서열 및 한정된 5′말단을 가지는 표적핵산(DNA)를 도시한다. 단계(1)와 (7)의 올리고뉴클레오티드는 원표적 DNA(명칭상(+))의 표적서열 3′말단영역과 복합체를 형성하는 프라이머를 포함한다. 단계(4)와 (10)의 올리고뉴클레오티드는 원표적의 상보체의 표적서열의 3′말단 영역과 복합체를 형성하는 차단된 스플라이스 주형을 포함한다.
표적/스플라이스 주형 복합체가 형성되며 DNA 합성이 개시되는 복합체화 조건하에서 스플라이스 주형을 표적핵산의 3′말단과 복합체화시킨다(단계 1). 적당한 DNA 중합효소를 사용, 표적 핵산의 3′말단을 신장하여 복합체화 서열의 5′쪽의 스플라이스 주형에 상보적인 서열을 첨가한다. 스플라이스 주형의 3′말단이 차단되지 않았고 표적핵산에 충분히 상보적이라면, 스플라이스 주형은 프라이머로 작용하여 스플라이스 주형의 3′말단이 또한 신장될 수 있다(제2(a)도). 얻어진 표적/스플라이스 주형 복합체는 부분적으로 또는 완전히 이중가닥이다(제2(a)도에 대하여 제2(b) 및 2(c)도를 참조). 최소한 이중가닥 영역은 표적핵산과 복합체를 형성하는 프로모터 서열 및 프라이밍 서열을 포함한다.
단계 2의 주형은 적당한 RNA 중합효소에 의해 전사된다. RNA 중합효소는 각 주형단 RNA 복사체를 약 5 내지 1000개 생산한다. 제2(a) 내지 2(c)도에서 생성된 RNA는 명칭상 “+”센스이며 프로모터의 3′말단에서부터 표적 핵산의 5′말단까지의 서열을 포함한다.
단계 3의 RNA 생성물은 표적서열을 자동 촉매적으로 증폭하기 위하여 일반적 방법에 따라서 사용될 수 있거나 또는 선택적으로 결합 및 프라이밍 조건하에서, 복합체를 형성할 RNA의 표적서열의 3′말단 영역에 충분히 상보적인 3′말단에 복합체화 서열을 가지며 선택적으로 복합체화 서열의 5′에 다른 서열을 포함하는 프라이머로 처리될수 있다.
RNA를 주형으로 사용하여 프라이머 신장반응에서 RNA-의존 DNA 중합효소에 의해 프라이머를 신장한다. 이 단계는 적어도 부분적인 이중가닥의 생성물을 생산하며 RNAse H(단계 5) 또는 변성과 같은 다른 방법등의 RNA 영역분해에 의하여 차후의 합성을 위한 적어도 부분적 단일 가닥으로 만들어져야만 한다.
단계 6에서 생산된 DNA는 단계 1를 위한 표적분자로 사용될 수 있으며 상술한 스플라이스 주형으로 처리하여 더 많은 RNA 및 DNA를 생산한다. 이들 단계들은 바람직한 증폭 수준을 생성하기 위하여 반복될 수 있다. 또한 적당한 스플라이스 주형 및 프라이머를 선택함으로써, 이 신규의 표적분자(단계 6)은 원래 분자와는 다른 말단을 가질 수 있음을 주지하여야 한다.
더욱이, RNA로부터의 프라이머 신장 생성물이 복합체화 서열의 5′에 프로모터 서열을 가진다면, “+”센스의 복합체화 서열 및 선택적으로 복합체화 서열의 5′에 다른 서열을 가지는 제2프라이머는 RNA 중합효소의 이중가닥 주형을 생산하기 위하여 신장된 프라이머 생성물을 복사하는데 사용될 수 있다. 그렇게 생성된 주형은 RNA 중합효소에 의해 본명세서의 단계에 따라 더욱 증폭되거나 또는 일방적 방법에 따라 증폭되는“-”센스 RNA를 제조하게 된다.
[예비단계 II]
예비단계 II는 자동촉매적 형식이 발생되는 방법에 있어 예비단계 I과 상이하다. DNA 표적핵산은 한정된 3′말단을 가질 필요가 없다. 한편으로는 복합체화 서열의 5′에 프로모터 서열을 포함하는 프라이머는 RNA 중합효소의 주형에 프로모터 서열을 도입하기 위하여 스플라이스 주형 대신에 사용된다. 프라이머는 복합체를 형성한 표적서열의 3′-말단 영역에 충분히 상보적인 복합체화 서열 및 복합체화 서열의 5′에 RNA 중합효소의 프로모터를 포함하는 서열을 가진다. 프라이머는 DNA 중합효소로 신장되어 프라이머 신장 생성물을 생성한다.
가닥을 분리한후 보통 열 변성법에 의하여 표적분자와 동일한 센스의 제2 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 제1 프라이머 신장 생성물의 DNA 상보체를 합성한다. 제2 프라이머는 프로모터를 포함하는 복합체화 서열의 5′에 부가 서열을 가진다. 제2 프라이머에 프로모터 서열을 삽입하는 것은 증폭을 증가시킬 수 있다. 제2 프라이머 역시 스플라이스 주형이다.
예비단계 II는 제3도에 관련하여 더욱 상세 기술한다. 제3도는 표적서열의 5′및 3′양쪽에 부가서열을 가지는 표적 DNA를 도시한다. 제1 프라이머는 3′말단에 복합체화 서열을 가지며 프로모터 서열을 포함하는 복합체화 서열의 5′에 서열을 가지며 표적과 충분히 복합체화하여 프라이밍 기능을 수행하며 DNA 합성을 개시한다. 적당한 DNA 중합효소는 프라이머를 신장하여 프라이머 신장 생성물을 생성한다. 변성 또는 기타 방법에 의하여 가닥을 분리하여 프라이머 신장생성물을 포함하는 단일 가닥 프로모터를 제조한다.
제1 프라이머 신장 생성물의 표적서열의 3′말단 영역에 충분히 상보적인 3′말단의 결합서열 및 프로모터 서열을 포함하는 복합체화 서열의 5′에 선택적으로 다른 서열을 포함하는 제2프라이머를 사용한다. 제2프라이머는 단계 3의 프라이머 신장 생성물과 결합하여 프라이밍 기능을 수행하며 DNA 합성을 개시한다. DNA 중합효소는 제2프라이머를 신장하여 제2프라이머 신장생성물을 생성한다. 얻어진 이중가닥 DNA 분자는 RNA 중합효소의 주형으로 작용하여 일반적인 방법을 위한 RNA 전사체를 제조하게 된다. 제3도에 도시된 것처럼 생성된 RNA 분자는 명칭상 “+”센스이며 본발명의 일반적 방법에 의하여 복제될수 있다.
제2프라이머의 복합체화 서열이 단계3의 제1 프라이머 신장 생성물의 3′말단에 상보적이며 제2 프라이머가 복합체화 서열의 5′에 프로모터 서열을 포함하고 있을 경우에는 제2 프라이머는 스플라이스 주형으로 작용하여 단계 3의 제1 프라이머 신장 생성물의 3′말단이 더욱 신장되어서 프로모터 서열을 첨가하게 되며, 양쪽 센서의 RNA 전사체를 생성하는 RNA 중합효소의 주형을 제조하게 된다. 생성된 RNA 분자는 일반적 방법에 따라 증폭될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에 있어서는 제2 프라이머는 스플라이스 주형으로 작용하여 복합체화 서열의 5′에 프로모터를 가짐으로써 제1 프라이머는 프로모터를 가질 필요가 없다. 이 경우에 단계 2의 제1 프라이머 신장 생성물은 더 신장되어 프로모터 서열의 상보체를 생성하여 따라서 RNA 중합효소에 의하여 “-”센스 RNA의 생산을 위한 주형을 제조하게 된다.
상술한 단계를 반복함으로써 표적서열의 RNA 및 DNA 성분을 부수적 생산할 수 있다.
[실시예]
[서두]
상술한 단계의 다음 실시예는 본발명의 방법의 메카니즘 및 이용을 밝히고 있다. 실시예들은 본발명을 한정하지 않으며 한정적으로 취급되어서도 안된다.
하나 또는 그 이상의 실시예에서 사용하는 많은 재료들은 비슷하다. 실시예의 기술은 단순하게 하기 위해 일부 재료들은 약자로 표시하며 본 명세서에 기술하였다.
“frag 1”으로 언급되는 주형은 헤파티티스 B 게놈으로부터의 DNA 영역에 상동적인 이중가닥 DNA 단편이다. 제한 뉴클레아제 절단에 의해 플라스미드로부터 절제하여 크로마토그래피 방법에 의해 잔여 헥산으로부터 정제하였다. 정제후, 제한 엔도뉴클레오티드로 절단하고 페놀 추출 및 에탄올 침전으로 정제하여 의도한 표적을 생산하였다.
“MI3L(-)”로 언급되는 주형은 (-)가닥 표적 서열을 총서열의 작은 단편으로서 포함하는 정제된 단일 가닥 DNA 표적이다.
본 명세서에서 기술된 실시예에 몇몇 상이한 프라이머 및 스플라이스 주형이 사용된다. T7pro(+)로 언급되는 올리고뉴클레오티드는 5′말단 근방에 T7 RNA 중합효소 프로모터를 포함하며 3′말단에 상술한 두주형의 (-)가닥 표적서열의 3′말단에 상보적인 서열을 가진다; T7pro(+)는 또한 성능을 향상시키는 다른 서열정보를 포함한다. T7pro(+)의 서열은 5′-AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GAGGT TATCG C*TGGA*TGTGT CTGCG GC*GT 3′이다.
T7pro(+)에 유사한 다른 올리고뉴클레오티드는 ddT7pro(+)이다. 3′말단이 말단데옥시뉴클레오티딜 전이효소에 의해 디데옥시 뉴클레오티드로 신장된다는 점에서 T7pro(+)와 상이하다. T7pro(+)와는 달리, ddT7pro(+)는 역전사효소에 의한 DNA 합성의 프라이머로서 작용할 수 없으나 스플라이스 주형으로 작용할 수 있다.
HBV(-)Pr은 frag 1 주형의 (+)가닥에 혼성화할 수 있는 프라이머이며 M13L (-)안의 서열에 상동적이다[HBV(-)Pr은 T7pro(+)에 상동적인 (+) 가닥서열의 3′서열에 상보적이다]. HBV(-)Pr의 서열은 5′-GAGGA CAAAC GGGCA ACATA CCTTG-3′이다.
프로모터 영역을 포함하는 다른 올리고뉴클레오티드는 T7pro(-)이다. 이 프로모터- 프라이머는 T7pro(+)와 동일한 서열을 포함하나, (-) 표적의 상보적인 서열을 (+)표적에 상보적인 서열로 대치한다. T7pro(-)의 3′말단은 frag 1의 (+) 가닥의 3′말단에 상보적이다. T7pro(-)의 서열은 5′-AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GATCC TGGAA TTAGA GGACA AACGG CG-3′이다. ddT7pro(+)와 같이 ddT7pro(-)도 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소에 위해 디데옥시 뉴클레오티드로 3′말단이 신장되어 만들어진 3′차단 올리고뉴클레오티드이다. ddT7pro(-)는 프라이머로 작용할 수 없으나 한편으로는 T7pro(-)에 유사하다.
본 실시예에 사용된 주형은 상술한 프라이머에 상보적 또는 상동적인 영역과 스플라이스 주형 사이의 실질적 서열을 포함한다.
올리고뉴클레오티드 사이의 서열이 발명의 결과로써 증폭될 것이기 때문에 이 서열의 정량화는 증폭을 측정하는 특정 수단을 제공한다. 올리고뉴클레오티드 플라이머와 스플라이스 주형 사이를 코드화한 서열에 특이적인 DNA 프로브를 사용한 혼성화 기술에 의하여 생성물을 분석하는 것이 편리하다. 본 실시예에서 사용되는 두 프로브는 아래와 같다; 프로브(+) 및 프로브(-).
프로브(+)는 (-)센스 생성물에 상보적이며 프로브(-)는 (+)센스 생성물에 상보적이다. 프로브(+)의 서열은 5′-CCTCT TCATC CTGCT GCTAT GCCTC-3′이고 프로브(-)의 서열은 5′-GAGC ATAGC AGCAG GATGA AGAGG-3′이다. 여기서 사용된 프로브는 화학형광표로 표지되어 있다.
분석에서 혼성화된 프로브의 표지가 광도계에서 측정될 빛을 방사한다.
다음 실시예에서 상대적 증폭도를 아래와 같이 측정하였다. 증폭 반응혼합물의 샘플(보통 10㎕)를 10mM Tris-HCl pH 8.3으로 50㎕에 희석하고, 95℃에서 2분간 변성하였다. 얼음에서 냉각한후, 대략 75fmol 프로브(+) 또는 프로브(-), 0.2M 리튬 숙시네이트, pH 5.2, 21%(w/v) 리튬 라우릴 설페이트, 2mM EDTA 및 2mM EGTA를 함유하는 프로브 용액 50㎕을 샘플에 첨가하고 혼합하였다. 그다음 반응을 60℃에서 20분간 배양하고 냉각하였다. 각각의 혼성화반응에 포화 붕소나트륨용액을 염산으로 pH8.5에 조정하여 제조한 용액 500㎕를 첨가하고, 그다음 희석하여 붕소농도를 최종 8.0M로 가져가며, Triton X-100를 첨가하여 최종 5%(v/v)로 가져갔다. 그후 반응을 혼합하고 60℃에서 6분간 배양하여 혼성화되지 않은 프로브의 화학형광 표지를 파괴하였다. 혼성화되지 않은 프로브의 화학형광 표지를 파괴하는 이 방법은 매우 특이적이다; 매우 작은양의 비혼성 프로브 만이라도 화학 형광을 남긴다. 반응을 냉각하고 남아있는 화학형광성을 1.5M 수산화나트륨, 0.1%(v/v) 과산화수소 200㎕ 첨가하에 광도계에서 정량하였다. 분석에서 혼성화 프로브는 광도계에서 측정할 빛을 방사한다. 비혼성화 프로브의 화학형광 표지를 파괴하는 반응은 100% 효율적이지 않기 때문에 300 내지 1300의 상대적 광단위(RLU) 범위에서 존재하는 표지의 일반적인 기초 수준이 존재한다. 동위원소 표지 프로브, 블로팅 기술 및 전기 영동에 혼성화를 응용하는 분석등을 포함하여 기타 다른 많은 분석방법들이 또한 사용된다.
다음 실시예에 사용되는 효소는 Seikagaku America, Inc.의 조류 골수아구증 바이러스 역전사효소, New England Biolabs 또는 Epiceutre의 T7 RNA 중합효소, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소 및 Bethesda Research Lab의 E. Coli RNAse H들이다. 유사 활성을 가지는 다른 효소 및 다른 출처원으로부터의 효소도 사용된다;
상이한 프로모터 특이성을 가지는 다른 RNA 중합효소도 또한 사용하기에 적당하다.
다른 특정사항이 없다면 다음 실시예에서 사용되는 반응조건은 100㎕ 부피에 40mM Tris-HCl, 25mM NaCl, 8ml MgCl, 5mM 디티오트레이톨, 2mM 스페르미딘 트리히드로클로라이드, 1mM rATP, 1mM rCTP, 1mM rGTP, 1mM rUTP, 0.2mM dATP, 0.2mM dCTP, 0.2mM dGTP, 0.2mM dTTP, 0.15μM의 각 프라이머 또는 스플라이스 주형, 및 특정량의 주형 및 효소이다. 이들 반응 조건들은 반드시 최적이지 않으며 몇몇 시스템에 주지한 바에 따라 변화될 수 있다. 사용되는 올리고뉴클레오티드는 전형적이며 다른 서열이 이들 및 다른 표적서열에 사용되는 것에 따라 제한되어지는 것을 의미하지 않는다.
[실시예 1]
[예비단계 I]
본 시스템이 작동되는 것을 밝히기 위하여 상술한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 4개의 프로모터의 각각을 4fmol 표적(frag 1)의 존재여부에 무관하게 반응에 사용하였다. 반응을 95℃에서 2분간 배양하여 표적을 변성한 다음, 냉각하여 올리고뉴클레오티드가 표적에 어닐링하도록 하였다. 역전사효소 13 유니트(unit)와 T7 DNA 중합효소 100유니트를 첨가하고 반응을 37℃에서 30분간 배양하였다. 반응의 10분의 1을 혼성화 방법으로 분석하였다. 표 1에 나타난 결과(상대적 광단위 또는 “RLU”및 fmols)는 차단 및 비차단 올리고뉴클레오티드 모두가 스플라이스 주형으로 작용하여 생성물을 생산한다는 사실을 보여주고 있다. 표적없이 반응을 측정한 시그날은 이와같은 유형의 분석에서 시그날의 전형적인 기초수준을 나타낸다.
[표 1]
[실시예 2]
[예비단계 I로 반응사이클]
증폭시스템을 ddT7pro(+) 및 T7pro(+)로 반복하였다. 본실험에서 4amol frag I, HBV (-) Pr 및 ddT7pro(+) 또는 T7pro(+)를 표준반응에 혼합하고 95℃에서 배양하였다. 냉각후, 역전사효소 13유니트, 및 T7 RNA 중합효소 100유니트를 첨가하고 혼합물을 37℃에서 30분간 배양하였다. 반응의 1/10을 분석용으로 제거하고 나머지는 사이클을 반복하였다. 3회에 걸쳐 사이클을 반복한후 10㎕ 부분 표본을 프로브(-)를 사용한 혼성화 방법에 의해 분석하였다. 표 2에 나타난 결과에서 생성물이 차단 및 비차단 스플라이스 주형으로 반응 사이클을 통하여 증폭된다는 사실을 나타내고 있다.
[표 2]
[실시예 3]
[예비단계 I의 감도]
본 실시예에서 증폭 방법의 감도를 시험하기 위하여 비차단 스플라이스 주형 T7pro(+)와 프라이머 HBV(-)Pr를 사용하였다. 예비단계 I의 6반응 사이클을 실시예 2에 기술된 대로 frag 1의 감량으로 실시하였다. 증폭후, 발명의 상세한 설명에 기술된 혼성화 방법에 따라 생성물을 분석하였다. 이 방법을 사용하여 4×10-21mol frag 1을 검출하였다(표 3 참조).
[표 3]
[실시예 4]
[예비단계 I를 포함한 증폭]
다음 실시예에서 증폭될 표적은 frag 1이다. 첫 반응세트에서 표적과 스플라이스 주형의 다양한 조합을 95℃에서 2분간 배양한 다음, 역전사효소 13유니트와 T7 RNA 중합효소 100유니트를 첨가하기 전에 냉각하였다. 반응을 37℃에서 30분간 배양한 다음, 반응의 5㎕ 부분 표본을 양 프로브로 분석하여 생성물을 정량화하였다. 이 분석에 이어, T7pro(-) 스플라이스 주형과 반응 1 및 2의 5㎕를 사용하여 반응을 준비하였다. 혼합물은 95℃에서 2분간 배양한후, 역전사효소 13단위와 T7 RNA 중합효소 100단위를 첨가하기 전에 냉각하였다. 새로운 반응을 혼합하고 37℃에서 2시간 배양하였다. 아래표 4에 지시된 시간에 10㎕부분 표본을 얼음통에서 제거하였다. 이미 기술된 혼성화 방법에 따라 생성물을 분석하였다. 분석 결과는 두 스플라이스 주형 모두가 frag 1으로부터 RNA를 생성하게 한다는 사실을 나타낸다. 또한 결과는 상당히 많은 (+) 및 (-) 센스 생성물이 그 RNA에 상보적인 스플라이스 주형 및 RNA를 포함하는 반응에서 생성된다는 것을 나타낸다. 최종적으로 반응 1B의 반응 동력학(kinetics)은 생성물의 기하적 증가를 보이는 반면 2B반응의 동력학은 훨씬 선형이다. 이 차이점은 1B 반응의 생성물이 더 많은 생성물을 재조하는 기질로서 작용하며 따라서 반응이 자동 촉매적이라는 사실을 나타낸다.
[표 4]
[실시예 5]
[에비단계 I를 포함하는 증폭의 반응 운동학]
다음 실시예는 본발명 방법의 구체화 가능성을 더욱 상세히 밝히고 있다. T7pro(+), T7pro(-) 및 HBV(-)Pr의 다양한 조합과의 반응에서 frag 1(10amol)의 소량을 사용하였다. 반응혼합물을 95℃에서 2분간 배양하여 DNA 표적을 변성하고 역전사효소 및 T7 RNA 중합효소를 첨가하기 전에 냉각하였다. 혼합후, 반응을 37℃에서 30분간 배양하였다. 15㎕ 부분 표본을 다양한 시간에 제거하여 분석할 때까지 0℃에서 저장하였다. 반응생성물을 정량화하기 위하여 혼성화방법을 사용하였다. 표 5에 나타난 결과들은 본발명이 하나의 스플라이스 주형과 하나의 프라이머를 필요로 한다는 사실을 보여준다. 그러나 제2 스플라이스 주형은 도움이 된다. 단하나의 프라이머 또는 스플라이스 주형으로의 결과는 분석의 검출한계에 미치지 못한다. 앞의 실시예에서 반응 동력학은 기하학적이며 자동촉매적 시스템임을 나타낸다.
[표 5]
본발명자의 뒤이은 실험은 5.0 시간이상 동안 계속된 생성물 합성을 밝혔으며, 이는 실질적으로 기존 방법에 비해 향상된 것이다. 또한 본발명자들은 증가된 감도를 밝혔다.
[실시예 6]
[예비단계 II를 포함하는 증폭]
본 실시예에서 다양한 조합의 프라이머가 한정된 말단을 가지지 않는 500amol DNA 표적을 증폭하기 위하여 사용되었다.
표적은 상기 언급된 M13L(-)있다. 반응준비를 하고, 샘플을 95℃에서 2분간 배양한 다음, 역전사효소 13유니트를 첨가하기 전에 냉각하였다. 그다음, 42℃에서 12분간 반응을 배양하였다. 다음에 다시 95℃에서 2분간 가열하고 냉각하였다. 역전사효소 및 T7 RNA 중합효소를 첨가하고 37℃에서 2시간동안 배양하였다. 10㎕ 반응부분표본을 프로브(+)와 프로브(-) 모두로 분석하였다. 표 6에 나타난 결과는 많은 양의 핵산합성이 두 프라이머가 사용될때만 일어난다는 사실을 보여주고 있다. 또한 이 결과들을 두 프로모터-프라이머가 하나의 프로모터-프라이머와 하나의 프라이머보다 유익함을 밝히고 있다.
반응 4 및 5에서의 낮은 수준의 합성은 원주형으로부터 대략 DNA의 한 복사체를 합성하는 것에 대응된다. 바람직하지 않는 뉴클레아제 또는 프로타아제 활성을 불활성화시킬 뿐만아니라, 이중가닥 표적 또는 단일가닥 표적의 이중가닥영역을 변성하는데 작용하는 초기의 95℃ 변성단계를 본 시스템에서 사용하였다.
[표 6]
[실시예 7]
[RNAse H의 효과]
외래 RNAse H의 첨가가 본발명의 기술된 자동촉매적 시스템에서 증폭을 개선시킨다는 것을 밝히기 위하여 다양한 양의 표적 M13L(-), 및 0 또는 2단위의 외래 RNAse H를 이용하여 몇몇 반응을 준비하였다. 사용된 외래 RNAse H는 E. Coli로부터 얻었다. 모든 반응을 T7pro(+) 및 T7pro(-)로 준비하였다. 반응을 95℃에서 변성시키고 역전사효소를 첨가하기 전에 냉각하였다. 42℃에서 12시간 배양한후, 다시 95℃에서 반응을 변성시켰다. 냉각후, 역전사효소, T7 RNA 중합효소 및 지시된다면(표 7 참조) RNAse H를 첨가하고 37℃에서 3시간동안 반응을 배양하였다. 혼성화방법에 의한 분석을 위하여 일정시간 간격으로 각 반응에서 10㎕부분 표본을 제거하였다. 표 7에 나타난 결과는 외래 RNAse H가 상당히 반응 동력학을 증가시키며 본발명의 감도를 증가시킨다는 사실을 보여준다. 600 RLU 이하의 시그날은 전형적인 기초(background) 수준으로 해석된다.
[표 7]
[실시예 8]
[외래 DNA의 효과]
외래 DNA의 첨가가 본 자동촉매적 증폭 시스템을 상당히 방해한다는 사실이 밝혀졌다. 외래 RNAse H의 첨가 잇점을 더욱 밝히기 위하여 이 저해작용을 밝히는 2㎍의 소흉선 DNA와 함께 또는 없이, 증폭반응을 준비하였다. 소흉선 DNA와의 반응에서 역전사효소의 두 유니트농도를 사용하여 부가적 AMV RNAse H가 저해작용을 극복하는지를 시험하였다. 또한 E. Coli로부터의 RNAse H를 동일한 이유로 일부 반응에 첨가하였다. 각각의 리보뉴클레오티드 농도가 2.5mM로 증가하며 염화마그네슘 농도가 12.8mM로 증가하였다는 점에서 이 반응은 표준 반응과 상이하다.
M13L(-) 100amoℓ을 표적으로 하고 T7pro(+) 및 T7pro(-)를 이용하여 반응을 준비하였다. 95℃에서 2분간 변성한후, 반응을 냉각하고, 역전사효소 13 또는 39유니트를 첨가하고 반응을 37℃에서 12분간 배양하였다. 다시 95℃에서 반응을 변성하고 역전사효소 13 또는 39유니트, T7 RNA 중합효소 100 또는 300유니트 및 E. Coli RNAse H 0 또는 2 유니트를 첨가하기 전에 냉각하였다. 37℃에서 1시간 배양한 후, 각 반응의 10㎕를 혼성화분석에 사용하여 분석하였다. 표 8에 나타난 결과는 소흉선 DNA가 외래 DNA없는 반응시스템과 비교하여 90% 정도 반응을 저해하며 부가적 연속 슬라이드 파스너(및 그에 연계된 RNAse H)가 생성물 증폭에 심각하게 영향을 미치지 않는다는 사실을 보여주었다. T7 RNA 중합효소의 더많은 첨가는 생성물 수율에 상당한 영향을 미치나 외래 RNAse H의 첨가에 기인한 증가에 비해 적다. 저해작용이 제거될 뿐만아니라, 소흉선 DNA 및 E. Coli RNAse H 없는 반응에 비하여 5배정도 증폭이 증가된다. E. Coli RNAse H의 많은 양으로 관찰된 시그날은 혼성화분석에 사용된 프로브양을 포화하였다. 이들 샘플을 정확히 정량하기 위하여 증폭생성물의 희석이 분석하기 전에 필요하다.
[표 8]
[실시예 9]
[일반적 방법에 의한 증폭]
본시스템은 초기 전사 미 변성을 필요로 하지 않는다; 표적의 DNA 상보체를 만들고 원 표적을 RNAse H로 제거하였다. 다음에 DNA를 제2 프라이머 또는 프로모터-프라이머에 어닐링하고 DNA 합성을 통하여 RNA 중합효소의 주형을 제조하였다. RNAse H가 불활성이라면 처음 생성된 DNA:RNA 혼성체는 RNA 중합효소의 주형을 생산하지 않고 반응을 종결시킨다. 본 발명의 방법을 밝히기 위한 시도에서 RNA 중합효소 프로모터 및 표적 핵산을 포함하는 플라스미드를 사용하여 다른 서열안에 표적서열을 포함하는 단일가닥 RNA 전사체의 많은 양을 생산하였다. 두개의 유사한 반응을 또한 준비하였다: RNA 중합효소가 없는 플라스미드를 포함하는 반응 및 플라스미드가 없는 RNA 중합효소와의 반응 각각의 이들 반응의 희석액을 분석하여 생성물을 정량하였다. 세반응 모두의 동등 희석액을 사용하여 두 프로모터-프라이머, T7pro(+) 및 T7pro(-)를 포함하는 증폭 반응을 준비하였다. 표 9의 반응 1은 RNA 60amoℓ과 출발 플라스미드 0.6amoℓ를 포함한다. 반응 2는 출발 플라스미드 0.6amoℓ를 포함하며 RNA는 포함하지 않는다. 반응 3은 아무런 표적도 포함하지 않는다. 반응은 95℃에서 변성하지 않는다; 대신에 역전사효소 및 T7 RNA 중합효소를 첨가하고 37℃에서 4시간동안 반응을 배양하였다. 차후의 혼성화분석을 위하여 시간간격으로 부분표본을 제거하였다. 표9에 보여지듯이, 플라스미드로부터 생성된 RNA 및 플라스미드를 포함하는 반응은 많은 혼성화 시그날을 나타냈다; T7 RNA 중합효소가 플라스미드로부터 RNA를 생산할 수 있듯이 플라스미드만을 포함하는 반응은 상당한 생성물을 생산하였으며 이것을 이용하여 일반적 방법에 따라 양 센스의 더 많은 핵산을 생산하였다; 및 최종적으로 표적을 포함하지 않은 대조반응(반응 3)은 아무것도 생산하지 않았다.
[표 9]
[실시예 10]
[일반적 방법에 의한 증폭]
한정된 말단이 없는 DNA 표적에 대한 제1 프라이머 신장 및 변성단계의 필요성을 완화시키는 다른 개시방법이 본발명에 대해 가능한지를 결정하기를 위하여 다음 실험을 실시하였다. 본 실험에서, 표 10에 표시된 대로 제1역전사효소 단계없이 또는 함께 제시된 표적양을 증폭하였다. 일단 모든 효소가 첨가된다면 증폭시간은 4시간이다. 사용된 표적은 생리식염수에 희석한 M13(+)이었다. T7pro(+) 및 T7pro(-)를 사용하였다. 각 희석액 25㎖에 0.1N KOH 25㎕를 첨가하였다. 샘플을 98℃에서 10분간 배양한 다음 냉각하였다.
각 샘플을 50mM Trizma 염기, 40mM 글루탐산, 25mM 수산화칼륨, 12.8mM 염화마그네슘, 5mM 디티오트레이톨, 2mM 스페르미딘 트리히도클로라이드, 2.5mM의 각각의 리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 0.15μM의 각 프라이머의 최종 농도 및 100㎕에 가져갔다. 표준 프로토콜 튜브에 역전사효소 13 유니트를 첨가하고 반응을 42℃에서 12분간 배양한다음, 85℃에서 2분간 배양하고 냉각하였다. 그다음 모든 튜브에 역전사효소 13유니트, T7 RNA 중합효소 100유니트 및 RNAse H 0.5U 유니트를 첨가하였다.
그다음 37℃에서 4시간 반응을 배양하고 10㎕ 부분표본을 화학형광 프로브 분석을 이용하여 분석하였다. 표 10에 나타난 결과는 일부 증폭이 약식 프로토콜을 이용함이 분명하다는 것을 보여준다.
비록 관찰된 증폭 수준이 표준프로토콜에 비하여 상당히 낮다하더라도 더욱 개발되어 효율적일 수 있으며 표적 핵산의 상당한 수준이 존재하는 경우에도 유용할 수 있다.
[표 10]
이 결과에 대한 있음직한 설명은 T7 RNA 중합효소가 완전히 특이적이지 않다는 사실이다. 표적 영역의 RNA 복사체의 작은 수을 생산하는 임의 RNA 합성의 수준이 낮다. 이들 복사체는 표준 방법을 통하여 증폭된다.
본발명자의 초기 연구작업은 외래 RNAse H의 첨가없이 일부 프라이머 군 및 표적으로 휼륭한 증폭을 밝혔다. 반응 메카니즘을 분명히하는 본발명자의 계속된 연구작업은 폭넓은 다양한 표적에 본발명을 효율적으로 사용할수 있도록 하였다. 본발명자들은 외래 RNAse H를 증폭에 사용하는 방법 및 역전사효소와 연관된 RNAse H 활성에 의존하는 방법을 본 명세서에서 밝히고 있으며 요구하는 바이다.
본발명자들은 E. Coli RNAse가 항상 증폭을 개선시키는 것은 아니기 때문에 관례적으로 첨가하여서는 안된다는 사실을 발견하였다. 본발명자들은 일부 RNAse H 형태가 RNA:DNA 혼성체의 RNA을 절단한 곳에 대하여 특이적인 서열이라는 것을 확인하였다. 증폭반응에 있어서, 본발명자들은 전 길이의 생성물 DNA로 프로모터- 함유 프라이머를 검출하지 못했다. 두 프로모터-프라이머를 사용한 구체예에서 단 하나의 프로모터-프라이머가 전-길이 생성물 DNA에 뚜렷하게 통합되어있다. 이 분야에 통상의 지식을 가진자가 제시한 다른 모든 메카니즘들은 두 프라이머를 포함하는 전-길이 생성물 DNA를 보여주고 있다. 본 발명자들은 이러한 관찰 사항들에서 RNAse H가 증폭동안에 합성된 주요 RNA종을 완전히 분해하지 않을 가능성이 있는 것으로 생각하였다. 이들 관찰에 근거하여 RNAse H 서열 특이성을 고려한 발명자들의 관찰을 포괄하는 신규 증폭 메카니즘이 본 명세서에서 제시된다. 새로운 그리고 유용한 프로모터-프라이머 디자인 기준이 밝혀진다. 더욱이, 본발명자들은 본 명세서에서 표적 핵산서열의 복사체를 다수 합성하는 다음의 단계로 구성되는 신규방법을 주장한다.
a) RNA 표적의 영역과 복합체를 형성하는 RNA 표적서열의 영역에 상보적인 프라이머를 선택하는 단계, 상기 표적의 영역은 선택 RNAse H에 의한 분해작용에 노출된 후 프라이머 신장 생성물을 형성할 수 있도록 위치한다.
b) 모든 실질적인 RNA가 RNAse H의 분해작용을 통하여 이중가닥으로부터 제거되는 영역에서 DNA와 복합체를 형성하는, 프라이머의 신장에 의하여 얻어지는 DNA의 영역에 상보적인 프로모터-프라이머를 선택하는 단계, 그리고
c) RNA 표적을 프라이머, 프로모터-프라이머, RNAse H, 역전사효소 및 전사효소와 혼합하고, RNA의 복사체를 다수 형성하여 RNA에 상보적인 DNA 복사체를 다수 형성하는 단계.
본명세서에서 기술된 신규 방법은 RNA 표적 서열과 동일한 극성(또는“센스”)의 DNA 복사체를 실질적으로 동등수 제조하는 것이 아니다.
본단계는 신규 표적부위에 대한 프라이머 및 효과적인 프로모터-프라이머의 디자인을 허용하는 방법을 제공한다. 본발명자들은 본 명세서에서 이와같은 프로모터-프라이머 및 프라이머 조합과 이것을 위한 디자인 기준을 밝히고 주장한다. 본 명세서에서 밝혀진 메카니즘은 RNA 가닥의 전사를 위한 신규 반응 중간물질에 관련된다. 이 중간물질은 이중가닥 DNA 프라이머 영역을 포함하는 DNA과 RNA의 이중가닥 복합체이다. 본발명자가 알기에는 이와같은 것은 문헌에도 전혀 기술되지 않은 것이다. 정말로, 이전의 기술 시스템의 어떤것(구체적으로 Guatelli J. C. et al., 87 PNAS 1874-1878(1990), 및 Gingeras, T.R. et al.,의 PCT 출원 제88/10315호)도 RNAse H 분해 부위의 위치에 근거한 프라이머와 프로모터-프라이머 서열을 바람직하게 선택하지 않았다. 따라서 본명세서의 방법은 신규한 것이며 이전의 밝혀진 것으로부터 용이하지 않다.
RNAse H 서열 특이성의 중요성 인식 및 반응 메카니즘의 이해는 광범위의 다양한 표적서열의 본 표적 증폭방법을 효율적으로 사용하는데 꼭알아야 할 사항이다. 더욱이, 지금까지 연구자들은 RNAse H가 RNA:DNA 복합체의 RNA 가닥을 충분히 그리고 체계적으로 분해하는 것으로 여기고 있었다.
I. 증폭 방법의 메카니즘
이전의 두 기술방법으로 증폭 효율을 테스트한 결과, 사용한 프라이머군에 작은 변화를 가지면서 증폭 효율에 많은 다양성이 있음을 밝혔다. 종래기술에서 일반적으로 받아들여진 반응 방법은 본발명자의 견지에서는 왜 하나의 프라이머가 다른것보다 훨씬 더 잘 작용하는지에 대한 합당한 설명을 제공하지 못했다.
종래기술방법을 이용한 증폭을 개선시키려는 노력들은 만족스런 결과를 주지 못했다. 프라이밍의 효율을 검사하여 DNA 사슬을 개시하는 능력에 있어서의 차이가 프라이머군 효율에서의 관찰된 차이의 원인인지를 검토하였다. 프라이밍 효율과 전반적인 증폭사이의 상관관계는 밝혀지지 않았다. 자기-상보구조 및 교차(cross)-상보구조를 형성하는 프라이머군의 능력을 분석한 결과, 프라이머 효율의 차이는 이들 요소 어느 하나에 전적인 원인이 있는 것이 아니다는 사실이 밝혀졌다.
본발명자는 또한 E. Coli RNAse H의 첨가가 일정하게 증폭을 개선시키지 않는다는 것을 알게되었다. 본 명세서에 제시된 자료들이 보여주듯이 관찰된 결과들은 표적에 따라 및 프라이머군에 따라 다양하였다. 또한 첨가된 E. Coli RNAse H의 양은 매우 중요하며 엄격히 한정된 범위내에서 유지되어야 한다. 주어진 표적 및 프라이머 군과 함께 E. Coli RNAse H의 첨가는 역전사효소가 조류 골수아구증 바이러스(“AMV”)로부터의 효소인 몇몇 경우에는 유용하나 몰로니 뮤린백혈병 바이러스(“MMLV”)로부터의 역전사 효소일 때에는 그렇지 않다. 이들 결과를 설명하는 데이타는 명세서에 제시된다.
초기연구는 AMV 역전사효소가 바이러스 복제동안에 형성된 RNA:DNA 혼성체로부터 RNA를 분해할 때 비교적 큰 단편을 남기게 된다는 사실을 제시하였다. 이들 단편들은 제2DNA 가닥의 합성을 개시하기 위한 프라이머로 작용한다.
본발명자들은 AMV 및 MMLV RNAse H 활성의 서열 특이성에 대한 증거가 있다는 관찰을 본명세서에 제시한다.
반응의 메카니즘을 명백히 밝히기 위하여 각각의 프라이머를32P로 말단 표지하고 각 프라이머의 DNA 생성물의 통합을 폴리아크릴 아미드겔 전기영동에 의해 검사하였다. 일반적으로 받아 들여지는 종래의 기술 메카니즘에 따라서 양 프라이머는 완전한 길이의 DNA 생성물에 통합되어진다. 그러나 본발명자의 실험은 증폭동안 합성된 주요 RNA 종에 상보적인 프라이머만이 완전한 길이의 생성물에 통합된다는 사실을 보여준다. 주 RNA 가닥과 동일한 극성을 가지는 프라이머는 완전한 길이의 DNA 생성물에서 전혀 검출되지 않았다. 사실, 매우 조그만하게 남아있다. 이들 결과는 많은 수의 다른 표적 및 프라이머군으로 확인되었다.
프라이머의 하나의 신장을 검출하지 못한 것은 완전한 이중-가닥 DNA 중간물질이 증폭동안에 축적되지 않았으며 자동 촉매적 증폭에는 필요하지 않다는 사실을 나타낸다. 이러한 관찰들은 RNAse H의 가능성 있는 서열특이성을 고려한 본발명의 증폭 시스템의 메카니즘을 제시한다. 메카니즘은 제4도에 일반적으로 도시되어있다.
이 효소가 RNA:DNA 혼성체의 RNA를 특정 단편으로 절단한다는 사실이 실험으로 밝혀졌다. 더욱이 절단부위의 위치는 특정 영역에 있는 것으로 보인다. 메카니즘을 확인하기 위하여 T7pro/T7pro~ 표적 및 프라이머군 조합으로부터 생겨난 +가닥 RNA가 포함된 RNA:DNA 혼성체를 제조하였다.32P 표지 RNA를 상보적 DNA에 혼성하고 AMV 역전사효소(연관 RNA H 활성을 가짐)로 배양하고 반응 생성물을 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 분석하였다(제5도). 단편 크기로부터 몇몇 작은 조각이 생기며 이들은 하나 또는 양 말단부근의 절단에 의하여 생겨난 것이라는 사실을 단편 크기로부터 알 수 있다. 분자의 내부 영역은 절단되지 않는다. 효소는 사용된 반응조건하에서 서열 또는 구조 특이성을 가짐을 본 실험으로 밝혀졌다. 결과는 제4도의 반응 메카니즘과 전으로 일치한다.
절단 부위가 어디에 일어나는지를 측정하기 위하여 또다른 실험을 실시하였다. 다중 절단부위는 프로모터- 포함 프라이머에 상동적인 영역에 일어나고 다른 프라이머에 복합체를 형성하는 영역에 일어나지 않는 것이 바람직하다. RNA의 각각의 말단을 표지하고 절단생성물을 분석함으로써, 사용된 조건하에서 절단은 RNA의 5′말단에만 검출된다는 사실을 알게되었다. 이것은 제4도의 메카니즘과 일치한다.
AMV의 RNAse H 활성 및 MMLV 역전사효소가 절단하는 서열을 결정하기 위하여 서열 실혐을 실시하였다. 각 효소에 의하여 특이적으로 절단되는 서열이 동정되었다. 예상했듯시 두효소의 서열특이성은 상이하며 이것은 일부 프라이머군이 한 효소에 더 잘 작용하며 일부는 나머지 하나에 더 잘 작용하는 이유를 설명하는 것으로 여겨진다. 본반응 조건하에서 MMLV 효소에 대해 얻어진 서열 특이성은 반응 조건의 다른 셋트하에서의 문헌에 기록된 것과 일치하지 않으며, 이 사실은 특이성이 반응조건에 영향을 받는다는 사실을 제시한다.
증폭 메카니즘에서 RNAse H의 역할의 조사결과, cDNA 복사체으로부터 전사체를 지휘하는 프로모터를 완전히 제거하는 것은 반드시 필요하지 않으며 또한 새로운 전사적 활성주형의 형성에도 바람직하지 않다. 따라서 일부 응용의 경우에, 역전사효소- 내재 RNAse H로부터 유래한 RNAse H 활성의 매우 낮은 수준도 RNAse H가 프로모터-프라이머를 제1가닥 cDNA 생성물에 어닐링하는데 훨씬 선택적인 부위이거나 또는 다른 전사체에 기타 프라이머의 어닐링을 덜 간섭한다면 효과적인 증폭을 위하여 충분하다. E. Coli RNAse H는 레트로바이러스의 효소보다 덜 특이적이기 때문에 특별히 이 프라이머 표적 E. Coli RNAse H 및 효소의 활성에 영향을 미치는 성분의 농도가 신중히 조절되지 않더라도 비-프로모터 함유 프라이머가 복합체를 형성하는 영역에 절단할수 있다. 본발명자의 견해에서 이 결과들은 상업적사용에 E. Coli RNAse H의 사용을 바람직하지 않는 것으로 만들었다. 다른 특이성을 가지는 다른 RNAse H 활성의 첨가는 역전사효소 RNAse H가 바람직한 영역에 절단하지 않거나 또는 적당한 조건하에서 절단하지 않는 경우에 유용할수 있다. 예컨대 MMLV 역전사 효소로의 연구는 효소가 샘플 DNA에 의한 저해에 대하여 AMV 효소보다 덜 민감하다는 사실을 보여준다. 여러 시스템에 대한 가장 좋은 방식이다.
본 명세서에서 지금까지 얻은 RNAse H 서열 특이성 정보 및 모델에 근거하여 신규 프라이머 군을 디자인하고 제시한다. 메카니즘 및 서열 특이성의 정보없이 이전에 디자인된 것으로부터 보다 이들 프라이머 군으로부터 상당히 더 좋은 합성이 이루어진다. 본 명세서에 기술된 발명은 특정 표적서열에 대한 기능 프라이머의 디자인을 가능하게 한다.
본발명자들이 발견한 신규 메카니즘은 RNA 가닥의 전사를 위한 신규 반응 중간체와 연관된다. 이 중간체는 이중가닥 DNA 프로모터 영역을 포함하는 DNA와 RNA의 이중가닥 복합체이다. 본발명자의 지식에서 반응은 이전에 밝혀진 것과는 분명히 상이하다.
반응 메카니즘의 이해는 이 표적 증폭단계의 이용에 결정적이다. RNAse H 서열 특이성의 중요성의 인식은 이 표적 증폭방법을 다양한 표적서열에 응용하기 위하여 중요하다.
한편, 프로모터-프라이머 디자인에 대한 실험적 연구는 매우 힘이들며, 비용이 많이들고 성공의 확률이 낮아서, 본발명은 기술분야에 유용하게 사용되어질 수 있다.
A. RNAse H 농도에 대한 좁은 활성 범위
E. Coli RNAse H와의 증폭시스템은 초기에는 연구된 특정표적 및 프라이머군으로 상당한 합성이 성취되었기 때문에 바람직한 구체예로 여겨졌으며 E. Coli RNAse H는 샘플 DNA에 의한 저해를 극복하는 수단으로 유용한 것으로 알려졌다. 그러나, 반응분석에서 E. Coli RNAse H의 첨가는 많은 경우에 있어 증폭에 나쁜 영향을 끼친다. 더욱이, 첨가된 E. Coli RNAse H의 양은 너무 많은 양의 존재 또는 너무 적은 양의 존재도 해롭기 때문에 좁은 범위에서 신중하게 조정되어야 한다.
본발명의 실질적인 상업적 응용을 위해서는 이것은 효소가 저장상에서 완전히 안정적이지 않을수 있기 때문에 중요한 단점이 된다. 또한 E. Coli RNAse H의 사용은 많은 비용과 시스템에 복잡성을 부여하게 된다. 비용은 많은 상업적 사용을 저해할수 있다. E. Coli RNAse H의 사용은 분석을 더욱 복잡하게 하며 따라서 연구 및 개발비용을 증가시키게 되고 광범위한 상업적 응용에 있어 분석을 너무 어렵게 만들수 있다. 따라서 분석 메카니즘을 명확히 함으로써, 기술적 가능성(표적 부위에의 사용성)의 면에서 뿐만아니라 더욱 싸고 더욱 강력한 단계면에서 광범위한 사용목적의 방법을 제사하게된다. E. Coli RNAse H의 첨가가 초기 실험에서 증가된 증폭을 초래하기 때문에 혈청 또는 인간 DNA를 함유하는 샘플에서 증폭시스템의 실행에 있어 E. Coli RNAse H의 효과를 몇몇 실험에서 조사하였다.
[실시예 11]
[E. Coli RNAse H 농도의 최적화]
혈청에서 최적 증폭을 위하여 필요한 E. Coli RNAse H의 양을 결정하기 위한 실험을 실시하였다. 분석당 0, 0.25, 0.5 및 1U의 RNAse H의 존재하에 T7pro+/T7pro-프라이머쌍으로의 증폭실험과 다음 실험을 비교하였다. HBV-인간 혈청 또는 HBV-혈청에서만 나타난 수준으로 희석된 HBV+ 혈장을 테스트하였다.
혈청 10㎕를 0.1N KOH의 동등량에 첨가하며 증발을 방지하기 위하여 오일층을 도포하였다. 샘플을 혼합하고, 95℃까지 가열하고 실온까지 냉각하였다. 50mM Tris 아세테이트 pH 7.6, 20.8mM MgCl, 5mM 디티오트레이톨, 2mM 스페르미딘 히드로클로라이드, 0.15μM의 각 프라이머, 6.25mM GTP, 6.25mM ATP, 2.5mM UTP, 2.5mM CTP, 0.2mM의 각 dTTP, dATP, dGTP, dCTP 및 13U의 AMV 역전사효소의 최종농도로 90㎕ 반응 용량에 샘플을 가져갔다. 샘플을 혼합하고 37℃에서 12분간 가열한 다음, 95℃까지 가열하고 실온까지 냉각하였다.
13유니트의 RT와 100U의 T7 RNA 중합효소를 첨가하고 반응을 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 각 반응의 25㎕를 분석하였다. 결과로부터 이 시스템의 반응당 0.25U의 E. Coli RNAse H를 기준으로 E. Coli RNAse H의 좁은 최적 농도 범위가 있음을 알 수 있다. E. Coli RNAse H가 사용하기 어렵다하더라도 일부 첨가된 RNAse H 활성은 본 실험에서 유익하다.
[표 11]
[실시예 12]
다음, HIV 프라이머 쌍의 최적 증폭을 위하여 필요한 E. Coli RNAse H의 양을 인간 DNA 8㎍을 함유하는 세포 용해질의 유, 무하에서 측정하였다. 각 반응에 바이러스 표적 2×10-18mole이 존재한다. 40mM Tris HCl pH8.3, 25mM NaCl, 20.8mM MgCl, 5mM 디티오트레이톨, 2mM 스페르미딘 히드로클로라이드 및 표 11에 기술된 뉴클레오티드 트리포스페이트 용액의 각 프라이머 50 pmoℓ과 DNA 표적을 혼합하고, 95℃까지 가열하고 실온까지 냉각하였다. AMV 역전사 효소의 13유니트를 첨가하고 반응을 1분 동안 42℃까지 가열하고, 95℃까지 그리고 다시 실온까지 냉각하였다. AMV 역전사효소 13유니트 및 T7 RNA 중합효소 100유니트를 첨가하고 반응을 분석하기 전에 3.5시간 동안 37℃까지 가열하였다.
[표 12]
이들 결과로부터 너무 많은 RNAse H는 증폭에 나쁜 영향을 미치기 때문에 E. Coli RNAse H 수준은 신중하게 조절되어야 한다는 것을 알 수 있다. 또한, 최적 농도는 비-특이적 인간 DNA의 존재에 의하여 변화되며 인간 DNA에 의한 저해는 모든 RNAse H 수준에서 중요하다.
[실시예 13]
HIV 영역 2에 대하여 제2영역의 증폭에 미치는 E. coli RNAse H의 효과를 본 발명자들은 조사하였다. 다음 데이타들은 E. coli RNAse H가 좁은 농도 범위역내에서 증폭을 증가시킨다는 사실을 밝히고 있다.
상이한 농도의 E. coli RNAse H의 존재하에 표 12에 기술된 대로 HIV 영역 2 프라이머를 증폭하였다. 각 반응의 10㎕를 분석하고 필요한 경우에는 희석액을 만들었다. 만들어진 표적양을 결정하기 위하여 시그날을 표적 도표와 비교하였다.
이들 결과로부터, Guatelli 등 (87 PANS 1874-1878)의 확신과는 상반되게, E. coli RNAse H의 첨가없이도 증폭이 이루어질 수 있음을 알 수 있다.
본 발명자들은 몇몇 표적 영역에서 MMLV 역전사 효소와 E. coli RNAse H를 사용하여 연구하였다. 반응은 실시예 12에서 기술된 조건을 이용하여 인간 DNA 8㎍의 유, 무하에 3시간의 자동촉매적 단계로 행해졌다. HIV 영역 1, 3 및 4로부터의 프라이머 군을 테스트 하였다. 사용한 바이러스 주형의 양은 혼성화분석의 직선범위에서 RLU를 제시하도록 선택하였다. MMLV 역전사효소는 개시동안에는 400U, 증폭동안에는 800U를 사용하였다. T7 RNA 중합효소의 400U를 포함하고 E. coli RNAse H 1U를 표시대로 첨가하였다. 컬럼 머리부 아래에 있는 값, +RNAse H, -RNAse H는 10㎕ 반응분석으로 부터 얻어진 RLU이다.
[표 15]
DNA의 존재하에서, E. coli RNAse H는 HIV 영역 4 프라이머에 의해 지휘되는 증폭을 자극한다. 본 발명자들이 테스트한 모든 경우에 있어서, MMLV 역전사 효소만을 사용한 증폭은 적어도 MMLV 역전사효소가 E. coli RNAse H와 사용될때만큼 양호하다. E. coli RNAse H는 Guatelli등(87 PANS 1874-1878)의 확신과는 상반되게, 효율적인 증폭을 위하여 필요하지 않다.
[역전사 효소의 서열 특이성]
또한 본 발명자들은 일부 프라이머군이 MMLV 역전사 효소로 또는 역전사 효소 하나와 첨가된 E. coli RNAse H로 가장 잘 작용하는 반면 일부 프라이머 군은 AMV 역전사효소로 가장 잘 작용한다는 사실을 발견하였다. 프로모터-프라이머와 프라이머 또는 RNAse H 원의 조그만 변화와 증폭효율에 있어 관찰될 정도의 다양성은 본 발명자가 제시한 메카니즘을 뒷받침한다. 본 발명자들은 이들 발견을 뒷받침하는 세부적 자료를 아래에 제시하였다.
MMLV 역전사효소를 클로닝하여 BRL(Bethesda Research Labs), U.S.Biochemicals 및 기타로부터의 매우 농축된 형태(㎕당 300단위 이상)로 상업적으로 이용할 수 있다. 중성 핵산 주형에의 비교 DNA 합성 활성은 RNA 역전사 효소에 비해 대략 10배 이상의 MMLV 역전사효소 단위 농도로 얻어진다는 사실을 주목하여야 하겠다. 단위 활성의 비교결여는 효소가 동질중합체주형(단위 활성 분석에 사용됨) 및 이질중합체 핵산 주형으로 테스트될 때 상이한 비교활성을 나타낸다는 사실에 기인한다. 본 발명자들은 증폭 반응에서 MMLV 역전사 효소를 다양한 농도로 사용하여 테스트하였다. 이들 결과의 예는 하기 표에 나타나 있다. AMV 역전사 샘플에서 개시단계 동안 14U의 역전사효소를 사용하였으며 증폭단계 동안에 56U의 역전사효소를 사용하였다. MMLV 역전사효소의 양은 개시 및 증폭단계 동안에 적정하였다. 사용된 배양조건은 실시예 12에서 기술된 것과 동일하다. 다만 15pmol의 각 HIV 영역 2 프라이머를 사용하고 NaCl를 25mM KCl로 대치한다. 증폭동안 400U의 T7 중합효소를 사용하였다. 8㎍ 인간 DNA의 유, 무하에서의 성능을 다음표에 나타내었다.
AMV 또는 MMLV로 칼럼의 서두에 명기된 각각 AMV 역전사효소 또는 MMLV 역전사효소로 실시한 증폭결과를 나타낸다. 숫자는 각각 개시및 자동촉매 동안에 사용된 단위 수를 의미한다. 표안에 포함된 수치는 RLU이다. 증폭생성물이 희석은 실시하지 않으며 200,000 RLU 이상의 수치는 시그날 포화가 사용된 조건에서 약 250,000RLU을 나타내기에 충분한 혼성화표적 수준에서 일어나기 때문에 증폭의 정도를 상당히 오산할 수 있다.
[표 16]
사람 DNA가 없이 MMLV 역전사효소에 의해 지휘되는 증폭의 감도가 AMV 지휘 증폭보다 상당히 낮다고 하더라도 MMLV는 외래 DNA의 존재하에 훨씬 효과적이다.
HIV 영역 2의 고수준 증폭을 관찰한 후, 본 발명자들은 인간 DNA의 존재하에 다른 표적 영역을 테스트하고, AMV 역전사 효소를 이용한 E. coli RNAse H는 이들 영역에 가장 효과적인 증폭을 위하여 여전히 필요하다는 사실을 알게되었다. 그 다음 본 발명자들은 E. coli RNAse H 없이 MMLV 역전사 효소를 이용하여, 각 표적 영역을 테스트하여 AMV 역전사효소와 E. coli RNAse H를 함유하는 반응과 증폭성능을 비교하였다. 두 표적 영역에 대한 이들 결과의 예는 하기 표에 제시되어 있다. HIV 영역 3과 4를 실시예 12에 기술된 대로 사용하였다(반응당 50 pmol).
AMV 역전사효소를 이용한 반응에서, 개시에는 14U가 사용되었으며 증폭을 위하여 56U 역전사효소와 1U E. coli RNAse H를 첨가하였다. MMLV 역전사효소를 이용한 반응에서, 개시에는 400U를, 증폭시에는 800U를 첨가하였다. 모든 반응은 4시간 증폭배양동안 400U T7 RNA 중합효소를 포함한다. 표안의 수치는 10㎕ 증폭반응 이용하여 실시한 동질방어 분석으로부터 얻어진 RLU이다. 반응이 희석은 븐석하기전에 몇몇 경우에서 실시하였다.
[표 17]
HIV 영역 2에서 관찰된 것처럼, 인간 DNA 없이, MMLV로의 증폭은 AMV 역전사효소 +RNAse H의 경우보다 상당히 미약하나, DNA의 존재하에, MMLV 지휘증폭은 최소한 AMV 역전사효소 +RNAse H의 경우와 비슷하다.
[실시예 14]
[HBV 게놈의 제2영역을 위한 프라이머]
HBV 게놈의 두 영역에 지휘되는 프라이머군으로 다음의 실험을 실시하였다. 데이타 결과는 프라이머군은 AMV RT와 같은 정도로 증폭하지 않는다는 것을 보여준다. (-)혈청에 희석된 HBV(+) 혈장을 이용하여 실시예 11에 기술된 대로 실험을 실시하였다. 10㎕의 증폭반응을 혼성화분석에서 테스트하였다.
[표 18]
이들 결과들은 표준방식을 이용한 다른 실험에 의해 확인되었다. 영역 1 프라이머는 일정하게 이들 실험에서 높은 RLU를 나타낸다. 반대로, 동일한 두 프라이머 쌍을 증폭하기 위하여 800U의 MMLV 효소를 사용할 경우에는 하기와 같은 역효과가 나타난다.
[표 19]
본 실험에서, 각 반응은 5㎕ 혈청을 포함한다.
따라서, 각 프라이머 쌍의 증폭위상은 증폭동안에 존재하는 역전사 효소에 영향을 받는다. 주형서열의 이용성, 프라이머의 특이적인 혼성화능력 및 RNA 합성의 효율등과 같은 요소들은 존재하는 역전사효소의 유형에 심각하게 영향을 받지 않는다. RNAse H 특이성 및 활성과 DNA 중합 활성등과 같은 요소는 영향을 받을 수 있다. 다음의 데이타는 적당한 조건에서 이용된 프로모터-프라이머 조합이 증폭을 증가시킬수 있도록 디자인될수 있음을 보여주고 있다.
[표 21]
본 실험은 표 11에 기술된대로 HBV 영역 2 프라이머로 실시하였다. 단 완전한 증폭반응은 혼성화로 분석하였다.
[실시예 15]
[AMV 역전사효소와 MMLV 역전사효소의 비교]
MMLV(300유니트) 또는 AMV(39 유니트)를 사용하여, CML의 환자에서 발견되는 BCL-2 크로모좀 해독 주 인간 크로모좀 중단점 t(14; 18)을 위한 프라이머의 증폭을 비교하였다. E. coli RNAse H의 효과는 각 효소로 평가하였다. 증폭은 실시예 12를 위해 기술된 대로 실시하였다. 단, 24mM MgCl2와 50pmol의 각 프라이머를 사용하였다. 세포 용해물을 포함한 반응에서, 백혈구의 DNA 4㎍이 존재한다. 모든 반응은 300 유니트의 T7 RNA 중합효소 및 10amol의 입력 이중가닥 DNA 표적을 포함한다.
[표 22]
결과는 특히 E. coli RNAse H가 없이 MMLV와 AMV TR가 이 프라이머군을 동일한 정도로 증폭하지 않는다는 것을 보여준다. AMV 역전사효소를 포함하는 반응에 첨가된 E. coli RNAse H는 현저하게 증폭을 개선시킨다; 이 사실은 RNAse 활성이 이들 반응에 한정된다는 것을 나타낸다. 반대로, E. coli RNAse H는 MMLV RT를 포함하는 반응에 첨가될 때 증폭을 증가시키지 않는다. 또한 데이타는 비특이적 인간 DNA의 많은 양의 존재하에 상당한 증폭을 유지하는 MMLV RT의 능력에 대하여 이미 형성된 사실을 확실히 한다.
C. 한 프라이머는 전 길이 생성물에 병합(incorporation)되지 않는다.
본 발명자의 가장 중요한 발견의 하나는, 주 RNA 종과 동일한 극성의 프라이머는 전길이 DNA 생성물에 뚜렷이 병합되지 않는다는 사실이다. 이 사실을 밝히기 위하여, 각 프라이머를32P로 말단 표지하고, 각 프라이머의 DNA 생성물로의 통합을 폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 조사하였다. 본 발명자들은 초기에 두 프라이머가 전 길이 DNA 생성물에 병합되는 것으로 예견했다. 사실, 매우 적게 남아있다. 이들 결과들은 많은 다른 표적 및 프라이머군으로 확인되었다. 본 방법은 하기에 설명한다.
자동촉매동안 축적된 cDNA 종을 동정하기 위하여, T4폴리뉴클레오티드키나제를 사용 5′에32P 표지을 하고 증폭반응에 조금 첨가(spike)하였다. 다음의 실시예는 한 극성의 cDNA가 증폭동안 우선적으로 축적되며 축적된 가닥이 항상 자동촉매동안 합성된 주된 RNA종에 상보적이다는 사실을 보여준다. 제5도는 증폭동안32P-표지 HIV 영역 2 프라이머의 통합 결과를 나타낸다. 이 프라이머 군은 (+) 센스의 214 염기 RNA의 합성을 초래한다. RNA에 상보적인 프라이머는 표적서열이 존재할 때 두개의 주요 235 및 214염기 밴드에 통합된다. (3레인) 전 길이 단편은 표적이 없이는 보이지 않는다(4 레인). 214 염기 단편은 RNA와 길이가 동일한 cDNA를 표시하며 235 염기 단편은 RNA+ 21염기의 T7 프로모터 서열과 길이가 같다. 이와 반대로, 프로모터 프라이머는 표적의 유, 무하에서(각각, 1 및 2 레인), 전길이 DNA 생성물에 관찰되지 않는다. 제5도의 5-8레인은 증폭동안32P-표지 HBV 영역 1 프라이머의 통합결과를 보여준다. T7 pro+와 T7 pro-로 알려진다. 이 프라이머 군은 양극성의 (+) 가닥 RNA 주종 132 염기 RNA를 생산할수 있다.
주 RNA에 상보적인 T7 pro-는 본 발명자가 제시한 메카니즘과 일치하는 132 염기 및 153 염기 단편에 병합된다(7 레인 (+) 표적, 8 레인(-) 표적). 153 염기단편은 T7 pro의 T7 프로모터 서열의 21염기 +RNA의 길이와 같다. 이와반대로,32P-표지 T7 pro 프라이머는 각 길이의 단편에 병합된다(5레인(+) 표적, 6레인 (-)표적).
겔 전기영동에 의해 분석된 반응을 또한 HPA로 분석하여 주 RNA와 같은 극성을 가지는 cDNA를 다른 방법으로 검출할수 있는지를 결정하였다. (+)와 (-) 가닥 프로브는 형성된 가닥의 상대적 비율을 결정하기에 사용되며, 각 반응의 부분을 RNAse A로 처리하여 RNA 대 DNA의 비율을 결정하였다.
[표 23]
*=32P로 표지된 (+)가닥 프라이머, 기타,32P로 표지된 (-) 가닥 프라이머.
이들 결과는 전 길이생성물이 프로모터-프라이머로 관찰되지 않을때라도 증폭은 잘 작동함을 보여준다. 이들 결과는 이전의 연구에서 관찰된것과 서로 관련된다. 즉, 한 센스 프로브로 관찰되는 대부분의 시그날은 RNA로부터이며 상보적 가닥 시그날은 예상했던것처럼 DNA이다. 이 사실은 양 극성의 형성 RNA를 가지는 HBV 영역 1 프라이머 군에도 맞아들어 간다.
D. 효소가 RNA/DNA 혼성체의 RNA의 특정부위를 절단한다는 사실을 보여주는 메카니즘의 확증
상기에 보고된 관찰 및 실험에 근거하여, RNAse H이 가능한 서열 특이성을 고려한 증폭시스템의 메카니즘은 제4도에 도시되어 있다.
이 메카니즘을 뒷받침하기 위하여, RNAse H 서열 특이성은 중요한 요소이기 때문에 정말로 효소가 RNA:DNA 혼성체의 RNA의 특정부위를 절단하는지를 밝힐 필요가 있다. 더욱이, 절단부위의 위치는 좋은 증폭을 얻기위하여 모델에 따라 특정 영역에 있어야 한다.
이 문제를 조사하기 위하여, 알려진 표적 및 프라이머 군 조합으로부터 생성된 RNA를 포함하는 RNA:DNA 혼성체를 제조하였다. RNA를32P로 표지하고 AMV 역전사 효소로 배양하고(연관된 RNAse H 활성을 가짐), 반응 생성물을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다. 결과는 새로운 반응 메카니즘과 전적으로 일치한다. 즉 단편크기로부터, 일부 작은 단편이 생겼으며 이들은 하나 또는 양 말단 근방의 절단에 의하여 생성된다는 사실을 알 수 있다. 분자의 내부영역은 절단되지 않는다. 이 실험은 사용된 반응조건하에서 효소가 서열 또는 구조 특이성을 가짐을 확증하였다.
제시된 메카니즘은 다중 절단이 프로모터-함유 프라이머를 복합체를 형성하는 영역에 일어날 것을 필요로 하기 때문에 절단이 어디에 일어나는 것인지를 결정하기 위하여 또 다른 실험을 실시하였다. RNA 각각의 말단을 표지하고 분해 생성물을 분석함으로써, 절단이 RNA의 5′말단에만 일어난다는 것을 밝혔다. 또한 이 사실은 제시된 메카니즘과 일치한다.
[실시예 16]
제6도는 AMV, MMLV 및 E. coli로부터의 RNAse H 활성이 특정 RNAse H 절단부위를 절단한다는 사실을 보여준다. 도면상의 화살표는 전길이 RNA의 위치를 나타낸다.
제6도는 HIV 영역 2 RNA를 초기에32P로 표지하고 단일가닥 표적서열에 혼성화하고 45분간 AMV로부터의 (레인 2) RNAse H로 5, 15, 45 또는 120분간 MMLV로(3-6레인), 또는 5분간 E. coli RNAse H로 (7레인) 닉(nick)하였다. 생성된 단편의 크기는 각 효소에 따라 상이하며 분리되어 있다. 이는 효소의 절단 특이성 및 본 주형에 효소간의 다양한 특이성을 나타낸다. 가장 바른 분해가 E. coli RNAse H의 존재하에서 관찰되는데 이는 낮은 특이성 또는 이 효소로의 높은 절단 활성을 나타낸다.
제6(b)도는 HBV 영역 1 RNA가 합성 표적 서열에 혼성화하고 AMV 역전사효소로부터의 5, 30, 60 또는 120분(2-5레인) 또는 E. coli로부터 1,3, 15 또는 60분(6-9레인) 동안 RNAse H로 닉(nick)한 결과를 보여준다. 상이한 크기의 단편이 두 효소로 생성되는데, 이는 절단의 특이성을 나타낸다. HBV RNA를 3′말단에 표지하고 AMV 역전사효소로 닉할 때 같은 크기의 단편이 관찰되며 이는 RNA의 5′말단 근방에 절단부위가 있음을 나타낸다. 이들 데이타는 특정부위가 AMV, MMLV 및 E. coli로부터의 RNAse H로 절단되며 적어도 일부 부위는 세 효소에 따라 상이하다는 것을 보여준다. 증폭될 영역단의 특정부위의 존재는 RNA:DNA 혼성체의 RNA를 절단하게 하며 따라서 자동촉매가 효율적으로 일어나도록 한다. 절단부위 정보를 이용하여 디자인한 프라이머는 개선된 증폭 효율을 나타낸다. 이것은 일부 프라이머 군이 RNAse H 출처원에 따라 상이한 정도로 증폭된다는 본 발명자의 관찰과 일치한다.
E. MMLV 및 AMV RNAse H 절단부위의 동정
[실시예 17]
AMV RNAse H에 의해 절단되는 부위를 동정하기 위하여, RNA를 상보적서열과 혼성화하고 AMV RNAse H로 닉하였다. 변성후, 서열화될 영역의 3′말단에 상보적인 프라이머를 혼성화하고 생거 서열화 방법에 의하여 디에옥시리보뉴클레오티드의 존재하에서 신장하였다. RNA의 절단을 나타내는 cDNA 합성의 종결은 HBV RNA의 다음 부위에서 관찰되었다:
MMLV RNAse H에 의해 절단되는 부위를 동정하기 위하여, RNA를 상보적인 서열과 혼성화하고 MMLV RNAse H로 닉하였다. 변성후, 서열화될 영역의 3′말단에 상보적인 프라이머를 혼성화하고 생거 서열화방법에 의하여 디데옥시뉴클레오티드의 존재하에서 신장하였다. cDNA 합성의 종결은 HBV RNA의 다음 부위에서 관찰되었다:
제2 HBV RNA 서열을 위한 다음 부위를 동정하였다:
HIV RNA 서열을 위한 다음 부위를 동정하였다:
대부분의 절단부위는 디뉴클레오티드 CA 또는 UG 근방에서 발생한다. 절단부위를 검출하기 위해 사용된 방법은 절단반응동안 축적된 부위만을 동정한다. 사용된 방법에 의하여 인식되지 않는 다른 부위가 절단된다는 사실도 예견할 수 있다.
F. 증폭시스템을 위한 프라이머
다양한 RNAse H 효소가 서열특이성을 가진다는 사실에 근거하여, 본 발명자들은 다양한 프라이머/ 표적 조합을 테스트하고 증폭시스템에서 이들의 성능을 최적화하려고 시도하였다. 지금까지 얻어진 데이타는 생성된 RNA 단편의 크기가 비교적 크며 아마 단편이 이중가닥으로부터 자동적으로 해리되지 않는다는 사실은 나타낸다. AMV RNA 또는 폴리오바이러스 RNA를 복사하는 AMV 역전사효소로의 작동은 RNAse H에 의해 생산된 RNA 단편이 효소에 의해 사용되어 초기에 합성된 cDNA 가닥으로부터 cDNA의 합성을 프라이밍한다는 사실을 보여주기 때문에 예상하지 않았던 것이 아니다.
RNAse H 효소가 서열 특이성을 가진다면, 증폭반응은 다음과 같이 진행된다(반응에서 RNA 중간생성체로 시작):
증폭동안 생성된 주 RNA종에 상보적인 프라이머는 RNA의 3′말단에 결합한다. 반응에서 프라이머의 농도가 높기때문에 초과 프라이머는 합성을 개시하기 전에 RNAse H 활성에 의하여 절단되는 RNA:DNA 이중체를 생성한다. 그러므로 프라이머 결합 영역은 반응에 사용되는 RNAse H 효소에 의하여 인식되는 많은 서열을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
절단부위가 빈번히 일어나므로, 인식된 절단부위가 없는 RNA 상보적 프라이머를 디자인하는 것은 일부 경우에 실질적이지 못하다; 이런경우 절단부위는 가능한한 5′말단 가까이에 있어서 프라이머의 3′말단부가 RNA에 어닐되어 남아있어야 한다.
적당한 DNA 중합효소에 의하여 프라이머의 신장시 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 제2프라이머의 결합부위는 노출되어야 한다. cDNA에 혼성화되는 것과 같이 핵산분해 및 프라이머의 지퍼링(zippering)를 허용하며, 프라이머의 역전사효소 매개결합을 허용하며 또한 단지 RNA를 닉하여 생성된 RNA 단편을 대체할수 있도록 하기 위하여서는 RNA 부분만을 제거하여도 충분하다. 본 데이타는 비교적 큰 RNA 조각이 생성되며 프로모터 함유 프라이머가 전길이 DNA에 통합되지 않는다는 사실을 보여주기 때문에 다음 사건이 일어날 수 있다.
1. 프로모터-프라이머의 결합을 허용하기에 충분한 RNA의 닉이 있다. 적당한 위치에의 닉이 단순히 용해하기에 충분히 작은 RNA 단편을 생성하며 프라이머 결합부위 또는 그 영역을 노출하거나 또는 닉이 RNA 단편을 대체하기 위한 하나 또는 그 이상의 효소와 연관된 사슬풀림 활성을 허용하는지에 대하여서는 아직 알려지지 않았다.
2. cDNA 3′말단이 역전사효소에 의하여 신장되어 프로모터 영역 이중가닥 DNA를 만든다.
3. 만들어진 복합체로부터 RNA를 합성한다.
이 복합체는 RNA에 결합된 cDNA로 구성되며 이중가닥 DNA 프로모터를 포함한다.
따라서 반응에서 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 프라이머의 결합부위 또는 그근방 어딘가에 존재하는 RNAse H 활성에 의하여 인식되는 서열이 있어야만 한다.
일부 응용에 있어, 또한 표적 서열 자체에 RNAse H 인식부위를 가지지 않는것이 바람직할 수 있다. 표적내의 부위는 절단되거나 이중가닥 cDNA 영역의 합성을 위한 RNA 프라이머를 생산하기에 사용되어질 수 있다.
이 효소 활성의 가능성을 제거하는 것이 바람직하다.
본 발명자들이 얻은 RNAse H 서열특이성 정보 및 모델에 근거하여 신규 프라이머 군을 디자인하였다.
본 디자인 기준은 다음과 같다:
T7 프로모터-프라이머에 대하여:
1) 프라이머 영역은 10염기당 하나 또는 그 이상의 절단부위를 가져야 한다.
2) 프라이머 영역은 5′말단 근방에 절단부위를 가져야 한다.
3) 프라이머 영역은 3′말단 근방에 절단부위, 가능한한 3′말단에 부분부위를 가져야 한다.
4) 프라이머 길이는 18염기 이상이어야 한다.
5) Tmest.는 약 55-65℃이어야 한다.
[다른 프라이머에 대하여:]
1) 프라이머는 거의 또는 전혀 RNAse H 절단부위를 가지지 않아야 한다.
2) 프라이머의 어떤 절단부위도 5′말단 근방에 있어야 한다.
3) 프라이머 길이는 대략 18-28 염기 길이이어야 한다.
4) Tmest.는 대략 55-65℃이어야 한다.
이들 기준과 서열특이성 및 메카니즘의 지식을 이용하여 디자인한 프라이머군으로부터 상당히 좋은 합성이 얻어진다. 이것은 특정표적 영역에 대한 기능적 프라이머 군의 디자인을 가능하게 하는데 본 발명의 유용성을 보여준다. 하기에 더욱 완전하게 설명되어 있다.
[실시예 18]
RNAse H 특이성에 대한 본 발명자들은 발견은 효율적인 프로모터-프라이머 조합을 디자인하는데 이용되었다. 기존의 방법은 단순히 비선택적으로 프로모터를 프라이머 서열에 부착시킨다. 본 발명자들은 증폭 생성물이 수율을 높이기 위하여 프로모터-프라이머 조합을 디자인하고 최적화할 수 있게 하였다. 다음의 실시예는 프로모터-프라이머 서열의 조그만 변화가 증폭효율에서 크나큰 변화를 초래한다는 것을 보여준다.
다음의 실시예는 RNAse H 절단부위 및 GP-III 증폭효율에 비교하여 유사영역으로부터의 프라이머를 보여준다. 각 실시예에서, 테스트되는 프라이머를 제외하고 보통시약을 사용하여 이중 증폭을 실시하였다.
1. 비프로모터 프라이머
첫번째 실시예에서, CML 주요 t(14; 18) 중단점을 증폭영역을 위한 비프로모터 프라이머 부위는 15염기 이동하여, 4 염기 인식서열이면 4 내지 1, 3 염기 인식서열이면 5 내지 2의 잠재적 RNAse H 절단부위의 수를 감소시킨다. 반응은 실시예 15를 위해 기술된 대로 실시하였다. 단, 2.5mM ATP, 16.5mM MgCl2및 50mM KCl을 포함한다. 프라이머 서열의 이 변화는 증폭효율에 상당한 양성효과를 가진다. 두번째의 실시예에서, HBV 영역 1의 비프로모터 프라이머에 내부적으로 의도적인 미스매치(mismatch)를 위치케하여, 4 염기 인식부위이다면 잠재적 RNAse H 절단부위만이 제거된다. 3 염기 절단부위에 경우에 통상의 지식을 가진자는 미스매치가 3′말단 최근방의 절단부위를 제거한다는 것을 인식할 것이다. 또한 이 변화는 증폭효율에 결정적인 양성효과를 가진다. 데이타는 프라이머의 위치 또는 미스 매치의 삽입을 변화시키는 두 방법이 증폭을 증가시킬 수 있음을 보여준다. 아마. 비프로모터 프라이머로부터 RNAse H 절단부위의 제거는 자동촉매동안 cDNA 합성의 더 효율적인 프라이밍을 유발한다.
2. 프로모터-프라이머.
다음의 실시예는 유사한 영역에서 나왔지만 잠재적인 RNAse H 절단부위의 수가 다른 프로모터 프라이머를 보여준다. 첫번째 예에서, HIV 영역 5의 두 프로모터 프라이머부위 10염기가 대체되어, 4염기 인식부위일 경우에는 2 내지 3의 잠재적 RNAse H 절단부위의 수를 변화시키거나 또는 3 염기 인식부위일 경우에는 3 내지 5의 자매적 RNAse H 절단부위의 수를 변화시킨다. 이는 증폭효율에 양성효과를 미친다. 두번째 예에서 잠재적 RNAse H 절단부위를 포함하는 서열을 주 중단점 t(14; 18) 전좌를 위한 프로모터 프라이머의 상부에 삽입하고 표적의 하나의 미스매치가 포함되어 프라이머 영역안에 절단부위를 만들게 된다.이는 프로모터 프라이머에 RNAse H 절단부위의 삽입이 증폭효율을 증가시키는데 사용될 수 있음을 보여준다. 아마, RNAse H 절단부위의 삽입은 RNA 가닥 해리를 도와서 프로모터 영역의 복사효율을 증가시키게 되어 더욱 효율적인 자동촉매를 유발한다.
상기예에서, 비프로모터 프라이머로부터 RNAse H 절단부위의 제거는 절단부위의 제거가 원표적에 미스매치를 병합하게 되는 것과 연관되더라도 증대된 증폭을 유발하였다. 또한 부가적 RNAse H 절단부위를 포함하기 위한 프로모터- 함유 프라이머의 디자인은 절단부위의 제거가 원 표적에 미스매치를 통합하게 되는 것과 연관되더라도 증폭을 증대시켰다. 잠재적 RNAse H 절단부위의 수, 분포 및 위치는 부분적으로 주어진 프라이머의 유용성을 결정하게 된다. 프로모터와 프라이머 사이에 서열을 삽입하거나 또는 의도적인 미스매치를 포함하게 함으로써 증폭을 개선시키는 것은 증폭방법에 용이하지 않은 개선이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, RNA 표적서열을 결정한 후 RNAse H 분해가 어디에 이중가닥의 RNA 부분을 절단 또는 제거하는지를 결정하기 위하여 분석하였다. AMV 역전사효소와 MMLV 역전사 효소에, 존재하는 RNAse H, E. coli RNAse H 또는 이들의 조합에 의하여 표적서열의 RNAse 분해효과를 결정하기 위한 실험을 실시하였다.
프라이머를 선택하는데 있어서, 반응 혼합물에 존재하는 RNAse H에 의하여 실질적으로 비분해되는 RNA 부분과 혼성화하도록 프라이머를 선택하는 것이 바람직하다. 실질적인 분해가 있다면, 프라이머의 영역에 있는 RNA 가닥상의 절단은 DNA 합성을 중지 또는 저해하며 프라이머의 신장을 방지한다. 따라서, RNA가 RNAse H에 작동되어질 때 프라이머 신장 생성물의 형성을 방지하는 실질적인 분해가 없도록 위치한, RNA 표적 서열과 혼성화하는 프라이머를 선택하는 것이 바람직하다.
RNA 가닥의 충분한 분해에 의해 프로모터-프라이머가 혼성화하는 DNA 가닥의 영역에 혼성화된 RNA 가닥영역의 제거가 일어날수 있도록 프로모터- 프라이머의 혼성화 부위가 선택된다. 전형적으로, RNAse H 분해에 의해 RNA:DNA 이중체로부터 RNA 부분만이 제거되며 이중체에서 RNA 가닥의 실질적 부분은 남는다. 이중가닥 DNA 프로모터를 포함하는 RNA:DNA 이중체가 생겨난다.

Claims (43)

  1. RNA 표적서열의 다수의 복사체를 합성하는 방법에 있어서, (a) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 표적서열의 3′말단부에 충분히 상보적인 혼성화 서열을 가지며 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 혼성화 서열의 5′서열을 선택적으로 가지는 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머로 상기 표적서열을 포함하는 RNA를 처리하는 단계, (b) RNA 표적에 상보적인 DNA 프라이머 신장 생성물을 생성하기 위하여 신장반응에서 주형으로서의 상기 표적과 역전사효소를 사용하여 프라이머를 신장하는 단계, (c) RNAse H 활성을 가진 효소를 사용하여 단계(b)에서 형성된 RNA-DNA이중체의 RNA 가닥을 선택적으로 분해하는 단계, (d) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화서열을 가지는 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 스플라이스 주형으로 DNA 프라이머 신장 생성물을 처리하는 단계, 단 제1 올리고뉴클레오티드가 프로모터 서열을 갖지 않는다면, 제2 올리고뉴클레오티드는 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 혼성화 서열의 5′서열을 갖는 스플라이스 주형임; (e) 이중가닥된 프로모터 영역에 결합된 RNA 중합효소에 대한 주형을 생성하기 위하여 DNA 신장반응에서 상기 제2 올리고뉴클레오티드, 상기 제1 프라이머 신장생성물, 또는 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 상기 제1 프라이머 신장 생성물 모두의 3′-말단을 신장하는 단계, 및 (f) 표적서열의 다수의 RNA 복사체를 생성하도록 단계(e)에서 형성된 이중가닥 프로모터 영역에 결합된 주형과 주형에 결합된 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 사용하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 단계(b)에서 사용된 역전사효소가 RNAse H 활성을 가진 역전사효소이고 상기 역전사효소 단독으로 단계(c)에 대해서 RNAse H활성을 부가적으로 제공하여 실질적으로 일정한 온도, 이온강도 및 pH의 조건하에서 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 사용된 역전사 효소는 조류 골수아구증 바이러스의 역전사효소(AMV 역전사효소)인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 사용된 역전사 효소는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스의 역전사효소(MMLV 역전사효소)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항, 제2항 및 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 프라이머이며, (a) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드로 상기 RNA를 처리하는 단계, (b) RNA 표적에 상보적인 제1 DNA 프라이머 신장 생성물을 제공하도록 신장반응에서 주형으로서의 상기 표적과 역전사 효소를 사용하여 제1 프라이머를 신장하는 단계, (c) 필요한 RNAse H활성을 단독으로 제공하는 역전사 효소를 사용하여 단계(b)에서 형성된 RNA-DNA이중체의 RNA 가닥을 선택적으로 분해하는 단계, (d) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화 서열을 가진 제2프라이머인 상기 제2 올리고뉴클레오티드로 제1 DNA 프라이머 신장 생성물을 처리하는 단계, (e) 제2 DNA 프라이머 신장 생성물을 제공하도록 DNA 신장 반응에서 제2 프라이머의 3′-말단을 신장하여 이중가닥된 프로모터 영역에 결합된 RNA 중합효소에 대한 주형을 생성하는 단계, 및 (f) 표적서열의 다수의 RNA 복사체를 생성하도록 단계(e)에서 형성된 이중가닥 프로모터 영역에 결합된 주형과 주형에 결합된 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제2프라이머는 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 프로모터 서열과 다르거나 같은 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 혼성화 서열의 5′서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, (g) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 상기 제2프라이머로 단계(f)로부터의 RNA 복사체를 처리하는 단계, (h) RNA 복사체에 상보적인 제2 DNA 프라이머 신장 생성물을 제공하도록 DNA 신장 반응에서 제2프라이머의 3′-말단을 신장하는 단계, (i) 필요한 RNAse H활성을 단독으로 제공하는 역전사 효소를 사용하여 단계(h)에서 형성된 RNA-DNA 이중체의 RNA 가닥을 선택적으로 분해하는 단계, (j) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 제1 프라이머로 제2 DNA 프라이머 신장 생성물을 처리하는 단계, (k) 제1 DNA 프라이머 신장 생성물 및 제2 DNA 프라이머 신장 생성물의 3′말단을 제공하기 위하여 DNA 신장 반응에서 제1 프라이머의 3′말단을 신장하여 이중가닥된 프로모터 영역에 결합된 RNA 중합효소에 대한 주형을 생성하는 단계, 및 (l) 표적서열의 다수의 RNA 복사체를 생성하도록 단계(k)에서 형성된 이중가닥 프로모터 영역에 결합된 주형과 주형에 결합된 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 사용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, (g) 혼성화 조건하에서 상기 제1 및 제2프라이머로 단계(f)의 RNA 복사체를 처리하는 단계, (h) DNA 프라이머 신장 생성물을 제공하도록 DNA 신장 반응에서 주형으로서 RNA 복사체를 사용하여 프라이머를 신장하는 단계, (i) 필요한 RNAse H 활성을 단독으로 제공하는 역전사 효소를 사용하여 단계(h)에서 형성된 RNA-DNA 이중체의 RNA 가닥을 선택적으로 분해하는 단계, (j) 혼성화 조건하에서 상기 프라이머들로 DNA 프라이머 신장 생성물을 처리하는 단계, (k) 상보적인 프라이머 신장 생성물을 제공하기 위하여 DNA 신장반응에서 상기 프라이머들을 신장하여 이중가닥된 프로모터 영역에 결합된 RNA 중합효소에 대한 주형을 생성하는 단계, 및 (l) 표적서열의 다수의 RNA 복사체를 생성하도록 단계(k)에서 형성된 이중가닥 프로모터 영역에 결합된 주형과 주형에 결합된 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소들을 사용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, (m) 표적서열의 다수의 복사체를 자동촉매적으로 합성하도록 단계(l)의 RNA 복사체를 사용하고, 단계(g) 내지 (l)을 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항, 제2항 및 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 스플라이스 주형이고, (a) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화 서열을 가진 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머로 상기 RNA를 처리하는 단계, (b) RNA 표적에 상보적인 DNA 프라이머 신장 생성물을 제공하기 위하여 신장반응에서 주형으로서의 표적과 역전사효소를 사용하여 제1 프라이머를 3′말단을 신장하는 단계, (c) 필요한 RNAse H 활성을 단독으로 제공하는 역전사효소를 사용하여 단계(b)에서 형성된 RNA-DNA 이중체의 RNA 가닥을 선택적으로 분해하는 단계, (d) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 제1 프라이머 신장 생성물의 3′-말단에 충분히 상보적인 혼성화 서열과 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 혼성화 서열의 5′서열을 가진 상기 제2 올리고뉴클레오티드로 DNA 프라이머 신장 생성물을 처리하는 단계, (e) 스플라이스 주형의 프로모터 서열에 상보적인 서열을 거기에 첨가하기 위하여 제1 프라이머 신장 생성물의 3′-말단을 신장하여 이중가닥된 프로모터 영역에 결합된 RNA 중합효소에 대한 주형을 생성하는 단계, 및 (f) 표적서열의 다수의 RNA 복사체를 생성하도록 단계(e)에서 형성된 이중가닥 프로모터 영역에 연결된 주형과 주형에 연결된 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, (g) 표적서열의 다수의 복사체를 자동촉매적으로 합성하도록 단계(f)의 RNA 복사체를 사용하고, 단계(a) 내지 (f)를 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 제2 올리고뉴클레오티드 스플라이스 주형의 3′-말단이 차단되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 단계(e)에서, 제2 올리고뉴클레오티드 스플라이스 주형은 제2 프라이머 역할을 하며 상기 스플라이스 주형의 3′-말단은 DNA 신장 반응에서 신장되어 제1 프라이머 신장 생성물에 상보적인 제2 프라이머 신장 생성물을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머는 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 혼성화 서열의 5′서열을 가지며, 사이 프로모터 서열은 상기 제2 올리고뉴클레오티드 스플라이스 주형의 프로모터 서열과 다르거나 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머와 상기 제2 올리고뉴클레오티드 스플라이스 주형은 이 스플라이스 주형서열이 프라이머 서열의 5′인 단일 올리고뉴클레오티드를 구성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항, 제2항 및 제3항 중 어느 한항에 있어서, (a) 상기 RNA, 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드, (i) DNA-지향된 DNA 중합효소 활성, (ii) RNA-지향된 DNA 중합효소 활성 및 (iii) RNAse H 활성을 가진 역전사효소 및 프로모터(들)를 인식하는 RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소들을 혼합하는 단계, 및 (b) 실질적으로 일정한 온도, 이온강도 및 pH를 포함하는 DNA 프라이밍 및 핵산합성 조건하에서 상기 표적서열의 다수의 복사체를 생성하도록 상기 결과적으로 생성되는 혼합물을 배양하는 단계로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제9항에 있어서, 단계(a)의 RNA는 단계(a)에서의 RNA 표적서열에 상보적이고 한정된 3′-말단을 가진 DNA 표적서열을 포함하는 단일가닥 DNA로 시작하는 예비단계에 의해 발생하며, 상기 예비단계는 (i) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 상기 DNA 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화 서열과 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 혼성화 서열의 5′서열을 가진 상기 제2 올리고뉴클레오티드 스플라이스 주형으로 상기 단일가닥 DNA를 처리하는 단계, (ii) 스플라이스 주형의 프로모터 서열에 상보적인 서열을 첨가하기 위하여 상기 DNA 표적서열의 3′-말단을 신장하여 이중가닥 프로모터 영역에 결합된 RNA 중합효소에 대한 주형을 생성하는 단계, 및 (iii) 표적서열의 다수의 RNA 복사체를 생성하도록 단계(ii)에서 형성된 이중가닥 프로모터 영역에 결합된 주형과 이 주형에 결합된 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, (a) 상기 DNA, 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드, (i) DNA-지향된 DNA 중합효소 활성, (ii) RNA-지향된 DNA 중합효소 활성 및 (iii) RNAse H 활성을 가진 역전사효소 및 프로모터를 인식하는 RNA 중합효소들을 혼합하는 단계, 및 (b) 실질적으로 일정한 온도, 이온강도 및 pH를 포함하는 DNA 프라이밍 및 핵산합성 조건하에서 상기 표적서열의 다수의 복사체를 생성하도록 상기 결과적으로 생성되는 혼합물을 배양하는 단계로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제9항에 있어서, 단계(a)의 RNA는 예비단계에 의하여 상기 RNA 표적서열에 상보적인 DNA 표적서열을 포함하는 단일가닥 DNA로부터 발생하며, 상기 예비단계는 (i) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화 서열과 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 서열을 가진 상기 제2 올리고뉴클레오티드로 상기 DNA를 처리하는 단계, (ii) DNA 표적서열에 상보적인 제1 DNA 프라이머 신장 생성물을 제공하기 위하여 DNA 신장 반응에서 주형으로서 상기 표적을 사용하여 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3′-말단을 신장하는 단계, (iii) 상기 표적으로부터 단계(ii)에서 형성된 프라이머 신장 생성물을 분리하는 단계, (iv) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화 서열을 가진 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머로 상기 분리된 프라이머 신장 생성물을 처리하는 단계, (v) 제2 DNA 프라이머 신장 생성물을 제공하도록 DNA 신장반응에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3′-말단을 신장하여 이중가닥 프로모터 영역에 결합된 RNA 중합효소에 대한 주형을 생성하는 단계, 및 (vi) 표적서열의 다수의 RNA 복사체를 생성하도록 단계(v)에서 형성된 이중가닥 프로모터영역에 결합된 주형과 이 주형에 결합된 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 제2 올리고뉴클레오티드 스플라이스 주형의 프로모터와 다르거나 같은 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 혼성화 서열의 5′서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제9항에 있어서, 단계(a)의 RNA는 예비단계에 의하여 상기 RNA 표적서열에 대응하는 DNA 표적서열을 포함하는 단일가닥 DNA로부터 발생하며, 상기 예비단계는 (i) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화 서열을 가진 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머로 상기 DNA를 처리하는 단계, (ii) 표적에 상보적인 DNA 프라이머 신장 생성물을 제공하기 위하여 신장반응에서 주형으로서 표적을 사용하여 프라이머의 3′-말단을 신장하는 단계, (iii) 표적으로부터 단계(ii)에서 형성된 프라이머 신장 생성물을 분리하는 단계, (iv) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 스플라이스 주형이며, 혼성화하기 위한 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화 서열과 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 혼성화 가열의 5′서열을 가진 상기 제2 올리고뉴클레오티드로 상기 분리된 프라이머 신장 생성물을 처리하는 단계, (v) 스플라이스 주형의 프로모터 서열에 상보적인 서열을 거기에 첨가하도록 프라이머 신장 생성물의 3′말단을 신장하여 이중가닥 프로모터 영역에 결합된 RNA 중합효소에 대한 주형을 생성하는 단계, 및 (vi) 표적서열의 다수의 RNA 복사체를 생성하도록 단계(v)에서 형성된 이중가닥 프로모터영역에 결합된 주형과 이 주형에 결합된 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제18항 내지 제20항중 어느 한항에 있어서, (a) 상기 단일가닥 DNA, 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 및 역전사효소를 혼합하는 단계, (b) 표적서열에 상보적인 제1 DNA 프라이머 신장생성물이 주형으로서 표적서열을 사용하여 합성되는 DNA 프라이밍 및 합성 조건하에서, 단계(a)의 혼합물을 배양하는 단계, (c) DNA 이중체의 DNA 가닥의 분리를 유발하도록 단계(b)의 반응혼합물을 가열하는 단계, (d) 비-효소 변성 조건하에서 단계(c)의 반응혼합물에 두 번째 양의 역전사 효소 및 프로모터 서열(들)을 인식하는 RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소들을 첨가하는 단계, 및 (e) 실질적으로 일정한 온도, 이온강도 및 pH를 포함하는 DNA 프라이밍 및 핵산합성 조건하에서 상기 표적서열의 다수의 복사체를 생성하도록 단계(d)의 혼합물을 배양하는 단계로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제9항에 있어서, (i) 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 제1 프라이머의 신장에 의해 형성된 RNA-DNA 이중체내에서 역전사효소의 RNAse H 활성에 의하여 실질적으로 분해되지 않고 남아 있는 상기 RNA 표적서열의 부분과 혼성화되도록 선택되며, 그리고 (ii) 스플라이스 주형 올리고뉴클레오티드는 상보적인 RNA의 충분한 부분이 상기 RNAse H 활성의 분해작용에 의하여 상기 혼성화에 대한 표적 RNA-제1 DNA 프라이머 신장생성물 이중체로부터 제거되는 영역에서 제1 DNA 프라이머 신장생성물과 혼성화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제9항에 있어서, (a) 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머는 제1 DNA 프라이머 신장생성물의 형성을 개시하는 그것의 능력이 RNA 표적-제1 올리고뉴클레오티드 프라이머 복합체내에서 RNA 표적의 상보적인 서열상의 역전사효소의 RNAse H 활성에 의한 어떤 분해작용에 의하여도 영향받지 않도록 선택되며, 및 (b) 스플라이스 주형 올리고뉴클레오티드는 상보적인 RNA의 충분한 부분이 상기 RNAse H 활성의 분해작용에 의하여 상기 혼성화에 대한 표적 RNA-제1 DNA 프라이머 신장생성물 이중체로부터 제거되는 영역에서 제1 DNA 프라이머 신장생성물과 혼성화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제12항 또는 제13항에 있어서, 역전사효소의 RNAse H활성은 RNA 표적서열의 5′-단부부분의 선택적인 제거를 유발하도록 RNA 표적-제1 DNA 프라이머 신장생성물 이중체에 작용하며, 상기 부분은 이중가닥 DNA 프로모터를 생성하도록 스플라이스 주형 올리고뉴클레오티드의 혼성화와 제1 DNA 프라이머 신장 생성물의 3′-말단의 신장을 허용하는 데 충분한 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, (a) 상기 RNA, 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머, 스플라이스 주형 올리고뉴클레오티드, (i) DNA-지향된 DNA 중합효소 활성, (ii) RNA-지향된 DNA 중합효소 활성 및 (iii) RNAse H활성을 가진 역전사효소 및 프로모터를 인식하는 RNA 중합효소를 혼합하는 단계, 및 (b) 실질적으로 일정한 온도, 이온강도 및 pH를 포함하는 DNA 프라이밍 및 핵산합성 조건하에서, 상기 표적서열의 다수의 복사체를 생성하도록 상기 결과적으로 생성되는 혼합물을 배양하는 단계로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제22항 또는 제23항에 있어서, 단계 (a)의 RNA는 RNA로 시작하고 제4항에 정의된 단계(a) 내지 (f)로 필수적으로 구성되거나, 단일가닥 DNA로 시작하고 제16항에 정의된 단계(i) 내지 (iii) 또는 제18항 또는 제20항에 정의된 단계(i) 내지 (vi)로 필수적으로 구성되는 예비단계에 의해 발생되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제10항에 있어서, 제2 올리고뉴클레오티드 스플라이스 주형의 3′-말단이 차단되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제10항에 있어서, 단계(e)에서, 제2 올리고뉴클레오티드 스플라이스 주형은 제2 프라이머 역할을 하며 상기 스플라이스 주형의 3′-말단은 DNA 신장 반응에서 신장되어 제1 프라이머 신장 생성물에 상보적인 제2 프라이머 신장 생성물을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제10항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머는 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 혼성화 서열의 5′서열을 가지며, 상기 프로모터 서열은 상기 제2 올리고뉴클레오티드 스플라이스 주형의 프로모터 서열과 다르거나 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제10항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머와 상기 제2 올리고뉴클레오티드 스플라이스 주형은 이 스플라이스 주형서열이 프라이머 서열의 5′인 단일 올리고뉴클레오티드를 구성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제4항에 있어서, (a) 상기 RNA, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드, (i) DNA-지향된 DNA 중합효소 활성, (ii) RNA-지향된 DNA 중합효소 활성 및 (iii) RNAse H 활성을 가진 역전사효소 및 프로모터(들)를 인식하는 RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소를 혼합하는 단계, 및 (b) 실질적으로 일정한 온도, 이온강도 및 pH를 포함하는 DNA 프라이밍 및 핵산합성 조건하에서, 상기 표적서열의 다수의 복사체를 생성하도록 상기 결과적으로 생성되는 혼합물을 배양하는 단계로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제5항 내지 제7항중 어느 한항에 있어서, (a) 상기 RNA, 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드, (i) DNA-지향된 DNA 중합효소 활성, (ii) RNA-지향된 DNA 중합효소 활성 및 (iii) RNAse H 활성을 가진 역전사효소 및 프로모터(들)를 인식하는 RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소를 혼합하는 단계, 및 (b) 실질적으로 일정한 온도, 이온강도 및 pH를 포함하는 DNA 프라이밍 및 핵산합성 조건하에서 상기 표적서열의 다수의 복사체를 생성하도록 상기 결과적으로 생성되는 혼합물을 배양하는 단계로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제8항에 있어서, (a) 상기 RNA, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드, (i) DNA-지향된 DNA 중합효소 활성, (ii) RNA-지향된 DNA 중합효소 활성 및 (iii) RNAse H 활성을 가진 역전사효소 및 프로모터(들)를 인식하는 RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소를 혼합하는 단계, 및 (b) 실질적으로 일정한 온도, 이온강도 및 pH를 포함하는 DNA 프라이밍 및 핵산합성 조건하에서, 상기 표적서열의 다수의 복사체를 생성하도록 상기 결과적으로 생성되는 혼합물을 배양하는 단계로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제9항에 있어서, (a) 상기 RNA, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드, (i) DNA-지향된 DNA 중합효소 활성, (ii) RNA-지향된 DNA 중합효소 활성 및 (iii) RNAse H 활성을 가진 역전사효소 및 프로모터(들)를 인식하는 RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소를 혼합하는 단계, 및 (b) 실질적으로 일정한 온도, 이온강도 및 pH를 포함하는 DNA 프라이밍 및 핵산합성 조건하에서, 상기 표적서열의 다수의 복사체를 생성하도록 상기 결과적으로 생성되는 혼합물을 배양하는 단계로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제10항 내지 제14항중 어느 한항에 있어서, (a) 상기 RNA, 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드, (i) DNA-지향된 DNA 중합효소 활성, (ii) RNA-지향된 DNA 중합효소 활성 및 (iii) RNAse H 활성을 가진 역전사효소 및 프로모터(들)를 인식하는 RNA 중합효소 또는 RNA 중합효소를 혼합하는 단계, 및 (b) 실질적으로 일정한 온도, 이온강도 및 pH를 포함하는 DNA 프라이밍 및 핵산합성 조건하에서, 상기 표적서열의 다수의 복사체를 생성하도록 상기 결과적으로 생성되는 혼합물을 배양하는 단계로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제10항 내지 제14항중 어느 한항에 있어서, 단계(a)의 RNA는 단계(a)에서의 RNA 표적서열에 상보적이고 한정된 3′-말단을 가진 DNA 표적서열을 포함하는 단일가닥 DNA로 시작하는 예비단계에 의해 발생하며, 상기 예비단계는 (i) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 상기 DNA 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화 서열과 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 혼성화 서열의 5′서열을 가진 상기 제2 올리고뉴클레오티드 스플라이스 주형으로 상기 단일가닥 DNA를 처리하는 단계, (ii) 스플라이스 주형의 프로모터 서열에 상보적인 서열을 첨가하기 위하여 상기 DNA 표적서열의 3′-말단을 신장하여 이중가닥 프로모터 영역에 결합된 RNA 중합효소에 대한 주형을 생성하는 단계, 및 (iii) 표적서열의 다수의 RNA 복사체를 생성하도록 단계(ii)에서 형성된 이중가닥 프로모터영역에 결합된 주형과 결합된 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제10항 내지 제12항 및 제13항중 어느 한항에 있어서, 단계 (a)의 RNA는 예비단계에 의하여 상기 RNA 표적서열에 상보적인 DNA 표적서열을 포함하는 단일가닥 DNA로부터 발생하며, 상기 예비단계는 (i) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화서열과 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 서열을 가진 상기 제2 올리고뉴클레오티드로 상기 DNA를 처리하는 단계, (ii) DNA 표적서열에 상보적인 제1 DNA 프라이머 신장 생성물을 제공하기 위하여 DNA 신장 반응에서 주형으로서 상기 표적을 사용하여 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3′-말단을 신장하는 단계, (iii) 상기 표적으로부터의 단계(ii)에서 형성된 프라이머 신장 생성물을 분리하는 단계, (iv) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화 서열을 가진 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머로 상기 분리된 프라이머 신장 생성물을 처리하는 단계, (v) 제2 DNA 프라이머 신장 생성물을 제공하도록 DNA 신장반응에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3′-말단을 신장하여 이중가닥 프로모터 영역에 결합된 RNA 중합효소에 대한 주형을 생성하는 단계, 및 (vi) 표적서열의 다수의 RNA 복사체를 생성하도록 단계(v)에서 형성된 이중가닥 프로모터영역에 결합된 주형과 이 주형에 결합된 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제10항 내지 제14항중 어느 한항에 있어서, 단계 (a)의 RNA는 예비단계에 의하여 상기 RNA 표적서열에 대응하는 DNA 표적서열을 포함하는 단일가닥 DNA로부터 발생하며, 상기 예비단계는 (i) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 혼성화하기 위한 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화 서열을 가진 상기 제1 올리고뉴클레오티드로 프라이머로 상기 DNA를 처리하는 단계, (ii) 표적에 상보적인 DNA 프라이머 신장 생성물을 제공하기 위하여 신장반응에서 주형으로서 상기 표적을 사용하여 프라이머의 3′-말단을 신장하는 단계, (iii) 표적으로부터 단계(ii)에서 형성된 프라이머 신장 생성물을 분리하는 단계, (iv) 올리고뉴클레오티드/표적서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에서, 스플라이스 주형이며, 혼성화하기 위한 표적서열의 3′-말단부에 충분히 상보적인 혼성화 서열과 RNA 중합효소에 대한 프로모터 서열을 포함하는 혼성화 서열의 5′서열을 가진 상기 제2 올리고뉴클레오티드로 상기 분리된 프라이머 신장생성물을 처리하는 단계, (v) 스플라이스 주형의 프로모터 서열에 상보적인 서열을 거기에 첨가하도록 프라이머 신장 생성물의 3′말단을 신장하여 이중가닥 프로모터 영역에 결합된 RNA 중합효소에 대한 주형을 생성하는 단계, 및 (vi) 표적서열의 다수의 RNA 복사체를 생성하도록 단계(v)에서 형성된 이중가닥 프로모터 영역에 결합된 주형과 이 주형에 결합된 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소를 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제10항에 있어서, (i) 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 제1 프라이머의 신장에 의해 형성된 RNA-DNA 이중체내에서 역전사효소의 RNAse H활성에 의하여 실질적으로 분해되지 않고 남아 있는 상기 RNA 표적서열의 부분과 혼성화되도록 선택되며, 그리고 (ii) 스플라이스 주형 올리고뉴클레오티드는 상보적인 RNA의 충분한 부분이 상기 RNAse H 활성의 분해작용에 의하여 상기 혼성화에 대한 표적 RNA-제1 DNA 프라이머 신장생성물 이중체로부터 제거되는 영역에서 제1 DNA 프라이머 신장생성물과 혼성화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제10항에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머는 제1 DNA 프라이머 신장생성물의 형성을 개시하는 그것의 능력이 RNA 표적-제1 올리고뉴클레오티드 프라이머 복합체내에서 RNA 표적의 상보적인 서열상의 역전사효소의 RNAse H 활성에 의한 어떤 분해작용에 의하여도 영향받지 않도록 선택되며, 및 (b) 스플라이스 주형 올리고뉴클레오티드는 상보적인 RNA의 충분한 부분이 상기 RNAse H 활성의 분해작용에 의하여 상기 혼성화에 대한 표적 RNA-제1 DNA 프라이머 신장생성물 이중체로부터 제거되는 영역에서 제1 DNA 프라이머 신장생성물과 혼성화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제24항에 있어서, (a) 상기 RNA, 제1 올리고뉴클레오티드 프라이머, 스플라이스 주형을 올리고뉴클레오티드, (i) DNA-지향된 DNA 중합효소 활성, (ii) RNA-지향된 DNA 중합효소 활성 및 (iii) RNAse H활성을 가진 역전사효소 및 프로모터를 인식하는 RNA 중합효소를 혼합하는 단계, 및 (b) 실질적으로 일정한 온도, 이온강도 및 pH를 포함하는 DNA 프라이밍 및 핵산합성 조건하에서, 상기 표적서열의 다수의 복사체를 생성하도록 상기 결과적으로 생성되는 혼합물을 배양하는 단계로 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제24항에 있어서, 단계 (a)의 RNA는 RNA로 시작하고 제4항에 정의된 단계(a) 내지 (f)로 필수적으로 구성되거나, 단일가닥 DNA로 시작하고 제16항에 정의된 단계(i) 내지 (iii) 또는 제18항 또는 제20항에 정의된 단계(i) 내지 (vi)로 필수적으로 구성되는 예비단계에 의해 발생되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제25항에 있어서, 단계 (a)의 RNA는 RNA로 시작하고 제4항에 정의된 단계(a) 내지 (f)로 필수적으로 구성되거나, 단일가닥 DNA로 시작하고 제16항에 정의된 단계(i) 내지 (iii) 또는 제18항 또는 제20항에 정의된 단계(i) 내지 (vi)로 필수적으로 구성되는 예비단계에 의해 발생되는 것을 특징으로 하는 방법.
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